KR101955053B1 - 중공 섬유 생물 반응기에서의 줄기 세포의 확장 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중공 섬유 생물 반응기 기술을 이용한 다수의 세포의 제조에 관한 것이다. 세포는 형질전환 없이 하기 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있는 비배아 줄기, 비생식 세포이다: 배양 중 연장된 복제 및 연장된 복제의 마커, 예컨대 텔로머라아제, 전능성의 마커, 및 광범위한 분화 잠재력.

Description

중공 섬유 생물 반응기에서의 줄기 세포의 확장{EXPANSION OF STEM CELLS IN HOLLOW FIBER BIOREACTORS}
본 발명은 중공 섬유 연속 관류 생물 반응기 기술을 이용한 다수의 세포의 제조에 관한 것이다. 세포는 형질전환 없이 하기 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있는 비배아 줄기, 비생식 세포이다: 배양 중 연장된 복제 및 연장된 복제의 마커, 예컨대 텔로머라아제, 전능성의 마커, 및 광범위한 분화 잠재력.
중공 섬유 생물 반응기 기술은 세포의 고밀도 확장의 수득에 사용되어 왔다. 일반적으로, 세포는 다수의 중공 섬유 내에서 및/또는 상기 중공 섬유 외부에서 확장된다. 이 디자인에 의해 제공되는 큰 표면적 때문에, 배양 기재로서의 섬유의 사용은 특히 임상 응용용의 다수의 세포가 생성되게 한다. 처음에 크나제크(Knazek)에 의해 1970년대에 개발된 이 기술은 다수의 발전 및 개선을 겪었다. 기본적인 개념은 영양소, 가스 및 다른 기본적인 배지 성분과, 세포 노폐물에 대해서는 투과성이지만 세포에 대해서는 불투과성인, 그리고 세포가 그 위에서 확장될 수 있는 섬유 매트릭스를 제공하는 것이다.
반투성 관형 막 상에서의 세포 배양은 처음에 크나제크에 의해 1970년대 초반에 발명되었다. 예를 들어, 미국 특허 제3,821,087호; 미국 특허 제3,883,393호; 미국 특허 제4,220,725호; 미국 특허 제4,184,922호; 및 미국 특허 제4,200,689호를 참조한다. 상기 발명에 따르면, 영양 배지에 현탁된 세포는 모세관을 유통하는 산소화된 영양 배지에 의해 계속 관류되는 모세관의 외부 표면 상에 침강되었다. 영양 물질은 관류 배지로부터 모세관 벽을 통하여 세포 내로 확산되는 반면, 세포 노폐물은 세포로부터 모세관 벽을 통하여 관류액으로 확산되었는데, 상기 관류액으로부터 상기 노폐물이 회수될 수 있었다.
상기 기술은 세포를 살아있는 조직의 세포에 근접한 밀도 및/또는 구조로 성장시키려는 시도가 실패한 것에 대한 응답으로 개발되었다. 주로, 생존가능한 세포를 매우 높은 밀도로, 예컨대 조직에서 발견되는 것으로 성장시키는 문제가 있었다. 첫째, 배지의 성분은 세포층들을 통하여 확산되어 모든 세포에 도달하여야 하며, 그 이유는 세포층의 두께가 증가하기 때문이다. 둘째, 적합한 미세환경이 세포 배양 동안 유지되어야 한다. 따라서, 성장 중인 세포에 바로 인접한 유체는 세포 대사가 진행됨에 따라 계속 교환되고 있고, 배양 배지가 교환되거나 교반될 때 단계적 방식으로만 그의 원래 상태로 되돌아간다. 셋째, 조밀한 세포를 성장시킬 격자 또는 적합한 물질이 요구된다. 크나제크의 발명은 큰 필수 분자 및 작은 필수 분자 둘 모두를 공급하는, 세포 물질 내의 영양 공급원; 대사 산물을 제거하는 세포 물질 내의 싱크(sink); 적합한 미세환경; 3차원으로 성장을 가능케 하는 격자; 및 표준 세포 배양 기술이 요구하는 체적에 비하여 큰, 일층 및/또는 다층 세포 배양을 위한 표면적을 제공함으로써 이러한 문제들을 해결하였다.
상기 원래 발명 이래로, 이러한 기술은 다양한 세포 유형의 확장에 성공적으로 사용되어 왔으며, 이러한 기본 기술의 다양한 개선에 관한 큰 몸체의 과학 및 특허 문헌이 있다. 이러한 개선은 크나제크의 원래 목표를 달성하기 위하여 이 기술을 사용하는 것이 최적화되도록 다양한 기술적 변형을 다루었다. 당 산업계에서, 이 기술은 "중공 섬유" 세포 배양으로 표기되기에 이르렀으며, 생물 반응기 세팅에서, 중공 섬유 생물 반응기 세포 배양을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제3,997,396호; 미국 특허 제4,184,922호; 미국 특허 제4,200,689호; 미국 특허 제4,220,725호; 미국 특허 제4,804,628호; 미국 특허 제4,999,298호; 미국 특허 제5,126,238호; 미국 특허 제5,162,225호; 미국 특허 제5,627,070호; 미국 특허 제5,656,421호; 미국 특허 제5,712,154호; 미국 특허 제6,001,585호; 미국 특허 제6,680,166호; 미국 특허 제6,911,201호; 미국 특허 제6,933,144호; 미국 특허 제7,534,609호; 미국 특허 공개 제2001/0044413호; 미국 특허 공개 제2003/0224510호; 미국 특허 공개 제2005/0032218호; 미국 특허 공개 제2005/0003530호; 미국 특허 공개 제2006/0205071호; 미국 특허 공개 제2007/0298497호; 미국 특허 공개 제2008/0206733호; 미국 특허 공개 제2008/0213894호; 미국 특허 공개 제2008/0220522호; 미국 특허 공개 제2008/0220523호; 미국 특허 공개 제2008/0227190호; 미국 특허 공개 제2008/248572호; 미국 특허 공개 제2008/254533호; 미국 특허 공개 제2009/0191631호; 미국 특허 공개 제2009/0196901호; 미국 특허 공개 제2010/0042260호; 미국 특허 공개 제2010/0144037호; 미국 특허 공개 제2010/0209403호; 미국 특허 공개 제2010/0233130호; 미국 특허 공개 제2010/0267134호; 국제 특허 공개 제WO 91/18972호; 국제 특허 공개 제WO 95/13088호; 국제 특허 공개 제WO 95/21911호; 국제 특허 공개 제WO 01/23520호; 국제 특허 공개 제WO 07/012144호; 국제 특허 공개 제WO 10/034468호; 국제 특허 공개 제WO 10/149597호; 및 문헌[Gloeckner et al., Biotech Prog 17:828-31 (2001)]을 참조한다.
미국 특허 공개 제2010/0267134호에는 중공 섬유 모세관 배양을 이용한 성인 인간 생식 세포계 줄기 세포의 단리, 특성화 및 분화가 개시되어 있다. 이 참고 문헌에는 중공 섬유 모세관 표면 상에 접종된 세르톨리(Sertoli) 세포의 영양 세포층(feeder layer) 상에서의 정원 줄기 세포의 성장이 기술되어 있다.
미국 특허 공개 제2007/0298497호 및 미국 특허 공개 제2008/0220523호에는 중간엽 줄기 세포에 적용된 중공 섬유 생물 반응기 기술이 개시되어 있다. 세포 확장 시스템(cell expansion system; CES) 및 중간엽 줄기 세포를 성장시키는 데 이를 사용하는 방법이 기술되어 있다.
미국 특허 공개 제2009/0196901호는 지방 유래된 줄기 세포의 성장 및 분화를 용이하게 하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 세포는 세포 성장 및 분화용 중공 섬유를 포함할 수 있는 생물학적으로 양립가능한 스캐폴드(scaffold) 구조체를 이용하여 성장시킬 수 있으며, 상기 스캐폴드는 세포의 성장 및 분화를 위하여 생물 반응기에서 배양된다. 상기 참고 문헌은 다른 줄기 세포 유형이 이 공정에 사용될 수 있음을 제안한다. 그러나, 생물 반응기에서의 배양을 위한 직조 섬유 스캐폴드 상에서의 성장 및 분화 이전에, 세포는 이미 세포 배양에서 유의하게 확장되었다. 이는, 세포가 농축되고 겔 생체 재료와 같은 매트릭스에 현탁되고 3차원 스캐폴드에 적용되도록 충분한 수의 줄기 세포를 생성한다.
미국 특허 공개 제2010/0209403호에는 중공 섬유를 포함할 수 있는 생물 반응기에서 유착성 태반 및 지방 중간엽 줄기 세포를 성장시키는 방법이 개시되어 있다.
국제 특허 공개 제WO 95/13088호에는 간질 세포로 지지된 조혈 줄기 세포를 성장시키는 중공 섬유 기술이 개시되어 있다.
국제 특허 공개 제WO 91/18972호에는 골수 유래의 조혈 줄기 세포의 성장을 위한 중공 섬유 생물 반응기가 개시되어 있다.
국제 특허 공개 제WO 07/012144호에는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ESC) 및 다른 세포를 번식시키기 위하여 표면에 링커를 부착시킴으로써 개선된 중공 섬유 생물 반응기가 개시되어 있다.
국제 특허 공개 제WO 10/149597호에는 정원 세포 및 다른 생식 세포계 세포를 성장시키기 위한 중공 섬유 생물 반응기가 개시되어 있다.
국제 특허 공개 제WO 10/034468호에는 유착성 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포를 코팅 없이 성장시키는 중공 섬유 기술이 개시되어 있다.
문헌[Antwiler et al., "Bioreactor Design and Implementation," Stem Cell Bioengineering, Parekkadan and Yarmush, eds., pp. 49-62 (2009)]에는 자동화 중공 섬유 생물 반응기 시스템을 이용한 골수 단핵 세포(bone marrow mononuclear cell; BMMNC) 및 전 골수 둘 모두로부터의 중간엽 줄기 세포의 생체외(ex vivo) 확장 방법이 개시되어 있다. 상기 시스템은 살균 폐쇄 루프형 컴퓨터 제어식 배지 및 가스 교환기에 연결된 합성 중공 섬유 생물 반응기를 포함하였다. 실험 세팅에서, 이는 비교적 짧은 양의 시간 내에 치료적 용량의 중간엽 줄기 세포가 소량의 단일 골수 흡인물로부터 성장되게 한다.
본 발명은 중공 섬유 생물 반응기에서 본원에 개시된 세포를 확장시키는 것에 관한 것이다. 영양소의 계속적인 공급 및 노폐 대사 산물의 제거를 위한 연속 관류가 본 발명의 일 측면이다. 요망되는 분비 분자의 수집도 일 측면이다.
세포는 직접적으로 조직 샘플로부터, 예를 들어 골수, 제대혈, 또는 태반으로부터 비정제된 제제 또는 부분 정제된 제제로서 확장될 수 있다. 또는 세포는 이전에 단리 및 확장되거나 다르게는 정제된, 실질적으로 균질한 세포의 정제된 제제일 수 있다. 따라서, 출발 세포 제제의 순도는 사실상 비정제된 것이거나 (예컨대, 전체 골수 단핵 세포에서 출발), 1%-100% 순수할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 세포의 순도는 약 100%이다(실질적으로 균질하다). 다른 실시양태에서, 이것은 95% 내지 100%이다. 일부 실시양태에서, 이것은 85% 내지 95%이다. 그러나, 상기 백분율은 약 1%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-95%일 수 있다. 또는 단리/순도는 세포가 겪었을 세포 배가의 면에서 표현될 수 있으며, 예를 들어 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 또는 이보다 더 큰 세포 배가로 표현될 수 있다.
세포는 확장을 위하여 단일 공여체로부터 유래되고 그 공여체로 되돌려질 수 있다(자가). 또는 세포는 확장을 위하여 단일 공여체로부터 유래되고 상이한 대상체에게 투여될 수 있다(동종이계). 또는 세포는 상이한 공여체로부터 유래될 수 있다.
세포는 임의의 요망되는 수의 세포 배가를 통하여 확장될(증식될) 수 있다. 그 범위는 2배로부터 최대 1000배까지의 것 또는 그보다 더 큰 것을 포함한다. 한계치는 충분한 영양소를 제거하고 유해한 노폐물을 제거하는 능력에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 세포 배가는 약 2 내지 약 10배, 약 10 내지 약 50배, 및 약 50 내지 약 100배의 범위이다. 본 출원에 기술된 기술을 사용하면, 108개 초과의 세포가 단일 공여체로부터 생성될 수 있다.
세포는 확장되고, 수확되고, 그 후 추가의 확장을 위하여 생물 반응기 내로 재도입될 수 있다. 본 출원의 목적에 있어서, "런(run)"는 1회의 라운드의 확장 (세포의 도입으로부터 수확까지)을 나타낸다. 따라서, 세포는 1회 이상의 런 후 수집될 수 있다. "계대"는 런을 나타낸다. 세포는 각각의 런에 있어서 상이한 세포 배가를 통하여 확장될 수 있다. 예를 들어, 단일 런에서, 세포는 2 내지 10배 확장될 수 있다. 그러나, 반복된 런에 의해, 전체 확장이 훨씬 더 많아질 수 있다(상기에 논의된 바와 같음).
본 발명이 관련된 세포는 전능성 마커, 예컨대 oct4를 발현할 수 있다. 본 세포는 또한 연장된 복제 능력과 결부된 마커, 예컨대 텔로머라아제를 발현할 수 있다. 전능성의 다른 특성은 외배엽, 내배엽, 및 중배엽의 배엽 중 2개 이상의 배엽과 같은 1개 초과의 배엽의 세포 유형으로 분화되는 능력을 포함할 수 있다. 이러한 세포는 배양 중 불사화되거나 형질전환될 수 있거나 또는 그러하지 않을 수 있다. 본 세포는 형질전환되지 않고서 고도로 확장될 수 있으며, 또한 정상 핵형을 유지할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 비배아 줄기, 비생식 세포는 배양 중 적어도 10-40배의 세포 배가, 예컨대 50배, 60배 또는 그보다 많은 배가를 겪을 수 있으며, 여기서, 세포는 형질전환되지 않고, 정상 핵형을 갖는다. 본 세포는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 2가지 각각의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있으며, 상기 3가지 모두로의 분화를 포함할 수 있다. 추가로, 본 세포는 기형종을 생성하지 않는 것과 같이 종양 형성성이 아닐 수 있다. 세포가 형질전환되거나 종양 형성성이고, 세포를 주입용으로 사용하는 것이 바람직할 경우, 그러한 세포가 바람직할 수 있으며, 따라서 그러한 세포는 종양으로의 세포 증식을 방지하는 처리에 의한 것과 같이 생체내에서 종양을 형성할 수 없다. 그러한 처리는 당업계에 공지되어 있다.
세포는 하기의 넘버링된 실시양태를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다;
1. 배양 중 적어도 10-40배의 세포 배가를 겪은 단리되고 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, oct4를 발현하며, 형질전환되지 않으며, 정상 핵형을 갖는 세포.
2. 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 1의 비배아 줄기, 비생식 세포.
3. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 적어도 2가지의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 1의 비배아 줄기, 비생식 세포.
4. 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 3의 비배아 줄기, 비생식 세포.
5. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 3의 비배아 줄기, 비생식 세포.
6. 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 5의 비배아 줄기, 비생식 세포.
7. 배양 중 40배 이상의 세포 배가를 겪은 비배아, 비생식 조직의 배양에 의해 수득되는 단리되고 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 형질전환되지 않으며, 정상 핵형을 갖는 세포.
8. oct4, 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 7의 비배아 줄기, 비생식 세포.
9. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 적어도 2가지의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 7의 비배아 줄기, 비생식 세포.
10. oct4, 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 발현하는 상기 9의 비배아 줄기, 비생식 세포.
11. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 9의 비배아 줄기, 비생식 세포.
12. oct4, 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 발현하는 상기 11의 비배아 줄기, 비생식 세포.
13. 배양 중 적어도 10-40배의 세포 배가를 겪은 단리되고 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 텔로버라아제를 발현하며, 형질전환되지 않으며, 정상 핵형을 갖는 세포.
14. oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 13의 비배아 줄기, 비생식 세포.
15. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 적어도 2가지의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 13의 비배아 줄기, 비생식 세포.
16. oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 발현하는 상기 15의 비배아 줄기, 비생식 세포.
17. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 15의 비배아 줄기, 비생식 세포.
18. oct4, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 17의 비배아 줄기, 비생식 세포.
19. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 적어도 2가지의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 단리되고 확장된 비배아 줄기, 비생식 세포로서, 배양 중 적어도 10-40배의 세포 배가를 겪은 세포.
20. oct4, 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 추가로 발현하는 상기 19의 비배아 줄기, 비생식 세포.
21. 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 적어도 1가지의 세포 유형으로 분화될 수 있는 상기 19의 비배아 줄기, 비생식 세포.
22. oct4, 텔로머라아제, rex-1, rox-1, 또는 sox-2 중 1가지 이상을 발현하는 상기 21의 비배아 줄기, 비생식 세포.
상기에 기술된 세포는 임의의 바람직한 조직 공급원으로부터 제조될 수 있으며, 상기 공급원은 골수, 제대 혈액, 제대 매트릭스, 말초 혈액, 태반, 태반 혈액, 근육, 뇌, 신장 및 다른 실질 기관(solid organ)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한 세포는 배설액, 예컨대 소변 및 월경혈로부터 유래될 수 있다.
일 실시양태에서, 세포는 인간 조직으로부터 유래된다.
중공 섬유 생물 반응기를 구성함에 있어서, 세포의 확장과 결부된 목표에 따라 달라질 수 있는 몇몇 디자인 상의 고려 사항 및 몇몇 파라미터가 있다. 첫째, 생물 반응기 내의 섬유의 수가 달라질 수 있다. 일반적으로, 복수개의 섬유 또는 섬유 번들(bundle)이 요망되는 표면적 및 고밀도의 세포의 제공에 사용된다. 섬유 수의 실질적 범위는 또한 섬유의 길이에 따라 달라진다. 따라서, 길이도 가변적이다. 일반적으로, 섬유의 길이는 효율적으로 영양 배지를 세포와 접촉하여 이동시키고, 노폐물 또는 요망되는 세포 생성물을 제거하고, 세포를 섬유 기재로부터 효과적으로 방출시키는 능력에 의해서만 한정된다. 따라서, 섬유 길이의 범위는 다양할 수 있다. 추가의 디자인 상의 고려 사항은 섬유 벽의 두께이다. 상기 벽 두께는 가변적이며, 영양소를 세포에 효율적으로 제공하고 세포로부터의 노폐물 또는 유용한 생성물을 효율적으로 제거하는 파라미터에 의해서만 한정된다. 또 다른 디자인 상의 고려 사항은 섬유 벽 내의 기공의 크기이다. 일반적으로 이것은 영양소의 세포로의 통과의 허용, 노폐물의 운반, 요망되는 생성물(예컨대 성장 인자)의 세포에의 제공, 세포로부터의 요망되는 생성물의 제거 등을 위하여 설계된다. 예를 들어, 기공 크기는 예를 들어 혈청에 존재할 수 있는 특정한 인자가 세포에 도달하지 않도록 설계될 수 있다. 추가의 디자인 상의 고려 사항은 중공 섬유의 내경(예컨대, 둥근 섬유의 직경)이다. 이 선택에 있어서의 고려 사항은 적당한 영양소를 제공하고, 노폐물을 제거하고, 요망되는 세포 밀도를 달성하기 위하여, 배양 배지를 세포에 적당하게 접근시키는 것을 포함한다. 추가의 디자인 상의 고려 사항은 섬유 벽의 조성이다. 이는 매우 다양한 생체 적합성 재료를 포함하는데, 상기 재료는 세포가 유착될 수 있는 기재를 제공한다. 일부 실시양태에서, 유착성은 상기 벽 재료를 유착 촉진 기재, 예컨대 세포외 매트릭스 단백질로 코팅함으로써 향상될 수 있다.
더욱이, 1가지 초과의 유형의 섬유가 상기에 기술된 다양한 파라미터와 관련하여 생물 반응기에서 발견될 수 있다. 이는, 예를 들어 상이한 세포 유형들을 동시 배양하는 것이 바람직할 때 유용하다. 최적 섬유 디자인은 상이한 세포들에 대하여 상이할 수 있다.
일반적으로 복수의 중공 섬유는 배지를 섬유 내로 및/또는 섬유 주위에서 관류시키기 위한 유입구 및 유출구에 연결되는 것이 바람직한 외부 쉘 내에 넣어진다. 일 실시양태에서, 이들 섬유는 성장 챔버의 일부로서 발견되며, 상기 성장 챔버 내에서는 세포 배지가 관류되어서(순환되어서) 상기 배지는 섬유 내로 및/또는 섬유 주위로 유동한다. 일 실시양태에서, 섬유는 세포 배양 배지 및 보충제의 주입을 위한 펌프에 연결되는 카트리지 내에 배치된다.
섬유를 만들 수 있는 재료는 매우 다양한 생체 적합성 반투성 재료를 포함한다. 이러한 재료는 영양 배지가 섬유 벽을 통하여 확산되어 세포에 공급되게 하면서 세포가 3차원으로 성장하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 관련된 세포는 본 세포와 함께 동시 도말되는 또는 확장 챔버에서 별도로 유착되거나 다르게는 배양된 다른 세포 유형과 함께 동시 배양될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 다른 세포는 본 발명의 세포의 도입 이전에 섬유의 내부(또는 외부) 표면에 부착될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포는 바람직한 세포 유형의 단층 상에 침적될 수 있다.
중공 섬유는 1가지 이상의 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 매트리겔(Matrigel), 피브로넥틴 또는 콜라겐으로 예비코팅되어 세포 부착성을 향상시킬 수 있다. 세포외 매트릭스 단백질은 섬유의 내부 및/또는 외부 표면에 부착될 수 있다. 일반적으로, 세포외 매트릭스 단백질은 미국 특허 제5,872,094호 및 미국 특허 제6,471,689호에 기술된 방법들 중 임의의 것에 의해 상기 표면에 부착될 수 있는데, 상기 미국 특허 둘 모두는 이들 방법의 교시를 위하여 본원에 참고로 포함된다.
유량도 확장시킬 세포 및 당해 공정의 단계에 따라 가변적이다. 예를 들어, 세포 접종 후, 세포 유착의 달성 후, 유량을 증상 상태 수준으로 증가시킬 수 있다. 유량은 세포의 유착 후, 그리고 또 챔버 내에서부터의 세포의 수확을 용이하게 하기 위하여 증가된다.
주문 설계된 중공 섬유 모세관 배양 시스템은 많은 상이한 판매 회사에 의해 계약을 기반으로 하여 포유류 세포 배양을 위한 쉽게 입수가능한 재료를 이용하여 제조될 수 있다. 세포 배양용 중공 섬유 시스템의 일부 유형은 회사, 예를 들어 파이버셀 시스템즈, 인크.(FiberCell Systems, Inc.)(미국 메릴랜드주 프레더릭)로부터 상업적으로 입수가능하다. 파이버셀 시스템즈에 의해 만들어진 중공 섬유 시스템은 직경이 대략 200 마이크로미터인 섬유로 구성된다. 섬유는 카트리지의 단부를 통하여 펌핑되는 세포 배양 배지가 섬유의 내부를 유통하도록 설계된 카트리지 내에 밀봉된다. 세포는 다공성 지지체에 부착되며, 배양물은 수 개월간의 연속 제조 동안 유지될 수 있다.
확장 중인/확장된 세포의 분석은 본 출원에 기술된 것과 같은 마커의 발현을 포함할 수 있다. 게다가, 조혈 마커, 예컨대 CD34 및 CD45의 발현의 결여가 분석될 수 있다. 샘플 상청액 및 단층은 (a) 세포 형태, (b) 배수성 및 (c) 세포 마커에 대한 원위치(in situ) 혼성화에 대하여 주기적으로 모니터링될 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 생물 반응기에서 확장된 세포는 먼저 단리되고, 다른 배양 조건을 이용하여 배양될 수 있다. 예를 들어, 예시된 세포("MAPC"로 표기됨)는 먼저 단리되고, 배양될 수 있으며, 이는 하기에 본원에 기술된 바와 같다.
도 1은 중공 섬유 세포 확장 시스템의 개략도를 제공한다.
도 2는 본 발명에서 사용될 수 있는 생물 반응기의 개략도이다.
도 3a는 세포 성장 챔버의 중공 섬유 세포 성장 챔버 실시양태의 측면도를 도시한다. 도 3b는 도 3a의 실시양태의 중공 섬유 세포 성장 챔버의 절취된 측면도를 도시한다.
도 4 - 블록 다이아그램 시스템 및 모든 백 연결부를 나타내는 세포 확장 시스템(CES) 유체 회로.
도 5 - 골수로부터 또는 세포 은행으로부터 멀티스템(MultiStem)을 확장시키는 데 사용되는, 카리디안 비씨티(Cardian BCT, 현재는 테루모(Terumo)가 소유함)로부터의 퀀텀 세포 확장 시스템(Quantum Cell Expansion System)의 흐름도.
도 6 - WJS 골수 흡인물을 골수 단핵 세포(BMMNC)의 사전 선발 없이 퀀텀에 접종하고, 동일 공여체 유래의 BMMNC를 보통의 세포 배양 플라스틱 상에 접종하였다. 이를 3가지의 독립적인 공여체에 대하여 행하였다. T75 내의 세포를 3회 이상 계대하고, 세포 수를 계수하여 집단 배가(population doubling; PD)를 계산하였다. 퀀텀 내의 세포를 수확하고, 계수하고, 새로운 생물 반응기 상에 로딩하고, 6일 후 다시 수확하였다. 퀀텀에서의 골수 흡인물로부터 시작되는 멀티스템의 확장 속도는 세포 배양 플라스틱 상에서의 확장과 유의하게 상이한 것은 아니다.
도 7 - 골수 흡인물로부터 시작하여, 멀티스템 마스터 세포 은행을 17일 이내에 생성하는 것이 가능하다.
도 8 - 도 5의 장치의 더욱 상세한 개략도.
도 9 - 폐쇄 시스템, 연속 관류, 중공 섬유 생물 반응기에서의 확장 실시양태의 개관.
도 10 - 자격이 있는 공여체로부터의 세포의 단리로부터 마스터 세포 은행을 단리하고 그 후 상기 세포를 환자에게 투여하기까지의 생성 공정의 개관.
도 11. 세포 은행화 접근법의 개략도.
본 발명은 본원에 기술된 특정한 방법, 프로토콜, 및 시약 등에 한정되지 않으며, 따라서 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태를 단지 기술할 목적을 위한 것으로서, 개시된 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아닌데, 본 발명의 범주는 단지 특허청구범위에 의해 정의된다.
섹션의 제목은 본원에서 단지 조직의 목적을 위하여 사용되며, 어떠한 방식으로든지 기술된 요지를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
일반적으로 본 출원의 방법 및 기술은 달리 나타내지 않으면 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 그리고 더욱 구체적인 참고 문헌에 기술된 바와 같이 그리고 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)을 참조한다.
정의
단수형("a" 또는 "an")은 본원에서 하나 이상; 적어도 하나를 의미한다. 복수형이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 일반적으로 단수형을 포함한다.
"생물 반응기"라는 용어는 폐쇄된 살균 시스템에서, 세포 성장에 도움이 되는 물리화학적 환경을 제공할 뿐만 아니라 영양소를 세포에 제공하고 대사 산물을 제거하기도 하는 세포 배양 시스템을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, "생물 반응기"라는 용어는 모니터링되고 제어되는 환경 하에서 그리고 작동 조건 하에서, 예를 들어 pH, 온도, 압력, 영양소 공급 및 노폐물 제거 하에서 생물학적 및/또는 생화학적 공정이 전개되는 임의의 기구를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 본 발명에서 사용하기에 적합한 기본적인 생물 반응기류는 중공 섬유 생물 반응기를 포함한다.
"세포 은행"은 미래의 사용을 위하여 성장시켜서 보관한 세포의 산업적 명명법이다. 세포는 분취물 형태로 보관될 수 있다. 세포는 보관에서 직접적으로 사용될 수 있거나 보관 후 확장될 수 있다. 이는 편리하여서, 투여용으로 입수가능한 "바로 구입할 수 있는" 세포가 있다. 세포는 이미 제약상 허용되는 부형제 중의 형태로 보관될 수 있어서, 세포는 직접적으로 투여될 수 있거나 세포는 이것이 보관에서 해제될 때 적절한 부형제와 혼합될 수 있다. 세포는 행존성을 보존하는 형태로 냉동되거나 다르게는 보관될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포 은행이 생성되며, 여기서, 세포는 대식 세포의 활성화의 향상된 조정용으로 선발되었다. 보관에서의 해제 이후, 그리고 대상체에게의 투여 이전에, 세포를 효력, 즉, 대식 세포의 활성화의 조정 수준에 대하여 다시 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 본 출원에 기술되거나 다르게는 당업계에 공지된, 직접적이거나 간접적인 분석법들 중 임의의 것을 사용하여 행해질 수 있다. 그 후, 요망되는 효력을 갖는 세포는 치료를 위하여 대상체에게 투여될 수 있다. 은행은 치료될 개체로부터 유래된 세포(그의 태아기 조직, 예컨대 태반, 제대 혈액 또는 제대 매트릭스로부터 유래되거나 출생 후 임의의 시점에서 상기 개체로부터 확장된 세포)를 사용하여 만들어질 수 있다(자가). 또는 은행은 동종이계적 사용을 위한 세포를 함유할 수 있다. 마스터 세포 은행은 대상체에게의 투여를 위한 용량을 제공하도록 추가로 확장될 수 있는 세포의 분취물을 제공하는 세포의 저장체이다.
세포의 "임상적으로 관련있는" 수는 대상체에 있어서 임상적 응답; 즉, 바람직하지 못한 병리학적 상태의 예방, 감소, 개선 등을 초래하기에 충분한 세포의 수를 나타낸다. 특정 실시양태는 마스터 세포 은행을 생성하기에 충분한 세포의 수에 관련된다.
"동시 투여"는 2가지 이상의 에이전트의 동시 투여 또는 순차적 투여를 포함하는, 서로와 함께 투여하는 것, 함께 투여하는 것, 대등하게 투여하는 것을 의미한다.
"포함하는"은 다른 제한 없이, 다른 것이 포함될 수 있다는 것에 대한 어떠한 자격 요건 또는 배제도 없이, 지시 대상을 필연적으로 포함함을 의미한다. 예를 들어, "x 및 y를 포함하는 조성물"은, 비록 다른 성분이 조성물에 존재할 수 있다 하더라도, x 및 y를 함유하는 임의의 조성물을 포함한다. 이와 마찬가지로, "x의 단계를 포함하는 방법"은, x가 이 방법에서 유일한 단계이든지 이것이 단지 단계들 중 하나이든지 간에, 얼마나 많은 다른 단계가 존재할 수 있든지, 그리고 얼마나 단순한 또는 복잡한 x가 그들과 비교하여 있든지, x가 실시되는 임의의 방법을 포함한다. "~로 이루어지는" 및 "포함하다"의 어근의 단어를 사용한 유사한 어구는 본원에서 "포함하는"의 동의어로서 사용되며, 동일한 의미를 갖는다.
"~로 이루어지는"은 "포함하는"의 동의어이다(상기 참조).
"조절된 세포 배양 배지"는 당업계에 공지된 용어이며, 세포가 성장한 배지를 나타낸다. 본원에서 이것은 본 출원에 기술된 결과들 중 임의의 것을 달성하기에 효과적인 인자를 분비하기에 충분한 시간 동안 세포를 성장시킴을 의미한다.
조절된 세포 배양 배지는 인자들을 배지 내에 분비하도록 세포를 배양한 배지를 나타낸다. 본 발명의 목적상, 세포는 배지가 효과를 갖도록 그러한 인자의 유효량을 생성하기에 충분한 수의 세포 분열을 통하여 세포를 성장시킬 수 있다. 세포는 원심분리, 여과, 면역고갈(예를 들어, 태그된(tagged) 항체 및 자성 컬럼을 통하여) 및 FACS 분류를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 방법들 중 임의의 것에 의해 배지로부터 제거된다.
"EC 세포"는 기형암종으로 칭해지는 유형의 암의 분석으로부터 발견되었다. 1964년에, 연구자들은 기형암종 내의 단일 세포가 단리되고 이는 배양 중 미분화된 채로 남아있을 수 있음을 주목하였다. 이러한 유형의 줄기 세포는 배아 암종 세포(embryonic carcinoma cell; EC 세포)로 공지되게 되었다.
일반적으로 "유효량"은 요망되는 국소 효과 또는 전신 효과를 제공하는 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 유익한 또는 요망되는 임상 결과를 유발하기에 충분한 양이다. 유효량은 단회 투여에서 한꺼번에 전부 제공되거나 수회 투여에서 유효량을 제공하는 분할된 양으로 제공될 수 있다. 어떤 것이 유효량으로 간주되는지에 대한 정확한 결정은 대상체의 크기, 연령, 상해 및/또는 치료되는 질환 또는 상해, 및 손상이 일어나거나 질환이 시작된 이래의 시간의 양을 포함하는, 각각의 대상체에게 개벌적인 인자를 기반으로 할 수 있다. 당업계의 숙련자라면, 당업계에서 일상적인 이러한 고려 사항을 기반으로 하여 주어진 대상체에 대한 유효량을 결정할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "유효 용량"은 "유효량"과 동일한 것을 의미한다.
일반적으로 "유효 경로"는 요망되는 구획, 시스템 또는 위치로의 에이전트의 전달을 제공하는 경로를 의미한다. 예를 들어, 유효 경로는, 유익하거나 요망되는 임상 결과를 유발하기에 충분한 에이전트의 양이 요망되는 작용 부위에 제공되도록 에이전트가 투여될 수 있는 것이다.
"배아 줄기 세포(ESC)"는 당업계에 공지되어 있으며, 많은 상이한 포유류 종으로부터 제조되어 왔다. 배아 줄기 세포는 배반포로 공지된 초기 배아의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된 줄기 세포이다. 배아 줄기 세포는 3가지의 일차 배엽인 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 모든 유도체로 분화될 수 있다. 이는 성체에서 220가지 초과의 세포 유형 각각을 포함한다. ES 세포는 태반을 제외하고서, 체내에서 임의의 조직이 될 수 있다. ESC와 유사한 일부 세포는 체세포 핵을 핵제거 수정란 내로 핵이식시킴으로써 생성될 수 있다.
"확장시키다"는 유출 세포의 임상적으로 관련있는 수의 세포 분열의 달성을 의미한다. "임상적으로 관련있는"은 임상적으로 관련있는 수의 유출 세포를 제공하기에 충분한 이들 세포의 세포 배가가 섬유 내에서 및/또는 섬유 상에서 달성됨을 의미한다. 중공 섬유 생물 반응기 기술은 임상적으로 관련있는 수의 유출 세포를 생성하는 실제 세포 확장 이외의 목적에 사용되어 왔다. 예를 들어, 그러한 생물 반응기는 투입 세포 집단의 분화, 투입 세포 집단의 농축, 투입 세포 집단에 의한 혈액 및 다른 유체의 처리 등에 사용되어 왔다. 이들 실시양태에서, 섬유와 결부된 세포는 실제로 유출 세포가 아니다. 상기 세포는 이것이 확장되지 않도록, 그러나 상이한 목적을 위하여 섬유에 유착된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 다른 목적을 달성하는 데 사용되는 시간들에서, 투입 세포 중 일부는 사실상 확장될 수 있다. 이것과, 상기 기술의 현재의 응용을 구별하는 것은 세포의 확장이 임상적으로 관련있는 수로 달성되지 않는다는 것이다. 세포 배가는 제한된다.
"중공 섬유"라는 용어는 생물 반응기 내에 포함된 세포에 영양소(용액 중)를 전달하는 데 사용하기 위한, 그리고 생물 반응기 내에 포함된 세포로부터 노폐 물질(용액 중)을 제거하기 위한, 규정된 크기, 형상 및 밀도의 기공을 포함하는 중공 구조체(임의의 형상의 것)를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 목적상, 중공 섬유는 재흡수성 또는 비재흡수성 재료로 구성될 수 있다. 섬유는 관형 구조를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
"포함하다"라는 용어의 사용은 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
"증가하다" 또는 "증가하는"은 전적으로 기존에 존재하지 않았던 경우를 유도하거나 또는 그 정도를 증가시킴을 의미한다.
"유도형 전능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; IPSC 또는 IPS 세포)"는 예를 들어 체세포에 덜 분화된 표현형을 부여하는 외인성 유전자를 도입함으로써 재프로그래밍된 체세포이다. 이러한 세포는 그 후 덜 분화된 자손으로 분화되도록 유도될 수 있다. IPS 세포는 원래는 2006년에 발견된 접근법을 변형시킨 것을 사용하여 유도되었다 (문헌[Yamanaka, S. et al., Cell Stem Cell, 1 :39-49 (2007)]). 예를 들어, 1가지 예에서, IPS 세포를 생성하기 위하여, 과학자는 피부 세포로 시작하였으며, 상기 피부 세포는 그 후, 레트로바이러스를 사용하여 세포 DNA 내로 유전자를 삽입하는 표준 실험실 기술에 의해 변형되었다. 1가지 예에서, 삽입된 유전자는 Oct4, Sox2, Lif4, 및 c-myc이었으며, 이들은 세포를 배아 줄기 세포 유사 상태로 유지하는 천연 조절자로서 함께 작용하는 것으로 공지되었다. 이들 세포는 문헌에 기술되었다. 예를 들어, 문헌[Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861 (2008)]; 문헌[Jaenisch et al., Cell, 132:567-582 (2008)]; 문헌[Hanna et al., Cell, 133:250-264 (2008)]; 및 문헌[Brambrink et al., Cell Stem Cell, 2: 151-159 (2008)]을 참조한다. 이러한 참고 문헌들은 IPSC 및 이의 제조 방법을 교시하기 위하여 참고로 포함된다. 또한, 그러한 세포는 특정 배양 조건(특정 에이전트에의 노출)에 의해 생성될 수 있다는 것이 가능하다.
"투입 세포 집단"은 세포 유형의 확장을 위하여 생물 반응기 내로 도입되는 세포 유형을 말하며, 이는 궁극적으로 유출 세포 집단을 형성한다. 투입 세포 집단은 매우 적은 수로 생물 반응기 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 골수에 있어서, 요망되는 투입 세포 집단은 원래 백만개 중 1개만큼 적은 세포수로 발견될 수 있다. 대안적으로, 투입 집단은 실질적으로 균질할 수 있으며, 예컨대 세포 은행으로부터 유래되고 추가로 생물 반응기에서 확장될 수 있다.
"단리된"이라는 용어는 생체내의 세포(들)와 결부된 1개 이상의 세포 또는 1가지 이상의 세포 성분과 결부된 것이 아닌 세포(들)를 나타낸다. "풍부화된 집단"은 생체내에서 또는 일차 배양에서 1가지 이상의 다른 세포 유형에 비하여 요망되는 세포의 수가 상대적으로 증가된 것을 의미한다.
그러나, 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 단지 줄기 세포의 존재를 지시하는 것은 아니다. 오히려, "단리된"이라는 용어는 세포가 그의 천연 조직 환경으로부터 꺼내지고, 정상 조직 환경과 비교하여 더 높은 농도로 존재함을 나타낸다. 따라서, "단리된" 세포 집단은 줄기 세포에 더하여 세포 유형을 추가로 포함할 수 있으며, 추가의 조직 성분을 포함할 수 있다. 이는 또한 예를 들어 세포 배가의 면에서 표현될 수 있다. 세포는, 이것이 생체내에서의 또는 그의 원래 조직 환경(예를 들어, 골수, 말초 혈액, 지방 조직 등)에서의 그의 원래 수와 비교하여 풍부화되도록, 시험관내에서 또는 생체외에서 10배, 20배, 30배, 40배 또는 그보다 더 많은 배가를 겪었을 수 있다.
"MAPC"는 "다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cell)"의 두문자어이다. 이것은 배아 줄기 세포 또는 생식 세포가 아니지만, 이들의 일부 특성을 갖는 세포이다. MAPC는 다수의 대안적인 설명에서 특성화될 수 있으며, 상기 설명 각각은 세포가 발견되었을 때 세포에 신규성을 부여하였다. 따라서 이는 상기 설명 중 하나 이상에 의해 특성화될 수 있다. 첫째, 이는 형질전환되지 않고서, 그리고 정상 핵형을 갖고서, 배양 중 연장된 복제 능력을 갖는다(종양 형성성). 둘째, 이는 분화시에 1가지 초과의 배엽의 세포 자손, 예컨대 2가지의 또는 3가지 전부의 배엽(즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽)이 생기게 할 수 있다. 셋째, 이것이 배아 줄기 세포 또는 생식 세포가 아니라 할지라도, 이것은 이들 원시 세포 유형의 마커를 발현할 수 있어서 MAPC는 Oct 3/4(즉, Oct 3A), rex-1, 및 rox-1 중 1가지 이상을 발현할 수 있게 된다. 이는 또한 sox-2 및 SSEA-4 중 1가지 이상을 발현할 수 있다. 넷째, 줄기 세포와 같이, 이는 자기 재생될 수 있으며, 즉, 형질전환되지 않고서 연장된 복제 능력을 갖는다. 이는 이들 세포가 텔로머라아제를 발현함을(즉, 텔로머라아제 활성을 가짐을) 의미한다. 따라서, "MAPC"로 표기된 세포 유형은 그의 신규한 특성들 중 일부를 통하여 세포를 설명하는 대안적인 기본 특성들에 의해 특성화될 수 있다.
MAPC에 있어서 "성체"라는 용어는 비제한적이다. 이것은 비배아 체세포를 나타낸다. MAPC는 핵형이 정상이며, 생체내에서 기형종을 형성하지 않는다. 이 두문자어는 골수로부터 단리된 전능성 세포를 설명하기 위하여 미국 특허 제7,015,037호에서 처음에 사용되었다. 그러나, 전능성 마커 및/또는 분화 잠재력을 갖는 세포가 그 후에 발견되었으며, 이 발명의 목적상, 이는 "MAPC"로 처음에 표기된 세포와 등가의 것일 수 있다. MAPC 세포 유형에 대한 필수적인 설명은 상기의 발명의 개요에 제공되어 있다.
MAPC는 MSC보다 더 원시적인 전구 세포를 나타낸다 (문헌[Verfaillie, CM., Trends Cell Biol 12:502-8 (2002)]; 문헌[Jahagirdar, B.N., et al., Exp Hematol, 29:543-56 (2001)]; 문헌[Reyes, M. and CM. Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938:231-233 (2001)]; 문헌[Jiang, Y. et al., Exp Hematol, 30896-904 (2002)]; 및 문헌[Jiang, Y. et al., Nature, 418:41-9. (2002)]).
"멀티스템®"이라는 용어는 미국 특허 제7,015,037호의 MAPC, 즉, 상기에 기술된 비배아 줄기, 비생식 세포를 기반으로 하는 세포 제제의 상표명이다. 멀티스템®은 이 특허 출원에 개시된 세포 배양 방법에 따라, 특히 더욱 낮은 산소 및 더욱 높은 혈청에서 제조된다. 멀티스템®은 고도로 확장가능하며, 핵형이 정상이고, 생체내에서 기형종을 형성하지 않는다. 이것은 1가지 초과의 배엽의 세포 계통으로 분화될 수 있으며, 텔로머라아제, oct3/4, rex-1, rox-1, sox-2, 및 SSEA4 중 1가지 이상을 발현할 수 있다.
"영양액"이라는 용액은 생물 반응기에 유입되는 그리고 포유류 또는 척추동물 세포의 배양에 필수적인 영양 물질을 함유하는 용액을 포함하는 것으로 의도된다. 영약액은 또한 배양 하에서의 또는 광화와 같은 형성 중인 새롭게 형성되는 뼈의 매트릭스 구조의 변화에 기여하는 세포 표현형의 특정한 변화에 영향을 주는 첨가제를 함유할 수 있다.
영양소는 생물 반응기 내의 세포에 전달되며, 생물 반응기 내에 함유된 세포의 성장 및 분화에 영향을 줄 수 있다. 영양액은 생물 반응기 내에서 생존성, 성장 및/또는 분화를 유지하기에 충분한 영양소를 세포에 제공하도록 선택된다. 당업계의 숙련자라면 본 발명에 적절한 영양액을 선택할 수 있다. 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 같은 배지가 사용될 수 있으며, 이것에는 다른 적합한 영양소가 추가로 보충될 수 있다. 다른 적합한 영양소는 소 태아 혈청, L-아스코르브산, 2-포스페이트, 항생제, 세포 조정제, 예컨대 덱사메타손, 베타-글리세롤포스페이트, 글루코스, 글루타민, 아미노산 보충제, 아폽토시스(apoptosis)의 억제제(또는 활성화제), 예컨대 글루타티온-에틸 에스테르, 항산화제, 카스파아제 억제제 및 양이온 및 음이온, 예를 들어 마그네슘, 망간, 칼슘, 포스페이트, 클로라이드, 나트륨, 칼륨, 아연 및 술페이트 이온, 및 니트레이트 및 니트라이트를 포함한다. 영양액 중 성분의 나머지 농도는 생물 반응기에서 성장을 촉진하고 세포의 생존성을 유지하기에 충분해야 한다.
"유출 세포 집단"은 생물 반응기에서 확장된 후 생물 반응기로부터 수확하고자 하는 세포를 나타낸다. 수확된 세포는 생물 반응기로부터 꺼내지는 것으로 정의되며, 이는 그 후 임상에서 또는 다른 목적으로, 예를 들어 연구, 임상 실험 등의 목적으로 사용된다.
"원시 배아 생식 세포"(PG 또는 EG 세포)는 많은 덜 분화된 세포 유형이 생성되도록 배양 및 자극될 수 있다.
"전구 세포"는 그의 최종적으로 분화된 자손의 특성들 중 일부를 갖는 그러나 그 모두를 갖는 것은 아닌 줄기 세포의 분화 동안 생성되는 세포이다. 규정된 전구 세포, 예컨대 "심장 전구 세포"는 계통으로 되지만, 특정한 또는 최종적으로 분화된 세포 유형으로 되는 것은 아니다. "MAPC""라는 두문자어에 사용될 때, "전구체"라는 용어는 이러한 세포를 특정 계통에 한정시키는 것은 아니다. 전구 세포는 전구 세포보다 더 고도로 분화된 자손 세포를 형성할 수 있다.
선발은 조직 내의 세포로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 이 경우, 세포는 요망되는 조직으로부터 단리되고, 배양 중 확장되고, 요망되는 특성에 대하여 선발되고, 선발된 세포는 추가로 확장된다.
"자기 재생"은 복제 딸 줄기 세포가 생기게 한 것과 동일한 분화 잠재력을 갖는 복제 딸 줄기 세포를 생성하는 능력을 나타낸다. 이와 관련하여 사용되는 유사한 용어는 "증식"이다.
"무혈청 배지"는 혈청이 존재하지 않거나, 존재할 경우 혈청의 성분들이 세포의 성장 또는 생존능에 어떠한 영향도 주지 않는 수준으로 있는(즉, 실제로 필요하지 않음, 예컨대 잔존하는 양 또는 미량) 배지를 나타낸다.
"줄기 세포"는 자기 재생을 겪을 수 있고(즉, 동일한 분화 잠재력을 갖는 자손) 또한 분화 잠재력이 더욱 제한된 자손 세포를 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 문맥 내에서, 줄기 세포는 예를 들어 핵 이전에 의해, 더욱 원시적인 줄기 세포와의 융합에 의해, 특정 전사 인자의 도입에 의해, 또는 특정 조건 하에서의 배양에 의해 탈분화된, 더욱 분화되는 세포를 또한 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997)]; 문헌[Ying et al., Nature, 416:545-548 (2002)]; 문헌[Guan et al., Nature, 440: 1199-1203 (2006)]; 문헌[Takahashi et al., Cell, 126:663-676 (2006)]; 문헌[Okita et al., Nature, 448:313-317 (2007)]; 및 문헌[Takahashi et al., Cell, 131 :861-872 (2007)]을 참조한다.
또한 탈분화는 탈분화를 야기하는, 시험관내 또는 생체내에서의 물리적 환경에의 노출 또는 특정 화합물의 투여에 의해 야기될 수 있다. 줄기 세포는 또한 비정상 조직, 예컨대 기형암종 및 일부 다른 공급원, 예컨대 배양체로부터 유래될 수 있다(그러나 이들은 이들이 내세포괴로부터 직접적으로는 아니라 할지라도 배아 조직으로부터 유래된다는 점에서 배아 줄기 세포로 간주될 수 있다). 줄기 세포는 또한 줄기 세포 기능과 결부된 유전자를 비줄기 세포, 예컨대 유도형 전능성 줄기 세포 내로 도입함으로써 생성될 수 있다.
"대상체"는 척추동물, 예컨대 포유류, 예컨대 인간을 의미한다. 포유류는 인간, 개, 고양이, 말, 소 및 돼지를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
"폐액"이라는 용어는 생물 반응기에서 유출되며 세포 대사의 폐부산물을 함유하는 용액을 포함하는 것으로 의도된다. 폐액 중 폐부산물, 예를 들어 암모니아, 락트산 등의 농도와, 영양소, 예컨대 글루코스의 잔존 수준은 생물 반응기에서 배양되는 세포의 대사 활성의 수준의 평가에 사용될 수 있다.
생물 반응기
생물 반응기, 특히 조직 재생 공정에 사용되는 생물 반응기가 공지되어 있다. 예를 들어, 참고로 포함된 미국 특허 제6,306,169호; 미국 특허 제6,197,575호; 미국 특허 제6,080,581호; 미국 특허 제5,677,355호; 미국 특허 제5,433,909호; 미국 특허 제5,898,040호를 참조한다.
생물 반응기는 소정의 정도의 보호를 세포 환경에 제공하면서 세포를 인큐베이션할 수 있는 임의의 종류의 용기를 본질적으로 포함하는 일반화된 용어이다. 생물 반응기는 변수(예컨대 성장 배지의 조성, 산소 농도, pH 수준, 및 삼투성)가 완전히 제어 및 모니터링되는 것은 아닌 배양 백 또는 플라스크와 같은 정적 용기일 수 있다. 반면에, 모든 변수가 모니터링되고 제어가능한, 완전 자동화된 전기기계식의 최첨단 생물 반응기가 있다. 이들 예 사이의 많은 상호 조합이 세포 생명 공학의 숙련자에게 공지되어 있다.
단리된 조혈 줄기 또는 전구 세포의 배양을 위한 하기의 3가지의 상이한 전통적인 접근법이 문헌에 기술되었다: 정적 배양, 교반 배양 및 고정화된 배양. 정적 배양은 매우 단순한 배양 시스템, 예컨대 웰 플레이트, 조직 배양 플라스크 또는 가스 투과성 배양 백에서 일어난다. 전자의 두 시스템은 임상 규모의 세포 배양을 허용하지 않기 때문에, 후자가 줄기 세포 확장에 실제로 가장 흔히 사용되는 기술이다 (문헌[Purdy et al., J Hematother, 4:515-525 (1995)]; 문헌[McNiece et al., Hematol Cell Ther, 4:82-86 (1999)]; 및 문헌[McNiece et al., Exp Hematol, 28: 1181-1186 (2000a)]). 모든 이들 시스템은 복잡하지 않은 세포 수확을 가능하게 하는, 취급이 용이한 일회용 장치라는 이점을 갖는다. 그러나, 모든 이들 시스템에서, 공정 제어 조정은 인큐베이터 환경의 제어를 통하여 초래되며, 연속 공급의 제공이 없다. 따라서, 배양 동안의 배양 조건(예를 들어, 산소 분압, pH, 기질, 대사 산물 및 사이토카인 농도)의 변동은 모든 3가지 정적 배양 방법에서 결정적인 인자이다.
교반식 생물 반응기가 동물 세포 배양에서 일반적으로 사용되며, 이는 균질한 환경, 대표적 샘플링, 공정 제어에의 더욱 우수한 접근 및 증가된 산소 전달을 제공한다. 교반 기술(스피너 플라스크 및 교반 용기형 생물 반응기) 중 몇몇은 조혈 세포의 배양에서 성공적으로 구현되었다 (문헌[Zandstra et al., Biotechnol, 12:909-914 (1994)]).
줄기 세포 및 전구 세포의 고정화는 국소적 고 세포 밀도에 도달하고 간질 영양 세포층의 사용 없이 조직(예컨대 골수)의 3차원 구조를 모방하려는 시도이다. 고정화된 생체 촉매 반응기에서, 세포는 담체 내에 또는 담체 상에 고정화될 수 있거나, 서로와의 사이의 결합에 의해 고정화되어 더욱 큰 입자를 형성하거나, 막 장벽 내에 국한될 수 있다. 대부분의 반응기는 회분식, 유가식 또는 연속식으로 작동될 수 있다. 문헌[Ullmann's Encyclopedia Of Industrial Chemistry: Fifth edition, T. Campbell, R. Pfefferkom and J. F. Rounsaville Eds, VCH Publishers 1985, Vol A4, pp 141-170]; 문헌[Ullmann's Encyclopedia Of Industrial Chemistry: Fifth ed., B. Elvers, S. Hawkins and G. Schulz Eds, VCH Publishers, 1992, Vol B4, pp 381-433]; 문헌[J. B. Butt "Reaction Kinetics And Reactor Design" Prentice-Hall, Inc., 1980, pp 185-241]과 같은 표준 교과서에 기술된 바와 같이 패킹층 반응기(Packed Bed Reactor; PBR) 및 연속 교반 탱크 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor; CSTR)과 같은 통상적인 반응기와 같은 고정화 생물 반응기는 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 생물 반응기는 하기를 포함하는 일반 카테고리에 따라 분류될 수 있다: 정적 생물 반응기, 교반 플라스크형 생물 반응기, 회전 벽 용기형 생물 반응기, 중공 섬유 생물 반응기 및 직접적 관류식 생물 반응기. 생물 반응기 내에서, 세포는 자유 세포이거나, 또는 다공성 3차원 스캐폴드(하이드로겔) 상에 고정, 접종될 수 있다.
중공 섬유 생물 반응기는 배양 동안 물질 전달을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 생물 반응기는 중공 섬유 생물 반응기이다. 중공 섬유 생물 반응기는 배지가 내강외 공간에 관류되는, 섬유의 내강 내에 매립된 줄기 및/또는 전구 세포를 가질 수 있거나, 또는 대안적으로 세포가 관광외 공간 내에서 성장하는, 중공 섬유를 통한 가스 및 배지 관류를 제공할 수 있다. 본 발명에 적합한 그러한 중공 섬유 생물 반응기는 본원에 기술된 바와 같이 개시되었으며, 일부, 예컨대 카리디안(Caridian)(테루모(Terumo)) BCT 퀀텀 세포 확장 시스템이 상업적으로 입수가능하다.
생물 반응기는 세포 및 그 생성물의 표준 생성을 위한 세포의 생리학적 요건(예를 들어, pH, 온도, 압력, 영양소, 공급물 및 폐기물 제거)을 제공하는 임의의 장치로 정의된다. 생물 반응기는 세포 증식을 위한 엔지니어링(engineering) 생물 반응기에서의 물질 수송을 향상시킬 수 있다. 계속적인 세포의 영양 노폐물의 제거가 있다. 세포의 자가 투여에 있어서, 생물 반응기는 비교적 소형이고, 일회용이고, 경제적이어야 한다. 일반적으로, 큰 챔버/체적 비가 요구된다. 마지막으로, 세포를 특정 분화 상태로 유지하는 것은 성장 인자 또는 혈청 성분을 필요로 할 수 있으며, 따라서 배지를 지닌 생물 반응기가 바람직하다. 이러한 요건은 안트윌러(Antwiler) 등의 문헌에 기술된 중공 섬유 생물 반응기 기반의 세포 확장 시스템에 의해 충족된다.
안트윌러 등의 문헌에 기술된 장치에서, 상기 시스템은 대략 120 ml의 챔버 성장 체적을 제공하지만, 더 큰 챔버 체적이 수용될 수 있다. 성장에 있어서, 1.7 m2의 표면적이 제공된다. 따라서, 동시 배양물을 비롯하여 유착성 세포 및 현탁 세포 둘 모두를 이 기구에서 성장시킬 수 있다. 다른 물리적인 특성으로는 길이: 295 mm; 내경: 215 ㎛; IC 체적: 104 ml; EC 체적: 330 ml; 섬유의 수: 9000개가 있다. 피브로넥틴은 유착성 세포용 코팅으로 사용될 수 있다. 본 기구는 관심있는 세포의 성장을 위한 모든 필요한 실험 조건, 예컨대 가스 농도, pH, 배지, 온도, 영양소의 관리, 폐기물, 및 필요한 첨가제를 유지할 수 있다. 오염 방지를 위하여, 폐쇄된 살균 유체 구획을 갖는 시스템이 설계된다. 배지 시약 및 용액의 백은 공급 스케줄, 폐기물 제거 및 일반적인 세포 배양 환경이 요망될 경우 대체되고, 제어되고, 최적화될 수 있도록 시스템에 부착된 채로 있다. 상기 유닛은 벤치 톱(bench top)에서 사용될 수 있다. 세포는 섬유의 내부에서(모세관내), 외부에서(모세관외) 또는 이들 둘 모두의 면에서 동시에 성장될 수 있다. 이러한 중공 섬유 생물 반응기 디자인은 폐쇄된 시스템을 수득하기 위하여 적절한 연동 펌프, 핀치 밸브 등을 통하여 보내질 수 있는 배관을 사용한 직접적 연결을 허용한다. 가스 제어는 중공 섬유 산소 공급기를 이용하여 관리된다. 본 시스템은 세포의 첨가 및 수확, 배지의 대체 및 시약의 첨가 등의 능력을 수용한다. 따라서, 백은 모든 유체 에 사용되며, 백 연결부 모두는 살균 연결 기술을 이용한다. 개략도가 도 4에서 발견된다.
본 출원에서 예시된 실시양태(실시예 1)에서, 연속 유동식 생물 반응기는 내부 유체 체적이 184 ml이며, 외부 유체 체적이 303 ml로서, 이는 총 표면적(모세관내)이 대략 2.1 m2(3255 in2)이고, 벽 두께가 50 ㎛이고, 내경이 215 ㎛이고, 길이가 295 mm인 1.1 x 104개의 중공 섬유를 포함한다. 기공 크기는 성분의 통과를 위하여 16 kDa의 컷오프(cutoff)를 갖는다.
중공 섬유는 생물 반응기에서 영양소의 전달 및 페기물의 제거에 적합하여야 한다. 중공 섬유는 임의의 형상일 수 있으며, 예를 들어 중공 섬유는 둥글고 관형일 수 있거나 동심원상 링의 형태일 수 있다. 중공 섬유는 재흡수성 또는 비재흡수성 막으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 중공 섬유의 적합한 성분은 폴리디옥사논, 폴리락티드, 폴리글락틴, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리글리콜산/트리메틸렌 카르보네이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 셀룰로오스계 중합체, 셀룰로오스 에스테르, 재생 셀룰로오스, 플루로닉, 콜라겐, 엘라스틴 및 이들의 혼합물을 포함한다. 매우 다양한 적합한 물질이 당업계에 공지되어 있으며, 큰 체지의 문헌으로 나타낸다. 이러한 물질의 예는 미국 특허 제4,220,725호; 미국 특허 제4,184,922호; 미국 특허 제4,200,689호; 미국 특허 제3,821,087호; 미국 특허 제3,883,393호; 미국 특허 제4,184,922호; 미국 특허 제4,200,689호; 미국 특허 제3,997,396호; 미국 특허 제4,220,725호; 미국 특허 제4,999,298호; 미국 특허 제4,804,628호; 미국 특허 제5,126,238호; 미국 특허 제5,656,421호; 미국 특허 제5,162,225호; 미국 특허 제5,622,857호; 미국 특허 제5,627,070호; 미국 특허 제6,001,585호; 미국 특허 제6,911,201호; 미국 특허 제6,933,144호; 미국 특허 제7,534,609호; 및 미국 특허 공개 제2007/0298497호; 미국 특허 공개 제2008/0220523호; 미국 특허 공개 제2001/0044413호; 미국 특허 공개 제2009/0196901호; 미국 특허 공개 제2010/0233130호; 미국 특허 공개 제2009/0191631호; 미국 특허 공개 제2005/0032218호; 미국 특허 공개 제2005/0003530호; 미국 특허 공개 제2003/0224510호; 미국 특허 공개 제2006/0205071호; 미국 특허 공개 제2010/0267134호; 미국 특허 공개 제2008/0206733호; 미국 특허 공개 제2010/0209403호; 미국 특허 공개 제2008/0213894호; 미국 특허 공개 제2008/0220522호; 미국 특허 공개 제2008/0227190호; 미국 특허 공개 제2008/0248572호; 미국 특허 공개 제2008/0254533호; 미국 특허 공개 제2010/0144037호; 및 미국 특허 공개 제2010/0042260호에 기술되었으며, 이들 모두는 이러한 물질의 교시를 위하여 참고로 포함된다. 벽 재료의 기준은 하기를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다: 세포에 유독하지 않음; 폐기물의 제거 및 영양소의 수용을 위하여 다공성임, 그리고 세포에 의해 분비되는 성분의 수집이 요망되는 경우, 다공성이 상기 파라미터용으로 조정됨; 온도 변화에 대하여 비교적 둔감함, 즉, 열적으로 안정함; 형상 완전성을 유지할 수 있음.
그러한 재료는 세포에 대하여 불투과성이지만, 다양한 요망되는 물질에 대하여 투과성임이 또한 공지되어 있다. 따라서, 중공 섬유는 영양소 및 폐기물이 그 내부로 그리고 그 외부로 통과되게 하는 기공을 포함한다. 중공 섬유의 기공은 분자가 중공 섬유의 한 쪽으로부터 중공 섬유의 다른 한 쪽으로 확산되게 하기에 충분한 직경의 것이다. 바람직하게는, 중공 섬유 기공을 통과할 수 있는 분자는 약 0.002 내지 약 50 kDa, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 25 kDa, 또는 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 16 kDa이다. 따라서, 섬유 벽의 기공 크기는 벽을 통과시키고자 하는 성분에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 기공 크기는 단지 작은 분자를 허용할 수 있거나, 또는 아마도 더욱 큰 것은 상피 성장 인자 및 혈소판 유래된 성장 인자를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 성장 인자를 포함하는 큰 단백질성 분자의 통과를 허용할 수 있다. 당업계의 숙련자라면, 세포에 도달하기 위하여 또는 세포로부터 물질을 운반하기 위하여 섬유 벽을 통과하는 것이 바람직한 성분에 따라 기공 크기를 변화시키는 방법을 이해할 것이다. 예를 들어, 추가의 사용을 위하여 세포에 의해 만들어진 성분을 수집하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 세포는 사이토카인, 성장 인자, 면역조절 인자, 및 추가로 유용한 다른 성분을 발현 및 분비할 수 있다. 세포로부터 운반될 수 있는 물질은 또한 세포로부터 제거하고자 하는 노폐물을 포함한다. 따라서, 이 기술은 유용한 성분을 함유하는, 세포에 의해 조절된 배지를 생성하는 데 사용될 수 있다.
다수의 생물 반응기 구성은 고정 의존성 세포, 예컨대 본 발명의 세포의 배양용으로 존재한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 구성에 의존적인 것은 아니다. 1가지 예가 미국 특허 공개 제2007/0298497호에 제공되어 있는데, 상기 미국 특허 공개에는 중간엽 줄기 세포를 성장시키는 데 사용된 구성이 개시되어 있다.
미국 특허 공개 제2007/0298497호 (한정하고자 하는 것은 아님)의 1가지 예로는 도 2에 도시된 중공 섬유 생물 반응기가 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 세포 확장 모듈 또는 생물 반응기(10)는 하우징(14) 내에 봉입된 중공 섬유 막(12)의 번들로 만들어진다. 중공 섬유의 번들은 막으로 총칭된다. 하우징 또는 모듈(14)은 형상이 원통형일 수 있으며, 임의의 유형의 생체 적합성 중합체 재료로 만들어질 수 있다.
모듈(14)의 각각의 단부를 단부 캡(cap) 또는 헤더(header; 16, 18)로 막는다. 단부 캡(16, 18)은 임의의 적합한 재료, 예컨대 폴리카르보네이트가 생물 반응기에서 성장시킬 세포에서 생체 적합성이기만 하다면, 상기 재료로 만들어질 수 있다.
모듈 내부로의 그리고 모듈 외부로의 4개 이상의 출입구(port)가 있을 수 있다. 2개의 출입구는 모세관외 공간(EC 공간)에 유체 연결되는데, 1개의 출입구(34)는 중공 섬유를 둘러싸고 있는 상기 공간 내로의 신선한 모세관외 배지 진입용이고, 1개의 출입구(44)는 모듈 외부로의 사용된 모세관외 배지의 배출용이다. 2개의 출입구는 또한 모세관내 공간(IC 공간)에 유체 연결되는데, 1개의 출입구(26)는 확장시킬 세포의 도입 뿐만 아니라 중공 섬유의 내강 내로의 신선한 모세관내 배지의 진입용이고, 1개의 포트(42)는 사용된 모세관내 배지의 배출 및 생물 반응기로부터의 확장된 세포의 제거용이다.
생물 반응기에서 확장시킬 세포는 IC 공간 또는 EC 공간 내로 유동될 수 있다. 시린지를 사용하여 생물 반응기에 세포를 로딩할 수 있거나, 세포는 세포 분리기로부터 직접적으로 IC 또는 EC 공간 내로 분배될 수 있다. 또한 세포는 생물 반응기에 살균 도킹될(docked) 수 있는 세포 유입 백 또는 플라스크(요소(5)로 도시됨)로부터 성장 모듈 또는 생물 반응기 내로 도입될 수 있다.
일 실시양태에서, 사용될 수 있는 중공 섬유 벽 재료는 하기 2가지 유형을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다: 상표명 데스모판(Desmopan).RTM.(독일 소재의 바이엘 머티리얼 사이언스 아게(Bayer MaterialScience AG)로부터 입수가능함)으로 판매되는 0.5% 열가소성 폴리우레탄, 및 폴리아믹스(Polyamix).RTM(폴리아미드, 폴리아릴에테르술폰 및 폴리비닐피롤리돈의 블렌드)의 막을 갖는 투석기의 상표명인 폴리플럭스(Polyflux).RTM(독일 헤칭겐 소재의 감브로 디알리사토렌, 게엠베하(Gambro Dialysatoren, GmBH)로부터 입수가능함)(문헌[Hoenich, et al. (2000) ASAIO J., 46:70-75], 참고로 포함됨).
미국 특허 공개 제2008/0220523호에는 세포 확장 시스템, 및 특정 실시양태에서 본원에 기술된 세포를 성장시키는 데 적합한 이의 사용 방법이 제공된다. 세포 확장 시스템은 일반적으로 중공 섬유 세포 성장 챔버, 및 각각 중공 섬유의 내부 및 중공 섬유의 외부와 결부된 제1 및 제2 순환 루프(모세관내 루프 및 모세관외 루프)를 포함한다. 분리형 유동 회로 및 세포의 확장 방법이 또한 제공된다. 세포 성장 챔버는 하기에 기술되며, 또한 도 3에 도시된다.
세포 성장 챔버 (미국 특허 공개 제2008/0220523호)
세포 확장 시스템의 세포 성장 챔버는 일반적으로 제1 및 제2 유체 순환 경로를 분리하는 복수의 반투성 중공 섬유로 이루어진 중공 섬유 막을 포함한다.
예시적인 세포 성장 챔버가 도 3에 도시되어 있으며, 이는 중공 섬유 세포 성장 챔버(200)의 잘라낸 측면도를 도시하고 있다. 세포 성장 챔버(200)는 세포 성장 챔버 하우징(202)에 의해 결속된다. 세포 성장 챔버 하우징(202)은 하기 4개의 개구, 또는 출입구를 추가로 포함한다: 유입구(204), 유출구(206), 유입구(208) 및 유출구(210).
제1 순환 경로 내의 유체는 유입구(204)를 통하여 세포 성장 챔버(200)에 유입되고, 복수의 중공 섬유의 모세관내 쪽(다양한 실시양태에서, 중공 섬유 막의 모세관내("IC")쪽 또는 "IC 공간"으로 칭해짐) 내로 들어가서 통과하며, 세포 성장 챔버(200)에서 나와서 유출구(209)를 통과한다. "중공 섬유", "중공 섬유 모세관" 및 "모세관"이라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다. 복수의 중공 섬유는 "막"으로 총칭된다. 제2 순환 경로 내의 유체는 세포 성장 챔버 내에서 유입구9208)을 통하여 유동하며, 중공 섬유의 외부(상기 막의 "EC 쪽" 또는 "EC 공간"으로 칭해짐)와 접촉하게 되고, 유출구(210)를 통하여 세포 성장 챔버(200)에서 배출된다. 세포는 제1 순환 경로 또는 제2 순환 경로 내에 포함될 수 있으며, 막의 IC 쪽 또는 EC 쪽 중 어느 하나에 존재할 수 있다.
세포 성장 챔버 하우징(202)은 형상 면에서 원통형으로 도시되지만, 이것은 당업계에 공지된 임의의 다른 형상을 가질 수 있다. 세포 성장 챔버 하우징(202)은 임의의 유형의 생체 적합성 중합체 재료로 만들어질 수 있다. 다양한 다른 세포 성장 챔버 하우징은 형상 및 크기가 상이할 수 있다.
당업계의 숙련자라면, "세포 성장 챔버"라는 용어가, 세포 확장 시스템에서 성장되거나 확장되는 모든 세포를 세포 성장 챔버 내에서 성장시키는 것을 내포하지 않음을 인지할 것이다. 유착성 세포는 성장 챔버 내에 배치된 막에 유착될 수 있거나, 결부된 튜브류 내에서 성장할 수 있다. 비유착성("현탁 세포"로도 칭해짐)도 성장시킬 수 있다. 세포는 제1 또는 제2 유체 순환 경로 내의 다른 영역에서 성장시킬 수 있다.
예를 들어, 중공 섬유(212)의 단부는 연결 재료(본원에서 "포팅(potting)" 또는 "포팅 재료"로도 칭해짐)에 의해 세포 성장 챔버의 측면에 포팅될 수 있다. 포팅은 중공 섬유들(212)을 접합시키는 데 적합한 임의의 재료일 수 있되, 단, 배지 및 세포의 중공 섬유 내로의 유동이 방해되지 않으며, IC 유입구를 통한 세포 성장 챔버 내로의 액체 유동물은 단지 중공 섬유 내로 유동한다. 예시적인 포팅 재료는 폴리우레탄 또는 다른 적합한 접합 또는 접착 성분을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 다양한 실시양태에서, 중공 섬유 및 포팅은 각각의 단부에서 중공 섬유의 중심축에 수직으로 절단되어서 유체가 IC 쪽의 내부 및 외부로 유동하는 것을 가능하게 할 수 있다. 단부 캡(214, 216)은 세포 성장 챔버의 단부에 배치된다.
유입구(208)을 통한 세포 성장 챔버(200)로의 유체 유입은 중공 섬유 외부와 접촉 상태로 있다. 중공 섬유 세포 성장 챔버의 이 부분은 "모세관외(EC) 공간"으로 칭해진다. 작은 분자(예를 들어, 물, 산소, 락테이트 등)는 중공 섬유의 내부로부터 EC 공간으로, 또는 EC 공간으로부터 IC 공간으로 중공 섬유를 통하여 확산될 수 있다. 큰 분자량의 분자는 전형적으로 너무 커서 중공 섬유를 통과할 수 없으며, 중공 섬유의 IC 공간 내에 남아있다. 배지는 필요할 경우 대체될 수 있다. 또한 배지는 필요할 경우 가스의 교환을 위하여 산소 공급기를 통하여 순환될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 세포는 시린지에 의한 것을 비롯하여 임의의 다양한 방법에 의해 중공 섬유 내로 로딩될 수 있다. 또한 세포는 세포 성장 챔버와 유체 결부될 수 있는, 유체 용기, 예컨대 백으로부터 세포 성장 챔버 내로 도입될 수 있다.
중공 섬유는 섬유의 모세관내 공간(즉, 중공 섬유 내강 내부)에서 세포가 성장하도록 구성된다. 중공 섬유는 중공 섬유 내강을 통한 배지의 유동을 실질적으로 저지하지 않고서 관광에서의 세포 유착을 허용하기에 충분히 크다. 다양한 실시양태에서, 중공 섬유의 내경은 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 마이크로미터 이상일 수 있다. 이와 마찬가지로, 중공 섬유의 외경은 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 650, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 또는 100 마이크로미터 이하일 수 있다. 중공 섬유 벽 두께는 작은 분자의 확산을 허용하기에 충분하다.
많은 중공 섬유가 세포 성장 챔버에서 사용될 수 있되, 단, 중공 섬유는 세포 성장 챔버의 유입구 및 유출구와 유체 결부될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 세포 성장 챔버는 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000 또는 12000개 이상의 수의 중공 섬유를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 성장 챔버는 12000, 11000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 또는 2000개 이하의 수의 중공 섬유를 포함할 수 있다. 다른 다양한 실시양태에서, 중공 섬유의 길이는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 밀리미터 이상일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 성장 챔버는 평균 길이가 295 mm이고, 평균 내경이 215 마이크로미터이고, 평균 외경이 315 마이크로미터인 대략 9000개의 중공 섬유를 포함한다.
중공 섬유는 세포 성장 챔버 유입구로부터 세포 성장 챔버 유출구까지 액체를 수송할 수 있는 섬유를 형성하기에 충분한 크기를 형성할 수 있는 임의의 재료로 구성될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 중공 섬유는 유착성 줄기 세포와 같은 특정한 유형의 세포에 결합할 수 있는 플라스틱 유착 재료로 구성될 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, 중공 섬유는 유착성 표면을 형성하기 위하여 피브로넥틴과 같은 화합물로 처리될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 중공 섬유는 반투성, 생체 적합성 중합체 재료로 만들어질 수 있다. 사용될 수 있는 1가지 그러한 중합체 재료로는 폴리아미드, 폴리아릴에테르술폰 및 폴리비닐피롤리돈의 블렌드("PA/PAES/PVP")가 있다. 반투성 막은 EC 공간과 IC 공간 사이의 막을 통한 영양소, 폐기물 및 용존 가스의 이전을 허용한다. 다양한 실시양태에서, 중공 섬유 막의 분자 이전 특성은 대사 폐기물이 상기 막을 통하여 중공 섬유 관광측 내로 확산되게 하여 제거되게 하면서, 중공 섬유로부터의, 성장 인자, 사이토카인 등과 같은 세포 성장에 필요한 고가의 시약의 손실이 최소화되도록 선택된다.
특정한 변화에서, 각각의 PA/PAES/PVP 중공 섬유의 1개의 외층은 규정된 표면 조도(roughness)를 갖는 균질한 그리고 개방된 기공 구조를 특징으로 한다. 기공의 개구는 0.5-3 ㎛의 크기의 범위이며, 섬유의 외부 표면 상의 기공의 수는 m2당 10,000 내지 150,000개의 기공의 범위이다. 이 외층은 두께가 약 1 내지 10 ㎛이다. 각각의 중공 섬유 내의 다음 층은 스펀지 구조의 형태를 갖는 제2 층이며, 추가의 실시양태에서, 이의 두께는 약 1 내지 15 ㎛이다. 이러한 제2 층은 외층을 위한 지지체로서의 역할을 한다. 제2 층 다음의 제3 층은 핑거(finger) 유사 구조의 형태를 갖는다. 이러한 제3 층은 기계적 안정성 및 높은 공극 체적을 제공하는데, 이는 막을 통한 분자의 수송에 대한 매우 낮은 저항성을 막에 제공한다. 사용 동안, 핑거 유사 공극은 유체로 충전되며, 유체는 공극 체적이 더욱 작은 스펀지 충전 구조를 갖는 매트릭스보다 더 낮은, 확산 및 대류에 대한 저항성을 제공한다. 이러한 제3 층의 두께는 20 내지 60 ㎛이다.
추가의 실시양태에서, 중공 섬유 막은 65-95 중량%의 적어도 1가지의 소수성 중합체 및 5-35 중량%의 적어도 1가지의 친수성 중합체를 포함할 수 있다. 소수성 중합체는 폴리아미드(PA), 폴리아라미드(PAA), 폴리아릴에테르술폰(PAES), 폴리에테르술폰(PES), 폴리술폰(PSU), 폴리아릴술폰(PASU), 폴리카르보네이트(PC), 폴리에테르, 폴리우레탄(PUR), 폴리에테르이미드 및 상기 중합체들 중 임의의 것의 공중합체 혼합물, 예컨대 폴리에테르 술폰 또는 폴리아릴에테르술폰과 폴리아미드의 믹스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜모노에스테르, 수용성 셀룰로오스 유도체, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 옥시드 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
세포 성장 챔버에서 확장시킬 세포의 유형에 따라, 중합체 섬유는 세포 성장 및/또는 세포가 막에 유착되는 것을 향상시키기 위하여 피브로넥틴과 같은 물질로 처리될 수 있다.
미국 특허 공개 제2008/0220523호 및 미국 특허 공개 제2008/0248572호는 또한 상세한 플로 차트 프로토콜을 포함하여 다른 상세한 반응기 실시양태의 예를 갖는다. 이들 다양한 실시양태는 예를 들어 미국 특허 공개 제2008/0220523호의 도 1b, 1c 및 1d에서 발견될 수 있다. 상기 플로 차트 프로토콜은 도 1d와 관계가 있다. 이들 중 임의의 것이 본 발명의 실행에 적합하다. 미국 특허 공개 제2008/0220522호에 개시된 실시양태도 참조한다. 모든 이러한 교재는 본 발명에 따른 세포에서 이용하기 위하여 이들 실시양태를 개시하는 데 있어서 참고로 포함된다.
국제 특허 공개 제WO/2010/034468호는 케이싱 내에 장착된 반투성 막에 의해 분리되는 2개의 구획, 즉 2개의 접근부를 갖춘 제1 내부 구획 및 1개 또는 2개의 접근부를 포함하는 제2 외부 구획을 포함하는 또 다른 예시적인 기구를 제공하는데, 상기 둘 모두의 구획은, 적용가능할 경우 (i) 상기에 정의된 바와 같이 중공 섬유 번들형의 반투성 막을 포함하는 상기 기구의 둘 모두의 구획을 분리하는 원통형 파티션(partition) 또는 (ii) 상기에 정의된 바와 같이 시트 막형의 반투성 막을 포함하는 상기 기구 내의 타이트한 시일(seal)의 형성용으로 의도되는 적절한 접착제 화합물을 기반으로 한 포팅(potting) 화합물에 의해 또한 분리된다.
또 다른 예시적인 기구는 복수의 중공 섬유 막을 포함하는데, 상기 막은 외부 쉘 내에 포함되고, 중공 섬유 외부의 공간(즉, 모세관외 구획) 내의 유체가 중공 섬유 및 그의 상응하는 오리피스(orifice)를 통과하는 유체로부터 분리되도록 구성된다. 부가적으로, 본 기구는 기구의 반대쪽 단부들 상에 외부 쉘 내의 2개의 매니폴드형(manifold) 말단 챔버를 포함한다. 중공 섬유의 2개의 오리피스 각각은 상이한 말단 챔버에 연결된다. 말단 챔버들 및 모세관외 구획은 중공 섬유의 반투성 막에 의해 분리된다. 모세관외 구획 내의 조성물은 어느 정도까지는 중공 섬유의 막의 분자량 컷오프, 또는 기공 크기에 의해 제어될 수 있다.
본 기구의 1가지 작동 양식에서, 세포를 모세관외 구획에서 성장시키는 반면, 영양 배지를 중공 섬유에 통과시킨다. 본 기구의 또 다른 작동 양식에서, 세포를 중공 섬유의 모세관내 공간(즉, 내강)에서 성장시키는 반면, 영양 배지를 모세관외 구획 및/또는 모세관내 구획에 통과시킨다. 반투성 성질의 중공 섬유는 영양소 및 세포 폐기물이 중공 섬유의 벽을 통과하게 하는 반면, 세포는 이를 하지 못하게 한다.
쉘-튜브형(shell-and-tube) 생물 반응기는 몇몇 이점을 제공한다. 유착성 세포에 있어서, 몇몇 중공 섬유의 사용은 비교적 작은 체적 내에서, 세포가 성장할 수 있는 다량의 표면 영역을 제공한다. 이러한 다량의 표면 영역은 또한 성장 중인 세포로 영양 배지를 국소 분배하는 것 및 세포 폐기물의 신속한 수집을 용이하게 한다. 쉘-튜브형 생물 반응기는 다른 세포 배양 기구에서 가능한 것보다 훨씬 더 높은 밀도로 세포가 성장할 수 있게 한다. 쉘-튜브형 생물 반응기는 밀리리터당 108개 초과의 세포의 세포 밀도를 지지할 수 있으며, 반면에, 다른 세포 배양 기구는 전형적으로 밀리리터당 대략 106개의 세포의 밀도로 한정된다.
줄기 세포
본 발명은 바람직하게는 척추동물 종, 예컨대 인간, 비인간 영장류, 가축, 축류, 및 다른 비인간 포유류의 줄기 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 이는 하기에 기술된 세포를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
배아 줄기 세포
가장 잘 연구된 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC)이며, 그 이유는 이것이 무한 자기 재생 및 다능성 분화 잠재력을 갖기 때문이다. 이러한 세포는 배반포의 내세포괴로부터 유래되거나, 착상후 배(배아 생식 세포 또는 EG 세포)의 원시 생식 세포로부터 유래될 수 있다. ES 및 EG 세포는 처음에 마우스로부터 유래되었으며, 이후에 많은 상이한 동물들로부터 유래되었고, 더욱 최근에는 또한 비인간 영장류 및 인간으로부터 유래되었다. 마우스 배반포 또는 다른 동물의 배반포 내에 도입될 때, ESC는 동물의 모든 조직에 기여할 수 있다. ES 및 EG 세포는 SSEA1(마우스) 및 SSEA4(인간)에 대한 항체를 이용한 양성 염색에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,453,357호; 미국 특허 제5,656,479호; 미국 특허 제5,670,372호; 미국 특허 제5,843,780호; 미국 특허 제5,874,301호; 미국 특허 제5,914,268호; 미국 특허 제6,110,739호; 미국 특허 제6,190,910호; 미국 특허 제6,200,806호; 미국 특허 제6,432,711호; 미국 특허 제6,436,701호; 미국 특허 제6,500,668호; 미국 특허 제6,703,279호; 미국 특허 제6,875,607호; 미국 특허 제7,029,913호; 미국 특허 제7,112,437호; 미국 특허 제7,145,057호; 미국 특허 제7,153,684호; 및 미국 특허 제7,294,508호를 참조하는데, 상기 미국 특허 각각은 배아 줄기 세포 및 이의 제조 및 확장 방법의 교시를 위하여 참고로 포함된다. 따라서, ESC 및 이의 단리 및 확장 방법은 당업계에 공지되어 있다.
생체내에서 배아 줄기 세포의 가능성 상태(potency status)에 영향을 주는 다수의 전사 인자 및 외인성 사이토카인이 확인되었다. 줄기 세포 전능성에 연루된, 기술될 첫 번째 전사 인자는 Oct4이다. Oct4는 POU(Pit-Oct-Unc) 패밀리의 전사 인자에 속하며, 프로모터 또는 인핸서 영역 내의 옥타머 모티프로 불리우는 옥타머 서열을 함유하는, 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 결합 단백질이다. Oct4는 난통이 형성될 때까지 수정된 접합자의 난할 단계시에 발현된다. Oct3/4의 기능은 분화 유도 유전자(즉, FoxaD3, hCG)를 억제하는 것 및 전능성을 촉진하는 유전자(FGF4, Utf1, Rex1)를 활성화시키는 것이다. 고이동도 군(high mobility group; HMG) 박스 전사 인자의 구성원인 Sox2는 Oct4와 협력하여 내세포괴에서 발현되는 유전자의 전사를 활성화시킨다. 배아 줄기 세포에서의 Oct3/4의 발현은 특정한 수준들 사이에서 유지되는 것이 필수적이다. Oct4 발현 수준의 >50%의 과다발현 또는 하향조절은 배아 줄기 세포의 운명을 변경시키는데, 이때 각각 원시 내배엽/중배엽 또는 영양외배엽이 형성된다. 생체내에서, Oct4 결함 배아는 배반포기로 발달하지만, 내세포괴는 전능성이 아니다. 대신, 이것은 배체외 영양포 계통을 따라 분화한다. 포유류 Spalt 전사 인자인 Sall4는 Oct4의 상류 조절자이며, 따라서 발생학의 초기 시기 동안 Oct4의 적절한 수준을 유지하는 데 중요하다. Sall4 수준이 특정한 역치 아래로 떨어지면, 영양외배엽 세포는 내세포괴로 이소성으로 확장된다. 전능성에 필요한 또 다른 전사 인자로는 켈트족의 "Tir Nan Og"[the land of the ever young]를 따라 명명된 Nanog가 있다. 생체내에서, Nanog는 수축 상실배 단계로부터 발현되며, 후속적으로 내세포괴에 한정되며, 착상기에 의해 하향 조절된다. Nanog의 하향 조절은 전능성 세포의 제어되지 않은 확장을 회피하고, 장배 형성 동안 다중계통 분화를 허용하는 데 중요할 수 있다. 5.5일에 단리된 Nanog 널(null) 배아는 주로 배체외 내배엽을 포함하고 식별가능한 배반엽상층은 포함하지 않는 무질서한 배반포로 이루어진다.
비배아 줄기 세포
줄기 세포는 대부분의 조직에서 확인되었다. 아마도, 가장 잘 특성화된 것은 조혈 줄기 세포(HSC)일 것이다. HSC는 세포 표면 마커 및 기능적 특성을 이용하여 정제될 수 있는 중배엽 유래된 세포이다. HSC는 골수, 말초 혈액, 제대 혈액, 태아 간 및 난황낭으로부터 단리되었다. HSC는 조혈을 개시하며, 다수의 조혈 계통을 생성한다. 치명적으로 조사된 동물 내로 이식될 때, HSC는 적혈구계 호중구-대식 세포, 거핵구 및 림프구양 조혈 세포 풀을 재집단화할 수 있다. HSC는 또한 일부 자기 재생적 세포 분열을 겪도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,635,387호; 미국 특허 제5,460,964호; 미국 특허 제5,677,136호; 미국 특허 제5,750,397호; 미국 특허 제5,681,599호; 및 미국 특허 제5,716,827호를 참조한다. 미국 특허 제5,192,553호에는 인간 신생아 또는 태아 조혈 줄기 세포 또는 선구 세포의 단리 방법이 보고되어 있다. 미국 특허 제5,716,827호에는 Thy-1+ 선구체인 인간 조혈 세포 및 시험관내에서 이를 재생시키기에 적절한 성장 배지가 보고되어 있다. 미국 특허 제5,635,387호에는 인간 조혈 세포 및 그 전구체의 배양을 위한 방법 및 기구가 보고되어 있다. 미국 특허 제6,015,554호에는 인간 림프양 세포 및 수지상 세포의 재구성 방법이 기술되어 있다. 따라서, HSC 및 이의 단리 및 확장 방법은 당업계에 공지되어 있다.
당업계에 공지된 또 다른 줄기 세포는 신경 줄기 세포(NSC)이다. 이 세포는 적어도 일부의 뉴런 세포를 생체내에서 증식시키고 계속하여 재생시킬 수 있다. 생체외에서 배양될 때, 신경 줄기 세포는 상이한 유형의 뉴런 및 교질 세포로 증식되도록 유도될 수 있고, 이외에도 상기 뉴런 및 교질 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 뇌 내에 이식될 때, 신경 줄기 세포는 신경 세포 및 교질 세포에 그래프팅되어 신경 세포 및 교질 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Gage F.H., Science, 287: 1433-1438 (2000)], 문헌[Svendsen S.N. et al, Brain Pathology, 9:499-513 (1999)], 및 문헌[Okabe S. et al., Mech Development, 59:89-102 (1996)]을 참조한다. 미국 특허 제5,851,832호에는 뇌조직으로부터 수득된 다능성 신경 줄기 세포가 보고되어 있다. 미국 특허 제5,766,948호에는 신생아 대뇌 반구로부터의 신경모세포의 생성이 보고되어 있다. 미국 특허 제5,564,183호 및 미국 특허 제5,849,553호에는 포유류 신경릉 줄기 세포의 사용이 보고되어 있다. 미국 특허 제6,040,180호에는 포유류 다능성 CNS 줄기 세포의 배양물로부터의 분화된 뉴런의 시험관내 생성이 보고되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 98/50526호 및 국제 특허 공개 제WO 99/01159호에는 신경상피 줄기 세포, 희돌기교세포-성상세포 전구체 및 계통 제한된 뉴런 전구체의 생성 및 단리가 보고되어 있다. 미국 특허 제5,968,829호에는 배아 전뇌로부터 수득된 수득된 신경 줄기 세포가 보고되어 있다. 따라서, 신경 줄기 세포 및 이의 제조 및 확장 방법은 당업계에 공지되어 있다.
당업계에서 광범위하게 연구된 또 다른 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포(MSC)이다. MSC는 배아 중배엽으로부터 유래되며, 특히 성체 골수, 말초 혈액, 지방, 태반 및 제대 혈액을 포함하는 많은 공급원으로부터 단리될 수 있다. MSC는 근육, 뼈, 연골, 지방 및 건을 포함하는 많은 중배엽 조직으로 분화될 수 있다. 이러한 세포에 관한 상당한 문헌이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,486,389호; 미국 특허 제5,827,735호; 미국 특허 제5,811,094호; 미국 특허 제5,736,396호; 미국 특허 제5,837,539호; 미국 특허 제5,837,670호; 및 미국 특허 제5,827,740호를 참조한다. 또한, 문헌[Pittenger, M. et al, Science, 284: 143-147 (1999)]을 참조한다.
성체 줄기 세포의 또 다른 예로는 지방 조직 유래된 성체 줄기 세포(ADSC)가 있으며, 이는 전형적으로 지방흡입, 이어서 콜라게나아제를 이용한 ADSC의 방출에 의해 지방으로부터 단리되었다. ADSC는, 지방으로부터 세포를 더 많이 단리하는 것이 가능하다는 것을 제외하고는, 골수로부터 유래된 MSC와 많은 방식으로 유사하다. 이러한 세포는 뼈, 지방, 근육, 연골 및 뉴런으로 분화되는 것으로 보고되었다. 단리 방법이 미국 특허 공개 제2005/0153442호에 기술되었다.
당업계에 공지된 다른 줄기 세포는 위장관 줄기 세포, 표피 줄기 세포 및 간 줄기 세포를 포함하는데, 이는 또한 "난형 세포(oval cell)"로도 칭해졌다(문헌[Potten, C, et al., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998)], 문헌[Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997)]; 문헌[Alison et al., Hepatology, 29:678-683 (1998)].
1가지 초과의 배엽의 세포 유형으로 분화될 수 있는 것으로 보고된 다른 비배아 세포는 제대 혈액 유래의 세포(미국 특허 공개 제2002/0164794호 참조), 태반 유래의 세포(미국 특허 공개 제2003/0181269호 참조), 제대 매트릭스 유래의 세포(문헌[Mitchell, K.E. et al., Stem Cells, 21 :50-60 (2003)]), 소형 배아 유사 줄기 세포(문헌[Kucia, M. et al., J Physiol Pharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006)]), 양수 줄기 세포 유래의 세포(문헌[Atala, A., J Tissue Regen Med, 1 :83-96 (2007)]), 피부 유래된 전구체 유래의 세포(문헌[Toma et al., Nat Cell Biol, 3:778-784 (2001)]), 및 골수 유래의 세포(미국 특허 공개 제2003/0059414호 및 미국 특허 공개 제2006/0147246호 참조)를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아닌데, 상기 미국 특허 공개 및 문헌 각각은 이들 세포의 교시를 위하여 참고로 포함된다.
체세포의 재프로그래밍 전략
몇몇 상이한 전략, 예컨대 핵 이식, 세포 융합, 및 배양 유도된 재프로그래밍을 분화된 세포의 배아 상태로의 전환의 유도에 이용하였다. 핵이식은 체세포 핵을 핵제거 난모 세포 내에 주입하는 것을 포함하는데, 이는 대리모 내로의 핵이식시에, 클론("생식형 클로닝")이 생기게 할 수 있거나, 또는 배양 중 외식시에, 유전적으로 매칭된 배아 줄기(ES) 세포("체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer", SCNT)가 생기게 할 수 있다. 체세포와 ES 세포의 세포 융합은 전능성 ES 세포의 모든 특징을 나타내는 하이브리드(hybrid)를 생성한다. 배양 중 체세포의 외식은 전능성 또는 다능성일 수 있는 불사 세포주를 선발한다. 오늘날, 정원 줄기 세포는 출생후 동물로부터 유래될 수 있는 전능성 세포의 유일한 공급원이다. 정의된 인자를 이용한 체세포의 형질도입은 전능성 상태로의 재프로그래밍을 개시할 수 있다. 이러한 실험적 접근법은 광범위하게 개관되었다(문헌[Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441 : 1061-1067 (2006)] 및 문헌[Yamanaka, S., Cell Stem Cell, 1 :39-49 (2007)]).
핵이식
체세포 핵이식(SCNT)로도 칭해지는 핵이식술(nuclear transplantation; NT)은 공여체 체세포로부터의 핵을 핵제거 난모세포 내로 도입하여 클로닝된 동물, 예컨대 돌리(Dolly) 양을 생성하는 것을 나타낸다(문헌[Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997)]). NT에 의한 살아있는 동물의 생성은 최종적으로 분화된 세포의 것을 포함하는 체세포의 후성적인 상태가, 안정한 반면, 비가역적으로 고정된 것은 아니지만, 새로운 유기체의 발생을 유도할 수 있는 배아 상태로 재프로그래밍될 수 있음을 입증하였다. 배아 발생 및 질환에 연루된 기본적인 후성적 기작을 해명하는 흥미진진한 실험적 접근법을 제공하는 것에 더하여, 핵 클로닝 기술은 환자 특이적 이식용 의약에 있어서 잠재적으로 흥미로운 것이다.
체세포와 배아 줄기 세포의 융합
체세포 핵을 미분화 상태로 후성적으로 재프로그래밍하는 것은 배아 세포와 체세포의 융합에 의해 생성된 쥐과 하이브리드에서 입증되었다. 다양한 체세포와 배아 암종 세포(문헌[Solter, D., Nat Rev Genet, 7:319-327 (2006)], 배아 생식 세포(EG), 또는 ES 세포(문헌[Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233 (2005)]) 사이의 하이브리드는 많은 특징을 모(parental) 배아 세포와 공유하며, 이는 전능성 표현형이 이러한 융합 생성물에서 우성임을 나타낸다. 마우스에서와 같이(문헌[Tada et al., Curr Biol, 11 : 1553-1558 (2001)]), 인간 ES 세포는 융합 후 체세포 핵을 재프로그래밍하는 잠재력을 갖는다(문헌[Cowan et al., Science, 309: 1369-1373(2005)]; 문헌[Yu et al., Science, 318: 1917-1920 (2006)]). 사일런트(silent) 전능성 마커, 예컨대 Oct4의 활성화 또는 불활성 체세포 X 염색체의 재활성화는 상기 하이브리드 세포에서의 체세포 게놈의 재프로그래밍에 대한 분자적 증거를 제공하였다.융합한지 2일 후에 처음으로 관찰되는 전능성 마커의 활성화에 DNA 복제가 필수적이며(문헌[Do and Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)]), ES 세포에서의 Nanog의 강제된 과다발현은 신경 줄기 세포와의 융합시에 전능성을 촉진한다(문헌[Silva et al., Nature, 441 :997-1001 (2006)])는 것이 제안되었다.
배양 유도된 재프로그래밍
전능성 세포는 출생후 정원 줄기 세포("maGSCsm" "ES 유사" 세포), 원시 생식 세포(EG 세포), 배반엽상층(EpiSC 세포) 및 배반포 (ES 세포)의 내세포괴(ICM) 및 할구와 같은 배아 공급원으로부터 유래되었다. 하기 전능성 세포가 그 공여 세포/조직과 함께 다음과 같이 있다: 병리 유전적 ES 세포는 쥐과 난모 세포로부터 유래되며(문헌[Narasimha et al., Curr Biol, 7:881-884 (1997)]); 배아 줄기 세포는 할구(문헌[Wakayama et al., Stem Cells, 25:986-993 (2007)]); 내세포괴 세포(공급원은 적용가능하지 않음)(문헌[Eggan et al., Nature, 428:44-49 (2004)])로부터 유래되었으며; 배아 생식 세포 및 배아 암종 세포는 원시 생식 세포로부터 유래되었으며(문헌[Matsui et al., Cell, 70:841-847 (1992)]); GMCS, maSSC, 및 MASC는 정원 줄기 세포로부터 유래되었으며(문헌[Guan et al., Nature, 440: 1199-1203 (2006)]; 문헌[Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119: 1001-1012 (2004)]; 및 문헌[Seandel et al., Nature, 449:346-350 (2007)]); EpiSC 세포는 배반엽상층으로부터 유래되었으며(문헌[Brons et al., Nature, 448: 191-195 (2007)]; 문헌[Tesar et al., Nature, 448: 196-199(2007)]); 병리 유전적 ES 세포는 인간 난모 세포로부터 유래되었으며(문헌[Cibelli et al., Science, 295L819 (2002)]; 문헌[Revazova et al., Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007)]); 인간 ES 세포는 인간 배반포로부터 유래되었으며(문헌[Thomson et al., Science, 282: 1145-1147 (1998)]); MAPC는 골수로부터 유래되었으며(문헌[Jiang et al., Nature, 418:41-49 (2002)]; 문헌[Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007)]); 제대혈 세포는 제대혈로부터 유래되엇으며(문헌[van de Ven et al., Exp Hematol, 35: 1753-1765 (2007)]); 신경구 유래된 세포는 신경 세포로부터 유래되었다(문헌[Clarke et al., Science, 288: 1660-1663 (2000)]). 정원 줄기 세포 또는 PGC와 같은 생식 세포 계통으로부터의 공여 세포는 생체내에서 단능성인 것으로 공지되어 있지만, 전능성 ES 유사 세포(문헌[Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119: 1001-1012 (2004)] 또는 maGSC(문헌[Guan et al., Nature, 440: 1199-1203 (2006)]가 장기간의 시험관내 배양 후 단리될 수 있음이 밝혀졌다. 대부분의 이들 전능성 세포 유형은 시험관내 분화 및 기형종 형성이 가능하였지만, 단지 ES, EG, EC 및 정원 줄기 세포 유래된 maGCS 또는 ES 유사 세포는 더욱 엄격한 기준에 의해 전능성이었으며, 그 이유는 이들이 출생후 키메라를 형성할 수 있고 생식세포 계열에 기여할 수 있기 때문이었다. 최근에, 다능성 성체 정원 줄기 세포(MASC)는 성체 마우스의 정소 정원 줄기 세포로부터 유래되었으며, 이러한 세포는 ES 세포의 것과는 상이한 발현 프로파일을 갖지만(문헌[Seandel et al., Nature, 449:346-350 (2007)]) 착상후 마우스 배아의 배반엽상층으로부터 유래된 EpiSC 세포와는 유사하였다 (문헌[Brons et al., Nature, 448: 191-195 (2007)]; 문헌[Tesar et al., Nature, 448: 196-199 (2007)]).
규정된 전사 인자에 의한 재프로그래밍
타카하시(Takahashi) 및 야마나카(Yamanaka)는 체세포를 다시 ES 유사 상태가 되도록 재프로그래밍하는 것을 보고하였다(문헌[Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676 (2006)]). 이들은 4가지의 전사 인자, Oct4, Sox2, c-myc, 및 Klf4의 바이러스 매개된 형질도입, 이어서 Oct4 표적 유전자 Fbxl5의 활성화에 대한 선발 후, 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 및 성체 섬유모세포를 전능성 ES 유사 세포로 성공적으로 재프로그래밍하였다(도 2a). Fbxl5를 활성화시킨 세포는 만들어진 iPS(유도형 전능성 줄기) 세포였으며, 살아있는 키메라를 생성할 수는 없었지만, 기형종을 형성하는 그의 능력에 의해 전능성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 전능 상태는 형질도입된 Oct4 및 Sox2 유전자의 계속적인 바이러스 발현에 의존적이었으며, 반면에, 내인성 Oct4 및 Nanog 유전자는 발현되지 않거나 ES 세포에서보다 더 낮은 수준으로 발현되었고, 그의 각각의 프로모터는 대부분 메틸화되는 것으로 밝혀졌다. 이는 Fbxl5-iPS 세포가 ES 세포에 상응하지 않았지만 불완전한 상태의 재프로그래밍을 나타냈을 수 있다는 결론과 일치한다. 유전적 실험에 의해 Oct4 및 Sox2가 전능성에 필수적임이 확립되었지만(문헌[Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004)]; 문헌[Ivanona et al., Nature, 442:5330538 (2006)]; 문헌[Masui et al., Nat Cell Biol, 9:625-635 (2007)]), 재프로그래밍에 있어서 2가지 암유전자 c-myc 및 Klf4의 역할은 덜 명확하다. 이러한 암유전자들 중 일부는 실제, 재프로그래밍에 불필요할 수 있으며, 그 이유는 마우스 및 인간 iPS 세포 둘 모두가, 낮은 효율이기는 하지만 c-myc 형질도입의 부재 하에 수득되었기 때문이다(문헌[Nakagawa et al., Nat Biotechnol, 26: 191-106 (2008)]; 문헌[Werning et al., Nature, 448:318-324 (2008)]; 문헌[Yu et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)]).
MAPC
인간 MAPC가 미국 특허 제7,015,037호에 기술되어 있다. MAPC는 다른 포유류에서 확인되었다. 예를 들어, 쥐과 MAPC가 또한 미국 특허 제7,015,037호에 기술되어 있다. 래트 MAPC가 또한 미국 특허 제7,838,289호에 기술되어 있다.
이러한 참고 문헌은 처음에 캐더린 버파일리(Catherine Verfaillie)에 의해 단리된 MAPC의 기술을 위하여 참고로 포함된다.
MAPC 의 단리 및 성장
MAPC의 단리 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,015,037호를 참조하며, 이러한 방법은 MAPC의 특성화(표현형)와 함께 본원에 참고로 포함된다. MAPC는 골수, 태반, 제대 및 제대혈, 근육, 뇌, 간, 척수, 혈액 또는 피부를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다수의 공급원으로부터 단리될 수 있다. 따라서, 골수 흡인물, 뇌 또는 간 생검체 및 다른 기관을 수득하고, (예를 들어, 기능적 또는 형태적 분석법, 예컨대 본원에 참고로 포함된 상기 특허 출원에 개시된 것에 의해) 이들 세포에서 발현되는(또는 발현되지 않는) 유전자에 따라 당업계의 숙련자가 이용가능한 양성 또는 음성 선발 기술을 이용하여 세포를 단리하는 것이 가능하다.
또한 MAPC는 문헌[Breyer et al., Experimental Hematology, 34: 1596-1601 (2006)] 및 문헌[Subramanian et al., Cellular Programming and Reprogramming: Methods and Protocols; S. Ding (ed.), Methods in Molecular Biology, 636:55-78 (2010)]에 기술된 변형된 방법에 의해 수득되었는데, 상기 문헌은 이들 방법을 위하여 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,015,037호에 기술된 인간 골수 유래의 MAPC
MAPC는 일반적인 백혈구 항원 CD45 또는 적아구 특이적 글리코포린-A(Gly-A)를 발현하지 않는다. 혼합 세포 집단을 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) 분리에 처하였다. 그 후 상기 세포를 항-CD45 및 항-Gly-A 항체를 사용하여 CD45+ 및 Gly-A+ 세포 집단을 고갈시켜서 음성 선발하고, 그 후 남아있는 대략 0.1%의 골수 단핵 세포를 회수하였다. 세포는 또한 피브로넥틴 코팅된 웰에 도말되고, 하기에 기술된 바와 같이 2-4주 동안 배양되어 CD45+ 세포 및 Gly-A+ 세포를 고갈시킬 수 있다. 유착성 골수 세포의 배양에 있어서, 많은 유착성 간질 세포는 대략 30배의 세포 배가에서 복제적 노화를 겪으며, 더욱 균질한 세포 집단은 계속하여 확장되고 긴 텔로머라아제를 유지한다.
대안적으로, 세포 특이적 마커들의 조합을 통하여 세포를 단리하기 위하여 양성 선발을 이용할 수 있다. 양성 및 음성 선발 기술 둘 모두를 당업계의 숙련자가 이용할 수 있으며, 음성 선발 목적에 적합한 다수의 단클론 및 다클론 항체가 당업계에서 또한 입수가능하며(예를 들어, 문헌[Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds. (1995) Oxford University Press] 참조), 다수의 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다.
세포 집단들의 혼합물로부터의 포유류 세포 분리 기술도 슈바르츠(Schwartz) 등의 미국 특허 제5,759,793호(자기 분리(magnetic separation)), 문헌[Basch et al., 1983](면역친화성 크로마토그래피) 및 문헌[Wysocki and Sato, 1978](형광 활성화 세포 분류)에 기술되었다.
세포는 저 혈청 또는 무혈청 배양 배지에서 배양될 수 있다. MAPC의 배양에 사용되는 무혈청 배지는 미국 특허 제7,015,037호에 기술되어 있다. 일반적으로 사용되는 성장 인자는 혈소판 유래된 성장 인자 및 상피 성장 인자를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국 특허 제7,169,610호; 미국 특허 제7,109,032호; 미국 특허 제7,037,721호; 미국 특허 제6,617,161호; 미국 특허 제6,617,159호; 미국 특허 제6,372,210호; 미국 특허 제6,224,860호; 미국 특허 제6,037,174호; 미국 특허 제5,908,782호; 미국 특허 제5,766,951호; 미국 특허 제5,397,706호; 및 미국 특허 제4,657,866호를 참조하는데, 이들 모두는 무혈청 배지에서의 세포 성장의 교시를 위하여 참고로 포함된다.
추가의 배양 방법
추가의 실험에서, MAPC가 배양되는 밀도는 약 100개의 세포/cm2 또는 약 150개의 세포/cm2 내지 약 10,000개의 세포/cm2로 다양할 수 있으며, 이는 약 200개의 세포/cm2 내지 약 1500개의 세포/cm2 내지 약 2000개의 세포/cm2를 포함한다. 상기 밀도는 종들 사이에서 달라질 수 있다. 부가적으로, 최적 밀도는 세포의 공급원 및 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 주어진 세트의 배양 조건 및 세포에 있어서의 최적 밀도의 결정은 당업자의 기술 이내이다.
또한, 약 1-5%, 특히 3-5%를 포함하는, 약 10% 미만의 유효 대기중 산소 농도가 배양 중 MAPC의 단리, 성장 및 분화 동안 임의의 시점에서 사용될 수 있다.
세포는 다양한 혈청 농도, 예를 들어 약 2-20% 하에서 배양될 수 있다. 소 태아 혈청이 사용될 수 있다. 더 많은 혈청, 예를 들어, 약 15-20%가 더 낮은 산소 분압과 조합되어 사용될 수 있다. 세포는 배양 디쉬에의 유착 이전에 선발될 필요는 없다. 예를 들어, 피콜 구배 후, 세포는 예를 들어 250,000-500,000개/cm2로 직접적으로 도말될 수 있다. 유착성 콜로니는 골라지고, 가능하게는 풀링되고, 확장될 수 있다.
일 실시양태에서, 실시예에서의 실험 절차에서 사용될 경우 고 혈청(대략 15-20%) 및 저 산소(대략 3-5%) 조건이 세포 배양에 사용되었다. 구체적으로, 콜로니로부터의 유착성 세포는 18% 혈청 및 3% 산소에서 약 1700-2300개의 세포/cm2의 밀도로 도말되고 계대되었다(PDGF 및 EGF를 이용함).
MAPC에 특이적인 실시양태에서, 보충제는 모든 3가지 계통과 같은 1가지 초과의 배아 계통의 세포 유형으로 분화되는 능력을 MAPC가 유지하게 하는 세포 인자 또는 성분이다. 이는 미분화 상태의 특정 마커, 예컨대 Oct 3/4(Oct 3A) 및/또는 고 확장능의 마커, 예컨대 텔로머라아제의 발현에 의해 지시될 수 있다.
세포 배양
하기에 열거된 모든 성분에 있어서, 미국 특허 제7,015,037호를 참조하는데, 이는 이들 성분의 교시를 위하여 참고로 포함된다.
일반적으로, 본 발명에 유용한 세포는 당업계에서 입수가능하고 공지된 배양 배지에서 유지 및 확장될 수 있다. 또한 고려되는 것은 포유류 혈청을 포함하는 세포 배양 배지의 보충이다. 추가의 보충제는 또한 최적 성장 및 확장에 필요한 미량 원소를 세포에게 보충하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 호르몬도 세포 배양에서 유리하게 사용될 수 있다. 또한 지질 및 지질 담체가 세포의 유형 및 분화 세포의 운명에 따라 세포 배양 배지를 보충하는 데 사용될 수 있다. 또한 고려되는 것은 영양 세포층의 사용이다.
흔히 줄기 세포는 고형 지지체, 예컨대 라미닌, 제I형 및 제II형 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 피브로넥틴, "수퍼피브로넥틴" 및 피브로넥틴 유사 중합체, 젤라틴, 폴리-D 및 폴리-L-라이신, 트롬보스폰딘 및 비트로넥틴에의 그의 부착을 장려하는 추가의 인자를 필요로 한다. 기저막 유래된 단백질 혼합물을 기반으로 하거나 이로 구성된 다른 적합한 코팅 물질을 사용할 수 있다. 이들 중 일부, 예컨대 매트리겔(Matrigel)은 상업적으로 입수가능하다. 코팅은 세포외 매트릭스 단백질 및 이의 적합한 유도체를 사용할 수 있으며, 이외에도 이들 단백질의 혼합물도 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태는 피브로넥틴을 이용한다. 예를 들어, 문헌[Ohashi et al., Nature Medicine, 13:880-885 (2007)]; 문헌[Matsumoto et al., J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354 (2008)]; 문헌[Kirouac et al., Cell Stem Cell, 3:369-381 (2008)]; 문헌[Chua et al., Biomaterials, 26:2537-2547 (2005)]; 문헌[Drobinskaya et al., Stem Cells, 26:2245-2256 (2008)]; 문헌[Dvir-Ginzberg et al., FASEB J, 22: 1440-1449 (2008)]; 문헌[Turner et al., J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater, 82B: 156-168 (2007)]; 및 문헌[Miyazawa et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, 22: 1959-1964 (2007)]을 참조한다.
일단 배양에서 확립되었으면, 세포는 신선하게 사용되거나 또는 예를 들어 20%-40% FCS 및 10% DMSO를 포함하는 DMEM을 사용하여 냉동된 스톡으로서 냉동 보관될 수 있다. 일 실시양태에서, 20% FCS가 사용된다. 배양된 세포를 위한 냉동 스톡을 제조하는 다른 방법도 당업계의 숙련자가 이용가능하다.
본 출원의 목적상, 상기에 기술된 배지 성분 및 조건과 관련하여, 추가의 배양 방법과, 이외에도 다른 배양 방법이 또한 생물 반응기법에 적용된다. 예로서, 에시된 실시양태에서, 산소 농도는 5%이며, 혈청은 약 19%이며, EGF 및 PDGF 둘 모두가 배지에 첨가된다.
제약 제형
미국 특허 제7,015,037호는 제약 제형의 교시를 위하여 참고로 포함된다. 특정한 실시양태에서, 세포 집단은 전달용으로 개조된 그리고 전달용으로 적합한 조성물 내에 존재하며, 즉, 생리학적으로 양립가능하다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 세포(또는 조절 배지)의 순도는 약 100%이다(실질적으로 균질함). 다른 실시양태에서, 이것은 95% 내지 100%이다. 일부 실시양태에서 이것은 85% 내지 95%이다. 특히, 다른 세포와의 혼합물의 경우, 백분율은 약 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%- 70%, 70%-80%, 80%-90%, 또는 90%-95%일 수 있다. 또는, 단리/순도는 세포 배가의 면에서 표현될 수 있으며, 여기서, 세포는 예를 들어, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50배 또는 그보다 많은 세포 배가를 겪었다.
주어진 응용을 위하여 세포를 투여하기 위한 제형의 선택은 다양한 인자에 의존한다. 이들 중 현저한 것은 대상체의 종, 치료되는 병의 성질, 대상체에 있어서 이의 상태 및 분포, 다른 치료법 및 투여되는 에이전트의 성질, 최적 투여 경로, 상기 경로를 통한 생존능, 투약 요법, 및 당업계의 숙련자에게 명백한 다른 인자이다. 예를 들어, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 투여 형태의 성질에 의존한다.
세포/배지의 수성 현탁물의 최종 제형은 전형적으로 현탁물의 이온 강도를 등장성(즉, 약 0.1 내지 0.2)으로 조정하는 것 및 생리학적 pH(즉, 약 pH 6.8 내지 7.5)로 조정하는 것을 포함한다. 최종 제형은 또한 전형적으로 유체 윤활제를 함유한다.
일부 실시양태에서, 세포/배지는 단위 투여형 주사가능 형태, 예컨대 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제형화된다. 세포/배지의 주사에 적합한 제약 제형은 전형적으로 살균 수성 용액 및 분산액이다. 주사가능 제형의 담체는 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다.
당업자라면 본 발명의 방법에서 투여될 조성물 중의 세포의 양 및 임의적 첨가제, 비히클, 및/또는 담체의 양을 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, 임의의 첨가제(세포에 더하여)가 용액, 예컨대 인산염 완충 염수 중에 0.001 내지 50 중량%의 양으로 존재한다. 활성 성분은 대략 마이크로그램 내지 밀리그램으로, 예컨대 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 가장 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량% 또는 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량%, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량%로 존재한다.
실시예
실시예 1. 중공 섬유 생물 반응기 세포에 의한 세포 은행으로부터의 멀티스템의 확장
본질적으로 미국 특허 공개 제2008/0220523호 및 문헌[Antwiler et al.]에 기술된 바와 같이, 세포 확장 시스템을 사용하여 유입 멀티스템의 집단을 확장시켰는데, 상기 집단은 실질적으로 균질한 집단이다. 상기 시스템을 퀀텀 CES로 표기하였다. 이것은 자가 확장에 특히 유용한 벤치톱 확장 시스템을 제공하였다. (그러나, 이것은 동종이계 확장에도 유용하다.) 본 출원에 나타낸 결과를 기반으로 하면, 108개 초과의 세포가 단일 공여체로부터 수득될 수 있다.
멀티스템을 냉동 세포 은행에 보관한 후 해동시켰다. 2회의 실험에 있어서, 10 x 106개의 멀티스템을 연속 유동 생물 반응기 내에 접종하였는데, 상기 생물 반응기는 내부 유체 체적이 184 ml이고, 외부 유체 체적이 303 ml이고, 1.1 x 104개의 중공 섬유를 포함하고, 상기 중공 섬유는 총 표면적(모세관내)이 대략 2.1 m2(3255 in2)이고, 벽 두께가 50 ㎛이고, 내경이 215 ㎛이고, 총 길이가 295 mm이다(섬유당 평균 30 mm, 10-50 mm의 범위). 기공 크기는 대략적인 컷오프가 16 kDa이다. 세포는 중공 섬유의 내부에 유착되었다. 세포를 6일 동안 배양하였다. 752 x 1O6, 753 x 106 및 782 x 106개의 세포를 동일 접종 스톡으로부터 시작하여 3회의 독립 실험에서 생성하였다.
유량은 가변적일 수 있지만, 일반적으로 세포가 증식함에 따라 증가하여서 영양소가 충분한 양으로 제공되게 하고 폐기물이 충분한 양으로 제거되게 하였다. 일반적으로, 유량은 대략 10배 증가시킬 수 있다. 그러나, 이 파라미터는 배지 중 락테이트 및 글루코스 수준과 같은 폐기물의 모니터링에 의해 조정하였다.
벽 재료는 PA/PAES/PVP의 복합체였다.
또한, 이 특정 실시양태에서, 섬유를 피브로넥틴으로 코팅하였다.
확립된 세포에 있어서, 즉, 이전에 단리되고, 확장되고, 실질적으로 정제된 배양물로부터 유래된 것에 있어서, 5 mg의 피브로넥틴을 사용하며, 코팅을 하룻밤 행한다. 그 후, 코팅을 세척하고, 배지로 대체한다. 접종 후, 세포를 셀내 루프를 통한 유동 없이 24시간 동안 부착시킨다. 그 후, 공급 속도를 분당 약 0.1 ml에서 시작한다. 락테이트 수준 및 세포의 배가 속도를 기반으로 하여, 공급 속도를 대략적으로 24시간마다 배가시킨다. 첫 번째 3일 후에, 본 발명자는 락테이트 수준을 대략 0.5 g/ℓ로 유지하려고 시도하였다. 마지막 3일에, 이것은 대략 1 g/ℓ로 유지하며, 이때 최대치는 1.5 g/ℓ이다. 마지막날에(즉, 세포가 그 최대치로 확장될 때), 공급 속도는 약 3 ml/분이다.
세포를 약 200 ml의 2.5% 트립신을 사용하여 수확하며, 이때 인큐베이션 시간을 2.5분으로 하고 수확 체적을 약 500 ml로 한다.
골수 흡인물을 사용할 때, 모세관내 표면을 약 10 mg의 피브로넥틴으로 코팅하고, 이때 부착기를 48시간으로 한다. 공급 속도는, 락테이트 수준이 0.4 내지 0.5 g/ℓ까지 올라갈 경우 공급 속도가 배가되도록 조정한다. 일반적으로 공급 속도는 확립된 세포로부터 출발하는 배양물과 비교하여 그만큼 높지 않다. 하나의 실험에서, 약 25-30 ml의 골수 흡인물을 사용하여 전체 BMMC로부터 약 4 x 106개의 세포를 생성하였다. 이를 위하여, 골수를 피콜 구배에 처하여 비핵화 세포를 제거하였다.
상세 사항은 도 5에서 발견된다. 유동 방법은 하기 2개의 루프로 이루어진다: 모세관내(IC) 루프 및 모세관외(EC) 루프. IC 루프는 하기 3개의 유입 라인을 갖는다: 세포 라인, 시약 라인 및 IC 배지 라인. 백을 세포, 코팅제, 트립신 및 배지 첨가를 위하여 이들 라인에 부착시킨다. 각각의 라인을 밸브로 제어하는데, 상기 밸브는 2가지 위치, 개방 또는 폐쇄 위치를 갖는다. 유입 속도를 IC 유입 펌프(1)로 제어한다. 본 시스템 내에서의 순환은 IC 순환 펌프(2)로 제어한다. IC 회로는 150 ml을 함유한다. EC 루프는 하기의 2개의 유입 라인을 갖는다: 세척(용액) 라인 및 EC 배지 라인. 백을 PBS를 이용한 세척 및 배지의 EC 루프에의 첨가를 위하여 이들 라인에 부착시킨다. EC 유입 속도를 EC 유입 펌프(3)로 제어하고, 이 회로 내에서의 순환을 EC 순환 펌프(4)로 제어한다. EC 루프 내에 산소 발생기가 존재한다. 이 산소 발생기는 외부 가스 실린더(멀티스템의 경우, 이것은 90% N2; 5% 02; 5% C02임)에 부착되며, EC 배지에 있어서 가스 농도를 유지한다. IC 배지는 생물 반응기에서의 막을 통한 가스의 관류 때문에 평형에 이르게 된다. EC 회로는 대략 250 ml을 함유한다. 용액/세포가 시스템을 떠나는 하기 2가지 방법이 있다: 폐기물 백 또는 수확 백의 형태로 떠남. EC 루프 뿐만 아니라 IC 루프도 폐기물 백에의 연결부를 갖는데, 상기 폐기물 백은 밸브로 제어된다. 수확 백은 단지 IC 루프와의 연결부를 가지며, 또한 밸브로 제어된다.
유입 집단 및 유출 집단을 비교하였다. 구체적으로, 유입 집단을 특정한 선택된 유전자의 유전자 발현에 대하여 평가하였으며, 이를 유출 집단과 비교하였다. 게다가, 형태 및 배수성을 비교하였다. 유출 집단은 측정된 파라미터와 관련하여 유입 집단과 실질적으로 동일하였다.
실시예 2. 중공 섬유 생물 반응기 세포 확장 시스템에서의 골수로부터의 멀 티스템의 생성
상기에 기술한 세포 확장 시스템을 이용하여 골수 단핵 세포로부터의 멀티스템을 생성하였다. 확장 결과를 도 6에 나타낸다. 1가지 가능한 요법에서, 골수 흡인물로부터 시작하여 17일 이내에 멀티스템 마스터 세포 은행을 생성하는 것이 가능하다. 이것은 골수로부터 15배의 집단 배가까지 1회의 실행이 걸리며, 이 수확물이 18.5배의 집단 배가에 도달하기 위하여 확장 실행이 있고, 마스터 세포 은행(2000만개의 세포의 200개 바이알)을 생성하기 위하여 평균 10회의 실행이 걸린다. 그 후 이러한 200개의 바이알을 사용하여 제조용 세포 은행을 생성할 수 있다. 개략도를 도 7에 나타낸다. 그러나, 마스터 세포 은행은 10배 더 많은 세포까지의 증가 또는 10배 더 적은 세포로의 감소와 같이 증가되거나 감소될 수 있다.
확장 후, 유출 세포는 멀티스템과 결부된 면역조절 특성을 가지며, 텔로머라아제를 발현하였다.

Claims (27)

  1. a) 세포를 중공 섬유 기재 상에, 세포가 기재에 유착되도록 접종하는 단계; b) 기재 상의 유착된 세포를 확장시키는 단계; 및 c) 확장된 세포를 기재로부터 제거하는 단계를 포함하는, 생체외에서 세포를 확장시키는 방법으로서, 상기 세포는 비배아 줄기, 비생식 세포인 것을 특징으로 하는 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC)이고, 텔로머라아제를 발현하며, 형질전환되지 않고, 정상 핵형을 갖으며, 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 중 적어도 2가지의 세포 유형들로 분화될 수 있는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, MAPC가 oct4, rex-1, rox-1 또는 sox-2 중 하나 이상을 추가로 발현하는 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, MAPC가 내배엽, 외배엽 및 중배엽 배아 계통 각각의 세포 유형들로 분화될 수 있는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, MAPC가 골수로부터 유래되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, MAPC가 골수로부터 유래되는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, MAPC가 인간 유래인 방법.
  9. 제5항에 있어서, MAPC가 인간 유래인 방법.
  10. 제6항에 있어서, MAPC가 인간 유래인 방법.
  11. 제7항에 있어서, MAPC가 인간 유래인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)에서의 세포가 균질한 집단을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)가 골수, 제대 혈액, 제대 매트릭스, 말초 혈액, 태반, 태반 혈액, 근육, 뇌, 신장 또는 다른 실질 기관(solid organ)으로부터 선택되는 조직 유래의 세포를 접종하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, d) 제거된 세포를 동일하거나 상이한 기재 상에 재접종하는 단계; 및 e) 요망되는 수의 확장된 세포에 도달할 때까지 단계 b) - d)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 세포는 10-100배 확장되는 것인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중공 섬유가 코팅되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 코팅이 피브로넥틴인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 섬유 중 벽 재료가 폴리아미드(PA), 폴리아릴에테르술폰(PAES) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)의 블렌드인 방법.
  21. 제5항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  22. 제6항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  23. 제7항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  24. 제8항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  25. 제9항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  26. 제10항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
  27. 제11항에 있어서, 중공 섬유 기재가 폐쇄식 연속 관류 생물 반응기 내에 있는 것인 방법.
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