KR20210015740A - 조직 상태를 검출하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
조직 상태를 검출하기 위한 방법 및 시스템이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태의 하나 이상의 마커 및 하나 이상의 조직 특이적 무세포 폴리뉴클레오티드의 수준이 정량화되고, 그 수준은 참조와 비교되며, 그 비교에 기초하여 조직이 질환 또는 병태에 의해 손상되었는지가 결정된다. 본원에 기술된 방법을 수행하기 위한 시스템이 또한 제공된다.
Description
본 출원은 35 USC 119에 따라 2017년 9월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 62/560,936호를 우선권으로 주장하며, 상기 가특허 출원은 마치 그 전체가 본 명세서에 설명되어 있는 것처럼 참고 인용되어 있다.
다양한 마커가 다양한 병태를 검출하는데 이용가능하다. 그러나, 이러한 병태 중 다수가 다른 조직에 영향을 미칠 수 있는 것들이다. 순환에서, 예컨대 혈액 샘플에서 이러한 병태의 마커를 검출하는 것은 어떤 조직이 영향 받고 있는 지를 확인할 때에 항상 도움이 되는 것이 아니다. 예를 들어, 염증에 대한 일반적인 마커는 체내 어딘가에서의 염증성 반응을 지시할 수 있지만, 어느 조직, 예컨대 간, 신장, 폐 또는 관절이 그 반응으로부터 고통 받고 있는 지는 알 수 없다. 조직 특이성 시험, 예컨대 생검은 종종 침습적이고, 감염 위험을 지니고 있으며, 전형적으로 전체 기관 또는 조직을 포괄하지 않는다. 영상 기법, 예컨대 MRI 및 CT-스캔은 조직 건강을 평가하는데 이용될 수 있지만, 일반적으로 단지 공공연한 특색 및 변화만을 검출할 수 있다. 이로써, 이러한 영상 기법은 일반적으로 병태의 초기 발병 또는 병태의 상당히 최근의 발병을 충분히 포착하기에 민감하지 못하다.
발명의 개요
일부 양태에서, 본 명세서에는 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플로부터 세포를 제거하여 세포 고갈된 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하여 미소입자 고갈된 샘플을 얻는 단계; 미소입자 고갈된 샘플에서 유전자에 상응하는 무세포 RNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실제 예에서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는, 세포 고갈된 샘플을, 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 그 결합 모이어티는 항체 또는 항원 결합 항체 단편이다. 일부 실제 예에서, 항체 또는 항원 결합 항체 단편은, 혈액 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 세포 표면 마커와 상호 작용한다. 일부 실제 예에서, 항체는 항-CD45 항체를 포함한다. 일부 실제 예에서, 항체는 항-CD66b 항체를 포함한다. 일부 실제 예에서, 방법은 세포 고갈된 샘플을, 제1 세포 상의 제1 단백질과 상호 작용하는 제1 항체 및 제2 세포 상의 제2 단백질과 상호 작용하는 제2 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 제1 단백질은 제2 세포 상에서 발현되지 않고, 제2 단백질은 제1 세포 상에서 발현되지 않는다. 일부 실제 예에서, 세포외 미소입자는 엑소좀이다. 일부 실제 예에서, 엑소좀은 혈액 세포로부터 유래된다. 일부 실제 예에서, 혈액 세포는 혈소판이고, 여기서 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-GypA 항체 또는 이의 GypA 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 혈액 세포는 적혈구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD235a 항체 또는 이의 CD235a 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 혈액 세포는 과립구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD66b 항체 또는 이의 CD66b 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 혈액 세포는 림프구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 CD45, CD19 또는 CD3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결?d 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실제 예에서, 세포 고갈된 샘플은 섭씨 60도에서 1시간 인큐베이션된다. 일부 실제 예에서, 방법은 카오트로픽 염(chaotropic salt), 계면활성제(detergent), 단백질 분해 효소 K, 2-메르캅토에탄올 또는 이들의 조합의 존재 하에 세포 고갈된 샘플을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실제 예에서, 방법은 샘플을 Tris와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실제 예에서, 방법은 지질 및 단백질 구조를 파괴하는 단계를 포함한다. 일부 실제 예에서, 방법은 세포 고갈된 샘플을 실리카 컬럼과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실제 예에서, 방법은 세포 고갈된 샘플을 카오트로픽 염 및 100% 이소프로판올과 인큐베이션하여 실리카 컬럼에 대한 RNA의 결합을 증진시키는 단계를 포함한다.
참고 인용
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은, 마치 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 참고 인용되어 있는 것으로, 구체적으로 그리고 개별적으로 명시되어 있는 것과 같은 정도로, 본 명세서에서 참고 인용되어 있다.
본 발명의 신규한 특색은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 진술되어 있다. 본 발명의 특색 및 이점의 보다 우수한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태로 진술되어 있는 후술하는 상세한 설명 및 수반되는 도면을 참고함으로써 얻어지며, 상기 도면은 다음과 같이 간단히 설명된다.
도 1은 새롭게 여과된 샘플이 최소한 양의 혈액 세포 오염을 가지며, 무세포 RNA 연구에 최적합하다는 것을 나타낸다.
도 2는 비혈액 세포 전사물(간 RNA)에 대한 신호가 혈액 샘플의 여과후에 2배 더 높다는 것을 나타낸다.
도 3은 본 명세서에서 개시된 방법을 이용하는 무세포 RNA 수율이 증가된다는 것을 나타낸다.
도 4a는 질환 중증도(NAFLD = 비-알콜성 지방간 질환, NASH = 비-지방간성 간염)에 따른 다형핵(PMN) 백혈구 전사물 트랙을 나타낸다.
도 4b는 PMN에 의해 설명되는 전사체의 정도를 나타낸다.
도 5는 간 조직 RNA의 적정으로부터 계산된 qPCR 프라이머 효율을 나타낸다.
도 6은 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 처리된 샘플에 의한 비혈액 세포 전사물의 qPCR 정량화의 매우 우수한 재현성을 나타낸다.
도 7은 재현성이 입력의 함수로서 개선된다는 것을 나타낸다.
도 8은 65-환자 NAFLD 코호트를 사용하여 서열분석과 qPCR 패널 간의 상관관계를 나타낸다. 각각의 도트는 각각의 환자에 대하여 서열분석(log2 TPM) 및 qPCR(음성 Ct)에 의해 작도된 96-유전자 qPCR 패널에서 유전자 중 하나를 나타낸다. 각각의 샘플의 경우, 추출된 RNA의 절반은 qPCR에 사용되고, 나머지 절반은 서열분석에 사용된다.
도 9는 보다 많은 총 RNA를 지닌 샘플에서 qPCR과 서열분석 간의 개선된 상관관계를 나타낸다.
도 10a는 96 유전자 패널로부터의 qPCR 데이타를 사용하여 초기 분류자, NASH 대 대조군을 나타낸다. 도 10b는 96 유전자 패널로부터의 qPCR 데이타를 사용하여 초기 분류자, NAFLD 대 NASH를 나타낸다.
도 11a-11d는 CD45 결합 모이어티가 복수 유형의 혈액 세포 및 이의 세포외 미소입자를 포획할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12a-12b는 서열분석 어세이 감도 개선을 나타낸다. 도 12a는 개선 전의 감도를 나타내고, 도 12b는 개선 후의 감도를 나타낸다.
도 13a는 진단에 따른 간 특이적 서열분석화된 트랙의 개수를 나타내고, 도 13b는 섬유화 점수에 따른 간 특이적 유전자 검출된 트랙을 나타낸다.
도 14a는 진단에 따른 알부민 전사물 서열분석화된 트랙을 나타내고, 도 14b는 섬유화 점수에 따른 알부민 전사물 검출된 트랙을 나타낸다.
도 15는 모든 유전자로부터의 서열분석 데이타를 사용하여 초기 분류자: NASH 대 대조군을 나타낸다.
도 16은 본 명세서에서 개시된 방법, 시스템 및 키트가 관심이 있는 ∼250개의 유전자의 검출을 허용한다는 것을 나타낸다.
도 17a-17b는 서열분석 어세이 개선이 NASH 대 대조군에 대한 보다 우수한 분류자를 결과로 얻게 한다는 것을 나타내고, 도 17a는 개선 전을 나타내며, 도 17b는 개선 후를 나타낸다.
도 1은 새롭게 여과된 샘플이 최소한 양의 혈액 세포 오염을 가지며, 무세포 RNA 연구에 최적합하다는 것을 나타낸다.
도 2는 비혈액 세포 전사물(간 RNA)에 대한 신호가 혈액 샘플의 여과후에 2배 더 높다는 것을 나타낸다.
도 3은 본 명세서에서 개시된 방법을 이용하는 무세포 RNA 수율이 증가된다는 것을 나타낸다.
도 4a는 질환 중증도(NAFLD = 비-알콜성 지방간 질환, NASH = 비-지방간성 간염)에 따른 다형핵(PMN) 백혈구 전사물 트랙을 나타낸다.
도 4b는 PMN에 의해 설명되는 전사체의 정도를 나타낸다.
도 5는 간 조직 RNA의 적정으로부터 계산된 qPCR 프라이머 효율을 나타낸다.
도 6은 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 처리된 샘플에 의한 비혈액 세포 전사물의 qPCR 정량화의 매우 우수한 재현성을 나타낸다.
도 7은 재현성이 입력의 함수로서 개선된다는 것을 나타낸다.
도 8은 65-환자 NAFLD 코호트를 사용하여 서열분석과 qPCR 패널 간의 상관관계를 나타낸다. 각각의 도트는 각각의 환자에 대하여 서열분석(log2 TPM) 및 qPCR(음성 Ct)에 의해 작도된 96-유전자 qPCR 패널에서 유전자 중 하나를 나타낸다. 각각의 샘플의 경우, 추출된 RNA의 절반은 qPCR에 사용되고, 나머지 절반은 서열분석에 사용된다.
도 9는 보다 많은 총 RNA를 지닌 샘플에서 qPCR과 서열분석 간의 개선된 상관관계를 나타낸다.
도 10a는 96 유전자 패널로부터의 qPCR 데이타를 사용하여 초기 분류자, NASH 대 대조군을 나타낸다. 도 10b는 96 유전자 패널로부터의 qPCR 데이타를 사용하여 초기 분류자, NAFLD 대 NASH를 나타낸다.
도 11a-11d는 CD45 결합 모이어티가 복수 유형의 혈액 세포 및 이의 세포외 미소입자를 포획할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12a-12b는 서열분석 어세이 감도 개선을 나타낸다. 도 12a는 개선 전의 감도를 나타내고, 도 12b는 개선 후의 감도를 나타낸다.
도 13a는 진단에 따른 간 특이적 서열분석화된 트랙의 개수를 나타내고, 도 13b는 섬유화 점수에 따른 간 특이적 유전자 검출된 트랙을 나타낸다.
도 14a는 진단에 따른 알부민 전사물 서열분석화된 트랙을 나타내고, 도 14b는 섬유화 점수에 따른 알부민 전사물 검출된 트랙을 나타낸다.
도 15는 모든 유전자로부터의 서열분석 데이타를 사용하여 초기 분류자: NASH 대 대조군을 나타낸다.
도 16은 본 명세서에서 개시된 방법, 시스템 및 키트가 관심이 있는 ∼250개의 유전자의 검출을 허용한다는 것을 나타낸다.
도 17a-17b는 서열분석 어세이 개선이 NASH 대 대조군에 대한 보다 우수한 분류자를 결과로 얻게 한다는 것을 나타내고, 도 17a는 개선 전을 나타내며, 도 17b는 개선 후를 나타낸다.
비혈액 세포 세포로부터 혈중 RNA를 분석하는 것을 목적으로 하는 당업자는 다수의 비정렬된 RNA 및 매우 적은 정보적 mRNA를 접하게 된다. 이는 혈액으로부터의 추출 효율 및 양을 개선함으로써 개선될 수 있다. 이는 강화(enrichment)에 의해, 즉 서열분석 전에 상업적으로 이용가능한 캡쳐 기반 키트를 사용하는 것에 의해 더욱 더 개선될 수 있다. 이 과정의 종점에서, 정보적 RNA(예를 들면, 간으로부터의 유용한 조직 특이적 mRNA)가 전형적으로 ∼0.3% 미만이다. 이는 문제가 되는데, 그 이유는 서열분석의 99.7% 초과가 비정보적 리드(non-informative read)에 대하여 소모되기 때문이다. 이에 대한 이유는 혈액 세포 암호화된 mRNA가 혈액 중의 다수의 무세포 RNA를 구성한다는 것에 있다. 전형적인 불량 처리된 혈액 샘플(예를 들면, 세포를 제거하기 위해서 저속 원심분리를 이용한 것)에서, 결과로 얻어지는 혈장의 85% 초과가 혈소판 전사물이 된다. 이는 감소될 수 있지만, 고속 원심분리(예를 들면, 16,000×g)에 의해 또는 여과에 의해 제거되어 큰 혈소판 및 다른 세포 파편을 제거할 수 있게 된다. 다음의 가장 일반적인 오염물은 과립구 전사물이며, 이어서 단핵구 및 RBC이다. 유감스럽게도, 이들은 원심분리에 의해 단순 제거될 수 없으며, 이들 세포에 의해 생성된 엑소좀에 의해 구성되기 쉽다. 고속 원심분리에 의해 이들 세포를 제거하는 시도는 대부분 엑소좀을 제거하기 쉽고, 기관 특이성 신호를 크게 감소시킨다.
대안은 관심 대상이 아닌 세포에 의해 구성된 엑소좀을 선택적으로 면역고갈시키는 것이다. 이는 기원 세포에 특이적인 항체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 엑소좀은 면역고갈(immunodepletion)을 허용하도록 이러한 항원을 충분히 높은 수준으로 발현시켜야 한다. 예를 들면, 림프구로부터의 엑소좀 상의 CD45의 수준은 충분히 높고, 반면에 과립구 상의 것은 혈장 서열분석에 의해 측정된 바와 같이 명백하게 충분히 높지 않다. 상기 목적은 면역고갈을 허용하는 적당한 항체를 동정하는 것이다. CD41(혈소판), CD66b(과립구), CD235(RBC), CD45(림프구) 항체의 조합이 사용되어 이러한 오염 엑소좀을 제거할 수 있다. 이는 당업자가 훨씬 더 큰 혈장 샘플을 처리하는 것을 허용하고, 조직 특이성 RNA를 풀 아웃하는 것을 훨씬 더 효율적으로 만든다.
본 발명자들이 어떤 조직 또는 어떤 세포 유형(예를 들면, 간세포만)을 연구하고자 하는 지를 본 발명자들이 정확히 이해하고 있는 대안은 고갈보다는 오히려 직접 면역강화(immunoenrichment)를 수행하는 것이다. 이러한 사례에서, 본 발명자들은 간 특이적인 엑소좀을 면역강화하기 위해서 조직 특이적 Ab(예를 들면, 간세포에 대한 ASGR1)를 사용할 것이다.
본 명세서에서 기술된 방법, 시스템 및 키트는 압박(duress) 하에 유사 장애 및 유사 조직을 둘 다 동시적으로 측정하도록 하기 위해서 마커 유형의 조합을 이용하는 장애의 신속 비침습적 검출에 관한 것이다. 본 명세서에서의 개시내용의 실시를 통해, 당업자는, 영향을 받고 있는 것으로 의심되는 조직 또는 조직들의 임의의 침습적 연구조사를 요구하는 일 없이, 질환 동일성 및 하나 이상의 조직에 미치는 그 질환의 영향 정도에 관한 예측을 신뢰성 있게 만들 수 있다.
빈번하지만 비배타적으로, 마커 중 하나는, 기원 조직으로부터의 RNA의 상대적 구성에서의 증가가 그 기관 내의 압박을 나타내거나 그 기관에 특이적이 되도록, 기원 조직에 용이하게 상관관계가 있을 수 있는 순환 RNA이다. 기관으로부터 유도된 단일 마커 및 집합체 RNA는 둘 다 다양한 실시양태에서 조직 상태의 지시자로서 고려된다. 대안적으로 또는 조합적으로, 순환 DNA, 예컨대 조직 특이적 방식으로 별도로 메틸화되어 있는 DNA는 조직 특이적 마커의 일부로서 또는 전부로서 포함된다.
동시적으로, 장애의 유형을 나타내는 마커가 또한 측정된다. 단백질, 스테로이드, 리피드, 콜레스테롤 또는 헥산, 예컨대 DNA 또는 RNA를 포함하는, 장애 유형의 지시자로서 고려된 광범위한 마커가 존재한다. 질환 또는 장애에 연루된 단백질을 암호화하는 특정 전사물과 같은 RNA는 매우 유용한데, 이는 질환 상태를 나타내는 메틸화 패턴을 갖는 DNA가 존재하기 때문이다. 빈번하나 항상 그런 것이 아니지만, 질환 마커는 또한 예를 들어 채혈로부터 쉽게 얻어지는 순환 마커이기도 하다. 그러나, 대안, 예컨대 X선, MRI 또는 다른 데이타가 일부 질환에 대한 마커로서 고려된다.
이들 마커의 수준 또는 동일성을 기준 값 또는 데이타 세트와 비교함으로써, 당업자는, 환자 또는 환자 샘플을, 특정 질환 또는 기관으로서 국소화된 환자에서의 특정 질환을 나타내는 것으로서 카테고리화할 수 있다. 그 기준 값 또는 데이타 세트는 질환 및 조직에 따라 다양할 것이며, 하나 이상의 건강한 개인으로부터의 데이타, 질환 또는 조직 압박의 다양한 정도로 고통 받고 있는 하나 이상의 개인으로부터의 데이타, 중간 개인으로부터의 데이타, 및 모델로부터 예측된 데이타를 다양하게 포함할 것이다. 샘플은, 그의 값이 임계치 위에 또는 아래에 개인적으로 또는 집합적으로 존재할 때, 또는 그 값이 장애 또는 병태와 상관관계가 있는 기준 데이타 세트와 유의적으로 상이하지 않을 때, 또는 그 값이 질환 또는 장애의 부재와 상관관계가 있는 기준 데이타 세트로부터 유의적으로 상이할 때, 장애 또는 병태를 나타내는 것으로서 카테고리화할 수 있다.
실제 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 방법, 시스템 및 키트는 일상적인 기준에서 위험에 처한 집단에 있어서, 복수의 기관에서, 병태 또는 복수의 병태의 발병 또는 진행에 대하여 선별하는데 이용될 수 있다. 이는 만성 병태, 예컨대 대사 증후군, 비만, 당뇨병, 신경변성 장애 및 암을 지닌 대상체에서 특히 유용할 수 있으며, 상기 병태에서는 하나 이상의 조직이 부상, 손상 또는 부전의 위험에 처해 있다.
대사 증후군 및 비만은 전세계 집단의 크게 지속 성장하는 백분율에 영향을 미친다. 이러한 집단은 생명 위협하는 합병증, 예컨대 심장 마비, 뇌졸중, 간경변, 췌장 피로, 및 신부전의 발병 위험이 지속적으로 비교적 높다. 이로써, 이러한 집단은 기관 및 조직의 어레이에서 합병증의 발병 위험이 지속적으로 존재한다. 유사하게도, 수 많은 암은 돌연변이되어 다른 조직 및 기관으로 전이되는 위험이 지속적으로 존재한다. 게다가, 암에 대한 치료는 성공의 불활실성을 갖는 채로 종종 실시되고 있으며, 이러한 치료가 효과적인지 아니면 독성이 되는지 여부를 신속하게 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 예시적인 사례에서, 전통적인 방법, 예컨대 영상 기법 및 생검을 이용하여 일상적인 기준으로 대상체를 평가하는 것이 실제적이지 못하다. 그러나, 본 명세서에서 기술된 것들과 같은 방법, 시스템 및 키트는 대상체에 있어서 하나 이상의 기관에서 모욕, 증가된 위험 및 치료 효과를 신속하게 검출하는 것을 제공함으로써, 급성 합병증에 대한 만성 병태, 질환 진행 및 치료 효과를 지닌 대상체를 모니터링하는 수단을 제공한다.
하기 방법, 키트 및 시스템은, 병태 또는 질환에 의해 손상 또는 영향을 받고 있거나 압박하에 있는 대상체의 조직 또는 기관을 신속하고 비침습적으로 검출하기 위한 것이다. 일부 경우, 하기 방법, 키트 및 시스템은 또한 어떤 질환 또는 병태가 압박하에 있는 조직에 영향을 미치는지 또는 질환 또는 병태가 조직에 영향을 미치는 정도를 결정한다. 혈장, 타액 또는 소변과 같은 샘플을 대상체로부터 수집하고 대상체에서 질환 및 질환 위치를 나타낼 수 있는 마커 및 무세포 폴리뉴클레오티드에 대해 분석한다. 이들 방법, 키트 및 시스템은 일반적으로, 혈장 또는 소변 샘플 중의 무세포 RNA와 같은, 압박하에 있는 조직 또는 기관으로부터 생물학적 유체로 방출 또는 분비된 순환하는 무세포 핵산에 의존한다. 특정 조직에서 특이적으로 발현되거나 우세하게 발현되는 유전자에 집중함으로써, 총 순환 RNA에 대한 조직으로부터의 RNA의 상대적 기여에 기초하여 그 조직의 건강 상태에 관한 추론 또는 결론이 도출될 수 있다. 상대적 기여를 정량화함으로써, 침윤성 생검 또는 거시 규모 제한 조영 기술 없이 병태에 의해 영향을 받는 조직을 유리하게 찾을 수 있다. 조직-특이적 핵산을 다양한 병태에 대한 마커와의 조합으로 사용하여, 치료법을 선택하고, 치료 효과를 모니터링하며, 질환 또는 병태의 진행을 모니터링한다.
압박하에 있는 질환 및 조직을 식별하는 것은 시험 대상체의 샘플 중의 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 및 마커의 수준을 대조군 대상체로부터의 적어도 하나의 샘플의 수준과 비교하는 것을 필요로 할 수 있다. 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 및 마커는 본원에서 패널로서 일컬어질 수 있다. 일부 경우, 시험 대상체로부터 수득된 샘플 중의 마커 및 조직-특이적 폴리뉴클레오티드의 수준을 대조 대상체의 수준과 비교한다. 일부 경우, 시험 대상체로부터 수득된 샘플 중의 마커 및 조직-특이적 폴리뉴클레오티드의 수준을 다수의 대조군 대상체에서의 해당 수준의 평균과 비교한다. 대조군 대상체는 관심 병태를 가질 수 있거나 또는 대조군 대상체는 병태를 갖는 않는 대상체일 수 있다.
방법, 시스템 및 키트는 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 및/또는 마커의 패널을 검출 또는 정량화하기 위해 제공된다. 유전자 발현은 대상체 집단 내에서 및 대상체 집단 사이에서(예컨대, 상이한 인종군 사이에서) 매우 다양할 수 있으며, 이러한 경우, 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 및/또는 마커의 패널이 특히 유용할 수 있다고 인식된다. 예컨대, 방법은 패널을 하나 이상의 대조군 패널과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 각각의 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 및 마커의 발현 수준은 유사하지 않을 수 있지만, 패널이 대조군 패널과 충분히 유사하거나 충분히 상이하다면 대상체의 상태 또는 조직(들)에 대해 결론 또는 추론이 여전히 이루어질 수 있다. 이러한 방식으로, 패널은 단일의 조직-특이적 폴리뉴클레오티드 또는 질환의 단일 마커를 사용하는 것보다 이점을 제공할 수 있다. 일부 경우, 방법은 제1 시점에서의 대상체의 패널을 제2 시점에서의 대상체의 패널과 비교하는 것을 포함한다. 따라서, 단일 대상체의 자연적 유전자 변이 및 유전자 발현 변동이 제어되고, 영향을 받은 조직(들) 또는 상태의 변화로 인해 패널간 차이의 가능성이 더 커진다. 일부 경우, 패널은 비폴리뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다. 패널은 폴리뉴클레오티드 및 다른 생물학적 분자(예컨대, 펩티드, 지질, 병원체 단편 등)를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법, 키트 및 시스템은 대상체의 질환 또는 병태의 발병 가능성 또는 위험, 질환 또는 병태의 진행 또는 중증도, 또는 질환 또는 병태에 대한 요법 또는 치료의 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 키트, 시스템 및 방법은, 마커 또는 조직-특이적 폴리뉴클레오티드의 제1 수준을 마커 또는 조직-특이적 핵산의 제2 수준과 비교하여 병태의 위험, 병태의 진행 상태, 또는 치료에 의한 병태의 개선을 구별하기에 충분히 민감하고 정확하다. 일부 경우, 마커 또는 조직-특이적 핵산의 제1 수준은 제1 시점에서 대상체로부터의 샘플에 상응하고 마커 또는 조직-특이적 핵산의 제2 수준은 제2 시점에서 대상체로부터의 제2 샘플에 상응한다.
본원에 개시된 키트, 시스템 및 방법을 사용하여 다수의 질환 및 조직을 동시에 평가할 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 개시된 키트, 시스템 및 방법을 사용하여 하나 이상의 병태의 존재 또는 부재를 평가하고 영향을 받은 조직 및 영향을 받지 않은 조직 둘 다를 식별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 본원에 개시된 방법, 시스템 또는 키트에 의해 생성된 결과에 기초하여 의료 행위를 선택 또는 추천하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 결정에 기초하여 맞춤형 의료 행위가 추천되고 선택적으로 취해진다. 일부 경우, 맞춤형 의료 행위는 예컨대 조직의 방사선 치료 또는 주사 치료에 의해 압박하에 있는 조직을 직접 치료하는 것을 포함한다. 의료 행위의 비제한적 예는 추가의 시험(예컨대, 생검, 조영, 수술)을 수행하는 것, 질환 또는 병태에 대해 대상체를 치료하는 것, 및 대상체의 치료를 변경하는 것(예컨대, 약학 조성물의 용량 변경, 약학 조성물의 투여 중단, 다른 또는 추가의 약학 조성물의 투여)을 포함한다.
본원에 개시된 시스템, 방법 및 키트는 다수의 조직에서 병태 또는 질환을 검출하기 위해 제공될 수 있다. 일부 경우, 대상체는 병태의 정도 또는 중증도에 따라 하나 이상의 조직에 영향을 미치는 것으로 알려진 병태를 갖는다. 본원에 개시된 것과 같은 시스템, 방법 및 키트는 유리하게도 압박하에 있는 다수의 조직의 식별 및 표적화된 치료를 가능하게 한다. 예컨대, 본원에 개시된 시스템은 대상체에서 염증을 검출하고 순환하는 간-특이적 RNA 및 심장-특이적 RNA의 수준으로 인해 간 및 심장이 염증에 의해 영향을 받는지를 결정하기 위한 마커를 제공할 수 있다. 또한, 예컨대, 상기 방법은 암과 연관된 돌연변이(예컨대, 암의 원인 또는 결과로서 발생하는 돌연변이)를 보유하거나 또는 암을 지시하는 수준으로 존재하는 혈장 샘플 중의 무세포 RNA를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일단 암의 존재가 검출되면, 상기 방법은 다양한 조직으로부터의 조직-특이적 상대적 기여 무세포 RNA를 정량화하여 어느 조직이 종양을 보유하고 있는지 또는 그 시작을 결정하는 것을 더 포함할 수 있다.
손상된 조직을 검출하는 것에 더하여, 상기 방법은 조직 손상을 야기하는 병태의 식별 또는 구별을 추가로 제공한다. 비제한적인 예로서, 대상체에서 간 손상을 검출하고 간 손상을 유발하는 병태를 식별하며 대상체를 치료하기 위한 요법을 선택하고 요법의 효과를 모니터링하는 방법이 본원에 개시된다. 인간의 간에서 주로 발현되는 유전자에 상응하는 무세포 RNA는 대상체의 혈장 샘플에서 정량화된다. 혈장 샘플에서 이러한 RNA의 수치가 높아지면 간 손상이 있음을 지시한다. 본원에 개시된 바와 같은 질환의 식별 또는 구별은 일반적으로 조직-특이적 RNA를 단순히 검출하는 것이 아니라 이를 정량화하고 질환의 마커를 정량화하는 것에 의존한다. 예컨대, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 더 진행된 심각한 질환인 비알코올성 지방 간염(NASH)은 유사한 간-특이적 RNA 및 마커에 의해 확인될 수 있지만, NAFLD보다 NASH에서 간 손상이 더 많이 발생하기 때문에 이들 분자의 수준은 NAFLD의 경우보다 NASH의 경우에 더 높을 수 있다. 대부분의 경우 NAFLD보다 NASH에서 간 손상이 더 많이 발생하기 때문에, NAFLD의 경우보다 NASH의 경우에 간으로부터 더 많은 간-특이적 RNA가 방출될 것이다.
본원에 개시된 시스템 및 방법은 빠른 결과를 제공하고 비침습적이며 값싸기 때문에, 대상체에서의 질환의 존재 및 위치가 질환의 초기 단계에 결정될 수 있다. 따라서, 대상체는 초기 단계에 비하여 제어 또는 치료가 비교적 더 곤란한 진행 단계로 질환이 진행되기 전에 유리하게 치료받을 수 있다. 예컨대, 본원에 개시된 시스템 및 방법은, 종양이 CT 또는 PET 스캔과 같은 조영 기술로 가시화될 정도로 충분히 크기 전에 어느 조직(들) 또는 기관(들)이 암성 세포를 갖는지 판단하게 할 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 질환의 초기 단계에서 국소 주입 및 표적화된 방사선 치료와 같은 집중된 분석 및 표적화된 요법을 제공한다.
유리하게는, 본 방법 및 시스템은 조직 손상 정도에 적합한 또는 최적인 요법에 의한 치료를 제공한다. 일부 경우, 본 방법은 요법의 효과 또는 독성을 평가하기 위해 마커 및/또는 조직-특이적 폴리뉴클레오티드를 검출/정량화하는 것을 포함한다. 일부 경우 요법이 지속된다. 다른 경우, 요법이 중단되고 및/또는 다른 요법으로 대체된다. 어떻든 상관없이, 본 방법 및 시스템의 빠르고 비침습적인 성질로 인해, 치료 효과는 종래의 치료 최적화에 비해 더 자주 평가되고 최적화될 수 있다.
비제한적인 예로서, 종래의 프랙티스에 따르면, 암 치료를 받는 환자에게 화학요법을 투여하고 3개월 후에 MRI를 수행하여 종양 크기가 감소되는지를 판단한다. 종양 크기의 증가가 관찰되면 의사는 다른 요법을 처방하지만 종양은 이미 전이되었다. 대조적으로, 본원에 개시된 방법을 사용하면, 치료 시작 후 1주 내지 2주 환자를 테스트하여 치료 효과의 마커 및 종양을 보유한 조직에 상응하는 조직-특이적 핵산의 수준을 평가한다. 조직-특이적 핵산 및 마커의 수준이 요법이 비효과적임을 나타내는 경우, 의사는 유사한 방법에 의해 효과적이라고 빨리 판단되는 다른 요법을 처방한다. 후자의 경우, 종양은 조영 기술을 이용하는 종래의 방법에 비해 성장 시간이 짧아서 전이하지 않아, 환자에게 더 나은 예후를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 시스템, 샘플, 마커 및 조직-특이적 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 일부 경우, 압박하에 있는 대상체의 조직 또는 기관 뿐만 아니라 압박의 원인인 질환 또는 병태를 비침습적으로 검출하기 위한 시험관내 샘플의 용도가 본원에 개시된다. 일부 경우, 압박하에 있는 대상체의 조직 또는 기관 뿐만 아니라 압박의 원인인 질환 또는 병태를 비침습적으로 검출하기 위한 생체외 샘플의 용도가 본원에 개시된다. 일반적으로, 본원에 개시된 용도는 생체외 샘플 및 시험관내 샘플을 포함하는 샘플에서 마커 및 조직-특이적 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 용도는 제1 샘플에서의 마커의 양과 조직-특이적 폴리뉴클레오티드의 양을 비교하고 그 양을 제2 샘플에서의 각각의 양과 비교하는 것을 포함한다. 일부 경우, 제1 샘플은 제1 대상체에서 유래하고 제2 샘플은 대조군 대상체(예컨대, 건강한 대상체 또는 병태를 갖는 대상체)에서 유래한다. 일부 경우, 제1 샘플은 제1 시점에서 대상체로부터 유래한 것이고 제2 샘플은 제2 시점에서 동일한 대상체에서 유래한 것이다. 제1 시점은 대상체에게 요법이 투여되기 전에 수득될 수 있고 제2 시점은 요법 후에 수득될 수 있다. 따라서, 대상체의 병태, 대상체의 조직 건강 상태, 또는 치료제의 효과를 모니터링 또는 평가하기 위한, 본원에 개시된 샘플, 마커, 조직-특이적 폴리뉴클레오티드, 키트 및 시스템의 용도가 또한 본원에 제공된다.
특정 용어
하기 설명은 본원에 개시된 방법, 시스템 및 키트의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본원에서 사용되는 하기 용어 설명은 이들 용어의 정의를 제한하려는 것이 아니다. 이들 용어는 본원 전체에 걸쳐 추가로 설명되고 예시된다.
본원에 기재된 방법, 시스템 및 키트는 일반적으로 무세포 핵산을 검출하고 정량화한다. 이러한 이유로, 본원에 기술된 생물학적 샘플은 일반적으로 무세포성 생물학적 유체이다. 비제한적인 예로서, 대상체로부터의 샘플은 세포가 제거된 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 척수액일 수 있다. 예컨대, 생물학적 분자는 대상체의 혈류에서 순환할 수 있으므로, 대상체로부터의 혈액 또는 혈청 샘플에서 마커를 검출하거나 정량화하는 데에 검출 시약이 사용될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "혈장" 및 "혈청"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 일부 경우에, 둘다 명세서 또는 청구범위에 의해 커버됨을 나타내기 위해, 이들은 샘플 종의 단일 리스트에 포함된다.
본원에 기술된 용어 "조직특이적 폴리뉴클레오티드", 예컨대 "조직특이적 RNA"는 일반적으로 특정 조직에서 주로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 종종, 본원에 개시된 방법, 시스템 및 키트는 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 본원에 기재된 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드는, 이들이 발현되는 조직 또는 기관의 손상시, 생물학적 유체에서 정량화될 수 있는 수준으로 발현되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 생물학적 유체 중 본원에 개시된 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 존재는, 조직 또는 기관의 손상시의 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 방출에 기인하며, 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 발현의 변화에 기인하는 것이 아니다. 본원에 개시된 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 상승된 수준은 상응하는 조직 또는 기관의 손상을 나타낸다. 일부 경우에, 본원에 개시된 무세포 폴리뉴클레오티드는 여러 조직에서, 그러나 이들 조직 중 하나 이상에서 조직특이적 수준으로 발현/생성된다. 이러한 경우에, 무세포의 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 절대적 또는 상대적 양은 특정 조직 또는 기관에 대한 손상, 또는 조직 또는 기관의 수집을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 조직특이적 폴리뉴클레오티드는 조직특이적 변형을 갖는 핵산이다. 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 조직특이적 폴리뉴클레오티드 또는 마커는 조직특이적 메틸화 패턴을 갖는 DNA 분자(예컨대, 유전자 또는 비코딩 영역의 일부)를 포함한다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오티드 및 마커는 많은 조직에서 유사하게, 또는 심지어 대상체 전체에서 편재적으로 발현될 수 있지만, 변형은 조직특이적이다. 일반적으로, 본원에 개시된 조직특이적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 수준은 질환에 특이적이지 않다. 일반적으로, 본원에 개시된 조직특이적 폴리뉴클레오티드는 질병 메커니즘에 연루된 단백질을 코딩하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "마커"는 광범위한 생물학적 분자를 포함한다. 마커는 또한 본원에서 질병 마커 또는 질병의 마커로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 마커는 복수의 질병과 관련된 병태에 대한 것이다. 예컨대, 마커는 심혈관 질환, 간염 및 암과 관련될 수 있는 염증에 대한 것일 수 있다. 비제한적 예로서, 마커는 펩티드, 호르몬, 지질, 비타민, 병원체, 세포 단편, 대사산물 및 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 마커는 무세포 핵산이다. 일반적으로, 본원에 개시된 마커는 조직특이적이지 않다. 그러나, 드문 경우에, 마커는 조직특이적이다. 본원에 개시된 마커는 또한 질병 바이오마커로 지칭될 수 있다. 질병 바이오마커는 질병의 결과로서 존재하거나 생성되거나, 질병의 결과로 조절되지 않거나, 질병에 기계적으로 연루되거나, 질병 상태에서 돌연변이되거나 또는 변형되거나, 또는 이들의 임의의 조합인 생물학적 분자이다. 마커는 대상체에 의해 생성될 수 있다. 마커는 다른 종에 의해 생산될 수도 있다. 예컨대, 마커는 간염 바이러스 또는 스트렙토코커스 박테리아에 의해 제조된 핵산 또는 단백질일 수 있다. 이러한 마커를 식별하는 방법은 이들 병원체에 의해 감염되거나 영향을 받는 조직을 결정하고, 임의로 조직(들)이 손상되는 정도를 결정하기 위해 조직특이적 폴리뉴클레오티드를 검출/정량화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 질병의 마커는 일반적으로 질병의 영향을 받지 않는 개체에서 순환하지 않는다.
일반적으로, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "무세포 폴리뉴클레오티드" 및 "무세포 핵산"은 세포로부터 폴리뉴클레오티드를 추출하지 않고 샘플로부터 단리될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 개시된 무세포 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 손상된 조직 또는 손상된 기관으로부터 방출 또는 분비된 폴리뉴클레오티드이다. 예컨대, 조직 또는 기관의 손상은, 손상된 조직의 세포로부터 무세포 폴리뉴클레오티드를 순환계로 방출하면서, 세포 용해를 초래하는, 질병, 상해 또는 다른 병태에 기인할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 무세포 폴리뉴클레오티드는 조직특이적이다. 다른 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 조직특이적이지 않다. 일부 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 세포에 존재하거나 세포와 접촉한다. 일부 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 소기관, 소포 또는 엑소좀과 접촉한다. 일부 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 무세포이며, 즉, 무세포 폴리뉴클레오티드는 세포와 접촉하지 않는 것을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 무세포 폴리뉴클레오티드는 자유롭게 순환한다. 일부 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 자유롭게 순환하고, 즉, 무세포 폴리뉴클레오티드는 소포, 소기관 또는 세포와 접촉하지 않는다. 일부 경우에, 무세포 폴리뉴클레오티드는 임의의 다른 분자가 아닌, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질(전이 효소, 리보솜 단백질 등)과 관련이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약" 숫자는 그 숫자의 플러스 또는 마이너스 10%의 숫자를 의미한다. "약" 범위라는 용어는 최저값의 마이너스 10% 내지 최대값의 플러스 10% 범위를 나타낸다.
명세서 및 청구 범위에 사용된 바의 단수형은 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 복수에 대한 지칭을 포함한다. 예컨대, 용어 "샘플"은 이들의 혼합물을 비롯한 복수의 샘플을 포함한다.
용어 "결정하기", "측정하기", "평가하기" 및 "분석하기"는 종종 측정 형태를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 요소가 존재하는지 또는 아닌지를 결정하는 것(예컨대 검출)을 포함한다. 이들 용어는 정량적, 정성적, 또는 정량적 및 정성적 결정을 포함할 수 있다. 평가는 대안적으로 상대적이거나 절대적이다. "존재의 검출"은 존재하는 것의 존재 여부를 결정하는 것 뿐만 아니라, 존재하는 것의 양을 결정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하기"는 수용자에서 유리한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 약학적 또는 다른 중재 요법을 지칭하는 데에 사용된다. 유리한 또는 원하는 결과는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 치료적 이익은 치료되는 증상 또는 기저 질환의 근절 또는 완화를 지칭할 수 있다. 또한, 기저 질환과 관련된 하나 이상의 생리학적 증상의 근절 또는 완화와 함께 치료적 이익이 달성될 수 있어서, 대상체가 여전히 기저 질환으로 고통받을 수 있음에도 불구하고 대상체에서 개선이 관찰된다. 예방 효과는 질병 또는 병태의 출현의 지연, 예방 또는 제거, 질병 또는 병태의 증상의 발현의 지연 또는 제거, 질병 또는 병태의 진행의 늦춤, 중단 또는 역전, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예방적 이익을 위해, 특정 질환의 발병 위험이 있는 대상체 또는 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체는, 이 질병의 진단이 이루어지지 않았더라도 치료를 받을 수 있다.
방법
상기 및 하기 설명에서 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 방법은 압박 하의 대상체에서 조직 또는 기관을 비침습적으로 검출할 뿐 아니라, 압박 하의 조직 또는 기관에 질병 또는 병태가 영향을 미치는지를 결정하기 위한 것이다. 본원에 개시된 일부 방법은 대상체에서 질병 또는 병태의 단계 또는 진행을 결정하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 데에 사용되는 요법에 대한 반응을 결정하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 대상체의 특정 조직 또는 기관이 손상, 상해 또는 감염되었는지를 결정하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 대상체의 특정 조직 또는 기관이 질병 또는 병태에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 본원에 개시된 생물학적 분자를 검출 또는 정량화하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 본원에 개시된 마커 및/또는 조직특이적 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 정량화하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 일부 방법은 대상체의 샘플 중 1종 이상의 핵산을 검출, 정량화 및/또는 분석하는 것을 포함한다. 상기 방법은 생물학적 샘플 중 1종 이상의 핵산을 검출, 정량화 및/또는 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 동결되어 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 동결되어 있지 않다. 조직특이적 폴리뉴클레오티드는 조직특이적 무세포 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 방법은 마커 및/또는 조직특이적 무세포 폴리뉴클레오티드의 양을, 각각 마커의 기준 수준 및 조직특이적 폴리뉴클레오티드의 기준 수준과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 기준 수준과의 비교가 필요하지 않다. 예컨대, 마커 및/또는 조직특이적 무세포 폴리뉴클레오티드의 존재가, 질병 또는 병태를 검출하거나, 특정 조직이 질병 또는 병태에 의해 손상, 상해 또는 감염되는지를 결정하기에 충분할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 질병 또는 병태의 진단 또는 예후, 또는 이의 진행의 평가를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용은 혈액 세포 중 혈액 샘플을 고갈시키는 단계; 및 엑소좀의 혈액 샘플을 고갈시키는 단계를 포함하는, 혈액 샘플 중 비혈액 RNA를 순환시키기 위한 농축(enriching) 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시 내용은 혈액 세포의 혈액 샘플을 고갈시켜 세포가 고갈된 혈액 샘플을 생성하는 단계; 및 세포가 고갈된 혈액 샘플을 혈액 세포 표면 결합 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하는, 혈액 샘플 중 비혈액 RNA를 순환시키기 위한 농축 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; (b) 혈액 샘플로부터 세포를 제거하여 세포가 고갈된 샘플을 얻는 단계; (c) 혈액 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하여 미소입자가 고갈된 샘플을 얻는 단계; 및 (d) 미소입자가 고갈된 샘플 중 유전자에 상응하는 RNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; (b) 혈액 샘플을 원심 분리 또는 여과하여 혈장 샘플을 얻는 단계; (c) 혈장 샘플을 여과하여 혈장 샘플로부터 혈소판을 제거하여, 세포가 고갈된 샘플을 생성하는 단계; (d) 세포가 고갈된 샘플을 세포-표면 단백질 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 세포-표면 단백질 결합 모이어티는 세포가 고갈된 샘플 중 혈액-세포 엑소좀 상의 세포-표면 단백질에 결합할 수 있는 단계; (e) 세포가 고갈된 샘플로부터 세포-표면 단백질 결합 모이어티를 제거하여, 세포가 고갈된 샘플로부터 혈액-세포 엑소좀을 제거하는 단계; 및 (f) 세포가 고갈된 샘플 중 순환 무세포 RNA를 정량화하는 단계로서, 무세포 RNA는 관심있는 조직에 의해 발현되는 단계를 포함한다.
세포의 제거
일부 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 개시된 샘플(예컨대, 생물학적 유체, 혈액, 혈장 샘플, 세포가 고갈된 샘플)로부터 세포를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 세포를 제거하는 단계는 샘플을 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 세포를 제거하는 단계는 샘플을 1 회 초과하여 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 세포를 제거하는 단계는 샘플을 2 회 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 샘플을 약 5,000g 내지 약 25,000g에서 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 샘플을 약 8,000g 내지 약 20,000g에서 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 샘플을 약 12,000g 내지 약 18,000g에서 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 샘플을 약 14,000g 내지 약 18,000g에서 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 샘플을 약 16,000g에서 원심 분리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 세포를 제거하는 단계는 샘플을 여과하는 단계를 포함한다. 샘플을 여과하는 단계는 샘플을 약 200 마이크론 내지 약 1000 마이크론의 공경을 갖는 필터와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 샘플을 여과하는 단계는 샘플을 800 마이크론 필터와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 개시된 샘플로부터 세포를 제거하여 본원에 기재된 바와 같은 세포가 고갈된 샘플을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플에는 실질적으로 세포가 없다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 10개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 50개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 100개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 150개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 200개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 500개 미만의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 세포가 고갈된 샘플은 약 1000개 미만의 세포를 포함한다.
일부 경우에, 세포는 혈액 세포이다. 일부 경우에, 세포는 백혈구이다. 일부 경우에, 세포는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 줄기 세포 전구체, 대식 세포, 단핵구, 과립구, 혈소판, 적혈구, 순환 내피 세포 또는 순환 상피 세포에서 선택된다. 일부 경우에, 세포는 혈소판이다. 일부 경우에, 세포는 과립구이다.
본원에 개시된 일부 방법은 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 약 90% 이상을 제거하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 약 95% 이상을 제거하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 약 75% 이상 내지 약 95% 이상을 제거하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 약 75% 이상 내지 약 99% 이상을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 세포는 샘플 중 세포 단편을 포함한다. 이러한 샘플은 본원에서 "세포가 고갈된 샘플"로 지칭될 수 있다.
세포외 미소입자의 제거
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 본원에 개시된 샘플(예를 들어, 생체액, 혈액, 혈장 샘플, 세포 고갈된 샘플)로부터 세포외 미소입자를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 샘플로부터 하나 이상의 세포외 미소입자를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 샘플로부터 복수의 세포외 미소입자를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 세포외 미소입자는 엑소좀, 소낭, 미세소낭, 엑소좀-유사 소낭, 또는 미소입자로서 특성화되거나 또는 이로 지칭된다. 일부 경우에서, 세포외 미소입자는 엑소좀이다. 일부 경우에서, 세포외 입자는 백혈구로부터의 것이다. 일부 경우에서, 세포외 입자는 혈액 세포로부터의 것이다. 일부 경우에서, 세포외 입자는 순환 세포로부터의 것이다. 혈장 또는 혈청 중의 90% 초과의 엑소좀은 혈액 세포로부터의 것이다. 본원에 개시된 방법은 이러한 세포외 미소입자를 제거하고, 이에 의해 순환-세포 무함유 핵산 정량화의 정확도 및 민감도를 개선한다.
일부 방법은 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 샘플은 세포 고갈된 샘플이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 순환 세포에 의해 발현되는 것으로 알려진 세포 표면 마커와 상호 작용한다. 일부 경우에서, 순환 세포는 골수 유래 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 혈액 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 백혈구이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 T 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 B 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 수지상 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 자연 살해 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 줄기 세포 전구체이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 대식세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 단핵구이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 과립구이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 혈소판이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 적혈구이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 순환 내피 세포이다. 일부 경우에서, 순환 세포는 순환 상피 세포이다.
일부 방법은 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질에 대한 수용체 또는 리간드이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 결합 단백질이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 소분자이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 압타머 또는 핵산이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 지질, 지방산, 스테롤 또는 다른 생체고분자이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 항체이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 항원-결합 항체 절편이다. 일부 경우에서, 항체 또는 이의 항원 결합 절편은 GypA, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33, CD66b, CD41, CD42b, CD61, CD62, CD138, CD235a, CD146 또는 CD326으로부터 선택된 세포 표면 마커와 결합한다. 일부 경우에서, 세포외 미소입자는 백혈구로부터의 것이고, 세포 표면 마커는 CD45이다. 일부 경우에서, 세포외 미소입자는 과립구로부터의 것이고, 세포 표면 마커는 CD66b이다.
일부 방법은 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 고형 지지체에 부착된다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 고형 지지체에 연결된다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 고형 지지체에 접합된다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 고형 지지체와 상호 작용한다. 고형 지지체의 비제한적인 예는 비드, 컬럼, 플레이트, 또는 어레이이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 샘플과 불혼화성인 용액에 대한 친화성을 갖고, 이로써 샘플이 결합 모이어티와 접촉된 이후에 용액이 샘플에 첨가되는 경우, 결합 모이어티는 용액으로 분리되어 샘플로부터 세포외 입자가 제거된다.
일부 방법은 복수의 세포외 미소입자의 표면 상의 복수의 단백질과 상호 작용하는 복수의 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 2개 이상의 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 3개 이상의 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 4개 이상의 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 약 2개의 결합 모이어티 내지 약 5개의 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 방법은 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 제1 결합 모이어티는 제1 세포 상의 제1 단백질과 상호 작용하고, 제2 항체는 제2 세포 상의 제2 단백질과 상호 작용한다. 일부 경우에서, 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 상이하다. 일부 경우에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하다. 예로서, 일부 경우에서, 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 동일한 단백질을 표적화하지만, 결합 모이어티가 대상체의 샘플에서 가장 잘 작용하는 것에 대한 불확실성이 존재하기 때문에 둘 모두가 사용된다. 일부 경우에서, 제1 결합 단백질 및 제2 결합 단백질은 상이하다. 일부 경우에서, 제1 결합 단백질 및 제2 결합 단백질은 약 10개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 경우에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 100개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 경우에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 200개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 경우에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 400개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 경우에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 상이한 유전자로부터 발현된다. 일부 경우에서, 제1 단백질은 제2 세포 상에서 발현되지 않고, 제2 단백질은 제1 세포 상에서 발현되지 않는다. 일부 경우에서, 제1 세포 및 제2 세포는 2개의 상이한 유형의 백혈구이다. 일부 경우에서, 방법은 본원에 개시된 바와 같이 세포외 미소입자를 제거하는 것과 유사한 방식으로 세포 절편을 제거하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 일부 방법은 본원에 개시된 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 방법은 본래 혈액 샘플에 존재하였던 세포외 미소입자의 90% 이상의 혈액 샘플을 고갈시킨다. 일부 경우에서, 방법은 본래 혈액 샘플에 존재하였던 세포외 미소입자의 99% 이상의 혈액 샘플을 고갈시킨다.
본원에 개시된 일부 방법은 세포, 세포 절편, 및 세포외 미소입자 이외에도 샘플 중의 추가의 성분을 제거하는 단계를 포함한다. 추가의 성분의 비제한적인 예는 마이크로RNA, 리보솜 RNA, 및 tRNA 등이다.
세포외 미소입자의 포집
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 단백질 결합 모이어티와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 단백질 결합 모이어티는 혈장 샘플 중의 세포외 미소입자 상의 표면 단백질과 결합할 수 있고, 세포외 미소입자는 대상체의 조직으로부터의 것인 단계; 세포 고갈된 샘플로부터 단백질 결합 모이어티를 제거하고, 이에 의해 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하는 단계; 및 세포외 미소입자 중의 핵산을 정량화하는 단계로서, 상기 핵산은 조직에 의해 발현되는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 혈액이 아니다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 고형 기관(solid organ)이다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 간이고, 단백질 결합 모이어티는 SLC7A10 또는 지방산 결합 단백질 4(FABP4)와 상호 작용한다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 지방조직(adipose)이고, 단백질 결합 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 1(ASGR1), 또는 신경교섬유질 산성 단백질(GFAP)과 상호 작용한다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 신경 조직(neurological tissue)이고, 단백질 결합 모이어티는 글루타메이트 아스파르테이트 전달체(GLAST)와 상호 작용한다. 일부 경우에서, 관심대상의 조직은 신장이고, 단백질 결합 모이어티는 감마-글루타밀-트랜스퍼라제와 상호 작용한다. 일부 경우에서, 세포-표면 단백질 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 절편이다. 일부 경우에서, 세포외 미소입자는 엑소좀이다. 조직 또는 종양으로부터의 엑소좀의 비제한적인 예는 프로스타좀(prostasome), 에피디디모좀(epididimosome), 덱소좀(dexosome), 텍소좀(texosome) 및 온코좀(oncosome)을 포함한다.
핵산의 정량화
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체의 샘플 중의 RNA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같이 변경되거나 또는 처리된다. 일부 경우에서, RNA는 무세포 RNA이고, 이는 또한 순환 세포 무함유 RNA로도 지칭될 수 있다. 일부 경우에서, RNA는 세포, 세포 절편, 세포외 미소입자(예를 들어, 엑소좀), 또는 이의 절편에 부착되지 않는다. 일부 경우에서, RNA는 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 경우에서, RNA는 본질적으로 mRNA로 이루어진다. 일부 경우에서, RNA는 mRNA이다. 일부 경우에서, RNA는 약 75개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 경우에서, RNA는 100개의 뉴클레오티드 내지 약 250개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 경우에서, RNA는 약 125개의 뉴클레오티드 내지 약 225개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 경우에서, RNA는 약 300개의 뉴클레오티드 내지 약 5000개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 방법은 샘플에 대한 RNA의 상대적인 기여도(relative contribution)를 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 방법은 샘플의 총 RNA 중의 RNA의 분율을 정량화하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 일부 방법은 RNA를 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 정량화는 Q-PCR을 포함한다. 일부 경우에서, 정량화는 다중 PCR(multiplexed PCR)을 포함한다. 일부 경우에서, 정량화는 어레이 검출 방법(예를 들어, 마이크로어레이)를 포함한다. 일부 경우에서, 정량화는 프라이밍 및 템플레이트-스위칭 공정(template-switching process)에 의한 어댑터의 동시적 첨가와 함께의 무작위 프라이밍(random priming)을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체의 샘플 중의 RNA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, RNA는 조직으로부터의 것이다. 일부 경우에서, 조직은 액상 조직(예를 들어, 혈액)이 아니다. 일부 경우에서, 조직은 고형 조직이다. 일부 경우에서, 조직은 기관이다. 일부 경우에서, 조직은 기능과 관련된다. 예로서, 조직은 신경 조직일 수 있다. 신경 조직은 뇌, 척수, 말초 신경, 또는 이들의 조합일 수 있다. 조직의 비제한적인 예는 간, 지방조직, 신장을 포함한다. 일부 경우에서, RNA는 조직-특이적 세포 유형으로부터의 것이다. 일부 경우에서, 조직-특이적 세포 유형은 비-혈액 세포이다. 일부 경우에서, 조직-특이적 세포 유형은 신경 세포 유형이다. 신경 세포 유형의 비제한적인 예는 성상교세포 및 희소돌기아교세포이다. 일부 경우에서, 조직-특이적 세포 유형은 간세포 유형이다. 간세포 유형의 비제한적인 예는 간세포, 쿠퍼 세포, 및 성상 세포(stellate cell)이다. 일부 경우에서, 조직-특이적 세포 유형은 신장 세포 유형이다. 신장 세포 유형의 비제한적인 예는 신세뇨관 세포이다.
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체의 샘플 중의 RNA를 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, RNA는 혈액에서 발현되는 것보다 관심대상의 조직에서 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 혈액 세포에서 발현되는 것보다 관심대상의 조직에서 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 혈액 세포에 의해 발현되지 않는다. 일부 경우에서, RNA는 혈액보다 상기 조직에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 혈액보다 상기 조직에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 혈액보다 상기 조직에서 20배 이상 더 많이 발현된다.
일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 상기 조직에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 상기 조직에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 상기 조직에서 20배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 2개 이하의 조직에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 2개 이하의 조직에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 2개 이하의 조직에서 20배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 3개 이하의 조직에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 3개 이하의 조직에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 조직에서 보다 3개 이하의 조직에서 20배 이상 더 많이 발현된다.
일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 하나의 세포 유형에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 상기 세포 유형에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 상기 세포 유형에서 20배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 2개 이하의 세포 유형에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 2개 이하의 세포 유형에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 2개 이하의 세포 유형에서 20배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 3개 이하의 세포 유형에서 5배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 3개 이하의 세포 유형에서 10배 이상 더 많이 발현된다. 일부 경우에서, RNA는 임의의 다른 세포 유형보다 3개 이하의 세포 유형에서 20배 이상 더 많이 발현된다.
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체의 샘플에서의 RNA, 또는 이의 cDNA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 방법은 정량화하기 전에 RNA, 또는 이의 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 방법은 정량화하면서 RNA를 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 증폭은 RNA 또는 cDNA를 무작위 헥사머와 혼성화하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 증폭은 RNA 또는 cDNA와 서열 특이적 프라이머와 혼성화하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 증폭은 열순환 반응(thermocycling reaction)을 포함한다. 일부 경우에서, 증폭은 등온 반응을 포함한다. 일부 경우에서, 증폭은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)을 포함한다.
시스템
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 생체액 중의 핵산의 검출 또는 정량화를 개선하기 위해, 세포, 세포 절편, 및 세포외 미소입자의 생체액 샘플을 고갈시키는 시스템을 제공한다. 일부 시스템은 생체액의 추가의 성분, 예를 들어, 리보솜 RNA, 미토콘드리아 RNA, 세균 RNA를 제거할 수 있다. 세균 RNA는 장(gut)으로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에서, 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 경우에서, 핵산은 본질적으로 RNA로 이루어진다. 일부 경우에서, RNA는 메신저 RNA이다.
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 고형 조직 또는 고형 기관을 포함하는 비-혈액 조직으로부터의 것인 생체액 샘플 중의 세포외 미소입자를 포집하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 순환 세포가 아닌 세포로부터의 세포외 미소입자를 포집하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 혈액 세포가 아닌 혈액으로부터의 세포외 미소입자를 포집하기 위해 제공된다.
일부 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체의 샘플 중의 세포외 미소입자를 결합할 수 있는 결합 모이어티의 혼합물을 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용한다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질에 대한 수용체 또는 리간드이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 단백질이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 소분자이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 압타머 또는 핵산이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 지질, 지방산, 스테롤 또는 다른 생체고분자이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 항체이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 항원-결합 항체 절편이다.
일부 경우에서, 세포외 미소입자는 혈액 세포로부터의 것이다. 일부 경우에서, 결합 모이어티는 혈액 세포 상의 세포 표면 마커인 세포외 미소입자 상의 단백질과 상호 작용하거나 또는 이와 결합한다. 혈액 세포의 비제한적인 예는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 줄기 세포 전구체, 대식세포, 단핵구, 과립구, 혈소판, 적혈구, 순환 내피 세포, 및 순환 상피 세포이다. 일부 경우에서, 세포는 혈소판이다. 일부 경우에서, 세포는 과립구이다. 혈액 세포 상의 세포 표면 마커의 비제한적인 예는 GypA, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33, CD66b, CD41, CD42b, CD61, CD62, CD138, CD235a, CD146 또는 CD326을 포함한다.
일부 예에서, 결합 모이어티는, 비혈액 세포의 세포 표면 마커인 세포외 미소입자 상의 단백질과 상호 작용하거나 결합한다. 비혈액 세포 유형의 비제한적인 예는 성상 세포, 간세포, 및 지방 세포이다. 비혈액 세포는 고형 조직 또는 고형 기관으로부터 유래할 수 있다. 고형 조직의 비제한적인 예는 간, 지방, 신장, 췌장, 심장, 근육, 골수, 피부, 전립선, 고환, 유방, 난소, 자궁, 결장, 폐, 및 신경 조직을 포함한다. 간 세포의 세포 표면 마커의 비제한적인 예는 ASGR1 및 GFAP를 포함한다. 지방 세포의 세포 표면 마커의 비제한적인 예는 SLC7A10 및 FABP4이다. 성상 세포의 세포 표면 마커의 비제한적인 예는 GLAST를 포함한다. 신장 세포(예를 들어, 신세뇨관 세포)의 세포 표면 마커의 비제한적인 예는 감마-글루타밀-트랜스펩티다제를 포함한다.
일부 시스템은 복수의 세포외 미소입자 표면 상의 복수의 단백질과 상호 작용하는 복수의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 2개 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 3개 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 4개 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 약 2개의 결합 모이어티 내지 약 5개의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 시스템은 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 제1 결합 모이어티는 제1 세포 상의 제1 단백질과 상호 작용하고, 제2 항체는 제2 세포 상의 제2 단백질과 상호 작용한다. 일부 예에서 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하다. 예를 들어, 일부 경우에, 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 동일한 단백질을 표적으로 하지만, 둘 다 사용되는데, 왜냐하면 어떤 결합 모이어티가 대상의 샘플에서 가장 잘 작동하는 지에 대한 불확실성이 있기 때문이다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 10개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 100개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 200개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 약 400개 이상의 아미노산이 상이하다. 일부 예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 상이한 유전자로부터 발현된다. 일부 예에서, 제1 단백질은 제2 세포 상에서 발현되지 않고 제2 단백질은 제1 세포 상에서 발현되지 않는다. 일부 예에서, 제1 세포 및 제2 세포는 2가지 상이한 유형의 백혈구이다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 둘 이상의 상이한 세포 유형으로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다.
일부 시스템은 복수의 세포외 미소입자 표면 상의 복수의 단백질과 상호 작용하는 복수의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 2종 이상의 상이한 세포 유형으로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 3종 이상의 상이한 세포 유형으로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 4종 이상의 상이한 세포 유형으로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 5종 이상의 상이한 세포 유형으로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 2종 이상의 상이한 유형의 순환 세포 또는 혈액 세포로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 3종 이상의 상이한 유형의 순환 세포 또는 혈액 세포로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 4종 이상의 상이한 유형의 순환 세포 또는 혈액 세포로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 일부 예에서, 복수의 결합 모이어티는 5종 이상의 상이한 유형의 순환 세포 또는 혈액 세포로부터의 세포외 미소입자와 결합 또는 상호 작용할 수 있다. 순환 세포 또는 혈액 세포의 유형의 비제한적인 예는 림프 세포, T 세포, B 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 줄기 세포 전구체, 대식 세포, 단핵 세포, 과립 세포, 혈소판, 적혈구, 순환 내피 세포, 및 순환 상피 세포를 포함한다.
본원에 개시된 일부 시스템은 고형 지지체를 포함하며, 여기에서 하나 이상의 결합 모이어티가 고형 지지체에 부착된다. 일부 예에서, 결합 모이어티는 고형 지지체에 연결된다. 일부 예에서, 결합 모이어티는 고형 지지체에 접합된다. 일부 예에서, 결합 모이어티는 고형 지지체와 상호 작용한다. 고형 지지체의 비제한적인 예는 비드, 컬럼, 플레이트, 또는 어레이이다. 일부 예에서, 결합 모이어티는 샘플과 혼합되지 않는 용액에 대한 친화력을 가져서, 샘플과 결합 모이어티를 접촉시킨 후 용액을 샘플에 첨가한 경우, 결합 모이어티가 용액으로 분리되어, 샘플로부터 세포외 입자를 제거한다. 일부 예에서, 시스템은 용액을 포함한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 시스템은 대상의 샘플을 위한 용기를 포함한다. 용기는 EDTA를 포함할 수 있다. 용기는 EDTA를 포함하지 않을 수 있다. 샘플은 세포를 포함할 수 있다. 일부 시스템은 대상의 샘플로부터 세포를 분리하기 위한 세포 분리 구성요소를 포함한다. 일부 예에서, 세포 분리 구성요소는, 용기를 회전시켜 용기에 원심력을 가하여, 혈액 샘플로부터 세포의 적어도 일부를 제거하는 기계이다. 대안으로, 또는 추가로, 시스템은 세포를 제거하기 위한 필터를 포함한다. 일부 예에서, 필터는 샘플의 세포 단편, 세포외 미소입자, 또는 다른 성분을 제거한다. 일반적으로 필터는 샘플의 순환 세포 유리 전령 RNA로부터 이들 성분을 분리하는 데 적합하다. 일부 예에서, 필터의 공극 직경은 약 200 마이크론 내지 약 800 마이크론이다. 일부 예에서, 필터의 공극 직경은 약 800 마이크론 내지 약 2,000 마이크론이다. 일부 예에서, 필터의 공극 직경은 약 400 마이크론 내지 약 1,200 마이크론이다. 일부 예에서, 필터의 공극 직경은 약 600 마이크론 내지 약 1,000 마이크론이다. 일부 예에서, 필터의 공극 직경은 약 800 마이크론이다.
본원에 개시된 일부 시스템은 대상으로부터의 샘플에 존재하는 핵산을 정량화하기 위한 1종 이상의 시약을 포함한다. 일부 예에서, 핵산은 RNA이다. 일부 예에서, RNA는 전령 RNA이다. 일부 예에서, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)이다. 일부 예에서, 시약은 관심 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 일부 예에서, 시약은 역전사 효소이고, 시스템은 RNA를 cDNA로 역전사시키는 데 사용된다. 일부 예에서, 시약은 cDNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 일부 예에서, 시스템은 RNA 또는 cDNA를 증폭시킬 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 시약은 핵산을 증폭시키는 효소이다. 일부 예에서 시스템은 Q-PCR 또는 서열분석 판독을 생성 및/또는 판독하는 데 필요한 기계 또는 시약을 포함한다. 이러한 기계 및 시약은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 상대적 엔트로피 최대화에 의한 디콘볼루션(deconvolution)의 사용을 포함한다: 혼합물의 유전자 발현 측정에 기반한, 세포 유리 RNA와 같은 복합 혼합물로부터 관심있는 특정 세포 유형/조직/기관의 상대적인 양을 정량화하는 방법.
상이한 조직으로부터의 RNA의 혼합물이 주어지면, 혼합물의 유전자 발현 값 뿐만 아니라 각각의 조직에서의 유전자 발현 값을 사용하여, 상기 방법은 혼합물을 구성하는 조직의 비율의 벡터인 p를 구한다. 이 방법의 목적은, 1) 혼합물에서 관찰된 발현 프로파일과 p에 의해 가중된 조직 발현 프로파일의 선형 조합 사이의 상대 엔트로피 및 2) p의 값이 합해서 1이 되어야 한다는 제약조건 하에서 L2 노름 페널티 함수(L2-norm penalty function)의 합을 최소화하는 p의 값을 구하는 것이다.
목표는 조직 기여도에 대한 확률 분포를 추정하는 것이므로, 모든 조직에 대한 확률이 합해서 1이어야 한다는 제약조건 하에서 최적화를 수행해야 한다. 현재 구현예에서, 선험적으로 기준 조직을 선택하고, 이어서 기준 조직에 대한 특정 조직의 기여도의 로그비를 나타내는 n-1개의 자유 파라미터를 추정함으로써, n개의 조직에 대한 확률이 합해서 1이어야 한다는 이러한 제약조건이 충족된다. 이어서 파라미터 추정이 완료된 후 로그비를 확률로 변환할 수 있다. 추정된 로그비가 수치적으로 안정하도록, 기준 조직은 혼합물에서 높게 나타날 수 있는 조직으로 선택된다. 제약 최적화 방법의 사용과 같은 다른 접근법도 가능하지만, 수치적 어려움에 더 취약할 수 있다.
특징 선택 단계는 디콘볼루션 전에 수행된다. 특징 매트릭스는 조직 유전자 발현 프로파일로부터 구성된다. 유전자 또는 유전자의 가중 선형 조합일 수 있는 특징은 조직 특이적으로 선택된다. 높은 상관관계의 유전자를 함께 결합하여, 노이즈를 줄이고 다중공선성(multicollinearity)을 줄이는 새로운 특징을 생성할 수 있다.
적합치(fit)의 P 값은 로그비 시험을 사용하여 계산할 수 있다.
보다 정확하게는, n×f 특징 매트릭스 F(n은 조직의 총 수이고 f는 특징의 총 수이다), 및 관찰된 발현 프로파일 O의 f-롱 벡터(f-long vector)가 주어지면, 본 발명자들은 하기 식을 최소화하는 P의 값을 구하였다:
상기 식에서 Q는 P의 현재 값으로부터의 예측된 발현 프로파일의 F-롱 벡터이며,
Q =
FP
이다.
넘버링한 실시양태
본 발명은 본원에 인용된 넘버링한 실시양태의 검토를 통해 추가로 이해된다. 1. 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플을 원심 분리 또는 여과하여 혈장 샘플을 얻는 단계; 혈장 샘플을 여과하여 혈장 샘플로부터 혈소판을 제거함으로써, 세포 고갈된 샘플을 생성하는 단계; 세포 고갈된 샘플을 세포 표면 단백질 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 여기서 세포 표면 단백질 결합 모이어티는 세포 고갈된 샘플에서 혈액 세포 엑소좀 상의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 것인 단계; 세포 고갈된 샘플로부터 세포 표면 단백질 결합 모이어티를 제거함으로써, 세포 고갈된 샘플로부터 혈액 세포 엑소좀을 제거하는 단계; 및 세포 고갈된 샘플에서 순환 무세포 RNA를 정량화하는 단계로서, 여기서 무세포 RNA는 관심 조직에 의해 발현되는 단계를 포함하는 방법. 2. 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플로부터 세포를 제거하여 세포 고갈된 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하여 미소입자 고갈된 샘플을 얻는 단계; 미소입자 고갈된 샘플에서 유전자에 상응하는 RNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 방법. 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 세포외 미소입자 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 4. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 결합 모이어티는 항체 또는 항원 결합 항체 단편인 방법. 5. 실시양태 4에 있어서, 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 지지체에 부착되는 것인 방법. 6. 실시양태 4에 있어서, 항체는 혈액 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 세포 표면 마커와 상호 작용하는 것인 방법. 7. 실시양태 6에 있어서, 혈액 세포는 백혈구인 방법. 8. 실시양태 7에 있어서, 항체는 항-CD45 항체를 포함하는 것인 방법. 9. 실시양태 6에 있어서, 혈액 세포는 과립구인 방법. 10. 실시양태 9에 있어서, 항체는 항-CD66b 항체를 포함하는 것인 방법. 11. 실시양태 4에 있어서, 세포 고갈된 샘플을, 제1 세포 상의 제1 단백질과 상호 작용하는 제1 항체 및 제2 세포 상의 제2 단백질과 상호 작용하는 제2 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법. 12. 실시양태 11에 있어서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 적어도 10개의 아미노산이 상이한 것인 방법. 13. 실시양태 11에 있어서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 상이한 유전자로부터 발현되는 것인 방법. 14. 실시양태 11에 있어서, 제1 단백질은 제2 세포 상에서 발현되지 않고 제2 단백질은 제1 세포 상에서 발현되지 않는 것인 방법. 15. 실시양태 11에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포는 2개의 상이한 유형의 백혈구인 방법. 16. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 정량화 단계는 미소입자 고갈된 샘플에 대한 RNA의 상대적 기여도를 정량화하는 단계를 포함하는 것인 방법. 17. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 정량화 단계는 RNA를 서열분석하는 단계를 포함하는 것인 방법. 18. 실시양태 1 또는 2에 있어서, RNA는 대상체의 임의의 다른 조직보다 관심 조직에서 더 높게 발현되는 것인 방법. 19. 실시양태 18에 있어서, 관심 조직은 신경 조직인 방법. 20. 실시양태 18에 있어서, 관심 조직은 간, 지방, 신장 또는 신경 조직인 방법. 21. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포를 제거하는 단계는 혈액을 원심 분리 또는 여과하는 단계를 포함하는 것인 방법. 22. 실시양태 2에 있어서, 세포를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 여과하여 혈소판을 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법. 23. 실시양태 1 또는 2에 있어서, RNA 또는 이의 cDNA를 증폭시켜 증폭된 핵산을 생성하는 단계를 포함하는 방법. 24. 실시양태 23에 있어서, 증폭 단계는 RNA 또는 cDNA를 랜덤 헥사머와 하이브리드화하는 단계를 포함하는 것인 방법. 25. 실시양태 1 또는 2에 있어서, RNA는 메신저 RNA를 포함하는 것인 방법. 26. 실시양태 1, 2 및 23 중 어느 하나에 있어서, 정량화 단계는 RNA, cDNA 또는 증폭된 핵산을 서열분석하는 단계를 포함하는 것인 방법. 27. 실시양태 1 또는 2에 있어서, RNA는 혈액에서 발현되는 것보다 관심 조직에서 더 높게 발현되는 것인 방법. 28. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포외 미소입자는 엑소좀인 방법. 29. 실시양태 28에 있어서, 엑소좀은 혈액 세포로부터 유래되는 것인 방법. 30. 실시양태 29에 있어서, 혈액 세포는 혈소판인 방법. 31. 실시양태 30에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-GypA 항체 또는 이의 GypA 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 32. 실시양태 29에 있어서, 혈액 세포는 적혈구인 방법. 33. 실시양태 32에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD235a 항체 또는 이의 CD235a 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 34. 실시양태 29에 있어서, 혈액 세포는 과립구인 방법. 35. 실시양태 34에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD66b 항체 또는 이의 CD66b 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 36. 실시양태 29에 있어서, 혈액 세포는 림프구인 방법. 37. 실시양태 36에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 CD45, CD19 또는 CD3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 38. 실시양태 1 또는 2에 있어서, RNA는 세포, 엑소좀 또는 이의 단편에 부착되지 않는 것인 방법. 39. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포 고갈된 샘플은 혈액 샘플에서 세포의 적어도 90%가 고갈되는 것인 방법. 40. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포 고갈된 샘플은 혈장 또는 혈청을 포함하는 것인 방법. 41. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 세포 고갈된 샘플은 본질적으로 혈장 또는 혈청으로 이루어지는 것인 방법. 42. 실시양태 41에 있어서, 혈장 또는 혈청으로부터 RNA를 정제하는 단계를 포함하는 방법. 43. 실시양태 42에 있어서, 혈장 또는 혈청은 섭씨 60도에서 1시간 인큐베이션되는 것인 방법. 44. 실시양태 43에 있어서, 카오트로픽 염, 계면활성제, 단백질 분해 효소 K, 2-메르캅토에탄올 또는 이의 조합의 존재 하에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법. 45. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 샘플을 Tris와 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법. 46. 실시양태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 지질 및 단백질 구조를 파괴하는 단계를 포함하는 방법. 47. 실시양태 42에 있어서, 혈장 또는 혈청을 실리카 컬럼과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법. 48. 실시양태 47에 있어서, 샘플을 카오트로픽 염 및 100% 이소프로판올과 인큐베이션하여 RNA와 실리카 컬럼의 결합을 증진시키는 단계를 포함하는 방법. 49. 실시양태 48에 있어서, 진공 매니폴드를 사용하여 샘플을 실리카 컬럼에 통과시키는 단계를 포함하는 방법. 50. 실시양태 49에 있어서, 샘플을 저농도 카오트로픽 염 및 에탄올로 세척하는 단계를 포함하는 방법. 51. 실시양태 50에 있어서, 샘플을 100% 에탄올 세척으로 세척하여 샘플 중의 불순물 및 억제제를 제거하는 단계를 포함하는 방법. 52. 실시양태 48에 있어서, 실리카 컬럼으로부터 RNA를 저이온성 완충제 또는 물로 용리시키는 단계를 포함하는 방법. 53. 실시양태 52에 있어서, 용리된 RNA를 20분 동안 촉매 효율이 매우 높은 고도로 순수한 억제제 저항성 재조합 DNase와 인큐베이션하여 임의의 DNA를 제거하는 단계를 포함하는 방법. 54. 실시양태 53에 있어서, 오염물 및 억제제를 제거하는 억제제 제거 컬럼을 통해 RNA를 통과시키는 단계를 포함하는 방법. 55. 실시양태 53에 있어서, 카오트로픽 염 및 66% 에탄올을 사용하여 RNA를 실리카 멤브레인에 결합시키고, RNA를 세척하고 용리시키는 단계를 포함하는 방법. 56. 실시양태 55에 있어서, 물로 용리시키는 단계를 포함하는 방법. 57. 혈액 샘플에서 순환 비혈액 RNA를 농축시키는 방법으로서, 혈액 세포의 혈액 샘플을 고갈시키는 단계; 및 엑소좀의 혈액 샘플을 고갈시키는 단계를 포함하는 방법. 58. 혈액 샘플에서 순환 비혈액 RNA를 농축시키는 방법으로서, 혈액 세포의 혈액 샘플을 고갈시켜 세포 고갈된 혈액 샘플을 생성하는 단계; 및 세포 고갈된 혈액 샘플을 혈액 세포 표면 결합 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법. 59. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 고갈 단계는 혈액 샘플을 여과하여 혈액 세포를 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법. 60. 실시양태 59에 있어서, 혈액 세포는 혈소판을 포함하는 것인 방법. 61. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 고갈 단계는 혈액 샘플을 원심 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법. 62. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 적어도 90%의 혈액 샘플을 고갈시키는 방법. 63. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포의 적어도 99%의 혈액 샘플을 고갈시키는 방법. 64. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포외 미소입자의 적어도 90%의 혈액 샘플을 고갈시키는 방법. 65. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 혈액 샘플에 원래 존재했던 세포외 미소입자의 적어도 99%의 혈액 샘플을 고갈시키는 방법. 66. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 비혈액 RNA는 고형 기관으로부터 유래되는 것인 방법. 67. 실시양태 66에 있어서, 고형 기관은 간, 지방, 신장 또는 뇌인 방법. 68. 실시양태 67에 있어서, 고형 기관은 뇌 또는 척수인 방법. 69. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 비혈액 RNA는 비혈액 세포 유형으로부터 유래되는 것인 방법. 70. 실시양태 69에 있어서, 비혈액 세포 유형은 희소돌기아교세포인 방법. 71. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 비혈액 RNA를 정량화하는 단계를 포함하는 방법. 72. 실시양태 71에 있어서, 정량화 단계는 정량화 PCR 및 서열분석으로부터 선택된 적어도 하나의 방법을 포함하는 것인 방법. 73. 대상체의 혈액 샘플용 용기; 용기를 회전시켜 용기에 원심력을 가함으로써, 혈액 샘플로부터 세포의 적어도 일부를 제거하는 기계; 혈액 샘플로부터 혈소판을 제거하기 위한 필터; 및 세포외 미소입자 상의 단백질과 상호 작용하는 항체를 포함하는 시스템. 74. 실시양태 73에 있어서, 복수의 항체를 포함하는 시스템. 75. 실시양태 73에 있어서, 복수의 항체는 CD45, CD66b, GypA, CD235a, CD19, 및 CD3 중 적어도 하나를 포함하는 것인 시스템. 76. 실시양태 73에 있어서, 항체는, 혈액 샘플과 접촉할 수 있고 혈액 샘플로부터 제거될 수 있는 지지체에 부착됨으로써, 혈액 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하는 것인 시스템. 77. 실시양태 73에 있어서, 혈액 샘플에 존재하는 RNA를 정량화하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 시스템. 78. 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계; 혈액 샘플을 원심 분리 또는 여과하여 혈장 샘플을 얻는 단계; 혈장 샘플을 세포 표면 단백질 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 여기서 세포 표면 단백질 결합 모이어티는 혈장 샘플에서 세포외 미소입자 상의 세포 표면 단백질에 결합할 수 있으며, 세포외 미소입자는 대상체의 조직으로부터 유래되는 것인 단계; 세포 고갈된 샘플로부터 세포 표면 단백질 결합 모이어티를 제거함으로써, 세포 고갈된 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하는 단계; 및 세포외 미소입자에서 RNA를 정량화하는 단계로서, 여기서 RNA는 관심 조직에 의해 발현되는 것인 단계를 포함하는 방법. 79. 실시양태 78에 있어서, 조직은 고형 기관인 방법. 80. 실시양태 78에 있어서, 세포 표면 단백질 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법. 81. 실시양태 78에 있어서, 조직은 간인 방법. 82. 실시양태 80에 있어서, 세포 표면 단백질은 아시알로당단백질 수용체 1(ASGR1) 또는 신경교섬유질 산성 단백질(GFAP)인 방법. 83. 실시양태 78에 있어서, 조직은 지방인 방법. 84. 실시양태 83에 있어서, 세포 표면 단백질은 SLC7A10 또는 지방산 결합 단백질 4(FABP4)인 방법. 85. 실시양태 78에 있어서, 조직은 신경 조직인 방법. 86. 실시양태 85에 있어서, 세포 표면 단백질은 글루타메이트 아스파테이트 수송체(GLAST)인 방법. 87. 실시양태 78에 있어서, 조직은 신장인 방법. 88. 실시양태 87에 있어서, 세포 표면 단백질은 감마-글루타밀-트랜스펩 티다제인 방법.
실시예
하기 실시양태는 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하기 위한 목적으로 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 현재 바람직한 실시양태를 대표하고 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구범위의 범주에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 내에 포함되는 변경 및 다른 용도는 당업자에게 일어날 것이다.
실시예 1: 무세포 RNA의 단리
V2 추출법: 혈액 샘플을 EDTA 튜브에 수집하고, 1900 g에서 10분 동안 원심 분리하였다. 혈장을 새로운 튜브로 분리하였다(도 3의 혈소판 농후 혈장). 이어서 혈소판을 제거하기 위해 혈장을 16000 g에서 원심 분리하고 0.8 μm 필터에 통과시켰다. 일부 경우에, 혈장을 동결시키고 37℃에서 해동시켰다. 혈장으로부터의 핵산을 정제하기 위해, Tris 배경에서 고농도의 카오트로픽 염, 계면활성제, 단백질 분해 효소 K 및 2-메르캅토에탄올의 존재 하에 섭씨 60도에서 1시간 인큐베이션하여 지질 및 단백질 구조를 파괴하였다. 용해 후, 부가적인 카오트로픽 염 및 이소프로판올 100%를 샘플에 첨가하여 핵산과 실리카 컬럼의 결합을 증진시켰다. 진공 매니폴드를 사용하여 샘플을 실리카 멤브레인에 통과시켰다. 불순물 및 억제제(다당류, 바이오염, 단백질)를 제거하기 위해 100% 에탄올 세척 외에, 저농도 카오트로픽 염 및 에탄올로 샘플을 철저히 세척하였다. 핵산을 저이온 완충제 또는 물로 용리시켰다. 이어서, 임의의 DNA를 제거하기 위해 촉매 효율이 매우 높은 고도로 순수한 억제제 저항성 재조합 DNase와 20분 동안 샘플을 인큐베이션하였다. 다운스트림 적용에서 역전사효소 반응의 억제를 방지하기 위해 오염물 및 억제제(폴리 페놀, 휴믹산)를 제거하는 억제제 제거 컬럼에 cfRNA를 통과시켰다. 남아있는 효소 및 불순물을 제거하고 cfRNA를 농축시키기 위해 카오트로픽 염 및 66% 에탄올을 사용하여 실리카 멤브레인에 샘플을 결합시키고, 세척하고, 15 ul의 물에 용리시켰다. 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc., 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 Agilent RNA 6000 Pico 칩에서 1 ul의 샘플을 러닝함으로써 cfRNA의 양, 크기 및 완전성을 추정하였다.
이 방법은 본원에서 구식 추출법으로도 지칭되는 이전에 알려진 방법과 비교될 수 있다(도 3 참조). 이전에 알려진 방법의 예는 다음과 같다. 1 ml의 혈장을 실온에서 해동하고 2 M GTC, 120 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl2, 2% Tween 20, 1% 트리톤 X-100, 2-메르캅토에탄올 및 200 ul의 단백질 분해 효소 K(20 mg/ml)의 존재 하에 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해 후, 카오트로픽 염 및 에탄올을 첨가하고 샘플을 실리카계 매트릭스를 통해 회전시켰다. 2.5 M GTC, 50 mM 시트레이트 및 37.7% 에탄올로 세척한 후 핵산을 물에 용리시켰다. 이어서, 샘플을 37℃에서 30분 동안 DNaseI 엔도뉴클레아제로 처리하였다. 마지막으로, 33% 에탄올 및 카오트로픽 염을 사용하여 실리카 매트릭스에 샘플을 결합시키고, 세척하고 15 ul의 물에 용리시켰다. mRNA의 양은 SuperScript III 역전사효소, 백금 DNA 폴리머라제 및 SYBR 그린을 사용하여 qPCR에 의해 추정되었다. 인간 18S 전사물은 RNA 농도를 추정하기 위한 대용으로서 사용되었다(18S_정방향: 5'-GGCCCTGTAATTGGAATGAGTC; 18S-역방향: 5'-CCAAGATCCAACTACGAGCTT; Integrated DNA Technologies, WCO., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재). 인간 뇌 조직 총 RNA를 사용하여 보정 곡선을 생성하였다(FirstChoice Human Brain Reference Total RNA, Thermo Fisher Scientific, Inc.). 리얼 타임 정량 PCR을 CFX96 터치 리얼 타임 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 상에서 수행하였다.
실시예 2. 무세포 핵산의 면역결핍 및 농후
대상체로부터 혈장 샘플을 얻었다. 혈장은 복수 유형의 혈액 세포로부터 유래한 엑소좀을 함유하였다. 혈장을 CD45 항체와 인큐베이션하였다. CD45 항체를 표적화하는 자성 입자를 혈장 샘플에 첨가하였다. 자석을 사용하여 자성 입자 및 결합 구조를 제거하고 결합되지 않은 엑소좀을 남겼다. 생성된 샘플은 엑소좀 제거 후 단핵 혈액 세포로부터의 더 적은 전사물을 함유하였으며, 이는 RNA 서열분석에 의해 측정된, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 이 세포 유형으로부터 전사물의 10배 고갈을 나타낸다.
샘플을 서열분석에 의해 분석하였고, 하기 표는 특정 세포 유형으로 표시되는 판독률(%)을 나타낸다. 예를 들어, 단핵 세포(림프구 및 단핵구)는 고갈 전 세포의 _8.831% 및 고갈 후 0.893%를 차지한다.
실시예 3. 무세포 RNA 정량화를 위한 Q-PCR 효율 평가
간 mRNA의 qPCR로부터 생성된 각각의 앰플리콘을 간 조직 mRNA의 적정과 비교하여 qPCR 반응의 효율을 결정하였다. 효율은, 100%일 것으로 예상되는 이상적인 PCR 반응에 대해 예상되는 사이클 당 배가에 비교되는 수율의 백분율로 계산된다. 결과는 도 5에 도시되어 있다. x 축은 섬유증 단계이다. 쿼리된 RNA는 다음 유전자에 상응한다:
실시예 4. 동일한 양의 RNA로부터 출발한 2개의 PCR 복제물 사이의 재현성.
대조군 공여체 혈장 풀로부터 RNA를 얻었다. 1 mL의 혈장으로부터의 RNA가 15 마이크로리터 추출물에 함유되어 있다. 결과에 대해 도 7을 참조한다. X 및 Y 축에는 PCR의 Ct 계수가 표시된다.
실시예 5: 복수의 혈액 세포 엑소좀을 제거하기 위해 항체 칵테일을 사용
대상체로부터 혈장 샘플을 얻었다. 혈장은 복수 유형의 혈액 세포로부터 유래한 엑소좀을 함유하였다. 복수 유형의 혈액 세포에 상응하는 세포 표면 마커에 결합하는 항체를 갖는 자성 비드를 혈장 샘플에 첨가하고 인큐베이션하였다. 대안적으로 또는 추가적으로, 다수의 혈액 세포 유형에서 발현되는 세포 표면 마커에 결합하는 단일 항체가 사용된다. 샘플을 자석에 적용하고 원하지 않는 엑소좀을 혈장 샘플로부터 제거하여 관심 엑소좀을 남긴다. 생성된 샘플은 엑소좀 제거 후 혈액 세포로부터 훨씬 적은 전사물을 함유하여 조직 특이적 전사물에 대한 검출 감도를 증가시킨다.
나머지 샘플에서 관심 핵산은 다음 단계에 따라 분석된다.
· 수집: EDTA-2 회전 후 여과 → 혈소판 감소는 1회 저속 회전 후 고속 회전(16k)이 바람직함. 상청액 동결.
· 추출: 샘플 해동 후 Qiagen CNA 키트 여과 → 긴 전사물 외에 혈소판 빈약 혈장, 즉 더 작은 cfRNA 종(100개 염기)으로부터 수율 10 x 증가
· 클린업: 폴리페놀 억제제 제거 컬럼, 오프-컬럼 재조합 DNAse, 클린업 컬럼
· RT: 고농도 랜덤 헥사머가 있는 SS IV 2 단계
· RQ-PCR: 모든 프라이머를 포함하는 프리앰프 단계에서 상이한 프라이머를 갖는 네스티드 디자인 후, 엑소뉴클레아제 1을 처리하여 단일 가닥 프라이머를 제거하고, 이어서 최종 PCR 검출 반응을 위해 한 쌍의 네스티드 프라이머를 사용하여 별도의 마이크로챔버에서 최종 증폭. 나머지 혈액 세포 및 관심 기관 이외의 다른 기관으로부터의 핵산이 표준화를 위해 포함된다.
· Swift 1S를 사용하여 샘플에서 핵산의 서열분석 라이브러리를 제조한 후 표적 농후화.
· 데이터 처리: 정렬 전 부분 조립, 엔트로피 기반의 혈액 세포 할당.
도 16: 우측 패널에는 이전에 논의된 모든 개선사항이 포함되어 있다: 1) "Molstract"에서 새로운 추출(CNA) 키트로 전환, 2) 폴리페놀 억제제 제거 컬럼 첨가, 3) Clontech Smarter에서 Swift 1s 라이브러리 제조로 전환, 4) 유니플렉스 캡처 농후에서 멀티플렉스(16개 샘플) 캡처 농후로 전환.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형, 변경 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 떠오를 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조 및 그의 균등내용이 이에 의해 포함되도록 의도된다.
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 2
ccaagatcca actacgagct t 21
Claims (20)
- a) 대상체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계;
b) 혈액 샘플로부터 세포를 제거하여 세포 고갈된 샘플을 얻는 단계;
c) 혈액 샘플로부터 세포외 미소입자를 제거하여 미소입자 고갈된 샘플을 얻는 단계;
d) 미소입자 고갈된 샘플 중 유전자에 상응하는 무세포 RNA의 양을 정량화하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는, 세포 고갈된 샘플을 세포외 미소입자의 표면 상의 단백질과 상호 작용하는 결합 모이어티와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 결합 모이어티는 항체 또는 항원 결합 항체 단편인 방법.
- 제3항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 항체 단편은, 혈액 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 세포 표면 마커와 상호 작용하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 항체는 항-CD45 항체를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 항체는 항-CD66b 항체를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 고갈된 샘플을, 제1 세포 상의 제1 단백질과 상호 작용하는 제1 항체 및 제2 세포 상의 제2 단백질과 상호 작용하는 제2 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 제1 단백질은 제2 세포 상에서 발현되지 않고, 제2 단백질은 제1 세포 상에서 발현되지 않는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포외 미소입자는 엑소좀인 방법.
- 제9항에 있어서, 엑소좀은 혈액 세포 유래의 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 혈액 세포는 혈소판이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-GypA 항체 또는 이의 GypA 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 혈액 세포는 적혈구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD235a 항체 또는 이의 CD235a 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 혈액 세포는 과립구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 항-CD66b 항체 또는 이의 CD66b 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 혈액 세포는 림프구이고, 세포외 미소입자를 제거하는 단계는 세포 고갈된 샘플을 CD45, CD19 또는 CD3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 고갈된 샘플은 섭씨 60도에서 1시간 인큐베이션되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 카오트로픽 염, 계면활성제, 단백질 분해 효소 K, 2-메르캅토에탄올, 또는 이들의 조합의 존재 하에 세포 고갈된 샘플을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 샘플을 Tris와 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 지질 및 단백질 구조를 파괴하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 고갈된 샘플을 실리카 컬럼과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 세포 고갈된 샘플을 카오트로픽 염 및 100% 이소프로판올과 인큐베이션하여 실리카 컬럼에 대한 RNA의 결합을 증진시키는 단계를 포함하는 방법.
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