KR101579861B1 - Ｒｖ３１３１ 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Rv3131 단백질은 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 특히 최근 결핵의 예방에 중요하다고 알려진 다기능 T 세포의 생성을 유도한다. 또한 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｒｖ３１３１ 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물{Vaccine composition for tuberculosis containing Rv3131 protein}

본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

결핵은 WHO에서 규정한 3대 감염질환 중 하나로 1882년 미생물학자인 로베르트 코흐에 의해 발견되었으며, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacerium tuberculosis)에 의하여 유발되는 높은 발병률과 사망률을 보이는 치명적인 질병이다. 전 세계적으로 약 6천만 명 환자가 활동성 결핵에 감염되어 있으며, 매년 약 5천만에서 1억여 명이 새로 결핵에 감염되는 것으로 추정되고 있고, 적어도 매년 900만 명 이상의 새로운 결핵 환자가 발생하며, 연간 150만 명 이상이 결핵으로 사망한다고 알려졌다. 결핵 발병률은 인구 10만 명당 146명, 결핵 사망률은 인구 10만 명당 49명으로 단일 감염병 중에서 가장 많은 사망 원인을 차지하고 있어, 세계적으로 심각한 보건 문제로 남아 있다.

한국의 전체 결핵 발병률은 감소하고 있는 추세(직접도말양성결핵균의 유병률, 1965년에 10만 명에 686명에서 1995년 10만 명에 93명)에 있지만 (Hong et al., 1998), 여전히 상대적으로 높은 비율(0.11%)이다 (unpublished survey data by the CDC in Korea). 최근 들어 우리나라에서 발병하는 결핵환자 중에 약제내성을 나타내는 MDR-TB 환자와 XDR TB 환자가 급격하게 증가하는 추세에 있다. 한국 결핵 발병 중 약 10%는 다제 내성 결핵(MDR-TB)이지만, 보다 우려되는 것은, 전체 다제 내성 결핵균 중 광범위한 다제 내성 결핵(XDR-TB)의 비율이 5~15%로 나타났다는 것이다 (Jain & Dixit, 2008; Kim et al., 2008). 한국 내 결핵균의 유전자 지문은 베이징 결핵균과의 하나가 우점적으로 존재하는 것으로 나타났으며, 이 유전자형은 총 결핵균의 18.4%를 차지하는 것으로 나타났다 (Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). 김 등(2001)은 한국에서 고등학교 학생들에게 결핵을 유발한 결핵균 중 베이징과에 속하는 전염성이 강한 결핵균을 확인하였으며, 이 균을 K 균주라 명명하였다.

현재, 결핵은 주로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin)의 생균을 이용하여 예방하고 있다. 그러나 BCG 백신은 K 균주에는 그 효과가 없는 것으로 알려져 있으며, 안전성 및 효능에 논란이 있어 (Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 7:17-43), 미국과 같은 몇몇 국가는 이의 사용을 금지하고 있다. 또한, BCG는 HIV에 감염된 어린이들에게 사용하기에는 적당하지 못하다고 알려져 있다. 이에 BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 결핵 예방 백신의 개발이 요구되고 있다.

아직까지 국내에서 유행하고 있는 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주의 감염에 의한 결핵을 효과적으로 예방할 수 있는 백신이 개발되지 않았다. 따라서 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주를 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 백신 연구의 필요성이 있으며, 병원균의 노출 위험이 없어 약제내성을 유발하지 않는 새로운 백신에 대한 필요성이 있다

따라서, 본 발명의 목적은 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주에 의한 결핵을 예방할 수 있는 백신을 제공하는 것으로서, Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Rv3131 단백질은 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN- 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 특히 최근 결핵의 예방에 중요하다고 알려진 다기능 T 세포의 생성을 유도한다. 또한 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 클로닝을 통해 분리한 재조합 Rv3131 단백질을 SDS-PAGE 및 western blot을 통해 확인한 도이다.
도 2는 결핵균 감염 10주 전부터 마우스에 Rv3131 단백질을 3주 간격으로 3번 주입시킨 뒤 IFN-γ 생성능과 유도된 T 세포를 분석하기 위한 실험 설계를 나타낸 도이다.
도 3은 Rv3131 단백질을 마우스에 주입하여 면역화 한 뒤 폐와 비장에서 항원자극을 통한 IFN-γ의 분비능을 확인한 도이다.
도 4는 Rv3131 단백질을 마우스에 주입하여 면역화한 뒤 폐와 비장에서 항원자극을 통한 T 세포의 유도를 유세포 분석기로 확인한 도이다.
도 5는 Rv3131로 면역화 시킨 마우스에서 Rv3131 자극에 의하여 유도되는 항원 특이적인 다기능 CD4, CD8 T세포들을 유세포 분석기로 분석한 도이다.
도 6은 결핵균을 감염시킨 뒤 폐 조직에서 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 도이다(Adjuvant control :GLA-SE를 처리한 군. **p<0.01, ***p<0.001).
도 7은 결핵균을 감염시킨 뒤 폐와 비장의 결핵균의 수를 측정한 도이다(폐 조직 ***p<0.001, 비장 조직 **p<0.005).
도 8은 Rv3131 단백질로 면역화 한 마우스에 결핵균 감염 후 폐와 비장 세포에 항원 재자극을 통해 유도되는 항원 특이적 다기능 CD4 T세포의 비율을 나타낸 도이다.
도 9는 Rv3131 단백질을 면역화 한 마우스에 결핵균 감염 후 폐와 비장 세포에 항원 재자극을 통해 유도되는 항원 특이적 다기능 CD8 T세포의 비율을 나타낸 도이다.

본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 Rv3131(NfnB, Nitroreductase)은 Mycobacterium tuberculosis H37RV에 존재하는 유전자로 Mycobacterium tuberculosis K 에서는 MTBK32990이 Rv3131의 ortholog이다. Rv3131은 1035bp의 유전자 및 344개의 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 단백질의 크기는 38KDa 이고 PI값은 6.67이다. Rv3131은 nitroreductase domain을 가지고 있는 단백질로써, 그 정확한 기능은 아직 밝혀지지 않았지만, 결핵균 내에서 FMN을 cofactor로 가지며 homodimer를 이루어 기능을 수행하고, 질소화합물을 환원시키는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. Rv3131의 주요한 기능은 알려져 있지 않지만, dormancy와 관련된 DosR regulon과 연관되어 있고 DosR에 의하여 조절된다는 사실은 밝혀져 있다.

상기 Rv3131 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열에 의해 코딩되는 단백질, 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 본 발명의 Rv3131 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 변이체란 Rv3131 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Rv3131 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 Rv3131 단백질은 서열번호 2의 유전자서열에 의해 코딩될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 Rv3131 단백질은 결핵균으로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

본 발명에서 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후 결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 결핵은 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주에 의해 발병되는 것을 포함한다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주는 한국 내 우점적으로 존재하는 베이징 결핵과 중 하나로 전염성이 강한 균주이다(Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). 마우스 감염 시 초기 선천면역을 극복할 수 있는 특이적 병인기전을 나타내며 이는 결핵균 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 균주 감염량의 10배에 해당되는 성장속도를 나타낸다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염에 의한 마우스의 폐사는 결핵균 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 균주 감염에 의한 마우스의 폐사보다 2배 이상 빠르며, 감염 후 폐사 시기의 균수는 거의 동일한 것으로 보아 감염 후기에는 숙주의 면역반응에 의한 면역병리가 병인기전으로서 매우 중요할 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 병원성 유기체의 약독화된 균주를 개체에 접종하여 병원체에 대한 면역 반응을 유도한 것이 아니라, 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 병원균에 대한 노출 없이 이후의 병원균 감염을 예방한 것을 특징으로 하기 때문에, 기존에 알려진 BCG 면역법에 비하여 보다 안전한 면역법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 Rv3131 단백질은 부스터(booster) 백신으로 이용될 수 있다. 백신에 의한 예방접종으로 항체가 생성될 때 첫 번째의 항원 자극 후에 나타나는 반응에 비해 항원의 두 번째의 접종에 의해 급속하며 보다 강하고 높은 항체가 생성된다. 이 두 번째의 항원자극을 부스터(booster)라고 한다. 본 발명의 Rv3131 단백질은 공지의 결핵 백신 투여 후 이어지는 두 번째 접종에 사용되어 강한 항체 반응을 유도할 수 있으므로, 부스터 백신으로 사용될 수 있다. 상기 공지의 결핵 백신은 일차적으로 접종되어 항체 반응을 유도하는 결핵 백신을 제한 없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 BCG 백신일 수 있으며, 이 경우 본 발명의 Rv3131 단백질은 BCG 1차 접종 후에 이어 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 부스터 백신 조성물을 제공한다. 부스터 백신의 투여는 당업계에서 적합한 임의의 수단에 의해, 예를 들어 접종 또는 주사, 특히 피내 주사에 의해 달성될 수 있으며, 이는 하나 이상의 별도의 용량을 이용하여 일어날 수 있다. 그러한 용량은 동일한 농도의 단백질 및 면역보조제를 포함할 수 있으며, 실질적으로 동시에 투여될 수 있고, 이는 피부 표면상에서 서로 이격되어 또는 하나의 접종 부위에 투여될 수 있다. 전형적으로 부스터 백신은 일차 면역화 일정이 완료된 후 투여되며, 바람직하게는 필요할 경우 일차 면역화 후 매 6개월 또는 12개월마다 투여된다.

본 발명에 따른 Rv3131 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Rv3131 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 Rv3131 단백질은 항원으로 작용하여 다기능 T 세포(multifunctional T cell)을 유도한다. 본 발명에서 “다기능 T 세포”는 결핵균을 방어하는 데 중요한 숙주의 구성요소 중 하나로 알려져 있으며, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 모두 분비하는 T 세포이다.

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 면역증강제(adjuvant)와 함께 투여한다. 면역증강제는 면역세포의 초기 성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 면역증강제는 임의의 다양한 면역증강제를 포함하며, 전형적인 면역증강제로는 프로인트 면역증강제(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나 바람직한 예시 중 하나로 GLA-SE를 면역증강제로 사용한 예를 개시한다. 상기 면역증강제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 “면역학적 유효량”이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

또한, 본 발명은 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 Rv3131 단백질과 함께 결핵의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 결핵의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 하기 제조예, 시험예 및 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들은 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

제조예 - Rv3131 재조합 단백질의 제조

결핵균 표준균주인 Mycobacterium tuberculosis H37Rv로부터 genomic DNA를 추출하여 Rv3131를 유전자를 클로닝하였다. Rv3131 유전자를 정방향 프라이머(5'-CATATGACCGCAGCCGTTGA-3')와 역방향 프라이머(5'-AAGCTTGCACCGTTGTCGCA-3')를 이용한 PCR을 통하여 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 NdeI과 HindIII 제한 효소로 절단하고, 발현 벡터인 pET-22b(+) 벡터(Novagen, Madison, WI)에 삽입한 뒤, Rv3131 유전자가 삽입된 pET-22b(+) 벡터를 이용하여 E. coli BL21을 형질전환 시킨 후, 이를 600에서의 흡광도(OD)가 0.4~0.5가 될 때까지 30℃에서 배양하였다. 상기 배양액에 1mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고, 30℃에서 8시간 동안 배양한 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 대장균을 파쇄하였다. 파쇄한 뒤 4℃에서 30분간 15000rpm으로 원심분리하여 조추출액을 분리해 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 TALON Metal Affinity Resin(Clontech)을 이용해 제조사의 방법에 준하여 Rv3131 재조합 단백질을정제하였다. 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 정제된 Rv3131 재조합 단백질을 이후 시험예 및 실시예에 사용하였다.

실시예 1 - Rv3131 단백질의 면역화 효과

1.1 Rv3131 단백질 주입을 통한 마우스의 면역화 유도

실험 동물로 생후 5 내지 6주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan)를 연세대학교 임상의학 연구 센터 내의 ABSL-3 바이오해저드 애니멀룸 제한 공간에서 사육하였다. 마우스에게는 멸균된 판매용 마우스 먹이와 물을 임의적으로 제공하였다.

마우스를 면역화 시키기 위하여 주사당 5㎍의 재조합 Rv3131 단백질을 GLA-SE(면역증강제)와 함께 결핵균 감염 10주 전부터 3주 간격으로 총 3회 등 근육 내로 주사하였다. 마우스 당 GLA-SE는 5㎍, Rv3131 단백질은 5㎍을 주입하였다. GLA-SE는 제조사 (미국 Infectious Disease Research Institute)의 지침서에 따라서 멸균 PBS에 녹인 후, 항원과 함께 희석하고, 최종 부피가 주사 당 200㎕가 되게 하였다. 양성대조군으로서 BCG를 사용하였으며, 3회 주입 중 1회 주입 시에 BCG Pasteur 1173P2(2×10⁵ CFU/마우스)균주를 피하로 투여하였다. 음성대조군은 200㎕의 멸균 PBS 또는 항원이 포함되어 있지 않는 200㎕의 GLA-SE를 사용하였다. 면역화 유도 반응을 시험하기 위한 시험 설계를 도 2에 간략하게 나타내었다.

이후 면역화된 마우스의 비장과 폐에서 결핵 방어에 중요하다고 알려진 인자들의 생성 능력을 확인하였다.

1.2 Rv3131 단백질에 의한 IFN-γ의 생성능 확인

결핵균에 특이한 항원을 발굴하여 IFN-γ의 생성능을 확인하는 것은 새로운 진단항원이나 결핵균 예방 백신 후보 물질을 발굴하는 데 효과적인 방법이다. 따라서 Rv3131 단백질이 항원으로 작용하여 IFN-γ의 생성을 유도할 수 있는 지 확인하기 위하여, 상기 1.1과 같이 면역화 된 마우스의 비장과 폐에서 세포를 분리하여 생체 외(ex vivo)에서 Rv3131 단백질로 자극한 뒤 ELISA 방법으로 항원 특이적 IFN-γ의 생성능을 확인하였다. 한편 양성 대조군으로 제조한 BCG로 면역화 시킨 마우스에는 자극 항원으로 PPD(purified protein derivative)를 사용하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 Rv3131 단백질로 면역화 시킨 마우스의 폐와 비장 세포의 경우 Rv3131 단백질로 자극할 때 IFN-γ의 생성능이 증가한 반면 동일한 그룹을 PPD로 자극하였을 때는 IFN-γ의 생성능에 미치는 효과가 없음을 확인하였다. 한편 양성 대조군(BCG로 면역화 시킨 마우스)의 폐와 비장 세포를 Rv3131 단백질로 자극한 경우 IFN-γ의 생성능에 효과가 없었지만, 세포를 PPD로 자극한 경우는 IFN-γ가 유도되는 것을 확인하였다.

따라서 Rv3131 단백질과 BCG를 주입하여 면역화 시킨 마우스가 성공적으로 면역화 되었으며 Rv3131 단백질이 결핵균에 특이한 항원으로서 IFN-γ을 유도하므로 결핵 예방 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

1.3 Rv3131 단백질에 의한 T 세포 유도능 확인

결핵균 감염 시 결핵균 항원에 대한 특이적 T 림프구가 복제, 분화 하여 작용 T 세포(effector T cell)가 결핵 항원에 대해 면역반응을 일으키며, 이후 면역반응이 사라지게 되면 대부분 사멸하지만 일부는 살아남아 오랫동안 지속되는 기억 T 세포(memory T cell)를 형성하게 된다. 이렇게 유도된 기억 T 세포는 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다고 알려져 있다. 따라서 Rv3131의 주입이 면역화 유도를 통해 T 세포를 효과적으로 유도시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 1.1과 같이 면역화 된 마우스의 폐와 비장 세포를 상기 1.2와 같은 실험군으로 자극하였다. 유세포 분석기(FACSverse, BD)를 통하여 네이티브 T 세포(native T cell), 중심 기억 T 세포(central memory T cell), 작용 기억 T 세포(effentor memory T cell), 작용 T 세포들의 유도를 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 Rv3131 단백질로 면역화 시켰을 때 작용 기억 CD4+ T 세포(effector memory CD4+ T cell)는 폐와 비장 모두에서 크게 유도되었지만 작용 기억 CD8+ T 세포(effector memory CD8+ T cell)는 폐에서만 유도되는 것을 확인했다. 또한 Rv3131 단백질은 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인하였다.

1.4 Rv3131 단백질로 인한 면역화에 의하여 유도된 T 세포의 활성 확인

다기능 CD4+ T 세포(multifunctional CD4+ T cell)는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 모두 분비하며 결핵균을 방어하는데 중요한 숙주의 구성요소 중 하나로 알려져 있다. Rv3131 단백질이 이러한 다기능 T 세포를 유도하는 지 확인하기 위하여, 상기 면역화된 마우스에 결핵균으로 감염시키기 전에 Rv3131 단백질을 주입하여 폐와 비장을 분리하여, 생체 외에서(ex vivo) Rv3131 단백질을 재처리하였다. 대조군은 상기 1.2와 마찬가지로 실험하였다. 재처리된 폐와 비장 세포에 유도되는 항원 특이적 다기능 T 세포를 유세포 분석기로 분석하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 을 모두 분비하는 다기능 CD4+ T 세포가 상대적으로 크게 증가한 반면 CD8+ T 세포에서는 이러한 반응이 일어나지 않음을 확인하였다.

실시예 2 - Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물의 효능 확인

2.1 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염 마우스의 제조

한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(M. tuberculosis K strain)와 M. bovis BCG(Pastuer strain)를 7H9-OADC broth에서 15일간 배양하였다. 배양된 균주들을 수집한 후, 6㎜ 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱하면서 파쇄하였다. 세포 응집물이 가라앉은 다음 상청액을 수거하고 각각 나누어 -70℃에 보관하였다. 이를 해동한 후, 살아있는 균주를 Middlebrook 7H11 아가(Difco, Detroit, MI, USA)에서 단계적 희석 평판 배양하고 카운팅하였다. 마우스에게 결핵균을 접종하기 위해, 상기 결핵균 현탁액을 음파조(sonic bath)에서 가볍게 음파처리하고, pH7.2의 PBS(phosphate buffered saline)로 희석시켜 원하는 수의 결핵균을 수득하였다.

상기 실시예 1.1에서 면역화 시킨 마우스에 병원성이 높은 한국형 결핵균 K 균주를 Glas-Col inhalation device(Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200-250개의 균이 들어가도록 공기 감염시켜서 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염 마우스를 제조했다. 이후 Rv3131 단백질의 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염 결핵의 예방 및 치료 효과를 제조된 감염 마우스를 이용하여 확인하였다.

2.2 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신의 효과 - 조직병리학적 분석

상기 2.1의 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염 마우스 제조 4주 후, 각 실험군의 마우스에서 폐 조직을 적출하여 이를 10% neutral-buffered formalin에 보존시킨 후, 파라핀에 고정시켰다. 고정된 조직을 4-5㎜의 두께로 절편을 만들고 H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 GLA-SE만을 투여한 군(음성 대조군)은 많은 면역세포의 유입과 심각한 염증이 유발된 반면 BCG로 면역화 시킨 군(양성 대조군)과 Rv3131 단백질로 면역화 시킨 군은 면역세포의 유입과 염증이 상대적으로 감소됨을 확인했다.

또한 폐 조직에서 염증 소견을 보이는 부분의 면적을 ImageJ program(National Institutes of Health, MD, USA)을 이용하여 분석한 결과, Rv3131로 면역화 시킨 군은 BCG로 면역화 시킨 군과 동일한 염증 면적을 가지는 것을 확인했다.

따라서, Rv3131 단백질이 BCG와 비슷한 수준으로 면역세포의 유입과 염증을 억제하는 효과가 있고 BCG와 마찬가지로 결핵 예방 백신으로서 사용될 수 있음을 조직병리학적으로 확인하였다.

2.3 Rv3131 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신의 효과 - 결핵균 수의 측정

상기 2.1의 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염 마우스를 제조하여 4주 후, 각 실험군의 마우스에서 폐와 비장 조직을 적출하여 결핵균의 수를 측정하였다. 폐와 비장 조직 내 살아있는 결핵균의 수는 Middlebrook 7H11 아가상에서 전체 기관 균질현탁액을 순차적으로 희석하여 플레이팅한 후, 이를 37℃에서 3~4주간 배양하고 콜로니를 카운팅하는 방식으로 측정하였다. 그 결과를 전체 폐와 비장의 조직 당 평균 log₁₀CFU±표준편차로 나타내었으며, 이를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, Rv3131 단백질을 항원으로 이용하여 면역화 시킨 군은 GLA-SE만으로 면역화 시킨 군(음성 대조군)에 비하여 폐와 비장 조직에서 결핵균 수가 BCG 면역화 군(양성 대조군)과 유사하게 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 Rv3131 단백질은 한국형 고병원성 결핵균 K 균주에 의해서 유발되는 고병원성 결핵을 예방하는 데 탁월한 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3 - 결핵균 감염 후 Rv3131 단백질에 의해 유도되는 다기능 T 세포의 확인

상기 1.1과 같이 마우스를 면역화 시킨 뒤 상기 2.1과 같이 결핵균을 공기 감염시켰다. 결핵균 감염 4주와 10주 후, 폐 세포 및 비장 세포를 분리 후 생체 외(ex vivo)에서 Rv3131 재조합 단백질로 세포를 자극하였다. 그 후 유도되는 항원 특이적 다기능 T 세포를 유세포 분석기를 통해 분석하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

그 결과 도 8 및 도 9에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 Rv3131 단백질을 예방 접종한 마우스의 폐 세포 및 비장 세포에서 항원 특이적 다기능 CD4+ T 세포가 감염 후 4주와 10주에서 모두 크게 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 항원 특이적인 CD8+ T 세포에서는 항원 특이적 반응이 일어나지 않는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 Rv3131 단백질을 예방접종 한 마우스에서 결핵균 방어에 중요한 항원 특이적인 다기능 Th1 세포를 유도하는 효과가 있으므로 Rv3131 단백질이 결핵 예방용 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

제제예 - 의약품의 제조

1.1 산제의 제조

Rv3131 단백질 5㎍

GLA-SE 5㎍

유당 100㎎

탈크 10㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 주사제의 제조

Rv3131 단백질 5㎍

GLA-SE 5㎍

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.3 액제의 제조

Rv3131 단백질 5㎍

GLA-SE 5㎍

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100㎖로 맞춘다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Vaccine composition for tuberculosis containing Rv3131 protein <130> 1_15P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 344 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 1 Met Thr Ala Ala Val Asp Gly Lys Gly Pro Ala Ala Met Asn Thr His 1 5 10 15 Phe Pro Asp Ala Glu Thr Val Arg Thr Val Leu Thr Leu Ala Val Arg 20 25 30 Ala Pro Ser Ile His Asn Thr Gln Pro Trp Arg Trp Arg Val Cys Pro 35 40 45 Thr Ser Leu Glu Leu Phe Ser Arg Pro Asp Met Gln Leu Arg Ser Thr 50 55 60 Asp Pro Asp Gly Arg Glu Leu Ile Leu Ser Cys Gly Val Ala Leu His 65 70 75 80 His Cys Val Val Ala Leu Ala Ser Leu Gly Trp Gln Ala Lys Val Asn 85 90 95 Arg Phe Pro Asp Pro Lys Asp Arg Cys His Leu Ala Thr Ile Gly Val 100 105 110 Gln Pro Leu Val Pro Asp Gln Ala Asp Val Ala Leu Ala Ala Ala Ile 115 120 125 Pro Arg Arg Arg Thr Asp Arg Arg Ala Tyr Ser Cys Trp Pro Val Pro 130 135 140 Gly Gly Asp Ile Ala Leu Met Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly Gly Val 145 150 155 160 Met Leu Arg Gln Val Ser Ala Leu Asp Arg Met Lys Ala Ile Val Ala 165 170 175 Gln Ala Val Leu Asp His Val Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Arg Glu Leu 180 185 190 Thr Ile Trp Ser Gly Arg Tyr Gly Ser Val Ala Gly Val Pro Ala Arg 195 200 205 Asn Glu Pro Pro Ser Asp Pro Ser Ala Pro Ile Pro Gly Arg Leu Phe 210 215 220 Ala Gly Pro Gly Leu Ser Gln Pro Ser Asp Val Leu Pro Ala Asp Asp 225 230 235 240 Gly Ala Ala Ile Leu Ala Leu Gly Thr Glu Thr Asp Asp Arg Leu Ala 245 250 255 Arg Leu Arg Ala Gly Glu Ala Ala Ser Ile Val Leu Leu Thr Ala Thr 260 265 270 Ala Met Gly Leu Ala Cys Cys Pro Ile Thr Glu Pro Leu Glu Ile Ala 275 280 285 Lys Thr Arg Asp Ala Val Arg Ala Glu Val Phe Gly Ala Gly Gly Tyr 290 295 300 Pro Gln Met Leu Leu Arg Val Gly Trp Ala Pro Ile Asn Ala Asp Pro 305 310 315 320 Leu Pro Pro Thr Pro Arg Arg Glu Leu Ser Gln Val Val Glu Trp Pro 325 330 335 Glu Glu Leu Leu Arg Gln Arg Cys 340 <210> 2 <211> 1035 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 2 atgaccgcag ccgttgatgg gaaaggcccg gcagccatga acacccattt cccggacgcc 60 gaaaccgtgc gaacggttct caccctggcc gtccgggccc cctccatcca caacacgcag 120 ccgtggcggt ggcgggtatg cccgacgagt ctggagctgt tctctagacc cgatatgcag 180 ctgcgtagca ccgatccgga cgggcgtgag ttgatcctca gctgtggtgt ggcattgcac 240 cactgcgtcg tcgctttggc gtcgctgggc tggcaggcca aggtaaaccg tttccccgat 300 cccaaggacc gctgccatct ggccaccatc ggggtacaac cgcttgttcc cgatcaggcc 360 gatgtcgcct tggcggcggc cataccgcgg cgacgcaccg atcggcgcgc ctacagttgc 420 tggccggtgc caggaggtga catcgcgttg atggccgcaa gagcagcccg tggcggggtc 480 atgctgcggc aggtcagtgc cctagaccga atgaaagcca ttgtggcgca ggctgtcttg 540 gaccacgtga ccgacgagga atatctgcgc gagctcacca tttggagtgg gcgctacggt 600 tcagtggccg gggttcccgc ccgcaacgag ccgccatcag accccagtgc cccgatcccc 660 ggtcgcctgt tcgccgggcc cggtctgtct cagccgtccg acgtcttacc cgctgacgac 720 ggcgccgcga tcctggcact aggcaccgag acagacgacc ggttggcccg gctgcgcgcc 780 ggcgaggccg ccagcatcgt cttgttgacc gcgacggcaa tggggctggc gtgctgcccg 840 atcaccgaac cgctggagat cgccaagacc cgcgacgcgg tccgtgccga ggtgttcggc 900 gccggcggct acccccagat gctgctgcga gtgggttggg caccgatcaa tgccgacccg 960 ttgccaccga cgccacggcg cgaactgtcc caggtcgttg agtggccgga agagctactg 1020 cgacaacggt gctga 1035

Claims (9)

1. Rv3131 단백질을 포함하는, 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 감염에 의해 발병된 결핵 예방용 백신 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 Rv3131 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 Rv3131 단백질은 서열번호 2의 유전자 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후 결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
7. 제1항 내지 제 4항, 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rv3131 단백질은 다기능 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 백신은 부스터(booster) 백신인 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
   
9. Rv3131 단백질을 유효성분으로 포함하는, 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 감염에 의해 발병된 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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