KR101425653B1 - Cellular Therapeutic Agent Comprising Multipotent Stem Cells Derived From Human Adipose Tissue and Hair Follicle Cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 함유하는 발모유도용 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포, 및 CD34 양성 및/또는 음성세포를 함유하는 두피조직 유래 모낭세포가 일정 혼합비율로 함유되어 있는 발모유도용 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a stem cell for adult stem cell derived from human adipose tissue and a stem cell for scalp tissue derived from scalp tissue. More particularly, the present invention relates to a stem cell for adult human adipose tissue derived stem cells and a stem cell comprising CD34 positive and / Which comprises a hair follicle cell derived from scalp tissue in a predetermined mixing ratio.
본 발명에 따른 발모유도용 세포치료제는 탈모증 및 무모증을 포함하는 모낭형성이 정상적으로 이루어지지 않아 발생하는 증상에 적용하여 발모의 효능을 이끌어 내는데 유용하다.The cell therapy agent for foot-shuffling according to the present invention is useful for eliciting the effect of the hair growth by applying to the symptoms caused by the hair follicle formation including alopecia and asphyxia.
지방조직 유래, 성체 줄기세포, 모낭세포, 탈모치료, 발모 Adipose tissue-derived, adult stem cells, hair follicle cells, hair loss treatment, hair growth
Description
도 1은 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 100배 배율로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the result of observing human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention at a magnification of 100 times.
도 2는 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 스피어배양한 다음, 7일 후에 형성된 스피어를 200배 배율로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 2 is a graph showing the result of observing the sphere formed after 7 days from the human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention at a magnification of 200 times.
도 3은 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 스피어배양한 다음, 12일 후에 형성된 스피어를 200배 배율로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 3 shows the result of observing the spear formed after 12 days from the human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention at a magnification of 200 times.
도 4는 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 CORM-2 함유 배지에서 배양한 후 면역염색한 결과를 100배의 배율로 관찰한 형광사진이다.FIG. 4 is a fluorescence image obtained by culturing human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention in a medium containing CORM-2 and immunostaining the cells at 100-fold magnification.
도 5는 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포로부터 분화된 지방세포를 200배 배율로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 5 shows the results of observing adipocytes differentiated from human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention at a magnification of 200 times.
도 6, 도 7 및 도 8은 발모유도용 모낭세포를 각 동물실험군에 주사한 후 각각 14일, 18일 및 21일째의 군별 발모효과를 관찰한 결과이다.FIGS. 6, 7 and 8 are the results of observing the hair growth effects on the 14th, 18th, and 21st days after injection of hair follicle hair follicle cells into each animal experimental group.
본 발명은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포, 및 CD34 양성 및/또는 음성세포를 함유하는 두피조직 유래 모낭세포가 일정 혼합비율로 함유되어 있는 발모유도용 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a therapeutic agent for foot-and-foot disease cell, which contains human adipose tissue-derived adult stem cells and hair follicle cells derived from scalp tissue containing CD34-positive and / or negative cells at a predetermined mixing ratio.
최근 미용에 관한 관심이 높아지면서 탈모증의 치료에 대한 관심 또한 높아지고 있다. 탈모증이란 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 없는 상태를 말한다. 모발은 생명에 직접 관계되는 중요한 생리적 기능은 없지만 미용적인 관점에서 역할이 매우 크며 이외에도 자외선 차단, 머리 보호 등의 기능이 있다. 탈모가 심한 경우 사회생활을 하는데 문제가 있을 수 있으며 심리적으로도 심각한 영향을 미칠 수 있어서 삶의 질 측면에서 중요하다 (Passchier J. et al., Dermatology , 197:217, 1998; McDonagh, A.J. and Messenger, A.G., Dermatol Clin ., 14:661, 1996).As interest in cosmetics has recently increased, interest in the treatment of alopecia has also increased. Hair loss refers to the state of hair where hair should normally be present. Hair does not have important physiological functions directly related to life, but it plays a very important role from a cosmetic point of view. In addition, it has UV blocking function and hair protection function. If hair loss is severe, it can be a problem in social life, and can have a serious psychological impact, which is important in terms of quality of life (Passchier J. et al ., Dermatology , 197: 217, 1998; McDonagh, AJ and Messenger, AG, Dermatol Clin ., 14: 661,1996).
탈모는 임상적으로 상처가 동반되는 반흔성 탈모와 모발만 빠지는 비반흔성 탈모로 나뉠 수 있다. 반흔성 탈모의 경우 모낭이 파괴되므로 모발이 다시 나지 않는다. 모발은 모낭이라고 하는 곳에서 만들어지며 각 모낭은 주기적으로 활동과 정지의 단계를 거치게 된다(McDonagh, A.J. and Messenger, A.G., Dermatol Clin ., 14:661, 1996). 이러한 모발 주기의 시간적 간격은 신체 부위에 따라 다양한 데 머리털의 경우에는 26년 정도의 성장기(생장기)와 2∼4주간의 퇴행기를 거쳐서 3∼4 개월 정도의 휴식기(휴지기)에 들어가게 된다. 각 모낭은 일생 동안 10∼20회의 모낭 성장 주기(hair follicle growth cycle)를 갖게 된다 (Cotsarelis, G. et al ., Cell, 29;61:1329, 1990).Hair loss can be divided clinically into scarring hair loss accompanied by scarring and non-scarring hair loss that only hair falls. In the case of scarring hair loss, the hair does not come back because the hair follicle is destroyed. Hair is made from a hair follicle, and each hair follicle periodically undergoes activities and stops (McDonagh, AJ and Messenger, AG, Dermatol Clin ., 14: 661,1996). The temporal interval of the hair cycle varies depending on the body part, and in the case of the hair, it takes about 3 to 4 months of rest period (resting period) after 26 years of growth period (growth period) and 2 to 4 weeks of regression period. Each hair follicle has a hair follicle growth cycle of 10-20 times per year (Cotsarelis, G. et al . , Cell, 29; 61: 1329, 1990).
정상인의 경우 머리털의 수는 약 10만개 정도이며, 하루에 자라는 길이는 평균 0.37mm 정도 된다(한 달에 약 1cm 정도 성장). 보통의 경우 머리털의 85∼90%는 성장기에 있고 나이를 먹음에 따라 성장기 모낭의 수가 감소한다. 따라서 10∼15%의 모낭이 퇴행기나 휴지기에 있으며, 하루 평균 50∼60여 개 정도의 머리털이 정상적으로 빠지며 하루 100개 이상 빠지면 탈모증을 의심해야 한다. The average number of hair in a normal person is about 100,000, and the average length of a day is about 0.37mm (about 1cm grows per month). Usually, 85 to 90% of the hair is in growth phase and the number of growing hair follicles decreases with age. Therefore, 10-15% of the hair follicles are in the regressive or dormant period, and the average hair loss is about 50 ~ 60 per day. If you lose more than 100 hair per day, you should suspect hair loss.
탈모의 원인에는 첫 번째로 남성호르몬의 일종인 DHT(다이하이드로테스토스테론)이 모낭에 영향을 주어 단백질 합성 저하와 모낭에 직접 손상을 주어 탈모가 발생한다는 설과 남성호르몬(testosterone)이 세포내에 있는 수용체인 5α리덕타아제(환원효소)와 결합하여 활동하는데 그 산물인 DHT(다이하이드로테스토스테론)이 DNA전사 과정에서 모낭에 영향, 즉 단백질 합성저해, 모낭의 손상등으로 탈모가 발생한다는 남성호르몬 영향설이 있다. 두 번째로는 탈모 유전자를 받아 남성호르몬의 영향에 의해 발생한다는 것과 탈모증 자체는 유전이 아니고, 탈모가 되기쉬운 체질을 조상으로부터 유전 받는다는 유전적 탈모설이 있으며 세 번째로는 스트레스로 인한 탈모설 네 번째로는 두피는 20세 전후까지 두개골은 30세전 후까지 발달하는데, 이로인해 두피가 얇아지고, 혈류장애가 원인이 되어 탈모가 된다는 두개골 발달로 인한 탈모설, 마지막으로 노화에 의해 탈모가 발생한다는 설 등 여러 가지 원인이 있는 것으로 보고되고 있다 (Sheen, M., Fighting Hair Loss, USA Library Publishing, Inc. p. cm. 97090157, 1966).The first cause of hair loss is DHT (dihydrotestosterone), which is a type of male hormone, which affects the hair follicle, leading to loss of protein synthesis and direct damage to the hair follicle resulting in hair loss, and testosterone is a receptor (DHA), which interacts with 5α reductase (reductase), is involved in the transcription of DNA, which is the result of inhibition of protein synthesis and damages of hair follicles. have. The second is that it is caused by the influence of the male hormone by receiving the hair loss gene, and that the hair loss itself is not hereditary, there is the genetic hair loss theory that the constitution which is likely to be hair loss is inherited from the ancestor, The skulls develop until the age of 30 years before and after 20 years of age. The scalp is thinned, hair loss is caused by blood flow disorder, hair loss due to development of skull, and hair loss due to aging. It has been reported that there are several causes (Sheen, M., Fighting Hair Loss , USA Library Publishing, Inc. p. cm. 97090157, 1966).
탈모의 치료법으로 현재 가장 많이 쓰이고 있는 수술 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가모발이식(자기모발이식)이며, 프로페시아 및 미녹시딜을 사용하는 약물치료가 널리 시술되고 있다. 약물치료의 효과는 투여할 당시에는 그 발모효능이 나타나지만 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되며, 미녹시딜의 경우에는 성기능 장애 등의 부작용이 단점으로 알려져 있다 (Bouhanna, P., Dermatol Surg ., 29:1130, 2003; Thiboutot, D., Arch Dermatol ., 135:1417, 1999; Messenger, A.G. and Rundegren J., Br J Dermatol ., 150:186, 2004).Currently, the most commonly used surgical procedure for treating hair loss is hair transplantation (hair transplantation) using transplanted hair using its own hair, and drug therapy using propecia and minoxidil is widely practiced. The effect of the drug treatment is shown at the time of administration, but when the treatment is stopped, hair loss is resumed. In the case of minoxidil, adverse effects such as sexual dysfunction are known as disadvantages (Bouhanna, P., Dermatol Surg ., 29: 1130, 2003; Thiboutot, D., Arch Dermatol ., 135: 1417,1999; Messenger, AG and Rundegren J., Br J Dermatol ., 150: 186, 2004).
최근에 도입된 치료방법으로는 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료를 들 수 있다. 그러나 유전자 치료는 치료의 효능성, 치료비용, 안정성 등에 대해 불확실하고, 치료법이 안전하게 현실화되기까지는 상당한 기간이 걸릴 수 있다는 단점 때문에 임상적용이 용이하지 않다.Recently, the treatment methods that have been introduced include gene therapy that is performed by transferring genes associated with hair loss to hair follicles or blocking gene expression. However, gene therapy is not easy for clinical applications due to the uncertainty about the efficacy of the treatment, the cost of treatment, the stability, and the disadvantage that it can take a considerable time for the therapy to become safe.
유전자 치료 외에 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법도 최근 부각되고 있다. 이 방법은 줄기세포가 가지고 있는 다분화능을 이용한 탈모 치료방법은 탈모 또는 무모의 증상을 나타내는 곳에 줄기세포를 주입하여 모낭세포로 분화하도록 유도하는 과정으로 시술된다.In addition to gene therapy, hair loss treatment methods using stem cells have recently been highlighted. This method is performed by inducing stem cells to differentiate into hair follicle cells by injecting stem cells into a place where symptoms of hair loss or hairlessness are manifested.
줄기세포(stem cells)란 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 배아 줄기세포라 불리는 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells) 및 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.Stem cells can be divided into totipotent stem cells, pluripotent stem cells called multipotent stem cells, and multipotent stem cells called embryonic stem cells.
상기 분류 중에서 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다. 이러한 성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나, 최근에는 성체줄기세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있다.Among these classes, multipotent stem cells are stem cells capable of differentiating into cells and tissues specific to the tissues and organs containing the cells, and are used for growth and development of tissues and organs of the fetal period, neonatal period and adult period Development is, of course, involved in maintaining the homeostasis of adult tissues and inducing regeneration in tissue damage, and tissue-specific multipotent cells are collectively called adult stem cells. These adult stem cells are derived from cells already existing in various organs of the human body and are developed into stem cells. In recent years, however, experiments using adult stem cells to differentiate into various tissues such as hepatocytes have been successful.
상기 다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었으나, 그 후 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었으며, 최근에는 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(Tomas et al ., Nat . Cell Biol., 3:778, 2001; Jiang et al ., Nature, 418:41, 2002; Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Cousin et al ., BBRC., 301:1016, 2003; Miranville et al ., Circulation , 110:349, 2004; Seo et al ., BBRC., 328:258, 2005).The pluripotent stem cells were first isolated from adult bone marrow, but then from skin, blood vessels, muscles and brains, and recently, adipose tissue has been found to be a new source of multipotential stem cells (Tomas et al ., Nat . Cell Biol ., 3: 778,2001; Jiang et al . , ≪ / RTI > Nature 418: 41,2002; Sampaolesi et al ., Science , 301: 487, 2003; Cousin et al ., BBRC ., 301: 1016, 2003; Miranville et al ., Circulation , 110: 349, 2004; Seo et al ., BBRC ., 328: 258, 2005).
지방조직은 지방 흡입술(liposuction) 과정에서 부수적으로 얻을 수 있고, 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있다. 상기 조직에 포함되어 있는 지방 유래 줄기세포는 지금까지 상피세포, 연골세포, 골 형성, 지방 세포, 신경세포, 연골세포, 및 근육세포 등으로 분화할 수 있다는 보고가 있으며, 최근 연구에서는 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 확인되었다 (Zuk et al ., Tissue Eng ., 7:211, 2001; Rodriguez et al ., BBRC., 315:255, 2004; Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005; Safford et al ., BBRC, 294:371, 2005; Biomaterials, 25:3211, 2004; Fujimura et al ., BBRC, 333:116, 2005; 미국특허 6,777,231).The adipose tissue can be obtained incidentally during the liposuction process, and the adipose tissue can be extracted in a large amount. It has been reported that adipose-derived stem cells contained in the above-described tissues can be differentiated into epithelial cells, cartilage cells, bone formation, adipocytes, neurons, chondrocytes, and muscle cells. And ability to promote neural differentiation (Zuk et < RTI ID = 0.0 > al ., Tissue Eng . , 7: 211, 2001; Rodriguez et al ., BBRC ., 315: 255, 2004; Brzoska et al ., BBRC , < / RTI & gt ; 330: 142, 2005; Safford et al ., BBRC , 294: 371, 2005; Biomaterials , 25: 3211, 2004; Fujimura et al ., BBRC , 333: 116, 2005; U.S. Patent 6,777,231).
임상에서는 현재 다양한 분야에서 성체줄기세포를 응용하고 있다. 예를 들면 각막 상피 줄기세포를 각막이식에 응용하거나, 조혈모세포를 자가조직의 부분적인 줄기세포 이식과 유전자 치료에 적용한 보고가 있다(Cotsarelis, G. et al ., Cell 57, 201, 1989; Tsai, R.J. et al., N. Engl . J. Med ., 343, 86,2000; Bernstein, I.D. et al ., Blood Cells , 20:15, 1994). 따라서 탈모나 화상과 같은 다른 피부 질병도 이와 마찬가지로 모낭 줄기세포의 동정과 유전자 분석과 같은 방법으로 치료의 발전을 기대할 수 있는 것으로 여겨진다.In clinical practice, adult stem cells are now being applied in various fields. For example, it has been reported that corneal epithelial stem cells are used for transplantation of corneas or hematopoietic stem cells are applied to partial stem cell transplantation and gene therapy of autologous tissue (Cotsarelis, G. et al . , Cell 57, 201, 1989; Tsai, RJ et al ., N. Engl . J. Med ., 343, 86, 2000; Bernstein, ID et al . , Blood Cells , 20: 15,1994). Therefore, it is considered that other skin diseases such as hair loss and burn can also expect the development of treatment by methods such as identification of hair follicle stem cells and genetic analysis.
표피에서의 줄기세포 개념은 30년 전부터 이미 논의되어 왔으며, 두피에 존재하는 성체 줄기세포는 모낭 돌출부분(bulge region)에서 얻을 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 또한 상기 돌출부분(bulge region)에서의 모낭 줄기세포는 CD34 세포표면 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 줄기세포와 관련된 발모기전에 대해 활발한 연구가 이루어지고 있다. 최근 연구에서는 모낭형성과정에서 지방세포가 모낭 주변에 혈관생성을 유도하면서 모낭발달에 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되었다 (Cotsarelis, G. et al ., Cell , 61: 1329, 1990; Lavker, R.M. et al., J Invest Derm , 101:16, 1993; Morris, R.J., Potten C.S., J Invest Derm , 112:470, 1999; Trempus, C.S. et al ., J Invest Dermatol, 120:501, 2003; Blanpain, C. et al., Cell , 3;118:635, 2004; Hausman, G.J., et al., Am . J. Anatomy, 161:85, 2005).The concept of stem cells in the epidermis has been discussed for over 30 years, and adult stem cells present in the scalp are thought to be obtained from the bulge region. In addition, hair follicle stem cells in the bulge region are known to express CD34 cell surface proteins, and active studies have been conducted on the hair growth mechanism associated with such stem cells. Recent studies have shown that adipocytes play an important role in follicular development while inducing angiogenesis around hair follicles (Cotsarelis, G. et al . , Cell , 61: 1329, 1990; Lavker, RM et al ., J Invest Derm , 101: 16, 1993; Morris, RJ, Potten CS, J Invest Derm , 112: 470,1999 ; Trempus, CS et al . , ≪ / RTI > J Invest Dermatol, 120: 501, 2003; Blanpain, C. et al ., Cell , 3: 118: 635, 2004; Hausman, GJ, et al., Am . J. Anatomy , 161: 85, 2005).
줄기세포 사용하여 발모효과를 유도하기 위해서는 많은 양의 줄기세포가 필요하지만 아직까지 조직에서 분리한 줄기세포를 임상에 적용할 수 있을 정도로 충분한 양을 얻을 수 있는 배양기술이 미미하며, 줄기세포를 나타내는 표지 단백질도 아직까지 정확하게 확립되지 않아 줄기세포를 이용한 탈모치료방법을 실제로 임상에 적용하기에는 기술력이 상당히 미흡한 상태이다.In order to induce hair growth by using stem cells, a large amount of stem cells are required. However, there are only a few culturing techniques that can obtain a sufficient amount of stem cells isolated from tissues so as to be clinically applicable. Since the labeling proteins have not been established yet, the techniques for treating hair loss using stem cells have not been sufficiently applied to clinical practice.
이에 본 연구자들은, 보다 효율적인 발모효능을 유도하고 탈모효능에 유의한 양의 줄기세포를 확보하여 탈모치료에 적용할 수 있도록 예의 노력한 결과, 지방조직 유래 성체줄기세포와 두피조직 유래 모낭세포를 적절한 비율로 혼합하여 조성된 세포치료제를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.As a result, the present inventors have found that stem cells derived from adipose tissue and hair follicles derived from scalp tissue can be cultured in an appropriate ratio The present invention has been completed.
본 발명의 목적은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 발모유도용 세포치료제를 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a therapeutic agent for foot-and-breast cancer cells containing human adult tissue-derived adult stem cells and hair follicle-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
본 발명의 다른 목적은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 탈모치료제 및 무모증치료제를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a hair loss treatment agent and an aspirin treatment agent containing adult stem tissue-derived adult stem cells and scalp tissue-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 발모유도용 세포치료제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cell therapy agent for foot-and-foot disease comprising human adult tissue-derived adult stem cells and scalp tissue-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
본 발명은 또한, 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 탈모치료제 및 무모증치료제를 제공한다.The present invention also provides a hair loss treatment agent and an asymmetry treatment agent comprising adult stem tissue-derived adult stem cells and hair follicle-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 일 관점에서, 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 발모유도용 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates, in one aspect, to a cell therapy agent for foot and breast cancer, which comprises human adult tissue-derived adult stem cells and scalp tissue-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
본 발명의 두피조직 유래 모낭세포는 CD34 양성세포 및/또는 CD34 음성세포를 함유할 수 있다.The hair follicle cells derived from the scalp tissue of the present invention may contain CD34-positive cells and / or CD34-negative cells.
본 발명에서 ‘발모유도’는 탈모 부위 또는 무모 부위에 모낭을 형성하여 털이 나도록 유도하는 능력을 말한다.In the present invention, 'hair growth induction' refers to the ability to induce hair follicles to form hair follicles at hair loss sites or hairless areas.
본 발명의 인간 지방조직 성체 줄기세포는 인간 지방 조직의 지방흡입술(liposuction)에서 부수적으로 얻어지는 지방세포와 식염수 혼합물에서 플라스크 배양용기에 부착하여 배양함으로써 얻을 수 있다.The human adipose tissue adult stem cells of the present invention can be obtained by adhering and culturing adipocyte and saline mixture obtained in liposuction of human adipose tissue to a flask culture container.
본 발명에서 '지방흡입술(liposuction)'은 지방 제거의 미용 또는 성형 수술의 한 기법으로서, 지방질 부분을 절개하여 진공 펌프로 지방질을 뽑아내는 것 또는 주사기의 압력으로 뽑아내는 것을 의미한다.In the present invention, 'liposuction' is a technique of cosmetic or cosmetic surgery for removing fat, which means cutting the lipid part and extracting the fat with a vacuum pump or extracting it with the pressure of the syringe.
본 발명의 '성체 줄기세포'는 제대혈이나 성장을 마친 성인의 골수와 혈액 등에서 추출해낸 것으로, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포이고, 여기에는 조혈모세포와 재생의학의 재료로 각광받고 있는 중간엽줄기세포, 신경줄기세포 등이 있다. 이밖에 간이나 표피, 췌장 등에도 줄기세포가 있다. 상기 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.The 'adult stem cells' of the present invention are extracted from bone marrow and blood of a cord blood or grown adult, and are primitive cells just before being differentiated into cells of specific organs such as bone, liver, and blood. These cells include hematopoietic stem cells and regenerative medicine And mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc., which are attracting attention as materials of the nervous system. In addition, there are stem cells in the liver, epidermis, and pancreas. The adult stem cells are difficult to proliferate and tend to differentiate easily. Instead of using a variety of adult stem cells, they can be used for long-term regeneration required in actual medicine, .
본 발명의‘CD34 양성세포’와 ‘CD34 음성세포’도 마찬가지로 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정 세포로의 분화능을 갖는 줄기세포가 포함되어 있다.The 'CD34 positive cells' and 'CD34 negative cells' of the present invention also include stem cells having the characteristics of stem cells, that is, undifferentiated, indefinite proliferation and ability to differentiate into specific cells.
본 발명에서의 발모유도를 위해서는 인간 지방조직 및 모낭을 포함하는 두피에서 분리된 성체 줄기세포인 것이 바람직하며, 자가 성체 줄기세포인 것이 보다 바람직하다.In order to induce hair growth in the present invention, adult stem cells preferably separated from scalp including human adipose tissue and hair follicles are preferable, and autologous stem cells are more preferable.
본 발명의 인간 지방조직흡입으로 얻어진 성체줄기세포를 함유하는 세포 배양액에서 목적하는 표면항원을 발현하고 있는 다분화능의 줄기세포를 수득하는 방법은 세포 선별기능을 가진 세포분석기를 사용한 FACS법, 마그네틱 비드를 사용하는 MACS법, 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법 등을 포함하는 당해 분야에서 통상의 기술을 사용하여 분리할 수 있다.The method for obtaining a multipotent stem cell expressing a desired surface antigen in a cell culture fluid containing adult stem cells obtained by inhalation of human adipose tissue according to the present invention comprises a FACS method using a cell analyzer having a cell sorting function, , A panning method using an antibody that specifically recognizes multipotential stem cells, and the like can be used.
본 발명의 두피조직유래 모낭세포는 CD34 양성세포 단독, CD34 음성세포 단 독, 또는 CD34 양성세포 및 음성세포가 혼합된 상태로 발모유도능이 나타나도록 제조할 수 있으며, 혼합된 상태로 제조하는 것이 바람직하다.The hair follicle derived from the scalp tissue of the present invention can be produced so as to exhibit hair growth inducing ability in a state where CD34-positive cells, CD34-negative cell lysate, or CD34-positive cells and negative cells are mixed, Do.
본 발명의 발모유도용 세포치료제에 함유되는 CD34 양성세포 및 CD34 음성세포는 일정비로 서로 혼합되어야 최대의 발모유도효능을 나타낼 수 있다. 따라서 상기 두 종의 세포의 혼합비율은 100:1 내지 1:100일 수 있으며, 바람직하게는 50:1 내지 1:50, 더욱 바람직하게는 20:1 내지 1:20, 가장 바람직하게는 1:2 내지 1:5일 수 있다. 일 회 투여량은 1일 당 104 ~ 108 개의 세포를 함유하도록 할 수 있으나, 상기의 양은 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있으며, 투여자의 탈모상태 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 처방될 수 있다. 또한, 투여 횟수는 일 회 또는 피험자의 상태에 따라 수 회 투여할 수 있다.The CD34-positive cells and CD34-negative cells contained in the therapeutic agent for footwashing cell of the present invention should be mixed with each other at a certain ratio to exhibit the maximum hair growth inducing effect. Therefore, the mixing ratio of the two kinds of cells may be 100: 1 to 1: 100, preferably 50: 1 to 1:50, more preferably 20: 1 to 1:20, most preferably 1: 2 to 1: 5. The dose may be 10 4 to 10 8 cells per day, but the amount can be determined by a person skilled in the art and depends on factors such as the patient's hair loss state and responsiveness It can be prescribed variously. The number of administrations may be administered once or several times depending on the condition of the subject.
본 발명의 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포는 두피조직유래 모낭세포와 혼합하여 제조할 수 있다.The human adipose tissue-derived adult stem cells of the present invention can be prepared by mixing with hair follicular cells derived from scalp tissue.
본 발명의 발모유도용 세포치료제에 함유되는 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포는 일정비로 두피조직 모낭세포와 혼합되어야 최대의 발모유도효능을 나타낼 수 있다. 따라서 상기 두 종의 세포의 혼합비율은 100:1 내지 1:100일 수 있으며, 바람직하게는 50:1 내지 1:50, 더욱 바람직하게는 20:1 내지 1:20, 가장 바람직하게는 1:9 내지 9:1일 수 있다. 일 회 투여량은 1일 당 104 ~ 108 개의 세포를 함유하도록 할 수 있으나, 상기의 양은 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있으며, 투여자의 탈모상태 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 처방될 수 있다. 또한, 투여 횟수는 일 회 또는 피험자의 상태에 따라 수 회 투여할 수 있다.The human adipose tissue-derived adult stem cells contained in the therapeutic agent for foot-shuffling cell of the present invention can exhibit the maximum hair growth inducing effect by mixing with scalp tissue hair follicle cells at a certain ratio. Therefore, the mixing ratio of the two kinds of cells may be 100: 1 to 1: 100, preferably 50: 1 to 1:50, more preferably 20: 1 to 1:20, most preferably 1: 9 to 9: 1. The dose may be 10 4 to 10 8 cells per day, but the amount can be determined by a person skilled in the art and depends on factors such as the patient's hair loss state and responsiveness It can be prescribed variously. The number of administrations may be administered once or several times depending on the condition of the subject.
본 발명의 발모유도용 세포치료제에 함유된 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포는 체내에 투여한 후 지방세포로 분화하여 함께 혼합투여한 모낭세포가 발모 기능을 원활하게 수행하도록 혈관생성 등의 간접적 역할로 발모효능에 상승적 효과를 유도할 수 있으며, 또한, 모낭세포 자체로 분화하여 발모기능에 직접적으로 관여할 수 있다.The human adipose tissue-derived adult stem cells contained in the therapeutic agent for foot-and-mouth disease cell of the present invention are indirectly acting as an angiogenesis such that the hair follicle cells, which are administered into the body and differentiated into adipocytes and mixed and administered together, Can induce a synergistic effect on the hair growth effect, and can also directly participate in the hair growth function by differentiating into the hair follicle cell itself.
본 발명은 다른 관점에서 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포를 유효성분으로 함유하는 탈모치료제 및 무모증치료제에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a hair loss therapeutic agent and an anti-hair remedy comprising human adult tissue-derived adult stem cells and hair follicle-derived hair follicle cells as an effective ingredient.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제는 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여 등을 포함하는 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으며, 주로 탈모 또는 발모를 필요로 하는 부위에 직접 주입하는 방법으로 투여할 수 있다.The parenteral administration, including intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or local administration, is preferable for the cell therapy agent for treating foot foot oil, hair loss treatment agent and anti-hair treatment agent, Or local administration, and can be administered by a method of direct injection into a site mainly requiring hair loss or hair growth.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제는 소위 ‘대머리’로 인식되는 전형적인 남성형 탈모 및 폐경 또는 난소제거 수술 후 발생할 수 있는 여성형 탈모증에 대한 치료를 위하여 두피에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 예를 들면, 외상으로 인한 흉터로 모발이 손상된 부위, 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.The cell treatment agent, hair loss treatment agent and hair loss treatment agent of the present invention of the present invention can be applied not only to a typical male hair loss recognized as a so-called 'baldness' but also to a scalp for treatment of female alopecia resulting from postmenopausal or ovarian elimination surgery It can be applied to any part of the body that needs hair growth. For example, it can be used for areas where hair has been damaged by trauma, or for improving the condition of wide forehead or M-type forehead, eyelashes or eyebrows and aspiration for simple cosmetic effects.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutically acceptable carrier to be contained in the therapeutic agent for hair loss breast cancer cell line, the hair loss treatment agent and the treatment for alopecia of the present invention are those conventionally used in the formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, Calcium carbonate, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and minerals Oils, and the like, but are not limited thereto.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.In addition to the above components, the cell therapeutic agent, hair loss therapeutic agent and asymmetric therapeutic agent for foot milk of the present invention may further comprise a lubricant, a wetting agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations include, but are not limited to, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The cell therapeutic agent for hair loss breast cancer according to the present invention, the hair loss treatment agent and the treatment for asymmetry may be prepared by using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by uniting into a multi-dose container, and may further include a dispersant or a stabilizer.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제는 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 발모 유도 약물요법 또는 수술요법 등과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하였을 경우 극대화된 효능을 나타낼 수 있다.The cell treatment agent for hair loss breast cancer of the present invention, the hair loss treatment agent and the treatment for asymmetry may be used as a single therapy but may be used together with other conventional hair growth induction drug therapy or surgery therapy. Can show efficacy.
본 발명의 발모유도용 세포치료제, 탈모치료제 및 무모증치료제와 함께 이용 될 수 있는 약물제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드, 싸이옥톨(Cyoctol) 및 RU58841를 포함하는 남성 호르몬 또는 DHT 유발 억제제, 부갑상선 호르몬(PTH) 억제제, 미녹시딜, 버셀린(Burserelin), 혈액순환 개선제 및 메소테라피에 응용되는 조성물 등을 들 수 있으며, 수술요법으로는 모발이식, 두피 피판술, 두피 축소술 등을 들 수 있다.Drug formulations that may be used in combination with the cell therapy drug for hair loss breast cancer, anti hair remedy, and anti-hair treatment agent of the present invention include male hormone or DHT induction inhibitors including Finasteride, Dutasteride, Cyoctol and RU58841, A hormone (PTH) inhibitor, minoxidil, Burserelin, a composition for improving blood circulation and mesotherapy, and the like. Examples of surgery include hair transplantation, scalp flap, and scalp reduction.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example 1: 인간 지방조직에서 1: In human adipose tissue 다분화능Multiparameter 줄기세포의 분리 Isolation of stem cells
서울대학교 유방암센터에서 분양받은 여성의 유방조직에서 지방조직을 분리하여 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라겐분해효소 타입1 (1 mg/ml)을 첨가한 DMEM배지를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해하였다. 다음으로, PBS로 세척한 후, 1000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 제거하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100 ㎛ 매쉬를 사용하여 부유물을 제거한 다음, PBS로 다시 세척하였다. DMEM(10% FBS, 2 mM NAC, 0.2 mM 아스코르브산)배지에서 배양하고, 하룻밤 지난 후 배양용기 바닥에 부착되지 세포들은 PBS로 세척하고, 2 mM NAC, 0.2 mM 아스코르브산, 0.09 mM 칼슘, 5 ng/ml rEGF, 50 ㎍/ml BPE, 5 ㎍/ml 인슐린 및 74 ng/ml 하이드로코티손를 함유한 케라티노사이트-SFM 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 다분화능 줄기세포를 분리하였다 (도 1).The adipose tissues were isolated from the breast tissue of women who were delivered from the Seoul National University Breast Cancer Center and washed with PBS. The tissues were finely cut and then cultured in DMEM supplemented with collagenase type 1 (1 mg / ml) Deg.] C for 2 hours. Next, the cells were washed with PBS and then centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and the pellet remaining on the bottom was washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed using a 100 μm mesh and then washed again with PBS. After overnight incubation, cells that did not adhere to the bottom of the culture vessel were washed with PBS and resuspended in 2 mM NAC, 0.2 mM ascorbic acid, 0.09 mM calcium, 5 mM NaCl, The pluripotent stem cells were separated by culturing with keratinocyte-SFM medium containing ng / ml rEGF, 50 / / ml BPE, 5 / / ml insulin and 74 ng / ml hydrocortisone every 2 days (Fig. 1) .
실시예Example 2: 지방 유래 2: locally derived 다분화능Multiparameter 줄기세포의 면역학적 특성 Immunological characteristics of stem cells
실시예 1에서 수득한 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리한 다음, 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 각 샘플에 대해 1×105 개의 세포를 분주하였다. 각 세포에 대해서는 항체(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 첨가하여 얼음에서 40분 동안 방치하여 결합을 유도하였다. 반응이 종결되면 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후에는 최종적으로 1% 파라포름알데하이드를 첨가하여 고정하고, FACS방법을 통하여 얻어진 다분화능 줄기세포의 표면항원을 분석하였다 (표 1).The human adipose tissue-derived multipotent stem cells obtained in Example 1 were washed with PBS, treated with trypsin, and then the cells were harvested and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, washed with a mixture of 2% FBS and PBS, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After the supernatant was discarded, the cells were suspended in PBS and 1 × 10 5 cells were added to each sample. For each cell, an antibody (R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody) was added and allowed to stand for 40 minutes on ice to induce binding. After the reaction was completed, the supernatant was removed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes and then washed twice with PBS. After washing, final 1% paraformaldehyde was added and fixed. The surface antigen of the multipotent stem cells obtained through the FACS method was analyzed (Table 1).
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포는 CD73에 대해서는 91%, CD90에 대해서는 97%, CD29에 대해서는 96%, CD44에 대해서는 83%, CD105에 대해서는 80%의 양성반응을 보였다. 또한, 다른 항원에 대한 면역표현형을 확인한 결과, CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내었다. As a result, as shown in Table 1, the human adipose tissue-derived adult stem cells of the present invention were 91% for CD73, 97% for CD90, 96% for CD29, 83% for CD44, 80% Positive response. In addition, the immunophenotypes for the other antigens were confirmed. As a result, the immunological characteristics of all of the CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 and HLA-DR were negative.
실시예Example 3: 인간 지방조직 3: Human adipose tissue 다분화능Multiparameter 줄기세포의 Stem cell 스피어Spear (( spheresphere ) 형성) formation
실시예 1에서 수득된 유방의 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 10 μM CORM-2, 5ml antibiotic antimycotic solution(100X), 1 ㎍/ml 하이드로코티손, 5 ㎍/ml 인슐린, 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF, B27 및 β-멀캅토에탄올을 함유한 무혈청 MEBM 배지를 함유하는 6웰 세포배양기의 각 웰에 5×104~1×105 개/ml의 세포를 분주하여 배양한 결과, 3 ~ 7일째부터 스피어(sphere)를 형성하기 시작하였고, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 7 ~ 10일째에도 줄기세포가 증식해서 스피어를 형성하였다.The breast adipose tissue-derived multipotent stem cells obtained in Example 1 were inoculated into 10 μM CORM-2, 5 ml antibiotic antimycotic solution (100 ×), 1 μg / ml hydrocortisone, 5 μg / ml insulin, 20 ng / The cells were cultured at 5 × 10 4 to 1 × 10 5 cells / ml in each well of a 6-well cell culture medium containing serum-free MEBM medium containing ng / ml FGF, B27 and β-mercaptoethanol , The sphere began to form on days 3 to 7, and as shown in FIGS. 2 and 3, the stem cells proliferated even after 7 to 10 days to form spheres.
한편, 실시예 1에서 수득된 줄기세포 5×104 개/ml을 24웰 세포배양용기의 각 웰에 분주한 다음, 계대 횟수에 따라 스피어수를 조사하였다 (표 2). 그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 스피어를 계대함으로써 장기간 증식 및 세포 분화성질의 유지가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도4에 나타난 바와 같이, Oct4가 양성 발현하는 것으로 보아 미분화 상태를 유지하며 우수한 증식율을 가진다는 것을 알 수 있었다.On the other hand, 5 × 10 4 / ml of the stem cells obtained in Example 1 were dispensed into each well of a 24-well cell culture container, and the number of spheres was examined according to the number of passages (Table 2). As a result, as shown in Table 2, it was confirmed that long-term proliferation and maintenance of cell differentiation properties were possible by spear propagation. In addition, as shown in FIG. 4, it was found that Oct4 was positive expression, indicating that it retained its undifferentiated state and had an excellent proliferation rate.
실시예Example 4: 인간 지방조직 유래 줄기세포의 면역염색분석 4: Immunostaining of human adipose tissue-derived stem cells
상기 실시예 4에서 수득된 인간 지방조직 유래 줄기세포 스피어를 PBS로 세 번 세척하고, 4% 파라포름알데하이드를 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton- X100을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 1차 항체를 함유한 PBS에 하룻밤 동안 반응시킨다. PBS로 3회 세척하고, 2차 항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 마운팅하였다.The human adipose tissue-derived stem cell sphere obtained in Example 4 was washed three times with PBS and fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 30 minutes. After three washes with PBS, the cells were permeabilized with PBS containing 0.1% Triton-X100 for 10 minutes. Washed three times with PBS, reacted with 10% NGS for 1 hour, and reacted overnight in PBS containing primary antibody. Washed three times with PBS, and reacted with secondary antibody for 1 hour in a dark room. Washed three times with PBS, and mounted.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 다분화능 줄기세포 스피어는 신경 전구세포의 마커라고 할 수 있는 네스틴 및 미분화상태의 세포 마커라고 할 수 있는 Oct4 및 중간엽 줄기세포의 마커인 SH2(CD105) 및 SH3/4(CD73)에 대하여 모두 양성반응을 나타내었다.As a result, as shown in FIG. 4, the multipotential stem cell spear according to the present invention is a nestin which is a marker of neural progenitor cells, Oct4 which is a cell marker of undifferentiated state, and a marker of mesenchymal stem cells Positive for both SH2 (CD105) and SH3 / 4 (CD73).
실시예Example 5: 지방 유래 5: Fat-derived 다분화능Multiparameter 줄기세포의 지방세포로의 분화 Differentiation of stem cells into adipocytes
실시예 1에서 수득한 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 5% FBS, 1μM 덱사메타손, 200μM 인도메타신, 10㎍/ml 인슐린, 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 함유한 α-MEM 배지에서 2주 동안 배양하여 다분화능 줄기세포의 지방세포로의 분화를 유도하고, Oil red O 염색법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포가 지방세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다. The human adipose tissue-derived multipotent stem cells obtained in Example 1 were inoculated into an autoclave containing 5% FBS, 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin, 10 μg / ml insulin, 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) MEM broth for 2 weeks to induce the differentiation of multipotent stem cells into adipocytes and analyzed using Oil red O staining method. As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the human adipose tissue-derived multipotent stem cells according to the present invention were differentiated into adipocytes.
실시예Example 6: 6: 두피조직유래Origin of scalp tissue 모낭세포의Follicular 배양 culture
두피유래 조직을 세절한 다음, 콜라게나아제 타입 IA가 함유된 배지(10% 우태아혈청(Gibco, USA), 100 unit의 페니실린, 0.1 mg/ml의 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml의 네오마이신(Gibco, USA), 100 ㎍/ml의 노르모신(Invivogen, USA)이 함유된 DMEM(Gibco, USA) 및 2 mg/ml의 콜라게나아제 타입ⅠA(Sigma, USA)이 첨가된 배지)에 넣어 130 m/min, 37℃에 30분 동안 반응시켰다. 효소분해된 조직을 원심분리로 수거하여 PBS로 3번 세척한 다음, M199/F12 혈청배지(1:1의 M199 및 F12, 0.62 ㎍/ml의 인슐린(Sigma, USA), 0.62 ㎍/ml의 트랜스페린(Gibco, USA), 100 unit의 페니실린, 0.1 mg/ml 의 스트렙토마이신, 0.25 ㎍/ml의 네오마이신(Gibco, USA), 10 ng/ml의 rEGF(Sigma, USA), 10 ng/ml의 bFGF(Sigma, USA), 100 ㎍/ml의 노르모신(Invivogen, USA), 10% 우태아혈청 및 1mM의 N-아세틸-L-씨스테인(Sigma, USA)을 첨가한 배지)에서 조직배양을 하였다. 약 3일 후부터 조직들이 배양용기 바닥에 부착되기 시작하면, M199/F12 무혈청 배지로 교체하여 1주일간 배양하고, 노르모신이 없는 케라티노사이트 무혈청 배지{0.2 mM 아스코르빈산(Sigma, USA)을 첨가한 케라티노사이트 무혈청 액상배지(Gibco cat# 10785012), USA}로 교체하여 배양하였다.After the scalp-derived tissues were cut, the culture medium (10% fetal bovine serum (Gibco, USA), 100 units of penicillin, 0.1 mg / ml of streptomycin, 0.25 g / ml of neomycin (Sigma, USA) supplemented with DMEM (Gibco, USA) containing 100 / / ml normocin (Invivogen, USA) and 2 mg / ml collagenase type I A m / min, 37 [deg.] C for 30 minutes. The enzymatically digested tissues were collected by centrifugation, washed three times with PBS, and resuspended in M199 / F12 serum medium (1: 1 M199 and F12, 0.62 ug / ml insulin (Sigma, USA), 0.62 ug / ml transferrin (Gibco, USA), 10 ng / ml rEGF (Sigma, USA), 10 ng / ml bFGF (Sigma, USA), 100 units of penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 0.25 ug / ml neomycin (Sigma, USA), 100 μg / ml normocin (Invivogen, USA), 10% fetal bovine serum and 1 mM N-acetyl-L-cysteine (Sigma, USA) . After about 3 days, when the tissues begin to adhere to the bottom of the culture vessel, they are incubated for one week by replacing with M199 / F12 serum-free medium and incubated with keratinocyte free serum (0.2 mM ascorbic acid (Sigma, USA) (Gibco cat # 10785012, USA) supplemented with keratinocyte-free serum.
실시예Example 7: 7: MACSMACS 를 통한 Through 두피조직유래Origin of scalp tissue 모낭세포의Follicular 분류 Classification
상용화 되어있는 MACS(Magnetic Cell Sorting, Miltenyi Biotec Inc., Germany)를 이용하여 CD34 양성세포를 분리하였다. 실시예 1에서 얻어진 세포를 수거하여 세척한 다음, 배지를 첨가하여 피펫팅으로 단일세포로 부유시키고 150 ~ 300 ㎕ MACS 버퍼와 50 ~ 100 ㎕ 블로킹 리전트, 50 ~ 100 ㎕ 마이크로 비드를 순서대로 첨가하였다. 상기 혼합액을 제조하는 과정은 암상태에서 수행하였으며, 혼합액이 담긴 튜브는 알루미늄 호일로 싸고, 4℃에서 30분 내지 4시간동안 반응시켰다. 그 후에 알루미늄 호일을 벗기고 혼합액의 약 10배 부피의 MACS 버퍼를 튜브에 추가하고 피펫으로 잘 섞어준 후 1200 rpm에서 5 ~ 6분간 원심분리하고, 상층액은 제거하였다. 500 ㎕ MACS 버퍼를 세포의 수에 맞게 첨가한 다음, CD34 양성세포와 CD34 음성세포를 제조사가 권장하는 방법에 따라 MACS를 사용하여 분리하였다. 이때 수거된 CD34 양성세포의 세포수는 약 1 ~ 2 x 107 이었으며, 멸균생리식염수 100㎕에 재부유시켜 추후의 동물실험에 사용하였다.CD34-positive cells were isolated using commercially available MACS (Magnetic Cell Sorting, Miltenyi Biotec Inc., Germany). The cells obtained in Example 1 were collected and washed. Then, the medium was added and suspended in a single cell by pipetting, and 150-300 μl MACS buffer, 50-100 μl blocking digits, and 50-100 μl microbeads were added in this order . The process of preparing the mixed solution was carried out in a dark state, and the tube containing the mixed solution was wrapped with aluminum foil and reacted at 4 ° C for 30 minutes to 4 hours. Then, the aluminum foil was peeled off, and a MACS buffer of about 10 times the volume of the mixed solution was added to the tube. The mixture was pipetted, centrifuged at 1200 rpm for 5 to 6 minutes, and the supernatant was removed. 500 [mu] l MACS buffer was added to the number of cells, and CD34-positive cells and CD34-negative cells were separated using MACS according to the manufacturer's recommended method. At this time, the number of CD34-positive cells collected was about 1 to 2 x 10 7, and the cells were resuspended in 100 μl of sterile physiological saline and used for further animal experiments.
실시예Example 8: 8: 두피조직유래Origin of scalp tissue 모낭세포의Follicular 발모치료 효과 Effect of hair treatment
6주령의 수컷 BALB/cAnNCrjBginu 누드마우스((주)중앙실험동물, 대한민국)에 표 3의 구성으로 두피조직유래의 각 세포를 투여하여 발모효과를 관찰하였다. 본 실험에 사용된 67마리의 누드마우스는 서울대학교 수의과대학 실험동물사육실 내 SPF 구역에서 사육하였으며, 무작위법으로 각각 5마리씩이 포함되도록 군을 분리하여 실험을 수행하였다. 시험군의 구성은 아래 표와 같다 (표 3).Male hair BALB / cAnNCrjBginu nude mice (Central Laboratories, Inc., Korea) at 6 weeks of age were administered with each cell derived from scalp tissue in the composition of Table 3, and the hair growth effect was observed. The 67 nude mice used in this experiment were raised in the SPF area of experimental animal breeding room of Seoul National University College of Veterinary Medicine. The test group is shown in the following table (Table 3).
혼합투여군CD34 positive / CD34 negative
Mixed administration group
또한, 상용되는 탈모치료제 미녹시딜(Minoxidil, Pfizer, USA)를 배양된 세포와 병합 사용하여 발모효과를 평가하기 위해 각 군당 3마리의 마우스가 포함되도록 하여 표 1과 대비되는 실험군을 편성하였다 (표 4).In addition, in order to evaluate the hair growth effect using a commercially available hair loss treatment agent Minoxidil (Pfizer, USA) in combination with the cultured cells, three mice per group were included to prepare an experimental group as compared with Table 1 ).
단독투여군(MP)CD34 positive
Single dose group (MP)
단독투여군(MN)CD34 negative
In the monotherapy group (MN)
혼합투여군(MT)CD34 positive / CD34 negative
Mixed group (MT)
상기 실험군에 모낭세포를 투여하기 하루 전 칼슘티오글라이코레이트(Sigma, USA)로 실험동물의 잔털들을 제거했고 투여한 후 30일 동안 실험동물의 두피를 관찰하였다. 매일 발모 유도 점수를 구분하여 기록하였고, 실험 시작 전과 종료시점에 동물의 체중을 측정하고, 실험 종료 후 31일째에 부검을 실시하였다.The hair follicles of the experimental animals were removed with calcium thioglycolate (Sigma, USA) one day before the hair follicle cells were administered to the test group, and the scalp of the experimental animals was observed for 30 days after administration. Daily hair growth induction score was recorded separately, and the body weight of the animal was measured before and after the experiment, and the autopsy was performed on the 31st day after the end of the experiment.
각 실험동물의 상태에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 원-웨이 ANOVA를 실시하여 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정되면 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군 실험군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다 (p<0.05).For the statistical analysis of the status of each experimental animal, one-way ANOVA was performed to test significance between groups. Dunnett's t-test was performed when significance was confirmed (p < 0.05).
발모효능은 실험개시 24일 이후에 대부분 최대를 나타내었으며, 모낭세포 혼합군인 T3군에서 발모개시효과가 가장 빠르게 나타났다. 또한, 미녹시딜과 혼합투여군(MT)에서도 이와 유사한 효과를 보였으나, 24일 이후의 효능에서는 T3가 월등이 높은 것으로 나타났으며, 모낭 세포 투여 후 14일째, 21일째 및 28일째에서 발모효과를 사진으로 기록하였다 (도6, 도7 및 도8).The hair growth inhibitory effect was the highest at 24 days after the initiation of the experiment, and the hair growth initiation effect was the fastest in the hair follicle T3 group. Similar effects were also observed with minoxidil (MT), but T3 was significantly higher in the efficacy after 24 days, and hairy effect was observed at 14 days, 21 days, and 28 days after hair follicle cell administration (Figs. 6, 7 and 8).
실시예Example 8: 줄기세포의 발모치료 효과 8: Effect of stem cells on hair growth
6주령의 수컷 BALB/cAnNCrjBginu 누드마우스((주)중앙실험동물, 대한민국)에 표 3의 두피조직유래의 각 세포와 지방조직유래 줄기세포를 일정 비율로 혼합 투여하여 동물에서의 발모효과를 관찰하였다. 사용하는 마우스는 실시예 1과 동일하게 서울대학교 수의과대학 실험동물사육실 내 SPF 구역에서 사육하고, 무작위법으로 각각 5마리씩이 포함되도록 군을 분리하여 실험을 수행하였으며, 미녹시딜 첨가군을 포함시켜 세포치료제와의 발모효능을 비교한 결과, 본 발명에 따른 인간 지방조직 유래 줄기세포 및 두피조직 유래 모낭세포 혼합군에서 대조군(모낭세포 단독투여군)에 비해 월등한 발모효과를 관찰할 수 있었으며, 이 때 최적의 발모효과를 위한 본 발명의 줄기세포와 모낭세포의 혼합비는 약 1:9 내지 9:1인 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.In the male BALB / cAnNCrjBginu nude mice (Central Laboratories, Inc., Korea) at 6 weeks of age, stem cells from the scalp tissues and the adipose tissue-derived stem cells of Table 3 were mixed at a certain ratio to observe the hair growth effect in the animals . In the same manner as in Example 1, the mouse used was raised in an SPF area in an experimental animal breeding room of Seoul National University, and 5 mice were randomly divided into two groups. (Hair follicle-treated group) of the human adipose tissue-derived stem cell and hair follicle-derived hair follicle cell group according to the present invention were superior to the control group (hair follicle cell alone group) The mixing ratio of the stem cells and hair follicle cells of the present invention for hair growth effect of about 1: 9 to 9: 1 was confirmed.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the invention is not limited thereby. It will be obvious. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 인간 지방조직 유래 성체 줄기세포, 및 CD34 양성 및/또는 음성세포를 함유하는 두피조직 유래 모낭세포가 일정 혼합비율로 함유되어 있는 발모유도용 세포치료제에 관한 것이다.INDUSTRIAL APPLICABILITY As described in detail above, the present invention relates to a stem cell treatment agent for stem cells, which contains human adipose tissue-derived adult stem cells and hair follicle cells derived from scalp tissue containing CD34-positive and / or negative cells at a predetermined mixing ratio .
본 발명에 따른 발모유도용 세포치료제는 모낭형성이 정상적으로 이루어지지 않아 발생하는 탈모증 및 무모증과 같은 증상에 적용하여 발모의 효능을 이끌어 내는데 유용하다.The cell therapy agent for foot milk according to the present invention is useful for eliciting the effect of hair growth by applying to symptoms such as alopecia and asphyxia which are caused when hair follicle formation is not normally performed.
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