SU1431691A3

SU1431691A3 - Способ получени гликопротеина

Info

Publication number: SU1431691A3
Application number: SU792745898A
Authority: SU
Inventors: Такаку Фумимара; Огаса Кацухиро; Кубояма Морио; Саито Минору; Нисида Масаюки; Фунакоси Сатоси; Янаи Нобуя; Ямада Мунео
Original assignee: Моринага Милк Индастри Ко.,Л.Т.Д. (Фирма); Дзе Грин Кросс Корпорейшн (Фирма)
Priority date: 1978-03-20
Filing date: 1979-03-19
Publication date: 1988-10-15
Also published as: CA1120468A; JPS6030291B2; JPS54140707A; US4275056A; ZA791282B; BE874937A

Description

ы

Изобретение относитс к медицине, а именно к получению гликопротеина.

Целью изобретени вл етс повышение специфичности способа при получении гликопротеина, способного стимулировать образование гранулоцитов человека HGO-гликопротеин за счет обработки мочи методом хроматографии на силикагеле, СМ-сефадексе G-50 ДЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрации на Сефадексе G-150, адсорбции на конка- $алин А Сефароза 4В с последующей (Ьчисткой с помощью зонного электрофореза .

Способ осуществл ют следующим об- разом..

; Свежую мочу, собранную от нормаль- людей, довод т до рН 6-9, пред Аочтительно 7-8, разбавленными раство ами кислоты или растворами щелочи и фатем центрифугируют дл удалени не- |1астворимых примесей, содержащихс в моче. Верхний слой контактирует с Кремнийсодержащим адсорбентом, таким как силикагель, силикагель-силикат магни , диатомитбва земл , кварц или бентонит, и адсорбированные составные Части элюируют щелочным раствором г редпочтительно при рН 9 или выше (щелочный раствор, который использу- и|)Т дл элюации, не вл етс специаль- , это предпочтительно водные раст- йоры гидроокиси аммони , гидроокиси 1|атри и т.п. в концентрации 0,3- i,5 М). Затем довод т рН полученно- :tio элюата до 7-8 раствором кислоты rt добавл ют нейтральную соль, например сульфат аммони , до 70% насьвдени и получают фракцию сырого протеина, содержащего НСЗ-гликопротеин.

Полученизло фракцию сырого протеина раствор ют вновь в мало7й порции Щелочного раствора, освобождают от низкомолекул рных веществ ультрафильтрацией , разбавл ют сол ным буферным раствором и привод т в контакт с катионньм обменником например, карбоксимётилдекстраном,карбоксиметил целлюлозой или фосфоцеллюлозой дл удалени примесей, содержащихс в растворе, в услови х нейтрального рН. Сырую фракцию НСЗ-гликопротеина катионнообменник довод т до рН 6- 8 предпочтительно 0,01-0,15 М сол ными буферными растворами. Больша , часть HGD-гликопротеина проходит через катионный обменник без адсорбции . Концентрированный выход щий про

10

15

0 5 л

-

0

5

дукт уравнивают разбавленным буферным раствором с рН 6-8 и используют в ионно-обменной хроматографии с анионным обменником, например, ДЕАЕ- целлюлозой, который уравнивают таким же буфером, HGJ-гликопротеин адсорбируетс на анионном обменнике. Затем адсорбированный HGj-гликопротеин элюируют методом градиентного линейного концентрационного элюировани с использованием 0,1-0,3 М сол ных растворов , например хлорида натри .

НСЗ-гликопротеин элюируют при концентрации соли от 0,1 М и вьше, но полное отделение затруднено. Отбирают фракции выход щего продукта при концентрации соли 0,1-0,3 М и при необходимости подвергают их обессо- ливанию и концентрационным обработкам . Дл того, чтобы злюировать HGJ-гликопротеин из ионного обмен- ника, можно примен ть последовательное элюирование сол ным раствором 0;1-0,3 М.

Дл целей дальнейшей очистки объединенные фракции, полученные выше, очищают гель-фильтрационной хроматографией- на сильно сшитом полимерном геле, имеющем величину набухани в воде 10-20 мл/г, например Sepha. dex® G-150 или Biogel® Р-100 и активные вещества .извлекают 0,05- 0,1 М сол ным буферным раствором, Фракции относительного объема выход щего продукта 1,11-1,60, предпочтительно 1,11-1,45 отбирают, обессо- ливают и концентрируют или лиофилизу- ют.

Пример 1. Довод т рН 400 л свежей мочи, собранной от нормальных людей, до 8 10%-ным раствором гидроокиси натри и центрифугируют с помощью непрерьшного центрифугировани при 15000 об/мин при 0°С дл удалени нерастворимых примесей. Довод т рН поверхностного сло до 7 10%-ным раствором сол ной кислоты и пропускают через колонку с силикаге- лем (10 X 80 см). Вещества, адсорбированные на колонке, элюируют 40 л 5%-ного раствора аммиака. Довод т.до рН злюированного раствора 7,5 1 н. серной кислотой, добавл ют сульфат аммони до 70%-ного насыщени и отстаивают при О С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, раствор ют в 2 л 5%-ного раствора аммиака, помещают в целлофановые трубки и провод т диа31431691

ЛИЗ на фоне 0,05 М фосфатного буферно- го раствора (рН 6,5). Диализованный раствор довод т до 10 л таким же буферным раствором и пропускают через ионообменную колонку CM-Sephadex .G-50 (40x40 см), котора уравновешена 0,05 М фосфатным буферным раствором СрН 6,5), дл адсорбции примесей на ионно-обменной смоле. 10 л 0 вьшедшего раствора концентрируют с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах DI AFLO (фракционируемый мол. вес приблизительно 10000). Провод т диализ концентриро- увеличению и дифференциации грануло- ванного раствора на фоне 0,1 М трис- цитов, отбирают и диализуют на фоне НС1 буфера (рН 7, 0) при 5°С в тече- дистиллированной воды. Диализованный ние ночи. Диализованный раствор смеши- раствор лиофилизуют (образец 5). вают с 1 л такого же буферного раст- Около 5 мг указанного лиофштизо- вора (полз енный раствор - образец 1) 20 ванного порошка раствор ют в 1 мл Указанный раствор пропускают че- 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

,200 мг полуочищенного НСЗ-гликопр теина раствор ют в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 1,0 М хлористого натри , и пропускают чере колонку со 100 мл конкавалина A-Sep- harose-4B, котора уравновешена таким же буфером. После тщательного промьшани колонки этим-буфером НСЗ-гликопротеин элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 50 мл ot -метил-В-глюкозида и 1,0 М хлористого натри . Фракции которые способны к эффективному быстрому

рез колонку с целлюлозой ДЕЛЕ (4,Ох X 40 см), котора уравновегаена 0,1 М трис-НС1 буфером (рН 7,0) и промывают колонку достаточным объемом 0,1 М трис-НС буфера (рН 7,0). На наполненной колонке выполн ют последовательное элюирование 0,1 М трис- НС буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,3 М хлористого натри (о-бразец 2).

Диалиэованный раствор снова пропускают через колонку с целлюлозой ДЕЛЕ (4,0x40 см), котора уравнове- шена 0,1 М трис-НС1 буфером (рН 7,0), и на наполненной колонке выполн ют элюирование с линейным концентрационным градиентом хлористым натрием (0-0,3 М). Активные фракции отбирают и добавл ют с-ульфат аммони до 70% насьщ5ени . Осадки отдел ют центрифугированием , раствор ют в малом объеме 0,1 М трис-НС буфера (рН 7,0) и .диализуют на фоне этого же буферного раствора (диализованный раствор - образец 3).

20 мл диализованного раствора чис т т на колонке с Sephadex G-150 (4,Ох X 60 см), котора уравновешена 0,1 М трис-НС буфером (рН 7,0) и отбирают полученные выходные фракции при отношени х 1,11-1,45. Объединенные фракции тщательно диализуют на фоне дистиллированной воды при 5 С и диализованный раст вор лиофилизуют с получением 500 мг порошка (этот полуочищенньш НСЗ-гли- копротеин - образец 4).

25

30

35

40

45

50

5

содержащего 10% глицерина. Провод т электрофорез полученного раствора при мА в услови х охлаждени с помощью iпрепаративной электрофоретической аппаратуры, примен ющей 8%-ньА акрил- амидный гель (рН 8,9, 20 х 25 мм). Фракцию с относительной подвижностью 6,46 извлекают 0,025 М трис-глициног вым буфером (рН 8,3) и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют с получением около 10 мг НСЗ-гликопротеина (образец 6).

Пример.2. К 100 мг порошка .НСЗ-гликопротеина (образец 6), полу- ; ченног о таким же путем, к-ак в пример 1, добавл ют 00 мл водного раствора , содержащего 5% альбумина сыворот ки крови человека и 1% глицина. Полу- ченный раствор стерилизуют с помощью ; фильтраци онной системы, снабженной ,мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм. По мл стерилизованного раствора асептически внос т в пузырь ки, которые стерилизуют нагреванием при в течение 2 ч После лио- филизации пузырьки герметично закры- ;вают. Таким образом, приготовили 95 пузырьков терапевтического агента дл лейкопении, причем каждый пузырек содержал мг НСЗ-гликопротеина .V

П р и М е р 3. Таким же способом, как в примере 1, л концентрированного раствора, содержащего HGD-глико протеин, аналогичного образцу 1, го- тов т из 000 л свежей мочи, собранной от нормальных людей. К этому

увеличению и дифференциации грануло- цитов, отбирают и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют (образец 5). Около 5 мг указанного лиофштизо- ванного порошка раствор ют в 1 мл 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

0 увеличению и дифференциации грануло- цитов, отбирают и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный - раствор лиофилизуют (образец 5). Около 5 мг указанного лиофштизо- 20 ванного порошка раствор ют в 1 мл 0,125 М трис-глицин буфера (рН 6,8),

25

30

35

40

45

50

5

Пример.2. К 100 мг порошка .НСЗ-гликопротеина (образец 6), полу- ; ченног о таким же путем, к-ак в примере 1, добавл ют 00 мл водного раствора , содержащего 5% альбумина сыворотки крови человека и 1% глицина. Полу- ченный раствор стерилизуют с помощью ; фильтраци онной системы, снабженной ,мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм. По мл стерилизованного раствора асептически внос т в пузырьки , которые стерилизуют нагреванием при в течение 2 ч После лио- филизации пузырьки герметично закры- ;вают. Таким образом, приготовили 95 пузырьков терапевтического агента дл лейкопении, причем каждый пузырек содержал мг НСЗ-гликопротеина .V

концентрированному раствору добавл ют 10 л 0,1 М трис-НС буфера рН7,0| После тщательного перемешивани разбавленный раствор вновь концентрируют до 0,1 первоначального объема с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах DIAFLO®. К концентрированному раствору добавл ют 5 л 0,1 М трис-НС буфера (рН .7,0) и 5 л суспензии целлюлозы ДЕАЕ, со- 4ержащей 300 г сухой основной целлю - ДЕАЕ, котора уравновешена 4,1 М трис-HCl буфером (рН 7,0). Смесь перемешивают в течение 30 мин, йтетаивают в течейие 10 мин и Ьтфильт- 1 овьгоают под вакуумо на воронке Бюхч rtepa, отдел целлюлозу ДЕАЕ, Отоб- Данную целлюлозу ДЕАЕ промьшают С|,1 М трис-НС буфером (рН 7,0) и 4новь отдел ют фильтрацией таким же Способом, как указано выше. Далее Целлюлозу ДЕАЕ промывают 10 л 0,1 М Трис-НС1 буфером (рН 7 , Q) f содержазано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раст- |вор обессоливают ультрафильтрацией н полых волокнах DIAFLO, Обессоленный рдствор лиофилизуют, отбира 15 г порошка. Порошок раствор ют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке Sephadex G-150 (6,0x80 см),

Q которую уравновешивают 0,1 М трис- НС буфером (рН 7,0). Отбирают фрак ции, которые соответствуют отношению 1,. Провод т тщательный диализ объединенных фракций на фоне

,г дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью концентрационной аппара туры на полых волокнах DIAFLO (тип ДС-2) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 г

20 сырого НСЗ-гликопротеина. Концентрированный раствор смешивают с 1 г гли цина и 5 г альбумина сьгооротки. Полу ченный раствор стерилизуют фильтраци ей таким же способом, как в примере

щим 0,05 М хлористого натри , и вновь 25 1. и- асептически заполн ют порци ми

по 2,5 мл пузырьки. После

отбирают таким же способом, как укапано выше. Обработанную целлюлозу ДЕАЕ добавл ют к 10 л 0,1 М трис-HCl. буфера (рН 7,0), содержащего 0,3 М Хлористого натри , и перемешивают, чтобы освободить HGD-гликопротеин От целлюлозы ДЕАЕ. Смесь отфильтро- Вьшают таким же способом, как. ука30

асептичес кой лиофилизации пузырьки герметично закрьшают. Таким образом, получено 40 пузырьков терапевтического агента дл лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг НСЗ-глико- протеина.

зано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раст- |вор обессоливают ультрафильтрацией на полых волокнах DIAFLO, Обессоленный рдствор лиофилизуют, отбира 15 г порошка. Порошок раствор ют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке Sephadex G-150 (6,0x80 см),

Q которую уравновешивают 0,1 М трис- НС буфером (рН 7,0). Отбирают фракции , которые соответствуют отношению 1,. Провод т тщательный диализ объединенных фракций на фоне

г дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью концентрационной аппара туры на полых волокнах DIAFLO (тип ДС-2) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 г

0 сырого НСЗ-гликопротеина. Концентрированный раствор смешивают с 1 г глицина и 5 г альбумина сьгооротки. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией таким же способом, как в примере

по 2,5 мл пузырьки. После

асептической лиофилизации пузырьки герметично закрьшают. Таким образом, получено 40 пузырьков терапевтического агента дл лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг НСЗ-глико- протеина.

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА путем удаления нерастворимых веществ из мочи человека, обработки ее хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, с последующей очисткой гель-фильтрацией на Сефадексе G-150, отличающийся тем,что, с целью повышения специфичности способа при получении гликопротеина, способного :стимулировать образование гранулоцитов человека, пробу мочи предваритель но подвергают хроматографии на силикагеле при элюировании 5%-ным раствором аммиака, элюат нейтрализуют раствором серной кислоты, а затем насыщают до 70% сульфатом аммония, полученный при этом осадок растворяют в воде, затем пропускают через колонку с СМ-Сефадексом G-50, полученный элюат подвергают хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе при элюировании 0,1 М трис-HCl буферным раствором pH 7,0, содержащим 0,3 М NaCl, полученный после этой процедуры элюат вновь подвергают хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе при элюировании в градиенте концентрации раствора хлористого натрия от 0,001 до 0,3 М, элюат подвергают высаливанию сульфатом аммония, полученный осадок растворяют в воде, раствор подвергают гель-фильтрации на Сефадексе G-150 и .адсорбции на конкавалин А Сефароза 4 В с последующим элюированием 50 м раствором об-метил-D-глюкозида, элюат подвергают очистке с помощью препаративного зонного электрофореза, а· целевой продукт получают элюированием 0,025 М трис-0,192 глициновым раствором.

а

SU<.„ 1431691 а