JPH09501719A - ヘパリン官能アフィニティー支持体 - Google Patents

ヘパリン官能アフィニティー支持体

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JPH09501719A
JPH09501719A JP7507090A JP50709095A JPH09501719A JP H09501719 A JPH09501719 A JP H09501719A JP 7507090 A JP7507090 A JP 7507090A JP 50709095 A JP50709095 A JP 50709095A JP H09501719 A JPH09501719 A JP H09501719A
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heparin
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ラスムッセン，ジェラルド，ケー．
カリー，ラッセル，エー．
ウォーカー，マーガレット，エム．
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ミネソタ マイニング アンド マニュファクチャリング カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 本開示は、ヒドラジンとのアズラクトン官能ポリマーの反応により得られるヒドラジド官能ポリマーについて記載する。このヒドラジン官能ポリマーは、生物学的活性をもつ物質の精製、調製、分離及び調査に有用であるヘパリン官能ポリマーを提供するために、カルボニル官能材料、例えばヘパリンとの反応に有用である。アンチトロンビンIIIの精製のためのビーズの如く有意に改善されたアフィニティー・クロマトグラフィー支持体としてのヘパリン官能ポリマーの製造及び使用方法についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリン官能アフィニティー支持体 本発明は、それらの表面上にヒドラジド官能リガンド（hydrazide functional ligands）をもつポリマーに及びこのようなヒドラジド官能ポリマーから作られ たヘパリン官能ポリマーに並びに両者の製造及び使用方法に関する。背景 固定化ヘパリンは、生物学的活性をもつ物質の精製、調製、分離及び調査のた めのアフィニティー・クロマトグラフィーにおけるリガンドとして広く使用され ている。ヘパリンは、固体支持体上にさまざまな公知の方法によるクロマトグラ フィー目的のために固定化される。例えば、“Application of Immobilized Hep arins for Isolation of Human Antithrombin III”by G．Mitra，E．Hall and I．Mitra，Biotechnology and Bioengineering, Vol．XXVIII，pp.217-222 (198 6)を参照のこと。 東ドイツ国特許第 276,814 A1 号は、 3.8以下のpHにおける水性バッファー中 でのヒドラジド−誘導体化ポリアクリルアミド粒子への非誘導体化ヘパリンのカ ップリングについて記載している。この特許は、改善されたカップリング効率、 そのカップリング結合のより大きな安定性及びその方法に対するその支持体のよ り大きな機械的強度に貢献する。しかしながら、請求に係るマトリックスは未だ 比較的乏しい機械的安定性を有し、そして多数回の使用及び高流速が望まれる大 規模分離工程にはほとんど有用ではないであろう。さらに、この支持体の調製の ために使用される酸性条件は、そのヘパ リン分子のいくらかの脱硫酸化 (desulfation)及び加水分解をもたらし、これ故 、アフィニティー・クロマトグラフィー目的のためのその生物学的特異性及び有 用性を減少させる。 米国特許第 5,116,962号は、誘導体化ヘパリンが反応性アミノ基を含む担体材 料に結合される方法について記載している。しかしながら、この方法は、その結 合された生成物を提供するための、アルカリ金属ホウ化水素の使用を必要とする 。このようなホウ化水素は高価、毒性及び有害であり、そして環境にやさしくな いと考えられる。さらに、このヘパリン官能支持体生成物の製造のための反応時 間は、ひじょうに長く、好ましくは12〜16日間であり、ひじょうに低い処理量を 伴う工程をもたらす。 従って、改善されたヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体 を提供するための最近の努力はひじょうに成功しておらず、そしてより良好な支 持体及び方法が望まれるであろうと理解される。 アンチトロンビンIII（antithrombinIII）を精製するためのヘパリン官能アフ ィニティー・クロマトグラフィー支持体の使用はよく知られており（例えば、米 国特許第 3,842,061号参照）、そしてそれは、治療用途のためのアンチトロンビ ンIIIの選択に係る提供方法である。アンチトロンビンIIIは、心臓血管疾患を治 療するため有用な、ひじょうに重要であるがひじょうに高価な物質であるので、 その単離及び精製のための方法においていずれかの有意な改善が潜在的にひじょ うに価値が高い。本発明の目的の中の１は、精製されたアンチトロンビンIII及 びヘパリンについて特異的アフィニティーをもつ基、をもつ他の分子、すなわち ヘパリン−相互作用性分子の製造のための新規の組成物及び方法を提供すること である。本発明の要約 固定化ヘパリンの使用の利点は長年にわたり知られてきたけれども、報告され 又は商業的に販売されている現在利用可能な方法及び製品に対して多くの欠点が 残存する。 改良された支持体であって、以下の： ａ）支持体へのヘパリンの高効率のカップリング； ｂ）それによりヘパリンが結合されるところの化学的結合の高い安定性； ｃ）高い生物学的活性をもつヘパリン・リガンド； ｄ）ヘパリン又は支持体マトリックスへの、標的分子以外の分子の低い非特異 的結合；及び ｅ）ヘパリン又は支持体に結合した非標的タンパク質を取り除くために使用さ れる試薬に対する、ヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体の 高い安定性、 を提供するものについての必要性が存在する。 本発明は、アズラクトン官能ポリマーから誘導された改良されたヘパリン官能 ポリマー及びヒドラジド官能ポリマーを提供する。 さらに特に、本発明は、改良されたヘパリン官能アフィニティー・クロマトグ ラフィー支持体を提供する。このような支持体は、アズラクトン官能支持体から 誘導されたヒドラジド官能支持体に基づく。本発明に係る支持体は、ヘパリン官 能支持体への標的分子の驚ろくべき高い結合効率、安定したカップリング結合、 ヘパリンの分解を最小にする温和な反応条件、及びヘパリン支持体から非標的分 子を取り除くために使用される塩基に対するその支持体の高い安定性、を提供す る。 本発明は、アズラクトン官能ポリマー支持体から誘導されるヒドラジド官能ポ リマーをも提供する。 広義には、本発明は、ヘパリン官能性表面の提供方法であって、ヒドラジンと 反応させることによりアズラクトン官能ポリマー表面を誘導体化し、ヒドラジド を提供し、そしてさらに、ヘパリンと反応させることにより誘導体化することを 含んで成る方法についても記載する。 広義には、本発明は、ヘパリン官能表面とヘパリン相互作用性分子の相互作用 を行う方法であって、ヘパリンとの反応によりさらに誘導体化されるヒドラジド を提供するためにヒドラジンとの反応により誘導体化されるアズラクトン官能ポ リマーである表面を用意し、そしてその表面をそのヘパリン相互作用性分子に晒 すことを含んで成る方法についても記載する。 用語“表面”は先に使用するとき、材料の外部又は一番上の境界として広く定 義される。 用語“ヘパリン (heparin)”は本明細書を通じて一般的に使用され、そして天 然のヘパリン、誘導体化ヘパリン、ヘパリン塩、低分子量ヘパリン、ヒドラジド 官能基と反応するであろうさまざまな化学的に修飾されたヘパリン及び合成ヘパ リン様分子を含む。カルボニル官能ヘパリンとカルボニル官能ヘパリン様分子の 両方が本発明の利点のいくつか又は全てを提供するであろうことが当業者により 理解されるであろう。本発明の実施例のほとんどにおいて使用されるヘパリンは 、Diosynth Laboratories Inc.，(Chicago，IL) から商業的に入手可能なアルデ ヒド官能ナトリウム・ヘパリンである。他の好適な商業的に入手可能なヘパリン はSigma Chemical Co.，Calbiochem，and Scientific Protein Laboratories か ら入手可能である。 本発明は、生物学的に活性な標的分子を分離及び精製するための改良方法を提 供する。より特に、アンチトロンビンIIIの精製のため の驚ろくべき改良方法について記載する。詳細な説明 1989年10月４日に米国に出願された米国逐次番号第07/335,835号に基づく、欧 州特許出願第 0392,735 A2号は、生物学的に活性な支持体を提供することを含む さまざまな目的に有用なアズラクトン−官能ポリマー支持体の使用について記載 している。ヒドラジド官能性である本発明に係る、有用な反応性ポリマー、例え ばポリマー支持体は、ヒドラジンとの、公知のアズラクトン−官能ポリマー、例 えばポリマー支持体であって例えば欧州特許出願第 0392,735 A2中に記載されて いるものの反応により製造されることができる。この反応は、驚ろくべき温和な 条件下で、すなわち、周囲温度（約25℃）において行われ、そしてすみやかに完 結する（例えば、実験室条件下で１〜24時間、好ましくは１〜３時間）。 本発明における使用のために好ましいアズラクトン−官能ポリマ MNから商業的に入手可能である。このバイオサポート媒質は、先に引用した欧州 特許明細書中に一般的に記載されているように、商業的に入手可能なメチレン・ ビス（アクリルアミド）モノマーと２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン から製造される。 一般的に、この反応は、（好ましくは）水及び／又は非反応性溶媒中で行われ る。過剰のヒドラジンが便利には使用される。温やかな加熱が、その反応を加速 することが望ましい場合に、使用されることができるが、外部加熱は一般的には 不要である。この反応は、一般的に、アズラクトン官能ビーズを用いて行われる けれども、そのアズラクトン官能ポリマーはビーズ形態にある必要はなく、いず れかの他の形態、例えばフィルム、マトリックス、膜、コート膜、 有機及び無機物質を含む他のコート膜その他で存在することもできる。アズラク トン官能膜及びマトリックスは1991年10月11日に出願された米国特許出願逐次番 号第07/776,601号、1992年６月９日に出願された米国特許出願逐次番号第07/776 ,601号、及びPCT 公開WO93/06925号中に開示されている。本明細書中で使用する アズラクトン−官能ポリマーはその場 (in situ)で製造され、そして次にヒドラ ジンと反応されることもできる。 このヒドラジド官能ポリマーは本明細書中に記載するようにヘパリンの反応に 特に有用であるけれども、これらのヒドラジド基は、アルデヒド基を含む他の分 子及びケトン基を含む分子と有利には反応されることもできる。 本発明に係るヒドラジド官能ポリマーは、公知の手順（例えば、欧州特許出願 第 0392,735 A2号並びに米国特許出願第07/776,601号及び第07/896,107号参照） に従って支持体及び他の有用な形態、例えばビーズ、フィルム、マトリックス、 膜、又は有機又は無機支持体上のコーティングに作られることができる。 アズラクトン−官能ポリマー支持体から誘導されるヒドラジド−官能反応性支 持体の調製は、以下の式（Ｉ）： ｛式中、Ｒ1とＲ2が互いに独立して、１〜14炭素原子をもつアルキル基、３〜14 炭素原子をもつシクロアルキル基、５〜12環原子をもつアリール基、６〜26炭素 原子をもつアレニル基並びに０〜３の Ｓ，Ｎ、及び非ペルオキシドＯ複素原子であり、又はＲ1とＲ2がそれらが結合さ れる炭素原子と一緒になって、４〜12環原子を含むカルボサイクリック環を形成 し、ｎが整数０又は１であり、そしてSuが支持体を表す。｝により表されるアズ ラクトン官能基を含んで成る公知のアズラクトン官能支持体のいずれかに基づく 反応性支持体を用いて行われることができる。 ヒドラジンとのアズラクトン官能支持体の反応は、以下の式： ｛式中、Ｒ1，Ｒ2、及びｎは先の式（Ｉ）中に記載されたものである。｝により 表されるヒドラジド−官能支持体を作り出す。 好ましい支持体の基は、ヒドラジンと、式中Ｒ1とＲ2がメチルであり、そして ｎがゼロである式（Ｉ）のアズラクトンとの反応により得られて、以下に示すヒ ドラジド官能反応性支持体を提供する。 先に記載されたヒドラジド−官能反応性支持体の反応は、バッファー中、ひじ ょうに温和な条件下、例えば周囲条件（例えば25℃）の下でそのヒドラジド基に 共有結合によりヘパリンを結合させるためにヘパリンを用いて行われる。好適な バッファーは、約５〜10のpHレンジを提供し、そして例えば、塩、例えば硫酸ナ トリウムの存在又は非存在中、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び炭酸ナト リウムである。この反応は、比較的速く、そして通常 100時間未満 で本質的に完結する。但し、少量の反応は多くの時間、例えば 144時間にわたり 継続する。反応は所望により加熱により加速されることができる。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体を提供 するために使用されるヘパリンは、反応性のカルボニル基、例えばアルデヒド基 を含む。アルデヒド基を含むヘパリン調製品は商業的に入手可能であり、そして これらのあるものは、さらに処理せずにヒドラジド官能反応性支持体と反応させ るために使用されることができる。あるいは、商業的に入手可能な天然ヘパリン 中のカルボニル基の数は、例えば過ヨウ素酸塩をもちいた、本分野において記載 されているようなヘパリンの簡単な酸化により強化されることができる。商業的 に入手可能なヘパリン調製品のいくつかは、存在するアルデヒド基の数を強化す るために化学的に修飾される。 ヘパリンとヒドラジド官能支持体の反応は、式中Hep がヘパリン残基である以 下の式により表されるヘパリン−官能支持体を作り出す。 これは、あるいは以下の式： ｛式中、Ｒ1とＲ2は先の式（Ｉ）中に記載されたものである。｝ に還元されることができる。 好ましい生成物を以下に示す。 他の生成物を以下に示す、ここで、ヘパリン結合における二重結合は慣用の方 法、例えばホウ化水素ナトリウム（sodium borohydride）との反応により還元さ れる。 本発明に係る方法により製造されるヘパリン官能ポリマーは、いずれかの便利 な形態、例えばフィルム、膜、コート膜、ビーズ又はマトリックスにおいて使用 され、又はいずれかの所望の支持体、例えば有機又は無機支持体上にコートされ ることができるが、最も便利には、アフィニティー・クロマトグラフィーのカラ ム内でビーズとして使用される。 上記のように及び本明細書の実施例において製造されるこのようなヘパリン官 能ビーズは典型的なガラス、金属又はプラスチックのクロマトグラフィー・カラ ム内にスラリー充填され、そしてバッファー、例えば商業的に入手可能な0.05Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）バッファーであって一般的に は塩化ナトリウムが添加され、例えば、0.1〜0.5Ｍ塩化ナトリウム、好ましくは 約0.15Ｍ塩化ナトリウムにおいて添加され、中性pHにおいて又はその近付で、例 えばpH7.4 にあるものにより平衡にされる。このビーズのカラムを次に、最初に 0.15Ｍ塩化ナトリウムを含む一定容量の0.05Ｍ TRIS バッファー（ローディング ・バッファー）、その後0.05 Ｍ TRIS 中 4.0Ｍ塩化ナトリウムの等容量により、そして最後に等容量の上記ロ ーディング・バッファーを使用することにより、塩濯ぎに供する。 米国赤十字（American Red Cross）から得た精製アンチトロンビンIII（ATIII ）を、このカラムがこの物質を保持する能力を定量するために使用した。このカ ラムのビーズ上のヘパリンのローディング投与量に依存して、11.10mg／mL程高 いアンチトロンビンIII能力が、同一条件下で3.86の能力を提供する商業的カラ ムと比較するときに、観察される。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体の使用 は、有利には、大きなカラム内でのATIIIの商業的に有用な量の製造のために大 規模に行われる。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムがヒ ト成長因子の精製においても有用であることも発見された。 ヘパリン官能クロマトグラフィー支持体は、標的分子以外の、分子、例えばタ ンパク質により徐々に汚染されることが知られている。このような非標的分子は 、そのヘパリン結合性部位を徐々にブロックする非特異的結合を経験すると言わ れている。本発明に係る支持体は、特定の商業的に入手可能な支持体よりも非特 異的結合を有意に受けにくいことが発見された、すなわち、本発明に係る支持体 は低い非特異的結合をもつ。ヘパリン支持体からの非特異的分子のクリーニング は、通常、有機又は無機塩基を用いて行われる。無機塩基が好ましい。なぜなら 、それらは標的分子から除去することが容易であるからである。本発明に係る支 持体は、無機塩基、例えば水性水酸化ナトリウムにより洗浄するときに驚ろくべ き良好な安定性を立証し、 0.1Ｎ水性水酸化ナトリウムにより洗浄されるときそ れらの結合能力の90％を上廻るものを保持し、そして 1.0Ｎ水性水酸化ナトリウ ムにより洗浄されるとき80％を上廻るものを保持することが発見された。 以下の実施例を本発明を説明するために使用するがそれは、クレームにおいて 定められるように本発明を限定することを意図されない。実施例１ ：メチレン（ビス）アクリルアミド・ポリマー上のアズラクトン官能基 から誘導されたヒドラジド官能ビーズの製造 以下の式： ｛式中、Suはポリマー支持体媒質（メチレンビスアクリルアミド）を表す。｝に より表される反応単位をもつ、 3.0ｇ部のアズラクトン−官能ビーズであって、 米国特許出願第 335,835号の実施例4Eの方法の（実施例２において以下に記載す る）変法に従って調製され、そして欧州特許出願第 0392,735 A2号として公開さ れ、そして３ １として商業的に入手可能なものを、50mL遠心分離管内で計量し、そして水中64 ％ヒドラジン30mlを添加した。この混合物は、添加の間の反応の開始のために僅 かに温まり、そして２時間回転ミキサー上で撹拌された。次にこのビーズを濾過 により分離し、その水がpH紙に従って中性になるまで蒸留水で繰り返し洗浄し、 そして冷蔵庫内で保存した。実施例２ ：ヒドラジド官能ビーズの他の製造 348mLのヘプタン、188mLのトルエン及び欧州特許出願第 0392, 735 A2号の実施例4E中に記載されたような0.13ｇのポリマー安定剤の有機溶液を 撹拌しながら35℃まで加熱した。窒素雰囲気下でこの撹拌溶液に0.72mlＬの２− ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン・モノマーを添加した。水性溶液をSigm a Chemical Companyから入手可能な 13.33ｇのメチレンビス（アクリルアミド） 90mLのイソプロピルアルコール、60mLの脱イオン水から調製し、これを溶解する まで低加熱において撹拌し、次に0.55ｇの過硫酸ナトリウムを添加し、そしてそ の混合物をそれが溶解するまで撹拌した。 上記有機溶液と上記水性溶液を５分間混合し、次に0.55mLのテトラメチルエチ レンジアミンを添加した。撹拌を、アズラクトン官能ビーズを形成させながら２ 時間続けた。これらのビーズを単離し、そして合成中間体として使用することが できるがこのランにおいては、20ｇのヒドラジンを次にその反応混合物に添加し 、そして撹拌を続けた。 1.5時間後、このヒドラジド官能ビーズを濾過により分 離し、pH紙に対して洗浄水が中性になるまで蒸留水で十分に洗浄し、そして冷蔵 庫内に保存した。実施例３ ：ヒドラジド官能ビーズ製造−ヒドラジン濃度研究 Emphaze Biosupport Medium AB 1ビーズ(125mg) のアリコートを４ れの中に計量し、そして回転ミキサー上で撹拌しながら２時間脱イオン水中で５ mLのヒドラジン溶液と反応させた。各々のカラム上の破断先端を取り除き、過剰 のヒドラジン溶液を排出し、そしてこの誘導体化ビーズを、その溶出液がpH紙に 対して中性になるまで脱イオン水で洗浄した。このビーズのヒドラジド含量を、 G．T．Hermanson，A．K．Mallia，and P．K．Smith，“Immobilized Affinity L igand Techniques”，Academic Press，San Diego，CA，1992，pp. 287により記 載されたプロトコールに従って計測した。以下の表は 、誘導性ヒドラジン溶液の濃度と、対応の測定された誘導体化されたビーズのヒ ドラジド含量を列記する。 ビーズ官能に対するヒドラジン濃度の効果 本実施例は、誘導体化のために0.2Ｍ程の低いヒドラジンの濃度を使用すると きでさえアズラクトン−官能ビーズからひじょうに高いヒドラジド官能基を得る ことができるということを示している。同様の手順により、ヒドラジド官能支持 体は、他のアズラクトン官能支持体、例えば欧州特許出願第 0392,735 A2号の実 施例５中に記載されたものから製造されることができる。実施例４ ：好ましいヒドラジド官能ビーズの製造 968mLの蒸留水中の32mLの無水ヒドラジンの撹拌溶液に、実施例１において使 用したアズラクトン−官能ビーズのロット63ｇを 2.5分間にわたりゆっくりと添 加した。この混合物を２時間と20分間撹拌し、次にこれらのビーズを焼結ガラス 漏斗を使用して濾過により分離し、そしてその洗浄水がpH紙に対して中性になる まで蒸留水で 洗浄した。これらのビーズを蒸留水でスラリーとし、30分間沈澱せしめ、そして 上清を捨てて不所望の余分なビーズを取り除いた。この手順を繰り返した。３番 目の反復は細かいビーズを含まない透明な上清を作り出した。計測されたヒドラ ジド含量は、ビーズ１ミリリッター当り22.4マイクロモルであった。望ましいヒ ドラジド官能ビーズを冷蔵庫に保存した。実施例５ ：ヘパリン−官能ビーズの製造 0.1Ｍ水性酢酸ナトリウムの緩衝溶液 (pH5.0)と５mg／mLのヘパリン・ナトリ ウム（バッチNo．129としてDiosynth，Chicago，ILから得られたもの）５mLに、 実施例１において得られたヒドラジド官能ビーズ１mlを添加した。２時間の反応 後、ビーズを濾過により単離し、５mLの0.1Ｍ水性酢酸ナトリウム・バッファー で洗浄し、次に20ミリモルのリン酸ナトリウム中１Ｍ塩化ナトリウム (pH7.0)10 mLで洗浄し、次に蒸留水で洗浄した。 ヘパリン付加物の存在を評価するために、ビーズのサンプルを 0.5mLの水性ト ルイジン・ブルー溶液（１重量％）と混合した。過剰のトルイジン・ブルーを蒸 留水で繰り返し洗浄することにより除去するとき、これらのビーズは赤紫色であ り、特徴的なヘパリン−トルイジン・ブルー反応を示した。 ヒドラジド官能ビーズとヘパリンとの反応を上述のように繰り返した。但し、 反応体の比率は５mLの緩衝化ヘパリンと２mLのヒドラジド官能ビーズであった。 得られたヘパリン官能ビーズを定性的に評価し、そしてアンチトロンビンIIIに 結合することが発見された。実施例６ ：ヘパリン官能ビーズの製造 施例４において記載されたように製造されたヒドラジド官能ビーズを、ヒドラジ ド−官能ビーズの容量に等しい容量においてヘパリン 溶液を添加することにより、３つの別個の濃度のヘパリン(25.50と75mg／mL) に おいて反応させた。この反応を、酢酸ナトリウム・バッファー、pH5.0 中で約25 ℃において混合することにより行った。72時間後、上清溶液を捨て、それらのビ ーズを10容量の水で、その後10容量の、中性pHにおける 2.0Ｍ塩化ナトリウムで 濯ぎ、その後10容量の水でさらに２回濯いだ。実施例７ ：アンチトロンビンIII能力についてのヘパリン官能ビーズの評価 アンチトロンビンIII能力について実施例６において製造したビーズを評価す るために、そしてそれを商業的に入手可能なヘパリン− から入手可能なもの）と比較するために、別々のカラムを調製した。 ヘパリン・ビーズをガラス・カラム（３mm×５cm）内にスラリー充填し、そし て（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO から入手可能な）0.05Ｍ TRIS バ ッファー、pH7.4 中の0.15Ｍ塩化ナトリウムを使用して平衡にし、そしてロード した。各カラムのビーズを、ローディング・バッファー (3.5mL)により、その後 0.05Ｍ TRIS, pH7.4中の 4.0Ｍ塩化ナトリウム3.5mLにより濯ぐことにより（Ph 濯ぎに供し、そして 3.5mLのローディング・バッファーで平衡にした。 米国赤十字からの精製アンチトロンビンIIIを、0.15Ｍ塩化ナトリウム−0.05 Ｍ TRIS バッファー中 1.0mg／mLの濃度に希釈した。アンチトロンビンIIIの20 カラム容量(7.0ml) を１時間当り 100〜200cm の線速度において上記FPLCシステ ム上で各々のカラム上にロードした。ベースライン吸収に戻すために、 3.5ml（ 10カラム容量）の ローディング・バッファーがカラムを通過した。そのカラムから吸収されたアン チトロンビンIIIを溶出させるために、線形塩化ナトリウム・グラジエントを開 始させ、そして 7.0mLを上廻って運び、ローディング・バッファーと溶出バッフ ァー（0.05Ｍ TRIS，pH7.4中 4.0Ｍ塩化ナトリウム）の計算された比率を用いて 、TRISバッファー中で0.15Ｍの塩化ナトリウムで開始させ、そしてTRISバッファ ー中 2.0Ｍ塩化ナトリウムで終了させた。画分を集め、そしてアンチトロンビン III能力を、280nmにおいてそれらの画分の紫外線吸収の読みから定量した。結合 されたアンチトロンビンIIIは、約 0.9Ｍにおけるピーク溶出を伴って、約0.45 Ｍ塩化ナトリウムにおいて溶出を始めた。 計測されたアンチトロンビンIII（ATIII）能力は下表のようであった： 実施例８：水性水酸化ナトリウムのさまざまな濃度による洗浄に対するヘパリン 官能ビーズの安定性の評価 １mLの溶液当り 100mgのヘパリンにより誘導体化された、実施例６の方法に従 って製造されたヘパリン官能ビーズを、水性水酸化ナトリウムのさまざまな濃度 において４℃において２時間混合することによりそれらのビーズを含浸させた後 にガラス・クロマトグラフ ィー・カラム（３mm×５cm）を調製するために使用した。これらのビーズを次に 水(0.5mLのビーズ当り５mLの水)で３回洗浄し、次にカラム内に充填してアンチ トロンビンIII能力を評価した。精製され るような各々のカラムを通過した。静菌媒質に対するそのカラムの安定性を立証 するために水中の20％エタノール中に含浸された別々に製造されたヘパリン官能 ビーズのカラムを評価した。0.05Ｍ TRIS バッファー、pH7.4 中の0.15Ｍ塩化ナ トリウムを使用して調製された別々に調製されたヘパリン・ビーズ・カラムを対 照として使用した。 結果を表III中に示す。 特定の上記カラムからビーズを取り出し、４℃において２時間処理溶液中で混 合し、上述のように水で濯ぎ、そのカラムに再充填し、そして再びアンチトロン ビンIII能力を測定することにより、第２の処理を行った。これらの結果を表IV 中に示す。 この実験は、本発明のビーズの水酸化ナトリウム洗浄に対する優れた安定性を 立証する。実施例９ ：ヘパリン−官能ビーズの製造及びそのビーズのアンチトロンビンIII 能力についての追加のヘパリン源の評価 ４つの記載のヘパリン製品（表Ｖ参照）をScieutific Protein Laboratories (Waunakee，WI)から得た。これらのヘパリン塩を 0.1Ｍ酢酸塩バッファー、pH5. 0 中 100mg／mLにおいて溶解し、そして、混合しながら、約25℃において72時間 ビーズ対ヘパリン溶液の１：３容量化において実施例４からのヒドラジド官能ビ ーズと反応させた。これらのヘパリン官能ビーズ調製物の濯ぎを実施例６に従っ て行った。 これらのヘパリン官能ビーズを３mm×５cmクロマトグラフィー・カラム内に充 填し、そして実施例７中に記載したようにATIII能力についてテストした。得ら れたATIII能力は以下のようであった： 実施例10：ヘパリン官能ビーズ上の非特異的結合の評価 支持体）ビーズのクロマトグラフィー・カラム（３mm×５cm）(100mg／mLのヘパ リンを反応のために好ましい条件において実施例６中に記載したように得たヒド ラジド官能ビーズと反応させて、93時間反応させた) を実施例７におけるように ローディング・バッファーと溶出バッファーで濯いだ。凍結ヒト血液血漿（米国 赤十字、Rocleville，MD）を４℃において解凍し、遠心分離して冷却沈澱した物 質を除去し、そして 0.8μｍ〜0.2 μｍの篩サイズを通して濾過して追加の粒子 を取り除いた。10.0mLの血漿（29カラム容量）を200cm／時においてクロマトグ ラフィー・カラム上にロードし、その後10.0mLのローディング・バッファーでそ のカラムを濯いだ。非特異的に結合したタンパク質を、0.05Ｍ TRIS，pH7.4中0. 30Ｍ塩化ナトリウムの 7.0mL（20カラム容量）により除去した。ATIIIの溶出を 2.0Ｍ塩化ナトリウムのその後の濯ぎと残存タンパク質の完全な除去を保証する ための 4.0Ｍ塩化ナトリウムを伴う 1.0Ｍ塩化ナトリウムの塩化ナトリウムのグ ラジエント段階により行った。画分を各々 の段階の間に集めた。 0.30Ｍ塩化ナトリウム画分の各画分の吸収の読みが非特異的結合タンパク質を 示す。同一条件下で処理された、ヘパリン− Sepharo は、上記クロマトグラフィー記録において定性的に明らかである。 イン吸収により速く戻り、そして0.30Ｍ塩化ナトリウム濯ぎの間溶出タンパク質 のより小さなピークを現したからである。 1.0Ｍ塩化ナトリウムにより溶出され た画分は、ATIIIを同定するためのCoomassie Blue染色による標準的なSDS-PAGE 分析を使用してATIIIに矛盾しないタンパク質の単一バンドを示した。追加のタ ンパク質は 2.0Ｍ又は 4.0Ｍ塩化ナトリウム処理によっては全く溶出されなかっ た。実施例11 ：ヘパリン・カップリング反応の時間経過 pport Medium AB 1ビーズを、実施例５における条件(pH5.0，25℃,0.1Ｍ酢酸ナ トリウム・バッファー）に従って５mg／mL又は 150mg／mLのいずれかの負荷投与 量において（Diosynthから入手可能な）ヘパリンと反応させた。ビーズを４日間 表VI中に示したような時間増分にわたりヘパリンと反応せしめ、ビーズをそのカ ップリング反応を停止させるために各々の間隔の終わりに水及び高塩溶液(2.0Ｍ 水性塩化ナトリウム) により濯いだ。得られたヘパリン−誘導体化ビーズをクロ マトグラフィー・カラムに充填し、そしてATIII能力を標的分子として２mg ATI II又は７mg ATIIIのいずれかを使用して実施例７におけるように測定した。 以下の結果を得た： 実施例12：ヒドラジド官能ビーズへのヘパリン・カップリングに対するpHと塩の 効果 ヘパリンを、 100mg／mLのヘパリン負荷及び48時間のカップリング時間を使用 して、水性硫酸ナトリウムの増加モル濃度において及び３つのpHレベルにおいて 実施例４に従って製造したヒドラジド− させた。使用したバッファーは所望のpHに依存し、pH5.07においては 0.1Ｍ酢酸 ナトリウム、pH7.0 においては 0.1Ｍリン酸ナトリウム、そしてpH10.0において は 0.1Ｍ炭酸ナトリウムのカップリング・バッファーであった。 以下の結果を得た： 上記実験は、ヘパリン・カップリング反応が約10のpHにおけるよりも約５又は 約７のpHにおいて高いATIIIを作り出す点においてより効率がよっかたことを立 証する。塩効果はpHと共に変化した。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年７月１３日 【補正内容】 先に記載されたヒドラジド−官能反応性支持体の反応は、バッファー中、ひじ ょうに温和な条件下、例えば周囲条件（例えば25℃）の下でそのヒドラジド基に 共有結合によりヘパリンを結合させるためにヘパリンを用いて行われる。好適な バッファーは、約５〜10のpHレンジを提供し、そして例えば、塩、例えば硫酸ナ トリウムの存在又は非存在中、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び炭酸ナト リウムである。この反応は、比較的速く、そして通常 100時間未満で本質的に完 結する。但し、少量の反応は多くの時間、例えば 144時間にわたり継続する。反 応は所望により加熱により加速されることができる。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体を提供 するために使用されるヘパリンは、反応性のカルボニル基、例えばアルデヒド基 を含む。アルデヒド基を含むヘパリン調製品は商業的に入手可能であり、そして これらのあるものは、さらに処理せずにヒドラジド官能反応性支持体と反応させ るために使用されることができる。あるいは、商業的に入手可能な天然ヘパリン 中のカルボニル基の数は、例えば過ヨウ素酸塩をもちいた、本分野において記載 されているようなヘパリンの簡単な酸化により強化されることができる。商業的 に入手可能なヘパリン調製品のいくつかは、存在するアルデヒド基の数を強化す るために化学的に修飾される。 ヘパリンとヒドラジド官能支持体の反応は、式中Hep がヘパリン残基である以 下の式により表されるヘパリン−官能支持体を作り出す。 これは、あるいは以下の式： ｛式中、Ｒ1とＲ2は先の式（Ｉ）中に記載されたものである。｝に還元されるこ とができる。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー支持体の使用 は、有利には、大きなカラム内でのATIIIの商業的に有用な量の製造のために大 規模に行われる。 本発明に係るヘパリン官能アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムがヒ ト成長因子の精製においても有用であることも発見された。 ヘパリン官能クロマトグラフィー支持体は、標的分子以外の、分子、例えばタ ンパク質により徐々に汚染されることが知られている。このような非標的分子は 、そのヘパリン結合性部位を徐々にブロックする非特異的結合を経験すると言わ れている。本発明に係る支持体は、特定の商業的に入手可能な支持体よりも非特 異的結合を有意に受けにくいことが発見された、すなわち、本発明に係る支持体 は低い非特異的結合をもつ。ヘパリン支持体からの非特異的分子のクリーニング は、通常、有機又は無機塩基を用いて行われる。無機塩基が好ましい。なぜなら 、それらは標的分子から除去することが容易であるからである。本発明に係る支 持体は、無機塩基、例えば水性水酸化ナトリウムにより洗浄するときに驚ろくべ き良好な安定性を立証し、 0.1Ｎ水性水酸化ナトリウムにより洗浄されるときそ れらの結合能力の90％を上廻るものを保持し、そして 1.0Ｎ水性水酸化ナトリウ ムにより洗浄されるとき80％を上廻るものを保持することが発見された。 好ましい態様に従えば、本ヘパリン官能ポリマーは５mg／mLを上廻るアンチト ロンビンIIIに結合する。 以下の実施例を本発明を説明するために使用するがそれは、クレームにおいて 定められるように本発明を限定することを意図されない。 請求の範囲 １．アズラクトン−官能ポリマーとのヒドラジンの反応から形成されたヒドラ ジド反応性基に共有結合された生物学的に活性なヘパリンを含んで成るヘパリン 官能ポリマー。 ２．以下の式： ｛式中、Suが支持体であり、ｎが０又は１であり、Hep がヘパリン残基であり、 そしてＲ1とＲ2が互いに独立して、１〜14炭素原子をもつアルキル基、３〜14炭 素原子をもつシクロアルキル基、５〜12環原子をもつアリール基、６〜26炭素原 子をもつアレニル基並びに０〜３のＳ，Ｎ、及び非ペルオキシドＯ複素原子であ り、又はＲ1とＲ2がそれらが結合される炭素原子と一緒になって、４〜12環原子 を含むカルボサイクリック環を形成することができる。｝により表される、請求 項１に記載のヘパリン官能ポリマー。 ３．支持体に結合されたヘパリンが、１Ｎ水酸化ナトリウムによるその支持体 の洗浄後に80％を上廻るアンチトロンビン−III結合活性を保持する、請求項１ に記載のヘパリン官能ポリマー。 ４．ポリマーが、５mg／mLを上廻るアンチトロンビン−IIIに結合する、請求 項１に記載のヘパリン官能ポリマー。 ５．以下の式： ｛式中、ｎが０又は１であり、そしてＲ1とＲ2が互いに独立して、１〜14炭素原 子をもつアルキル基、３〜14炭素原子をもつシクロアルキル基、５〜12環原子を もつアリール基、６〜26炭素原子をもつアレニル基並びに０〜３のＳ，Ｎ、及び 非ペルオキシドＯ複素原子であり、又はＲ1とＲ2がそれらが結合される炭素原子 と一緒になって、４〜12環原子を含むカルボサイクリック環を形成し、そしてSu が支持体を表す。｝により表される構造を含んで成るヒドラジド官能クロマトグ ラフィー・ポリマー支持体。 ６．以下の式： 又は ｛式中、Suが支持体であり、そしてHep がヘパリン残基である。｝から成る群か ら選ばれる、請求項２に記載のヘパリン官能クロマトグラフィー・ポリマー支持 体。 ７．ヘパリン相互作用性分子とヘパリン官能表面との相互作用を行う方法であ って、１）ヘパリンとの反応によりさらに誘導体化されるヒドラジドを提供する ためにヒドラジンとの反応により誘導体化されるアズラクトン官能ポリマーを含 んで成る表面を提供し、そして２）そのヘパリン相互作用性分子にその表面を晒 す、ことを 含んで成る方法。 ８．ヘパリン相互作用性分子が、アンチトロンビンIII又はヒト成長因子であ る、請求項７に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カリー，ラッセル，エー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133―3427, セント ポール，ポスト オフィス ボッ クス 33427（番地なし) (72)発明者 ウォーカー，マーガレット，エム. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133―3427, セント ポール，ポスト オフィス ボッ クス 33427（番地なし)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．アズラクトン−官能ポリマーとのヒドラジンの反応から形成されたヒドラ ジド反応性基に共有結合された生物学的に活性なヘパリンを含んで成るヘパリン 官能ポリマー。 ２．以下の式： から成る群｛式中、Suが支持体であり、ｎが０又は１であり、Hepがヘパリン残 基であり、そしてＲ1とＲ2が互いに独立して、１〜14炭素原子をもつアルキル基 、３〜14炭素原子をもつシクロアルキル基、５〜12環原子をもつアリール基、６ 〜26炭素原子をもつアレニル基並びに０〜３のＳ，Ｎ、及び非ペルオキシドＯ複 素原子であり、又はＲ1とＲ2がそれらが結合される炭素原子と一緒になって、４ 〜12環原子を含むカルボサイクリック環を形成することができる。｝により表さ れる、請求項１に記載のヘパリン官能ポリマー。 ３．支持体に結合されたヘパリンが、１Ｎ水酸化ナトリウムによるその支持体 の洗浄後に80％を上廻るアンチトロンビン−III結合活性を保持する、請求項１ に記載のヘパリン官能ポリマー。 ４．ポリマーが、約５mg／mLを上廻るアンチトロンビン−IIIに結合する、請 求項１に記載のヘパリン官能ポリマー。 ５．以下の式： ｛式中、ｎが０又は１であり、そしてＲ1とＲ2が互いに独立して、１〜14炭素原 子をもつアルキル基、３〜14炭素原子をもつシクロアルキル基、５〜12環原子を もつアリール基、６〜26炭素原子をもつアレニル基並びに０〜３のＳ，Ｎ、及び 非ペルオキシドＯ複素原子であり、又はＲ1とＲ2がそれらが結合される炭素原子 と一緒になって、４〜12環原子を含むカルボサイクリック環を形成し、そしてSu が支持体を表す。｝により表される構造を含んで成るヒドラジド官能クロマトグ ラフィー支持体。 ６．以下の式： ｛式中、Suが支持体であり、そしてHepがヘパリン残基である。｝から成る群か ら選ばれる、請求項５に記載のヘパリン官能クロマトグラフィー支持体。 ７．ヘパリン相互作用性分子とヘパリン官能表面との相互作用を行う方法であ って、ｉ）ヘパリンとの反応によりさらに誘導体化されるヒドラジドを提供する ためにヒドラジンとの反応により誘導体化されるアズラクトン官能ポリマーを含 んで成る表面を提供し、そしてii）そのヘパリン相互作用性分子にその表面を晒 す、ことを 含んで成る方法。 ８．ヘパリン相互作用性分子が、アンチトロンビンIII又はヒト成長因子であ る、請求項７に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014005284A (ja) * 2005-12-13 2014-01-16 Exthera Medical Corp 血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2094701B1 (es) * 1995-07-12 1997-09-01 Grifols Grupo Sa Procedimiento para la produccion de antitrombina iii
GB2304347A (en) 1995-08-11 1997-03-19 Boeringer Ingelheim Vetmedica Antigenic preparations
US6562781B1 (en) * 1995-11-30 2003-05-13 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US7045585B2 (en) 1995-11-30 2006-05-16 Hamilton Civic Hospital Research Development Inc. Methods of coating a device using anti-thrombin heparin
US6797743B2 (en) 2000-09-27 2004-09-28 Michigan Biotechnology Institute Antimicrobial polymer
US6509104B2 (en) 2000-12-05 2003-01-21 Michigan Biotechnology Institute Antithrombogenic polymer coating
US6939554B2 (en) 2002-02-05 2005-09-06 Michigan Biotechnology Institute Antimicrobial polymer
TW200307734A (en) 2002-03-20 2003-12-16 Michigan Biotech Inst Conductive polymer-based material
US6951902B2 (en) 2002-08-16 2005-10-04 Michigan Biotechnology Institute Two dimensional polymer that generates nitric oxide
WO2007058592A1 (en) * 2005-11-21 2007-05-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab A method of chromatography using semi-synthetic heparin ligands
WO2008155683A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Firmenich Sa Malodor counteracting compositions and method for their use
CA2967094C (en) 2009-12-01 2022-08-16 Exthera Medical Corporation Method for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides
WO2012112724A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Exthera Medical, Llc Device and method for removal of blood-borne pathogens, toxins and inflammatory cytokines
ES2647577T3 (es) 2012-06-13 2017-12-22 Exthera Medical Corporation Uso de heparina y carbohidratos para tratar el cáncer
MX2015018005A (es) 2013-06-24 2016-04-15 Exthera Medical Corp Sistema de filtracion de sangre que contiene substrato recubierto con manosa.
ES2799398T3 (es) 2013-11-08 2020-12-17 Exthera Medical Corp Métodos para diagnosticar enfermedades infecciosas usando medios de adsorción
JP2017513636A (ja) 2014-04-24 2017-06-01 エクスセラ メディカル コーポレイション 高流量を用いて血液から細菌を除去するための方法
KR20170060062A (ko) 2014-09-22 2017-05-31 엑스테라 메디컬 코퍼레이션 웨어러블 혈액관류 장치
JP2018513217A (ja) * 2015-04-15 2018-05-24 アットウィル メディカル ソルーションズ インコーポレイテッド アンチトロンビン−ヘパリンの組成物および方法
AU2016274868B2 (en) 2015-06-11 2021-02-18 Attwill Medical Solutions Inc. Medical devices, systems, and methods utilizing antithrombin-heparin compositions
US11911551B2 (en) 2016-03-02 2024-02-27 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
EP3422943A4 (en) 2016-03-02 2019-10-16 ExThera Medical Corporation METHOD OF TREATING DRUG ENTRIES
CN109776696A (zh) * 2019-01-15 2019-05-21 湖北亿诺瑞生物制药有限公司 一种高纯度肝素钠的制备工艺

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3519011A1 (de) * 1985-05-25 1986-11-27 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur herstellung eines materials zur affinitaetschromatographie
US4737560A (en) * 1987-03-13 1988-04-12 Minnesota Mining And Manufacturing Company Polymer beads
CA1320718C (en) * 1987-06-08 1993-07-27 Richard Frederick Hammen Chromatographic material
DD276814A1 (de) * 1987-06-29 1990-03-14 Dummerstorf Rostock Tierprod Verfahren zur herstellung einer affinitaetsmatrix fuer die trennung biologischer substanzen
GB9009570D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Biocompatibles Ltd Antithrombogenic polymers
JP2903251B2 (ja) * 1990-06-26 1999-06-07 チッソ株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法
US5344701A (en) * 1992-06-09 1994-09-06 Minnesota Mining And Manufacturing Company Porous supports having azlactone-functional surfaces

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014005284A (ja) * 2005-12-13 2014-01-16 Exthera Medical Corp 血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2168038A1 (en) 1995-02-23
WO1995005400A1 (en) 1995-02-23
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CN1130386A (zh) 1996-09-04

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