JPH11506919A - Fibroblast growth factor 15 - Google Patents

Fibroblast growth factor 15

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JPH11506919A
JPH11506919A JP9500364A JP50036496A JPH11506919A JP H11506919 A JPH11506919 A JP H11506919A JP 9500364 A JP9500364 A JP 9500364A JP 50036496 A JP50036496 A JP 50036496A JP H11506919 A JPH11506919 A JP H11506919A
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polynucleotide
dna
cells
cell
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Abstract

(57)【要約】 ヒト繊維芽細胞増殖因子15ポリペプチドとそのポリペプチドをコードするDNA（RNA）が開示されている。また、組換え技術による上記ポリペプチドの生産法も提供される。さらに、再血管化を刺激するため、創傷を処置するため、及びニューロン損傷を予防するための上記ポリペプチドの使用法も開示されている。上記ポリペプチドに対するアンタゴニストと、細胞増殖異常、血管過多性疾患及び上皮水晶体細胞増殖の予防用治療薬としてのそれらの使用も開示されている。宿主から得た試料中の上記ポリペプチドのコーディング配列中の突然変異及び該ポリペプチドの濃度の変化を検出するための診断法も開示されている。   (57) [Summary] Disclosed are human fibroblast growth factor 15 polypeptides and DNA (RNA) encoding the polypeptides. Also provided is a method for producing the polypeptide by recombinant techniques. Also disclosed are uses of the polypeptides described above to stimulate revascularization, treat wounds, and prevent neuronal damage. Also disclosed are antagonists to the above polypeptides and their use as therapeutics for the prevention of abnormal cell proliferation, vascular hyperplasia and epithelial lens cell proliferation. Diagnostic methods for detecting mutations in the coding sequence of the polypeptide and changes in the concentration of the polypeptide in a sample obtained from the host are also disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 繊維芽細胞増殖因子15 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによっ てコードされるポリペプチド、そのポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、 並びにそのポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関する。より具体的に述 べると、本発明のポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子/ヘパリン結合性増殖因 子（以下、これを「FGF-15」という）であると推定されている。本発明は、上記 ポリペプチドの作用を阻害することにも関する。 繊維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに結合するという特性を示すタンパク質のフ ァミリーであり、それゆえにヘパリン結合性増殖因子（HBGF）とも呼ばれる。こ のタンパク質ファミリーの種々の構成要素は様々な組識で発現し、その発現は独 特の時間的空間的制御を受けている。これらのタンパク質は、繊維芽細胞、角膜 及び血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管平滑筋、 水晶体上皮細胞、メラニン形成細胞、ケラチン生成細胞、寡突起膠細胞、星状細 胞、骨芽細胞及び造血細胞を含む、中胚葉、外胚葉及び内胚葉由来の様々な細胞 にとって、強力な有糸分裂促進因子である。 各構成要素は、互いに重複する機能を持つと共に、それぞれ独特の機能スペク トルをも持つ。FGF-1とFGF-2は、血管内皮細胞の増殖を刺激する能力に加えて、 内皮細胞にとって走化性であり、FGF-2は内皮細胞が基底膜を貫入するのを可能 にすることが示されている。これらの特性と合致して、FGF-1とFGF-2は、血管形 成を刺激する能力を持つ。これら増殖因子のもう1つの重要な特徴は、それらが 創傷治癒を促進できるということである。FGFファミリーの他の多くの構成要素 も、血管形成及び創傷治癒の促進など、FGF-1及び2と同様の活性を持つ。FGFフ ァミリーの構成要素のいくつかは、中胚葉形成を誘発し、ニューロン細胞、含脂 肪細胞及び骨格筋細胞の分化を調節することが示されている。 正常組識におけるこれら生物活性の他に、FGFタンパク質は、その発現の制御 が解除されると、腫瘍血管新生を促進することにより、またトランスフォーミン グタンパク質として、癌腫及び肉腫の腫瘍形成の促進にも関係する。 現在、FGFファミリーは、構造的に関係する8種類のポリペプチド：塩基性FGF 、酸性FGF、int 2、hst 1/k-FGF、FGF-5、FGF-6、ケラチン生成細胞増殖因子、A IGF（FGF-8）から構成されており、最近になって、ヒトグリオーム細胞系の培養 上清から精製されたグリア活性化因子が、新規ヘパリン結合性増殖因子であるこ とが示されている（Miyamoto，M.ら，Mol．and Cell．Biol.，13(7):4251-4259 （1993））。それぞれの遺伝子はクローン化され、配列決定されている。それら 構成要素のうちの2つ、FGF-1とFGF-2は、多くの名前で特徴づけられているが、 それぞれ酸性及び塩基性繊維芽細胞増殖因子と呼ばれることが最も多い。正常な 遺伝子産物は、大半の内胚葉及び神経外胚葉系細胞の一般的な増殖能力に影響を 及ぼす。それらは、生体内で血管形成を誘導することができ、初期発生に重要な 役割を果たしうる（Burgess，W.H.及びMaciag，T.，Annu．Rev．Biochem.，58:5 75-606，（1989））。 また、FGFファミリーの上記構成要素の多くは同じレセプターに結合し、それ らのレセプターに対する結合によって第2メッセージを誘導する。 分泌型FGF-1をコードする真核発現ベクターは、遺伝子転移によってブタ動脈 内に導入されている。このモデルは生体内の動脈壁における遺伝子機能を明確に する。FGF-1発現は、遺伝子転移の21日後に、ブタ動脈における血管内膜の肥厚 化を誘導した（Nabel，E．G.ら，Nature，362:844-6（1993））。さらに、塩基 性繊維芽細胞増殖因子が、グリオームの増殖と進行を、腫瘍血管形成におけるそ の役割とは無関係に調節しうることと、塩基性繊維芽細胞増殖因子の放出又は分 泌がこれらの作用には必要であるらしいことも立証されている（Morrison，R.S. ら，J．Neurosci．Res.，34:502-9（1993））。 塩基性FGFのような繊維芽細胞増殖因子は、カポジ肉腫細胞の試験管内増殖に も関係づけられている（Huang，Y.Q.ら，J．Clin．Invest．91:1191-7（1993） ）。また、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするcDNA配列は、バクテリオ ファージT7 RNAポリメラーゼによって認識される転写プロモーターの下流にクロ ーニングされている。そのようにして得た塩基性繊維芽細胞増殖因子は、有糸分 裂促 進性、プラスミノーゲン活性化因子の合成及び血管形成アッセイにおいて、ヒト 胎盤繊維芽細胞増殖因子と識別できない生物活性を持つことが示されている（Sq uires，C．H.ら，J．Biol．Chem.，263:16297-302（1988））。 米国特許第5,155,214は、実質上純粋な哺乳類塩基性繊維芽細胞増殖因子とそ れらの生産を開示している。ウシ及びヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸 配列と、ウシ種のポリペプチドをコードするDNA配列が開示されている。 新たに発見されたFGF-9は、FGFファミリーの他の構成要素と30%程度の配列類 似性を持つ。ファミリー構成要素内の2つのシステイン残基とその他の共通配列 も、FGF-9配列にはよく保存されていた。FGF-9は、そのN末端に、酸性及び塩基 性FGFのような典型的シグナル配列を持たないことがわかった。しかし、FGF-9は 、典型的なシグナル配列FGFを欠くにも関わらず、合成後に細胞から分泌される ことがわかった（Miyamoto，M.ら，Mol．and Cell．Bioll，13(7):4251-4259（1 993））。さらに、FGF-9は、寡突起膠細胞タイプ2星状細胞前駆細胞BALB/c3T3と PC-12細胞の細胞増殖を刺激するが、ヒト臍静脈内皮細胞の細胞増殖は刺激しな いことがわかった（Naruo，K.ら，J．Biol．Chem.，268:2857-2864（1993））。 塩基性FGFと酸性FGFは細胞増殖、細胞移動、分化及び生存の強力な調節因子で あり、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に由来する細胞タイプに作用する。これら2つ のFGFは、KGF及びAIGFと共に、タンパク質精製によって同定されている。しかし 、他の4つの構成要素は腫瘍遺伝子として単離され、その発現は、胚形成と一定 のタイプの癌に制限された。FGF-9は、膠細胞に対する有糸分裂促進因子である ことが立証された。FGFファミリーの構成要素は腫瘍形成力を持つと報告されて いる。FGF-9は、BLB/c3T3細胞に形質転換されると、トランスフォーミング能力 を示す（Miyamoto，M.ら，Mol．Cell．Biol.，13(7):4251-4259（1993））。 FGF-8としても知られるアンドロゲン誘導性増殖因子（AIGF）は、テストステ ロンで刺激されたマウス乳癌細胞（SC-3）の調整培地から精製された。AIGFは独 特なFGF様増殖因子であり、推定シグナルペプチドを持ち、既知のFGFファミリー 構成要素と30〜40%相同である。AIGFで形質転換された哺乳類細胞は、アンドロ ゲンの不在下にSC-3細胞の増殖に対して著しい刺激効果を示す。したがってAIGF は、SC-3細胞と、そしておそらくは他の細胞のアンドロゲン誘導性増殖を媒介す る。なぜなら、これは腫瘍細胞自体によって分泌されるからである。 本発明のポリペプチドは、FGFファミリーの他の構成要素とのアミノ酸配列相 同性から、FGFファミリーの構成要素であると推定された。 本発明の一側面によれば、新規成熟ポリペプチド、並びに生物学的に活性かつ 診断又は治療に有用なその断片、類縁体及び誘導体が提供される。本発明のポリ ペプチドはヒト由来である。 本発明のもう1つの側面によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離さ れた核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）並びに生物学的に活性かつ 診断又は治療に有用なその断片が提供される。 本発明のさらなる側面によれば、組換えベクター（本発明ポリペプチドの組換 え生産に使用する試薬として有用なクローニング及び発現ベクターなど）と本発 明ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核及び/又は真核宿主細胞 とを使用することにより、組換え技術で上記ポリペプチドを生産する方法が提供 される。 本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチドを、それらに対する作用薬及び拮抗薬をスクリーニン グするために使用する方法、及び例えば火傷や潰瘍による創傷の治癒を促進した り、ニューロン障害によるニューロン損傷を予防し、ニューロン成長を促進した り、皮膚老化と脱毛を予防したり、初期胚と四肢再生における血管形成、中胚葉 誘導を刺激するなどの治療目的で使用する方法が提供される。 本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対する抗体が提供される 。 本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対する拮抗薬（アンタゴ ニスト）と、例えば細胞トランスフォーメーション（例えば腫瘍）の治療で上記 ポリペプチドの作用を阻害するため、傷あとを減らすため、あるいは血管過多性 疾患を治療するために、それらを使用する方法とが提供される。 本発明のもう1つの側面によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドに特異的にハイブリッド形成するに足る長さの核酸分子からなる核酸 プローブが提供される。 本発明のさらなる側面によれば、本発明の核酸配列中の突然変異に関係する疾 患又はその疾患に対する罹病性を検出するため、及びその配列によってコードさ れるポリペプチドの過剰発現を検出するための診断的アッセイが提供される。 本発明のもう1つの側面によれば、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドを コードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成及びDNAベクターの製造 に関係する試験管内目的に使用する方法が提供される。 本発明のこれらの側面とその他の側面は、本明細書の教示から当業者には明ら かなはずである。 次の図面は、単に本発明の特定の態様の例示にすぎず、決して限定を意味する ものではない。 図1は、FGF-15のcDNA配列と対応する推定（deduced）アミノ酸配列を示す図で ある。 図2は、FGF-15と他のFGFファミリー構成要素の間のアミノ酸配列相同性を示す 図である。保存されたアミノ酸が容易に確認できる。 本発明の一側面によれば、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポ リペプチド、若しくはATCC寄託番号97146として1995年5月12日に寄託されたクロ ーンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸 分子（ポリヌクレオチド）が提供される。 本発明のFGF-15をコードするポリヌクレオチドは、最初は、ヒト副腎腫瘍組識 に由来するcDNAライブラリー中に発見された。これは繊維芽細胞増殖因子ファミ リーの全ての構成要素と構造的に関連し、252アミノ酸のポリペプチドをコード する読み取り枠を含有する。主な組み合わせのうち、1）ヒトFGF-9に対しては、 129アミノ酸の区間にわたって、41%の同一性と66%の配列類似性を持ち、2）ヒト KGFに対しては、88アミノ酸の領域にわたって、37%の同一性と59%の類似性を持 つ。 FGF/HBGFファミリーの特徴、GXLX(S,T,A,G)X6(D,E)CXFXEは、本発明のポリペ プチドにも保存されている（Xは任意のアミノ酸残基を表す；（D，E）はD残基又 はE残基を表す；X6は任意の6アミノ酸残基を表す）。 本発明のポリヌクレオチドはRNA型であってもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合 成DNAを含むDNA型であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖であっ てもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図1に示すコー ディング配列（配列番号1）又は上記寄託クローンのコーディング配列と同一で あってもよいし、図1のDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAと同じ成熟ポリペプ チドをコードするが、遺伝コードの冗長性又は縮重性ゆえに異なるコーディング 配列であってもよい。 図1の成熟ポリペプチド（配列番号2）若しくは上記寄託cDNAによってコードさ れる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、その成熟ポリペプチド のコーディング配列のみを含んでもよいし、その成熟ポリペプチドのコーディン グ配列とリーダー又は分泌配列などの付加的コーディング配列若しくはプロタン パク質配列をコードしてもよく、また、成熟ポリペプチド（付加的コーディング 配列を伴ってもよい）と非コーディング配列（イントロンや、成熟ポリペプチド に関するコーディング配列の5'及び/又は3'側にある非コーディング配列など） とを含んでもよい。 したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、 そのポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さらに付 加的なコーディング配列及び/又は非コーディング配列をも含むポリヌクレオチ ドとを包含する。 さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド若 しくは上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、類縁 体及び誘導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変種にも関係する。このポ リヌクレオチド変種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変種 であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの天然には存在しない変種であっても よい。 したがって本発明は、図1に示す成熟ポリペプチド(配列番号2)又は上記寄託ク ローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟ポリペプチドを コードするポリヌクレオチド、並びに図1のポリペプチド（配列番号2）若しくは 上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は 類縁体をコードする上記ポリヌクレオチドの変種を包含する。そのようなヌクレ オチド変種としては、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙げられる。 上述のように、本発明のポリヌクレオチドは、図1に示すコーディング配列（ 配列番号1）若しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に存在する対 立遺伝子変種であるコーディング配列を持ってもよい。当技術分野では知られて いるように、対立遺伝子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変 えない1又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を持ちうる代替型の ポリヌクレオチド配列である。 本発明は、上記成熟ポリペプチドのコーディング配列が宿主細胞によるポリペ プチドの発現と分泌を促進するポリヌクレオチド配列（例えばポリペプチドの細 胞からの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に同じ読み枠で 融合しているポリヌクレオチドをも包含する。リーダー配列を持つポリペプチド はプレタンパク質であり、そのリーダー配列は宿主細胞によって切断されて、そ のポリペプチドの成熟型を形成しうる。本発明ポリヌクレオチドは、成熟タンパ ク質に5'アミノ酸残基が追加されたプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配 列を持つ成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そのタンパク質の不活性型で ある。そのプロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 したがって、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、プロ配列を持つ タンパク質、又はプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を持つタンパク質 をコードできる。 本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製に利用されるマーカ ー配列にインフレーム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよい。 細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識を マーカー配列にして、そのマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備える ことができ、また、C0S-7細胞のような哺乳類宿主を使用する場合は、例えば血 球凝集素（HA）標識をマーカー配列にすることができる。HA標識は、インフルエ ンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら，Cell， 37:767（1984））。 「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生産に関与するDNAの区分を意味 し、コーディング領域の前後にある領域（リーダー及びトレーラー）と、個々の コーディング区間（エクソン）の間にある介在配列（イントロン）とを含む。 完全長FGF-15遺伝子の断片をcDNAライブラリー用のハイブリッド形成プローブ として用いることにより、その完全長遺伝子そのものや、その遺伝子に対して高 い配列類似性又は類似の生物学的活性を持つ他の遺伝子を単離することができる 。このタイプのプローブは、少なくとも30塩基からなることが好ましく、50塩基 以上を含んでもよい。また、このプローブは、完全長転写物に相当するcDNAクロ ーン、ゲノムクローン、若しくは調節及びプロモーター領域、エクソン並びにイ ントロンを含む完全なFGF-15遺伝子を含有するクローンを同定するためにも使用 できる。スクリーニングの一例では、オリゴヌクレオチドプローブの合成に既知 のDNA配列を用いることによって、FGF-15遺伝子のコーディング領域を単離する 。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレオチドを用いて、 ヒトのcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのプロ ーブがハイブリッド形成するライブラリーの構成要素を決定する。 さらに、本発明は、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、より 好ましくは少なくとも95%の同一性がある場合に上述の配列にハイブリッド形成 するポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、厳密な条件下で上述のポリヌク レオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用す る「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95%、好ましくは少なくと も97%の同一性がある場合にのみ、ハイブリッド形成が起こることを意味する。 好ましい態様として、上述のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌク レオチドは、図1のcDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAによってコードされる成 熟ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコ ードする。 また、上記ポリヌクレオチドは、上述のように、本発明のポリヌクレオチドに ハイブリッド形成し、かつ、該ポリヌクレオチドに対して同一性を持つ（活性は 保持しても、保持しなくてもよい）、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、よ り好ましくは少なくとも50塩基を含んでもよい。このようなポリヌクレオチドは 、例えば、配列番号1のポリヌクレオチドに関する（例えばポリヌクレオチド回 収用の）プローブとして、診断用プローブとして、あるいはPCRプライマーとし て使用できる。 したがって、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドに対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より 好ましくは少なくとも95%の同一性を持つポリヌクレオチド、及び少なくとも30 塩基、好ましくは少なくとも50塩基からなるその断片、並びにそのようなポリヌ クレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。 本明細書で言及する寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約に基づいて維持されるだろう。これらの寄託物は便宜上、用意 されているに過ぎず、これが35U.S.C§112で求められる寄託であると認めるわけ ではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列と、それによってコードさ れるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書の一部を構成し、万一 、本明細書に記載する配列の説明と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記 寄託物を製造、使用又は販売するには承諾が必要な場合があり、本明細書はその ような承諾を与えるものではない。 さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド又 は上記寄託cDNAによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペプチド、及びそ のようなポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体に関する。 図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリ ペプチドに関して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場合、これらの用 語は、そのポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプ チドを意味する。したがって類縁体には、プロタンパク質部分の切断によって活 性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成しうるプロタンパク質が含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド及び合成 ポリペプチドのいずれであってもよく、組換えポリペプチドが好ましい。 図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリ ペプチドの断片、誘導体又は類縁体は、（i）1又はそれ以上のアミノ酸残基が保 存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されて いるもの（その置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであっ てもよいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、（ii）1又はそれ以上の アミノ酸残基が置換基を含有するものであってもよく、或いは（iii）成熟ポリ ペプチドがもう1つの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大させるた めの化合物（ポリエチレングリコールなど））に融合しているものや、（iv）リ ーダー又は分泌配列や、成熟ポリペプチド又はプロタンパク質配列の精製に使用 される配列などといった付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの であってもよい。そのような断片、誘導体及び類縁体は、本明細書の教示から、 当業者の技術範囲に含まれると考えられる。 本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、単離型で提供されることが好 ましく、また、均一に精製されることが好ましい。 「単離された」という用語は、その物質がその当初の環境（例えばそれが天然 物ならばその自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた 動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離され」てい ないが、その天然系中に共在する物質の一部又は全部から分離されたそのポリヌ クレオチド又はポリペプチドは「単離され」ている。そのようなポリヌクレオチ ドがベクターの一部であったり、かつ/または、そのようなポリヌクレオチド又 はポリペプチドが組成物の一部であっても、そのようなベクター又は組成物がそ の自然環境の一部でないという点で、それらは「単離され」ている。 本発明のポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド（特にその成熟ポリペプ チド）及び配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも70%の類似性（好ましく は70%の同一性）、より好ましくは配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも 90%の類似性（より好ましくは90%の同一性）、さらに好ましくは配列番号2のポ リペプチドに対して少なくとも95%の類似性（さらに好ましくは95%の同一性）を 持つポリペプチドを包含し、また、一般的には少なくとも30アミノ酸、より好ま しくは少なくとも50アミノ酸を含有する上記ポリペプチドの一部をも包含する。 当技術分野では知られているように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、 一方のポリペプチドのアミノ酸配列とその保存的アミノ酸置換を、他方のポリペ プチドの配列と比較することによって決定される。 本発明ポリペプチドの断片又は一部は、対応する完全長ポリペプチドのペプチ ド合成による生産に使用できる。つまり、これらの断片は、完全長ポリペプチド を生産するための中間体として使用できる。本発明ポリヌクレオチドの断片又は 一部は、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用できる。 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺 伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産にも 関係する。 宿主細胞は、本発明のベクター（それは例えばクローニングベクターであって もよいし、発現ベクターであってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形 質転換若しくはトランスフェクション）されうる。ベクターは、例えばプラスミ ド、ウイルス粒子、ファージなどの形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プ ロモーターの活性化、形質転換体の選択若しくは本発明遺伝子の増幅に適した変 更が施された従来の栄養培地で培養できる。温度やpHなどといった培養条件は、 発現用に選択したその宿主細胞に対して過去に用いられた条件であり、当業者に は明らかだろう。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生産するた めに使用できる。したがって、例えば、そのポリヌクレオチド配列は、種々の発 現ベヒクル（具体的にはそのポリペプチドを発現させるためのベクター又はプラ スミド）のいずれにも組込むことができる。そのようなベクターとしては、染色 体DNA配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40の誘導体、細菌性プ ラスミド、ファージDNA、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わ せに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏 痘ウイルス、偽性狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他のベクタ ーはプラスミドであっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能であるか ぎり、使用できる。 適当なDNA配列は、種々の手法によってベクターに挿入できる。一般的には、 当技術分野で知られる手法によって、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にDNA 配列を挿入する。そのような手法その他は、当業者の技術範囲に含まれると考え られる。 発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令する適当な発現制御配列（プロ モーター）に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの代表例としては 、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、ファージラムダPLプロモータ ー、及び原核細胞、真核細胞若しくはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御 することが知られているその他のプロモーターを挙げることができる。発現ベク ターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位と転写終結区（ターミネーター）をも 含有する。またベクターは、発現の増幅に適した配列を含んでもよい。 さらに発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択に利用できる表現型的 特徴を与えるための遺伝子（例えば真核細胞培養用のネオマイシン耐性やジヒド ロ葉酸レダクターゼ、大腸菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性 など）を含有することが好ましい。 上述の適当なDNA配列と適当なプロモーター又は制御配列とを含有するベクタ ーを、適当な宿主の形質転換に使用することによって、その宿主にそのタンパク 質を発現させることができる。適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプ トミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、キイロショウ ジョウバエS2及びSpodoptera Sf9などの昆虫細胞、CHO、COS又はボーズ黒色腫な どの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙げることができる。適当な宿 主の選択は、本明細書の教示から、当業者の技術範囲に含まれると考えられる。 より具体的に述べると、本発明は、上に広く記述した配列の1又はそれ以上を 含む組換え構築物をも包含する。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は 逆方向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベクターなど）を含む 。この態様の好ましい側面では、上記構築物がさらに、上記配列に作動可能に連 結 した調節配列（プロモーターなどを含む）をも含有する。好適なベクターとプロ モーターは当業者に多数知られており、市販されている。次に挙げるベクターは その例である。細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、phagescript、p siX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene ）、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真核細胞用 ：pWLneo、pSV2cat、p0G44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pS VL（Pharmacia）。ただし、その他のプラスミド又はベクターであっても、それ がその宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用できる。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターや、選択可能マーカーを持つ他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択 することができる。適当なベクターはPKK232-8とpCM7である。特に有名な細菌プ ロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL及びtrpが挙げら れる。真核プロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジンキナーゼ、初期 及び後期SV40、レトロウイルスのLTR、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる 。適当なベクターとプロモーターの選択は、当該技術分野の通常の技術水準に十 分含まれる。 さらなる態様として、本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関する。 本発明の宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよいし、酵母 細胞のような下等真核細胞であってもよく、また、細菌細胞のような原核細胞で あってもよい。宿主細胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフ ェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、又はエレクトロポ レーションによって達成できる（Davis，L.，Dibner，M．Battey，I.，Basic Me thods in Molecular Biology（1986））。 宿主細胞中の構築物を従来のように使用することによって、その組換え配列に よってコードされる遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発明の ポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成生産することもできる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌 その他の細胞中で発現させることができる。本発明のDNA構築物から得られるRNA を用いて上記タンパク質を生産するには、無細胞翻訳系も使用できる。原核宿主 及び真核宿主での使用に適したクローニングベクターと発現ベクターは、Sambro okら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版，ニューヨーク州コー ルドスプリングハーバー（1989））に記述されており、その開示は参考文献とし て本明細書の一部を構成する。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、そのベ クターにエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーはDN Aのシス作用性要素であり、通常10〜300bpであって、プロモーターに作用してそ の転写を増大させる。複製起点の後期側（100〜270bp）にあるSV40エンハンサー 、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあ るポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどがその例である 。 一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点、その宿主細胞の形質転換を可能 にする選択可能マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカロミ セス・セレビシェTRPl遺伝子）及び下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子 由来のプロモーターを含むだろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3- ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵素、α-因子、酸性ホスフ ァターゼ又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる 。異種構造配列は、翻訳開始配列と終止配列及び好ましくは翻訳されたタンパク 質の周辺腔又は細胞外培地への分泌を指令することのできるリーダー配列に対し て適当な位相で組み立てられる。任意に、その異種配列が、発現した組換え産物 の安定化や簡便な精製などといった所望の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（ identification peptide）を含む融合タンパク質をコードしてもよい。 細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮ Ａ配列を、適当な翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プロモ ーターに対して作動可能な解読位相（reading phase）に挿入することによって 、構築される。ベクターは、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれば 、その宿主内での増幅を提供するために、1又はそれ以上の表現型選択可能マー カーと複製起点を含むだろう。形質転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯 草 菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトミセス属及びスタフ ィロコッカス属に属する様々な種が挙げられる。ただし、その他の宿主も選択肢 として使用できる。 細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例としては、周知のクローニングベク ターpBR322（ATCC 37017）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する選択可 能マーカー及び細菌性複製起点を含むものを挙げることができる（ただしこれに 限られるわけではない）。そのような市販ベクターとしては、例えばpKK223-3（ Pharmacia Fine Chemicals,スウェーデン・ウプサラ）及びGEM1（Promega Biotec .，米国ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」 部分を、適当なプロモーター及び発現させようとする構造配列と組み合わせる。 適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、 選択したプロモーターを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって抑制 解除し、細胞をさらに培養する。 典型的には、細胞を遠心分離によって収集し、物理的又は化学的手段によって 破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために確保する。 タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理 、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用など、都合のよい方法のいずれでも破壊でき る。 組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳類細胞培養系も使用できる。哺乳類 発現系の例としては、Gluzman，Cell，23:175（1981）に記載のサル腎繊維芽細 胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させることのできる他の細胞系（例え ばC127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクターは 、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサーを含み、さらに必須のリボソ ーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部位 、転写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要な非転写遺伝子要素 を提供するには、SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列（例えばSV40起点、初 期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位及びポリアデニル化部位）を使 用することができる。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰 イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ ィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含 む従来の方法によって、組換え細胞培養から回収、精製できる。必要なら、成熟 タンパク質の立体配置の完成に、タンパク質再生段階を使用してもよい。最後に 、最終的な精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用する ことができる。 本発明のポリペプチドは、天然の精製産物であってもよいし、化学合成法の生 成物であってもよく、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例えば培 養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞など）か ら生産されるものであってもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発 明のポリペプチドは、哺乳類その他の真核炭水化物でグリコシル化されることも あるし、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドは、開始メチ オニンアミノ酸残基を含んでもよい。 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞成長を刺激することができるので、種 々の疾患状態（例えば血栓症、動脈硬化、その他の心血管病）による虚血組識の 再血管化を刺激するための処置に使用できる。これらのポリペプチドは、血管形 成と四肢再生の刺激にも使用できる。 本発明ポリペプチドは、けが、火傷、手術後の組識修復及び潰瘍による創傷の 処置にも使用できる。というのは、本発明ポリペプチドは、起源の異なる種々の 細胞（例えば繊維芽細胞と骨格筋細胞）に対して有糸分裂促進性を持ち、それゆ えに、傷ついた組識又は病的な組識の修復又は交換を促進するからである。 本発明のポリペプチドは、ニューロン成長の刺激や、ある種のニューロン障害 又は神経変性病（アルツハイマー病、パーキンソン病及びAIDS関連合併症など） で起こるニューロン損傷の治療及び予防にも使用できる。FGF-15は軟骨細胞成長 刺激能力を持つので、それらを用いて、骨及び歯周再生を向上させ、組識移植や 骨移植片の補助とすることができる。 本発明のポリペプチドを使用すれば、ケラチン生成細胞の成長を刺激すること によって、日焼けによる皮膚の老化を予防することもできる。 FGF-15ポリペプチドは、脱毛の予防にも使用できる。というのは、FGFファミ リー構成要素は、毛髪形成細胞を活性化し、メラニン形成細胞の成長を刺激する からである。同様に、本発明のポリペプチドを他のサイトカインと併用すれば、 造血細胞と骨髄細胞の増殖と分化を刺激することもできる。 FGF-15ポリペプチドは、移植前の器官を維持するためや、一次組識の細胞培養 を支持するために使用することもできる。 本発明のポリペプチドは、初期胚における内胚葉由来組識の分化を誘導するた めにも使用できる。 本発明のさらなる側面によれば、科学的研究、DNAの合成、DNAベクターの生産 に関係する試験管内用途や、ヒト疾患治療用の治療薬と診断薬を提供する目的で 、上記ペプチド又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する 方法が提供される。 本発明は、本発明ポリペプチドに対するレセプターの同定法を提供する。レセ プターをコードする遺伝子は、例えばリガンドパンニング（ligand panning）や FACSソーティング（Coliganら，Current Protocols in Immun.，1(2),第5章（19 91））など、当業者の知る数多くの方法によって同定できる。好ましくは、本発 明ポリペプチドに応答する細胞（例えばFGFファミリータンパク質に対するレセ プターを複数含有することが知られているNIH3T3細胞や、SC-3細胞）からポリア デニル化RNAを調製し、そのRNAから作成したcDNAライブラリーをいくつかのプー ルに分割し、それらを用いて本発明ポリペプチドに応答しないCOS細胞その他の 細胞をトランスフェクションするという発現クローニング法を使用する。トラン スフェクションされた細胞をガラススライド上で生育し、それを標識しておいた 本発明のポリペプチドにさらす。ポリペプチドは、ヨウ素化や、部位特異的プロ テインキナーゼに関する認識部位の組み込みなどといった種々の手段で標識でき る。 固定と培養の後、そのスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。陽性 プールを同定し、サブプールを調製して再トランスフェクションし、サブプール 化と再スクリーニング作業を繰り返すことによって、最終的に、その推定レセプ ターをコードする単一のクローンを得る。 レセプターを同定するためのもう1つの方法として、標識したポリペプチドを 、そのレセプター分子を発現させる細胞膜又は抽出調製物と光親和性（photo-af finity）結合させてもよい。架橋した物質をPAGE分析によって分離し、X線フィ ルムにさらす。そのポリペプチドのレセプターを含有する標識された複合体を切 り出し、ペプチド断片に分割し、タンパク質微量配列決定にかけることができる 。微量配列決定によって得たアミノ酸配列を用いて、cDNAライブラリーをスクリ ーニングするための一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計することによ り、その推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。 本発明は、本発明ポリペプチドの作用を調節する化合物を同定するための化合 物スクリーニング法を提供する。そのようなアッセイの一例では、繊維芽細胞が 正常に増殖する細胞培養条件下に、哺乳類繊維芽細胞、本発明のポリペプチド、 スクリーニングしようとする化合物、及び3[H]チミジンを混合する。スクリーニ ングする化合物の不在下に対照アッセイを行なって、その化合物の存在下におけ る繊維芽細胞増殖の量と比較すれば、それぞれの場合の3[H]チミジンの取り込み を測定することにより、その化合物が増殖を刺激するかどうかを決定できる。繊 維芽細胞増殖の量は、液体シンチレーションクロマトグラフィーで3[H]チミジン の取り込みを測定することによって測定される。この方法によって、アゴニスト （作用薬）化合物とアンタゴニスト（拮抗薬）化合物の両方を同定することがで きる。 もう1つの方法として、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現させ る哺乳類細胞又は膜調製物を、被験化合物の存在下に、標識した本発明ポリペプ チドと共に培養する。そうすれば、その化合物がこの相互作用を増大させる能力 又は遮断する能力を測定することができるだろう。別法として、スクリーニング する化合物とFGF-15レセプターの相互作用後に、既知の第2メッセンジャー系の 応答を測定し、その化合物の上記レセプターへの結合能と、第2メッセンジャー 応答誘導能を測定することにより、その化合物が潜在的アゴニスト又はアンタゴ ニストであるかどうかを決定する。このような第2メッセンジャー系としては、c AMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル又はホスホイノシチド加水分解な どが挙げられるが、これらに限るわけではない。 アンタゴニスト化合物の例には、本発明ポリペプチドのレセプターに結合する が第2メッセンジャー応答を誘導しない、又はFGF-15ポリペプチド自体に結合す る、抗体又は（場合によって）オリゴペプチドがある。また、そのレセプターに 結合するが、第2メッセンジャー応答を誘導しないので、本発明ポリペプチドの 作用を効果的に遮断する、突然変異型ポリペプチドも、潜在的アンタゴニストで ありうる。 FGF-15遺伝子及び遺伝子産物に対するもう1つのアンタゴニスト化合物は、ア ンチセンス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技 術は、アンチセンスDNA又はRNA若しくは三重らせん形成による遺伝子発現の制御 に使用でき、これらの方法は共に、DNA又はRNAに対するポリヌクレオチドの結合 に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド配列の5'コーディング部分を用いて、約10〜40塩基対長のアンチセンスRNA オリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺 伝子の領域に相補的になるように設計されるので（三重らせん−Leeら，Nucl．A cids．Res.，6:3073（1979）；Cooneyら，Science，241:456（1988）；Dervanら ， Science，251:1360（1991）を参照）、本発明ポリペプチドの転写と生産を妨 害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRNAにハイブリッド形 成し、そのmRNA分子の本発明ポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス− Okano，J．Neurochem.，56:560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，フロリダ州ボカラトン（1988） を参照）。アンチセンスRNA又はDNAが生体内で発現して、ポリペプチドの生産を 阻害しうるように、上述のオリゴヌクレオチドを細胞に送達することもできる。 潜在的アンタゴニスト化合物には、レセプターの結合部位に結合し、その部位 を占拠して、レセプターをそのポリペプチドに近づけなくすることによって、正 常な生物活性を妨害する小分子も含まれる。そのような小分子の例としては、小 ペプチド又は小さいペプチド様分子が挙げられるが、これらに限られるわけでは ない。 アンタゴニスト化合物は、新生物細胞及び組識に対する本発明ポリペプチドの 細胞成長及び増殖効果（すなわち、腫瘍血管形成の刺激）を阻害することにより 、例えば腫瘍の形成又は増殖において、異常な細胞成長及び増殖を遅延又は防止 するために使用できる。 上記アンタゴニストは、血管過多性疾患を予防するため、及び被膜外白内障手 術後の上皮水晶体細胞の増殖を予防するためにも使用できる。本発明ポリペプチ ドの有糸分裂促進活性の予防は、気球血管形成術後の再狭窄のような場合にも望 ましいだろう。 上記アンタゴニストは、創傷治癒中の瘢痕組識の成長を予防するためにも使用 できる。 上記アンタゴニストは、後述するような医薬的に許容しうる担体を含む組成物 として使用できる。 本発明のポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストを、適当な医薬担体と 組み合わせて、非経口投与用医薬組成物にすることができる。そのような組成物 は、治療有効量の上記ペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストと、医薬的に許 容できる担体又は賦形剤とを含有する。そのような担体としては、塩水、緩衝塩 水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせが 挙げられるが、これらに限られるわけではない。その製剤は、投与法に適合すべ きである。 本発明は、本発明医薬組成物の1又はそれ以上の成分で満たされた1又はそれ以 上の容器からなる医薬パック又はキットをも提供する。そのような容器には、医 薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定さ れた形式で、ヒト投与に関する製造、使用又は販売の該機関による認可を反映す る情報を付すことができる。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニスト及びア ンタゴニストを他の治療用化合物と併用してもよい。 上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経 路、皮下経路、鼻孔内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与できる。上 記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は予防に有効な量で投与される。 一般的には、少なくとも約10mg/kg体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8mg /kg体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほとんどの場合、日用量は、投与 経路、症状などを考慮して、約10mg/kg〜約1mg/kg体重であり、1cm2あたり約0.1 μg〜9mgまでの投与量を投与することが好ましい。 本発明のポリペプチドと、ポリペプチドであるアゴニスト及びアンタゴニスト 化合物を、本発明に従って使用する場合は、それを生体内における上記ポリペプ チドの発現によってすることもできる。これはしばしば「遺伝子療法」と呼ばれ る。 したがって、例えば、細胞を、生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌク レオチド（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置しようとする患者に 、操作したその細胞を与えることができる。このような方法は当技術分野では良 く知られている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレ トロウイルス粒子を使用して、当技術分野で知られる手法で、細胞を操作するこ とができる。 さらに、生体内でポリペプチドを発現させるために、例えば当技術分野で知ら れる手法によって、生体内で細胞を操作することもできる。生体内で細胞を操作 し、生体内でポリペプチドを発現させるには、当技術分野では知られているよう に、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を生 産するための生産細胞を患者に投与すればよい。そのような方法による本発明ポ リペプチドの上記その他の投与法は、本発明の教示から、当業者には明らかなは ずである。例えば、細胞を操作するための発現ベヒクルは、適当な送達ベヒクル と組み合わせれば生体内で細胞を操作するために使用できるアデノウイルスなど 、レトロウイルス粒子以外であってもよい。 上述のレトロウイルスプラスミドベクターの供給源となりうるレトロウイルス としては、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス 、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、 テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、脊髄増 殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限られるわけでは ない。一態様として、レトロウイルスプラスミドベクターをモロニーネズミ白血 病ウイルスから誘導する。 ベクターは1又はそれ以上のプロモーターを含む。使用できる好適なプロモー ターとしては、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター、Millerら，Biotechniqu es ,第7巻,第9号，980-990（1989）に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プ ロモーター、その他任意のプロモーター（例えばヒストンプロモーター、pol II Iプロモーター、β-アクチンプロモーター（ただしこれらに限らない）のような 真核細胞プロモーターなどの細胞性プロモーター）が挙げられるが、これらに限 られるわけではない。使用できるその他のウイルスプロモーターとしては、アデ ノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボ ウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限られるわけではない。適当な プロモーターの選択は、本明細書の教示から、当業者には明らかだろう。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、好適なプロモーターの制御下 にある。使用できる好適なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター （アデノウイルス主要後期プロモーターなど）、異種プロモーター（サイトメガ ロウイルス（CMV）プロモーターなど）、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモー ター、誘導性プロモーター（MMTプロモーターやメタロチオネインプロモーター など）、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモータ ー、ヒトグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（単純 ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど）、レトロウイルスLTR（上述の修 飾レトロウイルスLTRを含む）、β-アクチンプロモーター、ヒト成長ホルモンプ ロモーターが挙げられるが、これらに限るわけではない。プロモーターは、本発 明ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよ い。 上記レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞を形質導 入することによって、生産細胞系を作成する。トランスフェクションできるパッ ケージング細胞の例としては、Miller，Human Gene Therapy,第1巻，5-14頁（19 90）（この刊行物の全内容は参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載 のDAN、PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψC RIP、GP+E-86及びGP+envAm12細胞系が挙げられるが、これらに限るわけではない 。ベクターは、当技術分野で知られる任意の手段で、パッケージング細胞に形質 導入できる。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの 使用及びリン酸カルシウム沈降法が挙げられるが、これらに限るわけではない。 もう1つの方法として、レトロウイルスブラスミドベクターをリポソームに封入 するか、脂質にカップリングしてから、宿主に投与してもよい。 上記生産細胞系は、本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レ トロウイルスベクター粒子を生成する。そのようなレトロウイルスベクター粒子 は、試験管内又は生体内で、真核細胞の形質導入に使用できる。形質導入された 真核細胞は、本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるだろう。形 質導入できる真核細胞としては、胚幹細胞、胚癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、繊 維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び気管支上皮細胞が挙げら れるが、これらに限られるわけではない。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異の存在に 関係する疾患、又はその疾患に対する罹病性を検出するための診断的アッセイの 一部として、本発明遺伝子を使用することにも関係する。 本発明の遺伝子に突然変異を持つ個体は、種々の技術によってDNAレベルで検 出できる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び剖検などといった患 者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは、検出に直接使用してもよいし、 分析に先立って、PCRを用いて酵素的に増幅してもよい（Saikiら，Nautre，324: 163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に使用できる。例えば、本発明のポリ ペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーを使用して、突然変異を同 定及び分析することができる。例えば、欠失や挿入は、増幅産物のサイズが正常 な遺伝子型とは異なることによって検出できる。点変異は、放射線標識したRNA 配列若しくは放射線標識したアンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリッ ド形成させることによって同定できる。完全に一致する配列は、RNaseA消化若し くは融解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と識別することがで きる。 DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変性剤を含む（若しくは含まない）ゲ ルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって、達成でき る。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化できる。 配列が異なるDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、 異なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分的融解温度に従って、 ゲル中の異なる位置で減速される（例えばMyersら，Science，230:1242（1985） を参照のこと）。 特定の位置における配列の変化は、化学的切断法や、RNase及びS1保護などの ヌクレアーゼ保護アッセイでも明らかにできる（例えばcottonら，PNAS，USA，8 5:4397-4401（1985）を参照）。 したがって、特定のDNA配列の検出は、ハイブリッド形成、RNase保護、化学的 切断、直接DNA配列決定などの方法、若しくは制限酵素の使用（例えば制限断片 長多形（Restriction Fragment Length Polymorphisms；RFLP））及びゲノムDNA のサザンブロッティングによって達成できる。 より従来的なゲル電気泳動とDNA配列決定に加えて、インシチュー分析でも突 然変異を検出することができる。 また、本発明は、種々の組織におけるFGF-15ポリペプチドのレベルの変化を検 出する診断的アッセイにも関係する。正常な対照組織試料に比べて本発明タンパ ク質の発現が過剰であることは、異常な細胞増殖（例えば腫瘍）の存在を示しう るからである。宿主から得た試料中のタンパク質レベルを検出するためのアッセ イは、当業者にはよく知られており、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ 、ウェスタンブロット分析、ELISAアッセイ及び「サンドイッチ」アッセイなど が ある。ELISAアッセイ（Coliganら，Current Protocols in Immunology，1(2),第 6章（1991））では、先ず、本発明ポリペプチドの抗原に特異的な抗体（好まし くはモノクローナル抗体）を調製する。さらに、そのモノクローナル抗体に対す るリポーター抗体を調製する。リポーター抗体には、放射活性や蛍光などの検出 可能な試薬（この例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）を結合する。次に、 宿主から試料を採取し、その試料中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば ポリスチレン皿）上でインキュベートする。次に、非特異的タンパク質（ウシ血 清アルブミンなど）と共にインキュベートすることによって、皿上の遊離のタン パク質結合部位をすべて覆う。次に、上記モノクローナル抗体をその皿中でイン キュベートする。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合した 本発明ポリペプチドのすべてに結合する。未結合のモノクローナル抗体を緩衝液 で洗い流す。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したリポーター抗体をそ の皿に入れ、目的のタンパク質に結合したモノクローナル抗体にレポーター抗体 を結合させる。 次に、未結合のリポーター抗体を洗い流す。次に、ペルオキシダーゼ基質をそ の皿に加え、所定の期間中に発色する色の量を標準曲線と比較すれば、所定の体 積の患者試料中に存在するポリペプチドの量の測定値が得られる。 競争アッセイを使用する場合は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を固形 支持体に結合する。次に、標識したFGF-13と宿主から得た試料をその固形支持体 上に通し、例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーなどによって検出し た標識の量を、その試料中の本発明ポリペプチドの量に相関させることができる 。 「サンドウィッチ」アッセイはELISAアッセイに似ている。「サンドウィッチ 」アッセイでは、本発明のポリペプチドを固形支持体上に通し、固形支持体に取 り付けた抗体に結合させる。次に、二次抗体を目的のポリペプチドに結合させる 。次に、二次抗体に特異的であってかつ標識されている三次抗体をその固形支持 体上に通して、二次抗体に結合させると、量を定量することができる。 本発明の配列は、染色体同定にも有効である。本発明の配列は、個々のヒト染 色体上の特定の位置に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成することがで きる。また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必要とされているこ とでもある。現在のところ、染色体位置の標識に利用できる、実際の配列データ （反復多形（repeat polymorphism's））に基づく染色体標識試薬はほとんどな い。本発明による染色体に対するDNAのマッピングは、それらの配列を疾患に関 係する遺伝子と相関させる際の重要な第1段階である。 簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPCRプライマー（15〜25bpが好ましい ）を調製することによって、染色体に対してマッピングできる。ゲノムDNA中の2 エクソン以上にまたがることによって増幅工程を複雑にすることのないプライマ ーをすばやく選択するには、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次に 、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに、こ れらのプライマーを用いる。そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハ イブリッドのみが、増幅断片を生成するだろう。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て る迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用いると、 同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパネル若しくは大きいゲノムクロ ーンのプールで、サブマッピング（sublocalization）を達成できる。染色体に 対するマッピングに同様に使用できる他のマッピング法としては、インシチュー ハイブリッド形成、染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリッ ド形成による予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sorted）染色体によ る予備スクリーニングが挙げられる。 中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光インシチューハイブリッド形成（FISH ）を用いると、1段階で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は50又 は60塩基程度のcDNAでも使用できる。この技術の概要については、Vermaら，Hum an Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press,ニューヨー ク（1988）を参照のこと。 配列を正確な染色体位置にマッピングしたら、その配列の染色体上の物理的位 置を遺伝子マップデータと相関させることができる。そのようなデータは、例え ばV．McKusick，Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学ウ ェ ルチ・メディカル・ライブラリーからオンラインで入手できる）に認められる。次 に、同じ染色体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分析（linkag e analysis）（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定する。 次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又はゲノム配列の相違を決定する必要が ある。ある突然変異がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には観測 されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子であるかもしれない。 物理的マッピング技術と遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、その疾患 に関係する染色体領域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の潜在 的原因因子のうちの一つであろう（1メガ塩基マッピング解像度と20bにつき1遺 伝子と仮定）。 本発明ポリペプチド、その断片その他の誘導体、その類縁体、若しくはそれら を発現させる細胞は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として使用で きる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体であり うる。本発明は、キメラ抗体、一本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現 ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体及び断片の生産には、当技術 分野で知られる種々の方法を使用することができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じる抗体は、動物（好ましく はヒト以外の動物）にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することによっ て得ることができる。そのようにして得た抗体は、そのポリペプチド自体に結合 するだろう。この方法では、そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用し て、その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させることもできる。そのよ うな抗体は、そのポリペプチドを発現させる組織からそのポリペプチドを単離す るために使用できる。 モノクローナル抗体の製造には、連続的継代細胞系培養によって生産される抗 体を与える任意の技術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hler及びMilstein，1975，Nature，256:495-497）、トリオーマ（trioma）技術 、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983，Immunology Today 4:72）及 びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1 98 5, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.，77-96頁 ）が挙げられる。 一本鎖抗体の生産について記述した技術（米国特許4,946,778）は、本発明の 免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることができる 。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する 擬人化抗体を発現させることもできる。 以下の実施例を参照して、本発明をさらに説明する。ただし、本発明はこれら の実施例に限定されないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や量は すべて重量に基づく。 下記実施例の理解を容易にするため、頻繁に使用する方法及び/又は用語をい くつか説明しておく。 「プラスミド」は、小文字pとその前後の大文字及び/又は数字で指定される。 本明細書における出発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手できる か、若しくは入手できるプラスミドから公表された方法に従って構築できる。さ らに、当該技術分野では、本明細書に記述するプラスミドと等価なプラスミドが 知られており、それらは当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素によるDN Aの触媒的切断を意味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販されてお り、それらの反応条件、補因子その他の必要条件は、当業者に知られているであ ろうものを使用した。分析には、通常、１μgのプラスミド又はDNA断片を約2単 位の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築用のDNA断片を 単離する場合は、通常、より大きい体積中で、5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵 素で消化する。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、製造者によって指 定される。通常は37℃で約1時間のインキュベーション時間を使用するが、これ は供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応液をポリアクリ ルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離する。 切断した断片のサイズ分離は、Goeddel，D.ら，Nucleic Acids Res.，8:4057 （1980）に記載の8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。 「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成できる一本鎖ポリデオキシヌクレ オチド又は2本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合 成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないので、キナーゼの存在下にATPで リン酸基を付加しないと、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろう 。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片に連結するだろう。 「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間にリン酸ジエステル結合を形成させる 工程をいう（Maniatis，T.ら,同上，146頁）。特に断わらない限り、連結は、既 知の緩衝液と条件を用いて、連結しようとするほぼ等モル量のDNA断片0.5μgに つき10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で達成することができる。 特に明言しない限り、形質転換はGraham，F.及びVan der Eb，A.，Virology， 52:456-457（1973）の方法で行なった。 実施例1 FGF-15 タンパク質の細菌発現と精製 FGF-15をコードするDNA配列（ATCC No．97146）を、まず、プロセシングされ たタンパク質（シグナルペプチド配列を欠く）の5'配列とその遺伝子の3'側にあ るベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する 。その遺伝子に対応する追加のヌクレオチドを、その5'配列と3'配列に付加する 。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、5’GCCAGA CCATGG TAAAACCG GTGCCCCTC 3'（配列番号3）という配列を持ち、NcoI制限酵素部位（太字部分）を含有する 。3'配列（5’GGCAGG AGATCT TGTTGTCTTACTCTTGTTGAC 3'；配列番号4）は、BglI I部位に相補的な配列（太字部分）を含有し、その後に、FGF-15コーディング配 列の21ヌクレオチドが続いている。 これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE60（Quiagen，Inc.，91311カ リフォルニア州チャッツワース）上の制限酵素部位に対応する。pQE-60は抗生物 質耐性（Ampr）、細菌性複製起点（ori）、IPTGで制御できるプロモーターオペ レーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-His標識及び制限酵素部位を コードする。次に、pQE-60をNcoIとBglIIで消化した。増幅した配列をpQE-60中 に連結し、ヒスチジン標識及びリボソーム結合部位（RBS）と枠を合わせて挿入 する。次に、その連結混合物を用いて、Sambrook，J.ら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Harbor Laboratory Press（1989）に記載の手法で、 大腸菌M15/rep4株（Qiagen，Inc.）を形質転換する。M15/rep4は、lacI抑制因子 を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kanr）を付与するプラスミドpREP4の複数 コピーを含有する。LBプレート上で成長するそれらの能力によって形質転換体を 同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを 単離し、制限分析によってそれを確認する。所望の構築物を含有するクローンを 、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）の両方を補足したLB液体培地で、終夜（O /N）培養する。そのO/N培養物を、1:100〜1:250の比率で、大きい培養に接種す る。光学密度600（O.D.600）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育する。次に、IPTG （「イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド」）を最終濃度1mMになるよう 加える。IPTGは、lacI抑制因子を不活化することによって、P/Oをきれいにし、 遺伝子発現の増大を誘導する。細胞をさらに3〜4時間生育する。次に、遠心分離 によって細胞を収集する。細胞ペレットをカオトロピック試薬6M塩酸グアニジン 中で可溶化する。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を含有するタンパク質 による強固な結合が可能な条件下に、ニッケル-キレートカラムでのクロマトグ ラフィーによって、可溶化したFGF-15を精製する(Hochuli，E.ら，J．Chromatog raphy 411:177-184(1984))。タンパク質を6M塩酸グアニジンpH5.0でカラムから 溶出させ、再生のために、3M塩酸グアニジン、100mMリン酸ナトリウム、10mMグ ルタチオン（還元型）及び2mMグルタチオン（酸化型）に調節する。この溶液を1 2時間インキュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析 する。 実施例2 バクロウイルス発現系を用いるFGF-15のクローニングと発現 完全長FGF-15タンパク質をコードするDNA配列（ATCC No．97146）を、その遺 伝子の5'及び3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅 する。 そのFGF-15 5'プライマーは、5’CTAGT GGATCC GCCATCATGGTAAAACC GGTGCCC 3 '（配列番号5）という配列を持ち、Bam HI制限酵素部位（太字部分）を含有し、 その部分に、真核細胞における翻訳開始用の効率のよいシグナルに似た4ヌクレ オチド（Kozak，M.，J．Mol．Biol.，196:947-950（1987））が続き、それは上 記遺伝子の最初の18ヌクレオチドのすぐ後方にある（翻訳開始コドン「ATG」に 下線を引いてある）。 3'プライマーは5’CGACT GGTACC AGCCACGGAGCAGGAATGTCT 3'（配列番号6）と いう配列を持ち、制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位（太字部分）と、上 記遺伝子の3'非翻訳配列に相補的な21ヌクレオチドを含有する。 増幅した配列を、市販のキット（「Geneclean」，BI0 101 Inc.，カリフォル ニア州ラジョラ）を用いて、1%アガロースゲルから単離する。次に、その断片を 各エンドヌクレアーゼで消化した後、1%アガロースゲルで再び精製する。この断 片をF2と命名する。 バクロウイルス発現系（概要についてはSummers，M.D.及びSmith，G.E.，1987 , A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture pr ocedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555を参 照のこと）によるタンパク質の発現には、ベクターpA2（pVL941ベクターを改良 したもの、後述）を使用する。この発現ベクターは、Autographa californica核 多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーター と、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHI及びXbaIの認識部位とを含有する 。効率のよいポリアデニル化のために、シミアンウイルス（SV）40のポリアデニ ル化部位を使用する。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ- ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先 行するポリヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入する。ポリヘドリン配列の両 端には、同時にトランスフェクションされる野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相 同組換え用に、ウイルス配列を隣接させる。pA2の代わりに、pRG1、pAc373、pVL 941及びpAcIM1（Luckow，V.A.及びSummers，M.D.，Virology，170:31-39）など といった他の多くのバクロウイルスベクターも使用できる。 そのプラスミドを上記制限酵素で消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて 、当技術分野で知られる手法で脱リン酸化する。次に、市販のキット（「Genecl ea n」，BI0 101 Inc.，カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、そのDNAを1%アガロ ースゲルから単離する。このベクターをV2と命名する。 断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNAリガーゼで連結する。次に、大腸菌 DH5α細胞を形質転換し、そのプラスミド（pBacFGF-15）を含有する細菌を、各 制限酵素を用いて同定する。クローン化した断片の配列をDNA配列決定によって 確認する。 リポフェクション法（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-741 7（1987））を用いて、5μgのプラスミドpBacFGF-15を、市販の直鎖化したバク ロウイルス（「BaculoGold TM baculovirus DNA」，Pharmingen,カリフォルニア 州サンディエゴ）1.0μgと同時にトランスフェクションする。 1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAと5μgの上記プラスミドを、血清非含有グレ ース培地（Life Technologies Inc.，メリーランド州ガイサースブルク）50μl の入ったマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフ ェクチン10μlとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間インキュベー トする。次に、血清を含まないグレース培地1mlが入っている35mm組織培養プレ ートに接種したSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に、上記トランスフェクション混 合物を滴下する。プレートを前後にゆすって、新たに加えた溶液を混合する。次 に、そのプレートを27℃で5時間培養する。5時間後、トランスフェクション溶液 をプレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグレース昆虫培地1mlを加 える。そのプレートを培養器に戻し、培養を27℃で4日間続ける。 4日後に上清を集め、Summers及びSmith（上記）の記述と同様にして、プラー クアッセイを行なう。改良点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.， ガイサースブルク）を含むアガロースゲルを使用する。これは、青く染色したプ ラークの単離を容易にする。「プラークアッセイ」に関する詳細な説明は、Life Technologies Inc.（ガイサースブルク）が発行している昆虫細胞培養とバクロ ウイルス学に関するユーザーズガイドの9-10頁にも認められる。 連続希釈の4日後に、ウイルスを細胞に加え、青く染色したプラークをエッペ ンドルフピペットのチップで拾う。次に、組換えウイルスを含有するその寒天を 、 グレース培地200μlの入ったエッペンドルフチューブ中に再懸濁する。短い遠心 分離によって寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35 mm皿に接種したSf9細胞を感染させる。４日後に、これらの培養皿の上清を収集 し、4℃で保存する。 Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグレース培地で生育する。その細胞を 組換えバクロウイルスV-FGF-15に感染多重度（MOI）2で感染させる。6時間後、 培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF900 II培地（Life Technologie s Inc.,ガイサースブルク）に置換する。42時間後、5μCiの35S-メチオニンと5 μCiの35S-システイン（Amersham）を加える。細胞をさらに16時間培養した後、 遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグラ フィーで可視化する。 実施例4 COS 細胞における組換えFGF-15の発現 1）SV40複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起点、4）CMV プロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV40イントロン及びポリアデニル 化部位を含有するベクターpcDNA3/Amp（Invitrogen）から誘導されるプラスミド FGF-15-HAの発現。全FGF-15前駆体と、その3'末端にインフレーム（in frame） 融合したHA標識とをコードするDNA断片を、上記ベクターのポリリンカー領域に クローニングする。したがって、その組換えタンパク質の発現はCMVプロモータ ーに制御される。HA標識は、既に記述したように、インフルエンザ血球凝集素タ ンパク質に由来するエピトープに対応する（I．Wilson，H．Niman，R．Heighten , A．Cherenson，M．Connolly及びR．Lerner，Cell，37:767（1984））。標的タ ンパク質にHA標識を融合すると、HAエピトープを認識する抗体でその組換えタン パク質を容易に検出できるようになる。 プラスミド構築法は次の通りである。 FGF-15をコードするDNA配列（ATCC No．97146）を、次の2つのプライマーを用 いるPCRによって構築する。5'プライマー（5’CTAGT GGATCC GCCATC ATGGTAAAAC CGGTGCCC 3'；配列番号7）は、BamHI部位と、それに続く、開始コドンから始ま るコーディング配列の18ヌクレオチドとを含有する。3'配列（5’GTCGAC CTCGAG TGTGTGCTTACTCTTGTT 3'；配列番号8）は、XhoI部位、翻訳終止コドン、HA標識 及びFGF-15コーディング配列の最後の18ヌクレオチド（終止コドンを含まない） に相補的な配列を含有する。したがって、そのPCR産物は、BamHI部位、コーディ ング配列とそれに続いてインフレーム融合したHA標識、HA標識に続く翻訳終結終 止コドン、及びXhoI部位を含有する。 そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNA3/Ampを、各制限酵素で消化し、連結する 。その連結混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems，92037カリフ ォルニア州ラジョラから入手可能）を形質転換し、その形質転換培養をアンピシ リン培地プレートで培養して、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質 転換体から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調べる。この組換えFG F-15を発現させるために、DEAE-デキストラン法（J．Sambrook，E．Fritsch，T ．Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laborato ry Press（1989））によって、COS細胞を上記発現ベクターでトランスフェクシ ョンする。FGF-15-HAタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法（E．Harlow ，D. Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator y Press（1988））によって検出される。トランスフェクションの2日後に、細胞 を35S-システインで8時間標識する。次に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤 （RIPA緩衝液（150mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%DOC，50mM Tris ，pH7.5）で溶解する（Wilson，I.ら,同上，37:767（1984））。細胞溶解液と培 養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。沈殿したタンパク 質を15%SDS-PAGEゲルで分析する。 上の教示を考慮すれば、本発明には数多くの改良や変更を加えることができる ので、具体的に説明した態様の他にも、添付の請求の範囲内で本発明を実施する ことができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                            Fibroblast growth factor 15   The present invention relates to newly identified polynucleotides, Use of the encoded polypeptide, its polynucleotides and polypeptides, And its production of polynucleotides and polypeptides. More specifically In other words, the polypeptides of the present invention have a fibroblast growth factor / heparin-binding growth factor. (Hereinafter referred to as "FGF-15"). The present invention It also relates to inhibiting the action of the polypeptide.   Fibroblast growth factor is a family of proteins that exhibit the property of binding to heparin. Family, and is therefore also called heparin-binding growth factor (HBGF). This The various components of the protein family are expressed in various tissues, and their expression is independent. It has special temporal and spatial controls. These proteins are found in fibroblasts, cornea And vascular endothelial cells, granulocytes, adrenocortical cells, chondrocytes, myoblasts, vascular smooth muscle, Lens epithelial cells, melanocytes, keratinocytes, oligodendrocytes, astrocytes Various cells from mesoderm, ectoderm and endoderm, including blastocysts, osteoblasts and hematopoietic cells Is a powerful mitogen.   Each component has overlapping functions and a unique functional specification. It also has a toll. FGF-1 and FGF-2, in addition to their ability to stimulate vascular endothelial cell proliferation, Chemotactic for endothelial cells, FGF-2 allows endothelial cells to penetrate basement membrane It is shown that Consistent with these properties, FGF-1 and FGF-2 Has the ability to stimulate growth. Another important feature of these growth factors is that they It can promote wound healing. Many other components of the FGF family Also have similar activities as FGF-1 and 2, such as promoting angiogenesis and wound healing. FGF Some of the components of the family induce mesodermal formation, neuronal cells, It has been shown to regulate the differentiation of fat cells and skeletal muscle cells.   In addition to these biological activities in normal tissues, FGF proteins regulate their expression Is released, by promoting tumor angiogenesis and also by transforming As a protein, it is also involved in the promotion of carcinoma and sarcoma tumorigenesis.   Currently, the FGF family comprises eight structurally related polypeptides: basic FGF , Acidic FGF, int 2, hst1 / k-FGF, FGF-5, FGF-6, keratinocyte growth factor, A It is composed of IGF (FGF-8) and has recently been cultured in human glioma cell lines. The glial activator purified from the supernatant is a novel heparin-binding growth factor. (Miyamoto, M. et al., Mol. And Cell. Biol., 13 (7): 4251-4259). (1993)). Each gene has been cloned and sequenced. Those Two of the components, FGF-1 and FGF-2, are characterized by many names, Most often referred to as acidic and basic fibroblast growth factors, respectively. normal Gene products affect the general proliferative capacity of most endodermal and neuroectodermal cells. Exert. They can induce angiogenesis in vivo and are important for early development May play a role (Burgess, W.H. and Maciag, T., Annu. Rev. Biochem., 58: 5). 75-606, (1989)).   Also, many of the above members of the FGF family bind to the same receptor, A second message is induced by binding to their receptor.   A eukaryotic expression vector encoding secreted FGF-1 is expressed in porcine artery by gene transfer. Has been introduced within. This model clarifies gene function in the arterial wall in vivo. I do. FGF-1 expression increases intimal thickening in porcine arteries 21 days after gene transfer (Nabel, EG, et al., Nature, 362: 844-6 (1993)). Furthermore, the base Fibroblast growth factor regulates glioma growth and progression in tumor angiogenesis. And the release or distribution of basic fibroblast growth factor. It has also been demonstrated that secretion appears to be necessary for these effects (Morrison, R.S. J. et al. Neurosci. Res., 34: 502-9 (1993)).   Fibroblast growth factors, such as basic FGF, increase the growth of Kaposi's sarcoma cells in vitro. (Huang, Y.Q., et al., J. Clin. Invest. 91: 1191-7 (1993)). ). In addition, the cDNA sequence encoding human basic fibroblast growth factor Clones downstream of the transcription promoter recognized by phage T7 RNA polymerase. Have been trained. The basic fibroblast growth factor thus obtained is Tearing In humans in aggressive, plasminogen activator synthesis and angiogenesis assays It has been shown to have a biological activity indistinguishable from placental fibroblast growth factor (Sq uires, C.I. H. et al. Biol. Chem., 263: 16297-302 (1988)).   U.S. Pat. No. 5,155,214 discloses substantially pure mammalian basic fibroblast growth factor and They disclose their production. Amino acids of bovine and human basic fibroblast growth factor Disclosed are sequences and DNA sequences encoding bovine species polypeptides.   The newly discovered FGF-9 shares about 30% of the sequence with other members of the FGF family. Have similarity. Two cysteine residues and other consensus sequences within family members Was well conserved in the FGF-9 sequence. FGF-9 has acid and base at its N-terminus. It was found to have no typical signal sequence like sex FGF. However, FGF-9 Is secreted from cells after synthesis, despite lacking the typical signal sequence FGF (Miyamoto, M. et al., Mol. And Cell. Bioll, 13 (7): 4251-4259 (1 993)). In addition, FGF-9 interacts with oligodendrocyte type 2 astrocyte precursor cells BALB / c3T3. Stimulates cell proliferation of PC-12 cells but not human umbilical vein endothelial cells (Naruo, K. et al., J. Biol. Chem., 268: 2857-2864 (1993)).   Basic and acidic FGFs are potent regulators of cell proliferation, cell migration, differentiation and survival Yes, acts on cell types derived from ectoderm, mesoderm and endoderm. These two FGFs, along with KGF and AIGF, have been identified by protein purification. However , The other four components are isolated as oncogenes, whose expression is consistent with embryogenesis Type of cancer was restricted. FGF-9 is a mitogen for glial cells It was proved. FGF family members reported to have oncogenic potential I have. FGF-9 has a transforming capacity when transformed into BLB / c3T3 cells. (Miyamoto, M. et al., Mol. Cell. Biol., 13 (7): 4251-4259 (1993)).   Androgen-inducible growth factor (AIGF), also known as FGF-8, Purified from conditioned medium of mouse breast cancer cells (SC-3) stimulated with Ron. AIGF is Germany A special FGF-like growth factor with a putative signal peptide and a known FGF family 30-40% homologous to the component. Mammalian cells transformed with AIGF are Shows a significant stimulatory effect on the growth of SC-3 cells in the absence of Gen. Therefore AIGF Mediates androgen-induced proliferation of SC-3 cells and possibly other cells You. This is because it is secreted by the tumor cells themselves.   The polypeptides of the present invention differ in amino acid sequence sequence from other members of the FGF family. From the same sex, it was presumed to be a member of the FGF family.   According to one aspect of the present invention, a novel mature polypeptide, and a biologically active and Fragments, analogs and derivatives thereof useful for diagnosis or therapy are provided. The poly of the present invention The peptides are of human origin.   According to another aspect of the present invention, an isolated protein encoding a polypeptide of the present invention is provided. Nucleic acid molecules (including mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA) and biologically active and Fragments thereof are provided that are useful for diagnosis or therapy.   According to a further aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector (recombinant polypeptide of the present invention). Cloning and expression vectors useful as reagents used in production) Recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell comprising a nucleic acid sequence encoding a light polypeptide And a method for producing the above polypeptide by recombinant technology is provided. Is done.   According to a further aspect of the invention, the polypeptide or the polypeptide is Screening polynucleotides for agonists and antagonists against them. Method used to promote wound healing, for example, due to burns and ulcers Prevent neuronal damage from neuronal damage and promote neuron growth Prevent skin aging and hair loss, angiogenesis in early embryo and limb regeneration, mesoderm Methods for use for therapeutic purposes, such as stimulating induction, are provided.   According to a further aspect of the present invention there is provided an antibody against the above polypeptide. .   According to a further aspect of the present invention, there are provided antagonists to said polypeptides (antago Nist) and, for example, in the treatment of cell transformation (eg, tumors) To inhibit the action of the polypeptide, reduce scarring, or hypervascularity And methods of using them for treating diseases.   According to another aspect of the present invention, there is provided a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention. Nucleic acids consisting of nucleic acid molecules long enough to specifically hybridize to nucleotides A probe is provided.   According to a further aspect of the invention, a disease associated with a mutation in a nucleic acid sequence of the invention. To detect a disease or a susceptibility to the disease, and encoded by the sequence thereof. Diagnostic assays are provided for detecting overexpression of a polypeptide.   According to another aspect of the present invention, the polypeptide or the polypeptide is Scientific research, DNA synthesis and DNA vector production Provided for use in vitro.   These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. It should be.   The following drawings are merely illustrative of particular embodiments of the present invention, and are in no way limiting. Not something.   FIG. 1 shows the deduced amino acid sequence corresponding to the cDNA sequence of FGF-15. is there.   FIG. 2 shows amino acid sequence homology between FGF-15 and other FGF family members FIG. The conserved amino acids can be easily confirmed.   According to one aspect of the present invention, a mature polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. Repeptide, or a black deposit deposited on May 12, 1995 as ATCC deposit number 97146. Nucleic acid encoding the mature polypeptide encoded by the cDNA of the ribonucleic acid A molecule (polynucleotide) is provided.   The polynucleotide encoding the FGF-15 of the present invention is initially a human adrenal tumor tissue. Was found in a cDNA library derived from This is a family of fibroblast growth factors Structurally related to all components of Lie and encodes a 252 amino acid polypeptide Reading frame. Among the main combinations, 1) for human FGF-9, 41% identity and 66% sequence similarity over a stretch of 129 amino acids; 2) human 37% identity and 59% similarity over 88 amino acid regions to KGF One.   The characteristics of the FGF / HBGF family, GXLX (S, T, A, G) X6 (D, E) CXFXE, (X represents an arbitrary amino acid residue; (D, E) represents a D residue or Represents an E residue; X6 represents any 6 amino acid residues).   The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA, cDNA, genomic DNA and It may be of a DNA type including adult DNA. DNA can be double-stranded or single-stranded. You may. The coding sequence encoding the mature polypeptide has the coding sequence shown in FIG. Coding sequence (SEQ ID NO: 1) or the coding sequence of the deposited clone Or the same mature polypeptide as the DNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA described above. Encodes a peptide, but coding differently due to the redundancy or degeneracy of the genetic code It may be an array.   Encoded by the mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA described above. The polynucleotide encoding the mature polypeptide is the mature polypeptide. The coding sequence of the mature polypeptide. Coding sequences and additional coding sequences such as leader or secretory sequences or protan The protein sequence may be encoded by a mature polypeptide (additional coding And non-coding sequences (introns, mature polypeptides) Non-coding sequence 5 'and / or 3' to the coding sequence) May be included.   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" A polynucleotide containing only the coding sequence of the polypeptide; Polynucleotides containing additional coding and / or non-coding sequences And   Further, the present invention relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of FIG. Or fragments and analogs of the polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone Also related to variants of the above polynucleotides, which encode bodies and derivatives. This port A polynucleotide variant is a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide. Or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide Good.   Therefore, the present invention relates to the mature polypeptide (SEQ ID NO: 2) shown in FIG. A mature polypeptide identical to the mature polypeptide encoded by the loan's cDNA. The encoding polynucleotide, as well as the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or Fragments, derivatives or polypeptides encoded by the cDNA of the deposited clone Variants of the above polynucleotides that encode the analogs. Such a nucleus Otide variants include deletion variants, substitution variants and addition or insertion variants.   As described above, the polynucleotide of the present invention has the coding sequence shown in FIG. SEQ ID NO: 1) or a naturally occurring pair of the coding sequence of the deposited clone It may have a coding sequence that is a progenitor variant. Known in the art Allelic variants substantially alter the function of the encoded polypeptide. Alternative types that may have one or more nucleotide substitutions, deletions or additions Is a polynucleotide sequence.   The present invention provides that the coding sequence for the mature polypeptide A polynucleotide sequence that promotes peptide expression and secretion (eg, a polypeptide sequence). (Leader sequence that functions as a secretory sequence that controls transport from the cell) Also encompasses fused polynucleotides. Polypeptide having a leader sequence Is a preprotein whose leader sequence is cleaved by the host cell and Can form a mature form of the polypeptide. The polynucleotide of the present invention comprises a mature protein. The protein may encode a proprotein in which a 5 'amino acid residue has been added to the protein. Professional distribution A mature protein with a sequence is a proprotein, an inactive form of that protein. is there. Cleavage of the prosequence leaves an active mature protein.   Therefore, the polynucleotide of the present invention has a mature protein and a prosequence. Proteins or proteins that have both a prosequence and a presequence (leader sequence) Can be coded.   The polynucleotide of the present invention is a marker used for purification of the polypeptide of the present invention. -Sequence may have a coding sequence fused in frame. For bacterial hosts, use the hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector. Marker sequence to prepare for purification of mature polypeptide fused to the marker When using a mammalian host such as COS-7 cells, for example, The hemagglutinin (HA) label can be a marker sequence. HA label is influenza Corresponding to an epitope from the hemagglutinin protein (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1984)).   The term "gene" refers to a section of DNA involved in the production of polypeptide chains And the areas before and after the coding area (leaders and trailers) And intervening sequences (introns) between coding segments (exons).   Hybridization probe for cDNA library using full-length FGF-15 gene fragment As a result, the full-length gene itself and the gene Other genes with similar sequence similarity or similar biological activity can be isolated . Probes of this type preferably consist of at least 30 bases, preferably 50 bases. The above may be included. This probe also provides a cDNA clone corresponding to the full-length transcript. Clones, genomic clones or regulatory and promoter regions, exons and genes. Also used to identify clones containing the entire FGF-15 gene, including thetron it can. One example of screening is known for the synthesis of oligonucleotide probes. The coding region of the FGF-15 gene by using the DNA sequence of . Using a labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention, Screening of human cDNA, genomic DNA or mRNA libraries The library determines the components of the library to which it hybridizes.   Further, the present invention provides that at least 70%, preferably at least 90%, Hybridizes to the above sequences, preferably when there is at least 95% identity To a polynucleotide. In particular, the present invention relates to the above-described polynuclei under stringent conditions. Polynucleotides that hybridize to leotide. As used herein The term "stringent conditions" refers to at least 95%, preferably at least 95%, Also means that hybridization occurs only if there is 97% identity. In a preferred embodiment, a polynucleic acid hybridizing to the above-described polynucleotide Reotide is a cDNA encoded by the cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA described above. A polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the mature polypeptide To load.   In addition, the polynucleotide is, as described above, a polynucleotide of the present invention. Hybridize and have identity to the polynucleotide (activity is May or may not be retained), at least 20 bases, preferably 30 bases, More preferably, it may contain at least 50 bases. Such a polynucleotide is For example, the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 As a probe), as a diagnostic probe, or as a PCR primer Can be used.   Accordingly, the present invention relates to polynucleotides encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. At least 70% identity, preferably at least 90% identity to A polynucleotide preferably having at least 95% identity, and at least 30 Bases, preferably fragments thereof consisting of at least 50 bases, as well as such polynucleotides. It relates to polypeptides encoded by nucleotides.   The deposit referred to herein relates to the international recognition of the deposit of microorganisms in patent proceedings. Will be maintained under the Budapest Treaty. These deposits are provided for convenience And that this is a deposit required by 35 U.S.C.§112 is not. The sequence of the polynucleotide contained in the deposit and the The amino acid sequence of the polypeptide is part of the present specification for reference, In the case of conflict with the sequence descriptions provided herein, this will prevail. the above Manufacture, use or sale of the deposit may require consent, and this specification may not It does not give such consent.   Further, the present invention relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of FIG. Is a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, and And fragments and analogs and derivatives of such polypeptides.   The polypeptide encoded by the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA When referring to "fragments", "derivatives" and "analogs" with respect to peptides, The term refers to a polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the polypeptide. Means tide. Therefore, analogs are activated by cleavage of the proprotein part. Proproteins that can be sexualized to produce the active mature polypeptide are included.   The polypeptides of the present invention include recombinant polypeptides, natural polypeptides and synthetic polypeptides. Any of the polypeptides may be used, and a recombinant polypeptide is preferred.   The polypeptide encoded by the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited cDNA Peptide fragments, derivatives or analogs may (i) have one or more amino acid residues. Substituted with conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) (The replacement amino acid residue is one encoded by the genetic code) May or may not be), and (ii) one or more The amino acid residue may contain a substituent, or (iii) A peptide is used to increase the half-life of another compound (eg, the polypeptide). Compound (eg, polyethylene glycol)) or (iv) For the purification of mature polypeptide or proprotein sequences Additional amino acids, such as the sequence to be fused, are fused to the mature polypeptide It may be. Such fragments, derivatives and analogs are, from the teachings herein, It is believed to be within the skill of those in the art.   The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably provided in an isolated form. Preferably, it is preferably purified uniformly.   The term "isolated" refers to the substance that is in its original environment (e.g., If it is a thing, it means that it is taken out of its natural environment. For example, alive Naturally occurring polynucleotides or polypeptides present in animals are "isolated". But not isolated from some or all of the coexisting substances in the natural system A nucleotide or polypeptide is "isolated." Such polynucleotides Code is part of a vector and / or such a polynucleotide or Although such a vector or composition may be part of a composition, They are "isolated" in that they are not a part of the natural environment.   The polypeptide of the present invention comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (especially its mature polypeptide). And at least 70% similarity to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 (preferably Is 70% identity), more preferably at least for the polypeptide of SEQ ID NO: 2. 90% similarity (more preferably 90% identity), even more preferably SEQ ID NO: 2 At least 95% similarity (more preferably 95% identity) to the polypeptide Polypeptides, and generally have at least 30 amino acids, more preferably Or a portion of the above polypeptide containing at least 50 amino acids.   As is known in the art, the "similarity" between two polypeptides is The amino acid sequence of one polypeptide and its conservative amino acid substitutions are It is determined by comparing with the sequence of the peptide.   A fragment or portion of a polypeptide of the present invention may comprise a peptide of the corresponding full-length polypeptide. It can be used for production by de-synthesis. That is, these fragments are the full-length polypeptide Can be used as intermediates for the production of A fragment of the polynucleotide of the present invention or Some can be used for the synthesis of full-length polynucleotides of the invention.   The present invention relates to a vector containing the polynucleotide of the present invention and a vector of the present invention. Genetically engineered host cells, and also for the production of polypeptides of the invention by recombinant techniques Involved.   The host cell is a vector of the present invention (for example, a cloning vector, Or may be an expression vector) by genetic manipulation (transduction or Transformation or transfection). The vector is, for example, Plasmi , Virus particles, phages and the like. The engineered host cells Suitable for activating the promoter, selecting a transformant, or amplifying the gene of the present invention. It can be cultured in a modified conventional nutrient medium. Culture conditions such as temperature and pH Conditions previously used for that host cell selected for expression, Will be obvious.   The polynucleotides of the present invention produce polypeptides by recombinant techniques. Can be used for Thus, for example, the polynucleotide sequence may have various origins. The current vehicle (specifically, a vector or plasmid for expressing the polypeptide) Sumid). Such vectors include staining Somatic, non-chromosomal and synthetic DNA sequences, such as SV40 derivatives, bacterial Rasmid, phage DNA, yeast plasmid, combination of plasmid and phage DNA Vector, viral DNA (eg, vaccinia, adenovirus, chicken) Pox virus, pseudorabies virus) and the like. However, other vectors Is a plasmid, but is it replicable and viable in its host? Can be used.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various techniques. In general, DNA can be added to the appropriate restriction endonuclease sites by techniques known in the art. Insert an array. Such techniques and others are deemed to be within the skill of the artisan. Can be   The DNA sequence in the expression vector is ligated with appropriate expression control sequences (pro- Motor). Representative examples of such promoters , LTR or SV40 promoter, E. coli lac or trp, phage lambda PLPromoter And the expression of genes in prokaryotes, eukaryotes and their viruses Other promoters known to do so can be mentioned. Expression vector Ter includes a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator (terminator). contains. The vector may also include a sequence suitable for amplifying expression.   In addition, expression vectors are phenotypically accessible for selection of transformed host cells. Genes that confer traits (such as neomycin resistance or dihydrogen for eukaryotic cell culture) Lofolate reductase, tetracycline resistance and ampicillin resistance in Escherichia coli And the like.   A vector containing the above-described appropriate DNA sequence and an appropriate promoter or control sequence Can be used to transform an appropriate host to give that host its protein. Quality can be expressed. Representative examples of suitable hosts include E. coli and Strep. Bacterial cells such as T. typhimurium, Salmonella typhimurium, fungal cells such as yeast, and D. DrosophilaS2as well asSpodoptera Sf9Such as insect cells, CHO, COS or Bose melanoma Any animal cells, adenoviruses, plant cells and the like can be mentioned. Suitable inn The primary choice is considered to be within the skill of those in the art, given the teachings herein.   More specifically, the invention relates to one or more of the sequences broadly described above. And recombinant constructs. These constructs are those wherein the sequence of the invention is in the forward orientation or Includes vectors inserted in the reverse direction (plasmids, viral vectors, etc.) . In a preferred aspect of this embodiment, the construct is further operably linked to the sequence. Conclusion Regulatory sequences (including promoters). Suitable vectors and pros Many motors are known to those skilled in the art and are commercially available. The following vectors are This is an example. For bacteria: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, p siX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene ), PTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). For eukaryotic cells : PWLneo, pSV2cat, p0G44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pS VL (Pharmacia). However, even if other plasmids or vectors are used, Can be used as long as it is replicable and viable in its host.   The promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector The desired gene using a vector or other vector with a selectable marker can do. Suitable vectors are PKK232-8 and pCM7. Especially famous bacteria LacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PLAnd trp It is. Eukaryotic promoters include CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early And late SV40, LTR of retrovirus, mouse metallothionein-I . Selection of the appropriate vector and promoter is well within the level of ordinary skill in the art. Minutes included.   In a further aspect, the present invention relates to a host cell containing the above-described construct. The host cells of the present invention may be higher eukaryotic cells, such as mammalian cells, or yeast cells. It may be a lower eukaryotic cell, such as a cell, or a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. There may be. Introduction of the above construct into the host cell can be accomplished by calcium phosphate transfer. Injection, DEAE-dextran mediated transfection, or electroporation (Davis, L., Dibner, M. Battey, I., Basic Me thods in Molecular Biology (1986)).   Conventional use of the construct in the host cell allows its recombinant sequence to be Thus, the encoded gene product can be produced. Alternatively, the present invention Polypeptides can also be produced synthetically with conventional peptide synthesizers.   Mature proteins can be obtained from mammalian cells, yeast, or bacteria under the control of appropriate promoters. It can be expressed in other cells. RNA obtained from the DNA construct of the present invention A cell-free translation system can also be used to produce the protein using Prokaryotic host Suitable cloning and expression vectors for use in eukaryotic hosts are Sambro ok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, Co., NY) Spring Harbor (1989)), the disclosure of which is incorporated by reference. Constitute a part of this specification.   Transcription of a DNA encoding the polypeptide of the present invention by higher eukaryotes is a matter of It is increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancer is DN A cis-acting element of A, usually 10-300 bp, acting on the promoter Increase transcription. SV40 enhancer on the late side of replication origin (100-270bp) , The cytomegalovirus early promoter enhancer, on the late side of the replication origin Polyoma enhancers and adenovirus enhancers are examples. .   In general, recombinant expression vectors allow for the origin of replication and transformation of its host cells. Selectable markers (such as the ampicillin resistance gene of Escherichia coli and Ses cerevisiae TRPl gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences It will include a promoter of origin. Such promoters are, inter alia, 3- Glycolytic enzymes such as phosphoglycerate kinase (PGK), α-factor, acid phosphatase Obtained from operons encoding phatase or heat shock proteins . Heterologous structural sequences include translation initiation and termination sequences and, preferably, translated protein. For leader sequences that can direct secretion into the periplasmic space or extracellular medium And assembled in an appropriate phase. Optionally, the heterologous sequence is an expressed recombinant product N-terminal identification peptide that imparts desired characteristics such as stabilization of the protein and easy purification ( a fusion protein containing an identification peptide).   Useful expression vectors for bacterial use include the structure DN encoding the desired protein. The A-sequence, together with the appropriate translation initiation and termination signals, is added to the functional promoter. By inserting it into a reading phase operable for the Be built. The vector ensures the maintenance of the vector and, if desired, One or more phenotypically selectable markers to provide amplification in the host. Will include the car and the origin of replication. Prokaryotic hosts suitable for transformation include E. coli, grass Fungi, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces and Stauff There are various species belonging to the genus Ilococcus. However, other hosts are also options Can be used as   Typical examples of expression vectors useful for bacterial use include well-known cloning vectors. Selectable from commercially available plasmids containing the genetic elements of pBR322 (ATCC 37017) And those containing a functional marker and a bacterial origin of replication. It is not limited). Such commercially available vectors include, for example, pKK223-3 ( Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden and GEM1 (Promega Biotec) , Madison, Wisconsin, USA). These pBR322 "skeletons" The parts are combined with a suitable promoter and the structural sequence to be expressed.   After transforming a suitable host strain and growing the host strain to a suitable cell density, Repress selected promoters by appropriate means (eg temperature change or chemical induction) Release and further culture the cells.   Typically, cells are collected by centrifugation and by physical or chemical means Break up and reserve the resulting crude extract for further purification.   Microbial cells used for protein expression are freeze-thaw cycles, sonication Can be disrupted by any convenient method, such as mechanical disruption or use of cell lysing agents You.   Various mammalian cell culture systems can also be used for recombinant protein expression. mammalian Examples of expression systems include the monkey kidney fibroblast described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). Vesicle COS-7 line and other cell lines capable of expressing compatible vectors (eg, C127, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines). Mammalian expression vectors , An origin of replication, an appropriate promoter and enhancer, Binding site, polyadenylation site, splice donor and splice acceptor , A transcription termination sequence and a 5 'flanking non-transcribed sequence. Required non-transcribed genetic elements DNA sequences derived from the SV40 viral genome (eg, SV40 origin, initial Promoter, enhancer, splice site and polyadenylation site). Can be used.   The polypeptides of the invention may be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, Ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography , Hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, Including hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography Can be recovered and purified from recombinant cell culture by conventional methods. Mature if necessary A protein regeneration step may be used to complete the protein configuration. Finally Use high performance liquid chromatography (HPLC) as the final purification step be able to.   The polypeptide of the present invention may be a natural purified product or a product of a chemical synthesis method. It may be a product, and may be produced by prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, Cultured bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells and mammalian cells) It may be produced from. Depending on the host used in the recombinant production method, The light polypeptide can also be glycosylated in mammals and other eukaryotic carbohydrates. Yes, and may not be glycosylated. The polypeptide of the present invention comprises It may contain an onine amino acid residue.   Since the polypeptide of the present invention can stimulate vascular endothelial cell growth, Ischemic tissue due to various disease states (eg thrombosis, arteriosclerosis, other cardiovascular diseases) Can be used in procedures to stimulate revascularization. These polypeptides are Can also be used to stimulate adult and limb regeneration.   The polypeptides of the present invention may be used to repair wounds due to injuries, burns, tissue repair after surgery and ulcers. Can also be used for treatment. This is because the polypeptide of the present invention can be used for various sources having different origins. Mitogenic for cells (eg, fibroblasts and skeletal muscle cells); Moreover, it promotes the repair or replacement of damaged or pathological tissues.   The polypeptides of the present invention may be used to stimulate neuronal growth or to inhibit certain neuronal disorders. Or neurodegenerative diseases (such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and AIDS-related complications) It can also be used to treat and prevent neuronal damage that occurs in FGF-15 is chondrocyte growth Since it has stimulating ability, it can be used to improve bone and periodontal regeneration, It can be an aid for bone grafts.   Use of the polypeptides of the present invention to stimulate the growth of keratinocytes This can prevent skin aging due to sunburn.   FGF-15 polypeptides can also be used to prevent hair loss. Because the FGF family Lie component activates hair-forming cells and stimulates melanocyte growth Because. Similarly, if the polypeptide of the present invention is used in combination with other cytokines, It can also stimulate the proliferation and differentiation of hematopoietic and bone marrow cells.   FGF-15 polypeptides can be used to maintain organs prior to transplantation or for primary tissue culture Can also be used to support   The polypeptides of the present invention induce differentiation of endoderm-derived tissue in early embryos. Can also be used for   According to a further aspect of the invention, scientific research, DNA synthesis, production of DNA vectors To provide therapeutic and diagnostic agents for the treatment of human diseases in vitro Using the above-mentioned peptide or a polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide A method is provided.   The present invention provides a method for identifying a receptor for the polypeptide of the present invention. Rece Genes encoding putters include, for example, ligand panning and FACS sorting (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2), Chapter 5 (19 91)) and many other methods known to those skilled in the art. Preferably, Cells that respond to the light polypeptide (eg, receptors for FGF family proteins) From NIH3T3 cells and SC-3 cells, which are known to contain multiple Prepare denylated RNA and prepare a cDNA library from that RNA using several pools. COS cells or other cells that do not respond to the polypeptide of the present invention. The expression cloning method of transfecting cells is used. Tran The transfected cells were grown on glass slides and labeled Exposure to a polypeptide of the invention. Polypeptides can be iodinated or site-specific. Labeling can be performed by various means such as incorporation of a recognition site for tein kinase. You.   After fixation and culture, the slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive Identify pools, prepare subpools, retransfect, subpool By repeating the optimization and rescreening tasks, To obtain a single clone that encodes the protein.   Another method for identifying receptors is to use labeled polypeptides. , Photoaffinity (photo-af) with cell membrane or extract preparation expressing its receptor molecule finity). The crosslinked material is separated by PAGE analysis and Expose to Lum. Cleavage of the labeled complex containing the polypeptide receptor Extracted, split into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing . A cDNA library is screened using the amino acid sequence obtained by microsequencing. By designing a set of degenerate oligonucleotide probes for And identify the gene encoding the putative receptor.   The present invention provides compounds for identifying compounds that modulate the effects of the polypeptides of the present invention. The present invention provides a product screening method. In one example of such an assay, fibroblasts are Under normal growing cell culture conditions, mammalian fibroblasts, polypeptides of the invention, The compound to be screened, andThree[H] Thymidine is mixed. Screenini Perform a control assay in the absence of the compound to be Compared to the amount of fibroblast proliferationThree[H] Thymidine uptake By measuring, one can determine whether the compound stimulates proliferation. Fiber The amount of fibroblast proliferation was determined by liquid scintillation chromatography.Three[H] thymidine It is measured by measuring the uptake of By this method, the agonist Can identify both (agonist) and antagonist (antagonist) compounds Wear.   Another method is to express a receptor for the polypeptide of the present invention. A mammalian cell or membrane preparation in the presence of a test compound, labeled with a polypeptide of the invention. Incubate with tide. Then the compound's ability to increase this interaction Or the ability to block could be measured. Alternatively, screening Of the known second messenger system after the interaction of The response is measured and the ability of the compound to bind to the receptor and the second messenger By measuring the response inducing ability, the compound can be identified as a potential agonist or antago. Determine if you are a nyst. As such a second messenger system, c AMP guanylate cyclase, ion channel or phosphoinositide hydrolysis Examples include, but are not limited to:   Examples of antagonist compounds bind to the receptor of the polypeptide of the invention Does not induce a second messenger response or binds to the FGF-15 polypeptide itself Antibodies, or (optionally) oligopeptides. In addition, the receptor Binds, but does not elicit a second messenger response, so that the polypeptide of the invention Mutant polypeptides that effectively block action are also potential antagonists It is possible.   Another antagonist compound for the FGF-15 gene and gene product is Antisense constructs made using antisense technology. Antisense technique Surgery controls gene expression by antisense DNA or RNA or triple helix formation Both methods can be used to bind polynucleotides to DNA or RNA. Based on For example, a polynucleotide encoding the mature polypeptide of the invention Using the 5 'coding portion of the peptide sequence, an antisense RNA about 10-40 base pairs in length Design oligonucleotides. DNA oligonucleotides are involved in transcription. Since it is designed to be complementary to the region of the gene (triple helix-Lee et al., Nucl. A cids. Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al. , Science, 251: 1360 (1991)), which prevents the transcription and production of the polypeptide of the present invention. Harm. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo To block translation of the mRNA molecule into the polypeptide of the present invention (antisense- Okano, J .; Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense  Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Florida (1988) See). Antisense RNA or DNA is expressed in vivo to increase polypeptide production. The oligonucleotides described above can also be delivered to cells so that they can be inhibited.   Potential antagonist compounds bind to the binding site of the receptor, By occupying the receptor and keeping the receptor away from the polypeptide, Also included are small molecules that interfere with normal biological activity. Examples of such small molecules include small Peptides or small peptide-like molecules, including but not limited to Absent.   Antagonist compounds are those that bind the polypeptides of the invention to neoplastic cells and tissues. By inhibiting cell growth and proliferation effects (ie, stimulation of tumor angiogenesis) Delay or prevent abnormal cell growth and proliferation, eg, in tumor formation or proliferation Can be used to   The antagonists are used to prevent hypervascular disease and to treat extracapsular cataract It can also be used to prevent post-operative epithelial lens cell proliferation. The present polypeptide Prevention of mitogen-promoting activity is also desirable in cases such as restenosis following balloon angioplasty. Would be better.   The above antagonists are also used to prevent the growth of scar tissue during wound healing it can.   The antagonist comprises a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier as described below. Can be used as   Combining the polypeptides, agonists and antagonists of the present invention with a suitable pharmaceutical carrier They can be combined into a pharmaceutical composition for parenteral administration. Such a composition Is pharmaceutically acceptable with a therapeutically effective amount of the peptide, agonist or antagonist. An acceptable carrier or excipient. Such carriers include saline, buffered salt Water, dextrose, water, glycerol, ethanol and their combinations But not limited to these. The preparation should be compatible with the administration method. It is.   The present invention relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. A pharmaceutical pack or kit comprising the above container is also provided. Such containers contain medical Regulated by government agencies that regulate the manufacture, use or sale of drugs or biological products. To reflect the agency's approval of manufacture, use or sale for human administration in an approved format Information can be attached. In addition, the polypeptides, agonists and Antagonists may be used in combination with other therapeutic compounds.   The pharmaceutical composition may be administered orally, topically, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly. Administration can be by any convenient means, such as by tract, subcutaneous route, intranasal route or intradermal route. Up The pharmaceutical compositions are administered in an amount effective to treat and / or prevent the particular indication. Generally, it will be administered in an amount of at least about 10 mg / kg body weight, most often about 8 mg / kg body weight / day will not be administered. In most cases, the daily dose will be Considering the route, symptoms, etc., about 10 mg / kg to about 1 mg / kg body weight, 1 cmTwoAbout 0.1 per It is preferred to administer a dose of from μg to 9 mg.   Polypeptides of the invention and agonists and antagonists that are polypeptides If the compound is to be used according to the invention, it may be used It can also be done by expression of the tide. This is often called “gene therapy” You.   Thus, for example, cells may be transformed in vitro into a polynucleotide encoding a polypeptide. Manipulate with leotide (DNA or RNA) and treat patients with the polypeptide You can give the manipulated cells. Such methods are good in the art. Well known. For example, a protein containing RNA encoding the polypeptide of the present invention. Using torovirus particles to manipulate cells in a manner known in the art. Can be.   Further, to express the polypeptide in vivo, for example, it is known in the art. Cells can also be manipulated in vivo by such techniques. Manipulate cells in vivo However, to express a polypeptide in vivo, as is known in the art, First, a retroviral particle containing RNA encoding the polypeptide of the present invention is produced. Production cells for production may be administered to the patient. The method of the present invention by such a method. These and other modes of administration of the polypeptides will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. It is. For example, an expression vehicle for manipulating cells may be a suitable delivery vehicle. Adenovirus that can be used to manipulate cells in vivo when combined with Alternatively, it may be other than retrovirus particles.   Retrovirus that can be a source of the aforementioned retroviral plasmid vector Moloney murine leukemia virus, spleen necrosis virus, retrovirus For example, Rous sarcoma virus, Harvey sarcoma virus, avian leukemia virus, Gibbon ape leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, spinal cord increase Sarcoma virus and breast cancer virus, including but not limited to Absent. In one embodiment, the retroviral plasmid vector is a Moloney murine leukemia. Derived from the disease virus.   The vector contains one or more promoters. Suitable Promos That Can Be Used The retrovirus LTR, SV40 promoter, Miller et al.Biotechniqu es , Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989). Motor, or any other promoter (eg, histone promoter, pol II Such as, but not limited to, the I promoter and the β-actin promoter Cellular promoters such as eukaryotic cell promoters), but are not limited thereto. Not necessarily. Other viral promoters that can be used include Virus promoter, thymidine kinase (TK) promoter and B19 parvo Viral promoters include, but are not limited to. Appropriate The choice of a promoter will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. It is in. Suitable promoters that can be used include adenovirus promoters (Adenovirus major late promoter, etc.), heterologous promoter (cytomega Virus (CMV) promoter), respiratory syncytial virus (RSV) promoter And inducible promoters (MMT promoter and metallothionein promoter Etc.), heat shock promoter, albumin promoter, ApoAI promoter -, Human globin promoter, viral thymidine kinase promoter (simple Herpes thymidine kinase promoter, etc.), retrovirus LTR Decorative LTR), β-actin promoter, human growth hormone promoter Motors, but not limited to them. Promoter It may be a natural promoter that controls the gene encoding the light polypeptide. No.   Transduction of packaging cells using the above retroviral plasmid vector To create a production cell line. Transfectable package Examples of caging cells include Miller,Human Gene Therapy, Vol. 1, p. 5-14 (19 90) (the entire contents of this publication are incorporated herein by reference). DAN, PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψC RIP, including but not limited to GP + E-86 and GP + envAm12 cell lines . The vector can be used to transform the packaging cell by any means known in the art. Can be introduced. Such means include electroporation, liposome Use and calcium phosphate precipitation methods, but are not limited to these. Alternatively, retroviral brasmid vector is encapsulated in liposomes Alternatively, it may be administered to a host after coupling to a lipid.   The above-mentioned production cell line is an infectious agent containing a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention. Generate torovirus vector particles. Such retroviral vector particles Can be used for transduction of eukaryotic cells in vitro or in vivo. Transduced Eukaryotic cells will express a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the invention. form Eukaryotic cells that can be transfected include embryonic stem cells, embryonic cancer cells, hematopoietic stem cells, hepatocytes, and fibers. Fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells and bronchial epithelial cells. But not limited to these.   The present invention relates to the presence of a mutation in a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the present invention. Diagnostic assays to detect the disease involved or susceptibility to the disease In part, it concerns the use of the gene of the invention.   Individuals having a mutation in the gene of the present invention can be detected at the DNA level by various techniques. I can get out. Diagnostic nucleic acids can be used in blood, urine, saliva, tissue biopsy, autopsy, etc. Can be obtained from human cells. Genomic DNA may be used directly for detection, Prior to analysis, it may be enzymatically amplified using PCR (Saiki et al., Nautre, 324: 163-166 (1986)). RNA and cDNA can be used for the same purpose. For example, the poly Mutations are identified using PCR primers complementary to the nucleic acid encoding the peptide. Can be determined and analyzed. For example, deletions and insertions result in normal size amplification products. Different genotypes. Point mutations are radiolabeled RNA The amplified DNA is hybridized to the sequence or radiolabeled antisense DNA sequence. Can be identified. Perfectly matched sequences should be digested with RNaseA Or the difference in melting temperature makes it possible to distinguish from mismatched double-stranded molecules. Wear.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed with or without denaturing agents. Can be achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in You. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. DNA fragments with different sequences can be identified on denaturing formamide gradient gels. in this case, The mobility of different DNA fragments depends on their respective melting temperature or partial melting temperature, Decelerated at different locations in the gel (eg, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) checking).   Sequence changes at specific positions can be detected by chemical cleavage methods or RNase and S1 protection. A nuclease protection assay can also reveal (eg, cotton et al., PNAS, USA, 8 5: 4397-4401 (1985)).   Therefore, the detection of a specific DNA sequence is dependent on hybridization, RNase protection, Methods such as cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes (eg, restriction fragments) Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) and genomic DNA Can be achieved by Southern blotting.   In addition to more traditional gel electrophoresis and DNA sequencing, Naturally, mutations can be detected.   In addition, the present invention detects changes in the level of FGF-15 polypeptide in various tissues. It also relates to the diagnostic assay that is issued. Compared to a normal control tissue sample, Excessive expression of cytoplasm indicates the presence of abnormal cell growth (eg, tumor) This is because that. Assays for detecting protein levels in samples obtained from the host B is well known to those skilled in the art and can be used in radioimmunoassays, competitive binding assays , Western blot analysis, ELISA assay and "sandwich" assay etc. But is there. ELISA assay (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1 (2), In Chapter 6 (1991), first, an antibody (preferably an antibody specific to the antigen of the polypeptide of the present invention) is used. Or a monoclonal antibody). In addition, the monoclonal antibody Prepare a reporter antibody. For reporter antibodies, detection of radioactivity, fluorescence, etc. A possible reagent (horseradish peroxidase enzyme in this example) is coupled. next, A sample is taken from the host and the solid support (eg, (Polystyrene dish). Next, non-specific proteins (bovine blood Free albumin on a plate by incubation with Covers all protein binding sites. Next, the monoclonal antibody was injected into the dish. Cubate. During this time, the monoclonal antibody bound to the polystyrene dish Binds to all of the polypeptides of the invention. Buffer unbound monoclonal antibody Wash off with. Next, a reporter antibody conjugated to horseradish peroxidase was added. Put the reporter antibody on the monoclonal antibody bound to the protein of interest. To combine.   Next, the unbound reporter antibody is washed away. Next, a peroxidase substrate is added. By comparing the amount of color developing during a given period with the standard curve, A measure of the amount of polypeptide present in the product patient sample is obtained.   When using a competition assay, an antibody specific for a polypeptide of the invention may be immobilized on a solid Attach to the support. Next, labeled FGF-13 and a sample obtained from the host were And detected by liquid scintillation chromatography, for example. The amount of the labeled label can be correlated to the amount of the polypeptide of the present invention in the sample. .   "Sandwich" assays are similar to ELISA assays. "sandwich In the “assay”, the polypeptide of the present invention is passed over a solid support, and is immobilized on the solid support. Bind to the attached antibody. Next, the secondary antibody is allowed to bind to the desired polypeptide. . The tertiary antibody, which is specific and labeled for the secondary antibody, is then supported on its solid support. Once passed over the body and bound to the secondary antibody, the amount can be quantified.   The sequences of the present invention are also useful for chromosome identification. The sequences of the present invention are It is specifically induced at a specific position on the chromosome and can hybridize to it. Wear. In addition, identifying specific sites on chromosomes is currently needed. And also. Actual sequence data currently available for labeling chromosome locations Most chromosome labeling reagents based on (repeat polymorphism's) No. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention relates those sequences to diseases. This is an important first step in correlating with the gene involved.   Briefly, the sequence is derived from its cDNA by PCR primers (preferably 15-25 bp). ) Can be mapped to the chromosome. 2 in genomic DNA A primer that does not complicate the amplification process by spanning more than exons To quickly select a key, use computer analysis of the 3 'untranslated region. next PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes Use these primers. C containing the human gene corresponding to the primer Only hybrids will generate amplified fragments.   PCR mapping of somatic hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes It is a quick method. Using the present invention with the same oligonucleotide primers, In a similar manner, a panel of fragments from a particular chromosome or a large genomic clone Sub-localization can be achieved with a pool of scenes. On the chromosome Another mapping method that can be used for mapping to Hybridization, hybridization to construct chromosome-specific cDNA libraries Pre-selection by labeling and label flow-sorted chromosomes Preliminary screening.   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomes (FISH ) Allows accurate chromosomal location to be obtained in one step. This technology is 50 Can be used with cDNA of about 60 bases. For an overview of this technology, see Verma et al., Hum. an Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York See K (1988).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on the chromosome Location can be correlated with genetic map data. Such data, for example, If V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Jones Hopkins University E (Available online from the Ruchi Medical Library). Next In addition, a linkage analysis (linkag) e analysis) (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).   Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between patients and non-patients. is there. Some mutations are observed in some or all of the patients and normal individuals If not done, the mutation may be the causative agent of the disease.   With the current resolution of physical mapping technology and gene mapping technology, the disease CDNAs that are precisely located in chromosomal regions associated with (1 megabase mapping resolution and 1 residue per 20b) Assuming a gene).   The polypeptide of the present invention, its fragments and other derivatives, its analogs, and the like Can be used as an immunogen to produce antibodies against them. Wear. These antibodies are, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. sell. The present invention relates to chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies and Fab fragments or Fab expression Also includes the products of the library. For the production of such antibodies and fragments, Various methods known in the art can be used.   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention can be animal (preferably Are non-human animals) by direct injection or administration of the polypeptide. Can be obtained. The antibody thus obtained binds to the polypeptide itself will do. This method uses sequences that encode only fragments of the peptide. Alternatively, antibodies can be generated that bind the whole naturally occurring polypeptide. That's it Such antibodies isolate the polypeptide from tissues that express it. Can be used to   Monoclonal antibody production involves the production of antibodies produced by continuous cell line cultures. Any technique that gives the body can be used. Examples include hybridoma technology (Ko hler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trioma technology , Human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) and EBV hybridoma technology for the production of human and monoclonal antibodies (Cole et al., 1 98 5, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 ).   The technology described for the production of single chain antibodies (U.S. Pat. Can be adapted for the production of single-chain antibodies to immunogenic polypeptide products . In addition, using the transformed mouse, the immunogenic polypeptide product of the present invention Anthropomorphic antibodies can also be expressed.   The present invention is further described with reference to the following examples. However, the present invention It should be understood that the present invention is not limited to the embodiment. Unless otherwise specified, percentages and quantities are All based on weight.   In order to facilitate understanding of the following examples, frequently used methods and / or terms will be described. Here are some explanations.   "Plasmids" are designated by a lower case p preceded and / or followed by capital letters and / or numbers. The starting plasmids herein are commercially available or publicly available without restriction Alternatively, they can be constructed according to published methods from available plasmids. Sa In addition, plasmids equivalent to the plasmids described herein are known in the art. Known, they will be apparent to those skilled in the art.   "Digestion" of DNA refers to DN by a restriction enzyme that acts only at specific sequences in the DNA. Means the catalytic cleavage of A. The various restriction enzymes used herein are commercially available. And their reaction conditions, cofactors and other requirements are known to those skilled in the art. We used wax. For analysis, typically 1 μg of plasmid or DNA fragment is Use in about 20 μl of buffer solution with the enzyme in position. DNA fragment for plasmid construction For isolation, usually 5 to 50 μg of DNA in a larger volume is used for 20 to 250 units of enzyme. Digest with element. The appropriate amount of buffer and substrate for a particular restriction enzyme is determined by the manufacturer. Is determined. Usually an incubation time of about 1 hour at 37 ° C is used. Can be changed according to the supplier's instructions. After digestion, the reaction mixture is The desired fragment is isolated by electrophoresis directly on a luamide gel.   Size separation of the cleaved fragments is described in Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057. Performed using 8% polyacrylamide gel described in (1980).   “Oligonucleotide” is a single-stranded polydeoxynucleotide that can be chemically synthesized. Otide or two complementary polydeoxynucleotide chains. Such a case Since synthetic oligonucleotides do not have a 5 'phosphate group, ATP can be used in the presence of a kinase. Without a phosphate group, it would not ligate to another oligonucleotide . A synthetic oligonucleotide will ligate to a fragment that has not been dephosphorylated.   "Ligation" means that a phosphodiester bond is formed between two double-stranded nucleic acid fragments. (Maniatis, T. et al., Supra, p. 146). Unless stated otherwise, consolidation is Using known buffer and conditions, add 0.5 μg of approximately equimolar amount of DNA fragment to be ligated. 10 units of T4 DNA ligase ("ligase").   Unless otherwise stated, transformations were performed by Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973).                                 Example 1                     FGF-15 Bacterial expression and purification of proteins   The DNA sequence encoding FGF-15 (ATCC No. 97146) was first processed and Sequence of the 5 'protein (lacking the signal peptide sequence) and the 3' Using PCR oligonucleotide primers corresponding to the vector sequence . Add additional nucleotides corresponding to the gene to the 5 'and 3' sequences . The 5 'oligonucleotide primer was 5' GCCAGA CCATGG TAAAACCG GTGCCCCTC It has the sequence 3 '(SEQ ID NO: 3) and contains an NcoI restriction enzyme site (bold part) . The 3 'sequence (5' GGCAGG AGATCT TGTTGTCTTACTCTTGTTGAC 3 '; SEQ ID NO: 4) is composed of BglI Contains the sequence complementary to the I site (bold) followed by the FGF-15 coding sequence The row is followed by 21 nucleotides.   These restriction sites are found in the bacterial expression vector pQE60 (Quiagen, Inc., 91111). (Chatsworth, California). pQE-60 is an antibiotic Quality resistance (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), promoter operation controllable by IPTG Ribosome binding site (RBS), 6-His label and restriction enzyme site Code. Next, pQE-60 was digested with NcoI and BglII. Amplified sequence in pQE-60 And inserted in frame with histidine label and ribosome binding site (RBS) I do. Then, using the ligation mixture, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A  Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory Press (1989) E. coli strain M15 / rep4 (Qiagen, Inc.) is transformed. M15 / rep4 is a lacI inhibitor And express kanamycin resistance (Kanr) Conferring multiple pREP4 plasmids Contains a copy. Transformants by their ability to grow on LB plates Identify and select ampicillin / kanamycin resistant colonies. Plasmid DNA Isolate and confirm it by restriction analysis. Clones containing the desired construct LB liquid medium supplemented with both Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml) overnight (O / N) Incubate. The O / N culture is inoculated into a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. You. Optical density 600 (O.D.600The cells are grown until 0.4) is 0.4-0.6. Next, IPTG ("Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside") to a final concentration of 1 mM Add. IPTG cleans P / O by inactivating the lacI repressor, Induces increased gene expression. The cells are grown for an additional 3-4 hours. Next, centrifuge Collect cells by: Cell pellet with chaotropic reagent 6M guanidine hydrochloride Solubilized in After cleaning, the protein containing the 6-His tag Chromatography on a nickel-chelate column under conditions that allow strong binding by Purify solubilized FGF-15 by luffy (Hochuli, E. et al., J. Chromatog raphy 411: 177-184 (1984)). Protein from column with 6M guanidine hydrochloride pH 5.0 Elute and regenerate 3M guanidine hydrochloride, 100 mM sodium phosphate, 10 mM Adjust to lutathione (reduced form) and 2 mM glutathione (oxidized form). Add this solution to 1 After incubation for 2 hours, the protein is dialyzed against 10 mM sodium phosphate I do.                                 Example 2         Cloning and expression of FGF-15 using baculovirus expression system   The DNA sequence encoding the full-length FGF-15 protein (ATCC No. 97146) was Amplification using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene I do.   The FGF-15 5 'primer is a 5' CTAGT GGATCC GCCATCATGGTAAAACC GGTGCCC 3 '(SEQ ID NO: 5) and contains a Bam HI restriction enzyme site (bold part) In that part, 4 nuclei resembling an efficient signal for translation initiation in eukaryotic cells Otide (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947-950 (1987)) followed by Immediately after the first 18 nucleotides of the gene (with the translation initiation codon "ATG") Underlined).   The 3 'primer was 5' CGACT GGTACC AGCCACGGAGCAGGAATGTCT 3 '(SEQ ID NO: 6) And the cleavage site for the restriction endonuclease Asp718 (in bold) and Contains 21 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence of the gene.   The amplified sequence was transferred to a commercially available kit (“Geneclean”, BI0101 Inc., California). (La Jolla, N.A.) using a 1% agarose gel. Next, the fragment After digestion with each endonuclease, it is purified again on a 1% agarose gel. This cut The piece is named F2.   Baculovirus expression system (Summers, M.D. and Smith, G.E., 1987 for an overview) , A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture pr ocedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. See 1555 For the expression of proteins by means of a vector, the vector pA2 (modified from the pVL941 vector) Used later). This expression vector is in the Autographa californica nucleus. Strong polyhedrin promoter of polyhedrosis virus (AcMNPV) And the subsequent recognition sites for the restriction endonucleases BamHI and XbaI. . For efficient polyadenylation, the simian virus (SV) 40 polyadenylation Use the site of cleavage. For easy selection of recombinant virus, β- The galactosidase gene is preceded by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. Insert in the same direction as the polyhedrin promoter to be run. Both polyhedrin sequences At the end is the cell-mediated phase of co-transfected wild-type viral DNA. The viral sequences are flanked for the same recombination. Instead of pA2, pRG1, pAc373, pVL 941 and pAcIM1 (Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170: 31-39) and the like Many other baculovirus vectors can also be used.   After digesting the plasmid with the above restriction enzymes, using bovine intestinal phosphatase Dephosphorylation by techniques known in the art. Next, a commercially available kit ("Genecl ea n ", BI0101 Inc., La Jolla, Calif.) Isolate from gel. This vector is named V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 are ligated with T4 DNA ligase. Next, E. coli DH5α cells were transformed and bacteria containing the plasmid (pBacFGF-15) were Identify using restriction enzymes. The sequence of the cloned fragment was determined by DNA sequencing. Confirm.   Lipofection method (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-741. 7 (1987)), 5 μg of plasmid pBacFGF-15 was added to a commercially available linearized plasmid. Virus ("BaculoGoldTM baculovirus DNA ", Pharmingen, California Transfection with 1.0 μg simultaneously.   1 μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of the above plasmid were added to serum-free gray Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50 μl Mix in sterile wells of a microtiter plate containing. Then Lipov Add 10 μl of pectin and 90 μl of Grace's medium, mix and incubate for 15 minutes at room temperature. To Next, a 35 mm tissue culture plate containing 1 ml of Grace's medium without serum Transfection mixture was added to Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) The mixture is dropped. Shake the plate back and forth to mix the newly added solution. Next Next, the plate is incubated at 27 ° C. for 5 hours. 5 hours later, transfection solution From the plate and add 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal bovine serum. I can. The plate is returned to the incubator and the culture is continued at 27 ° C. for 4 days.   Four days later, the supernatant was collected, and the supernatant was collected as described in Summers and Smith (above). Perform the assay. As an improvement, "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Use agarose gel containing Gaithersburg). This is a blue stained plate. Facilitates isolation of larks. A detailed description of the “plaque assay” can be found at Life  Insect Cell Culture and Baculo Published by Technologies Inc. (Gaithersburg) Also found on pages 9-10 of the User's Guide on Virology.   Four days after serial dilution, virus is added to cells and blue-stained plaques are Pick up with the tip of a Ndolph pipette. Next, the agar containing the recombinant virus was , Resuspend in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. Short centrifuge The agar was removed by separation and the supernatant containing the recombinant baculovirus was used for 35 Infect Sf9 cells inoculated in mm dishes. After 4 days, collect the supernatant of these culture dishes And store at 4 ° C.   Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. The cells Infect recombinant baculovirus V-FGF-15 at a multiplicity of infection (MOI) of 2. Six hours later, Remove the medium and remove SF900 II medium lacking methionine and cysteine (Life Technologie s Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi35S-methionine and 5 μCi35Add S-cysteine (Amersham). After culturing the cells for another 16 hours, The collected and labeled proteins are collected by centrifugation and analyzed by SDS-PAGE and autoradiography. Visualize with fees.                                  Example 4                     COS Expression of recombinant FGF-15 in cells   1) SV40 replication origin, 2) ampicillin resistance gene, 3) E. coli replication origin, 4) CMV Promoter followed by polylinker region, SV40 intron and polyadenyl Derived from the pcDNA3 / Amp (Invitrogen) vector containing an activating site Expression of FGF-15-HA. All FGF-15 precursors and their 3 'end in frame A DNA fragment encoding the fused HA label was added to the polylinker region of the vector. Cloning. Therefore, the expression of the recombinant protein is controlled by the CMV promoter. Controlled by HA labeling, as previously described, is influenza hemagglutinin Corresponding to epitopes derived from proteins (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten , A. Cherenson, M .; Connolly and R.S. Lerner, Cell, 37: 767 (1984)). Target When the HA tag is fused to the protein, the recombinant protein is treated with an antibody that recognizes the HA epitope. Parkin can be easily detected.   The plasmid construction method is as follows.   The DNA sequence encoding FGF-15 (ATCC No. 97146) was used with the following two primers. Be constructed by PCR. 5 'primer (5' CTAGT GGATCC GCCATCATGGTAAAAC CGGTGCCC 3 '; SEQ ID NO: 7) begins with a BamHI site followed by a start codon. 18 nucleotides of the coding sequence. 3 'sequence (5'GTCGAC CTCGAG  TGTGTGCTTACTCTTGTT 3 '; SEQ ID NO: 8) has an XhoI site, a translation termination codon, and an HA label And the last 18 nucleotides of the FGF-15 coding sequence (not including the stop codon) Contains a sequence complementary to Therefore, the PCR product contains a BamHI site, Labeling sequence followed by HA label fused in frame, translation termination following HA labeling Contains a stop codon and an XhoI site.   The PCR-amplified DNA fragment and the vector pcDNA3 / Amp are digested with each restriction enzyme and ligated. . Escherichia coli SURE strain (Stratagene Cloning Systems, 92037 Calyph) (Available from La Jolla, Arn.) And transforming the transformed culture Incubate on phosphorus media plates to select resistant colonies. Transform plasmid DNA Isolate from transformants and check for the presence of the correct fragment by restriction analysis. This recombinant FG To express F-15, the DEAE-dextran method (J. Sambrook, E. Fritsch, T.) . Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laborato ry Press (1989)), transfected COS cells with the above expression vector. To work. Expression of FGF-15-HA protein was determined by radiolabeling and immunoprecipitation (E. Harlow). , D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator y Press (1988)). Two days after transfection, cells To35Label with S-cysteine for 8 hours. Next, collect the culture medium and transfer the cells to detergent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris , PH 7.5) (Wilson, I. et al., Supra, 37: 767 (1984)). Cell lysate and medium Both nutrient media are precipitated with an HA-specific monoclonal antibody. Precipitated protein The quality is analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.   Many modifications and variations can be made to the present invention in light of the above teachings. Therefore, in addition to the specifically described embodiments, the present invention is embodied within the scope of the appended claims. be able to.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＳ ＡＤＳ 48/00 ＡＢＲ 48/00 ＡＢＲ Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 16/22 16/22 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ローゼン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国20882メリーランド州 レ イトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 45/00 AAM A61K 45/00 ADS ADS 48/00 ABR 48/00 ABR C07K 14/50 C07K 14/50 16/22 16 / 22 C12P 21/02 H C12N 5/10 C12N 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/24 ADU // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW , MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Rosen, Craig A United States 20882 Maryland Rolling Hill Road 22400, Laytonsville

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（a）図1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （b）(a)のポリヌクレオチドにハイブリッド形成することができ、そのポリヌク レオチドと少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド；及び、 （c）(a)又は(b)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片； からなる群より選択される要素からなる単離されたポリヌクレオチド。 ２．配列番号2に記載のアミノ酸1からアミノ酸252までを含むポリペプチドを コードする請求項1のポリヌクレオチド。 ３．そのポリヌクレオチドがDNAである請求項1のポリヌクレオチド。 ４．該ポリヌクレオチドがRNAである請求項1のポリヌクレオチド。 ５．そのポリヌクレオチドがゲノムDNAである請求項1のポリヌクレオチド。 ６．配列番号1に記載のヌクレオチド1からヌクレオチド759までを含む請求項1 のポリヌクレオチド。 ７．（a）ATCC寄託番号97146に含まれるDNAによってコードされる成熟ポリペ プチドをコードするポリヌクレオチド； （b）ATCC寄託番号97146に含まれるDNAによって発現されるポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド； （c）(a)又は(b)のポリヌクレオチドにハイブリッド形成することができ、その ポリヌクレオチドと少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド；及び、 （d）(a)、(b)又は(c)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片； からなる群より選択される要素からなる単離されたポリヌクレオチド。 ８．該ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97146に含まれるDNAによって発現され るポリペプチドをコードする請求項7のポリヌクレオチド。 ９．該ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97146に含まれるDNAによって発現され るポリペプチドをコードする請求項7のポリヌクレオチド。 10．該ポリヌクレオチドがATCC寄託番号97146に含まれるDNAによって発現され るポリペプチドをコードする請求項7のポリヌクレオチド。 11．請求項2のDNAを含有するベクター。 12．請求項11のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 13．請求項12の宿主細胞から該DNAによってコードされるポリペプチドを発現 させることからなるポリペプチドの生産法。 14．請求項11のベクターで細胞を遺伝子操作することからなる、ポリペプチド を発現させることのできる細胞の生産法。 15．（i）図1の推定アミノ酸配列を持つポリペプチド及びその断片、類縁体並 びに誘導体；及び（ii）ATCC寄託番号97146のcDNAによってコードされるポリペ プチド及び該ポリペプチドの断片、類縁体並びに誘導体、からなる群より選択さ れるポリペプチド。 16．そのポリペプチドが図1の推定アミノ酸配列を持つ請求項15のポリペプチ ド。 17．請求項15のポリペプチドに対する抗体。 18．請求項15のポリペプチドを阻害する化合物。 19．請求項15のポリペプチドに対するレセプターを活性化する化合物。 20．FGF-15ポリペプチドを必要とする患者の処置法であって、請求項15のポリ ペプチドの治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 21．FGF-15ポリペプチドを阻害する必要がある患者の処置法であって、請求項 18の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 22．該ポリペプチドの該治療有効量の投与が、該ポリペプチドをコードし、か つ、該ポリペプチドを生体内で発現させるDNAを、その患者に与えることによっ てなされる請求項20の方法。 23．該化合物がポリペプチドであり、その化合物の治療有効量の投与が、該ア ンタゴニストをコードし、かつ、該アンタゴニストを生体内で発現させるDNAを 、その患者に与えることによってなされる請求項21の方法。 24．下記の操作からなる、請求項15のポリペプチドに対するアゴニストとして 活性な化合物を同定する方法： （a）細胞が通常、該ポリペプチドによって刺激される条件下に、スクリーニン グしようとする化合物と細胞を含有する反応混合物とを混合する。ここに、該反 応混合物は、上記細胞が増殖するにつれて、その細胞内に組み込まれる標識を含 有する；及び、 （b）その細胞の増殖の程度を測定することにより、その化合物が有効なアゴニ ストであるかどうかを明らかにする。 25．下記の操作からなる、請求項15のポリペプチドに対するアンタゴニストと して活性な化合物を同定する方法： （a）細胞が通常、該ポリペプチドによって刺激される条件下に、スクリーニン グしようとする化合物と細胞を含有する反応混合物とを混合する。ここに、該反 応混合物は、上記細胞が増殖するにつれて、その細胞内に組み込まれる標識を含 有する；及び、 （b）その細胞の増殖の程度を測定することにより、その化合物が有効なアンタ ゴニストであるかどうかを明らかにする。 26．請求項15のポリペプチドの過少発現に関係する疾患又はその疾患に対する 罹病性を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸中の突然変異 を決定することからなる方法。 27．宿主から得た試料中の請求項15のポリペプチドの存在について分析するこ とからなる診断法。[Claims]   1. (A) a polynucleotide encoding the polypeptide of FIG. 1; (B) the polynucleotide capable of hybridizing to the polynucleotide of (a); A polynucleotide at least 70% identical to leotide; and (C) a polynucleotide fragment of the polynucleotide of (a) or (b); An isolated polynucleotide consisting of an element selected from the group consisting of:   2. A polypeptide comprising amino acids 1 to 252 of SEQ ID NO: 2 2. The polynucleotide of claim 1, which encodes.   3. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is DNA.   4. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein said polynucleotide is RNA.   5. 2. The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is genomic DNA.   6. Claim 1 comprising nucleotide 1 to nucleotide 759 of SEQ ID NO: 1. Polynucleotide.   7. (A) mature polypeptide encoded by the DNA contained in ATCC Deposit No. 97146 A polynucleotide encoding a peptide; (B) encoding the polypeptide expressed by the DNA contained in ATCC Deposit No. 97146; A polynucleotide to be loaded; (C) capable of hybridizing to the polynucleotide of (a) or (b), A polynucleotide at least 70% identical to the polynucleotide; and (D) a polynucleotide fragment of the polynucleotide of (a), (b) or (c); An isolated polynucleotide consisting of an element selected from the group consisting of:   8. The polynucleotide is expressed by the DNA contained in ATCC Deposit No. 97146 8. The polynucleotide of claim 7, which encodes a polypeptide.   9. The polynucleotide is expressed by the DNA contained in ATCC Deposit No. 97146 8. The polynucleotide of claim 7, which encodes a polypeptide.   Ten. The polynucleotide is expressed by the DNA contained in ATCC Deposit No. 97146 8. The polynucleotide of claim 7, which encodes a polypeptide.   11． A vector containing the DNA of claim 2.   12． A host cell genetically engineered with the vector of claim 11.   13. Expressing the polypeptide encoded by the DNA from the host cell of claim 12. Producing a polypeptide.   14. A polypeptide comprising genetically engineering a cell with the vector of claim 11. A method for producing a cell capable of expressing a cell.   15． (I) Polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 and fragments and analogs thereof And (ii) a polypeptide encoded by the cDNA of ATCC Deposit No. 97146. Selected from the group consisting of peptides and fragments, analogs and derivatives of the polypeptides. Polypeptide.   16． 16. The polypeptide of claim 15, wherein said polypeptide has the deduced amino acid sequence of FIG. De.   17． An antibody against the polypeptide of claim 15.   18． A compound that inhibits the polypeptide of claim 15.   19. A compound that activates a receptor for the polypeptide of claim 15.   20. A method of treating a patient in need of an FGF-15 polypeptide, wherein the polypeptide of claim 15 is used. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the peptide.   twenty one. A method of treating a patient in need of inhibiting a FGF-15 polypeptide, comprising: Administering to the patient a therapeutically effective amount of the 18 compounds.   twenty two. Administering the therapeutically effective amount of the polypeptide encodes the polypeptide; First, the patient is provided with DNA that expresses the polypeptide in vivo. 21. The method of claim 20, wherein the method is performed.   twenty three. The compound is a polypeptide, and administration of a therapeutically effective amount of the compound is administered to the compound. DNA encoding an antagonist and expressing the antagonist in vivo 22. The method of claim 21, wherein said method is provided by giving to said patient.   twenty four. As an agonist for the polypeptide of claim 15, comprising the following operations: Methods for identifying active compounds: (A) screening cells under conditions that are normally stimulated by the polypeptide; The compound to be crushed and the reaction mixture containing the cells are mixed. Here, The reaction mixture contains a label that is incorporated into the cells as they grow. Have; and (B) By measuring the degree of proliferation of the cell, it is Determine if it is a strike.   twenty five. An antagonist to the polypeptide of claim 15, comprising the following operations: To identify active compounds by: (A) screening cells under conditions that are normally stimulated by the polypeptide; The compound to be crushed and the reaction mixture containing the cells are mixed. Here, The reaction mixture contains a label that is incorporated into the cells as they grow. Have; and (B) measuring the degree of proliferation of the cell to determine if the compound is effective; Identify if you are a gonist.   26. A disease associated with underexpression of the polypeptide of claim 15 or a disease thereof. A method for diagnosing susceptibility, comprising a mutation in a nucleic acid encoding the polypeptide. A method consisting of determining.   27. Analyzing the presence of the polypeptide of claim 15 in a sample obtained from the host. A diagnostic method consisting of:
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