KR102381936B1 - 클라우딘 발현 암 질환의 치료제 - Google Patents

클라우딘 발현 암 질환의 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T 세포들에 대한 결합을 가능하게 하는 CD3에 특이적인 결합 도메인 및 종양-관련 클라우딘 분자에 특이적인 결합 도메인을 함유하는 결합제 및 이들 결합제 또는 결합제를 인코딩하는 핵산을 이용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

클라우딘 발현 암 질환의 치료제{AGENTS FOR TREATMENT OF CLAUDIN EXPRESSING CANCER DISEASES}
클라우딘은 표피 및 내피의 밀착연접부(tight junction)에 위치하는 통합 막 단백질이다. 클라우딘은 세포질 내에 위치한 N- 및 C-말단 및 2개의 세포외 루프를 갖는 4개의 막통과 세그먼트를 갖는 것으로 예상된다. 막통과 단백질들의 클라우딘 (CLDN) 패밀리는 표피 및 내피 밀착연접을 유지하는데 중요한 역할을 하며 세포골격의 유지 및 세포 시그널링에 있어서도 어떤 역할을 한다.
클라우딘 18 (CLDN18) 분자는 4개의 막 스패닝 소수성 영역과 2개의 세포외 루프(소수성 영역 1과 소수성 영역 2에 의해 포섭된 루프 1; 소수성 영역 3 및 4에 의해 포섭된 루프 2)를 갖는 통합 막통과 단백질 (테트라스패닌: tetraspanin)이다. CLDN18은 마우스 및 인간에서 설명된, 2 가지 상이한 스플라이스 변이체들로서 존재한다 (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). 상기 스플라이스 변이체들 (Genbank 수탁번호: 스플라이스 변이체 1 (CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, 및 스플라이스 변이체 2 (CLDN18.2): NM_001002026, NP_001002026)은 분자량이 대략 27,9 / 27,72 kD이다. 이들 스플라이스 변이체들 CLDN18.1과 CLDN18.2는 제1 막통과 (TM) 영역 및 루프1을 포함하는 N-말단 부분에서 차이가 나는 반면, C-말단의 일차 단백질 서열은 동일하다.
정상 조직에서는, 분화된 단명한 위표피 세포들에서만 CLDN18.2가 배타적으로 발현되는 위장을 제외하고는 CLDN18.2의 검출가능하게 발현되지 않는다. CLDN18.2는 악성 세포전환의 경과 중에 유지되며 그에 따라 인간 위암 세포 표면에 종종 나타난다. 뿐만 아니라, 이 범종양 항원은 식도, 췌장 및 폐 선암종에서 유의적인 수준으로 이소적으로(ectopically) 활성화된다. CLDN18.2 단백질은 위암 선암종의 림프절 전이 및 특히 난소 내로의 원위성 전이(소위 크루켄버그 종양)에서도 국소화된다.
CLDN6은 일련의 상이한 인간 암세포들에서 발현되는 반면 정상 조직에서의 발현은 태반으로 국한된다.
암 및 정상적인 세포들 간의 CLDN18.2 및 CLDN6과 같은 클라우딘의 이러한 차별화된 발현, 이들의 막 국소화 및 대다수의 독성 관련 정상 조직에 있어서의 이들의 부재로 인해, 이들 분자들은 암 면역요법에 있어서 매력적인 표적이 되며, 암 치료법에서 클라우딘을 표적화하는 항체-기반 치료법의 사용은 높은 수준의 치료적 특이성을 약속해준다.
암치료에 있어서 T 세포들의 잠재능을 이용하는 접근법에는 종양-유도된 단백질, RNA 또는 펩타이드 항원을 이용한 백신접종, 종양-유도된, 생체외(ex-vivo) 확장된 T 세포들(입양 전달이라 칭해짐) 의 주입, T 세포 수용체 유전자 전달 또는 이중특이 또는 삼중특이 항체들에 의한 T 세포들의 직접적인 인게이지먼트가 포함된다. 마찬가지로, T 세포 반응의 다양한 자극제들이 단일요법으로 또는 조합적으로 임상 시험되고 있는데, 여기에는 예컨대 Toll-유사 수용체에 대한 리간드, T 세포 상에서 CTLA-4를 차단하는 항체, 면역 자극 시토카인, 또는 TGF-β 또는 B7-H1와 같이 암세포의 면역 탈출과 관련된 항체 무력화 분자들을 들 수 있다. T 세포에 기반한 치료법의 집중적인 개발은 종양이 T 세포들에 의해 침윤된 경우 환자가 유의적으로 더 오래 생존하는 듯 하다는 관찰에 의해 동기부여 되었다. 뿐만 아니라, 수많은 마우스 모델에 있어서, 다양한 수단에 의한 T 세포의 개재가 심지어 커다란 종양도 근절하게 해주고 여러 가지 T 세포 치료법이 다양한 암 증상을 치료하는데 있어서 최근 유의적인 진전을 이루고 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 한 가지 목적은 암 질환을 치료하기 위한 새로운 물질 및 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 문제 해법은 종양-관련 클라우딘 분자, 즉 암 세포에 특이적인 결합 도메인을 함유하는 결합제(binding agent)를 생성한다는 개념에 기반한 것이다. 다른 결합 도메인은 T 세포에 대한 결합을 가능케 하는 CD3에 특이적인 것으로서 T 세포를 복합체로 인도하여, T 세포의 세포독성 효과를 암 세포에 대해 표적화시키는 것을 가능케 한다. 이러한 복합체의 형성은 세포독성 T 세포에 있어서 단독으로 또는 다른 부속 세포들과 조합적으로 시그널링을 유도할 수 있으며, 이에 의해 세포독성 매개자의 방출이 유도된다.
본 발명자들은 CD3 및 클라우딘을 표적화하는 결합제들이 강력한 T 세포-매개된 용해를 유도할 수 있고 종양 질환을 치료하는데 효과적임을 최초로 보고하였다.
발명의 개요
일 측면에서 본 발명은 제1 결합 도메인은 클라우딘에 결합하고 제2 결합 도메인은 CD3에 결합하는 것인, 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 결합제는 세포독성 세포 (CD3 수용체에 연루됨으로써) 및 표적으로서 파괴시키고자 하는 CLDN을 발현하는 암세포에 결합할 수 있다.
일 구체예에서 결합제는 이중특이 항체, 특히 이중특이 단일 사슬 항체와 같은 이중특이 분자이다. 일 구체예에서 상기 클라우딘은 암세포에서 발현된다. 일 구체예에서 상기 클라우딘은 암세포의 표면에서 발현된다. 일 구체예에서 상기 클라우딘은 클라우딘 18.2 및 클라우딘 6로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서 상기 제1 결합 도메인은 상기 클라우딘의 세포외 도메인에 결합한다. 일 구체예에서 상기 제1 결합 도메인은 살아있는 세포의 표면에 존재하는 CLDN의 천연 에피토프에 결합한다. 일 구체예에서 상기 제1 결합 도메인은 CLDN의 제1 세포외 루프에 결합한다. 일 구체예에서 상기 제2 결합 도메인은 CD3의 엡실론-사슬에 결합한다. 일 구체예에서 상기 CD3은 T 세포 표면에서 발현된다. 일 구체예에서 상기 결합제의 T 세포 상의 CD3에 대한 결합은 상기 T 세포들의 증식 및/또는 활성화를 야기하여, 상기 활성화된 T 세포들이 좋기로는 세포독성 인자, 예컨대 퍼포린 및 그랜자임을 방출하고 암세포의 세포자멸사 및 세포용해를 개시하게 된다. 일 구체예에서 클라우딘에 대한 상기 결합 및/또는 CD3에 대한 상기 결합은 특이적인 결합이다.
일 구체예에서 결합제는 전장 항체 또는 항체 단편의 포맷을 갖는다. 일 구체예에서 결합제는 적어도 2개의 결합 도메인과 함께 4개의 항체 가변 도메인들을 포함하는데, 이 중 적어도 하나의 결합 도메인은 클라우딘에 결합하고, 적어도 하나의 결합 도메인은 CD3에 결합한다. 일 구체예에서 결합제는 클라우딘 항원에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린(VH)의 중쇄 가변 도메인(VH(CLDN)), CD3에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린(VL)의 경쇄 가변 도메인(VL(CD3))을 포함한다.
일 구체예에서 결합제는 동일한 폴리펩타이드 사슬 상의 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함함으로 해서, 이들 두 도메인이 쌍을 이루지 않는, 이중체(diabody)의 포맷으로 존재한다. 일 구체예에서 상기 이중체는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는데, 이 중 하나의 폴리펩타이드 사슬은 VH(CLDN) 및 VL(CD3)을 포함하는 것이고 다른 폴리펩타이드 사슬은 VH(CD3) 및 VL(CLDN)을 포함하는 것이다.
일 구체예에서 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들로 이루어진 이중특이 단일 사슬 항체 포맷일 수 있는데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 좋기로는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN) 또는 VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN)의 순서로 배열된 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 길이가 긴 펩타이드 링커, 좋기로는, 아미노산 서열(GGGGS)3 또는 VE(GGGGS)2GGVD을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 2개의 VH-VL 또는 VL-VH scFv 유닛들은 짧은 펩타이드 링커, 좋기로는, 아미노산 서열 SGGGGS 또는 GGGGS을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN18.2이고 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN18.2이고 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN6이고 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN6이고 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 97, 98, 99 또는 100으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 VH(CD3)은 SEQ ID NO: 36, 94 또는 95로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CD3)은 SEQ ID NO: 37 또는 96으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 VH(CD3)은 SEQ ID NO: 36으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CD3)은 SEQ ID NO: 37로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 VH(CD3)은 SEQ ID NO: 95로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CD3)은 SEQ ID NO: 96으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 측면에서 본 발명의 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들을 포함하는 이중특이 단일 사슬 항체 포맷일 수 있는데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3)의 순서로 배열되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH(CD3) 및 VL(CD3)은 15 내지 20, 좋기로는 15 또는 20개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 구성된 펩타이드 링커를 통해 연결되고, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 펩타이드 링커를 경유하여 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 2개의 VH-VL scFv 유닛은 아미노산 서열 SGGGGS를 포함하는 링커 펩타이드를 통해 연결된다. 상기 2개의 VH-VL scFv 유닛들 중 하나 또는 양자 모두는 인터페이스 디설파이드 브릿지를 하나 이상 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명의 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들을 포함하는 이중특이 단일 사슬 항체 포맷일 수 있는데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VL(CLDN)-VH(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3)의 순서로 배열되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH(CD3) 및 VL(CD3)은 15 내지 20, 좋기로는 15 또는 20개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 구성된 펩타이드 링커를 통해 연결되고, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 펩타이드 링커를 경유하여 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 VL(CLDN) 및 VH(CLDN)은 20 내지 25, 좋기로는 20 또는 25개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 구성된 펩타이드 링커를 통해 연결되고, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)5를 포함하는 펩타이드 링커를 경유하여 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VL-VH 및 VH-VL scFv 유닛은 아미노산 서열 SGGGGS를 포함하는 링커 펩타이드를 경유하여 연결된다. 상기 2개의 VL-VH 또는 VH-VL scFv 유닛 중 하나 또는 양자 모두는 인터페이스 디설파이드 브릿지를 하나 이상 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명의 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들을 포함하는 이중특이 단일 사슬 항체 포맷인데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VL(CD3)-VH(CD3)의 순서로 배열된다. 좋기로는, 상기 VL(CD3)-VH(CD3) scFv 유닛은 인터페이스 디설파이드 브릿지를 하나 이상 포한한다. 일 구체예에서 상기 VL(CD3) 및 VH(CD3)은 20 내지 25, 좋기로는 20 또는 25개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 이루어진 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는, 아미노산 서열 (GGGGS)5를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH(CLDN) 및 VL(CLDN)은 15 내지 20, 좋기로는 15 또는 20개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 이루어진 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH-VL 및 VL-VH scFv 유닛은 아미노산 서열 SGGGGS를 포함하는 링커 펩타이드를 통해 연결된다. 상기 VH(CLDN)-VL(CLDN) scFv 유닛은 인터페이스 디설파이드 브릿지를 하나 이상 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명의 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들을 포함하는 이중특이 단일 사슬 항체 포맷인데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VL(CLDN)-VH(CLDN)-VL(CD3)-VH(CD3)의 순서로 배열된다. 좋기로는, 상기 VL(CD3)-VH(CD3) scFv 유닛은 하나 이상의 인터페이스 디설파이드 브릿지를 포함한다. 일 구체예에서 상기 VL(CD3) 및 VH(CD3)은 20 내지 25, 좋기로는 20 또는 25개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 이루어진 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)5를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VL(CLDN) 및 VH(CLDN)은 20 내지 25, 좋기로는 20 또는 25개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 이루어진 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)5를 포함하는 펩타이드 링커를 경유하여 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 2개의 VL-VH scFv 유닛은아미노산 서열 SGGGGS를 포함하는 링커 펩타이드를 경유하여 연결된다. 상기 VL(CLDN)-VH(CLDN) scFv 유닛은 인터페이스 디설파이드 브릿지를 하나 이상 포함할 수 있다.
전술한 임의 측면들의 일 구체예에서, 상기 CLDN은 CLDN18.2이다. 좋기로는 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 15로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다. 별법으로, 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다. 일 구체예에서 상기 VH(CD3)은 SEQ ID NO: 95로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CD3)은 SEQ ID NO: 96으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 측면에서 본 발명의 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들을 포함하는 이중특이 단일 사슬 항체 포맷인데, 여기서 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단을 향해, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3)의 순서 또는 VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN)의 순서로 배열된다. 일 구체예에서 상기 VH(CLDN) 및 VL(CLDN)은 15 내지 20, 좋기로는 15 또는 20개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 구성된 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)3을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH(CD3) 및 VL(CD3)은 15 내지 20, 좋기로는 15 또는 20개의 아미노산, 좋기로는 글리신 및/또는 세린으로 구성된 펩타이드 링커를 통해 연결되며, 좋기로는 아미노산 서열 GGGGS(GGS)3GGGS를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 2개의 VH-VL scFv 유닛은 아미노산 서열 SGGGGS를 포함하는 링커 펩타이드를 통해 연결된다.
전술한 측면의 일 구체예에서, 상기 CLDN은 CLDN6이다. 좋기로는 상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다. 좋기로는 상기 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 98, 99 또는 100으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다. 가장 좋기로는, 상기 VL(CLDN)은 SEQ ID NO: 99로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 상기 VH(CD3)은 SEQ ID NO: 95로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함하고 VL(CD3)은 SEQ ID NO: 96으로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 아미노산 서열 또는 단편의 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN18.2이고 본 발명의 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 38, 39, 40 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN18.2이고 본 발명의 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 CLDN은 CLDN18.2이고 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하되, 상기 아미노산 서열은 분비 시그널 예컨대 N-말단 분비 시그널, 특히 SEQ ID NO: 51에 따른 서열을 결여하고/결여하거나 His-태그 예컨대 C-말단 His-태그, 특히 존재할 경우, 서열 Gly-Gly-Ser-(His)6 또는 (His)6을 결여한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN6이고 본 발명의 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 42, 43, 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다.
일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN6이고 본 발명의 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일 구체예에서 상기 CLDN은 CLDN6이고 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하되, 여기서 상기 아미노산 서열은 분비 시그널 예컨대 N-말단 분비 시그널, 특히 SEQ ID NO: 51에 따른 서열을 결여하고/결여하거나 His-태그 예컨대 C-말단 His-태그, 특히 존재할 경우, 서열 Gly-Gly-Ser-(His)6 또는 (His)6을 결여한다.
일 구체예에서 CLDN18.2를 발현하는 상기 암세포들은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 그의 전이암, 크루켄버그 종양, 복강 전이 및/또는 림프절 전이로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 암세포들이다.
일 구체예에서 상기 CLDN6을 발현하는 암세포들은 방광암, 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 특히 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형 선종, 육종, 특히 활막 육종및 암육종, 담관암, 방광의 암, 특히 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 특히 소장 선암종 및 회장의 선암종, 배아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양 예컨대 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 암세포들이다.
일 구체예에서 결합제는 N-말단 분비 시그널 및/또는 C-말단 히스티딘 에피토프 태그, 좋기로는 6개의 히스티딘 에피토프 태그를 갖는다.
일 측면에서 본 발명은 본 발명의 결합제를 인코딩하는 재조합 핵산에 관한 것이다. 일 구체예에서 재조합 핵산은 벡터의 형태이다. 일 구체예에서 재조합 핵산은 RNA이다.
일 측면에서 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서 본 발명은 치료, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 본 발명의 결합제, 본 발명의 재조합 핵산 또는 본 발명의 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서 본 발명은 본 발명의 결합제, 본 발명의 재조합 핵산 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서 본 발명은 환자에게 본 발명의 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서 상기 암의 세포들은 상기 결합제가 결합할 수 있는 클라우딘을 발현한다.
일 구체예에서 상기 클라우딘은 CLDN18.2이고 상기 암은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 그의 전이암, 크루켄버그 종양, 복강 전이 및/또는 림프절 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서 상기 클라우딘은 CLDN6이고 상기 암은 방광암, 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 특히 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형 선종, 육종, 특히 활막 육종및 암육종, 담관암, 방광의 암, 특히 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 특히 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양 예컨대 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 치료방법에 사용되기 위한 결합제 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 숙주 세포를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 치료방법에 사용되기 위한 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라, CLDN18.2는 좋기로는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 갖고 CLDN6은 좋기로는 SEQ ID NO: 2 또는 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 그 밖의 특징과 장점은 이하의 설명과 청구범위를 참조하면 명확히 이해될 것이다.
도 1. TAA CLDN18.2를 표적화하는 재조합 bi-scFv 단백질들의 설계를 설명하는 모듈식 설명도.
항TAA 가변부와 관련한 (A) N-말단 및 (B) C-말단 위치의 bi-scFvs의 디자인. 모노클로날 CLDN18.2 항체 (mCLDN18.2ab)의 서열로부터 항CLDN18.2 VH 및 VL 영역을 생성한다. 항CD3은 다음의 모노클로날 CD 항체들의 서열로부터 생성된 VH 및 VL 영역을 포괄적으로 나타내는 것으로 한다: UCHT1-HU (인간화 mAB), UCHT1, CLB-T3, TR66, 145-2C11. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; His, 헥사히스티딜-태그; HU, 인간화; LL, 롱 링커 (15-18 아미노산); Sec, 분비 시그널; SL, 숏 링커 (5-6 아미노산); TAA, 종양관련 항원; V, 항체의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변부를 나타낸다.
도 2. 특이적 표적 세포 용해에 미치는 도메인 배향과 항CD3-scFv 선택의 효과: 5'-mCLDN18.2ab V H -V L _ TR66 V H -V L -3' bi-scFvs 1BiMAB 및 no.15가 가장 강력한 변이체이다.
CLDN18.2 및 CD3에 지향된 몇몇 bi-scFv 변이체들을 HEK293T 세포들에서 일시적으로 발현시키고 세포독성 분석에서 이들의 효능을 비교하기 위해 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 소규모 정제하였다. CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들로서 루시페라제를 안정하게 발현하는 세포들을 표적 세포로 삼았다. 인간 T세포들 및 표적 세포들을 E:T 비율을 5:1로 하여 5 ng/ml의 각 bi-scFv 단백질과 함께 96-웰 포맷에서 인큐베이션하였다. 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 no.35, 인간 T 세포들이 아닌 쥐의 T 세포들을 표적화하는 no.11, 및 no.16을 음성 대조군으로 하였다. 각 테스트 샘플을 6중(sixfold) 도말하고, Lmin에 대한 대조군 샘플은 9중 도말하였다. 분석 전 공인큐베이션 기간은 8h, 16h, 및 24h였다. 주어진 시점에서 루시페린 용액을 첨가한 후, Infinite M200 TECAN 리더로 발광도를 측정하였다. 대조군 bi-scFv no.35 (Lmin)에 대한 샘플 정규화에 의해 특이적인 표적 세포 용해를 계산하였다. 가장 강력한 bi-scFv 단백질들 - 1BiMAB 및 no.15 -은 도메인 배향과 mAB TR66의 항CD3 오리진을 공유하였으나, 코돈 최적화 (각각 HS 및 CHO) 및 롱 링커 서열들에 있어서는 차이를 나타냈다. CHO는 차이니즈 햄스터 난소; mAB는 모노클로날 항체; HU는 인간화; TAA는 종양관련 항원을 나타낸다.
도 3. bi-scFv 단백질 1BiMAB의 쿠마씨 겔 및 웨스턴 블롯 분석
1BiMAB을 안정적으로 발현하는 모노클로날 HEK293 세포들의 FCS 없는 상등액을 Ni-NTA 친화 크로마토그래피 (IMAC)로 정제하였다. 상이한 정제 단계들의 분주액을 4 - 12% Bis-Tris 겔에 로딩하였다. (A) 세포 상등액의 쿠마씨 염색, 용리액의 플로우 쓰루(flow through) 및 8개 분획. 제1 용리 피크 분획은 폐기하였고, 제2 용리 피크 분획을 추가 연구를 위해 회수하여, PBS 및 이어서 200 mM 아르기닌 완충액으로 투석하였다. (레인 1: HEK293/1BiMAB SN; 레인 2: IMAC 플로우 쓰루 분획; 레인 3-4: 제1 용리 피크 분획(폐기됨); 레인 5-10: 제2 용리 피크 분획 (회수됨)) (B) 3 가지 독립 정제물(레인 1, 2, 3)으로부터의 0.5 μg의 1BiMAB의 웨스턴 블롯 분석. 제1 모노클로날 항His 및 제2 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항마우스 항체에 대해 검토하였다. IMAC는 고정형 금속 친화 크로마토그래피를; PBS는 인산염 완충염수; SN은 상등액; WB는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 4. Bi-scFv 단백질 1BiMAB는 CLDN18.2-발현 표적 세포들 및 인간 T 세포들에 효과적이고도 특이적으로 결합한다.
(A) 2.5x105 CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 양성 대조군으로서 50 μg/ml 1BiMAB 또는 10 μg/ml mCLDN18.2ab 및 대응하는 APC-컨쥬게이트된 2차 항체들과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 염색은 APC-컨쥬게이트된 2차 항체들 단독 (g-a-h, g-a-m), 항His 및 g-a-m APC, 또는 1BiMAB 및 g-a-m APC를 포함하였다. 유세포분석을 실시하였다. APC 시그널의 MFI을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. (B) 1x105 CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 증가하는 농도의 1BiMAB(20 pg/ml - 20 μg/ml), 항His 및 g-a-m APC로 염색하였다. 음성 대조군으로서 세포들을 항His 및 g-a-m APC와 함께 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로는 mCLDN18.2ab 및 g-a-h APC를 사용하였다. APC 시그널의 MFI을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. (C) 1x106 인간 T 세포들을 증가하는 농도의 1BiMAB (2 ng/ml-2 μg/ml), 항His 및 g-a-m APC와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서 세포들을 항His 및 g-a-m APC 또는 g-a-m APC 단독과 함께 인큐베이션하였다. APC 시그널의 MFI을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. (D) 1x105 CLDN18.2 음성 PA-1 세포들을 증가하는 농도의 1BiMAB concentrations (10 ng/ml - 10 μg/ml), 항His 및 g-a-m APC와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 세포들을 항His 및 g-a-m APC 또는 g-a-h APC 단독과 함께 인큐베이션하였다. 10 μg/ml mCLDN18.2ab 및 g-a-h APC를 이용하여 세포들의 CLDN18.2 음성도(negativity)를 확인하였다.
G-a-h는 염소-항인간; g-a-m은 염소-항마우스; MFI는 평균 형광강도; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 5. Bi-scFv 단백질 1BiMAB는 CLDN18.2 양성 표적 세포들 상에서 T 세포 클러스터링을 유발한다. CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 6-웰 플레이트에서 이펙터 대 표적의 비율을 5:1로 하여 24h 동안 1 ng/ml 및 1 μg/ml 1BiMAB 및 인간 T 세포들과 함께 인큐베이션하였다. T 세포들 단독(TL), 표적 세포들 단독(NugC4) 및 인간 T 세포들과 표적 세포들의 조합 (-ctrl)을 대조군 샘플들로서 선택하였다. 24h 후, 샘플들을 Nikon Eclipse Ti 현미경으로 200x 배율로 사진을 찍었다. 백색 화살표는 표적 세포들 상의 T 세포 클러스터들을 가리킨다. TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 6. 1BiMAB는 투여량 의존 방식으로 T 세포 활성화를 매개한다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을, 24-웰 포맷에서 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 24h 및 48h 동안 증가하는 농도의 bi-scFv 단백질 1BiMAB (0.001 - 1000 ng/ml) 및 인간 T 세포들과 함께 중복적으로 인큐베이션하였다. 대조군으로서 인간 T 세포들을 NugC4 표적 세포들 없이 1-1000 ng/ml 1BiMAB와 함께 인큐베이션하여 1BiMAB에 의해 매개되는 T 세포들의 표적 의존 활성화를 검정하였다. 24h (A) 및 48h (B) 후, T 세포들을 수확하고 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 및 항CD69-APC로 표지한 다음 유세포분석을 실시하였다. TL은 T 림프구를 가리킨다.
도 7. 1BiMAB는 CLDN18.2 고, 저 및 비-발현 세포주들과 함께 장기간 인큐베이션된 후에조차도 철저하게 표적 의존성 T 세포 활성화를 매개한다.
(A) 6종의 종양 세포주들의 총 RNA로부터 생성된 RT-PCR 데이터를 나타낸다. 하우스키핑 유전자 HPRT에 대해 정규화된 CLDN18.2 발현의 Ct-값을 2가지 독립 실험을 수행하여 산출하였다. 유방암 세포주 MCF7 (회색 막대)를 음성 CLDN18.2-발현 대조군 세포주로서 선택하였다.(B) (A)로부터의 암세포주들을 6-웰 포맷에서 이펙터 대 표적의 비율을 5:1로 하여 인간 T 세포 존재 또는 부재하에 144h 동안 5 ng/ml bi-scFv 단백질 1BiMAB과 함께 중복 인큐베이셩하였다. T 세포들을 항CD3-FITC, 항CD25-PE 및 항CD69-APC로 표지하여 유세포분석에 의해 총 T 세포 집단 (CD3), T 세포의 조기 활성화 (CD69), 및 후기 활성화 (CD25)를 검토하였다. TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 8. 1BiMAB는 CLDN18.2 양성 표적 세포들의 존재 하에서만 T 세포 증식 및 Granzyme B 상향조절을 유도한다.
(A) 인간 T세포들을 CFSE 염색하고 단독(TL) 또는 1 ng/ml 1BiMAB (TL + 1 ng/ml 1BiMAB), NugC4 세포들 (TL + NugC4), 또는 NugC4 세포들 및 1 ng/ml 1BiMAB (TL + 1 ng/ml 1BiMAB + NugC4)의 존재 하에 120h 동안 배양하였다. 이펙터 대 표적 비율을 5:1이 되도록 하였다. T 세포 증식을 가리키는 CFSE 시그널의 감소를 유세포분석으로 검토하였다. (B) 인간 T세포들을 NugC4 표적 세포들의 존재 또는 부재 하에, 그리고 및 5 ng/ml bi-scFv 1BiMAB 단백질의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 이펙터 대 표적 비율은 6-웰 포맷에서 5:1이었다. 96h의 공인큐베이션 후 T 세포들을 수확하고 항GrB-PE로 세포내 염색한 다음 유세포분석을 실시하였다. 항GrB-PE 시그널의 MFI를 FlowJo 소프트웨어로 산출하였다. 염색되지 않은 샘플 TL + NugC4 + 5 ng/ml 1BiMAB의 시그널을 모든 샘플들로부터 공제하였다. CFSE는 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르; GrB는 Granzyme B; MFI는 평균 형광 강도; PE는 피코에리쓰린; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 9. 48h 후 특이적 표적 세포 용해에 대한 1BiMAB의 EC50은 약 10 pg/ml이다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들로서 루시페라제를 안정하게 발현하는 세포들을 96-웰 포맷에서 24h 및 48h 동안 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 증가하는 농도 (0.001 - 1000 ng/ml)의 bi-scFv 단백질 1BiMAB 인간 T 세포들과 함께 삼중 인큐베이션시켰다. 최소 용해 (Lmin) 대조군으로서 이펙터 및 표적 세포들을 bi-scFv 1BiMAB 없이 도말하였다. 루시페린 첨가 바로 전에 bi-scFv의 부재 하에 이펙터 및 표적 세포들을 함유하는 대조군 웰에 Triton X-100을 첨가함으로써 자연발생적인 발광 카운트에 대한 최대 용해(Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액 첨가로부터 24h 및 48h 후에 Infinite M200 Tecan 마이크로플레이트 판독기로 발광도를 측정하였다. 다음 공식: % 특이적 용해 = [1 - (발광도테스트 샘플 - Lmax) / (Lmin - Lmax)] x 100으로 특이적인 표적 세포 용해를 구하였다. 얻어진 값들을 1BiMAB 농도의 log10으로서 플롯팅하였다.
EC50은 절반 최대 유효농도(half maximal effective concentration)를; L은 용해(lysis)를 가리킨다.
도 10. 1BiMAB는 진행된 SC 종양 모델에서 생체내 치료 효능을 나타낸다.
NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스들에게 CLDN18.2를 안정하게 발현하는 1x107 HEK293를 피하주사하였다. 5일 후 2x107 인간 PBMC 이펙터 세포들을 그룹 G3 및 G4에게 복강내(IP) 주사하고, 대조군 (G1 및 G2)에게는 PBS만을 주입하였다. 이 동물 한 마리 당 5 μg bi-scFv 단백질 1BiMAB 또는 대조군으로서 비히클을 다음 날부터 매일 복강내 주사하였다. 치료를 위한 투여는 22일간 지속하였으며, 칼리퍼를 이용하여 종양 크기를 측정하고 다음 식에 의해 크기를 산출하였다 mm3 = 길이 mm x 폭 mm x (폭 mm/2). (A) 마우스 한 마리의 종양 크기와 그룹 당 중앙값을 제0일 및 제15일(윗줄)에, 치료 종료로부터 제3일 및 제13일에 (아랫줄) 나타내었다. (B) 인간 이펙터 세포들이 이식된(engrafted) 2가지 처리군의 평균 종양 크기를 나타내었다. 점선은 희생된 동물을 나타낸다. (C) 카플란-마이어 생존 곡선은 종양 접종일부터 제41일까지 모든 그룹에 대해 나타내었다. 종양 크기가 500 mm3를 초과하는 즉시 동물들을 희생시켰다. 41일 후 남아있는 모든 동물들을 희생시켜 마우스 비장 내의 인간 이펙터 세포들의 이식을 분석하였다. (D) 모든 마우스들의 비장세포를 분리하고 항CD45-APC 및 항CD3-FITC로 염색하여 인간 T 세포들을 유세포분석으로 탐지하였다. 중양(median) 이식도를 박스플롯 다이아그램으로 나타내었다. G는 그룹을; IP는 복강내; PBMC는 말초혈액단핵구 세포; PBS는 인산염 완충염수; SC는 피하를 나타낸다.
도 11. TAA CLDN6를 표적화하는 재조합 bi-scFv 단백질들의 설계를 설명하는 모듈식 설명도.
항TAA 가변부와 관련한 (A) N-말단 및 (B) C-말단 위치의 bi-scFvs의 디자인. 항CLDN6 VH 및 VL 영역이 모노클로날 CLDN6 항체 (mCLDN6ab)의 서열로부터 생성된다. 항CD3 VH 및 VL 영역은 모노클로날 CD3 항체 TR66의 서열로부터 생성된다. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; His는 헥사히스티딜-태그; LL은 롱 링커 (15-18 아미노산); Sec은 분비 시그널; SL은 숏 링커 (5 아미노산); TAA는 종양관련 항원; V는 항체의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변부를 나타낸다.
도 12. Bi-scFv 단백질 6PHU5 및 6PHU3은 CLDN6 양성 표적 세포들 상에서 T 세포 클러스터링을 유도한다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 6-웰 플레이트에서 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 24h 동안 50 ng/ml 6PHU5 또는 6PHU3 및 인간 T 세포들과 함께 인큐베이션하였다. T 세포들 단독 (TL), 표적 세포들 단독 (PA-1) 및 인간 T 세포들과 표적 세포들의 조합 (-ctrl)을 대조군 샘플들로서 사용하였다. 24h 후 샘플들을 Nikon Eclipse Ti 현미경으로 200x 배율로 사진찍었다. 백색 화살표는 표적 세포들 상의 T 세포 클러스터를 가리킨다. TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 13. 도메인 배향이 효능에 미치는 효과: bi-scFv 단백질 6PHU3은 T 세포 활성화를 유도하는데 있어서 6PHU5보다 약간 더 효과적이다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 6-웰 포맷에서 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 증가하는 44h 동안 증가하는 농도(5 - 200 ng/ml)의 6PHU5 또는 6PHU3 및 인간 T 세포들과 함께 중복 인큐베이션하였다. 대조군으로서 인간 T 세포들을 표적 세포 없이 100 및 200 ng/ml 6PHU5 또는 6PHU3과 함께 인큐베이션하였다. 44h 후 T 세포들을 수확하고, 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 및 항CD69-APC로 표지하였다. 투여량-의존성 T 세포 활성화를 유세포분석으로 분석하였다. Hu는 인간; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 14. 6PHU3 단백질의 쿠마씨 겔 및 웨스턴 블롯 분석
6PHU3을 안정적으로 발현하는 폴리클로날 HEK293 세포들의 FCS 없는 상등액을 Ni-NTA 친화 크로마토그래피 (IMAC)로 정제하였다. 상이한 정제 단계들의 분주액을 4 - 12% Bis-Tris 겔에 로딩하였다. (A) 세포 상등액의 쿠마씨 염색, 용리액의 플로우 쓰루(flow through) 및 9개 분획. 제1 용리 피크 분획은 폐기하였고, 제2 및 제3 용리 피크 분획을 추가 연구를 위해 회수하여, PBS 및 이어서 200 mM 아르기닌 완충액으로 투석하였다. (레인 1: HEK293/6PHU3 SN; 레인 2: IMAC 플로우 쓰루 분획; 레인 3 - 5: 제1 용리 피크 분획(폐기됨); 레인 6-11: 제2 및 제3 용리 피크 분획 (회수됨)). (B) 2 가지 독립 정제물로부터의 0.5 μg의 6PHU3의 웨스턴 블롯 분석. 제1 모노클로날 항His 및 제2 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항마우스 항체에 대해 검토하였다. IMAC는 고정형 금속 친화 크로마토그래피를; PBS는 인산염 완충염수; SN은 상등액; WB는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 15. Bi-scFv 단백질 6PHU3은 CLDN6-발현 표적 세포들 및 인간 T 세포들에 효과적이고도 특이적으로 결합한다.
(A) 1x105 CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 및 OV-90 세포들을 증가하는 농도의 6PHU3 또는 대조군 bi-scFv 1BiMAB (10 ng/ml - 10 μg/ml)과 함께 인큐베이션하고 10 μg/ml mCLDN6ab 또는 대조군 mAB mCLDN18.2ab를 대응하는 APC-컨쥬게이트된 2차 항체들과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 염색물은 APC-컨쥬게이트된 2차항체들 단독 (g-a-h, g-a-m)이었다. 유세포분석을 수행하였다. APC 시그널의 MFI을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. (B) 5x105 인간 T 세포들을 증가하는 농도의 6PHU3 (100 ng/ml - 10 μg/ml), 항His 및 g-a-m PE와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서 세포들을 항His 및 g-a-m PE, 또는 g-a-m PE 단독과 함께 인큐베이션하였다. PE 시그널의 MFI를 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. (C) 1x105 CLDN6 음성 NugC4 세포들을 증가하는 농도의 6PHU3 및 1BiMAB (10 ng/ml - 10 μg/ml), 항His 및 g-a-m APC와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서 세포들을 g-a-m APC 단독과 함께 인큐베이션하였다. 10 μg/ml mCLDN6ab 및 g-a-h APC를 이용하여 세포들의 CLDN6 음성도를 확인하였다. 양성 대조군으로서 mCLDN18.2ab 및 g-a-h APC를 이용하였다. APC 시그널의 MFI을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. APC는 알로피코시아닌; g-a-h는 염소-항인간; g-a-m은 염소-항마우스; mAB는 모노클로날 항체; MFI는 평균 형광 강도; PE는 피코에리쓰린; TL은 T 림프구를 가리킨다.
도 16. 6PHU3은 투여량 의존 방식으로 T 세포 활성화를 매개한다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 24h 및 48h 동안 증가하는 농도의 bi-scFv 단백질 6PHU3 (0.001 - 1000 ng/ml) 및 인간 T 세포들과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 24-웰 포맷에서 중복 인큐베이션하였다. 대조군으로서 인간 T 세포들을 PA-1 표적 세포들 없이 1 - 1000 ng/ml 6PHU3과 함께 인큐베이션하여 6PHU3에 의해 매개된 T 세포들의 표적 의존성 활성화를 검정하였다. 24h 후 (A) 및 48h 후(B), T 세포들을 수확하여, 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 및 항CD69-APC로 표지한 다음 유세포분석을 실시하였다. TL은 T 림프구를 가리킨다.
도 17. 48h 후 특이적인 표적 세포 용해에 대한 6PHU3의 EC50은 약 10 pg/ml이다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들로서 루시페라제를 안정적으로 발현하는 세포들을 24h 및 48h 동안 증가하는 농도의 6PHU3 단백질(0.001 - 1000 ng/ml) 및 인간 T 세포들과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 96-웰 포맷에서 삼중 인큐베이션하였다. 최소 용해 대조군 (Lmin)으로서 이펙터 및 표적 세포들을 bi-scFv 6PHU3 없이 도말하였다. 루시페린 첨가 바로 전에 bi-scFv의 부재 하에 이펙터 및 표적 세포들을 함유하는 대조군 웰에 Triton X-100을 첨가함으로써 자연발생적인 발광 카운트에 대한 최대 용해(Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액 첨가 후 24h 및 48h 후에 Infinite M200 Tecan 마이크로플레이트 판독기로 발광도를 측정하였다. 다음 공식: % 특이적 용해 = [1 - (발광도테스트 샘플 - Lmax) / (Lmin - Lmax)] x 100으로 특이적인 표적 세포 용해를 구하였다. 얻어진 값들을 6PHU3 농도의 log10으로서 플롯팅하였다. EC50은 절반 최대 유효농도(half maximal effective concentration)를; L은 용해(lysis)를 가리킨다.
도 18. 6PHU3은 진행된 SC 종양 모델에서 생체내 치료 효능을 나타낸다.
NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에게 CLDN6을 내재적으로 발현하는 1x107 PA-1을 피하(SC) 주사하였다. 15일 후 2x107 인간 PBMC을 G3 및 G4 그룹에게 복강주사하고 대조군 (G1 및 G2)에게는 PBS 만을 주사하였다. 이 동물 한 마리 당 5 μg 6PHU3 또는 대조군 bi-scFv 1BiMAB 또는 비히클 단독 투여를 대조군으로서 5일 후부터 매일 복강내 주사하였다. 치료를 위한 투여는 25일간 지속하였으며, 칼리퍼를 이용하여 종양 크기를 측정하고 다음 식에 의해 크기를 산출하였다 mm3 = 길이 mm x 폭 mm x (폭 mm/2). (A) 마우스 한 마리의 종양 크기와 그룹 당 중앙값을 제0일 및 제14일(윗줄)에, 그리고 제21일 및 제25일에 (아랫줄) 나타내었다. (B) 모든 치료군의 평균 종양 크기를 나타내었다. 점선은 희생된 동물을 나타낸다. (C) 종양 접종일부터 제45일까지 모든 그룹의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내었다. 종양 크기가 > 1500 mm3이면 즉시 동물들을 희생시켰다. 45일 후 남아있는 모든 동물들을 희생시켜 마우스 비장 내의 인간 이펙터 세포들의 이식을 분석하였다. (D) 모든 마우스들의 비장세포를 분리하고 항CD45-APC 및 항CD3-FITC로 염색하여 인간 T 세포들을 유세포분석으로 탐지하였다. 중앙(median) 이식도를 박스플롯 다이아그램으로 나타내었다. IP는 복강내; PBMC는 말초혈액단핵구 세포; PBS는 인산염 완충염수; SC는 피하를 나타낸다.
도 19. 6PHU3 처리에 반응하여 T 세포의 SC PA-1 내로의 증강된 침윤
NSG 마우스들에게 CLDN6을 내재적으로 발현하는 1x107 PA-1를 피하 주사하였다. 15일 후 2x107 인간 PBMC를 G3 및 G4 그룹에 복강내 주사하고, 대조군(G1 및 G2)에게는 PBS 만을 투여하였다. 이 동물 한 마리 당 5 μg 6PHU3 또는 대조군 bi-scFv 1BiMAB 또는 비히클 단독 투여를 대조군으로서 5일 후부터 매일 복강내 주사하였다. 실험 말기에 종양을 1500 mm3의 크기로 절단하고, 파라핀 임베딩을 위해 4% 포름알데히드 완충 용액에서 보관하였다.
SC PA-1 종양의 파라핀 임베딩된 종양 조직을 면역조직화학 염색으로 처리하였다. 연속적인 섹션들을 폴리클로날 1차 항체 항클라우딘 6 또는 항인간 CD3으로 염색하였다. 1차 항체들을 HRP-컨쥬게이트된 2차 항토끼 항체들로 염색하였다. A-E의 윗 줄은 CLDN6 염색을, 아랫줄은 CD3 염색을 나타낸다. Mirax 스캐너로 영상을 수집하였다. (A) 및 (B)는 인간 이펙터 세포들을 받지 않고 비히클 또는 bi-scFv 6PHU3을 받은 PBS 대조군 G1 및 G2를 각각 나타내고, (C)는 처리군으로서 인간 이펙터 세포들 및 비히클을 받은 대조군 G3를 나타내며, (D)는 처리군으로서 인간 이펙터 세포들 및 bi-scFv 6PHU3을 받은 G4 그룹을 나타내고, 및 (E)는 인간 이펙터 세포들 및 대조군 bi-scFv 1BiMAB를 받은 대조군 G5를 나타낸다. 양성 시그널은 적색 염색으로 나타난다. 흑색 화살표는 CD3 시그널의 예를 가리킨다. IP는 복강내; PBMC는 말초혈액 단핵구 세포들; PBS는 인산염 완충염수; SC는 피하를 나타낸다.
도 20. TAA CLDN18.2를 표적화하는 bi-scFv 항체들을 인코딩하는 IVT-RNA 분자들의 모식적 설명도
항CLDN18.2 bi-scFv 항체들을 인코딩하는 시험관내 전사된 RNA 서열들의 반응도. (A) 항TAA 가변부와 관련한 5'- 및 3'- 위치의 IVT-mRNA. (B) 항TAA 가변부와 관련한 5'-위치의 IVT 알파바이러스 레플리콘. 항CLDN18.2 VH 및 VL 영역들은 모노클로날 CLDN18.2 항체 (mCLDN18.2ab)의 서열로부터 생성되었다. "캡(Cap)"은 ARCA, β-S-ARCA (D1) 또는 β-S-ARCA (D2)에 골고루 이용된다. (A)에서, "항CD3"은 다음의 모노클로날 CD3 항체들의 서열들로부터 생성된 VH 및 VL 영역을 광범하게 나타낸다: UCHT1-HU (인간화 mAB), UCHT1, CLB-T3, TR66, 145-2C11, (B)에서, "항CD3"은 TR66으로부터의 VH 및 VL 만을 설명하는 것이다. A는 아데닌; bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; hAg는 인간 알파 글로빈 5'-UTR; hBg는 인간 β 글로빈 3'-UTR; His는 헥사히스티딜-태그; IVT는 시험관내 전사; LL은 롱 링커 (15-18 아미노산); nsP1-4은 비구조체 단백질 1-4; Sec은 분비 시그널; sgP는 서브게놈 프로모터; SL은 숏 링커 (5-6 아미노산); TAA는 종양관련 항원; UTR은 미번역 영역; V는 항체의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변부를 나타낸다.
도 21. 도메인 배향 및 항CD3-scFv 선택이 표적 의존성 T 세포 활성화 및 특이적 표적 세포 용해에 미치는 효과.
세포독성 분석에서의 강도 비교를 위해, CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 CLDN18.2 및 CD3에 지향된 몇몇 bi-scFv 변이체들로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 변이체 당, 5x106 NugC4 세포들을 20 μg/ml IVT-mRNA와 함께 전기영동하였다. 트랜스펙션된 표적 세포들을 카운트하고, 1x105 세포들을 6-웰 플레이트 마다 접종하고 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)과 함께 E:T 비율을 5:1로 하여 인큐베이션하였다. 음성 대조군들로서, 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(ctrl), 및 T 세포들이 아닌 CLDN18.2를 표적화하는 모(母) IgG mAB chCLDN18.2ab (ctrl IgG)를 선택하였다. 5 ng/ml의 농도의 1BiMAB 단백질을 양성 대조군으로 하였다. 배경 사멸 세포 레퍼런스로서, 전기영동처리된 표적 세포들을 T 세포 없이 접종하고, 배경 활성화 레퍼런스로서, T 세포들을 표적 세포들 없이 접종하였다. 각각의 샘플을 중복 접종하였다. 48 h 후, T 세포들 및 표적 세포들을 수확하고 생존-사멸 염색을 위해 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 항CD69-APC 및 7-AAD로 표지한 다음 유세포분석을 수행하였다. (A) 모든 항CLDN18.2 bi-scFv 변이체에서 TAA-의존성 bi-scFv 매개된 T 세포 활성화가 관찰되었다. (B) 7-AAD 샘플 표적 세포 집단으로부터 7-AAD 레퍼런스 집단을 공제하여 특이적인 표적 세포 용해도를 구하였다. 아주 약간 더 높은(marinal higher) 표적 세포 용해를 유도하는 bi-scFv 항체들 - 1BiMAB 및 no.5 -는 mAB TR66의 항CD3 오리진과 도메인 배향을 공유한 반면, 그의 코돈 최적화(각각 HS 및 CHO) 및 롱 링커 서열들에서는 차이를 보였다. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; ctrl은 대조군; IgG은 면역글로불린 G; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 22. 1BiMAB IVT-mRNA로 트랜스펙션된 표적 세포들과 인간 T 세포들과의 공인큐베이션은 T 세포 클러스터링을 야기한다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 80 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA와 함께 전기영동처리하여 일시적으로 트랜스펙션시킨 다음 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 96-웰 플레이트에서 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)와 함께 공인큐베이션시켰다. 음성 대조군 샘플로서, 인간 세포독성 T 세포들과 공윤큐베이션된 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(- ctrl)로 트랜스펙션된 NugC4 표적 세포들을 이용하였다(윗줄 좌측). 아랫줄은 인간 T 세포들 없이 대조군 bi-scFv (좌측) 또는 1BiMAB IVT-mRNA (우측)에 의해 트랜스펙션된 NugC4 세포들을 나타낸다. 24 h 공인큐베이션한 후, 샘플들을 Nikon Eclipse Ti 현미경으로 200x 배율로 사진찍었다. 백색 화살표는 표적 세포들 상의 T 세포 클러스터를 가리킨다. CTL은 세포독성 T 림프구; ctrl은 대조군; hu는 인간을 가리킨다.
도 23. IVT-mRNA 트랜스펙션 후 표적 세포들에 의해 분비된 1BiMAB는 농도 의존 방식으로 T 세포 활성화를 매개한다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을, 0.4-40 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA 플러스 적절한 양의 루시페라제 IVT-mRNA를 함유하는 총 40 μg/ml IVT-mRNA와 함께 전기영동시킴으로써 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 표적 세포들을 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 6-웰 플레이트에서 중복 인큐베이션하였다. T 세포 활성화 레퍼런스로서 인간 T 세포들을 40 μg/ml 루시페라제 IVT-mRNA (0.0 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA)에 의해 트랜스펙션된 NugC4 표적 세포들과 함께 공인큐베이션하였다. 24 h 후 (A) 및 48 h 후 (B), T 세포들을 수확하고 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 및 항CD69-APC로 표지하여 유세포분석을 실시하였다. 그래프는 FlowJo 소프트웨어로 측정할 경우 양성 염색된 세포독성 인간 T 세포들의 백분율을 나타낸다. IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 24. IVT-mRNA 트랜스펙션 후 표적 세포들에 의해 분비된 1BiMAB는 농도 의존적 표적 세포 용해를 유도한다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 0.4-40 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA 플러스 적량의 루시페라제 IVT-mRNA를 함유하는 총 40 μg/ml IVT-mRNA, 또는 레퍼런스 샘플로서 40 μg/ml 루시페라제 IVT-mRNA로 전기영동함으로써 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 표적 세포들에게 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)을 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하거나 또는 이펙터 세포 없이 접종하고 각각의 개별적인 전기영동에 의해 배경 사멸 표적 세포들의 백분율을 구하였다. 24 h 후 (A) 및 48 h 후 (B), T 세포들을 수확하고, 생존/사멸 염색을 위해 프로피디움 요오다이드 (PI)로 표지하고 유세포분석을 실시하였다. 사멸된(PI+) 표적 세포들의 백분율을 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 구하였다. 얻어진 값들을 개별적인 샘플 및 레퍼런스 샘플에 대해 추가로 정규화하였다. IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 25. CLDN18.2 존재 하 표적 세포들에 의한 1BiMAB 분비에 반응하여 T 세포 증식이 특이적으로 유도된다.
분석을 위해 인간 T 세포들을 CFSE 염색하였다. 양성 활성화 대조군 (+ctrl)으로서 T 세포들을 표적 세포들 없이 (T 세포들) 5 μg/ml OKT3 및 2 μg/ml αCD28과 함께 또는, 5 ng/ml 비표적화 대조군 bi-scFv (-ctrl 단백질) 또는 5 ng/ml 1BiMAB 단백질 (1BiMAB 단백질)와 함께 조합 배양하였다. 달리 아무것도 없이(mock) 또는 5 ng/ml 1BiMAB 단백질 (1BiMAB 단백질)과 함께, CLDN18.2을 과발현하는 T 세포들 및 NugC4 표적 세포들 (T 세포들 + CLDN18.2 양성 표적 세포들)을 함께 인큐베이션하였다. IVT-mRNA를 시험하기 위해, NugC4 세포들을 20 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA (1BiMAB mRNA) 또는 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(-ctrl mRNA)로 트랜스펙션하고 T 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 이에 더해, 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA에 의해 트랜스펙션된 NugC4 세포들을 5 ng/ml 1BiMAB 단백질 (-ctrl mRNA + 1BiMAB 단백질)과 조합하였다. 추가적인 특이성 대조군으로서, T 세포들과 함께 CLDN18.2-비발현 표적 세포주 MDA-MB-231을 갖는 샘플들을 포함시켰다(T 세포들 + CLDN18.2 음성 표적 세포들). MDA-MB-231을 미처리 상태로 사용하고 다른 것 없이 (mock), 5 ng/ml 대조군 bi-scFv 단백질 (-ctrl 단백질) 또는 5 ng/ml 1BiMAB 단백질 (1BiMAB 단백질)과 함께 인큐베이션시키거나 또는 MDA-MB-231을 20 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA (1BiMAB mRNA) 또는 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(-ctrl mRNA)에 의해 트랜스펙션하였다. 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 96-웰에서 각 삼중 샘플을 72 h 동안 인큐베이션하였다. T 세포 증식을 가리키는 CFSE 시그널의 감소를 유세포분석에 의해 분석하고, FlowJo 소프트웨어로 계산하고 % 증식 T 세포로서 플로팅하였다. CFSE는 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA를 나타낸다.
도 26. 1BiMAB 분비에 대한 T 세포 활성화 및 T 세포-매개된 표적 세포 용해는 이펙터 대 표적 비율 0.3:1에서 개시된다.
CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들을 40 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA와의 전기영동에 의해 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 표적 세포들을 지시된 이펙터 대 표적 비율인 0.3:1 내지 10:1로 6-웰 플레이트에서 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)과 함께 중복 공인큐베이션하였다. 레퍼런스로서 인간 T 세포들을 표적 세포들의 부재 하에 배양하고 ((A) 1:0) 대조군 IVT-mRNA에 의해 트랜스펙션된 표적 세포들을 이펙터 세포들의 부재 하에 배양하였다 ((B) 0:1). 음성 대조군으로서 인간 T 세포들을 10:1의 E:T 비율로 40 μg/ml 루시페라제 IVT-mRNA (ctrl IVT-mRNA)에 의해 트랜스펙션된 NugC4 표적 세포들과 함께 공인큐베이션시켰다((A) 및 (B) ctrl IVT-mRNA 10:1). 48 h 후, 세포들을 수확하고 생존/사멸 염색을 위해 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 항CD69-APC 및 프로피디움 요오다이드 (PI)로 표지하여 유세포분석하였다. (A)는 양성적으로 염색된 세포독성 인간 T 세포들의 백분율을 나타낸다. (B)는 사멸 (PI+) 표적 세포들의 백분율을 나타낸다. 모든 값들을 FlowJo 소프트웨어를 통해 정하였다. E:T는 이펙터 대 표적; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 27. 인간 세포독성 T 세포들은 bi-scFv IVT-mRNA 수용체 및 프로듀서 세포의 역할을 할 수 있다.
인간 세포독성 T 세포들을 PBMCs로부터 CD8 양성 선별에 의해 새로 분리한 다음 80 또는 240 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA와 함께 전기영동함으로써 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 이펙터 세포들을, CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 표적 세포들과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 6-웰 플레이트에서 중복적으로 공인큐베이션하였다. 레퍼런스로서 미처리 인간 T 세포들을 표적 세포들과 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서 80 또는 240 μg/ml eGFP 대조군 IVT-mRNA으로 트랜스펙션된 인간 T 세포들을 NugC4 표적 세포들과 함께 공인큐베이션하였다. 48 h 후, 세포들을 수확하고 생존/사멸 염색을 위해 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 항CD69-APC 및 프로피디움 요오다이드 (PI)으로 표지한 다음 유세포분석을 실시하였다. (A)는 양성 염색된 세포독성 인간 T 세포들의 백분율을 나타낸다. (B)에, 레퍼런스 샘플에 대해 정규화된 사멸 (PI+) 표적 세포들의 백분율을 나타내었다. 모든 값들은 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 구하였다. Ctrl은 대조군; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 28. 1BiMAB IVT-mRNA에 의해 트랜스펙션된 CLDN18.2 음성 표적 세포들은 T 세포들에 의해 용해되지 않는다
루시페라제를 안정적으로 발현하는 CLDN18.2 음성 세포주 PA-1을 표적 세포주로 삼았다. 5x106 PA-1/luc 세포들을 총 40 μg/ml IVT-mRNA와 함께 전기영동하여 트랜스펙션시켰다. 4 및 40 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA 또는 내인적으로 발현된 CLDN6을 표적화하는 6RHU3을 양성 대조군으로서 트랜스펙션시켰다. bi-scFv 음성 대조군으로서, 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 40 μg/ml의 bi-scFv IVT-mRNA(- ctrl)을 트랜스펙션시켰다. 이 IVT-mRNA는 또한 4 μg/ml IVT-mRNA 샘플들에서 필-업(fill-up) RNA로서도 작용하였다(IVT-mRNA 4 μg/ml 1BiMAB, IVT-mRNA 4 μg/ml 6RHU3).bi-scFv 음성 대조군 트랜스펙션된 PA-1/luc 세포들 및 이펙터 세포들과 조합적으로 1BiMAB 및 6PHU3와 함께 단백질 대조군 샘플들이 포함되었다.
트랜스펙션된 표적 세포들에 인간 세포독성 T 세포들 (Pan T 세포들)을 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 접종하였다. 모든 샘플들을 96-웰 포맷으로 삼중 접종하고 72 h 동안 공인큐베이션하였다. 최소 용해 대조군 (Lmin)으로서 각각의 개별적인 트랜스펙션된 표적 세포 샘플을 이펙터 세포 없이 접종하였다. 루시페린 첨가 전에 이펙터 및 미처리 표적 세포들 (Lmax1) 또는 미처리 표적 세포들 단독 (Lmax2)을 함유하는 대조군 웰에 Triton X-100을 첨가함으로써 자연발생적인 발광 카운트에 대한 최대 용해(Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액을 첨가하고 30 min 후, Infinite M200 Tecan 현미경 판독기로 발광도를 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해를 다음 식에 의해 산출하였다: 　% 특이적 용해 = [1 - (발광도 테스트 샘플 - Lmax1) / (Lmin_테스트 샘플 - Lmax2)] x 100. Ctrl은 대조군; IVT는 시험관내 전사; mRNA는, 메신저 RNA를 나타낸다.
도 29. bi-scFv IVT-mRNA 또는 - 레플리콘 RNA에 의해 트랜스펙션된 포유동물 세포에 의한 1BiMAB 생산 증거
(A) 5x106 BHK21 세포들을 40 μg/ml의 1BiMAB IVT-mRNA 또는 -레플리콘 RNA와 전기영동하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 목(mock) 대조군으로서 세포들을 RNA 없이 전기영동하였다. 트랜스펙션한지 18 h 후, 상등액 및 세포들을 수확하였다. 세포들을 용해시키고 상등액을 ~50배 농축시켰다. 미처리 및 농축된 상등액들을 Ni-NTA 플레이트, 항chCLDN18.2ab 특발성 mAB 및 AP-컨쥬게이트된 2차 항체를 이용하여 ELISA 분석하였다. 2.3 내지 37.5 ng/ml 범위로 2 단계로 희석된 정제된 1BiMAB 단백질을 표품으로서 사용하였다. (B) 양성 대조군으로서 0.1 μg 정제된 1BiMAB 단백질, (A)의 세포 용해물 및 농축 상등액을 SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 1차 모노클로날 항His 및 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 2차 항마우스 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (C) 5x106 BHK21 세포들을 40 μg/ml의 1BiMAB 또는 no.25 IVT-mRNA와 함께 전기영동하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 목(mock) 대조군으로서 세포들을 RNA 없이 전기영동하였다. 트랜스펙션한지 48 h 후, 상등액을 수확하고 40배 농축시켰다. 양성 대조군으로서 0.1 μg 정제된 1BiMAB 단백질 및 SN을 SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 1차 모노클로날 항His 및 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 2차 항마우스 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Ctrl은 대조군; mAB는 모노클로날 항체; SN은 상등액; WB는 웨스턴 블롯을 가리킨다.
도 30. 1BiMAB bi-scFv IVT - mRNA 또는 - 레플리콘 RNA의 주사는 마우스에서 1BiMAB bi-scFv 분자의 생체내 생성 및 검출가능한 1BiMAB bi-scFv 분자를 유도한다
10 μg 1BiMAB IVT-mRNA를 EBK IVT-mRNA와 함께 또는 없이, 또는 10 μg 1BiMAB IVT-레플리콘을 NSG 마우스에 근육내(IM) 주사하였다. 주사한지 2, 4, 및 7일 후 혈액으로부터 얻은 혈청을 시험관내 세포독성 분석하였다. CLDN18.2 및 루시페라제를 안정적으로 발현하는 NugC4-LVT-CLDN18.2/luc 표적 세포들을 인간 T 세포들과 함께 E:T 비율을 30:1로 하여 20 μl 샘플 혈청과 함께 48 h 동안 공인큐베이션시켰다. 표준 1BiMAB 단백질 대조군, Lmin 및 Lmax 은 20 μl NSG 목(mock) 혈청을 함유하였다. EBK는 백시니아 바이러스 단백질 칵테일 E3, B-18R, K3; IM은 근육내를 나타낸다.
도 31. TAA CLDN6를 표적화하는 bi-scFv 항체를 인코딩하는 IVT-RNA 분자의 모식적 설명도
항CLDN6 bi-scFv 항체들을 인코딩하는 시험관내 전사 RNA 서열들의 모식도. (A) 항TAA 가변부와 관련된 5'- 및 3'- 위치의 IVT mRNA. (B) 항TAA 가변부와 관련된 3'-위치의 IVT 알파 바이러스 레플리콘. 항CLDN6 VH 및 VL 영역들이 모노클로날 CLDN6 항체 (mCLDN6ab)의 서열로부터 생성된다. "캡(Cap)"은 ARCA, β-S-ARCA (D1) 또는 β-S-ARCA (D2)에 골고루 이용된다. 항CD3 VH 및 VL 영역이 모노클로날 CD3 항체 TR66의 서열로부터 생성된다. A는 아데닌; bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; hAg는 인간 알파 글로빈 5'-UTR; hBg는 인간 β 글로빈 3'-UTR; His는 헥사히스티딜-태그; IVT는 시험관내 전사; LL은 롱 링커 (15-18 아미노산); nsP1-4는 비구조 단백질 1-4; Sec은 분비 시그널; sgP는 서브게놈 프로모터; SL은 숏 링커 (5-6 아미노산); TAA는 종양관련 항원; UTR은 미번역 영역; V는 항체의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변부를 나타낸다.
도 32. 항CLDN6 bi-scFv IVT-mRNA로 트랜스펙션된 표적 세포들과 인간 T 세포들과의 공인큐베이션은 T 세포 클러스터링을 유도한다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 20 μg/ml 6RHU5 또는 6RHU3 IVT-mRNA와 함께 전기영동하여 일시적으로 트랜스펙션시키고 인간 T 세포들 (Pan T 세포들)과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 6-웰 플레이트에서 공인큐베이션시켰다. 음성 대조군 샘플로서, 인간 T 세포들과 공인큐베이션된 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(- ctrl)에 의해 트랜스펙션된 PA-1 표적 세포들을 사용하였다(윗줄, 좌측 사진). 가운데 줄은 음성 대조군으로서 단백질 없는 미처리 PA-1 세포들 및 인간 T 세포들(mock, 좌측 사진) 또는 양성 대조군들로서 50 μg/ml 정제된 항CLDN6 bi-scFv 단백질 6PHU5 (가운데) 또는 6PHU3 (우측)을 갖는 미처리 PA-1 세포들 및 인간 T 세포들을 나타낸다. 가장 아래줄은 미처리 PA-1 세포들 (좌측) 및 인간 T 세포들 단독(우측)을 나타낸다. 공인큐베이션한지 24 h 후, 샘플들을 Nikon Eclipse Ti 현미경으로 200x 배율로 사진 찍었다. 백색 화살표는 표적 세포들 상의 T 세포 클러스터를 가리킨다. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; ctrl은 대조군; hu는 인간; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 33. 도메인 배향이 효능에 미치는 효과: 항CLDN6 bi-scFv 6RHU3에 의한 표적 세포 트랜스펙션은 6RHU5에 의한 것보다 더 높은 백분율의 활성화된 T 세포들을 결과시킨다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 CLDN6 및 CD3에 대해 지향된 2종의 bi-scFv 변이체들인 6RHU5 및 6RHU3로 일시적으로 트랜스펙션시켜 T 세포 활성화 분석에 있어서의 이들의 효능을 비교하였다. 변이체 당 5x106 PA-1 세포들을 20 μg/ml IVT-mRNA로 전기영동시켰다. 트랜스펙션된 표적 세포들을 다시 카운트(re-counted)하고, 6-웰 플레이트마다 1x105 세포들을 접종한 다음 인간 세포독성 T 세포들 (CD8+ 선택된 T 세포들)과 함께 E:T 비율을 5:1로 하여 인큐베이션하였다.음성 대조군으로서 미처리 표적 세포들 (hu TL + PA-1 미처리됨) 및 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(hu TL + PA-1 - ctrl)로 트랜스펙션된 표적 세포들을 선택하였다. 6PHU5 단백질은 50 ng/ml 농도로 양성 대조군으로 삼았다 (hu TL + PA-1 단백질 ctrl). 또한, 배경 활성화 레퍼런스로서 6PHU5 단백질 존재 또는 부재 하에 표적 세포 없이 T 세포를 접종하였다. 각 샘플을 중복 접종하였다. 24 h 후 및 48 h 후에 분석을 실시하였다: T 세포들을 수확하고 생존-사멸 염색을 위해 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 항CD69-APC 및 7-AAD로 표지한 다음 유세포분석을 실시하였다. 공인큐베이션한지 24 h 후 (A) 및 48 h 후 (B), TAA-의존성 bi-scFv 매개된 T 세포 활성화가 항CLDN6 bi-scFv 변이체들 두 가지 모두에 대해서 관찰되었다. 두 가지 시점 모두에서 Bi-scFv 6RHU3 트랜스펙션은 약 20　% 더 높은 T 세포 활성화를 유도하였다. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; ctrl은 대조군; hu는 인간; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 34. 6RHU3 분비는 농도 의존 방식으로 T 세포 활성화를 매개한다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 0.2-20 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA 플러스 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 적절한 양의 bi-scFv IVT-mRNA를 함유하는 총 20 μg/ml IVT-mRNA과 함께 전기영동함으로써 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 발현되지 않은 TAA(0.0 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA)를 표적화하는 20 μg/ml bi-scFv IVT-mRNA의 트랜스펙션은 특이성 대조군 역할을 하였다. 트랜스펙션된 표적 세포들을 인간 세포독성 T 세포들 (Pan T 세포들)과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 6-웰 플레이트에서 중복적으로 공인큐베이션시켰다. T 세포 활성화 레퍼런스로서 인간 T 세포들을 6PHU5 단백질 (hu TL -) 없이 단독으로 또는 6PHU5 단백질과 함께 배양하였다 (hu TL 단백질 ctrl). 음성 대조군으로서 T 세포들을 미처리 PA-1 표적 세포들과 함께 배양하였다 (hu TL + PA-1 - ctrl). 6PHU5 단백질은 50 ng/ml의 농도로 양성 대조군 역할을 하였다 (hu TL + PA-1 단백질 ctrl). 48 h 후, T 세포들을 수확하고 항CD3-FITC, 항CD25-PE, 및 항CD69-APC로 표지하여 유세포분석을 실시하였다. 그래프는 FlowJo 소프트웨어로 정해지는 바와 같이 양성 염색된 인간 T 세포들의 백분율을 나타낸다. Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변 단편; ctrl은 대조군; hu는 인간; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA; TL은 T 림프구를 나타낸다.
도 35. 48 h 후 특이적 세포 용해에 대한 6RHU3의 EC50는 약 200 ng/ml이다.
CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들로서 루시페라제를 안정적으로 발현하는 세포들을, 0.004 - 13.3 μg/ml 6RHU3 및 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 적량의 bi-scFv IVT-mRNA를 함유하는 총 농도 13.3 μg/ml bi-scFv IVT-mRNA와 함께 전기영동시킴으로써 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 표적 세포들에 인간 T 세포들을 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 96-웰 포맷으로 삼중 접종하였다. 최소 용해 대조군 (Lmin)으로서 각각의 개별적인 트랜스펙션된 표적 세포 샘플을 이펙터 세포들 없이 접종하였다. 루시페린 첨가 바로 전에 이펙터 및 미처리 표적 세포들을 함유하는 대조군 웰에 Triton X-100을 첨가함으로써 자연발생적인 발광 카운트에 대한 최대 용해(Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액 첨가로부터 30 분 후, 발광도를 24 h 후 및 48 h 후에 Infinite M200 Tecan 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해를 다음 식에 따라 산출하였다: 　% 특이적 용해 = [1 - (발광도 테스트 샘플 - Lmax) / (Lmin_테스트 샘플 - Lmax)] x 100. 얻어진 값들을 6RHU3 농도의 log10으로서 플롯팅하였다. EC50은 절반 최대 유효 농도를 나타내고; L은 용해를 가리킨다.
도 36. CLDN6 존재 하에 표적 세포들에 의한 6RHU3 분비에 반응하여 T 세포 증식이 특이적으로 유도된다.
인간 T세포들을 분석을 위해 CFSE 염색하였다. T 세포들을 표적 세포들 (T 세포들) 없이 양성 활성화 대조군(+ctrl)으로서 5 μg/ml OKT3 및 2 μg/ml αCD28과 조합하여, 5 ng/ml 비표적화 대조군 bi-scFv과 조합하여 (-ctrl 단백질) 또는 5 ng/ml 6PHU3 단백질과 조합하여 (6PHU3 단백질) 배양하였다. T 세포들 및 CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 표적 세포들을 다른 것 없이(mock) 또는 5 ng/ml 6PHU3 단백질 (6PHU3 단백질)와 함께 인큐베이션시켰다 (T 세포들 + CLDN6 양성 표적 세포들). IVT-mRNA를 시험하기 위해, PA-1 세포들을 20 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA (6RHU3 mRNA) 또는 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(-ctrl mRNA)로 트랜스펙션시키고 T 세포들과 함께 인큐베이션시켰다. 이에 더해, 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA로 트랜스펙션된 PA-1 세포들을 5 ng/ml 6PHU3 단백질과 조합하였다 (-ctrl mRNA + 6PHU3 단백질). 부가적인 특이성 대조군으로서, T 세포들과 함께 CLDN6-비발현 표적 세포주 MDA-MB-231을 갖는 샘플들을 포함시켰다(T 세포들 + CLDN6 음성 표적 세포들). MDA-MB-231은 처리하지 않은 채로, 아무 것도 없이(mock), 5 ng/ml 대조군 bi-scFv 단백질과 함RP (-ctrl 단백질) 또는 5 ng/ml 6PHU3 단백질과 함께 (6PHU3 단백질) 인큐베이션시키거나 또는 MDA-MB-231을 20 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA (6RHU3 mRNA) 또는 발현되지 않은 TAA를 표적화하는 bi-scFv IVT-mRNA(-ctrl mRNA)에 의해 트랜스펙션시켰다. 96-웰에서 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 분석을 실시하였으며, 각 샘플에 대해 삼중 분석하고 인큐베이션 기간은 72 h 였다. T 세포 증식을 가리키는 CFSE 시그널의 감소를 유세포분석에 의해 분석하고, FlowJo 소프트웨어로 산출하여, % 증식 T 세포로서 나타내었다. CFSE는 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르; IVT는 시험관내 전사; mRNA는 메신저 RNA를 나타낸다.
도 37. bi-scFv IVT-mRNA 또는 - 레플리콘 RNA에 의해 트랜스펙션된 포유동물 세포에 의한 6RHU3 번역의 증거
(A) 5x106 BHK21 세포들을 40 μg/ml의 6RHU3 IVT-mRNA 또는 -레플리콘 RNA과 함께 전기영동함으로서 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 40 μg/ml no.25 IVT-mRNA의 트랜스펙션을 엑스트라 샘플로서 포함시켰다. 목(mock)으로서 ctrl 세포들을 RNA 없이 전기영동하였다. 트랜스펙션으로부터 18 h 후, 상등액 및 세포들을 수확하였다. 세포들을 용해하고 상등액을 ~50배 농축하였다. 미처리 및 농축된 상등액을 Ni-NTA 플레이트, 항mCLDN6ab 특발성 mAB 및 AP-컨쥬게이트된 2차 항체를 이용하여 ELISA 분석하였다. 2.3 내지 150 ng/ml 범위로 2 단계로 희석된 정제된 6PHU3 단백질을 표품으로서 사용하였다. (B) 양성 대조군으로서 0.1 μg 정제된 6PHU3 단백질, (A)의 세포 용해물 및 농축 상등액을 SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 1차 모노클로날 항His 및 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 2차 항마우스 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (C) 5x106 BHK21 세포들을 40 μg/ml의 6RHU3 또는 no.25 IVT-mRNA와 함께 전기영동하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 목(mock) 대조군으로서 세포들을 RNA 없이 전기영동하였다. 트랜스펙션한지 48 h 후, 상등액을 수확하고 40배 농축시켰다. 양성 대조군으로서 0.1 μg 정제된 6PHU3 단백질 및 SN을 SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 1차 모노클로날 항His 및 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 2차 항마우스 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Ctrl은 대조군; mAB는 모노클로날 항체; SN은 상등액; WB는 웨스턴 블롯을 가리킨다.
도 38. 6RHU3 bi-scFv IVT-mRNA 또는 - 레플리콘 RNA의 주사는 마우스에 있어서 생체내 번역 및 검출가능한 bi-scFv 분자를 유도한다
10 μg 6RHU3 IVT-레플리콘 또는 EBK IVT-mRNA 존재 또는 부재 하에 10 μg 6RHU3 IVT-mRNA을 NSG 마우스에 근육내 주사하였다. 주사한지 7일 후 혈액으로부터 얻은 혈청을 시험관내 세포독성 분석하였다. CLDN6 및 루시페라제를 안정적으로 발현하는 PA-1/luc 표적 세포들을 인간 T 세포들과 함께 E:T 비율을 30:1로 하여 20 μl 샘플 혈청과 함께 48 h 동안 공인큐베이션시켰다. 표준 6PHU3 단백질 대조군, Lmin 및 Lmax은 20 μl NSG 목(mock) 혈청을 함유하였다. EBK는 백시니아 바이러스 단백질 칵테일 E3, B-18R, K3; IM은 근육내를 나타낸다.
도 39. 단백질의 C-말단부에 scFv 항CD3 결합 도메인을 함유하는 항CLDN18.2 bi-scFv 단백질들의 세포독성 결과.
CLDN18.2 및 CD3에 지향된 Bi-scFv 변이체들을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고 세포독성 분석에 있어서 이들의 효능 비교를 위해 단백질-L 수지로 정제하였다. CLDN18.2을 내재적으로 발현하는 NugC4 세포들로서 루시페라제를 안정적으로 발현하는 세포들을 표적 세포로 삼았다. 인간 T세포들 및 표적 세포들을 E:T 비율을 5:1로 하여 5000, 1000, 200 및 40 ng/ml의 각 bi-scFv 단백질과 함께 96-웰 포맷으로 인큐베이션시켰다. 각각의 테스트 샘플을 세배 도말하고, Lmin에 대한 대조군 샘플을 세배 도말하였다. 분석 전 공인큐베이션 기간은 24h 및 48h 이었다. 주어진 시점에서 루시페린 용액을 첨가한 후, Infinite M200 TECAN 판독기로 발광도를 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해를 각각의 농도에서 산출하여 기록하였다.
a. 항CD3의 가변 도메인은 VH - VL 순서이며 LL4 펩타이드 링커에 의해 분리되어 있다.
b. 항CD3의 가변 도메인은 VH - VL 순서이며 LL4 펩타이드 링커에 의해 분리되어 있다. scFv 항CD3은 VH 및 VL 도메인들 사이에 인터페이스 디설파이드 브릿지를 함유한다.
c. 항CD3의 가변 도메인은 VL - VH 순서이며 LL5 펩타이드 링커에 의해 분리되어 있다.
d. 항CD3의 가변 도메인은 VL - VH 순서이며 및 LL5 펩타이드 링커에 의해 분리되어 있다. scFv 항CD3은 VL 및 VH 도메인들 사이에 인터페이스 디설파이드 브릿지를 함유한다.
도 40. 항CLDN6 bi-scFv 단백질을 이용한 루시페라제 세포독성 분석에서 수득된 EC50 값들의 내부-분석 비교.
T 세포 증식에 있어서 루시페라제 세포독성 분석을 서로 다른 3명의 도너에 대해 수행하였다. 24h 및 48h 인큐베이션 후 6종의 테스트된 항CLDN6 bi-scFv 단백질에 대해 산출된 EC50 값을 각각의 독립적인 분석(A, B 및 C)에 대해 기록하였다. CLDN6을 내재적으로 발현하는 PA-1 세포들을 24h 및 48h 동안 증가하는 농도 (A 및 B의 경우 0.025-50000 ng/ml, C의 경우 0.0025-5000 ng/ml)의 항CLDN6 bi-scFv 단백질 및 인간 T 세포들과 함께 이펙터 대 표적 비율을 5:1로 하여 96-웰 포맷에서 삼중 인큐베이션하였다. 최소 용해 대조군 (Lmin)으로서 이펙터 및 표적 세포들을 bi-scFv 단백질 없이 도말하였다. 루시페린 첨가 바로 전에 bi-scFv의 부재 하에 이펙터 및 표적 세포들을 함유하는 대조군 웰에 Triton X-100을 첨가함으로써 자연발생적인 발광 카운트에 대한 최대 용해(Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액 첨가로부터 30 분 후, 표적 및 이펙터 세포 인큐베이션 24 h 후 및 48 h 후에 Infinite M200 Tecan 마이크로플레이트 판독기로 발광도를 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해를 다음 식에 따라 산출하였다: 　% 특이적 용해 = [1 - (발광도테스트 샘플 - Lmax) / (Lmin - Lmax)] x 100. EC50은 절반 최대 유효 농도를 나타내고; L은 용해; NA는 적용불가( not applicable)를 가리킨다.
발명의 상세한 설명
이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어들은 어디까지나 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구체예와 함께 리스트되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 실시예와 바람직한 구체예들은 다양하게 설명된 실시예와 바람직한 구체예들은 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들만으로 한정짓는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 구체예들과 여하한 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성 요소들을 조합하는 구체에들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 이 출원의 모든 설명된 구성요소들의 여하한 순열 및 조합들 역시 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
좋기로는, 본 명세서에 사용된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koebl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 설명된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 실시하는데 있어서는 달리 설명되지 않는 한, 이 기술분야의 문헌 (cf., 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook 외 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)에서 설명되는 화학, 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 상법이 이용될 것이다.
이하의 상세한 설명과 청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한 "포함하다(comprise)" 및 그의 변형어들 예컨대 "comprises" 및 "comprising"은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹을 포괄하되, 비록 몇몇 구체예에서는 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제될 수도 있지만, 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제되는 것은 아니다, 즉, 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹들을 포함한다. 본 발명을 설명함에 있어 문맥상 사용된 관사 "a" 및 "an" 및 "the" 그리고 이와 유사한 참조 용어들(특히 청구범위 문맥상)은 달리 언급되거나, 반대 의미를 갖는 것이 명백하지 않은 한, 단복수를 아우르는 것이다.
본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 인용된 것으로 간주된다. 본 발명에 설명된 모든 방법들은 달리 언급하거나 문맥상 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 실시될 수 있다. 본 명세서에 제공된 여하한 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예컨대 "와 같은")는 본 발명을 좀 더 잘 설명하기 위해 의도된 것으로, 본 발명의 범위를 달리 한정지으려는 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 청구되지 않은 구성요소를 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로 가리키는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 몇 가지 문헌들이 인용된다. 인용된 이들 각각의 상기 또는 하기 문헌들 (모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 모두 그 내용 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 이들 언급된 문헌들 중 어느 것도 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
클라우딘은 밀착연접부의 가장 중요한 구성원인 단백질 패밀리로서, 밀착연접부에서 이들은 상피의 세포들 간의 세포간 공간에서의 분자 흐름을 제어하는 세포주위 장벽을 확립한다. 클라우딘은 N-말단 및 C-말단 (두 가지 모두 세포질 내에 위치)과 함께 4회에 걸쳐 막을 관통하는 막통과 단백질이다. EC1 또는 ECL1이라 명명된 제1 세포외 루프는 평균 53개의 아미노산으로 구성되고, EC2 또는 ECL2라 명명된 제2 세포외 루프는 대략 24개의 아미노산으로 이루어진다. CLDN6 및 CLDN18.2과 같은 클라우딘 패밀리의 세포 표면 단백질은 다양한 기원의 종양에서 발현되는데, 이들의 선택적 발현(독성 관련 정상 조직에서는 발현되지 않음)과 세포질 막으로의 국소화로 인해, 이들은 항체-매개된 암 면역치료법과 관련하여 특히 적합한 표적 구조를 갖는다.
본 발명의 문맥 상, 바람직한 클라우딘은 CLDN6 및 CLDN18.2이다. CLDN6 및 CLDN18.2는 종양 조직에서 달리 발현되는 것으로 동정되었는데, CLDN18.2을 발현하는 유일한 정상 조직은 위장이고 CLDN6을 발현하는 유일한 정상 조직은 태반이다.
CLDN18.2는 위점막의 분화된 상피 세포들의 정상 조직에서 선택적으로 발현된다. CLDN18.2는 예컨대 췌장 암종, 식도 암종, 위 암종, 기관지 암종, 유방 암종 및 ENT 종양과 같은 다양한 기원의 암에서 발현된다. CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 예컨대 비소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 및 담낭의 암, 및 이들의 전이암, 특히 위암 전이암, 예컨대, 크루켄버그 종양복강 전이, 및 림프절 전이를 비롯한 원발성 종양의 예방 및/또는 치료에 있어서 가치있는 표적이다.
CLDN6은 예를 들어, 난소암, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 흑색종, 두경부암, 육종, 담관암, 신장세포암, 및 방광암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CLDN6은 난소암, 특히 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 특히 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 특히 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 특히 악성 다형 선종, 육종, 특히 활막 육종및 암육종, 담관암, 방광의 암, 특히 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 특히 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 특히 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 특히 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양 예컨대 기형암종 또는 배아암종, 특히 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태의 예방 및/또는 치료에 있어서 특히 바람직한 표적이다. 일 구체예에서, CLDN6 발현과 연관된 암 질환은 난소암, 폐암, 전이성 난소암 및 전이성 폐암이다. 좋기로는 난소암은 암종 또는 선암종이다. 좋기로는, 폐암은 암종 또는 선암종이고 좋기로는 세기관지암 예컨대 세기관지성 암종 또는 세기관지성 선암종이다.
본 발명에서 용어 "CLDN"은 클라우딘을 의미하며 CLDN18.2 및 CLDN6을 포함한다. 좋기로는 클라우딘은 인간 클라우딘이다.
용어 "CLDN18"은 클라우딘 18에 관한 것으로서 클라우딘 18 스플라이스 변이체 1 (클라우딘 18.1 (CLDN18.1)) 및 클라우딘 18 스플라이스 변이체 2 (클라우딘 18.2 (CLDN18.2))를 비롯한 임의의 변이체를 모두 포괄한다.
용어 "CLDN18.2"는 좋기로는 인간 CLDN18.2에 관한 것으로, 좋기로는, 서열목록의 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 좋기로는 이러한 서열로 구성된 단백질에 관한다. CLDN18.2의 제1 세포외 루프는 좋기로는 SEQ ID NO: 1에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 27 내지 81, 더욱 좋기로는 아미노산 29 내지 78을 포함하는 것이 바람직하다. CLDN18.2의 제2 세포외 루프는 SEQ ID NO: 1에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 140 내지 180을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제1 및 제2 세포외 루프들은 좋기로는 CLDN18.2의 세포외 부분을 형성하는 것이 바람직하다.
용어 “CLDN6”은 좋기로는 인간 CLDN6에 관한 것으로, 특히, 좋기로는 서열목록의 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는, 좋기로는 이러한 서열로 구성된 단백질에 관한다. CLDN6의 제1 세포외 루프는 좋기로는 SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 28 내지 80, 더욱 좋기로는 아미노산 28 내지 76을 포함하는 것이 바람직하다. CLDN6의 제2 세포외 루프는 좋기로는 SEQ ID NO: 2에 나타난 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 나타난 아미노산 서열의 아미노산 138 내지 160, 좋기로는 아미노산 141 내지 159, 더욱 좋기로는 아미노산 145 내지 157을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 제1 및 제2 세포외 루프는좋기로는 CLDN6의 세포외 부분을 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 용어 “변이체(variant)”는 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 컨포메이션(conformations), 이소형(isoforms), 대립형 변이체(allelic variants), 종 변이체(species variants) 및 종 동족체(species homologs), 특히 자연적으로 존재하는 것들을 칭한다. 대립형 변이체는 어떤 유전자의 정상적 서열에 있어서의 변경과 관련된 것으로, 그 유의성은 종종 불확실하다. 주어진 유전자에 대한 완전한 유전자 시퀀싱에 의해 종종 수많은 대립형 변이체들이 동정된다. 종 동족체는 주어진 핵산이나 아미노산 서열의 그것과 기원을 달리하는 다른 종의 핵산 또는 아미노산 서열이다. "변이체"라는 용어는 후번역적으로 변형된 변이체 및 컨포메이션 변이체들을 모두 포괄한다.
본 발명에 설명된 결합제의 제2 표적 분자는 CD3 (분화 3의 클러스터)이다. CD3 복합체는 다분자 T-세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로서 성숙한 인간 T-세포, 흉선세포 및 내추럴 킬러 세포들의 서브셋에서 발현되는 항원을 표시한다. T-세포-공수용체(T-cell co-receptor)는 4가지 서로 다른 사슬들로 이루어진 단백질 복합체이다. 포유동물에 있어서, 이 복합체는 CD3gamma 사슬, CD3delta 사슬, 및 2개의 CD3ε 사슬들을 함유한다. 이들 사슬들은 T-세포 수용체 (TCR)로서 알려져 있으며 ζ-사슬은 T 림프구에서 활성화 시그널을 생성하는 것으로 알려져 있다. TCR, ζ-사슬 및 CD3 분자들은 함께 TCR 복합체를 구성한다.
인간 CD3 엡실론은 GenBank 수탁번호 No. NM_000733로 표시되며 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 인간 CD3 γ는 GenBank 수탁번호 No. NM 000073으로 표시된다. 인간 CD3 델타는 GenBank 수탁번호 No. NM_000732로 표시된다. CD3은 TCR의 시그널 형질도입에 책임이 있다. Lin 및 Weiss의 문헌[Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001)]에 설명된 바와 같이, MHC-제시된 특이적 항원 에피토프의 결합에 의한 TCR 복합체의 활성화는, Src 패밀리 키나아제에 의한 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAMs)의 인산화를 야기하여, Ca2+ 방출을 비롯한 T 세포 활성화를 초래하는 추가적인 키나아제의 동원(recruitment)를 촉발한다. 예컨대 고정된 항CD3-항체들에 의한 T 세포들 상의 CD3의 클러스터링은 그의 클론에 전형적인 특이성과는 무관하지만, T 세포 수용체의 진입(engagement)과 유사한 T 세포 활성화를 유도한다.
본 발명에서, "CD3"은 인간 CD3을 포함하며 다분자형 T 세포 수용체 복합체의 일부로서 인간 T 세포 상에서 발현되는 항원을 표시한다.
CD3과 관련하여, 본 발명의 결합제는 유리하게도 CD3의 엡실론-사슬을 인식하며, CD3 엡실론의 첫번째 27 N-말단 아미노산 또는 이 27 아미노산 스트레치의 기능적 단편에 대응하는 에피토프를 인식한다.
본 발명에 따라, 용어 "클라우딘 양성 암" 또는 이와 유사한 용어들은 클라우딘을 발현하는 암세포, 좋기로는 상기 암세포 표면에서클라우딘을 발현하는 암세포를 포함하는 암을 의미한다.
"세포 표면"이라 함은 기술분야에서 흔히 갖는 그대로의 의미로 사용되며, 따라서 단백질 및 기타 분자들이 결합할 수 있도록 접근가능한 세포의 외부를 포함한다.
클라우딘은 만일 그것이 세포의 표면에 위치하면 상기 세포 표면 상에서 발현되며 그 세포에 부가된 클라우딘-특이적 항체에 의한 결합에 대해 접근을 허용한다.
본 발명에서 "세포외 부분(extracellular portion)"이라 함은 어떤 세포에서 세포외 공간을 마주하는 단백질과 같은 분자의 부분을 가리키는 것으로 좋기로는 상기 세포의 외부로부터 예컨대 상기 세포 외부에 위치하는 항체와 같은 항원-결합 분자가 접근가능한 부분을 의미한다. 좋기로는 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 그의 단편을 가리킨다.
본 발명에서 "부분/일부(part)" 또는 "단편(fragment)"이라는 용어는 호환적으로 사용되며 연속적인 요소를 가리킨다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 일부는 상기 구조의 연속적인 요소를 칭한다. 어떤 구조의 일부, 부분 또는 단편은 좋기로는 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 어떤 에피토프나 펩타이드의 일부, 부분 또는 단편은 이들이 유도된 바로 그 에피토프나 펩타이드와 면역학적으로 동등한 것이 바람직하다. 단백질 서열의 일부 또는 단편은 그 단백질 서열의 적어도 6, 특히 적어도 8, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 또는 적어도 100개의 연속적인 아미노산으로 된 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 위장 세포 또는 위장 조직에서의 발현 수준보다 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다. 좋기로는, 발현 수준은 위장 세포 또는 위장 조직에서의 발현 수준의 10% 미만, 좋기로는 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.05% 미만 또는 심지어 이보다 더 낮은 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 위장이 아닌 다른 비암(non-cancerous) 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 좋기로는 1.5배 이하로 초과할 경우 실제로 세포에서 발현되지 않으며, 바람직하게는, 상기 비암 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 것이 좋다. 좋기로는, CLDN18.2는 만일 발현 수준이 검출한계 미만이고/미만이거나 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 발현 수준이 너무 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다.
본 발명에 따라, CLDN18.2는 발현 수준이 위장이 아닌 비암 조직에서의 발현 수준을 좋기로는 2배 초과, 좋기로는 10배 초과, 100배 초과, 1000배 초과, 또는 10000배 초과할 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, CLDN18.2는 발현 수준이 검출한계를 상회하고/상회하거나 세포에 첨가된 CLDN18.2-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분할 정도로 발현 수준이 높을 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, 세포에서 발현된 CLDN18.2는 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, CLDN6은 만일 발현 수준이 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현 수준보다 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다. 좋기로는, 발현 수준은 태반 세포 또는 태반 조직에서의 발현 수준의 10% 미만, 좋기로는 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 또는 0.05% 미만 또는 심지어 이보다 더 낮은 것이 바람직하다. 좋기로는, CLDN6은 만일 발현 수준이 태반이 아닌 다른 비암(non-cancerous) 조직에서의 발현 수준을 2배 이하, 좋기로는 1.5배 이하로 초과할 경우 실제로 세포에서 발현되지 않으며, 바람직하게는, 상기 비암 조직에서의 발현 수준을 초과하지 않는 것이 좋다. 좋기로는, CLDN6은 만일 발현 수준이 검출한계 미만이고/미만이거나 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 발현 수준이 너무 낮을 경우 세포에서 실제로 발현되지 않는다.
본 발명에 따라, CLDN6은 발현 수준이 태반이 아닌 비암 조직에서의 발현 수준을 좋기로는 2배 초과, 좋기로는 10배 초과, 100배 초과, 1000배 초과, 또는 10000배 초과할 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, CLDN6은 발현 수준이 검출한계를 상회하고/상회하거나 세포에 첨가된 CLDN6-특이적 항체에 의한 결합을 허용하기에 충분할 정도로 발현 수준이 높을 경우 세포에서 발현된다. 좋기로는, 세포에서 발현된 CLDN6은 상기 세포의 표면에서 발현되거나 노출되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, "질병/질환(disease)"이라는 용어는 암, 특히 본 명세서에 설명된 유형의 암을 비롯하여 모든 병리적 상태를 일컫는다. 암 또는 암의 특정 형태에 대한 모든 칭호는 그의 암 전이도 포괄한다. 바람직한 구체예에서, 본 출원발명에 따라 치료될 질병은 CLDN18.2 및/또는 CLDN6와 같은 클라우딘을 발현하는 세포와 연관되어 있다.
"CLDN을 발현하는 세포와 연관된 질병" 또는 이와 비슷한 표현은 본 발명에 따라, CLDN이 병에 걸린 조직 또는 장기의 세포에서 발현됨을 의미한다. 일 구체예에서, 병에 걸린 조직이나 장기의 세포에서 CLDN의 발현은 건강한 조직 또는 장기에서의 상태에 비해 증가된다. 증가라 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 오직 병에 걸린 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서는 발현이 억제된다. 본 발명에 따라, CLDN을 발현하는 세포와 연관된 질환에는 암 질환이 포함된다. 또한, 본 발명에 따라, 암 질환은 좋기로는 암세포가 CLDN을 발현하는 질환이다.
본 발명에서, "암 질환" 또는 "암"은 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동이 비정상적으로 조절됨을 특징으로 하는 질환을 포괄한다. "암 세포"라 함은 급속하게 제어되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 그 새로운 성장을 개시시킨 자극이 멈춘 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 좋기로는, "암 질환"은 CLDN18.2를 발현하는 세포에 의해 특징지어지며 암 세포는 CLDN18.2를 발현한다. CLDN18.2를 발현하는 세포는 좋기로는 암 세포이며, 본 발명에서 설명된 암의 암 세포인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "암"이라는 용어는 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형암종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌의 암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이암을 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암이나 종양의 전이암을 들 수 있다. 본 발명에 따른 용어 암은 전이암 역시도 포괄한다.
본 발명에서, "암종(carcinoma)"이라 함은 상피 세포로부터 유도된 악성 종양을 의미한다. 이 그룹은 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암과 같은 흔한 형태의 암을 비롯한 가장 일반적인 암을 나타낸다.
"선암종(Adenocarcinoma)"은 샘조직에 기원을 둔 암이다. 이 조직은 또한 상피 조직이라 알려진 보다 큰 조직 카테고리의 일부이기도 하다. 상피 조직에는 피부, 샘 및 신체의 캐비티와 장기들을 라이닝하는 다양한 기타 조직이 포함된다. 상피는 발생학적으로 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래한다. 해당 세포가 분비 특성을 갖는 한, 선암종으로 분류되기 위해, 이들이 반드시 샘의 일부일 필요는 없다. 암종의 이러한 형태는 인간을 비롯한 어느 정도 고등 포유동물에서 일어날 수 있다. 잘 분화된 선암종은 이들이 유래한 샘 조직과 유사한 경향이 있는 반면, 덜 분화된 선암종은 그렇지 않을 수 있다. 생검에 의해 세포를 염색함으로써, 병리학자는 종양이 선암종인지 또는 다른 유형의 암인지 결정할 수 있다. 선암종은 샘들이 체내 도처에 존재하는 특성 상 신체의 많은 조직에서 일어날 수 있다. 각각의 샘이 동일한 물질을 분비하는 것이 아닐 수 있으나, 세포에 대해 외분비 기능이 있는 한, 샘이라 간주되며 그의 악성 형태는 따라서 선암종이라 명명된다. 악성 선암종은 다른 조직을 침습하며 시간이 충분할 경우 종종 전이되기도 한다. 난소 선암종은 난소 암종의 가장 흔한 유형이다. 이것은 장액성(serous) 및 점액성(mucinous) 선암종, 투명한 세포 선암종 및 자궁내막모양 선암종을 포함한다.
"전이(metastasis)"라 함은 암 세포가 그의 원래 자리로부터 체내의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로서 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 매트릭스의 침습, 상피기저막의 침입에 의한 체강 및 혈관으로의 유입 및 이어서 혈액에 의한 운반 후 표적 장기내로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도 종양 세포 또는 성분들이 남아있을 수 있거나 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 지역 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 "원격전이(distant metastasis)"에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 림프절 전이에 관한 것이다. 본 발명의 치료법으로 치료가능한 전이의 한 가지 특별한 형태는 원발 부위로서 위암으로부터 기원하는 전이이다. 바람직한 구체예에서 이러한 위암 전이는 크루켄버그(Krukenberg) 종양, 복강 전이 및/또는 림프절 전이이다.
크루켄버그 종양은 모든 난소 종양의 1% 내지 2%를 차지하는, 난소의 흔치 않은 전이 종양이다. 크루켄버그 종양의 예후는 여전히 나쁘며 크루켄버그 종양의 확립된 치료법도 없는 실정이다. 크루켄버그 종양은 난소의 전이성 반지세포 선암종이다. 위장은 대부분의 크루켄버그 종양 케이스의 원발 부위이다(70%). 결장, 충수 및 유방의 암종(주로 침윤성 소엽 암종)이 두 번째로 흔한 원발 부위이다. 담낭, 담도관, 췌장, 소장, 바터 팽대부, 자궁경부 및 방광/요막관의 암종으로부터 기원하는 흔치 않은 경우의 크루켄버그 종양 역시 보고된 바 있다.
"치료하다(treat)"라 함은 대상자에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 대상자의 질환 진행을 멈추거나 둔화시키는 것; 대상자에서 새로운 질병의 발달을 억제하거나 둔화시키는 것; 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸렸었던 대상자에서 증상 및/또는 재발의 빈도나 위중도를 감소시키는 것; 및/또는 대상자의 수명을 연장, 즉 증가시키는 것을 비롯하여, 질병을 예방 또는 제거하기 위해, 대상자에게 화합물이나 조성물 또는 화합물이나 조성물의 조합을 투여하는 것을 의미한다.
특히, "질병의 치료"라는 용어에는, 질병이나 그의 증상을 치유, 기간 단축, 완화, 예방, 둔화시키거나 진행이나 악화를 억제하거나 또는 개시를 예방 또는 둔화시키는 것이 포함된다.
본 발명의 문맥 상, 보호하다", "예방하다", "예방적", "예방성", 또는 "보호적" 등의 표현은 대상자에 있어서 어떤 질병의 발병 및/또는 전파의 예방 또는 치료 또는 양자 모두에 관한 표현으로서, 특히, 대상자에 있어서 질병의 진행 기회를 최소화하거나 질병의 진행을 지연시키는 것과 관련된 표현이다. 예를 들어, 암에 걸릴 위험이 있는 개체는 암 예방 요법의 후보가 된다.
"위험에 처하다"라는 표현은 일반 집단에 비해, 어떤 대상자에서 질병, 특히 암이 일어날 정상적인 기회가 더 높은 것으로 동정된 것을 의미한다. 또한, 질병, 특히 암에 걸렸었거나, 현재 걸린 대상자는 질환이 계속적으로 일어날 수 있으므로, 질환에 걸릴 위험성이 큰 대상자이다. 현재 암에 걸려있거나 암에 걸렸던 적이 있는 대상자 역시 암 잔이 위험성이 증가된 대상자이다.
본 발명에서 "환자"라는 용어는 치료의 대상자, 특히 질병에 걸린 대상자를 의미하며 여기에는 인간, 비인간 영장류 또는 기타 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이와 같은 포유동물 또는 마우스나 래트와 같은 설치류가 포함된다. 특히 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
"표적 세포"라 함은 암 세포와 같이 바람직하지 못한 세포를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 CLDN을 발현하는 것이다.
용어 "항원"은 면역 반응이 지향되거나 지향될 에피토프를 포함하는 단백질 또는 펩타이드와 같은 물질에 관한다. 바람직한 구체예에서, 항원은 예컨대 CLDN18.2와 같은 종양-관련 항원, 즉 세포질, 세포 표면 및 세포핵으로부터 유래할 수 있는 암 세포의 구성원이며, 특히, 암 세포 상에서 표면 항원으로서 또는 세포내에서 대량 생산되는 항원인 것들이 바람직하다.
본 발명의 문맥 상, "종양-관련 항원"은 좋기로는 정상 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 장기에서 특이적으로 또는 특이적 발달 단계에서 발현되고 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 또는 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 문맥 상, 종양-관련 항원은 암 세포의 세포 표면과 연관이 있고, 정상 조직에서는 발현되지 않거나 발현되더라도 드물게만 발현되는 것이 바람직하다.
"에피토프"라는 용어는 분자 내의 항원 결정인자를 가리키는데, 즉, 면역계에 의해 인식되는, 예컨대, 항체에 의해 인식되는 분자의 일부를 가리킨다. 예컨대, 에피토프는 항원 상의 불연속적인, 3차원적 부분이며, 면역계에 의해 인식된다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성적인 표면 그루핑을 구성하며, 대체로 특이적인 3차원 구조 특징과 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태적(Conformational) 에피토프와 비입체형태적(non-conformational) 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서는 전자에 대한 결합이 소실되는 반면 후자에대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 단백질의 에피토프는 좋기로는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하며 좋기로는 길이가 예컨대 5 내지 100, 좋기로는 5 내지 50, 더욱 좋기로는 8 내지 30, 가장 좋기로는 10 내지 25 아미노산인 것이 바람직하고, 예컨대, 에피토프의 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산인 것이 좋다.
"항체"라 함은 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 칭하는 것이다. "항체"라는 용어에는 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및 키메라 항체가 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부(VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부(VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 이루어진다. VH 및 VL 부분은 상보성 결정부(CDR)라 명명되는 하이퍼변이성 부분들로 더 세분화될 수 있고, 프레임워크부(FR)로 명명되는, 보다 보존적인 부분들이 사이사이에 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성되며, 이들은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 다음 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄와 경쇄의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포들(예컨대 이펙터 세포) 및 클래시컬 보체계의 제1 성분(Clq)을 비롯하여, 숙주의 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에서 "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 말한다. 모노클로날 항체는 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다. 일 구체예에서, 모노클로날 항체들은 불멸화된 세포에 융합되는 비인간 동물, 예컨대, 마우스로부터 얻어지는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에서 "재조합 항체"라는 용어는 (a) 면역글로불린 유전자들 또는 그들로부터 제조되는 하이브리도마에 관하여 유전자 이식 또는 트랜스염색체적인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체들 , (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스펙토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 다른 DNA 서열들에 면역글로불린 유전자 서열들의 스플라이싱과 관련된 다른 수단들에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나 제조된 항체들을 비롯한, 재조합적 수단에 의해 분리되거나, 생성되거나, 발현되거나, 제조된 모든 항체들을 포함한다.
본 발명에서 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부와 불변부를 갖는 항체를 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명에 설명된 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다(예컨대, 무작위적인 또는 위치-특이적 돌연변이 유발에 의해 시험관내 유도된 돌연변이 또는 생체내 체세포 돌연변이).
"인간화 항체"라 함은 분자의 항원 결합부는 실질적으로 비인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래한 반면, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초하는 것인 분자를 가리킨다. 항원-결합 부분는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함할 수도 있고 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 부분에 그래프트된 상보성 결정부(CDR) 만을 포함할 수도 있다. 항원-결합 부분는 야생형이거나 또는 1 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예컨대, 인간 면역글로불린에 보다 더 밀접히 닮도록 변형될 수 있다. 인간화 항체들 중 몇몇 유형은 모든 CDR 서열을 보존한다 (예컨대 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDRx를 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 유형들은 하나 이상의 CDR이 오리지널 항체와 다를 수 있다.
"키메라 항체"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 일 부분이 특별한 클래스에 속하거나 특별한 종들로부터 유래된 항체들에서 상응하는 서열들과 상동성이고, 반면 사슬의 남아있는 세그먼트(segment)는 상응하는 서열들에 달리 상동성이다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄들의 가변부는 포유류의 한 종들로부터 유래된 항체들의 가변부들과 닮은 반면, 불변 부분들은 달리 유래된 항체들의 서열들과 상동성이다. 그러한 키메라 형태들의 한가지 분명한 잇점은 가변부가 예컨대, 인간 세포 제조로부터 유래된 불변부들과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한B-세포들 또는 하이브리도마를 이용하여 현재 알려진 소스로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변부는 각각의 제조물의 잇점을 가지고, 특이성은 소스에 영향을 받지 않는 반면, 인간인 불변부는 항체들이 비인간 소스로부터의 불변부인 것 보다 항체들이 주입될 때 인간 대상으로부터의 면역 반응을 잘 이끌어내지 않는다. 그러나 상기 정의는 이러한 특별한 예시로 국한되지 않는다.
항체는 비제한적인 예로서 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 인간을 비롯한 여러 가지 종들로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 설명된 항체들에는 IgA 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, 및 IgD 항체가 포함된다. 다양한 구체예에서, 항체는 IgG1 항체, 더욱 특히는 IgG1, 카파 또는 IgG1, λ 이소형 (즉 IgG1, κ,λ), IgG2a 항체 (예컨대 IgG2a, κ,λ), IgG2b 항체 (예컨대 IgG2b, κ,λ), IgG3 항체 (예컨대 IgG3, κ,λ) 또는 IgG4 항체 (예컨대 IgG4, κ,λ)이다.
본 발명에서, "이종 항체(heterologous antibody)"는 그러한 항체를 생산하는 형질전환 유기체와 관련하여 규정된다. 이 용어는 형질전환 유기체가 아닌 유기체에서 발견되는 아미노산 서열 또는 그것에 상응하는 인코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 가리킨다.
본 발명에서, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체들 기원의 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체를 말한다. 예컨대, 쥐의 경쇄와 연관된 인간 중쇄를 가지는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.
본 발명에 기재된 항체들은 좋기로는 분리된 것이다. 본 발명에서 사용된 "분리된 항체"라는 용어는 상이한 항원성 특이성을 가지는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 가리키는 것으로 의도된 것이다 (예컨대, CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 항체에는 실질적으로 CLDN18.2가 아닌 항원들과 특이적으로 결합하는 항체들이 없다). 인간 CLDN18.2의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 그러나, 다른 관련된 항원들, 예컨대, 다른 종들로부터 유래된 다른 관련된 항원들과 교차반응성을 가질 수 있다 (예컨대, CLDN18.2 종 동족체). 또한, 분리된 항체에는 실질적으로 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 없을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, "분리된" 모노클로날 항체들의 조합은 상이한 특이성들을 가지며 잘 규정된 조성물 또는 혼합물로서 조합된 항체들에 관한 것이다.
항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 (또는 간단히, "결합 부분") 또는 항체의 "항원-결합 단편(또는 간단히 "결합 단편")은 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있다는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함된 결합 단편들의 예들은 (i) Fab 단편들, VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성된 1가의 단편들; (ii) F(ab')2 단편들, 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편들; (iii) VH 및 CH 도메인들로 구성된 Fd 단편들; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편들, (v) dAb 단편들 (Ward 외, (1989) Nature 341: 544-546), VH 도메인으로 구성됨; (vi) 분리된 상보성 결정 영역들 (CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 두개 이상의 CDR들의 조합들을 포함한다. 또한, VL 및 VH의 2개의 도메인들이 분리된 유전자들에 의해 코딩됨에도 불구하고, VL과 VH영역들이 1가의 분자들을 형성하기 위해 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로써 그것들이 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법들을 이용하여 결합될 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려진; Bird 외 (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston 외 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 참고). 그러한 단일 사슬 항체들은 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에서 포함될 수 있는 것으로 생각된다. 추가적인 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, (iii) CH2 불변부에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들은 추가적으로 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시된다. 이러한 항체 단편들은 기술분야에 당업자에게 알려져있는 통상의 기술을 이용하여 얻고, 그 단편들은 온존한(intact) 항체들처럼 동일한 방식으로 사용을 위해 스크리닝된다.
용어 "결합 도메인(binding domain)"은 본 발명에 있어서 예컨대, 주어진 표적 구조/항원/에피토프에 결합하거나 이와 상호반응하는 항체의 구조를 특징짓는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 도메인은 "항원-상호반응-자리"를 가리킨다.
본 발명의 목적 상 본 명세서에 설명된 바와 같은 항체 단편 등의 모든 항체 및 항체의 유도체는 "항체"라는 용어에 의하여 포괄된다. 용어 "항체 유도체"란 항체의 임의의 변형된 형태, 예컨대 항체와 다른 약제 또는 항체, 또는 항체 단편과의 컨쥬게이트를 의미한다. 또한, 본 발명에 설명된 바와 같은 항체 및 항체의 유도체는 항체 단편과 같은 본 발명의 결합제를 생산하는데 유용하다.
자연발생적인 항체는 일반적으로 단일 특이적이므로, 단일 항원에 결합한다. 본 발명은 세포독성 세포(CD3 수용체 진입에 의해) 및 암 세포(CLDN 진입에 의해)에 결합하는 결합제를 제공한다. 본 발명의 결합제는 적어도 이중특이적이며 또는 삼중특이적, 사중특이적 등과 같이 다중특이적이다.
본 발명에 따라, 이중특이 분자, 특히 이중특이 단백질, 예컨대 이중특이 항체는 2 가지 서로 다른 결합 특이성을 가짐으로 해서 CLDN 및 CD3과 같이 2 가지 다른 종류의 항원에 결합할 수 있는 분자이다. 특히, 본 발명에서 사용된 "이중특이 항체(bispecific antibody)"라는 용어는 2개의 항원-결합부, 즉 제1 항원 또는 에피토프에 친화성을 갖는 제1 결합부와 제1 항원 또는 에피토프와는 다른 제2 항원 또는 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합부를 포함하는 항체를 가리킨다. 특히, 이중특이 항체는 2개의 서로 다른 항체들의 단편들로 구성되며 (상기 2개의 서로 다른 항체들의 단편들이 2개의 결합 도메인들을 형성함) 그 결과 2 가지 서로 다른 유형의 항원에 결합한다. 본 발명에 따른 이중특이 항체는 면역 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, 특히 T 세포 예컨대 세포독성 세포 (CD3에 결합함으로써) 및 파괴하고자 하는 암세포와 같은 표적 세포(종양-관련 항원 CLDN에 결합함으로써)에 동시에 결합하도록 처리된다.
"이중특이 항체들"이라는 용어는 이중체(diabodies)들을 또한 포함한다. 이중체들은 2가의 이중특이 항체들로서 그의 VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 사슬에 발현되지만, 같은 사슬 상에 두 개의 도메인들 사이에 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로 해서 이들 도메인들이 다른 사슬의 상보적 도메인들과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합부를 생성할 수 있도록 하는 2가의 이중특이 항체들이다(예를 들어, Holliger, P., 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., 외 (1994) Structure 2: 1121-1123 참고).
"다중특이 결합제(Multispecific binding agents)"는 2개 보다 많은 상이한 결합 특이성을 갖는 분자들이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 것들은 이중특이 항체 단편들을 포함하는 이중특이 항체들, 특히 이중특이 단일 사슬 항체 단편을 포함하는 특히 이중특이 단일 사슬 항체들이다. 용어 "이중특이 단일 사슬 항체"는 2개의 결합 도메인들을 포함하는 단일한 폴리펩타이드 사슬을 표시한다. 특히, 용어 "이중특이 단일 사슬 항체" 또는 "단일 사슬 이중특이 항체" 또는 본 발명에서 관련된 용어들은 좋기로는 완전한 면역글로불린에 존재하는 불변부 및/또는 Fc부(들)이 전혀 없는 단일 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 2개의 항체 가변부를 연결함으로써 결과되는 항체 구조물을 의미한다.
예를 들어, 이중특이 단일 사슬 항체는 예를 들어, 각각이 별개의 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 짧은 폴리펩타이드 스페이서를 통해 서로 연결된 2개의 VH 영역을 갖는 구조물로서, 상기 2개의 항체 가변부가 그들의 개재 스페이서와 함께 하나의 인접한 폴리펩타이드 사슬로서 존재하는 구조물일 수 있다. 이중특이 단일 사슬 항체의 또 다른 예는 3개의 항체 가변부를 갖는 단일한 폴리펩타이드 사슬일 수 있다. 여기서, 2개의 항체 가변부, 예컨대 하나의 VH 및 하나의 VL이 하나의 scFv를 구성할 수 있는데, 여기서 2개의 항체 가변부는 합성 폴리펩타이드 링커를 통해 서로 연결되어 있되 상기 링커는 종종 단백질분해에 대해 최대한도로 내성을 갖도록 유지되면서 최소한도로 면역원성을 나타내도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이 scFv는 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 추가적인 항체 가변부, 예컨대 scFv에 의해 결합된 항원과는 다른 항원에 결합할 수 있는 VH 영역에 결합된다.이중특이 단일 사슬 항체의 또 다른 예는 4개의 항체 가변부를 갖는 하나의 폴리펩타이드 사슬일 수 있다. 여기서, 첫 번째의 2개의 항체 가변부, 예컨대 VH 영역과 VL 영역은 하나의 항원에 결합할 수 있는 하나의 scFv를 형성할 수 있는 한편, 두 번째 VH 영역과 VL 영역은 다른 항원과 결합할 수 있는 두 번째 scFv를 형성할 수 있다. 단일한 인접 폴리펩타이드 사슬 내에서, 한 가지 특이성의 개별적인 항체 가변부는 합성 폴리펩타이드 링커에 의해 유리하게 분리될 수 있는 반면, 각각의 scFvs는 전술한 바와 같이 짧은 폴리펩타이드 스페이서에 의해 유리하게 분리될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체의 제1 결합 도메인은 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체 제1 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인들, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체의 제2 결합 도메인은 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체의 제2 결합 도메인은 2개의 항체 가변 도메인, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH를 포함하는 것이 바람직하다. 그의 최소 형태에서, 본 발명에 따른 이중특이 항체 내의 항체 가변부의 총 갯수는 따라서 단지 2개이다. 예를 들어, 이러한 항체는 2개의 VH 또는 2개의 VHH 도메인들을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 각각은 하나의 항체 가변 도메인, 좋기로는 VHH 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에 따라, 이중특이 항체의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 각각 2개의 항체 가변 도메인, 좋기로는 scFv, 즉 VH-VL 또는 VL-VH을 포함하는 것이 바람직하다. 이 구체예에서, 본 발명의 결합제는 좋기로는 (i) CLDN 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH), (ii) CLDN 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL), (iii) CD3 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 (iv) CD3 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것이 바람직하다.
이중특이 전장 항체(Bispecific full-length) 항체들은 2개의 모노클로날 항체들을 공유적으로 링크시키거나 또는 통상적인 하이브리드-하이브리도마 기술에 의해 수득될 수 있다. 2개의 모노클로날 항체들의 공유 링킹은 Anderson, Blood 80 (1992), 2826-34에 설명되어 있다. 본 발명의 문맥 상, 항체들 중 하나는 CLDN에 특이적이고 다른 하나는 CD3에 특이적이다.
일 구체예에서, 이중특이 결합제는 서로 다른 특이성을 갖는 2개의 연속적인 N-말단 가변 도메인을 함유하는 중쇄 및 서로 다른 특이성을 갖는 2개의 연속적인 가변 도메인을 갖는 경쇄의 포맷을 갖는데 (Wu 외, Nat. Biotechnology, 2007, 25(11)), 여기서 하나의 특이성은 CD3이고 다른 특이성은 CLDN에 대한 것이다.
바람직한 일 구체예에서, 이중특이적인 본 발명의 결합제는 항체 단편의 포맷을 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이 분자는 2개의 Fab 영역을 갖는데, 이 중 하나는 CLDN에 지향된 것이고 다른 하나는 CD3에 지향된 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 분자는 항원 결합 단편 (Fab)2 복합체이다. Fab2 복합체는 2개의 Fab 단편들로 이루어져 있는데, 하나의 Fab 단편은 CD3 항원에 특이적인 Fv 도메인, 즉 VH 및 VL 도메인들을 포함하고, 또 다른 Fab 단편은 CLDN에 특이적인 Fv 도메인을 포함한다. 각각의 Fab 단편들은 2개의 단일 사슬인 VL-CL 모듈과 VH-CH 모듈로 이루어질 수 있다. 별법으로, 각각의 개별적인 Fab 단편들은 단일 사슬, 좋기로는, VL-CL-CH-VH으로 배열되는 것이 바람직하며, 개별적인 가변 및 불변 도메인들은 펩타이드 링커로 연결될 수 있다. 일반적으로, 개별적인 단일 사슬들과 Fab 단편들은 디설파이드 결합, 부착(adhesive) 도메인들, 화학적 링크 및/또는 펩타이드 링커를 경유하여 연결될 수 있다. 이중특이 분자는 또한 세 개 이상의 Fab 단편들을 포함할 수 있는데, 특히, 이 분자는 a Fab3, Fab4, 또는 2, 3, 4가지 이상의 상이한 항원들에 대해 특이성을 갖는 다중 Fab 복합체일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 결합제는 다양한 종류의 이가 및 삼가 단일-사슬 가변 단편들 (scFvs), 2개 항체들의 가변 도메인들을 모방하는 융합 단백질들을 포함한다. 단일-사슬 가변 단편 (scFv)은 10 내지 약 25개의 아미노산들로 된 숏 링커 펩타이드에 의해 연결된, 면역글로불린들의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변부의 융합 단백질이다. 링커에 대체로 유연성을 위한 글리신, 가용성을 위한 세린 또는 쓰레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단과 VL의 C-말단 또는 그 반대로 연결될 수 있다. 2개의 scFvs를 연결함으로써 2가의 단일-사슬 가변 단편들 (di-scFvs, bi-scFvs)이 엔지니어링될 수 있다. 이것은 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드 사슬을 생성하여 탄뎀 scFvs를 생성함으로써 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 세 개 이상의 scFvs 결합 도메인들을 포함하는 다중특이 분자도 포함한다. 이에 의해 분자들이 다중 항원 특이성을 갖는 것이 가능하고 삼중특이, 사중특이 또는 다중특이 분자일 수 있으며 또는 분자가 동일한 항원에 대하여 특이성을 갖는 두 개 이상의 scFv 결합 도메인을 포함하는 이중특이 분자가 될 수 있다. 특히, 본 발명의 분자는 다중특이 단일 사슬 Fv일 수 있다.
또 다른 가능성은 함께 폴딩되기에는 너무 짧은(약 5개의 아미노산) 링커 펩타이드들을 갖는 scFvs를 만들어, scFvs로 하여금 이량화하게 만드는 것이다. 이 종류는 이중체(diabodies)라고 알려져 있다. 링커 길이가 더 짧으면 (1개 또는 2개의 아미노산) 소위 삼중체(triabodies 또는 tribodies)인 삼량체가 형성된다. 사중체역시도 제조된 바 있다. 이들은 표적에 대한 친화도가 이중체보다 더 높다.
이중특이 항체 단편의 특히 바람직한 예는 작은 2가의 이중특이 항체 단편인 이중체이다(Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). 이중체는 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인들 간에 쌍을 이루기에는 너무 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결된, 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL) 상의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함한다. 이것은 다른 사슬의 상보적 도메인들과의 페어링을 강제하여 2개의 기능성 항원 결합부를 갖는 이량체 분자의 어셈블리를 촉진한다. 본 발명의 이중특이 이중체를 구축하기 위해, 항CD3 항체와 항CLDN 항체의 V-도메인들을 융합하여 2개의 사슬, 즉 VH(CD3)-VL(CLDN), VH(CLDN)-VL(CD3)을 생성할 수 있다. 각 사슬은 그 자체로는 개개의 항원에 결합할 수 없지만 다른 사슬과 페어링시 항CD3 항체 및 항CLDN 항체의 기능적 항원 결합부를 재생산한다. 이를 위해, 동일 사슬 상에서 2개의 도메인들 간의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 펩타이드 링커가 사용된다. 분자내 다이머화하기에는 너무 짧은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 간의 링커를 갖는 2개의 scFv 분자들이 공발현되어, 반대 말단에서 2개의 결합부를 갖는 이중-특이 분자가 형성되도록 자가 조립된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 다중특이 분자들은 면역글로불린의 가변 도메인(VH, VL) 및 불변 도메인들 (C)을 포함한다. 일 구체예에서 이중특이 분자는 미니바디, 좋기로는 각 사슬의 불변 도메인(C)를 경유하여 상호 연결되어 있는 2개의 단일 VH-VL-C 사슬을 포함하는 미니바디인 것이 바람직하다. 이 측면에 따라, 대응하는 중쇄 가변부 (VH), 대응하는 경쇄 가변부 (VL) 및 불변 도메인들 (C)이 N-말단으로부터 C-말단으로, VH(CLDN)-VL(CLDN)-(C) 및 VH(CD3)-VL(CD3)-C의 순서로 배열되는데, 여기서 C는 CH3 도메인인 것이 바람직하다. 불변 도메인들의 페어링에 의해 미니바디가 형성된다.
특히 바람직한 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 이중특이 결합제는 이중특이 단일 사슬 항체 구조물 포맷을 가질 수 있는데, 여기서 상기 구조물은 도메인들 중 하나는 CLDN에 결합하고 두 번째 도메인은 CD3에 결합하는 것인 적어도 2개의 결합 도메인들을 포함하거나 2개의 결합 도메인들로 구성된다. "이중특이 T 세포 인게이져(bispecific T cell engagers)" (BiTEs; 용어 BiTE는 그의 한쪽 암(arm)이 CD3에 특이적인 이중-특이 분자만을 가리킨다)라고도 칭해지는 이러한 분자들은 링커 펩타이드를 통해 연결되니 2개의 scFv 분자들로 이루어진다.
본 발명에서, "이중특이 단일 사슬 항체"는 2개의 결합 도메인들을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 나타낸다. 각각의 결합 도메인은 항체 중쇄로부터의 하나의 가변부("VH region")를 포함하는데, 여기서 제1 결합 도메인의 VH 영역은 CLDN에 특이적으로 결합하고 제2 결합 도메인의 VH 영역은 CD3에 특이적으로 결합하는 것이다. 이들 2개의 결합 도메인들은 임의로 짧은 폴리펩타이드 스페이서에 의해 상호 연결된다. 폴리펩타이드 스페이서의 비제한적인 예는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) 및 이들의 반복물(repeats)이다. 각각의 결합 도메인은 항체 경쇄 ("VL 영역")으로부터 하나의 가변부를 부가적으로 포함할 수 있고, 제1 및 제2 결합 도메인들 각각의 사이의 VH 영역과 VL 영역은 제1 결합 도메인의 VH 영역과 VL 영역 및 제2 결합 도메인의 VH 영역과 VL 영역이 서로 쌍을 이루는데 충분히 긴 폴리펩타이드 링커를 통해 상호 연결되어 있는 것이다.
이 측면에 따라, 대응하는 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)가 N-말단으로부터 C-말단으로, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN) 또는 VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN)의 순서로 배열된다. 그러나, 본 발명의 이중특이 단일 사슬 항체들이 다른 도메인 배열, 예컨대 VL(CLDN)-VH(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VL(CLDN)-VH(CLDN)-VL(CD3)-VH(CD3), VH(CLDN)-VL(CLDN)-VL(CD3)-VH(CD3), VL(CD3)-VH(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN), VL(CD3)-VH(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN)의 배열을 가질 수도 있다.
롱 링커는 일반적으로 대응하는 중쇄 가변부 (VH)와 대응하는 경쇄 가변부 (VL)를 연결하여 scFv 결합 도메인을 생성하는 반면 숏 링커는 일반적으로 2개의 scFv 결합 도메인들을 연결한다. 링커는 일반적으로 유연성과 프로테아제 내성을 제공하도록 설계되며 좋기로는, 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산 잔기들을 포함하는 것이 바람직하다. 숏 펩타이드 링커는 12개 이하 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 아미노산, 좋기로는 5 또는 6개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 숏 펩타이드 링커들은 좋기로는 아미노산 서열 SGGGGS 또는 GGGGS를 포함하는 것이 바람직하다. 롱 펩타이드 링커들은 12개 이상, 예컨대 15 내지 25 또는 15 내지 20 또는 15 내지 18개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 롱 펩타이드 링커들은 좋기로는 아미노산 서열 (GGGGS)3 또는 VE(GGSGGS)2GGVD를 포함하는 것이 바람직하다. 추가의 롱 펩타이드 링커들은 아미노산 서열 (GGGGS)4, (GGGGS)5 또는 GGGGS(GGS)3GGGS을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 결합제는 또한 N-말단 분비 시그널과 같이 분자의 분비를 용이하게 해주는 아미노산 서열 및/또는 분자의 결합, 정제 또는 검출을 용이하게 해주는 하나 이상의 에피토프 태그들을 포함할 수도 있다.
좋기로는, 분비 시그널은 분비 경로를 통한 충분한 통과(passage) 및/또는 세포외 환경으로의 결합제의 분비를 가능케 하는 시그널 서열(예컨대 SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55로부터 선택된 것)인 것이 바람직하다. 좋기로는 분비 시그널 서열은 절단가능하고 성숙한 결합제로부터 제거되는 것이 바람직하다. 분비 시그널 서열은 좋기로는 결합제가 생산된 세포 또는 유기체와 연관지어 선택되는 것이 바람직하다.
에피토프 태그의 아미노산 서열은 결합제의 아미노산 서열의 어느 위치로든 도입될 수 있으며 인코딩된 단백질 구조 내에서 루프 형상을 할 수 있고 또는 이것은 결합제에 N-말단적으로 또는 C-말단적으로 융합될 수도 있다. 좋기로는 에피토프 태그가 결합제에 C-말단적으로 융합되는 것이 바람직하다. 에피토프 태그는 결합제로부터의 태그 제거를 허용하는 절단 자리를 함유할 수도 있다. 상기 에피토프 태그는 천연 및/또는 변성 조건 하에서 기능성인 여하한 종류의 에피토프 태그, 좋기로는 히스티딘 태그, 가장 좋기로는 6개의 히스티딘을 포함하는 태그일 수 있다.
본 발명의 이중특이 결합제는 상기 제1 및 제2 결합 도메인에 더해, 예컨대 종양 세포들에 대한 선택성을 증강시키는 기능을 하는 추가적인 결합 도메인을 함유할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, 생성된 결합제는 좋기로는 본 발명에 설명된 면역 이펙터 기능을 이끌어낼 수 있는 것이 바람직하다. 좋기로는 상기 면역 이펙터 기능은 그의 표면에서 종양-관련 항원 CLDN을 지니는 세포에 지향되는 것이 바람직하다.
본 발명의 문맥 상 용어 "면역 이펙터 기능"은 예컨대, 종양의 전파 및 전이 억제를 비롯한 종양 진행의 억제 및/또는 종양 성장의 억제를 야기하는 면역계의 성분들에 의해 매개되는 임의 기능을 포함한다. 좋기로는, 면역 이펙터 기능은 종양 세포들의 사멸을 야기한다. 이러한 기능은 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포-매개된 포식작용(ADCP), 종양-관련 항원을 지니는 세포들에 있어서의 세포자멸사 유도, 종양-관련 항원을 지니는 세포들의 세포용해, 및/또는 종양-관련 항원을 지니는 세포들의 증식 억제를 포함한다. 결합제는 또한 단지 암 세포 표면 상의 종양-관련 항원에 대해 결합함으로써 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 항체들은 단지 암 세포 표면 상의 종양-관련 항원에 대해 결합함으로써 종양-관련 항원의 기능을 차단하거나 세포자멸사를 유도할 수 있다.
본 명세서에 설명된 결합제들은 예컨대 세포독소, 약물 (면역억제제) 또는 방사능동위원소와 같은 치료 모이어티 또는 치료제에 컨쥬게이트될 수도 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 해롭거나 특히 세포를 살해시키는 모든 물질을 포함한다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미디신 D, 이티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디히드록테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 그리고 퓨로마이신과 이것들의 유사체 또는 동족체 물질을 포함한다. 항체 컨쥬게이트를 형성하기 위한 적절한 치료적 물질은, 이것에 제한되는 것은 아니지만, 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트(methodtrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬레이팅 물질(예컨대, 메크로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜파란, 카르무스틴 (BSNU), 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 플라티넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신)) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC), 및 항-미토틱 물질 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 일 선호된 구체예에서, 치료제는 세포 독성 물질나 방사성 독성 물질이다. 다른 구체예예서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 GM-CSF이다. 선호된 구체예에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 황산염, 카르무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드 또는 리신 A이다.
결합제는 또한 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111과 같은 방사성 동위원소에 결합해 세포 독성 방사성 의약품을 생산할 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 컨쥬게이트시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌들(Arnon 외, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld 외(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 외, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 외 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological 및 Clinical Applications, Pinchera외 (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, 및 Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection 및 Therapy, Baldwin 외 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe 외, "The Preparation 및 Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982))을 참조할 것.
본 발명에 따른 용어 "결합(binding)"은 좋기로는 특이적 결합에 관한 것이다.
본 발명에서, 만일 항체와 같은 물질이 표준 분석법에 의할 때 소정의 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지고 상기 소정의 표적과 결합한다면 상기 항체는 상기 소정의 표적에 결합할 능력이 있는 것이다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 평형 해리 상수(KD)에 의하여 종종 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의적인 친화도"란 10-5 M 또는 그 미만, 10-6 M 또는 그 미만, 10-7 M 또는 그 미만, 10-8 M 또는 그 미만, 10-9 M 또는 그 미만, 10-10 M 또는 그 미만, 10-11 M 또는 그 미만, 또는 10-12 M 또는 그 미만의 해리 상수(KD) 값으로 소정의 표적에 결합하는 것을 의미한다.
만일 물질이 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않는다면, 특히 검출 가능할 정도로 결합하지 않는다면, 그 물질은 상기 표적에 결합할 능력이 (실질적으로) 없는 것이다. 좋기로는, 물질이 최대 2, 좋기로는 최대 10, 더욱 좋기로는 최대 20, 특히 최대 50 또는 100 ㎍/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하면, 그 물질은 상기 표적과 검출가능할 정도로 결합하는 것이 아니다. 좋기로는, 만일 물질이 결합할 능력이 있는 소정의 표적에 대한 결합 KD에 비해 KD값이 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 더 높게 상기 표적과 결합한다면 그 물질은 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 갖는 것이 아니다. 예컨대, 만일 물질이 결합 가능한 표적에 대한 항체의 결합 KD값이 10-7 M이면, 그 물질이 유의적인 친화도를 갖지 않는 표적에 대한 결합 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M이 될 것이다.
어느 항체와 같은 물질이 다른 표적에는 결합할 수 없는 것, 즉 다른 표적에는 유의적인 친화도를 가지지 않고, 표준 분석에서 다른 표적에는 유의적으로 결합하지 않는 것인 반면에, 소정의 표적에는 결합할 수 있는 것이라면, 그 물질은 상기 소정의 표적에 특이적인 것이다. 본 발명에 따를 때, 어느 물질이 CLDN에 대해서는 결합할 수 있지만, 다른 표적에는 (실제로) 결합할 수 없는 것이라면, 그 물질은 CLDN에 특이적인 것이다. 좋기로는 다른 표적에 대한 친화도 및 결합이, 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 클라우딘과 관계없는 단백질에 대한 친화도 또는 결합, 또는 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체와 같은 비클라우딘 막투과 단백질, 또는 다른 특정 폴리펩타이드에 대한 친화도 또는 결합을 유의적으로 능가하는 것이 아니라면, 상기 물질은 CLDN18.2에 대하여 특이적인 것이다. 좋기로는 어느 물질이 특이적이지 않은 표적에의 결합을 위한 KD 값보다 적어도 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 또는 106-배 더 낮은 KD 값을 가지고 소정의 표적에 결합한다면, 그 물질은 상기 표적에 대하여 특이적인 것이다. 예를 들어 어느 물질이 그것이 특이적인 표적에 결합하기 위한 KD 값이 10-7 M인 경우, 그것이 특이적이지 않은 표적에 결합하기 위한 KD 값은 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
어떤 물질의 표적에 대한 결합은 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있는데, 예를 들어 논문(Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman 및 Company New York, N Y (1992)) 및 본 명세서에 기술된 방법을 참조할 것. 평형투석의 사용; 제조사에 의해 개괄된 일반적 절차를 사용하는 BIAcore 2000 기구의 사용; 방사능 표지된 표적 항원을 사용하는 방사능 면역 분석법에 의하여; 또는 숙련된 기술자에게 알려진 또 다른 방법에 의하는 것과 같은 통상적인 기법을 사용하여 친화도를 손쉽게 결정할 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 논문(Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949))의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 만일 다른 조건(예컨대 염 농도, pH)에서 측정된다면, 특정 항체-항원 결합의 측정된 친화도는 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 KD, IC50와 같은 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "이소형(isotype)"이라 함은 중쇄 불변부 유전자들에 의해 코딩되는 항체 클래스(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "이소형 스위칭(switching)"은 항체들의 클래스 또는 이소형이 하나의 Ig 클래스로부터 다른 Ig 클래스들 중 하나까지로 변화하는 것에 의한 현상을 나타낸다.
목적에서 적용된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 바와 같은, "자연적으로 일어나는"이라는 용어는 목적을 자연에서 찾을 수 있는 사실을 나타낸다. 예컨대, 자연에서 소스로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스들을 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 일어난다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "재배열된(rearranged)"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 로커스(locus)의 배열을 나타내는 것으로, V 세그먼트는 필수적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 구조에서 D-J 또는 J 세그먼트에 즉시 인접하여 위치된다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 로커스는 생식세포(germline) DNA와 비교에 의해 확인될 수 있다; 재배열된 로커스는 적어도 하나의 재조합된 헵타머/나노머 상동성 요소를 가질 것이다.
V 세그먼트와 관련하여 본 명세서에서 사용된 "비재배열된(unrearranged)" 또는 "생식세포(germline) 배열"이라는 용어는 V 세그먼트가 재조합되지 않아 D 또는 J 세그먼트에 직접적으로 인접되어 있는 배열을 가리킨다.
일 구체예에서, 본 발명의 결합제는 CLDN18.2에 결합하는 능력, 즉 CLDN18.2 에 존재하는 에피토프에 결합하는 능력, 좋기로는 CLDN18.2의 세포외 도메인 내에 위치하는 에피토프, 특히 제1 세포외 루프, 좋기로는 CLDN18.2 의 아미노산 위치 29 내지 78에 존재하는 에피토프에 결합하는 능력을 갖는다. 특정 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력을 갖는 물질은 CLDN18.1에는 존재하지 않는 CLDN18.2 상의 에피토프에 결합한다.
CLDN18.2에 결합하는 물질은 좋기로는 CLDN18.2에는 결합하지만 CLDN18.1에는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 좋기로는 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 CLDN18.2에 특이적인 것이 바람직하다. 좋기로는 CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 세포 표면에 발현된 CLDN18.2에 결합하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN18.2의 천연 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부 (VH)를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함한다.
바람직한 특정 구체예에서, CLDN18.2에 결합하는 능력이 있는 물질은 다음의 가능한 경우 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)와의 조합을 포함한다:
(i) VH는 SEQ ID NO: 5로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 12로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 6으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 11로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 7로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 13으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 9로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 16으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) VH는 SEQ ID NO: 8로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 15로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 10으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 14로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 10으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 17로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(viii) VH는 SEQ ID NO: 10으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 18로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ix) VH는 SEQ ID NO: 10으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 19로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합할 수 있는 물질은 중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 8로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 15로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, CLDN18.2에 결합할 수 있는 물질은 중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 6으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 11로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
용어 "단편"이라 함은, 특히, 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 좋기로는중쇄 가변부 (VH)의 CDR3 가변부 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 가리킨다. 일 구체예에서 상기 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDRs)은 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 용어 "단편"이라 함은 중쇄 가변부 (VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 가리킨다.
일 구체예에서 전술한 바와 같은 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 상기 CDR과 함께 그의 개재 프레임워크 영역을 포함한다. 좋기로는, 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 영역들 중 일방 또는 양방의 적어도 약 50%를 포함하되, 여기서 50%는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50% 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 결합제의 구축은 본 발명의 가변부에 면역글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인(예컨대 이중체 생산시) 또는 단백질 표지를 결합시키기 위한 링커의 도입을 비롯하여, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 인코딩되는 가변부 내로 N- 또는 C-말단 잔기들의 도입을 야기할 수 있다.
일 구체예에서, 상기한 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 인간 항체 프레임워크에서 상기 CDR을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 결합제는 CLDN6에 결합하는 능력, 즉 CLDN6에 존재하는 에피토프에 결합하는 능력, 좋기로는 CLDN6의 세포외 도메인 내에 위치하는 에피토프, 특히 제1 세포외 루프, 좋기로는 CLDN6의 아미노산 위치 28 내지 76에 존재하는 에피토프 또는 제2 세포외 루프, 좋기로는 CLDN6의 아미노산 위치 141 내지 159에 존재하는 에피토프에 결합하는 능력을 갖는다. 특정 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력을 갖는 물질은 CLDN9에는 존재하지 않는 CLDN6의 에피토프에 결합한다. 좋기로는, CLDN6에 결합하는 물질은 CLDN4 및/또는 CLDN3에는 존재하지 않는 CLDN6 상의 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 더욱 좋기로는 CLDN6에 결합하는 능력을 갖는 물질은 CLDN6이 아닌 다른 CLDN 단백질 부분에는 존재하지 않는 CLDN6 상의 에피토프에 결합하는 것이다.
CLDN6에 결합하는 능력을 갖는 물질은 좋기로는 CLDN6는 결합하지만 CLDN9에는 결합하지 않고 좋기로는 CLDN4 및/또는 CLDN3에는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 좋기로는 CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 CLDN6에 특이적인 것이 좋다. 바람직하게는, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 세포 표면에 발현된 CLDN6에 결합하는 것이 좋다. 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 살아있는 세포 표면에 존재하는 CLDN6의 천연 에피토프에 결합하는 것이 좋다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그의 단편을 포함하는 중쇄 가변부 (VH)를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 28, 29, 97, 98, 99, 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그의 단편을 서열을 포함하는 경쇄 가변부 (VL)를 포함한다.
바람직한 특정 구체예에서, CLDN6에 결합하는 능력이 있는 물질은 다음의 가능한 경우 (i) 내지 (xi)로부터 선택되는 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)와의 조합을 포함한다:
(i) VH는 SEQ ID NO: 20으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 21로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 22로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 23으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 24로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 25로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 26로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 27 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 21로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 28로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 29로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(viii) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 97로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ix) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 98로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(x) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 99로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(xi) VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 100으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 대한 결합능을 갖는 물질은 중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 갖는 것이 좋다:
VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 23으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 대한 결합능을 갖는 물질은중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 갖는 것이 좋다:
VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 97로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 대한 결합능을 갖는 물질은중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 갖는 것이 좋다:
VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 98로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 대한 결합능을 갖는 물질은중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 갖는 것이 좋다:
VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 99로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, CLDN6에 대한 결합능을 갖는 물질은중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL)의 다음의 조합을 갖는 것이 좋다:
VH는 SEQ ID NO: 22 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 100으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함.
용어 "단편"이라 함은, 특히, 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 좋기로는중쇄 가변부 (VH)의 CDR3 가변부 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 가리킨다. 일 구체예에서 상기 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDRs)은 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 용어 "단편"이라 함은 중쇄 가변부 (VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 가리킨다.
일 구체예에서 전술한 바와 같은 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 상기 CDR과 함께 그의 개재 프레임워크 영역을 포함한다. 좋기로는, 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 영역들 중 일방 또는 양방의 적어도 약 50%를 포함하되, 여기서 50%는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50% 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 결합제의 구축은 본 발명의 가변부에 면역글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인(예컨대 이중체 생산시) 또는 단백질 표지를 결합시키기 위한 링커의 도입을 비롯하여, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 인코딩되는 가변부 내로 N- 또는 C-말단 잔기들의 도입을 야기할 수 있다.
일 구체예에서, 상기한 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 인간 항체 프레임워크에서 상기 CDR을 포함한다.
본 발명에 따른 결합제를 제공하는데 유용한 항CD3 항체에는 UCHT1-HS (인간화 mAB), UCHT1-MM (쥐의 mAB), CLB-T3, TR66, 145-2C11가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
UCHT1은 인간과 영장류 샘플 종류의 CD3를 탐지하는 모노클로날 IgG1 항CD3 모노클로날 항체이다. CLB-T3은 CD3 항원에 지향된 마우스 모노클로날 항CD3 항체로서 80-90% 인간 말초 T 림프구 및 수질 흉선세포와 반응한다. TR66은 인간 CD3의 엡실론-사슬을 인식하는 마우스 IgG1 모노클로날 항CD3 항체이다. 145-2C11은 아르메니아 햄스터 모노클로날 항마우스 CD3 항체이다.
좋기로는, CD3-결합 도메인의 VH 및 VL 영역은 그의 천연 배열에서 TCR을 발현하는 활성화된 일차 인간 T 세포에 존재하는 것과 다른 TCR 서브유닛 맥락에서 인간 CD3을 특이적으로 인식할 수 있는 항체-유사 분자 및 항체/항체 분자들로부터 유도되는 것이 바람직하다. CD3-엡실론 사슬에 대해 특이적인 항체로부터 유도된 VH 및 VL 영역이 가장 바람직하며 상기(모(母)) 항체는 TCR 복합체 관점에서 제히된 인간 CDR의 천연 또는 천연에 가까운 구조 또는 배열적 에피토프를 반영하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있어야 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, CD3-결합 도메인의 VH 및 VL 영역은 UCHT1-HS, UCHT1-MM, CLB-T3 및 TR66로 이루어진 군으로부터 선택된 CD3 특이 항체, 좋기로는 TR66로부터 유도된다.
바람직한 일 구체예에서, CD3에 결합할 수 있는 물질은 SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 94, 95, 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부(VH)를 포함한다.
바람직한 일 구체예에서, CD3에 결합할 수 있는 물질은 SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 96 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부(VL)를 포함한다.
어떤 바람직한 구체예에서, CD3에 결합하는 능력이 있는 물질은 다음의 가능한 경우 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변부 (VH)와 경쇄 가변부 (VL)와의 조합을 포함한다:
(i) VH는 SEQ ID NO: 30으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 31로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 32로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 33으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 34로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 36으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(v) VH는 SEQ ID NO: 94로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 95로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 36으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 96로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(viii) VH는 SEQ ID NO: 94로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 96으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함,
(ix) VH는 SEQ ID NO: 95로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 96으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
특히 바람직한 구체예에서, CD3에 결합할 수 있는 물질은 중쇄 가변부(VH) 및 경쇄 가변부(VL)의 다음의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 36으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
더 바람직한 구체예에서, CD3에 결합할 수 있는 물질은 중쇄 가변부(VH) 및 경쇄 가변부(VL)의 다음의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 94로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 37로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
더 바람직한 구체예에서, CD3에 결합할 수 있는 물질은 중쇄 가변부(VH) 및 경쇄 가변부(VL)의 다음의 조합을 포함한다:
VH는 SEQ ID NO: 95로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 VL은 SEQ ID NO: 96으로 나타내지는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함함.
용어 "단편"이라 함은, 특히, 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 좋기로는중쇄 가변부 (VH)의 CDR3 가변부 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 CDR3 가변부를 가리킨다. 일 구체예에서 상기 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDRs)은 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 용어 "단편"이라 함은 중쇄 가변부 (VH)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 가변부 (VL)의 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 가리킨다.
일 구체예에서 전술한 바와 같은 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 상기 CDR과 함께 그의 개재 프레임워크 영역을 포함한다. 좋기로는, 상기 부분은 또한 제1 및 제4 프레임워크 영역들 중 일방 또는 양방의 적어도 약 50%를 포함하되, 여기서 50%는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50% 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 결합제의 구축은 본 발명의 가변부에 면역글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인(예컨대 이중체 생산시) 또는 단백질 표지를 결합시키기 위한 링커의 도입을 비롯하여, 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 인코딩되는 가변부 내로 N- 또는 C-말단 잔기들의 도입을 야기할 수 있다.
일 구체예에서, 상기한 하나 이상의 CDRs, CDR의 세트 또는 CDR의 세트의 조합을 포함하는 결합제는 인간 항체 프레임워크에서 상기 CDR을 포함한다.
본 발명에서, CLDN18.2를 표적화하는 바람직한 결합제는 SEQ ID NOs: 38, 39, 40 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명에서, CLDN18.2를 표적화하는 또 다른 바람직한 결합제는 SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 아미노산 서열은 N-말단 분비 시그널과 같은 분비 시그널, 특히 SEQ ID NO: 51에 따른 서열을 결여하며 및/또는 C-말단 His-태그와 같은 His-태그, 특히 서열 Gly-Gly-Ser-(His)6 또는 존재할 경우 (His)6,을 결여한다.
본 발명에 따라, CLDN6을 표적화하는 바람직한 결합제는 SEQ ID NOs: 42, 43, 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명에 따라, CLDN6을 표적화하는 또 다른 바람직한 결합제는 SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일 구체예에서 상기 아미노산 서열은 N-말단 분비 시그널과 같은 분비 시그널, 특히 SEQ ID NO: 51에 따른 서열을 결여하며 및/또는 C-말단 His-태그와 같은 His-태그, 특히 서열 Gly-Gly-Ser-(His)6 또는 존재할 경우 (His)6을 결여한다.
본 발명에 설명된 결합제는 결합제를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 투여함으로써 및/또는 결합제를 인코딩하는 RNA 와 같은 핵산을 투여함으로서 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 환자에게 투여될 때 결합제를 인코딩하는 핵산은 리포좀 또는 바이러스 입자 형태와 같은 적절한 전달 비히클 내에 네이키드 형태로 또는 숙주 세포 내에 존재할 수 있다. 제공된 핵산은 치료 항체들, 특히 이중특이 항체들의 경우 적어도 부분적으로 관찰된 불안정성을 완화하는 지속적 방식으로 장기간에 걸쳐 결합제를 생산할 수 있다. 환자에게 전달될 핵산은 재조합 방식으로 제조될 수 있다. 만일 핵산이 숙주 세포에 제시되지 않은 채로 환자에게 투여되면, 좋기로는 그 핵산에 의해 인코딩되는 결합제 발현을 위해 환자 세포에 의해 취해지는 것이 좋다. 만일 핵산이 숙주 세포 내에 제시되어 환자에게 투여되는 경우에는, 그 핵산에 의해 인코딩되는 결합제 발현을 위해 환자 내의 숙주 세포에 의해 발현되는 것이 좋다.
본 발명의 문맥 상 용어 "재조합"은 "재조합 유전자를 통해 만들어진 것"을 의미한다. 좋기로는 본 발명의 문맥 상 재조합 핵산과 같은 "재조합 물체(recombinant object)"은 자연발생적인 것이 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "자연발생적인"이라는 표현은 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 가리킨다. 예를 들어, 어떤 유기체(바이러스를 포함한다) 내에 존재하고 자연의 소스로부터 분리가능하며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연발생적인 것이다.
본 발명에서 용어 "핵산"은 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자들, 게놈 DNA, cDNA, mRNA와 같은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일-사슬 또는 이중-사슬일 수 있다. RNA는 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다.
핵산은 벡터 내에 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 예컨대 λ 파지와 같은 파지 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 또는 배큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 통상의 기술자에게 잘 알려진 여하한 벡터를 모두 포함한다. 상기 벡터에는 클로닝 벡터와 같은 발현 벡터도 포함된다. 발현 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하며 일반적으로 특정 숙주 생명체(예컨대 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 요구되는 코딩 서열 및 적절한 DNA 서열들을 일반적으로 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 어떤 소망되는 DNA 단편을 조작 및 증폭하는데 사용되며 소망되는 DNA 단편의 발현에 요구되는 기능적 서열들을 결여할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기들을 포함하고 좋기로는 전적으로 또는 실제로 리보뉴클레오타이드 잔기들로 이루어진 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보퓨라노실기의 2'-위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한다. 이 용어에는 이중사슬 RNA 단일사슬 RNA, 분리된 RNA 예컨대 부분 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합 생산된 RNA 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적인 RNA와 차이가 나는 변형된 RNA 가 포괄된다. 이러한 변경에는 비뉴클레오타이드 물질의 예컨대 RNA의 말단(들)에 대한 또는 내부에로의 부가, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의 부가가 포함될 수 있다. RNA 분자 중의 뉴클레오타이드는 또한 비표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비자연발생적인 뉴클레오타이드 또는 화학합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연발생적인 RNA의 유사체라 칭할 수 있다.
본 발명에 따라, 용어 "RNA"에는 "메신저 RNA"를 의미하며 주형으로서 DNA를 이용하여 생산가능하고 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 "전사체"에 관한 "mRNA"가 포함되며 좋기로는 이에 관한 것이다. mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩타이드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포내 및 시험관 내에서 제한된 반감기를 갖는다. 좋기로는, mRNA는 DNA 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 생산되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학 합성에 의해 수득된다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 공지이다. 예를 들어, 다양한 종류의 시험관내 전사 키트가 시판되고 있다.
본 발명의 일 구체예에서, RNA는 예컨대 단일 사슬 자가-복제 RNA와 같은 자가-복제 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 포지티브 센스의 단일 사슬 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스성 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스 게놈 RNA이거나 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도된다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 일 구체예에서, 바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 하나 이상의 트랜스유전자를 함유하며 상기 트랜스유전자들 중 적어도 하나는 본 발명에 설명된 결합제를 인코딩하는 것이다. 일 구체예에서, 만일 RNA가 바이러스 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 경우, 트랜스유전자는 예컨대 구조 단백질을 코딩하는 바이러스 서열들과 같은 바이러스 서열들을 부분적으로 또는 전적으로 대체할 수 있다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
알파바이러스의 게놈은 큰 폴리단백질의 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)를 인코딩하는 포지티브 센스의 단일사슬 RNA(ssRNA(+))이다. 게놈의 5'-말단의 ORF는 비구조 단백질들인 nSP1 내지 nSP4 (nsP1-4)를 인코딩하는데, 이들은 번역되어 RNA-의존성 RNA-폴리머라제(레플리카제)로 프로세싱되고; 3'-말단의 ORA는 구조 단백질 - 캡시드 및 당단백질들을 인코딩한다. 두 가지 ORF 모두 구조 ORF의 전사를 지배하는 소위 서브게놈 프로모터(SGP)에 의해 이격되어 있다. 유전자 벡터로 이용될 경우, 구조 SGP 뒤의 단백질들은 흔히 트랜스유전자에 의해 대체된다. 이러한 벡터들을 바이러스 입자들 내로 패키지하기 위해, 구조 단백질들은 흔히 헬퍼 구조물들로부터 트랜스 발현된다. 알파바이러스들은 RNA 수준에서 감염된 세포들의 세포질에서만 복제된다. 감염 후, ssRNA(+) 게놈은 nsP1234 폴리-단백질 전구체의 번역을 위한 mRNA로서 작용하는데, 상기 전구체는 바이러스 생명 주기의 초기 단계에서 자가단백질분해적으로 프로세싱되어 단편 nsP123 및 nsP4로 된다. 단편 nsP123 및 nsP4는 (-) 가닥 레플리카제 복합체를 형성하고 이것은 (-)가닥 RNA를 게놈 RNA 주형으로부터 전사한다. 후기 단계에서, nsP1234 폴리단백질은 단일 단백질들로 완벽하게 절단되어 구조 단백질 또는 트랜스유전자를 코딩하는 새로운 (+) 가닥 게놈 및 서브게놈 전사체를 합성하는 (+) 가닥 레플리카제 복합체로 어셈블된다. 서브게놈 RNA와 새로운 게놈 RNA는 캡핑 및 폴리아데닐화되고 그에 따라 표적 세포들 감염 후 mRNA로서 인식된다. 오직 새로운 게놈 RNA만이 패키징 시그널을 함유함으로 해서 게놈 RNA만을 발아 비리온 내로 패키징시키게끔 한다. 벡터학에 있어서 알파바이러스 레플리콘의 매력은 캡핑되어 폴리아데닐화된 RNA 게놈의 포지티브 배향에 기초한다. 번역가능한 레플리콘 RNA는 시험관내에서 용이하게 합성가능하므로, 캡핑은 시험관내 전사 반응에 부가된 캡-유사체에 의해 달성될 수 있고 poly-A 테일은 플라스미드 주형 상에 poly-T 트랙으로서 코딩될 수 있다. 시험관내 전사된(IVT) 레플리콘들은 통상적인 트랜스펙션 기술에 의해 트랜스펙션되어 심지어 적은 양의 출발 IVT RNA가 급속히 배가된다. 전달 후 수시간 이내에, SGP의 하류에 위치한 트랜스유전자들은 세포 당 서브게놈 RNA 약 40,000 내지 200,000 카피의 매우 높은 카피 수로 전사되므로, 재조합 단백질들이 강력하게 발현되는 것은 놀라운 일이 아니다. 특정 목적에 따라, IVT 레플리콘들은 표적 세포 내로 직접 트랜스펙션되거나 또는 트랜스 내에서 구조 유전자를 제공하는 헬퍼 벡터와 함께 알파바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. 피부나 근육 내로의 전달은 고도의 지속적인 국소 발현을 야기하며 체액성 및 세포성 면역반응의 강력한 유도가 수반된다.
본 발명에 사용된 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 좋기로는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열을 변경함이 없이 이를 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 RNA와 관련한 용어 "변형(modification)"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 모두 포괄한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성가능하다.
본 발명에 따른 RNA는 그의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 자연발생적인 또는 합성 리보뉴클레오타이드로 변령될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘이 부분적으로 또는 완전히, 좋기로는 완전히 시티딘을 대신할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 슈도우리딘이 부분적으로 또는 전적으로, 좋기로는 전적으로 우리딘을 대신하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 용어 "변형(modification)"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 가리키며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연발생적인 RNA 5'-캡, 좋기로는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 칭한다. 본 발명의 문맥 상, 용어 "5'-캡"에는 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA에 결합될 경우, 좋기로는 생체내 및/또는 세포 내에서 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체가 포함된다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있는데, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공-전사적으로 혼입되거나 RNA가 예컨대 시험관내 전사에 의해 생성되고, 5'-캡이 캡핑 효소, 예컨대 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 이용하여 RNA에 후전사적으로 결합될 수 있다.
RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가 변형에는 자연발생적인 폴리(A) 테일의 연장 또는 트렁케이션이거나 또는 5'- 또는 3'-미번역 영역 (UTR)의 변형 에컨대 상기 RNA의 코딩 영역에 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, β-글로빈, 좋기로는 β-글로빈, 더욱 좋기로는 인간 β-글로빈과 같은 글로빈 유전자로부터 유도된 3'-UTR의 하나 이상의 카피 좋기로는 2개의 카피의 삽입이 포함된다.
따라서, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현 증가를 위해서, 좋기로는 길이가 10 내지 500, 더욱 좋기로는 30 내지 300, 더더욱 좋기로는 65 내지 200 및 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기를 갖는, 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리-A 서열은 약 120 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 이에 더해, 2개 이상의 RNA 분자의 3'-비번역 영역(UTR)의 3'-비번역 영역 내로의 혼입은 번역 효율성을 향상시킬 수 있다. 특정한 일 구체예에서 3'-UTR은 인간 β-글로빈 유존자로부터 유도된다.
좋기로는, RNA가 세포 특히 생체내 존재하는 세포 내로 전달, 즉 트랜스펙션될 경우, 그것이 인코딩하는 단백질, 펩타이드 또는 항원을 발현하는 것이 바람직하다.
용어 "트랜스펙션"은 핵산, 특히 RNA의 세포 내로의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 목적 상, 용어 "트랜스펙션"은 또한 핵산의 세포 내로의 도입 또는 그러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 포괄하며, 이 때 상기 세포는 대상자, 예컨대 환자 내에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 본 발명에 설명된 핵산의 트랜스펙션을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내 존재할 수 있으며, 예컨대 이러한 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 조직의 일부를 구성할 수 있다. 본 발명에 따라, 트랜스펙션은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 트랜스펙션의 몇 가지 적용예에서, 트랜스펙션된 유전 물질이 일시적으로 발현되기만 해도, 충분하다. 트랜스펙션 과정에서 도입된 핵산은 대개 핵 게놈 내로 통합되지 않으므로, 외래 핵산은 세포유사분열을 통해 희석되거나 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허여하는 세포들은 희석비율을 크게 감소시킨다. 만일 트랜스펙션된 핵산이 세포 및 그의 딸 세포들의 게놈 내에 실제로 남아있는 것이 요구될 경우, 안정한 트랜스펙션이 일어나야 한다. RNA는 그의 코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다.
용어 RNA의 "안정성"은 RNA의 "반감기"에 관한 것이다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 갯수의 절반을 제거하는데 필요한 기간이다. 본 발명의 문맥 상, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 그 RNA의 "발현 기간"에 영향을 미칠 수 있다. 수명이 긴 RNA는 장기간 발현될 것으로 기대할 수 있다.
본 발명의 문맥 상, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관한 것이다. 후속적으로, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하는데, 상기 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서, 좋기로는 적절한 세포 추출물을 이용하여 시험관내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 좋기로는, 전사체 생성에 클로닝 벡터가 응용되는 것이 바람직하다. 이들 클로닝 벡터들은 일반적으로 전사 벡터로서 설계되며 용어 "벡터"에 의해 포괄되는 본 발명에 따른 것들이다.
본 발명에서 용어 "번역"은 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 만들어내는, 세포의 리보좀 내에서 일어나는 프로세스에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로, RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질의 예컨대 전사 및/또는 번역에 의한 생산을 포함한다. RNA의 경우, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 이것은 또한 헥산의 부분적 발현을 포함하기도 한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 본 발명에 따라, 용어 발현에는 또한 "비정상 발현" 또는 "이상성 발현"도 포함된다.
본 발명에서 "비정상 발현" 또는 "이상 발현"이라 함은 발현이 변경되는 것, 좋기로는 레퍼런스, 예컨대 어떤 단백질, 예컨대 종양 항원의 비정상 또는 이상 발현과 연관된 질병이 없는 대상자의 상태와 같은 레퍼런스에 비해 증가된 것을 의미한다. 발현이 증가되었다 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 이상 증가된 것을 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 질병 상태에서만 발견되는 반면 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.
용어 "특이적으로 발현되다"라는 것은 단백질이 특이 조직 또는 장기에서만 본질적으로 발현됨을 의미한다. 예를 들어, 위점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위점막에서 우선적으로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 또는 다른 조직이나 장기 종류에서는 유의적인 정도로 발현되지 않음을 의미한다. 따라서, 위점막 세포에만 배타적으로 발현되고 다른 조직 예컨대 고환에서는 유의적으로 훨씬 낮은 정도로 발현되는 단백질은 위점막 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 종양 항원은 또한 두 개 이상의 조직 종류 또는 장기, 예컨대 2개 또는 3가지 조직 종류 또는 장기에서 그러나 네 가지 이하의 상이한 조직 또는 종양 종류에서 정상 조건 하에 특이적으로 발현될 수도 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 장기에서 특이적으로 발현되는 것이다. 예를 들어, 만일 어떤 종양 항원이 정상 조건 하에서 좋기로는 폐와 위에서 대략 비슷한 정도로 발현될 경우, 상기 종양 항원은 폐와 위에서 특이적으로 발현되는 것이다.
본 발명에 따라, 용어 "RNA가 인코딩하다"라 함은 RNA가 적절한 환경 하에 존재할 경우, 좋기로는 세포 내에 존재할 경우, 그것이 인코딩하는 단백질이나 펩타이드를 생산하도록 발현될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 몇몇 측면들은 본 발명에 설명된 결합제를 인코딩하는 RNA와 같은 핵산에 의해 시험관내 트랜스펙션되어 좋기로는 낮은 전구체 빈도로부터 임상적으로 타당한 세포 수까지 생체외 증폭된 후 환자와 같은 수혜자에게 전달되는 숙주 세포들의 후천적 전달에 의존한다. 본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포들은 처리되는 수헤자에 대해 자가, 동종이계, 또는 동계일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "자가(autologous)"는 동일한 대상자로부터 유래하는 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, "자가이식(autologous transplant)"이라 함은 동일한 대상자로부터 유래하는 조직이나 장기의 이식을 가리킨다. 이러한 절차는 그렇지 않다면 이식거부를 야기할 면역장벽을 극복해주므로 유리하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 종(species)의 다른 개체로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다. 2 이상의 개체에서 하나 이상의 위치(loci)에서의 유전자가 동일하지 않을 경우 그 2 이상의 개체들은 서로에 대해 동종이계이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 유전형을 갖는 개체나 조직, 즉 동일한 쌍동이 또는 동일한 순계(inbred strain)의 동물 또는 그들의 조직으로부터 유래한 것을 설명하는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이종(heterologous)"이라는 표현은 복수개의 서로 다른 요소들로 이루어진 것들을 설명하는데 사용된다. 일례로서, 어떤 개체의 골수를 다른 개체로 전달하는 것은 이종 이식을 구성하는 것이다. 이종 유전자는 그 대상자와는 다른 소스로부터 유도된 유전자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩타이드"에는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드가 포함되며 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 결합된 2개 이상, 좋기로는 3개 이상, 좋기로는 4개 이상, 좋기로는 6개 이상, 좋기로는 8개 이상, 좋기로는 9개 이상, 좋기로는 10개 이상, 좋기로는 13개 이상, 좋기로는 16개 이상, 좋기로는 21개 이상 및 좋기로는 최대 8, 10, 20, 30, 40 또는 50, 특히 최대 100개의 아미노산들을 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "단백질"은 큰 펩타이드, 좋기로는 100개를 초과하는 아미노산 잔기들로 된 펩타이드를 가리키지만, 일반적으로 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 동의어이며 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
특정한 아미노산 서열, 예컨대 서열목록에 나타난 아미노산 서열에 관한 본 발명의 교시 내용은 그 특이적인 서열들과 기능적으로 동등한 서열들, 예컨대 상기 특이적인 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 특성을 갖는 아미노산 서열들을 결과시키는 상기 특이적인 서열들의 변이체에 관한 것으로 이해되어야 한다. 한 가지 중요한 특성은 표적에 대한 결합을 유지하거나 이펙터 기능을 유지하는 것이다. 좋기로는, 특이적인 서열과 관련한 변이체인 서열은 그것이 항체의 특이 서열을 대체할 경우 CLDN 및/또는 CD3에 대한 상기 항체의 결합을 유지하는 것이 바람직하고 좋기로는 본 발명에 설명된 바와 같은 상기 항체의 기능, 예컨대 CDC 매개된 용해 또는 ADCC 매개된 용해를 유지하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 서열목록에 나타난 서열들은 하나 이상의, 좋기로는 모든 유리 시스테인 잔기들이 제거되도록, 특히, 이들 시스테인 잔기들을 시스테인이 아닌 아미노산, 좋기로는 세린, 알라닌, 쓰레오닌, 글리신, 티로신, 류신 또는 메티오닌, 가장 좋기로는 알라닌 또는 세린으로 대체함으로써 시스테인 잔기들을 대체하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 서열목록의 SEQ ID NO: 36에 나타난 서열의 103번 위치의 시스테인 또는 상기 서열을 포함하는 서열 중의 대응하는 시스테인을 이러한 방식으로 변형시킬 수 있다. 또한 이러한 방식으로 변형가능한 시스테인은 SEQ ID NO: 42의 178번 위치, SEQ ID NO: 43의 197번 위치, SEQ ID NO: 44의 427번 위치 또는 SEQ ID NO: 45의 446번 위치의 시스테인들이다.
통상의 기술자는 특히 CDR, 하이퍼가변부 및 가변부의 서열들이 CLDN 및/또는 CD3에 대한 결합능을 잃지 않고도 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, CDR 부분은 본 발명에 명시된 항체의 부분들과 동일하거나 고도로 상동적일 것이다. "고도로 상동적인(highly homologous)"이라는 의미는 CDRs 내에 1 내지 5, 좋기로는 1 내지 4, 예컨대 1 내지 3 또는 1 또는 2개의 치환이 있을 수 있는 것으로 의도된다. 또한, 하이퍼가변부 및 가변부는 이들이 본 발명에 특별히 설명된 항체들의 부분과 실제로 상동성을 갖도록 변형될 수도 있다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결여 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단의 결여를 포함하는 아미노산 결여 변이체는 또한 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체로도 불리운다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열 중에 1 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 가지는 아미노산 서열 변이체의 경우, 생성물의 적절한 스크리닝을 구비한 랜덤한 삽입 또한 가능하지만, 1 이상 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 특정 부위 속으로 삽입된다.
아미노산 첨가 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산과 같은 1 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합을 포함한다.
아미노산 결여 변이체는 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산을 제거하는 것에 의하는 것과 같이 서열로부터 1 이상의 아미노산을 제거하는 것을 특징으로 한다. 결여는 단백질의 임의의 부위에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내 적어도 하나의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 그 특징으로 한다. 상동체 단백질 또는 펩타이드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열 부위에서의 변형 및/또는 아미노산을 유사한 성질을 가지는 다른 것으로 치환하는 것이 선호된다. 바람직하게는 단백질 변이체에서의 아미노산의 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 전하성 또는 비전하성 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그것의 측쇄와 관련된 아미노산 족의 하나의 치환과 관련된다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 다음의 4개 족으로 나뉜다: 산성 아미노산(아스파르트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 아미노산(알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비전하성 극성 아미노산(글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
좋게는, 유사성 정도, 좋기로는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 동일성이 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 것이 바람직하다. 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 참조 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대하여 주어진다. 예를 들어 참조 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성된 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 아미노산에 대하여, 좋기로는 연속되는 아미노산에 대하여 주어진다. 바람직한 구체예에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 서열 목록에 나타난 아미노산 서열과 같은 참조 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 주어진다. 서열 유사성 결정을 위한 배열, 좋기로는 서열 동정은 당업계에 알려진 도구를 이용하여, 좋기로는 최상의 서열 배열을 사용하여, 예를 들어 얼라인(Align)을 사용하여, 표준 세팅, 좋기로는 EMBOSS::니들, 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산들의 백분율을 나타낸 것이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 "서열 동일성"은 서열 간 동일한 아미노산들의 백분율을 가리킨다.
용어 "퍼센트 동일성(percentage identity)"은 가장 적합한 정렬 후 얻어지는 비교될 두 개의 서열들 간에 동일한 아미노산 잔기들의 퍼센트를 나타내고자 하는 것으로, 이러한 퍼센트는 오로지 통계적인 퍼센트이고 임의적으로 분포된 두 개의 서열 간의 차이 및 전장 서열에 걸친 두 개의 서열 간의 차이이다. 두 개의 아미노산 서열들 간의 서열 비교는 통상적으로 상술한 서열들을 최적으로 정렬시킨 후 비교함으로써 실시되고, 상기 비교는 절편 또는 "비교 윈도우(window of comparison)"에 의해 실시되어 서열 유사성의 국소적 부위들을 동정하고 비교하는 것이다. 비교를 위한 서열들 간의 최적 정렬은 수작업을 제외한 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 탐구 방법, 또는 상술한 알고리즘들을 이용하는 컴퓨터 프로그램들(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)에 의해 얻어질 수 있다.
퍼센트 동일성은 비교되는 두 개의 서열들 간의 동일한 위치들의 수를 결정하는 단계, 비교된 위치들의 수로 상기 동일한 위치들의 수를 나누는 단계 및 얻어진 결과들에 100을 곱하는 단계에 의해 계산되어 상술한 두 개의 서열들 간의 퍼센트 동일성을 얻는다.
본 발명의 결합제들은 세포내(예컨대 세포액 내, 세포질 주변내 또는 봉입체 내)에서 생산된 다음 숙주 세포들로부터 분리되고 임의로 추가 정제됨으로써 생산될 수 있다; 또는 이들은 세포외(예컨대 숙주 세포들이 배양된 배지 내)에서 생산된 다음 배양 배지로부터 분리되어 임의로 추가 정제됨으로써 생산될 수도 있다. 특이적이고 적절한 발현 벡터와 같은 폴리펩타이드들의 재조합 생산에 사용되는 방법 및 시약들, 형질전환 또는 트랜스펙션 방법, 선택 마커, 단백질 발현의 유도 방법, 배양 조건 등은 기술분야에 공지이다. 마찬가지로, 단백질 분리 및 정제 기술 역시 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 좋기로는 온전한 세포, 즉 효소, 소기관 또는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포내 성분들을 방출하지 않은 온전한 막을 갖는 온전한 세포에 관한 것이다. 온전한 세포(intact cell)sms 좋기로는 살아있는 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 좋기로는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 트랜스펙션될 수 있는 여하한 세포에 관한 것이다. 좋기로는 상기 세포는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되어 수혜자에게 전달된 경우 그 수혜자에서 그 핵산을 발현할 수 있는 것이 바람직하다. 용어 "세포"에는 세균 세포들이 포함된다; 기타 유용한 세포들은 효모 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포들이다. 적절한 세균 세포에는 예컨대 대장균, 프로테우스 및 슈도모나스와 같은 그램-음성 세균 균주 바실러스, 스트렙토마이세스, 스타필로코커스 및 락토코커스와 같은 그램-양성 세균 균주가 포함된다. 적절한 진균 세포로는 트리코더마, 뉴로스포라 및 아스퍼질러스 종의 세포들이 포함된다. 적절한 효모 세포에는 사카로마이세스(예컨대 사카로마이세스 세레비지에), 쉬조사카로마이세스 (예컨대 쉬조 사카로마이세스 폼베), 피치아(예컨대 피치아 파스토리스 및 피치아 메타놀리카), 및 한세눌라가 포함된다. 적절한 포유동물 세포에는 예컨대 CHO 세포들, BHK 세포들, HeLa 세포들, COS 세포들, 293 HEK 등이 포함된다. 그러나, 이종 단백질 발현을 위해 기술 분야에서 사용되는 양서동물 세포들, 곤충 세포들, 식물 세포들, 및 그 밖의 다른 세포들 역시도 본 발명에서 사용될 수 있다. 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류와 같은 포유동물 세포들이 후천적인 전달에 특히 적합하다. 세포들은 다수의 조직 종류로부터 유래될 수 있고 여기에는 일차 세포들 및 세포주들 예컨대 면역계 세포들, 특히 항원-제시 세포들 예컨대 수지상 세포들 및 T 세포들, 조혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포들 및 그 밖의 세포 종류가 포함된다. 항원-제시 세포는 그의 표면에서 주요 조직적합성 복합체 관점에서 항원을 나타내는 세포이다. T 세포들은 그의 T세포 수용체 (TCR)을 이용하여 이 복합체를 인식할 수 있다.
본 발명에서 "감소시키다", "저감시키다", "억제하다"의 의미는 어떤 수준, 예컨대 세포의 증식 수준 또는 발현 수준을, 좋게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 좋게는 50% 이상, 및 가장 좋게는 75% 이상 전반적으로 감소시키거나 전반적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다.
"증가시키다" 또는 "증대시키다"라는 용어는 좋기로는 약 적어도 10%, 좋기로는 적어도 20%, 좋기로는 적어도 30%, 더욱 좋기로는 적어도 40%, 더욱 좋기로는 적어도 50%, 더더욱 좋기로는 적어도 80%, 및 가장 좋기로는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상 증가 또는 증대시키는 것에 관한다.
항체 의존성 세포-매개된 세포독성
ADCC는 본 발명에 개시된 것처럼 이펙터 세포들, 특히 임파구들의 세포 살해 능력을 설명하고, 이것은 좋게는 항체에 의해 마킹(mark)되는 표적 세포를 필요로한다.
ADCC는 좋게는 항체들이 종양 세포상에 항원과 결합하고, 항체 Fc 도메인들이 면역 이펙터 세포들의 표면에 Fc 수용체와 관여할 때 일어난다. Fc 수용체들의 몇몇 패밀리는 확인되어왔고, 특이적 세포 집단은 특징적으로 규명된 Fc 수용체들을 발현한다. ADCC는 항원 표시 및 종양 관련된 T 세포 반응의 유도를 가져오는 즉각적인 종양 파괴의 다양한 정도를 직접 유도하기 위한 메카니즘으로서 간주될 수 있다. 좋게는, ADCC의 생체 내 유도는 종양 관련 T 세포 반응들 및 숙주 유래 항체 반응을 가져온다.
보체 의존성 세포독성
CDC는 항체에 의해 지시될 수 있는 다른 세포 살해 방법이다. IgM은 보체 활성을 위한 가장 효과적인 이소형이다. IgG1 및 IgG3는 전형적인 보체활성 경로를 통해 CDC를 지시하는 것에서 매우 효과적이다. 좋게는, 이러한 캐스캐이드(cascade)에서, 항원-항체 복합체들의 형성은 IgG 분자 (C1q는 보체 C1의 3개의 하위인자 중 하나이다)를 비롯한 항체 분자를 참여하는 CH2 도메인상에 가깝게 근접하여 다중 C1q 결합 사이트의 노출을 일으킨다. 좋게는, 이러한 노출된 C1q 결합 사이트는 이전의 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호반응을 높은 애비더티(avidity)로 전환하고, 이것은 다른 일련의 보체 단백질이 관련된 하나의 캐스캐이드 작용을 일으키고, 이펙터 세포 화학주성의/활성제 C3a 및 C5a의 단백질 분해적 방출을 가져온다. 좋게는, 막의 형성에서 보체 캐스캐이드 말단은 복합체를 공격하고, 이것은 세포 내외의 용질 및 물의 자유(free) 통로를 촉진하는 세포 막에서 구멍을 형성한다.
예컨대 VL 및 VH 영역을 제공하는 본 발명의 항체는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature 256: 495 (1975)의 표준 체세포 하이브리다이제이션 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산가능하다. 체세포 혼성화 절차가 선호될 지라도, 주로, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술들이 전개될 수 있다, 예컨대, B-임파구 또는 파지의 바이러스 또는 종양 형질변환은 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 기술을 나타낸다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위한 선호되는 동물 시스템은 쥐과(murine) 계열이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 구축된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 기술분야에서 잘 알려져있다. 융합 파트너 (예컨대, 쥐의 골수종 세포)와 융합 절차는 또한 알려져있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위한 다른 선호되는 동물 시스템은 래트 및 래빗 시스템이다 (예컨대, Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)에 개시됨).
또 다른 바람직한 구체예에서, 인간 모노클로날 항체들은 마우스 시스템 보다 인간 면역 시스템의 부분들을 수행하는 유전자이식(transgenic) 또는 트랜스염색체적(transchromosomal) 마우스를 이용하여 생성가능하다. 이러한 유전자이식 및 트랜스염색체적 마우스는 각각 HuMab 마우스 및 KM 마우스로 알려져 있고, "유전자 이식 마우스"로 본 발명에 집합적으로 언급된다. 그러한 유전자 이식 쥐 내에 인간 항체의 생산은 WO2004 035607에서 CD20을 위한 자세히 기재된 내용으로써 수행될 수 있다.
모노클로날 항체들을 생성하기 위한 또 다른 전략은 예컨대, Babcock et al., 1996; 규정된 특이성의 항체를 생산하는 단일의 분리된 임파구들로부터 모노클로날 항체를 생산하기 위한 신규한 전략을 참고한, 규정된 특이성의 항체를 생산하는 임파구로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접 분리하는 것이다. 재조합 항체 공학의 자세한 내용은 또한 문헌(Welschof 및 Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 및 Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1)을 참고할 것.
항체를 생성하기 위해, 항원 서열, 즉 그 항체을 지향시키고자 하는 서열로부터 유래된 담체-컨쥬게이트된 펩타이드, 기재된 CLDN18.2을 재조합적으로 발현된 풍부한 제조물 또는 그 단편 및/또는 CLDN18.2 또는 그의 단편을 발현하는 세포들로 마우스를 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 항원 또는 그 단편을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 항원의 정제된 또는 풍부한 제조물을 이용한 면역화가 항체를 생성하지 않는 경우에, 마우스는 면역 반응을 촉진하기 위해, 항원을 발현하는 세포들, 예컨대 세포주로 또한 면역화될 수 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와후(retroorbital) 블리즈(bleeds)에 의해 수득되는 혈장 및 혈청 시료로 면역화 프로토콜의 코스로 모니터될 수 있다. 충분한 역가의 면역글로불린을 가진 마우스는 융합에 이용될 수 있다. 마우스는 희생되어, 특이적 항체를 분비하는 하이브리도마의 비율을 증가시키기 위한 비장(spleen) 제거전에 3일 동안 항원 발현 세포들로 복강내 또는 정맥내로 부스트(boost)될 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스들로부터의 림프절 세포들 및 비장림프구를 분리하여, 마우스 골수종 세포주를 비롯한 적절한 불사화된 세포주에 융합시킬 수 있다. 이어서, 결과적으로 나오는 하이브리도마들을 항원 특이적 항체의 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 그리고나서, 각각의 웰들은 항체를 분비하는 하이브리도마를 위한 ELISA에 의해 스크린될 수 있다. 항원 발현 세포들을 이용한 면역형광 및 FACS에 의해, 항원에 특이적인 항체들이 확인될 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마는 리플레이트(replate)될 수 있고, 다시 스크린될 수 있으며, 만약 모노클로날 항체들을 위해 여전히 양성이라면 제한하는 희석에 의해 서브클론될 수 있다. 안정적인 서브클론은 그리고나서 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성하기 위해 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있다.
항체들은 또한 예컨대, 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법들의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
예컨대, 일 구체예에서, 흥미로운 유전자(들), 예컨대, 항체 유전자들은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 기술분야에 잘 알려진 다른 발현 시스템에 의해 사용된 것을 비롯한 진핵 발현 플라스미드를 비롯한 발현 벡터내로 라이게이션 될 수 있다. 클론된 항체 유전자들을 가진 정제된 플라스미드는 CHO 세포들, NS/0 세포들, HEK293T 세포들 또는HEK293 세포들 또는 대안적으로 식물 유래 세포들, 곰팡이 또는 효모 세포들과 같은 다른 진핵 세포들내로 도입될 수 있다. 이러한 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 다른 것들을 비롯한 기술분야에 기재된 방법들일 수 있다. 숙주 세포 내에서 이러한 항체 유전자들의 도입 후에, 항체를 발현하는 세포들은 확인되고 선택된다. 이러한 세포들은 그리고나서 그 발현 수준을 위해 증폭되고, 항체를 생산하기 위해 업스케일(upscale)될 수 있는 트랜스펙토마를 나타낸다. 재조합 항체들은 이러한 배양 상청액 및/또는 세포들로부터 분리되고 정제될 수 있다.
다르게, 클론된 항체 유전자들은 E.coli를 비롯한 미생물을 비롯한 원핵 세포들을 함유하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체들은 쉽(sheep) 또는 래빗으로부터의 우유에서 또는 암탉의 달걀에서와 같은 형질전환 비인간 동물들 또는 형질전환 식물들에서 생산될 수 있다(Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839 참고).
키메라화(Chimerization)
비표지된 쥐의 항체들은 반복적으로 치료적 효과의 감소를 가져올 때 인간 내에서 높은 면역성이다. 쥐의 항체의 면역원성은 중쇄 불변부에 의해 매개된다. 인간에서 쥐의 항체들의 면역원성은 만약 각각의 항체들이 키메라화되거나 인간화되면 감소되거나 완전히 막을 수 있다. 키메라 항체들은 항체들이고, 쥐의 항체로부터 유래된 가변부 및 인간 면역글로불린 불변부를 가지는 것을 비롯한 상이한 동물 종들로부터 유래된 상이한 부분들이다. 항체들의 키메라화는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변영역과 쥐의 항체 중쇄 및 경쇄의 가변부를 결합함에 의해 성취된다 (예컨대, Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8에 의해 개시된). 선호되는 방식으로는, 키메라화된 항체는 인간 카파 경쇄의 불변부를 쥐의 경쇄의 가변부에 결합시킴으로써 생성할 수 있다. 또 다른 선호되는 항체의 키메라화 방식으로는 인간 λ(lambda) 경쇄의 불변부를 쥐의 경쇄의 가변부에 결합시키는 방법이 있다. 키메라화된 항체 생성을 위한 선호되는 중쇄 불변부는 IgG1, IgG3 및 IgG4가 있다. 그 밖에 키메라 항체의 생성을 위해 선호되는 중쇄 불변부으로는 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이 있다.
인간화(Humanization)
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR안에 존재하는 아미노산 잔여물을 통해 우세하게 표적 항원과 반응한다. 이 때문에 CDR 내부의 아미노산 서열들은 CDR 외부의 서열보다 각각의 항체들 사이에서 다양하게 나타난다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원간 반응에 있어 결정적 역할을 하기 때문에, 서로 다른 성질들을 가진 서로 다른 항체로부터의 프래임워크(framework) 서열들 상에 이식되는 특이적으로 일어나는 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특이적 자연적으로 발생하는 항체들의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(e.g., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; 및 Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). 그러한 프래임워크 서열은 생식세포(germline) 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 이러한 생식세포 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 다를 것인데, 이들은 B 세포의 성숙 분열기 동안 V (D) J가 결합됨으로써 생성되는 완전히 결합된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식세포 유전자 서열은 또한 가변부 전체에 고르게 분포된 각각의 고친화도 이차적 레퍼토리 항체와도 다를 것이다.
항원에 결합하는 항체 및 기타 결합제의 능력은 표준 결합분석법(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유세포분석법)을 이용하여 탐지될 수 있다.
항체들을 정제하기 위해, 선택된 생산 세포주들은 재조합 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 자랄 수 있다. 별법으로, 항체들은 투석 기반 생물반응기에서 생산될 수 있다. 상청액은 필터될 수 있고, 만약 필요하다면, 단백질 L-세파로스로 친화도 크로마토그래피 전에 농축될 수 있다. 녹여서 분리된(eluted) IgG는 젤 전기영동 및 순도를 보장하기 위해 고 수행 액체 크로마토그래피에 의해 체크될 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체될 수 있고, 농도는 대응하는 소광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 OD280에 의해 측정된다. 재조합 항체들을 분주하여(aliquote), -80℃에서 보관할 수 있다.
항원을 발현하는 살아있는 세포들에 대한 모노클로날 항체들의 결합을 증명하기 위해, 유세포 분석법이 사용되었다. 천연 또는 형질감염후 CLDN18.2 발현하는 세포주들 및 항원 발현을 결여한 음성 대조군들 (표준 성장 조건에서 자란)은 하이브리도마 상청액들 또는 1% FBS 함유 PBS 내 모노클로날 항체들의 다양한 농도로 혼합될수 있고, 40분동안 4℃에서 인큐베이션 할 수 있다. 세척 후, APC- 또는 Alexa647-표지된 항 IgG 항체는 초기 항체 염색과 같은 조건하에 항원-결합된 모노클로날 항체와 결합할 수 있다. 시료들은 단일, 살아있는 세포들을 게이트(gate)하기 위한 빛 및 사이드 산란 특징(light 및 side scatter properties)들을 이용한 FACS 기구로 유세포 분석법에 의해 분석될 수 있다. 단일 측정에서 비특정 바인더(binder)들로부터 항원-특이적 모노클로날 항체들을 구별하기 위해, 공동-형질감염 방법이 구현될 수 있다. 항원 및 형광 마커를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 세포들은 상기에 기재된 바와 같이 염색될 수 있다. 형질감염된 세포들은 항체-염색된 세포들보다 서로 다른 형광 채널에서 검출될 수 있다. 형질감염된 세포들의 다수가 이식유전자(transgene) 모두를 발현하는 것처럼, 항원-특이적 모노클로날 항체들은 형광 마커 발현 세포들에 선호되게 결합하는 반면, 비특이적 항체들은 비형질감염된 세포들에 비교할만한 비율로 결합한다. 형광 현미경을 이용하는 대안적인 어세이는 유세포 분석법 어세이에 더하여 또는 대신으로 사용될 수 있다. 세포들은 상기한 바와 같이 정확히 염색되고, 형광 현미경에 의해 조사될 수 있다.
항원을 발현하는 살아있는 세포들에 대한 모노클로날 항체들의 결합을 증명하기 위해, 면역 형광 현미경이 사용될 수 있다. 예를 들어 자발적으로, 혹은 형질감염 후에 항원을 발현하는 세포주나 항원 발현을 결여하는 음성대조군은 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100IU/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에서 표준 성장 조건하의 챔버 슬라이드에서 배양된다. 세포들은 그 후 메탄올이나 파라포름알데히드로 고정되거나 미처리된다. 그리고나서 30분간 25℃에서 항원에 대해 모노클로날 항체와 반응하게 된다. 세척 후, 이 세포들은 동일 조건에서 Alexa555 표지된 항-마우스 IgG 2차 항체(Molecular Probes)와 반응하게 된다. 그리고 나서 형광 현미경으로 조사할 수 있다.
항원을 발현하는 세포나 적절한 음성대조군으로부터의 세포추출물을 준비해 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동시킬 수 있다. 전기이동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막으로 이동되어 차단되고, 실험할 모노클로날 항체와 함께 조사된다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 페록시다아제를 사용해 검출되고 ECL 기질로 현상(develop)된다.
항체는 당업자에게는 잘 알려진 방식으로 면역조직화학에 의해, 예컨대, 수술 과정에서 환자로부터, 혹은 자발적으로 또는 형질 감염후, 항원을 발현하는 세포주가 접종된 이종 이식된 종양을 갖고 있는 마우스로부터 얻은 암 없는 조직이나 암 조직 시료들로부터 파라포름알데히드나 아세톤 고정된 크라이오섹션, 또는 파라핀을 함유하고 파라포름알데히드로 고정된 조직 섹션을 사용하는 방식에 의해, 항원에 대한 반응성을 추가적으로 측정할 수 있다. 면역염색을 위해, 항원에 대해 반응성이 있는 항체들을 인큐베이션한 다음 배포업체 지시에 따라 염소 항마우스 또는 염소 항토끼 항체들(DAKO)과 호스래디쉬-퍼옥시다제 컨쥬게이트시킨다.
전임상 연구
CLDN을 발현하는 종양 세포의 성장을 제어하는데 있어서의 효능을 알아보기 위해, 생체내 모델(예컨대 CLDN을 발현하는 세포주가 접종된, 이종이식된 종양을 지니는 면역결핍 마우스에서)에서 본 발명에 설명된 결합제들을 실험할 수 있다.
CLDN 발현 종양 세포를 면역손상 마우스나 다른 동물에 주입한 후의 체내 연구를 본 발명의 결합제를 사용해 수행할 수 있다. 종양의 형성이나 종양 관련 증상을 예방하기 위한 결합의 효과를 측정하기 위해, 종양 없는 마우스에게 결합제들을 투여하고 종양 세포의 투여할 수 있다. 결합제들을 종양이 있는 마우스에 투여하여 종양의 성장, 전이 또는 종양 관련 증상을 줄이기 위한 각각의 결합제의 치료 효능을 측정할 수 있다. 결합제의 적용(application)은 세포 증식 억제제(cystostatic drugs), 성장 인자 억제제, 세포주기 차단제, 혈관신생 억제제 같은 다른 물질과 항체들의 적용을 조합들의 시너지 효과나 잠재적 독성을 측정할 수 있다. 결합제에 의한 독성 부작용을 분석하기 위해 동물에 결합제 또는 대조 시약을 주입하고 CLDN 결합제 치료와 연관이 있을 수 있는 증상에 대해 면밀히 조사할 수 있다.
결합제에 의해 인지되는 에피토프 맵핑을 "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 및 in 'Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay 에 자세히 설명된 대로 수행할 수 있다.
본 발명에 설명된 화합물들과 약제는 적절한 의약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 멸균된 것이 좋고 본 발명에 설명된 결합제의 유효량 및, 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 발생시키기 위해, 임의로 본 발명에 설명된 추가 물질을 함유한다.
의약 조성물은 단위 투여제형으로 대개 제공되며 공지 방식으로 제조될 수 있다. 의약 조성물은 예컨대 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다.
의약 조성물은 염, 완충물질, 보존제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 약학적으로 허용가능한 것이 좋다. "약학적으로 허용가능한"이라 함은 그 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호반응하지 않는, 물질의 비독성을 가리킨다.
약학적으로 허용가능하지 않은 염들을 이용하여 약학적으로 허용가능한 염을 만들 수 있으며 이들 역시 본 발명에 속한다. 이러한 종류의 약학적으로 허용가능한 염에는 다음의 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 알칼리금속 염이나 알칼리토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 완충물질에는 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 인산염이 포함된다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 보존제로는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 들 수 있다.
주사가능한 포뮬레이션은 Ringer Lactate와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
"담체"라는 용어는 활성성분의 적용을 용이화, 증강 또는 가능하게 하기 위해, 활성성분과 조합되는, 천연 또는 합성된 유기 또는 무기 성분을 가리키다. 본 발명에 따라, "담체"는 또한 환자에게 투여하는데 적합한 1 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함하기도 한다.
비경구 투여를 위한 가능한 담체 물질은 예컨대 멸균수, Ringer, Ringer 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소첨가된 나프탈렌 미치 특히, 생물적합성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 코폴리머이다.
본 발명에서 "부형제"라는 용어는 의약 조성물 내에 존재할 수 있으나, 예컨대 담체, 바인더, 윤활제, 농후제, 표면활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 풍미제 또는 착색제와 같이, 활성성분은 아닌 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
본 발명에 설명된 물질과 조성물은 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 투여와 같은 여하한 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 좋기로는 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 또는 근육내를 비롯한 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 활성 화합물의 멸균된 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이것은 수용자의 혈액과 등장성인 것이 좋다. 적합한 담체 및 용매는 Ringer 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 이에 더해, 대개 멸균된 고정 오일(fixed oils)이 용액 또는 현탁액 매질로서 이용된다.
본 발명에 설명된 물질 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 그 단독으로 또는 추가 투여량(doses)과 함께 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 내래 수 있는 양이다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 그 질환의 경과를 억제하는 것에 관한다. 이것은 질병의 진행을 둔화시키는 것, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료시 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 상기 상태의 개시를 둔화시키거나 개시를 방지하는 것일 수도 있다.
본 발명에 설명된 물질 또는 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 상태, 질병의 위중도, 환자의 개별적인 변수, 예컨대 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중, 치료 기간, 부수되는 치료법의 종류(있을 경우), 특정 투여 경로 및 유사 인자들에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에 설명된 물질의 투여량은 이러한 다양한 변수에 따라 달라진다. 만일 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분할 경우, 더 많은 투여량(또는 보다 국소적인, 다른 투여 령로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 발명에 설명된 물질과 조성물은 본 발명에 설명된 것과 같은 다양한 질환을 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 예컨대, 생체내로 투여될 수 있다. 바람직한 환자로는 본 발명에 설명된 물질과 조성물의 투여에 의해 교정 또는 완화될 수 있는 질병에 걸린 인간 환자가 포함된다. 여기에는 CLDN18.2 및/또는 CLDN6과 같은 CLDN의 변경된 발현 패턴에 의해 특징지어지는 세포가 관련된 질병이 포함된다.
예컨대, 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 결합제들을 이용하여 암 질환, 예컨대, CLDN을 발현하는 암 세포의 존재에 의해 특징지어지는 본 발명에 설명된 것과 같은 암질환에 걸린 환자를 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 의약 조성물과 치료 방법은 또한 본 발명에 설명된 질병의 예방을 위한 면역화 또는 백신접종을 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 하나 이상의 아쥬반트와 같은 보조면역증강 물질과 함께 투여될 수 있으며 그의 효능을 증가시키기 위해, 좋기로는 면역촉진의 상승 효과를 달성하기 위해, 1종 이상의 면역-증강 물질을 포함할 수도 있다. 용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 면역반응을 연장, 증강 또는 가속화하는 화합물에 관한 것이다. 다양한 메카니즘들이 아쥬반트의 다양한 종류에 따라 가능하다. 예를 들어, DC의 성숙화를 가능케하는 화합물들, 예컨대 리포폴리사카라이드 또는 CD40 리간드는 적절한 아쥬반트들의 첫번째 클라스를 형성한다. 일반적으로, "위험한 시그널" 유형의 면역시스템에 영향을 미치는 물질 (LPS, GP96, dsRNA etc.) 또는 사이토카인 예컨대 GM-CSF을, 제어된 방식으로 면역반응을 강화시키거나 및/또는 면역반응에 영향을 미칠 수 있는 아쥬반트로서 이용할 수 있다. 비록 전술한 바와 같이 특정 환경 하에서 일어나는 부작용을 감안하여야 하기는 하지만, CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드 역시 이와 관련하여 임의로 사용될 수 있다. 특히 바람직한 아쥬반트로는 사이토카인, 예컨대 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF알파, INF-γ, GM-CSF, LT-알파, 또는 성장인자, 예컨대 hGH를 들 수 있다. 또 다른 공지의 아쥬반트로는 수산화알루미늄, 프로인드 아쥬반트 또는 Montanide
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와 같은 오일을 들 수 있고, 가장 좋기로는 Montanide
Figure 112021041708355-pat00002
ISA51이 바람직하다. Pam3Cys와 같은 리포펩타이드 역시도 본 발명의 의약 조성물에서 아쥬반트로서 사용하기에 적합하다. 본 발명에 제공된 물질 및 조성물들은 단독으로 또는 통상적인 치료법, 예컨대 외과수술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수이식(자가, 동계, 동종이계 또는 무관련)과 같은 치료법과 조합적으로 사용될 수도 있다.
암의 치료는 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 항암제/치료법의 조합 작용이 흔히 단일요법 접근의 효과에 비해 훨씬 더 강력하게 상승효과를 생성하기 때문에, 조합 전략이 특히 바람직한 분야이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 의약 조성물과 같은 면역 또는 백신접종-기반 메카니즘을 이용하는 암 치료법을 유사하거나 다른 특이적 메카니즘을 표적화하는 다양한 다른 약물 및/방법과 효과적으로 조합시킬 수 있다. 이들의 예로는 예컨대 통상적인 종양치료법, 다중-에피토프 전략, 부가적인 면역요법 및 혈관신생 또는 세포자멸사를 표적으로 하는 치료적 접근을 들 수 있다(검토를 위해 예컨대, Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743 참조). 상이한 물질을 순차 투여하여 상이한 검토시점에서 암세포 성장을 억제할 수 있는 한편, 다른 제제들은 예컨대 새로운 혈관신생, 악세포들의 생존 또는 잠재적으로 암을 만성 질환으로 전환시키는 전이를 억제할 수 있다. 다음의 리스트들은 항암제 및 치료법의 몇몇 비제한적인 예를 제공하며 이들은 본 발명에서 조합적으로 사용가능하다:
1. 화학요법(Chemotherapy)
화학요법은 여러 가지 종류의 암의 표준 치료법이다. 가장 흔한 화학요법 약물은 암세포들의 주요 특성 중 하나인 급속히 분열하는 세포들을 사멸시킴으로써 작용한다. 따라서, 통상적인 화학요법 약물 예컨대 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제 및 세포 분열 또는 DNA 합성에 영향을 미치는 기타 항종양제와 같은 통상적인 화학요법제는 억제자 세포들을 소거하고, 면역계를 재부팅하며, 종양 세포들로 하여금 면역매개된 사멸에 대해 보다 감수성을 갖도록 하거나, 또는 면역계의 세포들을 부가적으로 활성화시키는 것을 조합적으로 이용함으로써, 본 발명의 치료효과를 유의적으로 향상시킬 수 있다. 화학요법 약물 및 백신접종-기반 면역치료약물의 상승적 항암작용은 여러가지 연구를 통해 입증된 바 있다(예컨대 Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33 참조; 또한 Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979 참조; 또한 Hirooka et al 2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74 참조). 복합 치료법에 기본적으로 적합한 화학요법약물로서 이용가능한 약물이 수백가지 존재한다. 본 발명에 조합 사용가능한 이러한 화학요법 약물의 몇몇(비제한적인) 예로는 카르보플라틴(파라플라틴), 시스플라틴(플라티놀, 플라티놀-AQ), 시클로포스파미드(시톡산, 네오사르), 도세탁셀(탁소티어), 독소루비신(아드리아마이신), 엘로티닙(타르세바), 에토포사이드(베페시드), 플루오로우라실(5-FU), 겜시타빈(겜자), 이마티닙 메실레이트(글리벡), 이리노테칸(캄토사르), 메토트렉세이트(폴렉스, 멕세이트, 아메토프테린), 파클리탁셀(탁솔, 아브락산), 소라피닙(넥사바), 수니티닙(수텐트), 토포테칸(하이캄틴), 빈크리스틴(온코빈, 빈카사르 PFS), 및 빈블라스틴(벨반)을 들 수 있다.
2. 외과적 수술(Surgery)
암 외과 적수술 - 종양을 제거하기 위한 수술 - 은 여전히 암 치료의 근간이 되는 치료방법으로서 남아있다. 외과적 수술은 잔류하는 여하한 종양 세포들을 제거하기 위해 다르느 암 치료법과 조합될 수 있다. 외과적 수술방법 후에 면역치료법을 조합시키는 것은 수없이 많이 유망한 치료적 접근법인 것으로 입증되어 왔다.
3. Radiation(방사선 치료법)
방사선 치료법은 모든 암 환자의 대략 50%가 그의 투병 기간 동안 방사능 치료를 받을 정도로 암 치료에 있어서 중요한 요소로 남아있다. 방사선 치료법의 주목적은 암세포들로부터 그의 잠재적인 복제능(세포분열)을 제거하는 데 있다. 암 치료에 사용되는 방사선의 종류로는 광자(photon) 방사선 치료(x선 및 γ선) 및 입자 방사선요법(전자, 양성자 및 중성자 빔)을 들 수 있다. 암 부위에 방사선으르 전달하는데는 2 가지 방법이 있다. 즉, 고에너지선(광자, 양성자 또는 입자 방사선조사)을 종양 부위에 표적화함으로써 체외로부터 외부 빔을 조사 전달하는 방법이 그 하나이다. 다른 한 가지는 내부 방사선 조사 또는 근접치료(brachytherapy)로서 이 방법은 카테터 또는 씨드 내에 봉입된 방사선원을 체내로부터 종양 부위로 전달하는 것이다. 본 발명에 조합사용될 수 있는 방사선 요법 기술에는 예컨대 분획화(fractionation: 분획화된 영역 내로 전달되는 방사선 요법, 예컨대 수 주일에 걸쳐 주 1.5 내지 3 Gy 분획의 선량을 매일 조사함), 3D 입체배열 방사선 요법(3DCRT; 육안적 종양체적에 방사선을 전달), 강도조절 방사선 요법(IMRT; 다양한 방사선 빔의 컴퓨터-제어된 강도 조절), 영상 가이드형 방사선요법(IGRT; 보정이 가능하능한 예비-방사선요법 조영을 포함하는 기술), 및 입체 체형 방사선 요법(SRBT, 단지 몇몇 치료 분획에 대해서만 매우 높은 선량의 방사선을 전달함)이 포함된다. 방사선 요법에 관한 보다 자세한 내용은 Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199를 참조할 것.
4. 항체(Antibodies)
항체들(좋기로는 모노클로날 항체들)은 다양한 메카니즘을 통해 암세포들에 대한 치료 효과를 거둔다. 이들은 세포자멸사의 발생 또는 프로그램된 세포 사멸을 직접적으로 일으킬 수 있다. 이들은 종양세포들의 증식을 효과적으로 정지시키는 예컨대 성장인자 수용체와 같은 시그널 형질도입(transduction) 경로의 성분을 차단할 수 있다. 모노클로날 항체들을 발현하는 세포들에서, 이들은 항이디오타입 항체 형성을 야기할 수 있다. 간접 효과에는 단핵구 및 식세포와 같이 세포독성을 갖는 세포들을 동원(recruiting)하는 것이 포함된다. 항체-매개된 세포 사멸의 이러한 유형은 항체-의존성 세포 매개형 세포독성 (ADCC)이라 부른다. 항체는 또한 보체에도 결합하여, 보체 의존성 세포독성(CDC)라고 알려진 직접적이니 세포 독성을 유도하기도 한다. 외과적 수술법을 면역치료 약물 또는 방법과 조합하는 것은 예컨대 문헌 [Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40]에 입증된 바와 같이 성공적인 접근법이다. 다음의 리스트는 항암제 항체의 몇몇 비제한적인 예와 본 발명에서 조합 사용가능한 잠재적인 항체 표적(괄호 안)을 나타낸다: 아바고맙(CA-125), 아브식시맙(CD41), 아베카투무맙(EpCAM), 아푸투주맙(CD20), 알라시주맙 페골(VEGFR2), 알투모맙 펜테테이트(CEA), 아마툭시맙(MORAb-009), 아나투무맙 마페나톡스 (TAG-72), 아폴리주맙(HLA-DR), 아르시투모맙(CEA), 바비툭시맙(포스파티딜세린), 벡투모맙(CD22), 벨리무맙(BAFF), 베바시주맙(VEGF-A), 바이바투주맙 메르탄신(CD44 v6), 블리나투모맙(CD19), 브렌툭시맙 베도틴(CD30 TNFRSF8), 칸투주맙 메르탄신(뮤신 CanAg), 칸투주맙 라브탄신(MUC1), 카프로맙 펜데타이드 (전립선 암종 세포들), 칼루맙(CNTO888), 카투막소맙(EpCAM, CD3), 세툭시맙(EGFR), 시타투주맙 보가톡스(EpCAM), 식수투무맙(IGF-1 수용체), 클라우딕시맙(클라우딘), 클리바투주맙 테트락세탄(MUC1), 코나투무맙(TRAIL-R2), 다세투주맙(CD40), 달로투주맙(인슐린-유사 성장인자 I 수용체), 데노수맙(RANKL), 데투모맙(B-림프종 세포), 드로지투맙(DR5), 에크로멕시맙(GD3 강글리오사이드), 에드레콜로맙(EpCAM), 엘로투주맙(SLAMF7), 에나바투주맙(PDL192), 엔시툭시맙(NPC-1C), 에프라투주맙 (CD22), 에르투막조맙(HER2/neu, CD3), 에타라시주맙 (인테그린 알파vβ3), 팔레투주맙(폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), 피클라투주맙(SCH 900105), 피지투무맙(IGF-1 수용체), 플란보투맙(당단백질 75), 프레솔리무맙(TGF-β), 갈릭시맙(CD80), 가니투맙(IGF-I), 겐투주맙 오조가미신(CD33), 게보키주맙(IL-1β), 기렌툭시맙(탄산탈수소효소 9 (CA-IX)), 글렘바투무맙 베도틴(GPNMB), 이브리투모맙 티욱세탄(CD20), 이크루쿠맙(VEGFR-1), 이고보마(CA-125), 인다툭시맙 라브탄신(SDC1), 인테투무맙(CD51), 이노투주맙 오조가미신(CD22), 이필리무맙(CD152), 이라투무맙(CD30), 라베투주맙(CEA), 렉사투무맙(TRAIL-R2), 리비비루맙(B형 간염 표면 항원), 린투주맙(CD33), 로보투주맙 메르탄신(CD56), 루카투무맙(CD40), 루밀릭시맙(CD23), 마파투무맙(TRAIL-R1), 마투주맙(EGFR), 메폴리주맙(IL-5), 밀라투주맙(CD74), 미투모맙(GD3 강글리오사이드), 모가물리주맙(CCR4), 목세투모맙 파수도톡스(CD22), 나콜로맙 타페나톡스(C242 항원), 납투모맙 에스타페나톡스(5T4), 나르나투맙(RON), 네시투무맙(EGFR), 니모투주맙(EGFR), 니볼루맙(IgG4), 오파투무맙(CD20), 오라라투맙(PDGF-R 알파), 오나르투주맙(인간 스캐터 인자 수용체 키나아제), 오포르투주맙 모나톡스(EpCAM), 오레고보맙(CA-125), 옥셀루맙(OX-40), 파니투무맙(EGFR), 파트리투맙(HER3), 펨투모마(MUC1), 페르투주맙(HER2/neu), 핀투모맙(선암종 항원), 프리투무맙(비멘틴), 라코투모맙 (N-글리콜릴뉴라민산), 라드레투맙(피브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라피비루맙(라비에스 바이러스 당단백질), 라무시루맙(VEGFR2), 릴로투무맙(HGF), 리툭시맙(CD20), 로바투무맙(IGF-1 수용체), 사말리주맙(CD200), 시브로투주맙(FAP), 실툭시맙(IL-6), 타발루맙(BAFF), 타카투주맙 테트락세탄(알파-태아단백질), 타플리투모맙 팝톡스(CD19), 테나투모맙(테나신 C), 테프로투무맙(CD221), 티실리무맙(CTLA-4), 티가투주맙(TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), 토시투모맙(CD20), 트라스투주맙(HER2/neu), TRBS07 (GD2), 트레멜리무맙(CTLA-4), 투모투주맙 셀모류킨(EpCAM), 유블리툭시맙(MS4A1), 유렐루맙(4-1BB), 볼로식시맙(인테그린 알파5β1), 보투무맙(종양 항원 CTAA16.88), 잘루투무맙(EGFR), 자놀리무맙(CD4).
5. 사이토카인, 케모카인, 공자극 분자, 융합 단백질
이로운 면역조절 또는 종양 억제 효과를 일으키기 위해 본 발명의 항원-코딩 의약 조성물과 사이토카인, 케모카인, 공자극 분자 및/또는 융합 단백질들을 조합 사용하는 것은 본 발명의 또 다른 구체예이다. 면역세포들의 종양 내로의 침윤을 증가시키고 항원-제시 세포들의 종양-배출 림프절로의 이동을 용이하게 하기 위해, C, CC, CXC 및 CX3C 구조를 갖는 다양한 케모카인이 이용될 수 있다. 가장 유망한 케모카인의 몇몇 예는 예컨대 CCR7 그의 리간드 CCL19 및 CCL21, 또한 CCL2, CCL3, CCL5, 및 CCL16이다. 그 밖의 예로는 CXCR4, CXCR7 및 CXCL12를 들 수 있다. 또한, B7 리간드(B7.1 및 B7.2)와 같은 공자극 또는 조절 분자가 유용하다. 또한 사이토카인 예컨대 인터류킨 특히(예컨대 IL-1 내지 IL17), 인터페론(예컨대 IFNalpha1 내지 IFNalpha8, IFNalpha10, IFNalpha13, IFNalpha14, IFNalpha16, IFNalpha17, IFNalpha21, IFNbeta1, IFNW, IFNE1 및 IFNK), 조혈인자, TGFs (예컨대 TGF-알파, TGF-β, 및 TGF 패밀리의 기타 멤버), 마지막으로 수용체의 종양괴사인자 패밀리 멤버 및 이들의 리간드 그리고 비제한적인 예로서 4-1BB, 4-1BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.β.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT, 및 CD95 (Fas/APO-1), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질, TNF 수용체-관련 세포자멸사-매개 단백질 (TRAMP) 및 사멸 수용체-6 (DR6)를 비롯한 기타 자극 분자들도 유용하다. 특히 CD40/CD40L 및 OX40/OX40L은 T 세포 생존 및 증식에 대한 이들의 직접적인 영향으로 인해 복합 면역요법에서 중요한 표적이 된다. 이에 대한 보다 구체적인 검토를 위해서는 문헌 [Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340]을 참조할 것.
6. 세균 치료(Bacterial treatments)
여러 연구들에서 산소가 부족한 종양 내부를 소비하기 위해 클로스트리듐 노비이 같은 혐기성 세균이 이용되었다. 이들은 종양의 산소화된 부분과 접촉시 죽게 되는데, 이는, 이들이 체내 나머지 부분에 대해서는 무해함을 의미한다. 또 다른 전략은 비독성 전구약물을 독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소로 형질전환된 혐기성 세균을 이용하는 것이다. 종양의 괴사 부분 및 저산소 부분에서 세균이 증식함에 따라, 이 효소는 종양에서만 발현된다. 따라서, 전신투여된 전구약물은 오직 종양에서만 독성 약물이 되도록 대사된다. 이것은 비병원성 혐기미생물인 클로스트리듐 스포로제네스의 이용에 따라 유용한 것으로 입증되었다.
7. 키나아제 억제제(Kinase inhibitors)
상보적인 암 치료법에 있어서 또 다른 커다란 잠재적인 표적 그룹은 키나아제 억제제인데 이는, 암세포의 성장 및 생존이 키나아제 활성의 탈조절과 밀접히 연관되어 있기 때문이다. 정상적인 키나아제 활성을 회복하고 그에 따라 종양 성장을 감소시키기 위해 광범한 억제제가 사용되고 있다. 표적화된 키나아제 그룹에는 수용체 티로신 키나아제 예컨대 BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF-IR, PDGFR-알파, PDGFR-β, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, FGFR4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, 세포질 티로신 키나아제 예컨대 c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, 세린/쓰레오닌 키나아제 예컨대 ATM, Aurora A & B, CDKs, mTOR, PKCi, PLKs, b-Raf, S6K, STK11/LKB1 및 지질 키나아제 예컨대 PI3K, SK1이 포함된다. 소분자 키나아제 억제제로는 예컨대 PHA-739358, 닐로티닙, 다사티닙 및 PD166326, NSC 743411, 라파티닙(GW-572016), 카네르티닙(CI-1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 수텐트(SU11248), 소라페닙(BAY 43-9006) 및 레플루노마이드(SU101)를 들 수 있다. 보다 상세한 정보를 찾기를 원하면 예컨대 Zhang et al. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39을 참조할 것.
8. Toll-유사 수용체(Toll-like receptrs)
Toll-유사 수용체 (TLRs) 패밀리의 멤버들은 선천성 면역과 후천선 면역간의 중요한 연결고리로서 많은 아쥬반트들의 효과가 TLR의 활성화에 달려있다. 암에 대하여 수립된 백신들의 다수가 백신 반응의 부스팅을 위해 TLR에 대한 리간드를 포함한다. 그 밖에도 TLR2, TLR3, TLR4 특히 TLR7 및 TLR 8이 수동면역치료적 접근법에서 암 치료에 시험된 바 있다. 밀접하게 관련된 TLR7 및 TLR8은 면역 세포, 종양 세포들, 및 종양의 미세환경에 영향을 미침으로서 항종양 반응에 기여하고 뉴클레오사이드 유사체 구조에 의해 활성화될 수도 있다. 모든 TLR들은 단독으로 면역요법에 또는 암 백신 아쥬반트에 사용되어왔으며 본 발명의 포뮬레이션 및 방법에 상승적으로 조합사용될 수 있다. 보다 자세한 정보를 알고 싶으면 van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55을 참조할 것.
9. 혈관생성 억제제(Angiogenesis inhibitors)
종양-매개된 탈출 메카니즘 및 면역 억제에 의해 영향을 받는 면역조절 수용체를 표적화하는 치료법에 더해 종양 환경을 표적으로 하는 치료법도 있다. 혈관생성 억제제는 종양이 성장하는데 필요한 혈관의 광범위 성장(혈관생성)을 예방한다. 예컨대 종양의 증가일로에 있는 영양 요구성 및 산소 요구성을 만족시키기 위해 종양 세포들에 의해 촉진된 혈관생성은 다른 분자들을 표적화함으로써 차단될 수 있다. 본 발명과 조합 사용가능한 혈관생성-매개 분자 또는 혈관생성 억제제의 비제한적인 예로는 가용성 VEGF (VEGF 이소폼 VEGF121 및 VEGF165, 수용체 VEGFR1, VEGFR2 및 co-수용체 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2) 1 및 NRP-1, 안지오포이에틴 2, TSP-1 및 TSP-2, 안지오스타틴 및 관련 분자, 엔도스타틴, 바소스타틴, 칼레티큘린, 혈소판인자-4, TIMP 및 CDAI, Meth-1 및 Meth-2, IFN-알파, -β 및 -γ, CXCL10, IL-4, -12 및 -18, 프로트롬빈(크링글 도메인-2), 항트롬빈 III 단편, 프로락틴, VEGI, SPARC, 오스테오폰틴, 마스핀, 칸스타틴, 프롤리페린-관련 단백질, 레스틴 및 약물 예컨대 베바시주맙, 이트라코나졸, 카르복시아미도트리아졸, TNP-470, CM101, IFN-알파, 혈소판인자-4, 수라민, SU5416, 트롬보스폰딘, VEGFR 길항제, 혈관생성저해(angiostatic) 스테로이드 + 헤파린, 연골-유도 혈관생성 억제제 인자, 매트릭스 메탈로단백질분해효소 억제제, 2-메톡시에스트라디올, 테코갈란, 테트라티오몰리브데이트, 탈리도마이드, 트롬보스폰딘, 프로락틴알파 Vβ3 억제제, 리노마이드, 타스퀴니모드를 들 수 있다. 이에 대한 보다 자세한 정보는 Schoenfeld 및 Dranoff 2011: 항angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81를 참조할 수 있다.
10. 소분자 표적요법 약물(Small molecule targeted therapy drugs)
소분자 표적요법 약물은 일반적으로 암세포 내의 돌연변이된, 과발현된, 또는 달리 중요한 단백질들의 효소 도메인의 억제제이다. 이들의 주요한 예로는 티로신 키나아제 억제제 이마티닙(글리벡(Gleevec/Glivec)) 및 게피티닙(이레사)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 암 치료를 위해 백신과 조합되어 몇몇 키나아제를 표적화하는 소분자 예컨대 수니티닙 말레이트 및/또는 소라페닙 토실레이트의 용도는 이전의 특허출원 US2009004213에 잘 설명되어 있다.
11. 바이러스-기반 백신(Virus-based vaccines)
본 발명의 포뮬레이션과 조합 치료법 접근에 함께 사용될 수 있는 몇몇 바이러스-기반 암 백신이 현재 이용가능하거나 또는 개발 중에 있다. 이러한 바이러스 벡터를 사용하는 한 가지 장점은 면역활성화에 필요한 위험 시그널을 발생시키는 바이러스 감염의 결과로서 일어나는 염증반응과 함께, 면역 반응을 개시하는 이들의 고유한 능력이다. 이상적인 바이러스 벡터는 안전하여야 할 뿐 아니라 항종양 특이적인 반응을 부스팅할 수 있도록 항벡터 면역반응을 도입하지 않아야 한다. 재조합 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 아비폭스 바이러스가 동물 종양 모델에 사용되어 왔으며 이들의 고무적인 결과에 기초하여, 인간을 대상으로 한 임상시험이 개시되었다. 특히 중요한 바이러스-기반 백신은 바이러스-유사 입자(VLP), 바이러스의 외피로부터의 특정 단백질을 함유하는 작은 입자들이다. 바이러스-유사 입자들은 바이러스로부터의 유전 물질은 함유하지 않으며 감염을 일으키지 못하지만 그들의 외피 상에 종양 항원들을 제시하도록 구축될 수 있다. VLP는 다양한 바이러스들, 예컨대 B형 간염 바이러스 또는 파보바이러스(예컨대 아데노-관련 바이러스), 레트로바이러스(예컨대 HIV) 및 플라비바이러스(예컨대 C형 간염 바일스)를 비롯한 다른 바이러스 패밀리로부터 유래할 수 있다. 일반적인 검토를 위해서는 문헌[Sorensen 및 Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177-93; virus-like particles against cancer are reviewed in Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569-83; 및 Guillen et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133]을 참조할 수 있다.
12. 다중-에피토프 전략(Multi-epitope strategies)
다중 에피토프의 사용은 백신접종에 유망한 결과를 나타낸다. 지능적 알고리듬 시스템과 연계된 패스트 시퀀싱 기술을 이용함으로서 종양 뮤타놈(mutanome)을 이용할 수 있고 본 발명과 조합가능한 개별화된 백신에 대한 다중 에피토프를 제공할 수 있다. 보다 자세한 정보는 문헌 [2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762-772; furthermore Castle et al. 2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5):1081-91]을 참조할 수 있다.
13. 후천적 T 세포 전달(Adoptive T cell transfer)
예를 들어, 종양 항원 백신접종 및 T 세포 전달의 조합이 다음 문헌에 설명되어 있다: Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788-97.
14. 펩타이드-기반 표적 치료법(Peptide-based target therapies)
펩타이드들은 세포 표면 수용체에 결합하거나 또는 종양을 둘러싼 영향을 받은 세포외 매트릭스에 결합할 수 있다. 이들 펩타이드에 부착된 방사성핵종(예컨대 RGDs)는 상기 방사성핵종이 세포 근방에서 붕괴할 경우 종국적으로 그 암세포를 사멸시킨다. 특히 이들 결합 모티프의 올리고머 또는 멀티머들은 매우 흥미로운데, 이는 이것이 증가된 종양 특이성 및 결합활성(avidity)를 유도할 수 있기 때문이다. 이의 비제한적인 예는 문헌 [Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and maligmant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61]에 설명되어 있다.
15. 기타 치료법
다른 수 많은 암 치료법을 본 발명의 포뮬레이션 및 방법과 조합할 수 있다. 이의 비제한적인 예로는 세포자멸사 표적화, 온열요법, 호르몬 요법, 텔로머라제 요법, 인슐린 강화 치료법, 유전자치료법 및 광역학 치료법을 들 수 있다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예 범위로 국한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: CLDN18.2 및 CD3을 타겟팅하는 이중특이 결합제의 제조 및 테스팅
a. 서열 오리진, bi-scFv 구조물의 고안, 및 발현 벡터로의 클로닝
인간 T 세포 수용체 구성성분 CD3 및 인간 종양 관련된 항원 (TAA)에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이 탠덤 단일 사슬 항체 구조물들 (bi-scFv)을 제조하였다. 각 구조물에 대해 상응하는 중쇄 가변부 (VH) 및 상응하는 경쇄 가변부 (VL)을 N-말단부터 C-말단까지 연속적인 순서로 특이적으로 배열시켰다:
N - VH αCLDN18.2 - VL αCLDN18.2 - VH αCD3 - VL αCD3-C (1BiMAB, 18PHU5, 번호 11-15)
N - VH αCD3 - VL αCD3 - VH αCLDN18.2 - VL αCLDN18.2-C (18PHU3, 번호 16-20)
표 1은 본 발명의 과정에서 제조되었던 TAA CLDN18.2 및 PLAC1에 특이적인 모든 bi-scFv 구조물들을 요약하고 있다. 상기 bi-scFv 구조물들은 상기 상응하는 항체의 VH 및 VL 서열들을 이용하는 GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Germany)에 의한 유전자 합성을 통해 제조하였다. 호모 사피엔스 (HS), 무스 무스큘러스 (MM), 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 같은 코돈 최적화는 GeneArt의 GeneOptimizer® 소프트웨어에 의해 실시하였으며, 표 1에 나열되어 있다. 모든 적용된 도메인들의 특이성, 단일클론 항체 (mAB)으로부터 유래된 서열 오리진, 코돈 이용, 추가적인 서열 특징 및 레퍼런스에 대한 정보는 표 2에 요약되어 있다. 각 CD3 항체들의 가변 도메인 서열 오리진은 표 2에 나열되어 있다. 인간 및 마우스 TAAs의 높은 상동성으로 인해, 동일한 항-TAA VH 및 VL 서열들이 마우스 어세이를 위한 bi-scFv 구조물들의 제조에 이용될 수 있지만, 마우스 특이적 항-CD3 항체 클론 145-2C11의 VH, VL 서열들과 조합하여 이용될 수 있다.
DNA 클로닝 및 발현 벡터 구축은 당업자에게 잘 알려진 표준 과정 (Green/Sambrook, Molecular Cloning, 2012)에 따라 실시하였다. 간략하게는, 리드오프(leadoff) bi-scFv DNA 서열들은 발현 플라스미드 내로의 클로닝을 위한 5' HindIII 및 3' XhoI 제한효소 위치 (bi-scFv 1BiMAB의 경우 HindIII 및 XbaI)를 가지도록 제조하였다. 세포 내 세포질부터 배양 배지로의 단백질 분비를 위해 분비 시그널 서열이 bi-scFv 서열의 5' 말단 업스트림에 도입되었다. 15 내지 18개 아미노산의 유연한 글리신-세린 펩타이드 링커를 코딩하는 서열이 단일 사슬 가변 항체 단편 (scFv)의 구성을 위한 VH 및 VL 도메인들을 결합시키기 위해 삽입되었는데, 상기 도메인들 중 하나는 CD3에 결합하고 다른 하나는 TAA에 결합한다. 이중특이 단일 사슬 항체를 형성하기 위해, 두 개의 scFv 도메인 서열들이 숏 펩타이드 링커 (GGGGS)를 코딩하는 서열에 의해 연결되었다. 이러한 링커 서열과 함께 이후 bi-scFv 구조물들의 클로닝을 위한 scFv 도메인 교환을 위해 BamHI 제한효소 위치를 도입하였다. 보다 상세하게는, 5' scFv-도메인들을 HindIII 및 BamHI 제한효소에 의해 교환시킬 수 있고 3' scFv-도메인들을 BamHI 및 XhoI 제한효소에 의해 교환시킬 수 있다. 또한 구축 개요에 대해서는 도 1을 보라.
모든 이용된 bi-scFv 항체 구조물들을 표준 포유동물 발현 벡터 pcDNA™3.1/myc-His (+) (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) 내로 클로닝하였다. 상기 C-말단 6xHis-tag은 상기 단백질의 금속 친화도 정제 및 검출 분석에 이용하였다. 모든 구조물들은 MWG'의 단일 판독 서열 서비스 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany)를 통한 시퀀싱에 의해 확인하였다.
표 1: TAA 및 CD3 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구조물들의 요약
내부 명칭 TAA 특이성 5'-VH-VL 3'-VH-VL 코돈 이용
1BiMAB CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 HS
번호 11 CLDN18.2 마우스 mCLDN18.2ab 145-2C11 CHO
번호 12 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab UCHT1-HU CHO
번호 13 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab UCHT1 CHO
번호 14 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab CLB-T3 CHO
번호 15 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 CHO
번호 16 CLDN18.2 마우스 145-2C11 mCLDN18.2ab CHO
번호 17 CLDN18.2 인간 UCHT1-HU mCLDN18.2ab CHO
번호 18 CLDN18.2 인간 UCHT1 mCLDN18.2ab CHO
번호 19 CLDN18.2 인간 CLB-T3 mCLDN18.2ab CHO
번호 20 CLDN18.2 인간 TR66 mCLDN18.2ab CHO
18PHU5 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 HS
18PHU3 CLDN18.2 인간 TR66 mCLDN18.2ab HS
18PMU5 CLDN18.2 마우스 mCLDN18.2ab 145-2C11 MM
18PMU3 CLDN18.2 마우스 145-2C11 mCLDN18.2ab MM
대조군 bi-scFv
번호 35 PLAC1 인간 78H11 TR66 CHO
CHO, 중국 햄스터 난소; HS, 호모 사피엔스; HU, 인간화된; MM, 무스(Mus)
표 2: bi-scFv 구조물 정보의 요약
Figure 112021041708355-pat00003
표 2 계속
Figure 112021041708355-pat00004
CHO는 중국 햄스터 난소를 나타낸다; HS, 호모 사피엔스; mAB, 단일클론 항체; MM, 무스 무스큘러스; TAA, 종양 관련된 항원.
b. 안정적인 생산자 세포주들의 제조
CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질의 안정적인 생산자 세포 클론들을 제조하기 위해, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 (ATCC CRL-1573) 및 중국 햄스터 난소 세포주 CHO-K1 (ATCC CCL-61)을 이용하였다.
HEK293 트랜스펙션
트랜스펙션 2일 전에 1x107 HEK293 세포를 14.5 cm 조직 배양 디쉬에 20 ml의 완전 DMEM 배지 (10% 열 불활성화된 FBS 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax; 모든 시약들 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 플레이팅하였다. 트랜스펙션 전에, 세포들을 2 mM EDTA가 보충된 DPBS로 세척한 후 FBS 또는 항생제 없는 20 ml의 플레인(plain) DMEM 배지를 첨가하였다. 실시예 1.a에 기재된 구조물들의 선형화된 DNA 20 μg을 0.5 ml 플레인 DMEM/F-12 배지에 희석하였다. 75 μl의 1 mg/ml 선형 PEI 용액 (폴리에틸렌이미드; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Germany)을 상기 희석된 DNA에 첨가하여 격하게 볼텍싱하였다. 상온에서 15분 반응시킨 후, DNA/PEI 복합체들을 한 방울씩 세포에 첨가하였고, 세포 배양 디쉬를 약하게 회전시켜준 후, 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에 배지를 바꿨다. 트랜스펙션된 세포의 선택은 최종 농도 0.8 mg/ml의 G418 술페이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 트랜스펙션하고 48시간 후에 시작하였다. 세포 배양 동안 세포 배지에 G418을 영구적으로 첨가하였다.
CHO-K1 트랜스펙션
트랜스펙션 하루 전에 1x106 CHO-K1 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에 2 ml의 완전 DMEM 배지 (항생제 없는 10% 열 불활성화된 FBS가 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax; 모든 시약들 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 플레이팅하였다. 트랜스펙션 전에, 세포들을 2 mM EDTA가 보충된 DPBS로 세척한 후 FBS 또는 항생제 없는 1.5 ml의 플레인 DMEM 배지를 첨가하였다. 실시예 1.a에 기재된 구조물들의 선형화된 DNA 4 μg을 0.25 ml 플레인 DMEM/F-12 배지에 희석하여 부드럽게 혼합하였다. 두 번째 반응 튜브에서, 2.5 μl의 리포펙타민 2000 (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)에 희석하여 부드럽게 혼합하고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 DNA/리포펙타민 2000 복합체들을 1:1 비율에서 조합하여 부드럽게 혼합하고 상온에서 20분 동안 반응시켰다.DNA/리포펙타민 2000 복합체를 한 방울씩 세포에 첨가하였고, 세포 배양 디쉬를 약하게 회전시켜준 후, 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 트랜스펙션 6시간 후에 상기 배지를 완전 DMEM/F-12 배지로 바꿨다. 세포를 다음의 날에 1:10 비율로 나누었다. 트랜스펙션된 세포의 선택은 최종 농도 0.5 mg/ml의 G418 술페이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 트랜스펙션하고 48시간 후에 시작하였다. 세포 배양 동안 세포 배지에 G418을 영구적으로 첨가하였다.
c. 생산자 세포로서 HEK293의 선택
실시예 1.b에 기재된 안정적으로 트랜스펙션된 HEK293 및 CHO-K1 세포주들에 의한 bi-scFv 단백질의 발현은 면역형광 염색으로 특징화됨으로써 표준 과정 (Current Protocols in Immunology, 2012)에 따라 bi-scFv 발현을 검출하였다. 간략하게는, 2x105 세포를 24시간 동안 유리 슬라이드 위에서 배양한 후 2% PFA로 투과되었다. 5% BSA 및 0.2% 사포닌이 첨가된 DPBS는 블락킹 완충액으로 이용하였다. DPBS로 세척하고 블랏킹 완충액으로 블락킹한 후, 세포를 블락킹 완충액에 1:500으로 희석된 일차 항체 항-HIS 에피토프-택 (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)과 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액으로 세척한 후, 블락킹 완충액에 1:500으로 희석된 이차 Cy3-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 IgG (H+L) 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)를 첨가하고 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액 및 H2O로 세척한 후, 세포를 Hoechst 33342 다이 (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)가 보충된 DAKO-마운팅 배지 (Dako, Carpinteria, CA, USA)에 임베드시켰다. bi-scFv 양성 세포의 존재에 대해 슬라이드를 조사하고 Nikon-Eclipse Ti 형광 현미경을 이용하여 사진을 찍었다 (데이터를 보이지 않음). HEK293 세포는 CHO-K1 세포보다 전체적으로 더 많은 bi-scFv 단백질의 발현을 보였고 이에 따라 생산자 세포주로 선택하였다.
d. HEK293 클론 #28에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 생산 및 검출
생산될 첫 번째 bi-scFv 단백질로서 Bi-scFv 1BiMAB를 선택하여 정제하고 다양한 어세이들의 확립을 위해 사용하였다. 이러한 목적을 위해, FACSAria 세포 분류기 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용한 단일 세포 분류에 의해 1BiMAB를 안정적으로 발현하는 HEK293 벌크 세포의 클론성 세포주들 (실시예 1.b 참고)를 생산하였다. 거의 40개의 클론성 라인들의 확장 후, 실시예 1.c에 기재된 대로 면역형광에 의해 가장 좋은 생산자 클론을 선택하였다.
선택된 생산자 클론 #28을 제조자의 가이드라인에 따라 10% FBS, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.8 mg/ml G418 (모든 시약들 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)이 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax로 10-층 세포 팩토리 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서 확장시키고 배양하였다. 컨플루언트 단계에서, 세포를 DPBS로 세척하고 배지를 항생제를 가지지만 FBS가 없는 DMEM/F-12 배지로 교체하였다. bi-scFv 단백질 1BiMAB를 포함하는 세포 상층액을 4주까지 동안 3-5일 마다 수거하였다. 상층액을 500 ml 스테리톱 필터 유니트(Steritop Filter Units) (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과시켰고 FPLC-정제까지 4℃에 저장하였다.
FPLC-정제 전에, 상기 세포 배양 상층액에서 bi-scFv의 존재를 표준 (Current Protocols in Protein Science, 2012)에 의해 실시된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 쿠마시 염색 및 웨스턴 블랏 분석으로 테스트하였다. 상기 상층액은 제조자의 프로토콜에 따라 센트리콘 원심분리 필터 장치 - 10K MWCO (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 통해 5x - 10x 배 농축하였다. 농축된 상층액 및 비-농축된 상층액을 NuPAGE 노벡스(Novex) 4 - 12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) 상에 분리하였다. 이후, 상기 겔을 표준 과정에 따라 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하여 상기 세포 배양 상층액에 포함된 50과 60 kD 사이의 bi-scFv 단백질 1BiMAB 및 다른 단백질들을 검출하였다. 웨스턴 블랏 분석을 실시하여 6xHis-택을 통해 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 특이적으로 검출하였다. 간략하게는, PVDF 막에 단백질들을 블랏팅하고 PBST/3% 분유로 블락킹한 후, 상기 막을 블락킹 완충액에서 1:500으로 희석된 일차 항체 항-HIS 에피토프-택 (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)과 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액으로 세척한 후, 막을 블락킹 완충액에서 1:10000으로 희석된 Fc-특이적 이차 퍼록시다제-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 IgG 항체 (Sigma Aldrich, Germany)와 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액으로 세척한 후, 시그널을 수퍼시그널 웨스트 펨토 화학발광성 기질 (SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate) (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에 의해 시각화하고, ImageQuant LAS 4000 이미저 (GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany)로 판독하였다. 내부 분자량 표준과 비교하여 bi-scFv의 시그널이 50과 60 kD 사이에서 검출되었다 (도 3A 및 B 참고).
e. bi-scFv 단백질 1BiMAB의 정제 및 정량
bi-scFv 단백질 1BiMAB를 포함하는 HEK293 클론 #28의 세포 배양 상층액 (실시예 1.d에 기재됨)을 표준 과정 (Current Protocols in Protein Science, 2012)을 이용한 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC) 하였다. 간략하게는, 여과된 세포 배양 상층액을 AKTA 정제기 10 FPLC 시스템에 연결된 His 트랩(Trap) FF 5 ml 컬럼 (두 개 모두 GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany) 상에 로딩하였다. PBS 세척 완충액은 10 mM 이미다졸을 포함하고, PBS 용출 완충액은 500 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4 및 250 mM 이미다졸을 포함하였으며, 양 완충액의 pH를 7.4로 조정하였다. 용출은 단계별 농도구배로 실시하였다. 용출된 bi-scFv 단백질 1BiMAB는 바로 Slide-A-Lyzer G2 투석 카세트 10K MWCO (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 1x PBS로 투석하였다. 1x PBS에 대한 투석 후, bi-scFv를 H2O 기반된 200 mM 아르기닌 완충액 (L-아르기닌-모노히드로클로라이드; Roth, Karlsruhe, Germany)으로 투석하였다.
Bi-scFv 농축은 ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)을 통해 결정된 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 흡광 계수 및 분자량의 고려 하에서 NanoDrop 2000c로 280 nm에서의 측정으로 결정하였다. 정제된 단백질을 분취하고 장기간 저장을 위해서는 -80℃에 저장하였으며 즉시 이용을 위해서는 4℃에서 유지시켰다.
bi-scFv 단백질 1BiMAB의 질 및 순도는 실시예 1.d (또한 도 3A 및 B 참고)에 기재된 대로 쿠마시 염색 및 웨스턴 블랏 분석에 의해 테스트하였다. BSA 표준 희석은 NanoDrop에 의해 측정된 농도를 개략적으로 확인하기 위한 쿠마시 과정에 포함되었다 (데이터를 보이지 않음).
f. ELISA 에세이의 확립
HEK293 세포의 세포 배양 상층액 내 1BiMAB의 정량을 위해, 특이적 ELISA 어세이가 확립되어야만 했다. 이러한 목적을 위해, 실시예 1.d에서 얻어진 상층액 및 실시예 1.e에 기재된 정제된 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 이용하였다. BSA 전-블락된 Ni-NTA 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 6xHis-택을 통한 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 고정하는 데 이용하였다. 모든 세척 단계들은 웰 당 200 μl의 1x PBS/0.05 % Tween (세척 완충액)으로 세 번에 걸쳐서 실시하였고 모든 단계들은 상온에서 실시하였다. 표준으로서, 정제된 1BiMAB 단백질을 사용하였으며, 10 - 500 ng/ml의 범위 내에서 1x PBS에 희석하였다. 상층액은 1x PBS에서 1:10으로 희석하였다. 100 μl의 희석된 단백질 또는 상층액을 각 웰로 옮겨서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, mCLDN18.2ab의 VH-VL 도메인들에 대한 항-유전자형 항체를 1x PBS/3 % BSA에서 0.5 μg/ml의 최종 농도로 희석시켰다. 100 μl의 항-mCLDN18.2ab 용액을 웰 당 첨가하여 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, AP-컨쥬게이트된 항-마우스-Fc 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)를 1x PBS/3 % BSA에서 300 ng/ml의 최종 농도로 희석시켰다. 100 μl의 이러한 이차 항체 용액을 웰 당 첨가하고 진탕하면서 추가적인 1시간 동안 반응시켰다. 음성 대조군으로서, 이차 항체 단독, 1BiMAB 플러스 이차 항체, 및 항-mCLDN18.2ab 플러스 이차 항체를 이용하였다. 또한, bi-scFv 단백질 없는 HEK293 세포 상층액을 어세이에 포함시켰다. 마지막으로, 세척 후 50 μl의 AP 기질 용액 (ml 기질 완충액 당 1.5 mg pNPP, AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany)을 웰 당 첨가하였다. 492 nm의 여기 파장을 가지는 405 nm에서의 암 흡수에서 5, 15, 및 30분 반응 후 Infinite M200 테칸 마이크로플레이트-판독기 (Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 측정하였다. 상층액으로부터 얻어진 bi-scFv 단백질의 농축은 표준 열(standard row)에 대한 계산으로 결정하였다 (데이터를 보이지 않음).
g. 비교 연구들을 위한 CLDN18.2-특이적 bi-scFv 단백질들의 일과성 트랜스펙션
바람직하게는 많은 양의 CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질들을 일시적으로 생산하기 위해, 인간 배아 신장 세포주 HEK293T (ATCC CRL-11268)를 트랜스펙션에 이용하였다.
트랜스펙션 2일 전에 1x107 HEK293 세포를 14.5 cm 조직 배양 디쉬에 20 ml의 완전 DMEM 배지 (10% 열 불활성화된 FBS 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax; 모든 시약들 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 플레이팅하였다. 트랜스펙션 전에, 세포들을 2 mM EDTA가 보충된 DPBS로 세척한 후 FBS 또는 항생제 없는 20 ml의 플레인 DMEM 배지를 첨가하였다. 원형 DNA 구조물들인 1BiMAB, 번호 11 - 20, 및 번호 35 (실시예 1.b에 기재됨) 20 μg을 0.5 ml 플레인 DMEM/F-12 배지에 희석하였다. 75 μl의 1 mg/ml 선형 PEI 용액 (폴리에틸렌이미드; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Germany)을 상기 희석된 DNA에 첨가하여 격하게 볼텍싱하였다. 상온에서 15분 반응시킨 후, 상기 DNA/PEI 복합체들을 한 방울씩 세포에 첨가하였고, 세포 배양 디쉬를 약하게 회전시켜준 후, 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 배지를 플레인 DMEM/F-12로 교환한 후 세포를 5% CO2, 33℃에서 48시간 동안 추가적으로 반응시켰다. 반응 후 세포 상층액을 수거하여 0.2 μm Minisart 주사기 필터 (Sigma-Aldrich, Germany)로 멸균 여과하였다. 이후, 제조자의 프로토콜 (Qiagen, Hilden, Gemany)에 따라 Ni-NTA 스핀 칼럼을 이용하여 세포 배양 상층액으로부터 bi-scFv 단백질을 소-규모로 정제하였다. Bi-scFv 단백질 농도는 실시예 1.f에 기재된 대로 ELISA로 측정하였고 실시예1.e에 기재된 대로 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다 (데이터를 보이지 않음). 정제된 단백질들은 즉시 이용하기 위해 4℃에 저장하였다.
실시예 2: 특이적 T 세포 활성화 및 bi-scFv 단백질에 의해 매개되는 다시 보내진 T 세포에 의한 타겟 세포 용해를 모니터링하기 위한 기능성 어세이들의 확립
인간 이펙터 세포를 TAA-양성 타겟 세포로 특이적으로 다시 보내는 bi-scFv 단백질들의 능력을 모니터링하기 위한 인 비트로 어세이를 확립하기 위해 FPLC-정제된 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 이용하였다. 상기 목적은 효과를 시각화하고 인간 T 세포의 활성화 및 특이적 타겟 세포 용해를 정량하는 것이었다.
a. bi-scFv 단백질에 의해 타겟 세포로 다시 보내지는 T 세포의 현미경적 분석
bi-scFv 단백질 기능성의 시각화를 위해, 현미경을 통해 bi-scFc 단백질들에 의한 CLDN18.2-발현 타겟 세포로 이펙터 세포의 재전송(redirection)을 보여주는 어세이를 확립해야만 했다. 이러한 목적을 위해, 상대적으로 높은 레벨의 인간 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 위 암종 세포주 NugC4 (Sahin U. et al., Clin Cancer Res. 2008 Dec 1;14(23):7624-34)를 타겟 세포주로 이용하였다.
인간 이펙터 세포를 표준 과정 (Current Protocols in Immunology, 2012)에 따라 건강한 공여자에서 얻은 인간 혈액으로부터 신선하게 분리하였다: 간략하게는, 혈액을 DPBS로 희석하였고, Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany)에서 층 로딩되어 원심분리하였다. 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)를 층간(interphase)으로부터 수득하여, 2 mM EDTA가 보충된 냉장 DPBS로 세척하고 카운팅하였다. 이후 인간 T 세포를 제조자의 가이드라인에 따라 Pan T 세포 분리 키트 II (Miltenyi Biotec, Teterow, Germany)에 의해 PBMCs로부터 자성-활성화된 세포 분리 (MACS)로 분리하였다.
1x105 NugC4 세포를 조직 배양 6-웰 플레이트에 웰 당 분주하였다. 인간 세포를 상기 기재된 바와 같이 준비하였으며 5:1의 이펙터 대 타겟 (E:T) 비율로 첨가하였다. 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)가 보충된 RPMI 1640 배지를 모든 세포에 이용하였고 웰 당 최종 용량은 웰 당 2 ml로 조정하였다. 대조군 시료는 bi-scFv 단백질과 함께 또는 없이 타겟 또는 T 세포만을 포함하였다. 이후 조직 배양 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 상기 어세이는 Wilovert S 도립 현미경 (Hund, Wetzlar, Germany)을 통해 6시간부터 48시간까지의 공동배양에서 연속적으로 관찰하였다. bi-scFv 단백질 1BiMAB의 존재 하에서 타겟 세포 상에 T 세포 클러스터링, 면역학적 시냅스의 형성 및 타겟 세포 사멸(killing)의 측면에서 유의한 효과가 24시간에 나타났다. 48시간 후 살아있는 타겟 세포를 거의 발견할 수 없었다. 사진은 Nikon Eclipse TS100 도립 현미경 (Nikon, Japan)으로 24시간에 찍었다. 또한 도 5를 보라.
이러한 어세이는 다양한 웰 포멧들에서의 모든 세포독성(cytotox) 어세이 에서 가시성 대조군(visibility control)으로서 추가적으로 포함하였다.
b. bi-scFv 단백질 1BiMAB에 의한 타겟-의존적 T 세포 활성화
bi-scFv 단백질에 의한 인간 T 세포의 특이적 활성화의 검출을 위해 유세포 분석 어세이를 확립하였다. T 세포 활성화의 검출을 위해, 초기 활성화 마커 CD69 및 후기 활성화 마커 CD25를 형광-컨쥬게이트된 항체에 의한 염색을 위해 선택하였다. 타겟 및 T 세포의 혼합물에서 인간 T 세포의 검출을 위해, T 세포 위의 CD3를 염색하였다.
상기로부터 셋-업된 어세이를 선택하였다 (실시예 2.a). 간략하게는, NugC4 타겟 세포를 2 ml 완전 배지에서 5:1의 E:T 비율로 인간 T 세포와 함께 분주하였고 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 0.001 - 1000 ng/ml의 범위 내 농도로 첨가하였다. 대조군 시료들은 bi-scFv 단백질 1BiMAB와 함께 또는 없이 타겟 또는 T 세포 단독으로 포함하였다. 24시간 및/또는 48시간 후 - 가시성 대조군의 결과에 따라 - 모든 세포들을 세포 스크랩퍼 (Sarstedt AG & Co, Nurmbrecht, Germany)로 부드럽게 긁어서 수득하였고 5 ml 라운드 바닥 튜브들 (BD Falcon, Heidelberg, Germany)로 옮겼다. 세포를 원심분리시켜 DPBS로 세척하였다. 세포 염색을 위해, 마우스 항-인간 CD3-FITC, 마우스 항-인간 CD69-APC, 및 마우스 항-인간 CD25-PE (모든 항체들 BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하였다. 세포 펠렛을 형광-컨쥬게이트된 항체들을 포함하는 50 μl의 FACS-완충액 (5% FBS가 보충된 DPBS)에 재현탁하였다. 암 상태에서 20분 동안 4℃로 반응시킨 후, 시료들을 4 ml DPBS로 세척하며 죽은 세포를 검출하기 위해 세포 펠렛을 1:1000의 최종 희석된 프로피디움 이오디드 (PI) 또는 7-AAD (모두 Sigma Aldrich, Germany)를 포함하는 200 μl의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 측정 내내 시료들을 얼음 및 암 상태에서 유지시켰다. 상기 어세이의 확립을 FACSCalibur로 실시하였고, 더 늦은 측정은 FACSCanto II 유세포 분석기 (모두 BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 실시하였다. 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 평가하였다.
도 6A 및 B에서 볼 수 있듯이, 타겟 세포의 부존재 하에서 어떠한 1BiMAB 매개된 T 세포 활성화도 관찰 가능하지 않은데, 이는 bi-scFv 기능성의 엄격한 타겟 의존성을 보여준다. 타겟 세포의 존재 하에서 유의한 T 세포 활성화는 24시간 후 0.01 ng/ml 1BiMAB에서만 일어났다. 100 ng/ml의 1BiMAB를 이용할 때 최대 효율을 얻었다.
T 세포 활성화의 연구 외에도, 이러한 어세이는 타겟 세포 개체군을 게이팅하고 PI- 또는 7-AAD-양성 타겟 세포의 백분율을 평가함으로써 타겟 세포 사멸 상 bi-scFv 매개된 효과의 정량적 분석도 가능하게 한다 (데이터를 보이지 않음). 모든 분석들은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 실시하였다.
c. 루시퍼라제 세포독성 어세이
CLDN18.2 및 CD3로 지시된 bi-scFv 단백질들의 타겟 세포 사멸능(killing potential)에서의 미묘한 차이를 결정하기 위해, 더 민감성 어세이를 개발해야만 했다. 상기 목적은, 상기 타겟 세포 사멸을 고속 방식에서 정량적으로 모니터링할 수 있는 어세이를 확립하는 것이었다. 이를 달성하기 위해, 루시퍼라제 세포독성 어세이를 선택하였다. 이 방식으로 살아있는 타겟 세포에 의한 루시퍼라제-발현의 측정이 항체의 존재 하에서 세포독성 이펙터 세포에 의해 매개되는 타겟 세포 용해를 간접적으로 결정하게 해 준다.
먼저, NugC4 세포 (상기 기재됨)에 반딧불이 루시퍼라제, EGFP 리포터 유전자 및 항생제 선택 마커를 가지는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 형질도입된 세포의 항생제 선택 후, EGFP 고 발현 세포를 FACSAria 세포 분류기 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 분류하여, 고 루시퍼라제 발현에 대해 분석하고 이후 추가적인 연구들을 위해 확장하였다.
인간 이펙터 세포들을 실시예 2.a에 기재된 대로 준비하였다. 어세이의 확립은 1 - 100 ng/ml 범위의 bi-scFv 단백질 1BiMAB에서 실시하였고, 이에 따라 5 ng/ml의 농도가 매우 효과적이고 재생산가능한 효과들을 초래하는 것으로 확인되었고 표준 농도로서 추가적으로 사용되었다. 루시퍼라제를 안정적으로 ㅂ발현하는 NugC4 세포 (상기 기재됨)를 타겟 세포로 이용하였다. 백색 편평한 바닥 96-웰 플레이트에 1x104 타겟 세포를 웰 당 분주하였다. 인간 T 세포 (실시예 2.a에 기재된 대로 제조됨)를 5:1의 E:T 비율로 첨가하였다. 상기 기재된 배지 (실시예 2.a)를 이용하였으며 웰 당 최종 용량은 100 μl로 조정되었다. 테스트 시료 및 대조군 시료들을 최소 3쌍으로 플레이팅하였다.
세포 배양 마이크로플레이트들을 5% CO2, 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 반응시켰다. 분석을 위해, 1 mg/ml 루시페린 (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 및 50 mM HEPES을 포함하는 50 μl의 물 용액을 웰 당 첨가하였으며 이후 플레이트를 암 상태로 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 루시퍼라제 발현 살아있는 세포에 의한 루시페린의 산화로부터 발생하는 발광을 마이크로플레이트-판독기 (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)에서 측정하였다. 특이적 타겟 세포 용해의 백분율을 다음의 공식에 따라 산출하였다: % 특이적 용해 = [1 - (발광테스트 시료 - Lmax) / (Lmin - Lmax)] x 100, "L"은 용해를 나타낸다. Lmin은 bi-scFv의 부존재 하에서 최소 용해를 의미하고 Lmax는 Triton X-100 (2% 최종 농도)의 첨가에 의해 달성되는 bi-scFv의 부존재 하에서 최대 용해 (자발적인 발광 카운트와 동일)를 의미한다.
이펙터 세포들과 관계없이 타겟 세포 상 bi-scFv 단백질의 잠재적인 직접적 효과들은 Lmin 및 Lmax 같은 모든 대조군들을 포함하는 인간 T 세포 없는 타겟 세포들을 플레이팅하여 결정하였다.
이러한 어세이는 타겟 세포의 특이적 T 세포 매개된 용해를 조사하기 위한 추가적인 연구들에 이용하였다. 변형들, 예를 들어 bi-scFv 농도들, bi-scFv 단백질들, E:T 비율들, 또는 이펙터 세포들 (CD8+, CD4+ T 세포, PBMCs)을 다양하게 하여 실행하였다.
실시예 3: CLDN18.2-특이적 bi-scFv 리드 후보의 선택
가장 강력한 bi-scFv 변이체의 선택을 위해 다양한 CLDN18.2-특이적 bi-scFv 단백질들을 이용한 루시퍼라제 세포독성 어세이
내인적으로 CLDN18.2를 발현하고 루시퍼라제를 이상적으로 발현하는 NugC4 타겟 세포 (실시예 2.c를 보라)를 이용한 루시퍼라제 세포독성 어세이에서 인간 코돈 최적화된 bi-scFv 단백질 1BiMAB와 비교하여 TAA CLDN18.2에 특이적인 CHO-코돈 최적화된 10개의 모든 구조물들 (번호 11-20)을 테스트하였다. 이용된 bi-scFv 단백질의 특성이 표 2에 명시되어 있다. TAA PLAC1에 특이적인 Bi-scFv 번호 35는 이소타입 대조군으로 사용하였는데, 이는 PLAC1이 NugC4 세포에 의해 발현되지 않기 때문이다. 인간 T 세포 상의 CD3에 대한 결합 활성은 FACS 결합 어세이에서 증명되었다 (데이터를 보이지 않음). 모든 bi-scFv 단백질을 실시예 1.g에 기재된 대로 제조하였고 실시예 2.c에 기재된 대로 셋업된 세포독성 어세이에 사용하였다.
모든 bi-scFv 단백질은 5 ng/ml의 최종 농도에서 이용되었다. Lmin의 결정을 위해, 대조군 bi-scFv 단백질 번호 35를 타겟 및 T 세포와 9배로 분주하였고, 테스트 시료는 6배로 플레이팅하였다. 분석을 위해 시간 포인트 당 하나의 플레이트를 준비하였다.
각 분석된 시간 포인트 (8시간, 16시간, 24시간)에서 특이적 용해를 상기 이용된 bi-scFv 단백질들에 대해 플롯팅하였다. Bi-scFv 단백질들 1BiMAB (서열번호 39) 및 번호 15 (서열번호 41) - 동일한 방향으로 구축되며 같은 항-CD3 서열 (TR66)을 포함하고 핵산 레벨 상에 코돈 이용 및 링커 서열들에서만 상이함 - 가 타겟 세포 용해를 매개하는 데 가장 강력한 항체들임을 확인하였다 (도 2 참고). 1BiMAB 및 번호 15는 효율 면에서 동일하기 때문에, 지금까지 더 좋게 조사된 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 다음의 모든 어세이들을 위해 선택하였다. 18PHU3 및 18PHU5 구조물들 (표 1 및 표 2 참고)을 1BiMAB에 대해 더 늦은 시간 포인트에서 비교하였다. 18PHU5의 효율은 1BiMAB과 동일하였고, 18PHU3는 덜 강력하였다 (데이터를 보이지 않음).
실시예 4: bi-scFv 단백질 1BiMAB의 결합능
FACS-기반된 결합 어세이의 확립
bi-scFv 단백질의 CLDN18.2 및 CD3-타겟팅 모이어티들에 대한 결합능을 평가하기 위해, 유세포 분석 어세이를 확립하였다. 항-CLDN18.2 위치를 조사하기 위해 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NugC4 세포를 이용하였으며 인간 T 세포를 항-CD3 위치를 조사하기 위해 이용하였다.
항-CLDN18.2 결합능의 조사를 위해, NugC4 세포를 트립신화시키고, 완전 RPMI 1640 배지로 세척한 후 DPBS로 세척하였다. 모든 세척 단계들은 4℃에서 6분 동안 1200 rpm으로 원심분리하여 실시하였다. 2.5x105 NugC4 세포를 5 ml 라운드 바닥 튜브에 옮기고 FACS-완충액 내 50 μg/ml의 FPLC-정제된 1BiMAB 단백질과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포를 2 ml의 FACS-완충액으로 세척한 후 3.3 μg/ml의 단일클론 항체 항-HIS 에피토프-택 (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 2 ml의 FACS-완충액으로 세척한 후, 상기 세포 펠렛을 FACS-완충액에서 1:200로 희석된 APC-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)와 암 상태로 20분 동안 4℃에서 반응시켰다. 세포를 2 ml의 FACS-완충액으로 두 번 세척하고 1 μg/ml PI (Sigma Aldrich, Germany)가 보충된 150 μl의 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁하여 죽은 세포를 카운터염색하였다. 동일한 과정을 이용한 다른 염색은 50 μg/ml 1BiMAB 및 APC-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 이차 항체 (1:200)을 이용하는 것을 포함하지만, 항-HIS 에피토프-택 항체를 포함하지 않는다. 음성 대조군 시료는 이차 염소-항-마우스 APC 항체 단독, 단일클론 항체 항-HIS 에피토프-택 플러스 이차 염소-항-마우스 APC 항체를 포함하였다. 양성 대조군으로서 10 μg/ml의 단일클론 CLDN18.2-특이적 항체 mCLDN18.2ab가 이차 염소-항-인간 APC 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)로 염색되었고 이의 이차 항체 단독이 대조군으로 이용되었다.
시료들을 FACSCalibur 유세포 분석기 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 측정하였으며 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 분석하였다. 1BiMAB, 항-HIS 에피토프-택 및 염소-항-마우스 APC의 연속적인 염색에 의해 강한 시그널을 검출하였다. 시그널 강도는 염소-항-인간 APC를 이용한 양성 대조군 mCLDN18.2ab에 비교할 만하였다. 1BiMAB에 대한 염소-항-마우스 APC의 낮은 직접 결합이 1BiMAB 및 항-HIS 에피토프-택 없는 염소-항-마우스 APC로 염색된 시료에서 관찰되었다 (도 4A 참고).
bi-scFv 단백질의 결합능을 조사하기 위한 모든 추가적인 FACS-결합 어세이들에 있어서 1BiMAB, 항-HIS 에피토프-택 및 염소-항-마우스 APC를 사용한 연속적인 염색 프로토콜을 이용하였다 (도 4B, C 및 D 참고). 1BiMAB의 비특이적 결합을 배제하기 위해, RT-PCR에 의해 증명된 대로 (데이터를 보이지 않음) CLDN18.2를 발현하지 않는 타겟 세포를 FACS-기반된 결합 어세이 하였다. 도 4D에서 볼 수 있듯이 1BiMAB의 어떠한 비특이적 결합도 검출되지 않았다.
bi-scFv 단백질 1BiMAB의 항-CD3 암(arm)에 대한 결합능을 조사하기 위해, 인간 T 세포를 이용하였다. 실시예 2.a에 기재된 대로 제조된 1x106 T 세포를 5 ml 라운드 바닥 튜브로 옮기고 FACS-완충액에서 0.002 - 2 μg/ml의 범위 내에 존재하는 FPLC-정제된 1BiMAB 단백질과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 추가적인 염색 과정은 상기 기재된 대로였다. 대조군 시료들은 이차 염소-항-마우스 APC 항체 단독 및 단일클론 항체 항-HIS 에피토프-택 플러스 이차 염소-항-마우스 APC 항체를 포함하였다. 상기 기재된 대로 측정 및 분석을 실시하였다. 유의한 시그널이 2 μg/ml 1BiMAB에서 얻어졌다 (도 4C 참고).
실시예 5: bi-scFv 1BiMAB에 의한 매우 특이적, 타겟 의존적 T 세포 활성화의 조사
높은 레벨 또는 낮은 레벨의 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 암 세포주들 및 CLDN18.2를 발현하지 않는 암 세포주들을 선택하여 인 비트로 세포독성 어세이에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 엄격한 타겟 의존성을 증명하였다. 상기 선택된 세포주들은 CLDN18.2를 발현하는 두 개의 두드러진 암종 타입이었다: 위 (NugC4, MKN7, SNU-1) 및 췌장 (DanG, KP-4) 암종. 유방 암종 세포주 MCF7은 음성 대조군으로 이용하였다.
a. 암 세포주들의 CLDN18.2 RT-PCR
제조자의 프로토콜 (Quiagen, Hilden, Germany)에 따라 RNEasy 미니 키트 과정에 의해 상기 언급된 암종 세포주들로부터 총 RNA를 추출하였다. SuperScript II 역전사 효소 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)를 이용한 cDNA 합성을 위해 5 μg의 RNA를 사용하였다.
RT-PCR 분석은 Sybr 그린 다이 및 다음의 프라이머를 이용한 ABI Prism 7300 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)에서 실행하였다:
CLDN18.2: 정방향(for) TGGCTCTGTGTCGACACTGTG; 역방향(rev) GTGTACATGTTAGCTGTGGAC
HPRT: 정방향 TGACACTGGCAAAACAATGCA; 역방향 GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT
CLDN18.2의 Ct-값으로부터 하우스키핑 유전자 HPRT의 Ct-값을 제하여 델타 Ct를 계산하였다 (결과에 있어서 도 7A 참고).
b. CLDN18.2의 존재 하에서 독점적 T 세포 활성화
실시예 2.a에 기재된 대로 세포독성 어세이를 셋업하였다. 정량적 RT-PCR을 통해 실시예 5.a에서 CLDN18.2 전사체에 대해 조사된 암종 세포주들을 타겟 세포로 이용하였다. 이러한 어세이에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 농도는 5 ng/ml로 셋팅하였다. 타겟 세포는 인간 T 세포 및 1BiMAB와 함께 두 쌍으로 분주하여 T 세포 활성화를 분석하였다. bi-scF 단백질 1BiMAB와 독립적으로 타겟 세포에 대한 T 세포의 잠재적인 동종반응성(alloreactivity)을 모니터링하기 위해, 타겟 및 T 세포를 1BiMAB 없이 두 쌍으로 분주하였다. 현미경을 통해 세포를 연속적으로 관찰하여 T 세포 클러스터링 및 타겟 세포 결합을 관찰하였다. 높은 CLDN18.2-발현 세포주 NugC4의 경우, 유의한 효과가 24시간 후에 일어났다; 48시간 후 살아있는 타겟 세포를 거의 볼 수 없었다. 낮은 CLDN18.2-발현 세포주 DanG의 경우, 첫 번째 효과가 96시간 후에 보여졌고 유의한 효과가 120시간 후에 관찰되었다. CLDN18.2 음성 세포주에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았는데, 이는 144시간 후에도 어떠한 T 세포 활성화조차 볼 수 없었다는 것을 보여준다. 모든 시료들의 T 세포를 실시예 2.a에 기재된 대로 초기 T 세포 활성화 마커 CD69 및 후기 활성화 마커 CD25에 대한 유세포 분석을 통해 타겟 세포와 144시간의 공동배양 후 분석하고, T 세포 개체군에 대해 CD3 및 죽은 세포에 대해 PI로 카운터염색하였다. 흥미롭게도, NugC4 및 1BiMAB과 공동배양된 T 세포의 100%까지는 CD25 양성이었지만 CD69 음성이었는데, 이는 CD69 하향조절이 이미 일어나는 경우 T 세포의 장기간 활성화를 나타낸다. DanG 및 1BiMAB와 공동배양된 T 세포의 대략 75%가 활성화되었고, 이중 약 40 %는 CD25 및 CD69를 동시에 발현하였는데, 이는 T 세포 활성화가 여전히 진행중이라는 것을 나타낸다. CLDN18.2 음성 세포주들와 공동배양된 T 세포는 T 세포 활성화 유도에 대한 어떤 신호도 나타내지 않았다: 1BiMAB 없는 시료의 레벨과 비교하여 CD69 또는 CD25 발현 중 어느 하나도 유의하게 증가하지 않았다 (또한 도 7B 참고).
실시예 6: bi-scFv 단백질 1BiMAB 유도된 T 세포 기능의 조사
a. T 세포 증식의 유도
T 세포 증식은 T 세포 활성화의 지시인자이다. CLDN18.2 양성 타겟 세포의 존재 하에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB에 대한 반응으로 T 세포 증식을 보이기 위해, 유세포 분석 어세이를 이용하였다. 간략하게는, 실시예 2.a에 기재된 대로 분리된 1x106 인간 T 세포를 37℃에서 10분 동안 암 상태에서 DPBS에 녹여진 0.5 μM 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르 (CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, Germany)로 염색하였다. 염색은 5배 용량의 냉장 완전 RPMI 1640 배지의 첨가로 중단하였다. 세포를 5분 동안 얼음에서 유지시키고 완전 RPMI 배지 (5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 소듐 피루베이트)로 3번에 걸쳐서 세척한 후 ml 당 1x105 세포로 재현탁하였다. 실시예 2.b에 기재된 대로 세포독성 어세이를 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NugC4 세포 및 이펙터 세포로서의 인간 T 세포로 셋업하였다. 세포에 ml 배지 당 50 U IL-2를 첨가하였다. 시료들은 T 세포 단독, 1 ng/ml 1BiMAB를 가진 T 세포, T 세포 및 NugC4 세포, 그리고 1 ng/ml 1BiMAB를 가진 T 세포 및 NugC4 세포를 포함하였다. 120시간의 공동배양 후, T 세포를 수거하며 5 ml 라운드 바닥 튜브에 모아 세척하고 1:1000 7-AAD DPBS 용액으로 염색하여 죽은 세포를 4℃에서 15분 동안 카운터염색하였다. DPBS로 세척한 후, 세포를 FACS-완충액에 재현탁하였고 FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 분석하였다.
T 세포의 증식은 타겟 세포 및 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 존재 하에서만 CFSE-시그널을 감소시킴으로써 검출되었다 (또한 도 8A 참고).
b. 세린 프로테아제 그란자임(Granzyme) B의 유도
CLDN18.2 양성 타겟 세포의 존재 하에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB에 의해 매개되는 T 세포 활성화 후 단백질 가수분해 분자의 상향조절을 증명하기 위해, 유세포 분석을 통한 세린 프로테아제 그란자임 B의 검출을 선택하였다. 실시예 2.b에 기재된 대로 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NugC4 세포 및 이펙터 세포로서의 인간 T 세포로 세포독성 어세이를 셋업하였다. 시료는 T 세포 단독, 5 ng/ml 1BiMAB를 가진 T 세포, T 세포 및 NugC4 세포, 그리고 5 ng/ml 1BiMAB를 가진 T 세포 및 NugC4 세포를 포함하였다. 96시간의 공동배양 후, T 세포를 수거하며 5 ml 라운드 바닥 튜브에 모아 세척하고 1:1000 7-AAD DPBS 용액으로 염색하여 죽은 세포를 4℃에서 15분 동안 카운터염색하였다. DPBS로 세척한 후, 세포를 100 μl Cytoperm/Cytofix 용액으로 상온에서 20분 동안 고정하였다. 세포를 1x Perm/Wash로 세척한 후 PE-컨쥬게이트된 마우스 항-인간 그란자임 B 항체로 상온에서 20분 동안 염색하였다. 세척 후, 세포를 FACS-완충액에 재현탁하였고 FACSCanto II (모든 시약 및 FACS 기계 BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 분석하였다.
T 세포에서 그란자임 B 상향조절은 타겟 세포와 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 존재 하에서만 검출되었다 (또한 도 8B 참고).
실시예 7: 인 비트로 세포독성 어세이에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 EC50의 결정
루시퍼라제 세포독성 어세이
bi-scFv 단백질 1BiMAB의 절반의 최대 효과적 투여량의 결정을 위해, 주로 실시예 2.c에서 기재된 대로, 1BiMAB의 적정 선(titration row)을 인 비트로 루시퍼라제 세포독성 어세이에서 테스트하였다.
실시예 2.c에서 기재된 안정적으로 루시퍼라제-발현 NugC4 세포를 인간 T 세포 및 1 pg/ml 내지 1 μg/ml (10의 단계에서)의 범위 내 농도의 bi-scFv 단백질 1BiMAB 또는 1BiMAB 없이 반응시켜 Lmin 값을 결정하였다. 어세이 실행 후 24시간 및 48시간에 살아있는 세포의 발광을 Infinite M200 테칸 플레이트 판독기로 측정하였다. 특이적 타겟 세포 용해를 실시예 2.c에 예시된 공식에 의해 계산하였다.
최대 용해는 1 - 10 ng/ml 1BiMAB를 처리하여 48시간 후에 도달하였다. 이러한 어세이에서 48시간 후 상기 결정된 EC50은 약 10 pg/ml이다 (또한 도 9를 보라). 이러한 어세이의 결과는 다른 사람들에 의해 보고 (예를 들어, Lutterbuese, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010 Jul 13;107(28):12605-10)된 대로 공여자의 면역 상태에 따라 다양한 인간 T 세포의 강력함에 강하게 의존한다. 이것 이외에도, 상기 이용된 타겟 세포주 NugC4는 결과에도 영향을 미치는 CLDN18.2의 다양한 발현을 나타낸다. 따라서, 10 - 300 pg/ml 내의 범위에서 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 EC50 값 다양함은 본 발명의 과정 동안 관찰되었다.
실시예 8: 마우스 이종이식 모델에서의 효능
인 비보 bi-scFv 단백질 1BiMAB의 치료학적 포텐셜을 조사하기 위해, 마우스 스트레인 NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ 또는 숏 NSG (Jackson laboratory, Bar Harbour, ME, USA)를 선택하였다. 상기 기재된 연구를 위해 마우스에 인간 이펙터 세포 및 인간 T 림프구의 접목(engraftment)은 인 비보 bi-scFv에 관여하는 T 세포의 효과를 연구하기 위해 필수불가결하다. B-, T- 및 NK 세포의 완전한 결핍으로 인해, 상기 마우스 스트레인 NSG는 이러한 종류의 이종이식 연구에 적합하다. 주로 PBMC 주입 후 접목된 인간 T 세포를 가지는 마우스 모델은 본 발명의 일부로서 확립되었다.
a. bi-scFv 단백질 1BiMAB를 가지는 마우스에서 진행된 CLDN18.2를 많이 발현하는 종양의 후기 개시 치료
상기 예증된 연구에서, 높은 레벨의 인간 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 1x107 HEK293 세포 (HEK293-CLDN18.2)를 8주령된 40마리의 암컷 NSG 마우스에 피하로 접종하였다. 종양 세포 접종 마우스는 5일째에 처리 그룹 내 종양 용적에 따라 희생시켰고, 종양 성장이 없는 마우스는 배제하였다. 동일한 날에 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)는 실시예 2.a에 기재된 대로 Ficoll 밀도 구배 기술에 의해 건강한 공여자의 인간 혈액으로부터 분리하고 인 비보에서 이펙터 세포로 이용하였다. 300 μl DPBS에 희석된 2x107 PBMCs는 분리한 날에 "PBMC"로 지정된 실험적 처리 그룹에 복강 내 주입하였다. "PBS"로 지정된 처리 그룹은 300 μl 플레인 DPBS를 대신 복강 내로 받았고 인간 이펙터 세포 없는 대조군으로 이용하였다. "PBS" 대조군 그룹과 함께 1BiMAB 자체에 의한 종양 성장 상의 잠재적 효과 또는 1BiMAB 또는 비히클(vehicle)에 의해 야기되고 마우스 조직에 대한 인간 이펙터 세포에 의해 야기되지 않는 어떠한 잠재적인 부작용 (즉, 마우스 조직에 대한 인간 이펙터 세포에 의해 나타나는 그라프트-대-숙주 반응)에 대한 조사를 검토할 수 있다. "PBS/비히클" 그룹은 4마리의 마우스를 포함하고(n=4), "PBS/1BiMAB"는 5마리의 마우스를 포함하며(n=5), "PBMC/비히클"은 13마리의 마우스를 포함하고(n=13) "PBMC/1BiMAB"는 15마리의 마우스를 포함하였다(n=15). 치료는 DPBS 또는 PBMC 적용 후 1일째에 시작하였다: "PBS/1BiMAB" 및 "PBMC/1BiMAB" 그룹은 동물 당 200 μl의 DPBS에 희석된 5 μg의 정제된 bi-scFv 단백질 1BiMAB를 복강 내로 받았다. "PBS/비히클" 및 "PBMC/비히클" 그룹은 DPBS에 희석된 200 μl의 비히클 완충액 (H2O에 녹여진 200 mM L-아르기닌-모노히드로클로라이드, 멸균 여과됨)을 복강 내로 받았다. 처리 그룹은 표 3에 요약되어 있다. 치료법은 22일 동안 매일 실시하였다. 주 당 두 번씩 종양 크기를 디지털 계산된 칼리퍼로 측정하였으며 mm3 = 길이 x 너비 x (너비/2)의 공식에 따라 계산하였다. 도 10A 및 B는 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 항체에 의해서만 "PBMC/1BiMAB" 그룹의 마우스 반에서 종양 성장의 억제 및 종양 크기(tumor burden)의 제거를 예증한다. 종양 용적이 500 mm3를 초과하거나 또는 심각한 병적 상태의 경우 (그라프트-대-숙주 증상들이 일부 마우스에서 관찰되었음)에 마우스는 경추이탈로 희생시켰다.
표 3: 처리 그룹
처리 마우스의 # 이펙터 세포 Bi-scFv μg bi-scFv
그룹 (G) (n) 단백질 단백질/마우스
G1 4 - - -
G2 5 - 1BiMAB 5
G3 13 PBMC - -
G4 15 PBMC 1BiMAB 5
b. 체중에 따른 치료 영향의 결정
실험실 저울을 사용하여 각 마우스의 체중을 주 당 두 번씩 조사하였다. 어떠한 그룹 내 마우스도 치료 시간 동안 무게 감소를 나타내지 않았다 (데이터를 보이지 않음). 양 "PBMC" 그룹들 내 일부 마우스는 PBMC 주입 후 4주 및 치료의 끝 여러 날에 그라프트-대-숙주 반응의 증상들을 보였다. 몸무게에서의 1BiMAB 자체에 의한 효과 또는 마우스의 건강에 관련된 어떠한 다른 부작용은 관찰되지 않았다.
c. 조직 보존 및 비장세포 분리
마우스를 죽인 후, 종양을 해부하고 면역조직학적 분석을 위해 즉시 조직을 10 ml Roti-Histofix 4% (Carl Roth, Karlsruhe, Germany)에 고정시켰다. 더욱이, 비장을 해부하여 유세포 분석에 의해 인간 세포의 접목을 검출하였다. 3 - 5 ml 주사기의 멸균 플런저(plunger)로 50 ml 반응 튜브에 위치된 70 μm 세포 여과기를 통해 상기 비장을 짓이기고 따듯한 DPBS로 상기 세포 여과기를 반복적으로 플러싱하여 비장 해체 후 즉시 비장세포 분리를 실시하였다. 분리된 비장세포를 원심분리하였고, DPBS를 제거하였으며 상기 비장세포 펠렛을 10% DMSO가 보충된 1 ml의 열 불활성화된 우태아혈청에 재현탁하였다. 시료들을 즉시 -80℃에 동결시켰고 모든 마우스로부터 비장세포 시료를 끝마칠 때까지 저장하였다.
d. 마우스 비장에서 인간 T 림프구의 접목 분석
모든 마우스로부터 비장세포를 수득하여 실시예 8.c에 기재된 대로 동결하였다. 비장세포 시료의 완전한 수집물을 한번에 해동시켰으며, 모든 세포를 따뜻한 DPBS로 두 번씩 세척하였고 시료 당 1x106 비장세포를 형광-컨쥬게이트된 항체와 4℃에서 20분 동안 암 상태로 반응시켜 항-CD45 염색에 의해 인간 세포의 접목을 검출하였으며 항-CD3, 항-CD4, 및 항-CD8 염색에 의해 인간 T 세포의 백분율을 검출하였다. 유세포 분석을 FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 실시하였다. 도 10D에서 볼 수 있듯이 양 "PBMC" 그룹에서 인간 T 세포 접목은 CD45-CD3 이중 양성 비장세포의 높은 백분율로 확인할 수 있었다.
실시예 9: CLDN6 및 CD3을 타겟팅하는 이중특이 결합체의 제조 및 테스팅
a. 서열 오리진, bi-scFv 구조물의 고안, 및 발현 벡터로의 클로닝
인간 T 세포 수용체 구성성분 CD3 및 인간 종양 관련된 항원 (TAA)에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이 탠덤 단일 사슬 항체 구조물 (bi-scFv)를 제조하였다. 각 구조물에 대해 상응하는 중쇄 가변부 (VH) 및 상응하는 경쇄 가변부 (VL)을 N-말단부터 C-말단까지 연속적인 순서로 특이적으로 배열시켰다:
N - VH αCLDN6 - VL αCLDN6 - VH αCD3 - VL αCD3-C (6PHU5, 서열번호 43)
N - VH αCD3 - VL αCD3 - VH αCLDN6 - VL αCLDN6-C (6PHU5, 서열번호 45)
표 4는 본 발명의 과정에서 제조되었던 TAA CLDN6에 특이적인 모든 bi-scFv 구조물들을 요약하고 있다. CLDN18.2 특이적 bi-scFv 구조물 1BiMAB는 대조군 항체로 이용하였다. 상기 bi-scFv 구조물들은 상기 상응하는 항체의 VH 및 VL 서열을 이용하는 GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Germany)에 의한 유전자 합성을 통해 제조하였다. 호모 사피엔스 (HS) 또는 무스 무스큘러스 (MM) 같은 코돈 최적화는 GeneArt의 GeneOptimizer® 소프트웨어에 의해 실시하였으며, 표 5에 나열되어 있다. 모든 적용된 도메인들의 특이성, 단일클론 항체 (mAB)으로부터 유래된 서열 오리진, 코돈 이용, 추가적인 서열 특징 및 레퍼런스에 대한 정보는 표 5에 요약되어 있다. 각 CD3 항체들의 가변 도메인 서열 오리진은 표 5에 나열되어 있다. 인간 및 마우스 TAAs의 높은 상동성을 인해, 동일한 항-TAA VH 및 VL 서열이 마우스 어세이를 위한 bi-scFv 구조물의 제조에 이용될 수 있지만, 마우스 특이적 항-CD3 항체 클론 145-2C11의 VH, VL 서열과 조합하여 이용될 수 있다.
DNA 클로닝 및 발현 벡터 구축은 당업자에게 잘 알려진 표준 과정 (Sambrook, 1989)에 따라 실시하였다. 간략하게는, 상기 bi-scFv DNA 서열은 발현 플라스미드 내로 클로닝을 위한 5' HindIII 및 3' BamHI 제한효소 위치를 가지도록 제조하였다. 분비 시그널 서열이 세포 내 세포질부터 배양 배지로의 단백질 분비를 위해 bi-scFv 서열의 5' 말단 업스트림에 도입되었다. 15 내지 18개 아미노산의 유연한 글리신-세린 펩타이드 링커를 코딩하는 서열이 단일 사슬 가변 항체 단편 (scFv)의 구성을 위한 VH 및 VL 도메인들을 결합시키기 위해 삽입되었는데, 상기 도메인 중 하나는 CD3에 결합하고 다른 하나는 TAA에 결합한다. 이중특이 단일 사슬 항체를 형성하기 위해, 두 개의 scFv 도메인 서열들이 숏 펩타이드 링커 (GGGGS)를 위한 코딩 서열에 의해 연결되었다. 이러한 링커 서열과 함께 이후 bi-scFv 구조물들의 클로닝을 위한 scFv 도메인 교환을 위해 BamHI 제한효소 위치를 도입하였다. 심도 있게, 5' scFv-도메인들을 HindIII 및 BamHI 제한효소에 의해 교환시킬 수 있고 3' scFv-도메인들을 BamHI 및 XhoI 제한효소에 의해 교환시킬 수 있다.
모든 이용된 bi-scFv 항체 구조물들을 표준 포유동물 발현 벡터 pcDNA™3.1/myc-His (+) (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) 내로 클로닝하였다. C-말단 6xHis-tag은 상기 단백질의 금속 친화도 정제 및 검출 분석에 이용하였다. 모든 구조물들은 MWG'의 단일 판독 서열 서비스 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany)를 통한 시퀀싱에 의해 확인하였다. 또한 구축 개요에 대해서 도 11을 보라.
표 4: TAA 및 CD3 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 구조물의 요약
내부 명칭 TAA 특이성 5'-VH-VL 3'-VH-VL 코돈 이용
1BiMAB CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 HS
6PHU5 CLDN6 인간 mCLDN6ab TR66 HS
6PHU3 CLDN6 인간 TR66 mCLDN6ab HS
6PMU5 CLDN6 마우스 mCLDN6ab 145-2C11 MM
6PMU3 CLDN6 마우스 145-2C11 mCLDN6ab MM
HS, 호모 사피엔스; MM, 무스 무스큘러스; TAA 종양 관련된 항원
표 5: bi-scFv 구조물 정보의 요약
Figure 112021041708355-pat00005
계속 표 5
Figure 112021041708355-pat00006
HS, 호모 사피엔스; mAB, 단일클론 항체; MM, 무스 무스큘러스; TAA 종양 관련된 항원
b. 안정적인 생산자 세포주들의 생산
CLDN6 특이적 bi-scFv 단백질의 안정적인 생산자 세포 클론들을 제조하기 위해, 인간 배아 신장 세포주 HEK293 (ATCC CRL-1573)을 이용하였다.
트랜스펙션 2일 전에 1x107 HEK293 세포를 14.5 cm 조직 배양 디쉬에 20 ml의 완전 DMEM 배지 (10% 열 불활성화된 FBS 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax; 모든 시약 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 플레이팅하였다. 트랜스펙션 전에, 세포들을 2 mM EDTA가 보충된 DPBS로 세척한 후, FBS 또는 항생제 없는 20 ml의 플레인 DMEM 배지를 첨가하였다. pcDNA3.1/6PHU5 및 pcDNA3.1/6PHU3 구조물의 선형화된 DNA 20 μg (실시예 9.a에 기재됨)을 0.5 ml 플레인 DMEM/F-12 배지에 희석하였다. 75 μl의 1 mg/ml 선형 PEI 용액 (폴리에틸렌이미드; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Germany)을 상기 희석된 DNA에 첨가하여 격하게 볼텍싱하였다. 상온에서 15분 반응시킨 후, DNA/PEI 복합체를 한 방울씩 세포에 첨가하였고, 세포 배양 디쉬를 약하게 회전시켜준 후, 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에 배지를 바꿨다. 트랜스펙션된 세포의 선택은 최종 농도 0.8 mg/ml의 G418 술페이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)로 트랜스펙션 48시간 후에 시작하였다. 세포 배양 동안 세포 배지에 G418을 영구적으로 첨가하였다.
c. 다중클론성 HEK293 세포들과 bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3의 소-규모 생산
인 비트로 비교를 위해 Bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3를 소-규모로 생산하였고 다중클론성 HEK293 세포 상층액으로부터 정제하였다.
간략하게는, 컨플루언트 상태에서, FBS 없는 상층액을 실시예 9.b에 기재된 상기 다중클론성 세포주들로부터 수득하고 0.2 μm Minisart 주사기 필터 (Sigma-Aldrich, Germany)로 여과하였다. 이후, 제조자의 프로토콜 (Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 Ni-NTA 스핀 컬럼에 의해 세포 배양 상층액으로부터 bi-scFv 단백질들을 소-규모로 정제하였다. bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3의 흡광 계수 및 분자량 - ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)을 통해 결정됨 -의 고려 하에서 Bi-scFv 단백질 농도를 NanoDrop 2000c로 280 nm에서의 측정으로 결정하였다. 정제된 단백질들을 즉시 이용을 위해서 4℃에 저장하였다.
Bi-scFv 단백질들을 표준 과정 (Current Protocols in Protein Science, 2012)에 의해 실시된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 쿠마시 염색 및 웨스턴 블랏 분석으로 테스트하였다. 소-규모 정제된 단백질들을 NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) 상에서 분리하였다. 이후, 상기 겔을 표준 과정 (Current Protocols in Protein Science, 2012)에 따라 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하여 상기 세포 배양 상층액에 포함된 bi-scFv 단백질들 6PHU5, 6PHU3, 및 다른 단백질을 검출하였다. 웨스턴 블랏 분석을 실시하여 6xHis-택을 통해 bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3를 특이적으로 검출하였다. 간략하게는, PVDF 막에 단백질을 블랏팅하고 PBST/3% 분유로 블락킹한 후, 상기 막을 블락킹 완충액에서 1:500으로 희석된 일차 항체 항-HIS 에피토프-택 (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)과 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액으로 세척한 후, 막을 블락킹 완충액에서 1:10000으로 희석된 Fc-특이적 이차 퍼록시다제-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 IgG 항체 (Sigma Aldrich, Germany)와 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 블락킹 완충액으로 다시 세척한 후, 시그널을 수퍼시그널 웨스트 펨토 화학발광성 기질 (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에 의해 시각화하고, ImageQuant LAS 4000 이미저 (GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany)로 판독하였다. 내부 분자량 표준과 비교하여 bi-scFv 단백질들의 시그널이 50과 60 kD 사이에서 검출되었다.
d. 다중클론성 HEK293 세포들과 bi-scFv 단백질 6PHU3의 대-규모 생산
다중클론성 생산자 세포주를 제조자의 가이드라인에 따라 10-층 세포 팩토리 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서 10% FBS, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.8 mg/ml G418 (모든 시약들은 Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany로부터 구매됨)이 보충된 DMEM/F-12 GlutaMax로 배양하였다. 컨플루언트 단계에서, 세포를 DPBS로 세척하고 배지를 항생제를 가지지만 FBS가 없는 DMEM/F-12 배지로 교체하였다. bi-scFv 단백질 6PHU3를 포함하는 세포 상층액을 3주까지 동안 3-5일 마다 수거하였다. 상층액을 500 ml 스테리톱 필터 유니트 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에서 여과시켰고 FPLC-정제까지 4℃에 저장하였다.
FPLC-정제 전에, 상기 세포 배양 상층액에서 bi-scFv의 존재를 실시예 9.c에 간략하게 기재된 표준 과정에 의해 실시된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 쿠마시 염색 및 웨스턴 블랏 분석으로 테스트하였다.
e. bi-scFv 단백질 6PHU3의 정제 및 정량
bi-scFv 단백질 6PHU3를 포함하는 다중클론성 HEK293 세포의 세포 배양 상층액 (실시예 9.b에 기재됨)을 표준 과정 (Current Protocols in Protein Science, 2012)을 이용한 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)에 종속시켰다. 간략하게는, 세포 배양 상층액을 AKTA 정제기 10 FPLC 시스템에 연결된 His Trap FF 5 ml 컬럼 (두 개 모두 GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany) 상에 로딩하였다. PBS 세척 완충액은 10 mM 이미다졸을 포함하고, PBS 용출 완충액은 500 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4 및 250 mM 이미다졸을 포함하였으며, 양 완충액의 pH를 7.4로 조정하였다. 용출은 단계별 농도구배로 실시하였다. 용출된 bi-scFv 단백질 6PHU3는 Slide-A-Lyzer G2 투석 카세트 10K MWCO (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 1x PBS로 즉시 투석하였다. PBS 투석 후, bi-scFv를 H2O 기반된 200 mM 아르기닌 완충액 (L-아르기닌-모노히드로클로라이드; Roth, Karlsruhe, Germany)으로 투석하였다.
Bi-scFv 농축은 bi-scFv 단백질 6PHU3의 흡광 계수 및 분자량의 고려 하에서 NanoDrop 2000c로 280 nm에서의 측정으로 결정하였다. 정제된 단백질을 분취하고 장기간 저장을 위해서는 -80℃에 저장하거나 또는 즉시 이용을 위해서는 4℃에서 유지시켰다.
bi-scFv 단백질 6PHU3의 질 및 순도는 실시예 9.c에 기재된 대로 쿠마시 염색 및 웨스턴 블락 분석에 의해 테스트하였다. BSA 표준 희석은 쿠마시 과정에 포함되어 NanoDrop에 의해 측정된 농도를 개략적으로 확인시켜 주었다 (데이터를 보이지 않음).
실시예 10: CLDN6-타겟팅 bi-scFv 후보들 6PHU5 및 6PHU3의 효율
a. bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3에 의해 타겟 세포로 다시 보내지는 T 세포의 현미경적 분석
현미경적 분석을 통해 bi-scFc 단백질에 의한 CLDN6-발현 타겟 세포로 이펙터 세포의 재전송을 시각화하기 위해, 인 비트로 세포독성 어세이를 실시하였다. NiNTA 컬럼-정제된 bi-scFv 단백질들 6PHU3 및 6PHU5 (실시예 9.c를 보라)를 그들의 효율에 따라 상술한 두 개의 변이체들을 비교하는 데 이용하였다. 타겟 세포주로서 높은 레벨의 인간 CLDN6를 내인적으로 발현하는 난소 테라토암종 세포주 PA-1을 이용하였다.
인간 이펙터 세포를 표준 과정 (Current Protocols in Immunology, 2012)에 따라 건강한 공여자에서 얻은 인간 혈액으로부터 신선하게 분리하였다: 간략하게는, 혈액을 DPBS로 희석하였고, Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany)에서 층 로딩되어 원심분리하였다. 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)를 층간으로부터 수득하여, 2 mM EDTA가 보충된 냉장 DPBS로 세척하고 카운팅하였다. 이후 인간 T 세포를 제조자의 가이드라인에 따라 Pan T 세포 분리 키트 II (Miltenyi Biotec, Teterow, Germany)에 의해 PBMCs로부터 자성-활성화된 세포 분리 (MACS)에 의해 분리하였다.
1x105 PA-1 세포를 조직 배양 6-웰 플레이트에 웰 당 분주하였다. 인간 세포를 상기 기재된 바와 같이 준비하였으며 5:1의 (E:T) 비율을 타겟팅하는 이펙터에 첨가하였다. 5% 열 불활성화된 FBS, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA, 1 mM 소듐 비카르보네이트 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)가 보충된 MEM 배지를 모든 세포에 사용하였고 웰 당 최종 용량은 웰 당 2 ml로 조정하였다. 상기 이용된 bi-scFv 단백질의 농도는 이러한 어세이에서 50 ng/ml이었다. 대조군 시료는 bi-scFv 단백질 없는 타겟 또는 T 세포 단독으로 포함하였다. 이후 조직 배양 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 상기 어세이는 Wilovert S 도립 현미경 (Hund, Wetzlar, Germany)을 통해 6시간부터 24시간까지의 공동배양에서 연속적으로 관찰하였다. bi-scFv 단백질 6PHU5 및 6PHU3의 존재 하에서 타겟 세포 상에 T 세포 클러스터링, 면역학적 시냅스의 형성 및 타겟 세포 사멸의 측면에서 유의한 효과가 24시간에 보여졌고 Nikon Eclipse TS100 도립 현미경 (Nikon, Japan)으로 사진 촬영하였다. 도 12에서 볼 수 있듯이 양 bi-scFv 단백질들은 강력한 T 세포 클러스터링 및 타겟 세포 사멸을 이끈다.
b. bi-scFv 단백질들 6PHU5 및 6PHU3에 의해 매개되는 T 세포 활성화
T 세포 활성화의 검출 및 두 개의 CLDN6-특이적 bi-scFv 변이체들의 효율에서의 차이를 확인하기 위해, FACS-기반된 T 세포 활성화 어세이를 이용하였다. 초기 활성화 마커 CD69 및 후기 활성화 마커 CD25를 형광-컨쥬게이트된 항체에 의한 염색을 위해 선택하였다. 타겟 및 T 세포의 혼합물에서 인간 T 세포의 검출을 위해, T 세포 상의 CD3를 염색하였다.
대체로, 상기로부터 셋-업된 어세이를 선택하였다 (실시예 10.a). 간략하게는, CLDN6을 내인적으로 발현하는 PA-1 타겟 세포를 2 ml 완전 배지에서 5:1의 E:T 비율로 인간 T 세포와 함께 분주하였고 bi-scFv 단백질들 6PHU5 또는 6PHU3를 5 - 200 ng/ml의 범위 내 농도로 첨가하였다. 대조군 시료는 bi-scFv 단백질들과 함께 또는 없이 타겟 또는 T 세포 단독으로 포함하였다. 24시간 및 48시간 후 T 세포를 플러싱하여 수득하였고 5 ml 라운드 바닥 튜브 (BD Falcon, Heidelberg, Germany)로 옮겼다. 세포를 원심분리시켜 DPBS로 세척하였다. 세포 염색을 위해 마우스 항-인간 CD3-FITC를, 마우스 항-인간 CD69-APC, 및 마우스 항-인간 CD25-PE (모든 항체들 BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하였다. 세포 펠렛을 형광-컨쥬게이트된 항체 및 2 μl 7-AAD (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 포함하는 50 μl의 FACS-완충액 (5% FBS가 보충된 DPBS)에 재현탁하였다. 암에서 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 시료를 4 ml DPBS로 세척하며 세포 펠렛을 200 μl의 FACS 완충액에 재현탁하였다. FACSCanto II 유세포 분석기 (both BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용한 측정 내내 시료를 얼음 및 암 상태로 유지시켰다. 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 평가하였다.
CLDN6-특이적 bi-scFv 변이체들 모두 60%까지의 효율적인 T 세포 활성화를 초래하였다. 변이체 6PHU3 (bi-scFv CD3 x CLDN6)는 5 -10 ng/ml의 낮은 농도 범위에서 더 강력하였고 (또한 도 13 참고) 이에 따라 추가적인 연구들을 위해 선택하였다.
실시예 11: bi-scFv 6PHU3의 결합능
FACS 결합 어세이
bi-scFv 단백질 6PHU3의 CLDN6 및 CD3-타겟팅 모이어티의 결합능을 평가하기 위해, 유세포 분석 어세이를 이용하였다. 항-CLDN6 위치를 조사하기 위해 CLDN6를 내인적으로 발현하는 PA-1 및 OV-90 세포를 이용하였으며 항-CD3 위치를 조사하기 위해 인간 T 세포를 이용하였다. CLDN6 음성 NugC4 세포들을 대조군으로서 사용하였다.
항-CLDN6 결합능의 조사를 위해, CLDN6 양성 세포 (PA-1, OV-90) 및 CLDN6 음성 세포 (NugC4)를 트립신화시키고, 완전 배지로 세척한 후 DPBS로 세척하였다. 모든 세척 단계는 4℃에서 6분 동안 1200 rpm으로 원심분리하여 실시하였다. 1x105 세포들을 5 ml 라운드 바닥 튜브에 옮기고 FACS-완충액 내 0.01 - 10 μg/ml의 FPLC-정제된 6PHU3 단백질 또는 대조군 bi-scFv 단백질 1BiMAB와 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세포를 2 ml의 FACS-완충액으로 세척한 후 3.3 μg/ml의 단일클론 항체 항-HIS 에피토프-택 (Dianova GmbH, Hamburg, Germany)과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 2 ml의 FACS-완충액으로 세척한 후, 상기 세포 펠렛을 FACS-완충액으로 1:200로 희석된 APC-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)와 암 상태에서 20분 동안 4℃에서 반응시켰다. 세포를 2 ml의 FACS-완충액으로 두 번 세척하고 1 μg/ml PI (Sigma Aldrich, Germany)가 보충된 150 μl의 FACS-완충액에 최종적으로 재현탁하여 죽은 세포를 카운터염색하였다. 음성 대조군 시료는 이차 염소-항-마우스 APC 항체 단독을 포함하였다. 양성 대조군으로서 10 μg/ml의 단일클론 CLDN6-특이적 항체 mCLDN6ab가 이차 염소-항-인간 APC 항체 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, England)로 염색되었고 이의 이차 항체 단독이 대조군으로 이용되었다.
시료들을 FACSCalibur 유세포 분석기 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 측정하였으며 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 분석하였다. 10 μg/ml 6PHU3의 시그널 강도는 양성 대조군 mCLDN6ab보다 4-9배 더 낮았다 (도 15A 참고). CLDN6-음성 세포주 NugC4에 대한 6PHU3의 비특이적 결합은 검출되지 않았다 (도 15C).
bi-scFv 단백질 6PHU3의 항-CD3 암(arm)의 결합능을 조사하기 위해, 인간 T 세포를 이용하였다. 5x105 T 세포를 5 ml 라운드 바닥 튜브로 옮기고 FACS-완충액에서 100 ng/ml - 10 μg/ml의 범위 내에 존재하는 FPLC-정제된 6PHU3 단백질과 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 추가적인 염색 과정은 상기 기재된 대로였다. 대조군 시료는 이차 염소-항-마우스 APC 항체 단독 및 단일클론 항체 항-HIS 에피토프-택 플러스 이차 염소-항-마우스 PE 항체를 포함하였다. 측정 및 분석을 상기 기재된 대로 실시하였다. 유의한 시그널이 100 ng/ml 6PHU3로 얻어졌다 (또한 도 15B 참고).
실시예 12: bi-scFv 6PHU3에 의한 타겟 의존적 T 세포 활성화의 조사
실시예 10.a 및 b에 기재된 대로 세포독성 어세이를 실시하였다. 간략하게는, CLDN6를 내인적으로 발현하는 PA-1 타겟 세포를 2 ml 완전 배지에서 5:1의 E:T 비율로 인간 T 세포와 함께 분주하였고 bi-scFv 단백질 6PHU3를 0.001 - 1000 ng/ml의 범위 내 농도로 첨가하였다. bi-scFv 매개된 T 세포 활성화에 대한 타겟 의존성을 분석하기 위해, T 세포를 타겟 세포 없이 분주하였지만 상기 타겟 플러스 T 세포 시료로서 동일한 bi-scFv 6PHU3 농도와 반응하였다. 24시간 및/또는 48시간 후 T 세포들을 플러싱하여 수득하였고 5 ml 라운드 바닥 튜브 (BD Falcon, Heidelberg, Germany)로 옮겼다. 세포 염색 및 분석은 실시예 10.b에 기재된 대로 실시하였다.
도 16A 및 16B에서 볼 수 있듯이, 타겟 세포의 부존재 하에서 어떠한 6PHU3 매개된 T 세포 활성화도 관찰 가능하지 않은데, 이는 bi-scFv 기능성의 엄격한 타겟 의존성을 보여준다. 유의한 T 세포 활성화는 48시간 후 0.01 ng/ml 6PHU3에서만 일어났다.
실시예 13: 인 비트로 세포독성 어세이에서 bi-scFv 6PHU3의 EC50의 결정
루시퍼라제 세포독성 어세이
bi-scFv 단백질 6PHU3의 절반의 최대 효과적 투여량의 결정을 위해, 6PHU3의 적정 선을 인 비트로 루시퍼라제 세포독성 어세이에서 테스트하였다.
5:1의 E:T 비율로 안정적으로 루시퍼라제-발현 PA-1 세포 및 인간 T 세포를 1 pg/ml 내지 1 μg/ml (10의 단계에서)의 농도 범위 내 bi-scFv 단백질 6PHU3와 반응시키거나 또는 6PHU3 없이 반응시켜 Lmin 값을 결정하였다.
세포 배양 마이크로플레이트를 5% CO2, 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 반응시켰다. 분석을 위해, 1 mg/ml 루시페린 (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 및 50 mM HEPES을 포함하는 50 μl의 물 용액을 웰 당 첨가하였으며 이후 플레이트를 암 상태로 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 루시퍼라제 발현 살아있는 세포에 의한 루시페린의 산화로부터 발생하는 발광을 Infinite M200 테칸 마이크로플레이트-판독기 (Tecan, Mannedorf, Switzerland)에서 측정하였다. 특이적 타겟 세포 용해의 백분율을 다음의 공식으로 산출하였다: % 특이적 용해 = [1 - (발광테스트 시료 - Lmax) / (Lmin - Lmax)] x 100, "L"은 용해를 나타낸다. Lmin은 bi-scFv의 부존재 하에서 최소 용해를 의미하고 Lmax는 Triton X-100 (2% 최종 농도)의 첨가에 의해 달성되는 bi-scFv의 부존재 하에서 최대 용해 (자발적인 발광 카운트와 동일)를 의미한다.
최대 용해는 1 - 10 ng/ml 6PHU3를 처리하여 48시간 후에 도달하였고, 48시간 후 상기 결정된 EC50은 약 10 pg/ml이다 (또한 도 17을 보라). 이러한 어세이의 결과는 다른 사람들에 의해 보고 (예를 들어, Lutterbuese, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010 Jul 13;107(28):12605-10)된 대로 공여자의 면역 상태에 따라 다양한 인간 T 세포의 강력함에 강하게 의존한다. 따라서, 3배의 bi-scFv 단백질 6PHU3의 EC50 값 다양함은 본 발명의 과정 동안 관찰되었었다.
실시예 14: 마우스 이종이식 모델에서의 효율
인 비보 bi-scFv 단백질 6PHU3의 치료학적 포텐셜을 조사하기 위해, 마우스 스트레인 NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ 또는 숏 NSG (Jackson laboratory, Bar Harbour, ME, USA)를 선택하였다. 상기 기재된 연구를 위해 마우스에 인간 이펙터 세포 및 인간 T 림프구의 접목은 인 비보 bi-scFv에 관여하는 T 세포의 효과를 연구하기 위해 필수불가결하다. B-, T- 및 NK 세포의 완전한 결핍으로 인해, 상기 마우스 스트레인 NSG는 이러한 종류의 이종이식 연구에 적합하다. 주로 PBMC 주입 후 접목된 인간 T 세포를 가지는 마우스 모델은 본 발명의 일부로서 확립되었다.
a. bi-scFv 단백질 6PHU3를 가지는 마우스에서 진행된 CLDN6를 많이 발현하는 종양의 후기 개시 치료
상기 예증된 연구에서, 높은 레벨의 인간 CLDN6를 내인적으로 발현하는 1x107 PA-1 세포를 8 - 11주령된 25마리의 암컷 및 25마리의 수컷 NSG 마우스에 피하로 접종하였다. 종양 세포 접종 마우스는 15일째에 처리 그룹 내 종양 용적에 따라 희생시켰고, 종양 성장이 없는 마우스는 배제하였다. 동일한 날에 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)는 Ficoll 밀도 구배 기술에 의해 건강한 공여자의 인간 혈액으로부터 분리하고 인 비보에서 이펙터 세포로 이용하였다. 200 μl DPBS에 희석된 2x107 PBMCs는 분리한 날에 "PBMC"로 지정된 실험적 처리 그룹에 복강 내 주입하였다. "PBS"로 지정된 처리 그룹은 200 μl 플레인 DPBS를 대신 복강 내로 받았고 인간 이펙터 세포 없는 대조군으로 이용하였다. "PBS" 대조군 그룹과 함께 6PHU3 자체에 의한 종양 성장 상의 잠재적 효과 또는 6PHU3 또는 비히클에 의해 야기되고 마우스 조직에 대한 인간 이펙터 세포에 의해 야기되지 않는 어떠한 잠재적인 부작용 (즉, 마우스 조직에 대한 인간 이펙터 세포에 의해 나타나는 그라프트-대-숙주 반응)에 대한 검사를 조사할 수 있다. "PBS/비히클" 그룹은 8마리의 마우스를 포함하고(n=8), "PBS/6PHU3"는 8마리의 마우스를 포함하며(n=8), "PBMC/비히클"은 7마리의 마우스를 포함하고(n=7) "PBMC/6PHU3"는 7마리의 마우스를 포함하며(n=7), "PBMC/1BiMAB"는 8마리의 마우스를 포함하였다 (n=8). 치료는 DPBS 또는 PBMC 적용 후 7일째에 시작하였다: "PBS/6PHU3", "PBMC/6PHU3" 및 "PBMC/1BiMAB" 그룹은 동물 당 200 μl의 DPBS에 희석된 5 μg의 정제된 bi-scFv 단백질 6PHU3 또는 1BiMAB를 복강 내로 받았다. "PBS/비히클" 및 "PBMC/비히클" 그룹은 DPBS에 희석된 200 μl의 비히클 완충액 (H2O에 녹여진 200 mM L-아르기닌-모노히드로클로라이드, 멸균 여과됨)을 복강 내로 받았다. 처리 그룹은 표 6에 요약되어 있다. 치료법은 26일 동안 매일 실시하였다. 주 당 두 번씩 종양 크기를 디지털 계산된 칼리퍼로 측정하였으며 종양 용적을 mm3 = 길이 x 너비 x (너비/2)의 공식에 따라 계산하였다. 도 18A 및 B는 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 항체에 의해 "PBMC/1BiMAB" 그룹의 마우스 모두에서 종양 성장의 억제를 예증한다. 종양 용적이 1500 mm3를 초과하거나 또는 심각한 병적 상태의 경우 (그라프트-대-숙주 증상들이 일부 마우스에서 관찰되었음)에 마우스는 경추이탈로 희생시켰다.
표 6: 처리 그룹
처리 마우스의 # 이펙터 세포 Bi-scFv μg bi-scFv
그룹 (G) (n) 단백질 단백질/마우스
G1 8 - - -
G2 8 - 1 6PHU3 5
G3 7 PBMC - -
G4 7 PBMC 6PHU3 5
G5 8 PBMC 1BiMAB 5
b. 체중에 따른 치료 영향의 결정
실험실 저울을 사용하여 각 마우스의 체중을 주 당 두 번씩 조사하였다. 어떠한 그룹 내 마우스도 치료 시간 동안 무게 감소를 나타내지 않았다 (데이터를 보이지 않음).
c. 조직 보존 및 비장세포 분리
마우스를 죽인 후, 종양을 해부하고 면역조직학적 분석을 위해 즉시 조직을 10 ml Roti-Histofix 4% (Carl Roth, Karlsruhe, Germany)에 고정시켰다. 더욱이, 비장을 해부하여 유세포 분석에 의해 인간 세포의 접목을 검출하였다. 비장 해체 후 3 - 5 ml 주사기의 멸균 플런저로 50 ml 반응 튜브에 위치된 70 μm 세포 여과기를 통해 상기 비장을 짓이기고 따뜻한 DPBS로 상기 세포 여과기를 반복적으로 플러싱하여 즉시 비장세포 분리를 실시하였다. 분리된 비장세포를 원심분리하였고, DPBS를 제거하였으며 상기 비장세포 펠렛을 10% DMSO가 보충된 1 ml의 열 불활성화된 우태아혈청에 재현탁하였다. 시료들을 즉시 -80℃에 동결시켰고 모든 마우스로부터 비장세포 시료 채취를 끝마칠 때까지 저장하였다.
d. 마우스 비장에서 인간 T 림프구의 접목 분석
모든 마우스로부터 비장세포를 수득하여 실시예 14.c에 기재된 대로 동결하였다. 비장세포 시료의 완전한 수집물을 한번에 해동시켰으며, 모든 세포를 따뜻한 DPBS로 두 번씩 세척하였고 시료 당 1x106 비장세포를 형광-컨쥬게이트된 항체와 암 상태로 4℃에서 20분 동안 반응시켜 항-CD45 염색에 의해 인간 세포의 접목을 검출하였으며 항-CD3, 항-CD4, 및 항-CD8 염색에 의해 인간 T 세포의 백분율을 검출하였다. 유세포 분석을 FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 실시하였다. 도 18D에서 볼 수 있듯이 양 "PBMC" 그룹에서 인간 T 세포 접목은 CD45-CD3 이중 양성 비장세포의 높은 백분율로 확인할 수 있었다.
e. 타겟 발현 및 T 세포 침투의 결정을 위한 면역조직화학
해부 후 4% 완충화된 포름알데히드-용액 (Roti-Histofix, Carl Roth, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 4℃에서 48시간 동안 종양을 고정하였다. 상기 고정된 종양은 두 부분으로 나뉘어지고 탈수를 위해 자동화된 진공 조직 프로세서 ASP200 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)로 옮긴 후 파라핀 디스펜서 스테이션 MPS/C (Slee Medical GmbH, Mainz, Germany)를 통해 파라핀 내로 임베드되었다. 면역조직화학적 염색을 위해, 상기 포르말린-고정되고 파라핀-임베드된 조직의 3 μm 두께의 절편을 회전 마이크로톰 RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)를 이용하여 생산하였다. 탈파라핀화 및 재-수화를 2선의 배치 염색기 StainMate Max (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에서 실시한 후 0,05% Tween20을 포함하는 10 mM 시트르산 완충액, pH6에서 120℃로 10분 동안 열-유도된 에피토프 복구를 실시하였다. 이후 내인성 퍼록시다제를 PBS 내 0.3% H2O2 용액 (Carl Roth)으로 15분 동안 퀀칭한 후, PBS 내 10% 염소 혈청 (PAA Laboratories GmbH/GE Healthcare, Pasching, Austria)과 30분 동안 반응시켜 비특이적 항체 결합 위치를 차단하였다. TAA 클라우딘(Claudin) 6는 다중클론 일차 항체 항-마우스 클라우딘 6 (C) 래빗 (IBL-America, Minneapolis, MN, USA)과 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 검출하였다; T 세포는 다중클론 항-CD3 AB (Abcam, Cambridge, UK)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 BrightVision 폴리머 HRP-컨쥬게이트된 항-래빗 2차 항체 (ImmunoLogic, Duiven, Netherlands)와 반응시켜 연속적인 섹션에서 검출하였다. 결합 반응은 제조자의 설명서에 따라 벡터 NovaRED 키트 (Vector Laboratories Ltd., Peterborough, UK)를 이용하여 시각화시킨 후, 헤마톡실린 카운터염색 (Carl Roth), 탈수 및 마운팅을 실시하였다. 분석 및 문서화는 Axio 이미저 M2 또는 Mirax 스캐너 (both Carl Zeiss Microscopy GmbH, Goettingen, Germany)를 이용하여 실시하였다.
도 19에서 볼 수 있듯이, 가장 높은 T 세포 침투를 CD3 염색에 의한 "PBMC/6PHU3" 그룹의 종양에서, 특히 CLDN6 발현의 가장자리 영역에서 검출하였다. 대조군 그룹에서 TAA CLDN6의 이질성 발현 패턴 (도 19A, B, C, 및 D)은 치료의 결과로서 "PBMC/6PHU3" 그룹의 종양에서 CLDN6 발현의 더 치밀한 영역으로 변했다 (도 19D).
실시예 15: CLDN18.2 및 CD3를 타겟팅하는 이중특이 결합제의 제조 및 테스팅
a. 서열 오리진, bi-scFv 구조물의 고안, 및 템플레이트 벡터로의 클로닝
인간 T 세포 수용체 구성성분 CD3 엡실론 및 인간 종양 관련된 항원 (TAA)에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 이중특이 탠덤 단일 사슬 항체 구조물들 (bi-scFv)을 제조하였다. 각 구조물에 대해 상응하는 중쇄 가변부 (VH) 및 상응하는 경쇄 가변부 (VL)을 5'-말단부터 3'-말단까지 연속적인 순서로 특이적으로 배열시켰다:
pST1-hAgKozak-VH αCLDN18.2-VL αCLDN18.2-VH αCD3-VL αCD3-His-2hBgUTR-A120
(1BiMAB, 18RHU5, 번호 1-5)
psT1-hAgKozak-VH αCD3-VL αCD3-VH αCLDN18.2- VL αCLDN18.2-His-2hBgUTR-A120
(18RHU3, 번호 6-10)
표 7은 본 발명의 과정에서 제조되었던 TAA CLDN18.2 및 PLAC1에 특이적인 모든 bi-scFv 구조물들을 요약하고 있다. 상기 bi-scFv 구조물들은 상기 상응하는 항체의 VH 및 VL 서열을 이용하는 GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Germany)에 의한 유전자 합성을 통해 제조하였다. 호모 사피엔스 (HS), 무스 무스큘러스 (MM), 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 같은 코돈 최적화는 GeneArt의 GeneOptimizer® 소프트웨어에 의해 실시하였으며, 표 7에 나열되어 있다. 모든 적용된 도메인들의 특이성, 단일클론 항체 (mAB)으로부터 유래된 서열 오리진, 코돈 이용, 추가적인 서열 특징 및 레퍼런스에 대한 정보는 표 8에 요약되어 있다. 각 CD3 항체들의 가변 도메인 서열 오리진은 표 8에 나열되어 있다. 인간 및 마우스 TAAs의 높은 상동성을 인해, 동일한 항-TAA VH 및 VL 서열이 마우스 어세이를 위한 bi-scFv 구조물들의 제조에 이용될 수 있지만, 마우스 특이적 항-CD3 항체 클론 145-2C11의 VH, VL 서열들과 조합하여 이용될 수 있다.
DNA 클로닝 및 발현 벡터 구축은 당업자에게 잘 알려진 표준 과정 (Green/Sambrook, Molecular Cloning, 2012)에 따라 실시하였다. 간략하게는, 리드오프 bi-scFv DNA 서열은 pST1 플라스미드 내로 클로닝을 위한 5' BsmBI 및 3' XhoI 제한효소 위치를 가지도록 제공하였다. 분비 시그널 서열이 bi-scFv 분비를 위해 bi-scFv 서열의 5' 말단 업스트림에 도입되었다. 15 내지 18개 아미노산의 유연한 글리신-세린 펩타이드 링커를 코딩하는 서열이 단일 사슬 가변 항체 단편 (scFv)의 구성을 위한 VH 및 VL 도메인들을 결합시키기 위해 삽입되었는데, 상기 도메인들 중 하나는 CD3에 결합하고 다른 하나는 TAA에 결합한다. 이중특이 단일 사슬 항체를 형성하기 위해, 두 개의 scFv 도메인 서열들이 숏 펩타이드 링커 (GGGGS)를 코딩하는 서열에 의해 연결되었다. 이러한 링커 서열과 함께 이후 bi-scFv 구조물들의 클로닝을 위한 scFv 도메인 교환을 위해 BamHI 제한효소 위치를 도입하였다. 간략하게는, 5' scFv-도메인들을 BsmBI 및 BamHI 제한효소에 의해 교환하였고 3' scFv-도메인들을 BamHI 및 XhoI 제한효소에 의해 교환하였다. 상기 번역된 단백질의 검출 분석을 위해 C-말단성 6xHis-택을 붙였다. 상기 bi-scFv 서열의 인간 알파 글로빈 5' 및 인간 베타 글로빈 3'의 비번역된 부위들이 상기 pST1 벡터에 존재하였다 (보다 상세하게는 WO2007/036366A2; Waggoner, S. et al. (2003) Exp. Biol. Med. (Maywood) 228 (4), pp. 387-395 참고).
1BiMAB 레플리콘 벡터 생산을 위해, 분비 시그널 및 6xHis-택을 포함하는 완전한 1BiMAB를 K. Lundstrom에 의해 친절하게도 제공된 셈리키 포리스트 바이러스 레플리콘 벡터 (pSFV) (Lundstrom, K. et al. (2001) Histochem. Cell Biol. 115 (1), pp. 83-91; Ehrengruber, M.U. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12), pp. 7041-7046)에 3'으로 서브클로닝시켰다.
모든 구조물들은 MWG'의 단일 판독 서열 서비스 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany)를 통한 시퀀싱에 의해 확인하였으며 올바른 서열과 100개 이상의 아데닌의 폴리(A) 테일을 가진 구조물들만 인 비트로 RNA 전사에 이용되었다.
또한 구축 개요에 대해서 도 20 A를 보라.
표 7: TAA 및 CD3 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 mRNA-템플레이트 구조물의 요약
내부 명칭 TAA 특이성 5'-V H -V L 3'-V H -V L 코돈 이용
1BiMAB CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 HS
번호 1 CLDN18.2 마우스 mCLDN18.2ab 145-2C11 CHO
번호 2 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab UCHT1-HU CHO
번호 3 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab UCHT1 CHO
번호 4 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab CLB-T3 CHO
번호 5 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 CHO
번호 6 CLDN18.2 마우스 145-2C11 mCLDN18.2ab CHO
번호 7 CLDN18.2 인간 UCHT1-HU mCLDN18.2ab CHO
번호 8 CLDN18.2 인간 UCHT1 mCLDN18.2ab CHO
번호 9 CLDN18.2 인간 CLB-T3 mCLDN18.2ab CHO
번호 10 CLDN18.2 인간 TR66 mCLDN18.2ab CHO
18RHU5 CLDN18.2 인간 mCLDN18.2ab TR66 HS
18RHU3 CLDN18.2 인간 TR66 mCLDN18.2ab HS
18RMU5 CLDN18.2 마우스 mCLDN18.2ab 145-2C11 MM
18RMU3 CLDN18.2 마우스 145-2C11 mCLDN18.2ab MM
대조군 bi-scFv
번호 25 PLAC1 인간 78H11 TR66 CHO
Bi-scFv는 이중특이 단일 사슬 가변성 단편을 나타낸다; CHO, 중국 햄스터 난소; HS, 호모 사피엔스; HU, 인간화된; MM, 무스 무스큘러스; TAA, 종양 관련된 항원; VH, 가변성 중쇄 도메인, VL, 가변성 경쇄 도메인.
표 8: bi-scFv mRNA-템플레이트 구조물 정보의 요약
Figure 112021041708355-pat00007
표 8 계속
Figure 112021041708355-pat00008
CHO는 중국 햄스터 난소를 나타낸다; HS, 호모 사피엔스; mAB, 단일클론 항체; MM, 무스 무스큘러스; TAA, 종양 관련된 항원.
b. IVT-RNA 합성
항-CLDN18.2-특이적 bi-scFv IVT 템플레이트들의 생산을 위해, 플라스미드들을 클래스 II의 엔도뉴클레아제를 이용하여 폴리(A)-꼬리 다운스트림 쪽에서 선형화시켰다. 선형화된 템플레이트 DNA를 다른 곳에 기재된 대로 (Holtkamp, S. et al. (2006) Blood 108 (13), pp. 4009-4017) 페놀/클로로포름 추출 및 소듐 아세테이트 침전에 의해 정제하였다.
선형화된 DNA 템플레이트들을 제조자의 가이드라인에 따라 MEGAscript 키트 (Ambion /Life Technologies, Darmstadt, Germany)를 이용하여 인 비트로 전사시켰다; pST1 템플레이트들을 MEGAscript T7 키트로 전사시켰고 pSFV 템플레이트들을 MEGAscript SP6 키트로 전사하였다. cap 아날로가(analoga)와 반응을 위해, 상기 GTP 농도를 1.5 mM까지 낮췄으며 다른 곳에 기재된 대로 (Kowalska, J. et al. (2008) RNA 14 (6), pp. 1119-1131; Grudzien, E. et al. (2004) RNA 10 (9), pp. 1479-1487; Stepinski, J. et al. (2001) RNA 7 (10), pp. 1486-1495) 합성된 6 mM의 ARCA, 베타-S-ARCA(D1), 또는 베타-S-ARCA(D2)를 상기 반응에 첨가하였다. 매뉴얼에 따라 MEGAclear 키트 (Ambion /Life Technologies, Darmstadt, Germany)로 IVT-mRNA의 정제를 실시하였다. 상기 IVT-RNA의 농도 및 품질을 분광 광도계로 평가하였으며 분석은 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 상에서 실행하였다.
실시예 16: 다양한 CLDN18.2-특이적 IVT-mRNAs로 트랜스펙션된 타겟 세포에 의한 bi-scFv 분비에 반응하는 T 세포 활성화
CLDN18.2-특이적 bi-scFv IVT-RNA 기능성의 조사를 위해, 상대적으로 높은 레벨의 인간 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 위 암종 세포주 NugC4 (Sahin, U. et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14 (23), pp. 7624-7634)를 타겟 세포주로 이용하였다.
NugC4 타겟 세포 - 매 어세이 전에 FACS 분석에 의해 TAA 발현에 대해 일상적으로 테스트됨 - 를 얼음 냉장 X-Vivo 15 배지 (LONZA, Basel, Switzerland)로 두 번 세척하였으며 2x107 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 250 μl 세포 현탁액을 전-냉장된 0.4 cm Gene Pulser/MicroPulser 큐벳 (Bio-Rad, Dreieich, Germany)으로 옮기고 20 μg/ml IVT-mRNA를 첨가하였다. 이용된 IVT-mRNAs는: 1BiMAB, 번호 2, 번호 3, 번호 4, 번호 5, 번호 7, 번호 8, 번호 9 및 번호 10이었다. bi-scFv 변이체들에 대한 상세한 정보를 위해 표 7 및 8을 보라. 주의깊게 혼합한 후, 세포를 다음의 조건을 이용하는 BTX ECM 830 전기천공기 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)로 트랜스펙션시켰다: 250 V, 2 펄스, 12 ms 펄스 길이, 400 ms 간격 길이. 전기천공 후 즉시, 큐벳을 짧게 얼음에 담근 후 세포 현탁액을 15 ml 튜브 내 RT 웜 어세이 배지 (5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청, 0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)를 포함하는 RPMI 1640 배지) 내로 옮겼다. 트랜스펙션된 타겟 세포를 카운팅하고 ml 당 1x105 세포로 조정하였다.
표준 과정 (Current Protocols in Immunology, 2012)에 따라 건강한 공여자의 인간 혈액으로부터 인간 이펙터 세포를 신선하게 분리하였다: 간략하게는, 혈액을 DPBS로 희석하였고, Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munich, Germany)에서 층 로딩되어 원심분리하였다. 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)를 층간으로부터 수득하여, 2 mM EDTA가 보충된 냉장 DPBS로 세척하고 카운팅하였다. 인간 세포독성 T 세포를 제조자의 가이드라인에 따라 CD8+ T 세포 분리 키트, 인간 (Miltenyi Biotec, Teterow, Germany)에 의해 PBMCs로부터 자성-활성화된 세포 분리 (MACS)로 분리하였다. FACS 분석 (CD4, CD8 염색)을 통해 성공적인 T 세포 분리를 위해 이펙터 세포 분리를 일상적으로 테스트하였다. T 세포는 어세이 배지에서 ml 당 5x105 세포로 조정하였다.
1x105 타겟 세포를 조직 배양 6-웰 플레이트에 웰 당 분주하였고 인간 T 세포를 5:1의 (E:T) 비율로 첨가하였다. 이펙터 및 타겟 세포를 포함하는 대조군 시료들은 번호 25, 양성 대조군으로서 5 ng/ml의 최종 농도로 부모 IgG mAB chCLDN18.2ab 및 1BiMAB 단백질을 분비하는 타겟 세포를 포함하였다. 대조군들은 전기천공된 타겟 세포 단독 또는 1BiMAB 단백질을 가지거나 이를 가지지 않는 T 세포 단독으로 포함하였다. 간략하게는, 모든 세포는 세포 스크랩퍼 (Sarstedt AG & Co, Nurmbrecht, Germany)로 부드럽게 긁어서 수득하였고 5 ml 라우드 바닥 튜브 (BD Falcon, Heidelberg, Germany)로 옮겼다. 세포를 원심분리시켜 DPBS로 세척하였다. 세포 염색 마우스 항-인간 CD3-FITC를 위해, 마우스 항-인간 CD69-APC, 및 마우스 항-인간 CD25-PE (모든 항체들 BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하였다. 세포 펠렛을 형광-컨쥬게이트된 항체를 포함하는 50 μl의 FACS-완충액 (5% FBS가 보충된 DPBS)에 재현탁하였다. 암에서 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 시료를 4 ml DPBS로 세척하며 죽은 세포를 검출하기 위해 세포 펠렛을 1:1000의 최종 희석된 프로피디움 이오디드 (PI) (Sigma Aldrich, Germany)를 포함하는 200 μl의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 측정 내내 시료를 얼음 및 암에서 유지시켰다. 상기 어세이의 확립을 FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)로 실시하였다. 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, USA)로 평가하였다.
도 21 A에서 볼 수 있듯이, 각 CLDN18.2-특이적 IVT-mRNA는 효과적인 T 세포 활성화에서 보여지듯이 bi-scFv 단백질의 분비를 초래하였다. T 세포 활성화에서 아주 약간의 차이만 가진 가장 강력한 변이체들은 하향 순서로 번호 5 > 번호 8 > 번호 10 > 번호 3 > 1BiMAB였다. 모든 상술한 변이체들은 55% 초과의 총 T 세포 활성화를 유도하였지만, 번호 2, 번호 4, 번호 7 및 번호 9 변이체들은 40 내지 50%의 총 T 세포 활성화를 유발하였다.
특이적 타겟 세포 용해를 다음 공식에 의해 계산하였다: % 용해 = (% PI+ 타겟 세포시료 - % PI+ 타겟 세포EP 레퍼런스)이며, "시료(sample)"는 공동배양된 이펙터 및 타겟 세포를 명시하며 "EP 레퍼런스(reference)"는 각 개별 IVT-mRNA 전기천공만으로 타겟 세포를 전기천공시켰다. 도 21 B에서 볼 수 있듯이, 65% 초과의 타겟 세포 용해는 하향하는 순서로 1BiMAB > 번호 5 > 번호 8 > 번호 3 변이체에 의해 달성되었다. 다른 변이체들은 55 - 64%의 타겟 세포 용해를 매개하였다.
가장 강력한 CLDN18.2-특이적 bi-scFv는 TR66 (1BiMAB, 번호 5, 번호 10) 또는 UCHT1 (번호 3, 번호 8)의 VH 및 VL 도메인을 운반한다. 도메인 방향성에 있어서, bi-scFv 변이체 단백질들과 비교하여 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다 (실시예 3 참고). 상기 단백질 연구들에 따라 1BiMAB를 인코딩하는 IVT-mRNA를 이후 연구들을 위해 선택하였다.
더 늦은 시간 포인트에서 1BiMAB와 18RHU5 및 18RHU3 구조물들 (표 7 및 8을 보라)을 비교하였다. 18RHU5의 효율이 1BiMAB와 동일하였으며, 18RHU3는 덜 강력하였다 (데이터를 보이지 않음).
실시예 17: CLDN18.2-특이적 bi-scFv 1BiMAB를 분비하는 타겟 세포로 다시 보내지는 T 세포의 현미경적 분석
어세이 셋-업은 실질적으로 실시예 2.a에 기재된 대로였다.
제조자의 가이드라인에 따라 CD8+ T 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Teterow, Germany)에 의해 신선하게 분리된 PBMCs로부터 인간 세포독성 T 세포를 MACS로 분리하였다.
80 μg/ml의 1BiMAB IVT-mRNA 또는 80 μg/ml의 번호 25 ctrl IVT-mRNA를 사용했다는 점을 제외하고는 실시예 16에 기재된 대로 NugC4 타겟 세포를 제조하고 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 타겟 세포를 카운트하고 ml 당 2x105 세포로 조정하였다. 1x104 타겟 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 분주하고 인간 세포독성 T 세포를 5:1의 E:T 비율에 따라 첨가하였다. 웰 당 최종 용량은 100 μl였다. 대조군 시료는 전기천공 후 건강함을 증명하기 위해 트랜스펙션된 타겟 세포 단독 및 이펙터 세포를 가지는 대조군 bi-scFv 트랜스펙션된 타겟 세포를 포함하였다. 이후 조직 배양 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 1BiMAB 트랜스펙션된 타겟 세포를 포함하는 시료에서 타겟 세포 상에 T 세포 클러스터링, 면역학적 시냅스의 형성 및 타겟 세포 사멸의 측면에서 유의한 효과가 24시간에 보였고 Nikon Eclipse TS100 도립 현미경 (Nikon, Japan)으로 기록하였다. 어떠한 T 세포 클러스터링 또는 타겟 세포 용해도 번호 25 트랜스펙션된 타겟 세포를 가지는 대조군 시료에서 관찰되지 않았는데 이는 T 세포 활성화를 유도하는 TAA 발현 상의 엄격한 의존성을 의미한다. 또한 도 22를 보라.
실시예 18: CLDN18.2-특이적 bi-scFv 1BiMAB에 의한 농도 의존적 T 세포 활성화의 유세포 분석
TAA-발현 타겟 세포의 존재 하에서 T 세포의 bi-scFv 농도 의존적 활성화를 조사하기 위해 3배의 희석 시리즈를 상기 트랜스펙션 공정에 적용하였다.
40 μg/ml의 최종 1BiMAB IVT-mRNA 농도를 사용했다는 점을 제외하고는 실시예 16에 기재된 대로 NugC4 타겟 세포를 제조하고 트랜스펙션하였다. 1BiMAB IVT-mRNA 농도는 0.4-40 μg/ml의 범위였으며 IVT-mRNA 양과 관련하여 동일한 스트레스 레벨로 모든 시료를 노출시키고자 적절한 양의 루시퍼라제 IVT-mRNA로 채웠다.
1x105 트랜스펙션된 타겟 세포 및 인간 세포독성 T 세포 (실시예 16에 기재된 대로 분리됨)를 6-웰 포멧에서 2 ml 어세이 배지에서 10:1의 E:T 비율로 분주하였다. 대조군 시료는 40 μg/ml의 루시퍼라제 IVT-mRNA로 트랜스펙션되지만 1BiMAB IVT-mRNA로 트랜스펙션되지 않은 타겟 세포를 포함하였다. 타겟 및 이펙터 세포 공동배양 24시간 및 48시간 후, 실시예 16에 기재된 대로 세포를 수득하여 염색하고 분석하였다.
도 23 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 4 μg/ml의 1BiMAB IVT-mRNA로 트랜스펙션된 타겟 세포를 포함하는 시료들에서 유의한 T 세포 활성화를 관찰하였다. 이러한 어세이에서 최대 T 세포 활성화는 40 μg/ml의 1BiMAB IVT-mRNA로 이루어졌다. CD69 및 CD25의 발현은 공동배양 시간 (도 23 A 내지 B) 및 IVT-mRNA 농도에 따라 다양했다. 더 많은 1BiMAB IVT-mRNA 양 (12 및 40 μg/ml)은, 예를 들어 도 23 B에서 CD69의 증가된 발현과 비교하여 CD25의 증가된 발현과 같이 보여지는 대로 T 세포 활성화 기작의 더 빠른 개시를 유발하였다. 총 T 세포 활성화는 ~40%를 초과하지 않았다.
실시예 19: CLDN18.2-특이적 bi-scFv 1BiMAB에 의한 농도 의존적 T 세포 매개된 타겟 세포 용해의 유세포 분석
bi-scFv 농도 의존적 T 세포 매개된 타겟 세포 용해를 조사하기 위해 실시예 18에 기재된 실험적 셋-업을 이용하였다. 이펙터 세포 및 타겟 세포 공동 배양 시료 ("시료") 외에도 개별적으로 전기천공된 타겟 세포만을 분주하였다. 후자를 T 세포에 의해 용해된 타겟 세포로부터 전기천공 공정 자체에 의해 사멸된 타겟 세포를 빼주기 위한 레퍼런스 시료 ("EP 레퍼런스")로 이용하였다.
수득 및 염색을 실시예 18에 따라 실시하였다. FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 이용하여 프로피디움 이오디드의 삽입을 통해 타겟 세포를 최종적으로 분석하였다.
특이적 타겟 세포 용해의 백분율을 백그라운드 죽은 세포의 두-단계 삭감을 통해 결정하였다:
1. % T 세포 매개된 용해 = (% PI+ 타겟 세포시료 - % PI+ 타겟 세포EP 레퍼런스)
2. % 특이적 용해 = (% T 세포 매개된 용해시료 - % T 세포 매개된 용해ctrl)
"T 세포 매개된 용해ctrl"는 이펙터 세포를 가진 대조군 시료 (40 μg/ml 루시퍼라제 IVT-mRNA 단독) 및 이펙터 세포가 없는 대조군 시료 (40 μg/ml 루시퍼라제 IVT-mRNA 단독)의 PI+ 타겟 세포들 간의 차이로부터 추정한다.
이러한 계산에 의해 이 실험에서 55.5 % +/- 5.6 %의 최대 특이적 용해가 12 μg/ml의 1BiMAB IVT-mRNA로 얻어진다. 전기천공 스트레스에 대한 NugC4 타겟 세포의 민감성 및 이와 함께 감해질 피할 수 없는 백그라운드 죽은 타겟 세포로 인해, 플롯팅된 특이적 타겟 세포 용해가 실제적인 용해 백분율보다 이 실험적 셋-업에서 더 낮을 수 있다.
실시예 20: 1BiMAB IVT-mRNA 형질주입에 대한 대응의 T 세포 증식
T 세포 증식은 T 세포 활성화의 지표이다. CLDN18.2 양성 표적 세포들의 존재 하에 bi-scFv를 인코딩하는 IVT-mRNA 1BiMAB에 대한 대응의 특이적 T 세포 증식을 나타내기 위하여, 유세포 분석법을 사용하였다. 간략하게, 실시예 16 이하에서 기재된 바와 같이 분리된 1x107 인간 T 세포들을 DPBS에 용해된 1 μM 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, 독일)로 실온 및 암실에서 5분 동안 염색하였다. 세포를 DPBS/5　% FCS으로 두 번 씻고, 어세이 배지에서 2x106 세포들/ml로 재현탁시켰다. 표적 세포로서, 인간 CLDN18.2으로 렌티바이러스 형질도입된 NugC4 세포 및 (특이성 시험을 위한) CLDN18.2-음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 선택하였다. 전기천공법을 위하여 20 μg/ml의 IVT-mRNAs 1BiMAB 또는 비표적 대조군을 사용하였다. NugC4의 전기천공을 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 수행하였다. MDA-MB-231의 전기천공을 다음의 조건으로 수행하였다: 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳(Bio-Rad, Dreieich, 독일)에서, 400 V, 3 ms 펄스 길이, 1 펄스, 400 ms 간격 길이. 실시예 16 이하에 기재된 바와 같은 세포독성 분석을 형질주입된 표적 세포 및 이펙터 세포로서 인간 CFSE-표제된 T 세포를 이용하여 설정하였다. T 세포 단독, 및 비형질주입된 또는 대조 형질주입된 표적 세포 플러스 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 5 μg/ml OKT3 (Bio X Cell, West Lebanon, NH, 미국) 및 2 μg/ml 항CD28 (BioLegend, Fell, 독일)으로 자극된 T 세포 단독이 양성 대조군으로 기능하였다. 5 ng/ml 농도의 1BiMAB 단백질을 비형질주입 표적 플러스 T 세포에 부가하여 어세이 유효성을 확인하였다. 비표적 bi-scFv 단백질 6PHU3과 조합된 샘플은 특이성 대조군으로 포함시켰다. 모든 샘플들을 세개씩(triplate) 96 웰 중에 총부피 0.2 ml의 어세이 배지 중에 두었다. 72 시간 동안 공인큐베이션 후, T 세포를 하베스트하고, 5 ml 둥근바닥 시험관에 수집하며, 씻고 및 4　℃에서 30분간 2 μl 항CD45-APC으로 염색하여 인간 T 세포들을 종양 세포들로부터 구별하였고, 200 μl DPBS 중에서 0.25 μl eFluor506 (BD Biosciences, Heidelberg, 독일)으로 죽은 세포들을 대비염색하였다. DPBS으로 씻은 다음, 세포들을 FACS-buffer 중에서 재현탁하였고, FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, 독일)으로 분석하였다.
CLDN18.2 양성 표적 세포 및 bi-scFv 1BiMAB 만이 존재 하는 가운데 CFSE-시그널을 감소시킴으로써 T 세포의 증식을 검출하였다 (도 25 참조). 양성 대조군을 배제하고, 1BiMAB 단백질과 조합된 CDLN18.2 양성 표적 세포의 존재 하에서 42-48　%의 T 세포 증식을 관찰할 수 있었다. 1BiMAB IVT-mRNA으로 형질주입된 표적 양성 세포는 22　% +/- 3%에 이르렀다. 단백질 보다는 IVT-mRNA에 대한 대응으로서의 낮은 증식은, NugC4 표적 세포들로 달성가능한 저형질주입 효율 때문일 수 있다. 양성 대조군을 제외하고는, 표적 세포가 없는 T 세포뿐만 아니라 CLDN18.2 음성 표적 세포 MDA-MB-231과 함께 배양된 T 세포는 모든 배좌(constellation)에서 유의한 증식을 나타내지 않는다.
실시예 21: 역기비를 결정하기 위한 표적비율에 대한 이펙터의 적정
FACS 분석에 근거한 생체외 세포독성 분석 환경에서 적절한 E:T 비율을 결정하기 위하여, 3배 공정에서 0.3:1 내지 10:1 범위의 E:T 비율을 선택하였다.
NugC4 표적 세포들을 준비하였고, 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 40 μg/ml 농도의 IVT-mRNA으로 형질주입하였다. 이렇게 준비된 1BiMAB IVT-mRNA 형질주입 세포들을 모든 검사 샘플들에 사용하였다. 40 μg/ml 루시페라제 IVT-mRNA의 형질주입이 음성 대조군으로 선택되었다.
인간 세포독성 T 세포들은 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 신선하게 분리된 PBMCs로부터 분리되었고, 이펙터 세포로 작용하였다. 표적 비율: 0.3:1 - 1:1 - 3:1 - 10:1으로 뒤따르는 이펙터에서 6-웰 플레이트에서 2개씩 1x105 형질주입 표적 세포들과 세포독성 T 세포들을 공동배양하였다. 추가로, 배경(background) T 세포 활성화를 알아내기 위하여 표적 세포 없이 인간 세포독성 T 세포들을 배양하였다. 전기천공 자극(electroporation stress)에 의해 배경 사멸 세포를 정의하기 위하여 대조 IVT-mRNA 또는 1BiMAB IVT-mRNA으로 형질주입된 표적 세포들을 이펙터 세포 없이 배양하였다. 루시페라제 음성 대조군만을 최대 E:T 비율 10:1으로 시딩하였다. 48시간 동안 공인큐베이션 세포를 하비스트한 다음, 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 표식 및 분석하였다.
도 26 A는 NugC4 표적 세포들에 의한 1BiMAB 분비에 대한 대응의 세포독성 T 세포의 특이적 활성화를 나타낸다. 샘플 중의 T 세포 수와 별도로, 총 활성화의 50-60%가 검출되었다. 게다가, 샘플들 중 CD25의 분포 및 CD69 발현은 매우 비슷하다. 이는 세포독성 T 세포 집단 중 활성화될 수 있는 T 세포에 소정의 비율이 있음을 나타낸다.
도 26 B에서, 세포독성 T 세포수의 유효 표적 세포 용해의 의존성이 분명해진다. 비록 표적 세포가 단지 0.3:1의 E:T 비율에서 용해되지만, 유력한 용해는 3:1의 비에서 시작된다.
실시예 22: FACS-기반 어세이에서 1BiMAB IVT-mRNA 형질주입 이펙터 세포의 T 세포 활성화 및 표적 세포 용해의 분석
이 실험의 목적은 IVT-mRNA 형질주입 후 인간 이펙터 세포도 역시 1BiMAB을 생산 및 분비를 할 수 있는지를 시험하기 위한 것이다. 이를 뒷받침하는 합리성은 환자 자신의 T 세포에 bi-scFv를 형질주입한 후, 환자에게로 재이식할 수 있는 가상의 환자 시나리오였다.
인간 세포독성 T 세포들 - 실시예 16 이하에서 기재된 바와 같이 분리된 - 을 X-Vivo 15 매질(LONZA, Basel, Switzerland)로 두 번 씻고, 2x107 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 250 μl 세포 현탁액을 예비냉각시킨 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳(Bio-Rad, Dreieich, 독일)으로 옮기고, 80 또는 240 μg/ml IVT-mRNA을 첨가하였다. 사용된 IVT-mRNAs는 1BiMAB 및 대조군으로서 eGFP이었다. 조심스럽게 혼합한 후, 세포를 a BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, 미국) 전자천공기를 사용하여 다음 조건 하에 전자천공하였다: 500 V, 1 펄스, 3 ms 펄스 길이, 400 ms 간격 길이. 전자천공 직후, 큐벳을 잠깐 동안 아이스에 둔 다음, 세포 현탁액을 10 U/ml IL-2를 함유하는 어세이 배지(5　% 열 비활성화 인간 AB 혈청, 0.5　% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 피루브산 나트륨을 첨가한 RPMI 1640 배지(Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일))로 옮겼다. 형질주입 이펙터 세포를 37　℃, 5　% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 형질주입 효율을 FACS에 의해 분석하였고, 그 결과 형질주입 효율은 eGFP IVT-mRNA 두 농도 모두에서 70　%을 초과하였다. 각각의 이펙터 세포 샘플에 대하여 카운트하고, 5x105 세포/ml로 조정하였다. NugC4 표적 세포를 트립신처리법에 의해 하베스트하고, 어세이 배지로 씻은 뒤, 카운트하고, 1x105 세포/ml으로 조정하였다. 이펙터 및 표적 세포를 혼합하고, 최종 E:T 비율 5:1 및 최종 부피 2 ml이 되도록 6-웰에 두개씩 시딩하였다. 배경 활성화 시그널의 결정하기 위하여, 비처리된 T 세포를 표적 세포 없이 시딩하였다. 37　℃, 5　% CO2에서 48시간 동안 공인큐베이션 후, 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 어세이 분석을 수행하였다.
1BiMAB IVT-mRNA 형질주입되고 표적 세포와 공인큐베이션된 세포독성 T 세포에 대하여 유의한 활성화를 도 27 A에 나타낸 바와 같이 달성하였다. 1BiMAB IVT-mRNA 형질주입 T 세포에 의한 표적 T 세포 용해는 도 27 B에 표시한 바와 같이 60%를 초과하였다. 80 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA의 효과는 RNA 양의 증가에 따라 증가하지 않았다.
이 실험의 결론은, 이론상으로 이펙터 세포는 bi-scFv를 생산하고 분비하는 수용체 세포로로 사용될 수 있다는 것이다.
실시예 23: 루시페라제-기반 세포독성 분석에서 CLDN18.2 음성 표적 세포를 이용한 1BiMAB IVT-mRNA의 표적 특이성의 조사
엄격한 표적 특이성은 환자에 있어 원치 않는 이상반응을 피하기 위하여 매우 중요한 과제이다. 이 예비 연구에서, IVT-mRNA로서 주입된 1BiMAB의 비특이적 세포용해 가능성을 검사하기 위하여 CLDN18.2 음성 세포주 - 기형암종 세포주 PA-1 (ATCC CRL-1572) - 를 선택하였다.
PA-1 세포주에 렌티바이러스 루시페라제 벡터를 안정되게 형질도입하여, 그 결과 루시페라제-기반 세포독성 어세이에 적용할 수 있었다. 실시예 16 이하에서 기재한 바와 같이, 전자천공을 위하여 PA-1/luc 표적 세포를 준비하였다. 총 40 μg/ml IVT-mRNA을 각 샘플에 형질주입하였다. 사용된 IVT-mRNAs는 1BiMAB, no. 25 및 6RHU3이었다. No. 25는 비발현 TAA PLAC-1을 표적화하고, 6RHU3은 PA-1/luc 세포 중 고발현 표적 CLDN6을 표적화한다. bi-scFv 변이체에 대한 자세한 정보를 위하여 표 7 및 8을 참조하라. 모든 표적 세포 샘플에 대하여 RNA 형질주입에 의한 동일한 자극 수준을 주기 위하여 No.25은 4 μg/ml IVT-mRNA의 전자천공 샘플 중 필업 IVT-mRNA으로 사용되었다. 조심스럽게 혼합한 후, 세포를 BTX ECM 830 전자천공기(Harvard Apparatus, Holliston, MA, 미국)로 다음의 조건 하에 형질주입하였다: 0.4 cm 큐벳: 200 V, 2 펄스, 12 ms 펄스 길이, 400 ms 간격 길이. 전자천공 직후, 큐벳을 잠시 아이스 위에 두고, 세포 현탁액을 15 ml 시험관 내 실온 PA-1 어세이 배지(10　% 열 비활성 FCS, 0.5　% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA, 1,5 g/l 중탄산나트륨 및 1 mM 피루브산 나트륨이 첨가된 MEM 배지(Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일))로 옮겼다. 형질주입된 표적 세포를 카운트하고 1x105 세포/ml로 조정하였다.
인간 이펙터 세포를 실시예 16 이하에 기재된 바와 같이 분리하였다. 인간 세포독성 T 세포를 자기-활성 세포 분리 (MACS)에 의하여 Pan T 세포 분리 Kit II, 인간 (Miltenyi Biotec, Teterow, 독일)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 PBMCs로부터 분리하였다. T 세포를 PA-1 어세이 배지에서 5x105 세포/ml로 조정하였다.
1x104 표적 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, E:T 비율이 5:1가 되도록 인간 세포독성 T 세포를 첨가하였다. 웰당 최종 부피는 100 μl이었다. 이펙터 및 표적 세포를 함유한 대조군 샘플은 음성 대조군으로 no.25를 분비하는 표적 세포, 양성 대조군으로 6RHU3 또는 6PHU3 단백질, 및 1BiMAB 단백질을 포함하였다. 단백질 농도는 최종 농도가 100 ng/ml이 되도록 설정되었고, no.25-형질주입 표적 세포와 조합되어 사용된 표적 세포들이 동일한 조건 하에 있게 하였다. 최소 용해 대조군 (Lmin)은 각 전자천공된 표적 세포 샘플만을 포함하였다. 자생 용해 대조군 (Lmax)은 Ltest 샘플로부터 감산하기 위한 비처리된 표적 및 이펙터 세포 (Lmax1)로 이루어지거나, Lmin로부터 감산하기 위한 비처리 표적 세포(Lmax2)만으로 이루어졌다. 각각의 샘플을 세개씩 시딩하였다. 37　℃, 5　% CO2에서 72시간 동안 배양한 후, 어세이 분석을 실시하였다. 자생 용해 대조군 (Lmax)을 최종 농도 2%에서 Triton X-100으로 처리하였다.
분석을 위하여, 1 mg/ml 루시페린 (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, 독일)의 50 μl 수용액 및 50 mM HEPES를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 37 ℃ 암실에서 30분 동안 배양하였다. 루시페라제를 발현하는 생존세포에 의한 루시페린의 산화로부터 일어난 발광을 microplate-reader (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, 스위스)에서 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해의 백분율을 다음 식으로 계산하였다: 　% 특이적 용해 = [1―(발광test 샘플―Lmax1) / (Lmin―Lmax2)] x 100.
도 28은 특이적 표적 세포 용해의 백분율을 나타낸다. 음성 대조군 no.25 또는 1BiMAB으로 형질주입된 CLDN18.2 음성 PA-1/luc 세포는 72시간의 배양 후에도 유의한 용해를 보이지 않는다. 또한, 100 ng/ml 1BiMAB 단백질은 유의한 용해가 일어나지 않는 반면, TAA-표적 6RHU3의 bi-scFv 분비에 의한 용해 또는 100 ng/ml 6PHU3 단백질에 의한 용해는 85 - 93　%이었다. 24 시간 및 48 시간의 시점에서도 분석하였고, 동등한 결과를 얻었다(데이터 미기재).
실시예 24: 포유류 세포의 IVT-RNA 형질주입 후 1BiMAB 단백질 생산의 정량분석
포유류 세포에서 단백질로의 RNA 번역을 조사하기 위하여, 세포주 BHK21 (ATCC CRL-13001)을 발현 시스템으로 선택하였다. 2x107 BHK21 세포/ml을 실시예 16이하에 기재한 바와 같이 전자천공에 의하여 변화를 주어 형질주입하였고, 모든 단계는 실온에서 이루어졌다. 250 μl 세포 현탁액을 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳(Bio-Rad, Dreieich, 독일)에 옮기고, 40 μg/ml 1BiMAB IVT-mRNA 또는 IVT-replicon RNA를 첨가하였다. 전자천공 조건은 다음과 같다: 300 V, 16 ms 펄스 길이, 1 펄스, 400 ms 간격 길이.
전자천공된 세포를 실온 배양배지(RPMI1640, 10　% FCS)에서 재현탁하였고, 15 cm 배양접시로 옮겼다. 시딩 후 5시간에, FCS을 함유하는 배지를 FCS-프리 배지로 교체하였다. 실시예 24 a 및 b의 경우, 전자천공 후 18시간에 세포 배양 상등액 및 세포를 분리하여 하베스트하였다. 세포 플레이트를 1x LDS 샘플 버퍼 (cat. no. NP0008; Life technologies, Darmstadt, 독일)에서 용해하고, 72　℃에서 15분간 가열하였다. ELISA 분석을 위하여 비농축 및 약 50배 농축 상등액을 사용하였다. 농축은 Amicon ultra-15 원심분리 필터 유닛(Merck Millipore, Billerica, MA, 미국)에 의해 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 실시예 24 c (IVT-mRNA 단독)의 경우, 상등액을 형질주입 후 48시간에 하베스트하고, 상술한 바와 같이 40배 농축하였다.
a. 상등액을 이용한 ELISA
ELISA 분석을 위하여, His-Tag을 통한 분해물질 포집을 위하여 니켈 코팅 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Bonn, 독일)를 사용하였다. 먼저, 플레이트를 웰당 200 μl 워시 버퍼(0.01%　Tween-20 in 1x PBS)로 3번 씻었다. 표준으로, 정제 1BiMAB 단백질을 1 x PBS (= 희석제)으로 희석하여 1.75　% Na-Casein이 되게 하였다. 희석물의 농도는 2.34 내지 37.50 ng/ml이었다. 표준 희석물당 100 μl을 농도당 3개씩 웰로 옮겼다. 즉, 100 μl의 샘플들을 3개씩 옮긴 것이다. 플레이트를 접착성 필름으로 밀봉하고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 그 후, 플레이트를 웰당 200 μl 워시버퍼로 3번 씻었다. 1BiMAB 검출을 위하여, mCLDN18.2ab의 VH-VL에 특이적으로 결합하므로 1BiMAB에도 결합하는 항이디오타입 모노클로날 IgG 8B1F3을 사용하였다. 8B1F3을 희석제에 혼합하여 최종 농도가 1 μg/ml이 되었다. 100 μl 항이디오타입 항체 용액을 각 웰에 옮기고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 그런 다음, 플레이트를 웰당 200 μl 워시버퍼로 3번 씻고, 100 μl AP-컨쥬게이트된 항마우스 검출 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, 미국) - 희석제로 1:500 희석 - 각 웰에 첨가하고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 최종 워시 단계(3x 200 μl wash buffer) 후, 적절한 기질 버퍼(1 M Diethanolamine, 0.5 mM MgCl2, 0.01 % Na-azide, pH 9.8) 중의 1.5 mg/ml pNPP 기질을 각 웰에 첨가하고, 실온 및 암실에서 30분간 배양하였다. 100 μl의 3 M KOH을 각 웰에 사용하여 효소 반응을 종료하였다. microplate-reader (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 듀얼 파장 분석을 위해 측정 파장을 405 nm로 하고, 대조 파장으로 492 nm을 설정하였다. 측정값에서 대조파장을 감산하여 흡광도 값을 계산하였다.
도 29A에 표준편차를 포함한 405 nm에서의 평균 흡광도 값을 표시하였다. 1BiMAB IVT-mRNA 및 IVT-replicon 형질주입 세포로부터의 농축 상등액은 bi-scFv을 인코딩하는 IVT-RNA의 번역을 증명하는 유의한 시그널에 이른다. mock 형질주입 세포로부터의 농축 상등액은 어떠한 시그널도 생기지 않았다. IVT-mRNA 및 IVT-replicon 구조물 및 약간 다른 x배 농축물의 서로 다른 독성 때문에 실제 단백질 농도는 제안되지 않았다. 비농축 상등액에서 대략의 단백질 농도 예측은 IVT-replicon 샘플에 대해서는 1.5 ng/ml 및 IVT-mRNA 샘플에 대해서는 2.4 ng/ml 범위이다.
b. 상등액 및 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 (IVT-mRNA 및 IVT-replicon 샘플)
웨스턴 블롯에 의한 분석을 위하여, 농축 상등액 및 세포 용해물을 NuPAGE Novex 4 - 12　% Bis-Tris Gels (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)에서 분리하였다. 1BiMAB IVT-mRNA, IVT-replicon RNA로 형질주입된 BHK21 세포 또는 비처리 세포의 상등액 및 세포 용해물 및 양성 대조군 - 0.1 μg 정제 1BiMAB 단백질 - 을 첨가하였다. 웨스턴 블롯 분석을 표준절차에 따라 수행하였다(Current Protocols in protein Science, 2012). 간단하게, PVDF 막에서 단백질 블롯 및 PBST/3　% 밀크 파우더로 블록킹 후, 막을 블로킹 버퍼에서 1:500으로 희석된 주 항체 항HIS Epitope-Tag (Dianova GmbH, Hamburg, 독일)으로 4　℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반복하여 씻은 후, 블로킹 버퍼에서 1:10000으로 희석한 Fc-특이 2차 페록시다아제-컨쥬게이트된 염소-항마우스 IgG 항체 (Sigma Aldrich, 독일)로 4　℃에서 1시간 동안 막을 배양하였다. 반복하여 씻은 후, Supersignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 미국)에 의하여 시그널을 가시화하고, ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munich, 독일)에 의하여 기록하였다. 내부 분자량 표준과 비교하여 1BiMAB의 신호가 50 내지 60 kD 범위에서 검출되었다.
도 29 B에 나타낸 바와 같이, IVT-mRNA (lane 2) 및 IVT-replicon RNA (lane 3) 형질주입된 세포의 상등액에서 약한 시그널이 검출된 반면, 비처리 세포의 상등액이 있는 lane 4은 시그널이 없었다. IVT-mRNA (lane 5) 및 IVT-replicon RNA (lane 6) 형질주입된 세포의 세포 용해물에서 강한 시그널이 생성될 수 있었다. 비처리 세포 (lane 7)의 세포 용해물은 시그널이 없었다. 모든 시그널은 정제 1BiMAB 단백질 대조군(lane 8)과 같은 수치를 나타냈다. 상등액에서 약한 시그널 ?? 약한 1BiMAB 분비는 아마도 형질주입 후 상대적으로 배양시간이 짧기 때문일 것이다. replicon RNA의 독성 효과 때문에, 더 긴 배양시간을 시험할 수 없었다.
두 분석 모두 정성적이며, 단백질 농도 결정을 위하여 기능하지 않는다.
c. 상등액 웨스턴 블롯 분석 (IVT-mRNA 샘플들)
형질주입 후 48시간에 수집된 상등액을 SDS-PAGE으로 분리하고, 실시예 24b 이하에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 29 C에 도시한 바와 같이, IVT-mRNA로루터 번역되고, 상등액에 분비된 no.25 및 1BiMAB을 His-tag을 통해 검출하였다. bi-scFv 특이성 대조군으로 사용된 no.25 뿐만 아니라 1BiMAB의 생산 및 분비를 증명할 수 있었다.
실시예 25: RNA 근육주사 후 생체내 번역된 및 기능성 1BiMAB 단백질의 검출
8-16 주된 암컷 및 수컷 NSG 마우스를 선택하여, 각 5마리씩 4개의 군으로 분류하였다. 40 μl RNA 용액을 마우스당 대퇴근에 주사하였다. 40 μl RNA 용액은 1x PBS, 5 μg D2-capped 1BiMAB IVT-mRNA 또는 replicon, 2 μg D1-capped 루시페라제 IVT-mRNA 및 0 또는 15 μg D1-capped EBK IVT-mRNA로 이루어졌다. RNA 번역 강화(Patent Application PCT/EP2012/04673)를 위하여 IFN 반응을 저해하고, PKR 활성화를 억제하기 위하여, 백시니아 바이러스 단백질 E3L, B18R 및 K3L (EBK)을 인코딩하는 EBK IVT-mRNA를 함께 주사하였다. 주사후 24시간에 Xenogen IVIS 2000으로 루시페라제 시그널를 관찰하고, 샘플로부터 시그널이 없는 마우스를 제외시켰다.
주사후 2, 4, 및 7일에 혈액을 채취하였다. 혈청을 하베스터한 후, -80　℃에서 냉동하였다. RNA 주사후 4일에 강한 발광 시그널을 갖는 마우스의 근육을 절제하고, IHC을 위하여 히스토픽스(histofix)하거나, 웨스턴 블롯 분석을 위해 충격-냉동하였다.
세포독소 어세이
생체외 세포독소 어세이에서 NSG 마우스의 혈청을 분석하였다. 더 나은 표적 발현을 위하여 반디 루시페라제 및 인간 CLDN18.2으로 안정되게 형질도입된 NugC4 표적 세포를 인간 T 세포(실시예 16 이하에서 기재한 바와 같이 분리됨)에 최대 민감성을 위해 E:T 비율 30 대 1로 시딩하였다. 어세이 배지는 10　% 열 비활성 FCS, 0.5　% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 피루브산 나트륨이 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)를 포함하였다. 20 μl의 해동 시험 혈청을 각 시험 샘플 웰에 첨가하였다. 표준 1BiMAB 단백질 대조군 웰, Lmin 및 Lmax 웰을 비처리 NSG 마우스의 20 μl 혈청으로 완료하였다. 웰당 최종 부피는 100 μl이었다. Lmin는 12배 시딩하고, Lmax 6배 및 시험 샘플 3개씩으로 하였다. 37　℃ 및 5　% CO2에서 배양 후 48시간에 Lmax 웰을 10 μl 2　% Triton X-100 용액과 혼합하고, 10분간 배양하였다. 나머지 웰에는 10 μl 어세이 배지를 첨가하였다. 50 μl 루시페린 용액(실시예 23 참조)을 첨가하고, 37　℃ 암실에서 30분간 배양단계 후 infinite M200 microplate reader (TECAN, Mannedorf, Switzerland)에서 플레이트를 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해 계산을 실시예 23 이하에 기재된 바와 같이 계산하였다.
도 30에서 특이적 용해 백분율을 도시하였다. 각 그룹에서 유의한 세포독성 효과가 검출되었다. 세포독성 효과는 EBK 및 1BiMAB IVT-mRNA을 주사하고, 주사 후 2일에 하베스트한 마우스의 혈청을 함유하는 웰에서 1.7배 만큼 증가하였다. 주사후 4 또는 7일에 하베스트된 샘플들의 경우 유효하게 더 낮은 효과가 달성되었다. 1BiMAB-replicon 샘플의 경우, 더 늦은 시점에 하베스트된 혈청은 더 강한 세포독성 효과를 발생시켰다.
이들 데이터는 근육주사후 IVT-mRNA 또는 replicon로부터 1BiMAB의 생체내 번역 및 혈류로의 분비를 증명한다.
실시예 26: CLDN6 및 CD3 표적 이중특이 결합제의 발생 및 시험
a. 서열 오리진, bi-scFv 구조물의 형태, 및 템플릿 벡터로의 클로닝
인간 T 세포 수용체 성분 CD3 및 인간 종양 관련 항원(TAA)에 특이적인 결합 도메인을 함유하는 이중특이적 탠덤 단일 사슬 항체 구조물들 (bi-scFv) 을 준비하였다. 각 구조에 대한 당해 중쇄 가변부 (VH) 및 당해 경쇄 가변부 (VL)을 5'- 부터 3'-말단까지 순서대로 특이적으로 배열하였다:
pST1-5'hAgKozak-VH CLDN6-VL CLDN6-VH CD3-VL CD3-His-2hBgUTR-A120 (6RHU5)
pST1-5'hAgKozak-VH CD3-VL CD3-VH CLDN6-VL CLDN6-His-2hBgUTR-A120 (6RHU3)
표 9는 본 발명에 따라 생성된, TAA CLDN6에 대한 모든 특이적 bi-scFv 구조물을 요약한다. CLDN18.2-특이 bi-scFv 구조 1BiMAB를 대조 항체로 사용하였다. bi-scFv 구조물을 당해 항체의 VH 및 VL 서열을 이용한 GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, 독일)에 의한 유전자 합성을 통해 생성하였다. 코돈 적합화, 예컨대 Homo sapiens (HS) 또는 Mus musculus (MM)를 GeneArt's GeneOptimizer® 소프트웨어에 의해 수행하고 표 9에 나열하였다. 특이성, 모노클로날 항체 (mAB)로부터의 서열 오리진, 코돈 이용, 추가 서열 특성 및 모든 적용 도메인의 인용에 대한 정보를 표 10에 요약하였다. 각 CD3 항체의 가변 도메인 서열 오리진을 표 10에 나열하였다. 인간 및 마우스 TAAs의 높은 상동성 때문에, 마우스 어세이에 대한 bi-scFv 구조물의 생성에 동일한 항TAA VH 및 VL 서열을 사용할 수 있었으나, 마우스 특이 항CD3 항체 클론 145-2C11의 VH, VL 서열과 조합하여 사용하였다.
DNA 클로닝 및 발현 벡터 건설을 숙련자에게 잘 알려진 표준 절차(Green/Sambrook, Molecular Cloning, 2012)에 의해 수행하였다. 간략하게, 리드오프 bi-scFv DNA 서열에, pST1 plasmids으로의 클로닝을 위한 5´-BsmBI 및 a 3'-XhoI 제한 부위를 제공하였다. bi-scFv 분비를 위하여 bi-scFv의 5' 말단 상류에 서열 분비 시그널 서열을 도입하였다. 15 내지 18 아미노산 플렉시블 글리신-세린 펩타이드 링커를 코딩하는 서열을 주입하여, 하나는 CD3에 결합하고 나머지는 TAA에 결합하는 단일 사슬 가변 항체 단편 (scFv) 조성물을 위하여 VH 및 VL 도메인과 연결하였다. 이중특이 단일 사슬 항체의 형성을 위하여, 짧은 펩타이드 링커 (GGGGS)를 코딩하는 서열에 의하여 두개의 scFv 도메인 서열을 연결하였다. 이 링커 서열과 함께, bi-scFV 구조물을 클로닝하기 위한 scFv 도메인 교환을 위하여 BamHI 제한 부위를 도입하였다. 간략하게, 5´scFv-도메인을 BsmBI 및 BamHI 제한으로 교환하고, 3´scFv-도메인을 BamHI 및 XhoI 제한으로 교환하였다. C-말단 6xHis-tag은 번역된 단백질의 검출 분석을 위해 기능하였다. 6RHU3 replicon 벡터 생성을 위해, 분비 시그널 및 6xHis-tag을 포함하는 전체 6RHU3 서열을 K. Lundstrom에 의해 제공된 Semliki forest virus replicon vector (pSFV)의 서브게놈 프로모터에 대하여 3' 서브클론하였다(Lundstrom, K. et al. (2001) Histochem. Cell Biol. 115 (1), pp. 83-91; Ehrengruber, M.U. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12), pp. 7041-7046).
MWG´s single read sequence service (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, 독일)을 통한 시퀀싱으로 모든 구조물을 확인하였고, 정확한 서열 및 100 아데닌을 초과하는 폴리(A) 테일을 갖는 것만을 생체외 RNA 전사에 사용하였다.
건설 도식은 도 31 A를 참조하라
표 9: TAA 및 CD3 특이적 이중특이 단일 사슬 항체 mRNA-템플릿 구조물의 요약
Figure 112021041708355-pat00009
Bi-scFv은 이중특이 단일 사슬 가변 단편; HS, Homo sapiens; MM, Mus musculus; TAA, 종양 관련 항원; VH, 가변 중쇄 도메인, VL, 가변 경쇄 도메인를 표시한다.
표 10: bi-scFv mRNA-템블릿 구조 정보의 요약
Figure 112021041708355-pat00010
HS, Homo sapiens ; mAB, 모노클로날 항체; MM, Mus musculus ; TAA, 종양 관련 항원.
b. IVT-RNA 합성
항CLDN6-특이 bi-scFv IVT 템플릿 생성을 위하여, II급 핵산내부가수분해효소를 사용하여 플라스미드를 폴리(A)-테일 하향류로 선형화하였다. 다른 문헌에 기재된 바와 같이(Holtkamp, S. et al. (2006) Blood 108 (13), pp. 4009-4017), 선형화된 템블릿 DNA를 페놀/클로로포름 추출 및 아세트산 나트륨 침전에 의하여 정제하였다.
선형화된 DNA 템플릿을 생체외에서 MEGAscript Kits (Ambion /Life Technologies, Darmstadt, 독일)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 전사시켰다: pST1 템플릿은 MEGAscript T7 Kit으로 전사되었고, pSFV 템플릿은 MEGAscript SP6 Kit으로 전사되었다. cap analoga와의 반응을 위하여, GTP 농도를 1.5 mM으로 낮추고, 다른 문헌(Grudzien, E. et al. (2004) RNA 10 (9), pp. 1479-1487; Kowalska, J. et al. (2008) RNA 14 (6), pp. 1119-1131; Stepinski, J. et al. (2001) RNA 7 (10), pp. 1486-1495)에 기재된 바와 같이 합성된 6 mM의 ARCA, beta-S-ARCA(D1), 또는 beta-S-ARCA(D2)을 상기 반응에 첨가하였다. IVT-RNA의 정제를 MEGAclear Kit (Ambion/Life Technologies, Darmstadt, 독일)에 의하여 매뉴얼에 따라 수행하였다. IVT-RNA의 농도 및 품질을 분광광도법으로 평가하고, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, 미국)에서 분석하였다.
실시예 27: CLDN6-특이 bi-scFv 1BiMAB를 분비하는 표적 세포에 재전송한 T 세포의 현미경 분석
어세이 환경은 실시예 2.a 이하에서 기재된 바와 같은 원칙으로 수행하였다.
표적 세포주로서, 내생적으로 인간 CLDN6을 높게 발현하는 난소 기형암종 세포주 PA-1 (ATCC CRL-1572)의 서브클론을 사용하였다. 인간 세포독성 T 세포를 MACS에 의해 Pan T 세포 분리 Kit II, 인간 (Miltenyi Biotec, Teterow, 독일)을 사용하여 제조자의 지침에 따라, 신선하게 분리된 PBMCs으로부터 분리하였다.
PA-1 표적 세포 - 매 어세이 전에, FACS 분석에 의해 TAA 발현에 대해 시험되는 - 를 아이스 콜드 X-Vivo 15 배지 (LONZA, Basel, Switzerland)로 두 번 씻고, 2x107 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 250 μl 세포 현탁액을 예비-냉각된 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳(Bio-Rad, Dreieich, 독일)으로 옮기고, 20 μg/ml IVT-mRNA을 가하였다. BTX ECM 830 electroporator (Harvard Apparatus, Holliston, MA, 미국)을 사용하는 조건은: 200 V, 12 ms 펄스 길이, 2 펄스, 400 ms 간격 길이였다. 사용된 IVT-mRNAs는 6RHU5, 6RHU3, no.25 이었다 (세부사항은 표 9 및 10을 참조). 형질주입된 표적 세포를 카운트하고, 1x105 세포/ml로 조정하였다. 1x105 표적 세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하였고, 인간 세포독성 T 세포를 E:T 비율 5:1로 첨가하였다. 웰당 최종 부피는 2 ml이었다. 대조군 샘플은 형질주입된 표적 세포만을 단독으로 포함하여, 전자천공 후의 건강을 증명하고, 이펙터 세포를 갖는 대조 bi-scFv 형질주입된 표적 세포를 포함하였다. 양성 대조군으로서, 당해 CLDN6-특이 bi-scFv 단백질, 6PHU5 및 6PHU3을 50 μg/ml 농도로 사용하였다. 따라서, 인간 T 세포를 갖는 비처리된 PA-1 세포를 사용하였다. 그런 다음, 티슈 배양 플레이트를 37　℃ 및 5　% CO2에서 배양하였다. 표적 세포에 클러스터링하는 T 세포에 있어서 유의한 효과, 면역 시냅스의 형성 및 6RHU5 또는 6RHU3 형질주입된 표적 세포를 함유하는 샘플 중 표적 세포 사멸이 24시간 후 관찰되었고, Nikon Eclipse TS100 inverted microscope (Nikon, Japan)으로 기록되었다. 도 32에 도시한 바와 같이, T 세포 클러스터링 또는 표적 세포 용해가 no.25 형질주입된 표적 세포를 갖는 대조군 샘플에서 전혀 발견되지 않았는데, 이는 T 세포 활성화를 유도하는 TAA 발현에 대한 엄격한 의존성을 의미한다. bi-scFv 이 없는 mock 대조군 역시 T 세포 클러스터링을 보이지 않았다. 반면, 단백질 대조군은 강한 T 세포 클러스터링 및 표적 세포 용해로 이어졌다.
실시예 28: CLDN6-표적 bi-scFv 후보 6RHU5 및 6RHU3에 의해 유도된 T 세포 활성화
T 세포 활성화 검출을 위하여, 그리고 두가지 CLDN6-특이 bi-scFv 변이체의 효능 차이를 정의하기 위하여, FACS-기반 T 세포 활성화 어세이를 수행하였다. 형광-컨쥬게이트된 항체에 의해 염색을 하기 위하여 초기 활성화 마커 CD69 및 후기 활성화 마커 CD25을 선택하였다. 표적 및 T 세포 혼합물 중에서 인간 T 세포 검출을 위하여, 모든 T 세포로 발현된 CD3을 염색하였다.
전술한 바와 같이(실시예 27) 표적 및 이펙터 세포를 준비하였다. 간략하게, 내생적으로 CLDN6을 발현하는 PA-1 표적 세포에 전자천공에 의해 20 μg/ml의 다음의 IVT-mRNAs을 형질주입하였다: 6RHU5, 6RHU3 및 no.25. No.25는 비발현 TAA을 표적화하는 특이성 대조군으로서 기능하고, 비처리 표적 세포는 mock 대조군으로서 기능하였다. 양성 대조군으로서 50 ng/ml 6PHU5 단백질을 사용하였다. 또한, 배경 활성화 기준으로서 T 세포는 표적 세포 없이, 그리고 6PHU5 단백질을 포함하거나 포함하지 않고 시딩하였다. 각 샘플을 6-웰 플레이트에 2개씩 시딩하였고, 37　℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 24시간 및 48시간 후, T 세포를 스크랩핑에 의해 하베스트하고, 5 ml 둥근바닥 시험관 (BD Falcon, Heidelberg, 독일)으로 옮겼다. 세포를 원심분리하고 DPBS으로 씻었다. 세포 염색을 위하여, 마우스 항인간 CD3-FITC, 마우스 항인간 CD69-APC, 및 마우스 항인간 CD25-PE (모든 항체 BD Biosciences, Heidelberg, 독일)를 사용하였다. 세포 펠렛을 형광-컨쥬게이트된 항체 및 2 μl 7-AAD (BD Biosciences, Heidelberg, 독일)를 함유하는 50 μl FACS-버퍼 (5　% FBS가 첨가된 DPBS)에서 재현탁시켰다. 4　℃ 암실에서 20분간 배양후, 샘플을 4 ml DPBS으로 씻고, 세포 펠렛을 200 μl FACS 버퍼로 재현탁시켰다. FACSCanto II flow cytometer (both BD Biosciences, Heidelberg, 독일)으로 측정하는 동안 샘플을 얼음 및 암실에서 보관하였다. 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, San Carlos, CA, 미국)로 평가하였다.
도 33 A 및 B에 도시한 바와 같이, 두 개의 변이체 모두에서 T 세포 활성화가 일어난 반면, 음성 대조군 중 어떤 것도 T 세포 활성화 마커 CD69 또는 CD25의 유의한 발현을 보이지 않았다.
6RHU3에 대한 반응으로 전체 T 세포 활성화는, 6RHU5에 비하여 공인큐베이션 24시간(A) 후 1.53배 더 높았고 48시간(B) 후 1.35배 더 높았다. 이러한 발견에 기반하여, 이후의 모든 연구는 변이체 6RHU3을 단독으로 하여 수행하였다.
실시예 29: 6RHU3 형질주입된 표적 세포와의 공인큐베이션에 의한 농도 의존적 T 세포 활성화
표적-의존적 T 세포 활성화를 유도하는데 필요한 6RHU3 IVT-mRNA의 최저 농도를 결정하기 위하여, 0.2 - 20 μg/ml 희석 범위의 IVT-mRNA을 PA-1 표적 세포에 형질주입하였다. 모든 샘플을 RNA 전자천공에 의한 동일한 수준의 자극에 노출하기 위하여, 총농도 20 μg/ml IVT-mRNA이 형질주입되었다. No.25 - 비발현 TAA를 표적화하는 - 필업 IVT-mRNA로 사용하였다. 따라서, 0 μg/ml 6RHU3은 20 μg/ml no.25과 상호관련된다. 전자천공을 실시예 27 이하에 기재한 바와 같이 실시하였다. 인간 T세포를 이펙터 세포들로 사용하였다. PBMCs로부터 분리를 제조자의 매뉴얼에 따라 수행하였다(Pan T 세포 분리 Kit II, Miltenyi, Teterow, 독일). 이펙터 및 표적 세포를 5:1 비율로 혼합하였다. T 세포를 갖는 비처리 표적 세포는 mock 대조군으로 기능하였다. 또한, 배경 활성화 기준으로서 T 세포는 표적 세포 없이, 그리고 6PHU5 단백질을 포함하거나 포함하지 않고 시딩하였다. 양성 대조군으로서, 비처리된 표적 세포를 T 세포 및 50 ng/ml 6PHU5 단백질과 혼합시켰다. 모든 샘플을 두개씩 6-웰 플레이트에 준비하였다.
표적 및 이펙터 세포를 37　℃, 5 % CO2에서 48시간 동안 공인큐베이션하였다. 플로우 유세포 분석을 위하여, 샘플을 실시예 28 이하에 기재된 바와 같이 준비하였다.
도 34에서, 활성화 마커를 나타내는 CD3-양성 T 세포의 백분율을 도시하였다. 대조군에서는 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다. 유의한 T 세포 활성화의 검출은 0.7 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA 농도에서 시작된다. 2.0 μg/ml 6RHU3 IVT-mRNA에 대한 효과는 50 ng/ml 6PHU5 단백질 대조군으로 조정된 것과 유사하였다. 따라서, 형질주입된 IVT-mRNA로부터 단백질 번역 및 분비는 효율적인 과정으로 보인다.
실시예 30: 6RHU3에 대한 EC 50 의 결정
bi-scFv을 인코딩하는 IVT-mRNA 6RHU3의 반수 최대 유효량을 결정하기 위하여, 생체외 루시페라제 세포독소 어세이에서 6RHU3의 역가를 시험하였다. 루시페라제-발현 PA-1 세포는 실시예 27 이하에 기재된 바와 같이 안정되게 전자천공에 의해 일시적으로 형질주입되었다. 6RHU3 IVT-mRNA 농도는 0.004 - 13.3 μg/ml 범위에서 6 희석 단계로 사용되었다. 전체 IVT-mRNA 농도는 일정하게 13.3 μg/ml으로 하였고, no.25는 필업 IVT-mRNA로 사용되었다. 최소 용해 대조군(Lmin)으로서 모든 형질주입된 표적 세포 샘플은 이펙터 세포 없이 시딩하였다. 이 절차에 의해, 각 전자천공 샘플의 배경 사멸 세포는 감산하였고, T 세포가 중재된 용해 효과만을 얻을 것이다.
형질주입된 표적 세포를 이펙터 중의 인간 T 세포와 함께 사용하여 목표 비율 5:1로 세개씩 96-웰 포맷에 시딩하고, 37　℃, 5　% CO2에서 배양하였다. 이펙터 및 비처리 표적 세포를 함유하는 대조군 웰에, 루시페린 첨가 직전에, Triton X-100을 첨가하여 자발 형광 카운트의 일반화를 위한 최대 용해 (Lmax)를 얻었다. 루시페린 용액의 첨가 후 - 1 mg/ml 루시페린 (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, 독일) 및 50 mM HEPES를 함유하는 수용액을 웰당 50 μl씩 - Infinite M200 Tecan microplate reader에서 24시간 후 및 48시간 후 형광을 측정하였다. 다음 식에 의해 특이적 표적 세포 용해를 계산하였다: 　% specific 용해 = [1―(형광시험 샘플―Lmax) / (Lmin_시험 샘플―Lmax)] x 100.
도 35는 6RHU3에 대한 대응의 특이적 표적 세포 용해에 대한 농도 의존적 곡선을 나타낸다. EC50 값 계산을 위한 그래프패드 프리즘 식 "log(agonist) vs. 반응 - 변수 슬로프" 은 EC50 (24 h) = 548.0 ng/ml, 및 EC50 (48 h) = 194.5 ng/ml을 나타냈다. 이 어세이 결과, 기증자의 면역 상태에 따라 달라지는 인간 T 세포의 힘에 강하게 의존하였는데, 이는 다른이들에 의해서도 보고되었다 (예컨대 (Lutterbuese, R. et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (28), pp. 12605-12610을 참조하라). 따라서, 각 기증자에 따라 결과가 달라진다.
실시예 31: 6RHU3 IVT-mRNA 형질주입에 대한 대응의 T 세포 증식
T 세포 증식은 T 세포 활성화의 지표이다. CLDN6 양성 표적 세포들의 존재 하에 bi-scFv을 인코딩하는 IVT-mRNA 1BiMAB에 대한 대응의 특이적 T 세포 증식을 나타내기 위하여, 유세포 분석법을 사용하였다. 간략하게, 실시예 16 이하에서 기재된 바와 같이 분리된 1x107 인간 T 세포들을 DPBS에 용해된 1 μM 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, 독일)로 실온 및 암실에서 5분 동안 염색하였다. 세포를 DPBS/5　% FCS으로 두 번 씻고, 어세이 배지에서 2x106 세포들/ml로 재현탁시켰다. 표적 세포로서, CLDN6을 생내적으로 발현하는 PA-1 및 - 특이성 시험을 위한 - CLDN6-음성 유방암 세포주 MDA-MB-231을 선택하였다. 전기천공을 위하여 20 μg/ml의 IVT-mRNAs 6RHU3 또는 비표적 대조군을 사용하였다. PA-1의 전기천공을 실시예 27 이하에 기재된 바와 같이 수행하였다. MDA-MB-231 전기천공을 다음의 조건으로 수행하였다: 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳 (Bio-Rad, Dreieich, 독일)에서, 400 V, 3 ms 펄스 길이, 1 펄스, 400 ms 간격 길이. 실시예 27 이하에 기재된 바와 같은 세포독성 분석을 형질주입된 표적 세포 및 이펙터 세포로서 인간 CFSE-표제된 T 세포들을 이용하여 설정하였다. T 세포 단독, 및 비형질주입된 또는 대조 형질주입된 표적 세포 플러스 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 5 μg/ml OKT3 (Bio X Cell, West Lebanon, NH, 미국) 및 2 μg/ml 항CD28 (BioLegend, Fell, 독일)로 자극된 T 세포 단독이 양성 대조군으로 기능하였다. 5 ng/ml 농도의 6RHU3 단백질을 비형질주입 표적 플러스 T 세포에 부가하여 어세이 유효성을 확인하였다. 비표적 bi-scFv 단백질 6PHU3과 조합된 샘플은 특이성 대조군으로 포함시켰다. 모든 샘플들을 세개씩(triplate) 96 웰 중에 총부피 0.2 ml의 어세이 배지 중에 두었다. 72 시간 동안 공인큐베이션 후, T 세포를 하베스트하고, 5 ml 둥근바닥 시험관에 수집하여, 씻고 및 4　℃에서 30분간 2 μl 항CD45-APC으로 염색하여 인간 T 세포를 종양 세포로부터 구별하였고, 200 μl DPBS 중에서 0.25 μl eFluor506 (BD Biosciences, Heidelberg, 독일)으로 죽은 세포들을 대비염색하였다. DPBS으로 씻은 다음, 세포들을 FACS-buffer 중에서 재현탁하였고, FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, 독일)으로 분석하였다.
CLDN6 양성 표적 세포 및 항-CLDN6-특이적-bi-scFv 만이 존재하는 가운데 CFSE-시그널을 감소시킴으로써 T 세포의 증식을 검출하였다 (도 36 참조). 양성 대조군을 배제하고, 6PHU3 단백질과 조합된 CLDN6 양성 표적 세포의 존재 하에서 49-61　%의 T 세포 증식을 관찰할 수 있었다. 6PHU3 IVT-mRNA으로 형질주입된 표적 양성 세포는 62　% +/- 2%에 이르렀다. 양성 대조군을 제외하고는, 표적 세포가 없는 T 세포뿐만 아니라 CLDN6 음성 표적 세포 MDA-MB-231과 함께 배양된 T 세포는 모든 배좌에서 유의한 증식을 나타내지 않는다.
실시예 32: 포유류 세포의 6RHU3 IVT-RNA 형질주입 후 단백질 생산의 정량분석
포유류 세포에서 단백질로의 RNA 번역을 조사하기 위하여, 세포주 BHK21 (ATCC CRL-13001)을 발현 시스템으로 선택하였다. 2x107 BHK21 세포/ml을 실시예 16이하에 기재한 바와 같이 전자천공에 의하여 변화를 주어 형질주입하였고, 모든 단계는 실온에서 이루어졌다. 250 μl 세포 현탁액을 0.4 cm 유전자 펄서/마이크로펄서 큐벳(Bio-Rad, Dreieich, 독일)에 옮기고, 40 μg/ml no.25 IVT-mRNA, 6RHU3 IVT-mRNA 또는 6RHU3 IVT-replicon RNA를 첨가하였다. 전자천공 조건은 다음과 같다: 300 V, 16 ms 펄스 길이, 1 펄스, 400 ms 간격 길이.
전자천공된 세포를 실온 배양배지(RPMI1640, 10　% FCS)에서 재현탁하였고, 15 cm 배양접시로 옮겼다. 시딩 후 5시간에, FCS을 함유하는 배지를 FCS-프리 배지로 교체하였다. 실시예 32 a 및 b의 경우, 전자천공 후 18시간에 세포 배양 상등액 및 세포를 분리하여 하베스트하였다. 세포 플레이트를 1x LDS 샘플 버퍼 (cat. no. NP0008; Life technologies, Darmstadt, 독일)에서 용해하고, 72　℃에서 15분간 가열하였다. ELISA 분석을 위하여 비농축 및 약 50배 농축 상등액을 사용하였다. 농축은 Amicon ultra-15 원심분리 필터 유닛 (Merck Millipore, Billerica, MA, 미국)에 의해 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 실시예 24 c (IVT-mRNA 단독)의 경우, 상등액을 형질주입 후 48시간에 하베스트하고, 상술한 바와 같이 40배 농축하였다.
a. 상등액을 이용한 ELISA
ELISA 분석을 위하여, His-Tag을 통한 분해물질 포집을 위하여 니켈 코팅 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Bonn, 독일)를 사용하였다. 먼저, 플레이트를 웰당 200 μl 워시 버퍼(0.01%　Tween-20 in 1x PBS)로 3번 씻었다. 표준으로, 정제 6PHU3 단백질을 1 x PBS (= 희석제)으로 희석하여 1.75　% Na-Casein이 되게 하였다. 2. 100 μl/표준 희석물의 단계에서 2.34 내지 150 ng/ml 범위의 희석물을 농도당 3개씩 웰로 옮겼다. 그에 따라, 100 μl의 샘플들을 3개씩 옮긴 것이다. 플레이트를 접착성 필름으로 밀봉하고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 그 후, 플레이트를 웰당 200 μl 워시버퍼로 3번 씻었다. 6PHU3/6RHU3 검출을 위하여, mCLDN6ab의 VH-VL에 특이적으로 결합하므로 6PHU3/6RHU3에도 결합하는 항이디오타입 모노클로날 IgG 4F9을 사용하였다. 4F9를 희석제에 혼합하여 최종 농도가 2.5 μg/ml이 되었다. 100 μl 항이디오타입 항체 용액을 각 웰에 옮기고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 그런 다음, 플레이트를 웰당 200 μl 워시버퍼로 3번 씻고, 100 μl AP-컨쥬게이트된 항마우스 검출 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, 미국) - 희석제로 1:500 희석 - 각 웰에 첨가하고, 37　℃에서 30분간 배양하였다. 최종 워시 단계(3x 200 μl wash buffer) 후, 적절한 기질 버퍼(1 M Diethanolamine, 0.5 mM MgCl2, 0.01 % Na-azide, pH 9.8) 중의 1.5 mg/ml pNPP 기질을 각 웰에 첨가하고, 실온 및 암실에서 30분간 배양하였다. 100 μl의 3 M KOH을 각 웰에 사용하여 효소 반응을 종료하였다. microplate-reader (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 듀얼 파장 분석을 위해 측정 파장을 405 nm로 하고, 대조 파장으로 492 nm을 설정하였다. 측정값에서 대조파장을 감산하여 흡광도 값을 계산하였다.
도 37A에 표준편차를 포함한 평균 흡광도 값을 표시하였다. 6RHU3 IVT-mRNA 및 IVT-replicon 형질주입 세포로부터의 농축 상등액은 bi-scFv을 인코딩하는 IVT-RNA의 번역을 증명하는 유의한 시그널에 이른다. Mock 및 no.25 대조군(-ctrl) 형질주입 세포로부터의 농축 상등액은 예상대로 어떠한 시그널도 생기지 않았다. IVT-mRNA 및 IVT-replicon 구조물 및 약간 다른 x배 농축물의 서로 다른 독성 때문에 실제 단백질 농도는 제안되지 않았다. 비농축 상등액에서 대략의 단백질 농도 예측은 IVT-replicon 샘플에 대해서는 1.4 ng/ml 및 IVT-mRNA 샘플에 대해서는 5.9 ng/ml 범위이다.
b. 상등액 및 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 (IVT-mRNA 및 IVT-replicon 샘플)
웨스턴 블롯에 의한 분석을 위하여, 농축 상등액 및 세포 용해물을 NuPAGE Novex 4 - 12　% Bis-Tris Gels (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)에서 분리하였다. 6RHU3 IVT-mRNA, IVT-replicon RNA, no.25 IVT-replicon RNA로 형질주입된 BHK21 세포 또는 비처리 세포의 상등액 및 세포 용해물 및 양성 대조군 - 0.1 μg 정제 6RHU3 단백질 - 을 첨가하였다. 웨스턴 블롯 분석을 표준절차에 따라 수행하였다(Current Protocols in protein Science, 2012). 간단하게, PVDF 막에서 단백질 블롯 및 PBST/3　% 밀크 파우더로 블록킹 후, 막을 블로킹 버퍼에서 1:500으로 희석된 주 항체 항HIS Epitope-Tag (Dianova GmbH, Hamburg, 독일)으로 4　℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반복하여 씻은 후, 블로킹 버퍼에서 1:10000으로 희석한 Fc-특이 2차 페록시다아제-컨쥬게이트된 염소-항마우스 IgG 항체 (Sigma Aldrich, 독일)로 4　℃에서 1시간 동안 막을 배양하였다. 반복하여 씻은 후, Supersignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 미국)에 의하여 시그널을 가시화하고, ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munich, 독일)에 의하여 기록하였다. 내부 분자량 표준과 비교하여 6PHU3의 신호가 50 내지 60 kD 범위에서 검출되었다.
도 37 B에 나타낸 바와 같이, no.25 IVT-mRNA (lane 1), 6RHU3 IVT-mRNA (lane 4), 및 6RHU3 IVT-replicon RNA (lane 5) 형질주입된 세포의 상등액에서 약한 시그널이 검출된 반면, 비처리 세포의 상등액이 있는 lane 6은 시그널이 없었다. 6RHU3 IVT-mRNA (lane 8) 및 IVT-replicon RNA (lane 9) 형질주입된 세포의 세포 용해물에서 강한 시그널이 생성될 수 있었다. no.25 형질주입 세포의 세포 용해물은 매우 약한 신호(lane 2)가 일어났으며, 비처리 세포 (lane 10)의 세포 용해물은 시그널이 없었다. 정제 6RHU3 단백질 대조군(lane 11)은 검출되지 않았다. 상등액에서 상대적으로 약한 시그널 및 약한 6RHU3 분비는 아마도 형질주입 후 상대적으로 배양시간이 짧기 때문일 것이다. replicon RNA의 독성 효과 때문에, 더 긴 배양시간을 시험할 수 없었다.
두 분석- ELISA 및 웨스턴 블롯- 모두 정성적이며, 단백질 농도 결정을 위하여 기능하지 않는다.
c. 웨스턴 블롯 분석 of 상등액 (IVT-mRNA 샘플들)
형질주입 후 48시간에 수집된 상등액을 SDS-PAGE으로 분리하고, 실시예 32b 이하에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 37 C에 도시한 바와 같이, IVT-mRNA로루터 번역되고, 상등액에 분비된 no.25 및 6RHU3을 His-tag을 통해 검출하였다. bi-scFv 특이성 대조군으로 사용된 no.25 뿐만 아니라 6RHU3의 생산 및 분비를 증명할 수 있었다.
실시예 33: RNA 근육주사 후 생체내 번역된 및 기능성 CLDN6-특이 bi-scFv 단백질의 검출
8-16 주된 암컷 및 수컷 NSG 마우스를 선택하여, 각 5마리씩 4개의 군으로 분류하였다. 40 μl RNA 용액을 마우스당 대퇴근에 주사하였다. 40 μl RNA 용액은 1x PBS, 5 μg D2-capped 6RHU3 IVT-mRNA 또는 replicon, 2 μg D1-capped 루시페라제 IVT-mRNA 및 0 또는 15 μg D1-capped EBK IVT-mRNA로 이루어졌다. RNA 번역 강화(Patent Application PCT/EP2012/04673)를 위하여 IFN 반응을 저해하고, PKR 활성화를 억제하기 위하여, 백시니아 바이러스 단백질 E3L, B18R 및 K3L (EBK)을 인코딩하는 EBK IVT-mRNA를 함께 주사하였다. 주사후 24시간에 Xenogen IVIS 2000으로 루시페라제 시그널를 관찰하고, 샘플로부터 시그널이 없는 마우스를 제외시켰다.
주사후 7일에 혈액을 채취하였다. 혈청을 하베스터한 후, -80　℃에서 냉동하였다.
세포독소 어세이
생체외 세포독소 어세이에서 NSG 마우스의 혈청을 분석하였다. 반디 루시페라제 형질도입되고 안정하게 CLDN6를 내인적으로 발현하는 PA-1 표적 세포를 인간 T 세포(실시예 16 이하에서 기재한 바와 같이 분리됨)에 최대 민감성을 위해 E:T 비율 30 대 1로 시딩하였다. 어세이 배지는 10　% 열 비활성 FCS, 0.5　% 페니실린-스트렙토마이신, 1x NEAA 및 1 mM 피루브산 나트륨이 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)를 포함하였다. 20 μl의 해동 시험 혈청을 각 시험 샘플 웰에 첨가하였다. 6RHU3 단백질 표준 대조군 웰, Lmin 및 Lmax 웰을 비처리 NSG 마우스의 20 μl 혈청으로 완료하였다. 웰당 최종 부피는 100 μl이었다. Lmin는 12배 시딩하고, Lmax 6배 및 시험 샘플 3개씩 하였다. 37　℃ 및 5　% CO2에서 배양 후 48시간에 Lmax 웰을 10 μl 2　% Triton X-100 용액과 혼합하고, 10분간 배양하였다. 나머지 웰에는 10 μl 어세이 배지를 첨가하였다. 50 μl 루시페린 용액(실시예 23 참조)을 첨가하고, 37　℃ 암실에서 30분간 배양단계 후 infinite M200 microplate reader (TECAN, Mannedorf, Switzerland)에서 플레이트를 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해 계산을 실시예 23 이하에 기재된 바와 같이 계산하였다.
도 38에서 특이적 용해 백분율을 도시하였다. 각 그룹에서 유의한 세포독성 효과가 검출되었다. CLDN6-특이 bi-scFv 단백질 농도는 6RHU3 IVT-mRNA 경우의 EBK 공주사(coinjection)에 의해 유의하게 증가하였다.
이들 데이터는 근육주사후 IVT-mRNA 또는 -replicon로부터 6RHU3의 생체내 번역 및 혈류로의 분비를 증명한다.
실시예 34: CLDN18.2 또는 CLDN6 및 CD3을 표적화하는 이중특이 결합제의 생성 및 시험
항CLDN18.2 및 항CLDN6 특이적 bi-scFv 항체 단편의 추가적 개발에 있어서, 오리지널 단백질의 최적화에 대한 다른 측면을 다루었다. 이들 측면은 주로, 재조합 단백질 생산을 통해 형성될 수 있는 다른 폴딩 종(folding species), 디설파이드 이성질체, 및 올리고머에 있어 높은 동질성을 갖는 제품 생산에 관한 것이다. 이들 변형은 bi-scFv 단백질의 기능 활성에 불리해서는 안된다.
bi-scFv 단백질의 항CD3 결합 도메인에서 추가 (홀) 시스테인 잔기의 치환
Ig 도메인의 주서열내에서 일어나는 홀(unpaired) 시스테인 잔기들이, 적절한 폴딩 및 생성 항체 단편의 안정성에 필수적인 쇄내 및/또는 쇄간 디설파이드 바운드의 정확한 형성을 방해할 수 있는지에 대한 조사를 위하여, 몇가지 합성 구조를 생성하였다. 이러한 홀 시스테인은 최종 단백질 제품의 효능, 동질성, 생산성 및 안정성을 저해할 수 있고, 따라서 방지되어야 한다. 디설파이드를 수반하는 시스테인의 "표준" 집합에 더하여, 짝 자유 시스테인 잔기가 가변 도메인에 존재할 수 있다.
예를 들어, OKT3 항체로부터의 VH 도메인에서, CDR-H3의 시작 전에 세 개의 잔기, H92 위치에서 보존 시스테인이 존재하며, H22 위치와 구조적 디설파이드 결합을 형성한다. 그러나, H100A (CDR-H3) 위치의 이 분자에서, 또 다른 시스테인 (Cys)이 미스-폴딩, 즉 H92 대신 H100A이 H22 위치와 디설파이드 결합을 형성할 수 있어서, 미스폴딩된 불용성 및 비기능 제품을 생성할 수 있다. 이러한 시스테인 잔기들의 미스페어링을 방지하기 위하여, 자유 시스테인의 사이트 지시 치환을 형성하였다 (Kipriyanov, protein Engineering 10:445-453, 1997). 이러한 단일 치환에 의하여, OKT3로부터 유래하는 scFv의 생산성 및 안정성의 유의한 증가가 전체 결합 활성을 유지하는 가운데 달성되었다.
본 연구에 사용된 항CD3 항체 TR66 (SEQ ID NO: 36)의 VH 도메인은, SEQ ID NO: 36에서 나타낸 바와 같은 주서열의 H103 위치의 자유 시스테인이다. 항CD3 항체 TR66 (SEQ ID NO: 36)의 VH 도메인의 서열을 항CD3 항체 OKT3의 VH 도메인의 서열과 비교하면 96.6% 서열 동성을 나타낸다.
이러한 결과에 뒤따라, 항CD3 항체 TR66의 VH 도메인의 CDR-H3 내의 세린 잔기에 의한 자유 시스테인의 치환을, CD3 (SEQ ID NO: 94)을 표적화하는 bi-scFv 단백질 또는 CLDN18.2 또는 CLDN6에 대하여 수행하였다. 이러한 치환체의 도입의 결과, bi-scFv 단백질 1-BiMAB-S (SEQ ID NO: 103) 및 6-PHU3-S (SEQ ID NO: 101)가 설계된다(각각 표 11 및 12 참조).
항CLDN6 bi-scFv 단백질에서 초과 (홀) 시스테인 잔기의 치환
그것의 가변 도메인이 대응 bi-scFv 단백질s 6PHU3 (SEQ ID NO: 45) 및 6PHU5 (SEQ ID NO: 43)의 조립에 사용되는, 모(parental) 항CLDN6 항체 mCLDN6ab은 대응 주서열 위치 46의 VL 도메인의 CDR-L2의 측면지역 내에 홀 시스테인 잔기를 함유한다. 이는 VL의 첫번째 아미노산이 생략된 SEQ ID NO: 23 내의 위치 45에 해당한다. 다른 치환를 수행하여 자유 시스테인을 다음으로 치환한다:
- 세린 잔기를 유사하게 항 CD3 항체 TR66 (SEQ ID NO: 100)의 VH 도메인에 치환.
- 루신 잔기, 다른 항CLDN6 항체들 (SEQ ID NO: 97 및 98)의 아미노산 서열과 비교.
- 트립토판 잔기, 생식세포계열 데이터베이스 (SEQ ID NO: 99)와 비교한 아미노산 서열에 의함.
항CLDN18.2 bi-scFv 단백질에서 링커 길이, V-도메인의 순서 및 인공 인터페이스 디설파이드 결합의 평가
다른 예로서, Arndt 등 (Biochemistry 37:12918-12926, 1998)은 비공유 결합된 scFv 단편의 올리고머의 외형에 대한 가능한 설명으로서, 소위 도메인 스와핑을 기술하였다. 이 모델 하에, 단백질 상태는 VL/VH 인터페이스 접점의 분자내 및 분자간 교환이 일정하게 일어나기 때문에 단량체 및 이량체/올리고머 형태 사이에 가능한 열역학적 평형에 이르게 된다. 이들 올리고머는 세포 배양 상등액에 이미 존재할 수 있으며, 정제 단계에서 제거되어야 한다. 그러나, 이들 분자 종은 정제 단량체 총의 저장 중에 형성될 수도 있다.
단백질의 바람직한 에너지 상태는 그 전체 설계(주서열, 링커 길이, VL/VH 방향 등)에 의하여 강력한 영향을 받는다. Worn 및 Pluckthun (JMB 305:989-1010, 1999)은 20 이상의 잔기들의 링커를 사용하여 단량체 종의 함량이 더 높은 형태가 얻어질 수 있다고 언급했다. Desplancq 등 (단백질 Eng. 7:1027-1033, 1994)은 가변 도메인 방향인 이량체 및 고분자 형태의 형성에 영향을 줄 수도 있다고 표시했다. 같은 간행물에서 Desplancq는 25 또는 30 아미노산 (aa)의 링커는 특정 항체에 있어서 이량체에 대한 단량체의 최선의 비율이라는 것을 보여주었다. VL의 C-말단 및 VH의 N-말단 간의 거리는 약 39-43 A이고, VH의 C-말단 및 VL의 N-말단 간의 거리는 32-34 A 이었다 (Pluckthun et al., From PCR to fermentation. (J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, & D. J. Chriswell, Eds.). In: (IRL Press., pp. 203-252, 1996). 유사한 분자 성질을 얻기 위하여, VL-VH 방향을 위한 링커는 VH-VL 링커 보다 길어야 한다. Pluckthun 등 (From PCR to fermentation (J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, & D. J. Chriswell, Eds.). 문헌 (IRL Press., pp. 203-252, 1996)은 VH/VL 방향의 15 또는 20 아미노산 길이의 링커, 및 VH/VL 방향의 20 또는 25 아미노산 길이의 링커 사용을 권장하였다.
단량체를 형성하고 VH/VL 도메인 상호작용을 안정화하는 다른 가능성은 인터페이스 디설파이드 결합이 두 도메인 사이의 접촉면에 생기게 하는 것이다. 디설파이드 브릿지를 위치 H44-L100 (Kabat numbering)에 도입하는 것이 scFvs의 경우 만족할만한 결과와 함께 가장 빈번하게 사용되어 왔다 (Brinkmann et al., PNAS. 90:7538-7542, 1993; Worn 및 Pluckthun, Biochemistry 38: 8739-8750, 1999; Weatherill et al., PEDS. 25:321-329, 2012). 이 전략은 전체 길이 IgG에 융합된 scFv와 결합하는 IgG-유사 이중특이 항체를 성공적으로 안정화시키는데 사용되어 왔다 (Michaelson et al., mAbs 1: 128-141, 2009; Schanzer et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 55:2369-2378, 2011).
Weatherill 등 (PEDS 25:321-239, 2012)은 VH44 및 VL-100 위치 사이에 디설파이드 결합을 갖는 인간 scFvs (VH-(G4S)4-VL 및 VL-(G4S)4-VH)을 안정화시켰다. 게다가, 이 간행물은 다른 SE-HPLC 실험을 다른 첨가 부피 및 농도로 수행함으로써, 인터페이스 디설파이드 결합이 없는 scFv과의 가능성 있는 도메인 스와핑의 문제를 해결한다. 상기 어세이는 비안정화 scFv에 대한 샘플 로딩 조건에 따라 서로 다른 결과를 가져왔으나, 단량체와 같이 용출된 디설파이드 안정화 분자에 대한 조건에 대해서는 독립적이다. Zhao 등 (Int. J. Mol. Sci. 12:1-11, 2011)은 scFv에서 동일한 돌연변이를 소개하였으며, 37 ℃에서 20시간 동안 보관 후 안정화된 분자에서 더 높은 안정성을 관찰하였다.
전체 길이 IgG에 융합된 scFv을 사용하는 이중특이 포맷에 대하여, Schanzer 등 (Antimicrob. Agents Chemother. 55:2369-2378 2011)은 링커 길이 및 인터페이스 디설파이드 결합의 효과를 비교하였다. 이 발명자들은 모 scFv 또는 scdFv (VH-(G4S)3-VL)을 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단부에 융합시켰다. 서로 다른 링커 길이 (20, 25 및 30 아미노산)를 위하여, 모 scFv을 중쇄 또는 경쇄의 C-말단부에 융합시켰다. 서로 다른 링커 길이로부터 얻은 결과는 30 aa 펩타이드가 안정성 단량체의 제조에 보다 바람직한 링커임을 나타냈다. 40℃에서 7일간 보관 후 응집체의 농도는 scFv15에 있어 50%, scFv20에 있어 18%, scFv25에 있어 8%, 및 scFv30에 있어 6%이었다. 그러나, 인터페이스 디설파이드 결합으로 안정화된 디설파이드 scFv15는 scFv30보다 다소 우수하였다. 동일한 접근법이 Michaelson 등(mAbs, 1:128-141 2009)에 의하여 사용되었는데, 이들은 링커 길이를 scFv의 20 aa으로 증가시키고, VH44 및 VL-100 위치 사이에 인터페이스 디설파이드 결합을 도입함으로써, VH/VL 방향 15 aa 링커와 함께 scFv을 함유하는 모IgG-유사 이중특이 항체를 개선하였다(응집체 40% 생성). 생성된 분자는 단량체가 98%를 초과하는 수율을 얻었는데, 이는 4℃에서 3개월 후에 안정하였다. 이들 저자는 이중특이 포맷으로 가기 전에 scFv 분자의 개선에 힘쓰기로 하였다.
항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질의 경우, 이량체 및 고분자 형태의 형성이 일어날 수 있는지, 및 항클라우딘 및/또는 항CD3 scFv 분자에 대한 그것의 영향이 무엇인지 알려지지 않았다. 각 별도의 scFv에 대한 항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질을 위한 최적의 전체 분자를 평가하기 위하여, 이하의 변형이 평가되었다:
- 도메인 방향
- 링커 길이
- 인터페이스 디설파이드 결합의 도입
- 이 세가지 변형의 조합
항클라우딘 18.2 binding 도메인에 대하여, mCLDN18.2ab (VH: SEQ ID NO: 8; VL: SEQ ID NO: 15)으로부터 유래한 가변 도메인에 추가하여, 항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질 구축을 위하여 mCLDN18.2ab1 (VH: SEQ ID NO: 6; VL: SEQ ID NO: 11) 로부터 유래된 서열이 사용되었다.
섹션 A에서 표 11은 "서열 오리진, 32 항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 구조물의 설계, 및 발현 벡터로의 클로닝"은 서로 다른 구조물을 설명한다.
A. CLDN18.2 및 CD3을 표적화하는 이중특이 결합제의 생성 및 시험
a. 서열 오리진, 32 항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 구조물의 설계, 및 발현 벡터로의 클로닝
본 명세서에 기재한 이중특이 탠덤 단일 사슬 항체 구조물 bi-scFv은 두가지 구별되는 결합 도메인을 함유하는데, 첫번째 것은 인간 종양 관련 항원 (TAA)에 대하여 특이적인 반면, 두번째 것은 인간 T 세포 수용체 (CD3)의 ε-사슬에 대하여 특이적이다. 이중특이 분자의 두 결합 도메인 각각은 scFv 부분으로서 VH-VL 또는 VL-VH 방향으로 배열된 두개의 항체 가변 도메인을 포함한다. 항체 가변 도메인은 G4S 서브유닛의 4 또는 5번 반복으로 이루어진 플렉시블 글리신-세린 펩타이드 링커를 통하여 방향에 따라 결합된다. 따라서, VH-VL 방향으로 배열된 scFv 부분은 20 아미노산 링커 ("LL4"라고 명명)에 의해 결합되고, VL-VH의 경우에는 25 아미노산 링커 ("LL5"라고 명명)에 의하여 결합된다. 한편, 두개의 scFv 부분은 6 아미노산 길이 SG4S 링커 ("SL"라고 명명)에 의해 결합된다. 모노클로날 항체 (mAB)로부터 서열 오리진 및 도메인 조직에 대한 정보는 표 11에 요약하였다.
변이체 5504, 5505, 5506, 5507, 5512, 5513, 5514, 5515, 5520, 5521, 5522, 5523, 5528, 5529, 5530, 5531, 5536, 5537, 5538, 5539, 5544, 5545, 5546, 5547, 5552, 5553, 5554, 5555, 5560, 5561, 5562 및 5563는 SEQ ID NO: 95를 갖는 VH 항CD3 및 SEQ ID NO: 96을 갖는 VL 항CD3을 포함한다.
특히 1-BiMAB-S의 경우, 자유 시스테인을 VH 항CD3 (SEQ ID NO: 94) 중의 세린으로 치환만이 1-BiMAB 서열 (SEQ ID NO: 39)의 아미노산 서열과 대조하여 수행되었다. SEQ ID NO: 39이 여전히, 포유류 발현에 의해 세포 배양 상등액으로의 1-BiMAB bi-scFv 단백질의 분비를 중재하는 N-말단 시그널 서열의 아미노산 서열을 함유하고 있음을 알아야 한다. 이 시그널 서열은, 시그널 펩티다제에 의해 소포체의 루멘에서 절단되기 때문에, 분비된 재조합 단백질의 일부가 아니다.
bi-scFv 구조물을 인코딩하는 유전자는 GeneArt® gene synthesis (Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)을 통해 GeneOptimizer® 소프트웨어를 사용하여 생성되어, CHO 세포의 발현을 위하여 코돈 이용을 최적화한다. 공통의 분비 시그널을 배제하고, 모든 DNA 구조물은 동일한 Kozak 서열 및 5' 말단에서 HindIII 제한을 갖는다. 3' 말단에서 BsiWI 및 XhoI 인식 사이트가 첨가되어 서로 다른 발현 벡터로의 플렉시블 서브클로닝을 가능하게 한다. HindIII 및 XhoI 제한 사이트를 이용한 Life Technologies에 의하여 선택 pCEP4 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)의 발현 벡터로의 서브클로닝을 수행하였다.
표 11: bi-scFv 항CLDN18.2 구조물의 요약
Figure 112021041708355-pat00011
Figure 112021041708355-pat00012
*) LL4, (G 4 S) 4 ; LL5, (G 4 S) 5 ; SL, SG 4 S
SEQ ID NOs: 66 내지 93는 여전히 포유류 발현에 의해 세포 배양 상등액으로의 1-BiMAB bi-scFv 단백질의 분비를 중재하는 N-말단 시그널 서열의 아미노산 서열을 함유하고 있음을 임을 알아야 한다. 이 시그널 서열은, 시그널 펩티다제에 의해 소포체의 루멘에서 절단되기 때문에, 분비된 재조합 단백질의 일부가 아니다.
b. 일시적 형질주입에 의한 32 항CLDN18.2 특이적 bi-scFv 단백질의 생산 및 정제
현탁액 적응 CHO-세포를 가습 CO2 쉐이커 중의 혈청없는 배지에서 서브-배양하였다. 형질주입 하루 전에, 세포를 쉐이커 플라스크 중의 혈청없는 배지에 시딩하였다. 혈청주입하는 날, 세포를 원심분리하고(200 x g에서 5분), 쉐이커 플라스크 중의 신선한 DMEM-Medium (Invitrogen, 41965-039)에서 재현탁시켰다. DNA 및 형질주입제를 세포에 첨가하고, 부드럽게 흔들어서 혼합하였다. CO2-인큐베이터에서 정적인 배양 후, 세포를 혈청없는 생장 배지로 희석하였고, 인큐베이션 쉐이커에서 발현을 위해 배양하였다. CHO CD EfficientFeed™ C (Invitrogen, A13275)을 이용하여 영양적 요구에 따라 세포에게 피딩했다. 세포의 생존율이 감소하기 시작한 후, Bi-scFv 단백질를 하베스트하였다. Capto L 세파로오스에 의해 항체 구조물을 정제하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
c. 32 항CLDN18.2-특이 bi-scFv 단백질에 대한 루시페라제 세포독성 분석
32 항CLDN18.2-특이 bi-scFv 단백질에 대한 기능 스크린을 위하여, 4지점 적정 (5000, 1000, 200 및 40 ng/ml)을 실시예 2.c에 기재된 바와 같이 생체외 루시페라제 세포독성 분석에서 시험하였다. 실시예 2.c에 기재된 바와 같은 안정한 루시페라제-발현 NugC4 세포를 인간 T 세포 및 bi-scFv 단백질과 함께, 또는 bi-scFv 단백질 없이 배양하여, Lmin 값을 결정하였다. 분석 시작 후 24시간 및 48시간에 생존 세포의 발광을 Infinite M200 Tecan plate reader로 측정하였다. 특이적 표적 세포 용해를 실시예 2.c에서 예시된 식으로 계산하였다.
scFv 항CD3 TR66 결합 도메인을 기반으로 세포독성 결과(도 39 a, b, c 및 d)의 정량분석을 수행하여, 다음의 결과를 이끌어낼 수 있었다.
루시페라제 세포독성 분석에서 최선으로 기능하는 항CLDN18.2-특이 bi-scFv 단백질은, 인터페이스 디설파이드 브릿지가 있거나 없는 상태에서, "LL4" 링커에 의해 결합되는, VH/VL 도메인 방향 항CD3 부분을 함유한다 (5504, 5505, 5506, 5507, 5536, 5537, 5538, 5539, 5512, 5513, 5514, 5515, 5544, 5545, 5546, 5547; 도 39 a 및 b). 더 낮은 세포독성 활성은 펩타이드 링커 "LL5" 및 인터페이스 디설파이드 브릿지를 갖는 VL/VH 도메인 방향 항CD3 부분을 함유하는 변이체에서 얻어진다 (5528, 5529, 5530, 5531, 5560, 5561, 5562, 5563; 도 39 d). 가장 낮은 세포독성 활성은 펩타이드 링커 "LL5"를 가지고, 인터페이스 디설파이드 브릿지가 없는 VL/VH 도메인 방향 항CD3 부분을 함유하는 변이체에서 얻어진다 (5520, 5521, 5522, 5523, 5552, 5553, 5554, 5555; 도 39 c).
B. CLDN6 및 CD3을 표적화하는 이중특이 결합제의 생성 및 시험
a. 서열 오리진, bi-scFv 구조물의 설계, 및 발현 벡터로의 클로닝
본 명세서에 기재한 이중특이 탠덤 단일 사슬 항체 구조물 bi-scFv은 두가지 구별되는 결합 도메인을 함유하는데, 첫번째 것은 인간 종양 관련 항원 (TAA)에 대하여 특이적인 반면, 두번째 것은 인간 T 세포 수용체 (CD3)의 ε-사슬에 대하여 특이적이다. 이중특이 분자의 두 결합 도메인 각각은 scFv 부분으로서 VH-VL 또는 VL-VH 방향으로 배열된 두개의 항체 가변 도메인을 포함한다. 항체 가변 도메인은 플렉시블 글리신-세린 펩타이드 링커를 통하여 결합된다.
TAA를 표적화하는 scFv 부분은 VH-VL 방향으로 배열되며, G4S 서브유닛의 동일한 3번 반복으로 이루어진 15 아미노산 링커 ("LL3"라고 명명)에 의해 결합된다. CD3를 표적화하는 scFv 부분도 역시 VH-VL 방향으로 배열되지만, 서열 G4S(G2S)3G3S을 갖는 18 아미노산 링커 (LLv1라고 명명)에 의해 결합된다. 한편, 두개의 scFv 부분은 6 아미노산 길이 SG4S 링커 ("SL"라고 명명)에 의해 결합된다. 모노클로날 항체 (mAB)로부터 서열 오리진 및 도메인 조직에 대한 정보는 표 12에 요약하였다. 변이체 5454, 5456, 5458, 5460, 5462 및 5464는 항CD3 결합 도메인에 있어 SEQ ID NO: 95을 갖는 VH 항CD3 및 SEQ ID NO: 96을 갖는 VL 항CD3을 포함한다. 변이체 5454 및 5458는 SEQ ID NO: 98을 갖는 VL 항CLDN6을 포함하고; 변이체 5456 및 5460 SEQ ID NO: 99을 갖는 VL 항CLDN6을 포함하며; 변이체 5462 및 5464는 SEQ ID NO: 100을 갖는 VL 항CLDN6을 포함한다.
특히 6PHU3-S (SEQ ID NO: 101)의 경우, 자유 시스테인을 VH 항CD3 (SEQ ID NO: 94) 중의 세린 잔기로 치환만이 6-PHU3 서열 (SEQ ID NO: 45)의 아미노산 서열과 대조하여 수행되었다. SEQ ID NO: 45이 여전히, 포유류 발현에 의해 세포 배양 상등액으로의 6PHU-3 bi-scFv 단백질의 분비를 중재하는 N-말단 시그널 서열의 아미노산 서열을 함유하고 있음을 알아야 한다. 이 시그널 서열은, 시그널 펩티다제에 의해 소포체의 루멘에서 절단되기 때문에, 분비된 재조합 단백질의 일부가 아니다. 더욱이, 6PHU3-SL (SEQ ID NO: 102)에 있어, 해당 주서열의 위치 46에서 자유 시스테인을 VL 항CLDN6 (SEQ ID NO: 97) 중의 루신 잔기로 치환하는 것만이 6PHU3-S의 아미노산 서열과 대조하여 수행되었다. 이는 VL의 첫번째 아미노산이 생략된 SEQ ID NO: 23 내의 위치 45에 해당한다.
bi-scFv 구조물을 인코딩하는 유전자는 GeneArt® gene synthesis (Life Technologies GmbH, Darmstadt, 독일)을 통해 GeneOptimizer® 소프트웨어를 사용하여 생성되어, CHO 세포의 발현을 위하여 코돈 이용을 최적화한다. 공통의 분비 시그널을 배제하고, 모든 DNA 구조물은 동일한 Kozak 서열 및 5' 말단에서 HindIII 제한을 갖는다. 3' 말단에서 BsiWI 및 XhoI 인식 사이트가 첨가되어 서로 다른 발현 벡터로의 플렉시블 서브클로닝을 가능하게 한다. HindIII 및 XhoI 제한 사이트를 이용한 Life Technologies에 의하여 선택 pEE12.4 (Lonza Group Ltd, Basel, 스위스)의 발현 벡터로의 서브클로닝을 수행하였다.
표 12: bi-scFv 항CLDN6 구조물의 요약
Figure 112021041708355-pat00013
*) LL3, (G4S)3; LLv1, G4S(G2S)3G3S; SL, SG4S
b. 일시적 형질주입에 의한 6 항CLDN6 특이적 bi-scFv 단백질의 생산 및 정제
현탁액 적응 CHO-세포를 가습 CO2 쉐이커 중의 혈청없는 배지에서 서브-배양하였다. 형질주입 하루 전에, 세포를 쉐이커 플라스크 중의 혈청없는 배지에 시딩하였다. 혈청주입하는 날, 세포를 원심분리하고(200 x g에서 5분), 쉐이커 플라스크 중의 신선한 DMEM-Medium (Invitrogen, 41965-039)에서 재현탁시켰다. DNA 및 형질주입제를 세포에 첨가하고, 부드럽게 흔들어서 혼합하였다. CO2-인큐베이터에서 정적인 배양 후, 세포를 혈청없는 생장 배지로 희석하였고, 인큐베이션 쉐이커에서 발현을 위해 배양하였다. CHO CD EfficientFeed™ C (Invitrogen, A13275)을 이용하여 영양적 요구에 따라 세포에게 피딩했다. 세포의 생존율이 감소하기 시작한 후, Bi-scFv 단백질를 하베스트하였다. Capto L 세파로오스를 사용한 FPLC에 의해 항체 구조물을 정제하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
c. 6 항CLDN6-특이 bi-scFv 단백질의 EC50의 결정
항CLDN6-특이 bi-scFv 단백질의 반수 최대 유효량을 결정하기 위하여, 실시예 13에 기재한 바와 같이 생체외 루시페라제 세포독성 분석에서 bi-scFv 단백질의 적가를 시험하였다.
안정 루시페라제-발현 PA-1 세포 및 인간 T 세포를 E:T 비율 5:1으로 하여 bi-scFv 단백질 농도 2.5 pg/ml 내지 5 μg/ml 범위내에서 (10 단계), 또는 항CLDN6-특이 bi-scFv 단백질 없이 배양하여 Lmin 값을 결정하였다.
세개의 독립적인 어세이를 인간 T 세포 제조를 위한 서로 다른 인간 기증자에 대하여 실시하였다. 그 결과를 도 40에 도시하였다.
CDR-L2의 측면 지역 내 세린, 루신 또는 트립토판에 의한 시스테인 잔기 치환 및 항CLDN6 및 항CD3 결합 도메인 위치를 기반으로 하여 세포독성 결과에 대한 정량비교를 수행함으로써, 다음의 결과를 이끌어낼 수 있었다.
루시페라제 세포독성 분석에서 최선으로 기능하는 항CLDN6-특이 bi-scFv 단백질은 bi-scFv 단백질의 N-말단부에 항CLDN6 결합 도메인을 갖고, 트립토판 치환될 시스테인을 포함한다 (변이체 5456). 다소 낮은 세포독성 활성은, 시스테인이 트립토판 (변이체 5460) 또는 세린 (변이체 5464)으로 치환된, C-말단부에 항CLDN6을 포함하는 변이체에서 얻어진다. bi-scFv 단백질의 N-말단부에 (변이체 5454) 또는 C-말단부에 (변수 5458) 항CLDN6을 갖는, 시스테인이 루신으로 치환된 변수에 있어서, 기존의 변이체와 비교하여 더 낮은 세포독성 활성이 측정된다. 놀랍게도, bi-scFv 단백질의 N-말단부에 (변이체 5462) 항CLDN6을 갖는, 시스테인이 세린으로 치환된 변이체는 가장 낮은 세포독성 활성을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> BioNTech AG et al. <120> AGENTS FOR TREATMENT OF CLAUDIN EXPRESSING CANCER DISEASES <130> 674-86 PCT <150> PCT/EP2012/004712 <151> 2012-11-13 <150> PCT/EP2013/002270 <151> 2013-07-30 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala 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Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 3 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Val Ile 130 135 140 Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly 180 185 190 Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val 210 215 220 <210> 4 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro 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Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 145 150 155 160 Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 165 170 175 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr 180 185 190 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 195 200 205 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 225 230 235 240 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe 245 250 255 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 260 265 270 Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 275 280 285 Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 290 295 300 Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 305 310 315 320 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 325 330 335 Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 340 345 350 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 355 360 365 Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 370 375 380 Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 405 410 415 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 420 425 430 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly 435 440 445 Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 450 455 460 Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 465 470 475 480 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 485 490 495 Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 500 505 510 Leu Lys His His His His His His 515 520 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 104 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 105 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 105 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 106 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 107 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His Tag <400> 107 His His His His His His 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His Tag <400> 108 Gly Gly Ser His His His His His His 1 5

Claims (38)

  1. 클라우딘(CLDN)에 결합하는 제1 결합 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 결합제로서,
    결합제는 클라우딘 항원에 대한 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변도메인 (VH(CLDN)), 클라우딘 항원에 대한 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변도메인 (VL(CLDN)), CD3에 대한 특이성을 갖는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변도메인 (VH(CD3)), 및 CD3에 대한 특이성을 갖는 면역글로불린의 경쇄(VL)의 가변도메인 (VH(CD3))(VL(CD3))을 포함하고,
    (i) CLDN은 CLDN6이고,
    상기 VH(CLDN)은 SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 및 26으로 표시되는 아미노산 서열 및 그의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 VL(CLDN)은 SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 및 27 내지 29로 표시되는 아미노산 서열 및 그의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    (ii) VH(CD3)은 SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 및 36으로 표시되는 아미노산 서열 및 그의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    VL(CD3)는 SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 및 37로 표시되는 아미노산 서열 및 그의 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 결합제.
  2. 제1항에 있어서, 결합제는 이중특이 분자인 것인 결합제.
  3. 제2항에 있어서, 이중특이 분자는 이중특이 항체인 것인 결합제.
  4. 제3항에 있어서, 이중특이 항체는 이중특이 단일 사슬 항체인 것인 결합제.
  5. 제1항에 있어서, T 세포들 상의 CD3에 대한 상기 결합제의 결합은 상기 T 세포들의 증식 및/또는 활성화를 초래하고, 상기 활성화된 T 세포들은 퍼포린 및 그랜자임을 포함하는 세포독성 인자를 방출하며 암세포의 세포분해 및 세포자멸사를 개시하는 것인 결합제.
  6. 제1항에 있어서, 결합제는 전장 항체, 항체 단편, 폴리펩타이드 사슬 상의 경쇄 가변 도메인 및 이와 연결된 동일한 폴리펩타이드 사슬 상의 중쇄 가변 도메인을 포함함으로 해서 이들 두 도메인이 쌍을 이루지 않는 이중체(diabody)의 포맷을 갖는 것인 결합제.
  7. 제6항에 있어서, 이중체는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하되 그 중 하나의 폴리펩타이드는 VH(CLDN) 및 VL(CD3)을 포함하고 다른 폴리펩타이드 사슬은 VH(CD3) 및 VL(CLDN)을 포함하는 것인 결합제.
  8. 제1항에 있어서, 결합제는 링커 펩타이드를 통해 연결된 2개의 scFv 분자들로 구성된 이중특이 단일 사슬 항체의 포맷으로 존재하는 것인 결합제.
  9. 제8항에 있어서, 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 N-말단으로부터 C-말단으로, VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN) 또는 VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN)의 순서로 배열된 것인 결합제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 중쇄 가변부 (VH) 및 대응하는 경쇄 가변부 (VL)는 아미노산 서열 (GGGGS)3 또는 VE(GGGGS)2GGVD을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결된 것인 결합제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 2개의 VH-VL 또는 VL-VH scFv 유닛은 아미노산 서열 SGGGGS 또는 GGGGS을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결된 것인 결합제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 결합제는 SEQ ID NOs: 42, 43, 44 및 45로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 것인 결합제.
  13. 제1항에 있어서, 결합제는 N-말단 분비 시그널 및/또는 C-말단 히스티딘 에피토프 태그 또는 6개의 히스티딘 에피토프 태그를 갖는 것인 결합제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 결합제를 인코딩하는 재조합 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 벡터 형태 또는 RNA 형태인 것인 재조합 핵산.
  16. 제14항에 기재된 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물의 제조용인 것인 결합제로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 결합제.
  18. 제14항에 있어서, CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물의 제조용인 것인 재조합 핵산으로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 핵산.
  19. 제16항에 있어서, CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물의 제조용인 것인 숙주 세포로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 숙주 세포.
  20. CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 결합제를 포함하는 의약 조성물로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 의약 조성물.
  21. CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 제14항에 기재된 재조합 핵산을 포함하는 의약 조성물로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 의약 조성물.
  22. CLDN6를 발현하는 암세포에 의하여 특징지어지는 암 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 제16항에 기재된 숙주 세포를 포함하는 의약 조성물로서,
    상기 암은 방광암, 난소암, 난소 선암종 및 난소 기형암종, 소세포 폐암 (SCLC) 및 비소세포 폐암(NSCLC)을 비롯한 폐암, 편평세포 폐암종 및 선암종, 위암, 유방암, 간암, 췌장암, 피부암, 기저세포 암종 및 편평세포 암종, 악성 흑색종, 두경부암, 악성 다형 선종, 육종, 활막 육종 및 암육종, 담관암, 방광의 암, 이행세포암종 및 유두암종, 신장암, 투명세포 신장세포 암종 및 유두상 신장세포 암종을 비롯한 신장세포 암종, 결장암, 회장의 암을 비롯한 소장암, 소장 선암종 및 회장의 선암종, 태아 고환암종, 태반 융모막암종, 자궁경부암, 고환암, 고환 정상피종, 고환 기형암 및 배아 고환암, 자궁암, 생식세포 종양, 기형암종 또는 배아암종, 고환의 생식세포 종양, 및 이들의 전이형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 의약 조성물.
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