JPH08510651A - MTS gene, mutations therein, and method of diagnosing cancer using MTS gene sequence - Google Patents

MTS gene, mutations therein, and method of diagnosing cancer using MTS gene sequence

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JPH08510651A
JPH08510651A JP7524717A JP52471795A JPH08510651A JP H08510651 A JPH08510651 A JP H08510651A JP 7524717 A JP7524717 A JP 7524717A JP 52471795 A JP52471795 A JP 52471795A JP H08510651 A JPH08510651 A JP H08510651A
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カン，アレクサンダー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppressor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒトの癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニングに関する。   (57) [Summary] The present invention relates to somatic mutations in the Multiple Tumor Suppressor (MTS) gene in human cancer and its use in the diagnosis and prognosis of human cancer. The invention further provides germline mutations in the MTS gene, and melanoma, melanoma of the eye, leukemia, astrocytoma, glioblastoma, lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, myoma, Its use in the diagnosis of predisposition to cancer such as cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL and cancer of the pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid, ovary, uterus, testis, kidney, stomach, colon and rectum Regarding The invention also relates to the treatment of human cancers with mutations in the MTS gene, including gene therapy, protein replacement therapy and protein mimetics. Finally, the present invention relates to the screening of drugs for use in treating cancer.

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＴＳ遺伝子、それにおける変異、およびＭＴＳ遺伝子配列を用いる癌の診断方 法関連出願の相互参照 本発明は、１９９４年６月１日出願の第０８／２５１,９３８号、１９９４年 ３月１８日出願の第０８／２１５,０８８号および１９９４年３月１８日出願の 第０８／２１４,５８１号の一部継続出願であり、それらすべてを参照により本 明細書に取り入れる。出願第０８／２５１,９３８号は、１９９４年３月１８日 出願の第０８／２１４,５８２号の一部継続出願である１９９４年４月１４日出 願の第０８／２２７,３６９号の一部継続出願であり、それらすべてを参照によ り本明細書に取り入れる。発明の背景 本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後 におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の 変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫 、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、 胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺 、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい 素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療 法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒト の癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニン グに関する。 本発明の背景、そして特に実施のためのさらなる詳細を提供する場合について 説明するために本明細書に用いる刊行物および他の材料は、参照により本明細書 に取り入れられ、適宜以下の文章において参照され、それらは添付した文献のリ ストにそれぞれ記載されている。 癌の遺伝学は複雑で、形質転換状態に対する多くの優性かつ正のレギュレータ ー（腫瘍遺伝子）ならびに多くの劣性かつ負のレギュレーター（腫瘍抑制遺伝子 ）を包含する。１００種以上の腫瘍遺伝子が特徴づけられている。１２種よりも 少ない腫瘍抑制遺伝子が同定されているが、その数は５０を越えると期待される （クヌドソン（Knudson）,１９９３年）。 非常に多くの遺伝子の関与が、正常組織の完全性を維持するために細胞中で機 能する増殖調節機構を複雑なものにしている。この複雑さは別の方法で明らかに されている。今までのところ、すべて、あるいは大部分のヒトの癌の増殖に関与 することが示されている単一遺伝子はない。大部分の共通した腫瘍原性変異はＨ −ｒａｓ遺伝子において存在し、すべての固形癌の１０〜１５％において見られ る（アンダーソン（Anderson）ら,１９９２年）。最も頻繁に変異される腫瘍抑 制遺伝子はｐ５３遺伝子であり、すべての腫瘍の約５０％において変異されてい る。すべての形質転換細胞に共通する標的がなければ、正常組織に損傷を与えず にガン細胞を破壊し、あるいは元に戻すことのできる「魔弾」の夢はかなわない 。新世代の特異的に標的とされる抗腫瘍剤に対する希望は、細胞分裂の調節に一 般的役割を果たす腫瘍抑制遺伝子または腫瘍遺伝子を同定しうる余地を与える可 能性がある。 クローニングされ特徴づけられた腫瘍抑制遺伝子は、１）網膜芽腫（ＲＢ１） ；２）ウィルムス（Wilm's）腫瘍（ＷＴ１）：３）リー−フラウメニ（Li-Fraum eni）（ＴＰ５３）；４）家族性腺腫様ポリープ症（ＡＰＣ５）；５）１型神経 線維腫症（ＮＦ１）；６）２型神経線維腫症（ＮＦ２）；７）フォン・ヒッペル ーリンダウ（von Hippel-Lindau）症候群（ＶＨＬ）；および８）２Ａ型多発性 内分泌腫瘍形成（ＭＥＮ２Ａ）に対する感受性に影響する。 遺伝学的にマッピングされているが、未だ単離されていない腫瘍サプレッサー 遺伝子座は、１型多発性内分泌腫瘍形成（ＭＥＮ１）；リンチ（Lynch）癌家族 症候群２（ＬＣＦＳ２）；家族性乳癌（ＢＲＣＡ１）；神経芽腫（ＮＢ）；基底 細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）；ベックウィズ−ウィーデマン（Beckwith-Wiedema nn）症候群（ＢＷＳ）；腎臓細胞癌（ＲＣＣ）；結節状硬化症１（ＴＳＣ１）； および結節状硬化症２（ＴＳＣ２）に関する遺伝子を包含している。現在に至る まで特徴づけられている腫瘍抑制遺伝子は、ＤＮＡ結合蛋白（ＷＴ１）、補助的 な転写レギュレーター（ＲＢ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化蛋白またはＧＡＰｓ（Ｎ Ｆ１）、細胞骨格成分（ＮＦ２）、膜結合受容体キナーゼ（ＭＥＮ２Ａ）をはじ めとする種々の蛋白タイプに対する類似性を有する産物、および既知蛋白とは明 らかな類似性のない他の産物（ＡＰＣおよびＶＨＬ）をコードしている。 多くの場合、本来遺伝学的研究により同定された腫瘍抑制遺伝子は、消失また は変異されるいくつかの散在性の癌において示されている。この結果は、染色体 の変状は、癌になりやすい遺伝的素因および散在性の癌の両方に関連する重要な 腫瘍抑制遺伝子の位置を示しうることを示唆する。今までのところ特徴づけられ ているいくつかの腫瘍抑制遺伝子であることの証明の１つは、ある種の癌タイプ において、それらが高頻度で欠失されるということである。欠失は、しばしば、 単一の対立遺伝子の損失、いわゆるヘテロ接合度の損失（ＬＯＨ）を包含するが 、両方の対立遺伝子のヘテロ接合性の欠失をも包含しうる。ＬＯＨに関しては、 先在する遺伝的変異または二次的な散在性変異のいずれかにより、残りの対立遺 伝子は機能的でないと推察される。 メラノーマは、多数のアメリカ人を苦しめている癌である（アメリカン・キャ ンサー・ソサエティー（American Cancer Society）,１９９２年）。紫外線への 曝露のごとき環境の影響は、メラノーマ発生に大きな役割を果たしているが、遺 伝も関連因子である。家族性メラノーマ、ＭＬＭに関する遺伝子が染色体９ｐ２ １にマッピングされた（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら,１９９ ２年；ナンカロウ（Nancarrow）ら,１９９３年；グルイス（Gruis）ら,１９９３ 年；ゴールドステイン（Goldstein）ら,１９９４年）。ＭＬＭ遺伝子座における 単一の素因となる対立遺伝子を有することは、個体がメラノーマを発生させる可 能性を約５０倍まで増大させる。メラノーマになりやすい素因は、優性メンデル 則として遺伝するが、ＭＬＭにおける素因を作る変異は、元々クヌドソン（Knud son）（１９７１年）により提案された様式で体細胞の劣勢対立遺伝子として作 用すると考えられる。１個の野生型および１個の変異したＭＬＭ対立遺伝子を有 する素因のある個体においては、細胞分裂は、ＭＬＭの野生型コピーの損失また は不活性化を包含する二次的変異を受け、そのことによって、遺伝された変異対 立遺伝子は無防備となる。逆に、該遺伝子の単一の野生型コピーは悪性の発生を 妨げる。 ９ｐ２１におけるＭＬＭ付近の染色体の変状は、神経膠細胞系、小型でない細 胞肺系（non-small cell lung lines）および急性リンパ芽球白血病系をはじめ とするいくつかの異なる腫瘍タイプにおいて非常によく特徴づけられている（オ ロペイド（Olopade）ら,１９９２年；オロペイド（Olopade）ら,１９９３年；ル ケイス（Lukeis）ら,１９９０年；ディアス（Diaz）ら,１９８８年；ミドルトン （Middleton）ら,１９９１年；ファウンテイン（Fountain）ら,１９９２年；チ ェン（Cheng）ら,１９９３年；ジェイムズ（James）ら,１９９３年）。かくして 、非メラノーマ腫瘍細胞における９ｐ２１染色体異常の頻度に基づけば、ＭＬＭ 領域が少なくともいくつかの異なる腫瘍タイプの発達に関与している遺伝子（遺 伝子群）を有する可能性がある。これらの事柄はＬＯＨならびに高頻度のホモ接 合性欠失に関連している。 組織中の細胞は、その生活において、３つの選択肢のみを有する−−それらは 分裂し増殖することができるか、増殖せずに静止するか、あるいはアポトーシス により死滅するかである。腫瘍は、不適切な増殖および分裂または死ぬべき場合 に死なない細胞のいずれかにより生じうる。腫瘍の増殖をコントロールする機構 の１つは、細胞周期に対する直接の調節を必要とするであろう。例えば、ＤＮＡ 複製の決定をコントロールする遺伝子は、それらがプロセスにおいて刺激的役割 を果たしているか、あるいは阻害的役割を果たしているかに依存するが、腫瘍遺 伝子または腫瘍抑制遺伝子に関する魅力的な候補である。細胞周期（Ｇ1、Ｓ、 Ｇ2およびＭ期）による真核細胞の発達は、一連のサイクリン／サイクリン−依 存性キナーゼ（Ｃｄｋ）複合体の形成、活性化およびその後の不活性化により支 配されている。サイクリンＤ'ｓ／Ｃｄｋ２、４、５、サイクリンＥ／Ｃｄｋ２ 、サイクリンＡ／Ｃｄｋ２およびサイクリンＢ／Ａ／Ｃｄｋ２はこのプロセスに 必要であること示されている。サイクリンＤ'ｓおよびＣｄｋ２、Ｃｄｋ４なら びにＣｄｋ５は、Ｇ1からＳへの遷移に関連していた；すなわち、細胞が増殖し ＤＮＡ複製を開始するかどうかを決定する場合に関連していた。さらなる細胞周 期調節エレメントが最近発見された。これらのエレメントはＣｄｋの阻害物質（ Ｃｄｋ阻害物質,ＣｋＩ）であり、Ｆａｒ１、ｐ２１、ｐ４０、ｐ２０およびｐ １６を包含する（マークス（Marx）,１９９４年；ナスマイス（Nasmyth）および フント（Hunt）,１９９３年）。 最近になって、いくつかの腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子は、細胞周期に直 接関与していることがわかった。例えば、サイクリン（ＤＮＡ複製を促進する蛋 白）の１つは腫瘍遺伝子として関与し（モトクラ（Motokura）ら,１９９１年； ラミー（Lammie）ら,１９９１年；ウィザーズ（Withers）ら,１９９１年；ロー ゼンバーグ（Rosenberg）ら,１９９１年）、腫瘍サプレッサーＲｂは第１のサイ クリン結合パートナーであるＣｄｋと相互作用する（エウェン（Ewen）ら,１９ ９３年）。メラノーマ感受性遺伝子座の同定は、例えば、日光への曝露による増 加した癌の危険性を評価するための、個体の遺伝学的スクリーニングへの途を開 くであろう。さらにＭＴＳは、他の多数の癌（白血病、星状膠細胞腫、グリア芽 腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫 、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状 腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌をはじめとする癌であ るが、これらに限定しない）の部位に対する素因を作りうる。さらに、ＭＴＳは いくつかの異なる腫瘍タイプの発達に影響するため、癌患者における予後の決定 に有用である。よって、ＭＴＳは、メラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状 膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエロ ーマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、 前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌に かかりやすい素因を予測する非常に重要な診断試験の開発の基礎として役立つ可 能性があ る。そのうえ、ＭＴＳは多数の腫瘍タイプの発達に関連しているため、ＭＴＳは 、その腫瘍増殖を抑制する能力による一般的な抗癌治療のための、直接的あるい は間接的手段を提供しうる。例えば、腫瘍細胞が正常なＭＴＳ機能を回復するこ とは、細胞を悪性でない細胞に変える可能性がある。発明の概要 本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multip1e Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後 におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の 変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫 、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、 胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺 、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい 素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療 法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒト の癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニン グに関する。図面の簡単な説明 図１Ａは血族３１３７を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロ タイプを有している。感受性のあるハプロタイプを有する個体における他の癌も 示す。凡例は以下のごとし：黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く 塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを 示す；「＊」は個体が感受性のあるハプロタイプを有するかどうかが不明である ことを示す；「＊＊」は個体が感受性のあるハプロタイプを有することを示す； 「３５」は、病気になった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。 図１Ｂは血族３１６１を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロ タイプを有している。他の癌はハプロタイプではない。凡例は以下のごとし：黒 丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗っ た四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを示す；「＝」は血族図の他の場 所に現れることを示す；五角形中の「３」は多重婚を示す；「３５」は、病気に なった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。 図１Ｃは血族３３５５を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロ タイプを有している。他の癌はハプロタイプではない。凡例は以下のごとし：黒 丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗っ た四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを示す；「３５」は、病気になっ た場合、試験または診断を受けた年齢を示す。 図１Ｄは血族１７７１を示し、メラノーマおよび他の癌の発生を示す。変異は 、この血族におけるＭＴＳにおいて同定された。凡例は以下のごとし：「＊」は 確認された変異を有する者である；黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部 を黒く塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す（この血族における 結腸癌）；「／」は死去したことを示す；「３５」は、病気になった場合、試験 または診断を受けた年齢を示す。 図２は、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１により仕切られた領域におけるＹＡ ＣおよびＰ１クローンを示す。セントロメアは右にある。Ｐ１クローンに関して は、矢印はベクター中のＴ７プロモーターの方向を示す。一緒に群分けされたＹ ＡＣは、領域中でのＳＴＳマッピングに基づき、同様であるクローンを示す。こ れらのＹＡＣはおそらく同一でなない。ＹＡＣ（Ａ５、Ｂ１１、Ｃ６およびＦ９ ）はＩＦＮ−１およびＩＦＮ−ｓを含んでいる。ＹＡＣ（Ｄ１、Ｆ５およびＥ３ ）はＤ９Ｓ１２６およびＤ９Ｓ１７１を含んでいる。Ｄ９Ｓ１７１を含む近位の ＹＡＣ末端も、ＩＦＮＡ−ｓを含む遠位のＹＡＣ末端も、示されていない。距離 は必ずしもスケール通りに描いたものではない。ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７ １の内部にあるマーカーを図２に示す。「ｃ」で始まるマーカーはコスミド末端 配列由来である。コスミドは示されていない。ｃ１.ｂとｃ５.３との間の距離お よび７６０−ＬとＤ９Ｓ１７１との間の距離は不明である。 図３は、メラノーマ細胞系において観察された欠失のダイヤグラムを示す。欠 失されたマーカーのセットに基づき、欠失を１２クラスに分類する。１１種の細 胞系は図に示したすべてのマーカーを欠失していた。このクラスは示さない。他 の１２種のクラスのそれぞれの代表例の数を細胞系数の欄に示す。クラス１〜１ ０については、欠失部位は欠失したＤＮＡに隣接したマーカーにおける欠落とし て示される。すなわち、欠失に至るシリーズにおける最後の陽性のマーカーであ る。クラス１１および１２については、欠失部位は黒三角により示される。 図４Ａはコスミドｃ５の地図を示す。コスミドおよびＰ１と同様に、欠失分析 に使用した重要なＳＴＳを示す。ｃ１.ｂマーカーはＰ１−１０６２に近い方に あり、示されていない。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の転写方向を矢印で示す。 図４Ｂはコスミドｃ５の制限酵素地図およびＳＴＳ地図を示す。ＭＴＳ１およ びＭＴＳ２に関するコーディングエキソンの位置を太線で示す。「Ｅ１」および 「Ｅ２」は、それぞれ「コーディングエキソン１」および「コーディングエキソ ン２」を示す。「Ｂ」はＢａｍＨＩ、「Ｓ」はＳａｌＩ、「Ｒ１」はＥｃｏＲＩ 、「Ｒ５」はＥｃｏＲＶを示す。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＭＴＳ１に関する５'非翻訳領域、エキソン１および イントロン１の一部を含むゲノム配列と、ｐ１６に関する公表されている配列（ セラノ（Serrano）ら,１９９３年）との比較を示す。開始コドン（下線）は位置 ８９１にあり、スプライス部位（矢印）は位置１０１６にある。図５Ａ−Ｂに示 すＭＴＳ１配列は配列番号：３である。図５Ｂに示すｐ１６配列は配列番号：２ ４である。 図６Ａおよび６Ｂは、ＭＴＳ１に関するイントロン１の一部、エキソン２およ びイントロン２の一部を含むゲノム配列と、ｐ１６に関する公表されている配列 （セラノ（Serrano）ら,１９９３年）との比較を示す。スプライス部位（矢印） は位置１９２の前かつ位置４９８の後にある。図６Ａ−Ｂに示すＭＴＳ１配列は 配列番号：４である。図６Ａに示すｐ１６配列は、配列番号：４のヌクレオチド １９２〜４９８と同じである。 図７Ａおよび７Ｂは、ＭＴＳ２に関するイントロン１、「エキソン２」および その後の配列を含むゲノムと、公表されたｐ１６配列との比較を示す。「エキソ ン２」配列は、ヌクレオチド２７３〜５８０のＭＴＳ１のエキソン２と同様であ る。ＭＴＳ２におけるスプライス部位、およびｐ１６におけるスプライス部位を 矢印で示す。相違（divergence）が開始する点を°により示す。ＭＴＳ２に関す る終止コドンはエキソン２中位置５３２にあり、「＊」により示す。図７Ａ〜Ｂ に示すＭＴＳ２配列は配列番号：５である。図７Ａに示すｐ１６配列は配列番号 ：４のヌクレオチド１９２〜４９８と同じである。 図８は、エキソン２および周囲の各イントロンを含むＭＴＳ１およびＭＴＳ２ のＤＮＡ配列の比較を示す。ＭＴＳ１に関するイントロン１の３'スプライスジ ャンクションおよびイントロン２の５'スプライスジャンクションを三角により 示す。コーディングエキソン２の３'末端近傍の相違点を矢印により示す。示さ れたＭＴＳ１配列は配列番号：４のヌクレオチド９２〜５４８に対応する。示さ れたＭＴＳ２配列は配列番号：５のヌクレオチド１７４〜６３０に対応する。 図９は種々のＳＴＳの腫瘍細胞系における欠失を示す。正のコントロールおよ び負のコントロールはそれぞれのＰＣＲ実験に使用され、１つのみまたは２つの ＳＴＳが欠失している細胞系（例えば、クラス２１）を、少なくとも２回再試験 した。 図１０Ａ〜Ｃは、ＭＴＳ２ ｍＲＮＡの発現を示す。図１０Ａは種々のヒト組 織由来のＲＮＡ（クローンテック（Clonetech）社製）におけるＭＴＳ２転写物 の相対的レベルを示す。レーン１−脳；レーン２−胸部；レーン３−腎臓；レー ン４−肺；レーン５−リンパ球；レーン６−卵巣；レーン７−膵臓；レーン８− 前立腺；レーン９−脾臓；レーン１０−胃；レーン１１−甲状腺。予想分子量と 異なる産物の起源は不明である（レーン１参照）。図１０Ｂは、ヒト・リンパ球 における相対的なＭＴＳ２転写物のレベルを、マイトジェンによる誘導後の時間 の関数として示す：レーン１−０時間；レーン２−１時間；レーン３−２時間； レーン４−４時間；レーン５−８時間；レーン６−１６時間；レーン７−２４時 間；レーン８−３２時間；レーン９−４０時間；レーン１０−４８時間；レーン １１−５６時間；レーン１２−６４時間。大多数の細胞は誘導後４０〜５０時間 においてＳ期にあった。図１０Ｃは、ＭＴＳ２転写物のレベルをＲｂの状態の関 数として示す。Ｒｂ+細胞系は：レーン１−ＫＩＴ８（ホリ（Hori）ら,１９８７ 年）；レーン２−２倍体のヒト・線維芽細胞ＭＲＣ５（２８代継代）；レーン３ −ＵＭＳＣＣ２；レーン４−ブリストル８；レーン５−ＺＲ７５；レーン６−Ｈ ａＣａＴ；レーン７−Ｔ２４。Ｒｂ-細胞系は：レーン８−ＭＤＡ ＭＢ４６８ ；レーン９−５６３７；レーン１０−Ｃ３３Ａ；レーン１１−ＳｉＨａ；レーン １２−ＣａＳｋｉ；レーン１３−ＷＥＲＩ。 図１１は５'一非翻訳領域を含むＭＴＳ２に関するｃＤＮＡ配列（およびコー ドされるポリペプチド）を示す。エキソン２の開始は位置４９１にあり、矢印に より示す。ｃＤＮＡ配列を配列番号：１５として示し、アミノ酸配列を配列番号 ：１６として示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ＭＴＳ１Ｅ１βのｃＤＮＡ配列（およびコードされ るポリペプチド）を示す。スプライス部位を矢印で示す。エキソン２は位置３３ ５から開始し、エキソン３は位置６４２から開始する。ｃＤＮＡ配列を配列番号 ：１３として示し、アミノ酸配列を配列番号：１４として示す。 図１３はＰ１６領域の構成を示す地図である。エキソン１α（Ｅ１α）、エキ ソン１β（Ｅ１β）、エキソン２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）を黒く塗っ たボックスにより示す。制限部位ＥｃｏＲＩ（Ｒ１）、ＥｃｏＲＶ（ＲＶ）およ びｓａｌＩ（Ｓ）を示す。上の制限酵素地図はゲノムクローンコスミドｃ５およ びＰ１ １０６３である。下の地図は細胞系Ａ３７５およびＳＫ−ｍｅ１９３に おける欠失である。破線は欠失したＤＮＡを示す。 図１４はマウスおよびヒトのＰ１６β転写物の配列を並べたものである。大文 字は同じヌクレオチドを示す。Ｐ１６読み取り枠におけるストップコドンに下線 を付す。Ｅ１βとＥ２との間のスプライスジャンクションを脱字記号（ｖ）で示 す。マウス・β配列を配列番号：２５として示す。ヒト・β配列は配列番号：１ ３のヌクレオチド１９３〜４６１と同じである。 図１５は、Ｅ１βの欠失を有する細胞系におけるα転写物の発現を示す。ｃＤ ＮＡは、示された試料から単離された全ＲＮＡ由来のものである。放射線標識し たプライマーを反応に用いてＰ１６転写物を増幅した。同体積のαおよびβ増幅 物を混合し、生成物を変性５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した：レーン１ −静止Ｔ細胞；レーン２−細胞系ＳＫ−ｍｅ１９３；レーン３−細胞系Ａ３７５ 。 図１６Ａ〜ＤはＰ１６転写物の発現を示す。放射線標識したプライマーを反応 に用いてＰ１６転写物を増幅し、生成物を変性５％ポリアクリルアミドゲル上で 分離した。図１６Ａおよび１６Ｂにおいて、共通試料からのαおよびβ反応物を 電気泳動の前に混合した。図１６Ａは、種々のヒト組織由来のＲＮＡにおけるＰ １６転写物の相対的レベルを示す：レーン１,脳；レーン２,胸部；レーン３,腎 臓；レーン４,肺；レーン５,リンパ球；レーン６,卵巣；レーン７,膵臓；レーン ８,前立腺；レーン９,脾臓；レーン１０,胃；レーン１１,甲状腺。図１６Ｂは、 ヒト・リンパ球におけるβ転写物の相対量をマイトジェンによる誘導後の時間の 関数として示す：レーン１,０時間；レーン２,１時間；レーン３,２時間；レー ン４,４時間；レーン５,８時間；レーン６,１６時間；レーン７,２４時間；レー ン８,３２時間；レーン９,４０時間；レーン１０,４８時間；レーン１１,５６時 間；レーン１２,６４時間。図１６Ｃは、ヒト・リンパ球におけるα転写物の相 対量をマイトジェンによる誘導後の時間の関数として示す：レーンは図１６Ｂと 同じであるが、１時間のポイントを省略した。細胞周期の進行に影響する疑いの ある、あるいは細胞周期の間、転写レベルにおいて調節されている他の分子の発 現も分析した。以前の結果と一致して、ＣＤＫ４およびＧｏＳ２（機能不明の分 子であるが、静止Ｔ細胞が細胞周期に入るとその転写が誘導される）のレベルは Ｔ細胞の誘導により上昇した（ラッセル（Russell）およびフォースダイク（For sdyke）,１９９１年；マツヒメ（Matsuhime）ら,１９９２年；ゲング（Geng）お よびワインバーグ（Weinberg）,１９９３年）。対照的に、実験期間中、ｐ２７ のＲＮＡレベルは不変であるように思われた（トヨシマ（Toyoshima）およびハ ンター（Hunter）,１９９４年；カトー（Kato）ら,１９９４年）。図１６Ｄは、 Ｐ１６転写物をＲｂの状態の関数として示す。Ｒｂ-細胞系：レーン１,ＷＥＲＩ ；レーン２,ＣａＳｋｉ；レーン３,ＳｉＨａ；レーン４,Ｃ３３Ａ；レーン５,５ ６３７；レーン６,ＭＤＡ ＭＢ４６８。Ｒｂ+細胞系：レーン７,Ｔ２ ４；レーン８,ＨａＣａＴ；レーン９,Ｚｒ７５；レーン１０,ブリストル８；レ ーン１１,ＵＭＳＣＣ２；レーン１２,２倍体のヒト・線維芽細胞ＭＲＣ５（２８ 代継代）；レーン１３,ＫＩＴ（ホリ（Hori）ら,１９８７年）。 図１７は、ｃＤＮＡの非コーディング部分を含むＭＴＳ１に関するｃＤＮＡ配 列を示す。三角はスプライスジャンクションを示す。２番目のスプライスジャン クションにおける配列中の破線は、単にこのスプライスジャンクションを強調す るに過ぎず、それらは欠失した塩基を示すのではない。この配列は配列番号：３ ６である。発明の詳細な説明 本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後 におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の 変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫 、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、 胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺 、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい 素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療 法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒト の癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニン グに関する。 本発明は、ＭＴＳ遺伝子座または変異したＭＴＳ遺伝子座のすべてもしくは一 部からなる、好ましくは、少なくとも長さ８塩基であり約１００ｋｂを越えない 、単離ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはアンチセンスポ リヌクレオチドであってもよい。さらに本発明は、かかる単離ポリヌクレオチド からなる組み換え構築物、例えば、形質転換細胞における発現に適した組み換え 構築物を提供する。 さらに、分析対象中のＭＴＳ遺伝子座の一部からなるポリヌクレオチドまたは その発現産物を検出する方法が本発明により提供される。かかる方法は、さらに ＭＴＳ遺伝子座の一部ゐ増幅する工程からなっていてもよく、該ＭＴＳ遺伝子座 の一部の増幅用プライマーであるポリヌクレオチドのセットを提供する工程を包 含していてもよい。該方法は、癌にかかりやすい素因の診断または癌の診断もし くは予後に有用である。 また本発明は、ＭＴＳ遺伝子座によりコードされる少なくとも５個のアミノ酸 残基からなる単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ましくは、モノ クローナル抗体を提供する。 また本発明は、分析対象中の、ＭＴＳ遺伝子座の一部からなるポリヌクレオチ ドを検出するためのキットであって、適当な容器に入ったＭＴＳ遺伝子座の一部 に相補的なポリヌクレオチドおよびその使用説明書からなるキットを提供する。 さらに本発明は、ヌクレオチドをポリマー化してＭＴＳの少なくとも８個の連 続したヌクレオチドからなる配列を得ることからなる、ポリヌクレオチドを調製 するための方法；およびアミノ酸をポリマー化してＭＴＳ遺伝子座中においてコ ードされている少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を得ることからなる、ポ リペプチドを調製するための方法を提供する。 さらに、本発明は、癌治療のための薬剤をスクリーニングしてＭＴＳ遺伝子産 物の機能を回復させるための適当な薬剤を確認する方法を提供する。 結局は、本発明は、遺伝子に基づく、癌細胞に指向される治療に必要な手段を 提供する。これらの治療因子は、適当なベクター中に置かれていてるか、または ＭＴＳ蛋白の機能が再構成されるようにより直接的な方法で標的細胞に送達され る、ＭＴＳ遺伝子座のすべてまたは一部からなるポリヌクレオチドの形態であっ てもよい。治療因子は、ＭＴＳの蛋白配列の一部または全体に基づくポリペプチ ドの形態であってもよい。これらは機能的にはインビボにおいてＭＴＳの活性と 置換する。 メラノーマおよび他の癌にかかりやすい素因を個体に与えるＭＴＳ遺伝子座（ 先行技術においてはメラノーマ（ＭＬＭ）遺伝子座と呼ばれていた）は、Ｃｄｋ 、特にＣｄｋ４の阻害剤であることが見いだされているＭＴＳ１をコードする遺 伝 子であるということが本発明により見いだされた。本明細書においては、この遺 伝子をＭＴＳ１と呼ぶ。さらに、ＭＴＳ遺伝子座が、その配列の一部に関してＭ ＴＳ１と類似であるＭＴＳ２と呼ばれる第２のコーディング配列を含むというこ とも本発明により見いだされた。ＭＴＳ１遺伝子が２個の別々のプロモーター（ αおよびβ）を有するということも、本発明により見いだされた。αプロモータ ーが使用される場合、得られるｍＲＮＡはエキソン１α、エキソン２およびエキ ソン３からなる。これをＭＴＳ１と呼ぶ。βプロモーターが使用される場合、得 られるｍＲＮＡはエキソンβ１、エキソン２およびエキソン３からなる。これを ＭＴＳ１Ｅ１βと呼ぶ。生殖系列におけるＭＴＳ遺伝子座における変異はメラノ ーマおよび他の癌になりやすい素因を示すものであるということが、本発明によ り見いだされた。結局、ＭＴＳ遺伝子座における体細胞変異は、すべての腫瘍タ イプでないとしても大部分の腫瘍タイプに関連し、よって、癌または癌の予後に 関する一般的なインジケーターを提供するものであるということが、本発明によ り見いだされた。ＭＴＳ遺伝子座の変異は、コーディング配列および非コーディ ング配列中の欠失、挿入ならびに点突然変異を包含しうる。 ＭＬＭ遺伝子座は、遺伝マーカーおよびメラノーマ素因の間における、ユタ州 の血族と１のテキサス州の血族における劇的な連関を示すことにより、最初の遺 伝学的位置を占めた（キャノン（Cannon）−アルブライト（Albright）,１９９ ２年）。血族において、組み換えにより決定された領域は、Ｄ９Ｓ７３６および Ｄ９Ｓ１７１に挟まれている。したがって、欠失を有するメラノーマおよび非メ ラノーマ双方の腫瘍細胞系におけるホモ接合性欠失の分析により、遺伝子を局在 化させるためにこれらのおよび他の遺伝マーカーが用いられた。欠失の最小限の 重複領域は、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１に挟まれていた。これらのマーカ ーを取り囲んでいるゲノムクローン同定するためにＹＡＣライブラリーがスクリ ーニングされた。Ｐ１クローンが染色体区域の一部として単離され、それらは２ 個のギャップを除いてはＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１に至る領域に接していた 。より詳細な分子地図を作成するために特異的配列−タグをつけられた部位（「 ＳＴＳ」）が調製された。これらのマーカーおよび欠失分析によると、欠失 重複領域は、コスミド５（ｃ５）上に見いだされたマーカーであるマーカーｃ５ .１およびｃ５.３を中心とする部分に重複していた。最も高頻度に欠失されてい るマーカーはｃ５.３であり、これはＭＴＳに非常に近接していた。 「ＣｐＧ」島の存在に関するｃ５の分析により、ｃ５がＭＴＳに関して少なく とも１個の候補遺伝子を含んでいることが示された。ｃ５のＥｃｏＲＩフラグメ ントのＤＮＡ配列が決定され、ＧｅｎＢａｎｋ由来の配列と比較された。ヒト・ Ｃｄｋ４阻害剤またはｐ１６をコードしている先に同定された遺伝子の領域に類 似の、ｃ５の別々の領域が同定された（セラノ（Serrano）ら,１９９３年）。こ れらの２個の候補遺伝子はＭＴＳ１およびＭＴＳ２と呼ばれた。リンパ球、胎児 の脳および正常な胸部をＭＴＳ１のエキソン２由来のプローブでスクリーニング することにより、ＮＴＳ１Ｅ１βと呼ばれるさらなる候補が同定された。 ｃ５由来のゲノム配列とｐ１６のｍＲＮＡ配列との詳細な比較により、ＭＴＳ １がｐ１６をコードしている配列の一部と同じである３０７ｂｐの伸長部分を含 むことが明らかとなった。ＭＴＳ１におけるこのヌクレオチドの伸長部分は、認 識可能なスプライスジャンクション配列に隣接していた。ＭＴＳ１のさらなる特 徴づけにより、ＭＴＳ１がｐ１６の全コーディング配列および２個のイントロン を含むことが示された。イントロン１は翻訳開始部位から１２６ｂｐ下流にあり ；イントロン２は翻訳終止部位から１１ｂｐ上流にあった。該２個のイントロン はｐ１６コーディング配列を３つの領域、すなわち１２６ｂｐの５'領域（コー ディングエキソン１）、３０７ｂｐの中央の領域（コーディングエキソン２）、 および１１ｂｐの３'領域（コーディングエキソン３）に分断していた。 ＭＴＳ２は、コーディングエキソン２の５'末端からイントロン２の方向に約 ２００ｂｐ伸長しているｐ１６とほとんど同じＤＮＡ配列の領域を含んでいた。 しかしながら、ＭＴＳ１のイントロン２の５１ｂｐ上流の所に至っては配列の類 似性が減少しており、その場所では２個の配列は完全に相違していた。このこと は、ＭＴＳ２の最終コドンの位置に対応いている。ＭＴＳ１由来の配列とＭＴＳ ２由来の配列の比較により、これらの２個の遺伝子間の類似性も、イントロン１ の３'スプライシジャンクションから約５０ヌクレオチド上流までであることが 示された。よって、非コーディングＤＮＡ部分は、コーディングＤＮＡと推定さ れるいくつかの領域よりも保存的である。コーディングＤＮＡにおける配列の相 違がクローニングによる人工物である可能性を排除するために、ＭＴＳ２の配列 相違箇所を越えて特異的に増幅を行うためにＰＣＲプライマーが設計された。こ れらのプライマーはコスミドＰ１およびゲノムＤＮＡ由来の予想された分子量の フラグメントを増幅した。それゆえ、ＭＴＳ２のエキソン２の３'末端付近に存 在する相違配列は真のゲノム配列である。 ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキソン１βまたは１Ｅβと呼ばれるエキソン１を有し、 ＭＴＳ１およびＭＴＳ２のエキソン１において見いだされた配列とは異なる配列 を有している。さらにＭＴＳ１Ｅ１βは、ＭＴＳ１のエキソン２および３と同じ であるエキソン２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）含んでいる。エキソン１β はｍＴＳ１のエキソン１の上流にあり、いかなるコーディング配列も含まない。 結果的に、ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキソン２の最初のＡＴＧにおける翻訳開始部位 を有するｐ１０をコードしている。 ＭＬＭ素因を有すると推定される個体由来のエキソン２を用いてゲノムＤＮＡ を分析することにより、遺伝学的に感受性のある遺伝子座ＭＴＳとの関連につい て、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２が試験された。８人の個体のうちの１個体において 、ＤＮＡ多形性がＭＴＳ１のエキソン２において確認された。変異は単一のヌク レオチド置換であり、アミノ酸変化を起こすものであった。この多形性はＭＬＭ 素因対立遺伝子に関連して分枝していた。 ＭＴＳ１における傷害（欠失およびヌクレオチド置換）の優位性は、ＭＴＳ１ または密接に連関した遺伝子座は腫瘍表現型に貢献していることを示す。これら の傷害を受けた細胞は、傷害を受けない細胞よりも選択的利点を有する。傷害は 細胞増殖に関係のないランダムな出来事であるという別の説明は、いくつかの理 由により成立する可能性がない。第１に、腫瘍表現型とＭＴＳ１における変異と の高い相関は、ＭＴＳ変異と腫瘍形成との間の因果関係を意味する。第２に、Ｍ ＴＳ１はメラノーマに対する感受性に影響し、よって、腫瘍抑制遺伝子として独 立して意味を持つ。第３に、Ｃｄｋ阻害剤としてのｐ１６の生化学的機能は、Ｍ ＴＳ１インビボにおいてＤＮＡ複製の生起に対する一般的な阻害物質として作用 するというモデルにうまく一致する。 本発明診断および予後方法によれば、野生型ＭＴＳ遺伝子座の変化が検出され る。さらに、野生型ＭＴＳ遺伝子座を検出し、素因または腫瘍形成の欠如を確認 することにより、本発明方法を実施することができる。「野生型遺伝子の変化」 は、コーディングおよび非コーディング配列における欠失、挿入および点突然変 異をはじめとするすべての形態の変異を包含する。欠失は遺伝子全体であっても よく、あるいは遺伝子の一部であってもよい。点突然変異はストップコドンにお いて生じてもよく、フレームシフト変異またはアミノ酸置換であってもよい。体 細胞変異は、ある組織、例えば腫瘍組織にのみ生じるものであってもよく、生殖 系列において遺伝しない。生殖系列の変異は、いかなる体組織においても見いだ され、遺伝する。ただ１つの対立遺伝子が体細胞変異した場合、初期の腫瘍状態 が示される。しかしながら、両方の対立遺伝子が変異した場合、後期の腫瘍状態 が示される。欠失されていないＭＴＳ対立遺伝子（例えば、ＭＴＳの欠失を有す る染色体に対する姉妹染色体上に見られる）を、挿入、小規模な欠失および点突 然変異のごとき他の変異に関してスクリーニングすることができる。腫瘍組織に おいて見いだされる多くの変異は、ＭＴＳ遺伝子産物の発現を減少させるもので あろう。しかしながら、機能的でない遺伝子産物を生じる変異も、癌の状態を誘 導するであろう。遺伝子のプロモーターのごとき調節領域において点突然変異が 生じる可能性があり、ｍＲＮＡ発現の欠損または減少を引き起こす。さらに点突 然変異は、正しいＲＮＡのプロセッシングを廃止し、ＭＴＳ遺伝子産物の発現の 減少、またはｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率の低下を引き起こす。 有用な診断方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、 直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、１本鎖コンホーメー ション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌ クレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびさらに以下に詳述するような ＰＣＲ−ＳＳＣＰを包含するが、これらに限定しない。 本発明において同定されるメラノーマおよび他の癌のごとき癌にかかりやすい 素因を、ヒトのいずれかの組織をＭＴＳ遺伝子の変異に関して試験することによ り確認することができる。例えば、生殖系列のＭＴＳ変異を遺伝しているヒトは 癌を発生させる傾向がある。このことを、その人の体のいかなる組織から得たＤ ＮＡを試験することによっても調べることができる。最も簡単には、血液を取り 、血液細胞からＤＮＡを抽出する。さらに、胎児細胞、胎盤細胞または羊水をＭ ＴＳ遺伝子の変異に関して試験することにより、胎児期の診断を行うこともでき る。例えば、点突然変異もしくは欠失による野生型ＭＴＳ対立遺伝子の変化を、 本明細書で述べるいかなる手段によっても検出することができる。 組織における野生型ＭＴＳ対立遺伝子の変化を検出するためには、正常組織か ら当該組織を単離することが役に立つ。腫瘍細胞に関する組織標品を富栄養化さ せるための手段は当該分野において知られている。例えば、組織をパラフィンま たはクリオスタット切片から単離してもよい。サイトメトリー（cytometry）に より正常細胞から癌細胞を分離してもよい。正常細胞から腫瘍細胞を分離するた めのこれらの方法ならびに他の方法は当該分野においてよく知られている。腫瘍 組織への常細胞の混入が激しい場合には、変異の検出はより困難となる。 ＤＮＡ配列の多形性を検出するための迅速な予備分析を、１種またはそれ以上 の制限酵素でのＤＮＡ断片の一連のサザンブロットを調べることにより行うこと ができる。各ブロットは一連の正常個体および一連の癌、腫瘍患者、もしくは両 方のものを含む。ハイブリダイズするフラグメントを示すサザンブロット（ＭＴ Ｓ遺伝子座の近傍またはこれを含む配列をプローブとした場合、対照ＤＮＡから の長さが異なる）は変異の可能性を示す。非常に長い制限フラグメントを生じる 制限酵素を用いる場合、パルスフィールドゲル電気泳動（「ＰＦＧＥ」）を用い る。当該分野においてよく知られた方法を用いてＭＴＳ対立遺伝子の分子クロー ニングおよび当該対立遺伝子の配列決定を行うことにより、点突然変異の検出を 行うことができる。別法として、知られた方法を用いて、腫瘍組織由来のゲノム ＤＮＡ標品から直接に遺伝子配列を増幅することもできる。次いで、増幅配列の ＤＮＡ配列を決定することができる。 感受性を有する対立遺伝子の存在の確認に関する、より完全であるが、さらに 間接的な試験について６つのよく知られた方法がある：１）１本鎖コンホーメー ション分析（「ＳＳＣＡ」）（オリタ（Orita）ら,１９８９年）；２）変性グラ ジエントゲル電気泳動（「ＤＧＧＥ」）（ワーテル（Wartell）ら,１９９０年； シェフィールド（Sheffie1d）ら,１９８９年）；３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ フィンケルステイン（Finkelstein）ら,１９９０年；キンスラー（Kinszler）ら ,１９９１年）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯｓ」）（ コナー（Ｃonner）ら,１９８３年）；５）イー・コリ（E.coli）のｍｕｔＳ蛋白 のごときヌクレオチドのミスマッチを認識する蛋白の使用（モドリッチ（Modric h）,１９９１年）；および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ラノ（Rano）およびキ ッド（Kidd）,１９８９年）。対立遺伝子特異的ＰＣＲには、その３'末端におい て特定のＭＴＳ変異体にハイブリダイズするプライマーを用いる。特定のＭＴＳ 変異体は存在しない場合、増幅生成物は観察されない。欧州特許出願第０３３２ ４３５号およびニュートン（Newton）ら,１９８９年に開示された増幅不応変異 システム（Amplification Refractory Mutation System）（ＡＲＭＳ）を用いて もよい。クローニングし、配列決定し、次いで増幅を行うことにより、遺伝子の 挿入および欠失を検出することもできる。さらに、該遺伝子または周囲のマーカ ーに対する制限フラグメント長の多形性（ＲＦＬＰ）プローブを用いて対立遺伝 子の変化または多形性フラグメントにおける挿入を評価することもできる。かか る方法は、罹患した個体の親類縁者を、その個体において見いだされるＭＴＳ変 異の存在に関してスクリーニングするのに有用である。当該分野において知られ た挿入および欠失を検出するための他の方法を用いることもできる。はじめの３ つの方法（すなわち、ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ）にお いて、新たな電気泳動バンドが出現する。配列の変化は１本鎖の分子内塩基対合 に変化を起こすので、ＳＳＣＡは異なって移動するバンドを検出する。ＲＮａｓ ｅ保護は変異ポリヌクレオチドの２個またはそれ以上の小フラグメントへの開裂 を必要とする。ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを用いて変異配列の移動速度 の野生型配列との相違を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセ イにおいて、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、ハイ ブリダイゼーション信号の有無を検出することによりアッセイを行う。ｍｕｔＳ アッセイにおいては、変異配列および野生型配列の間のヘテロ二重鎖におけるヌ クレオチドのミスマッチを有する配列のみに蛋白が結合する。 本発明によれば、ミスマッチとは、２本の鎖が１００％の相補性を示さない、 ハイブリダイズした核酸二重鎖である。全体としての同一性の欠如は、欠失、挿 入、逆転または置換によるものであろう。ミスマッチの検出を用いて遺伝子また はそのｍＲＮＡ産物における点突然変異を検出することができる。これらの方法 は配列決定よりも感度が低いが、多くの腫瘍試料について簡単に行うことができ る。ミスマッチ開裂法の例はＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実施において、 該方法は、ヒトの野生型ＭＴＳ遺伝子コーディング配列に相補的な標識リボプロ ーブ（riboprobe）の使用を必要とする。リボプローブと腫瘍組織から単離した ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかをアニーリング（ハイブイリダイズ）させ、次 いで、二重鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出できる酵素ＲＮａ ｓｅＡで消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅＡにより検出される場合、ＲＮａｓ ｅＡはそのミスマッチの部位を開裂する。かくして、アニーリングされたＲＮＡ 標品が電気泳動ゲルのマトリックス上で分離される場合、もし、ＲＮａｓｅＡに よりミスマッチが検出され開裂されたならば、リボプローブとｍＲＮＡまたはＤ ＮＡに関する全長の二重鎖よりも小さいＲＮＡ生成物が見られるであろう。リボ プローブは全長のＭＴＳのｍＲＮＡまたは遺伝子を必要としないが、それらのい ずれかの断片であってよい。リボプローブがＭＴＳのｍＲＮＡまたは遺伝子の唯 一の断片からなる場合には、これらのプローブを多数用いてミスマッチに関して 全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングするのが望ましい。 同様の方法で、酵素的または化学的開裂により、ＤＮＡプローブを用いてミス マッチを検出することができる。例えば、コットン（Cotton）ら,１９８８年； シェンク（Shenk）ら,１９７５年；ノバーク（Novack）ら,１９８６年参照。別 法として、マッチしている二重鎖に対するミスマッチの二重鎖の電気泳動におけ る移動度の変化によりミスマッチを検出することもできる。例えば、カリエロ（ Cariello）,１９８８年参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれか を用いて、変異を有する細胞のｍＲＮＡまたはＤＮＡを、ハイブリダイゼーショ ン前のＰＣＲ（下記）を用いて増幅することができる。ＭＴＳのＤＮＡにおける 変化は、特に、その変化が欠失および挿入のごとき大規模な配列の変化である場 合には、サザンハイブリダイゼーションを用いて検出することもできる。 ＰＣＲを用いることにより増幅されたＭＴＳ遺伝子のＤＮＡ配列を、対立遺伝 子特異的プローブを用いてスクリーニングしてもよい。これらのプローブは核酸 オリゴマーであり、それぞれが既知変異を有するＭＴＳ遺伝子配列の領域を含ん でいる。例えば、１のオリゴマーが、ＭＴＳ遺伝子配列の一部に対応している長 さが約３０ヌクレオチドであってもよい。かかる対立遺伝子特異的プローブの組 を用いることにより、ＰＣＲ増幅生成物をスクリーニングして前以て同定されて いるＭＴＳ遺伝子における変異の存在を確認することができる。例えば、ナイロ ンフィルター上で、対立遺伝子特異的プローブの増幅されたＭＴＳ配列とのハイ ブリダイゼーションをおこなうことができる。緊縮ハイブリダイゼーション条件 下での特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プ ローブにおけるのと同じ変異が腫瘍組織に存在することを示す。 候補となる遺伝子座における変異に関する最も決定的な試験は、癌患者由来の ゲノムＭＴＳ配列を対照由来の配列と比較することである。別法として、例えば ＰＣＲによる増幅後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定することができ、それに より候補遺伝子のエキソン構造の決定の必要性を除去することができる。 ＭＴＳのコーディング領域の外側で生じる癌患者由来の変異体を、ＭＴＳ遺伝 子付近またはＭＴＳ遺伝子内のイントロンおよび調節配列のごとき非コーディン グ配列を試験することにより検出することができる。非コーディング領域におけ る変異は重要であるという初期の指摘は、対照個体と比較した場合の、癌患者に おける異常なサイズのメッセンジャーＲＮＡ分子またはメッセンジャーＲＮＡ分 子の豊富さを明らかにするノーザンブロット分析に由来する。 ＭＴＳのｍＲＮＡ発現の変化を、当該分野において知られたいかなる方法によ っても検出することができる。これらの方法は、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ 増幅およびＲＮａｓｅ保護を包含する。減少したｍＲＮＡ発現は野生型ＭＴＳ遺 伝 子の変化を示す。野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を、野生型ＭＴＳ蛋白の変化につい てのスクリーニングによっても検出することができる。例えば、ＭＴＳと免疫反 応性のあるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる 。同種の抗原の欠如はＭＴＳの変異を示すであろう。変異した対立遺伝子の産物 に特異的な抗体を用いて変異ＭＴＳ遺伝子産物を検出することもできる。かかる 免疫学的アッセイを、当該分野で知られたいかなる便利なフォーマットにおいて も行うことができる。それらは、ウェスタンブロット、免疫組織学的アッセイお よびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。変化したＭＴＳ蛋白を検出するためのいか なる手段を用いても、野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を検出することができる。蛋白 別号分析のごとき機能的アッセイを用いることができる。例えば、ＭＴＳ蛋白は Ｃｄｋ、特にＣｄｋ４に結合することが知られている。よって、野生型ＭＴＳ蛋 白またはＣｄｋ４に対する結合能についてのアッセイを用いることができる。さ らに、ＭＴＳの生化学的機能（Ｃｄｋ４のごときＣｄｋに対する阻害および細胞 周期の調節）を検出するアッセイを用いることもできる。変異したＭＴＳ遺伝子 産物の発見は野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を示す。 血清、便、尿および痰のごとき他のヒトの身体からの試料において、変異した ＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物を検出することもできる。組織における変異した ＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物を検出するための上記と同じ方法を他の身体から の試料に適用することができる。癌細胞は腫瘍から剥離し、かかる身体からの試 料中に存在する。さらに、ＭＴＳ遺伝子産物自体は細胞外空間へ分泌され、癌細 胞が存在しない場合でさえもこれらの身体試料中に見いだされる。かかる身体試 料をスクリーニングすることにより、多くのタイプの癌について、簡単な初期の 診断を行うことができる。さらに、変異したＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物につ いてかかる身体試料を試験することにより、化学療法および放射線療法の進行を 簡単にモニターすることができる。 本発明診断方法は、ＭＴＳが腫瘍形成において役割を果たしているいかなる腫 瘍についても適用可能である。染色体アーム９ｐの欠失またはＭＴ領域内での体 細胞変異は、試験されたほとんどすべての腫瘍において観察された。本発明診断 方法は臨床医にとり有用であるため、臨床医は適切な治療コースを決定すること ができる。 本発明プライマーのペアーは、ＰＣＲを用いる特定のＭＴＳ対立遺伝子のヌク レオチド配列の決定に有用である。１本鎖ＤＮＡプライマーのペアーを染色体９ ｐ上のＭＴＳ遺伝子内もしくはその周辺の配列とアニーリングさせてＭＴＳ遺伝 子自体のＤＮＡ合成の増幅を開始することができる。これらのプライマーの完全 なセットによりＭＴＳ遺伝子コーディング配列のすべてのヌクレオチド、すなわ ちエキソンの合成が可能となる。好ましくは、プライマーのセットはイントロン およびエキソン療法の配列の合成を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーを 用いることもできる。かかるプライマーは特定のＭＴＳ変異対立遺伝子とアニー リングし、かくして鋳型としての変異対立遺伝子の存在下の生成物のみを増幅す るであろう。 次いで行う増幅配列のクローニングを容易にするため、プライマーが、その５ '末端に付加された制限酵素部位の配列を有していてもよい。かくして、制限酵 素部位を形成するのに必要なわずかのヌクレオチド以外は、プライマーのすべて のヌクレオチドはＭＴＳ配列またはＭＴＳに隣接する配列由来である。かかる酵 素は当該分野においてよく知られている。プライマー自体を、当該分野でよく知 られた方法を用いて合成することができる。一般的には、市販のオリゴヌクレオ チド合成装置を用いてプライマーを合成することができる。配列番号：１、配列 番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：１５およ び配列番号：３６に示されるＭＴＳ読み取り枠の配列が与えられれば、特定のプ ライマーの設計は当業者によく知られたものである。 本発明により提供される核酸プローブは多くの目的に有用である。それらを、 ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、およびすでに上述した点 突然変異検出のためのＲＮａｓｅ保護法に用いることができる。本発明プローブ を用いてＰＣＲ増幅産物を検出することができる。他の方法を用いてＭＴＳ遺伝 子またはｍＲＮＡに関するミスマッチを検出するために本発明プローブを用いて もよい。定義 本発明は以下の定義を用いる： 「ポリヌクレオチドの増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲー ション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱ−ベータレプリカーゼ 伸し用による増幅方法をいうのに用いる。これらの方法はよく知られており、当 該分野において広く行われている。米国特許第４,６８３,１９５号および第４, ６８３,２０２号ならびにイニス（Innis）ら,１９９０年（ＰＣＲに関して）； ウー（Wu）ら,１９８９年ａ（ＬＣＲに関して）参照。ＰＣＲを行うための試薬 およびハードウェアは市販されている。好ましくは、ＭＴＳ領域由来の配列を増 幅するのに有用なプライマーは、ＭＴＳ領域またはその標的領域に隣接する領域 における配列に対して相補的であり特異的にハイブリダイズするものである。増 幅により得られたＭＴＳ配列を直接配列決定してもよい。別法として、しかしあ まり望ましくない方法であるが、増幅された配列を配列決定前にクローン化して もよい。酵素的に増幅されたゲノム断片の直接クローニングおよび配列分析のた めの方法はシャーフ（Scharf）,１９８６年に記載されている。 「分析対象のポリヌクレオチド」および「分析対象の鎖」は、標的配列を有す る可能性があり、生化学的試料をはじめとする種々のタイプの試料中に存在しう る１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドをいう。 「抗体」さらに本発明は、ＭＴＳポリペプチドならびにそのフラグメントまた はＭＴＳ領域由来、特にＭＴＳ遺伝子座もしくはその一部由来のポリヌクレオチ ド配列に特異的に結合する、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体 ならびにそのフラグメント、そしてその免疫学的結合等価物を提供する。「抗体 」なる用語を、均一な分子本体、または多くの異なる分子本体からなる血清生成 物のごとき混合物の療法をいうために用いる。ペプチド合成装置においてポリペ プチドを合成的に調製し、キャリア分子（例えば、キーホルリムペット（keyhol e limpet）のヘモシアニン）とカップリングさせ、次いで、数カ月にわたりウサ ギに注射することができる。ＭＴＳポリペプチドまたはフラグメントに 対する免疫反応性に関してウサギの血清を試験する。蛋白、ポリペプチド、融合 蛋白またはそれらのフラグメントをマウスに注射することによりモノクローナル 抗体を作成してもよい。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニング し、ＭＴＳポリペプチドまたはそのフラグメントに対する特異的免疫反応性につ いて試験する。ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane）,１９８８年参照。こ れらの抗体はアッセイならびに医薬において有用であろう。 十分量の所望ポリペプチドが得られたならば、それを種々の目的に使用するこ とができる。典型的な使用は、特異的結合抗体の製造である。これらの抗体はポ リクローナルであってもモノクローナルであってもよく、当該分野において知ら れたインビトロ法またはインビボ法により製造することができる。 ポリクローナ抗体の製造には、適当な標的免疫系、典型的にはマウスまたはウ サギを選択する。次いで、当該動物に適した方法および免疫学者によく知られた たのパラメーターにより決定された方法で、精製された抗原を免疫系に与える。 典型的な注射部位は、足の甲、筋肉内、腹腔内、または経皮である。もちろん、 マウスまたはウサギの代わりに他の種を用いてもよい。次いで、当該分野で知ら れた方法を用いてポリクローナル抗体を精製し、所望の特異性に適合させる。 通常は、イムノアッセイを用いて免疫学的応答をアッセイする。通常は、かか るイムノアッセイは、例えば、抗原として同じ細胞、同じ方法により産生される 抗原の源をいくらか精製することを必要とする。種々のイムノアッセイ法は当該 分野においてよく知られている。例えば、ハーロウ（Harlow）およびレイン（La ne）,１９８８年、またはゴディング（Goding）,１９８６年参照。 １０-8または好ましくは１０-9ないし１０-10Ｍ-1もしくはそれより強力な親 和性を有するモノクローナル抗体を、典型的には、例えば、ハーロウ（Harlow） およびレイン（Lane）,１９８８年、またはゴディング（Goding）,１９８６年に おいて記載された標準的方法により作成する。簡単には、適当動物を選択し、所 望の免疫感作プロトコールに従う。適当な期間の経過後、かかる動物の脾臓を切 り取り、典型的には、適当な選択的条件下において個々の脾臓細胞を不死化され た骨髄腫細胞と融合させる。その後、細胞をクローン的に分離し、各クローンの 上清をその抗原の所望領域に特異的な適当な抗体の産生について試験する。 他の適当な方法は、リンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロでの曝露、 あるいはまたファージもしくは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選択を 包含する。ヒューズ（Huse）ら,１９８９年参照。本発明ポリペプチドおよび抗 体を修飾して用いても、修飾せずに用いてもよい。しばしば、検出可能なシグナ ルを有する物質を共有結合的または非共有結合的に結合させることにより、ポリ ペプチドおよび抗体が標識されよう。種々の標識および結合方法が知られており 、学術文献および特許文献の双方に広く報告されている。適当な標識は、放射性 核、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子等 を包含する。かかる標識の使用を教示する特許は、米国特許第３,８１７,８３７ 、３,８５０,７５２、３,９３９,３５０、３,９９６,３４５、４,２７７,４３７ 、４,２７５,１４９および４,３６６,２４１号を包含する。さらに、組み換え免 疫グロブリンを得てもよい（米国特許第４,８１６,５６７号参照）。 「結合パートナー」は、高い特異性でリガンド分子を結合することのできる分 子をいい、例えば、抗原と抗原特異的抗体、あるいは酵素とその阻害剤である。 一般的には、特異的結合パートナーは十分な親和性で結合して分析対象コピー／ 相補的二重鎖（ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合）を単離条件 下で固定化しなくてはならない。特異的結合パートナーは当該分野において知ら れており、例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧと 蛋白Ａ、多くの知られた受容体−リガンドのカップル、および相補的ポリヌクレ オチド鎖を包含する。相補的ポリヌクレオチド鎖の結合パートナーの場合、通常 、パートナーは少なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基の長さ であってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチド アナログからなっていてもよい。 「生物学的試料」は、個体由来の分析対象であるポリヌクレオチドまたはポリ ペプチドを有する可能性のある組織もしくは体液の試料、例えば、血漿、血清、 脊髄液、リンパ液、皮膚の外側の部分、呼吸器、消化管ならびに尿生殖管、唾液 、血液細胞、腫瘍、器官、組織およびインビトロ細胞培養成分の試料を包含する が、 これらに限定されない。 本明細書に用いる用語「診断」または「予後」は、腫瘍形成の過程において用 いられ、１）腫瘍形成としての障害の分類、２）腫瘍形成の重篤さの決定、また は３）治療前、治療中および治療後の疾病の進行のモニタリングを示すために用 いられる。 「コードする」 ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを「コードする」といわ れる。そのネイティブな状態にある場合、あるいは当業者によく知られた方法に より操作された場合、ポリヌクレオチドは転写および／または翻訳されてｍＲＮ Ａを生じ、そして／またはポリペプチドもしくはそのフラグメントを生じる。ア ンチセンス鎖はかかる核酸と相補的であり、コーディング配列はそこから推定さ れうる。 「単離された」または「実質的に純粋な」「単離された」または「実質的に純 粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、リボゾーム、ポ リメラーゼ、他の多くのヒト・ゲノム配列ならびに蛋白のごときネイティブなヒ トの配列もしくは蛋白を本質的に伴う他の細胞成分から実質的に分離されたもの である。この用語は、天然環境から取り出された核酸配列または蛋白を包含し、 組み換えまたはクローン化されたＤＮＡ単離体および化学合成されたアナログも しくは異種生物の系により生物学的に合成されたアナログを包含する。 「ＭＴＳ対立遺伝子」は、ＭＴＳ遺伝子座の正常な対立遺伝子、ならびに個体 に多くの部位の癌（例えば、メラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞 腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、 肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺 、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌）を発生 させる素因を与える変化した対立遺伝子をいう。かかる素因を与える対立遺伝子 は、「ＭＴＳ感受性対立遺伝子」とも呼ばれる。 「ＭＴＳ遺伝子座」、「ＭＴＳ遺伝子」、「ＭＴＳ核酸」または「ＭＴＳポリ ヌクレオチド」は、そのすべてがＭＴＳ領域にあるポリヌクレオチドあって、正 常組織において発現される可能性のうポリヌクレオチドをいう。それらのうちあ る種の対立遺伝子は個体に多くの部位の癌（例えば、メラノーマ、目のメラノー マ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ 腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに 膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸な らびに直腸の癌）を発生させる素因を与える。ＭＴＳ遺伝子座なる用語を、本明 細書においては先行技術にいうＭＬＭ遺伝子座に代えて用い、「ＭＴＳ」の使用 は、遺伝子座、遺伝子、領域等に関連して用いられる「ＭＬＭ」を包含する。Ｍ ＴＳ遺伝子座における変異は、他のタイプの腫瘍の開始および／または進行に関 連していてもよい。一部には、個体に癌発生の素因を与える変異により遺伝子座 が示される。これらの変異は上記ＭＴＳ領域内のものである。ＭＴＳ遺伝子座は 、コーディング領域、介在配列ならびに転写および／または翻訳をコントロール している調節エレメントを包含する。ＭＴＳ遺伝子座は当該ＤＮＡ配列のすべて の対立遺伝子変種を包含する。 これらの用語は、核酸について用いられる場合、ＭＴＳポリペプチド（ｐ１６ を含む）、フラグメント、同族体もしくは変種（例えば、蛋白融合または欠失に よるもの）をコードしている核酸をいう。本発明核酸は、天然のＭＴＳをコード している遺伝子由来の、あるいは実質的にそれと同様な配列、または天然のＭＴ Ｓをコードしている遺伝子もしくはその一部と相同性を有する配列を有する。Ｍ ＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１）に関するコーディング配列を配列番号：１に示し 、ＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１）のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。第２ のＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１Ｅ１β）のコーディング配列を配列番号：１３ に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。第３のＭＴＳポリペプ チド（ＭＴＳ２）のコーディング配列を配列番号：１５に示し、対応するアミノ 酸配列を配列番号：１６に示す。Ｐ１６なる用語は、ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ １βの代わりに用いられ、ｐ１６をコードしているＭＴＳ１およびｐ１０をコー ドしているＭＴＳ１Ｅ１βの両方を主するために用いられる。ＭＴＳ１およびＭ ＴＳ１Ｅ１βは１つの遺伝子の２つの形態であり、転写に際して、当該２つの形 態は該遺伝子の２個のプロモーターに依存している。ＭＴＳ２はＭＴＳ領域の別 の 部分であり、ｐ１５をコードしている。 本発明ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、お よび混合ポリマー、センスならびにアンチセンス鎖の両方を包含し、化学的また は生物学的に修飾されていてもよく、あるいは当業者に容易に認識される非天然 もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。かかる修飾は、 例えば、標識、メチル化、１個またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの アナログでの置換、電荷のない結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリ エステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、電荷のある結合（例えば、ホ スホロチオアート、ホスホロジチオアート等）、懸垂部分（pendent moieties） （例えば、ポリペプチド等）、挿入物（例えば、アクリジン、プソラレン等）、 キレーター、アルキル化剤、および修飾された結合（例えば、アルファアノマー 核酸等）のごとき分子間修飾を包含する。さらに、水素結合および他の化学的相 互作用により特定の配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合 成分子も包含される。かかる分子は当該分野で知られており、例えば、分子骨格 においてリン酸結合の代わりにペプチド結合が使用されている分子である。 本発明は、ＭＴＳのすべてまたは一部からなる組み換え型核酸を提供する。該 組み換え構築物は宿主細胞中で自律的に複製可能であってもよい。また、該組み 換え構築物は宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。かかる組み換え型ポリ ヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチ ドからなり、その起源もしくは取り扱いにより、１）天然においては会合してい るポリヌクレオチドのすべてまたは一部に会合していない；２）天然においては 連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結している；あるい は３）天然には存在しない、のいずれかである。 それゆえ、天然に存在しない配列からなる組み換え型核酸が本発明により提供 される。野生型配列を用いてもよいが、しばしば、それは、例えば欠失、置換ま たは挿入によって変化させられるであろう。 種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、本発明核酸の天然の源 としてスクリーニングしてもよく、あるいは、ゲノムＤＮＡもしくはたの天然起 源に存する配列を、矢よＰＣＲにより増幅することによりかかる核酸を提供して もよい。通常は、ｃＤＮＡライブラリーの選択は、所望蛋白に関するｍＲＮＡが 豊富である組織起源に対応する。通常は、ファージライブラリーが好ましいが他 のタイプのライブラリーを用いてもよい。ライブラリーのクローンをプレート上 に広げ、スクリーニングのための基質に移し、変性させ、次いで、所望配列の存 在に関してプローブされる。 本発明に用いるＤＮＡ配列は、通常は少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチ ド）、よち通常には少なくとも約７〜１５コドン、そして最も好ましくは少なく とも約３５コドンからなるであろう。このヌクレオチドの数は、通常は、ＭＴＳ をコードしている配列に特異的にハイブリダイズする都合のよいプローブに必要 な、ほぼ最小限の長さである。 核酸の取り扱い法は、一般的に説明されており、例えば、サムブルック（Samb rook）ら,１９８９年またはアウスベル（Ausbel）ら,１９９２年に記載されてい る。制限酵素等のごとき、かかる方法に適用する試薬は当該分野において広く知 られており、ニュー・エングランド・バイオラブズ（New England BioLabs）、 ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、アマシャム（Amersham） 、プロメガ・バイオテク（Promega Biotec）、ユー・エス・バイオケミカルズ（ U.S.Biochemicals）、ニュー・イングランド・ニュクリアー（New England Nucl ear）のごとき業者、および他の多くの販売元から市販されている。本発明融合 蛋白の製造に用いる組み換え型核酸は天然由来であっても合成配列であってもよ い。多くの天然遺伝子配列を、適当なプローブを用いてｃＤＮＡまたはゲノムラ イブラリーから得ることができる。ジェンバンク（GenBank）ナショナル・イン ステイチュート・オブ・ヘルス（National Institute of Health）参照。 「ＭＴＳ領域」は、Ｐ１クローンてあるＰ１−１０６２およびＰ１−１０６３ において見いだされるヒト・染色体９の一部をいう。イー・コリＮＳ３５２９中 のこれらのＰ１クローンは、アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビルのア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に、１９９４年３月１６日に寄託され、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ ６９５８９および６９５９０を付与された。この領域は、ＭＴＳ１、ＭＴＳ２お よびＭＴＳ１Ｅ１β遺伝子を含んでいるＭＴＳ遺伝子座を含む。 本明細書の用語「ＭＴＳ遺伝子座」、「ＭＴＳ対立遺伝子」および「ＭＴＳ領 域」はすべて、該遺伝子座、対立遺伝子または領域からなる２本鎖ＤＮＡ）なら びに該遺伝子座、対立遺伝子または領域からなる１本鎖ＤＮＡをいう。 本明細書の用語、ＭＴＳ遺伝子座または領域もしくは対立遺伝子の「一部」は 、少なくとも約８ヌクレオチド、あるいは好ましくは約１５ヌクレオチド、ある いはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズを有し、少なく とも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有していてもよいと定義される。 「ＭＴＳ蛋白」または「ＭＴＳポリペプチド」は、ＭＴＳ遺伝子座によりコー ドされている蛋白またはポリペプチド（ＭＴＳ１ポリペプチド、ＭＴＳ２ポリペ プチドおよびＭＴＳ１Ｅ１βポリペプチド）、その変種もしくはフラグメントを いう。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーおよびその同等物をいい、 生成物の特定の長さをいうのではない；よって、ペプチド、オリゴペプチドおよ び蛋白はポリペプチドの定義に包含される。この用語はポリペプチドの修飾体、 例えば、グリコシレーション、アセチル化、ホスホリレーション等されたものを いうのではなく、あるいはそれらを排除する。例えば、１個またはそれ以上のア ミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸等）を含むポリペプチド、置換された 結合ならびに当該分野で知られた天然および非天然双方の他の修飾を有するポリ ペプチドは当該定義に包含される。通常は、かかるポリペプチドは、ネイティブ なＭＴＳ配列に対して、少なくとも約５０％相同、好ましくは約９０％以上相同 、より好ましくは少なくとも約９５％相同である。さらに、高いもしくは低い緊 縮条件においてＭＴＳをコードしている核酸にハイブルダイズするＤＮＡにより コードされている蛋白、およびＭＴＳ蛋白に対する抗血清により回収される密接 に関連したポリペプチドもしくは蛋白も、当該定義に包含される。 相同性に関して比較されるポリペプチドの長さは、一般的には、少なくとも約 １６アミノ酸、通常は少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残 基、典型的には少なくとも約２８残基、そして好ましくは約３５残基よりも多い 。 「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が意図された様 式でそれらの機能を発揮できるような関係にある並置をいう。例えば、プロモー ターがその転写または発現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列に 作動可能に連結される。 「プローブ」ある種の癌の素因となるかまたは大部分の癌に関連しているＭＴ Ｓ対立遺伝子に関連したポリヌクレオチド多形性は、緊縮ないし緩和条件でのハ イブリダイゼーションおよび洗浄条件において標的配列と安定なハイブリッドを 形成するポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出され る。プローブが完全に標的配列と相補的であると予想される場合、緊縮条件が用 いられるであろう。いくつかのミスマッチが予想される場合、例えば、プローブ が完全には相補的でないという結果により変種が予想される場合には、ハイブリ ダイゼーションの緊縮度を低下させてもよい。非特異的／偶然の結合を除外する 条件、すなわち、ノイズを最小にする条件が選択される。かかる示度は通常のＤ ＮＡ多形性ならびに変異を同定するので、これらの示度は、ＭＴＳ感受性対立遺 伝子の検出を示すためのさらなる分析を必要とする。 ＭＴＳ対立遺伝子に対するプローブは、ＭＴＳ領域またはそのｃＤＮＡの配列 由来であってもよい。プローブはいかなる適当な長さであってもよく、ＭＴＳ領 域のすべてまたは一部にわたるものであり、ＭＴＳ領域と特異的にハイブイダイ ゼーションする。標的配列がプローブと同じ配列を含む場合、緊縮条件下におい てさえもハイブリッドは比較的安定であるため、プローブは短くてもよく、例え ば、約８〜３０塩基対の範囲でよい。ある程度のミスマッチがプローブについて 予想される場合、すなわち、プローブが変種領域にハイブリダイズしそうな場合 には、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズする長いプローブを用いてもよ い。 プローブは、標識またはレポーター分子に結合した単離ポリヌクレオチドを包 含するであろうし、さらに標準的方法により、配列が同様である他のポリヌクレ オチ下配列を単離するのに用いられてもよい。プローブを調製し、標識する方法 は、例えば、サムブルック（Sambrook）ら,１９８９年またはアウスベル（Ausbe l）ら,１９９２年参照。相同的ポリヌクレオチドにより、他の同様のポリヌクレ オチドを選択することができる。別法として、遺伝暗号の縮重を用いることによ り、これらのまたは同様のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを合 成または選択することができる。沈黙の変化（silent changes）により種々のコ ドン置換を導入してもよく、あるいは特定の系のために発現を最適化してもよい 。ポリペプチドの特性、おそらく、リガンド結合親和性、鎖間の親和性、または ポリペプチドの分解もしくはターンオーバー速度を変化させるために変異を導入 してもよい。 本発明合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドからなるプローブ は、天然または組み換え型の１本鎖もしくは２本鎖ポリヌクレオチド由来であっ てもよく、または化学合成されたものであってもよい。さらに、ニックトランス レーション、クレノウフィル−イン反応（Klenow fill-in reaction）、または 当配分野で知られた他の方法によりプローブを標識してもよい。 少なくとも約８ヌクレオチド、通常には少なくとも約１５ヌクレオチド、そし て約６Ｋｂより少ない、通常は約１.０Ｋｂより少ないポリヌクレオチド配列の 一部がプローブとして好ましい。プローブを用いてＭＴＳをコードしているｍＲ ＮＡが細胞または組織に存在するかどうかを調べてもよい。 「蛋白の修飾またはフラグメント」は、実質的に１次構造配列と相同的である が、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的および生化学的修飾を有する かまたは通常見られないアミノ酸を含んでいるＭＴＳポリペプチドまたはそのフ ラグメントについて、本発明により用いられる。かかる修飾は、例えば、アセチ ル化、カルボキシル化、ホスホリレーション、グリコシレーション、ユビキチネ ーション、放射性核ならびに種々の酵素修飾による標識のごとき、当業者により 容易に認識されるような修飾を包含する。ポリペプチドの標識のための種々の方 法、またはかかる目的に使用される標識は当該分野でよく知られており、32Ｐ、 標識された抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発 光剤、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合ペアーのメンバーとして役 立ちうる抗リガンドが包含される。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの 結合容易性、必要な安定性、および使用可能な器具に依存する。ポリペプチドを 標識する方法は当該分野で知られている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら ,１９８９年またはアウスベル（Ausbel）ら,１９９２年参照。 実質的に全長のポリペプチド以外に、本発明は、生物学的に活性のある当該ポ リペプチドのフラグメントを提供する。重要な生物学的活性は、ＭＴＳポリペプ チドに特徴的なリガンド結合、免疫学的活性および他の生物学的活性を包含する 。免疫学的活性は、標的免疫系における免疫原機能ならびに競争物質またはＭＴ Ｓ蛋白のエピトープの代用抗原として役立つ結合用免疫学的エピトープを共有す ることの双方を包含する。本明細書に用いる「エピトープ」は、ポリペプチドの 抗原決定因子をいう。エピトープは、当該エピトープに特有の空間的配置にある ３個のアミノ酸からなっていてもよい。一般的には、エピトープは、少なくとも ５個、より通常には少なくとも約８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。かかる アミノ酸の空間的配置は当該分野で知られている。 免疫学的目的のために、タンデム−リピート（tandem-repeat）ポリペプチド 断片を免疫原として用いてもよく、そのことにより非常に抗原的な蛋白が生産さ れる。また、かかるポリペプチドは、特異的結合に関して非常に効果的な競争物 質として役立つであろう。ＭＴＳポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的 な抗体の製造を後述する。 さらに本発明は、ＭＴＳポリペプチドおよびフラグメントはらなる融合ポリペ プチドを提供する。２種またはそれ以上のＭＴＳポリペプチド配列間で、または ＭＴＳと関連蛋白との間で同種のポリペプチドを融合させることができる。同様 に、誘導体蛋白の混合した特性または活性を示す異種の融合物を構築してもよい 。例えば、リガンド結合または他のドメインを、異なる新たな融合ポリペプチド またはフラグメントとの間で「交換」してもよい。かかる同種または異種の融合 ポリペプチドは、例えば、変化した結合強度または特異性を示す可能性がある。 融合パートナーは、免疫グロブリン、細菌のβ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、 蛋白Ａ、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ お よび酵母・アルファ接合因子を包含する。例えば、ゴドウスキ（Godowski）ら, １９８８年参照。 典型的には、下記組み換え核酸法により融合蛋白を製造してもよく、あるいは 化学合成してもよい。ポリペプチド合成法は、例えば、メリフィールド（Merrif ie1d）,１９６３年において記載されている。 「蛋白の精製」は、ＭＴＳをコードしている組み換え型核酸で形質転換された 細胞由来のごとき、他の生物学的物質からＭＴＳポリペプチドを単離する種々の 方法をいい、それらは当該分野においてよく知られている。例えば、かかるポリ ペプチドを、例えば本発明により提供される抗体を用いる免疫アフィニティーク ロマトグラフィーにより精製してもよい。蛋白精製のための種々の方法が当該分 野で知られており、ドイチャー（Deutscher）,１９９０年およびスコウプス（Sc opes）,１９９２年において記載された方法を包含する。 「単離された」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる用語は、 天然の状態において付随している成分から分離された蛋白またはポリペプチドを いうために適宜用いられる。少なくとも試料の約６０ないし７５％が単一のポリ ペプチド配列を示す場合、単量体蛋白は実質的に純粋である。典型的には、実質 的に純粋な蛋白は、約６０ないし９０％ Ｗ／Ｗの蛋白試料からなり、より通常 には約９５％、そして好ましくは約９９％以上の純度である。蛋白の純度または 均一性を当該分野で知られた多くの手段、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を行って、次いでゲルを染色することにより単一のポリペプチドのバンドを 可視化することにより示すことができる。ある目的には、ＨＰＬＣまたは当該分 野で知られた精製に用いる他の手段を用いることにより、より高度な分離を行っ てもよい。 ＭＴＳ蛋白は、天然において付随している汚染物質から分離された場合、実質 的に天然において付随している成分を含まない。よって、化学合成または天然に おける起源とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、実質的には、 天然において付随している成分を含まないであろう。さらに、当該分野において 知られた蛋白精製法を用いる単離により、蛋白から天然において付随している成 分を除去してもよい。 たとえ同種の細胞タイプにおいて発現されたとしても、単離または操作された 遺伝配列の発現産物して生産されたポリペプチドを、本明細書においては「単離 ポリペプチド」という。異種細胞により合成的に作られた形態または分子は、本 質的に単離分子である。 「組み換え型核酸」は、天然には存在しないかまたは配列の２個の別個の断片 の人工的組み合わせにより調製される核酸である。この人工的な組み合わせは、 しばしば、化学合成法もしくは核酸の単離断片の人工的操作、例えば遺伝子工学 的手法により行われる。通常は、かかる人工的操作は、コドンを、同じかまたは 保存的アミノ酸をコードしている縮重コドンに置き換えるものであるが、典型的 には、配列認識部位の導入または除去である。また、かかる人工的操作を行って 、所望機能の核酸断片を結合させて所望の機能の組み合わせを発揮させるように する。 「調節配列」は、通常は、遺伝子の発現に影響する遺伝子座のコーディング領 域の１０Ｋｂ以内の配列をいう（遺伝子の転写、およびｍＲＮＡの翻訳、スプラ イシング、安定性等を含む）。 「実質的に相同または同様」 他の核酸（またはその相補鎖）とともに適当に 並べた場合に（適当なヌクレオチドの挿入または欠失を有するが）、ヌクレオチ ド配列の同一性が少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は約７０％、よ ち通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましく は少なくとも９５〜９８％においてあるならば、核酸またはそのフラグメントは 互いに「実質的に相同」である（または「実質的に同様」である）。 また、核酸またはそのフラグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下 で、別の核酸（またはその相補鎖）にハイブリダイズする場合、鎖またはその相 補鎖に対して実質的な相同性または（同様であること）が存在する。特異性が全 く欠如している場合よりも実質的に選択的なハイブリダイゼーションが起こる場 合、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、少なくとも約１ 4個のヌクレオチドにおいてその約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、 より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％が相同 的である場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こるであろう。カネヒサ（ kanehisa）,１９８４年参照。説明したように、相同性の比較を行う長さは、長 い鎖であってよく、ある具体例においては、少なくとも約９個のヌクレオチド、 通常は少なくとも約２０個のヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４個の ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８個のヌクレオチド、より典型的には 少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６個のヌクレ オチドである。 核酸のハイブリダイゼーションは、相補鎖の塩基組成、長さ、およびハイブリ ダイズする核酸との間のミスマッチヌクレオチド塩基数のほかに、塩濃度、温度 、または有機溶媒のごとき条件（それらは当業者により容易に認識される）によ り影響を受けるであろう。一般的に、緊縮温度条件は、３０℃以上、典型的には ３７℃以上、好ましくは４５℃以上の温度を包含する。通常は、緊縮塩条件は、 １０００ｍＭ以下、典型的には５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下であ る。しかしながら、パラメーターの組み合わせは、いかなる単一のパラメーター の測定よりも重要である。例えば、ウェトムーア（Wetmur）およびデイビドソン （Davidson）,１９６８年参照。 プローブの配列も、ある条件下においては二重鎖ＤＮＡに特異的にハイブルダ イズして三重鎖または高次ＤＮＡ複合体を形成しうる。かかるプローブの調製お よび適当なハイブリダイゼーション条件は当該分野において知られている。 「実質的な相同性」または「実質的な同一性」なる用語は、ポリペプチドにつ いていう場合には、対象とするポリペプチドまたは蛋白が、天然の蛋白全体また はその一部に対して少なくとも約３０％、通常は少なくとも約７０％、好ましく は少なくとも約９５％の同一性を有することを示す。 「実質的に同様の機能」は、野生型ＭＴＳ核酸または野生型ＭＴＳポリペプチ ドに関する、修飾された核酸または修飾された蛋白の機能をいう。修飾されたポ リペプチドは実質的に野生型のＭＴＳポリペプチドに対して相同的であり、実質 的に伺じ機能、すなわち、Ｃｄｋ、特にＣｄｋ４の阻害機能を有するであろう。 修飾されたポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有していてもよく、さらに／ または修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。Ｃｄｋを阻害する機能のほかに 、修飾されたポリペプチドは、長い半減期のごとき他の有用な特性を有していて もよい。修飾されたポリペプチドのＣｄｋ阻害活性は、実質的に野生型ＭＴＳポ リペプチドの活性と同じであってもよい。また、修飾されたポリペプチドのＣｄ ｋ阻害活性は野生型ＭＴＳポリペプチドの活性よりも高くてもよい。修飾された ポリペプチドは慣用的方法を用いて合成され、あるいは修飾された核酸によりコ ードされており、慣用的方法を用いて製造される。修飾された核酸は慣用的な方 法により製造される。野生型ＭＴＳ遺伝子機能と実質的に同じ機能を有する核酸 は、上記修飾された蛋白を生じる。 典型的には、ポリペプチドに関する相同性は、配列分析ソフトウェアを用いて 測定される。例えば、ザ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケー ジ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピューター・グループ,ユニバーシティー ・オブ・ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センター,９１０ ユニバーシ ティー・アベニュー・マディソン・ウィスコンシン５３７０５（the sequence A nalysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of W isconsin Biotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705）参照。蛋白分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に割 り当てられた相同性の測定値を用いて同様の配列をマッチさせる。典型的には、 保存的置換は以下のグループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリ ン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、 グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニ ン、チロシン。 ポリペプチドの「フラグメント」、「一部」または「断片」は、少なくとも約 ５ないし７個、しばしば少なくとも約７ないし９個のアミノ酸、典型的には少な くとも約９ないし１３個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０ないし３ ０個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基の並びである。 本発明ポリペプチドは、可溶性である場合、固相支持体、例えば、ニトロセル ロース、ナイロン、カラム充填剤（例えばセファロースビーズ）、磁性ビーズ、 グラスウール、プラスチック、金属ポリマーゲル、細胞、または他の物質にカッ プリングさせてもよい。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェル、計量棒また は膜の形態であってもよい。 「標的領域」は、増幅および／または検出される核酸の領域をいう。用語「標 的配列」は、所望条件下において、プローブまたはプライマーが安定なハイブリ ッドを形成する配列をいう。 本発明の実施には、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組み換 えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的方法を用いる。例えば、マニアティス （Maniatis）,１９８２年；サムブルック（Sambrook）ら,１９８１年；アウスベ ル（Ausbel）ら,１９９２年；グロバー（Glover）,１９８５年；アナンド（Anan d）,１９９２年；グスリー（Guthrie）およびフィンク（Fink）,１９９１年参照 。ヒト・染色体９ｐのマッピングをはじめとするヒト・遺伝子のマッピングに関 する方法および材料の議論は、例えば、ホワイト（White）およびラロウエル（L alouel）,１９８８年にある。組換えまたは化学合成核酸の調製；ベクター、形質転換、宿主細胞 本発明の多量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中で複製させることによ って製造することができる。所望の断片をコードする天然または合成のポリヌク レオチド断片は、原核生物または真核生物細胞に導入できかつその中で複製でき る、通常はＤＮＡ構築物である組換えポリヌクレオチド構築物中に導入されよう 。通常は、ポリヌクレオチド構築物は、酵母または細菌のごとき単細胞生物宿主 中での複製に適しているであろうが、（ゲノム内へ組み込まれるか組み込まれな いかの）培養哺乳動物もしくは植物または他の真核生物の細胞系への導入も目的 とし得る。本発明の方法により作製した核酸の精製は、例えば、サムブルック（ Sambrook）ら,１９８９年またはアウスベル（Ausubel）ら,１９９２年に記載さ れている。 また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ビューケッジ（Beaucage）およ びカルサーズ（Carruthers）、１９８１年により記載されているホスホルアミダ イト法またはマテューチ（Matteucci）ら、１９８１年によるトリエステル法に よるような化学合成によっても作製でき、市販されている自動オリゴヌクレオチ ド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件 下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮ Ａポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成 物から得ることもできる。 原核生物または真核生物宿主へ導入するために調製したポリヌクレオチド構築 物は、所望のポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチド断片を含む、宿 主により認識される複製系よりなっていてもよく、好ましくは、該ポリペプチド コードセグメントに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節配列も含むで あろう。発現ベクターには、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシン グ部位、ポリアデニル化部位、ターミネーター配列およびｍＲＮＡ安定化配列の ごとき、複製開始点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモ ーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング配列が含まれていてもよい 。分泌シグナルには、適当には、蛋白質を、細胞膜を通過および/または停留さ せることができ、かくしてその機能的局所解剖学が達成できる天然のＭＴＳ蛋白 質もしくは他の受容体または同種もしくは関連種の分泌ポリペプチドのいずれか 由来のもの、あるいは細胞から分泌されるものが包含されうる。かかるベクター は、当該分野でよく知られていて、例えば、サムブルック（Sambrook）ら,１９ ８９年またはアウスベル（Ausubel）ら,１９９２年に論じられている標準的な組 換え技術の手段によって調製できる。 適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列の選択は、宿主で機能する ように選択され、適当には、ＭＴＳ遺伝子と本来的に関連するものを含んでいて もよい。細胞系および発現ベクターの作動可能な組合せの例は、サムブルック（ Sambrook）ら、１９８９年またはアウスベル（Ausubel）ら、１９９２年に記載 されている；また、例えば、メッツガー（Metzger）ら、１９８８年も参照せよ 。多くの有用なベクターが当該分野で知られており、ストラタジーン（Stratage ne）社、ニュー・イングランド・バイオラボス（New England Biolabs）社、プ ロメ ガ・バイオテック（Promega Biotech）社および他社のごとき販売業者から得る ことができる。ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモー ターおよび糖分解酵素プロモーターのごときプロモーターは、原核生物宿主に用 いることができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３-ホス ホグリセレート・キナーゼまたはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド-３-ホ スフェート デヒドロゲナーゼのごとき他の糖分解酵素、マルトースおよびガラ クトース利用に関与する酵素のプロモーター領域ならびに他のもののプロモータ ー領域が含まれる。酵母発現に用いるのに適応なベクターおよびプロモーターは 、さらにヒッツェマン（Hitzeman）ら,ＥＰ ７３,６７５Ａにも記載されている 。適当な非-天然哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０からの初期および後期プ ロモーター（フィアーズ（Fiers）ら,１９７８年）、またはマウスモロニー白血 病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、 ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマウイルス由来のプロモーターが含まれてい てもよい。さらに、複数コピーの遺伝子が生成され得るように（例えば、ＤＨＦ Ｒのような）増幅性遺伝子に該構築物を連結させてもよい。適当なエンハンサー および他の発現制御配列については、例えば、「エンハンサーおよび真核生物遺 伝子の発現（Enhancers and Eukaryotic Gene Expression）」、ニューヨーク州 、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Habor，New York）、コール ド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）社（１９８３ 年）も参照。 かかる発現ベクターは、自律的に複製させることもできるが、当該分野でよく 知られている方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入することによってそれらを 複製させることもできる。 発現およびクローニング用のベクターには、当該ベクターで形質転換した宿主 細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子である選択マーカーが 含まれるのが適当であろう。この遺伝子が存在することにより、挿入物を発現す る宿主細胞のみの増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、ａ）例えば、アン ピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート他のような抗生物質またはその他の 毒性物質に対する耐性を付与する；ｂ）栄養要求欠損を相補する、またはｃ）例 えば、バチルス（Bacillus）属についてＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺 伝子のような、複合培地から利用できない重要な栄養物を供給する蛋白質をコー ドしている。適当な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、異なった宿主に 対する適当なマーカーは当該分野でよく知られている。 目的の核酸を含有するベクターは、イン・ビトロ（in vitro）で転写して、得 られたＲＮＡを、例えば、注射（ティー・クボ（T.Kubo）ら、１９８８年参照） のようなよく知られている方法によって宿主細胞に導入できる。あるいは、該ベ クターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸 カルシウム、ＤＥＡＥ-デキストランまたは他の物質を用いたトランスフェクシ ョン；マイクロプロジェクタイル衝突（microprojectile bombardment）；リポ フェクション；（レトロウイルスゲノムのごとき、ベクターが感染因子である） 感染；および他の方法を含む、細胞性宿主のタイプによって変動する当該分野で よく知られた方法によって宿主細胞に直接導入できる（一般的には、サムブルッ ク（Sambrook）ら,１９８９年およびアウスベル（Ausubel）ら,１９９２年参照 ）。とりわけ、前記のものを含む当該分野で知られているいずれかの方法による ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、「形質転換」として本明細書中では示 す。その中に前記の核酸を導入した細胞は、かかる細胞の子孫をも含むことを意 味する。 大量の本発明の核酸およびポリペプチドは、適合する原核生物または真核生物 宿主の細胞において、ベクターまたは他の発現ビヒクル中でＭＴＳ核酸またはそ の一部分を発現させることによって調製できる。最も一般に用いる原核生物宿主 は、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）またはシュードモーナス（Pse udomonas）を用いてもよいが、エスシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の株 である。 酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類もしくは鳥類のごとき、哺乳動物ま たは他の真核生物ぼ宿主細胞も、本発明の蛋白質の産生に有用となり得る。培養 における哺乳動物細胞の増殖性は、本質的によく知られている（ジャコビー（Ja koby）およびパスタン（Pastan）（編）１９７９年参照）。一般的に用いられる 哺乳動物宿主細胞系の例は、例えば、高発現性、所望のグリコシレーションパタ ーンまたは他の特徴を提供するのに適当となり得る他の細胞系も熟練実施者によ って称賛されるであろうが、ＶＥＲＯおよびＨeＬa細胞、チャイニーズ・ハムス ター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＷＩ３８、ＢＨＫならびにＣＯＳ細胞系である。 クローンは、ベクター構築の様式に依存するマーカーを用いることによって選 抜する。マーカーは、同一または異なったＤＮＡ分子上にあってもよいが、同一 のＤＮＡ分子にあるのが好ましい。原核生物宿主においては、例えば、アンピシ リン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって、形質転換体 を選抜することができる。温度感受性に基づく特定の生成物の産生を、適当なマ ーカーとして供することもできる。 本発明のポリヌクレオチドで形質転換した真核生物または原核生物の細胞は、 本発明の核酸およびポリペプチドの産生のみならず、例えば、ＭＴＳポリペプチ ドの特徴を研究するのにも有用であろう。 アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、ＭＴＳ遺伝子座の発現を妨害または 低下させるのに有用であり、当業者により理解されるであろう。例えば、ＭＴＳ 遺伝子座またはＭＴＳ領域からの他の配列（特に、ＭＴＳ遺伝子座側面のもの） の全部または一部分を含むポリヌクレオチドベクターを、アンチセンス向きでプ ロモーターの制御下に配置し、細胞に導入してもよい。かかるアンチセンス構築 物の細胞内での発現によって、ＭＴＳの転写および/または翻訳および/または複 製が妨害されるであろう。 サイクリン（cycline）およびＣdkは、真核生物における遍在性の細胞周期制 御因子である。かかる蛋白質は、最初に酵母において発見され、海洋性無脊椎動 物、両生類、ならびにネズミ、ウサギおよびヒトを含む哺乳動物においても発見 されている。１の種の遺伝子配列に基づくプローブおよび/またはプライマーを 用いることにより、他の種において相同性の細胞周期制御配列遺伝子を同定する 。かくして、本明細書に開示するＭＴＳ遺伝子配列に基づくプローブおよびプラ イマーを用いて、他の種において相同性のＭＴＳ遺伝子配列および蛋白質を同定 する。これらのＴＭＳ遺伝子配列および蛋白質は、それらが単離された種につい ての本 明細書に記載した診断/予後、治療および薬剤スクリーニング方法に用いられる 。使用方法；核酸診断および診断キット 患者を癌にし易くするＭＴＳ対立遺伝子の存在を検出するためには、血液のご とき生物学的試料を調製し、ＭＴＳの感受性対立遺伝子が存在するか否かにつき 分析する。新生物、悪性の前駆障害に向かう進行、または予後指標としての存在 を検出するためには、障害の生物学的試料を調製し、ＭＴＳの新生物対立遺伝子 が存在するか否かにつき分析する。これらの試験の結果および解釈的情報は、試 験した患者に対するコミュニケーション用にヘルスケア提供者に戻される。かか る診断は、診断を行う研究室によって行うことができ、または別法として、診断 キットを製造し、ヘルスケア提供者または自己診断用に個人の患者に販売するこ ともできる。 まず、該スクリーニング法には、例えば、ＰＣＲによるごとき、関連のＭＴＳ 配列の増幅に続くＤＮＡ配列分析が含まれる。本発明のもう１つの好ましい具体 例において、該スクリーニング法には、ＰＣＲによらない方法が含まれる。かか るスクリーニング法には、当該分野でよく知られている２段階標識増幅方法学が 含まれる。ＰＣＲおよびＰＣＲによらないスクリーニング方法は双方とも、高レ ベルの感度で標的配列を検出することができる。 現在用いられる最もポピュラーな方法は、標的増幅である。本発明においては 、標的核酸配列をポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼにより行われる増幅を 用いる１つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本 発明の範囲内で目的とする好ましいＰＣＲによる方法を実施例１に提供する。ポ リメラーゼ連鎖反応および他のポリメラーゼにより行われる増幅アッセイにより 、ポリメラーゼにより行われる増幅サイクルの使用を通して、コピー数において 百万倍以上の増加が達成できる。一旦増幅されれば、得られた核酸は、配列決定 するか、またはＤＮＡプローブ用物質として使用できる。 該プローブを（例えば、癌感受性のスクリーニングのように）標的配列の存在 を検出するのに用いる場合、血液または血清のごとき分析すべき生物学的試料を 処理して、所望により、核酸を抽出してもよい。試料核酸は、標的配列の検出を 容 易にする種々の方法；例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッテ ィングで調製してもよい。分析核酸の標的化領域は、通常、少なくとも部分的に は一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければならな い。配列が元来一本鎖である場合には、変性させる必要はないであろう。しかし ながら、配列が二本鎖である場合には、配列を恐らくは変性させる必要があるで あろう。変性は、当該分野で知られている種々の方法によって行うことができる 。 分析核酸およびプローブは、プローブ中の標的配列が分析物中の予想標的化配 列と安定なハイブリッドを形成するのを促進する条件下でインキュベートする。 分析物に結合させるのに用いるプローブの領域は、ヒト染色体９ｐの標的化領域 に対して完全に相補的に作製することができる。したがって、間違ったものを予 防するためには高度な緊縮条件が望ましい。しかしながら、プローブがゲノムに 独特な染色体の領域に相補的である場合にのみ、高度な緊縮条件を用いる。ハイ ブリダイゼーションの緊縮度は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ およびホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーションの間および洗浄工程 の間の多くの要因によって決定する。これらの要因は、例えば、マニアティス（ Maniatis）ら、１９８２年およびサムブルック（Sambrook）ら、１９８９年に概 説されている。特定の条件下では、三重らせん、四重らせん他のごときさらに高 いオーダーのハイブリッドの形成が、標的配列を検出する手段を提供するのに望 ましい。 得られたハイブリッドを検出する場合には、通常は標識したプローブを用いる ことにより達成される。別法として、該プローブは非標識であってもよく、直接 的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適 当な標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は、当該分野で知ら れており、例えば、（例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライ ミングまたはキナーゼ処理のような）既知の方法によって取り込ませることがで きる放射性標識物、ビオチン、蛍光性基、（例えば、ジオキセタン、特には励起 ジオキサタンのような）化学発光基、酵素、抗体等が含まれる。この基本スキー ムの変形は当該分野で知られており、外来物質から検出すべきハイブリッドの分 離を容易にし、かつ/または該標識部位からのシグナルを増幅させる変形が含ま れる。多くのこれらの変形が、例えば、マシューズ（Matthews）およびクリッカ （Kricka）、１９８８年；ランデグレン（Landegren）ら、１９８８年；ミット リン（Mittlin）、１９８９年；米国特許第４,８６８,１０５号およびＥＰＯ公 開第２２５,８０７号に概説されている。 前に注記したごとく、本発明においては、非-PＣＲベースのスクリーニングア ッセイも目的としている。例示的な非-ＰＣＲベースの方法を実施例１５に提供 する。この方法は、核酸プローブ（または正常なホスホジエステルをメチルホス ホネート骨格に置き換えたごときアナログ）を低レベルのＤＮＡ標的にハイブリ ダイズさせる。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を 妨害しないように、当該プローブに共有結合する酵素を有していてもよい。次い で、この酵素-プローブ-抱合標的核酸複合体は、遊離プローブ酵素抱合体から単 離され、次いで、酵素検出用に基質が添加される。酵素活性は、感度で１０3〜 １０6倍増加する発色またはルミネセント出力の変化として観察する。オリゴデ オキシヌクレオチド-アルカリ性ホスファターゼ・コンジュゲートの調製および ハイブリダイゼーション・プローブとしてのそれらの使用に関連する例について は、ジャブロンスキー（Jablonski）ら、１９８６年を参照せよ。 二段階標識増幅方法は、当該分野で知られている。これらのアッセイは、（ジ ゴキシゲニン、ビオチン等のごとき）小さなリガンドが、ＭＴＳに特異的に結合 できる核酸プローブに結合するという原理に成り立っている。ＭＴＳ１に対する 例示的なプローブは、配列番号：４のヌクレオチド位置４４８〜４９８に相当す る核酸プローブである。対立遺伝子特異的プローブもこの例の範囲内で目的とし ており、例示的な対立遺伝子特異的プローブには、表３に要約した素因性突然変 異および表５に要約した腫瘍中の体細胞突然変異を包含するプローブが含まれる 。 １つの例において、核酸プローブに結合する小さなリガンドは、抗体-酵素抱 合体によって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲ ニンを核酸プローブに結合させる。ハイブリダーゼーションは、（化学ルミネセ ント基質となる）抗体-アルカリ性ホスファターゼ抱合体によって検出する。こ の 具体例による核酸プローブを標識する方法については、マーチン（Martin）ら、 １９９０年を参照せよ。第二の例において、小さなリガンドは、一次リガンドに 対して特異的に複合体を形成することができる二次リガンド-酵素抱合体によっ て認識される。この例のよく知られている具体例は、ビオチン-アビジン型の相 互作用である。核酸プローブを標識するための方法およびビオチン-アビジンベ ースのアッセイにおけるそれらの使用については、リグビー（Rigby）ら、１９ ７７年およびヌグーエン（Nguyen）ら（１９９２年）を参照せよ。 本発明の核酸プローブアッセイがＭＴＳ遺伝子を検出することができる核酸プ ローブの混合物を用いることも本発明の範囲内で目的としている。かくして、細 胞試料中のＭＴＳ１の存在を検出する１つの例において、ＭＴＳ１に相補的な１ 種より多いプローブを用い、あるいはまた、特に、異なるプローブの数は２、３ または５の異なった核酸プローブ配列である。もう１つの例において、患者のＭ ＴＳ１遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するために、ＭＴＳ１に相補的な１ 種をこえるプローブを用い、ここに混合物には、ＭＴＳ１に変化を有する患者の 集合で同定された対立遺伝子特異的突然変異に結合できるプローブが含まれてい る。この具体例において、いかなる数のプローブも用いることができ、好ましく は、個体に乳癌の素因を与えるものとして同定された主な遺伝子突然変異に対応 するプローブが含まれるであろう。本発明の範囲内で目的する幾つかの候補プロ ーブには、表３および５で同定した対立遺伝子-特異的突然変異を含むプローブ が包含される。使用方法；ペプチド診断および診断キット 新生物状態の障害を、野生-型ＭＴＳポリペプチドの変化に基づいて検出する こともできる。かかる変化は、慣用技術による配列分析によって決定できる。さ らに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて、 ＭＴＳペプチド中の相違、またはＭＴＳペプチドがないことを検出する。本発明 の好ましい具体例において、抗体は、溶液からＭＴＳ蛋白質を免疫沈降し、かつ ポリアクリルアミドゲルのウエスタン（Western）ブロットまたはイムノブロッ ト上でＭＴＳ蛋白質と反応するであろう。もう１つの好ましい具体例において、 抗体 は、免疫組織化学的技術を用いて、パラフィンまたは凍結組織切片中のＭＴＳ蛋 白質を検出するであろう。抗体を生成する技術および精製する技術は当該分野で よく知られており、本発明の調製を達成するためにはいずれのかかる技術を選択 してもよい。 ＭＴＳまたはその突然変異体を検出する方法に関連する好ましい具体例には、 モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法 を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法 （ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）が含 まれる。典型的なサンドイッチ法は、米国特許第４,３７６,１１０号および４, ４８６,５３０号（参照により本明細書に取り入れる）にデビッド（David）らに より記載されており、実施例１８に例示されている。使用方法：薬剤スクリーニング 本発明は、Ｃｄｋポリペプチドまたはその結合断片を種々の薬剤のいずれかを スクリーニングする技術に用いることによって、化合物をスクリーニングするの に特に有用である。好ましくは、Ｃｄｋ４を利用する。かかる試験に用いるＣｄ ｋポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に 運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法 は、ポリペプチドまたはその断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定して 形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競争的結合アッ セイにおいて利用する。独立または固定した形態のかかる細胞を、標準結合アッ セイに用いることができる。例えば、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片と試験 する剤との間のコンプレックスの形成を測定し、Ｃｄｋポリペプチドまたはその 断片とＭＴＳポリペプチドまたその断片との間の複合体の形成が、試験する剤に よって妨害される程度を検定することができる。 かくして、本発明は、当該分野でよく知られている方法によって、かかる因子 とＣｄｋポリペプチドまたはその断片とを接触させ、次いで、１）該因子とＣｄ ｋポリペプチドまたはその断片との間のコンプレックスの存在、または２）Ｃｄ ｋポリペプチドまたはその断片とリガンドとの間のコンプレックスの存在につき アッセイすることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供する。さらに、 Ｃｄｋ活性を測定して因子がＣｄｋを阻害でき、かくして細胞周期を調節できる かをどうか判断する。かかる競争的結合アッセイにおいて、典型的には、Ｃｄｋ ポリペプチドまたはその断片を標識する。遊離Ｃｄｋポリペプチドまたはその断 片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（すなわち、コン プレックスを形成しなかった）標識の量は、各々、試験される因子のＣｄｋに対 する結合またはＣｄｋ：ＭＴＳポリペプチド結合の妨害の尺度となる。ＭＴＳポ リペプチドの小さなペプチド（ペプチド模擬体）をこのように分析して、Ｃｄｋ 阻害活性を有するものを同定する。 薬剤スクリーニングのもう１つの方法は、Ｃｄｋポリペプチドに対して適当な 結合親和性を有する化合物についての高処理量スクリーニングを提供し、ゲイセ ン（Geysen）の１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願番号８４/０３ ６６４に詳細に記載されている。簡単に言えば、多数の異なった小さなペプチド 試験化合物を、プラスティックのピンまたは他のものの表面のごとき固体支持体 上で合成する。ペプチド試験化合物をＣｄｋポリペプチドと反応させ、洗浄する 。次いで、当該分野でよく知られている方法によって、結合Ｃｄｋポリペプチド を検出する。 精製Ｃｄｋは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に 被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非-中和抗体を用 いて抗体を捕捉し、Ｃｄｋポリペプチドを固相上に固定することができる。 本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も目的とし、ここにおいて 、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片に対する結合性につき、Ｃｄｋポリペプチ ドに特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競争させる。このようにして 、抗体を用いて、Ｃｄｋポリペプチドの１またはそれを超える抗原決定部位を有 するいずれのペプチドの存在も検出することができる。 薬剤スクリーニングに関するさらなる技術には、非機能性ＭＴＳ遺伝子を有す る（前記したごとき）宿主真核生物細胞系または細胞の使用が含まれる。これら の宿主系または細胞は、Ｃｄｋレベルでの細胞周期制御が不完全である。宿主細 胞 系または細胞は、薬剤化合物の存在下で増殖させる。宿主細胞の増殖速度を測定 して、該化合物が細胞周期を調節できるかを判断する。増殖速度を測定する１つ の手段は、Ｃｄｋ、好ましくはＣｄｋ４の生物学的活性を測定することによる。使用方法；合理的なドラッグデザイン 合理的なドラッグデザインの目的は、例えば、より活性または安定した形態の ポリペプチド、または例えば、イン・ビボ（in vivo）でポリペプチドの機能を 高めるかもしくは妨害する薬剤を創造するために、それらが相互作用する目的の 生物学的に活性なポリペプチドまたは小分子の構造アナログ（例えば、アゴニス ト、アンタゴニスト、インヒビターのような）を作製することである（例えば、 ホジソン（Hodgson）,１９９１年参照）。１つのアプローチにおいて、最初に（ 例えば、ｐ１６またはＣｄｋ４のような）目的の蛋白質、または例えばＣｄｋ４ -ｐ１６コンプレックスの三次元構造を、ｘ-線結晶学、コンピューター・モデリ ングまたは最も典型的には組み合わせたアプローチによって決定する。しばしば ほどではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性蛋白質の構 造に基づくモデリングによって得ることもできる。合理的な薬剤デザインの一例 は、ＨＩＶプロテアーゼ・インヒビターの開発である（エリックソン（Erickson ）ら、１９９０年）。くわえて、（例えば、ｐ１６またはＣｄｋ４のような）ペ プチドは、アラニンスキャン（alanine scan）（ウェルズ（We1ls）１９９１年 ）によって分析する。この技術においては、アミノ酸残基をＡlaで置換し、ペプ チドの活性に対するその影響を測定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこのよう に分析し、当該ペプチドの重要な領域を決定する。 また、機能性アッセイによって選択した標的-特異的抗体を単離し、次いでそ の結晶構造を解析することもできる。原則として、このアプローチにより、続く 薬剤デザインがベースとできるファーマコア（pharmacore）を得る。機能性の薬 理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体を生成させることによって 、蛋白質結晶学全体を迂回することができる。鏡像の鏡像として、抗-イディオ タイプ抗体の結合部位は、元の受容体のアナログであると予想されよう。次いで 、抗-イディオタイプ抗体を用いて、化学的または生物学的に生成したペプチド の バンクからペプチドを同定し単離する。次いで、選択されたペプチドは、ファー マコアとして作用するであろう。 かくして、例えば、改善されたＭＴＳ活性もしくは安定性、またはＭＴＳ活性 のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト他として作用するものを有する薬 剤をデザインすることができる。クローン化ＭＴＳ配列を入手できることによっ て、十分な量のＭＴＳポリペプチドを入手して、ｘ-線結晶学のような分析研究 を行うことができる。さらに、本明細書中に提供するＭＴＳ蛋白質配列の情報は 、ｘ-線結晶学に代えるかまたは加えて、コンピューターモデリング技術を用い ることに導くであろう。使用方法：遺伝子治療 また、本発明により、変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞に野生型ＭＴＳ機能 を供給する方法も提供される。かかる機能を供給することにより、受容細胞の新 生物増殖が抑制されるであろう。野生型ＭＴＳ遺伝子または該遺伝子の一部分は 、当該遺伝子を染色体外に維持するようなベクターを用いて細胞に導入できる。 かかる場合において、該遺伝子は、染色体外の位置から、細胞により発現される であろう。突然変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞に遺伝子部分を導入し、発現 させる場合、当該遺伝子部分は細胞の非腫瘍的増殖に必要なＭＴＳ蛋白質の一部 分をコードしているべきである。野生型ＭＴＳ遺伝子またはその一部分が、細胞 に存在する内因的な突然変異ＭＴＳ遺伝子との組換えが起こるように突然変異細 胞に導入される状況がさらに好ましい。かかる組換えには、ＭＴＳ遺伝子突然変 異が修正される、二重組換えの発生が必要である。組換えおよび染色体外維持の 双方のための遺伝子導入用のベクターは当該分野で知られており、いずれの適当 なベクターも用いることができる。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム 共沈およびウイルス形質導入のごとき、細胞にＤＮＡを導入する方法は当該分野 で知られており、該方法の選択は通常の当業者の能力の範囲内にある。野生型Ｍ ＴＳ遺伝子で形質転換した細胞は、癌の鎮静およびかかる鎮静を促進する薬剤治 療を研究するためのモデル系として用いることができる。 前記で一般的に論じたごとく、ＭＴＳ遺伝子またはその断片は、適用できる場 合には、癌細胞においてかかる遺伝子の発現産物量を増加させるために、遺伝子 治療法に用いることができる。かかる遺伝子治療は、正常細胞に比してＭＴＳポ リペプチドのレベルがなくなっているかまたは減少している癌性または前癌性の 細胞の双方における使用に特に適している。また、このことは、「正常な」レベ ルで突然変異遺伝子を発現している癌細胞においてでさえ、得られたＭＴＳ遺伝 子の発現レベルを上昇させるのにも有用となり得るが、該遺伝子産物は完全には 機能しない。 遺伝子治療は、例えば、「遺伝病の治療（Therapy for Genetic Disease）」 、ティー・フリードマン（T.Friedman）編、オックスフォード・ユニバーシティ ー・プレス（Oxford University Press）社（１９９１年）１０５-１２１頁に、 フリードマン（Friedman）によって記載されているような、一般的に許容される 方法に従って行われるであろう。患者の腫瘍からの細胞を、まず前記した診断方 法によって分析し、腫瘍細胞におけるＭＴＳポリペプチドの産生を確認する。発 現制御エレメントに連結したＭＴＳ遺伝子のコピーを含み、かつ該腫瘍細胞内で 複製できるウイルスまたはプラスミドベクターが好ましい。適当なベクターは、 米国特許第５,２５２,４７９号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３/０７２８２に開 示されたごとく、知られている。次いで、ベクターを腫瘍部位に局所的かまたは （他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも達せさせるためには）全身的に患 者に注射する。トランスフェクションされた遺伝子が各標的化腫瘍細胞のゲノム に恒久的に取り込まれない場合には、該処理を定期的に繰り返すことができる。 ＭＴＳポリペプチドは細胞周期の制御に本質的に拘わっているため、当該遺伝子 を取り込んだ全ての細胞によるＭＴＳポリペプチドの構造的発現を避けるために 、ＭＴＳ遺伝子をそれ自体の調節エレメントと共に導入するのが好ましい。 当該分野で知られている遺伝子転移系は、本発明の遺伝子治療法を実施するの に有用となり得る。これらには、ウイルス的または非ウイルス的なトランスファ ー法が含まれる。パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０、マドザック（Madzak）ら ，１９９２年のような）、アデノウイルス（バークナー（Berkner）,１９９２年 ；バークナー（Berkner）ら,１９８８年；ゴルジグリア（Gorziglia）およびカ ピキア ン（Kapikian）,１９９１年；クオンチン（Quantin）ら,１９９２年；ローゼン フェルド（Rosenfeld）ら,１９９２年；ウィルキンソン（Wilkinson）ら,１９９ ２年；ストラットフォード（Stratford）-ペリコーデット（Perricaudet）ら,１ ９９１年のような）、ワクシニアウイルス（モス（Moss）,１９９２年のような ）、アデノウイルス伴生ウイルス（ムジクツカ（Muzyczka）,１９９２年；オー イ（Ohi）ら,１９９０年のような）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイル ス（マルゴルスキー（Margolskee）,１９９２年；ジョンソン（Johnson）ら,１ ９９２年；フィンク（Fink）ら,１９９２年；ブレックフィールド（Breakfield ）およびゲラー（Geller）,１９８７年；フリース（Freese）ら,１９９０年のよ うな）、ならびに鳥類（ブランディオパドヒエイ（Brandyopadhyay）およびテミ ン（Temin）,１９８４年；ペトロポウロス（Petropoulos）ら,１９９２年のよう な）、齧歯類（ミラー（Miller）,１９９２年；ミラー（Miller）ら,１９８５年 ；ソルジェ（Sorge）ら,１９８４年；マン（Mann）およびバルチモア（Baltimor e）,１９８５年；ミラー（Miller）ら,１９８８年のような）およびヒト（シマ ダ（Shimada）ら,１９９１年；ヘルセス（Helseth）ら,１９９０年；ページ（Pa ge）ら,１９９０年；ブックシャッヒャー（Buchschacher）およびパンガニバン （Panganiban）,１９９２年のような）起源のレトロウイルスを含む数多くのウ イルスが、遺伝子トランスファーベクターとして用いられてきた。ほとんどのヒ トの遺伝子治療プロトコールは、無能化した齧歯類のレトロウイルスに基づいて いた。 当該分野で知られている非ウイルス遺伝子トランスファー法には、リン酸カル シウム共沈（グラハム（Graham）およびホン・デル・エブ（von der Eb）,１９ ７３年；ペリセル（Pellicer）ら,１９８０年のような）のごとき化学的技術； 例えば、マイクロインジェクション（アンダーソン（Anderson）ら,１９８０年 ；ゴードン（Gordon）ら,１９８０年；ブリンスター（Brinster）ら,１９８１年 ；コンスタンチーニ（Constantini）およびレイシー（Lacy）,１９８１年のよう な）；リポソームを介した膜融合による転移（フェルグナー（Felgner）ら,１９ ８７年；ウォン（Wang）およびファン（Huang）,１９８９年；カネダ（Kaneda） ら,１９８９年：スチュアート（Stewart）ら,１９９２年；ナーベル（Nabel）ら ,１９９０年；リム （Lim）ら,１９９２年のような）；ならびに直接ＤＮＡ取り込み（ウォルフ（Wo lff）ら,１９９０年；ウ（Wu）ら,１９９１年；ゼンケ（Zenke）ら,１９９０年 ；ウ（Wu）ら,１９８９年ｂ；ウォルフ（Wolff）ら,１９９１年；ワグナー（Wag ner）ら,１９９０年；ワグナー（Wagner）ら,１９９１年；コッテン（Cotten） ら,１９９０年；クリエル（Curiel）ら,１９９１年ａ；クリエル（Curiel）ら, １９９１年ｂのような）のごとき機械的技術、ならびに受容体-媒介ＤＮＡトラ ンスファーのような機械的技術が含まれる。ウイルスにより媒介される遺伝子転 移は、リポソーム・デリバリーを用いた直接イン・ビボ遺伝子転移と組み合わせ ることができ、ウイルスベクターを周囲の非分裂細胞ではなく腫瘍細胞に向ける ことが可能となる。別法として、レトロウイルスベクター産生細胞系を腫瘍に注 射することもできる（カルバー（Culver）ら,１９９２年）。産生細胞が注射さ れれば、ベクター粒子の連続的な源が提供される。この技術は、手術不可能な脳 腫瘍を患ったヒトでの使用が認可されている。 生物学的および物理学的な遺伝子トランンスファー法を合わせたアプローチに おいて、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋 白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組み合わせると、得られた複合体がアデノ ウイルスベクターに結合する。次いで、三分子複合体を用いて細胞に感染させる 。アデノウイルスベクターにより、カップリングしたＤＮＡが損傷される前に、 効率的な結合、内在化、およびエンドソーム分解が可能となる。 リポソーム/ＤＮＡコンプレックスは、直接イン・ビボの遺伝子転移を媒介で きることが示されている。標準的なリポソーム調製物においては、遺伝子転移プ ロセスが非特異的であるにも拘わらず、局在化されたインビボ（in vivo）の取 り込みおよび発現が、例えば、直接インサイチュ（in situ）投与の後に、腫瘍 沈着物で報告されている（ナーベル（Nabel）,１９９２年）。使用方法：ペプチド治療 ＭＴＳ活性を有するペプチドは、突然変異または欠損ＭＴＳ対立遺伝子を有す る細胞に供給することができる。ＭＴＳ蛋白質の配列を開示する（配列番号：２ 、配列番号：１４および配列番号：１６）。蛋白質は、例えば、知られている発 現 ベクターを用いて、細菌中でｃＤＮＡ配列を発現させることによって産生できる 。別法として、ＭＴＳポリペプチドは、ＭＴＳ-産生哺乳動物細胞から抽出する こともできる。さらに、合成化学の技術を用いてＭＴＳ蛋白質を合成することも できる。いずれかのかかる技術により、ＭＴＳ蛋白質よりなる本発明の調製が提 供できる。該調製物には、実質的に他のヒト蛋白質が含まれていない。このこと は、微生物中またはイン・ビトロにおける合成により最も容易に達成される。 活性ＭＴＳ分子は、例えば、マイクロインジェクションまたはリポソームを使 用することによって細胞に導入できる。別法として、ある種の活性分子も、能動 的または拡散によって、細胞によって取り込まれ得る。ＭＴＳ遺伝子産物の細胞 外の適用は、腫瘍の増殖に十分に影響し得る。ＭＴＳ活性を有する分子の供給は 、新生物状態の部分的な逆転を導くであろう。（例えば、ペプチド、薬剤または 有機化合物のような）ＭＴＳ活性を有する他の分子を用いて、かかる逆転に作用 させてもよい。実質的に同様な機能を有する修飾ポリペプチドもペプチド治療に 用いられる。使用方法：形質転換宿主 同様に、突然変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞および動物を、治療剤として の潜在的可能性性を有する物質を研究し試験するモデル系として用いることがで きる。細胞は、典型的には培養上皮細胞である。これらを、体細胞または生殖系 列のいずれかのＭＴＳ変異を有する患者から単離できる。別法として、該細胞系 は、前記したごとく、ＭＴＳ対立遺伝子に突然変異を有するように設計すること もできる。試験物質を細胞に適用した後に、該細胞の新生物的な形質転換表現型 を測定する。ヌードマウスにおける足場-依存性増殖、腫瘍形成性、細胞の侵入 性、ならびに成長因子依存性を含む、腫瘍形成的に形質転換した細胞のいかなる 特性も評価することができる。これらの各特性のためのアッセイは、当該分野で 知られている。 治療剤試験用の動物は、動物全体を突然変異誘発した後か、または生殖系細胞 もしくは接合子を処理した後に選択できる。かかる処理には、通常は第二の動物 種からの変異ＭＴＳ対立遺伝子の挿入、ならびに崩壊した相同性遺伝子の挿入が 含まれる。別法として、動物の内因性ＭＴＳ遺伝子（群）を、挿入もしくは欠損 突然変異または慣用技術を用いた他の遺伝子変性によって崩壊させてもよい（カ ペッチ（Capecchi）,１９８９年；バランシウス（Valancius）およびスミシーズ （Smithies）,１９９１年；ハスティー（Hasty）ら,１９９１年；シンカイ（Shi nkai）ら,１９９２年；モンバーツ（Mombaerts）ら,１９９２年；フィルポット （Philpott）ら,１９９２年；スノーワート（Snouwaert）ら,１９９２年；ドー ネホウアー（Donehower）ら,１９９２年）。試験物質を動物に投与した後に、腫 瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を阻害または抑制す る場合には、その試験物質は本明細書で同定した癌を治療するための治療剤の候 補である。 本発明は、以下の実施例を参照することにより説明されるが、例示 的な方法によって説明されているのであって、いかなる場合においても本発明を 限定することを意図するものではない。当該分野でよく知られている標準的技術 または以下に特記する技術を用いた。 実施例１ 材料および方法 Ａ．ＭＴＳ家系 図１Ａ〜１Ｄは、それそれ血族３１３７、３１６１、３３５５および１７７１ を示す。該図面には、これらの血族における癌の発生が示されている。血族３１ ３７におけるすべてのメラノーマは感受性ハロタイプを担持する。この血族につ いて、該感受性ハロタイプを担持する他の癌も示されている。血族３１６１およ び３３５５におけるすべてのメラノーマは、感受性ハロタイプを担持する。血族 １７７１における癌について、ＭＴＳ中の変異を同定した。 Ｂ．腫瘍細胞系 ルドビグ・インスティチュート・フォー・キャンサー・リサーチ、メモリアル ・スローン−ケタリング・キャンサー・センター（Ludwig Institute for Cance r Research，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）より７６個のメラノー マ細胞系を得、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Typ e Culture Collection（ATCC））より８個のメラノーマ細胞系および５個の非メラ ノーマ系を得た。 Ｃ．腫瘍細胞系ＤＮＡの調製および分析 約１×１０7個の細胞を３ｍｌの溶菌緩衝液（０.１Ｍ ＮａＣl；０.１Ｍトリ スＨＣl pＨ８.０；５mＭ ＥＤＴＡ；０.５％ＳＤＳ）に加え、ついでボルテッ クスおよびインキュベート（６５℃、３０分間）することにより、細胞系からＤ ＮＡを単離した。０.５ｍｌの８Ｍ ＫＯＡcを加え、該反応液を混合し、氷上で ３０分間インキュベートした。遠心分離（１０,０００×ｇで５分間）した後、 等容量の９５％エタノールで上清を沈殿させ、再度遠心分離した（１０,０００ ×ｇで１５分間）。該ＤＮＡを５０〜２００mlのＨ2Ｏに再懸濁した。 Ｄ．ＰＣＲ反応 ０.１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ ＫＣ １、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％ゼラチンおよび１単位のアンプリタック・ ポリメラーゼ（Amplitaq polymerae）（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer）） を含有する２０ｍｌの反応混合物中の３０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプラ イマーに５０ｎｇの鋳型を加えた。パーキン−エルマー９６００サーマルサイク ラー中、９４℃で１０秒間、５５℃で１０秒間および７２℃で１０秒間、サンプ ルを３５回循環させた。１.５％アガロース（シーケム（SeaKem））または３％ ヌシーブ（NuSieve）３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ（BioProducts ））のいずれかによる電気泳動の後、エチジウムブロミド染色により生成物を可 視化した。 Ｅ．ＹＡＣ 上記のＰＣＲ条件を用いて、ＣＥＰＨ ＹＡＣライブラリーをＩＦＮＡ、Ｄ９ Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６でスクリーニングすることにより、ＭＴＳ領域中に マーカーを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を得た。ＹＡＣを含有する酵母株 を３０℃で３日間、ＡＨＣ培地（１０ｇ／ｌカゼイン加水分解産物−酸；１.７ ｇ／ｌ酵母窒素塩基；５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム；２０ｍｇ／１アデニンヘミサ ルフェート；２％グルコース；ｐＨ＝５.８）中で激しく振盪させて増殖させた 。 オースベル（Ausubel）ら（１９９２）の記載のとおりに酵母ＤＮＡを調製した 。 Ｆ．ファージライブラリーの構築 ＹＡＣ ＤＮＡを含有する酵母ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して完成させ 、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））を 用いてＢａｍＨＩ−消化ＥＭＢＬ３ファージアーム（プロメガ（Promega））に 挿入し、ギガパックIIエクストラクツ（GigapackII extracts）（ストラタジー ン（Stratagene））でインビトロパッケージングした。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株Ｃ６００上でファージを増殖させた。32Ｐ−標識ヒトＣ0t−１ＤＮＡ（ギ ブコ（GIBCO）−ＢＲＬ）でハイブリダイゼーションすることにより、ヒトＤＮ Ａを含有する組換えファージ同定した。ＹＡＣ左または右アームからの配列を含 有するＰＣＲ断片でスクリーニングすることにより、ＹＡＣベクター（エンドク ローン）に結合したヒト配列を含むファージを同定した。標準的な条件下（ミド ルトン（Middleton）ら、１９９１）で、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を 行った。陽性プラークを拾い上げ、再び３回平板培養することにより精製した。 キアエックス（Qiaex）カラム（キアゲン（Qiagen））を用いてファージＤＮＡ を調製した。 Ｇ．コスミドライブラリーの構築 ＹＡＣ ＤＮＡを含有する酵母ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化し、直線 （１０〜４０％）ショ糖勾配上で大きさにより分画した（マニアティス（Maniat is）ら、１９８２に記載のとおりに行う）。製造業者の指示に従い、スーパーコ ス（SuperCos）１コスミドベクター（ストラタジーン（Stratagene））を調製し 、質量比４：１（挿入：ベクター）で挿入ＤＮＡと混合し、リガーゼで処理し、 上記のとおりインビトロパッケージングした。コスミドをＤＨ５α宿主細胞に導 入し、１５ｃｍペトリ皿当たり２０００コロニーの密度で平板培養した。上記お よびマニアティス（Maniatis）ら、１９８２に記載のとおり、コロニーハイブリ ダイゼーションを行った。 Ｈ．Ｐ１クローン ゲノム・システムズ・インコーポレーティッド（Genome Systems，Inc.）（ミ ズリー州セントルイス）から、本明細書中に記載のとおりに調製されたＳＴＳで スクリーニングすることにより、ＭＴＳ領域に及ぶＰ１クローンを得た。アルカ リ溶解（バーンボイム（Birnboim）およびドリー（Doly）、１９７９）、ついで 塩化セシウム勾配遠心分離（マニアティス（Maniatis）ら、１９８２）により、 これらのクローンからのＤＮＡを単離した。 Ｉ．ＳＴＳの作成 Ｐ１ベクター（pSacBII）、スーパーコス（SuperCos）１ベクターまたはＥＭ ＢＬ３ベクターのクローニング部位に隣接する配列に相補性のオリゴヌクレオチ ドで１.０ｍｇのＰ１、コスミドまたは鋳型ＤＮＡを配列決定することにより、 ＳＴＳを作成した。プリズム・レディー・リアクション・ダイデオキシ・ターミ ネーター・サイクル・シークエンシング・キット（PRISM Ready DyeDeoxy Termi nator Cycle Sequencing Kit（ABI）を有するＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡ配列決定シ ステム上で配列決定を行った。２０ｂｐ長に可能な限り近くなり、６０℃に可能 な限り近い融解温度を有するようにＳＴＳを設計した。 Ｊ．メラノーマー傾向血族におけるＭＴＳ１中の生殖系列変異 標準的な方法を用いることにより、キャリヤー個体からのゲノムＤＮＡを血液 から調製した。各サンプルからの２０ｎｇＤＮＡを用いてＭＴＳ１からのコーデ ィングエキソン１または２を、あるいはＭＴＳ２からのコーディングエキソン２ を増幅するためにイントロン位置でプライマーを設計した。ＰＣＲ反応では標準 緩衝液を使用した（ただし、ＤＭＳＯを最終濃度５％になるまで加えた）。該配 列の異なる点に位置したプライマーを使用し、増幅された生成物上でα−Ｐ32− ｄＡＴＰを用いて循環配列決定反応を行った。すべての（Ａ）反応物、ついで（ Ｃ）反応物等を並べて載せることにより、６％変性ポリアクリルアミドゲル上で 該配列決定生成物を分析した。反対の鎖の配列分析によりすべての多形性が確認 された。 実施例２ 遺伝的に連鎖したマーカーを用いるＭＴＳの位置決定 ９ｐ２１領域中のホモ接合欠失について腫瘍細胞系を分析するために、ＭＴＳ に連鎖していることが知られている１組のマーカーを使用した。これらのマーカ ーはもともと、１０個のユタ血族および１個のテキサス血族におけるメラノーマ 素因の劇的な連鎖（ＬＯＤ得点＝１２.７）を示すために使用された（キャノン −アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。該マーカーは、試験した 最も遠位のマーカーであるα−インターフェロン遺伝子クラスター（ＩＦＮＡ） （クウィアトコウスキー（Kwiatkowski）およびディアズ（Diaz）、１９９２） からの配列、近位のマーカー（Ｄ９Ｓ１０４）および両者間の４個の追加マーカ ー（Ｄ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６、Ｄ９Ｓ１６１およびＤ９Ｓ１６９）を含んで いた（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。遺伝的研 究から、該介在マーカーの直線配列はＤ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６、Ｄ９Ｓ１６ １、Ｄ９Ｓ１６９であると考えられた。該ＩＦＮＡマーカーは、野生型ゲノムＤ ＮＡから２個の断片［すなわちポリ（ＣＡ）の広がりを含有する約１３８〜１５ ０ｂｐの多形性断片（ＩＦＮＡ−１）および約１２０ｂｐの非変異断片（ＩＦＮ Ａ−ｓ）］を増幅したオリゴヌクレオチドプライマー対よりなるものであった。 ＩＦＮＡ−１に関するＩＦＮＡ−ｓの位置は不明であった。 欠失を含有すると既に報告されている５個の非メラノーマ腫瘍細胞系を、遺伝 マーカーを用いて分析した。各細胞系は、試験したマーカーの少なくとも１個の ホモ接合欠失を示した（表１）。Ｄ９Ｓ１６１、Ｄ９Ｓ１６９またはＤ９Ｓ１０ ４を使用することによってはホモ接合欠失は全く同定されなかった。これらの欠 失の間の重なりの最小領域は、ＩＦＮＡ−１およびＤ９Ｓ１７１に隣接していた 。これは、これらの２個のマーカーの間の領域が腫瘍抑制、おそらくＭＴＳに関 連した遺伝子を含有することを示唆する。ついで、Ｄ９Ｓ１７１とＩＦＮＡ−１ との間の、特にＩＦＮＡ−ｓに隣接したゲノム領域をさらに詳細に研究した。 実施例３ ＭＴＳ領域におけるゲノムクローン ＩＦＮＡ−ｓを包囲する領域のゲノムクローンを得るために、ＣＥＰＨ ＹＡ Ｃライブラリーをスクリーニングした（コーエン（Cohen）ら、１９９３）。Ｄ ９Ｓ１７１マーカーを含有する１１個のＹＡＣおよびＩＦＮＡ−ｓを含有する５ 個のＹＡＣを同定した。Ｄ９Ｓ１７１およびＩＦＮＡ−ｓの両方を含むＹＡＣは 全く単離されなかった（図２）。ＹＡＣクローン（Ｃ９、Ｃ６、Ｆ９）の３個を ファージ中にサブクローニングし、１個のＹＡＣ（Ｃ６）をコスミドベクター中 にサブクローニングした。これらおよびコスミドクローンは、公知の遺伝マーカ ーに本質的なＳＴＳを生成し下記の染色体歩行を促進する便宜な方法を提供した 。 該領域の近隣のゲノム地図の構築のための独立したゲノムＤＮＡ源を提供し、 ＳＴＳの生成を促進するために、Ｄ９Ｓ１７１へ伸長しているＩＦＮＡ−ｓ、Ｉ ＦＮＡ−ｓにまでさかのぼって伸長しているＤ９Ｓ１７１、および両方向のＹＡ Ｃ Ｃ６末端からのＰ１クローン中で染色体歩行を開始した。この染色体歩行の 一部として合計２７個のＰ１クローンを単離した（図２）。決定されたＰ１は、 ＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１へ２個の間隙を有して伸びる隣接した集合体を形 成した。Ｐ１クローンならびに数個のファージおよびコスミドクローンを使用し てＭＴＳ領域の詳細な構造地図を得た。 実施例４ ＭＴＳ領域の詳細な構造分析 ＭＴＳ領域のより詳細な分子地図を作成するためには追加のマーカーが必要で あった。ゲノムクローンから得られたＤＮＡ配列を用いてＳＴＳについてのＰＣ Ｒプライマーを設計した。これらのＳＴＳは、Ｐ１およびＹＡＣクローンを制御 するのを助けるのに交替して機能した。ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の領 域からの合計５４個のＳＴＳは、ＭＴＳ領域の詳細な物理的地図を展開するため の主要な基礎となった（図２）。これらのＳＴＳプライマー配列は、ゲノム・デ ータベース（Genome Database）に寄託されている。 ＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１に伸長する新しいマーカーの組を用いて、ＭＴ Ｓ領域におけるホモ接合欠失について８４個のメラノーマ細胞系を試験した。合 計５２個の系がホモ接合欠失の領域を示した（図３）。該欠失の幾つかは広範で あり、例えば１３個の系が８１６.７および７６０−Ｌの両方を含む領域を失っ ていた。 ＭＴＳを位置決定するために、最も情報性に富む腫瘍系を２群に分けた（図３ ）。すなわち、ｉ）ｃ５.１の欠失のみを含有するもの（クラス１１）、およびi i）ｃ５.３の欠失のみを含有するもの（クラス１２）に分けた。合計５個のメラ ノーマ系をこれらの区分に分けた。欠失が検出されたすべての場合で、該欠失は 単純であるようであった。すなわち、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の領域 における複数欠失事象の証拠は全くなかった。全体的に、欠失を含む系は、マー カーｃ５.１およびｃ５.３の周囲に集中した欠失重複の領域を示し、これはＩＦ ＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１への領域の完全な物理的地図の展開を不要にする。 実施例５ 含有ＭＴＳとしてのコスミドｃ５およびＰ１コロニーＰ１０６２およびＰ１０６ ３の同定 Ａ．遺伝マーカーの配置 ＹＡＣクローンの分析および腫瘍細胞系中の欠失の分析により、マーカーの遺 伝配置：ＩＦＮＡ、Ｄ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６に一致した結果が得られた。３ 個のＹＡＣはＤ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６の両方を含有していたが、４個の ＹＡＣはＩＦＮＡ−１およびＩＦＮＡ−ｓを含有していた（図２）。Ｄ９Ｓ１７ １およびＩＦＮＡの両方を含有するものはなかった。これは、ｉ）ＩＦＮＡ−１ およびＩＦＮＡ−ｓは深く連鎖していること、およびii）Ｄ９Ｓ１２６およびＤ ９Ｓ１７１は連鎖していることを示唆する。これらの結果は細胞系欠失により確 認された。Ｄ９Ｓ１７１を欠くほとんどの細胞系はＤ９Ｓ１２６をも欠いていた 。反対に、系Ｕ−８７はＤ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６について陽性を示した が、ＩＦＮＡ−ｓおよびＩＦＮＡ−１を欠いていた（表１）。１個のメラノーマ 細胞系、すなわちＳＫ−ＭＥＬ−５は、ＩＦＮＡ−ｓ、Ｄ９Ｓ１７１およびＤ９ Ｓ１２６を欠いていたが、ＩＦＮＡ−１は欠いていなかった。したがって、ＩＦ ＮＡ−１はＩＦＮＡ−ｓに対して遠位にあるに違いない。もう１つのメラノーマ 細胞系であるＳＫ−Ｍｅｌ−Ｚａｎは、ＩＦＮＡ−１、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９ Ｓ１７１を含むがＤ９Ｓ１２６を含まず、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１２６との間に Ｄ９Ｓ１７１が位置する欠失を含有していた。総括的には、これらの知見は表１ に示すマーカーの順序を支持する。 ヒトα−インターフェロン遺伝子ファミリーは２３個を超える遺伝子および染 色体９ｐに位置する擬遺伝子よりなる。この遺伝子クラスターはクローニングさ れ、１０個の連鎖群に分類されている（ヘンコ（Henco）ら、１９８５）。連鎖 群は、神経膠腫細胞系における異なるα−インターフェロン配列の欠失喪失の分 析により、部分的に順序付けされている（オロペイド（Olopade）ら、１９９２ ）。神経膠腫系Ｈ４は、ＩＦＮＡ−１およびＩＦＮＡ−ｓの両方を欠く。また、 それは連鎖群ＩＶ（例、α１３、α６およびα２０）からの配列をも欠く。神経 膠腫 系Ａ１７２はＩＦＮＡ−１および連鎖群ＩＶの両方を含有するが、連鎖群Ｉ（例 、α１、α１９）、III（例、α８）およびIX（例、α２）およびＩＦＮＡ−ｓ からの配列を欠く。この分析は、ＩＦＮＡ−１を、連鎖群Ｉ、IIIおよびIXなら びにＩＦＮＡ−ｓに対して遠位に置く。Ａ１７２欠失の遠位境界は、ＩＦＮＡ− ｓの遠位の１個のＰ１長内にマッピングされる。したがって、連鎖群Ｉ、IIIお よびIXは、ＩＦＮＡ−ｓに対して８５ｋｂ未満の遠位の点に隣接しているに違い ない。 Ｂ．遺伝マーカー間の物理的距離 この結果からは、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の距離の正確な推定をす ることができなかった。なぜなら、両マーカーを含有するＹＡＣを単離すること ができなかったからである。さらに、ＳＴＳによるマッピングに基づけば、ＩＦ ＮＡ−ｓから遠位に伸長する５個のＹＡＣはすべて、Ｄ９Ｓ１７１から近位に伸 長する１１個のＹＡＣのいずれとも重複しなかった。ＣＥＰＨ ＹＡＣ挿入の長 さが平均すると５００ｋｂ未満であると仮定すると、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７ １との間の距離は少なくともこの大きさであると考えられる。 ＩＦＮＡ−ｓとｃ５.１との間の領域は、Ｐ１ライブラリー中の９個の歩行工 程でカバーされた。各工程は平均してＰ１挿入の半分の長さであると仮定すると 、ｃ５.１とＩＦＮＡ−ｓとの間の距離はおよそ４００ｋｂである。したがって 、メラノーマ系においてしばしば欠失しているｃ５.１に堅く連鎖している腫瘍 抑制遺伝子は、ＩＦＮＡ−ｓに対して約４００ｋｂ近位にあるに違いない。 Ｃ．腫瘍系における欠失 ９ｐ２１領域のホモ接合欠失が、試験したメラノーマ腫瘍の５７％で見いださ れた。１４個の腫瘍系が、７６０−Ｌを通って近位側に伸長する欠失を含有し、 １６個の系が、遠位側の８１６.７を超えて伸長する欠失を含有していた。該欠 失が原因となる、すなわち、この領域の遺伝子の欠失が腫瘍表現型に寄与すると 仮定すると、腫瘍抑制遺伝子もまた７６０−Ｌと８１６.７との間に存在するに 違いない。最も小さい欠失はマーカーｃ５.１およびｃ５.３を含んでいた。試験 されたすべてのマーカーのうちで、最大数の系である５１からｃ５.３が欠失し ていた。したがって、腫瘍抑制遺伝子の最も可能性の高い位置はｃ５.３に非常 に近い。なぜなら、それは最も頻繁に欠失しているマーカーであるからである。 ４個の系がｃ５.３（クラス１２）のみの欠失を含有し、１個の系がｃ５.１（ク ラス１１）のみを欠いていた。これらのマーカーの両方は、同じコスミドである ｃ５上の存在していた。したがって、腫瘍抑制遺伝子はコスミドｃ５からの配列 を含むと考えられる。Ｐ１クローンＰ１０６２およびＰ１０６３は、ｃ５および 包囲するコスミド中に見いだされる配列を含む。したがって、以下にさらに示す とおり、Ｐ１０６２およびＰ１０６３は全ＭＴＳ領域を含有する。 上記実施例で得られた結果は、ＩＦＮＡ−１とＤ９Ｓ１２６との間の領域がＭ ＴＳの最も可能性の高い位置であることが判明したＭＴＳの以前の遺伝研究と一 致する（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。最近の 遺伝研究は、Ｐ１−４５２上のＩＦＮＡ−ｓとＣ５.３との間にある多形性（Ｃ Ａ）反復を用いて、ＭＴＳの位置をさらに限定している（図２）。したがって、 ＭＴＳは、メラノーマ細胞系中のホモ接合欠失が集合している領域内に位置する 。 これらの結果は、ｃ５.３の近くのどこかに位置する腫瘍抑制遺伝子座、ＭＴ Ｓがあるという見解を支持する。欠失を含有するすべての系は、欠失がｃ５.１ またはｃ５.３（クラス１１および１２）に制限されている組を除いて、欠失し たＤＮＡの共通の領域を共有する。コスミドｃ５内の細胞系以外の細胞系のこの 区分においては、非重複欠失の兆候は全くなかった。したがって、例えば、ｃ５ .１およびｃ５.３から遠位の９ｐ２１中の第２の腫瘍抑制遺伝子座を含む、より 複雑なスキームを生じさせる基礎は全くない。 ９ｐ２１のホモ接合欠失が複数の腫瘍型で生じるとの観察は、そこに存在する 腫瘍抑制遺伝子が種々の組織で発現され得ることを示唆する。したがって、腫瘍 抑制遺伝子は、複数の型の癌の発生に関与しているかもしれない点でｐ５３遺伝 子に類似しているかもしれない（さらに以下のデータを参照されたし）。メラノ ーマ傾向家族において、他の型の癌が報告されている（ナンカロウ（Nancarrow ）ら、１９９３；バーグマン（Bergman）ら、１９９０）。ｃ５.１およびｃ５. ３を用いる種々の腫瘍型の徹底的な欠失分析（以下に示す）は、メラノーマ以外 の 腫瘍におけるこの腫瘍抑制遺伝子の重要性を明らかにする。 観察されたホモ接合欠失のいくつかは、多数の遺伝マーカーを除去する。ファ ウンティン（Fountain）らは、２個の異なるメラノーマ系における染色体９ｐ２ １のホモ接合欠失は２〜３Ｍｂで伸長していると報告している（バーグマン（Be rgman）ら、１９９０）。この研究において、少なくとも１個の系、ＳＫ−ＭＥ Ｌ−５が、試験した最も遠位のマーカーであるＩＦＮＡ−１からＤ９Ｓ１２６を 越えて（明らかに大きすぎて単一のＹＡＣ上に含有され得ない領域である）伸長 する欠失を含有していた。大きな欠失が優勢であることは、ＭＴＳを包囲する領 域が細胞生存に必須の遺伝子を欠くことを示唆する。 実施例６ ＭＴＳ候補遺伝子の単離 上記実施例では、ＭＴＳの近隣のＹＡＣおよびＰ１染色体歩行の結果を記載し た。ｃ５配列由来のＳＴＳによる詳細な構造−マッピング実験は、５個の異なる メラノーマ細胞系におけるｃ５配列の小さな非重複欠失の存在を示す。この結果 に基づけば、腫瘍抑制遺伝子（おそらくＭＴＳであろう）はｃ５内に少なくとも 部分的に存在するようである。 ｃ５が少なくとも１個の遺伝子を含有するというさらなる兆候は、ｃ５および 近隣コスミドにおける（ＣｐＧ）ジヌクレオチド頻度の分析から得られる。哺乳 動物においては、ほとんどすべてのハウスキーピング遺伝子およびすべての組織 特異的遺伝子の半分近くが、（ＣｐＧ）ジヌクレオチドに異常に富む領域に関連 している（バード（Bird）、１９８９；ラーセン（Larsen）ら、１９９２）。し たがって、かかる「ＣｐＧ島」の存在は遺伝子を暗示する。コスミドｃ５、ｃ１ ２、ｃ５７およびｃ５９を、認識配列が２個の（ＣｐＧ）対を含む酵素である制 限エンドヌクレアーゼＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩおよびＳａｃＩＩで消化した。コス ミドｃ５およびｃ１２のみがこれらの酵素のための部位を含有していた。コスミ ドｃ５は１個のＥａｇＩ部位、少なくとも１０個のＢａａＨＩ部位および少なく とも１２個のＳａｃＩＩ部位を含有していた。ｃ５および重複コスミドｃ１２に おけるＣｐＧ島の存在は、ｃ５が実際に少なくとも１個のＭＴＳの候補遺伝子を 含有することを示唆した。 ＭＴＳを探すために、コスミドｃ５からのＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列を決定 した。これらの配列をジーンバンク（GeneBank）からの配列に対して比較した場 合、ヒトサイクリン依存キナーゼ４（Ｃｄｋ４）阻害剤またはｐ１６をコードす る既に同定されている遺伝子の領域に類似している、ｃ５の２個の別個の領域を 同定した（セラノ（Serrano）ら、１９９３）。これらの２個の遺伝子は、ＭＴ Ｓの候補であり、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２と称された。ＭＴＳ１は染色体９ｐテ ロメアに最も近いコスミドｃ５の末端近くに位置し、ＭＴＳ２はｃ５の動原体末 端の近くに位置していた。図４Ｂを参照されたし。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の位 置ならびにＰ１ １０６２、１０６３および１０６９を示すコスミド地図を図４ Ａに示す。 ｃ５からのＭＴＳ１のゲノム配列のｐ１６ｍＲＮＡ配列との詳細な比較により 、ＭＴＳ１が、ｐ１６コーディング配列の一部分と同一である３０７ｂｐの広が りを含有することが示された。ＭＴＳ１におけるヌクレオチドのこの広がりは、 認識可能なスプライシング部位配列に隣接している。ＭＴＳ１をさらに特徴づけ ると、それはｐ１６および２個のイントロンの全体のコーディング配列を含むこ とが示された（図５Ａおよび５Ｂおよび図６Ａおよび６Ｂ）。イントロン１は、 翻訳開始部位から１２６ｂｐ下流に位置し、イントロン２は翻訳停止部位から１ １ｂｐ上流に位置する。これら２個のイントロンは、ＭＴＳ１のコーディング配 列を３個の領域、すなわち、１２６ｂｐの５'領域（コーディングエキソン１） 、３０７ｂｐの中央領域（コーディングエキソン２）および１１ｂｐの３'領域 （コーディングエキソン３）に分割する。配列番号３は、ＭＴＳ１の５'領域、 エキソン１およびイントロン１の一部分のヌクレオチド配列を記載する。配列番 号４は、ＭＴＳ１のイントロン１の一部分、エキソン２およびイントロン２の一 部分のヌクレオチド配列を記載する。 ＭＴＳ２は、イントロン２へ約２１１ｂｐであるコーディングエキソン２の５ '末端から伸長するｐ１６とほとんど同一のＤＮＡ配列の領域を含有する（図７ Ａ）。 しかしながら、配列類似性は、ＭＴＳ２の最終コドンの位置に対応するＭＴＳ１ におけるイントロン２の５１ｂｐ下流の地点まで減少する（図８）。ＭＴＳ１お よびＭＴＳ２からの配列の比較（図８）は、これら２個の遺伝子の間の配列類似 性も、イントロン１の３'スプライシング部位からおよそ４０ヌクレオチド上流 に伸長していることを示した。したがって、非コーディングＤＮＡの一部分は、 推定コーディングＤＮＡのいくつかの領域より保存的である。コーディングＤＮ Ａにおける配列ダイバージェンスがクローニング人工産物であるという可能性を 除外するために、ＭＴＳ２の配列ダイバージェンス点を横切って特異的に増幅す るためにＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、コスミド、Ｐ１ およびゲノムＤＮＡからの予想された大きさの断片を増幅した。したがって、Ｍ ＴＳ２におけるエキソン２の３'末端の近くに位置する該ダイバージェント配列 は、ボナ・ファイド（bona fide）ゲノム配列である。配列番号５は、ＭＴＳ２ のイントロン１の一部分、「エキソン２」および「イントロン２」のヌクレオチ ド配列を記載する。配列番号１５は、ＭＴＳ２のｃＤＮＡ配列を記載する。 コスミドｃ５上の２個の深く関連した遺伝子の出現は、他の関連した遺伝子が この領域に存在することを示唆する。この可能性を調べるために、コスミドｃ５ 、Ｃ１２、ｃ５９、ｐ１ １０６３および１０６０およびヒトゲノムＤＮＡの制 限酵素消化物からサザンブロットを調製した。これらのブロットを、ＭＴＳ２と 共有する領域を含む、ＭＴＳ１からのエキソン２のほとんどを含有する断片でプ ローブした。２個のＥｃｏＲＩ断片を、クローニングされたＤＮＡおよびゲノム ＤＮＡの両方においてプローブで検出した。この結果は、ゲノム中の２個のｐ１ ６様遺伝子であるＭＴＳ１およびＭＴＳ２の存在と一致した。また、それは、今 や公知の、ＭＴＳ１含有エキソン２および３（しかしＭＴＳ１のエキソン１では ない）の代替型であるＭＴＳ１Ｅ１βの存在と一致する。 実施例７ ＭＴＳ１Ｅ１βの単離および構造 ＭＴＳ１Ｅ１βの単離 完全ＭＴＳ１ｃＤＮＡをプローブとして用い、通常のｃＤＮＡライブラリース クリーニングにより、ハイブリッド選択によりＭＴＳ１Ｅ１βを含有するクロー ンを単離した。通常のｃＤＮＡライブラリースクリーニングは、ＭＴＳ１のエキ ソン２由来のプローブを用いて行った。胎児脳、正常な乳房およびリンパ球由来 ライブラリーのそれぞれから百万個のクローンをスクリーニングした。ハイブリ ダイズｃＤＮＡクローンをリンパ球ライブラリーから単離した。該クローンを配 列決定し、Ｅ１βを含有することが示された。また、それはＭＴＳ１のエキソン ２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）を含有していた。卵巣組織由来のｃＤＮＡ をコスミドｃ５とインキュベートすることにより、ハイブリッド選択由来ｃＤＮ Ａクローンを単離した。該コスミドをビオチンで標識し、一本鎖にした。ｃ５と 該ｃＤＮＡとの間のハイブリッドを形成させ、ついでストレプトアビジンで被覆 された磁気粒子を用いて、ビオチニル化コスミドを捕らえた。選択されたｃＤＮ Ａを該コスミドから溶出し、ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定し た。該ｃＤＮＡクローンは、Ｅ１β、Ｅ２およびＥ３を含有する点で、ライブラ リースクリーニングにより単離されたものと類似していた。該クローンはいずれ も、上記のエキソン１（配列番号３参照）を含有していなかった。ＭＴＳ１Ｅ１ β ｃＤＮＡの配列は配列番号１３に記載されている。ＭＴＳ１Ｅ１βの構造 ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βは２個の形態、すなわち、共にエキソン２およ び３を利用するが異なる最初のエキソンを有する２個の形態の単一の遺伝子であ る。ＭＴＳ１は、ＭＴＳ１によりコードされるｐ１６タンパク質の最初の４３個 のアミノ酸をコードするα形態（Ｅ１α）を含有する。ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキ ソン１のβ形態（Ｅ１β）を含有する。ｐ１６遺伝子のエキソン構造は、複合ｃ ＤＮＡクローンの配列を、それが由来するゲノム領域と比較することにより決定 した（図１３）。ゲノムサザン、Ｐ１６を含有するゲノム領域の配列分析、およ び長ＰＣＲを組み合わせて使用して、Ｐ１６エキソンの位置をマッピングした（ 図１３）。ｐ１６遺伝子はゲノムＤＮＡの約３０ｋｂにわたる。Ｅ１βは、最も ５'側のエキソンであり、その順序はＥ１β、Ｅ１α、Ｅ２およびＥ３である。 ｐ１６読み枠（エキソン２および３をコードするｐ１６で用いられる読み枠か ら推定された）におけるＥ１βの翻訳は、Ｅ１βとＥ２との間のスプライシング 部位のわずか１０コドン上流に位置する枠内停止コドンを示した。停止コドンの 位置はゲノムおよびｃＤＮＡ配列分析により確認された。この停止の下流の最初 の潜在的な開始コドンは、Ｅ１／Ｅ２スプライシング部位のちょうど３'側のｐ １６読み枠にあった。この潜在的な開始コドンは、共通コザック（Kozak）配列 （コザック（Kozak）、１９８７）によくは似ていない配列に隣接している。ｐ １６読み枠で翻訳されれば、ｐ１６遺伝子のＥ１β転写物は１０５個のアミノ酸 のタンパク質をコードするであろう。 βｃＤＮＡの追加的分析によれば、それが、ｐ１６をコードするのに使用され るものより大きなＯＲＦを異なる枠内に有することが示された。該ＯＲＦ（ＯＲ Ｆ２と称する）はＥ１βを通って伸長し、Ｅ２内への６７個のアミノ酸について 伸びている。全体のＯＲＦは１８０個のアミノ酸のタンパク質をコードする。し かしながら、読み枠はＥ１βの５'末端で開いたままであり、したがって不完全 であるかもしれない。統計学的分析は、この大きさのＯＲＦはランダム配列（Ｐ ＝０.００３）よりなるＤＮＡ中では偶然には生じそうにないことを示唆した。 しかしながら、β転写物の基本組成が与えられれば、可能性はより高くなった（ Ｐ＝０.１６）。予想ポリペプチドはいずれの上記タンパク質とも類似していな かった。 Ｅ１βの進化上保存されている部分を同定することは、その機能にどの配列が 重要であるかの手掛かりを与えるであろう。ハイブリッド・キャプチャー（Hybr id Capture）ＲＡＣＥ（ＨＣＲ）と称される修飾ＲＡＣＥ技術（実施例１２参照 ）によりマウスｐ１６ｃＤＮＡを単離し、ヒトｐ１６ｃＤＮＡと比較した。１つ の型のマウスＰ１６ｃＤＮＡの（β型）は、ヒトＥ１βと等価のエキソンおよび Ｅ２等価体を有していた。第２の型（α型）のものは、Ｅ２に結合したＥ１α等 価体を含有していた。Ｅ１αおよびＥ２マウスエキソンは、それらのヒト相当物 に対して７０％同一であった。マウスのヌクレオチド配列およびヒトＥ１βエキ ソンは５１％同一であり（図１４）、該マウスＥ１βエキソンもｐ１６をコード す るのに使用される読み枠内に停止コドンを含有していた。停止コドンのヌクレオ チド配列５'から推定されるヒトおよびマウスポリペプチドは、完全に分岐して いた。したがって、ｐ１６読み枠内の停止コドンは配列決定人工産物ではないよ うである。 Ｅ１βの役割に関して不明確であったので、本発明者らは全３個の読み枠内の マウスとヒトβ転写物との間の類似性について分析した。マウスおよびヒトβ転 写物は、ｐ１６をコードするのに使用されるもの（ＯＲＦ１）より大きなＯＲＦ （ＯＲＦ２）を異なる読み枠内に含有していた。ＯＲＦ２によりコードされる推 定ポリペプチドは４０％同一であった。しかし、ＯＲＦ２ペプチドの比較をＥ１ βによりコードされる部分に限定すると、それらは２８％同一であるにすぎなか った。これとは対照的に、マウスおよびヒトｐ１６配列は６７％同一であった。 また、Ｅ２に含有されたＯＲＦ２から推定されたポリペプチドは、Ｅ２内の第３ の読み枠（ＯＲＦ３）から推定されたポリペプチドと同様（４２％）に類似して いた。これらの結果から、ＯＲＦ２は選択的に維持されず、おそらくタンパク質 をコードしないことが示唆される。ヒトおよびマウスβＲＮＡの二次構造につい ても比較した。著しい類似性は全く確認されなかった。まとめて言うと、これら の結果が示唆するところによれば、β転写物はマウスおよびヒトの両方における その存在により、Ｐ１６機能に必要であり、それが翻訳されるならば、コード化 タンパク質はおそらくエキソン２中の最初のメチオニンから開始するであろう。 実施例８ ＭＴＳ１における生殖系列変異 ＭＴＳ１またはＭＴＳ２が遺伝感受性遺伝子座であるＭＴＳに対応するか否か を調べるために、ＭＴＳ素因対立遺伝子を担持すると考えられる８個の個体から ゲノムＤＮＡを分析した（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１ ９９２）。ＭＴＳ１またはＭＴＳ２のいずれかに特異的なイントロン配列由来の オリゴヌクレオチドプライマー（表２）を用いて、該エキソンからのＤＮＡ配列 を各サンプルから増幅した。 プライマー１Ｆおよび１１０８Ｒを用いてＭＴＳ１のエキソン１を増幅し、つ いでプライマー１１０８Ｒを用いて配列決定した。プライマー４２Ｆおよび５５ １Ｒを用いてＭＴＳ１のエキソン２を増幅し、ついでプライマー４２Ｆおよび５ ５１Ｒを用いて配列決定した。プライマー２１Ｆおよび５０Ｒを用いてＭＴＳ２ のエキソン２を増幅し、プライマー８９Ｆおよび５０Ｒを用いて再増幅し、つい でプライマー８９Ｆおよび５０Ｒを用いて配列決定した。 これらのゲノム断片のＤＮＡ配列は、該８個体のうちの２個体において多形性 を示した。残りのサンプルのいずれにおいても多形性は存在しなかったが、これ はそれが該集団に共通でないことを示唆するものである。多形性がＭＴＳ染色体 に連鎖し残りの相同染色体には連鎖していないことを示すために、各血族からの 素因対立遺伝子を担持する他の個体からのゲノムＤＮＡを分析した。それぞれの 場合において、多形性は、ＭＴＳ素因対立遺伝子と分離していた。コドン９３の 変異（ｇｌｙ→ｔｒｐ）が血族３０１２の個体（１２８２１）に見いだされた。 また、それは影響を受けたキャリアー兄弟姉妹（１３１８３）および影響を受け ていないキャリアーいとこ（１４９１７）においても見いだされたが、影響を受 けていない非キャリアー兄弟姉妹（１３１８４）では見いだされなかった。コド ン１１８における変異（ｖａｌ→ａｓｐ）は、血族１７７１における個体（１５ ６３５）で見いだされた。また、それは一旦除かれた影響を受けたキャリアーの 最初のいとこ（１０２０５）、影響を受けたキャリアーの最初のいとこ（１１４ １４）および1０２０５の影響を受けたキャリアーの最初のいとこ（１０１４６ ）においても見いだされたが、１０２０５の影響を受けていない非キャリアーの おじ（１０１２０）では見いだされなかった。 該多形性は、アミノ酸変化を起こす単一ヌクレオチド置換であった（表３）。 該置換は、小さな親水性残基を大きな疎水性残基に置換すること、または中性ア ミノ酸を荷電アミノ酸に置換することのいずれかを含むものであった。 ＭＴＳ２からのエキソン２は、試験した８個のサンプルにおいて多形性を全く 示さなかった。これは、少なくともこの組の血族においては、ＭＴＳ２がメラノ ーマの素因とならないことを示唆する。ＭＴＳ１との類似性に基づくと、ＭＴＳ ２は他の型の癌に含まれている可能性がある。また、ＭＴＳ２が非機能性遺伝子 である可能性もある。 メラノーマの素因がある個体におけるＭＴＳ１（ＭＴＳ２でなく）における生 殖系列変異の知見は、メラノーマホモ接合欠失の分析と一致する。 実施例９ 腫瘍系におけるＭＴＳの存在の分析 複数の腫瘍型における９ｐ２１での高頻度の欠失のため、１２個の異なる型の 腫瘍から由来する細胞系をＭＴＳ１の存在または非存在について分析した。該遺 伝子を横切って広がる一組の配列標識部位（ＳＴＳ）を用いて、期待される断片 の存在または非存在について腫瘍細胞系からのゲノムＤＮＡを試験した（図４Ａ ）４Ｂおよび９）。この研究の結果は、ＭＴＳ１が大部分の腫瘍系から欠失して いることを示唆する（表４）。ホモ接合欠失は、結腸および神経芽腫細胞系以外 の試験したすべての腫瘍型において生じ、欠失の割合は最低値である肺癌および 白血病における２５％から星状細胞腫における９４％へ変化した。全体では、ホ モ接合欠失は試験した２９０個の細胞系のうちの１３５個で検出された。該分析 に使用したＳＴＳは全体の遺伝子に及ばないため、この数字は、欠失を有する腫 瘍系の割合の最小推定値を与える。このような訳で、ある小さな欠失が検出され なかったのであろう。また、このアプローチでは、少数のヌクレオチドの挿入ま たは欠失、ヌクレオチド置換のような損傷が見逃されるのであろう。 ＭＴＳ１変異を含有する細胞系の合計数の評価を向上させるために、ＭＴＳ１ における損傷について、ＭＴＳ１の明らかなホモ接合欠失を受けていない３４個 の細胞系をより詳細に調べた。ＭＴＳ１コーディング配列の約９７％よりなる配 列を増幅し、多形性についてスクリーニングした。３４個のメラノーマのうちの １４個に分布する、ＭＴＳ１のエキソン２またはエキソン１における１８個の体 細胞変異を観察した（表５）。これらの変異のうちの３個がフレームシフトであ り、７個がナンセンス変異であり、４個がミスセンス変異であり、４個がサイレ ントであった。また、サイレント変異を含有する４個の系のうちの３個がさらに 変異を含有し、１８個の変異のうちの１６個はコーディングエキソン２に位置し ていた。１個の系の他はすべて専ら半接合またはホモ接合多形性を含有していた が、これは残りの相同染色体が欠失を受けていることを示唆する。ヘテロ接合で ある単一系は２個の異なる非サイレント変異を含有していたが、これは各相同染 色体が独立した変異事象を受けているという見解と一致した知見である。このＤ ＮＡ配列およびＭＴＳ１の欠失分析に基づき、最小で７５％のメラノーマ系が変 異ＭＴＳ１を含有し、両相同染色体からの遺伝子を失っていた。 ＭＴＳ１における損傷（欠失およびヌクレオチド置換）の優位性は、ＭＴＳ１ または密接に連鎖した遺伝子座が腫瘍表現型に寄与していることを示す。これら の損傷を受ける細胞は、そうでない細胞に対する選択的な優位を享有する。損傷 が細胞増殖に無関係な無作為な事象であるという代替的な説明は、種々の理由の ために不可能と思われる。第１に、腫瘍表現型とＭＴＳ１における変異との間の 深い相互関係は、ＭＴＳ１変異と腫瘍形成との間の因果関係を暗示する。第２に 、ＭＴＳ１はメラノーマに対する感受性に影響を与え、したがって腫瘍抑制遺伝 子として独立して関連している。第３に、Ｃｄｋの強力な阻害剤としてのｐ１６ の生化学的機能は、一般的なＤＮＡ複製の開始の阻害剤としてｐ１６がインビボ で作用するモデルにうまく適合する。 ＭＴＳ１の変異または喪失が培養中の細胞増殖の産物である可能性がある。し かしながら、高い割合の一次白血病細胞もまた、ＭＴＳ１から５００ｋｂ未満に 位置する遺伝子ファミリーである（ディアズ（Diaz）ら、１９９０）α−インタ ーフェロン遺伝子クラスターのホモ接合欠失を含有する。先の欠失研究は、α− インターフェロン遺伝子の欠失が、ＭＴＳ１を越えて動原体まで伸長するマーカ ーを例外なく含むことを示唆する（ウイーバー（Weaver）−フェルドハウス（Fe ldhaus）ら、１９９４）。ＭＴＳ１領域のホモ接合欠失は一次腫瘍細胞および培 養細胞系中に生じるため、腫瘍細胞系中で観察される欠失が培養中の細胞増殖の 人工産物である可能性はないと思われる。それでも、腫瘍発達のＭＴＳ変異がい つ生じるかという疑問は、一次腫瘍サンプルを分析することにより最もうまく解 明されるであろう。ＭＴＳ１のインビボでの役割 すべての真核細胞では、細胞分裂は、ＤＮＡ合成が開始するＧ１からＳへの推 移、および有糸分裂が開始するＧ２からＭへの推移の２個の臨界決定点の通過を 要する。哺乳動物では、細胞分裂を制御する機構は複数の構成要素を有し、その 多くは関連している（検討のためにはシェール（Sherr）、１９９３を参照され たし）。該ＣｄｋはＧ１からＳへの及びＧ２からＭへの推移を起こすいくつかの 鍵基質をリン酸化により制御するため、該Ｃｄｋは制御装置の中心部にあるかも しれない。Ｇ１からＳへの推移は、細胞周期の最初に起こるため、おそらく最も 臨界的な決定点であろう。これまで、Ｇ１からＳへの制御に関与しているかもし れない４個の型のＣｄｋ（Ｃｄｋ２〜５）、およびこれらのＣｄｋの一組の正の 調節体（サイクリンＣ、Ｄ１〜３、Ｅ）が定義されている。また最近、ｐ１６、 ｐ１５、ｐ１８、ｐ２０、ｐ２１およびｐ２７を含むいくつかの負の調節体が同 定されている（シオン（Xiong）ら、１９９３；セラノ（Serrano）ら、１９９３ ；グ（Gu）ら、１９９３；エル−ダイアリー（El-Diery）ら、１９９３；ハーパ ー（Harper）ら、１９９３；ハノン（Hannon）およびビーチ（Beach）、１９９ ４；ポリアック（Polyak）ら、１９９４ｂ；トヨシマ（Toyoshima）およびハン ター（Hunter）、１９９４；グアン（Guan）ら、１９９５）。これらの負の調節 体は、ＣＤＫのキナーゼ活性を阻害することにより作用するようである。細胞周 期調節体のいくつかはヒトの癌に関連している（検討のためにはハンター（Hunt er）およびパインズ（Pines）、１９９４を参照されたし）。ｐ２０はＣｄｋ２ およびおそらく他のＣｄｋを阻害し、一方、ｐ１６（ＭＴＳ１、ＣＤＫＮ２また はＩＮＫ４ａとも称される）はＣｄｋ４を阻害するが、明らかにインビトロ検定 ではＣｄｋ２を阻害しない（セラノ（Serrano）ら、１９９３）。インビトロ研 究およびｐ５３とのその相互作用に基づき、ｐ２１はすべてのＣｄｋの一般的な 阻害剤であると提案されている（シオン（Xiong）ら、１９９３）。したがって 、インビトロでは、ｐ１６はｐ２１より特異的であるようである。これらの阻害 剤のそれぞれは、Ｓ相へ入るのに拮抗すると予想される。また、シクリンＤ１ま たはＣＤＫ４は、いくつかの乳癌において過剰発現され、ｐ１６遺伝子は多数の 細胞系および一次腫瘍において変異または欠失を受ける（バックリー（Buckley ）ら、１９９３；カルダス（Caldas）ら、１９９４；カンブ（Kamb）ら、１９９ ４ｂ；モリ（Mori）ら、１９９４；タム（Tam）ら、１９９４ａ）。これらの結 果は、あるサイクリンおよびＣＤＫがプロトオンコジーンであり、Ｐ１６（ＭＴ Ｓ１）が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。ｐ１５、ｐ１８、ｐ２１および ｐ２７の生化学的挙動はそれらもまた腫瘍抑制剤であり得ることを示すが、腫瘍 または細胞系におけるそれらの遺伝子の詳細な変異分析は報告されていない。こ こに示した結果は、ＭＴＳ１が細胞分裂の阻害剤としてインビボで機能するとい う証拠を提供する。 ヒト染色体９の９ｐ２１断片に位置するｐ１６遺伝子（ＭＴＳ１）は、幾つか の型の腫瘍および腫瘍由来細胞系の高い割合で変異またはホモ接合的欠失を受け ているため特に興味深い（キャルダス（Caldas）ら、１９９４；カンプ（Kamp） ら、１９９４ｂ；モリ（Mori）ら、１９９４；ノボリ（Nobori）ら、１９９４） 。また、９ｐ２１連鎖メラノーマ感受性を担持することが知られているいくつか の血族においては、ＭＴＳ１変異はメラノーマの素因と分離する（ハスシアン（ Hussussian）ら、１９９４；カンブ（Kamb）ら、１９９４ａ）。しかしながら、 ＭＴＳ１の遺伝および散発性癌における役割に関して未解決の疑問がある。９ｐ ２１マーカーについて高いＬＯＤ得点を有するいくつかのメラノーマ傾向血族は 、ＭＴＳ１コーディング配列における変異を示さない。また、腫瘍および細胞系 におけるＭＴＳ１ホモ接合欠失の優勢は腫瘍抑制遺伝子不活性化については例外 的であり、癌形成に関与しているＭＴＳ１近傍のもう１つの遺伝子の存在を暗示 する。 最近の報告は、いくつかのマイトジェンおよび抗マイトジェンシグナルが、Ｃ ＤＫ阻害剤の活性を調節することにより少なくとも部分的に、細胞周期に影響を 与えることを示唆する（フィルポ（Firpo）ら、１９９４；ハノン（Hannon）お よびビーチ（Beach）、１９９４；カトウ（Kato）ら、１９９４；ポリアック（P olyak）ら、１９９４ａ；スリンガーランド（Slingerland）ら、１９９４）。例 えば、ＴＧＦβ誘導細胞周期停止は、ｐ１５およびｐ２７の活性化により仲介さ れているかもしれない。逆に、ｐ２７は休止Ｔリンパ球のＩＬ−２誘導マイトジ ェン活性化の間、負に調節されているかもしれない。ＭＴＳ１の調節については 割合にほとんど知られていない。多数の最近の報告は、ＭＴＳ１値がある程度は Ｒｂタンパク質により調節されているかもしれないという証拠を提供する（セラ ノ（Serrano）ら、１９９３；リー（Li）ら、１９９４ａ；タム（Tam）ら、１９ ９４ｂ；パリー（Parry）ら、１９９５）。これらおよび他の知見（セラノ（Ser rano）ら、１９９５）は、ＭＴＳ１がＣＤＫ４／６を阻害し、それによりＲｂの リン酸化を抑制するＭＴＳ１作用のモデルに寄与している。Ｒｂは今度はＭＴＳ １の値を限定するフィードバック回路に寄与している。 これらの結果は、細胞周期の制御におけるＭＴＳ１の卓越した役割についての 遺伝的証拠を提供する。また、この結果は、ＭＴＳ１のインビボでの標的が腫瘍 発生の主要因であることを示唆する。ＭＴＳ１がＣｄｋ２でなくＣｄｋ−４をイ ンビボで阻害するならば、Ｃｄｋ４は癌遺伝子の有力な候補であるかもしれない 。ＭＴＳ１遺伝子中の変異の優勢は、Ｃｄｋ４が、ほとんどの（すべてというわ けではない）細胞の細胞分裂の一般的な活性化因子として作用していることを暗 示する。さらに、ＭＴＳ１の異なるＣｄｋに対する影響の生化学的研究は、正常 細胞および形質転換細胞の両方におけるＣｄｋ活性の階層を明確にするのに役立 つかもしれない。ｐ１６から類推して、ｐ２１がＣｄｋの一般的な阻害剤として 作用するならば、大部分の腫瘍においてその遺伝子は喪失または変異しているか もしれない。 ＭＴＳ１がほとんどの正常細胞で活性な一般的な腫瘍抑制剤であるならば、Ｍ ＴＳ１における生殖系列変異はメラノーマ以外の癌の素因となると予想されるで あろう。例えば、リー−フラオメニ（Li-Fraumeni）症候群で見られるようなｐ ５３における生殖系列変異は、小児肉腫、乳癌を含む多数の腫瘍型の可能性を増 加させる（マルキン（Malkin）ら、１９９０）。先の研究で、メラノーマにかか りやすい幾つかの家族において異常に高頻度の膵臓癌が見いだされている（バー グマン（Bergman）ら、１９９０；ナンキャロウ（Nancarrow）ら、１９９３）。 この観察は、ＭＴＳ１のホモ接合欠失が膵臓腫瘍系で生じるという知見と一致す る。ＭＴＳ１素因の遺伝的特徴は、ＭＴＳ１の体細胞の遺伝的特徴と相違する。 例えば、ＭＴＳ１を包囲する領域から多数キロベースのＤＮＡを除く大きな欠失 は、選択的な欠点のため、ヒト遺伝子プールから喪失しているかもしれない。し かしながら、かかる欠失は形質転換された体細胞では有利に働くかもしれない。 おそらく、それが複数の遺伝子を除去するからであろう。この可能性は、ＭＴＳ ２と称される、ＭＴＳ１に対して著しい類似性を有する第２遺伝子の存在と一致 している。ＭＴＳ２はＭＴＳ１のエキソン１のおよそ１２ｋｂ上流に位置し、Ｍ ＴＳ２の第１のエキソンは、ＭＴＳ２の第２のエキソンのおよそ２．５ｋｂ上流 にある。ＭＴＳ２はＭＴＳ１と同様に機能しているのかもしれない。ＭＴＳ１お よびＭＴＳ２の両方を除去する欠失は、一方の遺伝子を単独で不活性化する変異 より大きな、細胞に対する増殖利点を付与するのであろう。あるいは、その２個 の異なる遺伝子は、非重複的または部分重複的な組の細胞型において機能してい るのかもしれない。これらの可能性についての完全な解明が待たれる。 実施例１０ ＭＴＳ１Ｅ１βの変異分析 腫瘍由来細胞系においてＰ１６を不活化するホモ接合性欠失およびＰ１６にて 変異を示さない９ｐ２１結合のメラノーマ傾向にある血族が共に優勢であること により、Ｐ１６付近に癌形成にも関与する別の遺伝子の存在が提案されることと なった（Cairnsら、１９９４；Spruckら、１９９４）。Ｅ１βが細胞増殖の調整 に関与するタンパク質をコードするならば、その場合、これらの配列は、初期の 研究にて見逃されていたであろう散在性および／または家族性癌のいずれかにて 変異を有しうる。そこで、Ｅ１βを、種々の腫瘍に由来する細胞系にて、および いくらかメラノーマ傾向にある血族にて変異についてスクリーンした。 メラノーマ傾向の血族の遺伝特性が既に報告されている（Cannon-Albrightら 、１９９２）。ゲノムＤＮＡのメラノーマ傾向の血族（Kambら、１９９４ａ）お よび細胞系（Liuら、１９９５）からの単離が既に記載されている。Ｅ１βにつ いてのＰＣＲ増幅を、前進性プライマー（５'−ＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧ Ｇ−３' 配列番号３３）および復帰性プライマー（５'−ＧＧＣＴＡＧＡＧＧＣ ＧＡＡＴＴＡＴＣＴＧＴ−３' 配列番号３４）を用い、以下の条件：９７℃で３ 秒間、６５℃で１０秒間、７５℃で２０秒間で３０サイクル行った。増幅反応体 を１００倍に希釈し、同一の前進性プライマーおよび復帰性プライマー（５'− ＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧ−３' 配列番号３５）を用い、同 一反応条件下で再び増幅させた。ＰＣＲ産生物を１％アガロースゲル上に置き、 キアゲン・ビーズ（Qiagen bead）（Qiagen,Inc.）を用いて抽出した。該産生物 をサイクリスト・シーケンシング・キット（Cyclist Sequencing kit）（ストラ タゲン（Stratagene））を用い、前記した前進性プライマー（配列番号３３）で 配列決定を行った。 ４種の腫瘍（表６）に由来する一連の２４細胞系にて、または影響を受けた家 族構成員の間で共有する有意なハプロ型を有する６人のメラノーマ血族にて、Ｅ １βの配列変異体は全く検出されなかった（Cannon-Albrightら、１９９２）が 、以前の研究においてＰ１６変異を示さなかった（Kambら、１９９４ａ）。これ らの実験は、Ｅ１βの変異が腫瘍進行の間での共通事象ではなく、それら変異が これらの血族における９ｐ２１結合メラノーマ感受性に関与しないことを示唆す る。 実施例１１ ＭＴＳ２の変異スクリーニング 細胞系におけるＭＴＳ２変異スクリーニング 腫瘍由来細胞系にてＭＴＳ１を除去するホモ接合性欠失が優勢であることは、 腫瘍形成にも関与する、ＭＴＳ１の付近にて別の遺伝子または複数の遺伝子が存 在することを示唆する。ＭＴＳ２遺伝子が散在性癌に関与しているならば、それ は腫瘍源の細胞系にて変異を有するかもしれない。そこで、ＭＴＳ２コーディン グ配列を一連の腫瘍細胞系における変異についてスクリーンに付した。 ＭＴＳ２のエクソン１および２についてのＰＣＲ増幅をKambら（１９９４ａ） の記載に従って行った。プライマー対の２Ｅ１.Ｆ１（５'−ＡＧＧＧＡＡＧＡＧ ＴＧＴＣＧＴＴＡＡＧ−３' 配列番号１９）および２Ｅ１.Ｒ２（５'−ＡＧＡＣ ＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣ−３' 配列番号２０）を用い、エクソン１を 得た。プライマー対８９Ｆ（配列番号１２）および５０Ｒ（配列番号１１）を用 いてエクソン２を得た。増幅後、ＤＮＡ産生物を１％アガロースゲル上に置き、 キアゲン・ビーズ（Qiagen bead）（キアゲン・インコーポレイテッド（Qiagen, Inc.））を用いて抽出した。該産生物をエクソン１についてプライマー２Ｅ１. Ｆ１およびエクソン２について８９Ｆおよび５０Ｒで、サイクリスト・シーケン シング・キット（ストラタゲン）を用いて配列決定した。 ＭＴＳ２コーディング配列を、嚢、グリオーム、アストロサイトーム、肺、腎 臓およびメラノーマ腫瘍からの一連の細胞系における変異についてスクリーンし た。これらの細胞系はすべて、高頻度でＭＴＳ２およびＭＴＳ１のモノ接合性欠 失を有した（Kambら、１９９４ｂ）。メラノーマ、肺、腎臓および嚢の癌腫由来 の細胞系は、ＭＴＳ１にて点またはフレームシフト変異を有することが明らかに された（Liuら、１９９５）。しかし、グリオームおよびアストロサイトームの 細胞系がこのようなＭＴＳ２変異を有することは明らかにされていない。これら のスクリーニング実験にて用いられる個々の細胞系は、以前に、ＭＴＳ２および ＭＴＳ１配列のモノ接合性欠失を有することが明らかにされていない群より選択 した（Kambら、１９９４ｂ）。 ＭＴＳ２変異は、スクリーンされた５８細胞系のうちいずれの細胞系のＭＴＳ ２コーディング配列においても見られなかった（表７参照）。これらの型の細胞 系におけるＭＴＳ１の前の実験に基づいて、そのセットは、嚢、メラノーマ、肺 および腎臓群に限定して、約８のＭＴＳ１変異を有すると考えられる（Liuら、 １９９５）。かくして、ＭＴＳ２における体細胞変異についての証拠は、この一 連の腫瘍細胞系からは得られなかった。 血族におけるＭＴＳ２変異スクリーニング ＭＴＳ１コーディング配列変異を有しない９ｂ２１結合のメラノーマ傾向の血 族において、ＭＴＳ２遺伝子がメラノーマ感受性を説明する可能性のあることは 興味のあることである。メラノーマ傾向にある血統の遺伝特徴が既に報告されて いる（Cannon-Albrightら、１９９２）。家族構成員のゲノムＤＮＡを標準技法 （Kambら、１９９４ａ）を用いて全血より分離したリンパ球から単離した。メラ ノーマにかかりやすい９ｐ２１結合の素因について高ＬＯＤ評点を有するが、前 の研究にてＭＴＳ１変異を示さなかった６人の血族にて、前記したように、ＭＴ Ｓ２コーディング配列の変異についてスクリーニングを行った（表８参照）（Ka mbら、１９９４ａ）。ＭＴＳ２における変異は見られなかった。これらの実験は 、ＭＴＳ２病変が遺伝性メラノーマに関与するという証拠を提供しないが、その ような可能性は単にこれら限定された実験を基礎とするだけで除外できるもので はない。 実施例１２ ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βのＲＮＡの発現 ２種のＰ１６プロモーター ２つの異なる形態のＰ１６ ｍＲＮＡが２通りの方法にて生成できた。転写を 異なるプロモーターより開始するか、またはｍＲＮＡを単一のプロモーターより 誘導し、ついで交互にスプライスし、異なる形態の転写物を生成した。 α転写物およびβ転写物の個々のプロモーターについての証拠が、上流にある Ｅ１β配列が欠失されると同時に、α形態が細胞系にて転写されることを測定す ることで得られた。細胞系Ａ３７５およびＳＫ-mel９３は、Ｅ１αとＥ１βの間 の１つの破壊点で欠失を有した（図１３）。近位にある破壊点はいずれの細胞系 においても正確にはマップされていないが、Ｅ１βの５'末端の上流少なくとも ８５ｋｂであった。α−特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うと、これ ら細胞系は共にα転写物を発現することが明らかにされた（図１５）。ＲＴ−Ｐ ＣＲの操作は以下のとおりである：ｃＤＮＡをＴ細胞、細胞系またはヒト組織（ Clontech）から単離した全ＲＮＡ（Sambrookら、１９８９）より合成した。ｃＤ ＮＡ反応はランダムな９ｍｅｒを用い、ＤＮＡ合成およびSuperscriptII逆トラ ンスクリプターゼ（Bethesda Research Laboratories）をプライムした。α−32 Ｐ−ｄＡＴＰ（Amersham）（０.１Ｃi／ミリモル）を合成反応に用い、最終産生 物に取り込まれた放射活性なヌクレオチドの量を測定することによりｃＤＮＡ収 量を算定した。Ｐ１６αおよびＰ１６βの転写物レベルを、連続する２ラウンド の増幅にてＥ２由来のαまたはβ特異的前進性プライマーまたはヘミネスト復帰 性プライマーを用い、ＰＣＲにより分析した。最初の増幅にて、２ｎｇのｃＤＮ Ａをα−特異的プライマーＡＳ.１（５'−ＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴ ＡＣＧ−３' 配列番号２６）またはβ−特異的プライマーＢＳ.１（５'−ＴＡＣ ＴＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＴＣＴＡ−３' 配列番号２７）およびＸ２.Ｒ１４ ０'（５'−ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ−３' 配列番号２２）で増幅さ せた。反応を、以下の反応条件下：９７℃で３秒間；６５℃で１０秒間；７５℃ で２０秒間、２０サイクル、パーキン−エルマイヤー９６００熱サイクラー上で 行った。これらの反応物を１００倍に希釈し、ＡＳ.１またはＢＳ.１およびＸ２ Ｂ（５'−ＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣ−３' 配列番号２３）で再び増幅 させた。Ｘ２Ｂオリゴを、その５'末端（Sambrookら、１９８９）をγ−32Ｐ− ｄＡＴＰ（Dupont）で放射標識化した。１５サイクルである以外、ＰＣＲ条件は 前記のとおりであった。ゲノムＤＮＡ汚染による問題を排除するのに、ＰＣＲ産 生物はＥ１αまたはＥ１β／Ｅ２スプライス接合部をスパンした。該産生 物を変性５％ポリアクリルアミドゲルを介し、電気泳動法により分析した。乾燥 ゲルをＸ−ＯＭＡＴ（Kodak）フィルムに一夜暴露した。 結果はα転写がＥ１βの５'配列と無関係であるプロモーターから開始するこ とを示唆している。別の説明は、欠失が異所性プロモーター配列をＥ１αに融合 させたというものである。しかし、Ａ３７５およびＳＫ-mel９３が、独立して細 胞系より単離されることはないと考えられる。αプロモーターの正確な位置は明 らかでないが、ＲＮase保護分析はそれがＰ１６開始コドンの少なくとも４４０ ｂｐ上流で開始していることを示した。かくして、ヒトＰ１６遺伝子は、別個の プロモーター、ＰαおよびＰβより産生した、別個の解読ポテンシャルを有する ２つの部分的に重複した転写物の複合体である。Ｐ１６の発現パターン 遺伝子の機能を解決する糸口は、異なる組織におけるその発現パターンの分析 から明らかになるかもしれない。Ｐ１６の発現パターンを測定するのに、１１の 組織より調製した一連のｃＤＮＡサンプルをαおよびβ特異的プライマーを用い るＰＣＲによってスクリーンした（図１６Ａ−Ｄ）。両形態のＰ１６転写物を、 いくらか違いはあるが、試験したすべての組織にて検出した。例えば、脾臓にお いて、αおよびβ形態の間の割合はβよりであった。反対に、胸部におけるその 割合はαに有利であった。これらの発現データは、多くの異なる組織型に由来す る細胞系にてＰ１６の欠失および点変異を認める研究データ（Kambら、１９９４ ｂ；Liuら、１９９５）と一致し、多数の組織におけるｐ１６についての役割を 示唆する。 In vitroにてＣＤＫ４およびＣＤＫ６の阻害剤であると明らかにされている（ Serranoら、１９９３；Liら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）、ｐ１６の生化 学機能があれば、細胞サイクルをトラバースした細胞として、Ｐ１６の発現を分 析した。ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）はフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ） ＋インターロイキン−２（ＩＬ−２）により刺激され、刺激後の種々の時点で細 胞を収穫した。これらの細胞をフローサイトメトリーによりその細胞サイクルの 段階を測定し、ＲＴ−ＰＣＲによりＰ１６遺伝子発現の相対的レベルを測定し、 ウェスタンブロット法によりｐ１６タンパク質のレベルを測定することにより分 析した。末梢血液リンパ球を正常な成人ドナーより流出した血液から単離し、Fi coll-Hypaqueグラジエントにフローテーションさせることにより部分的に精製し た（Boyum、１９６８）。リンパ球を前記したように対流傾瀉に付すことでさら に精製した（Elstadら、１９８８）。この方法にて調製した細胞集団は９８％純 度のＰおよびＴ細胞であると評価された。該精製細胞を１０％ウシ胎児血清を補 足したＲＰＭＩ（Gibco）にて増殖させた。休止細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ （Sigma）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Sigma）で誘発させた。細胞サイクル の進行をフローサイトメトリーによりモニター観察した。ＲＮＡをＲＮazol Ｂ （CINNA/BIOTECX Laboratories,Inc.）を用い、一次Ｔ細胞より単離した。ＲＴ −ＰＣＲの定量性を、誘発後に単離されたＴ細胞ｃＤＮＡから一連の希釈体を形 成することにより確認した。非希釈サンプル中に存在する標的ｃＤＮＡの量を、 標的がもはや増幅し得ない希釈度を測定することにより定量した。種々のＰＣＲ 実験からの結果は一致するが、希釈実験により４倍よりも大きいＲＮＡレベルの 変化があった場合のみ検出できることがわかった。Ｒb+およびＲb-細胞系由来の ｃＤＮＡサンプルもまたこれを同じ方法にて分析した。ヒト・アクチンは容易に 検出され、各ｃＤＮＡサンプル（組織、細胞系またはＴ細胞）中に同様の量にて 存在した。 Ｐ１６転写物の２種の形態の割合は、細胞サイクルを介して劇的に変化した（ 図１６Ｂ−Ｃ）。最初、β形態は低濃度であるが、刺激後、３０ないし４０時間 までに、そのレベルは上昇し始めた。この間、α形態の発現レベルは、おそらく わずかに上昇しながら、比較的一定を保持した。フローサイトメトリーによれば 、割合変化は、Ｇoを終え、Ｓ期に入る細胞と相互関係にあった。ＲＴ−ＰＣＲ の定量性を、鋳型希釈実験により試験した。かかる実験によれば、ＲＴ−ＰＣＲ は転写物レベルの４倍またはそれ以上の変化に対して感受性であった。β誘発は 少なくとも１０倍であると推定された。したがって、細胞サイクルを受けたＴ細 胞として、該細胞はＰ１６転写物の２つの形態の相対量を変化させ、その結果、 その割合はβよりに変化した。 本発明者らはまた、細胞サイクルをトラバースしたＴ細胞として、Ｐ１６タン パク質発現のレベルを試験した。タンパク質をミトゲン誘発後の種々の時点で細 胞より単離し、その単離したタンパク質をウェスタン分析に付した。ｐ１６タン パク質のレベルを完全ポリペプチドの２０Ｃ−末端アミノ酸に対抗して産生され たｐ１６抗体を用いて測定した。Ｇoを終えた細胞として、ｐ１６タンパク質の レベルは比較的一定であった。かくして、ｐ１６コードＲＮＡ（α転写物）およ びｐ１６タンパク質は共に、細胞サイクルの間、比較的一定であった。他に、Ｓ 期の間にｐ１６レベルが適度に上昇することが報告されている（Tamら、１９９ ４ｂ）。種々の細胞型におけるｐ１６調節の違いを反映するか、またはタンパク 質（またはｃＤＮＡ）レベルの２ないし３倍増を検出するという問題を反映する 、ｐ１６の蓄積は見られなかった。腫瘍細胞系におけるＰ１６の発現 今までの研究はRbがＰ１６の発現に影響を及ぼすと示唆していた（Serranoら 、１９９３；Liら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）。βｍＲＮＡの発現につ いての細胞のＲb状態の効果を試験した（図１６Ｄ）。ｃＤＮＡを一連の細胞系 、そのうちの５つは野生型Ｒbタンパク質を有し、そのうちの６つは非機能性Ｒb タンパク質を有する細胞系より調製した（Parryら、１９９５）。予想どおり、 α転写物はＲb−陰性系でのみ検出された。しかし、β転写物はＲb−陽性および Ｒb−陰性細胞系の両方に存在した。したがって、αと異なり、βＲＮＡの発現 は腫瘍由来細胞系におけるＲbの変異状態と無関係である。 ｐ１６は多発性遺伝子種の一構成員であると証明されている（Guanら、１９９ ５）。他の多発性遺伝子種を用いて類推すれば、この種の構成員は余分な機能、 異なる機能、または異なる時間または組織特異的パターンにて機能を発揮してい るかもしれない。したがって、ｐ１６のレベルが低く、ＲbによるＰ１６調節が 明らかに喪失していれば、Ｐ１６がＴリンパ球における細胞サイクルを調整しな いことは可能である。しかし、β転写物はＴ細胞誘発時に劇的に誘発され、Ｐ１ ６は高割合のＴ細胞−誘導腫瘍にて欠失されているため（Hebertら、１９９４） 、ｐ１６はヒトＴ細胞にて重要な機能を果たしていると考えられる。ｐ１６に対 す るＲbの劇的な効果はウイルス形質転換または腫瘍由来の細胞系においてのみ観 察された。おそらく、Ｐ１６は、野生型組織中、ある別の方法で調節されている であろう。Ｅ１βはｐ１６の保存かつ調整された部分である β転写物の役割は明らかではないが、結果は：（ｉ）Ｅ１βはマウスにて保存 されていること；（ii）β転写物の相対量は組織特異的および細胞−サイクル依 存的方法の両方にて調整されること；および（iii）２つの細胞系は、Ｅ１αで なく、Ｅ１βを除去するモノ接合性欠失を有すること；によりｐ１６遺伝子座の 機能として重要であることを示唆している。これらの結果はＥ１βが野生型Ｐ１ ６の機能について要求されることを示唆する。 マウスβｃＤＮＡを単離し、ヒトのＭＴＳ１Ｅ１βと比較した。マウスｃＤＮ Ａクローンを、ハイブリッド捕獲ＲＡＣＥ（ＨＣＲ）と称される修飾ハイブリッ ド選択操作により単離した。マウスのポリＡ+に富むＲＮＡを胸部および胸腺組 織より単離した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成反応（Sambrookら、１９８９）はランダ ムな１２ｍｅｒおよびSuperscriptII逆トランスクリプターゼ（Bethesda Resear ch Laboratories）を用いた。第２の鎖合成の後、ｃＤＮＡを、特異的二本鎖オ リゴ（ｄｓＲＰ.２）（５'−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣ ＡＴＴＧＴＴＣ−３' 配列番号２８）をその５'末端に連結することにより「ア ンカー」に付した。第２のｃＤＮＡ鎖の５'末端は連結反応における単なるリン 酸化ＤＮＡ末端であった。連結後、そのアンカーｃＤＮＡをSepharoseＣＬ−４ Ｂカラム上で分別することにより精製した。アンカーｃＤＮＡをＰ１６特異的復 帰性プライマー（５'−ＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣ−３' 配列 番号２９）およびＲＰ.２のネステッド・バージョン（ＲＰ.Ｂ）（５'−ＴＧＡ ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧ−３' 配列番号３０）で増 幅し、つづいて第１の増幅に用いた復帰性プライマーの上流で、ビオチニル化遺 伝子特異的オリゴヌクレオチド（５'−ＡＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＴＡ ＣＣＴＴＣＴＣＣ−３' 配列番号３１）で捕獲した。その捕獲ｃＤＮＡをＲＰ. Ｂおよび遺伝子特異的復帰性プライマー（５'−ＧＡＡＣＧ ＴＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ−３' 配列番号３２）を用い、捕獲オリゴの上 流で再び増幅させた。得られた産生物をゲル精製に付し、クローンし、配列決定 した。マウスＰ１６オリゴヌクレオチドに対する配列を、低ストリンジェントで ヒトＥ２プローブにハイブリッドしている配列を有するマウスゲノムクローンを クローンし、配列決定することにより測定した。 マウスβ転写物のヒトのそれとの比較は、Ｅ１βがタンパク質をコードしない ことを示唆する。Ｅ２のｐ１６リーディングフレームからなる配列だけが厳格に 保存されていた。したがって、β転写物が翻訳された場合、タンパク質はＥ２に て開始され、ｐ１６をコードするのに用いられる同じフレームにて翻訳されたと 考えれる。推論ポリペプチドは概算分子量１０ｋＤａを有し、ｐ１６に存在する ４アンキリン繰返し単位の２ ３／４を保持する。しかし、ｐ１５は３ １／２ア ンキリン繰返し単位を有するにすぎず（HannonおよびBeach、１９９４）、他の タンパク質が、１または２の繰返し単位だけで重なり、機能している。ｐ１０分 子がin vivoにて存在するかどうか、該分子がＣＤＫ４／６を阻害するかどうか 、依然試験されている。βＲＮＡの機能 β転写物の役割が細胞増殖を阻害することにあるとするならば、腫瘍由来細胞 系においてＥ１βを分裂させる変異を見つけることができるであろう。Ｅ１βを 除去する欠失を有する２つのメラノーマ細胞系がなおα転写物を発現し続けるこ とはこの見解と一致している。ｐ１６コーディング配列は、これら細胞系におけ る野生型である。にもかかわらず、Ｅ１βにて小遺伝障害（例えば、塩基置換） は全く一連の２５腫瘍細胞系において見られなかった。したがって、Ｅ１βがホ モ接合性欠失の標的であると結論することは困難である。Ｅ１βエクソンがタン パク質をコードしないならば、小遺伝障害がその機能を崩壊するのに十分ではな いであろう。また、前記した欠失の標的はある別の遺伝子であるかもしれない。 例えば、ｐ１５遺伝子（ＭＴＳ２）がこれらメラノーマ細胞系にて欠失の関連標 的であったことは可能である。この見解において、Ｅ１βは、Ｅ１αよりもＰ１ ５に近いため、容易に欠失された。しかし、本発明者らは種々の細胞系にてＰ１ ５点変異を検出できず、特異的にＰ１５を除去した欠失を有する細胞系はないた め（Kambら、１９９４ｂ）、この説明は不当であると思われる。 遺伝的証拠は、ｐ１６およびＲbが、腫瘍進行の間にしばしば不活性化される 増殖調整経路の構成員であることを示唆する。β転写物の役割が否定的に細胞増 殖を調節することであるならば、それはおそらく、ｐ１６およびＲbと無関係に 変異するにちがいない別の経路の部分であろう。このことはＥ１βを特異的に崩 壊する欠失が何故Ｒb-細胞系にのみ見られるかを説明するであろう。その発現パ ターンに基づき、Ｅ１βは細胞を活性的にサイクルさせる役割を果たすようであ る。Ｅ１βの役割についての限定的結論は、in vivoにおけるその発現の分析を 待っばかりである。 実施例１３ ＭＴＳ２ｍＲＮＡの発現 ＲNazol Ｂ（CINNA／BIOTECX Laboratories,Inc.）を用い、細胞系または一次 Ｔ細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを全ＲＮＡ（Sambrookら、１９８９）よ りランダムな９ｍｅｒを用いて合成し、ＤＮＡ合成をプライムした。ｃＤＮＡ収 量を、合成反応におけるα32Ｐ−ｄＡＴＰ（Amerscham）（０.１Ｃi／ミリモル ）を含め、最終生成物に取り込まれる放射活性ヌクレオチドの量を測定すること により計算した。ＭＴＳ２発現を連続する２ラウンドの増幅にてヘミネスト復帰 性プライマーを用いることにより分析した。最初の増幅にて、２ｎｇのｃＤＮＡ をＥ１Ｆ（５'−ＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣ−３' 配列番号２１）およ びＸ２.Ｒ１４０'（５'−ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ−３' 配列番号 ２２）で増幅させた。該反応を以下の条件下：９７℃で３秒間；６５℃で１０秒 間；７５℃で２０秒間、２０サイクルについてPerkin-Elmer ９６００熱サイク ラーを用いて行った。これらの反応物を１００倍に希釈し、Ｅ１ＦおよびＸ２Ｂ （５'−ＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣ−３' 配列番号２３）で再び増幅さ せた。Ｘ２Ｂオリゴをその５'末端でγ32Ｐ−ｄＡＴＰ（DuPont）で放射標識化 した（Sambrookら、１９８９）。ＰＣＲ条件は、１５サイクルである以外は、 前記と同じであった。得られた産生物を変性５％ポリアクリルアミドゲルを介す る電気泳動により分析した。乾燥ゲルを、Ｘ−ＯＭＡＴ（Kodak）に一夜暴露し た。異なる組織でのＭＴＳ２発現 ＭＴＳ２は、ＭＴＳ２がホモ接合的に欠失されている腫瘍に生じるものを含め 、多くの組織型にて発現することが判明した（図１０Ａ参照）。しかし、組織間 で相違があった。例えば、ＭＴＳ２転写物は肺組織にて容易に検出されたが、前 立腺および脳組織では検出されなかった。対照的に、密接に関連するＭＴＳ１遺 伝子の発現は試験した組織すべてに検出された。ＭＴＳ２ ＲＮＡレベルにおけ る組織特異的相違がＭＴＳ２タンパク質についての組織特異的要件を反映してい るかどうかわかっていない。細胞サイクルの間のＭＴＳ２発現 ＭＴＳ２が細胞サイクルにおける重要な塩基転位を調節するならば、その発現 は細胞サイクル中に変化するかもしれない。例えば、正常な分割細胞において、 ｐ２１ ｍＲＮＡの量は細胞サイクル期の機能に比例して変化する（Liら、１９ ９４ｂ）。ＭＴＳ２転写が細胞サイクル中に調節されるかどうかを試験するのに 、休止ヒト細胞をＰＨＡおよびＩＬ２で刺激し、刺激後の種々の段階でモニター した（図１０Ｂ参照）。Ｇoを終え、細胞サイクル期を経た細胞のように、ＭＴ Ｓ２発現レベルにおける明白な傾向は何ら見られなかった。反対に、対照遺伝子 、ＣＤＫ４の発現は、予想どおりに変化した（Matsushimeら、１９９２）。かく して、正常に分割している細胞のサイクルの間に、ＭＴＳ２ ｍＲＮＡが差次的 に発現することについての証拠は全く見いだされなかった。 ＭＴＳ１タンパク質が、網膜芽腫タンパク質Ｒbが関与する成長調整経路にて 関与していると提案されている（Serranoら、１９９３；Guanら、１９９５；Ser ranoら、１９９５）。最近の研究により、ＭＴＳ１の発現が、少なくとも部分的 に、Ｒbにより調整されるという見解について、強力な状況証拠が得られた（Li ら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）。ＭＴＳ１とＭＴＳ２の間の生化学的類 似性は、ＭＴＳ２もまた、Ｒbにより調整されることを示唆している。この 可能性を、Ｒb陽性細胞系およびＲb陰性細胞系におけるＭＴＳ２ ｍＲＮＡのレ ベルを比較することにより試験した。Ｒbの状態とＭＴＳ２ ｍＲＮＡレベルの間 に相関関係は何ら見られなかった（図１０Ｃ参照）。このことは、細胞系のＲb の状態がＭＴＳ２転写物の量に劇的な影響を及ぼさないことを示唆している。か くして、ＭＴＳ１と異なり、ＭＴＳ２発現はＲbと無関係であろう。 実施例１４ ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の異所性発現 ＭＴＳ１の４８３塩基対フラグメントを、プライマーＭＴＳ１.Ｆ（５'ＡＡＡ ＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣ ＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴ３'）（配列番号１７）およびＥ３.Ｒ（ ５'ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧ３'）（配列番号１８） を用いるポリメラーゼ連鎖反応により生成した。プライマーＭＴＳ１.Ｆは将来 のクローニング用に５'末端付近に制限酵素部位およびコダック・コンセンサス 配列（Kozak、１９８７）を包含するように設計された。この反応についての鋳 型ＤＮＡは胸部組織由来のｃＤＮＡであった。この生成フラグメントを、ＥcoＲ ＩおよびＢamＨＩで消化された発現ベクターｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen）中に 挿入した。ｐｃＤＮＡ３はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し 、アンピシリンおよびネオマイシンに対する耐性をコードする。ついで、得られ た組換えベクター、ｐｃＤＮＡｐ１６を電気穿孔法により細胞系ＨＳ２９４Ｔに 挿入した。ＨＳ２９４Ｔはメラノーマより誘導され、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の 両方のホモ接合性欠失を有する。ＨＳ２９４Ｔを１０％ウシ胎児血清、非必須ア ミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタメートを補足した、ＤＭＥＭ（ Gibco）中に増殖させた。該細胞を５％ＣＯ2中３７℃で増殖させた。ＨＳ２９４ Ｔを、１：４の割合の、形質転換細胞に対してヒグロマイシン耐性を付与するｐ ＳＳ（Stratagene）、およびＣＭＶプロモーターの下流に挿入されたＭＴＳ１コ ーディング配列を含有するｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）または挿入体を有しない ｐｃＤＮＡ３ベクターで共同形質転換した。 ＭＴＳ２のコード部を、同様に、ｐｃＤＮＡ３中にクローンし、再びコダック 配列を形成させてｐｃＤＮＡｐ１５を得、ＨＳ２９４Ｔ中に挿入した。このため に、前記の実施例１３にて調製したＭＴＳ２ ｃＤＮＡを用いた。 ヒグロマイシン耐性用の選択マーカーを含有するプラスミドｐＳＳ（Stratage ne）を、同時に、ｐｃＤＮＡｐ１６またはｐｃＤＮＡｐ１５と一緒に共同転換さ せた；ｐＳＳは、電気穿孔にてキュベット当たり２０μｇで存在した。電気穿孔 についての条件は、キュベット当たり８００μＬの細胞であり、１.５ｘ１０6細 胞／ｍｌおよび５００μＦ電気容量、４００ボルトであった。対照実験をｐｃＤ ＮＡ３＋ｐＳＳを用いて行った。電気穿孔細胞（約４００μＬ）を、ヒグロマイ シン３００μｇ／ｍｌと一緒にペトリ皿に入れた。コロニー数（Foci）を１４日 後に計数した。結果を表９に示す。 ＣＭＶプロモーターに融合した完全なＭＴＳ２コーディング配列を有する構築 物がＨＳ２９４Ｔに形質転換された場合、その構築物は、ＭＴＳ１の異所性発現 の効果に匹敵する、対照と比較した場合の７つの遺伝因子によりコロニー形成を 阻害した。この結果はＭＴＳ２の異所性発現が細胞増殖を阻害するのに十分であ ることを示唆する。形質転換細胞が、ＭＴＳ１の異所性発現の結果と考えられる 、Ｇ１にて阻止されるか、または増殖が他の方法にて阻止されるかどうか明らか でない。（ホモ接合性欠失のため）ｐ１５またはｐ１６発現を欠く細胞系におけ るｐ１５またはｐ１６の過剰発現が細胞の増殖を阻害すると結論できる。正確な 機構は不明であるが、ｐ１５またはｐ１６の過剰発現が細胞分裂を停止させるか 、 または細胞を殺す可能性がある。これらの結果はｐ１５およびｐ１６がin vivo にてbona fide腫瘍サプレッサータンパク質として機能し、したがってｐ１５お よびｐ１６はおそらく治療的用途を有することを示唆する。 多くの理由から、ＭＴＳ２は腫瘍サプレッサー遺伝子として有望な候補である 。ＭＴＳ１に類似する広範な配列特性を有し、in vivoにてＣＤＫ機能に結合し て阻害し、ＭＴＳ２の異所性発現は、in vivoにおける細胞増殖を阻害する。前 記の結果は、ＭＴＳ２とＭＴＳ１の間に生化学的類似性があるにもかかわらず、 ２つのタンパク質にin vivoにて有意に異なる機能があるという可能性を想起さ せる。ＭＴＳ２の２つの特徴は、これがその可能性を有すること：ｉ）ＭＴＳ１ でなく、ＭＴＳ２がＴＧＦβにより導入されること（HannonおよびBeach、１９ ９４）およびii）ＭＴＳ１と異なり、ＭＴＳ２転写はＲbと無関係と思われるこ とを示唆する。ＭＴＳ２が腫瘍形成に全く関係しないことは可能である。また、 ＭＴＳ２は、ＭＴＳ１の関連する経路とは別の腫瘍抑制の経路に関連しているか もしれない。この経路の要素は知られていないが、これら要素のうちいくつかは 体細胞組織におけるＭＴＳ２よりもずっと高い頻度で変異すると考えられる。こ のことから、ＭＴＳ２の体細胞変異の欠如は決して腫瘍抑制における重要な役割 を排除するものではない。前記したように、ＭＴＳ２の異所性発現は細胞増殖を 阻害し、ＭＴＳ２の役割は首尾一貫して腫瘍を抑制することにある。細胞サイク ルの間にＭＴＳ２発現が一定レベルであること、およびそのＴＧＦβによる誘発 は、Ｇ１におけるＭＴＳ２の役割が、必須というわけではないが、細胞サイクル それ自体の発生の時期の調整を阻止することにあることを示唆する。反対に、Ｒ bによるＭＴＳ１発現の調整は、ＭＴＳ１が細胞サイクルにおけるオシレーター としての役割を有することを指示する。in vivoにおける増殖調整分子としての ＭＴＳ２の機能を試験することおよびＭＴＳ２が機能する範囲内の経路を吟味す ることは重要であろう。 実施例１５ サンプル中のＭＴＳの存在を検出するための２工程検定 親サンプルをアントナラキス（Antonarakis）ら（１９８５）によって開示さ れている方法に従って処理し、１％アガロースゲルを通して分離し、サザーンブ ロット分析用のナイロン膜に移す。膜をＧＳ・ジン・リンカー（Gene Linker） （Bio-Rad）を用いて１５０ｍＪでＵＶ架橋する。配列番号４のヌクレオチド位 置４４８−４９８に対応するＭＴＳプローブをｐＴＺ１８Ｕにサブクローンする 。ファージミドをＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Bio-Rad）リッチモンド、カ リフォルニア州）に感染したイー・コリＭＶ１１９０に形質転換させる。一本鎖 ＤＮＡを標準操作に従って単離する（Sambrookら、１９８９参照）。 ブロットを０.５Ｍ ＮaＰＯ4の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、６ ５℃で１５〜３０分間、プレハイブリダイズする。該方法はNguyenら、１９９２ に記載の方法によるものである。該ブロットを６５℃で、０.５Ｍ ＮaＰＯ4の７ ％ＳＤＳ中、２５〜５０ｎｇ／ｍｌの一本鎖プローブＤＮＡで一夜ハイブリダイ ズする。ハイブリダイズ後の洗浄は、４０ｍＭ ＮaＰＯ4の５％ＳＤＳ中、６５ ℃で２ｘ３０分間、洗浄し、つづいて４０ｍＭ ＮaＰＯ4の１％ＳＤＳ中、６５ ℃で２ｘ３０分間、洗浄することからなる。 次に、該ブロットを、室温で５分間、リン酸緩衝セイライン（pＨ６.８）でリ ンスし、室温で６０分間、ＰＢＳ中０.２％カゼインと共にインキュベートし、 ＰＢＳにて５分間リンスする。ついで、該ブロットを、６Ｍ尿素、０.３Ｍ Ｎa Ｃlおよび５ｘデンハード（Denhard's）溶液からなるハイブリダイゼーション用 緩衝液で振盪水浴（４５℃）にて５〜１０分間、プレインキュベートする（Samb rookら、１９８９参照）。該緩衝液を除去し、５０〜７５μｌ／ｃｍ2の新たな ハイブリダイゼーション用緩衝液＋２.５ｎＭの共有結合したオリゴヌクレオチ ド−アルカリ性ホスファターゼ接合体（ユニバーサルプライマー部位に対して相 補的なヌクレオチド配列を有する）（UP-AP、Bio-Rad）と置き換える。該ブロッ トを４５℃で２０〜３０分間ハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション後の 洗浄は、２ｘ１０分間の洗浄として、６Ｍ尿素、１ｘ標準セイラインシトレート （ＳＳＣ）、０.１％ＳＤＳ中、４５℃で、および１ｘ１０分間の洗浄として、 １ｘＳＳＣ、０.１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００中にてインキュベ ートする。該ブロットを室温で１０分間、１ｘＳＳＣでリンスする。 ブロットを、室温で振盪しながら１０分間、０.１Ｍジエタノールアミン、１ ｍＭ ＮgＣl2、０.０２％ナトリウムアジドからなる基質緩衝液（pH１０.０）中 にインキュベートする。個々のブロットを基質緩衝液および０.２ｍＭ ＡＭＰＰ Ｄ（３'−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリ ルオキシ）フェニル−１,２−ジオキセタン・ジナトリウム塩、Bio-Rad）と一緒 に熱密封性バックに入れる。室温で振盪しながら２０分間インキュベートした後 、過剰のＡＭＰＰＤ溶液を除去する。該ブロットを一夜Ｘ−線フィルムに暴露す る。陽性バンドはＭＴＳの存在を示唆する。 実施例１６ ＭＴＳに対するポリクローナル抗体の生成 ＭＴＳコーディング配列の断片をイー・コリにて融合タンパク質として発現さ せた。過剰発現したタンパク質をゲル溶出により精製し、HarlowおよびLane（１ ９８８）により記載されている方法に類似する操作に従ってウサギおよびマウス を免疫化するのに用いた。この操作は種々の他のタンパク質に対するＡｂｓを生 成すると示されている（例えば、Kreamerら、１９９３参照）。 簡単には、ＭＴＳコーディング配列の鎖を、プラスミドＰＥＴ５Ａ（Navagen ，Inc.、マディソン、ウィスコンシン州）中、融合タンパク質としてクローンさ せた。ＭＴＳを組み入れた配列は、配列番号４の４４８〜４９８に対応するアミ ノ酸を包含する。ＩＰＴＧで誘発後、予想される分子量を有する融合タンパク質 の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認した。融合タンパク質を電気溶出操作 によりゲルから精製した。ＭＴＳ融合産生物としてのタンパク質の同定を、Ｎ− 末端でのタンパク質配列決定により確認した。次に、精製タンパク質をウサギに おけるイムノゲンとして用いた。ウサギをフロイント完全アジュバント中のタン パク質１００μｇで免疫処理し、３週間の間隔で２回、最初はフロイント不完全 アジュバント中のイムノゲン１００μｇ、つづいてＰＢＳ中のイムノゲン１００ μｇでブーストした。抗体を含有する血清をその２週間後に収集した。 この操作を繰り返し、ＭＴＳ遺伝子の変異体に対する抗体を生成する。これら の抗体を、野生型のＭＴＳに対する抗体と共に用い、種々の組織および生物学的 流体中の変異体の存在および関連レベルを検出する。 実施例１７ ＭＴＳについて特異的なモノクローナル抗体の生成 モノクローナル抗体を以下のプロトコルに従って生成する。マウスを、グルタ ルアルデヒドまたはＥＤＣ（周知である）を用いてキーホールリンペットヘモシ アニンに結合した無傷のＭＴＳまたはＭＴＳペプチド（野生型または変異体）か らなるイムノゲンで免疫化する。 イムノゲンをアジュバントと混合する。各マウスに１０ないし１００μｇのイ ムノゲンを４回注射し、４回目の注射後、血液サンプルをマウスから摂取し、血 清が該イムノゲンに対する抗体を有するかどうか測定する。血清力価をＥＬＩＳ ＡまたはＲＩＡにより測定する。イムノゲンに対する抗体の存在を示す血清を有 するマウスを選択し、ハイブリドーマを産生する。 脾臓を免疫マウスより摘出し、単一の細胞懸濁液を調製する（HarlowおよびLa ne、１９８８参照）。細胞融合は、本質的にKohlerおよびMilstein、１９７５の 記載に従って行う。簡単には、Ｐ３.６５.３ミエローマ細胞（アメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州）を、Harlowおよ びLane、１９８８の記載に従って、ポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細 胞と融合させる。細胞を２ｘ１０5細胞／ウェルの密度で、９６ウェル組織培養 プレート上にプレートする。個々のウェルを増殖について試験し、増殖したウェ ルの上澄を、野生型または変異体ＭＴＳ標的蛋白質を用いるＥＬＩＳＡまたはＲ ＩＡによりＭＴＳ特異的抗体の存在についてテストする。陽性ウェルにある細胞 を膨張させ、サブクローンして、モノクローン性を確立し、確認する。 所望の特異性を有するクローンを膨張させ、マウスにてまたはホローファイバ ー系中、腹水細胞として増殖させ、特徴付けおよび開発用に検定するのに十分な 量の抗体を産生する。 実施例１８ ＭＴＳについてのサンドウィッチアッセイ モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のような固体表 面に付着させる。好ましくは、抗体を９６−ウェルのＥＬＩＳＡプレートのウェ ル表面に付着させる。ＭＴＳペプチド／タンパク質（野生型または変異体）含有 の１００μｌのサンプル（例、血清、尿、組織シトゾル）を固相抗体に加える。 該サンプルを室温で２時間インキュベートする。次に、サンプル流体をデカント し、該固相を緩衝液で洗浄し、未結合物質を除去する。１００μｌの（ＭＴＳペ プチド／タンパク質上の異なる決定因子に対する）第２モノクローナル抗体を該 固相に加える。この抗体を検出体分子（例、125Ｉ、酵素、フルオロホールまた はクロモホール）で標識化し、該第２抗体を有する固相を室温で２時間インキュ ベートする。第２抗体をデカントし、該固相を緩衝液で洗浄し、未結合物質を除 去する。 サンプル中に存在するＭＴＳペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の 量を測定する。野生型ＭＴＳに対して特異的なモノクローナル抗体ならびにＭＴ Ｓにて同定された各変異に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、別個の アッセイを行う。 本発明の方法および構成は種々の具体的表現の形態にて具体化することができ 、そのうちのほんの２、３の具体例を本明細書中に開示するものである。他の具 体例が存在し、それが本発明の精神から逸脱するものでないことは当業者にとっ て明らかである。かくして、記載されている具体例は例示であり、それに限定さ れるものではない。 Detailed Description of the Invention MTS gene, mutation in it, and method of diagnosing cancer using MTS gene sequence LawCross-reference of related applications   The present invention was filed on June 1, 1994, No. 08 / 251,938, 1994. No. 08 / 215,088 filed on Mar. 18 and Mar. 18, 1994 No. 08 / 214,581 is a continuation-in-part application, all of which are incorporated herein by reference. Incorporate in the statement. Application 08 / 251,938 was filed on March 18, 1994 No. 08 / 214,582, filed on April 14, 1994, which is a continuation-in-part application. No. 08 / 227,369, which is a continuation-in-part application, all of which are incorporated by reference. Incorporated herein.Background of the Invention   The present invention provides multiple tumor suppressors in human cancer. sor) (MTS) gene somatic mutation and human cancer diagnosis and prognosis Concerning its use in. Furthermore, the present invention relates to germline in the MTS gene. Mutations and melanoma, melanoma of the eye, leukemia, astrocytoma, glioblastoma , Lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, myoma, Cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, as well as pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid Prone to cancer, such as cancer of the ovary, uterus, testes, kidneys, stomach, colon and rectum Regarding its use in the diagnosis of predisposition. The present invention also provides gene therapy and protein replacement therapy. Humans having mutations in the MTS gene, including methods and protein mimics Regarding the treatment of cancer. In the end, the present invention is directed to the drug screenin used in the treatment of cancer. About Gu   Background of the Invention, and Especially When Providing Further Details for Implementation The publications and other materials used herein for the purpose of illustration are hereby incorporated by reference. And referred to in the following text where appropriate, which are referenced in the attached literature. Each is listed on the strike.   Cancer genetics are complex, with many dominant and positive regulators of transformation status. -(Oncogene) and many recessive and negative regulators (tumor suppressor genes) ) Is included. Over 100 oncogenes have been characterized. Than 12 species Fewer tumor suppressor genes have been identified, but the number is expected to exceed 50 (Knudson, 1993).   The involvement of so many genes is important in the cell to maintain the integrity of normal tissue. It complicates the active growth control mechanism. This complexity is revealed in another way Has been done. So far, involved in the growth of all or most human cancers No single gene has been shown to do so. Most common oncogenic mutations are H -Present in the ras gene and found in 10-15% of all solid tumors (Anderson et al., 1992). The most frequently mutated tumor suppressor The control gene is the p53 gene and is mutated in about 50% of all tumors. It Does not damage normal tissue without the common target of all transformed cells The dream of a "magic bullet" that can destroy cancer cells or restore them . Hope for a new generation of specifically targeted anti-tumor agents is one of the key factors in regulating cell division. Allows for the identification of tumor suppressor or oncogenes that play a general role There is a potential.   Tumor suppressor genes that have been cloned and characterized include: 1) Retinoblastoma (RB1) 2) Wilm's tumor (WT1): 3) Li-Fraum eni) (TP53); 4) Familial adenomatous polyposis (APC5); 5) Type 1 nerve Fibromatosis (NF1); 6) Neurofibromatosis type 2 (NF2); 7) von Hippel -Von Hippel-Lindau syndrome (VHL); and 8) type 2A multiple Affects susceptibility to endocrine neoplasia (MEN2A).   Tumor suppressors that have been genetically mapped but not yet isolated The locus is type 1 multiple endocrine neoplasia (MEN1); Lynch cancer family Syndrome 2 (LCFS2); Familial Breast Cancer (BRCA1); Neuroblastoma (NB); Basal Cell nevus syndrome (BCNS); Beckwith-Wiedema nn) syndrome (BWS); renal cell carcinoma (RCC); tuberous sclerosis 1 (TSC1); And the gene for tuberous sclerosis 2 (TSC2). To the present Tumor suppressor genes that have been characterized to include DNA-binding protein (WT1), an accessory Transcription regulator (RB1), GTPase activating protein or GAPs (N F1), cytoskeletal component (NF2), membrane bound receptor kinase (MEN2A) Products with similarities to the various protein types of interest and known proteins. It encodes other products (APC and VHL) with no mild similarity.   Tumor suppressor genes originally identified by genetic studies often disappear or Has been shown in some diffuse cancers to be mutated. This result is a chromosome Is associated with both a genetic predisposition to cancer and sporadic cancer It suggests that the location of the tumor suppressor gene may be indicated. Characterized so far One of the proofs that some of the tumor suppressor genes are In, they are frequently deleted. Deletions are often Including the loss of a single allele, the so-called loss of heterozygosity (LOH) , Can also include heterozygous deletions of both alleles. For LOH, Remaining conflicts due to either pre-existing genetic variations or secondary sporadic variations It is speculated that the gene is not functional.   Melanoma is a cancer that afflicts a large number of Americans. Nursing Society (American Cancer Society, 1992). To UV Environmental effects such as exposure play a major role in the development of melanoma. Tradition is also a relevant factor. Genes for familial melanoma and MLM have chromosome 9p2 1 (Cannon-Albright et al., 199). 2 years; Nancarrow et al., 1993; Gruis et al., 1993. Year; Goldstein et al., 1994). At the MLM locus Having a single predisposing allele allows an individual to develop melanoma. Increases potency up to about 50 times. The predisposing factor for melanoma is dominant Mendelian Although inherited as a rule, the mutation that makes a predisposition in MLM was originally Knudson (Knudson). son) (1971) in the manner proposed as a somatic recessive allele. It is thought to be used. Harboring one wild type and one mutated MLM allele In individuals predisposed to undergo cell division, loss of the wild-type copy of MLM or Undergo secondary mutations, including inactivation, which result in inherited mutation pairs. The standing gene is defenseless. Conversely, a single wild-type copy of the gene causes malignant development. Hinder.   Chromosome alterations near MLM at 9p21 are associated with glial cell lines and non-small cells. Including non-small cell lung lines and acute lymphoblastic leukemia system Are very well characterized in several different tumor types (see Olopade et al., 1992; Olopade et al., 1993; Le. Lukeis et al., 1990; Diaz et al., 1988; Middleton. (Middleton) et al., 1991; Fountain et al., 1992; Cheng et al., 1993; James et al., 1993). Thus , MLM based on the frequency of 9p21 chromosomal aberrations in non-melanoma tumor cells Genes whose regions are involved in the development of at least several different tumor types May have a gene group). These things are related to LOH and high frequency homozygosity. It is associated with compatible deletions.   Cells in tissues have only three options in their lives-they Can divide and proliferate, rest without proliferation, or undergo apoptosis It will die by. If the tumor grows inappropriately and divides or dies Can be caused by any of the cells that do not die. Mechanisms that control tumor growth One would require direct regulation of the cell cycle. For example, DNA Genes that control replication decisions are stimulatory in their process Tumors, or whether they play an inhibitory role. It is an attractive candidate for gene or tumor suppressor genes. Cell cycle (G1, S, G2And M phase) eukaryotic cell development is a series of cyclin / cyclin-dependent Supported by formation, activation and subsequent inactivation of the extrinsic kinase (Cdk) complex It is distributed. Cyclin D's / Cdk2, 4, 5, Cyclin E / Cdk2 , Cyclin A / Cdk2 and cyclin B / A / Cdk2 are involved in this process It has been shown to be necessary. For cyclin D's and Cdk2, Cdk4 And Cdk5 is G1Was associated with the transition from S to S; It was relevant in determining whether to initiate DNA replication. Further cell circumference Phase regulatory elements have recently been discovered. These elements are inhibitors of Cdk ( Cdk inhibitor, CkI), Far1, p21, p40, p20 and p Including 16 (Marx, 1994; Nasmyth and Hunt, 1993).   Recently, some oncogenes and tumor suppressor genes have been linked directly to the cell cycle. It turns out that they are involved. For example, cyclins (proteins that promote DNA replication One of them is involved as an oncogene (Motokura et al., 1991; Lammie et al., 1991; Withers et al., 1991; Rho Rosenberg et al., 1991), tumor suppressor Rb Interacts with the Culin Binding Partner, Cdk (Ewen et al., 19 1993). The identification of melanoma susceptibility loci can be increased, for example, by exposure to sunlight. Pave the way for genetic screening of individuals to assess the risk of additional cancer It will be. In addition, MTS is used in many other cancers (leukemia, astrocytoma, glioblastoma). Tumor, lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, myoma , Cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, and pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid Cancers including those of the gland, ovary, uterus, testicles, kidneys, stomach, colon and rectum But not limited to these). In addition, MTS Determining prognosis in cancer patients because it affects the development of several different tumor types Useful for. Thus, MTS can be associated with melanoma, melanoma of the eye, leukemia, stellate Glioblastoma, glioblastoma, lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma , Sarcoma, myoma, cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, as well as pancreas, chest, brain, For cancer of the prostate, bladder, thyroid, ovary, uterus, testis, kidney, stomach, colon and rectum Can serve as a basis for developing very important diagnostic tests that predict predisposing factors Is capable It Moreover, because MTS is associated with the development of many tumor types, MTS , For direct anti-cancer treatment due to its ability to suppress tumor growth, direct or Can provide an indirect means. For example, tumor cells may restore normal MTS function. And can transform cells into non-malignant cells.Summary of the invention   The present invention provides a multi-tumor suppressor for human cancer (Multip1e Tumor Suppres sor) (MTS) gene somatic mutation and human cancer diagnosis and prognosis Concerning its use in. Furthermore, the present invention relates to germline in the MTS gene. Mutations and melanoma, melanoma of the eye, leukemia, astrocytoma, glioblastoma , Lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, myoma, Cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, as well as pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid Prone to cancer, such as cancer of the ovary, uterus, testes, kidneys, stomach, colon and rectum Regarding its use in the diagnosis of predisposition. The present invention also provides gene therapy and protein replacement therapy. Humans having mutations in the MTS gene, including methods and protein mimics Regarding the treatment of cancer. In the end, the present invention is directed to the drug screenin used in the treatment of cancer. About GuBrief description of the drawings   FIG. 1A shows a clan 3137. All melanoma patients have susceptible haplo Have a type. Other cancers in individuals with susceptible haplotypes Show. The legend is as follows: Black circles or black squares indicate melanoma; some are black Painted circles or partially painted squares indicate other cancers; "/" indicates death Indicates; "*" is unknown if the individual has a susceptible haplotype "**" indicates that the individual has a susceptible haplotype; "35" indicates the age at which a test or diagnosis was made if ill.   FIG. 1B shows a clan 3161. All melanoma patients have susceptible haplo Have a type. Other cancers are not haplotypes. The legend is as follows: Black Circles or black squares indicate melanoma; partially painted circles or partially painted black Squares indicate other cancers; "/" indicates death; "=" indicates other places in the pedigree "3" in the pentagon indicates polygamy; "35" indicates illness If so, indicate the age of the test or diagnosis.   FIG. 1C shows a clan 3355. All melanoma patients have susceptible haplo Have a type. Other cancers are not haplotypes. The legend is as follows: Black Circles or black squares indicate melanoma; partially painted circles or partially painted black Squares indicate other cancers; "/" indicates death; "35" indicates sickness If yes, indicate the age at which the test or diagnosis was received.   FIG. 1D shows consanguineity 1771, showing the development of melanoma and other cancers. Mutation , Was identified in MTS in this family. The legend is as follows: "*" Those with confirmed mutations; solid circles or solid squares indicate melanoma; part Black circles or partially black squares indicate other cancers (in this family Colon cancer); "/" indicates death; "35" indicates test if ill Or indicates the age at which the diagnosis was made.   FIG. 2 shows YA in the area partitioned by IFNA-s and D9S171. C and P1 clones are shown. Centromere is on the right. Regarding P1 clone Indicates the direction of the T7 promoter in the vector. Y grouped together AC indicates similar clones based on STS mapping in the region. This Their YACs are probably not the same. YAC (A5, B11, C6 and F9 ) Includes IFN-1 and IFN-s. YAC (D1, F5 and E3 ) Includes D9S126 and D9S171. Proximal including D9S171 Neither the YAC terminus nor the distal YAC terminus containing IFNA-s is shown. distance Is not necessarily drawn to scale. IFNA-s and D9S17 The markers within 1 are shown in FIG. Markers starting with "c" are cosmid ends It is derived from the sequence. Cosmid not shown. The distance between c1.b and c5.3 And the distance between 760-L and D9S171 is unknown.   Figure 3 shows a diagram of the deletions observed in the melanoma cell line. Lack Deletions are classified into 12 classes based on the set of markers lost. 11 kinds of thin The cell system was missing all the markers shown in the figure. This class is not shown. other The number of representative examples of each of the 12 classes is shown in the cell line number column. Class 1 to 1 For 0, the deletion site was defined as a deletion in the marker adjacent to the deleted DNA. Indicated. That is, the last positive marker in the series leading to the deletion. It For classes 11 and 12, deletion sites are indicated by black triangles.   FIG. 4A shows a map of cosmid c5. Deletion analysis similar to cosmid and P1 The important STS used for c1.b marker is closer to P1-1062 Yes, not shown. The transcription direction of MTS1 and MTS2 is indicated by an arrow.   FIG. 4B shows the restriction enzyme map and STS map of cosmid c5. MTS1 and And the positions of the coding exons for MTS2 are shown in bold. "E1" and "E2" means "coding exon 1" and "coding exo," respectively. 2 ”. "B" is BamHI, "S" is SalI, and "R1" is EcoRI. , "R5" indicates EcoRV.   5A and 5B show the 5'untranslated region for MTS1, exon 1 and Genome sequence containing part of intron 1 and published sequence for p16 ( Comparison with Serrano et al., 1993). Start codon (underlined) is position 891 and the splice site (arrow) is at position 1016. Shown in Figures 5A-B The MTS1 sequence is SEQ ID NO: 3. The p16 sequence shown in Figure 5B is SEQ ID NO: 2. 4.   6A and 6B show a portion of intron 1 for MTS1, exon 2 and And a genomic sequence containing part of intron 2 and the published sequence for p16 (Comparison with Serrano et al., 1993). Splice site (arrow) Is before position 192 and after position 498. The MTS1 sequence shown in FIGS. 6A-B is The sequence number is 4. The p16 sequence shown in Figure 6A is the nucleotide of SEQ ID NO: 4. It is the same as 192-498.   7A and 7B show intron 1, “exon 2” and MTS2 related A comparison of the genome containing subsequent sequences with the published p16 sequence is shown. "Exo 2 "sequence is similar to exon 2 of MTS1 at nucleotides 273-580. It The splice site in MTS2 and the splice site in p16 Shown with an arrow. The point at which the divergence begins is indicated by °. Regarding MTS2 The stop codon at position 532 in exon 2 is indicated by "*". 7A-B The MTS2 sequence shown in is SEQ ID NO: 5. The p16 sequence shown in Figure 7A is SEQ ID NO: : 4 and is the same as nucleotides 192-498.   FIG. 8 shows MTS1 and MTS2 containing exon 2 and surrounding introns. Shows a comparison of the DNA sequences of Intron 1 3'splice dice relative to MTS1 5'splice junction of junction and intron 2 by triangle Show. Differences near the 3'end of coding exon 2 are indicated by arrows. Shown The resulting MTS1 sequence corresponds to nucleotides 92-548 of SEQ ID NO: 4. Shown The resulting MTS2 sequence corresponds to nucleotides 174-630 of SEQ ID NO: 5.   Figure 9 shows deletions in various STS tumor cell lines. Positive control and Negative and negative controls were used for each PCR experiment and only one or two Retest cell lines deficient in STS (eg class 21) at least twice did.   10A-C show expression of MTS2 mRNA. Figure 10A shows various human groups MTS2 transcript in RNA derived from weave (manufactured by Clonetech) Indicates the relative level of. Lane 1-Brain; Lane 2-Chest; Lane 3-Kidney; Ray Lane 4-lung; lane 5-lymphocytes; lane 6-ovary; lane 7-pancreas; lane 8- Prostate; lane 9-spleen; lane 10-stomach; lane 11-thyroid. Expected molecular weight and The origin of the different products is unknown (see lane 1). Figure 10B shows human lymphocytes. Relative MTS2 transcript levels in E. coli at times after induction with mitogens. Lane 1-0 hours; lane 2-1 hours; lane 3-2 hours; Lane 4-4 hours; Lane 5-8 hours; Lane 6-16 hours; Lane 7-24 hours. Lane; 8-32 hours; Lane 9-40 hours; Lane 10-48 hours; Lane 11-56 hours; lane 12-64 hours. Most cells are 40-50 hours after induction Was in S period. FIG. 10C shows MTS2 transcript levels as a function of Rb status. Shown as a number. Rb+Cell lines are: Lane 1-KIT8 (Hori et al., 1987). Year); Lane 2-2 diploid human fibroblast MRC5 (passage 28); Lane 3 -UMSCC2; Lane 4-Bristol 8; Lane 5-ZR75; Lane 6-H aCaT; Lane 7-T24. Rb-Cell lines are: Lane 8-MDA MB468. Lane 9-5637; Lane 10-C33A; Lane 11-SiHa; Lane 12-CaSki; Lane 13-WERI.   11 is 5'CDNA sequence for MTS2 (and the Polypeptide). The start of exon 2 is at position 491, marked by the arrow Show more. The cDNA sequence is shown as SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 15. : 16.   12A and 12B show the MTS1E1β cDNA sequence (and encoded Polypeptide). Splice sites are indicated by arrows. Exon 2 is at position 33 Starting at 5, exon 3 starts at position 642. Sequence number of the cDNA sequence : 13 and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 14.   FIG. 13 is a map showing the structure of the P16 area. Exon 1α (E1α), Ex Paint Son 1β (E1β), Exon 2 (E2) and Exon 3 (E3) black. It is indicated by a box. Restriction sites EcoRI (R1), EcoRV (RV) and And salI (S). The restriction map above shows the genomic clone cosmid c5 and And P1 1063. The map below shows cell lines A375 and SK-me193 Is a deletion. The broken line shows the deleted DNA.   Figure 14 shows the sequences of mouse and human P16β transcripts. Large sentence Letters indicate the same nucleotides. Underlined stop codon in P16 open reading frame Attach. The splice junction between E1β and E2 is indicated by the caret (v). You The mouse β sequence is shown as SEQ ID NO: 25. The human β sequence is SEQ ID NO: 1. 3 nucleotides 193-461.   FIG. 15 shows expression of α transcripts in cell lines with a deletion of E1β. cd NA is from total RNA isolated from the indicated sample. Radiation labeled The above primers were used in the reaction to amplify the P16 transcript. Same volume α and β amplification Were mixed and the products were separated on a denaturing 5% polyacrylamide gel: lane 1 -Quiescent T cells; lane 2-cell line SK-me193; lane 3-cell line A375. .   16A-D show expression of P16 transcripts. Reaction with radiolabeled primer Was used to amplify the P16 transcript and the product was run on a denaturing 5% polyacrylamide gel. separated. In Figures 16A and 16B, the α and β reactants from the common sample were Mix before electrophoresis. Figure 16A shows P in RNA from various human tissues. 16 shows relative levels of transcripts: lane 1, brain; lane 2, chest; lane 3, kidney Lane; lane 4, lung; lane 5, lymphocyte; lane 6, ovary; lane 7, pancreas; lane 8, prostate; lane 9, spleen; lane 10, stomach; lane 11, thyroid. FIG. 16B shows Relative abundance of β-transcripts in human lymphocytes versus time after induction with mitogen Shown as a function: Lane 1, 0 hours; Lane 2, 1 hour; Lane 3, 2 hours; Lane 4, 4 hours; Lane 5, 8 hours; Lane 6, 16 hours; Lane 7, 24 hours; Lane 8,32 hours; Lane 9,40 hours; Lane 10,48 hours; Lane 11,56 hours Between; Lane 12, 64 hours. FIG. 16C shows the phase of α transcript in human lymphocytes. Logarithm is shown as a function of time after induction with mitogen: lanes in Figure 16B. Same, but omit the 1 hour point. Suspected to affect cell cycle progression The expression of other molecules that are regulated at the transcriptional level during the cell cycle or during the cell cycle. I also analyzed it. Consistent with previous results, CDK4 and GoS2 (unknown function , But its transcription is induced when resting T cells enter the cell cycle) Elevated by induction of T cells (Russell and Force Dyke) sdyke), 1991; Matsuhime et al., 1992; Geng Oh. And Weinberg, 1993). In contrast, during the experimental period, p27 RNA levels appeared to be unchanged (Toyoshima and Ha. Hunter, 1994; Kato et al., 1994). FIG. 16D shows P16 transcripts are shown as a function of Rb status. Rb-Cell line: Lane 1, WERI Lane 2, CaSki; Lane 3, SiHa; Lane 4, C33A; Lane 5, 5 637; Lane 6, MDA MB468. Rb+Cell line: Lane 7, T2 4; Lane 8, HaCaT; Lane 9, Zr75; Lane 10, Bristol 8; Lane 11, UMSCC2; Lane 12, diploid human fibroblast MRC5 (28 Lane 13, KIT (Hori et al., 1987).   FIG. 17 shows the cDNA sequence for MTS1 containing the non-coding portion of the cDNA. Indicates a column. Triangles indicate splice junctions. Second splice jean The dashed line in the sequence at the junction simply highlights this splice junction. However, they do not represent the deleted bases. This sequence is SEQ ID NO: 3. It is 6.Detailed Description of the Invention   The present invention provides multiple tumor suppressors in human cancer. sor) (MTS) gene somatic mutation and human cancer diagnosis and prognosis Concerning its use in. Furthermore, the present invention relates to germline in the MTS gene. Mutations and melanoma, melanoma of the eye, leukemia, astrocytoma, glioblastoma , Lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, myoma, Cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, as well as pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid Prone to cancer, such as cancer of the ovary, uterus, testes, kidneys, stomach, colon and rectum Regarding its use in the diagnosis of predisposition. The present invention also provides gene therapy and protein replacement therapy. Humans having mutations in the MTS gene, including methods and protein mimics Regarding the treatment of cancer. In the end, the present invention is directed to the drug screenin used in the treatment of cancer. About Gu   The present invention is directed to all or one of the MTS loci or mutated MTS loci. Parts, preferably at least 8 bases in length and not exceeding about 100 kb , Providing an isolated polynucleotide. Such polynucleotides are antisense It may be a nucleotide. The present invention further provides such an isolated polynucleotide. Recombinant constructs comprising, for example, recombinants suitable for expression in transformed cells Provide the construct.   Furthermore, a polynucleotide consisting of part of the MTS locus in the analyte or A method of detecting the expression product is provided by the present invention. Such a method The MTS gene locus may consist of a step of amplifying a part of the MTS gene locus. Including a step of providing a set of polynucleotides that are amplification primers for a part of It may be included. The method may also be used to diagnose predisposition to cancer or to diagnose cancer. The prognosis is useful.   The invention also relates to at least 5 amino acids encoded by the MTS locus. An isolated antibody that specifically binds to an isolated polypeptide consisting of residues, preferably mono Provide a clonal antibody.   The present invention also relates to a polynucleotide comprising a part of the MTS locus to be analyzed. A part of MTS locus in a suitable container There is provided a kit comprising a polynucleotide complementary to, and instructions for its use.   Furthermore, the present invention provides for the polymerisation of nucleotides to produce at least 8 consecutive MTS sequences. Prepare a polynucleotide consisting of obtaining a sequence consisting of consecutive nucleotides And a polymerized amino acid for co-translation in the MTS locus. A sequence consisting of at least 5 amino acids that are encoded. Methods are provided for preparing a polypeptide.   In addition, the present invention screens drugs for cancer treatment to produce MTS genes. Provide a method for identifying an appropriate drug for restoring the function of an object.   In the end, the present invention provides the means necessary for gene-based cancer cell-directed therapies. provide. These therapeutic factors are placed in a suitable vector, or Delivered to target cells in a more direct way so that the function of the MTS protein is reconstituted In the form of a polynucleotide consisting of all or part of the MTS locus. May be. The therapeutic factor is a polypeptide based on part or all of the protein sequence of MTS. It may be in the form of a door. These are functionally equivalent to the activity of MTS in vivo. Replace.   MTS loci that confer on individuals a predisposition to melanoma and other cancers ( In the prior art called the melanoma (MLM) locus), the Cdk , Specifically encoding MTS1 which has been found to be an inhibitor of Cdk4 Biography It has been found by the present invention that it is a child. In this specification, The gene is called MTS1. In addition, the MTS locus contains M for some of its sequences. It contains a second coding sequence called MTS2 which is similar to TS1. Both have been found by the present invention. The MTS1 gene has two separate promoters ( It has also been found according to the invention to have α and β). α promoter , The resulting mRNA is exon 1α, exon 2 and exon 2 It consists of Song 3. This is called MTS1. gained if the β promoter is used The resulting mRNA consists of exon β1, exon 2 and exon 3. this Called MTS1E1β. Mutations at the MTS locus in the germline are associated with melano According to the present invention, it is a predisposing factor for cancer and other cancers. Was found. After all, somatic mutations at the MTS locus are associated with all tumor targets. Associated with most tumor types, if not ip, and thus cancer or cancer prognosis It is according to the invention that it provides a general indicator of Was found. Mutations in the MTS locus are associated with coding sequences and non-coding Deletions, insertions as well as point mutations in the coding sequence.   The MLM locus is located between genetic markers and melanoma predisposition in Utah First Relic by showing a dramatic link between the 1 Occupy a traditional position (Cannon-Albright, 199) 2 years). In the consanguineous, the region determined by recombination is D9S736 and It is sandwiched between D9S171. Therefore, melanomas with deletions and non-melanomas Gene localization by analysis of homozygous deletions in both ranoma tumor cell lines These and other genetic markers have been used to drive replication. Minimal deletion The overlap region was flanked by IFNA-s and D9S171. These markers The YAC library was screened to identify the genomic clones surrounding the Was trained. P1 clones were isolated as part of the chromosomal region, Except for this gap, it was in contact with the region from IFNA-s to D9S171 . Specific sequence-sites tagged to create a more detailed molecular map (" STS ") was prepared. According to these markers and deletion analysis, the deletion The overlapping region is the marker c5, which is the marker found on cosmid 5 (c5). It overlapped with the part centering on .1 and c5.3. Most frequently deleted The marker present was c5.3, which was very close to the MTS.   Analysis of c5 for the presence of "CpG" islands revealed that c5 was low in MTS. Both were shown to contain one candidate gene. c5 EcoRI Fragment The DNA sequence of the gene was determined and compared with the sequence from GenBank. Human Similar to regions of previously identified genes encoding Cdk4 inhibitors or p16 A similar, distinct region of c5 was identified (Serrano et al., 1993). This These two candidate genes were designated MTS1 and MTS2. Lymphocyte, fetus Human brain and normal breast with MTS1 exon 2 probe Has identified an additional candidate called NTS1E1β.   Detailed comparison of the genomic sequence from c5 with the mRNA sequence of p16 1 contains a 307 bp extension that is the same as part of the sequence encoding p16. It became clear. The extension of this nucleotide in MTS1 It was adjacent to a recognizable splice junction sequence. Further special features of MTS1 By convention, MTS1 contains the entire coding sequence of p16 and two introns. It was shown to contain. Intron 1 is located 126 bp downstream from the translation initiation site Intron 2 was 11 bp upstream from the translation termination site. The two introns Contains the p16 coding sequence in three regions, a 126 bp 5'region (cord Ding exon 1), the central region of 307 bp (coding exon 2), And 11 bp 3'region (coding exon 3).   MTS2 is approximately in the direction of intron 2 from the 5'end of coding exon 2. It contained a region of almost the same DNA sequence as p16 which was extended by 200 bp. However, the sequence up to 51 bp upstream of intron 2 of MTS1 is similar to the sequence. The similarity was diminished, where the two sequences were completely different. this thing Corresponds to the position of the last codon of MTS2. MTS1-derived sequences and MTS The similarity between these two genes also shows that intron 1 From the 3'splice junction to about 50 nucleotides upstream Was shown. Therefore, the non-coding DNA portion is presumed to be coding DNA. It is more conservative than some of the areas covered. Sequence phase in coding DNA In order to eliminate the possibility that the difference is an artifact due to cloning, the sequence of MTS2 PCR primers were designed to specifically amplify across differences. This These primers are of the expected molecular weight from cosmid P1 and genomic DNA. The fragment was amplified. Therefore, it exists near the 3'end of exon 2 of MTS2. The existing difference sequence is the true genomic sequence.   MTS1E1β has exon 1 called exon 1β or 1Eβ, Sequence different from that found in exon 1 of MTS1 and MTS2 have. Furthermore, MTS1E1β is the same as exons 2 and 3 of MTS1. Exon 2 (E2) and Exon 3 (E3) are included. Exon 1β Is upstream of exon 1 of mTS1 and does not contain any coding sequence. Consequently, MTS1E1β is a translation initiation site in the first ATG of exon 2. Is encoded with p10.   Genomic DNA using exon 2 derived from an individual presumed to have an MLM predisposition To analyze the association with the genetically susceptible locus MTS. MTS1 and MTS2 were tested. In 1 out of 8 individuals , A DNA polymorphism was confirmed in exon 2 of MTS1. Mutation is a single nuku It was a reotide substitution and caused an amino acid change. This polymorphism is MLM It was branched in relation to the predisposing allele.   The predominance of lesions (deletion and nucleotide substitution) in MTS1 is Alternatively, we show that closely linked loci contribute to the tumor phenotype. these Damaged cells have a selective advantage over uninjured cells. Injury Another explanation that it is a random event unrelated to cell proliferation is some reason. There is no possibility that it will be established due to reasons. First, the tumor phenotype and mutations in MTS1 A high correlation of 1 means a causal relationship between MTS mutations and tumorigenesis. Second, M TS1 affects susceptibility to melanoma and is therefore the only tumor suppressor gene. Stand and have meaning. Third, the biochemical function of p16 as a Cdk inhibitor is TS1 acts as a general inhibitor of the onset of DNA replication in vivo It matches the model of doing well.   According to the diagnostic and prognostic methods of the present invention, changes in the wild type MTS locus can be detected. It In addition, detect wild-type MTS loci to confirm predisposition or lack of tumorigenesis By doing so, the method of the present invention can be carried out. "Changes in wild-type genes" For deletions, insertions and point mutations in coding and non-coding sequences. It includes all forms of mutations including differences. The deletion is for the entire gene Well, or may be part of a gene. Point mutations at the stop codon May occur, and may be a frameshift mutation or an amino acid substitution. body Cellular mutations may occur only in certain tissues, such as tumor tissue, Not inherited in the lineage. Germline mutations found in any body tissue Be inherited. Early tumor status when only one allele is somatically mutated Is shown. However, if both alleles were mutated, late tumor status Is shown. Undeleted MTS allele (eg, having a deletion of MTS Found on sister chromosomes relative to the It is possible to screen for other mutations such as natural mutations. On tumor tissue Many of the mutations found in the table reduce expression of the MTS gene product. Ah However, mutations that result in non-functional gene products also induce cancer conditions. Will guide you. Point mutations in regulatory regions such as gene promoters Can occur, causing a deficiency or reduction in mRNA expression. Further collision Natural mutations abolish correct RNA processing and lead to expression of the MTS gene product. Causes a decrease or a decrease in mRNA stability or translation efficiency.   A useful diagnostic method is fluorescence in situ hybridization (FISH), Direct DNA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-stranded conformation Analysis (SSCA), RNase protection assay, allele-specific oligos Cleotide (ASO), dot blot analysis and as further detailed below Includes, but is not limited to, PCR-SSCP.   Prone to cancer such as melanoma and other cancers identified in the present invention The predisposition is tested by testing any tissue in humans for mutations in the MTS gene. Can be confirmed. For example, a human who inherits a germline MTS mutation Tends to develop cancer. D from any tissue of the person's body It can also be examined by testing the NA. The easiest way is to take blood , Extract DNA from blood cells. Furthermore, fetal cells, placental cells, or amniotic fluid are added to M A fetal diagnosis can also be made by testing for mutations in the TS gene. It Changes in the wild-type MTS allele due to, for example, point mutations or deletions, It can be detected by any means described herein.   To detect changes in the wild-type MTS allele in a tissue, is it normal tissue? It is useful to isolate the tissue from Enriched tissue preparations for tumor cells Means for causing are known in the art. For example, the tissue may be paraffin or Alternatively, it may be isolated from cryostat sections. For cytometry Cancer cells may be separated from more normal cells. To separate tumor cells from normal cells These as well as other methods for culturing are well known in the art. tumor Mutation detection becomes more difficult when normal cells are heavily contaminated with tissues.   Rapid pre-analysis to detect DNA sequence polymorphisms with one or more What to do by examining a series of Southern blots of DNA fragments with different restriction enzymes Can be. Each blot contains a set of normal individuals and a set of cancers, tumor patients, or both. Including one. Southern blots showing hybridizing fragments (MT When a probe near the S locus or a sequence containing it is used as a probe, Of different lengths) indicates the possibility of mutation. Results in very long restriction fragments When using restriction enzymes, use pulsed field gel electrophoresis (“PFGE”) It Molecular cloning of the MTS allele using methods well known in the art. Detection of point mutations by sequencing and sequencing alleles of interest. It can be carried out. Alternatively, using known methods, the genome derived from the tumor tissue It is also possible to amplify the gene sequence directly from the DNA preparation. Then the amplified sequence The DNA sequence can be determined.   A more complete but still more complete confirmation of the presence of susceptible alleles There are six well-known methods for indirect testing: 1) single-stranded conformation. Analysis (“SSCA”) (Orita et al., 1989); Dient Gel Electrophoresis ("DGGE") (Wartell et al., 1990; Sheffield (Sheffie1d et al., 1989); 3) RNase protection assay ( Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al. , 1991); 4) allele-specific oligonucleotides ("ASOs") ( (Conner et al., 1983); 5) E. coli mutS protein Use of proteins that recognize nucleotide mismatches, such as h), 1991); and 6) allele-specific PCR (Rano and Ki). Kidd, 1989). Allele-specific PCR has a 3'end A primer that hybridizes to a specific MTS variant is used. Specific MTS If no mutant is present, no amplification product is observed. European Patent Application No. 0332 435 and the amplification refractory mutation disclosed in Newton et al., 1989. System (Amplification Refractory Mutation System) (ARMS) Good. By cloning, sequencing, and then performing amplification, the gene Insertions and deletions can also be detected. Furthermore, the gene or a marker around it Alleles using restriction fragment length polymorphism (RFLP) probes to Offspring changes or insertions in polymorphic fragments can also be evaluated. Scarecrow The method involves altering the relatives of an affected individual to the MTS variable found in that individual. Useful for screening for the presence of differences. Known in the art Other methods for detecting insertions and deletions can also be used. The first 3 In two ways (ie SSCA, DGGE and RNase protection assay) And a new electrophoretic band appears. Sequence changes are due to single-stranded intramolecular base pairing , SSCA detects differently migrating bands. RNas e-protection cleaves a mutant polynucleotide into two or more small fragments Need. DGGE shows the migration rate of mutant sequences using denaturing gradient gel. The difference from the wild-type sequence of is detected. Allele-specific oligonucleotide assay In ii, we designed an oligonucleotide that detects a specific sequence and The assay is performed by detecting the presence or absence of a hybridization signal. mutS In the assay, the nucleotide in the heteroduplex between the mutant and wild-type sequences is The protein binds only to sequences with cleotide mismatches.   According to the invention, mismatch means that the two strands do not show 100% complementarity, It is a hybridized nucleic acid duplex. Lack of overall identity may be due to deletions, insertions It may be due to ingress, inversion or substitution. Mismatch detection can be used to Can detect point mutations in its mRNA product. These ways Is less sensitive than sequencing, but can be easily performed on many tumor samples It An example of a mismatch cleavage method is the RNase protection method. In the practice of the invention, The method involves labeling a riboprod complementary to a human wild-type MTS gene coding sequence. Requires the use of ribove. Isolated from riboprobe and tumor tissue Anneal (hybridize) either mRNA or DNA, then The enzyme RNa capable of detecting some mismatches in the double-stranded RNA structure Digest with seA. If a mismatch is detected by RNaseA, then RNas eA cleaves the site of the mismatch. Thus, the annealed RNA If the preparation is separated on a matrix of electrophoretic gel, If more mismatches are detected and cleaved, the riboprobe and mRNA or D RNA products smaller than the full length duplex for NA will be seen. Revolving The probe does not require full-length MTS mRNA or gene It may be a fragment. The riboprobe is the only MTS mRNA or gene. If it consists of one fragment, use many of these probes for mismatch It is desirable to screen all mRNA sequences.   In the same way, misses with a DNA probe due to enzymatic or chemical cleavage. Matches can be detected. For example, Cotton et al., 1988; See Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Another As a method, electrophoresis of mismatched duplexes relative to matched duplexes should be performed. The mismatch can also be detected by the change in mobility. For example, Caliero ( Cariello), 1988. Either a riboprobe or a DNA probe Using, the mRNA or DNA of the cell having the mutation is hybridized. PCR (see below) before amplification can be used. In MTS DNA The change is particularly a case where the change is a large sequence change such as a deletion and an insertion. In that case, Southern hybridization can also be used for detection.   The DNA sequence of the MTS gene amplified by using PCR was Screening may be performed using a child-specific probe. These probes are nucleic acids Oligomers, each containing a region of the MTS gene sequence with a known mutation I'm out. For example, one oligomer has a length corresponding to a part of the MTS gene sequence. May be about 30 nucleotides. Such allele-specific probe sets PCR amplification products can be screened and previously identified by using The presence of a mutation in the existing MTS gene can be confirmed. For example, Nairo On the filter, the allele-specific probe with the amplified MTS sequence Hybridization can be performed. Stringent hybridization conditions Hybridization to a particular probe under We show that the same mutations in lobes are present in tumor tissue.   The most definitive test for mutations at candidate loci is from cancer patients. Comparing genomic MTS sequences with sequences from controls. Alternatively, for example The messenger RNA can be sequenced after amplification by PCR, More can eliminate the need for determining the exon structure of a candidate gene.   Mutants derived from cancer patients that occur outside the coding region of MTS have been identified by Non-cordin such as introns and regulatory sequences near the offspring or in the MTS gene It can be detected by examining the sequence. In non-coding areas The early indication that mutations that are important is that cancer patients have Abnormal size messenger RNA molecules or messenger RNA components Derived from Northern blot analysis revealing abundance of offspring.   Alteration of MTS mRNA expression can be achieved by any method known in the art. Even can be detected. These methods include Northern blot analysis, PCR Includes amplification and RNase protection. Reduced mRNA expression is due to wild type MTS Biography Show changes in offspring. Changes in the wild-type MTS gene were compared with those in the wild-type MTS protein. It can also be detected by all screenings. For example, MTS and immune response Tissues can be screened using responsive monoclonal antibodies . Lack of cognate antigen would indicate a mutation in MTS. Mutated allele product Mutant MTS gene products can also be detected using an antibody specific for. Take Immunological assays in any convenient format known in the art Can also be done. They include Western blots, immunohistological assays and And ELISA assays. Squid for detecting altered MTS protein? By using this means, it is possible to detect a change in the wild-type MTS gene. Protein Functional assays such as differential analysis can be used. For example, MTS protein It is known to bind to Cdk, especially Cdk4. Therefore, wild type MTS Assays for binding capacity to white or Cdk4 can be used. It In addition, biochemical functions of MTS (inhibition of Cdk such as Cdk4 and cell Assays that detect cycle regulation) can also be used. Mutated MTS gene Product discovery indicates an alteration in the wild type MTS gene.   Mutated in samples from other human bodies such as serum, stool, urine and sputum It is also possible to detect the MTS gene or gene product. Mutated in tissue Same method for detecting MTS gene or gene product from other body Can be applied to samples. Cancer cells detach from the tumor and are tested by the body. Present in the fee. Moreover, the MTS gene product itself is secreted into the extracellular space, It is found in these body samples even in the absence of vesicles. Such body test Screening fees for many types of cancers Diagnosis can be done. In addition, the mutated MTS gene or gene product And testing such body samples to monitor the progress of chemotherapy and radiation therapy. It can be easily monitored.   The diagnostic method of the present invention is applicable to any tumor in which MTS plays a role in tumorigenesis. It is also applicable to ulcers. Deletion of chromosome arm 9p or body within MT region Cellular mutations were observed in almost all tumors tested. Invention diagnosis The method is useful to the clinician, so the clinician should determine the appropriate course of treatment. Can be.   The primer pairs of the present invention can be used to identify specific MTS alleles using PCR. It is useful for determining the reotide sequence. A pair of single-stranded DNA primers is attached to chromosome 9 MTS gene by annealing with a sequence in or around the MTS gene on p. Amplification of the DNA synthesis of the offspring itself can be initiated. Full of these primers Sets all nucleotides of the MTS gene coding sequence, ie Chi-exon synthesis is possible. Preferably, the set of primers is an intron And allows the synthesis of exon therapy sequences. Allele-specific primers It can also be used. Such primers can be used to anneal with specific MTS mutant alleles. And thus amplify only the product in the presence of the mutant allele as a template Will   To facilitate the subsequent cloning of the amplified sequence, the primer is It may have a sequence of a restriction enzyme site added to the'end. Thus, limited fermentation All of the primers except the few nucleotides needed to form the prime site Nucleotides from the MTS sequence or sequences flanking the MTS. Such fermentation Elements are well known in the art. The primer itself is well known in the art. It can be synthesized using the method described above. Generally, commercially available oligonucleosides Primers can be synthesized using a Tide synthesizer. SEQ ID NO: 1, sequence No .: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 and Given the sequence of the MTS open reading frame shown in SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 36. The design of the limer is familiar to those skilled in the art.   The nucleic acid probes provided by the present invention are useful for many purposes. Those, Southern hybridization to genomic DNA, and points already mentioned above It can be used in the RNase protection method for mutation detection. The probe of the present invention Can be used to detect PCR amplification products. MTS inheritance using other methods Using the probes of the invention to detect mismatches in the offspring or mRNA Good.Definition   The present invention uses the following definitions:   “Amplification of polynucleotides” refers to polymerase chain reaction (PCR), ligation Amplification (or ligase chain reaction (LCR) and Q-beta replicase It is used to refer to the amplification method by stretching. These methods are well known and It is widely practiced in the field. U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4, 683,202 and Innis et al., 1990 (with respect to PCR); See Wu et al., 1989a (Regarding LCR). Reagent for performing PCR And the hardware is commercially available. It is preferable to increase the sequence derived from the MTS region. Useful primers to extend the MTS region or a region adjacent to its target region. Is complementary to and specifically hybridizes to the sequence in. Increase The MTS sequence obtained by width may be sequenced directly. Alternatively, but oh Undesired method, the amplified sequence must be cloned before sequencing. Good. Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic fragments The method for this is described in Scharf, 1986.   "Analyte Polynucleotide" and "Analyte Strand" have a target sequence And may be present in various types of samples, including biochemical samples. Single-stranded or double-stranded polynucleotide.   "Antibodies" The invention further relates to MTS polypeptides and fragments thereof. Is a polynucleotide derived from the MTS region, especially from the MTS locus or a part thereof. Polyclonal and / or monoclonal antibody that specifically binds to a sequence As well as fragments thereof, and immunological binding equivalents thereof. "antibody The term "serum production consisting of a uniform molecular body or of many different molecular bodies. It is used to refer to the therapy of mixtures such as things. Polypeptide in peptide synthesizer A peptide is prepared synthetically and a carrier molecule (eg, keyhol limpet (keyhol e limpet) hemocyanin) and then for several months Can be injected into Gi. To MTS polypeptide or fragment Rabbit sera are tested for immunoreactivity against. Protein, polypeptide, fusion Monoclonal by injecting mice with proteins or their fragments Antibodies may be made. Screen monoclonal antibodies by ELISA And specific immunoreactivity to MTS polypeptides or fragments thereof. To test. See Harlow and Lane, 1988. This These antibodies will be useful in assays as well as in medicine.   Once a sufficient amount of the desired polypeptide is obtained, it can be used for various purposes. You can A typical use is the production of specific binding antibodies. These antibodies are It may be recombinant or monoclonal and is well known in the art. In vitro method or in vivo method.   For the production of polyclonal antibodies, a suitable target immune system, typically mouse or mouse, is used. Select a heron. Then the appropriate method for the animal and familiar to immunologists The purified antigen is presented to the immune system in a manner determined by the other parameters. Typical injection sites are the instep, intramuscular, intraperitoneal, or percutaneous. of course, Other species may be used in place of the mouse or rabbit. Then known in the art The polyclonal antibody is purified using the methods described and adapted to the desired specificity.   Immunoassays are commonly used to assay immunological responses. Usually a heel Immunoassays, for example, are produced by the same cell, same method as the antigen. Some purification of the source of antigen is required. Various immunoassays are Well known in the art. For example, Harlow and Rain (La ne), 1988, or Goding, 1986.   10-8Or preferably 10-9Through 10-TenM-1Or stronger parents Monoclonal antibodies that are compatible with, typically, for example, Harlow And Lane, 1988, or Goding, 1986. It is prepared by the standard method described above. Simply select a suitable animal and Follow desired immunization protocol. After a suitable period of time, the spleen of such animals is cut. And typically immortalize individual splenocytes under appropriate selective conditions. Fused with myeloma cells. After that, cells are clonally separated and The supernatant is tested for production of the appropriate antibody specific for the desired region of the antigen.   Other suitable methods include exposing lymphocytes to an antigenic polypeptide in vitro, Alternatively, select a library of antibodies in phage or similar vectors. Include. See Huse et al., 1989. Polypeptide of the Invention and Anti The body may be used with or without modification. Often a detectable signa By attaching covalently or non-covalently a substance having Peptides and antibodies will be labeled. Various labels and conjugation methods are known , Widely reported in both academic and patent literature. Suitable label is radioactive Nuclei, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent substances, chemiluminescent substances, magnetic particles, etc. Includes. A patent teaching the use of such labels is US Pat. No. 3,817,837. 3,850,752,3,939,350,3,996,345,4,277,437 4,275,149 and 4,366,241. In addition, recombination exemption Epiglobulin may be obtained (see US Pat. No. 4,816,567).   A “binding partner” is a moiety capable of binding a ligand molecule with high specificity. A child, for example, an antigen and an antigen-specific antibody, or an enzyme and its inhibitor. Generally, the specific binding partner binds with sufficient affinity to bind the analyte copy / Isolation conditions for complementary duplexes (for polynucleotide hybridization) Must be fixed below. Specific binding partners are known in the art. For example, biotin and avidin or streptavidin, IgG Protein A, many known receptor-ligand couples, and complementary polynucleotides Includes otido chains. Usually in the case of binding partners of complementary polynucleotide strands , The partner is at least about 15 bases long and at least 40 bases long May be Polynucleotides are DNA, RNA, or synthetic nucleotides It may consist of analog.   A "biological sample" is a polynucleotide or polynucleotide of interest from an individual. Samples of tissues or body fluids that may have peptides, such as plasma, serum, Spinal fluid, lymph, outer skin, respiratory, gastrointestinal and genitourinary tracts, saliva Includes samples of blood cells, tumors, organs, tissues and in vitro cell culture components But, It is not limited to these.   The terms "diagnosis" or "prognosis" as used herein refer to the process of tumorigenesis. 1) classification of disorders as tumorigenesis, 2) determination of the severity of tumorigenesis, and 3) Used to show monitoring of disease progression before, during and after treatment Can be.   A "encode" polynucleotide is said to "encode" a polypeptide. Be done. If it is in its native state, or if it is When further engineered, the polynucleotide is transcribed and / or translated into the mRN. A and / or a polypeptide or fragment thereof. A The antisense strand is complementary to such nucleic acid from which the coding sequence was deduced. Can be   "Isolated" or "substantially pure" "isolated" or "substantially pure" A “smart” nucleic acid (eg, RNA, DNA or mixed polymer) is a ribosome, Native human histories such as Limerase and many other human genomic sequences and proteins. Substantially separated from other cellular components essentially associated with the sequence or protein Is. The term includes nucleic acid sequences or proteins taken from their natural environment, Recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogs are also Preferably, it includes analogs that are biologically synthesized by heterologous systems.   "MTS allele" refers to normal alleles of the MTS locus, as well as individuals. Cancer in many parts of the body (eg, melanoma, melanoma of the eye, leukemia, astrocytes) Tumor, glioblastoma, lymphoma, glioma, Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, Sarcoma, myoma, cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, as well as pancreas, breast, brain, prostate , Cancer of the bladder, thyroid, ovary, uterus, testis, kidney, stomach, colon and rectum) An altered allele that gives a predisposing factor. Allele conferring such a predisposition Is also referred to as the "MTS susceptibility allele".   "MTS locus," "MTS gene," "MTS nucleic acid," or "MTS poly A "nucleotide" is a polynucleotide of which all are in the MTS region. A polynucleotide that is likely to be expressed in normal tissues. Out of them Alleles of certain species are present in individuals at many sites of cancer (eg, melanoma, melanoma of the eye). Ma, leukemia, astrocytoma, glioblastoma, lymphoma, glioma, Hodgkin lymph Tumor, multiple myeloma, sarcoma, myoma, cholangiocarcinoma, squamous cell carcinoma, CLL, and Pancreas, chest, brain, prostate, bladder, thyroid, ovary, uterus, testis, kidney, stomach, colon. Predisposed to develop rectal cancer). The term MTS locus Use of "MTS" in place of the MLM locus referred to in the prior art in the detailed text Includes "MLM" used in connection with loci, genes, regions, etc. M Mutations at the TS locus are associated with initiation and / or progression of other types of tumors. You may be in a row. In some cases, the loci are mutated by mutations that predispose the individual to the development of cancer. Is shown. These mutations are within the MTS region. MTS locus Control coding regions, intervening sequences and transcription and / or translation Including regulatory elements. The MTS locus is the entire DNA sequence Including allelic variants of.   These terms, when used in reference to nucleic acids, include MTS polypeptides (p16 , Fragments, homologues or variants (eg, for protein fusions or deletions) (According to the following). The nucleic acid of the present invention encodes a natural MTS Sequence derived from or substantially similar to the gene of interest, or native MT It has a sequence having homology with the gene encoding S or a part thereof. M The coding sequence for the TS polypeptide (MTS1) is shown in SEQ ID NO: 1. , MTS polypeptide (MTS1) amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Second Of the MTS polypeptide (MTS1E1β) of SEQ ID NO: 13 And the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14. Third MTS Polypep The coding sequence for tide (MTS2) is shown in SEQ ID NO: 15, and the corresponding amino acid The acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16. The term P16 refers to MTS1 and MTS1E It replaces 1β and encodes MTS1 and p10 encoding p16. It is used to control both the current MTS1E1β. MTS1 and M TS1E1β is two forms of one gene, and these two forms are involved in transcription. The state depends on the two promoters of the gene. MTS2 is a separate MTS area of Part, which encodes p15.   The polynucleotide of the present invention includes RNA, cDNA, genomic DNA, synthetic form, And mixed polymers, both sense and antisense strands, including chemical and May be biologically modified, or non-naturally Alternatively, it may contain a derivatized nucleotide base. Such modifications are For example, labeling, methylation, of one or more naturally occurring nucleotides Substitutions with analogs, uncharged bonds (eg methylphosphonate, phosphotriene) Esters, phosphoamidates, carbamates, etc.), charged bonds (eg (Suphorothioate, phosphorodithioate, etc.), suspended parts (Eg, polypeptide), insert (eg, acridine, psoralen, etc.), Chelators, alkylating agents, and modified linkages (eg alpha anomers Intermolecular modifications such as nucleic acid). In addition, hydrogen bonding and other chemical phases The ability to mimic a polynucleotide in its ability to bind to a particular sequence by interaction. Adult molecules are also included. Such molecules are known in the art, eg, the molecular backbone In which a peptide bond is used instead of a phosphate bond in.   The present invention provides a recombinant nucleic acid consisting of all or part of MTS. The The recombinant construct may be capable of autonomous replication in the host cell. Also, the combination The replacement construct may be integrated into the chromosome of the host cell. Such recombinant poly Nucleotides can be genomic, cDNA, semisynthetic, or synthetic And is associated in nature due to their origin or handling. Is not associated with all or part of a polynucleotide that contains; Linked to a polynucleotide other than the linked polynucleotide; yes 3) Either does not exist in nature.   Therefore, a recombinant nucleic acid comprising a non-naturally occurring sequence is provided by the present invention. To be done. The wild-type sequence may be used, but often it will be, for example, a deletion, a substitution. Or will be changed by insertion.   Various types of cDNA or genomic libraries can be used as the natural source for the nucleic acids of the invention. , Or genomic DNA or other naturally occurring Providing such a nucleic acid by amplifying the sequence present in the source by arrow PCR Good. Usually, a cDNA library is selected by selecting mRNA for the desired protein. Corresponds to abundant tissue origins. Phage libraries are usually preferred, but others This type of library may be used. Library clones on plate And transfer to a substrate for screening, denature, and then allow for the presence of the desired sequence. Probed for presence.   The DNA sequences used in the present invention will usually have at least about 5 codons (15 nucleotidies). D), usually at least about 7 to 15 codons, and most preferably less Both will consist of about 35 codons. This number of nucleotides is usually Required for a convenient probe that specifically hybridizes to the sequence encoding It is almost the minimum length.   Nucleic acid handling methods are generally described, for example, in Sambrook. rook) et al., 1989 or Ausbel et al., 1992. It Reagents applicable to such a method, such as restriction enzymes, are widely known in the art. It is being held, New Engrand Biolabs (New England BioLabs), Boehringer Mannheim, Amersham , Promega Biotec, US Biochemicals ( U.S. Biochemicals, New England Nucl ear) and many other vendors. Invention fusion Recombinant nucleic acids used to produce proteins may be of natural or synthetic sequence. Yes. Many natural gene sequences can be cloned into cDNA or genomic sequences using appropriate probes. Can be obtained from Ibrary. GenBank National Inn See National Institute of Health.   The “MTS region” is P1-1062 and P1-1063 which are P1 clones. A part of human chromosome 9 found in. E. coli NS3529 Of these P1 clones from Rockville, Maryland, USA. American Type Culture Collection) on March 16, 1994, with deposit number ATCC respectively. 69589 and 69590. This area is for MTS1, MTS2 And the MTS locus containing the MTS1E1β gene.   As used herein, the terms "MTS locus," "MTS allele," and "MTS region." Region is all double-stranded DNA consisting of the locus, allele or region) And a single-stranded DNA consisting of the locus, allele or region.   As used herein, the term "part" of the MTS locus or region or allele is , At least about 8 nucleotides, or preferably about 15 nucleotides Or more preferably has a minimum size of at least about 25 nucleotides and is less Both are defined as having a minimum size of about 40 nucleotides.   An "MTS protein" or "MTS polypeptide" is defined by the MTS locus. Protein or polypeptide (MTS1 polypeptide, MTS2 polypeptide Peptide and MTS1E1β polypeptide), variants or fragments thereof Say. The term "polypeptide" refers to polymers of amino acids and equivalents thereof, It does not refer to a specific length of the product; therefore, peptides, oligopeptides and And proteins are included in the definition of polypeptide. This term is a modified form of a polypeptide, For example, glycosylated, acetylated, phosphorylated, etc. Rather than say, or eliminate them. For example, one or more Polypeptides containing mino acid analogues (eg unnatural amino acids etc.), substituted Poly with binding and other modifications, both natural and non-natural, known in the art Peptides are included in the definition. Usually, such a polypeptide is native At least about 50%, preferably about 90% or more homologous to the MTS sequence. , And more preferably at least about 95% homology. In addition, high or low tension DNA that hybridizes to the nucleic acid encoding MTS under reduced conditions Closely recovered by antiserum against the encoded protein and MTS protein Also included within the definition are polypeptides or proteins related to.   The length of polypeptides compared for homology will generally be at least about 16 amino acids, usually at least about 20 residues, more usually at least about 24 residues Groups, typically at least about 28 residues, and preferably more than about 35 residues .   "Operably linked" means that the components so described are intended. It is a juxtaposition that has a relationship such that it can exert those functions in an expression. For example, promote Promoter affects the coding sequence if Operably connected.   "Probe" MT predisposing to certain cancers or associated with most cancers Polynucleotide polymorphisms associated with S alleles have been shown to be sensitive to stringent or relaxed conditions. Stable hybrid to target sequence in hybridization and washing conditions Detected by hybridization with the forming polynucleotide probe It Stringent conditions are used when the probe is expected to be completely complementary to the target sequence. I will be able to. If some mismatches are expected, eg probe If a variant is expected to result from You may reduce the stringency of the dysation. Exclude non-specific / accidental binding A condition is selected, that is, a condition that minimizes noise. This reading is normal D These readings are relevant to the MTS susceptibility allele as they identify NA polymorphisms as well as mutations. Further analysis is needed to show the detection of the gene.   The probe for the MTS allele is the sequence of the MTS region or its cDNA. It may be derived. The probe may be any suitable length and may be It covers the whole area or part of the area, and it is unique to the MTS area. Make a zation. If the target sequence contains the same sequence as the probe, Even hybrids are relatively stable, so probes may be short, For example, it may range from about 8 to 30 base pairs. Some mismatch about the probe If expected, that is, if the probe is likely to hybridize to the variant region Can be a long probe that hybridizes to the target sequence with the required specificity. Yes.   A probe contains an isolated polynucleotide bound to a label or reporter molecule. Other polynucleotides that are It may be used to isolate the subtilis sequence. How to prepare and label probes Are, for example, Sambrook et al., 1989 or Ausbe. See l) et al., 1992. Homologous polynucleotides allow other similar polynucleotides to Ochid can be selected. Alternatively, by using the degeneracy of the genetic code To combine polynucleotides encoding these or similar polypeptides. Can be made or selected. Various changes due to silent changes Don substitutions may be introduced or expression may be optimized for a particular system. . The properties of the polypeptide, perhaps ligand binding affinity, interchain affinity, or Introduce mutations to alter the rate of polypeptide degradation or turnover May be.   A probe comprising the synthetic oligonucleotide of the present invention or another polynucleotide Is derived from a natural or recombinant single-stranded or double-stranded polynucleotide. Or may be chemically synthesized. In addition, Nick Trance Ration, Klenow fill-in reaction, or The probe may be labeled by other methods known in the art.   At least about 8 nucleotides, usually at least about 15 nucleotides, and Less than about 6 Kb, usually less than about 1.0 Kb Some are preferred as probes. MR encoding MTS using probe It may be investigated whether NA is present in cells or tissues.   A "protein modification or fragment" is substantially homologous to a primary structural sequence. Have, for example, in vivo or in vitro chemical and biochemical modifications Or an MTS polypeptide containing amino acids not normally found, or a polypeptide thereof. For ragments, used according to the invention. Such modifications include, for example, acetyl Sulfation, carboxylation, phosphorylation, glycosylation, ubiquitine Solution, radionuclei and labeling with various enzyme modifications by those skilled in the art. Includes modifications that are readily recognized. Various methods for labeling polypeptides Laws, or labels used for such purposes, are well known in the art,32P, A ligand (eg, an antibody) that binds to a labeled anti-ligand, a fluorophore, a chemophore Serves as a member of a specific binding pair for light agents, enzymes, and labeled ligands Possible antiligands are included. The choice of label depends on the sensitivity and primer Depends on ease of coupling, required stability, and available equipment. Polypeptide Methods of labeling are known in the art. For example, Sambrook et al. , 1989 or Ausbel et al., 1992.   In addition to the substantially full-length polypeptide, the present invention also provides biologically active such polypeptides. Provide a fragment of the polypeptide. The key biological activity is MTS polypep Includes ligand binding, immunological and other biological activities characteristic of tide . Immunological activity depends on the immunogenic function in the target immune system as well as the competitor or MT. Shares a binding immunological epitope that serves as a surrogate antigen for the S protein epitope It includes both. As used herein, an "epitope" is a polypeptide An antigenic determinant. Epitopes are in a spatial arrangement unique to that epitope It may consist of 3 amino acids. Generally, the epitope is at least It consists of 5, more usually at least about 8-10 such amino acids. Take The spatial arrangement of amino acids is known in the art.   Tandem-repeat polypeptides for immunological purposes The fragment may be used as an immunogen, which produces a highly antigenic protein. Be done. Also, such polypeptides are highly effective competitors for specific binding. Will serve as a quality. Specific for MTS polypeptides or fragments thereof The production of such antibodies will be described later.   The invention further provides fusion polypeptides comprising MTS polypeptides and fragments. Offer Petit. Between two or more MTS polypeptide sequences, or Homologous polypeptides can be fused between MTS and related proteins. As well In addition, heterologous fusions exhibiting mixed properties or activities of derivative proteins may be constructed. . For example, a new fusion polypeptide that differs from a ligand-binding or other domain by Alternatively, it may be "exchanged" with the fragment. Such homologous or heterologous fusion Polypeptides can exhibit, for example, altered binding strength or specificity. Fusion partners include immunoglobulins, bacterial β-galactosidase, trpE, Protein A, β-lactamase, alpha amylase, alcohol dehydrogenase Oh And yeast / alpha mating factor. For example, Godowski et al. See 1988.   Typically, the fusion protein may be produced by the following recombinant nucleic acid method, or It may be chemically synthesized. Polypeptide synthesis methods are described, for example, in Merrif ie1d), 1963.   "Protein purification" was transformed with a recombinant nucleic acid encoding MTS A variety of methods for isolating MTS polypeptides from other biological materials, such as from cells. Method, which are well known in the art. For example, such poly Peptides can be labeled with immunoaffinity using, for example, the antibodies provided by the invention. It may be purified by chromatography. Various methods for protein purification Known in the field, Deutscher, 1990 and Scoops opes), 1992.   The terms "isolated", "substantially pure" and "substantially homogeneous" refer to A protein or polypeptide separated from its naturally associated components It is used to say so. At least about 60 to 75% of the sample is a single poly When displaying a peptide sequence, the monomeric protein is substantially pure. Typically Substantial Protein is composed of about 60 to 90% W / W protein sample, Is about 95%, and preferably about 99% or higher. Protein purity or Homogeneity is measured by many means known in the art, such as polyacrylamide gel electro A single polypeptide band is obtained by running and then staining the gel. It can be shown by visualization. For some purposes, HPLC or A higher degree of separation can be obtained by using other known purification methods. May be.   MTS proteins, when isolated from naturally associated contaminants, are essentially It does not contain naturally associated components. Therefore, chemically synthesized or naturally A polypeptide synthesized in a cell line different from the origin in It will be free of naturally associated ingredients. Furthermore, in the field Isolation using known protein purification methods results in the naturally associated growth of proteins. Minutes may be removed.   Isolated or engineered, even if expressed in the same cell type Polypeptides produced as expression products of genetic sequences are referred to herein as "isolated." Polypeptide ". A form or molecule synthetically produced by a heterologous cell is It is a qualitatively isolated molecule.   A "recombinant nucleic acid" is two non-naturally occurring or separate fragments of a sequence. A nucleic acid prepared by an artificial combination of. This artificial combination Often, chemical synthesis or artificial manipulation of isolated fragments of nucleic acids, such as genetic engineering It is carried out by a technical method. Usually, such artificial manipulations result in codons that are the same or It replaces a degenerate codon that encodes a conservative amino acid, but typically One is the introduction or removal of a sequence recognition site. Also, by performing such an artificial operation , So as to combine nucleic acid fragments with desired functions to exert a desired combination of functions To do.   A "regulatory sequence" is usually a coding region of a locus that affects gene expression. Sequence within 10 Kb of the region (transcription of genes, translation of mRNA, Icing, stability, etc.).   “Substantially homologous or similar” as appropriate with other nucleic acids (or their complementary strands) Nucleotides when aligned (with proper nucleotide insertions or deletions) Nucleotide bases with at least about 60% identity in the sequence, usually about 70%, Usually at least about 80%, preferably at least about 90%, more preferably Is at least 95-98%, the nucleic acid or fragment thereof is “Substantially homologous” to each other (or “substantially similar”).   In addition, the nucleic acid or a fragment thereof is subjected to selective hybridization conditions. When hybridizing to another nucleic acid (or its complementary strand), There is substantial homology or (similarity) to the complement. All idiosyncrasies Where hybridisation occurs that is substantially more selective than in the absence of If so, there is selectivity of hybridization. Typically at least about 1 About 55% at 4 nucleotides, preferably at least about 65%, More preferably at least about 75% and most preferably at least about 90% homologous. If so, selective hybridization will occur. Kanehisa ( kanehisa), 1984. As explained, the length of homology comparison is A strand, in certain embodiments, at least about 9 nucleotides, Usually at least about 20 nucleotides, more usually at least about 24 nucleotides Nucleotides, typically at least about 28 nucleotides, more typically At least about 32 nucleotides, and preferably at least about 36 nucleotides It's Ochid.   Nucleic acid hybridization depends on the base composition, length, and hybrid Mismatched nucleotide base number with soybean nucleic acid, salt concentration, temperature Or under conditions such as organic solvents, which are readily recognized by those skilled in the art. Will be affected. Generally, stringent temperature conditions are above 30 ° C, typically It includes temperatures above 37 ° C, preferably above 45 ° C. Usually, stringent salt conditions are 1000 mM or less, typically 500 mM or less, preferably 200 mM or less It However, the combination of parameters can be any single parameter Is more important than the measurement of. For example, Wetmur and Davidson (Davidson), 1968.   Under certain conditions, the sequence of the probe also specifically Can form triplex or higher order DNA complexes. Preparation of such probe And suitable hybridization conditions are known in the art.   The terms "substantial homology" or "substantial identity" refer to polypeptides. In this case, the target polypeptide or protein is the whole natural protein or At least about 30%, usually at least about 70%, preferably Indicates having at least about 95% identity.   "Substantially similar function" refers to wild-type MTS nucleic acid or wild-type MTS polypeptide. Function of the modified nucleic acid or modified protein. Qualified po The lipopeptide is substantially homologous to the wild-type MTS polypeptide, It will have an apparent function, that is, an inhibitory function of Cdk, particularly Cdk4. The modified polypeptide may have an altered amino acid sequence, and / Alternatively, it may contain a modified amino acid. In addition to the function that inhibits Cdk , The modified polypeptides have other useful properties such as long half-life. Good. The Cdk inhibitory activity of the modified polypeptide is substantially the same as wild-type MTS. It may be the same as the activity of the polypeptide. Also, the Cd of the modified polypeptide The k inhibitory activity may be higher than the activity of the wild type MTS polypeptide. Qualified Polypeptides are synthesized using conventional methods or are modified with modified nucleic acids. And manufactured using conventional methods. Modified nucleic acid is conventional Manufactured by the method. Nucleic acid having substantially the same function as the wild-type MTS gene function Yields the modified protein described above.   Typically, homologies for polypeptides are determined using sequence analysis software. To be measured. For example, The Sequence Analysis Software Package The of the Genetics Computer Group, University Of Wisconsin Biotechnology Center, 910 Universi Tea Avenue Madison Wisconsin 53705 (the sequence A nalysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of W isconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin  53705). Protein analysis software allows for various substitutions, deletions and other modifications. A similar measure is used to match similar sequences. Typically, Conservative substitutions include substitutions within the following groups: glycine, alanine; , Isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid; asparagine, Glutamine; Serine, Threonine; Lysine, Arginine; and Phenylalani Tyrosine.   A "fragment," "portion," or "fragment" of a polypeptide is at least about 5 to 7, often at least about 7 to 9 amino acids, typically few At least about 9 to 13 amino acids, most preferably at least about 20 to 3 A sequence of zero or more consecutive amino acid residues.   A polypeptide of the invention, when soluble, will have a solid phase support such as nitrocell. Loin, nylon, column packing material (eg Sepharose beads), magnetic beads, Cover glass wool, plastic, metal polymer gels, cells, or other substances. You may pull it. Such supports include, for example, beads, wells, dipsticks or May be in the form of a membrane.   "Target region" refers to a region of nucleic acid that is amplified and / or detected. The term "mark "Sequential sequence" is a hybrid of which the probe or primer is stable under the desired conditions. An array that forms a head.   The practice of the present invention includes chemistry, molecular biology, microbiology, recombinants, unless otherwise specified. The conventional methods of DNA, genetics, and immunology are used. For example, Maniatis (Maniatis), 1982; Sambrook et al., 1981; Ausbe. Ausbel et al., 1992; Glover, 1985; Anand d), 1992; see Guthrie and Fink, 1991. . Regarding mapping of humans and genes, including mapping of humans and chromosome 9p For a discussion of the methods and materials to do, see, for example, White and La Rowell (L. alouel), 1988.Preparation of recombinant or chemically synthesized nucleic acids; vectors, transformations, host cells   Large quantities of the polynucleotides of the invention can be replicated in a suitable host cell. Can be manufactured. Natural or synthetic polynucleotide encoding the desired fragment Leotide fragments can be introduced into and replicate in prokaryotic or eukaryotic cells. Will be introduced into the recombinant polynucleotide construct, which is usually a DNA construct . Usually, the polynucleotide construct is a unicellular host organism such as yeast or bacteria. It may be suitable for replication in Also for introduction into cultured mammalian or plant or other eukaryotic cell lines Can be Purification of a nucleic acid produced by the method of the present invention can be performed, for example, by Sambrook ( Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1992. Have been.   In addition, the polynucleotide of the present invention can be used, for example, in a view cage (Beaucage) and And phosphoramida described by Carruthers, 1981. Ito method or Matteucci et al., 1981 triester method Commercially available automated oligonucleotides that can also be produced by chemical synthesis such as It can also be performed on a de-synthesizer. For double-stranded fragments, synthesize complementary strands and The strands are either annealed together or DN with appropriate primer sequences Chemically synthesized single strand formation depending on whether complementary strand is added using A polymerase It can also be obtained from things.   Polynucleotide constructs prepared for introduction into prokaryotic or eukaryotic hosts The product comprises a polynucleotide fragment of interest that encodes the desired polypeptide. It may comprise a replication system recognized mainly by the polypeptide, preferably the polypeptide. It may also include transcriptional and translational initiation regulatory sequences operably linked to the coding segment. Ah Expression vectors include, for example, ribosome binding site, RNA splicin Site, polyadenylation site, terminator sequence and mRNA stabilizing sequence. Origin of replication or autonomously replicating sequence (ARS) and expression control sequence, promoter Of the sequencer, enhancer, and necessary processing sequences may be included. . Secretory signals suitably include proteins that cross and / or anchor the cell membrane. A natural MTS protein that can be rendered and thus achieve its functional topography Quality or other receptors or secreted polypeptides of the same or related species Those derived from or secreted from cells can be included. Such vector Are well known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., 19 Standard set discussed in 1989 or Ausubel et al., 1992. It can be prepared by means of alternative techniques.   Selection of the appropriate promoter and other necessary vector sequences will function in the host. Selected, suitably containing those naturally associated with the MTS gene Good. Examples of operable combinations of cell lines and expression vectors are Sambrook ( Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1992. See also, eg, Metzger et al., 1988. . Many useful vectors are known in the art, and Stratagene ne), New England Biolabs, Inc. Lome Obtained from distributors such as Promega Biotech and others be able to. trp, lac and phage promoter, tRNA promotion And promoters such as glycolytic enzyme promoters are for use in prokaryotic hosts. Can be Useful yeast promoters include metallothionein, 3-phos Hoglycerate kinase or enolase or glyceraldehyde-3-ho Other glycolytic enzymes such as sulfate dehydrogenase, maltose and gala Promoter regions of enzymes involved in lactose utilization as well as promoters of others Area is included. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are , And also in Hitzeman et al., EP 73,675A. . Suitable non-native mammalian promoters include early and late promoters from SV40. Romanor (Fiers et al., 1978) or Mouse Moloney white blood Disease virus, mouse tumor virus, chicken sarcoma virus, adenovirus II, Contains a promoter from bovine papilloma virus or polyoma virus May be. In addition, multiple copies of the gene may be generated (eg, DHF The construct may be linked to an amplifiable gene (such as R). Suitable enhancer For other expression control sequences, see, for example, “Enhancers and eukaryotic genes Enhancers and Eukaryotic Gene Expression ", New York , Cold Spring Harbor, New York, Cole Cold Spring Harbor Press (1983) See also year).   Although such an expression vector can be autonomously replicated, it is well known in the art. They are inserted into the genome of the host cell by known methods It can also be duplicated.   Expression and cloning vectors include hosts transformed with the vector. A selectable marker, which is a gene encoding a protein required for cell survival or proliferation, It would be appropriate to be included. The presence of this gene results in expression of the insert. Proliferation of only those host cells is guaranteed. Typical selection genes are: a) eg Anne Antibiotics such as picillin, neomycin, methotrexate and others or other Confers resistance to toxic substances; b) complements auxotrophy, or c) examples For example, a gene encoding D-alanine racemase for the genus Bacillus. Coat proteins that supply important nutrients not available from complex media, such as genes. I am doing it. The choice of the appropriate selectable marker will depend on the host cell and will be determined by different hosts. Suitable markers for such are well known in the art.   A vector containing the nucleic acid of interest can be obtained by transcribing it in vitro. The obtained RNA is, for example, injected (see T. Kubo et al., 1988). It can be introduced into a host cell by a well-known method such as. Alternatively, the Electroporation; calcium chloride, rubidium chloride, phosphoric acid Transfection with calcium, DEAE-dextran or other substances Yon; microprojectile bombardment; lipo Infection; (a vector is an infectious agent, such as a retrovirus genome) Infection; and other methods in the art that vary with the type of cellular host, including It can be introduced directly into host cells by well-known methods (generally, Sambruc See Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1992. ). By any method known in the art including, inter alia, those mentioned above Introduction of a polynucleotide into a host cell is referred to herein as "transformation." You A cell into which the above-mentioned nucleic acid has been introduced is meant to include progeny of such cell. To taste.   Large amounts of the nucleic acids and polypeptides of the present invention are compatible with prokaryotic or eukaryotic organisms. In the host cell, the MTS nucleic acid or its in a vector or other expression vehicle. Can be prepared by expressing a portion of Most commonly used prokaryotic host Is Bacillus subtilis or Pseudomonas (Pse udomonas) may be used, but a strain of Escherichia coli Is.   Yeasts, filamentous fungi, plants, insects, or mammals such as amphibians or birds. Or other eukaryotic host cells may also be useful in producing the proteins of the invention. culture The proliferative potential of mammalian cells in is essentially well known (Jacoby (Ja koby) and Pastan (ed.) 1979). Commonly used Examples of mammalian host cell lines are, for example, highly expressed, desired glycosylation patterns. Other cell lines that may be suitable for providing a clone or other features are also available to the skilled practitioner. VERO and HeLa cells, Chinese hams Tar Ovary (CHO) cells and WI38, BHK and COS cell lines.   Clones are selected by using a marker that depends on the mode of vector construction. Pull out. The markers may be on the same or different DNA molecules, but the same Preferably, the DNA molecule is In prokaryotic hosts, for example, Ampic Transformants by resistance to phosphorus, tetracycline or other antibiotics Can be selected. The production of specific products based on temperature sensitivity is It can also be used as a car.   Eukaryotic or prokaryotic cells transformed with a polynucleotide of the invention, Not only the production of the nucleic acids and polypeptides of the present invention, but also for example MTS polypeptides It may also be useful for studying the characteristics of the dog.   The antisense polynucleotide sequence interferes with expression of the MTS locus or It is useful for reducing and will be understood by those skilled in the art. For example, MTS Other sequences from the locus or MTS region (especially flanks of the MTS locus) A polynucleotide vector containing all or part of It may be placed under the control of a lomotor and introduced into cells. Such antisense construction The intracellular expression of the product results in transcription and / or translation and / or replication of MTS. Manufacturing will be hindered.   Cyclins and Cdks are ubiquitous cell cycle controls in eukaryotes. It is a factor. Such proteins were first discovered in yeast and were associated with marine invertebrate motion. Found in animals, amphibians, and mammals including mice, rabbits and humans Has been done. Probes and / or primers based on the gene sequence of one species Used to identify homologous cell cycle control sequence genes in other species . Thus, probes and probes based on the MTS gene sequences disclosed herein. Identify homologous MTS gene sequences and proteins in other species using immers To do. These TMS gene sequences and proteins are related to the species in which they were isolated. Book Used in the diagnostic / prognostic, therapeutic and drug screening methods described herein .Methods of use; nucleic acid diagnostics and diagnostic kits   In order to detect the presence of MTS alleles, which predispose patients to cancer, blood is used to detect. When a biological sample was prepared to determine whether a susceptibility allele for MTS was present. analyse. Presence of neoplasm, progression towards malignant prodromal disorder, or prognostic indicator In order to detect the disorder, a biological sample of the disorder was prepared and the MTS neoplastic allele Is analyzed for the presence of. The results and interpretive information from these studies are Returned to the healthcare provider for communication with the tested patient. Scarecrow The diagnosis can be made by the laboratory making the diagnosis, or alternatively Kits can be manufactured and sold to healthcare providers or individual patients for self-diagnosis. Can also be.   First, the screening method includes related MTS, such as PCR. Included is sequence amplification followed by DNA sequence analysis. Another preferred embodiment of the invention In examples, the screening methods include non-PCR based methods. Scarecrow Two-step label amplification methodologies well known in the art included. Both PCR and non-PCR screening methods are highly efficient. The target sequence can be detected with bell sensitivity.   The most popular method currently used is target amplification. In the present invention , Amplify the target nucleic acid sequence with a polymerase. Amplification carried out by the polymerase One particularly preferred method used is the polymerase chain reaction (PCR). Book A preferred PCR method of interest within the scope of the invention is provided in Example 1. Po By amplification assays performed by the Limerase Chain Reaction and other polymerases , Through the use of amplification cycles performed by the polymerase, in copy number An increase of over one million times can be achieved. Once amplified, the resulting nucleic acid can be sequenced Alternatively, it can be used as a substance for a DNA probe.   Presence of the target sequence with the probe (eg, in a cancer susceptibility screen) When used to detect, the biological sample to be analyzed, such as blood or serum It may be processed to extract nucleic acids if desired. The sample nucleic acid is used to detect the target sequence. Content Various methods to facilitate; eg denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotte It may be prepared by a wing. The targeting region of the analyte nucleic acid is usually at least partially Is single-stranded and must form a hybrid with the target sequence of the probe. Yes. If the sequence was originally single-stranded, it would not need to be denatured. However However, if the sequence is double-stranded, it may need to be denatured. Ah Denaturation can be achieved by various methods known in the art. .   Analytical nucleic acids and probes are designed so that the target sequence in the probe is the expected targeting sequence in the Incubate under conditions that promote the formation of stable hybrids with the row. The region of the probe used to bind the analyte is the targeting region of human chromosome 9p. Can be made completely complementary to. Therefore, predict the wrong High stringent conditions are desirable to prevent. However, the probe High stringency conditions are used only if they are complementary to a unique chromosomal region. Yes The stringency of hybridization depends on temperature, ionic strength, base composition, probe length. And washing steps, including the concentration of and formamide Determined by many factors between. These factors are, for example, Maniatis ( Maniatis et al., 1982 and Sambrook et al., 1989. It is explained. Higher values such as triple helix, quadruple helix, etc. under certain conditions The formation of low order hybrids is hoped to provide a means to detect target sequences. Good.   A labeled probe is usually used to detect the resulting hybrid. It is achieved by Alternatively, the probe may be unlabeled, directly It may be detected by specific binding to a ligand that is labeled, either indirectly or indirectly. Suitable Suitable labels, and methods for labeling probes and ligands, are known in the art. For example, (eg nick translation, random ply Can be incorporated by known methods (such as Radioactive labels, biotin, fluorescent groups, such as dioxetanes, especially excitation Chemiluminescent groups (such as dioxatan), enzymes, antibodies and the like are included. This basic ski Deformation of the hybrid is known in the art, and the amount of hybrid Includes variants that facilitate separation and / or amplify the signal from the labeling site Be done. Many of these variants are found, for example, in Matthews and Clicker. (Kricka), 1988; Landegren et al., 1988; Mitt. Mittlin, 1989; US Pat. No. 4,868,105 and EPO Outlined in Kai 225,807.   As noted previously, in the present invention, non-PCR based screening assays are used. The essay is also intended. An exemplary non-PCR based method is provided in Example 15. To do. This method uses nucleic acid probe (or normal phosphodiester Analogs such as the phonate skeleton) to hybridize to low level DNA targets. Soybeans. This probe has a covalent bond that increases the specificity of hybridization. It may have an enzyme that covalently binds to the probe so as not to interfere. Next Thus, this enzyme-probe-conjugated target nucleic acid complex is isolated from the free probe enzyme conjugate. Separated and then substrate is added for enzyme detection. Enzyme activity is 10 in sensitivity3~ 106Observe as doubling of color development or change in luminescent output. Oligode Preparation of oxynucleotide-alkaline phosphatase conjugate and For examples related to their use as hybridization probes See Jablonski et al., 1986.   Two-step label amplification methods are known in the art. These assays are Small ligands (such as goxigenin, biotin) bind specifically to MTS It is based on the principle of binding to a nucleic acid probe. For MTS1 An exemplary probe corresponds to nucleotide positions 448-498 of SEQ ID NO: 4. Nucleic acid probe. Allele-specific probes are also of interest within the scope of this example. And exemplary allele-specific probes include predisposed sudden mutations summarized in Table 3. And probes containing somatic mutations in tumors summarized in Table 5 are included. .   In one example, the small ligand that binds to the nucleic acid probe is an antibody-enzyme conjugate. It is specifically recognized by coalescence. In one embodiment of this example, digoxigen The nin is attached to the nucleic acid probe. Hybridization is based on (chemiluminescence Substrate) antibody-alkaline phosphatase conjugate. This of For methods of labeling nucleic acid probes according to specific examples, see Martin et al. See 1990. In the second example, the small ligand becomes the primary ligand. A secondary ligand-enzyme conjugate capable of specifically forming a complex with Be recognized. A well-known example of this example is the biotin-avidin type phase. It is an interaction. Method for labeling nucleic acid probes and biotin-avidinbe For their use in the assay of glucose, see Rigby et al., 19 See 1977 and Nguyen et al. (1992).   The nucleic acid probe assay of the present invention is capable of detecting the MTS gene. It is also within the scope of the invention to use a mixture of lobes. Thus, thin In one example of detecting the presence of MTS1 in a vesicle sample, one complementary to MTS1 More probes than species are used, or, in particular, the number of different probes is a few Or 5 different nucleic acid probe sequences. In another example, the patient's M To detect the presence of a mutation in the TS1 gene sequence, one complementary to MTS1 A cross-species probe was used in which the mixture of patients with changes in MTS1 Contains probes that can bind to allele-specific mutations identified in sets It In this embodiment, any number of probes can be used, and preferably Correspond to major genetic mutations identified as predisposing individuals to breast cancer Probe will be included. Within the scope of the present invention several candidate pro Probes containing allele-specific mutations identified in Tables 3 and 5 Is included.Method of use; Peptide diagnostics and diagnostic kits   Detects neoplastic disorder based on alterations in wild-type MTS polypeptide You can also. Such changes can be determined by sequence analysis by conventional techniques. It More preferably, using an antibody (polyclonal or monoclonal antibody), Detect differences in the MTS peptide or the absence of the MTS peptide. The present invention In a preferred embodiment of, the antibody immunoprecipitates MTS protein from solution, and Western blots or immunoblots of polyacrylamide gels Will react with the MTS protein on the mouse. In another preferred embodiment, antibody Using immunohistochemical techniques to detect MTS proteins in paraffin or frozen tissue sections. Will detect white matter. Techniques for producing and purifying antibodies are well known in the art. It is well known that any such technique may be selected to achieve the inventive preparation. May be.   Preferred embodiments related to the method of detecting MTS or mutants thereof include: Sandwich method using monoclonal antibody and / or polyclonal antibody Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), including radioimmunoassay (RIA), immunoradioassay (IRMA) and immunoenzymatic method (IEMA). Get caught A typical sandwich method is US Pat. Nos. 4,376,110 and 4, 486,530 (incorporated herein by reference) to David et al. More described and illustrated in Example 18.Usage: drug screening   The present invention provides Cdk polypeptides or binding fragments thereof for the treatment of any of a variety of agents. Screening compounds by use in screening techniques Especially useful for. Preferably, Cdk4 is used. Cd used for such test The k polypeptide or fragment thereof may be attached to a solid support or attached to the cell surface. It may be a free substance in the solution being carried. One method of drug screening Is a stable recombinant polynucleotide that expresses a polypeptide or fragment thereof. Transformed prokaryotic or eukaryotic host cells are preferably competent for binding. Used in the sei. Such cells, either independent or in fixed morphology, can be bound to a standard binding assay. It can be used for sei. For example, testing with Cdk polypeptides or fragments thereof Formation of a complex between the Cdk polypeptide and its Formation of a complex between the fragment and the MTS polypeptide or fragment thereof may result in the agent being tested. Therefore, it is possible to test the degree of interference.   Thus, the present invention provides for such factors by methods well known in the art. With a Cdk polypeptide or a fragment thereof, and then 1) the factor and Cd the presence of a complex between the k polypeptide or a fragment thereof, or 2) Cd the existence of a complex between the k polypeptide or a fragment thereof and the ligand Provided is a method for screening a drug characterized by assaying. further, Factors capable of inhibiting Cdk by measuring Cdk activity and thus regulating the cell cycle Decide whether or not. In such competitive binding assays, typically Cdk Label the polypeptide or fragment thereof. Free Cdk polypeptide or fragment thereof The strips are separated from those present in the protein: protein complex and released (ie The amount of label (which did not form a plex) was related to the Cdk of the agent tested, respectively. Binding or interference with Cdk: MTS polypeptide binding. MTS Po The small peptides of the lipopeptide (peptidomimetics) were thus analyzed to Those with inhibitory activity are identified.   Another method of drug screening is suitable for Cdk polypeptides. Providing a high throughput screen for compounds with binding affinity, European Patent Application No. 84/03, published September 13, 1984, by Geysen 664 in detail. Simply put, many different small peptides A solid support, such as the surface of a plastic pin or the like, of a test compound Synthesize above. Peptide test compound is reacted with Cdk polypeptide and washed . The bound Cdk polypeptide is then conjugated by methods well known in the art. Is detected.   The purified Cdk is directly loaded onto the plates used in the drug screening techniques described above. Can be coated. However, use non-neutralizing antibodies to the polypeptide The antibody can then be captured to immobilize the Cdk polypeptide on the solid phase.   The present invention is also directed to the use of competitive drug screening assays, where , Cdk polypeptides or fragments thereof for binding to Cdk polypeptides. The test compound competes with a neutralizing antibody capable of specifically binding to the test compound. In this way , Using an antibody, having one or more antigenic determinants of the Cdk polypeptide The presence of any of these peptides can also be detected.   Further technologies for drug screening include non-functional MTS genes The use of host eukaryotic cell lines or cells (as described above) is included. these Host system or cells of Bacillus subtilis have incomplete cell cycle control at the Cdk level. Host details Cell The system or cell is grown in the presence of the drug compound. Measures the growth rate of host cells To determine if the compound can regulate the cell cycle. One to measure growth rate Means by measuring the biological activity of Cdk, preferably Cdk4.Usage: rational drug design   The purpose of rational drug design is, for example, to identify more active or stable forms of Polypeptide, or, for example, the function of the polypeptide in vivo Of the purpose with which they interact to create drugs that enhance or interfere Structural analogs of biologically active polypeptides or small molecules (eg, Agonis , Antagonists, inhibitors, etc. (eg, See Hodgson, 1991). In one approach, first ( The protein of interest (eg p16 or Cdk4), or eg Cdk4 -Three-dimensional structure of p16 complex, x-ray crystallography, computer model Or most typically a combined approach. often To a lesser extent, useful information about the structure of a polypeptide is the structure of homologous proteins. It can also be obtained by modeling based on construction. An example of rational drug design Is the development of HIV protease inhibitors (Erickson ) Et al., 1990). In addition, a peg (such as p16 or Cdk4) Petit has an alanine scan (We1ls) 1991. ). In this technique, the amino acid residue is replaced with Ala and the peptide Its effect on the activity of tide is measured. For each amino acid residue of the peptide To determine important regions of the peptide.   In addition, the target-specific antibody selected by the functional assay is isolated and then isolated. It is also possible to analyze the crystal structure of. In principle, this approach will continue Obtain a pharmacore on which drug design can be based. Functional medicine By raising anti-idiotypic antibodies to physically active antibodies , Can bypass protein crystallography altogether. As a mirror image of a mirror image, anti-idio The binding site of a type antibody would be expected to be an analog of the original receptor. Then , Peptides produced chemically or biologically using anti-idiotypic antibodies of Peptides are identified and isolated from banks. The selected peptides are then Will act as a macaw.   Thus, for example, improved MTS activity or stability, or MTS activity Having drugs that act as inhibitors, agonists, antagonists, etc. of The agent can be designed. Availability of cloned MTS sequences And obtain sufficient quantities of MTS polypeptides to perform analytical studies such as x-ray crystallography. It can be performed. In addition, the MTS protein sequence information provided herein is , Using computer modeling techniques in place of or in addition to x-ray crystallography Will lead to that.Usage: gene therapy   In addition, according to the present invention, cells carrying a mutant MTS allele can be used to induce wild-type MTS function. Also provided is a method of supplying. By supplying such a function, Biological growth will be suppressed. The wild-type MTS gene or a part of the gene is , Can be introduced into cells using a vector that maintains the gene extrachromosomally. In such cases, the gene is expressed by the cell from an extrachromosomal location Will. Introducing a gene portion into a cell having a mutant MTS allele and expressing it If so, the gene part is a part of the MTS protein required for non-tumor growth of cells. Should be coding minutes. The wild-type MTS gene or a part thereof In order to cause recombination with the endogenous mutated MTS gene present in More preferred is the situation where it is introduced into the cell. Such recombination involves the sudden change of the MTS gene. The occurrence of double recombination is necessary, where the differences are corrected. For recombination and extrachromosomal maintenance Vectors for gene transfer for both are known in the art and any suitable Any vector can also be used. Electroporation, calcium phosphate Methods for introducing DNA into cells, such as co-precipitation and viral transduction are known in the art. , And the choice of said method is within the ordinary skill in the art. Wild type M Cells transformed with the TS gene can be used to treat cancer and to treat it with drugs that promote such sedation. It can be used as a model system for studying medical treatment.   As generally discussed above, the MTS gene or fragments thereof may be used where applicable. In order to increase the expression product of such gene in cancer cells, It can be used in therapy. Such gene therapy is more effective than normal cells in MTS Cancerous or pre-cancerous with absent or decreased levels of lipopeptides It is particularly suitable for use in both cells. This also means that "normal" level Obtained MTS inheritance even in cancer cells expressing mutant genes in Although it may be useful in raising expression levels in offspring, the gene product is not It doesn't work.   Gene therapy is, for example, “Therapy for Genetic Disease” , T. Friedman, Oxford University -Press (Oxford University Press) (1991), pages 105-121, Generally acceptable, as described by Friedman It will be done according to the method. The cells from the patient's tumor are first analyzed as described above. Method to confirm production of MTS polypeptide in tumor cells. Departure Contains a copy of the MTS gene linked to the current regulatory element, and within the tumor cell A virus or plasmid vector capable of replication is preferred. Suitable vectors are Opened in US Pat. No. 5,252,479 and PCT International Publication WO93 / 07282. Known, as indicated. The vector can then be applied locally to the tumor site or Systemic (to reach any tumor cells that can metastasize to other sites) Inject the person. The transfected gene is the genome of each targeted tumor cell If not permanently captured, the process can be repeated periodically. Since MTS polypeptides are essentially involved in cell cycle regulation, the gene To avoid constitutive expression of MTS polypeptide by all cells which have taken up , The MTS gene is preferably introduced together with its own regulatory elements.   Gene transfer systems known in the art are used to carry out the gene therapy methods of the invention. Can be useful to. These include viral and non-viral transfer -Including law. Papovaviruses (eg SV40, Madzak et al. , 1992, Adenovirus (Berkner, 1992) Berkner et al., 1988; Gorziglia and Ka. Pichia Kapikian, 1991; Quantin et al., 1992; Rosen Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson et al., 199. 2 years; Stratford-Perricaudet et al., 1 991, Vaccinia virus (like Moss, 1992) ), Adenovirus companion virus (Muzyczka), 1992; Oh. Herpeswill including HSV and EBV, such as Ohi et al. (1990) Su (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1) 992; Fink et al., 1992; Breakfield. ) And Geller, 1987; Freese et al., 1990. Una), and birds (Brandyopadhyay) and Temi Temin, 1984; like Petropoulos et al., 1992. ), Rodents (Miller, 1992; Miller et al., 1985). Sorge et al., 1984; Mann and Baltimor. e), 1985; Miller et al., 1988) and humans (Shima). Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page (Pa ge) et al., 1990; Buchschacher and Panganiban. (Panganiban, 1992). Ils has been used as a gene transfer vector. Most hi Gene therapy protocol based on an inactivated rodent retrovirus I was there.   Non-viral gene transfer methods known in the art include calcium phosphate. Co-precipitation of sium (Graham and von der Eb, 19 73; chemical techniques such as Pellicer et al., 1980); For example, microinjection (Anderson et al., 1980) Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981. As Constantini and Lacy, 1981 Transposition by liposome-mediated membrane fusion (Felgner et al., 19 87; Wang and Huang, 1989; Kaneda Et al., 1989: Stewart et al., 1992; Nabel et al. , 1990; Rim (Lim et al., 1992); as well as direct DNA uptake (Woof (Wo lff) et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990. Wu et al., 1989b; Wolff et al., 1991; Wagner. ner) et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten. Et al., 1990; Curiel et al., 1991a; Curiel et al., Mechanical techniques (such as 1991b), as well as receptor-mediated DNA tran Includes mechanical technologies such as surfers. Virus-mediated gene transfer Transfer combined with direct in vivo gene transfer using liposome delivery And direct the viral vector to tumor cells rather than surrounding non-dividing cells It becomes possible. Alternatively, inject the retroviral vector-producing cell line into the tumor It can also be fired (Culver et al., 1992). Production cells injected This would provide a continuous source of vector particles. This technique is inoperable brain Approved for use in humans with tumors.   A combined approach of biological and physical gene transfer methods The adenovirus hexon protein was used for plasmid DNA of either size. When combined with a polylysine-conjugated antibody specific for white matter, the resulting complex is It binds to the viral vector. Then infect cells with the trimolecular complex . Before the adenovirus vector damages the coupled DNA, Allows efficient binding, internalization, and endosomal degradation.   Liposome / DNA complex mediates direct in vivo gene transfer Has been shown to be possible. In standard liposome preparations, gene transfer Although the process is non-specific, localized in vivo Tumors that develop and develop, for example, directly after in situ administration Reported in deposits (Nabel, 1992).Usage: peptide therapy   Peptides with MTS activity have mutated or defective MTS alleles Can be supplied to cells. Disclosed is the sequence of the MTS protein (SEQ ID NO: 2). , SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16). Proteins are known to Present Can be produced by expressing the cDNA sequence in bacteria using a vector . Alternatively, the MTS polypeptide is extracted from MTS-producing mammalian cells. You can also. Furthermore, it is also possible to synthesize MTS proteins using synthetic chemistry techniques. it can. Any such technique provides for the preparation of the present invention consisting of MTS protein. Can be served. The preparation is substantially free of other human proteins. this thing Is most easily achieved by synthesis in microorganisms or in vitro.   Active MTS molecules may be prepared using, for example, microinjection or liposomes. Can be introduced into cells by using. Alternatively, some active molecules may also be active It can be taken up by cells either by physical or diffusion. MTS gene product cells External application can fully affect tumor growth. The supply of molecules with MTS activity , Will lead to a partial reversal of the neoplastic state. (Eg peptide, drug or Use other molecules that have MTS activity (such as organic compounds) to affect such reversal You may let me. Modified polypeptides with substantially similar function are also useful for peptide therapy. Used.Usage: Transformed host   Similarly, cells and animals carrying mutant MTS alleles may be used as therapeutic agents. It can be used as a model system to study and test substances with potential Wear. The cells are typically cultured epithelial cells. These are somatic cells or reproductive system It can be isolated from patients with MTS mutations in any of the rows. Alternatively, the cell line To have a mutation in the MTS allele, as described above. You can also After applying the test substance to the cell, the neoplastic transforming phenotype of the cell To measure. Anchorage-dependent proliferation, tumorigenicity, cell invasion in nude mice Any of the oncogenically transformed cells, including sex, as well as growth factor dependence Characteristics can also be evaluated. Assays for each of these properties are available in the art. Are known.   Animals for therapeutic drug testing should be performed after mutagenesis of the whole animal or in germ line cells. Alternatively, it can be selected after processing the zygote. Such treatment usually involves a second animal Insertion of mutant MTS alleles from species, as well as insertion of disrupted homologous genes included. Alternatively, insert or delete the animal's endogenous MTS gene (s) It may be disrupted by mutations or other genetic alterations using conventional techniques. Capecchi, 1989; Valancius and Smithies (Smithies), 1991; Hasty et al., 1991; Shin nkai) et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpot (Philpott) et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Doe. Donehower et al., 1992). After administration of the test substance to the animal, The growth of the ulcer must be evaluated. Test substance inhibits or suppresses tumor growth , The test substance is a therapeutic agent for treating the cancer identified herein. It is a supplement. The invention is illustrated by reference to the following examples In any case, the present invention is It is not intended to be limiting. Standard techniques well known in the art Alternatively, the technique specified below was used.                                 Example 1                               Materials and methods A.MTS family tree   FIGS. 1A-1D show that by their relatives 3137, 3161, 3355 and 1771. Is shown. The figure shows the development of cancers in these families. Blood 31 All melanomas at 37 carry a sensitive halotype. To this blood group However, other cancers carrying the sensitive halotype have also been shown. Blood family 3161 and All melanomas at 3 and 3355 carry a sensitive halotype. Bloodline A mutation in MTS was identified for the cancer at 1771. B.Tumor cell line   Ludobig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (Ludwig Institute for Cance r Research, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) 76 melanomas Ma cell line, American Type Culture Collection (American Typ e Culture Collection (ATCC)) 8 melanoma cell lines and 5 non-melanoma I got a normal type. C.Preparation and analysis of tumor cell line DNA   About 1 x 1073 cells of lysis buffer (0.1M NaCl; 0.1M Tri HCI pH 8.0; 5 mM EDTA; 0.5% SDS), and then Cell line by incubating and incubating (65 ° C, 30 minutes). NA was isolated. 0.5 ml of 8M KOAc was added, the reaction mixture was mixed and on ice. Incubated for 30 minutes. After centrifugation (5 min at 10,000 xg), The supernatant was precipitated with an equal volume of 95% ethanol and centrifuged again (10,000 Xg for 15 minutes). 50-200 ml H of the DNA2Resuspend in O. D.PCR reaction   0.1 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC 1, 20 mM MgCl2, 0.01% gelatin and 1 unit of AmpliTac Polymerase (Amplitaq polymerae) (Perkin-Elmer) 30 pmol of each oligonucleotide plasmid in 20 ml reaction mixture containing 50 ng of template was added to the immers. Perkin-Elmer 9600 thermal cycle Sample at 94 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 10 seconds in a It was circulated 35 times. 1.5% agarose (SeaKem) or 3% NuSieve 3: 1 agarose (FMC BioProducts )), Followed by ethidium bromide staining to obtain the product. Visualized. E. FIG.YAC   The CEPH YAC library was loaded with IFNA, D9 using the PCR conditions described above. By screening with S171 and D9S126, A yeast artificial chromosome (YAC) containing the marker was obtained. YAC strain containing YAC AHC medium (10 g / l casein hydrolyzate-acid; 1.7; g / l yeast nitrogen base; 5 g / l ammonium sulfate; 20 mg / 1 adenine hemisa Growing in vigorous shaking in Luffate; 2% glucose; pH = 5.8) . Yeast DNA was prepared as described by Ausubel et al. (1992). . F.Construction of phage library   Yeast genomic DNA containing YAC DNA was digested with BamHI to complete , T4 DNA ligase (Boehringer-Mannheim) BamHI-digested EMBL3 phage arm (Promega) using Insert and Gigapack II extracts (Strategy In vitro packaging (Stratagene). E. coli i) The phage were propagated on strain C600.32P-labeled human C0t-1 DNA (Gi Human DN by hybridization with BUC (GIBCO) -BRL) Recombinant phage containing A were identified. Contains sequences from the YAC left or right arm The YAC vector (endoc A phage containing the human sequence bound to (L.) was identified. Under standard conditions (mid Hybridton and Wash in Middleton et al., 1991). went. Positive plaques were picked up and purified again by plating 3 times. Phage DNA using Qiaex column (Qiagen) Was prepared. G.Construction of cosmid library   YAC genomic DNA containing YAC DNA was partially digested with Sau3A and linearized. Fractionation by size on a (10-40%) sucrose gradient (Maniat is) et al., 1982). Follow the manufacturer's instructions Prepare the SuperCos 1 cosmid vector (Stratagene) , Mass ratio 4: 1 (insert: vector), mixed with insert DNA, treated with ligase, In vitro packaged as above. Introduction of cosmid into DH5α host cell And plated at a density of 2000 colonies per 15 cm Petri dish. Above And colony hybrids as described in Maniatis et al., 1982. Did. H.P1 clone   Genome Systems, Inc. (Mi St. Louis, Zully) with STS prepared as described herein. By screening, a P1 clone covering the MTS region was obtained. Arca Lysis (Birnboim and Doly, 1979), followed by By cesium chloride gradient centrifugation (Maniatis et al., 1982), DNA from these clones was isolated. I.Create STS   P1 vector (pSacBII), SuperCos 1 vector or EM Oligonucleotide complementary to the sequence adjacent to the cloning site of BL3 vector By sequencing 1.0 mg of P1, cosmid or template DNA with Created STS. Prism lady reaction dideoxy thami Noether Cycle Sequencing Kit (PRISM Ready DyeDeoxy Termi ABI373A DNA sequencing system with nator Cycle Sequencing Kit (ABI) Sequencing was performed on the stem. As close as possible to 20bp length, possible at 60 ℃ The STS was designed to have a melting temperature as close as possible. J.Germline mutations in MTS1 in melanoma-prone consanguineous families   Genomic DNA from a carrier individual can be collected in blood by standard methods. Prepared from. Coding from MTS1 with 20 ng DNA from each sample Ing exon 1 or 2 or coding exon 2 from MTS2 Primers were designed at the intron position to amplify Standard in PCR reaction Buffer was used, except that DMSO was added to a final concentration of 5%. The distribution Α-P on the amplified product using primers located at different points in the row32− Circulating sequencing reactions were performed using dATP. All (A) reactants, then ( C) By placing the reaction products side by side on a 6% denaturing polyacrylamide gel The sequencing products were analyzed. Sequence analysis of opposite strands confirms all polymorphisms Was done.                                 Example 2             Localization of MTS using genetically linked markers   To analyze tumor cell lines for homozygous deletions in the 9p21 region, MTS A set of markers known to be linked to was used. These markers -Originally melanoma in 10 Utah and 1 Texas families Used to show dramatic linkage of predisposition (LOD score = 12.7) (Cannon -Cannon-Albright et al., 1992). The marker was tested Alpha-interferon gene cluster (IFNA), the most distal marker (Kwiatkowski and Diaz, 1992) From, the proximal marker (D9S104) and 4 additional markers in between -(D9S171, D9S126, D9S161 and D9S169) (Cannon-Albright et al., 1992). Genetic research From the research, the linear sequence of the intervening marker was D9S171, D9S126, D9S16. 1 and was considered to be D9S169. The IFNA marker is wild type genome D Two fragments from NA [ie approximately 138-15 containing a spread of poly (CA)] A 0 bp polymorphic fragment (IFNA-1) and an approximately 120 bp non-mutated fragment (IFN-1). As-s)] was amplified. The position of IFNA-s with respect to IFNA-1 was unknown.   Five non-melanoma tumor cell lines previously reported to contain deletions were inherited It analyzed using the marker. Each cell line contains at least one of the tested markers. It showed a homozygous deletion (Table 1). D9S161, D9S169 or D9S10 No homozygous deletions were identified by using 4. These deficiencies The minimal region of overlap between losses was adjacent to IFNA-1 and D9S171. . This is because the region between these two markers is related to tumor suppression, perhaps MTS. It is suggested that it contains a continuous gene. Then, D9S171 and IFNA-1 The genomic region between and, especially adjacent to IFNA-s, was studied in more detail.                                 Example 3                     Genomic clone in MTS region   To obtain a genomic clone of the region surrounding IFNA-s, CEPH YA The C library was screened (Cohen et al., 1993). D 11 YACs containing 9S171 marker and 5 containing IFNA-s Individual YACs were identified. YAC containing both D9S171 and IFNA-s It was not isolated at all (Figure 2). 3 YAC clones (C9, C6, F9) Subcloned into phage and clone one YAC (C6) into cosmid vector Subcloned into. These and cosmid clones are known genetic markers. To provide a convenient method for generating essential STS and promoting the following chromosomal walking. .   Providing an independent source of genomic DNA for the construction of a genomic map of the neighborhood of the region, IFNA-s, I extended to D9S171 to facilitate STS production D9S171 extending back to FNA-s, and YA in both directions Chromosomal walking was initiated in the P1 clone from the C C6 end. Of this chromosome walk A total of 27 P1 clones were isolated as part (FIG. 2). The decided P1 is Form an adjacent assembly extending from IFNA-s to D9S171 with two gaps. I made it. Using the P1 clone and several phage and cosmid clones A detailed structural map of the MTS area was obtained.                                 Example 4                         Detailed structure analysis of MTS area   Additional markers are needed to create a more detailed molecular map of the MTS region there were. PC for STS using DNA sequence obtained from genomic clone The R primer was designed. These STS control P1 and YAC clones It worked in turn to help do. Area between IFNA-s and D9S171 A total of 54 STSs from the area develop a detailed physical map of the MTS area. Became the main basis of (Fig. 2). These STS primer sequences are Database (Genome Database).   Using a new set of markers extending from IFNA-s to D9S171, MT Eighty-four melanoma cell lines were tested for homozygous deletions in the S region. Combined A total of 52 lines showed regions of homozygous deletion (Fig. 3). Some of the deletions are widespread Yes, for example, 13 systems lost the region containing both 816.7 and 760-L. I was   To localize MTS, the most informative tumor lines were divided into two groups (Fig. 3 ). I) those containing only the deletion of c5.1 (class 11), and i i) Divided into those containing only the deletion of c5.3 (class 12). 5 melas in total Norma lines were divided into these categories. In all cases where the deletion was detected, the deletion It seemed simple. That is, the area between IFNA-s and D9S171 There was no evidence of multiple deletion events in. Overall, the system containing the deletion Regions of deletion duplications centered around the car c5.1 and c5.3 are shown, which are IF Eliminates the development of a complete physical map of the area from NA-s to D9S171.                                 Example 5 Cosmid c5 and P1 colonies P1062 and P106 as containing MTS Identification of 3 A.Placement of genetic markers   Analysis of the YAC clone and of the deletion in the tumor cell line revealed a marker marker. Transposition: Results consistent with IFNA, D9S171, D9S126 were obtained. Three 4 YACs contained both D9S171 and D9S126, but 4 YAC contained IFNA-1 and IFNA-s (FIG. 2). D9S17 None contained both 1 and IFNA. This is i) IFNA-1 And IFNA-s are deeply linked, and ii) D9S126 and D 9S171 is suggested to be linked. These results are confirmed by the deletion of the cell line. It has been certified. Most cell lines lacking D9S171 also lacked D9S126 . In contrast, line U-87 was positive for D9S171 and D9S126. Lacked IFNA-s and IFNA-1 (Table 1). 1 melanoma The cell line, SK-MEL-5, is IFNA-s, D9S171 and D9. It lacked S126 but not IFNA-1. Therefore, IF NA-1 must be distal to IFNA-s. Another melanoma The cell line, SK-Mel-Zan, contains IFNA-1, IFNA-s and D9. Includes S171 but does not include D9S126, between IFNA-s and D9S126 It contained a deletion in which D9S171 was located. Overall, these findings are summarized in Table 1. Support the order of markers shown in.   The human α-interferon gene family comprises more than 23 genes and stains. It consists of a pseudogene located in chromophore 9p. This gene cluster is cloned Are classified into 10 linkage groups (Henco et al., 1985). chain The group consisted of loss of deletion of different α-interferon sequences in glioma cell lines. Partially ordered by analysis (Olopade et al., 1992). ). The glioma line H4 lacks both IFNA-1 and IFNA-s. Also, It also lacks sequences from linkage group IV (eg α13, α6 and α20). Nerve Glioma System A172 contains both IFNA-1 and linkage group IV, but linkage group I (eg , Α1, α19), III (eg, α8) and IX (eg, α2) and IFNA-s Lacks an array from. This analysis showed that IFNA-1 was linked to linkage groups I, III and IX And distal to IFNA-s. The distal border of the A172 deletion is IFNA- Mapped within one P1 length distal to s. Therefore, linkage groups I, III and And IX must be adjacent to a distal point less than 85 kb to IFNA-s Absent.                       B.Physical distance between genetic markers   This result provides an accurate estimate of the distance between IFNA-s and D9S171. I couldn't. Because of the isolation of YACs containing both markers Because I couldn't. Furthermore, based on the mapping by STS, IF All five YACs extending distally from NA-s extend proximally from D9S171. It did not overlap with any of the 11 long YACs. Length of CEPH YAC insertion Assuming the average is less than 500 kb, IFNA-s and D9S17 The distance to 1 is considered to be at least this size.   The region between IFNA-s and c5.1 contains 9 walkers in the P1 library. It was covered in about. Assuming each step is on average half the length of the P1 insertion , C5.1 and IFNA-s is approximately 400 kb. Therefore , Tumors tightly linked to c5.1 that are often deleted in the melanoma system The suppressor gene must be approximately 400 kb proximal to IFNA-s. C.Deletion in the tumor system   A homozygous deletion of the 9p21 region was found in 57% of melanoma tumors tested It was 14 tumor lines contain a deletion extending proximally through 760-L, Sixteen lines contained a deletion extending beyond the distal 816.7. The lack Loss, that is, a deletion of a gene in this region contributes to the tumor phenotype Assuming that the tumor suppressor gene is also present between 760-L and 816.7. Must. The smallest deletion contained the markers c5.1 and c5.3. test Of all the markers that were deleted, the largest number of lines, 51 to c5.3, was deleted. I was Therefore, the most likely location of the tumor suppressor gene is very high at c5.3. Close to. Because it is the most frequently deleted marker. Four lines contained a deletion of only c5.3 (class 12) and one line had a deletion of c5.1 (class 12). Only Las 11) was missing. Both of these markers are the same cosmid It was present on c5. Therefore, the tumor suppressor gene was sequenced from cosmid c5. It is considered to include. The P1 clones P1062 and P1063 have c5 and Contains sequences found in the surrounding cosmid. Therefore, further shown below As such, P1062 and P1063 contain the entire MTS region.   The results obtained in the above example show that the region between IFNA-1 and D9S126 is M In line with previous genetic studies of MTS, which proved to be the most likely location of TS. (Cannon-Albright et al., 1992). Recent Genetic studies have shown that the polymorphism between IFNA-s on C1-452 and C5.3 (C A) Iterations are used to further define the location of the MTS (Figure 2). Therefore, MTS is located within the region where homozygous deletions assemble in melanoma cell lines .   These results indicate that the tumor suppressor locus, located somewhere near c5.3, MT Support the notion that there is an S. All lines containing the deletion have a deletion of c5.1 Or deleted except for the set restricted to c5.3 (classes 11 and 12) Share a common region of DNA. For cell lines other than those in cosmid c5 There were no signs of non-overlapping deletions in the compartment. Therefore, for example, c5 .1 and a second tumor suppressor locus in 9p21 distal to c5.3, and more There is no basis for creating a complex scheme.   There is the observation that homozygous deletions of 9p21 occur in multiple tumor types. It is suggested that tumor suppressor genes may be expressed in various tissues. Therefore, the tumor Suppressors are p53 inherited in that they may be involved in the development of multiple types of cancer. May be similar to offspring (see data further below). Melano Other types of cancer have been reported in the Marma-prone family (Nancarrow ) Et al., 1993; Bergman et al., 1990). c5.1 and c5. A thorough deletion analysis of various tumor types (shown below) using 3 of To clarify the importance of this tumor suppressor gene in tumors.   Some of the observed homozygous deletions eliminate multiple genetic markers. Fa Fountain et al., Chromosome 9p2 in two different melanoma lines A homozygous deletion of 1 has been reported to extend at 2-3 Mb (Bergman (Be rgman) et al., 1990). In this study, at least one system, SK-ME L-5 drives the most distal markers tested, IFNA-1 to D9S126 Stretching beyond (apparently too large a region that cannot be contained on a single YAC) Contained a deletion that The predominance of large deletions indicates that the region surrounding MTS Suggest that the region lacks genes essential for cell survival.                                 Example 6                         Isolation of MTS candidate gene   The above example describes the results of YAC and P1 chromosome walking in the vicinity of MTS. It was Detailed structure-mapping experiments with STS from the c5 sequence show 5 different Shows the presence of a small non-overlapping deletion of the c5 sequence in a melanoma cell line. As a result Based on, the tumor suppressor gene (probably MTS) is at least within c5 It seems to exist partially.   A further indication that c5 contains at least one gene is c5 and Obtained from analysis of (CpG) dinucleotide frequencies in neighboring cosmids. Feeding In animals, almost all housekeeping genes and all tissues Nearly half of the specific genes are associated with regions rich in (CpG) dinucleotides (Bird, 1989; Larsen et al., 1992). Shi Therefore, the presence of such "CpG islands" implies a gene. Cosmid c5, c1 2, c57 and c59 are the enzymes whose recognition sequence contains two (CpG) pairs. Digested with the restriction endonucleases EagI, BssHI and SacII. Koss Only the mids c5 and c12 contained sites for these enzymes. Kosumi Doc5 has one EagI site, at least 10 BaaHI sites and at least Both contained 12 SacII sites. c5 and duplicate cosmid c12 In the presence of CpG islands in c5, c5 actually contains at least one candidate gene for MTS. It was suggested to contain.   DNA sequence determination of EcoRI fragment from cosmid c5 to look for MTS did. If these sequences are compared against sequences from GeneBank, Encodes a human cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4) inhibitor or p16 Two distinct regions of c5, which are similar to regions of previously identified genes Have been identified (Serrano et al., 1993). These two genes are MT It was a candidate for S and was called MTS1 and MTS2. MTS1 is chromosome 9p Located near the end of cosmid c5 closest to the romere, MTS2 is the centromere of c5 It was located near the edge. See Figure 4B. Place of MTS1 and MTS2 And a cosmid map showing P1 1062, 1063 and 1069 in FIG. Shown in A.   By detailed comparison of the genomic sequence of MTS1 from c5 with the p16 mRNA sequence , MTS1 has a 307 bp stretch that is identical to a portion of the p16 coding sequence. It was shown to contain This spread of nucleotides in MTS1 is Adjacent to the recognizable splicing site sequence. Further characterize MTS1 It contains the entire coding sequence of p16 and two introns. Were shown (FIGS. 5A and 5B and FIGS. 6A and 6B). Intron 1 is It is located 126 bp downstream from the translation start site, and intron 2 is 1 from the translation stop site. Located 1 bp upstream. These two introns are the coding sequence for MTS1. 3 regions in a row, ie 126 bp 5'region (coding exon 1) , 307 bp central region (coding exon 2) and 11 bp 3'region Divide into (coding exon 3). SEQ ID NO: 3 is the 5'region of MTS1, The nucleotide sequences of exon 1 and part of intron 1 are listed. Sequence number No. 4 is a part of intron 1 of MTS1, one of exon 2 and one of intron 2. The nucleotide sequences of the parts are listed.   MTS2 is 5 of coding exon 2 which is approximately 211 bp into intron 2. 'Contains a region of DNA sequence almost identical to p16 extending from the end (Fig. 7 A). However, the sequence similarity is such that MTS1 corresponds to the position of the final codon of MTS2. It decreases to the point 51 bp downstream of intron 2 in Fig. 8 (Fig. 8). MTS1 And a comparison of the sequences from MTS2 (FIG. 8) shows the sequence similarity between these two genes. Sex is also approximately 40 nucleotides upstream from the 3'splicing site of intron 1. It was shown to be extended to. Therefore, a portion of the non-coding DNA is It is more conserved than some regions of putative coding DNA. Coding DN The possibility that the sequence divergence in A is a cloning artifact To exclude, specifically amplify across the sequence divergence point of MTS2. PCR primers were designed for this purpose. These primers are cosmid, P1 And a fragment of the expected size from genomic DNA was amplified. Therefore, M The divergent sequence located near the 3'end of exon 2 in TS2 Is the bona fide genomic sequence. SEQ ID NO: 5 is MTS2 Nucleotides of "exon 2" and "intron 2", part of intron 1 of Describe the sequence. SEQ ID NO: 15 describes the MTS2 cDNA sequence.   The occurrence of two deeply related genes on cosmid c5 is due to the It suggests that it exists in this area. To investigate this possibility, cosmid c5 , C12, c59, p1 1063 and 1060 and control of human genomic DNA. Southern blots were prepared from restriction enzyme digests. These blots were labeled with MTS2 A fragment containing most of exon 2 from MTS1 containing the shared region. I robed. Two EcoRI fragments cloned into DNA and genome Probes were detected on both DNA. This result shows that two p1s in the genome Consistent with the presence of 6-like genes, MTS1 and MTS2. Also, it is now And known exons 2 and 3 containing MTS1 (but exon 1 of MTS1 No)) alternative form of MTS1E1β.                                 Example 7                       Isolation and structure of MTS1E1β Isolation of MTS1E1β   Normal cDNA library using complete MTS1 cDNA By cleaning, a hybrid containing MTS1E1β-containing clones was selected. Isolated. Normal cDNA library screening is based on MTS1 This was done using a probe from Son 2. From fetal brain, normal breast and lymphocytes One million clones were screened from each of the libraries. Hybrid A soybean cDNA clone was isolated from a lymphocyte library. Distribute the clone It was sequenced and shown to contain E1β. Also, it is an exon of MTS1 It contained 2 (E2) and exon 3 (E3). CDNA derived from ovarian tissue Hybridisation-derived cDNA by incubating E. coli with cosmid c5 A clone was isolated. The cosmid was labeled with biotin to make it single-stranded. c5 and Hybridize with the cDNA and then coat with streptavidin The biotinylated cosmid was trapped using the magnetic particles generated. Selected cDN A was eluted from the cosmid, amplified by PCR, cloned, sequenced It was The cDNA clone is a library in that it contains E1β, E2 and E3. It was similar to that isolated by Lee screening. Which clone is Also did not contain exon 1 above (see SEQ ID NO: 3). MTS1E1 The sequence of β cDNA is set forth in SEQ ID NO: 13.Structure of MTS1E1β   MTS1 and MTS1E1β are in two forms, namely exon 2 and Two forms of a single gene that utilize 3 and 3 but have different first exons It MTS1 is the first 43 p16 proteins encoded by MTS1 The α form (E1α) encoding the amino acid of MTS1E1β is exciting It contains the β form of Son 1 (E1β). The exon structure of the p16 gene is complex c Determined by comparing the sequence of a DNA clone with the genomic region from which it was derived (Fig. 13). Sequence analysis of the genomic region containing the genomic Southern, P16, and And long PCR were used in combination to map the position of the P16 exon ( (Fig. 13). The p16 gene spans approximately 30 kb of genomic DNA. E1β is the most It is an exon on the 5 ′ side, and its order is E1β, E1α, E2, and E3.   p16 reading frame (whether the reading frame used in p16 encoding exons 2 and 3 Translation of E1β was estimated by the splicing between E1β and E2. An in-frame stop codon located just 10 codons upstream of the site is indicated. Stop codon The location was confirmed by genomic and cDNA sequence analysis. Downstream first of this stop The potential start codon of p is just 3'to the E1 / E2 splicing site. It was in 16 reading frames. This potential start codon is a common Kozak sequence (Kozak, 1987) flanks sequences that do not closely resemble. p If translated in 16 reading frames, the E1β transcript of the p16 gene contains 105 amino acids. Will encode the protein of   Additional analysis of βcDNA revealed that it was used to encode p16. It was shown to have a larger ORF in different boxes. The ORF (OR Referred to as F2) extends through E1β for 67 amino acids into E2 It is growing. The entire ORF encodes a protein of 180 amino acids. Shi However, the open reading frame remains open at the 5'end of E1β and is therefore incomplete. May be. Statistical analysis showed that ORFs of this size had random sequences (P = 0.003), it is unlikely to occur by chance in the DNA. However, given the basic composition of β-transcripts, the possibility was higher ( P = 0.16). The predicted polypeptide is not similar to any of the above proteins won.   Identifying the evolutionarily conserved part of E1β is based on Will give a clue as to what is important. Hybrid capture (Hybr id Capture) Modified RACE technology called RACE (HCR) (see Example 12) Mouse p16 cDNA was isolated by (1) and compared with human p16 cDNA. One (Β-type) of the mouse P16 cDNA of It had an E2 equivalent. The second type (α type) is E1α linked to E2, etc. It contained a valence. E1α and E2 mouse exons are their human equivalents Was 70% identical to. Mouse nucleotide sequence and human E1β Sons are 51% identical (FIG. 14) and the mouse E1β exon also encodes p16. You It contained a stop codon in the reading frame used to Stop codon nucleo The human and mouse polypeptides deduced from the tide sequence 5'are completely divergent. I was there. Therefore, stop codons within the p16 open reading frame are not sequencing artifacts It is.   Since it was unclear as to the role of E1β, we found that all three reading frames The similarity between mouse and human β transcripts was analyzed. Mouse and human beta conversion The copy is an ORF larger than the one used to encode p16 (ORF1). It contained (ORF2) in a different reading frame. Recommendation coded by ORF2 The constant polypeptides were 40% identical. However, a comparison of ORF2 peptides was Limiting to the part encoded by β, they are only 28% identical It was. In contrast, mouse and human p16 sequences were 67% identical. In addition, the polypeptide deduced from the ORF2 contained in E2 is the third polypeptide in E2. Similar to the polypeptide deduced from the open reading frame (ORF3) (42%) I was there. From these results, ORF2 was not selectively maintained and probably protein Is suggested not to be coded. The secondary structure of human and mouse β RNA Even compared. No significant similarity was confirmed. In summary, these Results suggest that β-transcripts in both mouse and human Due to its presence, it is necessary for the P16 function, and if it is translated, encoded The protein probably starts with the first methionine in exon 2.                                 Example 8                       Germline mutations in MTS1   Whether MTS1 or MTS2 corresponds to the genetic susceptibility locus MTS From 8 individuals believed to carry the MTS predisposition allele Genomic DNA was analyzed (Cannon-Albright et al., 1 992). Derived from an intron sequence specific to either MTS1 or MTS2 DNA sequence from the exon using oligonucleotide primers (Table 2) Was amplified from each sample.   Exon 1 of MTS1 was amplified using primers 1F and 1108R, Sequenced using primer 1108R. Primers 42F and 55 1R was used to amplify exon 2 of MTS1, followed by primers 42F and 5 Sequencing was performed using 51R. MTS2 using primers 21F and 50R Exon 2 of A. and reamplified using primers 89F and 50R. Was sequenced using primers 89F and 50R at   The DNA sequences of these genomic fragments are polymorphic in two of the eight individuals. showed that. There was no polymorphism in any of the remaining samples, Suggests that it is not common to the population. Polymorphism is MTS chromosome To indicate that they are linked to and not to the remaining homologous chromosomes. Genomic DNA from other individuals carrying the predisposing allele was analyzed. each In some cases, polymorphisms were segregated from MTS predisposing alleles. Of codon 93 A mutation (gly → trp) was found in an individual of blood group 3012 (12821). It is also affected by Career Brothers and Sisters (13183) and affected It was also found in an unemployed career cousin (14917), but was affected. It was not found in a non-carrier non-carrier brothers and sisters (13184). Kod The mutation (val → asp) in gene 118 affects the individual (15 635). In addition, it has been removed from the affected carrier First cousin (10205), first cousin of the affected carrier (114) 14) and the first cousin of a carrier affected by 10205 (10146) ), But for non-carriers not affected by 10205 Uncle (10120) did not find it.   The polymorphism was a single nucleotide substitution that caused an amino acid change (Table 3). The substitution may be replacing a small hydrophilic residue with a large hydrophobic residue, or a neutral residue. It involved either replacing the mino acid with a charged amino acid.   Exon 2 from MTS2 shows no polymorphism in the 8 samples tested. Not shown. This is because, at least in this group of relatives, MTS2 is Suggests that it does not predispose to the human. Based on its similarity to MTS1, MTS 2 may be involved in other types of cancer. In addition, MTS2 is a non-functional gene It is also possible.   Lives in MTS1 (but not MTS2) in individuals predisposed to melanoma Findings of breeding line mutations are consistent with analysis of melanoma homozygous deletions.                                 Example 9                     Analysis of the presence of MTS in tumor lines   Due to the frequent deletion at 9p21 in multiple tumor types, 12 different types Tumor-derived cell lines were analyzed for the presence or absence of MTS1. The remains Expected fragment using a set of sequence marking sites (STS) spread across the gene Genomic DNA from tumor cell lines was tested for the presence or absence of (Figure 4A). ) 4B and 9). The results of this study indicate that MTS1 was deleted from most tumor lines. (Table 4). Homozygous deletions occur in colon and neuroblastoma cell lines Of all tumor types tested with the lowest percentage of deletions in lung cancer and It changed from 25% in leukemia to 94% in astrocytomas. Overall, ho Homozygous deletions were detected in 135 of the 290 cell lines tested. The analysis Since the STS used in It gives a minimum estimate of the proportion of the ulcer system. This is why a small deletion is detected Probably not. This approach also requires insertion of a few nucleotides. Or defects such as deletions, nucleotide substitutions may be missed.   To improve the assessment of the total number of cell lines containing MTS1 mutations, MTS1 34 without any apparent homozygous deletion of MTS1 for damage in Cell lines were examined in more detail. A sequence consisting of about 97% of the MTS1 coding sequence. Rows were amplified and screened for polymorphism. Out of 34 melanoma 18 bodies in exon 2 or exon 1 of MTS1, distributed in 14 Cellular mutations were observed (Table 5). Three of these mutations are frameshifts 7 are nonsense mutations, 4 are missense mutations, and 4 are silencing mutations. It was an event. In addition, 3 out of 4 lines containing silent mutations Containing mutations, 16 of the 18 mutations are located in coding exon 2 I was All but one system contained exclusively hemizygous or homozygous polymorphisms However, this suggests that the remaining homologous chromosomes have been deleted. With heterojunction One single line contained two different non-silent mutations, which were associated with each homologous stain. This finding is consistent with the view that chromophores undergo independent mutation events. This D Based on NA sequence and MTS1 deletion analysis, a minimum of 75% of melanoma lines were altered. It contained a heterologous MTS1 and had lost the gene from both homologous chromosomes.   The predominance of lesions (deletions and nucleotide substitutions) in MTS1 is that MTS1 Or, show that closely linked loci contribute to the tumor phenotype. these Cells that are damaged by the method of the invention enjoy a selective advantage over cells that are not. damage An alternative explanation that is a random event unrelated to cell proliferation is due to various reasons. Seems impossible because. First, between the tumor phenotype and the mutation in MTS1 The deep correlation suggests a causal relationship between MTS1 mutations and tumorigenesis. Secondly , MTS1 influences susceptibility to melanoma and therefore tumor suppressor inheritance Independently related as a child. Third, p16 as a potent inhibitor of Cdk Biochemical function of p16 in vivo as an inhibitor of the initiation of general DNA replication. Fits well into a model that works with.   Mutation or loss of MTS1 may be the product of cell growth in culture. Shi However, a high proportion of primary leukemia cells also decreased from MTS1 to less than 500 kb. Is a gene family located (Diaz et al., 1990). -Contains a homozygous deletion of the ferron gene cluster. The previous deletion study Interferon gene deletion marker extending beyond MTS1 to the centromere Are included without exception (Weaver-Feldhouse (Feaver ldhaus) et al., 1994). Homozygous deletions in the MTS1 region are associated with primary tumor cells and culture. The deletions observed in tumor cell lines occur in cell culture in culture as they occur in the cell line. Not likely to be an artifact. Still, there is no MTS mutation in tumor development The question of what may arise is best solved by analyzing the primary tumor sample. Will be revealed.In vivo role of MTS1   In all eukaryotic cells, cell division is a G1 to S initiation that initiates DNA synthesis. Transfer and the passage of two critical decision points of the transition from G2 to M where mitosis begins It costs. In mammals, the mechanism that controls cell division has multiple components, Many are relevant (for a review see Sherr, 1993) Oshi). The Cdk causes several transitions from G1 to S and from G2 to M. Since the key substrate is regulated by phosphorylation, the Cdk may be in the central part of the controller. unknown. The transition from G1 to S probably occurs most at the beginning of the cell cycle. It will be a critical decision point. So far, may be involved in the control from G1 to S 4 types of Cdk (Cdk2-5), and a set of these Cdk positive Regulators (cyclins C, D1-3, E) have been defined. Recently, p16, Several negative regulators, including p15, p18, p20, p21 and p27 Defined (Xiong et al., 1993; Serrano et al., 1993). Gu et al., 1993; El-Diery et al., 1993; Harpa Harper et al., 1993; Hannon and Beach, 199. 4; Polyak et al., 1994b; Toyoshima and Han. Hunter, 1994; Guan et al., 1995). These negative adjustments The body appears to act by inhibiting the kinase activity of CDK. Cell circumference Some of the phase regulators have been linked to human cancer (Hunt for discussion). er) and Pines, 1994). p20 is Cdk2 And possibly other Cdks, while p16 (MTS1, CDKN2 or (Also referred to as INK4a) inhibits Cdk4, but is clearly an in vitro assay. Does not inhibit Cdk2 (Serrano et al., 1993). In vitro lab Based on the study and its interaction with p53, p21 is a general gene for all Cdks. It has been proposed to be an inhibitor (Xiong et al., 1993). Therefore , In vitro, p16 appears to be more specific than p21. These inhibitions Each of the agents is expected to antagonize entry into S phase. In addition, Cyclin D1 Or CDK4 is overexpressed in some breast cancers and the pl6 gene Undergo mutations or deletions in cell lines and primary tumors (Buckley ) Et al., 1993; Caldas et al., 1994; Kamb et al., 199. 4b; Mori et al., 1994; Tam et al., 1994a). These conclusions In the fruit, some cyclins and CDKs are proto-oncogenes, and P16 (MT It is suggested that S1) is a tumor suppressor gene. p15, p18, p21 and Although the biochemical behavior of p27 indicates that they may also be tumor suppressors, tumors Or a detailed mutational analysis of those genes in cell lines has not been reported. This The results presented here indicate that MTS1 functions in vivo as an inhibitor of cell division. Provide evidence.   There are several p16 genes (MTS1) located in the 9p21 fragment of human chromosome 9. Type of tumors and a high proportion of tumor-derived cell lines undergo mutations or homozygous deletions Because it is particularly interesting (Caldas et al., 1994; Kamp) Et al., 1994b; Mori et al., 1994; Nobori et al., 1994). . Also, some are known to carry susceptibility to 9p21 linked melanoma MTS1 mutations segregate with the predisposition to melanoma in the H. Hussussian) et al., 1994; Kamb et al., 1994a). However, There are open questions regarding the role of MTS1 in heredity and in sporadic cancers. 9p Some melanoma prone families with high LOD scores for 21 markers , Shows no mutation in the MTS1 coding sequence. Also tumors and cell lines Of MTS1 homozygous deletions in mice is an exception for tumor suppressor gene inactivation And suggests the presence of another gene near MTS1 that is involved in carcinogenesis To do.   Recent reports indicate that some mitogens and antimitogenic signals are C Affects the cell cycle, at least in part, by modulating the activity of DK inhibitors Suggest giving (Firpo et al., 1994; Hannon et al. And Beach, 1994; Kato et al., 1994; Polyac (P Olyak) et al., 1994a; Slingerland et al., 1994). An example For example, TGFβ-induced cell cycle arrest is mediated by activation of p15 and p27. It may be. Conversely, p27 is an IL-2-induced mitogen of resting T lymphocytes. It may be negatively regulated during activation. For regulation of MTS1 Little is known about the proportion. Many recent reports show that MTS1 values are Provides evidence that it may be regulated by the Rb protein (Cera Serrano et al., 1993; Li et al., 1994a; Tam et al., 19 94b; Parry et al., 1995). These and other findings (Serano (Ser rano) et al., 1995) that MTS1 inhibits CDK4 / 6, which causes Rb It contributes to a model of MTS1 action that suppresses phosphorylation. Rb is now MTS It contributes to the feedback circuit that limits the value of 1.   These results implicate the prominent role of MTS1 in cell cycle regulation. Provide genetic evidence. This result also indicates that MTS1's in vivo target is tumor It is suggested to be the main cause of the outbreak. MTS1 does not use Cdk2 but Cdk-4 Cdk4 may be a strong candidate for oncogenes if blocked in vivo . The predominance of mutations in the MTS1 gene is that Cdk4 is most (all It is implied that it acts as a general activator of cell division To show. In addition, biochemical studies of the effects of MTS1 on different Cdks showed normal Helps define the hierarchy of Cdk activity in both cells and transformed cells It may be one. By analogy with p16, p21 is a general inhibitor of Cdk If so, is the gene lost or mutated in most tumors? It may happen.   If MTS1 is a general tumor suppressor active in most normal cells, then M Germline mutations in TS1 are expected to predispose to cancers other than melanoma Ah For example, p as seen in Li-Fraumeni syndrome Germline mutations at 53 increase the likelihood of multiple tumor types including childhood sarcoma, breast cancer (Malkin et al., 1990). In the previous study, did it affect melanoma? An unusually high frequency of pancreatic cancer has been found in some prone families (Bar Bergman et al., 1990; Nancarrow et al., 1993). This observation is consistent with the finding that a homozygous deletion of MTS1 occurs in pancreatic tumor lines. It The genetic characteristics of MTS1 predisposition differ from the somatic genetic characteristics of MTS1. For example, a large deletion that removes multiple kilobases of DNA from the region surrounding MTS1 May be missing from the human gene pool due to selective defects. Shi However, such deletions may be advantageous in transformed somatic cells. Probably because it removes multiple genes. This possibility is due to MTS Consistent with the presence of a second gene, designated 2, which has significant similarity to MTS1 are doing. MTS2 is located approximately 12 kb upstream of exon 1 of MTS1, and M The first exon of TS2 is approximately 2.5 kb upstream of the second exon of MTS2. It is in. MTS2 may be functioning similarly to MTS1. MTS1 And a deletion that removes both MTS2 is a mutation that inactivates one gene alone. It would confer a greater proliferative advantage for the cells. Or the two Genes of different functions in a non-overlapping or partially overlapping set of cell types. It may be A full elucidation of these possibilities is awaited.                                 Example 10                         Mutation analysis of MTS1E1β   At a homozygous deletion and P16 that inactivates P16 in tumor-derived cell lines Predominance of 9p21-binding melanoma-prone strains that do not show mutations Suggests the existence of another gene that is also involved in cancer formation near P16. (Cairns et al., 1994; Spruck et al., 1994). E1β regulates cell proliferation If they encode a protein involved in In either diffuse and / or familial cancer that would have been missed in the study May have mutations. Therefore, E1β was used in cell lines derived from various tumors, and Screened for mutations in some melanoma-prone consanguineous families.   Genetic characteristics of melanoma-prone consanguineous species have already been reported (Cannon-Albright et al. , 1992). Melanoma-prone congeners of genomic DNA (Kamb et al., 1994a) And isolation from cell lines (Liu et al., 1995) have already been described. To E1β PCR amplification with the forward primer (5'-AGTCTGCAGTTAAG G-3 ′ SEQ ID NO: 33) and a reversible primer (5′-GGCTAGAGGC GAATTATCTGT-3 ′ SEQ ID NO: 34) and the following conditions: 3 at 97 ° C. 30 cycles were performed at 65 ° C. for 10 seconds and 75 ° C. for 20 seconds. Amplification reactant Was diluted 100-fold and the same forward and reverse primers (5'- CACCAAACAAAAACAAGTGCCG-3 ′ SEQ ID NO: 35), It was amplified again under one reaction condition. Place the PCR product on a 1% agarose gel, Extraction was performed using Qiagen beads (Qiagen, Inc.). The product Cyclist Sequencing kit (stra With the forward primer (SEQ ID NO: 33) described above, using Sequencing was performed.   A series of 24 cell lines derived from 4 tumors (Table 6) or affected families In 6 melanoma congeners with significant haplotypes shared among clan members, E No 1β sequence variants were detected (Cannon-Albright et al., 1992) , Showed no P16 mutations in previous studies (Kamb et al., 1994a). this Et al. Showed that E1β mutations were not a common event during tumor progression, Suggests no involvement in 9p21-linked melanoma susceptibility in these families It                                 Example 11                       Mutation screening for MTS2 Screening for MTS2 mutations in cell lines   The predominance of homozygous deletions that remove MTS1 in tumor-derived cell lines There is another gene or genes near MTS1, which is also involved in tumorigenesis Suggest that it exists. If the MTS2 gene is involved in disseminated cancer, it May have mutations in the tumor-sourced cell line. So MTS2 Chordin The sequence was screened for mutations in a range of tumor cell lines.   PCR amplification for exons 1 and 2 of MTS2 was performed by Kamb et al. (1994a). Was performed as described in. The primer pair 2E1.F1 (5'-AGGGAAGAG TGTCGTTAAG-3 ′ SEQ ID NO: 19) and 2E1.R2 (5′-AGAC TCCTGTACAAAATCTAC-3 ′ SEQ ID NO: 20) and exon 1 Obtained. For primer pair 89F (SEQ ID NO: 12) and 50R (SEQ ID NO: 11) And got Exon 2. After amplification, place the DNA product on a 1% agarose gel, Qiagen beads (Qiagen, Inc.) Inc.)). The product was cloned into exon 1 with primer 2E1. Cyclist Sequen at 89F and 50R for F1 and Exon 2 Sequencing was performed using the Sing Kit (Stratagen).   MTS2 coding sequence in sac, glioma, astrocyte, lung, kidney Screen for mutations in a range of cell lines from visceral and melanoma tumors It was All of these cell lines frequently had a monozygous deficiency of MTS2 and MTS1. Had loss (Kamb et al., 1994b). Derived from melanoma, lung, kidney and sac carcinoma Cell lines revealed to have point or frameshift mutations in MTS1 (Liu et al., 1995). However, for gliomas and astrocytes It has not been shown that cell lines carry such MTS2 mutations. these The individual cell lines used in the screening experiments of Selected from a group not known to have a monozygous deletion of the MTS1 sequence (Kamb et al., 1994b).   The MTS2 mutation was detected in any of the 58 screened cell lines. It was also absent in the two coding sequences (see Table 7). These types of cells Based on previous experiments with MTS1 in the system, the set consisted of sac, melanoma, lung And limited to the kidney group, it is believed to have about 8 MTS1 mutations (Liu et al. 1995). Thus, the evidence for somatic mutations in MTS2 is this one. It was not obtained from a series of tumor cell lines. Screening for MTS2 mutations in relatives   9b21-binding melanoma-prone blood without MTS1 coding sequence mutations That the MTS2 gene may explain melanoma susceptibility in ethnic groups I'm interested. Previously reported genetic features of melanoma-prone pedigrees (Cannon-Albright et al., 1992). Standard technique for genomic DNA of family members (Kamb et al., 1994a) was used to isolate from lymphocytes separated from whole blood. Mela Has a high LOD score for the predisposition to 9p21 binding, which is prone to norma In 6 consanguineous groups that did not show MTS1 mutations in our study, as described above, MT We screened for mutations in the S2 coding sequence (see Table 8) (Ka mb et al., 1994a). No mutation was found in MTS2. These experiments , Provide no evidence that MTS2 lesions are involved in hereditary melanoma, but Such possibilities can only be ruled out on the basis of these limited experiments. There is no.                                 Example 12                 Expression of MTS1 and MTS1E1β RNA Two P16 promoters   Two different forms of P16 mRNA could be produced in two ways. Transcription Start from different promoters or mRNA from a single promoter Induced and then spliced alternately to produce different forms of transcripts.   Upstream evidence for individual promoters of alpha and beta transcripts It is determined that the α form is transcribed in a cell line at the same time that the E1β sequence is deleted. It was obtained. Cell lines A375 and SK-mel93 are between E1α and E1β Had a deletion at one of the breakpoints (Fig. 13). Which cell line is the proximal break point Not mapped correctly, but at least upstream of the 5'end of E1β It was 85 kb. When RT-PCR was performed using α-specific primers, Both cell lines were shown to express the alpha transcript (Fig. 15). RT-P The manipulation of CR is as follows: cDNA is transferred to T cells, cell lines or human tissues ( Synthesized from total RNA (Sambrook et al., 1989) isolated from Clontech. cd NA reaction was carried out using a random 9-mer, and DNA synthesis and Superscript II reverse transcription were performed. Primescriptase (Bethesda Research Laboratories) was primed. α-32 P-dATP (Amersham) (0.1 Ci / mmol) was used in the synthesis reaction to produce the final product. CDNA yield was determined by measuring the amount of radioactive nucleotides incorporated into the product. The amount was calculated. Transcript levels of P16α and P16β in two consecutive rounds Of E2 derived α- or β-specific forward primer or heminest reversion Sex primers were used and analyzed by PCR. 2 ng of cDNA in the first amplification A is the α-specific primer AS.1 (5′-CAACGCACCGAATATAGTT ACG-3 ′ SEQ ID NO: 26) or β-specific primer BS.1 (5′-TAC TGAGGAGCCACGCGTCTA-3 ′ SEQ ID NO: 27) and X2.R14 Amplified with 0 ′ (5′-AGCACCACCAGCGTGTC-3 ′ SEQ ID NO: 22) I let you. The reaction is carried out under the following reaction conditions: 97 ° C. for 3 seconds; 65 ° C. for 10 seconds; 75 ° C. 20 seconds, 20 cycles, on a Perkin-Elmeyer 9600 thermal cycler went. Dilute these reactions 100-fold and use AS.1 or BS.1 and X2 Amplified again with B (5'-CGTGTCCAGGAAGCCC-3 'SEQ ID NO: 23) Let The X2B oligo was γ-linked at its 5'end (Sambrook et al., 1989).32P- Radiolabeled with dATP (Dupont). PCR conditions other than 15 cycles It was as described above. PCR products are used to eliminate problems caused by genomic DNA contamination. The organism spanned the E1α or E1β / E2 splice junction. The production The product was analyzed by electrophoresis through a denaturing 5% polyacrylamide gel. Dry The gel was exposed to X-OMAT (Kodak) film overnight.   The result is that α transcription can be initiated from a promoter that is independent of the E1β 5'sequence. Suggests that. Another explanation is that the deletion fuses an ectopic promoter sequence to E1α. It is said to have been allowed. However, the A375 and SK-mel93 are independently It is believed that it will not be isolated from the cell line. The exact position of the α promoter is clear Not badly, RNase protection analysis showed that it was at least 440 of the P16 start codon It was shown to start upstream of bp. Thus, the human P16 gene is distinct Promoter, PαAnd PβBetter produced, with distinct decoding potential It is a complex of two partially overlapping transcripts.Expression pattern of P16   The clue to solving the function of genes is the analysis of their expression patterns in different tissues May be apparent from. To measure the expression pattern of P16, 11 A series of cDNA samples prepared from tissues using α and β specific primers Screened by PCR (FIGS. 16A-D). Both forms of P16 transcript Detected in all tissues tested, with some differences. For example, in the spleen And the ratio between the α and β forms was more than β. On the contrary, that in the chest The ratio favored α. These expression data come from many different tissue types. Data demonstrating P16 deletions and point mutations in cell lines (Kamb et al., 1994). b; Liu et al., 1995), with a role for p16 in many tissues. Suggest.   It has been clarified in vitro that it is an inhibitor of CDK4 and CDK6 ( Serrano et al., 1993; Li et al., 1994a; Parry et al., 1995), p16 biosynthesis If there is a scientific function, the expression of P16 is analyzed as a cell that has traversed the cell cycle. Was analyzed. Human peripheral blood lymphocytes (PBL) are phytohemagglutinin (PHA) + Is stimulated by interleukin-2 (IL-2), and is finely divided at various time points after stimulation. The cells were harvested. These cells were analyzed for their cell cycle by flow cytometry. Measuring the stage and measuring the relative level of P16 gene expression by RT-PCR, It was analyzed by measuring the level of p16 protein by Western blotting. Was analyzed. Peripheral blood lymphocytes were isolated from blood shed from normal adult donors and Fi Partially purified by flotation on a coll-Hypaque gradient (Boyum, 1968). By subjecting the lymphocytes to convection decantation as described above, (Elstad et al., 1988). The cell population prepared by this method is 98% pure Graded as P and T cells. The purified cells were supplemented with 10% fetal bovine serum. Proliferated with added RPMI (Gibco). Resting cells at 10 μg / ml PHA (Sigma) and 10 U / ml IL-2 (Sigma). Cell cycle Was monitored by flow cytometry. RNA to RNazol B (CINNA / BIOTECX Laboratories, Inc.) was used to isolate from primary T cells. RT -PCR quantification by forming a series of dilutions from T cell cDNA isolated after induction. Confirmed by The amount of target cDNA present in the undiluted sample is It was quantified by measuring the dilution at which the target could no longer be amplified. Various PCR Although the results from the experiments are consistent, dilution experiments show that RNA levels greater than 4-fold It turned out that it can be detected only when there is a change. Rb+And Rb-Derived from a cell line A cDNA sample was also analyzed in the same way. Human actin is easy Detected and in similar amounts in each cDNA sample (tissue, cell line or T cell) Were present.   The proportion of the two forms of the P16 transcript changed dramatically through the cell cycle ( 16B-C). Initially, β form is low concentration, but 30 to 40 hours after stimulation By then, that level had begun to rise. During this time, the expression level of the α form was probably It remained relatively constant while rising slightly. According to flow cytometry The rate change was correlated with the cells that finished Go and entered S phase. RT-PCR Was tested by a template dilution experiment. According to such an experiment, RT-PCR Were sensitive to 4-fold or more changes in transcript levels. β induction It was estimated to be at least 10 times. Therefore, T cells that have undergone the cell cycle As a cell, the cell changes the relative amount of the two forms of P16 transcript, resulting in The ratio changed from β.   The present inventors also used P16 cells as T cells that traversed the cell cycle. The level of protein expression was tested. Proteins were subdivided at various time points after mitogen induction. Cells were isolated and the isolated protein was subjected to Western analysis. p16 tongue Produced at levels of protein that oppose the 20 C-terminal amino acid of the complete polypeptide. P16 antibody was used for the measurement. As cells that finished Go, The level was relatively constant. Thus, p16-encoding RNA (alpha transcript) and Both the p16 and p16 proteins were relatively constant during the cell cycle. Besides, S Moderately elevated p16 levels during the period have been reported (Tam et al., 199). 4b). Reflects differences in p16 regulation in different cell types or proteins Reflects the problem of detecting a 2-3 fold increase in quality (or cDNA) levels , P16 accumulation was not seen.Expression of P16 in tumor cell lines   Previous studies have suggested that Rb affects P16 expression (Serrano et al. , 1993; Li et al., 1994a; Parry et al., 1995). Expression of β mRNA The effect of Rb status on cells was tested (FIG. 16D). cDNA for a series of cell lines , 5 of them have wild type Rb protein and 6 of them have non-functional Rb Prepared from cell lines with protein (Parry et al., 1995). As expected, The α transcript was detected only in the Rb-negative system. However, the β transcript is Rb-positive and It was present in both Rb-negative cell lines. Therefore, unlike α, βRNA expression Is independent of Rb mutation status in tumor-derived cell lines.   p16 has been demonstrated to be a member of multiple genetic species (Guan et al., 199). 5). By analogy with other polygenic genes, members of this species have extra functions, Acts differently, or at different times or in tissue-specific patterns It may be. Therefore, the level of p16 is low and P16 regulation by Rb is If not apparently, P16 does not regulate the cell cycle in T lymphocytes. Yes is possible. However, the β-transcript was dramatically induced upon T cell induction, and P1 6 is deleted in a high proportion of T cell-induced tumors (Hebert et al., 1994) , P16 are considered to play an important function in human T cells. Pair with p16 You The dramatic effect of Rb on Rb is observed only in virally transformed or tumor-derived cell lines. Was perceived. Possibly P16 is regulated in wild-type tissue in some other way Will.E1β is a conserved and regulated part of p16   The role of β transcript is not clear, but the result is: (i) E1β is conserved in mice (Ii) relative amounts of β-transcripts are tissue-specific and cell-cycle dependent. Be regulated by both existing methods; and (iii) the two cell lines , But with a monozygous deletion that removes E1β; It suggests that the function is important. These results indicate that E1β is wild type P1. It suggests that 6 functions are required.   Mouse β cDNA was isolated and compared to human MTS1E1β. Mouse cdn The A clone was modified with a modified hybrid, called hybrid capture RACE (HCR). It was isolated by a selection operation. Mouse poly A+Enriched RNA for breast and thymus gland Isolated from weave. The first strand cDNA synthesis reaction (Sambrook et al., 1989) is random. 12mer and Superscript II reverse transcriptase (Bethesda Resear ch Laboratories) was used. After second strand synthesis, the cDNA is transferred to a specific double-stranded Rigo (dsRP.2) (5'-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTC ATTGTTC-3 ′ SEQ ID NO: 28) is linked to its 5 ′ end to It is attached to the "nker". The 5'end of the second cDNA strand is the only phosphorus in the ligation reaction. It was an oxidized DNA end. After ligation, the anchor cDNA was labeled Sepharose CL-4 Purified by fractionation on a B column. P16 specific recovery of anchor cDNA Natural primer (5'-AGCGGTTCCCAGGAAGCCTTC-3 'sequence No. 29) and the nested version of RP.2 (RP.B) (5'-TGA GTAGATTCTAACGGCCGTCATTG-3 'SEQ ID NO: 30) And the biotinylation site upstream of the revertive primer used for the first amplification. Gene-specific oligonucleotide (5'-ACTGCCGAGGACCCCACTA Captured with CCTTCTCC-3 ′ SEQ ID NO: 31). The captured cDNA is RP. B and gene-specific revertive primer (5'-GAACG TTGCCCCATCATCATC-3 ′ SEQ ID NO: 32) and used on the capture oligo. It was amplified again by flow. The product obtained is subjected to gel purification, cloned and sequenced. did. Sequence for mouse P16 oligonucleotide with low stringency A mouse genomic clone containing a sequence hybridizing to the human E2 probe It was determined by cloning and sequencing.   Comparison of mouse β transcript with that of human shows that E1β does not encode a protein Suggest that. Only the sequence consisting of the E16 p16 reading frame is strictly It was saved. Therefore, if the β transcript is translated, the protein will become E2. And was translated in the same frame used to encode p16. I can think. The inferred polypeptide has an estimated molecular weight of 10 kDa and is present at p16. Retains 2 3/4 of the 4 ankyrin repeat units. However, p15 is 3 1/2 Only with nkyrin repeating units (Hannon and Beach, 1994), other The proteins overlap and function with only one or two repeating units. p10 minutes Whether the offspring are present in vivo, whether the molecule inhibits CDK4 / 6 , Still being tested.βRNA function   Tumor-derived cells, if the role of β-transcripts is to inhibit cell proliferation One will be able to find mutations that disrupt E1β in the system. E1β Two melanoma cell lines with deletions to be eliminated still express alpha transcripts. Is consistent with this view. The p16 coding sequence is not found in these cell lines. It is a wild type. Nevertheless, a small genetic disorder in E1β (eg, base substitution) Was not found in any of the 25 tumor cell lines. Therefore, E1β is It is difficult to conclude that it is the target of mozygosity loss. E1β exon is tongue If you don't code for a disorder, then a small genetic disorder isn't enough to disrupt its function. Would be Also, the target of the aforementioned deletion may be another gene. For example, the p15 gene (MTS2) is a related marker of deletion in these melanoma cell lines. It was possible that it was targeted. In this view, E1β is more P1 than E1α Since it is close to 5, it was easily deleted. However, we have shown that in various cell lines P1 There was no cell line with a deletion that could not detect the 5-point mutation and specifically removed P15 (Kamb et al., 1994b), this explanation seems to be unreasonable.   Genetic evidence indicates that p16 and Rb are often inactivated during tumor progression It is suggested to be a member of the growth regulation pathway. The role of β transcript is negatively increased If it is to regulate reproduction, it is probably independent of p16 and Rb It may be part of another pathway that must mutate. This means that E1β is specifically destroyed. Why the deletion that breaks is Rb-Will explain why it is only found in cell lines. Its expression Based on turn, E1β appears to play a role in actively cycling cells It A limiting conclusion on the role of E1β is to analyze its expression in vivo. I'm just waiting.                                 Example 13                           Expression of MTS2 mRNA   Cell line or primary using RNazol B (CINNA / BIOTECX Laboratories, Inc.) RNA was isolated from T cells. cDNA as total RNA (Sambrook et al., 1989) It was synthesized using a random 9mer to prime DNA synthesis. cDNA yield The amount of α in the synthesis reaction32P-dATP (Amerscham) (0.1 Ci / mmol) ), Including the amount of radioactive nucleotides incorporated into the final product. Calculated by Heminest reversion by two consecutive rounds of amplification of MTS2 expression It was analyzed by using a sex primer. 2 ng of cDNA in the first amplification To E1F (5′-TGAGGGTCTGGCCAGC-3 ′ SEQ ID NO: 21) and And X2.R140 ′ (5′-AGCACCACCACGCGTGTC-3 ′ SEQ ID NO: 22). The reaction was performed under the following conditions: 97 ° C. for 3 seconds; 65 ° C. for 10 seconds. Between; 75 ° C for 20 seconds, 20 cycles of Perkin-Elmer 9600 thermal cycle It was carried out using Ra. These reactions were diluted 100-fold and were diluted with E1F and X2B. (5′-CGTGTCCAGGAAGCCC-3 ′ SEQ ID NO: 23) and amplified again. I let you. X2B oligo is γ at its 5'end32Radiolabeled with P-dATP (DuPont) (Sambrook et al., 1989). PCR conditions except 15 cycles It was the same as above. The obtained product is passed through a denaturing 5% polyacrylamide gel. It was analyzed by electrophoresis. The dried gel was exposed to X-OMAT (Kodak) overnight. It wasMTS2 expression in different tissues   MTS2 includes those that occur in tumors in which MTS2 is homozygously deleted. , Was found to be expressed in many tissue types (see FIG. 10A). But between organizations There was a difference. For example, the MTS2 transcript was easily detected in lung tissue, but It was not detected in gonads and brain tissue. In contrast, the closely related MTS1 legacy Gene expression was detected in all tissues tested. At MTS2 RNA level Tissue-specific differences reflect the tissue-specific requirements for the MTS2 protein. I don't know if.MTS2 expression during the cell cycle   Expression of MTS2 if it regulates important translocations in the cell cycle May change during the cell cycle. For example, in normal dividing cells, The amount of p21 mRNA changes in proportion to cell cycle phase function (Li et al., 19 94b). To test whether MTS2 transcription is regulated during the cell cycle , Stimulate resting human cells with PHA and IL2 and monitor at various stages after stimulation (See FIG. 10B). MT, like Go through the cell cycle phase after finishing Go No clear trend in S2 expression levels was seen. Conversely, the control gene , CDK4 expression changed as expected (Matsushime et al., 1992). Scratch Thus, MTS2 mRNA is differentially expressed during the cycle of normally dividing cells. No evidence of expression in E. coli was found.   MTS1 protein is a growth regulatory pathway involving retinoblastoma protein Rb Proposed to be involved (Serrano et al., 1993; Guan et al., 1995; Ser rano et al., 1995). Recent studies show that MTS1 expression is at least partially In addition, strong circumstantial evidence was obtained regarding the view that it is regulated by Rb (Li Et al., 1994a; Parry et al., 1995). Biochemical classes between MTS1 and MTS2 The similarity suggests that MTS2 is also regulated by Rb. this Possibility to analyze MTS2 mRNA levels in Rb-positive and Rb-negative cell lines Tested by comparing bells. Between Rb status and MTS2 mRNA levels No correlation was found in (Fig. 10C). This means that the cell line Rb Suggests that the condition does not dramatically affect the amount of MTS2 transcripts. Or In contrast, unlike MTS1, MTS2 expression will be independent of Rb.                                 Example 14                     Ectopic expression of MTS1 and MTS2   The 483 base pair fragment of MTS1 was cloned into the primer MTS1.F (5'AAA GGATCCATTGCCACCCATGGAGCCGGGCGGCGGGGAGC AGCATGGAGCCTCTCGGCT3 ') (SEQ ID NO: 17) and E3.R ( 5'TTTTGAATTCAATCGGGGATGTCTG3 ') (SEQ ID NO: 18) Generated by the polymerase chain reaction. Primer MTS1.F will be the future Restriction site and Kodak consensus near the 5'end for cloning Designed to include the sequence (Kozak, 1987). Casting about this reaction The type DNA was cDNA derived from breast tissue. This generated fragment is EcoR In the expression vector pcDNA3 (In Vitrogen) digested with I and BamHI Inserted. pcDNA3 has a cytomegalovirus (CMV) promoter , Encoding resistance to ampicillin and neomycin. Then got Recombinant vector pcDNAp16 into the cell line HS294T by electroporation Inserted. HS294T is derived from melanoma and is associated with MTS1 and MTS2 It has both homozygous deletions. HS294T with 10% fetal bovine serum, non-essential DMEM, supplemented with mino acid, sodium pyruvate and L-glutamate ( Gibco). 5% CO in the cells2Grow at 37 ° C. HS294 P is the ratio of 1: 4 that confers hygromycin resistance to transformed cells. MTS1 clone inserted downstream of SS (Stratagene) and CMV promoters Does not have pcDNA3 (Invitrogen) or insert containing the coding sequence Co-transformed with pcDNA3 vector.   Similarly, the coding part of MTS2 was cloned into pcDNA3 and re-expressed in Kodak. Sequences were formed to give pcDNAp15 and inserted into HS294T. For this reason The MTS2 cDNA prepared in Example 13 was used for the above.   Plasmid pSS (Stratage) containing a selectable marker for hygromycin resistance ne) at the same time co-transformed with pcDNAp16 or pcDNAp15 PSS was present at 20 μg per cuvette by electroporation. Electroporation Conditions for 800 μL cells per cuvette, 1.5 × 10 56Fine Cells / ml and 500 μF capacitance, 400 volts. Control experiment with pcD Performed using NA3 + pSS. Electroporate cells (about 400 μL) with Placed in Petri dishes with 300 μg / ml syn. Colony count (Foci) 14 days Later counted. The results are shown in Table 9.   Construction with the complete MTS2 coding sequence fused to the CMV promoter When the construct was transformed into HS294T, the construct showed ectopic expression of MTS1. Colonization by seven genetic factors compared to controls, comparable to the effect of Inhibited. This result is sufficient for ectopic expression of MTS2 to inhibit cell proliferation Suggest that. Transformed cells may be the result of ectopic expression of MTS1 , G1 arrested, or whether proliferation is otherwise arrested Not. In cell lines lacking p15 or p16 expression (due to homozygous deletion) It can be concluded that overexpression of p15 or p16 that inhibits cell proliferation. Accurate Mechanism is unclear, but whether overexpression of p15 or p16 arrests cell division , Or it may kill the cells. These results show that p15 and p16 are in vivo Function as a bona fide tumor suppressor protein in And p16 probably have therapeutic applications.   MTS2 is a promising candidate as a tumor suppressor gene for many reasons . It has extensive sequence characteristics similar to MTS1 and binds CDK function in vivo. And ectopic expression of MTS2 inhibits cell proliferation in vivo. Before The above results show that despite the biochemical similarity between MTS2 and MTS1, Recall the possibility that the two proteins have significantly different functions in vivo. Let Two features of MTS2 are that it has the potential: i) MTS1 But MTS2 is introduced by TGFβ (Hannon and Beach, 19 94) and ii) unlike MTS1, MTS2 transcription appears to be independent of Rb. Suggest. It is possible that MTS2 is not involved in tumorigenesis at all. Also, Is MTS2 involved in a tumor suppressor pathway distinct from that associated with MTS1? It may happen. The elements of this pathway are unknown, but some of these elements It is thought to mutate at a much higher frequency than MTS2 in somatic tissues. This Thus, the lack of somatic mutations in MTS2 never plays an important role in tumor suppression Does not exclude. As mentioned above, ectopic expression of MTS2 leads to cell proliferation. Inhibition, the role of MTS2 is to consistently suppress tumors. Cell cycle Of constant level of MTS2 expression during the treatment and its induction by TGFβ Is not essential for the role of MTS2 in G1 It suggests that it is to prevent the adjustment of the timing of its occurrence. On the contrary, R The regulation of MTS1 expression by b is due to the fact that MTS1 is an oscillator in the cell cycle. To have a role as. as a growth regulator in vivo Testing the function of MTS2 and examining the pathways within which MTS2 works It will be important.                                 Example 15             Two-step assay for detecting the presence of MTS in a sample   The parent sample was disclosed by Antonarakis et al. (1985). Treated according to the method described above, separated through a 1% agarose gel, and Transfer to nylon membrane for lot analysis. Membrane GS · Gene Linker (Gene Linker) UV crosslinking at 150 mJ using (Bio-Rad). Nucleotide position of SEQ ID NO: 4 Subcloning the MTS probe corresponding to position 448-498 into pTZ18U . The phagemid was M13KO7 helper phage (Bio-Rad) Richmond, Transformed into E. coli MV1190 infected with California. Single strand DNA is isolated according to standard procedures (see Sambrook et al., 1989).   Blot the 0.5M NaPOFour6% in 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) Prehybridize for 15-30 minutes at 5 ° C. The method is described by Nguyen et al., 1992. According to the method described in. The blot was incubated at 65 ° C. with 0.5M NaPO.FourOf 7 Hybridized overnight with 25-50 ng / ml single-stranded probe DNA in% SDS. To close. Washing after hybridization is performed with 40 mM NaPOFour65% in 5% SDS Wash at 2 ° C for 30 minutes, then 40mM NaPOFour65% of 1% SDS It consists of washing for 2 x 30 minutes at 0 ° C.   The blot is then resuspended in phosphate buffered saline (pH 6.8) for 5 minutes at room temperature. And incubated with 0.2% casein in PBS for 60 minutes at room temperature, Rinse in PBS for 5 minutes. The blot is then stained with 6M urea, 0.3M Na. For hybridization consisting of Cl and 5x Denhard's solution Pre-incubate with buffer in shaking water bath (45 ° C) for 5-10 minutes (Samb rook et al., 1989). The buffer solution is removed, and 50 to 75 μl / cm2New Hybridization buffer + 2.5 nM covalently linked oligonucleotides De-alkaline phosphatase conjugate (phase to universal primer site It has a complementary nucleotide sequence) (UP-AP, Bio-Rad). The block Hybridized at 45 ° C. for 20 to 30 minutes, and after hybridization Wash with 6M urea, 1x standard saline citrate for 2x10 minutes (SSC) in 0.1% SDS at 45 ° C. and as a wash for 1 × 10 minutes, Incubate in 1 × SSC, 0.1% Triton® X-100. To start. The blot is rinsed with 1 × SSC for 10 minutes at room temperature.   The blots were shaken at room temperature for 10 minutes with 0.1 M diethanolamine, 1 mM NgCl2, In a substrate buffer (pH 10.0) consisting of 0.02% sodium azide Incubate. Individual blots were loaded with substrate buffer and 0.2 mM AMPP. D (3 '-(2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3'-phosphoryl Roxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt, Bio-Rad) Put in a heat-tight bag. After incubating for 20 minutes with shaking at room temperature , Remove excess AMPPD solution. Expose the blot to X-ray film overnight It Positive bands suggest the presence of MTS.                                 Example 16                   Generation of polyclonal antibody against MTS   A fragment of the MTS coding sequence was expressed as a fusion protein in E. coli. I let you. The overexpressed protein was purified by gel elution, then Harlow and Lane (1 988) and rabbits and mice according to procedures similar to those described by Was used to immunize This procedure produces Abs for various other proteins. Have been demonstrated (see, eg, Kreamer et al., 1993).   Briefly, the strand of the MTS coding sequence was cloned into the plasmid PET5A (Navagen , Inc., Madison, Wisconsin) as a fusion protein I let you. The sequence incorporating MTS is the amino acid sequence corresponding to 448-498 of SEQ ID NO: 4. No acids are included. Fusion protein with expected molecular weight after induction with IPTG Overexpression was confirmed by SDS / PAGE. Electroelution of fusion protein Was purified from the gel by. Identification of the protein as an MTS fusion product was performed using N- Confirmed by protein sequencing at the ends. Next, the purified protein is It was used as an immunogen. Rabbits in complete Freund's adjuvant Immunized with 100 μg of protein and administered twice every 3 weeks, initially incomplete Freund 100 μg of immunogen in adjuvant followed by 100 of immunogen in PBS Boosted with μg. Serum containing antibody was collected 2 weeks later.   This operation is repeated to generate an antibody against the mutant of the MTS gene. these Antibody with wild type MTS was used in various tissues and biological The presence and associated levels of variants in the fluid are detected.                                 Example 17               Generation of monoclonal antibodies specific for MTS   Monoclonal antibodies are produced according to the following protocol. Mouse, gluta Keyhole limpet hemopsies with lualdehyde or EDC (well known) Intact MTS or MTS peptide bound to anine (wild type or mutant) Immunize with the immunogen.   The immunogen is mixed with an adjuvant. 10 to 100 μg Mnogen was injected four times, and after the fourth injection, a blood sample was taken from the mouse Determine whether Qing has antibodies to the immunogen. ELIS serum titer Measure by A or RIA. Having serum showing the presence of antibodies to the immunogen Select a mouse to produce a hybridoma.   The spleen is removed from the immunized mouse to prepare a single cell suspension (Harlow and La ne, 1988). Cell fusion is essentially that of Kohler and Milstein, 1975. Follow the instructions. Briefly, P3.65.3 myeloma cells (American Thai Culture Collection, Rockville, Md., Harlow and And Lane, 1988, using polyethylene glycol to immunize spleen cells. Fuse with the cell. 2x10 cellsFive96-well tissue culture at cell / well density Plate on plate. Individual wells were tested for growth and grown wells. ELISA using either wild type or mutant MTS target protein Test by IA for the presence of MTS-specific antibody. Cells in positive wells Swell and subclone to establish and confirm monoclonality.   Expand clones with the desired specificity and in mice or in hollow fiber -Sufficient to grow as ascites cells in the system and assay for characterization and development. Produces a quantity of antibody.                                 Example 18                   Sandwich assay for MTS   Monoclonal antibodies can be applied to solid surfaces such as plates, tubes, beads or particles. Attach to the surface. Preferably, the antibody is applied to a 96-well ELISA plate as a wafer. Adhere to the surface. Contains MTS peptide / protein (wild type or mutant) 100 μl of sample (eg, serum, urine, tissue cytosol) is added to the solid phase antibody. Incubate the sample for 2 hours at room temperature. Then decant the sample fluid Then, the solid phase is washed with a buffer solution to remove unbound substances. 100 μl (MTS plate The second monoclonal antibody (for different determinants on peptide / protein) Add to solid phase. This antibody is a detector molecule (eg,125I, enzyme, fluorohole Is a chromophore) and the solid phase with the second antibody is incubated at room temperature for 2 hours. Beate. The second antibody is decanted and the solid phase is washed with buffer to remove unbound material. Leave.   Of the bound label proportional to the amount of MTS peptide / protein present in the sample Measure the quantity. Monoclonal antibody specific for wild type MTS and MT A separate monoclonal antibody specific for each mutation identified in S was used to Perform the assay.   The methods and configurations of the present invention can be embodied in the form of various specific expressions. Only a few specific examples of which are disclosed herein. Other ingredients It is obvious to a person skilled in the art that body examples exist and do not depart from the spirit of the invention. Is obvious. Thus, the described embodiments are illustrative and not restrictive. It is not something to be done.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 1/21 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/00 9358−4Ｂ 21/08 5/10 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 8310−2Ｊ 33/574 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 9284−4Ｃ Ｔ 33/574 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 9281−4Ｂ Ｄ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／２１５，０８８ (32)優先日 1994年３月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／２７７，３６９ (32)優先日 1994年４月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／２５１，９３８ (32)優先日 1994年６月１日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C07H 21/04 8828-4B C12N 1/19 C12N 1/19 8828-4B 1/21 1/21 9452-4B C12P 21/02 C 5/00 9358-4B 21/08 5/10 9453-4B C12Q 1/68 A C12P 21/02 8310-2J G01N 33/53 D 21/08 8310-2J 33/574 Z C12Q 1/68 9284-4C A61K 39/395 E G01N 33/53 9284-4C T 33/574 9281-4B C12N 5/00 B // A61K 39/395 9281-4B D 9455-4C A61K 37/02 (31) Claiming priority Number 08 / 215,088 (32) Priority date March 18, 1994 (33) Priority claiming country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 277,369 (32) Priority date April 14, 1994 Day (33) Priority claiming United States (US) (31) Priority claiming number 08 / 251,938 (32) Priority date June 1, 1994 (33) Priority claiming country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AM , AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SG, SI, SK, TJ, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＭＴＳポリペプチドをコードしているｃＤＮＡを必須としてなる単離ＤＮ Ａ。 ２．ＭＴＳ１ポリペプチドをコードしている請求項１の単離ＤＮＡ。 ３．ＭＴＳ２ポリペプチドをコードしている請求項１の単離ＤＮＡ。 ４．ＭＴＳ１Ｅ１βポリペプチドをコードしている請求項１の単離ＤＮＡ。 ５．ＭＴＳポリペプチドが配列番号：２、配列番号：１４、または配列番号： １６に示されたアミノ酸配列からなる請求項１の単離ＤＮＡ。 ６．請求項１のｃＤＮＡの少なくとも１５個のヌクレオチドを有するＤＮＡを 必須としてなる単離ＤＮＡ。 ７．配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号： １３、配列番号：１５および配列番号：３６に示された配列を有するＤＮＡから なる群より選択されるＤＮＡを必須としてなる単離ＤＮＡ。 ８．配列番号：１に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 ９．配列番号：３に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １０．配列番号：４に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １１．配列番号：５に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １２．配列番号：１３に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １３．配列番号：１５に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １４．配列番号：３６に示した配列を有する請求項７の単離ＤＮＡ。 １５．図５（ＡおよびＢ）、図６（ＡおよびＢ）、図７（ＡおよびＢ）、図８ 、図１１、図１２（ＡおよびＢ）、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４ 、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：３６のいず れか１つに示されたＭＴＳヌクレオチド配列の変異した形態である単離ＤＮＡ分 子。 １６．ポリメラーゼ連鎖反応によるＭＴＳ遺伝子のヌクレオチド配列の決定の ための１本鎖ＤＮＡプライマーのペアであって、プライマー配列がヒト・染色体 ９ｐ２１由来であり、ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーの使用がＭＴＳ 遺伝子配列の全部または一部を有する合成ＤＮＡを生じさせる１本鎖ＤＮＡプラ イマーのペア。 １７．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：１に示されている請求項１６のプライ マーのペア。 １８．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：３に示されている請求項１６のプライ マーのペア。 １９．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：４に示されている請求項１６のプライ マーのペア。 ２０．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：５に示されている請求項１６のプライ マーのペア。 ２１．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：１３に示されている請求項１６のプラ イマーのペア。 ２２．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：１５に示されている請求項１６のプラ イマーのペア。 ２３．該ＭＴＳ遺伝子配列が配列番号：３６に示されている請求項１６のプラ イマーのペア。 ２４．（ａ）ヌクレオチド位置２４１にＡを有する配列番号：１； （ｂ）ヌクレオチド位置１４８にＴを有する配列番号：１； （ｃ）ヌクレオチド位置４１８にＡを有する配列番号：１； （ｄ）ヌクレオチド２６６〜２７０を欠失した配列番号：１； （ｅ）ヌクレオチド位置２１４にＴを有する配列番号：１； （ｆ）ヌクレオチド位置３０６にＡを有する配列番号：１； （ｇ）ヌクレオチド１４８〜１５５を欠失した配列番号：１； （ｈ）ヌクレオチド位置３１７にＴを有する配列番号：１； （ｉ）ヌクレオチド位置３０５にＡを有する配列番号：１； （ｊ）ヌクレオチド位置１２４にＡを有する配列番号：１；および （ｋ）ヌクレオチド１０４〜１０５を欠失した配列番号：１ からなる群より選択される単離ＤＮＡ配列。 ２５．ヒト・野生型ＭＴＳ遺伝子配列に相補的な核酸プローブ。 ２６．配列番号：３のヌクレオチド８９１から１０１６までおよび配列番号： ４のヌクレオチド１９２から４９８までからなる群より選択されるエキソンにハ イブリダイズする請求項２５の核酸プローブ。 ２７．（ａ）ヌクレオチド位置２４１にＡを有する配列番号：１； （ｂ）ヌクレオチド位置１４８にＴを有する配列番号：１； （ｃ）ヌクレオチド位置４１８にＡを有する配列番号：１； （ｄ）ヌクレオチド２６６〜２７０を欠失した配列番号：１； （ｅ）ヌクレオチド位置２１４にＴを有する配列番号：１； （ｆ）ヌクレオチド位置３０６にＡを有する配列番号：１； （ｇ）ヌクレオチド１４８〜１５５を欠失した配列番号：１； （ｈ）ヌクレオチド位置３１７にＴを有する配列番号：１； （ｉ）ヌクレオチド位置３０５にＡを有する配列番号：１； （ｊ）ヌクレオチド位置１２４にＡを有する配列番号：１；および （ｋ）ヌクレオチド１０４〜１０５を欠失した配列番号：１ からなる群より選択されるＭＴＳ遺伝子の一部にハイブリダイズするヒトの変化 したＭＴＳ遺伝子配列に相補的な核酸プローブ。 ２８．請求項１〜１４のいずれか１項の単離ＤＮＡおよび宿主細胞中で作動す るレプリコンからなる、複製するクローニングベクター。 ２９．適当な調節配列に作動可能に連結された請求項１〜１４のいずれか１項 の単離ＤＮＡからなる発現系。 ３０．請求項２９の発現系で形質転換された組み換え型宿主細胞。 ３１．ＭＴＳポリペプチドの製造にとり効果的な条件下で請求項３０の細胞を 培養することを特徴とする、組み換え型ＭＴＳポリペプチドの製造方法。 ３２．蛋白のアミノ酸配列が配列番号：２、配列番号：１４または配列番号： １６に示すものに対応している、他のヒトの蛋白を実質的に含まないヒト・ＭＴ Ｓポリペプチド標品。 ３３．ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２、配列番号：１４または配 列番号：１６に示すアミノ酸配列と実質的な相同性を有し、ポリペプチドが野生 型ＭＴＳポリペプチドと実質的に同様の機能を有する、他のヒトの蛋白を実質的 に含まないヒト・ＭＴＳポリペプチド標品。 ３４．哺乳動物のＭＴＳポリペプチドと免疫反応し、哺乳動物の他のポリペプ チドとは実質的に免疫反応しない抗体。 ３５．モノクローナル抗体である請求項３４の抗体。 ３６．哺乳動物から単離された組織における野生型ＭＴＳ遺伝子またはその発 現産物の体細胞での変化であって該組織の腫瘍形成を示す変化を検出することを 特徴とする、哺乳動物における障害組織の診断または予後方法。 ３７．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ１である請求項３６の方法。 ３８．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ２である請求項３６の方法。 ３９．該発現産物がＭＴＳ１のｍＲＮＡである請求項３６の方法。 ４０．該発現産物がＭＴＳ２のｍＲＮＡである請求項３６の方法。 ４１．該組織試料由来のｍＲＮＡのＭＴＳ遺伝子プローブに対するハイブリダ イゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡの変化が検出される請求項３ ９または４０の方法。 ４２．ＭＴＳ遺伝子の調節領域において変化が検出される請求項３６の方法。 ４３．非変性ポリアクリルアミドゲル上の１本鎖ＤＮＡの電気泳動移動度にお ける変化を観察するこよにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３ ６の方法。 ４４．該組織から単離されたゲノムＤＮＡに対するＭＴＳ遺伝子プローブのハ イブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６ の方法。 ４５．ＭＴＳ遺伝子プローブが、配列番号：３のヌクレオチド８９１から１０ １６までおよび配列番号：４のヌクレオチド１９２から４９８までからなる群よ り選択されるエキソンにハイブリダイズする請求項４４記載の方法。 ４６．ＭＴＳ対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより野 生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６記載の方法。 ４７．該組織におけるＭＴＳ遺伝子の全部または一部を増幅して増幅配列を得 、次いで、増幅配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出 される請求項３６の方法。 ４８．特異的ＭＴＳ対立遺伝子に関するＭＴＳ遺伝子の全部または一部を増幅 することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６の方法。 ４９．該組織におけるＭＴＳ遺伝子の全部または一部を分子クローニングして クローン化された配列を得、クローン化された配列を配列決定することにより野 生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６の方法。 ５０．分子（１）および（２）を互いにハイブリダイズさせて二重鎖を形成さ せた場合に、該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子ゲノムＤＮＡもしくはＭＴＳｍ ＲＮＡ（分子（１））とヒト・野生型ＭＴＳ領域ＤＮＡに相補的な核酸プローブ （分子（２））との間のミスマッチを同定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の 変化が検出される請求項３６の方法。 ５１．該組織におけるＭＴＳ遺伝子配列を増幅し、増幅された配列を野生型Ｍ ＴＳ遺伝子配列からなる核酸プローブとハイブリダイゼーションさせることによ り野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６の方法。 ５２．該組織におけるＭＴＳ遺伝子配列を増幅し、増幅された配列を非野生型 ＭＴＳ遺伝子配列からなる核酸プローブとハイブリダイズさせることにより野生 型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項３６の方法。 ５３．欠失突然変異に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化 が検出される請求項３６の方法。 ５４．点突然変異に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が 検出される請求項３６記載の方法。 ５５．挿入に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出さ れる請求項３６記載の方法。 ５６．ＭＴＳ遺伝子とＭＴＳ遺伝子からなる核酸プローブとのインサイチュ（ in situ）でのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出 される請求項３６記載の方法。 ５７．発現産物が蛋白分子である請求項３６記載の方法。 ５８．イムノブロッティングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出さ れる請求項５７の方法。 ５９．モノクローナル抗体により野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出され る請求項５７の方法。 ６０．免疫細胞化学により野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求 項５７の方法。 ６１．該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子の蛋白とＣｄｋとの間の結合相互作 用をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求 項５７の方法。 ６２．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項６１の方法。 ６３．Ｃｄｋの生化学的活性の阻害をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺 伝子の蛋白の変化が検出される請求項５８の方法。 ６４．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項６３の方法。 ６５．哺乳動物試料における野生型ＭＴＳ遺伝子またはその発現産物、ＭＴＳ 遺伝子座から生じる腫瘍形成を示さない野生型遺伝子または発現産物の存在を検 出することを特徴とする、哺乳動物におけるＭＴＳ遺伝子座における腫瘍形成の 欠如を確認する方法。 ６６．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ１である請求項６５の方法。 ６７．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ２である請求項６５の方法。 ６８．該発現産物がＭＴＳ１のｍＲＮＡである請求項６５の方法。 ６９．該発現産物がＭＴＳ２のｍＲＮＡである請求項６５の方法。 ７０．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼ ーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡが検出される請求項６８の方法。 ７１．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼ ーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡが検出される請求項６９の方法。 ７２．ＭＴＳ遺伝子プローブと該組織から単離されたゲノムＤＮＡとのハイブ リダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項６５の方法。 ７３．ＭＴＳ遺伝子プローブが、配列番号：３のヌクレオチド８９１から１０ １６までおよび配列番号：４のヌクレオチド１９２から４９８までからなる群よ り選択されるエキソンにハイブリダイズする請求項７２の方法。 ７４．該組織におけるＭＴＳ遺伝子のすべてまたは一部を増幅して増幅された 配列を得、次いで、増幅された配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝 子が検出される請求項６５の方法。 ７５．該組織におけるＭＴＳ遺伝子のすべてまたは一部を分子クローニングし てクローン化された配列を得、次いで、クローン化された配列を配列決定するこ とにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項６５の方法。 ７６．ＭＴＳ遺伝子とＭＴＳ遺伝子からなる核酸プローブとのインサイチュに おけるハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項６ ５の方法。 ７７．発現産物が蛋白分子である請求項６５の方法。 ７８．イムノブロッティングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出さ れる請求項７７の方法。 ７９．免疫細胞化学により野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求 項７７の方法。 ８０．該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子の蛋白とＣｄｋとの間の結合相互作 用をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求 項７７の方法。 ８１．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項８０の方法。 ８２．Ｃｄｋの生化学的活性の阻害をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺 伝子の蛋白の変化が検出される請求項７７の方法。 ８３．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項８２の方法。 ８４．野生型ＭＴＳ遺伝子核酸または野生型ＭＴＳ遺伝子核酸と実質的に相同 的であり細胞周期を調節することのできる核酸を細胞に導入することを特徴とす る、ＭＴＳ遺伝子における変異によりＭＴＳ遺伝子機能を失ったかまたは変化し た遺伝子機能を有する細胞に野生型ＭＴＳ遺伝子機能または野生型と実質的に同 様なＭＴＳ機能を提供する方法。 ８５．該核酸が野生型ＭＴＳ遺伝子の一部であり、該一部が該細胞の非腫瘍形 成的増殖に必要な野生型ＭＴＳ遺伝子のポリペプチドの一部をコードしている請 求項８４の方法。 ８６．該核酸が野生型ＭＴＳ遺伝子の一部であり、該一部が該細胞の非腫瘍形 成的増殖に必要な野生型ＭＴＳ遺伝子のポリペプチドの全部をコードしている請 求項８４の方法。 ８７．該核酸が野生型ＭＴＳ遺伝子の一部と実質的に相同的であり、該一部が 野生型ＭＴＳポリペプチドの一部と実質的に相同性があり該細胞の非腫瘍形成的 増殖に必要な野生型ＭＴＳポリペプチドの一部と実質的に同様な機能を有するポ リペプチドをコードしている請求項８４の方法。 ８８．該核酸が野生型ＭＴＳ遺伝子の一部と実質的に相同的であり、該一部が 野生型ＭＴＳポリペプチドの全部と実質的に相同性があり該細胞の非腫瘍形成的 増殖に必要な野生型ＭＴＳポリペプチドの全部と実質的に同様な機能を有するポ リペプチドをコードしている請求項８４の方法。 ８９．該核酸がＭＴＳ遺伝子調節配列を含んでいる請求項８４〜８８のいずれ か１項の方法。 ９０．該核酸が細胞のゲノム中に含まれている請求項８４〜８９のいずれか１ 項の方法。 ９１．細胞の非腫瘍形成的増殖に必要な野生型ＭＴＳポリペプチドの全部また は一部を細胞中に導入することを特徴とする、ＭＴＳ遺伝子における変異により ＭＴＳ遺伝子機能を失ったかまたは変化した遺伝子機能を有する細胞に野生型Ｍ ＴＳ遺伝子機能または野生型と実質的に同様なＭＴＳ機能を提供する方法。 ９２．野生型ＭＴＳポリペプチドの機能を模倣する分子を細胞中に導入するこ とを特徴とする、ＭＴＳ遺伝子における変異によりＭＴＳ遺伝子機能を失ったか または変化した遺伝子機能を有する細胞に野生型ＭＴＳ遺伝子機能または野生型 と実質的に同様なＭＴＳ機能を提供する方法。 ９３．該分子が、細胞の非腫瘍形成的増殖に必要な完全な野生型ＭＴＳポリペ プチドと実質的に相同的であり、野生型ＭＴＳポリペプチドと実質的に同様の機 能を有するポリペプチドである請求項９２の方法。 ９４．該分子が、細胞の非腫瘍形成的増殖に必要な野生型ＭＴＳポリペプチド の一部と実質的に相同的であり、野生型ＭＴＳポリペプチドの一部と実質的に同 様の機能を有するポリペプチドである請求項９２記載の方法。 ９５．以下の工程（ａ）〜（ｃ）： （ａ）サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）のアッセイに適合する溶液中で、 癌治療の可能性のある化合物、Ｃｄｋ、サイクリン、Ｃｄｋ基質および標識され たＡＴＰを混合し； （ｂ）リン酸化された基質の量を測定し；次いで （ｃ）工程（ｂ）におけるリン酸化された基質の量を、工程（ａ）により調製 された対照試料であって癌治療薬の可能性のある化合物のかわりにＭＴＳポリペ プチドを含有する対照試料と比較する からなる、潜在的に癌治療が可能な薬剤をスクリーニングする方法。 ９６．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項９５の方法。 ９７．サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）、ＭＴＳポリペプチドおよび癌治 療薬である可能性のある化合物を混合し、次いで、ＭＴＳポリペプチドのＣｄｋ への結合量を測定することからなる、癌治療可能な薬剤をスクリーニングする方 法。 ９８．ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項９７の方法。 ９９．サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）および癌治療薬である可能性のあ る化合物を混合し、次いで、Ｃｄｋの生物学的活性を測定することからなる、潜 在的に癌治療が可能な薬剤をスクリーニングする方法。 １００．ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項９９の方法。 １０１．変化したＭＴＳ遺伝子を有する形質転換された真核宿主細胞を、癌治 療薬である可能性のある化合物の存在下で増殖させ、次いで、該宿主細胞の増殖 速度を測定することからなる、潜在的に癌治療が可能な薬剤をスクリーニングす る方法。 １０２．サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）の生物学的活性を測定すること により該宿主細胞の増殖速度が測定される請求項１０１の方法。 １０３．ゲノム中に第二の動物由来の変化したＭＴＳ対立遺伝子を有するトラ ンスジェニック動物。 １０４．変化したＭＴＳ対立遺伝子が欠失体である請求項１０３の方法。 １０５．変化したＭＴＳ対立遺伝子が崩壊した対立遺伝子である請求項１０３ の方法。[Claims]   1. An isolated DN which essentially comprises a cDNA encoding an MTS polypeptide A.   2. The isolated DNA of claim 1 which encodes an MTS1 polypeptide.   3. The isolated DNA of claim 1 which encodes an MTS2 polypeptide.   4. The isolated DNA of claim 1, which encodes a MTS1E1β polypeptide.   5. The MTS polypeptide is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: The isolated DNA according to claim 1, comprising the amino acid sequence shown in 16.   6. A DNA having at least 15 nucleotides of the cDNA of claim 1 Essential isolated DNA.   7. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, from the DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 36 An isolated DNA consisting essentially of a DNA selected from the group consisting of:   8. The isolated DNA of claim 7 having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.   9. The isolated DNA of claim 7 having the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.   10. The isolated DNA of claim 7, having the sequence set forth in SEQ ID NO: 4.   11. The isolated DNA of claim 7 having the sequence set forth in SEQ ID NO: 5.   12. The isolated DNA of claim 7, having the sequence set forth in SEQ ID NO: 13.   13. The isolated DNA of claim 7 having the sequence set forth in SEQ ID NO: 15.   14. The isolated DNA of claim 7 having the sequence set forth in SEQ ID NO: 36.   15. 5 (A and B), FIG. 6 (A and B), FIG. 7 (A and B), and FIG. , FIG. 11, FIG. 12 (A and B), SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 36 An isolated DNA fraction which is a mutated form of the MTS nucleotide sequence shown in one of these Child.   16. Of the determination of the nucleotide sequence of the MTS gene by the polymerase chain reaction Is a pair of single-stranded DNA primers for 9p21 and the use of primers in the polymerase chain reaction Single-stranded DNA plasmids that give rise to synthetic DNA containing all or part of a gene sequence A pair of immers.   17． The ply of claim 16, wherein the MTS gene sequence is set forth in SEQ ID NO: 1. A pair of mars.   18. The ply of claim 16, wherein the MTS gene sequence is shown in SEQ ID NO: 3. A pair of mars.   19. The ply of claim 16, wherein the MTS gene sequence is shown in SEQ ID NO: 4. A pair of mars.   20. The ply of claim 16, wherein the MTS gene sequence is shown in SEQ ID NO: 5. A pair of mars.   21. The plastic of claim 16, wherein said MTS gene sequence is shown in SEQ ID NO: 13. A pair of immers.   22. The plastic of claim 16, wherein said MTS gene sequence is shown in SEQ ID NO: 15. A pair of immers.   23. The plastic of claim 16 wherein said MTS gene sequence is set forth in SEQ ID NO: 36. A pair of immers.   24. (A) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 241; (B) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 148; (C) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 418; (D) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 266-270 deleted; (E) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 214; (F) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 306; (G) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 148 to 155 deleted; (H) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 317; (I) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 305; (J) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 124; and (K) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 104-105 deleted An isolated DNA sequence selected from the group consisting of:   25. A nucleic acid probe complementary to the human / wild type MTS gene sequence.   26. SEQ ID NO: 3 from nucleotide 891 to 1016 and SEQ ID NO: The exon selected from the group consisting of nucleotides 192 to 498 of 4 The nucleic acid probe according to claim 25, which is hybridized.   27. (A) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 241; (B) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 148; (C) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 418; (D) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 266-270 deleted; (E) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 214; (F) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 306; (G) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 148 to 155 deleted; (H) SEQ ID NO: 1 with a T at nucleotide position 317; (I) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 305; (J) SEQ ID NO: 1 with an A at nucleotide position 124; and (K) SEQ ID NO: 1 with nucleotides 104-105 deleted Of humans that hybridize to a part of the MTS gene selected from the group consisting of A nucleic acid probe complementary to the MTS gene sequence.   28. Operates in the isolated DNA of any one of claims 1-14 and a host cell A replicating cloning vector consisting of a replicating replicon.   29. 15. Any one of claims 1-14 operably linked to a suitable regulatory sequence. An expression system consisting of the isolated DNA of.   30. A recombinant host cell transformed with the expression system of claim 29.   31. 31. The cells of claim 30 under conditions effective for the production of MTS polypeptides. A method for producing a recombinant MTS polypeptide, which comprises culturing.   32. The amino acid sequence of the protein is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: The human MT corresponding to that shown in 16 and substantially free of other human proteins S polypeptide preparation.   33. The amino acid sequence of the polypeptide is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 or The polypeptide has a substantial homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and the polypeptide is wild. Other human proteins that have substantially the same function as the type MTS polypeptide. Human MTS polypeptide preparation not included in.   34. Immunoreactive with Mammalian MTS Polypeptides to Bind Other Mammalian Polypeptides An antibody that does not substantially immunoreact with Tide.   35. The antibody of claim 34 which is a monoclonal antibody.   36. Wild-type MTS gene or its expression in tissues isolated from mammals To detect changes in the somatic cells of the active product that are indicative of tumorigenesis of the tissue. A method of diagnosing or prognosing impaired tissue in a mammal, which is characterized.   37. 37. The method of claim 36, wherein the MTS gene is MTS1.   38. 37. The method of claim 36, wherein the MTS gene is MTS2.   39. 37. The method of claim 36, wherein the expression product is MTS1 mRNA.   40. 37. The method of claim 36, wherein the expression product is MTS2 mRNA.   41. Hybridizer of mRNA from the tissue sample to MTS gene probe A change in the mRNA of the wild-type MTS gene is detected by the ization. 9 or 40 methods.   42. 37. The method of claim 36, wherein changes are detected in the regulatory region of the MTS gene.   43. For the electrophoretic mobility of single-stranded DNA on non-denaturing polyacrylamide gel A change in the wild-type MTS gene is detected by observing the change in the WT gene. Method 6   44. A MTS gene probe for genomic DNA isolated from the tissue. 37. A change in the wild type MTS gene is detected by hybridization. the method of.   45. The MTS gene probe has nucleotides 891 to 10 of SEQ ID NO: 3. 16 and the group consisting of nucleotides 192 to 498 of SEQ ID NO: 4 45. The method of claim 44, which hybridizes to a reselected exon.   46. By hybridization with an MTS allele-specific probe 37. The method of claim 36, wherein changes in the live MTS gene are detected.   47. Amplification sequence is obtained by amplifying all or part of MTS gene in the tissue. , And then the amplified sequence is sequenced to detect changes in the wild-type MTS gene 37. The method of claim 36, wherein:   48. Amplify all or part of the MTS gene for a specific MTS allele 37. The method of claim 36, wherein the change in the wild-type MTS gene is detected.   49. Molecular cloning of all or part of the MTS gene in the tissue By obtaining the cloned sequence and sequencing the cloned sequence, 37. The method of claim 36, wherein changes in the live MTS gene are detected.   50. Molecules (1) and (2) hybridize to each other to form a duplex. MTS gene genomic DNA or MTSm isolated from the tissue Nucleic acid probe complementary to RNA (molecule (1)) and human / wild type MTS region DNA By identifying the mismatch between (Molecular (2)) 37. The method of claim 36, wherein a change is detected.   51. The MTS gene sequence in the tissue is amplified, and the amplified sequence is used as a wild-type M By hybridizing with a nucleic acid probe consisting of the TS gene sequence 37. The method of claim 36, wherein changes in the wild type MTS gene are detected.   52. Amplify the MTS gene sequence in the tissue and use the amplified sequence as a non-wild type Wild by hybridizing with a nucleic acid probe consisting of MTS gene sequence 37. The method of claim 36, wherein changes in type MTS gene are detected.   53. Changes in wild-type MTS gene by screening for deletion mutations 37. The method of claim 36, wherein is detected.   54. By screening for point mutations, changes in the wild-type MTS gene 37. The method of claim 36, which is detected.   55. Screening for insertion detected changes in the wild-type MTS gene. 37. The method of claim 36, wherein   56. In situ of MTS gene and nucleic acid probe consisting of MTS gene ( Changes in wild-type MTS gene detected by hybridization in situ) 37. The method of claim 36, wherein   57. 37. The method according to claim 36, wherein the expression product is a protein molecule.   58. Changes in the protein of the wild-type MTS gene were detected by immunoblotting. 58. The method of claim 57, wherein   59. Changes in the protein of the wild-type MTS gene were detected by the monoclonal antibody 58. The method of claim 57.   60. Claim that protein alteration of wild type MTS gene is detected by immunocytochemistry Item 57. The method of Item 57.   61. Binding interaction between a protein of the MTS gene isolated from the tissue and Cdk A change in the protein of the wild-type MTS gene is detected by assaying Item 57. The method of Item 57.   62. 62. The method of claim 61, wherein the Cdk is Cdk4.   63. By assaying for inhibition of Cdk biochemical activity, wild-type MTS 59. The method of claim 58, wherein changes in gene proteins are detected.   64. 64. The method of claim 63, wherein the Cdk is Cdk4.   65. Wild-type MTS gene or expression product thereof in mammalian sample, MTS The presence of a wild-type gene or expression product that does not show tumorigenesis arising from the locus is detected. Of tumorigenesis at the MTS locus in mammals characterized by How to confirm the lack.   66. 66. The method of claim 65, wherein the MTS gene is MTS1.   67. 66. The method of claim 65, wherein said MTS gene is MTS2.   68. 66. The method of claim 65, wherein the expression product is MTS1 mRNA.   69. 66. The method of claim 65, wherein the expression product is MTS2 mRNA.   70. Hybridase of mRNA derived from the tissue sample and MTS gene probe 69. The method according to claim 68, wherein the mRNA of the wild-type MTS gene is detected by the mutation.   71. Hybridase of mRNA derived from the tissue sample and MTS gene probe 70. The method according to claim 69, wherein the mRNA of the wild-type MTS gene is detected by the solution.   72. Hive of MTS gene probe and genomic DNA isolated from the tissue 66. The method of claim 65, wherein the wild type MTS gene is detected by redidation.   73. The MTS gene probe has nucleotides 891 to 10 of SEQ ID NO: 3. 16 and the group consisting of nucleotides 192 to 498 of SEQ ID NO: 4 73. The method of claim 72, which hybridizes to a reselected exon.   74. Amplified by amplifying all or part of the MTS gene in the tissue The wild-type MTS gene was obtained by obtaining the sequence and then sequencing the amplified sequence. 66. The method of claim 65, wherein offspring are detected.   75. Molecular cloning of all or part of the MTS gene in the tissue To obtain the cloned sequence and then to sequence the cloned sequence. 66. The method of claim 65, wherein the wild type MTS gene is detected by.   76. In situ with MTS gene and nucleic acid probe consisting of MTS gene The wild-type MTS gene is detected by hybridization in Method 5   77. 66. The method of claim 65, wherein the expression product is a protein molecule.   78. Changes in the protein of the wild-type MTS gene were detected by immunoblotting. 79. The method of claim 77, wherein   79. Claim that protein alteration of wild type MTS gene is detected by immunocytochemistry The method of paragraph 77.   80. Binding interaction between a protein of the MTS gene isolated from the tissue and Cdk A change in the protein of the wild-type MTS gene is detected by assaying The method of paragraph 77.   81. 81. The method of claim 80, wherein the Cdk is Cdk4.   82. By assaying for inhibition of Cdk biochemical activity, wild-type MTS 78. The method of claim 77, wherein alterations in gene proteins are detected.   83. 83. The method of claim 82, wherein the Cdk is Cdk4.   84. Wild type MTS gene nucleic acid or substantially homologous to wild type MTS gene nucleic acid And introducing a nucleic acid capable of regulating the cell cycle into a cell A mutation in the MTS gene that results in loss or alteration of MTS gene function. Cells having the same gene function as wild type MTS gene function or wild type How to provide such MTS function.   85. Said nucleic acid is part of a wild type MTS gene, said part being a non-tumor form of said cell A contract encoding a part of the polypeptide of the wild-type MTS gene required for adult growth The method of claim 84.   86. Said nucleic acid is part of a wild type MTS gene, said part being a non-tumor form of said cell A contract encoding all of the polypeptide of the wild-type MTS gene required for adult growth The method of claim 84.   87. The nucleic acid is substantially homologous to a portion of the wild-type MTS gene, and the portion Non-tumorigenicity of the cell with substantial homology to a portion of the wild-type MTS polypeptide A polypeptide having substantially the same function as a part of the wild-type MTS polypeptide required for growth. 85. The method of claim 84, which encodes a polypeptide.   88. The nucleic acid is substantially homologous to a portion of the wild-type MTS gene, and the portion Non-tumorigenicity of the cells with substantial homology to all of the wild-type MTS polypeptide A polypeptide having substantially the same function as all of the wild-type MTS polypeptide required for growth. 85. The method of claim 84, which encodes a polypeptide.   89. 89. Any of claims 84-88, wherein said nucleic acid comprises an MTS gene regulatory sequence. Or the method of item 1.   90. 89. Any one of claims 84-89, wherein said nucleic acid is contained in the genome of a cell. Method of terms.   91. All of the wild-type MTS polypeptide required for non-tumorigenic growth of cells Due to a mutation in the MTS gene, characterized in that Wild-type M in cells having gene function that has lost or altered MTS gene function A method of providing TS gene function or MTS function substantially similar to wild type.   92. Introducing into the cell a molecule that mimics the function of the wild-type MTS polypeptide. Loss of MTS gene function due to mutation in MTS gene characterized by Alternatively, cells with altered gene function may have wild type MTS gene function or wild type A method of providing MTS functionality substantially similar to.   93. The molecule is a complete wild-type MTS polypeptide required for non-tumorigenic growth of cells. A protein that is substantially homologous to peptide and is substantially similar to the wild-type MTS polypeptide. 93. The method of claim 92, which is a functional polypeptide.   94. The molecule is a wild-type MTS polypeptide required for non-tumorigenic growth of cells Substantially homologous to a portion of the wild type MTS polypeptide. 93. The method according to claim 92, which is a polypeptide having a similar function.   95. The following steps (a) to (c):   (A) in a solution compatible with the assay for cyclin-dependent kinase (Cdk), Compounds with potential for cancer treatment, Cdk, cyclins, Cdk substrates and labeled Mixed ATP;   (B) measuring the amount of phosphorylated substrate;   (C) Adjust the amount of phosphorylated substrate in step (b) by step (a) Control Samples Instead of Potential Cancer Therapeutic Compounds Instead of MTS Polype Compare with control sample containing peptide A method for screening a drug that is potentially capable of treating cancer.   96. 96. The method of claim 95, wherein said Cdk is Cdk4.   97. Cyclin-dependent kinase (Cdk), MTS polypeptide and cancer treatment Compounds that are potentially therapeutic agents are mixed and then the MTS polypeptide Cdk For screening a drug capable of treating cancer, which comprises measuring the amount bound to Law.   98. 98. The method of claim 97, wherein the Cdk is Cdk4.   99. Cyclin-dependent kinase (Cdk) and potential therapeutic agent for cancer Of the latent compound, which consists of admixing the compounds with each other and then measuring the biological activity of the Cdk. A method for screening a drug capable of locally treating cancer.   100. 100. The method of claim 99, wherein Cdk is Cdk4.   101. Transformed eukaryotic host cells with altered MTS gene are used to cure cancer. Grow in the presence of a potentially therapeutic compound and then grow the host cell Screening for potentially cancer-treating agents that consist of measuring velocity How to do.   102. To measure the biological activity of cyclin-dependent kinase (Cdk) 102. The method of claim 101, wherein the growth rate of said host cell is measured by.   103. Tigers with altered MTS alleles from the second animal in their genome Transgenic animal.   104. 104. The method of claim 103, wherein the altered MTS allele is a deletion.   105. 103. The altered MTS allele is a disrupted allele. the method of.
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