JP2903251B2 - アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法 - Google Patents
アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法Info
- Publication number
- JP2903251B2 JP2903251B2 JP2168109A JP16810990A JP2903251B2 JP 2903251 B2 JP2903251 B2 JP 2903251B2 JP 2168109 A JP2168109 A JP 2168109A JP 16810990 A JP16810990 A JP 16810990A JP 2903251 B2 JP2903251 B2 JP 2903251B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carrier
- heparin
- iii
- affinity chromatography
- affinity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液中の有用成分等の分離精製に用いられる
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー用担体およ
びアンチトロンビンIIIの精製方法に関するものであ
る。
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー用担体およ
びアンチトロンビンIIIの精製方法に関するものであ
る。
［従来の技術］ ヘパリンはＤ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸から
なる多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよび０−硫酸置換
体であり、生体の肺や小腸に多く存在し、血液凝固阻止
作用、脂血清澄作用を持つ。このため血栓、栓塞症の治
療薬として使用されている。
なる多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよび０−硫酸置換
体であり、生体の肺や小腸に多く存在し、血液凝固阻止
作用、脂血清澄作用を持つ。このため血栓、栓塞症の治
療薬として使用されている。
また、アンチトロンビンIII（以下AT III）は血しょ
う中に存在する分子量65,000の糖タンパク質であり、血
液の凝固阻害作用を有し、さらにこの阻害活性は、ヘパ
リンの存在下において顕著に増大される。この活性のた
めATR IIIは、血液凝固系に異常を持つ患者の治療薬と
して用いられている。
う中に存在する分子量65,000の糖タンパク質であり、血
液の凝固阻害作用を有し、さらにこの阻害活性は、ヘパ
リンの存在下において顕著に増大される。この活性のた
めATR IIIは、血液凝固系に異常を持つ患者の治療薬と
して用いられている。
ヘパリンがAT IIIの活性を増大する理由は、いまだ完
全に解明されてはいないが、ヘパリンのAT IIIへの親和
性が必須であることは明らかである。
全に解明されてはいないが、ヘパリンのAT IIIへの親和
性が必須であることは明らかである。
この親和性（アフィニティー）を利用して、血しょう
中よりAT IIIを精製する方法が、ヘパリンを担体に固定
化して使用するアフィニティークロマトグラフィーであ
り、AT III精製の有効な方法として、また、血液凝固因
子の精製方法として用いられている。AT III精製に使用
した例としては、例えばアンダーソンらの米国特許3,84
2,061号がある。
中よりAT IIIを精製する方法が、ヘパリンを担体に固定
化して使用するアフィニティークロマトグラフィーであ
り、AT III精製の有効な方法として、また、血液凝固因
子の精製方法として用いられている。AT III精製に使用
した例としては、例えばアンダーソンらの米国特許3,84
2,061号がある。
しかしながら、ヘパリンアフィニティークロマトグラ
フィーは有用な分離精製法ではあるが、吸着する物質が
複数ある群特異性のアフィニティークロマトグラフィー
に属する。このため混合溶液からの精製において、目的
成分以外の物質も吸着してしまい、このクロマトグラフ
ィーのみで目的成分を高純度に精製することはできなか
った。
フィーは有用な分離精製法ではあるが、吸着する物質が
複数ある群特異性のアフィニティークロマトグラフィー
に属する。このため混合溶液からの精製において、目的
成分以外の物質も吸着してしまい、このクロマトグラフ
ィーのみで目的成分を高純度に精製することはできなか
った。
したがって、不純物を除去するために目的物質の溶出
の前に様々な洗浄工程を含めたり、さらに精製工程を追
加するなどの対策が取られているが、いずれの場合も目
的物質の回収率の低下、設備の増加等の問題を含んでい
る。
の前に様々な洗浄工程を含めたり、さらに精製工程を追
加するなどの対策が取られているが、いずれの場合も目
的物質の回収率の低下、設備の増加等の問題を含んでい
る。
［発明が解決しようとする課題］ ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーが持つこ
れらの問題を解決するために、ヘパリンを結合させる担
体と該担体とヘパリンとの結合条件について鋭意研究を
重ねた結果、該担体のアミノ基量および該担体に対する
ヘパリンの固定化時のpHがAT IIIの精製度、回収率に著
しく影響することを見いだし、この知見に基づいて本発
明を完成した。
れらの問題を解決するために、ヘパリンを結合させる担
体と該担体とヘパリンとの結合条件について鋭意研究を
重ねた結果、該担体のアミノ基量および該担体に対する
ヘパリンの固定化時のpHがAT IIIの精製度、回収率に著
しく影響することを見いだし、この知見に基づいて本発
明を完成した。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、以下（１）〜（４）の構成を有する。
（１）アミノ基を有する不溶性多孔質担体に結合させる
ときのpHが８以上10以下でヘパリンを結合してなるアフ
ィニティークロマトグラフィー用担体。
ときのpHが８以上10以下でヘパリンを結合してなるアフ
ィニティークロマトグラフィー用担体。
（２）アミノ基を有する不溶性多孔質担体のアミノ基量
が乾燥重量当たり300以上1,500μモル以下である前記第
（１）項に記載の担体。
が乾燥重量当たり300以上1,500μモル以下である前記第
（１）項に記載の担体。
（３）不溶性多孔質担体が糖骨格を有する前記第（１）
〜（３）項に記載の担体。
〜（３）項に記載の担体。
（４）前記第（１）〜（３）項に記載の担体を使用する
ことを特徴とするアンチトロンピンIIIの精製方法。
ことを特徴とするアンチトロンピンIIIの精製方法。
本発明はAT IIIに対し選択性の高いアフィニティー担
体、およびこの担体を用いることを特徴とするAT IIIの
精製方法よりなる。
体、およびこの担体を用いることを特徴とするAT IIIの
精製方法よりなる。
以下本発明のアフィニティー担体について詳細に説明
する。
する。
担体にアミノ基を導入する方法は、特に限定されない
が例えば次の〜のような方法がある。
が例えば次の〜のような方法がある。
臭化シアンを用いる方法、すなわち、担体上の水酸基
をシアン酸エステルまたはイミドカルボネートに置換
し、これにアンモニアを付加する方法、 エピハロヒドリンを用いる方法、すなわち、担体の水
酸基をアルカリ置換し、ここにエピハロヒドリンのハロ
ゲンと脱塩させることでエポキシ基を導入後、アンモニ
アを付加してアミノ化する方法（詳細は有機合成化学、
第38巻128〜138ページ（1980年））、 アミノ化エチレンオキサイドを用いる方法、すなわち の構造を持つアミノエチレンオキサイドを無水条件下三
フッ化ホウ素等の触媒を用いて直接アミノ化する方法、 エピハロヒドリンを三フッ化ホウ素等の触媒で水酸基
に付加した後アンモニアと反応する方法である。
をシアン酸エステルまたはイミドカルボネートに置換
し、これにアンモニアを付加する方法、 エピハロヒドリンを用いる方法、すなわち、担体の水
酸基をアルカリ置換し、ここにエピハロヒドリンのハロ
ゲンと脱塩させることでエポキシ基を導入後、アンモニ
アを付加してアミノ化する方法（詳細は有機合成化学、
第38巻128〜138ページ（1980年））、 アミノ化エチレンオキサイドを用いる方法、すなわち の構造を持つアミノエチレンオキサイドを無水条件下三
フッ化ホウ素等の触媒を用いて直接アミノ化する方法、 エピハロヒドリンを三フッ化ホウ素等の触媒で水酸基
に付加した後アンモニアと反応する方法である。
以上の様な方法でアミノ化された担体はアミノ基導入
量により、その後調整されるヘパリンアフィニティーの
性能に大きく影響を与える。具体的にはアミノ基の導入
量が担体の乾燥重量1gあたり300〜1,500μモルである担
体（以下高度アミノ化担体）にヘパリンを結合させた場
合と、該導入量が300未満のアミノ基を持つ担体に対し
ヘパリンを結合させた場合とでは、AT IIIの精製効率に
大きな差が生じる。
量により、その後調整されるヘパリンアフィニティーの
性能に大きく影響を与える。具体的にはアミノ基の導入
量が担体の乾燥重量1gあたり300〜1,500μモルである担
体（以下高度アミノ化担体）にヘパリンを結合させた場
合と、該導入量が300未満のアミノ基を持つ担体に対し
ヘパリンを結合させた場合とでは、AT IIIの精製効率に
大きな差が生じる。
すなわち高度アミノ化担体にヘパリンを固定化したア
フィニティー担体により、血しょう中のAT IIIを精製す
ると従来のヘパリンアフィニティー担体を使用した場合
よりもAT III以外の物質であってヘパリンに親和性のあ
る物質の混入が抑えられ、その結果精製倍率、回収率と
もに高くなるのである。
フィニティー担体により、血しょう中のAT IIIを精製す
ると従来のヘパリンアフィニティー担体を使用した場合
よりもAT III以外の物質であってヘパリンに親和性のあ
る物質の混入が抑えられ、その結果精製倍率、回収率と
もに高くなるのである。
ヘパリンのアミノ化担体への固定化は、アミノ化担体
のアミノ基とヘパリンの還元末端のアルデヒドでシッフ
塩基を形成させ、ついで還元剤を加えシッフ塩基を還元
することにより実施される。
のアミノ基とヘパリンの還元末端のアルデヒドでシッフ
塩基を形成させ、ついで還元剤を加えシッフ塩基を還元
することにより実施される。
具体的にはヘパリンを緩衝液中に溶解させ、ついでこ
の溶液にアミノ化担体を加え一定時間撹拌しシッフ塩基
を形成させたあと、還元剤を添加してさらに一定時間撹
拌してシッフ塩基を還元することによりヘパリンを結合
させる。
の溶液にアミノ化担体を加え一定時間撹拌しシッフ塩基
を形成させたあと、還元剤を添加してさらに一定時間撹
拌してシッフ塩基を還元することによりヘパリンを結合
させる。
本発明において用いるヘパリンは市販品をそのまま使
用でき特に限定はされない。例えばヘパリンナトリウム
（レオ製薬会社（REO PHARMACEUTICAL PRODUCTS）製）
がある。
用でき特に限定はされない。例えばヘパリンナトリウム
（レオ製薬会社（REO PHARMACEUTICAL PRODUCTS）製）
がある。
固定化するヘパリンの量はアミノ化担体の乾燥重量1g
あたり10〜1,000mg好ましくは30〜200mgである。
あたり10〜1,000mg好ましくは30〜200mgである。
ヘパリンを溶解する緩衝液の量は担体の湿重量（緩衝
液に懸濁した担体をブフナーろうとを用いて吸引濾過し
て、余分の水を除去して得られる重量）に対し１〜10
倍、好ましくは２〜３倍である。
液に懸濁した担体をブフナーろうとを用いて吸引濾過し
て、余分の水を除去して得られる重量）に対し１〜10
倍、好ましくは２〜３倍である。
また緩衝液へヘパリンを溶解する濃度は0.1mg/ml以上
飽和濃度までの範囲であればよいが反応性と経済性から
好ましくは５〜500mg/mlである。
飽和濃度までの範囲であればよいが反応性と経済性から
好ましくは５〜500mg/mlである。
還元剤としては水素化ホウ素ナトリウム以下の還元力
を有し水溶性のものであれば特に限定はされない。例え
ばトリメチルアミンボラン、水素化シアノホウ素ナトリ
ウムが使用できる。この還元剤の濃度は使用される緩衝
液量に対し１〜500mg/mlであり、さらに好ましくは５〜
50mg/mlで用いられる。
を有し水溶性のものであれば特に限定はされない。例え
ばトリメチルアミンボラン、水素化シアノホウ素ナトリ
ウムが使用できる。この還元剤の濃度は使用される緩衝
液量に対し１〜500mg/mlであり、さらに好ましくは５〜
50mg/mlで用いられる。
また、本発明の方法ではヘパリン結合時の反応溶液の
pHをアルカリ側に調整して結合させることによってAT I
IIの精製倍率を増加できる。すなわちpH10以上ではヘパ
リンが失活し、pH7以下では精製倍率が低下するのでヘ
パリンを溶解する緩衝液のpHはpH7〜10、好ましくは８
〜9.8である。濃度は10〜500mMの緩衝液であれば特に限
定されない。
pHをアルカリ側に調整して結合させることによってAT I
IIの精製倍率を増加できる。すなわちpH10以上ではヘパ
リンが失活し、pH7以下では精製倍率が低下するのでヘ
パリンを溶解する緩衝液のpHはpH7〜10、好ましくは８
〜9.8である。濃度は10〜500mMの緩衝液であれば特に限
定されない。
ただしヘパリンの還元末端とシッフ塩基を形成する可
能性のある物質、例えばグリシン、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等を含んではならない。
能性のある物質、例えばグリシン、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン等を含んではならない。
使用される緩衝液の種類としては例えばリン酸ナトリ
ウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩
衝液がある。
ウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩
衝液がある。
以上述べた高度アミノ化担体とpHの条件を組み合わせ
れば、すなわちアミノ基の導入量が乾燥重量1gあたり30
0〜1,500μモルである担体にpH8〜9.5でヘパリンを結合
させればさらに精製度よく、回収率よくAT IIIを精製で
きる。
れば、すなわちアミノ基の導入量が乾燥重量1gあたり30
0〜1,500μモルである担体にpH8〜9.5でヘパリンを結合
させればさらに精製度よく、回収率よくAT IIIを精製で
きる。
次に本発明のアフィニティー担体を用いたAT IIIの精
製方法について記載する。AT IIIを精製する方法は通常
行われているクロマトグラフィーの方法に準じて実施さ
れる。
製方法について記載する。AT IIIを精製する方法は通常
行われているクロマトグラフィーの方法に準じて実施さ
れる。
参考例として例えばPurification of antithrombin I
II by affinity chromatography,Thrombin Res.第５
巻、439〜452ページ（1974年）記載の方法がある。すな
わちヘパリン固定化担体をカラムに充填し吸着バッファ
ーを流して平衡化する。
II by affinity chromatography,Thrombin Res.第５
巻、439〜452ページ（1974年）記載の方法がある。すな
わちヘパリン固定化担体をカラムに充填し吸着バッファ
ーを流して平衡化する。
ついでAT III含有溶液（例えば血しょう）を流して吸
着させる。ついで溶出緩衝液を流して吸着成分を溶出さ
せAT III画分を取得し、この画分を脱塩濃縮することに
より精製AT IIIを得ることができる。使用する緩衝液は
特に限定されないが、吸着緩衝液として例えば0.01〜0.
5M食塩を含む0.05〜0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6〜
８、溶出緩衝液としては例えば0.3M食塩を含む0.01Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液が使用できる。
着させる。ついで溶出緩衝液を流して吸着成分を溶出さ
せAT III画分を取得し、この画分を脱塩濃縮することに
より精製AT IIIを得ることができる。使用する緩衝液は
特に限定されないが、吸着緩衝液として例えば0.01〜0.
5M食塩を含む0.05〜0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6〜
８、溶出緩衝液としては例えば0.3M食塩を含む0.01Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液が使用できる。
この溶出を１ステップで行うのでなく、例えば食塩濃
度に０から0.5Mのグラジエンド勾配をかけてフラクショ
ネーションしたり、０から0.5Mの食塩濃度範囲で細かく
調製した各濃度の溶出液を用いてステップワイズ法で溶
出すれば、ヘパリンに対しAT IIIよりも親和性の弱いも
のと高いものが除去されるためにさらに高い純度でAT I
IIを精製できる。
度に０から0.5Mのグラジエンド勾配をかけてフラクショ
ネーションしたり、０から0.5Mの食塩濃度範囲で細かく
調製した各濃度の溶出液を用いてステップワイズ法で溶
出すれば、ヘパリンに対しAT IIIよりも親和性の弱いも
のと高いものが除去されるためにさらに高い純度でAT I
IIを精製できる。
実施例１ セルロファインCPC（チッソ（株）製の球状多孔性セ
ルロース粒子、排除限界分子100万以上、粒子径53−110
μｍ）、250g（湿重量）を2Lセパラブルフラスコにいれ
これに水酸化ナトリウム水溶液10重量％、500mlを加え3
0℃で１時間撹拌した。ついでエピクロルヒドリン200ml
を添加し30℃で２時間撹拌した後、ブフナーろうとで濾
過し蒸留水3Lで洗浄した。
ルロース粒子、排除限界分子100万以上、粒子径53−110
μｍ）、250g（湿重量）を2Lセパラブルフラスコにいれ
これに水酸化ナトリウム水溶液10重量％、500mlを加え3
0℃で１時間撹拌した。ついでエピクロルヒドリン200ml
を添加し30℃で２時間撹拌した後、ブフナーろうとで濾
過し蒸留水3Lで洗浄した。
得られたエポキシ化セルロース粒子を2Lセパラブルフ
ラスコにいれアンモニア水（25重量％）350mlを加えて3
0℃で２時間撹拌した。これを3Lビーカーにいれ蒸留水
約2Lと20分撹拌し再び濾過した。この撹拌、濾過による
洗浄操作を５回繰り返しアミノ化セルロース粒子を得
た。
ラスコにいれアンモニア水（25重量％）350mlを加えて3
0℃で２時間撹拌した。これを3Lビーカーにいれ蒸留水
約2Lと20分撹拌し再び濾過した。この撹拌、濾過による
洗浄操作を５回繰り返しアミノ化セルロース粒子を得
た。
得られた粒子20g（湿重量）を100mlのビーカーにいれ
80℃恒温器中で乾燥後、ケールダール法によりチッソ含
有量を測定した。この結果、乾燥粒子1gあたりのチッソ
含有量は5100μｇであり、アミノ基に換算すると364μ
モルであった。
80℃恒温器中で乾燥後、ケールダール法によりチッソ含
有量を測定した。この結果、乾燥粒子1gあたりのチッソ
含有量は5100μｇであり、アミノ基に換算すると364μ
モルであった。
実施例２ 実施例１において水酸化ナトリウム濃度を2.5重量
％、添加量400mlにかえる以外、実施例１と同様に操作
しアミノ化セルロース粒子を得た。この粒子のチッソ含
有量を測定した結果、乾燥粒子1gあたり2800μｇであ
り、アミノ基に換算すると200μモルであった。
％、添加量400mlにかえる以外、実施例１と同様に操作
しアミノ化セルロース粒子を得た。この粒子のチッソ含
有量を測定した結果、乾燥粒子1gあたり2800μｇであ
り、アミノ基に換算すると200μモルであった。
実施例３ 0.5Lセパラブルフラスコ中でヘパリンナトリウム（レ
オ製薬会社（LEO PHARMACEUTICAL PRODUCTS）製）5gを
0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH9,100mlに溶かした。
実施例２で調整したアミノ化セルロース粒子100g（湿重
量）を加え50℃で24時間反応した。
オ製薬会社（LEO PHARMACEUTICAL PRODUCTS）製）5gを
0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH9,100mlに溶かした。
実施例２で調整したアミノ化セルロース粒子100g（湿重
量）を加え50℃で24時間反応した。
トリメチルアミンボラン（以下TMAB:モートンチオコ
ール（Morton Thiokol,LTD.）製）1gを加え72時間撹拌
後さらにTMAB1gを加えて48時間撹拌した。反応溶液をブ
フナーろうとで濾過し、濾紙上に得られた担体を蒸留水
3Lで洗浄してヘパリン固定化セルロース粒子を得た。
ール（Morton Thiokol,LTD.）製）1gを加え72時間撹拌
後さらにTMAB1gを加えて48時間撹拌した。反応溶液をブ
フナーろうとで濾過し、濾紙上に得られた担体を蒸留水
3Lで洗浄してヘパリン固定化セルロース粒子を得た。
担体に結合したヘパリン量は以下の方法で求めた。す
なわち、ヘパリンセルロース粒子20g（湿重量）を実施
例１と同じ操作で乾燥重量とチッソ含有量を測定した。
なわち、ヘパリンセルロース粒子20g（湿重量）を実施
例１と同じ操作で乾燥重量とチッソ含有量を測定した。
ついで20g（湿重量）を0.01Mリン酸緩衝液、pH7,30ml
に懸濁させ約１時間脱気してから100mlメスシリンダー
に移し、１週間静置し、ヘパリン固定化セルロース粒子
の体積を測定した。
に懸濁させ約１時間脱気してから100mlメスシリンダー
に移し、１週間静置し、ヘパリン固定化セルロース粒子
の体積を測定した。
一方、反応に用いたヘパリン1gあたりの総チッソ量も
ケールダール法で定量し、以下の計算式によりセルロー
ス粒子に対するヘパリン結合量を求めた。
ケールダール法で定量し、以下の計算式によりセルロー
ス粒子に対するヘパリン結合量を求めた。
実施例４ 実施例３においてアミノ化セルロース粒子を実施例１
で得られた物に代え、またリン酸ナトリウム緩衝液のpH
を７に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化
セルロース粒子を得た。
で得られた物に代え、またリン酸ナトリウム緩衝液のpH
を７に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化
セルロース粒子を得た。
実施例５ 実施例３においてアミノ化セルロース粒子を実施例１
で得られた物に代える以外、実施例３と同様にしヘパリ
ン固定化セルロース粒子を得た。
で得られた物に代える以外、実施例３と同様にしヘパリ
ン固定化セルロース粒子を得た。
比較例１ 実施例３においてアミノ代セルロース粒子を実施例２
で得られた物に、またリン酸ナトリウム緩衝液のpHを７
に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化セル
ロース粒子を得た。
で得られた物に、またリン酸ナトリウム緩衝液のpHを７
に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化セル
ロース粒子を得た。
実施例６ 実施例３〜５及び比較例１で得られた各種ヘパリンセ
ルロース担体と市販のヘパリンセファロースCL−6B（フ
ァルマシアLKB（株）製）をそれぞれポリプロピレン製
ミニカラム（φ9mm、生化学（株）製）に1ml充填し0.15
M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液、pH7（以下、吸着緩衝
液）20mlで洗浄した。
ルロース担体と市販のヘパリンセファロースCL−6B（フ
ァルマシアLKB（株）製）をそれぞれポリプロピレン製
ミニカラム（φ9mm、生化学（株）製）に1ml充填し0.15
M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液、pH7（以下、吸着緩衝
液）20mlで洗浄した。
クエン酸塩添加人標準血しょう（サイトロールＩ（Ci
−trol Coagulation Control,Level I）バクスターヘル
スケア（Baxter Healthcare Corporation）社製）2mlを
カラムに添加し流速50ml/hrで流し、さらに吸着緩衝液2
0mlを流して洗浄した。この時の流出液は50mlのメスシ
リンダー（メチルペンテン樹脂製）に回収した。
−trol Coagulation Control,Level I）バクスターヘル
スケア（Baxter Healthcare Corporation）社製）2mlを
カラムに添加し流速50ml/hrで流し、さらに吸着緩衝液2
0mlを流して洗浄した。この時の流出液は50mlのメスシ
リンダー（メチルペンテン樹脂製）に回収した。
次にメスシリンダーを交換し1.5M食塩を含む0.01Mリ
ン酸緩衝液pH7（以下溶出緩衝液）20mlで溶出した。添
加血しょう、洗浄液、溶出液について蒸留水をブランク
にして紫外線吸収（波長280、以下OD280）ならびにAT I
II測定キット（クロモレイトAT IIIセット、（株）ヤト
ロン製）を用いてAT III活性を測定した。
ン酸緩衝液pH7（以下溶出緩衝液）20mlで溶出した。添
加血しょう、洗浄液、溶出液について蒸留水をブランク
にして紫外線吸収（波長280、以下OD280）ならびにAT I
II測定キット（クロモレイトAT IIIセット、（株）ヤト
ロン製）を用いてAT III活性を測定した。
このキットで求められるAT III活性は正常人血しょう
中のAT III活性を100％とした場合の相対活性値であ
る。また、精製倍率は次の計算式で求めた。
中のAT III活性を100％とした場合の相対活性値であ
る。また、精製倍率は次の計算式で求めた。
実施例１〜５、比較例１で得られたヘパリン固定化セ
ルロース粒子の総チッソ量とAT III吸着量の関係を表１
に示す。
ルロース粒子の総チッソ量とAT III吸着量の関係を表１
に示す。
実施例７ 実施例６で得た溶出液を膜型加圧濃縮器ノヴァセル
（NOVACELL,フィルター膜の排除限界分子量8000、FILTR
ON CORPORATION製）で1/40容量まで濃縮した。得られた
サンプルをメルカプトエタノール−ドデシル硫酸ナトリ
ウム溶液（10重量％メルカプトエタノール、５重量％ド
デシル硫酸ナトリウム、2mMエチレンジアミン４酢酸を
含む30mMトリス塩酸緩衝液、pH8）で1:1に希釈し５分間
煮沸した。
（NOVACELL,フィルター膜の排除限界分子量8000、FILTR
ON CORPORATION製）で1/40容量まで濃縮した。得られた
サンプルをメルカプトエタノール−ドデシル硫酸ナトリ
ウム溶液（10重量％メルカプトエタノール、５重量％ド
デシル硫酸ナトリウム、2mMエチレンジアミン４酢酸を
含む30mMトリス塩酸緩衝液、pH8）で1:1に希釈し５分間
煮沸した。
このタンパク組成を電気泳動装置ファストシステム
（Phast System,ファルマシア、LKBバイオテクノロジー
社製、電気泳動ゲル:PhastGel Grandient 8−25）で電
気泳動し、同システムで銀染色した。この結果を第１図
に示した。
（Phast System,ファルマシア、LKBバイオテクノロジー
社製、電気泳動ゲル:PhastGel Grandient 8−25）で電
気泳動し、同システムで銀染色した。この結果を第１図
に示した。
実施例３〜５及び比較例１から得られたヘパリン固定
化セルロース粒子をカラムに充填し、これに人血しょう
を流しヘパリンに親和性のある物質を吸着させ洗浄後溶
出し、得られたタンパク質の電気泳動パターンを第１図
に示す。
化セルロース粒子をカラムに充填し、これに人血しょう
を流しヘパリンに親和性のある物質を吸着させ洗浄後溶
出し、得られたタンパク質の電気泳動パターンを第１図
に示す。
実施例６において実施例５のヘパリン固定化セルロー
スを用いて、次に示す操作を変更する以外同じ操作とし
た。
スを用いて、次に示す操作を変更する以外同じ操作とし
た。
AT III吸着後、吸着緩衝液での洗浄操作を終えてから
さらに0.1M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液、pH7,20mlで
洗浄した。
さらに0.1M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液、pH7,20mlで
洗浄した。
次にメスシリンダーを交換し1M食塩を含む0.01Mリン
酸緩衝液、pH7で溶出した。
酸緩衝液、pH7で溶出した。
実施例１〜5,7及び比較例１で得られたヘパリン固定
化セルロース粒子の総チッソ量とAT III吸着量の関係を
表１にまとめた。
化セルロース粒子の総チッソ量とAT III吸着量の関係を
表１にまとめた。
［発明の効果］ 表１が示すように従来品であるヘパリンセファロース
CL−6B、比較例１［低アミノ化セルロース粒子、反応pH
7］に比較し、反応pHを９にするか（実施例３）または
高アミノ化セルロース粒子（実施例４）を用いることで
AT IIIの精製倍率を改善でき、さらに高アミノ化粒子と
反応pH9を組み合わせることで（実施例５）吸着量、精
製倍率ともに大きく改善できる。これらの改善がAT III
以外でヘパリンに親和性を持つ成分の吸着が抑えられた
ために生じたことが第１図の電気泳動結果からわかる。
CL−6B、比較例１［低アミノ化セルロース粒子、反応pH
7］に比較し、反応pHを９にするか（実施例３）または
高アミノ化セルロース粒子（実施例４）を用いることで
AT IIIの精製倍率を改善でき、さらに高アミノ化粒子と
反応pH9を組み合わせることで（実施例５）吸着量、精
製倍率ともに大きく改善できる。これらの改善がAT III
以外でヘパリンに親和性を持つ成分の吸着が抑えられた
ために生じたことが第１図の電気泳動結果からわかる。
以上述べたように本発明で得られるヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー用担体はAT IIIに対して高い
選択性を有し、この担体を用いてAT IIIを精製する方法
は、AT IIIを高純度かつ高回収率で精製できる優れた方
法である。
ティークロマトグラフィー用担体はAT IIIに対して高い
選択性を有し、この担体を用いてAT IIIを精製する方法
は、AT IIIを高純度かつ高回収率で精製できる優れた方
法である。
第１図は、本発明の実施例、比較例に係る各ヘパリンア
フィニティークロマトグラフィーに吸着した人血しょう
の電気泳動パターンを示す。 図面においてRun No.1〜６と実施例又は比較例No.若し
くはControlとの関係は、下記のとおりである。
フィニティークロマトグラフィーに吸着した人血しょう
の電気泳動パターンを示す。 図面においてRun No.1〜６と実施例又は比較例No.若し
くはControlとの関係は、下記のとおりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｎ Ｒ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/745 - 14/755 C07K 1/16 - 1/22 D01J 20/27 - 20/24 C08B 37/10 G01N 30/48 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】アミノ基を有する不溶性多孔質担体に結合
させるときのpHが８以上10以下でヘパリンを結合してな
るアフィニティークロマトグラフィー用担体。 - 【請求項２】アミノ基を有する不溶性多孔質担体のアミ
ノ基量が乾燥重量当たり300以上1,500μモル以下である
特許請求の範囲第（１）項に記載の担体。 - 【請求項３】不溶性多孔質担体が糖骨格を有する特許請
求の範囲第（１）〜（３）項に記載の担体。 - 【請求項４】特許請求の範囲第（１）〜（３）項に記載
の担体を使用することを特徴とするアンチトロンピンII
Iの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2168109A JP2903251B2 (ja) | 1990-06-26 | 1990-06-26 | アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2168109A JP2903251B2 (ja) | 1990-06-26 | 1990-06-26 | アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0459796A JPH0459796A (ja) | 1992-02-26 |
| JP2903251B2 true JP2903251B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=15862021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2168109A Expired - Fee Related JP2903251B2 (ja) | 1990-06-26 | 1990-06-26 | アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2903251B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995005400A1 (en) * | 1993-08-19 | 1995-02-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Heparin functional affinity supports |
| JP2002369881A (ja) * | 2001-06-14 | 2002-12-24 | Chisso Corp | アミノ化担体、およびそれを用いた細胞性フィブロネクチン−ヘパリン複合体の吸着方法 |
| CN106422415B (zh) * | 2016-09-12 | 2018-08-17 | 福州大学 | 一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱 |
-
1990
- 1990-06-26 JP JP2168109A patent/JP2903251B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0459796A (ja) | 1992-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU867284A3 (ru) | Анионообменный материал дл разделени биологических макромолекул и способ его получени | |
| SU1431691A3 (ru) | Способ получени гликопротеина | |
| Hook et al. | Anticoagulant activity of heparin: separation of high-activity and low-activity heparin species by affinity chromatography on immobilized antithrombin | |
| US5039529A (en) | Novel heparin derivatives | |
| US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
| JPS5839576B2 (ja) | 生物学的巨大分子を可逆的に固定しうる新規物質並びにその製造方法 | |
| US5234991A (en) | Porous mineral support coated with an aminated polysaccharide polymer | |
| SU1523046A3 (ru) | Способ очистки человеческого @ -интерферона | |
| JP3438735B2 (ja) | 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクションｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法 | |
| US4119774A (en) | Heparin purification method | |
| US5849874A (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| JP2903251B2 (ja) | アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン▲ｉｉｉ▼の精製方法 | |
| US3925152A (en) | Virus separation | |
| US5045203A (en) | Separation of protein antigens of Bordetella bacteria by affinity chromatography | |
| CA1232850A (en) | Purification of superoxide dismutase | |
| Mahieu et al. | Carbohydrate and Amino‐Acid Composition of Human Glomerular‐Basement‐Membrane Fractions Purified by Affinity Chromatography | |
| DE3014632C2 (ja) | ||
| US3109774A (en) | Erythropoietic factor preparation | |
| JP2001097997A (ja) | 硫酸化ヒアルロン酸を用いたアフィニティー吸着担体及びその使用 | |
| JP2739232B2 (ja) | 生物学的親和性を有するセルロースゲルの使用方法 | |
| JPH0147997B2 (ja) | ||
| RU1799599C (ru) | Способ получени лектина | |
| JPS6031479B2 (ja) | 純コンドロイチナ−ゼｃの製造法 | |
| JP2882828B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
| SU668348A1 (ru) | Способ выделени -амилазы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080326 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090326 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |