KR20240024357A - 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰 - Google Patents
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Abstract
올리고뉴클레오타이드와 같은 고품질 빌딩 블록의 제조를 위한 장치가 본원에 기재된다. 나노 크기 장치는 반응 조건의 선택적 제어를 허용한다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 장치는 매우 정확한 핵산의 큰 라이브러리의 신속한 제작을 허용한다.
Description
상호 참조
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드 노보 유전자 합성은 기본적인 생물학적 연구 및 생명공학 응용을 위한 강력한 도구이다. 소규모로 비교적 짧은 단편을 설계 및 합성하기 위한 다양한 방법이 알려져 있지만, 이러한 기술들은 종종 예측성, 확장성, 자동화, 속도, 정확성, 및 비용으로 고통받고 있다.
표면을 포함하는 고체 지지체; 상기 표면 상에 위치한 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 구조물; 및 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 극성 용매인 용매를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치가 본원에 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위(loci)를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 하나 이상의 전극이 하나 이상의 개별 좌위를 가열하는 어드레서블 전극(addressable electrode)인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 고체 지지체가 냉각 유닛을 추가로 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 10 nm 내지 약 1000 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm 내지 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 20 nm 내지 약 300 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 200 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 각각의 구조물은 3차원 구조물을 포함하고, 3차원 구조물은 나노웰(nanowell), 나노와이어(nanowire), 나노포스트(nanopost), 또는 나노로드(nanorod)인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 0.5 내지 약 1.5 g/mL의 밀도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 니트릴기를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 트리메틸아세토니트릴인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 5℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 10℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 장치가 폴리뉴클레오타이드 합성에 사용되고, 폴리뉴클레오타이드 합성이 복수의 신장(elongation) 단계를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 신장 단계 동안 제거되지 않는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 본원에 기재된 장치를 사용한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 추가로 제공된다.
표면을 포함하는 고체 지지체; 상기 표면 상에 위치한 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 구조물; 및 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 약 18℃ 이하의 용융 온도를 갖는 것인 용매를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치가 본원에 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 하나 이상의 전극이 하나 이상의 개별 좌위를 가열하는 어드레서블 전극인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 고체 지지체가 냉각 유닛을 추가로 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 10 nm 내지 약 1000 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm 내지 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 20 nm 내지 약 300 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 200 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 각각의 구조물은 3차원 구조물을 포함하고, 3차원 구조물은 나노웰, 나노와이어, 나노포스트, 또는 나노로드인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 0.5 내지 약 1.5 g/mL의 밀도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 극성 용매인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 니트릴기를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 트리메틸아세토니트릴인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 5℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 10℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 장치가 폴리뉴클레오타이드 합성에 사용되고, 폴리뉴클레오타이드 합성이 복수의 신장 단계를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 신장 단계 동안 제거되지 않는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 본원에 기재된 장치를 사용한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 추가로 제공된다.
표면을 포함하는 고체 지지체; 상기 표면 상에 위치한 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 구조물; 및 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 약 82℃ 이하의 비등 온도를 갖는 것인 용매를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치가 본원에 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 하나 이상의 전극이 하나 이상의 개별 좌위를 가열하는 어드레서블 전극인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 고체 지지체가 냉각 유닛을 추가로 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 10 nm 내지 약 1000 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm 내지 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 20 nm 내지 약 300 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 100 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 200 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리가 약 500 nm인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 각각의 구조물은 3차원 구조물을 포함하고, 3차원 구조물은 나노웰, 나노와이어, 나노포스트, 또는 나노로드인 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 0.5 내지 약 1.5 g/mL의 밀도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 0℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 30℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 55℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 장치가 폴리뉴클레오타이드 합성에 사용되고, 폴리뉴클레오타이드 합성이 복수의 신장 단계를 포함하는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 용매가 신장 단계 동안 제거되지 않는 장치가 본원에 추가로 제공된다. 본원에 기재된 장치를 사용한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 추가로 제공된다.
폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 위한 미리 결정된 서열을 제공하는 단계; 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계; 및 상기 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계로서, 탈블로킹(deblocking) 단계가 발생하기 전에 상이한 뉴클레오타이드가 순차적으로 첨가되는 것인 단계를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 제공된다. 합성이 용매를 추가로 포함하고, 용매가 적어도 하나의 상 변화를 겪는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 극성 용매인 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 트리메틸아세토니트릴인 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 0.5 내지 1.5 g/mL의 밀도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 합성이 복수의 신장 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 신장 단계 동안 제거되지 않는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 탈블로킹 단계가 발생하기 전에 적어도 2개의 상이한 뉴클레오타이드가 순차적으로 첨가되는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 탈블로킹 단계가 발생하기 전에 적어도 3개의 상이한 뉴클레오타이드가 순차적으로 첨가되는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 탈블로킹 단계가 발생하기 전에 적어도 4개의 상이한 뉴클레오타이드가 순차적으로 첨가되는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 모든 표면이 신장 단계 동안 동일한 뉴클레오타이드와 접촉되는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 적어도 하나의 상 변화가 용융 또는 동결인 방법이 본원에 추가로 제공된다. 적어도 하나의 상 변화가 비등 또는 응축인 방법이 본원에 추가로 제공된다.
본원에 기재된 장치를 사용한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 제공된다.
폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 위한 미리 결정된 서열을 제공하는 단계; 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계; 상기 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계로서, 고체상의 용매가 표면의 적어도 하나의 영역으로부터 연장되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 탈블로킹을 방지하고, 상기 용매는 약 18℃ 이하의 용융 온도를 갖는 것인 단계를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면을 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면을 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계로서, 용매는 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉과 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉 사이에서 제거되지 않는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면의 적어도 하나의 영역에 존재하는 용매를 용융시키는 단계, 및 적어도 하나의 영역에서의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 연장된 폴리뉴클레오타이드를 탈블로킹하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 15℃ 이하의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 10℃ 이하의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 5℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 10℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 위한 미리 결정된 서열을 제공하는 단계; 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계; 상기 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계로서, 기체상의 용매가 표면의 적어도 하나의 영역으로부터 연장되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 탈블로킹을 방지하고, 상기 용매는 약 82℃ 이하의 비등 온도를 갖는 것인 단계를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면을 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면을 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계로서, 용매는 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉과 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉 사이에서 제거되지 않는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계가 표면의 적어도 하나의 영역에 존재하는 용매를 응축시키는 단계, 및 적어도 하나의 영역에서의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 연장된 폴리뉴클레오타이드를 탈블로킹하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 75℃ 이하의 비등 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 약 65℃ 이하의 비등 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 0℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 30℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 용매가 55℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 표면이 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 각각 평평한 특징부(좌위), 채널, 또는 웰을 갖는 강성 구조물을 도시한다.
도 2는 클러스터 증폭으로부터 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 생성하는 개략도를 도시한다.
도 3a는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 3b는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 우측 단면을 도시한다.
도 4a는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 4b는 어드레서블 나노포스트를 갖는 가열된 나노포스트 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 5는 어드레서블 나노로드를 갖는 가열된 나노로드 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 6은 어드레서블 하부 접촉에 부착된 나노와이어 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 7은 폴리뉴클레오타이드 합성 물질 증착 장치를 도시한다.
도 8은 폴리뉴클레오타이드 합성 워크플로우를 도시한다.
도 9는 컴퓨터 시스템을 도시한다.
도 10은 컴퓨터 시스템의 아키텍처를 예시하는 블록도를 도시한다.
도 11은 복수의 컴퓨터 시스템, 복수의 휴대폰 및 개인 데이터 단말기, 및 네트워크 연결 저장장치(Network Attached Storage, NAS)를 통합하도록 구성된 네트워크를 도시한다.
도 12는 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템을 도시한다.
도 1은 각각 평평한 특징부(좌위), 채널, 또는 웰을 갖는 강성 구조물을 도시한다.
도 2는 클러스터 증폭으로부터 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 생성하는 개략도를 도시한다.
도 3a는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 3b는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 우측 단면을 도시한다.
도 4a는 어드레서블 웰을 갖는 가열된 나노웰 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 4b는 어드레서블 나노포스트를 갖는 가열된 나노포스트 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 5는 어드레서블 나노로드를 갖는 가열된 나노로드 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 6은 어드레서블 하부 접촉에 부착된 나노와이어 구조물의 정면 단면을 도시한다.
도 7은 폴리뉴클레오타이드 합성 물질 증착 장치를 도시한다.
도 8은 폴리뉴클레오타이드 합성 워크플로우를 도시한다.
도 9는 컴퓨터 시스템을 도시한다.
도 10은 컴퓨터 시스템의 아키텍처를 예시하는 블록도를 도시한다.
도 11은 복수의 컴퓨터 시스템, 복수의 휴대폰 및 개인 데이터 단말기, 및 네트워크 연결 저장장치(Network Attached Storage, NAS)를 통합하도록 구성된 네트워크를 도시한다.
도 12는 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템을 도시한다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이들 발명의 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 수치 특징은 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의성 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며 어떤 구현예의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 상기 범위 내의 개별 수치를 하한의 10분의 1까지 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위뿐만 아니라 상기 범위 내의 개별 값, 예를 들어, 1.1, 2, 2.3, 5, 및 5.9를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 이들 개재 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 명시적으로 배제된 한계에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 상기 포함된 범위 중 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 임의의 구현예를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 본 명세서에서 사용될 때 언급된 특징, 물품, 단계, 동작, 요소, 및/또는 구성요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 물품, 단계, 동작, 요소, 구성요소, 및/또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다는 것이 추가적으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 열거된 항목의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
문맥으로부터 명시적으로 언급되지 않거나 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 숫자 또는 숫자의 범위와 관련하여 용어 "약"은 언급된 숫자 및 숫자들의 +/- 10%, 또는 범위에 대해 열거된 값에 대한 열거된 하한보다 10% 낮고 열거된 상한보다 10% 높은 것을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미리 선택된 서열", "미리 정의된 서열" 또는 "미리 결정된 서열"은 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 중합체의 합성 또는 어셈블리 전에 중합체의 서열이 공지되고 선택되는 것을 의미한다. 특히, 본 발명의 다양한 양태는 핵산 분자의 제조와 관련하여 본원에 주로 기재되며, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열은 핵산 분자의 합성 또는 어셈블리 전에 공지되고 선택된다.
합성(즉, 드 노보 합성되거나 화학적으로 합성된) 폴리뉴클레오타이드의 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 용어 올리고뉴클레오타이드, 올리고, 및 폴리뉴클레오타이드는 전반에 걸쳐 동의어인 것으로 정의된다. 본원에 기재된 합성된 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 단편을 총괄적으로 코딩하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 코딩 또는 비코딩 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 복수의 cDNA 서열을 코딩한다. cDNA 서열이 기반으로 하는 참조 유전자 서열은 인트론을 함유할 수 있는 반면, cDNA 서열은 인트론을 배제한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 유기체로부터의 유전자 또는 유전자 단편을 코딩할 수 있다. 예시적인 유기체는, 비제한적으로, 원핵생물(예컨대, 박테리아) 및 진핵생물(예컨대, 마우스, 토끼, 인간, 및 비인간 영장류)을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 각각은 다수의 엑손에 대한 서열을 코딩한다. 본원에 기재된 라이브러리 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 서열, 즉, 동일하지 않은 서열을 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 라이브러리 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드는 라이브러리 내의 또 다른 폴리뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 적어도 하나의 부분을 포함한다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열은 달리 언급되지 않는 한 DNA 또는 RNA를 포함한다. 합성(즉, 드 노보 합성된) 유전자의 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 합성 유전자를 포함하는 라이브러리는, 2개 이상의 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 조합("스티칭(stitching)")하여 더 큰 DNA 단위(즉, 샤시(chassis))를 생성하는, PCA, 비-PCA 유전자 어셈블리 방법 또는 계층적 유전자 어셈블리와 같은 본원의 다른 곳에 더 상세히 기재된 다양한 방법에 의해 구축될 수 있다. 큰 작제물의 라이브러리는 적어도 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500 kb 이상의 길이인 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 큰 작제물은 약 5000, 10000, 20000 또는 50000개의 염기쌍의 독립적으로 선택된 상한에 의해 제한될 수 있다. 많은 폴리펩타이드-세그먼트 코딩 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 비리보솜 펩타이드(NRP)를 코딩하는 서열, 비리보솜 펩타이드-합성효소(NRPS) 모듈 및 합성 변이체, 항체와 같은 다른 모듈 단백질의 폴리펩타이드 세그먼트, 비코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 다른 단백질 패밀리로부터의 폴리펩타이드 세그먼트를 코딩하는 서열, 예컨대 조절 서열, 예컨대 프로모터, 전사 인자, 인핸서, siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 마이크로RNA로부터 유래된 작은 핵소체(small nucleolar) RNA, 또는 관심있는 임의의 기능적 또는 구조적 DNA 또는 RNA 단위의 합성. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 유전자간(intergenic) DNA, 연결 분석으로부터 정의된 좌위, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 작은 핵소체 RNA, 리보자임, 일반적으로 메신저 RNA(mRNA)의 역전사에 의해 또는 증폭에 의해 수득된, mRNA의 DNA의 표현인 상보적 DNA(cDNA); 합성적으로 또는 증폭에 의해 생산된 DNA 분자, 게놈 DNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 본원에 지칭된 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 cDNA는 상응하는 게놈 서열에서 발견된 개재 인트론 서열이 없는 엑손 서열(들)을 코딩하는 적어도 하나의 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, cDNA에 대한 상응하는 게놈 서열은 처음에 인트론 서열이 결여될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치
상 변화(phase change) 과정에 기초하여 어드레서블 위치에서 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 합성하기 위한 공정 및 장치가 본원에 제공된다. 선택성은 활성 폴리뉴클레오타이드 합성 표면 상에서의 합성을 블로킹함으로써, 반응 웰에서 액체 용매와 같은 반응 용매 상을 주변 용매에서의 시약에의 노출을 제한하는 고체 또는 기체와 같은 비반응성 상으로 전환시킴으로써 달성된다. 반응 웰에서의 가열 또는 냉각은 폴리뉴클레오타이드 합성 표면에 노출된 용매의 물리적 상태의 변화를 제공한다. 반복적인 합성 프로토콜 동안, 로컬 어드레서블 히터(예를 들어, 하나 이상의 전극 또는 가열 요소를 포함하는 가열 유닛)를 포함하는 나노구조물과 같은 구조물은 용매를 용융 또는 비등시켜, 뉴클레오사이드 커플링 및 연장 반응과 같은 하류 상호작용을 위해 합성 표면 상의 정의된 위치에서 접근성을 제공하는데 사용된다.
폴리뉴클레오타이드 합성 또는 연장을 위한 복수의 특징부(좌위)를 갖는 표면을 갖는 구조물이 본원에 제공된다. 일부 경우에 구조물 상의 각각의 특징부는 특징부의 영역에서 주변 용매의 상을 제어하기 위한 나노구조물과 같은 하나 이상의 더 작은 구조물을 포함한다. 구조물(101)의 일부에서의 각각의 특징부는 실질적으로 평면인 특징부(103), 웰(105), 또는 채널을 포함할 수 있다. 도 1을 참고한다. 하나의 경우에서, 구조물의 각각의 특징부는 약 10 nm 내지 약 10 μm의 폭 및 약 10 nm 내지 약 10 μm의 각각의 특징부의 중심 사이의 거리를 갖는다. 특징부의 단면 형상은, 비제한적으로, 원형, 직사각형, 삼각형 또는 다각형을 포함할 수 있다. 특징부의 형상은 테이퍼형(tapered), 원형, 웰, 채널, 와이어, 로드, 폴(pole), 원뿔, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 연장을 위해 좌위의 클러스터 상에서 합성되고, 방출된 후, 증폭 반응, 예컨대, PCR에 적용된다. 클러스터로부터 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 예시적인 워크플로우가 도 2에 도시되어 있다. 규소 플레이트(201)는 다수의 클러스터(203)를 포함한다. 각각의 클러스터 내에는 다수의 좌위(221)가 있다. 폴리뉴클레오타이드는 클러스터(203)로부터 플레이트(201) 상에서 드 노보 합성된다(207). 폴리뉴클레오타이드는 절단되고(211) 플레이트로부터 제거되어(213) 방출된 폴리뉴클레오타이드의 집단(215)을 형성한다. 이후, 방출된 폴리뉴클레오타이드의 집단(215)은 증폭되어(217) 증폭된 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리(219)를 형성한다.
제1 구조물에서, 고체-액체 상 제어를 위한 가열된 나노웰은 폴리뉴클레오타이드 합성을 제공한다. 도 3a 및 도 3b, 장치(300)를 참고한다. 구조물(301)의 일부에서의 각각의 특징부는 실질적으로 평면인 특징부(303)(예컨대, 평평한), 웰(305), 또는 채널일 수 있다. 일부 경우에, 실질적으로 평면인 특징부(303)는 제1 물질(307), 제2 물질(309), 제3 물질(311) 및 제4 물질(313)을 포함하고, 제3 물질(311)은 제1 물질(307) 및 제2 물질(309)의 제1 부분을 덮으며, 제4 물질(313)은 제1 물질(307) 및 제2 물질(309)의 제2 부분을 덮는다. 제1(307), 제2(309), 제3(311), 및 제4(313) 물질은 도체, 반도체, 또는 절연체를 포함한다. 일부 경우에, 제1 물질(307)은 규소와 같은 반도체 물질을 포함한다. 일부 경우에, 제2 물질(309)은 하부 어드레서블 전극의 2개 이상의 열(column)을 형성한다. 일부 경우에, 제2 물질(309)은 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 제2 물질(309)은 텅스텐을 포함한다. 일부 경우에, 제3 물질(311)은 이산화규소와 같은 절연체를 포함한다. 일부 경우에, 제4 물질(313)은 상부 어드레서블 전극의 2개의 이상의 행(row)을 형성한다. 일부 경우에, 제4 물질(313)은 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 제3 물질(311)은 질화티타늄을 포함한다. 사양과 일관되게 다른 금속, 반도체, 및 절연체가 사용된다.
일부 경우에, 하부 어드레서블 전극(309)의 하나 이상의 열, 및 상부 어드레서블 전극(313)의 하나 이상의 행에 전류를 동시에 인가하는 것은 하나 이상의 하부 전극(309)의 상응하는 열, 및 하나 이상의 상부 전극(313)의 상응하는 행의 교차점과 관련된 하나 이상의 웰(305)을 가열한다. 일부 양태에서, 제1 물질(307) 및 하부 전극(309)은 합성 표면(302)으로부터 냉각 요소(또는 냉각 유닛, 또는 콜드 척(cold chuck))로 열을 전도하는 역할을 한다. 일부 경우에, 늘어선 웰(305)은 히터로서 작용하고 뉴클레오타이드 결합 화학의 증착에 대해 선택적이다. 일부 경우에, SiO2와 같은 절연체는 웰(305) 및 장치(300)의 상부 표면을 열적으로 분리하는데 사용된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 선택적 합성을 위한 장치는 하나 이상의 어드레서블 전극으로 구성된 하나 이상의 가열 요소를 포함한다.
제2 구조물에서, 액체-기체 상 제어를 위한 가열된 나노웰은 폴리뉴클레오타이드 합성을 제공한다. 도 4a를 참고한다. 장치(400)의 일부에서의 각각의 특징부는 웰(401), 또는 채널일 수 있다. 일부 경우에, 웰은 실린더 형상이다. 일부 경우에, 장치(400)는 상부 접촉(403), 제1 가열 요소(404), 제1 물질(405), 제2 가열 요소(406), 하부 접촉(408), 및 제2 물질(409)을 포함하고, 상부 접촉(403)은 제1 물질(405)의 제1 부분 및 제1 가열 요소(404)의 제1 부분을 덮으며, 제1 가열 요소(404)는 제2 가열 요소(406)의 제1 부분, 및 제1 물질(405)의 제2 부분을 덮고, 제1 물질(405)은 제2 물질(409)의 제1 부분을 덮으며, 하부 접촉(408)은 제2 가열 요소(406) 및 제2 물질(409) 모두와 접촉한다. 일부 경우에, 상부 접촉(403) 및 하부 접촉은 각각 상부(403) 및 하부(408) 어드레서블 접촉을 형성한다. 일부 경우에, 상부 접촉(403) 및 하부 접촉(408)은 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 제1 물질(405) 및 제2 물질(409)은 이산화규소와 같은 절연 물질을 포함한다. 일부 경우에, 제1 가열 요소(404) 및 제2 가열 요소(406)는 규소와 같은 반도체 물질을 포함한다. 일부 경우에, 반도체 물질은 하나 이상의 도펀트, 예컨대 비제한적으로 인, 안티몬, 비소, 붕소, 알루미늄, 또는 인듐을 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 제1 가열 요소(404) 및 제2 가열 요소(406)는 도체이다.
일부 경우에, 하나 이상의 하부 어드레서블 접촉(408), 및 하나 이상의 상부 어드레서블 접촉(403)에 전류를 동시에 인가하여 전기 경로를 형성하는 것은 각각 제1 가열 요소(404) 및 제2 가열 요소(406)에서와 같이, 상응하는 하나 이상의 하부 접촉(408), 및 상응하는 하나 이상의 상부 접촉(403)의 교차점과 연관된 하나 이상의 웰(401)을 가열한다. 일부 경우에, 장치를 통해 전류를 인가하여 용매(402)를 가열하는 것은 용매 기화를 유발하여 합성 표면(407)과의 용매 접촉을 방지하는 증기 나노버블(417)을 형성하고, 이는 전류 흐름 또는 가열이 중단될 때 붕괴된다. 일부 경우에, 전기 경로는 p-n 접합과 같은 적어도 하나의 반도체 접합을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 접합은 전류 세기를 결정하고, 가열 요소 안정성을 개선한다. 일부 경우에, 제4 물질(406)은 가열 요소를 형성하고, 도핑된 반도체 저항기를 포함한다.
제3 구조물에서, 액체-기체 상 제어를 위한 가열된 나노포스트는 폴리뉴클레오타이드 합성을 제공한다. 도 4b, 장치(410)를 참고한다. 장치(410)의 일부에서의 각각의 특징부는 나노포스트일 수 있다. 일부 경우에, 특징부(410)는 코어 접촉 (412), 제1 물질(413), 표면 접촉(414), 가열 요소(415), 및 제2 물질(416)을 포함하고, 표면 접촉(414)은 제1 물질(413)의 제1 부분을 덮으며, 가열 요소(415)는 제1 물질(413)의 제1 부분 및 표면 접촉(414)의 제1 부분을 덮고, 제2 물질(416)은 코어 접촉(412)의 제1 부분 및 표면 접촉(414)의 제2 부분을 덮는다. 일부 경우에, 장치를 통해 전류를 인가하여 용매(402)를 가열하는 것은 용매 기화를 유발하여 합성 표면(407)과의 용매 접촉을 방지하고 전류 흐름 또는 가열이 중단될 때 붕괴되는 기체 버블(417)을 형성한다. 일부 경우에, 코어 접촉(412), 표면 접촉(414), 및 가열 요소(415)는 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 제1 물질(413) 및 제2 물질(416)은 절연 물질을 포함한다. 일부 경우에, 가열 요소(415)는 반도체 물질을 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 상부 표면 접촉(414) 및 하나 이상의 전도성 코어 접촉(412)에 전류를 동시에 인가하는 것은 하나 이상의 전기 저항기 측벽(가열 요소)(415)을 가열한다. 일부 경우에, 장치를 통해 전류를 인가하여 용매(402)를 가열하는 것은 용매 기화를 유발하여 합성 표면(407)과의 용매 접촉을 방지하고 전류 흐름 또는 가열이 중단될 때 붕괴되는 증기 나노버블(417)을 형성한다.
제4 구조물에서, 액체-기체 상 제어를 위한 가열된 나노로드는 폴리뉴클레오타이드 합성을 제공한다. 도 5, 장치(500)를 참고한다. 장치(500)의 일부에서의 각각의 특징부는, 비제한적으로 나노와이어 또는 탄소 나노튜브를 포함하는 하나 이상의 나노로드(502)를 포함할 수 있다. 도 5에서 폴리뉴클레오타이드 합성 또는 연장의 위치(507)는 단지 예시를 위해 나타나 있으며; 합성 또는 연장은 나노로드(502) 상의 어느 곳에서 일어날 수 있다. 일부 경우에, 장치(500)는 가열 요소(501), 나노로드(502), 상부 접촉(503), 제1 물질(504), 및 하부 접촉(505)으로 구성되고, 상부 접촉(503)은 제1 물질(504)의 제1 부분을 덮으며, 가열 요소(501)는 제1 물질(504)의 제2 부분 및 하부 접촉(505)의 제1 부분을 덮고, 나노로드(502)는 제1 물질(504)의 제3 부분을 덮는다.
일부 경우에, 상부 접촉(503) 및 하부 접촉(505)은 각각 상부(503) 및 하부(505) 어드레서블 접촉을 형성한다. 일부 경우에, 상부 접촉(503) 및 하부 접촉(505)은 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 제1 물질(504)은 절연 물질을 포함한다. 일부 경우에, 가열 요소(501)는 규소와 같은 반도체 물질을 포함한다. 일부 경우에, 반도체 물질은 하나 이상의 도펀트, 예컨대 비제한적으로 인, 안티몬, 비소, 붕소, 알루미늄, 또는 인듐을 포함한다. 일부 경우에, 가열 요소(501)는 금속과 같은 도체를 포함한다.
일부 경우에, 하나 이상의 하부 어드레서블 접촉(505), 및 하나 이상의 상부 어드레서블 접촉(503)에 전류를 동시에 인가하여 가열 요소(501) 및 용매(506)를 통해 전기 경로를 형성하는 것은 하나 이상의 나노로드(502) 또는 나노로드 클러스터를 둘러싸는 영역을 가열한다. 일부 경우에, 장치를 통해 전류를 인가하여 용매(506)를 가열하는 것은 용매 기화를 유발하여 전류 흐름 또는 가열이 중단될 때 붕괴되는 증기 나노버블(517)을 형성한다. 증기 버블(517)은 합성 표면(507)을 용매(506)로부터 분리한다. 일부 경우에, 전기 경로는 가열 요소(501)에서의 p-n 접합과 같은 적어도 하나의 반도체 접합을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 접합은 전류 세기를 결정하고, 가열 요소 안정성을 개선한다. 일부 경우에, 가열 요소(501)는 도핑된 반도체 저항기를 포함한다. 일부 경우에, 나노로드(502)는 뉴클레오타이드 커플링을 위한 증가된 표면적을 제공하여, 더 높은 폴리뉴클레오타이드 수율을 초래한다. 일부 경우에, 나노로드(502) 및 전극의 수 및 규모는 감소될 수 있다.
제5 구조물에서, 접촉 상의 나노로드는 폴리뉴클레오타이드 합성을 제공한다. 도 6, 장치(600)를 참고한다. 장치(600)의 일부에서의 각각의 특징부는, 비제한적으로 나노와이어 또는 탄소 나노튜브를 포함하는 하나 이상의 나노로드(603)일 수 있다. 일부 경우에, 나노로드(603)는 용매(604)와 접촉한다. 도 6에서 폴리뉴클레오타이드 합성 또는 연장의 위치(607)는 단지 예시를 위해 나타나 있으며; 합성 또는 연장은 나노로드(603) 상의 어느 곳에서 일어날 수 있다. 일부 경우에, 실질적으로 평면인 특징부(600)는 하부 접촉(601), 하나 이상의 나노로드(603), 및 제1 물질(602)을 포함하고, 제1 물질(602)은 하부 접촉(601)의 제1 부분을 덮는다. 일부 경우에, 하부 접촉(601)은 하부 어드레서블 접촉을 형성한다. 일부 경우에, 하부 접촉(601)은 금속과 같은 도체를 포함한다. 일부 경우에, 나노로드(603)는 도체 또는 반도체를 포함한다. 일부 경우에, 제1 물질(602)은 절연 물질을 포함한다.
일부 경우에, 나노로드(603)는 전도성 물질을 포함한다. 일부 경우에, 나노로드 특징부(607)는 뉴클레오타이드 커플링을 위한 증가된 표면적을 제공하여, 더 높은 폴리뉴클레오타이드 수율을 초래한다. 일부 경우에, 나노로드 및 접촉의 수 및 크기는, 예를 들어, 하나의 접촉을 갖는 하나의 나노로드로 감소될 수 있다. 일부 경우에, 하부 접촉(601)은 열 접촉이다. 일부 경우에, 하부 접촉(601)의 냉각은 하나 이상의 나노로드(607)를 냉각시키고, 하나 이상의 나노로드(603)를 동결된 용매의 층으로 코팅하여, 합성 표면(607)과의 용매 접촉을 방지한다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 구조물
일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 20 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 폭은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 20 내지 0.05의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 폭은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 1 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 폭은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 0.5 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 폭은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.16, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 또는 20의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 20 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 직경은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 20 내지 0.05의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 직경은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 1 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 직경은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 0.5 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 가지며, 직경은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 웰은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.16, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 또는 20의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 웰을 포함하고, 웰의 높이 또는 깊이는 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 웰의 높이는 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 웰 높이는 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 웰을 포함하고, 웰의 폭은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 웰의 폭은 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 웰 폭은 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 웰을 포함하고, 웰의 직경은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 웰의 직경은 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 웰 직경은 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 스팟 또는 실질적으로 평면인 특징부는 약 50 nm 내지 약 1000 nm, 약 50 nm 내지 약 900 nm, 약 50 nm 내지 약 800 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm의 직경을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 20 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 채널은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 20 내지 0.05의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 폭은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 1 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 폭은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 0.5 내지 0.01의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 폭은 웰의 가장 좁은 세그먼트에서의 폭의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.16, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 또는 20의 폭 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 20 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 직경은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 20 내지 0.05의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 직경은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 1 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 직경은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 0.5 내지 0.01의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖고, 직경은 채널의 가장 좁은 세그먼트에서의 직경의 측정치이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 채널은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.16, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 또는 20의 직경 대 깊이(또는 높이) 비율을 갖는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 채널을 포함하고, 채널의 높이 또는 깊이는 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 채널의 높이는 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 채널 높이는 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 채널을 포함하고, 채널의 폭은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 채널의 폭은 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 채널 폭은 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 복수의 채널을 포함하고, 채널의 직경은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 10 nm 내지 약 1 μm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 700 nm, 약 50 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 채널의 직경은 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 웰 직경은 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 또는 10 μm 초과이다.
일부 경우에, 특징부(예컨대, 실질적으로 평면인 특징부, 웰, 채널, 또는 폴리뉴클레오타이드 합성을 지지하는 다른 특징부)의 폭은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 100 nm 내지 약 10 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 200 μm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어, 약 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm, 또는 10 nm이다. 일부 경우에, 특징부의 폭은 약 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 특징부의 중심 사이의 거리는 약 10 nm 내지 약 10 μm, 20 nm 내지 약 5 μm, 약 50 nm 내지 약 2 nm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 750 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 600 nm, 예를 들어, 약 500 nm이다. 일부 경우에, 특징부의 총 폭은 약 10 nm, 20 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 또는 100 μm이다. 일부 경우에, 특징부의 총 폭은 약 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 또는 50 nm 내지 100 nm이다.
일부 경우에, 구조물(예컨대, 실질적으로 평면인 구조물, 웰, 채널, 나노웰, 나노로드, 나노포스트, 또는 폴리뉴클레오타이드 합성을 지지하는 다른 나노구조물)의 폭은 약 10 nm 내지 약 10 μm, 약 100 nm 내지 약 10 μm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 50 nm 내지 약 200 μm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어, 약 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm, 20 nm, 또는 10 nm이다. 일부 경우에, 구조물의 폭은 약 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 500 nm, 200 nm, 100 nm, 50 nm 또는 10 nm 이하이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 구조물의 중심 사이의 거리는 약 10 nm 내지 약 10 μm, 20 nm 내지 약 5 μm, 약 50 nm 내지 약 2 nm, 약 100 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 1 μm, 약 200 nm 내지 약 750 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 600 nm, 예를 들어, 약 500 nm이다. 일부 경우에, 구조물의 총 폭은 약 10 nm, 20 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 또는 100 μm이다. 일부 경우에, 구조물의 총 폭은 약 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 또는 50 nm 내지 100 nm이다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 표면
일부 경우에, 각각의 특징부는 또 다른 특징부 상에서 성장된 폴리뉴클레오타이드의 집단과 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 집단의 합성을 지지한다. 적어도 10, 100, 256, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000개 이상의 클러스터를 포함하는 표면이 본원에 제공된다. 2,000개 초과; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 5,000,000; 또는 10,000,000개 이상의 구별되는 특징부를 포함하는 표면이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 200, 500개 이상의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 50 내지 500, 50 내지 200, 50 내지 150, 또는 100 내지 150개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 100 내지 150개의 특징부를 포함한다. 예시적인 배열에서, 각각의 클러스터는 109, 121, 130 또는 137개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 특징부 내의 각각의 구조물(예컨대, 나노구조물)은 동일한 특징부 내에서, 또 다른 구조물 상에서 성장된 폴리뉴클레오타이드의 집단과 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 집단의 합성을 지지한다. 일부 경우에 각각 적어도 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100; 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000 또는 200,000개 초과의 구별되는 나노구조물을 포함하는 특징부가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 각각의 특징부는 약 10 내지 약 500, 약 50 내지 약 250, 약 10 내지 약 1000, 또는 약 1 내지 약 50개의 나노구조물을 포함한다.
10 nm 내지 1 μm의 가장 긴 세그먼트에서의 폭을 갖는 특징부가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 특징부는 약 10, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 nm의 가장 긴 세그먼트에서의 폭을 갖는다. 일부 경우에, 특징부는 다수의 세그먼트를 갖는 채널이고, 각각의 세그먼트는 5 내지 50 nm 떨어진 중심간 거리를 갖는다. 일부 경우에, 각각의 세그먼트에 대해 떨어진 중심간 거리는 약 5, 10, 15, 20 또는 25 nm이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물의 표면 상에 합성된 구별되는 폴리뉴클레오타이드의 수는 기판에서 이용가능한 구별되는 특징부의 수에 좌우된다. 일부 경우에, 기판의 클러스터 내의 특징부의 밀도는 mm2 당 적어도 또는 약 1개의 특징부, mm2 당 10개의 특징부, mm2 당 25개의 특징부, mm2 당 50개의 특징부, mm2 당 65개의 특징부, mm2 당 75개의 특징부, mm2 당 100개의 특징부, mm2 당 130개의 특징부, mm2 당 150개의 특징부, mm2 당 175개의 특징부, mm2 당 200개의 특징부, mm2 당 300개의 특징부, mm2 당 400개의 특징부, mm2 당 500개의 특징부, mm2 당 1,000개의 특징부, mm2 당 2,000개의 특징부, mm2 당 5,000개의 특징부, mm2 당 10,000개의 특징부, mm2 당 100,000개의 특징부, mm2 당 1,000,000개의 특징부 또는 mm2 당 1,000,000개 초과의 특징부이다. 일부 경우에, 기판은 mm2 당 약 10개의 특징부 내지 mm2 당 약 500개의 특징부, mm2 당 약 25개의 특징부 내지 mm2 당 약 400개의 특징부, mm2 당 약 50개의 특징부 내지 mm2 당 약 500개의 특징부, mm2 당 약 100개의 특징부 내지 mm2 당 약 500개의 특징부, mm2 당 약 150개의 특징부 내지 mm2 당 약 500개의 특징부, mm2 당 약 10개의 특징부 내지 mm2 당 약 250개의 특징부, mm2 당 약 50개의 특징부 내지 mm2 당 약 250개의 특징부, mm2 당 약 10개의 특징부 내지 mm2 당 약 200개의 특징부, 또는 mm2 당 약 50개의 특징부 내지 mm2 당 약 200개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 기판의 클러스터 내의 특징부의 밀도는 μm2 당 적어도 또는 약 1개의 특징부, μm2 당 10개의 특징부, μm2 당 25개의 특징부, μm2 당 50개의 특징부, μm2 당 65개의 특징부, μm2 당 75개의 특징부, μm2 당 100개의 특징부, μm2 당 130개의 특징부, μm2 당 150개의 특징부, μm2 당 175개의 특징부, μm2 당 200개의 특징부, μm2 당 300개의 특징부, μm2 당 400개의 특징부, μm2 당 500개의 특징부, μm2 당 1,000개의 특징부, μm2 당 2,000개의 특징부, μm2 당 5,000개의 특징부, μm2 당 10,000개의 특징부, μm2 당 100,000개의 특징부, μm2 당 1,000,000개의 특징부 또는 μm2 당 1,000,000개 초과의 특징부이다. 일부 경우에, 기판은 μm2 당 약 10개의 특징부 내지 μm2 당 약 500개의 특징부, μm2 당 약 25개의 특징부 내지 μm2 당 약 400개의 특징부, μm2 당 약 50개의 특징부 내지 μm2 당 약 500개의 특징부, μm2 당 약 100개의 특징부 내지 μm2 당 약 500개의 특징부, μm2 당 약 150개의 특징부 내지 μm2 당 약 500개의 특징부, μm2 당 약 10개의 특징부 내지 μm2 당 약 250개의 특징부, μm2 당 약 50개의 특징부 내지 μm2 당 약 250개의 특징부, μm2 당 약 10개의 특징부 내지 μm2 당 약 200개의 특징부, 또는 μm2 당 약 50개의 특징부 내지 μm2 당 약 200개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 클러스터 내의 2개의 인접한 특징부의 중심 사이의 거리는 약 10 μm 내지 약 500 μm, 약 10 μm 내지 약 200 μm, 또는 약 10 μm 내지 약 100 μm이다. 일부 경우에, 인접한 특징부의 2개의 중심 사이의 거리는 약 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm 또는 100 μm 초과이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 특징부의 중심 사이의 거리는 약 200 μm, 150 μm, 100 μm, 80 μm, 70 μm, 60 μm, 50 μm, 40 μm, 30 μm, 20 μm 또는 10 μm 미만이다. 일부 경우에, 클러스터 내의 2개의 인접한 특징부의 중심 사이의 거리는 약 10 nm 내지 약 1000 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 10 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm이다. 일부 경우에, 인접한 특징부의 2개의 중심 사이의 거리는 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm 또는 100 nm 초과이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 특징부의 중심 사이의 거리는 약 500 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm 또는 10 nm 미만이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물의 각각의 제곱 미터는 적어도 약 107, 108, 109, 1010, 1011 , 또는 적어도 약 1012개의 특징부를 허용하며, 각각의 특징부는 하나의 폴리뉴클레오타이드를 지지한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물의 각각의 제곱 미터는 적어도 약 107, 108, 109, 1010, 1011 , 또는 적어도 약 1012개의 특징부를 허용하며, 각각의 특징부는 복수의 상이한 폴리뉴클레오타이드를 지지한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물의 약 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 m2 미만 상에 109개의 폴리뉴클레오타이드가 지지된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 2,000개 초과; 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000; 100,000,000개 이상의 동일하지 않은 폴리뉴클레오타이드의 합성을 위한 지지체를 제공한다. 일부 경우에, 구조물은 구별되는 서열을 코딩하는 2,000개 초과; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000; 100,000,000개 이상의 폴리뉴클레오타이드의 합성을 위한 지지체를 제공한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부는 동일한 서열을 갖거나 동일한 서열을 이용하여 합성되도록 구성된다. 일부 경우에, 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 1,000, 2,000개의 염기 또는 2,000개 초과의 염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 성장을 위한 표면 환경을 제공한다. 일부 경우에, 구조물은 50 내지 2,000개의 염기, 50 내지 1,000, 50 내지 500, 50 내지 250, 또는 100 내지 1,000, 100 내지 500, 또는 100 내지 300개의 염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 성장을 위한 표면 환경을 제공한다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 구조물의 구별되는 특징부 상에서 합성되고, 각각의 특징부는 폴리뉴클레오타이드의 집단의 합성을 지지한다. 일부 경우에, 각각의 특징부는 또 다른 좌위 상에서 성장된 폴리뉴클레오타이드의 집단과 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 집단의 합성을 지지한다. 일부 경우에, 구조물의 특징부는 복수의 클러스터 내에 위치한다. 일부 경우에, 구조물은 적어도 10, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000개 이상의 클러스터를 포함한다. 일부 경우에, 구조물은 2,000개 초과; 5,000; 10,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,100,000; 1,200,000; 1,300,000; 1,400,000; 1,500,000; 1,600,000; 1,700,000; 1,800,000; 1,900,000; 2,000,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 또는 10,000,000개 이상의 구별되는 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150개 이상의 특징부(좌위)를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 50 내지 500, 100 내지 150, 또는 100 내지 200개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 109, 121, 130 또는 137개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 특징부를 포함한다. 일부 경우에, 하나의 클러스터 내의 구별되는 특징부로부터의 폴리뉴클레오타이드는 조립될 때 미리 결정된 서열의 인접한 더 긴 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 서열을 갖는다.
구조물 크기
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 약 표준 96 웰 플레이트의 크기, 예를 들어 약 100 내지 200 mm 대 약 50 내지 150 mm이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 약 1000 mm, 500 mm, 450 mm, 400 mm, 300 mm, 250 nm, 200 mm, 150 mm, 100 mm 또는 50 mm 이하의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 기판의 직경은 약 25 mm 내지 1000 mm, 약 25 mm 내지 약 800 mm, 약 25 mm 내지 약 600 mm, 약 25 mm 내지 약 500 mm, 약 25 mm 내지 약 400 mm, 약 25 mm 내지 약 300 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 200이다. 기판 크기의 비제한적인 예는 약 300 mm, 200 mm, 150 mm, 130 mm, 100 mm, 76 mm, 51 mm 및 25 mm를 포함한다. 일부 경우에, 기판은 적어도 약 100 mm2; 200 mm2; 500 mm2; 1,000 mm2; 2,000 mm2; 5,000 mm2; 10,000 mm2; 12,000 mm2; 15,000 mm2; 20,000 mm2; 30,000 mm2; 40,000 mm2; 50,000 mm2 이상의 평면 표면적을 갖는다. 일부 경우에, 기판은 약 50 mm 내지 약 2000 mm, 약 50 mm 내지 약 1000 mm, 약 100 mm 내지 약 1000 mm, 약 200 mm 내지 약 1000 mm, 또는 약 250 mm 내지 약 1000 mm의 두께를 갖는다. 두께의 비제한적인 예는 275 mm, 375 mm, 525 mm, 625 mm, 675 mm, 725 mm, 775 mm 및 925 mm를 포함한다. 일부 경우에, 기판의 두께는 직경에 따라 달라지며 기판의 조성에 좌우된다. 예를 들어, 규소 이외의 물질을 포함하는 구조물은 동일한 직경의 규소 구조물과 상이한 두께를 가질 수 있다. 구조물 두께는 사용된 물질의 기계적 강도에 의해 결정될 수 있으며, 구조물은 취급 동안 균열 없이 자체 중량을 지지할 수 있을 정도로 두꺼워야 한다. 일부 경우에, 구조물은 임의의 한 치수가 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 30, 40, 50 피트 초과이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은, 예를 들어 약 10 내지 200 nm 대 약 10 내지 150 nm의 나노구조물을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 약 1000 nm, 500 nm, 450 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm 또는 50 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 구조물의 직경은 약 10 nm 내지 1000 nm, 약 10 nm 내지 약 800 nm, 약 10 nm 내지 약 600 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 10 mm 내지 약 200 nm이다. 구조물 크기의 비제한적인 예는 약 300 nm, 200 nm, 150 nm, 130 nm, 100 nm, 76 nm, 51 nm 25 nm, 및 10 nm를 포함한다. 일부 경우에, 구조물은 적어도 약 100 nm2; 200 nm2; 500 nm2; 1,000 nm2; 2,000 nm2; 5,000 nm2; 10,000 nm2; 12,000 nm2; 15,000 nm2; 20,000 nm2; 30,000 nm2; 40,000 nm2; 50,000 nm2 이상의 평면 표면적을 갖는다. 일부 경우에, 구조물은 약 10 nm 내지 약 2000 nm, 약 50 nm 내지 약 1000 mm, 약 100 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 또는 약 250 nm 내지 약 1000 nm의 두께를 갖는다. 두께의 비제한적인 예는 50 nm, 100 nm, 275 nm, 375 nm 525 nm, 625 nm, 675 nm, 725 nm, 775 nm 및 925 nm를 포함한다.
물질
표면을 포함하는 장치로서, 표면은 미리 결정된 위치에서 그리고 결과적인 낮은 오류율, 낮은 탈락률(dropout rate), 높은 수율, 및 높은 올리고 표현으로 폴리뉴클레오타이드 합성을 지지하도록 변형된 것인 장치가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치의 표면은 드 노보 폴리뉴클레오타이드 합성 반응을 지지하기 위해 변형될 수 있는 다양한 물질로부터 제조된다. 일부 경우에, 장치는 충분히 전도성이며, 예컨대 장치의 전체 또는 일부에 걸쳐 균일한 전기장을 형성할 수 있다. 본원에 기재된 장치는 가요성 물질을 포함할 수 있다. 예시적인 가요성 물질은, 비제한적으로, 변형된 나일론, 비변형된 나일론, 니트로셀룰로오스, 및 폴리프로필렌을 포함한다. 본원에 기재된 장치는 강성 물질을 포함할 수 있다. 예시적인 강성 물질은, 비제한적으로, 유리, 퓨즈 실리카(fuse silica), 규소, 이산화규소, 질화규소, 질화금속, 규화금속(metal silicide), 탄화금속(metal carbide), 산화금속, 플라스틱(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 및 이의 블렌드), 및 금속(예를 들어, 금, 백금)을 포함한다. 일부 경우에, 금속 산화물은 TiO2, Ta2O5, Nb2O5, Al2O3, BaO, Y2O3, HfO2, SrO 또는 당업계에 공지된 다른 산화금속을 포함한다. 일부 경우에, 탄화금속은 TiC, WC, ThC2, ThC, VC, W2C, ZrC, HfC, NbC, TaC, Ta2C, 또는 당업계에 공지된 다른 탄화금속을 포함한다. 일부 경우에, 질화금속은 GaN, InN, BN, Be3N2, Cr2N, MoN, Si3N4, TaN, Th2N2, VN, ZrN, TiN, HfN, NbC, WN, TaN, 또는 당업계에 공지된 다른 질화금속을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치는 규소, 폴리스티렌, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 유리, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 물질로부터 제조된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 장치는 본원에 열거된 물질 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 물질의 조합으로 제조된다.
본원에 기재된 예시적인 물질의 인장 강도의 목록은 다음과 같이 제공된다: 나일론(70 MPa), 니트로셀룰로오스(1.5 MPa), 폴리프로필렌(40 MPa), 규소(268 MPa), 폴리스티렌(40 MPa), 아가로스(1-10 MPa), 폴리아크릴아미드(1-10 MPa), 폴리디메틸실록산(PDMS)(3.9-10.8 MPa). 본원에 기재된 고체 지지체는 1 내지 300, 1 내지 40, 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 3 내지 11 MPa의 인장 강도를 가질 수 있다. 본원에 기재된 고체 지지체는 약 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 20, 25, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 270 MPa 이상의 인장 강도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 장치는 연속 루프 또는 릴, 예컨대 테이프 또는 가요성 시트에 저장될 수 있는 가요성 물질의 형태인 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 고체 지지체를 포함한다.
영률(Young's modulus)은 하중 하의 탄성(복구가능한) 변형에 대한 물질의 내성을 측정한다. 본원에 기재된 예시적인 물질의 강성에 대한 영률의 목록은 다음과 같이 제공된다: 나일론(3 GPa), 니트로셀룰로오스(1.5 GPa), 폴리프로필렌(2 GPa), 규소(150 GPa), 폴리스티렌(3 GPa), 아가로스(1-10 GPa), 폴리아크릴아미드(1-10 GPa), 폴리디메틸실록산(PDMS)(1-10 GPa). 본원에 기재된 고체 지지체는 1 내지 500, 1 내지 40, 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 3 내지 11 GPa의 영률을 가질 수 있다. 본원에 기재된 고체 지지체는 약 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 20, 25, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 GPa 이상의 영률을 가질 수 있다. 가요성 및 강성 사이의 관계는 서로 반비례하기 때문에, 가요성 물질은 낮은 영률을 갖고 하중 하에 그의 형상을 크게 변화시킨다.
일부 경우에, 본원에 개시된 장치는 이산화규소 베이스 및 산화규소의 표면층을 포함한다. 대안적으로, 장치는 산화규소의 베이스를 가질 수 있다. 본원에 제공된 장치의 표면은 질감이 있어, 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 전체 표면적을 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 장치는 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 규소를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 장치는 절연체상 규소(SOI) 웨이퍼로부터 제조될 수 있다.
임의의 하나 이상의 다양한 물질로부터 제조된 구조물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치가 본원에 제공된다. 특정 경우에, 기판/ 고체 지지체가 포함하는 물질은 낮은 수준의 폴리뉴클레오타이드 결합을 나타내도록 제조된다. 일부 경우에, 가시광선 및/또는 UV 광에 투명한 물질이 사용될 수 있다. 충분히 전도성인 물질(도체), 예컨대 본원에 기재된 기판/고체 지지체의 전체 또는 일부에 균일한 전기장을 형성할 수 있는 물질이 이용될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 물질은 전기 접지에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 기판 또는 고체 지지체는 열 전도성이거나 절연성일 수 있다. 물질은 일련의 폴리뉴클레오타이드 합성 반응과 같은 화학적 또는 생화학적 반응을 지지하기 위해 화학적 내성이고 열 내성일 수 있다.
일부 경우에, 전도성 또는 반전도성 물질(반도체)은 비제한적으로 티타늄 질화규소, 질화티타늄, 질화텅스텐, 질화탄탈륨, 탄탈륨 질화규소, 티타늄, 규화백금, 또는 다른 전도성 물질 중 하나 이상을 포함한다. 예에서, 물질은 비제한적으로 알루미늄 탄화물, 탄화물, 질화물, 산화물, 규화물, 규소 질화물, 인화물, 또는 전도성 물질의 구성요소로서 사용되는 다른 비금속 또는 메탈로이드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 예시적인 물질은 (비제한적으로) 텅스텐, 코발트, 이리듐, 몰리브덴, 니켈, 백금, 레늄, 루테늄, 탄탈륨, 티타늄, 또는 전도성 물질의 구성요소로서 사용되는 다른 금속의 요소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 물질은 금속, 비금속, 또는 메탈로이드의 혼합물을 포함한다. 일부 경우에, 도펀트가 반전도체 물질에 첨가된다. 도펀트는 비제한적으로 인, 안티몬, 비소, 붕소, 알루미늄, 인듐, 또는 사양과 일관되는 다른 요소를 포함한다. 나노로드, 나노와이어, 또는 나노튜브와 같은 나노구조물의 경우, 관심있는 물질은 도체, 반도체, 또는 절연체를 포함한다. 이것은 비제한적으로 금속성 요소(예를 들어, 니켈, 구리, 은, 금, 백금), 반도체 물질(예를 들어, 규소, 산화아연, 게르마늄, 인화갈륨, 질화인듐), 또는 절연 물질(예를 들어, 이산화규소, 또는 이산화티타늄)을 포함한다. 도체, 반도체, 또는 절연체는 본원에 열거된 물질의 조합 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 물질을 이용하여 제조될 수 있다.
강성 물질의 경우, 관심있는 특정 물질은 유리; 퓨즈드 실리카; 규소, 플라스틱(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 및 이의 블렌드 등); 금속(예를 들어, 금, 백금 등)을 포함한다. 구조물은 규소, 폴리스티렌, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택된 물질로부터 제조될 수 있다. 기판/고체 지지체, 마이크로구조물, 반응기, 또는 그 안의 다른 폴리뉴클레오타이드 합성 구조물은 본원에 열거된 물질 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 물질의 조합으로 제조될 수 있다.
본원에 기재된 구조물을 위한 예시적인 가요성 물질은, 비제한적으로, 나일론(비변형된 나일론, 변형된 나일론, 투명 나일론), 니트로셀룰로오스, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 아세탈, 아크릴, 아크릴로니트릴, 부타디엔 스티렌(ABS), 폴리에스테르 필름, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트 또는 다른 아크릴, 폴리염화비닐 또는 다른 비닐 수지, 투명 PVC 호일, 프린터용 투명 호일, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 메타크릴레이트 공중합체, 스티렌 중합체, 고굴절률 중합체, 불소 함유 중합체, 폴리에테르설폰, 지환족 구조물을 함유하는 폴리이미드, 고무, 직물, 금속 호일, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 선택된 가요성 특징을 달성하기 위해 다양한 가소제 및 변형제가 중합체성 기판 물질과 함께 사용될 수 있다.
본원에 기재된 가요성 구조물은 플라스틱 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 구조물은 열가소성 물질을 포함한다. 열가소성 물질의 비제한적인 예는 아크릴, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 나일론, 폴리락트산, 폴리벤즈이미다졸, 폴리카르보네이트, 폴리에테르 설폰, 폴리에테르에테르 케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에틸렌, 산화 폴리페닐렌, 황화 폴리페닐렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함한다. 일부 경우에, 기판은 폴리아릴에테르케톤(PEAK) 패밀리 내의 열가소성 물질을 포함한다. PEAK 열가소성 물질의 비제한적인 예는 폴리에테르케톤(PEK), 폴리에테르케톤케톤(PEKK), 폴리(에테르 에테르 케톤 케톤)(PEEKK), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 및 폴리에테르케톤에테르케톤케톤(PEKEKK)을 포함한다. 일부 경우에, 구조물은 톨루엔과 호환성인 열가소성 물질을 포함한다. 일부 경우에, 플라스틱 물질의 가요성은 가소제의 첨가에 의해 증가된다. 가소제의 예는 에스테르계 가소제, 예컨대 프탈레이트이다. 프탈레이트 가소제는 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP), 디이소노닐 프탈레이트(DINP), 디-n-부틸 프탈레이트(DnBP, DBP), 부틸 벤질 프탈레이트(BBzP), 디이소데실 프탈레이트(DIDP), 디옥틸 프탈레이트(DOP, DnOP), 디이소옥틸 프탈레이트(DIOP), 디에틸 프탈레이트(DEP), 디이소부틸 프탈레이트(DIBP), 및 디-n-헥실 프탈레이트를 포함한다. 일부 경우에, 공중합을 통한 열가소성 중합체의 변형 또는 중합 전에 단량체에 비반응성 측쇄를 첨가하는 것을 통한 열가소성 중합체의 변형은 또한 가요성을 증가시킨다.
플루오로엘라스토머를 추가로 포함할 수 있는 가요성 구조물이 본원에 제공된다. 약 80% 플루오로엘라스토머를 갖는 물질은 FKM으로 지정된다. 플루오로엘라스토머는 퍼플루오로-엘라스토머(FFKM) 및 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 고무(FEPM)를 포함한다. 플루오로엘라스토머는 5개의 공지된 유형을 갖는다. 유형 1 FKM은 비닐리덴 플루오라이드(VDF) 및 헥사플루오로프로필렌(HFP)으로 구성되고, 이들의 불소 함량은 전형적으로 약 66 중량%이다. 유형 2 FKM은 VDF, HFP, 및 테트라플루오로에틸렌(TFE)으로 구성되고, 전형적으로 약 68% 내지 69%의 불소를 갖는다. 유형 3 FKM은 VDF, TFE, 및 퍼플루오로메틸비닐에테르(PMVE)으로 구성되고, 전형적으로 약 62% 내지 68%의 불소를 갖는다. 유형 4 FKM은 프로필렌, TFE, 및 VDF로 구성되고, 전형적으로 약 67%의 불소를 갖는다. 유형 5 FKM은 VDF, HFP, TFE, PMVE, 및 에틸렌으로 구성된다.
일부 경우에, 본원에 개시된 기판은 컴퓨터 판독가능한 물질을 포함한다. 컴퓨터 판독가능한 물질은, 비제한적으로, 자기 매체, 릴-투-릴 테이프, 카트리지 테이프, 카세트 테이프, 가요성 디스크, 종이 매체, 필름, 마이크로피시(microfiche), 연속 테이프(예컨대, 벨트) 및 전자 설명서를 저장하기에 적합한 임의의 매체를 포함한다. 일부 경우에, 기판은 자기 릴-투-릴 테이프 또는 자기 벨트를 포함한다. 일부 경우에, 기판은 가요성 인쇄 회로 보드를 포함한다.
본원에 기재된 구조물은 가시광선 및/또는 UV 광에 투명할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 구조물의 전부 또는 일부에 균일한 전기장을 형성하기 위해 충분히 전도성이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 구조물은 열 전도성이거나 절연성이다. 일부 경우에, 구조물은 폴리뉴클레오타이드 합성 반응과 같은 화학적 반응을 지지하기 위해 화학적 내성 및 열 내성이다. 일부 경우에, 기판은 자성이다. 일부 경우에, 구조물은 금속 또는 금속 합금을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 구조물은 임의의 치수가 1, 2, 5, 10, 30, 50 피트 이상의 길이일 수 있다. 가요성 구조물의 경우, 가요성 구조물은 선택적으로 권취된 상태, 예컨대, 릴로 저장된다. 예컨대 1 피트 길이를 초과하는 큰 구조물의 경우, 구조물은 수직 또는 수평으로 저장될 수 있다.
물질 증착 시스템
본원에 기재된 구조물 상에 생체분자를 증착 및 저장하기 위한 시스템 및 장치가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 생체분자는 코딩된 정보를 그들의 서열에 저장하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 시스템은 생체분자 부착을 지지하기 위한 구조물의 표면 및/또는 기판의 표면에 생체분자 적용하기 위한 장치를 포함한다. 일 예에서, 생체분자 적용을 위한 장치는 폴리뉴클레오타이드 합성 장치이다. 일부 경우에, 시스템은 기판을 유체, 예를 들어, 플로우 셀(flow cell)로 처리하기 위한 장치를 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 적용 장치 및 처리 장치 사이에서 기판을 이동시키기 위한 장치를 포함한다. 기판이 릴-투-릴 테이프인 경우, 시스템은 상이한 시간에 적용 및 선택적인 처리 장치에 기판의 상이한 부분의 액세스를 허용하는 2개 이상의 릴을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 폴리뉴클레오타이드 물질 증착 시스템의 첫 번째 예가 도 7에 나타나 있다. 시스템은 기판의 위치와 정렬되도록 X-Y 방향으로 이동하는 물질 증착 장치를 포함한다. 물질 증착 장치는 또한 Z 방향으로 이동하여 기판으로 밀봉하여 분해된 반응기를 형성할 수 있다. 분해된 반응기는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 시약을 포함하는 유체를 기판으로부터 캡핑 요소로 및/또는 그 반대로 전달하도록 구성된다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 유체는 기판 및 캡핑 요소 중 하나 또는 둘 모두를 통과할 수 있으며, 비제한적으로, 커플링 시약, 캡핑 시약, 산화제, 탈블로킹제, 아세토니트릴 및 질소 기체를 포함한다. 고해상도 액적 증착이 가능한 장치의 예는 잉크젯 프린터 및 레이저 프린터의 프린트헤드를 포함한다. 본원에 기재된 시스템 및 방법에 유용한 장치는 약 100 도트 퍼 인치(DPI) 내지 약 50,000 DPI; 약 100 DPI 내지 약 20,000 DPI; 약 100 DPI 내지 약 10,000 DPI; 약 100 DPI 내지 약 5,000 DPI; 약 1,000 DPI 내지 약 20,000 DPI; 또는 약 1,000 DPI 내지 약 10,000 DPI의 해상도를 달성한다. 일부 경우에, 장치는 적어도 약 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 10,000; 12,000 DPI, 또는 20,000 DPI의 해상도를 갖는다. 장치에 의해 수행되는 고해상도 증착은 기판의 특징부에 상응하는 각 노즐의 수 및 밀도와 관련된다.
폴리뉴클레오타이드 합성 장치를 사용하여 기판 상에 폴리뉴클레오타이드를 드 노보 합성하기 위한 예시적인 공정 워크플로우가 도 8에 나타나 있다. 폴리뉴클레오타이드 합성 시약을 포함하는 액적은 단계적인 방식으로 물질 증착 장치로부터 기판으로 방출되며, 물질 증착 장치는 액적을 방출하기 위해 전기적 신호를 기계적 신호로 변환하는 피에조(piezo) 세라믹 물질 및 전극을 갖는다. 액적은 데이터를 코딩하는 미리 결정된 서열을 갖는 복수의 합성된 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 한 번에 하나의 핵염기로 기판의 표면 상의 특정 위치에 방출된다. 일부 경우에, 합성된 폴리뉴클레오타이드는 기판 상에 저장된다. 핵산 시약은 비연속적, 또는 드롭 온 디맨드(drop-on-demand) 방법으로 기판 표면에 증착될 수 있다. 이러한 방법의 예는 전기기계적 전달 방법, 전기 열적 전달 방법, 및 정전기적 인력 방법을 포함한다. 전기기계적 전달 방법에서는, 전기 펄스에 의해 변형된 압전(piezoelectric) 요소가 액적을 방출시킨다. 전기 열적 전달 방법에서는, 장치의 챔버에서 버블이 생성되고, 버블의 팽창력이 액적을 방출시킨다. 정전기적 인력 방법에서는, 정전기적 인력이 액적을 기판 상에 방출하는데 사용된다. 일부 경우에, 드롭 주파수(drop frequency)는 약 5 KHz 내지 약 500 KHz; 약 5 KHz 내지 약 100 KHz; 약 10 KHz 내지 약 500 KHz; 약 10 KHz 내지 약 100 KHz; 또는 약 50 KHz 내지 약 500 KHz이다. 일부 경우에, 주파수는 약 500 KHz, 200 KHz, 100 KHz, 또는 50 KHz 미만이다.
분배된 액적의 크기는 장치의 해상도와 상관관계가 있다. 일부 경우에, 장치는 시약의 액적을 약 0.01 pl 내지 약 20 pl, 약 0.01 pl 내지 약 10 pl, 약 0.01 pl 내지 약 1 pl, 약 0.01 pl 내지 약 0.5 pl, 약 0.01 pl 내지 약 0.01 pl, 또는 약 0.05 pl 내지 약 1 pl의 크기로 증착시킨다. 일부 경우에, 액적 크기는 약 1 pl, 0.5 pl, 0.2 pl, 0.1 pl, 또는 0.05 pl 미만이다. 장치에 의해 분배된 액적의 크기는 증착 노즐의 직경과 상관관계가 있으며, 각각의 노즐은 시약을 기판의 특징부 상에 증착시킬 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 장치의 증착 장치는 약 100 내지 약 10,000개의 노즐; 약 100 내지 약 5,000개의 노즐; 약 100 내지 약 3,000개의 노즐; 약 500 내지 약 10,000개의 노즐; 또는 약 100 내지 약 5,000개의 노즐을 포함한다. 일부 경우에, 증착 장치는 1,000; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 또는 10,000개 초과의 노즐을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 물질 증착 장치는 복수의 노즐을 포함하고, 각각의 노즐은 선택적으로 기판 상의 특징부에 상응하도록 구성된다. 각각의 노즐은 또 다른 노즐과 상이한 시약 구성요소를 증착시킬 수 있다. 일부 경우에, 각각의 노즐은 기판의 하나 이상의 특징부를 덮는 액적을 증착시킨다. 일부 경우에, 하나 이상의 노즐은 각져있다. 일부 경우에, 다수의 증착 장치가 처리량의 배수 증가를 달성하기 위해 나란히 적층된다. 일부 경우에, 게인(gain)은 2x, 4x, 8x 이상이다. 증착 장치의 예는 삼바 프린트헤드(Samba Printhead(Fujifilm))이다. 삼바 프린트헤드는 삼바 웹 관리 도구(Samba Web Administration Tool, SWAT)와 함께 사용될 수 있다.
증착 부위의 수는 동일한 증착 장치를 사용하고 특정 각도 또는 세이버 각도(saber angle)로 회전시킴으로써 증가될 수 있다. 증착 장치를 회전시킴으로써, 각각의 노즐은 세이버 각도에 대응하는 특정 양의 지연 시간으로 분사된다. 이러한 비동기화된 분사는 노즐 사이에 크로스토크(cross talk)를 생성한다. 따라서, 액적이 0도와는 다른 특정한 세이버 각도로 분사되는 경우, 노즐로부터의 액적 부피는 상이할 수 있다.
일부 배열에서, 폴리뉴클레오타이드 합성 시스템의 구성은 릴-투-릴 유형 공정에서 이동하기 위해 기판의 가요성을 이용하는 연속적인 폴리뉴클레오타이드 합성 공정을 허용한다. 이 합성 공정은 기판의 위치를 회전시키는 하나 이상의 릴을 사용하여 기판이 다양한 단계의 폴리뉴클레오타이드 합성을 통과하여 이동하는 연속적인 생산 라인 방식으로 작동한다. 예시적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 합성 반응은 용매 배쓰(bath)를 통해, 포스포르아미다이트 증착을 위한 증착 장치 아래에, 산화제의 배쓰를 통해, 아세토니트릴 세척 배쓰를 통해, 및 탈블록 배쓰를 통해 기판을 롤링하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 테이프는 또한 캡핑 배쓰를 통해 이동한다. 릴-투-릴 유형 공정은 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 기판의 완성된 제품이 테이크업 릴(take-up reel) 상에 쉽게 모이게 하고, 여기서 추가 가공 및 저장을 위해 운반될 수 있다.
일부 배열에서, 폴리뉴클레오타이드 합성은 연속적인 가요성 테이프가 컨베이어 벨트 시스템을 따라 운반됨에 따라 연속적인 공정으로 진행된다. 릴-투-릴 유형 공정과 유사하게, 연속적인 테이프 상에서의 폴리뉴클레오타이드 합성은 생산 라인 방식으로 작동하며, 기판은 운반 동안 폴리뉴클레오타이드 합성의 다양한 단계를 통해 이동한다. 그러나, 컨베이어 벨트 공정에서, 연속적인 테이프는 릴-투-릴 공정에서와 같이 테이프의 롤링 및 언롤링 없이 폴리뉴클레오타이드 합성을 재개한다. 일부 배열에서, 폴리뉴클레오타이드 합성 단계는 구역으로 분할되고, 연속적인 테이프는 한 사이클에서 1회 이상 각각의 구역을 통해 운반된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 합성 반응은 (1) 사이클에서 용매 배쓰를 통해, 포스포르아미다이트 증착을 위한 증착 장치 아래에, 산화제의 배쓰를 통해, 아세토니트릴 세척 배쓰를 통해, 및 블록 배쓰를 통해 기판을 운반하는 단계, 및 이후 (2) 사이클을 반복하여 미리 결정된 길이의 합성된 폴리뉴클레오타이드를 달성하는 단계를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 합성 후, 가요성 기판은 컨베이어 벨트 시스템으로부터 제거되고, 선택적으로, 저장을 위해 롤링된다. 롤링은 저장을 위해 릴 주위에서 이루어질 수 있다.
예시적인 배열에서, 열가소성 물질을 포함하는 가요성 기판은 뉴클레오사이드 커플링 시약으로 코딩된다. 코팅은 각각의 특징부가 약 10 μm의 직경을 갖고 약 21 μm의 2개의 인접한 특징부 사이의 중심간 거리를 갖도록 특징부로 패턴화된다. 이 경우, 특징부 크기는 폴리뉴클레오타이드 합성 증착 단계 동안 0.2 pl의 세실 드롭 부피(sessile drop volume)를 수용하기에 충분하다. 일부 경우에, 특징부 밀도는 m2당 약 22억 개의 특징부(1개의 특징부 / 441 x 10-12 m2)이다. 일부 경우에, 4.5 m2 기판은 각각 10 μm 직경을 갖는 약 100억 개의 특징부를 포함한다.
또 다른 예시적인 배열에서, 나노구조물을 포함하는 기판은 뉴클레오사이드 커플링 시약으로 코팅된다. 코팅은 각각의 특징부가 약 10 nm 내지 약 200 nm의 직경을 갖고 약 10 nm 내지 약 200 nm의 2개의 인접한 특징부 사이의 중심간 거리를 갖도록 특징부로 패턴화된다. 이 경우, 복수의 특징부는 폴리뉴클레오타이드 합성 증착 단계 동안 0.2 pl의 세실 드롭 부피를 수용한다. 일부 경우에, 약 50 nm의 특징부 직경 및 약 100 nm의 2개의 인접한 특징부 사이의 중심간 거리는 m2당 약 100억 개의 특징부(1개의 특징부 / 100 x 10-12 m2)의 특징부 밀도를 초래한다.
본원에 기재된 물질 증착 장치는 각각 액적당 1개의 핵염기로 초당 약 100,000개의 액적을 증착시키는 약 2,048개의 노즐을 포함할 수 있다. 각각의 증착 장치의 경우, 하루에 적어도 약 1.75 x 1013개의 핵염기가 기판 상에 증착된다. 일부 경우에, 100 내지 500개의 핵염기 폴리뉴클레오타이드가 합성된다. 일부 경우에, 200개의 핵염기 폴리뉴클레오타이드가 합성된다. 선택적으로, 3일 동안, 하루에 약 1.75 x 1013개의 염기의 속도로, 적어도 약 262.5 x 109개의 폴리뉴클레오타이드가 합성된다.
일부 배열에서, 합성 반응 동안 기판에 하나 이상의 시약을 적용하기 위한 장치는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 기반 합성을 위한 시약 및/또는 뉴클레오타이드 단량체를 증착시키도록 구성된다. 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 시약은 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 시약 및 세척 완충제를 포함한다. 비제한적인 예로서, 장치는 세정 시약, 커플링 시약, 캡핑 시약, 산화제, 탈블로킹제, 아세토니트릴, 상 변화 용매, 질소 기체와 같은 기체, 및 이의 임의의 조합을 증착시킨다. 또한, 장치는 선택적으로 기판 무결성의 준비 및/또는 유지를 위한 시약을 증착시킨다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 장치는 약 1000, 500, 100, 50, 또는 20 pl 미만의 부피에 약 200 μm, 100 μm, 또는 50 μm 미만의 직경을 갖는 방울을 증착시킨다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 장치는 초당 약 1 내지 10,000, 1 내지 5,000, 100 내지 5,000, 또는 1,000 내지 5,000개의 액적을 증착시킨다.
일부 배열에서, 폴리뉴클레오타이드 합성 동안, 기판은 플로우 셀 내에 위치하고/거나 밀봉된다. 플로우 셀은 기판 내에서 반응하는데 필요한 시약, 예를 들어, 산화제 및/또는 용매를 포함하는 액체와 같은 액체의 연속적 또는 비연속적 흐름을 제공할 수 있다. 플로우 셀은 전형적으로 휘발성 기판의 향상된 증발을 통해 기판을 건조시키기 위해, 질소와 같은 기체의 연속적 또는 비연속적 흐름을 제공할 수 있다. 다양한 보조 장치는 건조를 개선하고 기판의 표면 상의 잔류 수분을 감소시키는데 유용하다. 이러한 보조 건조 장치의 예는, 비제한적으로, 진공 공급원, 감압 펌프 및 진공 탱크를 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 시스템은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20개와 같은 하나 이상의 플로우 셀 및 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개와 같은 하나 이상의 기판을 포함한다. 일부 경우에, 플로우 셀은 합성 반응에서의 하나 이상의 단계 동안 시약을 유지하고 기판에 제공하도록 구성된다. 일부 경우에, 플로우 셀은 기판의 위로 미끄러지는 뚜껑을 포함하고, 기판의 모서리 주위에 압착 밀봉을 형성하기 위해 제자리에 고정될 수 있다. 적절한 밀봉은, 비제한적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 기압의 압력을 허용하는 밀봉을 포함한다. 일부 경우에, 플로우 셀의 뚜껑은 폴리뉴클레오타이드 합성 장치와 같은 적용 장치에의 액세스를 허용하기 위해 개방된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 방법의 하나 이상의 단계는 기판의 수송 없이, 플로우 셀 내의 기판 상에서 수행된다.
일부 배열에서, 기판을 유체로 처리하기 위한 장치는 스프레이 바(spray bar)를 포함한다. 뉴클레오타이드 단량체는 기판 표면에 적용될 수 있고, 이어서 스프레이 바는 스프레이 바의 스프레이 노즐을 사용하여 하나 이상의 처리 시약으로 기판 표면을 스프레이한다. 일부 배열에서, 스프레이 노즐은 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 상이한 처리 단계와 상관되도록 순차적으로 정렬된다. 상이한 공정 단계에서 사용되는 화학 물질은 합성 방법 또는 합성 방법의 단계 사이의 변화를 쉽게 수용하도록 스프레이 바에서 변경될 수 있다. 일부 경우에, 스프레이 바는 기판이 스프레이 바를 지나 이동할 때 기판의 표면 상에 주어진 화학물질을 연속적으로 스프레이한다. 일부 경우에, 스프레이 바는 잔디 스프링클러에 사용되는 스프레이 바와 매우 유사하게, 기판의 광범위한 영역에 증착된다. 일부 경우에, 스프레이 바 노즐은 기판의 주어진 영역에 처리 물질의 균일한 코팅을 제공하도록 위치한다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 시스템은 합성된 폴리뉴클레오타이드의 하류 처리에 유용한 하나 이상의 요소를 포함한다. 일 예로서, 시스템은 열 사이클링 장치와 같은 온도 제어 요소를 포함한다. 일부 경우에, 온도 제어 요소는 PCA와 같은 핵산 어셈블리 및/또는 PCR과 같은 핵산 증폭을 수행하기 위해 복수의 분해된 반응기와 함께 사용된다.
온도 제어가능 장치를 사용한 드 노보 폴리뉴클레오타이드 합성
온도 특이적 방식으로 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 시약의 액세스를 조절하기 위한 상 변화 적용 방법이 본원에 제공된다(표 1 참고). 본원에 기재된 용매에 대한 예시적인 용융 온도는 약 10℃ 내지 약 30℃, 약 10℃ 내지 약 18℃, 약 -30℃ 내지 약 40℃, 또는 약 5℃ 내지 약 40℃를 포함한다. 일부 양태에서, 상 변화 용매는 약 15-16℃의 용융 온도를 갖는다. 일부 양태에서, 상 변화 용매는 약 10-25℃의 용융 온도를 갖는다. 일부 양태에서, 상 변화 용매는 약 15-25℃의 용융 온도를 갖는다. 일부 양태에서, 상 변화 용매는 약 15-18℃의 용융 온도를 갖는다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 적어도 -20℃, 또는 적어도 -15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 또는 40℃ 초과의 용융 온도를 갖는다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 -20℃ 이하, 또는 -15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 이하, 또는 40℃ 이하의 용융 온도를 갖는다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 약 5 내지 약 10개의 탄소 원자를 함유하는 용매를 포함한다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 극성 용매이다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 이온성 액체이다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 초임계 유체이다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 용매 특성에 영향을 미치는 하나 이상의 첨가제, 예컨대 염, 다른 고체, 액체, 또는 용해된 기체를 포함한다. 본원에 기재된 상 변화 용매의 예시적인 밀도는 약 0.5 g/mL 내지 약 1.5 g/mL, 또는 약 0.6 g/mL 내지 약 1.4 g/mL, 또는 약 0.7 g/mL 내지 약 1.3 g/mL을 포함한다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 82℃ 이상의 비등점을 갖는 용매이다. 일부 경우에, 상 변화 용매는 아세토니트릴 또는 아세토니트릴 혼합물이다.
일부 경우에, 상 변화 용매는 트리메틸아세토니트릴(TMACN)이다. 다른 예시적인 상 변화 용매는 비제한적으로 트리메틸아세토니트릴(TMACN), 디메틸설폭사이드(DMSO), p-자일렌, 사이클로헥실시아니드, 2,5-디메틸-2,4-헥사디엔, 사이클로옥탄, o-톨루니트릴, 아세토페논, 사이클로노난, p-메틸벤질 시아니드, 프로피오페논, m-니트로톨루엔, o-디메톡시벤젠, m-클로로벤즈알데히드, o-클로로벤즈알데히드, 사이클로데칸, 디메틸 석시네이트, 부티로페논, 4-에톡시벤즈알데히드, m-톨릴 아세테이트, 페닐 프로피오네이트, 또는 이의 혼합물을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 사용된 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 1, 2, 3개 이상의 순차적인 커플링 단계를 포함한다. 커플링 전에, 여러 경우에, 기판에 결합된 뉴클레오사이드는 보호기의 제거에 의해 탈보호되고, 여기서 보호기는 중합을 방지하는 기능을 한다. 일반적인 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)이다. 일부 경우에, 커플링 단계는 보호기를 제거하지 않고 2회 이상 반복된다.
커플링 후, 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 선택적으로 캡핑 단계를 포함한다. 캡핑 단계에서, 성장하는 폴리뉴클레오타이드는 캡핑제로 처리된다. 캡핑 단계는 일반적으로 추가의 사슬 신장으로부터 커플링 후 미반응된 기판 결합된 5'-OH 기를 차단하여, 내부 염기 결실을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 형성을 방지하는 역할을 한다. 또한, 1H-테트라졸로 활성화된 포스포르아미다이트는 종종 구아노신의 O6 위치와 작은 정도로 반응한다. 이론에 구속되지 않고, I2/물로 산화시, 이 부산물은, 아마도 O6-N7 이동을 통해, 탈퓨린화(depurination)를 겪는다. 퓨린결여(apurinic) 부위는 결국 폴리뉴클레오타이드의 최종 탈보호 과정에서 절단되어 전장 생성물의 수율을 감소시킬 수 있다. O6 변형은 I2/물로 산화시키기 전에 캡핑 시약으로 처리함으로써 제거될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 캡핑 단계를 포함시키는 것은 캡핑이 없는 합성과 비교하여 오류율을 감소시킨다. 일 예로서, 캡핑 단계는 기판 결합된 폴리뉴클레오타이드를 아세트산 무수물 및 1-메틸이미다졸의 혼합물로 처리하는 단계를 포함한다. 캡핑 단계 후, 기판은 선택적으로 세척된다.
뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 첨가 후와 선택적으로 캡핑 및 하나 이상의 세척 단계 후, 기판 결합된 성장하는 핵산은 산화될 수 있다. 산화 단계는 포스파이트 트리에스테르를 자연발생 포스페이트 디에스테르 뉴클레오사이드간 연결의 보호된 전구체인 4배위(tetracoordinated) 포스페이트 트리에스테르로 산화시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 산화는, 선택적으로 피리딘, 루티딘, 또는 콜리딘과 같은 약염기의 존재하에, 요오드 및 물로 처리함으로써 달성된다. 산화는 때때로 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 또는 (1S)-(+)-(10-캄포르설포닐)-옥사지리딘(CSO)을 사용하여 무수 조건 하에서 수행된다. 일부 방법에서, 캡핑 단계는 산화 후에 수행된다. 지속될 수 있는 산화로부터의 잔류수가 후속 커플링을 억제할 수 있기 때문에, 제2 캡핑 단계는 기판 건조를 허용한다. 산화 후, 기판 및 성장하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 세척된다. 일부 경우에, 산화 단계는 폴리뉴클레오타이드 포스포로티오에이트를 수득하기 위해 황화 단계로 치환되고, 임의의 캡핑 단계는 황화 후에 수행될 수 있다. 비제한적으로, 3-(디메틸아미노메틸렌)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온, DDTT, 보카주(Beaucage) 시약으로도 알려진 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드, 및 N,N,N'N'-테트라에틸티우람 디설파이드(TETD)를 포함하는 많은 시약은 효율적인 황 전달을 할 수 있다.
커플링을 통해 발생하는 뉴클레오사이드 혼입의 후속 사이클을 위해, 기판 결합된 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 보호된 5' 말단은 1차 하이드록실기가 다음 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트와 반응할 수 있도록 제거되어야 한다. 일부 경우에, 보호기는 DMT이고, 탈블로킹은 디클로로메탄 중의 트리클로로아세트산을 이용하여 발생한다. 연장된 시간 동안 또는 권장된 산 용액보다 더 강한 산 용액으로 탈트리틸화(detritylation)를 수행하는 것은 고체 지지체 결합된 폴리뉴클레오타이드의 탈퓨린화를 증가시켜 원하는 전장 생성물의 수율을 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 원하지 않는 탈퓨린화 반응을 제한하는 제어된 탈블로킹조건을 제공한다. 일부 경우에, 기판 결합된 폴리뉴클레오타이드는 탈블로킹 후 세척된다. 일부 경우에, 탈블로킹 후 효율적인 세척은 낮은 오류율을 갖는 합성된 폴리뉴클레오타이드에 기여한다.
본원에 기재된 기판 상에서 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 전형적으로 하기 단계의 반복 순서를 포함한다: 표면, 링커 또는 이전에 탈보호된 단량체와 연결하기 위해 기판 특징부의 표면에 보호된 단량체의 적용; 적용된 단량체가 후속적으로 적용된 보호된 단량체와 반응할 수 있도록 적용된 단량체의 탈보호; 연결을 위한 또 다른 보호된 단량체의 적용. 하나 이상의 중간 단계는 산화 및/또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 세척 단계는 하나 또는 모든 단계보다 선행하거나 후행한다. 일부 경우에, 마지막 세척 단계는 적합한 상 변화 용매의 첨가를 포함한다. 일부 경우에, 커플링 단계는 상 변화 용매를 제거하지 않고 발생한다. 일부 경우에, 반응 용매는 상 변화 용매이다.
본원에 기재된 방법의 일부 양태에서, 반응 용매의 상은 장치의 표면 상의 특정 부위를 블로킹하거나 탈블로킹하는데 사용된다. 일 예에서, 부위에서의 반응 용매의 상은 하나 이상의 어드레서블 가열 요소에 의해 제어되고, 폴리뉴클레오타이드의 합성 방법은 하나 이상의 다음 단계의 순서의 반복을 포함한다: 표면 상의 적용된 단량체 또는 반응성기가 후속 적용된 보호된 단량체와 반응할 수 있도록 표면 상의 적용된 단량체 또는 반응성기의 탈보호; 장치 표면의 선택적 냉각; 표면 상의 모든 히터 요소의 활성화; 상 변화 용매의 첨가, 블로킹될 장치 부위에서 모든 가열 요소의 불활성화 및 표면, 링커 또는 이전에 탈보호된 단량체와 연결하기 위해 기판 특징부의 표면에 보호된 단량체의 적용. 하나 이상의 중간 단계는 모든 히터 요소의 활성화 후, 산화 및/또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 세척 단계는 하나 또는 모든 단계보다 선행하거나 후행한다. 일부 경우에, 모든 가열 요소의 활성화는 하나 이상의 세척 단계보다 선행하거나 후행한다. 일부 경우에, 가열 요소는 블로킹될 부위에서 활성화된다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 하나 이상의 표면 영역에서의 하나 이상의 히터 요소의 불활성화가 이들 영역 내의 용매를 동결시켜 고체를 형성하는 방법이 본원에 추가로 기재된다. 일부 경우에, 고체 용매 용매는 합성 표면 영역과 탈트리틸화 시약과 같은 추가적인 시약과의 접촉을 방지하여, 탈보호를 방지한다. 일부 경우에, 가열 요소의 활성화 또는 냉각 요소의 불활성화는 고체를 용융시켜, 시약을 합성 표면에 접촉시킨다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 하나 이상의 표면 영역에서의 하나 이상의 히터 요소의 활성화가 이들 영역 내의 용매를 비등시켜 기체 버블을 형성하는 방법이 본원에 추가로 기재된다. 일부 경우에, 기체 용매의 버블은 합성 표면 영역과 탈트리틸화 시약과 같은 추가적인 시약과의 접촉을 방지하여, 탈보호를 방지한다. 일부 경우에, 냉각 요소의 활성화 또는 가열 요소의 불활성화는 버블을 붕괴시켜, 시약을 합성 표면에 접촉시킨다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 광불안정성 보호기를 이용하여 합성되며, 여기서 표면 상에 생성된 하이드록실기는 광불안정성 보호기에 의해 블로킹된다. 표면이 포토리소그래픽 마스크를 통해서와 같이 UV 광에 노출될 때, 표면 상에 유리 하이드록실기의 패턴이 생성될 수 있다. 이들 하이드록실기는 포스포르아미다이트 화학에 따라 광보호된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트와 반응할 수 있다. 제2 포토리소그래픽 마스크가 적용될 수 있고 표면은 UV 광에 노출되어 하이드록실기의 제2 패턴을 생성한 후, 5'-광보호된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트와 커플링될 수 있다. 마찬가지로, 패턴이 생성될 수 있고 올리고머 사슬이 연장될 수 있다. 이론에 구속되지 않으면서, 광절단가능한 기의 불안정성은 사용된 용매의 파장 및 극성에 의존하고, 광절단 속도는 노출 지속시간 및 광의 강도에 의해 영향을 받을 수 있다. 이 방법은 마스크의 정렬 정확성, 광보호기의 제거 효율, 및 포스포르아미다이트 커플링 단계의 수율과 같은 많은 인자를 활용할 수 있다. 또한, 주변 부위로의 의도하지 않은 광 노출이 최소화될 수 있다. 스팟당 합성된 올리고머의 밀도는 합성 표면 상에서 리더 뉴클레오사이드의 로딩을 조절함으로써 모니터링될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 지지체를 제공하는 기판의 표면은 합성된 폴리뉴클레오타이드 사슬이 표면으로부터 절단되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 사슬은 폴리뉴클레오타이드가 탈보호되는 것과 동시에 절단된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 사슬은 폴리뉴클레오타이드가 탈보호된 후에 절단된다. 예시적인 방식에서, (CH3CH2O)3Si-(CH2)2-NH2와 같은 트리알콕시실릴 아민은 기판의 표면 SiOH 기와 반응한 후, 아민을 갖는 석시닉 무수물과 반응하여 핵산 사슬 성장이 지지된 아미드 연결 및 유리 OH를 생성한다. 절단은 암모니아 또는 메틸아민을 이용한 기체 절단을 포함한다. 일부 경우에, 일단 표면으로부터 방출되면, 폴리뉴클레오타이드는 더 큰 핵산으로 조립되고, 이는 저장된 정보를 추출하기 위해 시퀀싱되고 디코딩된다.
짧은 시간 내에 기판 상에 고밀도의 폴리뉴클레오타이드를 합성하기 위한 시스템 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 기판은 가요성 기판이다. 일부 경우에, 하루에 적어도 약 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 1015개의 염기가 합성된다. 일부 경우에, 하루에 적어도 약 10 x 108, 10 x 109, 10 x 1010, 10 x 1011, 또는 10 x 1012개의 폴리뉴클레오타이드가 합성된다. 일부 경우에, 합성된 각각의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 20, 50, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 핵염기를 포함한다. 일부 경우에, 이들 염기는 100; 200; 300; 400; 500; 1000; 2000; 5000; 10000; 15000; 20000개 염기 중 약 1개 미만의 총 평균 오류율로 합성된다. 일부 경우에, 이들 오류율은 합성된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 이상에 대한 것이다. 일부 경우에, 합성된 폴리뉴클레오타이드의 이러한 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 이상은 이들이 코딩하는 미리 결정된 서열과 상이하지 않다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 오류율은 200개 중 약 1개 미만이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 오류율은 1,000개 중 약 1개 미만이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 오류율은 2,000개 중 약 1개 미만이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 오류율은 3,000개 중 약 1개 미만이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 시스템을 사용하여 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 오류율은 5,000개 중 약 1개 미만이다. 오류율의 개별 유형은 기판 상에 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 미스매치, 결실, 삽입, 및/또는 치환을 포함한다. 용어 "오류율"은 합성된 폴리뉴클레오타이드의 총량을 미리 결정된 폴리뉴클레오타이드 서열의 합계와 비교하는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 합성된 폴리뉴클레오타이드는 12 내지 25개의 염기의 테더(tether)를 포함한다. 일부 경우에, 테더는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 염기를 포함한다.
본 개시내용의 기판 상에서 폴리뉴클레오타이드를 합성하기 위한 적합한 방법은 포스포르아미다이트 빌딩 블록과 기판에 결합된 뉴클레오사이드 사이에 포스파이트 트리에스테르 연결을 형성하는 커플링 단계(예를 들어, 신장 단계)에서 성장하는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 포스포르아미다이트 빌딩 블록, 즉 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 제어 첨가하는 것을 포함하는 포스포르아미다이트 방법이다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 활성화된 기판에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 활성제와 함께 기판에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트는 기판 결합된 뉴클레오사이드보다 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100-배수 과량 이상으로 기판에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 첨가는 무수 환경, 예를 들어, 무수 아세토니트릴에서 수행된다. 커플링 단계에서 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 첨가 및 연결 후, 기판은 선택적으로 세척된다. 일부 경우에, 커플링 단계는 선택적으로 기판에 대한 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트 첨가 사이에 세척 단계와 함께, 추가 1회 이상 반복된다.
핵산 어셈블리
폴리뉴클레오타이드는 정보를 코딩하는 미리 결정된 서열의 큰 영역을 집합적으로 포괄하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 합성된 폴리뉴클레오타이드를 연결하는 결찰 반응을 통해 더 큰 폴리뉴클레오타이드가 생성된다. 결찰 반응의 하나의 예는 중합효소 연쇄 어셈블리(PCA)이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부는 유니버설 프라이머 결합을 위한 기질인 부가 영역을 포함하도록 설계된다. PCA 반응의 경우, 미리 합성된 폴리뉴클레오타이드는 서로 중첩(예컨대, 중첩 서열을 갖는 4, 20, 40개 이상의 염기)을 포함한다. 중합효소 사이클 동안, 폴리뉴클레오타이드는 상보적 단편에 어닐링된 다음 중합효소에 의해 채워진다. 따라서, 각각의 사이클은 어떤 폴리뉴클레오타이드가 서로를 발견하느냐에 따라 다양한 단편의 길이를 무작위로 증가시킨다. 단편들 사이의 상보성은 완전한 큰 범위의 이중 가닥 DNA를 형성할 수 있게 한다. 일부 경우에, PCA 반응이 완료된 후, 서열 내의 미스매치를 제거하기 위해 미스매치 복구 검출 효소를 사용하여 오류 교정 단계가 수행된다. 표적 서열의 더 큰 단편이 생성되면, 이들은 증폭될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 5' 및 3' 말단 어댑터 서열을 포함하는 표적 서열은 어댑터 서열에 혼성화하는 변형된 프라이머를 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 증폭된다. 일부 경우에, 변형된 프라이머는 하나 이상의 우라실 염기를 포함한다. 변형된 프라이머의 사용은 단편으로부터 변형된 염기쌍을 절단하는 효소에 의해 남겨진 변형된 염기 및/또는 갭을 표적화하는 것에 중점을 둔 효소 반응을 통해 프라이머를 제거할 수 있게 한다. 남아 있는 것은 어댑터 서열의 잔존물이 없는 이중 가닥 증폭 생성물이다. 이러한 방식으로, 다수의 증폭 생성물이 동일한 프라이머 세트를 이용하여 동시에 생성되어 이중 가닥 DNA의 상이한 단편을 생성할 수 있다.
오류 교정은 합성된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 조립된 생성물 상에서 수행될 수 있다. 오류 교정을 위한 예시적인 전략은 오류를 교정하기 위한 오버랩 PCR에 의한 부위 지정 돌연변이유발을 포함하며, 이는 선택적으로 2회 이상의 클로닝 및 시퀀싱과 결합된다. 특정 경우, 미스매치, 돌출부(bulge) 및 작은 루프를 갖는 이중 가닥 핵산, 화학적으로 변경된 염기 및/또는 다른 이종이합체는 정확하게 합성된 핵산의 집단으로부터 선택적으로 제거된다. 일부 경우에, 오류 교정은 단일 또는 이중 가닥 절단(break)을 생성하거나 가닥 전달 전위(strand transfer transposition) 사건을 개시하기 위해 이중 가닥 핵산 내의 미스매치되거나 쌍을 형성하지 않은 염기를 인식하고 이에 결합하거나 이의 옆에 있는 단백질/효소를 사용하여 수행된다. 오류 교정을 위한 단백질/효소의 비제한적인 예는 엔도뉴클레아제(T7 엔도뉴클레아제 I, E. coli 엔도뉴클레아제 V, T4 엔도뉴클레아제 VII, 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease), CelI, E. coli 엔도뉴클레아제 IV, UVDE), 제한 효소, 글리코실라제, 리보뉴클레아제, 미스매치 복구 효소, 레솔바제(resolvase), 헬리카제, 리가제, 미스매치에 특이적인 항체, 및 이들의 변이체를 포함한다. 특정 오류 교정 효소의 예는 T4 엔도뉴클레아제 7, T7 엔도뉴클레아제 1, S1, 녹두 엔도뉴클레아제, MutY, MutS, MutH, MutL, 클리바제(cleavase), CELI, 및 HINF1을 포함한다. 일부 경우에, DNA 미스매치 결합 단백질 MutS(Thermus aquaticus)가 합성된 생성물의 집단으로부터 실패 생성물을 제거하는데 사용된다. 일부 경우에, 오류 교정은 효소 코렉타제(Correctase)를 사용하여 수행된다. 일부 경우에, 오류 교정은 이종이합체 DNA에 대해 공지 및 비공지 돌연변이 및 다형성을 스캔하는 미스매치 특이적 DNA 엔도뉴클레아제인 SURVEYOR 엔도뉴클레아제(Transgenomic)를 사용하여 수행된다.
컴퓨터 시스템
다양한 양태에서, 본원에 기재된 임의의 시스템은 컴퓨터에 작동가능하게 연결되며, 선택적으로 컴퓨터를 통해 로컬 또는 원격으로 자동화된다. 다양한 경우에, 본 발명의 방법 및 시스템은 컴퓨터 시스템 상의 소프트웨어 프로그램 및 이의 사용을 추가로 포함한다. 따라서, 물질 증착 장치 이동, 분배 작용 및 진공 작동을 조정 및 동기화하는 것과 같은 분배/진공/충전 기능의 동기화를 위한 컴퓨터 제어는 본 발명의 범위에 속한다. 일부 경우에, 컴퓨터 시스템은 정확한 시약을 기판의 특정 영역으로 전달하기 위해 사용자 지정 염기 서열과 물질 증착 장치의 위치 사이를 연결하도록 프로그램된다.
도 9에 예시된 컴퓨터 시스템(900)은 매체(911) 및/또는 네트워크 포트(905)로부터의 명령을 읽을 수 있는 논리 장치로서 이해될 수 있으며, 이는 선택적으로 서버(909)에 연결될 수 있다. 도 9에 나타낸 바와 같은 시스템은 CPU(901), 디스크 드라이브(903), 키보드(915) 및/또는 마우스(916)와 같은 선택적인 입력 장치 및 선택적인 모니터(907)를 포함할 수 있다. 데이터 통신은 표시된 통신 매체를 통해 로컬 또는 원격 위치에 있는 서버로 달성될 수 있다. 통신 매체는 데이터를 전송 및/또는 수신하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 이러한 연결은 월드 와이드 웹을 통한 통신을 제공할 수 있다. 본 개시내용과 관련된 데이터는 제3자(922)에 의한 수신 및/또는 검토를 위해 이러한 네트워크 또는 연결을 통해 전송될 수 있는 것으로 예상된다.
도 10은 본 발명의 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템(1000)의 첫 번째 예시적인 아키텍처를 도시하는 블록도이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 예시적인 컴퓨터 시스템은 명령을 처리하기 위한 프로세서(1002)를 포함할 수 있다. 프로세서의 비제한적인 예는 인텔 XeonTM 프로세서, AMD OpteronTM 프로세서, 삼성 32-비트 RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TM 프로세서, ARM Cortex-A8 삼성 S5PC100TM 프로세서, ARM Cortex-A8 애플 A4TM 프로세서, Marvell PXA 930TM 프로세서, 또는 기능적으로 동등한 프로세서를 포함한다. 병렬 처리를 위해 다수의 실행 스레드(thread)가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 단일 컴퓨터 시스템에서든, 클러스터에서든, 또는 복수의 컴퓨터, 휴대폰, 및/또는 개인 데이터 단말기 장치를 포함하는 네트워크를 통해 시스템에 분산되어 있든지 간에, 다수의 프로세서 또는 다수의 코어를 갖는 프로세서가 또한 사용될 수 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 고속 캐시(cache)(1004)는 프로세서(1002)에 연결되거나 프로세서(1002)에 통합되어 프로세서(1002)에 의해 최근에 사용되었거나 자주 사용되는 명령 또는 데이터를 위한 고속 메모리를 제공할 수 있다. 프로세서(1002)는 프로세서 버스(1008)에 의해 노스 브릿지(1006)에 연결된다. 노스 브릿지(1006)는 메모리 버스(1012)에 의해 랜덤 액세스 메모리(RAM)(1010)에 연결되고, 프로세서(1002)에 의해 RAM(1010)에 대한 액세스를 관리한다. 노스 브릿지(1006)는 또한 칩셋 버스(1016)에 의해 사우스 브릿지(1014)에 연결된다. 사우스 브릿지(1014)는 결국 주변장치 버스(1018)에 연결된다. 주변장치 버스는, 예를 들어, PCI, PCI-X, PCI Express, 또는 다른 주변장치 버스일 수 있다. 노스 브릿지 및 사우스 브릿지는 종종 프로세서 칩셋으로 지칭되며, 프로세서, RAM, 및 주변장치 버스(1018) 상의 주변장치 구성요소 사이의 데이터 전달을 관리한다. 일부 대안적인 아키텍처에서, 노스 브릿지의 기능은 별도의 노스 브릿지 칩을 사용하는 대신에 프로세서에 통합될 수 있다.
일부 경우에, 시스템(1000)은 주변장치 버스(1018)에 부착된 가속기 카드(1022)를 포함할 수 있다. 가속기는 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA) 또는 특정 처리를 가속하기 위한 다른 하드웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가속기는 적응형 데이터 재구성을 위해 또는 확장된 세트 처리에 사용되는 대수식(algebraic expression)을 평가하는데 사용될 수 있다.
소프트웨어 및 데이터는 외부 저장장치(1024)에 저장되고, 프로세서에 의해 사용되도록 RAM(1010) 및/또는 캐시(1004)에 로딩될 수 있다. 시스템(1000)은 시스템 자원을 관리하기 위한 운영 체제를 포함하고; 운영 체제의 비제한적인 예는 Linux, WindowsTM, MACOSTM, BlackBerry OSTM, iOSTM, 및 다른 기능적으로 동등한 운영 체제뿐만 아니라 본 발명의 예시적인 경우에 따라 데이터 저장 및 최적화를 관리하기 위한 운영 체제에서 실행되는 응용 소프트웨어를 포함한다.
이 예에서, 시스템(1000)은 또한 네트워크 연결 저장장치(NAS)와 같은 외부 저장장치에 네트워크 인터페이스를 제공하기 위하여 주변장치 버스에 연결된 네트워크 인터페이스 카드(NIC)(1020 및 1021) 및 분산 병렬 처리에 사용될 수 있는 다른 컴퓨터 시스템을 포함한다.
도 11은 복수의 컴퓨터 시스템(1102a, 및 1102b), 복수의 휴대폰 및 개인 데이터 단말기(1102c), 및 네트워크 연결 저장장치(NAS)(1104a, 및 1104b)를 갖는 네트워크(1100)를 나타내는 도표이다. 예시적인 경우에서, 시스템(1102a, 1102b, 및 1102c)은 데이터 저장을 관리하고 네트워크 연결 저장장치(NAS)(1104a 및 1104b)에 저장된 데이터에 대한 데이터 액세스를 최적화할 수 있다. 수학적 모델이 데이터에 사용될 수 있고, 컴퓨터 시스템(1102a, 및 1102b), 및 휴대폰 및 개인 데이터 단말기 시스템(1102c)에 걸쳐 분산 병렬 처리를 사용하여 평가될 수 있다. 컴퓨터 시스템(1102a, 및 1102b), 및 휴대폰 및 개인 데이터 단말기 시스템(1102c)은 또한 네트워크 연결 저장장치(NAS)(1104a 및 1104b)에 저장된 데이터의 적응형 데이터 재구성을 위한 병렬 처리를 제공할 수 있다. 도 11은 단지 예를 예시하고, 다양한 다른 컴퓨터 아키텍처 및 시스템이 본 발명의 다양한 예와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 블레이드 서버(blade server)가 병렬 처리를 제공하는데 사용될 수 있다. 프로세서 블레이드는 병렬 처리를 제공하기 위해 후면을 통해 연결될 수 있다. 저장장치는 또한 후면에 연결될 수 있거나 별도의 네트워크 인터페이스를 통해 네트워크 연결 저장장치(NAS)로서 연결될 수 있다.
일부 예시적인 경우에, 프로세서는 별도의 메모리 공간을 유지하고 다른 프로세서에 의한 병렬 처리를 위해 네트워크 인터페이스, 후면 또는 다른 커넥터를 통해 데이터를 전송할 수 있다. 다른 경우에, 프로세서의 일부 또는 모두는 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용할 수 있다.
도 12는 예시적인 구현예에 따른 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템(1200)의 블록도이다. 시스템은 공유 메모리 서브시스템(1204)에 액세스할 수 있는 복수의 프로세서(1202a-f)를 포함한다. 시스템은 메모리 서브시스템(1204) 내에 복수의 프로그래머블 하드웨어 메모리 알고리즘 프로세서(MAP)(1206a-f)를 포함한다. 각각의 MAP(1206a-f)는 메모리(1208a-f) 및 하나 이상의 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA)(1210a-f)를 포함할 수 있다. MAP는 구성가능한 기능 유닛을 제공하고, 특정 알고리즘 또는 알고리즘의 일부는 각각의 프로세서와 밀접히 협력하여 처리하기 위해 FPGA(1210a-f)에 제공될 수 있다. 예를 들어, MAP는 데이터 모델에 관한 대수식을 평가하고 예시적인 경우에 적응형 데이터 재구성을 수행하는데 사용될 수 있다. 이 예에서, 각각의 MAP는 이러한 목적을 위해 모든 프로세서에 의해 전역에서 액세스될 수 있다. 일 구성에서, 각각의 MAP는 직접 메모리 액세스(DMA)를 사용하여 관련 메모리(1208a-f)에 액세스할 수 있고, 이는 그것이 각각의 마이크로프로세서(1202a-f)와 독립적으로 그리고 비동기적으로 작업을 실행할 수 있게 한다. 이 구성에서, MAP는 파이프라이닝(pipelining) 및 알고리즘의 병렬 실행을 위해 결과를 또 다른 MAP에 직접 공급할 수 있다.
상기 컴퓨터 아키텍처 및 시스템은 단지 예이며, 범용 프로세서, 보조 프로세서, FPGA 및 다른 프로그래머블 논리 장치, 시스템 온 칩(SOC), 주문형 반도체(application specific integrated circuits, ASIC), 및 다른 처리 및 논리 요소의 임의의 조합을 사용하는 시스템을 포함하는, 다양한 다른 컴퓨터, 휴대폰, 및 개인 데이터 단말기 아키텍처 및 시스템이 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨터 시스템의 전부 또는 일부는 소프트웨어 또는 하드웨어로 구현될 수 있다. 랜덤 액세스 메모리, 하드 드라이브, 플래시 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 어레이, 네트워크 연결 저장장치(NAS) 및 다른 로컬 또는 분산 데이터 저장 장치 및 시스템을 포함하는, 임의의 광범위한 데이터 저장 매체가 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본원에 개시된 예의 원리 및 실행을 당업자에게 보다 명확하게 예시하기 위해 제시되며, 임의의 청구된 예의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 부분 및 백분율은 중량 기준이다.
실시예
실시예 1: 상 변화 용매를 사용하여 온도 제어가능한 표면 상에서 50-머 서열
폴리뉴클레오타이드의 합성
폴리뉴클레오타이드 합성 장치(101)(도 1 참고)는 온도 제어가능한 플로우 셀(도 3a 및 도 3b)로 조립되며, 이는 도 7에 나타낸 바와 같이 플로우 셀(Applied Biosystems(ABI394 DNA 합성 장치"))에 연결된다. SiO2로 코팅된 웰(305)(도 3a 및 도 3b)의 하부 표면은 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드(Gelest, CAS No. 156214-80-1)로 균일하게 작용화되고, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 합성 방법을 사용하여 50 bp의 예시적인 폴리뉴클레오타이드("50-머 폴리뉴클레오타이드")를 합성하는데 사용된다. 50-머의 서열은 서열번호: 1에 기재된 바와 같다: 5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3' (서열번호: 1), 여기서 #는 티미딘-석시닐 헥스아미드 CED 포스포르아미다이트(ChemGenes로부터의 CLP-2244)를 나타내며, 이는 탈보호 동안 표면으로부터 폴리뉴클레오타이드의 방출을 가능하게 하는 절단가능한 링커이다.
합성은 각 셀에서의 화학적 커플링 반응이 온도 제어가능한 표면을 통해 제어되는 변형으로, 표 2의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈블로킹) 및 ABI 합성 장치를 변형하여 사용하여 수행된다(도 8 참고). 장치 온도는 콜드 척을 사용하여 상 변화 용매의 동결 온도보다 약 5℃ 낮아진다. 커플링 단계 동안, 상 변화 용매는 커플링 시약의 첨가 직전에 첨가되고, 상 변화 용매는 동결된다. 웰은 어드레서블 가열 요소를 통해 가열함으로써 커플링을 위해 활성화되고, 이는 개별 웰에서의 용매를 용융시킨다. 동결된 용매를 갖는 나머지 웰은 액체 커플링 시약과 반응하지 않으며 비활성이다. 각각의 커플링 반복에 대해 활성 웰을 변경하면서, 각각 상이한 DNA 염기, 예를 들어 A, T, G, 및 C를 사용하여 커플링 단계를 반복한다. 모든 원하는 부위가 작용화된 후, 모든 웰은 가열에 의해 활성화되고; 이후 전역 캡핑, 산화, 및 탈블로킹이 수행된다. 이 전체 과정은 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드가 합성될 때까지 반복된다.
장치 온도는 콜드 척을 사용하여 상 변화 용매의 동결 온도보다 약 5℃ 낮아진다. 커플링 단계 동안, 상 변화 용매는 커플링 시약의 첨가 직전에 첨가되고, 상 변화 용매는 동결된다. 웰은 어드레서블 가열 요소를 통해 가열함으로써 커플링을 위해 활성화되고, 이는 개별 웰에서의 용매를 용융시킨다. 동결된 용매를 갖는 나머지 웰은 액체 커플링 시약과 반응하지 않으며, 커플링 시약에 대해 비활성이다. 각각의 커플링 반복에 대해 활성 웰을 변경하면서, 상이한 DNA 염기, 예를 들어 A, T, G, 및 C를 사용하여 커플링 단계를 반복한다. 모든 원하는 부위가 작용화된 후, 모든 웰은 가열에 의해 활성화되고; 이후 전역 캡핑, 산화, 및 탈블로킹이 수행된다. 이 전체 과정은 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드가 합성될 때까지 반복된다.
실시예 2: 용매 증기 버블을 사용하여 온도 제어가능한 표면 상에서 50-머 서열 폴리뉴클레오타이드의 합성
폴리뉴클레오타이드 합성 장치(101)(도 1 참고)는 온도 제어가능한 플로우 셀(도 4a)로 조립되며, 이는 도 7에 나타낸 바와 같이 플로우 셀(Applied Biosystems(ABI394 DNA 합성 장치")에 연결된다. 웰(401)(도 4a)의 하부 표면은 실시예 1의 일반적인 방법을 사용하여 작용화된다.
합성은 각 셀에서의 화학적 커플링 반응이 온도 제어가능한 표면을 통해 제어되는 변형으로, 표 3의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈블로킹) 및 ABI 합성 장치를 변형하여 사용하여 수행된다(도 8 참고).
웰은 어드레서블 가열 요소를 통해 가열함으로써 커플링에 대해 블로킹되며, 이는 개별 웰에서의 용매를 기화시켜 버블(417)을 생성한다. 연장 또는 합성을 위해 폴리뉴클레오타이드 표면(407)과 접촉하는 액체 용매를 갖는 나머지 웰은 액체 커플링 시약과 반응하고 활성이다. 각각의 커플링 반복에 대해 활성 웰을 변경하면서, 상이한 DNA 염기, 예를 들어 A, T, G, 및 C를 사용하여 커플링 단계를 반복한다. 불활성 웰은 상기 웰에서 가열 요소를 끔으로써 활성화되며, 이는 증기 버블을 붕괴시킨다. 모든 원하는 부위가 작용화된 후, 모든 웰은 가열 요소를 끔으로써 활성화되고; 이후 전역 캡핑, 산화, 및 탈블로킹이 수행된다. 이 전체 과정은 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드가 합성될 때까지 반복된다.
실시예 3: 나노포스트를 사용하여 온도 제어가능한 표면 상에서 50-머 서열 폴리뉴클레오타이드의 합성
폴리뉴클레오타이드 합성 장치(101)(도 1 참고)는 온도 제어가능한 플로우 셀(도 4a)로 조립되며, 이는 도 7에 나타낸 바와 같이 플로우 셀(Applied Biosystems(ABI394 DNA 합성 장치")에 연결된다. 나노포스트(407)(도 4b)의 상부 표면은 실시예 1의 일반적인 방법을 사용하여 작용화된다.
합성은 실시예 2의 일반적인 방법을 사용하여, 각 셀에서의 화학적 커플링 반응이 온도 제어가능한 표면을 통해 제어되는 변형으로, 표 3의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈블로킹) 및 ABI 합성 장치를 사용하여 수행된다(도 8 참고).
실시예 4: 나노와이어를 사용하여 온도 제어가능한 표면 상에서 50-머 서열 폴리뉴클레오타이드의 합성
폴리뉴클레오타이드 합성 장치(101)(도 1 참고)는 온도 제어가능한 플로우 셀(도 5)로 조립되며, 이는 도 7에 나타낸 바와 같이 플로우 셀(Applied Biosystems(ABI394 DNA 합성 장치")에 연결된다. 나노로드(502)(도 5)의 표면은 실시예 1의 일반적인 방법을 사용하여 작용화된다.
합성은 실시예 2의 일반적인 방법을 사용하여, 각 셀에서의 화학적 커플링 반응이 온도 제어가능한 표면을 통해 제어되는 변형으로, 표 3의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈블로킹) 및 ABI 합성 장치를 사용하여 수행된다(도 8 참고).
실시예 5: 나노로드를 함유하는 표면 상에서 그리고 상 변화 용매를 이용하여 50-머 서열 폴리뉴클레오타이드의 합성
폴리뉴클레오타이드 합성 장치(101)(도 1 참고)는 온도 제어가능한 플로우 셀(도 5)로 조립되며, 이는 도 7에 나타낸 바와 같이 플로우 셀(Applied Biosystems(ABI394 DNA 합성 장치")에 연결된다. 나노로드(603)(도 6)의 표면은 실시예 1의 일반적인 방법을 사용하여 작용화된다.
합성은 각 셀에서의 화학적 커플링 반응이 온도 제어가능한 표면을 통해 제어되는 변형으로, 표 4의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캡핑, 산화, 및 탈블로킹) 및 ABI 합성 장치를 사용하여 수행된다(도 8 참고). 커플링 단계 동안, 상 변화 용매는 커플링 시약의 첨가 직전에 첨가된다. 웰은 하나 이상의 나노로드에 연결된 어드레서블 하부 접촉(601)을 통해 냉각함으로써 커플링을 위해 비활성화되고, 이는 나노로드 주위의 용매 층을 동결시킨다. 액체 용매를 갖는 나머지 나노로드는 액체 커플링 시약과 반응하고 활성이다. 각각의 커플링 반복에 대해 활성 웰을 변경하면서, 상이한 DNA 염기, 예를 들어 A, T, G, 및 C를 사용하여 커플링 단계를 반복한다. 모든 원하는 부위가 작용화된 후, 모든 나노로드는 냉각을 중단함으로써 활성화되고; 이후 전역 캡핑, 산화, 및 탈블로킹이 수행된다. 이 전체 과정은 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드가 합성될 때까지 반복된다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 나타나고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 많은 변경, 변화, 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이들 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조물 및 이들의 등가물이 이에 의해 포함된다는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> TWIST BIOSCIENCE CORPORATION
<120> HEATED NANOWELLS FOR POLYNUCLEOTIDE SYNTHESIS
<130> 44854-744.601
<140>
<141>
<150> 62/575,287
<151> 2017-10-20
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (51)..(52)
<223> Thymidine-succinyl hexamide CED phosphoramidite
<400> 1
agacaatcaa ccatttgggg tggacagcct tgacctctag acttcggcat tttttttttt 60
tt 62
Claims (55)
- a. 표면을 포함하는 고체 지지체;
b. 상기 표면 상에 위치한, 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 복수의 구조물; 및
c. 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 극성 용매인 용매
를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치. - a. 표면을 포함하는 고체 지지체;
b. 상기 표면 상에 위치한, 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 복수의 구조물; 및
c. 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 약 18℃ 이하의 용융 온도를 갖는 용매
를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치. - a. 표면을 포함하는 고체 지지체;
b. 상기 표면 상에 위치한, 폴리뉴클레오타이드 연장을 위한 복수의 구조물로서, 각각의 구조물은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 폭을 갖고, 각각의 구조물은 가열 유닛과 접촉하며, 가열 유닛은 적어도 하나의 전극을 포함하는 것인 복수의 구조물; 및
c. 상기 표면에 걸쳐 분포된 용매로서, 약 82℃ 이하의 비등 온도를 갖는 용매
를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 장치. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위(loci)를 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 전극은 하나 이상의 개별 좌위를 가열하는 어드레서블 전극(addressible electode)인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체는 냉각 유닛을 추가로 포함하는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 10 nm 내지 약 1000 nm인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 100 nm 내지 약 500 nm인 장치.
- 제1항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 20 nm 내지 약 300 nm인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 100 nm인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 200 nm인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 2개의 구조물의 중심 사이의 거리는 약 500 nm인 장치.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 구조물은 3차원 구조물을 포함하고, 3차원 구조물은 나노웰(nanowell), 나노와이어(nanowire), 나노포스트(nanopost), 또는 나노로드(nanorod)인 것인 장치.
- 제2항에 있어서, 용매는 극성 용매인 장치.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 용매는 니트릴기를 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 용매는 트리메틸아세토니트릴인 장치.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 용매는 5℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 용매는 10℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 장치.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 용매는 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 용매는 5℃ 내지 30℃의 용융 온도를 갖는 것인 장치.
- 제3항에 있어서, 용매는 0℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 장치.
- 제3항에 있어서, 용매는 30℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 장치.
- 제3항에 있어서, 용매는 55℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 0.5 내지 1.5 g/mL의 밀도를 갖는 것인 장치.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 장치는 폴리뉴클레오타이드 합성에 사용되고, 폴리뉴클레오타이드 합성은 복수의 신장(elongation) 단계를 포함하는 것인 장치.
- 제29항에 있어서, 용매는 신장 단계 동안 제거되지 않는 것인 장치.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 장치를 사용한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법.
- a. 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 위한 미리 결정된 서열을 제공하는 단계;
b. 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계;
c. 상기 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계로서, 고체상의 용매가 표면의 적어도 하나의 영역으로부터 연장되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 탈블로킹(deblocking)을 방지하고, 상기 용매는 약 18℃ 이하의 용융 온도를 갖는 것인 단계
를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법. - 제32항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는 표면을 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는 표면을 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 용매는 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉과 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉 사이에서 제거되지 않는 것인 방법.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는, 표면의 적어도 하나의 영역에 존재하는 용매를 용융시키는 단계, 및 적어도 하나의 영역의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 연장된 폴리뉴클레오타이드를 탈블로킹하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 약 15℃ 이하의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 약 10℃ 이하의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 5℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 10℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 15℃ 내지 18℃의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 5℃ 내지 30℃의 용융 온도를 갖는 것인 방법.
- d. 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 위한 미리 결정된 서열을 제공하는 단계;
e. 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계;
f. 상기 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계로서, 기체상의 용매가 표면의 적어도 하나의 영역으로부터 연장되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 탈블로킹을 방지하고, 상기 용매는 약 82℃ 이하의 비등 온도를 갖는 것인 단계
를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법. - 제42항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는 표면을 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는 표면을 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 용매는 제1 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉과 제2 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트와의 접촉 사이에서 제거되지 않는 것인 방법.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 표면으로부터 연장되는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 합성하는 단계는, 표면의 적어도 하나의 영역에 존재하는 용매를 응축시키는 단계, 및 적어도 하나의 영역의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 연장된 폴리뉴클레오타이드를 탈블로킹하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 약 75℃ 이하의 비등 온도를 갖는 것인 방법.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 약 65℃ 이하의 비등 온도를 갖는 것인 방법.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 0℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 방법.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 30℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 방법.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 용매는 55℃ 내지 82℃의 비등 온도를 갖는 것인 방법.
- 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 30,000개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 50,000개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 100,000개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 200,000개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 표면은 핵산 합성을 위한 적어도 1,000,000개의 좌위를 포함하는 것인 방법.
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