JPH119688A - タンパク質を含有する溶液を浄化する装置、その装置のための支持材料を生産する方法及びその装置の使用方法 - Google Patents

タンパク質を含有する溶液を浄化する装置、その装置のための支持材料を生産する方法及びその装置の使用方法

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JPH119688A
JPH119688A JP10029671A JP2967198A JPH119688A JP H119688 A JPH119688 A JP H119688A JP 10029671 A JP10029671 A JP 10029671A JP 2967198 A JP2967198 A JP 2967198A JP H119688 A JPH119688 A JP H119688A
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Veit Otto
オットー ヴァイト
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Fresenius SE and Co KGaA
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】血液や，血漿，又は細胞培養地のようなタンパ
ク質含有溶液を浄化するための装置、これに使用される
プラスチックの支持担体の製造法、及びこの装置の使用
方法の提供。 【解決手段】プラスチックでできた生物学的適合性の支
持材料が本発明に従って使用され、プラスチック材料は
ポリアクリレート，ポリメタクリレート，ポリスルホン
及びポリエーテルスルホンのグループから選択され、ア
ミン又はアミドを官能基として有する。これらはアルブ
ミンとペプチド結合の手段によって、共有結合でコート
されている。加えて、本発明は、本発明に従った支持材
料を製造する方法と装置の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液，血漿，細胞
培養地のようなタンパク質を含有する溶液を浄化する装
置，前記装置のための支持材料を生産する方法，及びこ
の装置の使用に関する。
【０００２】
【先行技術】メルカプタンのような代謝のトキシン，自
由脂肪酸，非結合ビリルビン，多くの外因性トキシンと
同様なグラム陰性菌の菌体内毒素，とりわけノルトリプ
チリン，アミトリプチン，ジアゼパム，ブロマゼパム等
のような薬物は、ほとんど完全に血流内のタンパク質に
結合していることは既に知られている。それらは血漿の
アルブミン留分と優先的に結合する。分子のサイズと、
タンパク質−トキシンの複合体の強い相互結合とのため
に、血液透析のような従来型の血液浄化方法では、アル
ブミンに結合した血液トキシンを選択的に除去すること
は困難又は不可能である。しかしながら、タンパク質−
結合のトキシンを血液又は血漿から除去することができ
る、既に知られた血液浄化方法がある。ひとつの知られ
た方法は血液吸着であって、活性炭又はイオン交換樹脂
を使用する。これらの吸収材料は、多くのタンパク質−
結合のトキシンに対して、適度な除去比率を有する（J.
L. Rosenbaum et al. 1980:"Current status of hemope
rfusion in toxicology." Clin. Toxicol. 17: 493）。
公知の吸収物質のひとつの不都合な点は、それらがたい
てい非特異的な結合特性を有することである。従って、
アルブミン−結合のトキシンに加えて、希望しないホル
モン，成長因子，血小板のような細胞が共に除去され、
これは副作用と合併症へとつながることがある。
【０００３】世界特許 WO 94/21363号は、アルブミン−
結合の物質を血液から除去することができる透析方法を
記述する。非対称の透析用中空ファイバーが、本質的に
血液から離れる面する側に（多孔性の支持層内に）アル
ブミンでコーティングされている。加えて、中空のファ
イバーは外側がアルブミン溶液ですすがれており、この
アルブミン溶液とともに、活性炭又はイオン交換樹脂の
カートリッジを通って循環し、そして追加の透析装置を
通って透析物から移送されたトキシンを除去する。トキ
シンを積んだ血液のアルブミン分子は、支持層内のトキ
シンのないアルブミン分子から、中間のアルブミン不浸
透性の透析ファイバの分離層によって、空間的に分離し
ている。アルブミン不浸透性の分離層は、本質的に自由
に動くトキシン−アルブミンの合成物の逆拡散を防止す
る、この組合わせの機能のために欠くことができず、そ
して従って、トキシンが血液から出て、透析物に入る、
方向性の移動を維持する。 血液から除去されるため
に、トキシンはアルブミン不浸透性の分離層を通過しな
ければならない。これは特に大きなトキシン合成物、グ
ラム陰性菌の菌体内毒素のような、を除去するのに不都
合であり、これは上述した方法では血液から除去するこ
とができない。加えて、この組合わせは物質の選択的な
除去も、もたらさない。なぜなら、透析ファイバの内側
分離層を通過することができるような小さな分子サイズ
を有する全ての物質もまた、同時に除去されることがで
きるからである。
【０００４】世界特許 WO 95/04559号は、タンパク質を
含有する液体、特に血液からの、トキシンの除去のため
の薄膜フィルタを備えた組合わせを記述する。浄化され
るべき液体、例えば血液、は中空ファイバ薄膜フィルタ
の管腔を通過し、フィルタの外周のまわりには、トキシ
ンに結合するための固体粒子を含んだ清浄用懸濁液が流
れる。清浄用懸濁液は、渦巻ポンプによって動き続けさ
せられ、薄膜フィルタ上での移動薄膜の圧力差の局所的
な変化の原因となり、そのためフィルタの壁面に沿って
液体の交換が存在する。液体とともに移動したトキシン
は、その後、吸収剤粒子と接触することになり、一方、
同時に、浄化された液体は血流内に戻る。この組合わせ
もまた、トキシンの合成物が除去されるべく、浄化すべ
き液体からフィルタ壁を通過しなければならないという
不都合を有する。
【０００５】タンパク質と結合した代謝産物又はトキシ
ンを血液から除去するのに使用される、アルブミンでコ
ーティングされた吸収物は、既に、J. of Clinical Inv
estigation, vol. 53 (March 1974) pages 778-785 に
よって知られている。しかしながら、知られている吸収
物は、血液とコンパチブルでもないし、蒸気殺菌もでき
なく、そのため、治療上に使用することは不可能であ
る。アルブミンは臭化シアンを介して結合し、これは不
純物として最終産物に付着するかも知れず、たとえ低い
濃度においても強いトキシンである。保持体もまた、補
体活性化又は血小板付着を防止するのに適当ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質結合のトキシンを、サイズに無関係に、選択的に
そして有効に、血液，血漿又は細胞培養地のようなタン
パク質含有溶液から、除去することができる装置を創造
することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は請求項１に従
った装置によって達成され、プラスチック材料からでき
た生物学的適合性の支持材料を有し、前記プラスチック
材料は以下のグループ：ポリアクリレート，ポリメタク
リレート，ポリスルホン及びポリエーテルスルホンから
選択され、アミン又はアミドを有し、アルブミンとペプ
チド結合の手段によって、共有結合でコートされてい
る。本発明に従った装置中で使用されるこの支持材料
は、吸収物として特に良好な特性をもつ。アルブミンが
マルチポイント結合によってプラスチック材料に結合さ
れると、とりわけ有利である。これは吸収物の殺菌可能
性を確実にする。支持材料は、ビーズパッキング又は平
坦又は中空のファイバ膜又はフィルムに形成して使用さ
れるようにしてもよい。もしビーズが用いられるとき
は、それらは有利的には１０と５００μｍの間の直径を
有するとよく、少なくともひとつのインレットとひとつ
のアウトレットとを有する、カラムに詰込まれた灌流可
能なパッキングの形状にパックされるとよい。
【０００８】本発明に従った装置中で使用される支持材
料を生産する有利的な方法によれば、マルチポイントの
結合がカプラー反応物の手段によって作り出され、これ
はアルブミンのカルボニル官能基だけを活性化させ、そ
の後ふたたび分離する。カルボジイミド又はＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドがカプラー反応物として超過して使
用することができる。カプラー反応物は、"触媒"として
作用する。なぜなら、それはアルブミンのカルボニル基
だけを活性化するからである。反応の後、カプラー反応
物はふたたび分離し、例えば、カルボジイミドの場合の
dialkylureaと同様である。支持材の反応性基のモル比
に対するアルブミンの濃度は、有利的には５０〜５０
０：１である。カプラー反応物は有利的には、支持材料
の反応性基に基づいて、１０倍のモル濃度までの濃度の
等モルである。これは所望の蒸気殺菌を許容する、マル
チポイント結合をもたらす。
【０００９】本発明に従えば、前記装置は人体の全血か
らトキシンを除去するのに使用することができるが、さ
らに人体の血漿又は細胞培養地からにも使用できる。
【００１０】
【発明の実施の形態】ポリメタクリレート又はポリヒド
ロキシメタクリレート（例えば、ローム社のEUPERGIT
(R)）でできたプラスチックビーズで、例えば、１０か
ら５００μｍの直径のものが、アミノ化され、適当なカ
プラー反応物によって、浄化された人体のアルブミンで
共有コートされ、カラムにパックされる。このようにし
て準備されたカラムは、血液で体外循環して灌流され
る。図１はメカニズムのダイアグラムを示す。人体のア
ルブミン１２は、プラスチックビーズ１０と共有結合さ
れている。血液は矢印ａの方向にカラムを通って灌流す
るため、トキシン−結合の又は、アルブミン−結合のト
キシン１４が、プラスチックビーズのコートされた表面
に沿って流れる。灌流に続いて、固定化されたアルブミ
ン１２が、アルブミンへの親和力を有するトキシン１４
を血液から離して吸収するであろう。
【００１１】図２はカラム１６を示しており、それを通
って、矢印ｄの方向にタンパク質を含有する溶液が流れ
る。これはアルブミン分子１２に結合したトキシン１４
を含有している。トキシン１４は、固定化されたアルブ
ミンを通過するにつれて、プラスチックビーズ１０の表
面に移送される。図２の下の領域では、アルブミン分子
１２はもはやいかなるトキシンも有さない。なぜなら全
てのトキシンは移送されたからである。図２に示された
メカニズムは、実例１にて詳細を説明したことと対応し
ている。 １．アルブミンコーティングの共有反応 ２０ｇのオキシランアクリル樹脂ビーズ（例えば、ロー
ム社の EUPERGIT(R)）で、約２００μｍの平均直径を有
し、０．２mmol/gの平均オキシラン含有のものが、２４
０ml，１３％のアンモニア溶液で室温で６時間でアミノ
化される。定温放置の終結と、蒸留水での数回の洗浄に
よる全てのアンモニア溶液の除去の後（ｐＨをチェック
して）、ビーズは、１２０ｍＬ，３０ｍＭの燐酸ナトリ
ウムバッファ，ｐＨ４．８と、及び、１％（ｗ／ｖ）の
血清アルブミン（牛血清アルブミン，脂肪酸なし，シグ
マ製）に再懸濁させられる。バッチは氷水中で４℃から
６℃に冷却される。ｐＨ４．８の燐酸ナトリウムバッフ
ァ中に６０ｍＬ，５％（ｗ／ｖ）のＥＤＣ溶液をゆっく
りと加えることによって、カップリングが達成される
（ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミド）。カルボジイミドを加えた
後、バッチは氷水中で４時間撹拌される。その後、氷冷
却の０．９％の塩化ナトリウム溶液で繰返し洗浄するこ
とによって、余分なカプラー反応物とタンパク質が除去
される。このように処理されたビーズは、その後、２０
ｍＭ，ｐＨ７．４の燐酸ナトリウムバッファ中に懸濁さ
れ、タンパク質結合収率は決定される。ＢＳＡでの典型
的な結合収率はビーズのグラム当り８から１０ｍｇのタ
ンパク質である。
【００１２】１．１ バッチ法による人体血漿からの脂
肪酸の吸収 遠心分離で１５００ｇで１５分で、健康なドナーから
の、ＡＣＤ（ＡＣＤ＝クエン酸ナトリウム／クエン酸グ
ルコース溶液）で凝固防止された、サンプルされた新鮮
な全血から、血漿が得られる。血漿中の脂肪酸含有量が
決定される。第１節に従って準備されたアルブミン−ア
クリル樹脂ビーズがエッペンドルフベッセル(Eppendorf
vessel)内に沈澱させられ、燐酸ナトリウムバッファの
上清が除去される。正確に０．１ｍＬの沈澱物が、その
後０．５ｍＬの血漿と混合させられる。バッチは撹拌器
中で３７℃で１時間保温される。保温の後、アルブミン
−アクリル樹脂ビーズはふたたび沈澱させられ、脂肪酸
決定のために、プラズマの上清からサンプルがとられ
る。残った上清は除去され、ビーズはその後６回、各回
とも１ｍＬ，２０ｍＭのｐＨ７．４の燐酸ナトリウムバ
ッファで洗浄される。スターティング血漿と吸収後の血
漿の上清との脂肪酸含有量、及びビーズへの直接の脂肪
酸結合が測定された。脂肪酸の決定（S. Shimizu et a
l. 1980: Anal Biochem. 107; 193-198）は光度測定法
によって実行され、商業的な酵素カラーテスト（Boehri
nger Mannheim）を使用した。アルブミン−固有の結合
を決定するため、アルブミンコーティングを有しないコ
ントロールビーズが全ての実験において同様の条件で処
理された。
【００１３】表１と図３はここで述べた実験によって典
型的に得られる結果を要約している。脂肪酸の結合の明
確な増加が、アルブミン−コートのアクリル樹脂ビーズ
について、コントロールビーズとの比較において、見い
だされた。
【００１４】
【表１】
【００１５】１．２ アルブミンでコートされたアクリ
ル樹脂ビーズによる人体の血漿からのエンドトキシンの
吸収 第１節で述べたようにして準備された正確に５ｍＬのア
ルブミン−アクリル樹脂ビーズがカラム内にパックされ
る。パックされたカラムは、可能な限り空気気泡を含ま
ず、第１に５０ｍＬ，０．５％（ｗ／ｖ）の発熱性物質
のないデオキシコールエステル溶液（ナトリウム−デオ
キシコールエステル，Fluka ）で流速５ｍＬ／min で灌
流される。表面に付着した全てのエンドトキシンは、こ
のステップで除去される。デオキシコールエステルの残
留物は１０００ｍＬの発熱性物質のない０．９％塩化ナ
トリウム溶液で除去され、カラムはその後、５０ｍＬ，
２０ｍＭのｐＨ７．４の燐酸ナトリウムバッファで平衡
させられる。洗浄動作と平衡化も５ｍＬ／min の流速で
実行される。最後の溶出物の部分標本が取られ、発熱性
物質がないかどうかが試験される。血漿は、ヘパリン化
された（２５ＩＵ／ｍＬ Ｌｉ−ヘパリン）健康なドナ
ーからの全血から、１５００ｇで１５分遠心分離するこ
とにより得られる。エンドトキシン（例えば、E. coli
からのリポ多糖類 055:B5, Sigma）が血漿に血漿が得ら
れた直後に加えられ、そしてエンドトキシンの量が決定
される。各例において、１０，０００単位（ＥＵ）の総
エンドトキシン含有量２０ｍＬの血漿が、２ｍＬ／min
の流速でカラムをポンプで通される。流れたものは集め
られる。血漿がカラムを通過した後、カラムは２０ｍ
Ｌ，２０ｍＭの発熱性物質のない燐酸ナトリウムバッフ
ァですすがれる。すすぎ溶液もまた集められる。
【００１６】アルブミン−アクリル樹脂ビーズの吸収能
力は、カラムの前に使用されたエンドトキシンの量とカ
ラムの後に溶出物に結合したエンドトキシンの量との違
いから決定される。コントロールの実験は、アルブミン
コーティングを有しない５ｍＬのアクリル樹脂ビーズの
カラムで同一の実験条件で行われる。エンドトキシンの
決定は、全ての実験において、濁度動的アメーバ様細胞
リムルス細胞分解産物試験（LAL test : J.F.Remillard
et al. 1987, in: S.W. Watson, J. Levin, T.J. Novi
tsky(eds.): "Detection of bacterial endotoxins wit
h the Limulus Amebacyte Lysate Test." New York, Al
an R. Riss, Inc., pp.197-210）の手段によって行われ
た。表２及び図４は実験で典型的に得られる結果を要約
している。コントロールビーズと比較すると、アルブミ
ンでコートされたアクリル樹脂ビーズは、エンドトキシ
ン結合において著しい増加を示している。
【００１７】
【表２】 アルブミンの固体支持材料の表面への共有結合による固
定はまた、特に有利的である。なぜならアルブミン分子
の特定の結合領域が、化学結合のタイプに依存してさら
される。例えば、固体支持の表面がアミノ基を含むとす
れば、アルブミン分子は、カプラー反応物としてカルボ
ジイミドが使用されたときには、構造を覆う領域の支持
上のカルボキシ基と優先的に結合する。これらの領域
は、もはや吸収に有効ではない。
【００１８】カルボキシ基によって固定されたアルブミ
ンは、試験された物質に対して強い結合特性を有し、な
ぜならそれは、固定の結果としての陽イオンの特性によ
ると見ることができる。アルブミンの結合は支持のアミ
ノ基によって生じる。本発明による吸収物の他の有利な
点は、その全血に対する血への適合性である。この測定
はカラムに付着して残った血小板の減少である。改善さ
れた全血に対する適合性を立証するため、ＬＰＳ（５０
０ｐｇ／ｍＬ）の存在下でのヘパリン血漿の血小板付着
が、以下比較実験に基づいて調査された。図５は本発明
によるアルブミン吸収材料の特性の例を、灌流された全
血の血小板損失に基づいて、示している。予備値に対す
るセルカウントの降下が低くなると、吸収物の血への適
合性は良くなる。カーブＡは、本発明によるアルブミン
吸収材料を用いた血小板カウントの降下を示している。
カーブＢは、カラムに吸収材料がないコントロールカー
ブを示している。カーブＣは、公知の血への適合性の貧
弱な吸収材料を用いた血小板カウントの降下を示してい
る。
【００１９】 ［実験の詳細な説明］ カラム： Ａ：Eupergit人アルブミン，lot FRE 76-060896 Ｂ：空カラム Ｃ：ＴＲＰ ８０−ＮＨ2 ゲルの量： ４ｍＬ すすぎ溶液： ５００ｍＬ ０．９％ ＮａＣｌ 溶液 ５００ｍＬ ０．９％ ＮａＣｌ 溶液＋５ ＩＵ／ｍＬ ナトリウム ヘパリン すすぎ流速： ９００ｍＬ／ｈ 血液体積： １２ｍＬ ヘパリン適量： ２５ ＩＵ／ｍＬ 使用されたヘパリン： ナトリウムヘパリン，５０００ＩＵ／０．２ｍＬ， Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ 血流： ３０ｍＬ／ｈ 留分： ４留分、各２ｍＬ
【００２０】［実験の手順］健康なドナーからの全血が
腕の静脈から取られ、殺菌した Falcon PP チューブへ
移送され、ナトリウムヘパリン（ヘパリン適量：２５Ｉ
Ｕ／ｍＬ血液）とともに準備される。ヘパリン血液試料
は、その後 E. coli 055:B5からのＬＰＳ，５００ｐｇ
／ｍＬとともに混合され、３７℃で１時間、回転撹拌器
で前保温される。吸収材料でパックされたカラムは、体
積型注入ポンプ（フレゼニウス）の助けにより、実験前
に、上述したすすぎ溶液によってすすぎされる。実験の
開始前に、約２ｍＬが血液試料から取られる（予備
値）。その後体積型ポンプの助けにより、１２ｍＬの血
液が各カラムにポンプで通される（上の流速を参照）。
各２ｍＬの留分がエッペンドルフベッセルに集められ
る。全ての試料中のセルカウントが Sysmex K1000 の助
けにより決定される。さらに、治療上の目的に特に好適
である、固有の１２１℃で１気圧余圧された蒸気殺菌
は、全ての材料に対しては耐性がなく、そして特に、タ
ンパク質に対しては全く耐性が期待できない。本発明に
よれば、マルチポイント結合によって蒸気殺菌可能性の
この特性を得ることが可能になる。マルチポイント結合
は、スターティング材料のモル比を選択することによっ
て達成され、支持材料のモルグループはアルブミン濃度
に対して過剰に使用され、好ましくは５０〜５００：１
の比である。
【００２１】他のタイプの殺菌もまた可能であり、例え
ばエチレンオキシド又はガンマ線による。しかし、外国
の物質や低落な材料が吸収材料に到達するかも知れない
という可能性は除外することができず、それは、後にな
って患者を危機にさらす可能性がある。従って、今日の
メディカルプロダクトは、過熱蒸気だけによって殺菌さ
れるようになってきている。この方法はタンパク質が用
いられている場合に、それらが熱により変性することか
ら問題である。本発明によるマルチポイント結合によっ
てのみ、変性が防止されることができ、蒸気殺菌が許容
される。図６は殺菌の前と後でのリポ多糖類の結合（エ
ンドトキシン）のグラフィックプロットを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】メカニズムのダイアグラムを示す。
【図２】タンパク質を含有する溶液が流れるカラムを示
す。
【図３】バッチ法による人体血漿からの脂肪酸の吸収の
実験結果を示す。
【図４】アルブミンでコートされたアクリル樹脂ビーズ
による人体の血漿からのエンドトキシンの吸収の実験結
果を示す。
【図５】本発明によるアルブミン吸収材料の特性の例
を、灌流された全血の血小板損失に基づいて、示してい
る。
【図６】殺菌の前と後でのリポ多糖類の結合（エンドト
キシン）のグラフィックプロットを示している。
【符号の説明】
１０ プラスチックビーズ １２ アルブミン １４ トキシン １６ カラム
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴァイト オットー ドイツ連邦共和国 66606 ザンクト ヴ ェンデル ドレスデナー シュトラーセ ２ (72)発明者 シュテファン シュルツェ ドイツ連邦共和国 61440 オーベルール ゼル ディールシュトラーセ 12

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血液，血漿，又は細胞培養地のようなタ
    ンパク質含有の溶液を浄化する装置において、 プラスチック材料が、ポリアクリレート，ポリメタクリ
    レート，ポリスルホン及びポリエーテルスルホンのグル
    ープから選択され、アミン又はアミドを官能基として有
    し、アルブミンとペプチド結合の手段によって、共有結
    合でコートされている、プラスチック材料からできた生
    物学的適合性の支持材料を有することを特徴とする装
    置。
  2. 【請求項２】 アルブミンはマルチポイント結合によっ
    てプラスチック材料に結合されていることを特徴とする
    請求項１記載の装置。
  3. 【請求項３】 支持材料は、ビーズパッキングの形状
    で，平坦な又は中空のファイバー膜の形状で，又はフィ
    ルムの形状で使用されることを特徴とする請求項１又は
    ２記載の装置。
  4. 【請求項４】 マルチポイント結合は、アルブミンのカ
    ルボニル官能基だけを活性化させ、その後ふたたび分離
    する、カプラー反応物によって生じることを特徴とする
    請求項１乃至３のいずれかひとつによる装置のための支
    持材料を製造する方法。
  5. 【請求項５】 カプラー反応物として、カルボジイミド
    又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドが使用されることを
    特徴とする請求項４による方法。
  6. 【請求項６】 支持材料の反応性基は、アルブミン濃度
    に対して、５０〜５００：１のモル比で使用されること
    を特徴とする請求項４又は５のいずれかひとつによる方
    法。
  7. 【請求項７】 カプラー反応物は、支持材料の反応性基
    に基づいて、１０倍のモル濃度の等モルで使用されるこ
    とを特徴とする上記請求項のいずれかひとつによる方
    法。
  8. 【請求項８】 人体の全血又は人体の血漿からトキシン
    を除去するために上記請求項のいずれかひとつによる装
    置を使用すること。
  9. 【請求項９】 細胞培養地からトキシンを除去するため
    に上記請求項のいずれかひとつによる装置を使用するこ
    と。
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