KR101528909B1

KR101528909B1 - 자기조립 세포외 기질 메트릭스 제조 방법 및 이것의 용도

Info

Publication number: KR101528909B1
Application number: KR1020120113833A
Authority: KR
Inventors: 박귀덕; 배순언; 한동근
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2015-06-12
Also published as: KR20130040748A; US20130101635A1; KR20140128921A

Abstract

본 발명은 세포에서 유래된 세포외 기질로부터 자기조립 메트릭스 제조 및 이를 이용하여 세포 증식 및 분화유도, 나아가 세포치료 응용에 관한 것으로, 구체적으로 특정 세포들로부터 분비되어지는 고유한 세포외 기질을 획득하고 이들을 탈세포화 과정을 통해 세포외 기질만으로 나노파이버가 형성된 자기조립 메트릭스를 만드는 방법에 대한 것이다.
또한, 상기와 같이 제작된 메트릭스는 세포의 대량증식이나 분화 유도에 효과적인 플랫포옴을 제공함으로서 이를 통해 세포치료제 제조 등에 응용할 수 있다.

Description

자기조립 세포외 기질 메트릭스 제조 방법 및 이것의 용도 {Method of the preparation of self-assembled extracellular matrices and their applications}

본 발명은 세포외 기질을 이용한 자기조립 메트릭스 제조, 메트릭스를 세포 증식 및 분화에 이용, 그리고 메트릭스를 세포치료에 활용하는 것에 관한 것이다.

재생의학(regenerative medicine)과 관련하여 인체 이식이 가능한 재생 조직이나 장기의 개발을 위한 조직공학적인 기초 및 응용기술 개발이 진행되고 있다. 예를 들면 줄기세포 증식 및 분화 연구, 세포 및 생체적합 삼차원적 지지체 개발, 그리고 다양한 조직공학적 도구 개발 등이 대표적이다. 줄기세포의 경우 미분화 상태의 줄기세포를 대량으로 증식할 수 있는 기술, 그리고 줄기세포를 특정세포로 충분히 분화를 유도하는 기술이 중요하다. 또한 조직세포 또는 줄기세포를 담지할 수 있는 이차원 및 삼차원적 지지체는 조직 및 장기 개발에 핵심적인 요소이다.

지지체는 주로 합성 및 천연 고분자, 그리고 이들의 복합체를 이용하여 제조되며 다양한 형태와 물성을 가지고 있다. 합성 고분자로는 생분해성의 폴리글리콜산(poly-glycolic acid, PGA), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(poly capro lactone, PCL)과 이들의 유도체 및 공중합체들이 대부분이다. 천연고분자는 콜라겐, 알지네이트, 하이알우론산, 젤라틴, 키토산, 피브린, 실크 및 이들의 변형체 등이 사용되고 있다.

현재 조직공학의 여러 가지 기술적인 제약들 중에서도 지지체와 관련된 핵심적인 기술은 세포에 적합한 표면 환경을 구현하는 기술이다. 지지체의 주요 임무가 세포이식 및 이식된 세포의 생존율 향상에 필요한 환경을 제공하는 것이므로, 세포부착이 일어나는 지지체 표면의 성격은 세포거동을 결정짓는 중요한 요인이 될 수 있다. 세포가 직접 부착하는 표면은 지지체 설계에서 중요한 요소 중 하나인데 일반적으로 세포부착은 합성 고분자보다 천연고분자 성분 위에서 훨씬 용이하다.

이러한 점을 이용하여 주로 세포 표면 리셉터가 인식할 수 있는 세포외 기질 성분 중에서 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 또는 알지닌-글리신-아스파르트산(arginine-glycine-aspartic acid, RGD) 펩타이드를 지지체에 코팅 또는 그래프팅 방법(Bhati et al., 2001, Lin et al., 2009)이 있다. 또한, 콜라겐, 젤라틴, 피브린과 같은 천연고분자를 표면 처리하는 방법(Mcbane et al., 2011)이 있다. 또는 합성 및 천연고분자를 일정 비율로 섞어서 하이브리드 지지체를 제조하는 방법(Ekaputra et al., 2011)이 사용되고 있다. 이러한 방법들은 일정 부분 세포부착 및 분화에 효과적이지만 실제 세포가 자기 환경이라고 인식하는 단계인 생체모방(biomimetic)에 가까운 표면 미세환경이라 할 수 없다.

따라서 현재의 지지체 표면부착을 통한 세포이식 방법으로는 온전한 조직재생을 구현하는데 한계가 있다. 특히 줄기세포의 경우 기존의 플라스틱 배양 플레이트나 천연 고분자가 코팅된 표면 위에서 세포부착 및 증식의 과정을 거치면서 다분화능을 소실하거나 의도하지 않은 방향으로의 분화 등 줄기세포의 거동을 조절하는데 많은 기술적인 어려움이 존재한다. 최근의 연구 결과들은 성장인자와 같은 화학적 신호 이외에도 표면 구조나 기계적 강도와 같은 물리적인 요소들이 줄기세포의 분화 방향성을 결정하는데 아주 중요한 역할을 수행하고 있음을 보여준다(Engler et al., 2006).

이러한 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 기존의 코팅방법에서 벗어나 훨씬 세포 친화적인 방법으로 특정세포가 표면부착 후 일정기간 동안 성장하면서 분비해 내는 세포외 기질 성분을 활용하여 이차원 메트릭스를 개발하였다. 이러한 메트릭스는 세포의 종류별로 다양한 형태로 얻어질 수 있고 실제 세포 배양 시 증식이 우수했고 줄기세포의 경우 특정세포로의 분화에 유리한 미세환경을 제공하였다. 또한 본 발명은 메트릭스 고유의 자연스러운 미세환경(성분 및 구조)위에서 세포를 대량증식 및 분화시킬 수 있으므로 메트릭스와 세포를 결부한 형태의 세포치료제 개발 가능성을 보여준다.

Bhati et al. J Biomed. Mater. Res. 56:74-82, 2001. Lin et al. Acta. Biomater. 5:1416-1124, 2009. Mcbane et al. Biomaterials 32:3584-3595, 2011. Ekaputra et al. Biomaterials 2011. Engler et al. Cell 126:677-689, 2006.

본 발명의 목적은 세포를 이차원 표면에서 배양하여 세포외 기질을 만드는 단계 및 상기 세포가 배양된 이차원 표면을 탈세포화 단계를 포함하는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포외 기질로 구성된 자기조립 자기조립 메트릭스의 세포 부착, 증식 또는 분화에 미치는 효과를 다양한 in vitro 측정 방법을 통해 입증하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포부착 및 증식에 효과적인 메트릭스 미세환경 위에서 계대배양을 통해 대량 증식된 조직세포나 줄기세포를 이용하여 조직재생이나 질환치료를 위한 세포치료에 활용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구체예는 세포외 기질을 만들도록 세포를 이차원 표면에서 배양하는 단계 및 상기 세포가 배양된 이차원 표면을 탈세포화 단계를 포함하는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스 제조 방법을 제공한다.

상기 자기조립 메트릭스 제조 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

상기 방법은, 세포외 기질을 만들도록 세포를 이차원 표면에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "세포에서 유래된 세포외 기질"은 세포를 일정기간 동안 배양할 경우 세포가 분비하는 물질에 의해 생성되는 기질을 의미한다. 또한, "세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스"는 상기의 세포외 기질중에서 세포의 핵을 제거한 뒤 세포가 분비하는 순수한 세포외 기질을 취해서 얻어진 얇은 막을 의미한다.

이렇게 얻어진 세포외 기질은 전체적으로 나노 또는 마이크로사이즈의 파이버 다발이 일정한 패턴에 의해서 형성된 구조를 가지고 있다.

세포외 기질 내에는 세포부착 및 세포신호전달에 필요한 다양한 종류의 단백질이 있으며 또한 줄기세포 분화조절에 필수적인 성장인자와 사이토카인도 존재한다. 그리고 세포가 분비하는 나노파이버 형태의 기질 성분들이 자가조립 나노(self-assembled nanostructure)구조를 이루면서 자연스러운 생체모방 미세환경이 만들어질 수 있다.

또한 세포 종류에 따라서 세포외 기질 성분 및 자가조립 구조가 달라질 수 있기 때문에 다양한 생체모방 구조를 만들 수도 있다. 따라서 세포유래 자기조립 메트릭스는 세포의 부착 및 증식에 효과적이며 특히 물리적인 신호로서 줄기세포의 특정세포로의 분화에 큰 영향을 미칠 수 있다.

상기 제조방법의 첫번째 단계에서 세포배양을 위한 표면의 재료로서 생분해성 유기 고분자, 무기질 성분, 천연고분자 및 금속소재로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 생분해성 유기 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산 및 이들의 공중합체 또는 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 무기질 성분은 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA), 바이페이직 칼슘 포스페이트(biphasic calcium phosphate), 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate, TCP),　 칼슘카보네이트(calcium carbonate) 및 glass ceramics으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 천연고분자는 콜라겐, 알지네이트, 하이얼우론산, 젤라틴, 키토산, 피브린 및 실크로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 금속소재는 티타늄, 스테인레스스틸, 코발트-크롬, 마그네슘, 및 이들의 합금으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 제조방법의 첫번째 단계의 이차원 표면에 배양시키는 세포는 자가 조직세포, 동종 또는 이종 조직세포, 자가 줄기세포, 및 동종 또는 이종 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 자가 조직세포는 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 조골세포(osteoblast), 혈관내피세포(endothelial cell), 혈관내피 전구세포(endothelial precursor cell), 근세포(myoblast), 평활근세포(smooth muscle cell), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neural cell), 심근세포(cardiomyocyte)및 척추 추간판 세포(interverteveral disc cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 동종 또는 이종 조직세포는 섬유아세포, 연골세포, 조골세포, 혈관내피세포, 혈관내피 전구세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포 및 척추 추간판세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 자가 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포및 근육유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 동종 또는 이종 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포 및 근육유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 방법은 이차원 표면에 배양된 세포를 탈세포화 시키는 단계를 포함할 수 있다. 탈세포화 시키는 단계는 세포외 기질로부터 세포를 제거하는 단계로서, 물리적인 방법, 화학적인 방법 또는 이를 혼합한 방법 일 수 있다.

탈세포화의 물리적인 방법으로는 세포를 얼려서 세포내에 형성된 얼음 결정(freezing)이 세포를 깨뜨리는 방법 일 수 있다. 또한, 물리적인 힘으로 ECM에 손상이 생길 수 있는 세포에 직접적으로 압력(pressure)을 주는 방법 일 수 있다. 또한, 마그네틱 바를 이용해서 세포를 교반시켜서(agitation 또는 sonication) 깨뜨리고 제거하는 방법 일 수 있다.

화학적인 방법으로는 탈세포화 용액에 배양된 세포를 일정시간 담그는 과정일 수 있으며, 구체적으로는, 아세트산, 과아세트산(peracetic acid, PAA), 염산, 황산 등의 산성용액을 이용해서 세포 내 성분을 제거하는 방법 일 수 있다. 또한 비이온성 세척제(Non-ionic detergent)인 Triton X-100을 이용해서 세포막을 깨뜨려서 세포 내 성분을 제거하는 방법 일 수 있다. 또한, DNase 와 RNase를 사용하여 세포핵 성분을 제거하는 방법 일 수 있다. 또한, 이온성 세척제(ionic detergent)로는 보통 도데실황산나트륨(SDS, sodium dodecyl sulfate), 데옥시콜산 나트륨(sodium deoxycholate), Triton X-200을 사용하여 세포막과 핵막을 녹여서 단백질-단백질 반응이 제거되면서 세포가 깨지는 방법 일 수 있다. 또한, 세포를 저장액에 담가두었다가 고장액에 넣어서 삼투현상으로 인해 세포가 터지는 방법, 킬레이트제(chelating agent)인 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)를 이용해서 세포를 깨고 제거하는 방법 일 수 있다. 또한, 효소 방법으로 트립신(trypsin)을 이용하여 37^OC 와 pH 8.0 조건에서 EDTA와 함께 사용했을 때 세포를 깨고 세포 안의 내용물을 제거하는 방법 일 수 있다.

또한, 상기 방법은 상기 이차원 표면으로부터 세포외 기질을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세포외 기질은 얇은 막 형태로 얻어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는, 상기 제조방법 첫번째 단계의 세포를 이차원 표면에서 배양하는 동안, 세포를 증식시키거나 세포외 기질 분비를 촉진하기 위해 배양액에 생리활성물질을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스 제조 방법을 제공한다.

상기 생리활성물질은 전환성장인자, 섬유아세포 성장인자, 골 형태발생 단백질, 혈관내피 성장인자, 표피성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 혈소판-유래 성장인자, 신경 성장인자, 간세포 성장인자, 태반성장인자, 및 과립구 콜로니 자극인자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스를 제공한다.

상기 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스는 세포를 이차원 표면에서 배양하여 세포외 기질을 만들게 한 후, 상기 세포가 배양된 이차원 표면을 탈세포화 시키고, 그 후 세포외 기질을 수득하는 단계를 거쳐 제작되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스에 세포를 이식하는 단계 및 상기 이식된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 in vitro 세포증식 또는 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

상기 이식되는 세포는 조직세포 또는 줄기세포일 수 있다.

상기 조직세포는 자가, 동종 또는 이종 조직세포일 수 있으며, 섬유아세포, 연골세포, 조골세포, 혈관내피세포, 혈관내피 전구세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포, 및 척추 추간판 세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

세포 증식은 Brd U 에세이, MTT 에세이 및 CCK-8 에세이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정될 수 있다.

구체적으로 상기 Brd U 에세이는 일반적으로 살아있는 조직에서 세포 증식을 측정하는 방법이다. Brd U는 증식하는 세포에 새롭게 합성되는 DNA 사이에 티민 대신 끼어들어갈 수 있다. Brd U에 특이적으로 반응하는 항체를 이용해서 복제된 DNA 양으로 세포의 증식 정도를 측정할 수 있다.

상기 MTT 에세이는 살아있는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 탈수소 효소작용(dehydrogenases)에 의해서 수용성 기질인 노란색의 MTT 테트라솔리움(tetrasolium)이 청자주색의 비수용성인 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원되는 능력을 분광광도법(spectrophotometry)으로 540 nm 파장에서 측정해서 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다.

상기 CCK-8 에세이 (cell counting kit-8)는 MTT 에세이와 유사한 원리로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에서 탈수소 효소작용으로 수용성 테트라솔리움 염을 분해하여 포르마잔으로 변하는 것을 이용해서 살아있는 세포의 수를 측정하는 방법이다.

또한, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화된 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포, 근육유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 1종을 선택하여 특정세포로의 분화를 유도하는 과정으로서 특정세포로는 연골세포, 조골세포, 혈관내피 전구세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 세포 분화는 분화된 조직 세포에 존재하는 단백질이나 mRNA등을 검출하여 확인할 수 있다. 이는 조직염색, 면역조직염색 또는 PCR 등을 통하여 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스에 줄기세포를 이식하는 단계 및 상기 이식된 줄기세포의 증식 또는 분화를 in vitro에서 측정하는 단계를 포함하는 세포 증식 또는 분화를 측정하는 방법을 제공한다.

상기 줄기세포는 자가, 동종 또는 이종 줄기세포일 수 있다.

상기 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화된 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포, 근육유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 1종을 선택하여 특정세포로의 분화를 유도하는 과정으로서 특정세포로는 연골세포, 조골세포, 혈관내피 전구세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 자기조립 메트릭스에서 분화를 측정시 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진하는 물질을 투입하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포외 기질은 생체 환경과 가장 유사한 물질이다. 그러므로, 상기 조건하에서 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진할 수 있는 물질은 생체내 환경에서 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진하는 물질일 수 있다.

그러므로, 이러한 측정방법을 통하여 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진할 수 있는 물질을 스크리닝 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는 자기조립 메트릭스 위에서 배양을 통해 대량 증식 또는 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공한다.

이때, 상기 세포치료제는 자기조립 메트릭스를 포함할 수 있다. 또한, 상기 세포는 자가, 동종 또는 이종 세포일 수 있다.

상기 세포 중 줄기세포는 배아줄기세포, 역분화된 줄기세포, 골수유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포, 및 근육 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 1종을 선택하여 특정세포로의 분화를 유도하는 과정으로서 특정세포로는 연골세포, 조골세포, 혈관내피 전구세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포 및 심근세포로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한 상기 세포 중 조직세포는 연골세포, 탈분화 연골세포, 조골세포, 혈관내피 전구세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포로 구성된 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 구체예는 상기 세포치료제를 질환을 가진 개체에 투입하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

세포치료제가 적용될 수 있는 질환은 자가면역질환, 심혈관계 질환, 골질환, 및 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포에서 유래된 세포외 기질로 만들어진 자기조립 메트릭스를 제조하는 방법을 이용하여 제작된 메트릭스는 세포의 증식 및 분화에 효과적인 표면 미세 환경을 제공한다. 특히 나노파이버로 이루어진 메트릭스 위에서 줄기세포의 미분화 상태를 상당기간 유지하거나 또는 특정세포로의 분화 촉진이 가능함으로서 줄기세포 치료제 개발이나 조직재생 관련된 중요한 물질 또는 정보를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포에서 유래된 세포외 기질로 만들어진 자기조립 메트릭스를 이용하여 세포 증식 및 특정세포로의 분화에 필요한 플랫폼을 제공할 수 있다. 한편 자기조립 자기조립 메트릭스 위에서 여러 차례 계대배양을 통해 얻어진 많은 수의 세포를 단독 또는 메트릭스와 함께 (matrix-assisted) 세포치료에 활용하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 탈세포화 과정을 통해 얻어진 세포외 기질의 자기조립 메트릭스의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다 (A: FDM, B: PDM, C: CHDM).
탈세포화를 거쳐 만들어진 자기조립 메트릭스의 표면형태가 드러난 이미지로서 나노사이즈의 파이버들이 서로 얽혀서 네트웍을 이루고 있으며 각각의 메트릭스가 특징적인 표면구조를 가지고 있음을 확인하였다.
도 2는 자기조립 메트릭스의 면역형광 염색법을 이용한 분석한 결과를 나타낸 것이다 (A: FDM, B: PDM, C: CHDM).
자기조립 메트릭스를 구성하는 단백질 성분들을 분석하기 위해 대표적인 성분인 파이브로넥틴, 타입 I 콜라겐, 라미닌을 면역형광 염색을 통해 각각의 메트릭스 (FDM, PDM, CHDM)에 대한 정보를 얻을 수 있었다.
도 3은 자기조립 메트릭스 위 골수유래 줄기세포(Bone-marrow-derived cells, BMSC)의 증식을 CCK-8 assay를 통해 나타낸 것이다 (A: FDM, B: PDM, C: CHDM). 메트릭스 위 세포 증식이 control에 비해서도 매우 우수한 것을 확인하였다.
도 4는 자기조립 메트릭스 위 골수유래 줄기세포(BMSC)의 분화효과 (조직학적 염색: Alizarin red staining)를 나타낸 것이다(A: FDM, B: PDM, C: CHDM). 각각의 자기조립 메트릭스 위에서 골수유래 줄기세포의 조골세포 분화를 유도한 후 칼슘형성 및 분포를 조직염색을 통해 확인했을 때, 특정 메트릭스(FDM) 위에서 골 분화가 훨씬 촉진됨을 알 수 있었다.
도 5는 쥐의 연골에서 분리된 연골세포를 자기조립 메트릭스 또는 일반적인 배양 플레이트에서 각각 계대 배양(P4)을 통해 대량증식된 연골세포를 이용하여 각각의 펠렛 형태로 만들었다. 이들을 4 주간 배양한 후 분석 결과 펠렛 사이즈, 연골 특이적 염색, glycosaminoglycan (GAG) 총량 등이 자기조립 메트릭스 위 증식된 연골세포로부터 연골조직 재생능이 더욱 우수함을 확인하였다(PGCP: plate-grown chondrocyte pellet, MGCP: matrix-grown chondrocyte pellet).

이하 본 발명을 다음의 실시 예 및 시험 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 하기의 실시예나 시험 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 커버슬립 위 세포배양

특정 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양이 가능한 커버 슬립(cover slip)에 2x 10⁴cells/cm² 의 밀도로 세포를 접종하여 세포배양 플래이트에서 일정기간 동안 세포를 배양하며 배양액은 2일에 한 번씩 교체해 주었다. 본 발명에 사용 가능한 부착성 세포로는 골수유래 줄기세포 및 다양한 초대 세포(primary cell) 및 세포주가　 포함되는데, 본 연구에서 자기조립 메트릭스 제조에 사용된 세포는 섬유아세포, 조골모세포, 및 연골세포를 사용하였다.

<실시예 2> 자기조립 메트릭스 확보

세포배양 후 5~6일 경과 후 컨플루언트한 세포(confluent cell)를 탈세포화(decellularization) 과정을 거쳐 세포핵을 제거하고, 세포로부터 유래된 세포외 기질 메트릭스를 얻었다.

구체적으로 커버슬립 위 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 탈세포화 용액에 침지시켰다. 탈세포화 용액의 주요 조성은 0.25 % Triton X-100, 10 mM NH₄OH, PBS 용액이 혼합된 형태이다. 샘플을 37^oC의 탈세포화 용액에 2분간 담지한 뒤 용액을 제거한 뒤, 50 unit/ml의 DNase 와 50 mg/ml RNase 용액에 담궈서 37^oC 배양기에서 2시간 동안 처리하였다.

샘플을 꺼내어 PBS로 조심스럽게 세척한 후 얻어진 막 형태의 메트릭스 구조체를 0.1 M 글리신-PBS 용액에 처리 후 4 ^oC에서 보관하였다.

<실시예 3> 자기조립 메트릭스 구조 및 성분 분석

세포로부터 유래된 세포외 기질 메트릭스의 성분 및 표면구조를 공초점 현미경(confocal microscope)(Olympus Fluo View^TM FV1000) 및 주사전자현미경(scanning electron microscope)(SEM; HITACHI S-410, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하는 방법이다. 세포외 기질의 나노구조 분석을 위해서 실시예 2에서 수득한 메트릭스를 PBS로 세척한 후 상온에서 2.5% 글루타르알데하이드/2.5% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정화 뒤 일련의 에탄올/물 혼합액을 사용하여 최종적으로 탈수시켰다. 이 후 진공오븐에 넣어 완전히 건조시킨 후 백금/팔라듐 코팅하여 구조체 형태를 FE-SEM으로 관찰하였다 (도 1).

한편 자기조립 메트릭스의 구성성분을 분석하기 위해 샘플을 PBS로 세척한 후 상온에서 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 15분간 고정화시키고 차가운 아세톤으로 -20 ℃에서 10분 동안 추가로 고정을 시킨 후 상온에서 완전히 건조하였다. 건조된 샘플은 PBS로 다시 세척해 준 뒤, 3% BSA(bovine serum albumin) 용액으로 비특이적인 단백질의 결합을 억제하였다. 그리고 해당 성분의 일차항체, 피브로넥틴(mouse monoclonal IgG), Col 1 (goat polyclonal IgG), 그리고 라미닌(laminin) (goat polyclonal IgG)을 1:50 농도로 1% BSA 용액에 희석하여 샘플을 처리한 뒤 4 ℃에서 12시간 보관한 뒤, 형광물질인 Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon) 또는 Alexa Fluor 594 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)가 결합된 이차 항체인 Alexa Flour 488-conjugated goat anti-mouse IgG (Invitrogen) 또는 DyLight 594-conjugated anti-goat IgG (Jackson Immuno Research)를 1:200농도로 희석하여 상온에서 1 시간 정도 반응한 뒤 PBS로 세척하였다. 그리고 수용성 봉입제(Permanent mounting medium, Vexta Mount^TM)를 이용하여 봉입한 뒤 공초점 형광현미경을 이용하여 해당 성분(피브로넥틴, 제 1형 콜라겐, 라미닌)을 관찰하였다 (도 2).

<실시예 4> 자기조립 메트릭스 위 세포부착 및 증식

실시예 2에서 얻어진 메트릭스 위에 5x10³ cells/cm² 농도로 세포이식하여 배양하면서 세포의 부착 및 증식을 평가하는 단계이다. 시험된 메트릭스는 섬유아세포, 조골모세포, 연골세포로부터 얻어진 메트릭스(FDM(fibroblast-derived matrix), PDM(preosteoblast-derived matrix), CHDM(chondrocyte-derived matrix))를 각각 사용하였다. 이식된 세포는 골수유래 줄기세포(bone marrow stromal cell, BMSC)를 사용하였다. 각기 다른 세포에서 얻어진 메트릭스 위에 줄기세포 이식 후 24시간 이내에 세포 모폴로지는 F-actin을 이용하여 형광 염색된 이미지를 관찰하였고 세포증식 측정은 CCK-8 에세이(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)를 통해 2주 동안의 세포수 변화를 평가하였다. 세포수는 시간에 따라 지속적으로 증가되었으며 특히 메트릭스 위에서 세포의 증식이 우세하였다 (도 3).

<실시예 5> 자기조립 메트릭스 위 골수줄기세포 분화 유도

각각의 메트릭스 위에 쥐의 골수로부터 분리된 BMSC를 이식하고 골형성 배지(osteogenic medium)에서 4주 동안 배양을 통해 BMSC의 골 분화(osteogenic differentiation)를 유도하였다. 실험방법으로는 조직염색, ALP 활성도(alkaline phosphatase activity) 측정, 골 마커 유전자 발현 등을 수행하고 결과 분석을 통해 각각의 메트릭스의 골형성 잠재성(osteogenic potential)을 평가하였다 (도 4).

골 특이적 조직염색(Alizarin red staining) 결과, 특히 A (FDM)와 B (PDM) 그룹에서 골 분화가 훨씬 잘 진행되고 있음을 염색농도 및 분포로 알 수 있었다. 마찬가지로 세포의 ALP 활성도를 측정했을 때 다른 그룹에 비해 A와 B 그룹이 현저히 높은 수준의 활성도를 나타냈다. 그리고 골 특이적 유전자의 발현도 A 그룹이 다른 그룹에 비해서 상대적으로 강하게 유지됨을 확인하였다. 따라서 자기조립 메트릭스가 골수줄기세포의 골 분화에 미치는 긍정적인 영향을 입증할 수 있었다.

<실시예 6> 자기조립 메트릭스 이용한 연골세포 대량증식 및 연골 분화능 연구

우선 메트릭스 제조를 위해 세포배양 플레이트에 preosteoblasts를 이식 후 6일 동안 modified Eagle's medium alpha (α-MEM)에 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/ streptomycin이 포함된 배양액으로 키운 뒤 탈세포화 과정을 진행하여 메트릭스가 점착된 플레이트인 “PDM plate”를 제조하였다. 한편 쥐의 무릎연골에서 분리한 연골세포를 일반적인 세포배양 플레이트에서 3차례 계대배양을 통해 세포증식을 유도하여 확보한 연골세포를 각기 다른 두 개의 플레이트(TCP 와 PDM plate)에 이식하였다. 이 후 동일한 배양 조건으로 이식된 연골세포를 2차례 더 계대배양 한 후 수거하여 1x10⁶개의 연골세포를 포함하는 현탁액을 각각 15ml 튜브에 담고 원심분리기로 10분 동안 1200 rpm에서 처리하였다. 튜브 바닥에 형성된 세포 펠렛을 확인하고 이들을 두 그룹(TCP 배양 vs. PDM plate 배양)으로 나눠 동일조건에서 4 주간 배양하였다. 이 후 연골조직 평가를 위해 조직염색(Safranin O staining), 면역조직염색(immunohistochemistry of type II collagen), 글라이코사아미노글라이칸(GAG) 정량을 실시하여 메트릭스 플레이트 또는 세포배양 플레이트에서 각각 증식된 연골세포의 연골 분화능을 분석하였다(도 5 참조).

그 결과 본 발명의 메트릭스에서 배양한 연골세포의 분화능이 우수함을 확인하였다.

이러한 결과로부터 상기 방법은 연골세포의 배양 및/또는 분화에 효과적으로 이용될 수 있으며, 이러한 방법으로 증식 및/또는 분화시킨 세포는 연골질환 치료에 세포치료제로서 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명에 의해 제조된 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스를 이용할 경우 조직세포 또는 줄기세포의 증식 및 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이렇게 증식 및 분화된 조직세포 또는 줄기세포는 여러가지 용도의 세포치료제로 이용될 수 있다. 따라서, 본원 발명의 제조 방법, 상기 방법으로 수득된 자기조립 메트릭스, 이를 이용한 세포 증식 및 분화방법은 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 이렇게 얻어진 세포를 세포치료제로 활용할 수 있으므로, 본 발명은 산업적으로 다양한 용도에 적용가능하다.

Claims

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1) 자기조립 메트릭스에 골수유래 줄기세포 또는 연골세포를 이식하는 단계; 및
2) 상기 이식된 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 자기조립 메트릭스는 세포외 기질을 만들도록 조골모세포 또는 섬유아세포를 이차원 표면에서 배양하는 단계; 상기 이차원 표면에 배양된 세포를 탈세포화시키는 단계; 및 상기 이차원 표면으로부터 세포외 기질을 수득하는 단계를 포함하는 세포외 기질로 구성된 자기조립 메트릭스 제조 방법에 의해 제조된 것인, in vitro에서 세포증식 또는 분화를 유도하는 방법으로서, 상기 이식되는 세포가 골수유래 줄기세포인 경우 상기 이차원 표면에서 배양되는 세포는 섬유아세포이고, 상기 이식되는 세포가 연골세포인 경우 상기 이차원 표면에서 배양되는 세포는 조골모세포인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 탈세포화시키는 단계는 비이온성 세척제를 포함한 용액 중에 세포를 침지시키는 것인 in vitro에서 세포증식 또는 분화를 유도하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 비이온성 세척제는 Triton X-100인 것인 in vitro에서 세포증식 또는 분화를 유도하는 방법.
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