JP2000500985A - Chromosome 13 linkage-breast cancer susceptibility gene - Google Patents

Chromosome 13 linkage-breast cancer susceptibility gene

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのうちの幾つかの突然変異対立遺伝子が癌、特に乳癌に対する感受性を引起すヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ２）を単離および検出するために用いる方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子中の生殖系突然変異、および乳癌におけるその使用、およびヒト乳癌の診断およびそれへの素因におけるその使用に関する。さらに、本発明は、他のヒト癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異およびヒト癌の診断および予後におけるその使用に関する。本発明は、遺伝子治療、蛋白質置換療法および蛋白質ミメティクスを包含する、ＢＲＣＡ２遺伝子中に突然変異を有するヒト癌の治療にも関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤のスクリーニングにも関する。最後に、本発明は、乳癌への素因を診断するのに有用である、突然変異についてのＢＲＣＡ２遺伝子のスクリーニングに関する。   (57) [Summary] The present invention relates generally to the field of human genetics. In particular, the invention relates to methods and materials used to isolate and detect the human breast cancer predisposition gene (BRCA2), of which several mutant alleles elicit susceptibility to cancer, particularly breast cancer. More particularly, the present invention relates to germline mutations in the BRCA2 gene and their use in breast cancer, and their use in diagnosing and predisposing to human breast cancer. Furthermore, the invention relates to somatic mutations in the BRCA2 gene in other human cancers and their use in diagnosing and prognosing human cancers. The present invention also relates to the treatment of human cancers having a mutation in the BRCA2 gene, including gene therapy, protein replacement therapy and protein mimetics. Furthermore, the present invention relates to screening of drugs for treating cancer. Finally, the invention relates to screening the BRCA2 gene for mutations, which is useful for diagnosing a predisposition to breast cancer.

Description

【発明の詳細な説明】 第１３染色体連鎖−乳癌感受性遺伝子発明の分野 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのう ちの幾つかの突然変異対立遺伝子が癌、特に女性および男性において乳癌に対す る感受性を引起すヒト癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ２）を単離および検出するために 用いる方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子中 の生殖系突然変異、および乳癌への素因の診断におけるその使用に関する。さら に、本発明は、ヒト乳癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、および ヒト乳癌の診断および予後におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他の ヒト癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌の診断およ び予後におけるその使用に関する。本発明は、また、遺伝子治療、蛋白質置換療 法、および蛋白質ミメティクスを包含する、ＢＲＣＡ２遺伝子中に突然変異を有 するヒト癌の治療にも関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤のスクリーニ ングに関する。最後に、本発明は、乳癌への素因を診断するのに有用である、突 然変異についてのＢＲＣＡ２遺伝子のスクリーニングに関する。 本明細書中にて用いる刊行物および他の材料は本発明の背景を説明するための ものであって、特に実施に関連するさらなる説明を記載する場合には、出典明示 して本明細書の一部とみなし、簡便のために、以下の明細書中において著者およ び発行年によって参照し、各々、添付する参考文献リストにグループ化する。発明の背景 癌の遺伝学は複雑であり、複優性、トランスフォーム状態の正の調節遺伝子（ 癌遺伝子）ならびに複劣性、負の調節遺伝子（癌抑制遺伝子）が包含される。１ ００種を超える癌遺伝子が特徴付けされている。１ダースも癌抑制遺伝子は同定 さ れていないが、その数は５０種を超えて増加すると予想される（Knudson,1993） 。 かくも多種の遺伝子の関与は、正常組織の完全性を維持するために細胞中で作 動する増殖制御機構の複雑性を強調している。この複雑性は、もう１つの方法に よっても明らかである。現在までに、全てまたは大部分のヒト癌でさえ、その発 病に関与することが示された単一の遺伝子は全くない。最も一般的な癌遺伝子性 突然変異は、全ての固形癌の１０-１５％において見出されているH-ras遺伝子中 に存在する（Anderson ら，1992）。最も頻繁に突然変異した癌抑制遺伝子は、 検査した全ての腫瘍のおおよそ５０％でホモ接合的に欠失しているTP53遺伝子、 および検査した４６％の腫瘍セルラインにおいてホモ接合的に欠失しているＣＤ ＫＮ２である（Kamb ら，1994a）。全てのトランスフォーメーションした細胞に 共通である標的がなくては、正常組織は無害のまま残しつつ癌細胞を破壊または 復帰させることができる「魔法の弾丸（magic bullet）」の夢は叶えられそう にない。特異的に標的化する抗腫瘍薬剤の新たな創製に対する希望は、細胞分裂 の制御に一般的な役割を果たしている腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子を同定する 能力にかかり得る。 クローン化され特徴付けられている癌抑制遺伝子は、１）網膜芽細胞腫（ＲＢ １）；２）ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）；３）リー・フラウメニ症候群（ＴＰ５３ ）；４）家族性大腸腺腫瘍（ＡＰＣ）；５）神経繊維腫症１型（ＮＦ１）；６） 神経繊維腫症２型（ＮＦ２）；７）フォンヒッペル・リンドウ症候群（ＶＨＬ） ；８）多発性内分泌腫瘍症２Ａ型（ＭＥＮ２Ａ）；および９）メラノーマ（ＣＤ ＫＮ２）；に対する感受性に影響する。 遺伝的に地図作成されているが未だ単離されていない癌抑制遺伝子座には、多 発性内分泌腫瘍症１型（ＭＥＮ１）；リンチ癌家族性症候群２型（ＬＣＦＳ２） ；神経芽細胞腫（ＮＢ）；基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）；ベックウィズ・ビ ーデマン症候群（ＢＷＳ）；腎細胞癌（ＲＣＣ）；結節性硬化症１型（ＴＳＣ１ ）；および結節性硬化症２型（ＴＳＣ２）についての遺伝子が包含される。現在 までに特徴付けられている癌抑制遺伝子は、ＤＮＡ結合蛋白質（ＷＴ１）、補助 転写調節遺伝子（ＲＢ１）、ＧＴＰエース活性化蛋白質もしくはＧＡＰ（ＮＦ１ ）、細胞体質 コンポーネント（ＮＦ２）、膜結合受容体キナーゼ（ＭＥＮ２Ａ）、細胞周期調 節遺伝子（ＣＤＫＮ２）、および公知の蛋白質（ＡＰＣおよびＶＨＬ）に明らか な類似性を有しない他のもの；を包含する種々の蛋白質型に類似性を有する生成 物をコードしている。 多くの場合においては、遺伝子研究を通して元来同定された癌抑制遺伝子は、 幾つかの散発性腫瘍においては欠失または突然変異していることが示されている 。この結果は、染色体異常の領域が、癌への遺伝的素因および散発性癌の両方に 関与する重要な癌抑制遺伝子の位置を表し得るということを示している。 現在までに特徴付けられている幾つかの癌抑制遺伝子の顕著な特徴のうちの１ つは、それらがある種の癌の型では高頻度で欠失しているということである。該 欠失は、しばしば単一対立遺伝子の欠失、いわゆるヘテロ接合性の欠失（ＬＯＨ ）を含むが、両方の対立遺伝子のヘテロ接合欠失も含み得る。ＬＯＨについては 、予め存在する遺伝した突然変異であるか、または二次的な散発性突然変異であ るかのいずれかであるためであるため、残りの対立遺伝子が非機能性であると予 想される。 乳癌は、女性に影響する最も重要な疾病のうちの１つである。最近の比率では 、アメリカ女性は９５歳までに乳癌を発病させる８の危険性のうちの１を有して いる（American Cancer Society,1992）。後期ステージにおける乳癌の治療では 、しばしば役立たず、醜くなってしまい、該疾病の医学的管理においては早期の 検出が非常に重要なものとなっている。乳癌よりも低い頻度ではあるが、卵巣癌 はしばしば迅速に死にいたり、アメリカ女性における癌死亡者の４番目の最も一 般的な原因である。乳癌発病率の不明確な比率に寄与する遺伝的因子は全ケース の約５％であるが、４０歳以前に診断されたケースのほぼ２５％と概算される（ Claus ら，1991）。乳癌は、年齢−特異的発病率曲線中の５０歳付近の変曲点に 基いて２つのタイプ；早期年齢開始および後期年齢開始に分けられている。１つ の遺伝子、ＢＲＣＡ１の突然変異は、ほぼ４５％の家族性乳癌の原因であると考 えられているが、乳癌および卵巣癌の双方を有する少なくとも８０％の家族の原 因であると考えられている（Easton ら，1993）。 ＢＲＣＡ1遺伝子は、それが1990年に地図作成された（Hall ら,1990；Ｎarod ら,1991）後、猛烈な努力の末単離された（Futreal ら,1994；Miki ら,1994）。 第２の遺伝子座、ＢＲＣＡ２は最近第１３染色体に地図作成され（Woosterら,19 94）、ＢＲＣＡ１におよそ等しい比率の早期開始乳癌の原因のようであるが、卵 巣癌にはより低い危険性を付与しているようである。早期開始乳癌に対する残り の感受性は、家族性癌の未だ地図作成されていない遺伝子とＴＰ５３のごとき遺 伝子中のより稀な生殖系突然変異との間に分けられる（Malkinら,1990）。毛細 管拡張性運動失調遺伝子の欠損形のへテロ接合性キャリアーが、乳癌に対してよ り高い危険性にあることも示されている（Swift ら,1976；Swiftら,1991）。後 期年齢開始乳癌も、早期年齢開始乳癌ほど比率における危険性は高くないが、し ばしば家族性である（Cannon−Albright ら,1994；Mettlin ら,1990）。しかし ながら、遺伝的感受性に起因するかかるケースのパーセンテージはわかっていな い。 乳癌は、長い間ずっと、部分的に家族性の疾病であると認識されてきた（Ande rson，1972）。膨大な数の研究者が遺伝的承継に関する事実を調べ、データは主 要感受性遺伝子座または座群についての優性遺伝と大部分一致すると結論してい る（Bishop および Gardner,1980；Go ら,1983；Williams およびAnderson，198 4；Bishop ら,1988；Noewman ら,1988；Clausら,1991）。最近の結果によれば、 乳癌ならびに他の癌に対する感受性を運搬している少なくとも３個の遺伝子座が 存在することが立証されている。これらの遺伝子座は、第１７ｐ染色体上のＴＰ ５３遺伝子座（Malkin ら,1990）、ＢＲＣＡ１として知られている１７ｑ−連鎖 感受性遺伝子座（Hall ら,1990）、および地図作成されていない残りのものに寄 与する１または２以上の遺伝子座である。Hallら（1990）は、早期年齢開始を有 する家系で遺伝された乳癌感受性が、第１７ｑ２１染色体に連鎖していることを 示している；しかし、より適当な遺伝モデルを用いたこのグループによる続く実 験は、早期年齢乳癌への限定に部分的に異議を唱えている（Margaritteら,1992 ）。 第１３染色体連鎖−乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ２）をクローニングする大部分 のストラテジーは、正確な遺伝子位置決定実験を要する。ＢＲＣＡ２の機能的な 役割に関する最も単純なモデルは、癌への素因となるＢＲＣＡ２の対立遺伝子が 野生型対立遺伝子に対して劣性である；すなわち、少なくとも１個の野生型ＢＲ ＣＡ２対立遺伝子を含む細胞は癌性ではない；ということを保持する。しかしな がら、１個の野生型ＢＲＣＡ２対立遺伝子および１個の素因対立遺伝子を含む細 胞は、ランダム突然変異によるか、または細胞分裂の間の染色体欠失（非分離） によるかのいずれかによる野生型対立遺伝子の欠失を時々被り得る。かかる突然 変異細胞の全子孫はＢＲＣＡ２の野生型機能を欠いており、腫瘍を発病し得る。 このモデルによれば、ＢＲＣＡ２の素因対立遺伝子は劣性であり、癌に対する感 受性もまた優性様式で遺伝され：１個の素因対立遺伝子（および１個の野生型対 立遺伝子）を有する女性は、彼女らの乳房上皮細胞が野生型ＢＲＣＡ２対立遺伝 子を自然に欠失し得るため、癌を発病する危険がある。このモデルは、網膜芽細 胞腫遺伝子および神経繊維腫症遺伝子を包含する遺伝子のクラスである、癌抑制 遺伝子または抗癌遺伝子（antioncogene）として知られている癌感受性遺伝子座 に適用される。推論により、このモデルは、最近示唆されているごとく（Smith ら,1992）、ＢＲＣＡ１機能を説明することができる。 第２の可能性は、ＢＲＣＡ２素因対立遺伝子が真に優性であり；すなわち、Ｂ ＲＣＡ２の野生型対立遺伝子は素因対立遺伝子の腫瘍形成機能に打ち勝つことは できない；というものである。かくして、野生型および突然変異対立遺伝子の両 方を運搬している細胞は、悪性細胞を生じる前に必ずしもＢＲＣＡ２の野生型コ ピーを欠失していないであろう。その代りに、素因のある（predisposed）個人 の乳房細胞は、癌に通じる幾つかの他の確率論的な変化（群）を起こすであろう 。 ＢＲＣＡ２素因対立遺伝子が劣性であるならば、ＢＲＣＡ２遺伝子は正常乳房 組織で発現されているが、乳癌においては機能的に発現されていないと予想され る。それとは反対に、ＢＲＣＡ２素因対立遺伝子が優性であるならば、野生型Ｂ ＲＣＡ２遺伝子は正常乳房組織で発現されていることも、されていないこともあ り得る。しかしながら、素因対立遺伝子は乳癌細胞で発現しているようである。 ＢＲＣＡ２の第１３染色体連鎖は、ＢＲＣＡ１に連鎖していなかった複数ケー スの早期年齢開始乳癌ケースを有する１５家族を調査することによって別々に確 認された（Wooster ら,1994）。これらの調査は、１３ｑ１２−１３によって画 定される物理的領域中にＢＲＣＡ２を位置させる、マーカーＤ１３Ｓ２８９とＤ １３Ｓ２６７との間の６センチモルガン（ｃＭ）またはほぼ6,000,000塩基対の 大きな領域内に該遺伝子が位置決定されることを主張している。これらの領域の サイズおよびそれらに関連する不確定性は、ＢＲＣＡ２遺伝子を単離するための 物理的地図作成および／またはクローニング・ストラテジーを設計し実行するこ とを困難としてきた。ＢＲＣＡ１のように、ＢＲＣＡ２は女性に早期年齢開始乳 癌の高い危険性を付与しているようである。しかしながら、ＢＲＣＡ２は男性乳 癌の上昇した危険性を付与するようであるが、卵巣癌の実質的に上昇した危険性 を付与しないようである（Wooster ら,1994）。 乳癌感受性遺伝子座の同定により、感受性個人の早期の検出が可能となり、癌 に通じる初期段階を理解するための本発明者らの能力を大きく増大させるであろ う。感受性遺伝子座はしばしば腫瘍進行の間に変化するため、これらの遺伝子を クローニングすることは、より良好な診断製品および予後製品、ならびにより良 好な癌療法の開発にも重要となり得る。発明の概要 本発明は一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのうち の幾つかの対立遺伝子が癌、特に女性および男性における乳癌に対する感受性を 引起すヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ２）を単離および検出するために使用する 方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子における 生殖系突然変異、および乳癌への素因の診断におけるその使用に関する。さらに 、本発明は、ヒト乳癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒ ト乳癌の診断および予後におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒ ト癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌の診断および 予後におけるその使用に関する。また、本発明は、遺伝子治療、蛋白質置換療法 および蛋白質ミメティクスを包含する、ＢＲＣＡ２中に突然変異を有するヒト癌 の治療にも関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤のスクリーニングに関す る。 最後に、本発明は、乳癌への素因を診断するのに有用である、突然変異について のＢＲＣＡ２遺伝子のスクリーニングに関する。図面の簡単な説明 図１は、ＢＲＣＡ２領域中のＳＴＳ、Ｐ１、ＢＡＣおよびＹＡＣの模式的地図 を示す。 図２は、ＢＲＣＡ２転写配列を組合わせるために用いたｃＤＮＡクローン、ハ イブリッド選抜クローン、ｃＤＮＡ ＰＣＲ生成物およびゲノム配列の間の配列 −空間関係を示す。２−Ｂｒ−Ｃ：ＲＡＣＥはヒト乳房およびヒト胸腺ｃＤＮＡ の両方から得られたビオチン−捕捉ＲＡＣＥ生成物である。ｃＤＮＡクローンλ ｓＣ７１３.１はヒト精巣およびＨｅｐＧ２ ｃＤＮＡライブラリーのプールを ハイブリッド選抜クローンＧＴ７１３でスクリーニングすることによって同定し た。配列１−ＢＲ：ＣＧ０２６→５ｋｂは、（λｓＣ７１３．１内の）エキソン ７／８ 接合部で始まりエキソン１１の一部であるハイブリッド選抜クローン内で終結す るＰＣＲ生成物から生成した。エキソン１１の配列は、公開されているドメイン および放射性同位元素標識ＤＮＡ配列決定ゲルにおけるゲノム配列であるハイブ リッド選抜クローンと比較することによって修正した。そのエキソン内に位置す るハイブリッド選抜クローン（ｎＨまたはＧＴで始まるクローン名）をその下側 に記載する。ｃＤＮＡクローンλｗＣＢＦ１Ｂ８.１、λｗＣＢＦ１Ａ５.１、λ ｗＣＢＦ１Ａ５．１２、λｗＣＢＦ１Ｂ６.２およびλｗＣＢＦ１Ｂ６.３は、ヒ ト乳腺、胎盤、精巣およびＨｅｐＧ２ ｃＤＮＡライブラリーのプールをエキソ ン・トラッピングクローンｗＸＢＦ１Ｂ８、ｗＸＰＦ１Ａ５およびｗＸＢＦ１Ｂ ６でスクリーニングすることによって同定した。クローンλｗＣＢＦ１Ｂ６.３ は（破線で示す）キメラであるが、その５’末端はλｗＣＢＦ１１Ａ５.１との 重要な重複を含んでいる。翻訳イニシエーターを示す。翻訳ターミネーターを示 す。 図３Ａ−３Ｄは、ＢＲＣＡ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：１にも記載する ）を示す。 図４は、ＢＲＣＡ２遺伝子のゲノム体制を示す。エキソン（四角および／また は縦線）は、それらのサイズおよび間隔が比例するように、ゲノム配列（ftp:/ ／genome.wust1.edu/pub/gscl/brca;）（横線）を横切って分離されている。各 ゲノム配列の名称を図の左側に記載する。配列９２Ｍ１８.００５４１および９ ２Ｍ１８.０１２８９は実際に重複している。他のゲノム配列の間の距離はわか っていない。公共のデータベースにも本発明者らのデータベースにも、エキソン ２１と重複するゲノム配列は含まれていなかった。エキソン１、１１および２１ は番号付けられている。「＊」はこのスケールでは分割できないほど十分に近接し て位置する２個の隣接エキソンを示す。 図５Ａ−５Ｄは、一次乳癌のヘテロ接合性の喪失（loss ofheterozygosity） （ＬＯＨ）分析を示す。ＳＴＲマーカーの対立遺伝子はクロマトグラムの下側に 示す。示したのは、ＢＲＣＡ２における腫瘍へテロ接合型の１つの例（図５Ａお よび５Ｂ）と、ＢＲＣＡ２においてＬＯＨを有する腫瘍の１つの例である（図５ Ｃおよび５Ｄ）。蛍光単位が縦座標であり；塩基対におけるサイズが横座標であ る。 Ｎは正常についてであって（図５Ａおよび５Ｃ）、Ｔは腫瘍についてである（図 ５Ｂおよび５Ｄ）。発明の詳細な説明 本発明は一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細には、本発明は、そのうち の幾つかの対立遺伝子が癌、特に女性および男性における乳癌に対する感受性を 引起すヒト乳癌素因遺伝子（ＢＲＣＡ２）を単離し検出するために使用する方法 および材料に関する。より詳細には、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子における生殖 系突然変異、および乳癌への素因の診断におけるその使用に関する。さらに、本 発明は、ヒト乳癌におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト乳 癌の診断および予後におけるその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌 におけるＢＲＣＡ２遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌の診断および予後 におけるその使用に関する。また、本発明は、遺伝子治療、蛋白質置換療法およ び蛋白質ミメティクスを包含する、ＢＲＣＡ２中に突然変異を有するヒト癌の治 療に関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤のスクリーニングに関する。最 後に、本発明は、乳癌への素因を診断するのに有用である、突然変異についての ＢＲＣＡ２遺伝子のスクリーニングに関する。 本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子座または突然変異ＢＲＣＡ２遺伝子座の全体また は一部分、好ましくは少なくとも８塩基長であって約１００ｋｂ以下を含む単離 ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはアンチセンス・ポリヌ クレオチドであってもよい。本発明は、また、かかる単離ポリヌクレオチドを含 む組換え構築物、例えば形質転換宿主細胞における発現に適当な組換え構築物も 提供する。 また、被検体中のＢＲＣＡ２遺伝子座の一部分を含むポリヌクレオチドまたは その発現産物を検出する方法も提供する。さらに、かかる方法は、ＢＲＣＡ２遺 伝子座の部分を増幅する工程を含んでいてもよく、さらに、ＢＲＣＡ２遺伝子座 の該部分を増幅させるためのプライマーである一連のポリヌクレオチドを得る工 程を含んでいてもよい。該方法は、癌への素因の診断、または癌の診断もしくは 予後のいずれかに有用である。 また、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子座によってコードされている少なくとも５ 個のアミノ酸残基よりなる単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ま しくはモノクローナル抗体も提供する。 また、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子座の一部分を含むポリヌクレオチドを被検 体中で検出するキットも提供し、該キットは適当な容器中に密閉されたＢＲＣＡ ２遺伝子座の一部分に相補的なポリヌクレオチド、およびそれを使用するための 指示書を含む。 さらに、本発明は、ヌクレオチドを重合して、ＢＲＣＡ２遺伝子座の少なくと も８個のヌクレオチドよりなる配列を得ることからなるポリヌクレオチドの調製 法も提供し；該ポリヌクレオチドの調製法はアミノ酸を重合させて、ＢＲＣＡ２ 遺伝子座内にコードされている少なくとも５個のアミノ酸を含む配列を得ること からなる。 さらに、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子をスクリーニングして突然変異を同定 す る方法も提供する。さらに、かかる方法はＢＲＣＡ２遺伝子座の一部分を増幅さ せる工程を含んでいてもよく、さらに、ＢＲＣＡ２遺伝子座の該部分を増幅させ るためのプライマーである一連のポリヌクレオチドを得る工程を含んでいてもよ い。該方法は、癌への素因の診断または癌の診断もしくは予後のいずれかで使用 して突然変異を同定するのに有用である。 さらに、本発明は、予想されるＢＲＣＡ２突然変異対立遺伝子をスクリーニン グしてＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異を同定する方法も提供する。 加えて、本発明は、癌治療用の薬剤をスクリーニングして、ＢＲＣＡ２遺伝子 産物機能を回復させるのに適した薬剤を同定する方法を提供する。 最後に、本発明は、癌細胞に指向される遺伝子ベースの治療剤の生成に必要な 手段を提供する。この治療剤は、ＢＲＣＡ２蛋白質の機能が復元されるように、 適当なベクターに挿入するか、またはより直接的な方法で標的細胞にデリバリー されたＢＲＣＡ２遺伝子座の全体または一部分を含むポリヌクレオチドの形態を 採り得る。また、治療剤は、ＢＲＣＡ２の一部分または全体の蛋白質配列のいず れかに基くポリペプチドの形態をも採り得る。これらは、ＢＲＣＡ２の活性をイ ン・ビボ（in vivo）で機能的に置換えることができる。 個人を乳癌に罹りやすくするＢＲＣＡ２遺伝子座が、ＢＲＣＡ２蛋白質をコー ドしている遺伝子であることが本発明の発見である。本明細書中においてはこの 遺伝子をＢＲＣＡ２と称する。生殖系におけるＢＲＣＡ２遺伝子座中の突然変異 が男性および女性の双方における乳癌への素因を示唆することが本発明の発見で ある。最後に、ＢＲＣＡ２遺伝子座中の体細胞突然変異も乳癌および他の癌と関 連し、これらの癌の、またはこれらの癌の予後のインジケーターを示すことも本 発明の発見である。ＢＲＣＡ２遺伝子座の突然変異事象には、コーディング配列 および非-コーディング配列内の欠失、挿入および点突然変異が包含され得る。 約6,000,000塩基対と概算されるサイズを有するヒトゲノムの第１３染色体上 の領域から出発する、乳癌を含む癌に対して感受性を引起す遺伝子座ＢＲＣＡ２ を含む1,000,000〜1,500,000塩基の小さい方の領域を同定した。 ＢＲＣＡ２遺伝子座を含む領域は、種々の遺伝子技術を用いて同定した。最初 に遺伝子地図作成技術により、遺伝子マーカーとの組換えによってＢＲＣＡ２領 域を画定した。乳癌の複数ケースを有する大きく広がる家族（「家系(kindred)」 ）の調査に基いて、ＢＲＣＡ２遺伝子を含む染色体領域を正確に位置決定した。 ＢＲＣＡ２遺伝子座を含む領域は、マーカーＤ１３Ｓ２８９とＤ１３Ｓ２６７と によって物理的に制限される。 本発明により提供される遺伝子マーカーを使用することにより、ヒト酵母人工 染色体（ＹＡＣ）またはヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーからの領域 をカバーするクローンを同定することができた。また、それにより、この領域か らのより簡便に操作したＰ１およびＢＡＣクローンを同定および調製し、ならび にサブセットのクローンからの隣接を構築することもできた。これらのＰ１、Ｙ ＡＣおよびＢＡＣにより、ＢＲＣＡ２遺伝子座のクローニングの基礎が提供され 、例えば、乳癌および／または卵巣癌の診断および治療に有効な試薬を開発する ための基礎が提供される。ＢＲＣＡ２遺伝子および他の潜在的な感受性遺伝子が この領域から単離されている。該単離は、該領域中で、Ｐ１およびＢＡＣからの 全体または部分的ｃＤＮＡを用いた、ソフトウエア捕捉(software trapping）（ 隣接または非隣接のゲノムＤＮＡ配列からコーディングエキソンを含んでいそう な配列を同定するためのコンピュータ的方法）、ハイブリッド選抜技術および直 接スクリーニングを用いて行い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。 これらの方法を用いて、乳房および他の組織中で発現している遺伝子座の配列を 得た。これらの候補遺伝子座を分析して、癌感受性を付与する配列を同定した。 本発明者らは、ＢＲＣＡ２として知られている第１３染色体連鎖−癌感受性に寄 与する、家系におけるＢＲＣＡ２遺伝子座のコーディング配列中に突然変異が存 在することを発見した。本発明は、患者の生存に極めて重大なある種の癌の早期 の検出を促進するのみならず、個人が癌を発病する前に感受性個人を検出するこ ともできる。集団資源 大きなよく報告されているユタ州家系は、ヒト遺伝学研究の良好な資源を提供 する点で極めて重要である。各大家系は、独立して、その家族においてＢＲＣＡ ２感受性対立遺伝子が分離しているか否かを検出する能力を提供する。ＢＲＣＡ ２遺伝子座の位置決定および単離に有益な組換え体は、感受性対立遺伝子の存在 を確認するのに十分に大きな家系からのみ得ることができた。大きな同胞群は、 ＢＲＣＡ２感受性対立遺伝子の浸透度は、年齢および性別の双方によって減じら れて有益な同胞群を見出すのが困難となるため、乳癌を研究するために極めて重 要である。大きな同胞群は、死亡した個人に近い親族関係のハプロタイプからの 推論によって死亡した個人のハプロタイプを構築するのに必須である。 他の集団でも有益な情報を提供し得るが、かかる研究は一般的に非常に大きな 労力を要し、該家族は通常遥かに小さく、したがって有益性が低い。ユタ州の年 齢−調整乳癌発病率は２０％であって、これは平均合衆国比率よりも低い。ユタ 州におけるより低い発病率は、恐らく、ユタ州家系において見出されたケースが 遺伝的素因を運搬していることの確率を上昇させる、初回妊娠時の低年齢に大き く起因している。遺伝子地図作成 一連の有益な家族が得られれば、疾病を染色体の領域に連鎖させるのに遺伝子 マーカーが必須である。かかるマーカーには、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）（Bo tstein ら,1980）、ＶＮＴＲ（variable number of tandem repeats）を有する マーカー(Jeffreysら,1985；Nakamuraら,1987)、および短タンデムリピート（Ｓ ＴＲ）、特にCpAの反復（WeberおよびMay,1989；Littら,1989）に基づく多量ク ラスのＤＮＡ多形性が包含される。遺伝子地図を作成するためには、強力な遺伝 子マーカーを選択し、研究する家系のメンバーから抽出したＤＮＡを用いて該遺 伝子マーカーを試験する。 疾病と関連する遺伝子座を探索するのに有用な遺伝子マーカーは、特定の染色 体を密にカバーするか、または染色体の特定の領域を詳細に分析することにより 、アド・ホック（ad hoc）ベースで選抜し得る。疾病と連鎖する遺伝子マーカー を選抜するために好ましい方法には、家系の有益性の程度を評価して所定の程度 の 多形性の遺伝子マーカー間の理想距離を測定し、次いで最大効率につき理想的に 間隔の空いている知られている遺伝子地図からマーカーを選抜することが含まれ る。家系の有益性は、該マーカーが無関係な個人においてヘテロ接合性となる確 率によって測定する。ＰＣＲを用いた標的核酸配列の増幅によって検出されるＳ ＴＲマーカーを用いることも最も有効であり；かかるマーカーは非常に有益であ ってアッセイするのが容易であり（WeberおよびMay,198９）；多重ストラテジー を用いて同時にアッセイすることができ（SkolnickおよびWallace,1988）、必要 な実験回数を大幅に減少する。 連鎖が確立されれば、疾病遺伝子座にフランク（flank）するマーカー、すな わち該疾病遺伝子座に隣接する１または２以上のマーカーと、該疾病遺伝子座に 遠位の１または２以上のマーカーとを見出す必要がある。可能な場合には、知ら れている遺伝子地図から候補マーカーを選抜することができる。知られているも のがない場合には、実施例で示すごとき、ＳＴＲ技術によって新たなマーカーを 同定することができる。 遺伝子地図作成は、通常、反復プロセスである。本発明においては、ＢＲＣＡ ２遺伝子座周辺のフランクする遺伝子マーカーを画定にすることによって開始し 、次いで、これらのフランスするマーカーをＢＲＣＡ２遺伝子座に順次近い他の マーカーで置換える。最初の工程としては、大きく広がった家系によって明確に なった組換え事象が、特定の遺伝子マーカーに遠位かまたは隣接するかのいずれ かのＢＲＣＡ２遺伝子座を位置決定するのに特に助けとなる（Woosterら,1994） 。 本発明が開示されるまで、ＢＲＣＡ２を囲む領域はよく地図作成されておらず 、マーカーはほとんど存在しなかった。したがって、短反復配列は、コスミド、 Ｐ１、ＢＡＣおよびＹＡＣから開発し、物理的に地図作成し、新たな遺伝子マー カーを開発するために該領域を分析した。新たなＳＴＲは双方とも多形性であり 、ＢＲＣＡ２領域に地図作成されることが判明した。物理的地図作成 ３種の異なる方法を用いて該領域を物理的に地図作成した。第１のものは、Ｂ ＲＣＡ２領域をクローン化するための酵母人工染色体（ＹＡＣ）の使用である。 第２のものは、ＢＲＣＡ２遺伝子座を含む領域をカバーする一連のＰ１、ＢＡＣ およびコスミドクローンの創製であった。 酵母人工染色体（ＹＡＣ） ＢＲＣＡ２遺伝子座を含む十分に小さい領域を同 定したら、該領域をカバーする一連の重複するＹＡＣを同定することによって該 領域中のＤＮＡの物理的単離を進めた。有用なＹＡＣはSt.LouisおよびCEPH YAC ライブラリーのごとき知られているライブラリーから単離することができ、これ らは広く分布し、各々がほぼ50,000のＹＡＣを含む。単離したＹＡＣはこれらの 公共的にアクセス可能なライブラリーからのものであり、Michigan Genome Cent erを包含する多数の供給源から得ることができる。明らかに、これらのＹＡＣに アクセスしたものであれば、彼らはＢＲＣＡ２遺伝子座を含む最小領域の中にど のＹＡＣが存在し、どのＹＡＣがその外側に存在するのかが理解できないであろ うから、本発明の開示がなくては、本発明者らが選抜した特定のＹＡＣの価値を 理解しないであろう。 Ｐ１およびＢＡＣクローン 本発明においては、Ｐ１およびＢＡＣクローンを 得て、この領域をカバーすることによって進めるのが有利である。ＹＡＣインサ ートに比してより小さいサイズのこれらのインサートは、特異的なハイブリダイ ゼーション・プローブとしてそれらをより有用とする。さらに、酵母細胞中より も細菌細胞中にクローン化ＤＮＡを有することは、簡便性を大きく増大させ、そ れでもって目的のＤＮＡを操作することができ、ハイブリダイゼーション・アッ セイのシグナル−対−ノイズ比を改善することができる。 Ｐ１およびＢＡＣクローンは、本明細書中に記載するごとく単離したＹＡＣ、 Ｐ１およびＢＡＣ由来の特定の標識化部位（ＳＴＳ）を用いて全ヒトゲノムから 構築したライブラリーをスクリーニングすることによって得る。 これらのＰ１およびＢＡＣクローンは、散在性反復配列（ＩＲＳ）ＰＣＲおよ び／または制限酵素消化につづくゲル電気泳動および得られたＤＮＡフラグメン ト（「フィンガープリント」）の比較によって比較することができる（Maniatisら ,1982）。該クローンは、ＳＴＳの存在によっても特徴付けることができる。該 フィンガープリントを用いて、該領域をカバーするが過剰に余分ではない、重複 隣接セットのクローンを画定する。本明細書中においてはこれを「最小タイル路 （minimum tiling path）」という。かかる最小タイル路は、ＢＲＣＡ２遺伝 子座からの起源となり得るｃＤＮＡを同定する続く実験の基礎をなす。 Ｐ１クローン（Sternberg,1990；Sternberg ら,1990；Pierce ら,1992；Shizu yaら,1992）は、スクリーニング用に本発明者らによって提供されたＰＣＲプラ イマーを用いてGenome Sciences社によって単離された。ＢＡＣは、Mel Simon 博士の研究室のハイブリダイゼーション技術および本発明者らの研究室のＰＣＲ プールの分析によって得られた。Ｐ１およびＢＡＣクローンを用いるストラテジ ーにより、ＹＡＣ由来ではない独立セットのクローンを用いてゲノム領域のカバ ーも可能となった。このことは、ＹＡＣ中の欠失の可能性に対して保護される。 Ｐ１およびＢＡＣクローン由来のこれらの新たな配列は、以下に説明するごとく 、候補遺伝子についてさらにスクリーニングするための材料を提供する。遺伝子単離 単離しようとする遺伝子座のコーディング配列の候補となりそうな配列の存在 についてゲノムクローンを試験するための多種の技術が存在し、それには限定さ れるものではないが、（ａ）ゾー・ブロット（zoo blot）、（ｂ）ＨＴＦ島を 同定すること、（ｃ）エキソン・トラッピング、（ｄ）ｃＤＮＡをＰ１、ＢＡＣ 、またはＹＡＣにハイブリダイズさせること、および（ｅ）ｃＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングすることが含まれる。 （ａ）ゾー・ブロット 第１の技術は、サザンブロットにコスミドをハイブリ ダイズさせて、進化的に保存され、したがって（サル、雌ウシ、ニワトリ、ブタ 、マウスおよびラットのごとき）ヒトに対して変化する程度の近縁関係の種から のＤＮＡと陽性ハイブリダイゼーションシグナルを供するＤＮＡ配列を同定する ことである。種々の種からのかかるＤＮＡを含むサザン・ブロットは市販されて いる（Clonetech社，カタログ番号7753-1)。 （ｂ）ＨＦＴ島を同定すること 第２の技術には、しばしばコーディング領域 の付近またはその中に発生するヌクレオチドＣおよびＧがリッチな領域を見出す ことが含まれる。かかる配列は、ＣｐＧダイマーを含む部位に特異的な制限酵素 がこれらの領域中を頻繁に切断するため、ＨＦＴ（Hpal小フラグメント、Hpal ti nyfragment）またはＣｐＧ島と称されている（Lindsay ら,1987）。 （ｃ）エキソン・トラッピング 第３の技術はエキソン・トラッピングであり 、この方法はスプライシング接合部を含み、したがって遺伝子のコーディング領 域を含んでいそうなゲノムＤＮＡ中の配列を同定する。エキソン増幅（Buckler ら,1991）を用いて前記のＤＮＡクローンからエキソンを選抜し、増幅する。エ キソン増幅は、機能的な５’および／または３’スプライシング部位によって挟 まれているＲＮＡ配列の選抜に基いている。該エキソン増幅の産物を用いて乳房 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、さらなる研究のために管理可能な 数の候補遺伝子を同定する。エキソン・トラッピングは、コンピュータプログラ ムを用いるか、またはソフトウエア・トラッピングによって配列決定したＤＮＡ の小セグメント上で行うこともできる。 （ｄ）ｃＤＮＡをＰ１、ＢＡＣまたはＹＡＣにハイブリダイズさせること 第 ４の技術は、コスミド、Ｐ１、ＢＡＣまたはＹＡＣに対するｃＤＮＡのハイブリ ダイゼーションを利用し、クローン化したゲノムＤＮＡ中に同定すべき、および それから回収すべき配列を転写させることができる選択的豊富化技術の修飾形で ある（Kandpal ら,1990）。本発明の目的のために変形した該選択的豊富化技術 には、ＹＡＣ中に存在するＢＲＣＡ２の領域からのＤＮＡをカラムマトリックス に結合させ、該結合したＤＮＡとハイブリダイズする適当なライブラリーからｃ ＤＮＡを選抜し、つづいて結合したＤＮＡを増幅し精製して、その結果クローン 化ゲノムＤＮＡによって示される領域中のｃＤＮＡを大きく豊富化させることが 含まれる。 （ｅ）ｃＤＮＡの同定 第５の技術は、ＢＲＣＡ２遺伝子座に相当するｃＤＮ Ａを同定することである。前記技術のいずれかを用いて選抜した推定コーディン グ配列を含むハイブリダイゼーション・プローブを用いて、乳房組織ｃＤＮＡラ イブラリーおよびいずれかの他の必要なライブラリーを包含する種々のライブラ リーを選抜する。 ｃＤＮＡの直接選抜の趣旨の他の変形を用いても、ＢＲＣＡ２の候補遺伝子を 見出すことができる（Lovettら,1991；Futreal,1993）。この方法はコスミド、 Ｐ１、またはＢＡＣのＤＮＡをプローブとして用いる。該プローブＤＮＡをHaeI IIのごとき平滑切断制限酵素で消化する。ついで、該ＤＮＡに二本鎖アダプター を連結させ、ビオチン標識プライマーを用いるつづくＰＣＲ増幅反応におけるプ ライマーの結合部位を供する。標的ｃＤＮＡは、ランダムプライムまたはオリゴ （ｄＴ）プライムしたいずれかの第１鎖につづいて第２鎖を合成することによっ て、例えば乳房組織のような組織試料由来のｍＲＮＡから作製する。ｃＤＮＡ末 端を平滑化し、二本鎖アダプターに連結する。このアダプターは、ＰＣＲ用の増 幅部位として供される。該標的およびプローブ配列を変性させ、ヒトＣ0ｔ−１ ＤＮＡと混合して反復配列をブロックする。溶液ハイブリダイゼーションを行 ってＣ0ｔ−１／２値を高くし、稀な標的ｃＤＮＡ分子のハイブリダイゼーショ ンを確実なものとする。ついで、アニールした材料をアビジンビーズ上に捕捉し 、高ストリンジェンシーで洗浄し、保持されたｃＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによっ て増幅する。選抜したｃＤＮＡは、分析用のプラスミドベクターにクローニング する前に、さらなるラウンドの豊富化に付す。 候補性についてのｃＤＮＡの試験 ｃＤＮＡがＢＲＣＡ２遺伝子座であることの証拠は、異常なＢＲＣＡ２遺伝子 産物または異常なレベルのＢＲＣＡ２遺伝子産物を生成する影響する家系メンバ ーから抽出したＤＮＡ中に配列を見出すことによって得られる。かかるＢＲＣＡ ２感受性対立遺伝子は、大きな家系における疾病と共分離（co-segregate）する であろう。また、それは、乳癌を有する非家系個人に、ついで一般集団中の個人 に、遥かに高頻度に存在するであろう。最後に、腫瘍は、しばしば、生殖系中で 突然変異した他の例にもある遺伝子座中で体細胞突然変異するため、本発明者ら は、腫瘍組織から抽出されたＤＮＡ中のＢＲＣＡ２感受性対立遺伝子と同一また はそれに類似する配列中に突然変異した正常生殖系ＢＲＣＡ２対立遺伝子が見 出されると予想した。腫瘍組織からのＢＲＣＡ２配列と同一個人の生殖系からの ＢＲＣＡ２対立遺伝子を比較するか、あるいは、癌ケースからの生殖系ＢＲＣＡ ２対立遺伝子と非影響の個人からのものを比較するかは、遺伝子産物の正常機能 に明らかな崩壊を引起すに十分に重大である突然変異を見出すことが鍵である。 これらの突然変異は多数の形態を採り得る。最も重い形態は、異常蛋白質をコー ドする遺伝子を引起すか、または蛋白質発現を大きく変化させるであろうフレー ムシフト突然変異または大きな欠失であろう。あまり重くない崩壊性突然変異に は、産生される蛋白質に重大な影響を及ぼすであろう、システイン残基へのまた はそれからの変化、塩基性から酸性アミノ酸へのまたはその反対の変化、疎水性 から親水性アミノ酸へのまたはその反対の変化、あるいは二次、三次または四次 蛋白質構造に影響するであろう他の突然変異のごとき、小さな読み枠内欠失およ び非同類塩基対置換が含まれるであろう。サイレント突然変異または同類アミノ 酸置換を生じるものは、一般的に蛋白質機能を崩壊するとは予想されないであろ う。 本発明の診断および予後方法により、野生型ＢＲＣＡ２遺伝子座の変化が検出 される。加えて、該方法は、野生型ＢＲＣＡ２遺伝子座を検出し、該ＢＲＣＡ２ 遺伝子座における癌への素因の欠損を確認することによって行うことができる。 「野生型遺伝子の変化」には、コーディングおよび非コーディング領域中の欠失 、挿入、および点突然変異を含む全ての形態の突然変異が包含される。欠失は遺 伝子全体のものでも遺伝子の一部分のみのものであってもよい。点突然変異は終 止コドン、フレームシフト突然変異またはアミノ酸置換を生じ得る。体細胞突然 変異はある種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じるものであり、生殖系中に遺伝 されない。生殖系突然変異はいかなる身体の組織においても見出すことができ、 遺伝される。単一の対立遺伝子のみが体細胞突然変異している場合には、初期新 生生物状態が示される。しかしながら、両方の対立遺伝子が体細胞突然変異して いる場合には、後期新生生物が示される。したがって、ＢＲＣＡ２突然変異の発 見により、診断および予後の双方の情報が提供される。（例えば、ＢＲＣＡ２欠 失を運搬している染色体の姉妹染色体上に見出されるような）欠失していないＢ ＲＣ Ａ２対立遺伝子は、挿入、小さな欠失および点突然変異のごとき他の突然変異に ついてスクリーニングすることができる。腫瘍組織中に見出される多くの突然変 異はＢＲＣＡ２遺伝予産物の発現の低下に通じるものであろうと考えられている 。しかしながら、非機能性遺伝子産物に通じる突然変異も癌状態に通じるであろ う。点突然変異事象は、ｍＲＮＡの発現の欠損または遺伝子のプロモーター中の ごとき調節領域中に生じ得る。点突然変異は、適切なＲＮＡプロセッシングも廃 止し得、これはＢＲＣＡ２遺伝子産物の発現の欠損またはｍＲＮＡ安定性または 翻訳効率における低下に通じる。 有用な診断技術には、限定されるものではないが、後に詳細に論じるような、 蛍光イン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接Ｄ ＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖立体構造分析（ＳＳ ＣＡ）、ＲＮエース保護アッセ対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ） 、ドットブロット分析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰが含まれる。 乳癌および本明細書で同定した他の癌のごとき癌への素因は、ＢＲＣＡ２遺伝 子の突然変異についていずれかのヒト組織を試験することによって確かめること ができる。例えば、生殖系ＢＲＣＡ２突然変異を遺伝しているヒトは癌を発病し がちであろう。このことは、該ヒトの身体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験 することによって判定することができる。最も単純には、採血し、血液細胞から ＤＮＡを抽出することができる。加えて、胎児期診断は、ＢＲＣＡ２遺伝子の突 然変異について、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を試験することによって行 うことができる。例えば、点突然変異によるか欠失によるかにかかわらず、野生 型ＢＲＣＡ２対立遺伝子の変化は、本明細書中にて論じるいずれの手段によって も検出することができる。 ＤＮＡ配列変異型を検出するために用いることができる幾つかの方法が存在す る。手動配列決定または自動化蛍光配列決定のいずれかの直接ＤＮＡ配列決定は 、配列変異型を検出することができる。ＢＲＣＡ２ほど大きな遺伝子については 、手動配列決定は非常に労働集約的であるが、最適条件下においては、遺伝子の コーディング配列中の突然変異をめったに見逃さない。もう１つのアプローチは 、一 本鎖立体構造多形アッセイ（ＳＳＣＡ）である（Orita ら,1989）。この方法は 、特にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐよりも大きな場合には全ての配列 変化を検出することはできないが、最適化して大部分のＤＮＡ配列変異型を検出 することができる。低下した検出感度は不利であるが、ＳＳＣＡを用いて処理量 を増加することができるため、魅力的であり、研究ベースにおける突然変異検出 の直接配列決定の別法を実行可能としている。ついで、ＳＳＣＡゲル上でシフト した移動度を有するフラグメントを配列決定して、ＤＮＡ配列変動の正確な性質 を判定する。２種の相補的ＤＮＡ鎖間の誤対合の検出に基く他のアプローチには 、クランプ（clamped）変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）（Sheffield ら,1991)、 ヘテロデュプレックス分析（ＨＡ）（White ら,1992）および化学的誤対合切断 （ＣＭＣ）（Grompeら,1989）が包含される。上記した方法ではいずれも大きな 欠失、重複または挿入は検出されず、また転写もしくは蛋白質の翻訳に影響する 調節突然変異も検出されないであろう。蛋白質切頭アッセイまたは非対照アッセ イのごときクラスの突然変異を検出できるであろう他の方法は、特定のタイプの 突然変異のみしか検出せず、ミスセンス突然変異は検出されないであろう。ＤＮ Ａ配列変異型を検出する最新の利用可能な方法の概説は、Grompe（1993）による 最近の概説に見出すことができる。突然変異が判明したら、対立遺伝子特異的オ リゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子特異的 な検出アプローチを利用して、その同一の突然変異について多数の他の試料を迅 速にスクリーニングすることができる。 組織における野生型ＢＲＣＡ２遺伝子の変化を検出するためには、周辺の正常 組織を含まない組織を単離することが助けとなる。腫瘍細胞の組織調製物を豊富 化する方法は当該技術分野で知られている。例えば、該組織はパラフィンまたは クライオスタット切片から単離することができる。癌細胞はフローサイトメトリ ーによっても正常細胞から分離することができる。これらの技術ならびに正常細 胞から腫瘍細胞を分離する他の技術は当該技術分野で知られている。腫瘍組織が 正常細胞で非常に汚染されている場合には、突然変異の検出はより困難となる。 １または２種以上の制限酵素、好ましくは多種の制限酵素で切断したＤＮＡの 一連のサザンブロットを見ることにより、ＤＮＡ配列中の多形性を検出する迅速 な予備分析を行うことができる。各ブロットは一連の正常個人および一連の癌ケ ース、腫瘍、またはその双方を含んでいる。（ＢＲＣＡ２遺伝子座付近またはそ れを含む配列でプローブ（probe）した場合に対照ＤＮＡとは長さが異なる）ハ イブリダイズしたフラグメントを示すサザンブロットは、可能性のある突然変異 を示している。非常に大きな制限フラグメントを生成する制限酵素を用いる場合 には、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いる。 点突然変異の検出は、ＢＲＣＡ２対立遺伝子（群）の分子クローニングおよび 当該技術分野でよく知られている技術を用いて該対立遺伝子（群）を配列決定す ることによってなし得る。別法として、該遺伝子配列は、知られている技術を用 いて、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接増幅することができる。つい で、増幅した配列のＤＮＡ配列を決定することができる。 感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全ではあるがなお間接的な試 験のための６種のよく知られた方法が存在する：１）一本鎖形成立体構造分析（ ＳＳＣＡ）（0rita ら,1989）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ ）（Wartell ら,1990；Sheffield ら,1989)；３）ＲＮエース保護アッセイ（Fin kelsteinら,1990;Kinszlerら,1991）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ ド（ＡＳＯ）（Conner ら,1983)；５）エシェリキア・コリ（E.coli） mutＳ蛋 白質のごときヌクレオチド誤対合を認識する蛋白質の使用（Modrich,1991）；お よび６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（RanoおよびKidd,1989）。対立遺伝子特異的 ＰＣＲについては、特定のＢＲＣＡ２突然変異に当該プライマーの３’末端でハ イブリダイズするプライマーを用いる。特定のＢＲＣＡ２突然変異が存在しない 場合には、増幅産物は認められない。増幅不応性突然変異系（AmplificationRef ractory Mutation System）（ＡＲＭＳ）も、欧州特許出願公開番号0332435号お よびNowtonら,1989に開示されているのと同様にして用いることができる。 遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出 することができる。加えて、遺伝子または囲むマーカー遺伝子についての制限断 片長多形（ＲＦＬＰ）を用いて、対立遺伝子の変化または多形フラグメント中の 挿入を記録することができる。かかる方法は、影響する個人に見出されたＢＲＣ Ａ２突然変異の存在についてその個人の親族をスクリーニングするのに特に有用 である。当該技術分野で知られているごとき挿入および欠失を検出するための他 の技術も用いることができる。 最初の３種の方法（ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＮエース保護アッセイ）にお いて、新たな電気泳動バンドが現れる。配列変化が一本鎖の、分子内塩基対形成 における相異を生じるため、ＳＳＣＡは異なって移動するバンドを検出する。Ｒ Ｎエース保護には、突然変異ポリヌクレオチドの１または２以上のより小さなフ ラグメントへの切断が含まれる。ＤＧＧＥは、変性勾配ゲルを用いて、野生型配 列と比較した突然変異配列の移動速度における相異を検出する。対立遺伝子特異 的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては、オリゴヌクレオチドは特定の配列を 検出するように設計され、ハイブリダイゼーション・シグナルの存在または不存 在を検出することによってアッセイを行う。mutＳアッセイにおいては、突然変 異と野生型配列との間のヘテロデュプレックス中のヌクレオチド誤対合を含む配 列にのみ蛋白質が結合する。 本発明による誤対合とは、その中の２本の鎖が１００％相補的ではないハイブ リダイズした核酸デュプレックスである。合計相同性の欠損は、欠失、挿入、転 位または置換によることがあり得る。誤対合検出を用いて遺伝子中の、またはそ のｍＲＮＡ生成物中の点突然変異を検出することができる。これらの技術は配列 決定よりも感度が低いが、これらは多数の腫瘍試料で行うにはより単純である。 誤対合切断技術の一例はＲＮエース保護法である。本発明の実施においては、該 方法は、ヒト野生型ＢＲＣＡ２遺伝子コーディング配列に相補的である標識リボ プローブの使用が含まれる。該リボプローブと腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡ またはＤＮＡのいずれかとを一緒にアニール（ハイブリダイズ）させ、つづいて デュプレックスＲＮＡ構造中の幾つかの誤対合を検出することができる酵素ＲＮ アシンＡで消化する。ＲＮアシンＡによって誤対合が検出された場合には、それ が誤対合の部位を切断する。したがって、アニールしたＲＮＡ調製物を電気泳動 ゲルマトリックス上で分離する場合に、誤対合が検出され、ＲＮアシンＡによっ て切断されれば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての完全長デ ュプレックスＲＮＡよりもより小さなＲＮＡ生成物が認められるであろう。該リ ボプローブはＢＲＣＡ２のｍＲＮＡまたは遺伝子の完全長である必要はないが、 いずれかのセグメントとすることができる。リボプローブがＢＲＣＡ２のｍＲＮ Ａまたは遺伝子のみを含む場合には、多数のこれらプローブを用いて誤対合につ いて全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングするのが望ましい。 同様にして、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的または化学的切断を介して誤対 合を検出することができる。例えば、cotton ら,198８；Shenk ら,1975；Novack ら，1986を参照されたし。別法として、対合デュプレックスに対する誤対合形成 デュプレックスの電気泳動移動度におけるシフトによって誤対合を検出すること もできる。例えば、Cariello，1988を参照されたし。リボプローブまたはＤＮＡ プローブのいずれかを用いれば、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲ（後記を 参照されたし）を用いて突然変異を含み得る細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡを増幅す ることができる。特に変化が欠失および挿入のごとき著しい転位である場合には 、サザンハイブリダイゼーションを用いてもＢＲＣＡ２のＤＮＡ中の変化を検出 することができる。 ＰＣＲの使用によって増幅したＢＲＣＡ２遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子 特異的プローブを用いてもスクリーニングすることができる。このプローブは核 酸オリゴマーであって、その各々は、知られている突然変異を載せているＢＲＣ Ａ２遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１つのオリゴマーは、ＢＲＣＡ２ 遺伝子配列の一部分に相当する約３０ヌクレオチド長とすることができる。かか る一群の対立遺伝子特異的プローブの使用により、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニ ングして、ＢＲＣＡ２遺伝子中の以前に同定された突然変異の存在を同定するこ とができる。対立遺伝子特異的プローブと増幅したＢＲＣＡ２配列とのハイブリ ダイゼーションは、例えばナイロンフィルター上で行うことができる。ストリン ジェントなハイブリダイゼーション条件下における特定のプローブへのハイブリ ダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブ中の突然変異と同一の突然変異が 腫瘍組織中に存在することを示している。 候補遺伝子座中の突然変異についての最も決定的な試験は、癌患者からのゲノ ムＢＲＣＡ２配列と対照集団からのものとを直接比較することである。別法とし て、例えばＰＣＲによって増幅した後のメッセンジャーＲＮＡを配列決定するこ とができ、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要を省略するこ とができる。 ＢＲＣＡ２のコーディング領域の外側に入る癌患者からの突然変異は、ＢＲＣ Ａ２遺伝子付近またはその中にあるイントロンまたは調節領域のごとき非コーデ ィング領域を検査することによって検出することができる。非コーディング領域 中の突然変異が重要であるという早期の示唆は、対照個人に比しての癌患者にお ける異常なサイズまたは豊富性のメッセンジャーＲＮＡ分子を出現させるノザン ブロット実験から生じ得る。 ＢＲＣＡ２のｍＲＮＡ発現の変化は、当該技術分野で知られているいずれかの 技術によって検出することができる。これらには、ノザンブロット分析、ＰＣＲ 増幅およびＲＮエース保護が包含される。低下したｍＲＮＡ発現は、野生型ＢＲ ＣＡ２遺伝子の変化を示している。野生型ＢＲＣＡ２の変化は、野生型ＢＲＣＡ ２蛋白質の変化についてのスクリーニングによっても検出することができる。例 えば、ＢＲＣＡ２と免疫反応性であるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリ ーニングすることができる。同族抗原の欠如はＢＲＣＡ２突然変異を示している であろう。突然変異対立遺伝子の産物に対して特異的な抗体を用いても、突然変 異ＢＲＣＡ２遺伝子産物を検出することができる。かかる免疫学的アッセイは、 当該技術分野で知られているいずれの簡便な様式でも行うことができる。これら には、ウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセ イが包含される。変化したＢＲＣＡ２蛋白質を検出するためのいずれの手段を用 いても、野生型ＢＲＣＡ２遺伝子の変化を検出することができる。蛋白質結合性 決定のごとき機能アッセイを用いることができる。加えて、ＢＲＣＡ２生化学的 機能を検出するアッセイを用いることができる。突然変異ＢＲＣＡ２遺伝子産物 が見出されることは、野生型ＢＲＣＡ２遺伝子の変化を示している。 突然変異ＢＲＣＡ２の遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液の ごとき他のヒト身体試料中においても検出することができる。突然変異ＢＲＣＡ ２の遺伝子または遺伝子産物の検出について前記に論じたのと同一の技術は、他 の身体試料に適用することができる。癌細胞は腫瘍から剥がれ落ち、かかる身体 試料中に現れる。加えて、ＢＲＣＡ２遺伝子産物自体は細胞外空間に分泌され得 、癌細胞が存在しない場合でさえこれらの身体試料中に見出され得る。かかる身 体試料をスクリーニングすることによって、多くのタイプの癌について単純な早 期診断を達成することができる。加えて、突然変異ＢＲＣＡ２の遺伝子または遺 伝子産物についてかかる身体試料を試験することによって、化学療法または放射 線療法の進行をより簡便にモニターすることができる。 本発明の診断方法は、その中でＢＲＣＡ２が腫瘍発生に役割を有するいずれの 腫瘍にも適用することができる。本発明の診断方法は、臨床医が治療の適当な工 程を決定できるため彼らに有用である。 本発明のプライマーの対は、ＰＣＲを用いた特定のＢＲＣＡ２対立遺伝子のヌ クレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、ＢＲＣＡ ２遺伝子自体の増幅するＤＮＡ合成をプライムさせるために、第１３染色体上の ＢＲＣＡ２遺伝子の中またはその周辺の配列にアニーリングさせることができる 。 これらの完全セットのプライマーにより、ＢＲＣＡ２遺伝子コーディング配列の 全ヌクレオチド、すなわちエキソンの合成が可能となる。一連のプライマーによ り、好ましくは、イントロンおよびエキソン配列の双方の合成が可能となる。対 立遺伝子特異的プライマーも用いることができる。かかるプライマーは特定のＢ ＲＣＡ２突然変異対立遺伝子にのみアニールし、したがって、鋳型としての突然 変異対立遺伝子存在下においてのみ産物を増幅するであろう。 増幅した配列のつづくクローニングを促進するために、プライマーは、その５ ’末端に付加された制限酵素部位配列を有していてもよい。かくして、プライマ ーの全ヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するために必要な幾つかのヌクレオ チドを除き、ＢＲＣＡ２配列またはＢＲＣＡ２に近接する配列由来である。かか る酵素および部位は当該技術分野でよく知られている。プライマー自体は、当該 技術分野でよく知られている技術を用いて合成することができる。一般的に、市 販 されているオリゴヌクレオチド合成器を用いてプライマーを作製することができ る。配列番号：１および図３に示すＢＲＣＡ２オープンリーディングフレームの 配列、特定のプライマーの設計は、以下に開示するものに加えて、当業者の能力 の十分に範囲内である。 本発明により提供される核酸プローブは、多種の目的に有用である。それは、 前記にすでに論じた点突然変異を検出するためのゲノムＤＮＡに対するサザン・ ハイブリダイゼーションおよびＲＮエース保護法に用いることができる。このプ ローブを用いてＰＣＲ増幅産物を検出することができる。それは他の技術と共に 用いて、ＢＲＣＡ２遺伝子またはｍＲＮＡの誤対合を検出することもできる。 野生型ＢＲＣＡ２遺伝子を有する個人はＢＲＣＡ２対立遺伝子から生じる癌を 有していないことが発見された。しかしながら、ＢＲＣＡ２蛋白質の機能を妨害 する突然変異は癌の病理に関与する。したがって、機能を欠損したか、または変 化した機能を有する蛋白質を産生する変化した（または突然変異した）ＢＲＣＡ ２遺伝子の存在は、癌の危険性の増大と直接的に相関する。ＢＲＣＡ２遺伝子突 然変異を検出するために、生物試料を調製し、分析するＢＲＣＡ２対立遺伝子の 配列と野生型ＢＲＣＡ２対立遺伝子の配列との間の相異について分析する。突然 変異ＢＲＣＡ２対立遺伝子は、前記したいずれの技術によっても最初に同定する ことができる。ついで、突然変異対立遺伝子を配列決定して、特定の突然変異対 立遺伝子の特異的突然変異を同定する。別法として、突然変異ＢＲＣＡ２対立遺 伝子は、慣用技術を用いて、突然変異（変化した）ＢＲＣＡ２蛋白質を同定する ことによって最初に同定することができる。ついで、突然変異対立遺伝子を配列 決定して各対立遺伝子についての特異的突然変異を同定する。ついで、突然変異 、特に変化した機能のＢＲＣＡ２蛋白質に通じる突然変異を、本発明の診断およ び予後方法に用いる。定義 本発明は以下の定義を用いる： 「ポリヌクレオチドの増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結増幅 （ま たはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱβレプリカーゼの使用に基く増幅方法 のごとき方法を用いる。これらの方法はよく知られており、当該分野において広 く実施されている。例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号ならび に(ＰＣＲについては)Innisら,1990；ならびに(ＬＣＲについては)Wuら,1989aを 参照されたし。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウエアは市販されている。 ＢＲＣＡ２領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、Ｂ ＲＣＡ２領域中の配列またはその中の標的領域を挟む領域中の配列に相補的であ ってそれに特異的にハイブリダイズする。増幅によって作製したＢＲＣＡ２配列 は直接的に配列決定することができる。別法として、あまり望ましくはないが、 増幅した配列（群）は配列分析する前にクローン化することもできる。酵素増幅 したゲノムセグメントの直接クローニングおよび配列分析の方法は、Scharf,198 6によって記載されている。 「被検体ポリヌクレオチド」および「被検体鎖」とは、標的配列を含むと予想 される一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドをいい、それは生物試料を含む種々 のタイプの試料中に存在し得る。 「抗体」 本発明は、ＢＲＣＡ２ポリペプチドおよびそのフラグメント、ある いはＢＲＣＡ２領域、特にＢＲＣＡ２遺伝子座またはその一部分からのポリヌク レオチド配列に特異的に結合することができる、ポリクローナルおよび／または モノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、ならびにそれらの免疫結合性 の相当物も提供する。「抗体」なる語は、均一な分子、または複数の異なる分子 より構成される血清産物のごとき混合物の双方をいうのに用いる。ポリペプチド はぺプチド合成器中で合成的に調製し、（例えば、鍵穴吸着性へモシアニンのよ うな）キャリアー蛋白質に結合させ、数ヶ月にわたってウサギに注射することが できる。ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性につい て、ウサギ血清を試験する。モノクローナル抗体は、マウスに蛋白質ポリペプチ ド、融合蛋白質またはそれらのフラグメントを注射することによって生成するこ とができる。モノクローナル抗体はＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＢＲ ＣＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントとの特異的免疫反応性について試験 する。 HarlowおよびLane,1988を参照されたし。これらの抗体は、アッセイならびに医 薬に有用であろう。 十分な量の目的のポリペプチドを得たら、種々の目的にそれを用いることがで きる。典型的な用途は、結合性につき特異的な抗体の生成である。これらの抗体 は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであってもよく、当該技術分 野でよく知られているイン・ビトロ（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo ）の技術によって生成することができる。ポリクローナル抗体の生成については 、適当な標的免疫系、典型的にはマウスまたはウサギを選抜する。実質的に精製 された抗原を、その動物について適当な方法によるか、または免疫学者によく知 られている他のパラメーターによって決定した様式で免疫系に提示する。注射の 適当な部位は、フットパッド、筋肉内、腹膜内、または皮内である。勿論、他の 種をマウスおよびウサギに代用することができる。ついで、目的の特異性に調整 した当該技術分野で知られている技術を用いてポリクローナル抗体を精製する。 免疫学的応答性は、通常、イムノアッセイでアッセイする。通常、かかるイム ノアッセイには、抗原の供給源、例えば、抗原と同一の細胞により同一の様式で 生成した抗原の供給源の幾分かの精製が含まれる。種々のイムノアッセイ法が当 該技術分野でよく知られている。例えば、HarlowおよびLane,1988またはGoding, 1986を参照されたし。 １０-8Ｍ-1または好ましくは１０-9〜１０-10Ｍ-1またはより強力な親和性を 有するモノクローナル抗体は、典型的には、例えばHarlowおよびLane,1988また はGoding,1986に記載されている標準的な手法によって生成されるであろう。 簡単には、適当な動物を選抜し、目的の免疫化プロトコールに準じる。適当な時 間の後に、かかる動物の脾臓を切除し、適当な選抜条件下にて、固定化ミエロー マ細胞に個々の脾臓細胞を融合させる。その後、細胞をクローン的に分離し、各 クローンの上清を、抗原の目的領域に特異的な適当な抗体のその産生について試 験する。 他の適当な技術には、抗原性ポリペプチドに対する、または別法として、ファ ージまたは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選抜に対するリンパ球のイ ン・ビトロでの曝露が含まれる。Huseら，1989を参照されたし。本発明のポリペ プチドペプチドまたは抗体は、修飾してか、または修飾なしに用いることができ る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを供する物質に 共有的かまたは非共有的かのいずれかで連結させることによって標識されよう。 広範な種々の標識およびコンジュゲート技術が知られており、科学および特許文 献の双方において広く報告されている。適当な標識には、放射性核種、酵素、基 質、補因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが含まれる。か かる標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号； 第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号および第4,366, 241号が包含される。また、組換え免疫グロブリンを作製することもできる（米 国特許第4,816,567号を参照されたし）。 「結合パートナー」とは、例えば抗原と抗原特異的抗体または酵素とそのイン ヒビターのごとき、高い特異性でリガンド分子に結合することができる分子をい う。一般的に、該特異的結合パートナーは、単離条件下にて、十分な親和性で結 合して、（ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションの場合においては）被検 体コピー／相補鎖デュプレックスを固定化しなければならない。特異的結合パー トナーは当該技術分野で知られており、例えば、ビオチンおよびアビジンまたは ストレプトアビジン、ＩｇＧおよび蛋白質Ａ、膨大な、知られている受容体−リ ガンド・カップル、ならびに相補的ポリヌクレオチド鎖が含まれる。相補的なポ リヌクレオチド結合パートナーの場合には、該パートナーは通常少なくとも約１ ５塩基長であり、少なくとも４０塩基長とすることができる。該ポリヌクレオチ ドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチド・アナログよりなっていてもよい 。 「生物試料」とは、個人からの被検体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを 含有すると予想される組織または流体の試料をいい、限定されるものではないが 、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸、腸、および尿 生殖器管、涙、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織、ならびにイン・ビトロ細胞 培養構成物の試料が包含される。 本明細書中で用い、新生生物の文脈で用いる「診断する」または「予後する」 なる語は、１）新生生物としての病変の分類、２）新生生物の重度の判定、また は３）治療の前、間および後の疾病進行のモニターを示すために用いる。 「コードする」 ポリヌクレオチドは、その天然状態または当業者によく知ら れている方法によって操作した場合にはポリペプチドを「コードする」といい、 それは転写および／または翻訳されて、ｍＲＮＡおよび／もしくはポリペプチド またはそのフラグメントを生成し得る。アンチセンス鎖はかかる核酸の相補体で あり、コードする配列はそれから推定することができる。 「単離（した）」または「実質的に純粋な」 「単離（した）」または「実質 的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー）とは、天然 のヒト配列または蛋白質、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒト のゲノム配列および蛋白質を自然に付随する他の細胞コンポーネントから実質的 に分離されているものである。該用語は、その自然発生環境から取り出された核 酸配列または蛋白質を包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離体および化学 合成アナログ、ならびに外来系によって生物的に合成したアナログが包含される 。 「ＢＲＣＡ２対立遺伝子」とは、ＢＲＣＡ２遺伝子座の正常対立遺伝子、なら びに、例えば乳、卵巣および胃癌を含む多くの部位に癌を発病させる素因を個人 につくる変異型を運搬している対立遺伝子をいう。かかる素因対立遺伝子は「Ｂ ＲＣＡ２感受性対立遺伝子」とも称する。 「ＢＲＣＡ２遺伝子座」、「ＢＲＣＡ２遺伝子」、「ＢＲＣＡ２核酸」または 「ＢＲＣＡ２ポリヌクレオチド」とは、各々、その全てがＢＲＣＡ２領域中に存 在するポリヌクレオチドをいい、それらは正常組織中で発現しているようであり 、そのうちのある種の対立遺伝子が個人に乳、卵巣および胃癌を発病させる素因 をつくる。ＢＲＣＡ２遺伝子座における突然変異は、他のタイプの腫瘍のイニシ エーションおよび／またはプログレッションに関与し得る。該遺伝子座は、一部 分、個人に癌を発病させる素因をつくる突然変異によって示される。これらの突 然変異は、下記のＢＲＣＡ２領域内に入る。ＢＲＣＡ２遺伝子座には、コーディ ング配列、介在配列、ならびに転写および／または翻訳を制御する調節エレメン トが含まれることを意図する。ＢＲＣＡ２遺伝子座には、ＤＮＡ配列の全ての対 立遺 伝子変異型が含まれることを意図する。 核酸に適用する場合のこれらの用語は、例えば、蛋白質の融合および欠失を含 む、ＢＲＣＡ２ポリペプチド、フラグメント、相同形または変異型をコードする 核酸をいう。本発明の核酸は、天然ＢＲＣＡ２をコードする遺伝子または該天然 ＢＲＣＡ２をコードする遺伝子もしくはその一部分と実質的な相同性を有する遺 伝子由来であるか、またはそれらに実質的に類似するかのいずれかである配列を 有するであろう。ＢＲＣＡ２ポリペプチドのコーディング配列を、配列番号：２ に示すアミノ酸配列と一緒に配列番号：１および図３に示す。 本発明のポリヌクレオチド組成物には、センスおよびアンチセンス鎖の双方の 、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマーが包含され 、当業者によって容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されて いてもよく、または非天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。 かかる修飾には、例えば、標識、メチル化、アナログでの天然発生ヌクレオチド の１または２箇所以上の置換、非荷電結合（例えば、メチル ホスホネート、ホ スホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート他）、荷電結合（例えば、 ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート他）、ペンダント基（例えば、ポリ ペプチドペプチド他）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン 他）、キレート剤、アルキル剤、および修飾結合（例えば、αアノマー核酸他） のごときヌクレオチド間修飾が包含される。また、その能力で、水素結合および 他の化学的相互作用を介して示す配列に結合するポリヌクレオチドをミメティク スする合成分子も包含される。かかる分子は当該技術分野で知られており、例え ば、分子骨格中のリン酸結合がペプチド結合に置換えられたものが包含される。 本発明は、ＢＲＣＡ２領域の全体または一部分を含む組換え核酸を提供する。 該組換え構築物は、宿主細胞中で自律的に複製することができる。その起源また は操作による、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを 含むかかる組換えポリヌクレオチドは、１）天然でそれと会合するポリヌクレオ チドの全体または一部分と会合せず；２）天然でそれが結合するもの以外のポリ ヌクレオチドに結合し；または３）天然で発生しない。 したがって、天然に発生しない他の配列を含む組換え核酸が本発明により提供 される。野生型配列を用いることもできるが、それはしばしば、例えば欠失、置 換または挿入によって変化しているであろう。 種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーを、本発明の核酸の天然 供給源としてスクリーニングすることができ、あるいは、かかる核酸は、例えば ＰＣＲによるゲノムＤＮＡまたは他の天然供給源中に存在する配列の増幅によっ て得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの選択は、通常、目的の蛋白質のｍ ＲＮＡが豊富である組織供給源に対応する。ファージライブラリーが通常好まし いが、他のタイプのライブラリーを用いることもできる。ライブラリーのクロー ンをプレート上に広げ、スクリーニング用の基質に移し、変性させ、目的の配列 の存在についてプローブする。 本発明で用いるＤＮＡ配列は、通常、少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチ ド）、より通常には少なくとも約７−１５コドン、最も好ましくは少なくとも約 ３５コドンを含むであろう。１または２以上のイントロンも存在していてもよい 。 この数のヌクレオチドが、通常ほぼ、ＢＲＣＡ２をコードしている配列と特異的 にハイブリダイズする首尾よいプローブに要求される最小の長さである。 核酸操作の技術は、例えばSambrookら,1989またはAusbelら,1992に一般的に記 載されている。制限酵素などのごときかかる技術を適用するのに有用な試薬は、 当該技術分野で広く知られており、New England BioLabs社、Boehringer Mannhe im社、Amersham社、Promega Biotec社、U.S.Biochemicals社、New England Nucl ear社ならびに他の多数の供給源のごとき販売業者から市販されている。本発明 の融合蛋白質を生成するのに用いる組換え核酸配列は、天然または合成配列由来 とし得る。多種の天然遺伝子配列が、適当なプローブを用いて種々のｃＤＮＡま たはゲノムライブラリーから得ることができる。GenBank,National Institute ofHealthを参照されたし。 「ＢＲＣＡ２領域」とは、マーカーtdj3820およびYS-G-B10Tによって画定され るヒト第１３染色体の部分をいう。この領域には、ＢＲＣＡ２遺伝子を含むＢＲ ＣＡ２遺伝子座が含まれる。 本明細書中にて用いる「ＢＲＣＡ２遺伝子座」、「ＢＲＣＡ２対立遺伝子」お よび「ＢＲＣＡ２領域」なる語は、全ての該遺伝子座、対立遺伝子または領域を 含む二本鎖ＤＮＡ、ならびに該遺伝子座、対立遺伝子または領域を含む一本鎖Ｄ ＮＡのいずれかをいう。 本明細書中にて用いるＢＲＣＡ２遺伝子座または領域または対立遺伝子の「部 分」は、少なくとも約８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌクレオチド、 またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズを有すると定 義され、少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有し得る。 「ＢＲＣＡ２蛋白質」または「ＢＲＣＡ２ポリペプチド」とは、ＢＲＣＡ２遺 伝子座、その変異型またはフラグメントによってコードされる蛋白質またはポリ ペプチドをいう。「ポリペプチド」なる語はアミノ酸およびその相当物のポリマ ーをいい、特定の長さの生成物をいうものではなく；したがって、ペプチド、オ リゴヌクレオチド、および蛋白質がポリペプチドの定義の中に含まれる。また、 この語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのようなポリペプ チドの修飾をいうものではなく、またはそれらを除く。該定義に含まれるのは、 例えば、天然または非天然の双方の、（例えば、非天然アミノ酸他を含む）１ま たは２以上のアミノ酸のアナログ、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当 該技術分野で知られている他の修飾物である。通常、かかるポリペプチドは、天 然ＢＲＣＡ２配列に対して少なくとも約５０％相同性であり、好ましくは約９０ ％以上、より好ましくは少なくとも約９５％相同性である。また、含まれるのは 、高または低ストリンジェンシー条件下にてＢＲＣＡ２をコードする核酸にハイ ブリダイズするＤＮＡによってコードされている蛋白質、およびＢＲＣＡ２蛋白 質（群）に対する抗血清によって回収される緊密に関係するポリペプチドまたは 蛋白質である。 相同性につき比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも約１ ６アミノ酸、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、 典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基を超えるであろう。 「作動可能に結合した」とは、前記したコンポーネントがその意図した様式で 機能し得る関係にある近位（juxtaposition）をいう。例えば、プロモーターが その転写または発現に影響する場合には、該プロモーターはコーディング配列に 作動可能に結合されている。 「プローブ」 ある種の癌への素因を有するか、または大部分の癌と関連する ＢＲＣＡ２対立遺伝子と関連するポリヌクレオチド多形性は、ストリンジェント ないし適度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下にて 、標的配列のものと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチド・プローブ とのハイブリダイゼーションによって検出される。該プローブが標的配列に完全 に相補的であろうと予想される場合には、ストリンジェントな条件が用いられる であろう。幾つかの誤対合が予想される場合、例えば、プローブは完全に相補的 ではないであろうという変異型が予想される場合には、ハイブリダイゼーション ・ストリンジェンシーを低下し得る。条件は、非特異的／偶然の結合が除外され る、すなわち、ノイズを最小限にするように選択する。かかる指標は中性（neut ral）のＤＮＡ多形性ならびに突然変異を同定するため、これらの指標はＢＲＣ Ａ２感受性対立遺伝子の検出を立証するためにはさらなる分析を要する。 ＢＲＣＡ２対立遺伝子のプローブはＢＲＣＡ２領域またはそのｃＤＮＡの配列 由来とすることができる。該プローブは、ＢＲＣＡ２領域の全体または一部分に 広がり、ＢＲＣＡ２領域への特異的なハイブリダイゼーションを許容するいずれ の適当な長さであってもよい。標的配列がプローブの配列と同一の配列を含む場 合には、該プローブは、例えば約８−３０塩基対の範囲のような短いものであっ てもよい。なぜならば、ストリンジェントな条件下でさえそのハイブリッドは比 較的安定であろうからである。該プローブとのある程度の誤対合が予想される場 合、すなわち、プローブが変異型領域にハイブリダイズするであろうと予想され る場合には、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズするより長いプローブを 用いることができる。 該プローブには、標識またはレポーター分子に結合した単離ポリヌクレオチド が含まれ、標準的な方法によって配列類似を有する他のポリヌクレオチド配列を 単離するために用い得る。プローブを調製し標識する技術については、Sambrook ら,1989またはAusubelら,1992を参照されたし。他の類似するポリヌクレオチド は、相同性ポリヌクレオチドを用いることによって選抜することができる。別法 として、これらのまたは類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは 、遺伝コード中の余分の使用によって合成または選抜することができる。例えば 、（それによって種々の制限部位が作製される）サイレント変化によってか、ま たは特定の系の発現を最適化するために、種々のコドン置換を導入することがで きる。突然変異を導入してポリペプチドの特性を改善し、恐らく、リガンド−結 合親和性、鎖間親和性、またはポリペプチドの分解もしくは代謝速度を改善させ ることができる。 本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブ は、天然発生、または組換え一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド由来とする ことができ、あるいは化学合成することができる。プローブはニックトランスレ ーション、クレノー・フィルイン反応（Klenow fill−in reaction）または当 該技術分野で知られている他の方法によって標識することもできる。 少なくとも約８ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド配列の部分は、通常、 少なくとも約１５ヌクレオチドであって、ＢＲＣＡ２をコードしているポリヌク レオチド配列よりも約６ｋｂ小さい、通常約１.０ｋｂ小さいものがプローブと して好ましい。該プローブを用いてＢＲＣＡ２をコードするｍＲＮＡが細胞また は組織中に存在するか否かを判定することもできる。 「蛋白質修飾物またはフラグメント」は、一次構造配列に実質的に相同的であ るＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントが本発明により提供されるが 、例えば、イン・ビボまたはイン・ビトロの化学的および生化学的な修飾物また は異常なアミノ酸を取込んだものが包含される。かかる修飾には、例えば、当業 者に容易に理解されるであろう、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリ コシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種での標識および種々の酵素的修飾が 包含される。ポリペプチドを標識する種々の方法、およびかかる目的に有用な種 々の置換または標識は当該技術分野でよく知られており、32Ｐのごとき放射性同 位元素、標識化抗リガンド（例えば抗体）、蛍光団、化学発光剤、酵素に結合す るリ ガンド、ならびに標識化リガンドに対する特異的結合対のメンバーとして作用し 得る抗リガンドが包含される。標識の選択は要する感度、プライマーとの結合性 の簡便性、安定性要件、および入手可能な機器に依存する。ポリペプチドの標識 方法は、当該技術分野でよく知られている。Sambrook ら,1989またはAusubelら, 1992を参照されたし。 実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、該ポリペプチドの生物学 的に活性なフラグメントも提供する。重要な生物活性には、リガンド結合性、免 疫活性およびＢＲＣＡ２ポリペプチドに特有の他の生物活性が包含される。免疫 活性には、標的免疫系における免疫機能、ならびにＢＲＣＡ２蛋白質のエピトー プに対する競合物または代替抗原のいずれかとして作用する、結合性に関する免 疫学的エピトープを有することの双方が含まれる。本明細書中にて用いる「エピ トープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、当該エピトー プにユニークである螺旋立体構造中に３個のアミノ酸を含むことができた。一般 的に、エピトープは少なくとも５個のかかるアミノ酸、より通常には少なくとも ８−１０個のかかるアミノ酸よりなる。かかるアミノ酸の螺旋立体構造を決定す る方法は当該技術分野で知られている。 免疫学的な目的には、縦列反復ポリペプチドセグメントを免疫原として用いる ことができ、それによって非常に抗原性の高い蛋白質が生成される。別法として 、かかるポリペプチドは特異的結合性についての非常に有効な競合物質として作 用するであろう。ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異 的な抗体の生成を以下に記載する。 本発明は、ＢＲＣＡ２ポリペプチドおよびフラグメントを含む融合ポリペプチ ドも提供する。相同ポリペプチドは、２または３以上のＢＲＣＡ２ポリペプチド 配列の間、またはＢＲＣＡ２の配列と関連する蛋白質との間で融合することがで きる。同様にして、誘導蛋白質の特性または活性の組合せを示すであろう、異種 融合物を構築することができる。例えば、リガンド−結合性または他のドメイン を異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換する」ことが できる。かかる相同または異種融合ポリペプチドは、例えば、変化した強さまた は結合性の特異性を示し得る。融合パートナーには、免疫グロブリン、細菌のβ −ガラクトシダーゼ、trpE、蛋白質Ａ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、ア ルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母のα接合因子が包含される。例えば、Go dowskiら,1988を参照されたし。 融合蛋白質は、典型的には、以下に記載するごとき組換え核酸法のいずれかに よって作製するか、または化学合成することができる。ポリペプチドを合成する 技術は、例えば、Merrifield,1963に記載されている。 「蛋白質精製」とは、ＢＲＣＡ２をコードする組換え核酸で形質転換した細胞 からのごとき、他の生物の試料からＢＲＣＡ２ポリペプチドを単離するための種 々の方法をいい、これらは当該技術分野でよく知られている。例えば、かかるポ リペプチドは、例えば本発明によって提供される抗体を用いた免疫アフィニティ ークロマトグラフィーによって精製することができる。蛋白質精製の種々の方法 が当該技術分野でよく知られており、それらにはDeutscher,1990およびScopes,1 982に記載されているものが包含される。 「単離（した）」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる語は、 互換的に用いて、その天然状態において蛋白質またはポリペプチドを伴うコンポ ーネントから分離された該蛋白質またはポリペプチドを説明する。単量体蛋白質 は、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合には 実質的に純粋である。実質的に純粋な蛋白質は、典型的には、約６０〜９０％ｗ ／ｗの、より通常には約９５％の、好ましくは約９９％純粋を超える蛋白質試料 を含むであろう。蛋白質の純度または均一性は、蛋白質試料のポリアクリルアミ ドゲル電気泳動につづく該ゲル染色における単一ポリペプチドバンドの視覚化の ごとき当該技術分野でよく知られている多種の手段によって示し得る。ある種の 目的には、ＨＰＬＣまたは精製に利用される当該技術分野でよく知られている他 の手段を用いることによってより高い分離度を提供し得る。 ＢＲＣＡ２蛋白質は、その天然状態においてそれを伴う天然狭雑物から分離さ れた場合には自然に関連するコンポーネントを実質的に含まない。かくして、化 学合成されたか、またはまたは天然起源とする細胞とは異なる細胞系で合成され たポリペプチドは、その天然に関連するコンポーネントを実質的に含まないであ ろう。蛋白質は、当該技術分野でよく知られている蛋白質精製技術を用いた単離 によって、天然に関連するコンポーネントを実質的に含まないようにすることが できる。 単離または操作した遺伝子配列の発現産物として産生されたポリペプチドは、 同種細胞型で発現された場合でさえ、本明細書中で用いる「単離ポリペプチド」 である。合成生成形態または異種細胞によって発現された分子は、固有に単離さ れる分子である。 「組換え核酸」とは、天然に発生しない核酸であり、あるいは、単離された配 列の分離セグメント他の２種の人工的な組合せによって作製される核酸である。 この人工的な組合せは、しばしば、化学合成手段、または核酸の単離セグメント の人工的な操作、例えば遺伝子操作技術、のいずれかによって行なわれる。通常 かかる操作を行って、典型的には配列認識部位を導入するかまたは除去しつつ、 同一または保存的なアミノ酸をコードする余分なコドンでコドンを置換える。別 法として、それを行って、目的の機能の核酸セグメントを共に連結して目的の機 能の組合せを生成する。 「調節配列」とは、（遺伝子の転写、メッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライ シング、安定性などを包含する）遺伝子の発現に影響する、遺伝子座のコーディ ング領域の通常は１００ｋｂ以内の配列をいうが、それはコーディング領域から より離れていてもよい。 「実質的な相同性または類似性」 他の核酸（またはその相補鎖）と（適当な ヌクレオチド挿入または欠失で）最適に整列させた場合に、少なくとも約６０％ のヌクレオチド塩基で、通常には少なくとも約７０％の、より通常には少なくと も約８０％の、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９ ５−９８％のヌクレオチド塩基でヌクレオチド配列同一性が存在する場合には、 もう１種のものに対してその核酸またはフラグメントは「実質的に相同的」（ま たは実質的に類似する）である。 別法として、核酸またはそのフラグメントが、選択的ハイブリダイゼーション 条件下にてもう１種の核酸（またはその相補鎖）に、鎖に、またはその相補体に ハイブリダイズするであろう場合には、実質的な相同性または（類似性）が存在 する。特異性の合計不足よりも実質的により選択的であるハイブリダイゼーショ ンが生じる場合には、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には 、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約５５％ の、好ましくは少なくとも約６５％の、より好ましくは少なくとも約７５％、最 も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在する場合には、選択的なハイブ リダイゼーションが生じるであろう。Kanehisa,1984を参照されたし。記載した ごとく、相同物の長さの比較は、より長いストレッチにわたるものとすることが でき、ある種の具体例においては、しばしば、少なくとも約９ヌクレオチドの、 通常には少なくとも約２０ヌクレオチドの、より通常には少なくとも２４ヌクレ オチドの、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチドの、より典型的には少なく とも約３２ヌクレオチドの、好ましくは少なくとも約３６の、またはそれを超え るヌクレオチドのストレッチにわたるであろう。 核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に簡単に理解されようごとく、塩基組 成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸の間のヌクレオチド塩基 誤対合の数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき条件によって影響 されるであろう。ストリンジェントな温度条件には、一般的に、３０℃を超える 、典型的には３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える温度が包含されるであ ろう。ストリンジェントな塩条件は、通常、1000mM未満、典型的には500mM未満 、好ましくは200mM未満であろう。しかしながら、パラメーターの組合わせは、 いずれの単一パラメーターの測定値よりも遥かに重要である。例えば、Wetmurお よびDavidson,1968を参照されたし。 プローブ配列も、ある種の条件下にてデュプレックスＤＮＡに特異的にハイブ リダイズして、トリプレックスまたは他のより高次元のＤＮＡ複合体を形成し得 る。かかるプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は当該技術 分野でよく知られている。 「実質的な相同性」または「実質的な同一性」なる語は、ペプチドについてい う場合には、問題のポリペプチドまたは蛋白質が天然に発生する蛋白質またはそ の部分と、少なくとも約３０％の同一性、通常には少なくとも約７０％の同一性 、好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示すことを示す。 「実質的に類似する機能」とは、野生型ＢＲＣＡ２核酸または野生型ＢＲＣＡ ２ポリペプチドに参照して、修飾された核酸または修飾された蛋白質の機能をい う。修飾ポリペプチドは、野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドに対して実質的に相同 性であって、実質的に同一の機能を有するであろう。修飾ポリペプチドは変化し たアミノ酸配列を有し得、および／または修飾アミノ酸を含み得る。機能の類似 性に加えて、修飾ポリペプチドは、より長い半減期のごとき他の有用な特性を有 し得る。修飾ポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＢＲＣＡ２ポリペ プチドの活性と実質的に同一とし得る。別法として、修飾ポリペプチドの機能（ 活性）の類似性は、野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドの活性よりもより高くし得る 。該修飾ポリペプチドは、慣用技術を用いて合成され、あるいは修飾核酸によっ てコードされ、慣用技術を用いて生成する。該修飾核酸は、慣用技術によって調 製される。野生型ＢＲＣＡ２遺伝子機能に実質的に類似する機能を有する核酸は 、前記した修飾蛋白質を生成する。 ポリペプチドに関する相同性は、典型的には配列分析ソフトウエアを用いて測 定する。例えば、”the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group”,University of Wisconsin Biotechnology Center,910 Univer sityAvenue,Madison,Wisconsin,53705を参照されたし。蛋白質分析ソフトウエア は、種々の置換、欠失、および他の修飾に指定された相同性の測定を用いて類似 する配列を対合させる。同類置換には、典型的には、以下の群内の置換が包含さ れる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸 、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、ア ルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。 ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」または「セグメント」とは、少な くとも約５〜７個の隣接するアミノ酸の、しばしば少なくとも約７〜９個の隣接 するアミノ酸の、典型的には少なくとも約９〜１３個の隣接するアミノ酸の、最 も 好ましくは少なくとも約２０〜３０個の、またはそれを超える隣接するアミノ酸 のストレッチまたはアミノ酸残基である。 本発明のポリペプチドは、可溶性の場合には、例えば、ニトロセルロース、ナ イロン、カラム充填材（例えば、Sepharoseビーズ）、磁性ビーズ、ガラスウー ル、プラスチック、金属もしくはポリマーゲル、細胞または他の基体のような固 体相支持体にカップリングさせることができる。かかる支持体は、例えば、ビー ズ、ウェル、計量棒またはメンブレンのような形態を採り得る。 「標的領域」とは、増幅および／または検出する核酸の領域をいう。「標的配 列」なる語は、所望の条件下にてそれとプローブまたはプライマーとが安定なハ イブリッドを形成するであろう配列をいう。 本発明の実施は、別段示されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換え ＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用技術を用いる。例えば、Maniatisら,1982;Sa mbrookら,1989;Ausubelら,1992;Glover,1985;Anand,1992;GuthrieおよびFink,19 91を参照されたし。ヒト第１３染色体の地図作成を含むヒト遺伝子地図作成に関 する技術および材料の一般的議論は、例えば、WhiteおよびLalouel,1988に記載 されている。組換えまたは化学合成核酸の調製：ベクター、形質転換、宿主細胞 本発明の多量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中における複製によって 産生することができる。目的のフラグメントをコードしている天然または合成ポ リヌクレオチドフラグメントは、原核生物または真核生物の細胞中に導入し、複 製させることができる、組換えポリヌクレオチド構築物、通常はＤＮＡ構築物に 取込ませるであろう。通常、該ポリヌクレオチド構築物は、酵母または細菌のご とき単細胞宿主中における複製に適しているであろうが、培養哺乳動物または植 物または他の真核生物セルラインへの(ゲノム内への一体化を伴うか伴わないで) 導入も意図し得る。本発明の方法により産生した核酸の精製は記載されている。 例えば、Sambrookら,1989またはAusubelら,1992を参照されたし。 本発明のポリヌクレオチドは、化学合成によって、例えば、Beaucageおよび Carruthers,1981によって記載されているホスホルアミダイト法、またはMatteuc ciおよびCarruthers,1981によるトリエステル法によっても産生させることがで き、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器で行うことができる。二本鎖フラグ メントは、相補鎖を合成しその鎖を適当な条件下にて一緒にアニーリングさせる ことによってか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い て相補鎖を添加することによってかのいずれかの化学合成の一本鎖産物から得る ことができる。 原核生物または真核生物宿主に導入するために調製するポリヌクレオチド構築 物には、目的のポリペプチドをコードする意図するポリヌクレオチドフラグメン トを含有する、宿主によって認識される複製系を含ませることができ、好ましく は、該ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結された転写および 翻訳開始調節配列も含むであろう。発現ベクターには、例えば、複製開始点また は自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーお よびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転 写ターミネーター配列、ならびにｍＲＮＡ安定化配列のごとき必要なプロセシン グ情報部位を含ませることができる。分泌シグナルは、適当には、天然ＢＲＣＡ ２蛋白質からのものか、あるいは他の受容体からのものからか、または同一もし くは関連する種の分泌ポリペプチドからのものにかかわらず、蛋白質が細胞膜を 通過および／またはその中に留まることを許容し、かくしてその機能トポロジー が達成され、または細胞から分泌される、ものも含ませることができる。かかる ベクターは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrookら,1989また はAusubel ら,1992に論じられている標準的な組換え技術によって調製すること ができる。 適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能的であろ うように選択され、適当には、ＢＲＣＡ２遺伝子と天然で関連するものを含ませ ることができる。セルラインおよび発現ベクターの作動可能な組合わせの例は、 Sambrookら,1989またはAusubel ら,1992に記載されており；例えば、Metzgerら, 1988を参照されたし。多くの有用なベクターが当該技術分野で知られており、 Stratagen社、New England BioLabs社、Promega Biotech社、などのごとき販 売業者から得ることができる。trp、lacおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡ プロモーターならびに解糖酵素プロモーターのごときプロモーターを原核生物宿 主で用いることができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３ −ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド −３−ホスフェート デヒドロゲナーゼのごとき他の解糖酵素、マルトースおよ びガラクトース利用に寄与する酵素ほかが包含される。酵母発現に使用するのに 適したベクターおよびプロモーターは、Hitzemanら,欧州特許73,675A号にさらに 記載されている。適当な非−天然哺乳動物プロモーターには、SV40からの初期お よび後期プロモーター（Fiersら,1978）またはげっ歯類モロニー白血病ウイルス 、マウス肉腫ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、II型アデノウイルス、ウシ乳頭 腫ウイルスまたはポリオーマ由来のプロモーターが包含され得る。加えて、該構 築物は、遺伝子の多重コピーが生成され得るように増幅性遺伝子（例えば、ＤＨ ＦＲ）に連結することができる。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列に ついては、”Enhancers and Eukaryotic Gene Expression”,Cold SpringHarbor Press社,Cold Spring Harbor,New York（1983）をも参照されたし。 かかる発現ベクターは自律的に複製し得るが、それらは当該技術分野でよく知 られている方法によって宿主細胞のゲノムに挿入させることによっても複製し得 る。 発現およびクローニングベクターには、選抜マーカー、当該ベクターで形質転 換した宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子が含まれよ う。この遺伝子の存在により、インサートを発現する宿主細胞のみの増殖が保証 される。蛋白質をコードする典型的な選抜遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒 性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート他に対する抵抗 性を付与し；ｂ）栄養欠失を補足し、またはｃ）複合培地から利用できない重要 な栄養、例えば、BaciliiについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝 子を供給する。適当な選抜マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、種々の宿主に 適当するマーカーは当該技術分野でよく知られている。 目的の核酸を含むべクターは、イン・ビトロで転写させ、得られたＲＮＡをよ く知られた方法、例えば、注射（Kubo ら,1988）によって宿主細胞に導入するこ とができ、あるいはエレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム 、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフエ クション；マイクロプロジェクタイル衝突（microprojectile bombardment）； リポフェクション；（ベクターがレトロウイルスゲノムのごとき感染性因子であ る場合には）感染；および他の方法を包含する、細胞宿主の型に依存して変動す る当該技術分野でよく知られている方法によって宿主細胞に直接導入することが できる。 一般的には、Sambrookら,1989およびAusubel ら,1992を参照されたし。とりわけ 前記したものを包含する当該技術分野で知られているいずれかの方法によるポリ ヌクレオチドの宿主細胞の導入を、本明細書においては「形質転換」という。 前記した核酸が導入される細胞とは、かかる細胞の子孫をも包含することを意味 する。本発明の多量の核酸およびポリペプチドは、ＢＲＣＡ２核酸またはその部 分を原核生物または真核生物宿主細胞に和合性のベクターまたは他の発現担体中 で発現させることによって調製することができる。最も一般的に用られる原核生 物宿主は、Bacillus subtilisまたはPseudomonasのごとき他の原核生物も用いる ことができるが、Escherichia coliの株である。 哺乳動物あるいは酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類または鳥類のごと き他の真核生物宿主細胞も、本発明の蛋白質の産生に有用となり得る。培養にお ける哺乳動物細胞の増殖は、それ自体、よく知られている。JakobyおよびPastan ,1979を参照されたし。一般的に用いられる哺乳動物宿主セルラインの例は、例 えば、より高い発現、望ましいグリコシル化パターンまたは他の特徴を提供する ためには他のセルラインが適当となり得ることは当業者によって理解されるであ ろうが、VER0およびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、な らびにWI38、BHK）およびCOSセルラインである。 クローンは、ベクター構築の様式に依存するマーカーを用いることによって選 択する。該マーカーは、同一または異なるＤＮＡ分子上、好ましくは同一ＤＮＡ 分子上に存在し得る。原核生物宿主においては、例えば、アンピシリン、テトラ サイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性によって、形質転換体を選抜する ことができる。温度感受性に基く特定の生成物の産生も、適当なマーカーとして 作用し得る。 本発明のポリヌクレオチドで形質転換した原核生物または真核生物細胞は、本 発明の核酸およびポリペプチドの産生のみならず、例えば、ＢＲＣＡ２ポリペプ チドの特徴の研究にも有用であろう。 アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、当業者により理解されるであろう、 ＢＲＣＡ２遺伝子座の発現を妨害するかまたは低下させるのに有用である。例え ば、ＢＲＣＡ２遺伝子座の全体もしくは一部分またはＢＲＣＡ２領域（特にＢＲ ＣＡ２遺伝子座を挟むもの）を含むポリヌクレオチドベクターからの他の配列を 、アンチセンス向きでプロモーターの制御下に置き、細胞に導入することができ る。細胞内でのかかるアンチセンス構築物の発現は、ＢＲＣＡ２の転写および／ または翻訳および／または複製を妨害するであろう。 本明細書に開示したＢＲＣＡ２遺伝子配列に基くプローブおよびプライマーを 用いて、他の種の相同性ＢＲＣＡ２遺伝子配列および蛋白質を同定する。これら のＢＲＣＡ２遺伝子配列および蛋白質は、それらが単離させた種についての、本 明細書中に開示した診断／予後、治療および薬剤スクリーニング法に用いる。使用方法：核酸診断および診断キット 個人を癌にさせる素因を有するＢＲＣＡ２対立遺伝子の存在を検出するために は、血液のごとき生物試料を調製し、ＢＲＣＡ２の感受性対立遺伝子の存在また は不存在について分析する。新生生物、前駆病変の悪性に向けての進行、または 予後インジケーターの存在を検出するためには、該病変の生物試料を調製し、Ｂ ＲＣＡ２の突然変異対立遺伝子の存在または不存在について分析する。これらの 試験の結果および解釈情報は、試験した個人へのコミューニケイションのために へルスケア提供者に戻される。かかる診断は、診断研究所によって行うことがで き、あるいは別法として、診断キットを製造して、ヘルスケア提供者または自己 診断用に個人に販売することができる。 まず、該スクリーニング方法には、関連するＢＲＣＡ２配列の増幅が含まれる 。本発明のもう１つの好ましい具体例において、該スクリーニング方法には、非 −ＰＣＲベースのストラテジーが含まれる。かかるスクリーニング方法には、２ 工程標識増幅方法が包含され、それは当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲ および非−ＰＣＲベースのスクリーニングストラテジーは双方とも、高レベルの 感度で標的配列を検出することができる。 今日最も一般的な方法は、標的増幅である。ここにおいては、標的核酸配列を ポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼ作動増幅を用いる１つの特に好ましい方 法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ポリメラーゼ連鎖反応および他 のポリメラーゼ作動増幅アッセイは、ポリメラーゼ作動増幅サイクルの使用を通 してコピー数において1,000,000倍を超える増加を達成し得る。増幅したら、得 られた核酸を配列決定し、あるいはＤＮＡプローブの基質として使用することが できる。 （例えば、癌感受性についてのスクリーニングにおいて）プローブを用いて標 的配列の存在を検出する場合には、血液または血清のごとき分析すべき生物試料 を処理して、望むなら核酸を抽出し得る。該試料核酸は、種々の方法で調製し、 標的配列の検出；例えば、変性、制限分解、電気泳動またはドットブロッティン グを促進することができる。被検体核酸の標的化領域は、通常、少なくとも部分 的には一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければな らない。配列が元来一本鎖である場合には、変性は要求されないであろう。しか しながら、配列が二本鎖である場合には、恐らくは該配列を変性させる必要があ るであろう。変性は当該技術分野で知られている種々の技術によって行うことが できる。 被検体核酸およびプローブは、当該プローブ中の標的配列と被検体中の推定標 的化配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下にてインキュベートする 。 被検体に結合させるために用いるプローブの領域は、ヒト第１３染色体の標的化 領域に完全に相補的に作製することができる。したがって、偽陽性を防ぐために は高ストリンジェンシー条件が望ましい。しかしながら、高ストリンジェンシー の条件は、プローブが、ゲノム中にユニークである染色体の領域に相補的である 場合にのみ用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イ オン強度、塩基組成、プローブ長、およびホルムアミドの濃度を包含する、ハイ ブリダイゼーションの間および洗浄工程の間の多数の因子によって決定する。こ れらの因子は、例えば、Maniatisら,1982およびSambrookら,1989に概説されてい る。ある種の環境下では、標的配列を検出する手段を提供するために、トリプレ ックス、クアドラプレックス他のごときより高次元のハイブリッドを形成させる ことが望ましいものとなり得る。 いずれの場合にも、得られたハイブリッドの検出は、通常、標識プローブを用 いることによって行なわれる。別法として、該プローブは非標識であってもよい が、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、標識されているリガンドと特異 的に結合させることによって検出可能なものとし得る。適当な標識、ならびにプ ローブおよびリガンドを標識するための方法は、当該技術分野で知られており、 例えば、（ニックトランスレーション、ランダムプライムまたはキナージング（ kinasing））などの知られている方法によって取込ませ得る放射性同位元素標識 、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に活性化（trigge red）ジオキセタン）、酵素、抗体が包含される。この基本スキームの変形は、 当該技術分野で知られており、外来材料からの検出すべきハイブリッドの分離を 容易にし、および／または標識化基からのシグナルを増幅する変形が包含される 。多種のこれらの変異型は、例えば、MatthewsおよびKricka,1988；Landegrenら ,1988；Mittlin,1989；米国特許第4,868,105号および欧州特許公開番号225,807 号に概説されている。 前記したごとく、非−ＰＣＲベースのスクリーニングアッセイも本発明におい て意図される。例示的な非−ＰＣＲベースの手法を実施例６に記載する。この手 法は、核酸プローブ（または、正常のホスホジエステルをホスホン酸メチル骨格 に置換えたごときアナログ）を、低レベルのＤＮＡ標的にハイブリダイズさせる 。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨害しないよ うにプローブに共有結合させた酵素を有する。ついで、この酵素−プローブコン ジュ ゲート−標的核酸複合体を遊離プローブ酵素コンジュゲートから単離し、酵素を 検出するために基質を添加することができる。酵素活性は、発色またはルミネセ ント出力における変化として観察され、その結果１０3−１０6倍の感度の上昇を 生じる。オリゴデオキシヌクレオチド−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲー トの調製およびそのハイブリダイゼーション・プローブとしての使用に関する例 については、Jablonskiら,1986を参照されたし。 二工程標識増幅法は当該技術分野で知られている。これらのアッセイは、（ジ ゴキシゲニン、ビオチンなどのごとき）小リガンドがＢＲＣＡ２に特異的に結合 し得る核酸プローブに結合するという原理で作用する。例示的なプローブは、本 特許出願の配列番号：１および図３に記載する配列に基いて開発することができ る。対立遺伝子特異的プローブも、この例の範囲内に意図され、例示的な対立遺 伝子特異的プローブには、表２に記載するものを含む、以下に記載する素因突然 変異を包含するプローブが含まれる。 １の例において、核酸プローブに結合した小リガンドは、抗体−酵素コンジュ ゲートによって特異的に認識される。この例の１の具体例において、ジゴキシゲ ニンが核酸プローブに結合される。ハイブリダイゼーションは、化学発光基質に 転じる抗体−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートによって検出する。この 具体例による核酸プローブを標識する方法については、例えば、Martinら,1990 を参照されたし。第２の例において、該小リガンドは、第１のリガンドに特異的 に複合化することができる第２のリガンド−酵素コンジュゲートによって認識さ れる。この例のよく知られている具体例は、ビオチン−アビジン型の相互作用で ある。核酸プローブを標識する方法およびビオチン−アビジンベースのアッセイ におけるその使用については、Rigbyら,1977およびNguyenら,1992を参照された し。 本発明の核酸プローブアッセイがＢＲＣＡ２を検出することができる核酸プロ ーブのカクテルを用いるであろうことも本発明の発明の範囲内に意図されている 。かくして、細胞試料中のＢＲＣＡ２の存在を検出するための１つの例において 、ＢＲＣＡ２に相補的な１を超えるプローブを用い、特に、多種の異なるプロー ブは、択一的に、２、３または５種の異なる核酸プローブ配列である。患者にお けるＢＲＣＡ２遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するためのもう１つの例に おいて、ＢＲＣＡ２に相補的な１を超えるプローブを用い、ここに、カクテルに はＢＲＣＡ２中に変化を有する患者の集団で同定された対立遺伝子特異的突然変 異に結合することができるプローブが含まれる。この具体例において、いずれの かの種のプローブを使用することができ、好ましくは、個人を乳癌にさせる素因 として同定された主要遺伝子突然変異に相当するプローブが含まれるであろう。 本発明の範囲内に意図される幾つかの侯補プローブには、以下に記載する対立遺 伝子特異的突然変異を含むプローブ、および突然変異部位の５’および３’側の 両方の、配列番号：１および図３に示すＢＲＣＡ２領域を有するプローブが包含 される。使用方法：ペプチド診断および診断キット 病変の新生生物症状は、野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドの変化に基いて検出す ることもできる。かかる変化は、慣用技術による配列分析によって判定すること ができる。より好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を用 いて、ＢＲＣＡ２ペプチド中の相異またはその不存在を判定する。抗体は、「抗 体」なる標題にて前記に論じたごとく調製することができ、実施例９および１０ にてさらに示す。抗体を生起させ精製する他の技術は当該技術分野でよく知られ ており、かかる技術のうちのいずれかを選択して、本発明で特許請求する調製を 達成することができる。本発明の好ましい具体例において、抗体は、溶液からＢ ＲＣＡ２蛋白質を免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲルのウエスタンまたは免 疫ブロット上でＢＲＣＡ２蛋白質と反応するであろう。もう１つの好ましい具体 例において、抗体は、免疫組織化学的技術を用いて、パラフィンまたは凍結組織 切片中のＢＲＣＡ２蛋白質も検出するであろう。 ＢＲＣＡ２またはその突然変異体を検出する方法に関する好ましい具体例には 、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いたサンドウィッチア ッセイを含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイム ノアッ セイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素 アッセイ（ＩＥＭＡ）が包含される。例示的なサンドウィッチアッセイは、（出 典明示して本明細書の一部とみなす）米国特許番号第4,376,110号および第4,486 ,530号中でDavidらによって記載されており、実施例９に例示する。使用方法：薬剤スクリーニング 本発明は、特に、種々の薬剤スクリーニング技術のうちのいずれかで、ＢＲＣ Ａ２ポリペプチドまたはその結合性フラグメントを用いることによって化合物を スクリーニングするのにも有用である。 かかる試験で用いるＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で 遊離しているか、固体支持体に固定化されているか、あるいは細胞表面に担持（ borne）されているかのいずれであってもよい。薬剤スクリーニングの１つの方 法は、好ましくは競合結合アッセイにおいて、ポリペプチドまたはフラグメント を発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換した真核生物または原核生 物宿主細胞を用いる。生存しているかまたは固定化形態かのいずれかのかかる細 胞を標準的な結合アッセイに用いることができる。例えば、ＢＲＣＡ２ポリペプ チドまたはフラグメントと試験すべき剤との間の複合体の形成を測定することが でき、あるいは、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメントと知られているリ ガンドとの間の複合体の形成が試験すべき剤によって妨害される程度を検査する ことができる。 かくして、本発明は、剤とＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントと を接触させ、次いで、当該技術分野でよく知られている方法によって、（ｉ）剤 とＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在について、 または（ｉｉ）ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメントとリガンドとの間の 複合体の存在についてアッセイすることからなる薬剤スクリーニング方法を提供 する。かかる競合結合アッセイにおいて、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグ メントは典型的には標識されている。蛋白質：蛋白質複合体および遊離（すなわ ち、非複合化）標識量中に存在する遊離ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはフラグメ ント は、各々、ＢＲＣＡ２に対する試験すべき剤の結合性またはＢＲＣＡ２：リガン ド結合性のその妨害の尺度である。 薬剤スクリーニングのもう１つの技術は、ＢＲＣＡ２ポリペプチドに対して適 当な結合親和性を有する化合物の非常に徹底したスクリーニングを提供し、これ は1984年９月13日に公開されたGeysenによるPCT国際公開番号WO84/03564号に詳 記されている。簡単に述べれば、膨大な種々の小ペプチド試験化合物を、プラス チック製ピンまたはある他のものの表面のごとき固体基体上で合成する。ペプチ ド試験化合物をＢＲＣＡ２ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次いで、結合し たＢＲＣＡ２ポリペプチドを、当該技術分野でよく知られている方法によって検 出する。精製したＢＲＣＡ２は、前記の薬剤スクリーニング技術で用いるために 、プレート上に直接コートすることができる。しかしながら、該ポリペプチドに 対する非−中和抗体を用い抗体を捕捉して、固相上にＢＲＣＡ２ポリペプチドを 固定化することができる。 本発明は、ＢＲＣＡ２ポリペプチドに特異的結合することができる中和抗体が 、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する結合性について試験 化合物と競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図する。この様 にして、抗体を用いて、ＢＲＣＡ２ポリペプチドの１または２以上の抗原決定基 を分有するいずれかのぺプチドの存在を検出することができる。 薬剤スクリーニングのさらなる技術には、非機能性ＢＲＣＡ２遺伝子を有する （前記したごとき）宿主真核生物セルラインまたは細胞群の使用が含まれる。こ れらの宿主セルラインまたは細胞群は、薬剤化合物存在下にて増殖させる。宿主 細胞の増殖速度を測定して、化合物がＢＲＣＡ２欠損細胞の増殖を調節すること ができるかを判定する。使用方法：合理的ドラッグデザイン 合理的ドラッグデザインの最終目標は、例えば、目的の生物学的に活性なポリ ペプチドのより活性または安定な形態である薬剤、または例えば、ポリペプチド の機能をイン・ビボで向上または妨害する薬剤を生成するために、該ポリペプチ ドの構造アナログ、または（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビタ ーなどの）それと相互作用する小分子の構造アナログを生成することにある。例 えば、Hodgsonら,1991を参照されたし。１つのアプローチにおいて、最初に目的 の蛋白質（例えば、ＢＲＣＡ２ポリペプチド）または例えばＢＲＣＡ２−受容体 もしくはリガンド複合体の三次元構造をＸ線結晶学によって、コンピュータ・モ デリングによって、最も典型的には、アプローチの組合せによって決定する。あ まりしばしばではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性蛋 白質の構造に基いてモデリングすることによっても得ることができる。合理的ド ラッグデザインの一例は、HIVプロテアーゼ・インヒビターの開発である(Ericks onら,1990)。加えて、ぺプチド（例えば、ＢＲＣＡ２ポリペプチド）はアラニン スキャン(Wells,1991)によって分析する。この技術においては、アミノ酸残基を Alaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を判定する。ペプチドの各アミ ノ酸残基をこのようにして分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。 また、機能アッセイによって選抜した標的特異的抗体を単離し、次いでその結 晶構造を解明することもできる。原則として、このアプローチは、その上におい てつづくドラッグデザインが基礎とし得る薬剤コア(pharmacore)を得る。機能的 な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体(抗−ids)を創製する ことによって蛋白質結晶学を全く迂回することも可能である。鏡像に対する鏡像 のごとき、抗−idsの結合部位は、元の受容体のアナログであると予想される。 ついで、抗−idを用いて、ぺプチドの化学的または生物学的に生成したバンクか らぺプチドを同定し、単離することができる。ついで、選抜したぺプチドは、薬 剤コアとして作用するであろう。 かくして、例えば、改善されたＢＲＣＡ２ポリペプチド活性または安定性を有 する薬剤、またはＢＲＣＡ２ポリペプチド活性のインヒビター、アゴニスト、ア ンタゴニスト他として作用する薬剤をデザインすることができる。クローン化Ｂ ＲＣＡ２配列の入手性によって、十分量のＢＲＣＡ２ポリペプチドを入手可能と することができ、Ｘ線結晶学のごとき分析実験を行うことができる。加えて、本 明細書中に記載したＢＲＣＡ２蛋白質配列の知見は、Ｘ−線結晶学の代りに、ま たはそれに加えて、コンピュータモデリング技術を用いるものを案内するであろ う。使用方法：遺伝子治療 本発明によれば、該方法は、突然変異ＢＲＣＡ２対立遺伝子を運搬する細胞に 野生型ＢＲＣＡ２機能を供給することも提供される。かかる機能を提供すること は、レシピエント細胞の新生生物増殖を抑制するにちがいない。野生型ＢＲＣＡ ２遺伝子または該遺伝子の一部分は、該遺伝子が染色体外に残るように、べクタ ーで細胞に導入することができる。かかる状況においては、該遺伝子は、染色体 外位置から細胞によって発現されるであろう。遺伝子フラグメントを突然変異Ｂ ＲＣＡ２対立遺伝子を運搬している細胞中に導入し、その中で発現させる場合に は、該遺伝子フラグメントは細胞の非新生生物増殖に必要であるＢＲＣＡ２蛋白 質の一部分をコードしていなければならない。より好ましくは、野生型ＢＲＣＡ ２遺伝子またはその一部分が、細胞中に存在する内因性の突然変異ＢＲＣＡ２遺 伝子と組換わるように、それを突然変異細胞に導入する状況である。かかる組換 えには、ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異の修正を生じる二重組換え事象が必要である 。組換えよび染色体外維持性の双方の遺伝子を導入するためのベクターは当該技 術分野で知られており、いずれの適当なベクターも用いることができる。エレク トロポレーション、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入のごとき細胞 にＤＮＡを導入する方法は、当該技術分野で知られており、方法の選択は従事者 の能力の範囲内である。野生型ＢＲＣＡ２遺伝子で形質転換した細胞は、モデル 系として用いて、癌軽減およびかかる軽減を促進する薬剤処理を実験することが できる。 前記に一般的に論じたごとく、ＢＲＣＡ２遺伝子またはフラグメントは、適用 し得る場合には、癌細胞中におけるかかる遺伝子の発現産物の量を増加させるた めに、遺伝子療法に用いることができる。かかる遺伝子治療は、ＢＲＣＡ2 ポリ ペプチドのレベルが不存在または正常細胞に比して低下している、癌性または前 癌性細胞の双方における使用に特に適している。突然変異遺伝子が「正常」レべ ルで発現しているが、その遺伝子産物が完全に機能的でない腫瘍細胞中でさえ、 所定のＢＲＣＡ２遺伝子の発現レベルを上昇させるのにも有用である。 遺伝子治療は、例えば、friedman,1991によって記載されているごとき認可さ れた方法に従って行なわれるであろう。患者の腫瘍からの細胞を、まず前記した 診断方法によって分析し、腫瘍細胞中のＢＲＣＡ２ポリペプチドの産生を確認す るであろう。発現制御エレメントに連結し、腫瘍細胞の内側で複製することがで きるＢＲＣＡ２遺伝子のコピーを含む、ウイルスおよびプラスミドベクター（さ らなる詳細は後記を参照されたし）を調製する。米国特許第5,252,479号およびP CT国際公開番号WO93/07282号に開示されているごとき適当なベクターは知られて いる。次いで、（他の部位に転位し得るいずれの腫瘍細胞にも到達させるために ）該ベクターを腫瘍部位に局所的にか、または全身的にかのいずれかで患者に注 射する。トランスフェクト遺伝子が各標的腫瘍細胞のゲノムに恒久的に取込まれ ない場合には、該治療を定期的に繰返さなければならないかもしれない。 当該技術分野で知られている遺伝子トランスファー系が、本発明の遺伝子治療 方法の実施に有用となり得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルストランス ファー方法が包含される。例えば SV40(Madzak ら,1992)、アデノウイルス(Berk ner,1992；Berknerら,1988；GorzigliaおよびKapikian,1992；Quantinら,1992； Rosenfeldら，1992；Wilkinsonら,1992；Stratford−Perricaudetら,1990)、ワ クシニアウイルス(Moss,1992)、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka,1992；Ohiら,199 1)のようなパポーバウイルス科、HSVおよびEBVを包含するへルペスウイルス(Mar golskee,1992;Johnsonら,1992;Finkら,1992;BreakfieldおよびGeller,1987;Free seら,1990)、ならびに鳥類(BrandyopadhyayおよびTemin,1984；Petropoulosら,1 992)、げっ歯類（Mil1er,1992；Mil1erら,1985;Sorgeら,1984;MannおよびBaltim ore,1985;Millerら,1988）およびヒト（Shimadaら,1991;Helsethら,1990;Pageら ,1990;BuchschacherおよびPanganibian,1992）起源のレトロウイルスを包含する 多種のウイルスが、遺伝子トランスファーベクターとして用いられている。大部 分のヒト遺伝子治療プロト コールは、無能化したマウスレトロウイルスに基いている。 当該技術分野で知られている非ウイルス遺伝子トランスファー法には、リン酸 カルシウム共沈(Grahamおよびvan der Eb,1973;Pellicerら,1980)のごとき化 学的技術；例えば、マイクロインジェクション（Andersonら,1980;Gordonら,198 0；Brinsterら,1981；ConstantiniおよびLacy,1981）のような機械的技術；リポ ソームを介した膜融合−媒介トランスファー（Felgnerら,1987；WangおよびHuan g,1989；Kanedaら,1989；Stewartら,1992；Nabelら,1990；Limら,1992）；直接 ＤＮＡ取込みおよび受容体−媒介ＤＮＡトランスファー（Wolffら,1990;Wuら,19 91;Zenkeら,1990;Wuら,1989b;Wolffら,1991;Wagnerら,1990;Wagnerら,1991；Cot tenら,1990；Curielら,1991a；Curielら,1991b）が包含される。ウイルス−媒介 遺伝子トランスファーは、リポソームデリバリーを用いる直接イン・ビボ遺伝子 トランスファーと合して、ウイルスベクターを、取囲む非分裂性細胞ではなく腫 瘍細胞に指向させることができる。別法として、レトロウイルスベクター産生セ ルラインを腫瘍に注射することができる(Cu1verら,1992)。次いで、産生細胞の 注射は、ベクター粒子の連続した供給源を提供する。この技術は、手術不能の脳 腫瘍を有するヒトにおける使用に認可されている。 生物学的および物理学的遺伝子トランスファー法を合するアプローチにおいて 、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・へキソン蛋白質に特 異的なポリリジンーコンジュゲート抗体と結合させ、得られた複合体をアデノウ イルスベクターに結合させる。ついで、三分子複合体を用いて細胞に感染させる 。該アデノウイルスベクターにより、効率的な結合性、インターナリゼーション 、およびカップリングさせたＤＮＡが障害を受ける前のエンドソームの分解が許 容される。 リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接イン・ビボ遺伝子トランスファーを媒介で きることが示されている。標準的なリポソーム調製物においては遺伝子トランス ファー工程は非特異的であるが、例えば、直接イン・サイチュ投与後に、位置決 定されたイン・ビボの取込みおよび発現が腫瘍沈殿物で報告されている(Nabel,1 992)。 乳房および卵巣組織、例えば乳房または卵巣の上皮細胞にＤＮＡを直接標的化 する遺伝子トランスファーが好ましい。受容体−媒介遺伝子トランスファーは、 例えば、ポリリジンを介して蛋白質リガンドに（通常、共有的に閉環した超螺旋 プラスミドの形態の）ＤＮＡをコンジュゲートすることによって行う。リガンド は、標的細胞の細胞表面上の相当するリガンド受容体の存在／組織型に基いて選 択する。１つの適当な受容体／リガンド対には、エストロゲン受容体とそのリガ ンドであるエストロゲン（およびエストロゲン・アナログ）が包含され得る。こ れらのリガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、望むなら血液に直接注射することが でき、受容体結合性およびＤＮＡ−蛋白質複合体のインターナリゼーションが起 こる標的組織に指向することができる。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するた めに、アデノウイルスとの同時感染を含ませて、エンドソーム機能を破壊するこ とができる。 該治療には、単独または結合して行うことができる二工程が含まれる。第１の 工程では、ＢＲＣＡ２感受性対立遺伝子を運搬する思春期前の女性を、その乳管 上皮前駆細胞の幾つかまたは全てが少なくとも１つの機能性正常ＢＲＣＡ２対立 遺伝子のさらなるコピーを受けるように、遺伝子デリバリー担体で治療する。こ の工程において、治療した個人は、感受性対立遺伝子の効果が正常対立遺伝子の 存在によって対抗される程度まで低下された乳癌の危険性を有する。予防的治療 の第２の工程において、素因低年齢女性、特に提唱した遺伝子治療処理を受けた 女性は、妊娠全期間の乳房に対する作用をミメティクスするためのホルモン療法 を受ける。使用方法：ペプチド療法 ＢＲＣＡ２活性を有するペプチドは、突然変異ＢＲＣＡ2 を運搬しているか、 またはＢＲＣＡ２を欠失している細胞に適用することができる。ＢＲＣＡ２蛋白 質の配列を配列番号：２に開示する。蛋白質は、例えば、知られている発現べク ターを用いて、細菌中でｃＤＮＡ配列を発現させることによって産生することが できる。別法として、ＢＲＣＡ２ポリペプチドは、ＢＲＣＡ２−産生哺乳動物細 胞から抽出することもできる。加えて、合成化学の技術を用いて、ＢＲＣＡ２蛋 白質を合成することもできる。かかる技術のいずれも、ＢＲＣＡ２蛋白質を含む 本発明の調製物を提供することができる。該調製物は、他のヒト蛋白質を実質的 に含まない。これは、微生物内またはイン・ビトロで合成することによって最も 容易に行われる。 活性ＢＲＣＡ２分子は、例えば、マイクロインジェクションによってか、また はリポソームを使用することによって細胞に導入することができる。別法として 、能動的または拡散によって、幾分かの活性分子を細胞によって取込ませること ができる。ＢＲＣＡ２遺伝子産物の細胞外適用は、腫瘍増殖に影響するのに十分 なものとし得る。ＢＲＣＡ２活性を有する分子の適用は、新生生物状態の部分的 な逆転に通じるにちがいない。ＢＲＣＡ２活性を有する他の分子（例えば、ペプ チド、薬剤、または有機化合物）を用いてもかかる逆転に影響することができる 。実質的に同様な機能を有する修飾ポリペプチドもペプチド療法に用いられる。使用方法：形質転換宿主 同様にして、突然変異ＢＲＣＡ2対立遺伝子を運搬している細胞または動物を 、治療剤としての潜在性を有する物質について実験し、試験するためのモデル系 として用いることができる。該細胞は、典型的には培養上皮細胞である。これは 、体細胞または生殖系のいずれかの、ＢＲＣＡ２突然変異を有する個人から単離 することができる。別法として、該セルラインは、前記したごとく、ＢＲＣＡ２ 対立遺伝子中に突然変異を運搬するように設計することもできる。試験物質を該 細胞に適用した後に、細胞の新生生物的なトランスフォーメーションを判定する 。固定−独立増殖性、ヌードマウスにおける発癌性、細胞の侵入性、および成長 因子依存性を包含する、新生生物的にトランスフォームした細胞のいずれの特性 をも検査することができる。これらの各特性についてのアッセイは当該技術分野 で知られている。 治療剤を試験する動物は、全動物の突然変異誘発後、または生殖系細胞もしく は接合体の処理の後に選抜することができる。かかる処理には、通常第２の動物 種からの突然変異ＢＲＣＡ２対立遺伝子の挿入、ならびに破壊した(disrupted) 相同性遺伝子の挿入が包含される。別法として、動物の内因性ＢＲＣＡ２遺伝子 （群）は、挿入または欠失突然変異または慣用技術を用いる他の遺伝的変化によ って破壊させることができる(Capecchi,1989;Va1anciusおよびSmithies,1991；H astyら,1991;Shinkaiら,1992;Mombaertsら,1992;Philpottら,1992;Snouwaertら, 1992;Donehowerら,1992)。試験物質を動物に投与した後に、腫瘍の増殖性を評価 しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を妨害または抑制する場合には、該 試験物質がここに同定された癌治療用の候補治療剤となる。これらの動物モデル は、候補治療生成物に対する重要な試験担体を提供する。 本発明を以下の実施例によって記載するが、これは例示的なものであって、断 じて本発明を限定するものではない。当該分野で良く知られた標準的技術次いで または後記にて特記する技術を利用した。 実施例１ 染色体１３−連鎖乳癌罹患性遺伝子座を有するらしい家系の確認および研究 研究に利用できる、乳癌の複数ケースを持つ拡大された家系および多くの親族 の大きな組を供するはっきりとした集団から、広範な癌に罹りやすい家系を確認 した。これらの大家系に存在する非常に多数の減数分裂は、ＢＲＣＡ２遺伝子座 が分離するか否かを検出する能力を供し、情報的組換え体が調査すべき小領域内 で起こる機会を増加させた。これは、ＢＲＣＡ２領域への連鎖を確立する機会を 大いに改良し、ＢＲＣＡ２領域を管理可能なサイズヘ低下させるのをかなり容易 とし、これはＢＲＣＡ２遺伝子座それ自体の同定を可能とする。 各家系は、全ての利用可能な関係親族を介して、各発端者または癌ケースの全 ての情報的一親等親族まで拡大された。これらの家系では、該家系においてやは り出現する、興味ある他の部位において癌を持つさらなる乳癌ケースおよび個体 を、主要登録連鎖ファイルを介して同定した。ユタ州癌登録所で確認されていな い家系で報告された全乳癌を調べた。全ての癌の確認のために、医療記録または 死亡証明書を入手した。ＤＮＡがそれから抽出された血液試料を供することに よって、個体および全ての情報的個体を結び付ける各鍵を参画させた。また、我 々は、故人ケースの遺伝子型がそれらの親族の遺伝子型から推定できるように、 故人の配偶者および親族もサンプリングした。 推定できる遺伝子型を持つ３以上の癌ケースを有する家系を、染色体１３マー カーに対する連鎖実験で選択した。これらは、増殖性乳房病気および乳癌の研究 についての連結データベースから外来確認された家系を含む(Skolnickら、１９ ９０)。これらの家系の選択用基準は、乳癌を持つ２人の姉妹または母親および 彼女の娘の存在であった。加えて、我々の乳癌連鎖研究の一部として１９８０年 以来研究した家系および男性および女性乳癌のクラスターの存在についての連結 データベースから確認された家系および初期開始乳癌を持つ自己言及家系が含ま れた。これらの家系を調査し、前記したごとくに我々のクリニックで拡張させた 。 これらの家系で収集した各試料については、標準的な研究室プロトコルを用い 、血液またはパラフィン−埋没組織ブロックからＤＮＡを抽出した。本実験にお ける遺伝型は短いタンデムリピート（ＳＴＲ）マーカーに限定された。というの は、一般に、それらは高へテロ接合性を有し、ＰＣＲ方法は非常に少量のＤＮＡ を使用しつつ迅速な方向転換(turnaround)を供するからである。この努力を助け るために、Ｒｂ腫瘍サプレッサー遺伝子座の領域における短腕に位置付けられる ２、３または４の短いタンデムリピートを含有するクローンについての染色体特 異的コスミドライブラリーをスクリーニングすることによって、染色体１３上の ＳＴＲマーーカーを開発した。我々の研究所で開発されなかったマーカーについ てのオリゴヌクレオチド配列は、公開された報告から、あるいはBreast Cancer LinkageConsortiumの一部として、あるいは他の研究者から入手した。対立遺伝 子の一貫したコーディングを維持するのに使用した標準レーンマーカーにて、盲 検により、全ての遺伝子型フィルムをスコア取りした。鍵となる試料は、すべて の関連マーカーにつき二連型別を受けた。 各家系についてのＬＯＤスコアは、２つの組換え分率値０.００１および０.１ について計算した。（ＬＯＤスコアの計算については、Ott 1985参照）。尤度は 、Clausら、１９９１によって誘導されたモデル下で計算し、該モデルは推定遺 伝 子頻度０.００３、女性遺伝子キァリアにおける寿命危険性約０.８０、および非 遺伝子キャリアにおける乳癌についての集団ベース年齢−特異的危険性を推定し た。ＬＯＤスコア計算で使用したマーカーについての対立遺伝子頻度は、ＣＥＰ Ｈパネルにおける無関係個体の我々自身の研究所型別から計算した（Whiteおよ びLalouel、１９８８）。 家系１０７は、いずれのグループによっても今日までに報告されている最大の 染色体１３−連鎖乳癌家族である。この家族についての染色体１３に対する連鎖 の証拠は圧倒的である。より小さい家系においては、散発性癌は、連鎖解析およ び鍵となる組換え体の正しい同定を大いに混乱させる。 我々の組換え体の特徴付けを改良し、より近いフランキングマーカーをはっき りとさせるために、染色体１３上の比較的小さな領域の密なマップが必要であっ た。我々のアプローチは、他の研究者によって提供された現存のＳＴＲマーカー および我々の染色体連鎖家系における我々の実験室から新しく開発されたいずれ ものマーカーを分析することであった。図１は、遺伝子分析で使用された１０の マーカーの位置決めを示す。表１は我々の実験における１９家系の各々に対する 連鎖についてのＬＯＤスコアを与え、これは該領域をほぼ１.５Ｍｂまで減少さ せた。 また、表１はＬＯＤスコアに基づくＢＲＣＡ２突然変異を有する家系の事後確 率および先験的確率も与える。これらのマーカーの４つ（Ｄ１３Ｓ１７、Ｄ１３ Ｓ２６０、Ｄ１３Ｓ３１０およびＤ１３Ｓ２６７）は従前に公知であった。他の ６つのマーカーはＢＲＣＡ２についての我々の研究の一部として見出された。我 々は、左側境界におけるマーカーｔｄｊ３８２０を持つ家系１０７における組換 え体およびＡＣ６およびＤ１３Ｓ３１０とほぼ同一位置である右側境界（図１） におけるマーカーＹＳ−Ｇ−Ｂ１０Ｔを持つ家系２０４３における第２の組換え 体に基づいて該領域を１.５メガベースにまで減少させることができた。さらに 、ＢＲＣＡ２自体によって駆動され得るＢＲＣＡ２領域における膵臓腫瘍細胞系 でホモ接合性欠失が見出された；この欠失を図１においてSchutte/Kern欠失とい う(Schutteら、１９９５)。図１におけるSchutte/Kernｃｏｔｉｇは、該欠失を カバーするこれらの著者らの物理的マップをいう。 実施例２ 注目する領域における遺伝子的および物理的源の開発 ＢＲＣＡ２領域における高度に多形な遺伝子座の数を増加させるために、我々 は、物理的に該領域にマップされるＰ１、ＢＡＣおよびＹＡＣから我々の研究室 において多数のＳＴＲマーカーを開発した。これらのマーカーは、我々が、さら に該領域を精査することを可能とした（表１および前記議論参照）。 所望の領域におけるＳＴＳを用いて、それらを含有するＹＡＣを同定した。次 いで、これらのＹＡＣを用いて、Ｐ１またはＢＡＣにおけるサブクローンを同定 した。次いで、これらのサブクローンを、短いタンデムリピートの存在につきス クリーニングした。強力なシグナルを持つクローンを優先的に選択した。という のは、それらは非常に多数の反復を有しおよび／または該パターンに対してほと んど完全に忠実である反復を表すようだからである。これらの特徴は共に多形の 確率を増加させることが知られている（Weberら、１９９０)。これらのクローン をベクターから直接配列決定して該反復を位置付けた。我々は、該反復の末端に 相補的な潜在的プライマー組の１つを用いることによって、短いタンデムリピー トの一方側のユニークな配列を得た。このユニークな配列に基づいて、プライマ ーをして他の向きに反復を横切って逆に配列決定させ、それに隣接する第２プラ イマーの設計用のユニークな配列を得た。次いで、ＳＴＲを、小さな群の無関係 個体に対する多形につきスクリーニングし、ハイブリッドパネルに対してテスト して、それらの物理的位置を確認した。次いで、これらの基準を満足する新しい マーカーをユタ州からの無関係個体の組においてタイプ分けして、この集団の研 究に適する対立遺伝子頻度を得た。この研究で報告された他のマーカーの多くも 無関係個体でテストして、同様に適する対立遺伝子頻度を得た。 前記した手法を用い、新規なＳＴＲは、多形であってＢＲＣＡ２領域に位置付 けられるこれらのＹＡＣから見出された。図１は、ＢＲＣＡ２領域におけるＳＴ Ｓ、Ｐ１、ＢＡＣおよびＹＡＣの模式的地図を示す。 実施例３ ｃｏｎｔｉｇ領域のゲノム分析によるＢＲＣＡ２遺伝子座についての候補ｃＤ ＮＡクローンの同定 １．一般的方法 もっともらしい領域の完全なスクリーニング 相当の労働ではあるが、候補ｃＤＮＡを同定する第１の方法では公知の技術を 用いた。該方法は、該ｃｏｎｔｉｇにおいてＰ１およびＢＡＣクローンをスクリ ーニングして推定コーディング配列を同定することを含むものであった。次いで 、推定コーディング配列を含有するクローンを、ｃＤＮＡライブラリーのフィル ター上のプローブとして用いて、さらなる分析用の候補ｃＤＮＡクローンを同定 した。該クローンを、２つの方法のいずれか１つによって、推定コーディング配 列につきスクリーニングした。 分析すべきＰ１クローンを制限酵素で消化して、ヒトＤＮＡをべクターＤＮＡ から遊離させた。該ＤＮＡを、２０ボルトにおいて１６時間、１４ｃｍの０.５ ％アガロースゲル泳動で一晩分離した。ヒトＤＮＡバンドをゲルから切り出し、 ０．５×トリス酢酸緩衝液中にて、１００ボルトで少なくとも２時間、ゲルウェ ッジ から電気溶出させた（Maniatisら、１９８２）。次いで、溶出したＮｏｔ Ｉ消 化ＤＮＡ（−１５ｋｂないし５.０ｋｂ）をＥｃｏＲＩ制限酵素で消化してより 小４さな断片（−０．５ｋｂないし５.０ｋｂ）が得られ、これはＤＮＡを放射 性ヌクレオチドで標識する次の工程で容易に融解する。ヘキサマーランダム起点 標識方法(Boehringer-Mannheim,Cat.＃1004760)によって該ＤＮＡ断片を標識し た。標識したＤＮＡをスペルミン沈殿させ(１００μｌ ＴＥ、５μｌ０．１ Ｍスペルミン、および５μｌの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを添加)、取り込 まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。次いで、標識ＤＮＡを６５゜Ｃに て０.５ＭＮａＣｌ １００μｌに５分間再懸濁し、次いで、製造業者の指示（G ibco/BRL、カタログ番号＃６２７９ＳＡ）に従い、ヒトＣ0ｔ−１ＤＮＡで２− ４時間でブロックした。Ｃ0ｔ−１でブロックしたプローブを、ブロッキング溶 液中、フィルター上で４２゜Ｃにて一晩インキュベートした。該フィルターを２ ×ＳＳＣ）０.１％ＳＤＳ中、室温で３０分間洗浄し、次いで、同緩衝液中、５ ５゜Ｃで３０分間洗浄した。次いで、該フィルターを、増感スクリーンを含むＫ ｏｄａｋＸＡＲ−５フィルムに−７０°Ｃで３日間暴露した。かくして、ブロッ トをインサートからのＥｃｏＲＩ断片のプールとまたは個々に各断片とハイブリ ダイズさせた。 該領域におけるクローンからのヒトＤＮＡを全インサートして、またはＥｃｏ ＲＩ断片として単離し、前記したごとくに標識した。ｃＤＮＡフィルターが０． １×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳのよりストリンジェントな洗浄を６５゜Ｃで３０分 間にて２回受ける以外は同一条件下で、該標識ＤＮＡを用いて種々のｃＤＮＡラ イブラリーのフィルターをスクリーニングした。 我々の実験で今日まで使用したｃＤＮＡライブラリーのほとんど（正常乳房組 織、妊娠８カ月の婦人からの乳房組織および乳房悪性度からのラリブラリー）は Clonetech,Inc.で調製した。８カ月妊娠婦人の乳房組織から生成したｃＤＮＡラ イブラリーはラムダｇｔ−１０ベクター中にて、Clonetech（カタログ番号ＨＬ １０３７ａ）から入手でき、Ｃ６００Ｈｆ１細菌宿主細胞で増殖させる。正常乳 房組織および悪性乳房組織試料は３７歳の白人女性から単離し、各組織１ｇをｍ Ｒ ＮＡプロセッシングおよびｃＤＮＡライブラリー構築のためにClonetechに送っ た。後者の２種のライブラリーはランダムおよびオリゴ−ｄＴ両プライミングを 用いて生成させ、最終産物のサイズを選択し、次いで、これをラムダＺａｐＩＩ ベクターにクローン化し、製造業者によって記載されているごとくに細菌のＸＬ １−ブルーー株中で増殖させた。さらなる組織−特異的ｃＤＮＡライブラリーは 、ヒト胎児脳（Stratagene,カタログ番号、９３６０２６）、ヒト精巣（Clonete chカタログＨＬ３０２4）、ヒト胸腺(C1onetechカログHL1127n)、ヒト脳(C1onet echカタログＨＬ１１８１０)、ヒト胎盤（Clonetechカタログ１０７５ｂ)、およ びヒト骨格筋（ClonetechカタログＨＬ１１２４ｂ）を含む。 該ｃＤＮＡライブラリーをＮＺＣＹＭプレート上でそれらの宿主細胞と共に平 板培養し、フィルターリフトをManiatisら（１９８２）に従って各プレートから 二連で作成した。候補ゲノムクローンからの昆虫（ヒト）ＤＮＡを精製し、高特 異的活性まで放射性標識した。次いで、放射性ＤＮＡをｃＤＮＡフィルターにハ イブリダイズさせて、それらのｃＤＮＡを同定し、これは候補コスミドクローン 内に位置する遺伝子に対応する。この方法によって同定されたｃＤＮＡを拾い、 再度平板培養し、標識クローンインサートまたはその誘導されたＥｃｏＲＩ断片 ＤＮＡで再度スクリーニングして、それらの陽性状態を確認した。次いで、その 第２ラウンドのスクリーニングの後に陽性であったクローンを増殖させ、それら のＤＮＡをサザーンブロット分析および配列決定のために精製した。製造業者か らのプロトコルに記載されているように、ラムダベクターからのプラスミドのイ ン・ビボ切り出しを介して、クローンをプラスミドとして精製するか、あるいは 制限断片としてラムダベクターから単離し、プラスミドベクターにサブクローン した。 サザーンブロット分析は二連で行い、１つはブローブとして元のゲノムインサ ートＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡインサートがハイブリダイズする配列を含有する かを確認した。第２のブロットは最大ｃＤＮＡクローンからのｃＤＮＡインサー トＤＮＡとハイブリダイズさせて、いずれのクローンが同一遺伝子を表すかを同 定した。ゲノムクローンにハイブリダイズし、ユニークである全てのｃＤＮ Ａを配列決定し、該ＤＮＡを分析して、該配列が公知またはユニーク遺伝子を表 すか否かを判断した。ユニークのように見える全てのｃＤＮＡクローンを、候補 ＢＲＣＡ２遺伝子座としてさらに分析した。具体的には、該クローンをノーザン ブロットにハイブリダイズさせて、正常−対−乳房腫瘍ＲＮＡにおいて乳房特異 的発現および異なる発現を探した。また、それらをＢＲＣＡ２領域におけるクロ ーンに対するＰＣＲによって分析してそれらの位置を確認する。遺伝子座の程度 をマップするために、全長ｃＤＮＡを単離し、それらの配列をＹＡＣおよび元の 同定クローンを囲むおよびそれを含むクローン上でＰＣＲプローブとして使用し た。イントロン−エキソン境界を、次いで、配列分析によってさらにはっきりと させた。 我々は、該領域におけるコスミドＢＡＣおよびＰ１クローンからのＥｃｏＲＩ 断片を持つ正常乳房、８カ月妊娠乳房および胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングした。潜在的ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡクローンを３つのラリブラリーの うちから同定した。クローンを拾い、再度平板培養し、元のプローブで再度スク リーニングしてそれらが陽性であることを確認した。 ハイブリッド−選択ｃＤＮＡの分析 プローブＤＮＡに対するサザーンブロットハイブイダイゼーションによって、 直接的選択から得られたｃＤＮＡ断片をチェックして、それらがｃｏｎｔｉｇに 由来することを確認した。このテストをパスしたものを、それらの全体について 、配列決定した。このようにして得られたＤＮＡ配列の組を、次いで、相互に対 して再度チェックして、重複する独立クローンを見つけた。 ｃＤＮＡの直接的選択方法（Loventら、１９９１;Futeral）１９９３）は、 プローブとしてＰ１およびＢＡＣ ＤＮＡを用いて利用する。該プローブＤＮＡ をＨａｅＩＩＩのごとき平滑切断末端制限酵素で消化する。次いで、二本鎖アダ プターを該ＤＮＡに連結し、ビオチン化プライマーを用いる引き続いてのＰＣＲ 増幅反応におけるプライマー用の結合部位として供する。ランダム起点またはオ リゴ（ｄＴ）起点第１鎖の合成、続いての第２鎖の合成によって、組織試料、例 えば乳房組織に由来するｍＲＮＡから、標的ｃＤＮＡを生じさせた。該ｃＤＮＡ 末端を平滑とし、二本鎖アダプターに連結する。これらのアダプターは、ＰＣＲ 用の増幅部位として供する。標的およびプローブ配列を変性させ、ヒトＣ0ｔ− １と混合して各配列をブロックする。サザーンハイブリダイゼーションを行って 、高Ｃ0ｔ−１／２値とし、稀な標的ｃＤＮＡ分子のハイブリダイゼーシヨンを 確実とする。次いで、アニールした物質をアビジンビーズ上に捕獲し、高ストリ ンジェンシーで洗浄し、保持されたｃＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによって増幅する 。分析用のプラスミドベクターへクローニングする前に、ｃＤＮＡをさらなるラ ウンドの富化に付す。 ＨＩＦ島分析 ｃＤＮＡライブラリー上でプローブとして使用するコスミドを同定する方法は ＨＩＦ島分析であった。ＨＩＦ島は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの非常に 高い頻度を含有するＤＮＡのセグメントであり（Tono1ioら、１９９０）、その 認識配列がＣｐＧジヌクレオチドを含む酵素の制限部位をクラスター化すること によって明らかとされる。ＨＩＦ−島分析で有用であることが知られている酵素 はＡｓｃＩ)ＮｏｔＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＥａｇＩ、ＳａｃＩＩ、ＮａｅＩ、Ｎａ ｒＩ、ＳｍａＩ、およびＭｌｕＩである（Anand、 １９９２）。 候補クローンの分析 前記から生じた１以上の候補遺伝子を配列決定し、該情報を各予測される遺伝 子の同定および分類で使用した。ヌクレオチト配列比較によっておよび全てのフ レームにおける翻訳、続いての公知アミノ酸配列との比較によって、ＤＮＡ配列 を公知遺伝子と比較した。これは、局所的および離れた配列データベース（例え ば、GenBank）に対する配列比較については、Genetic Data Environment(GDE)バ ージョン２.２ソフトウェアおよびクライエント／サーバーソフトウェアパッケ ージのBasic Local Alignment Search Tool (Blast)シリーズを用い、Ｓｕｎ ＳＰＡＲＣワークステーションで実行することによって達成された。コスミドお よびＰ１で同定されたｃＤＮＡクローンの収集から再構築された配列が生じた。 新しい配列を表した全ての候補遺伝子をさらに分析して、推定ＢＲＣＡ２遺伝子 座についてのそれらの候補性をテストした。突然変異スクリーニング 罹患血縁において突然変異をスクリーニングするために、２つの異なるアプロ ーチを引き続いて行った。まず、ＢＲＣＡ２の罹患性対立遺伝子を担持すること が知られている家族メンバーから単離されたゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによる候補 遺伝子配列の増幅用の鋳型として使用した。もしＰＣＲプライマーがイントロン ／エキソン境界に隣接しまたはそれと重複するならば、増幅された断片はｃＤＮ Ａ配列から予測されるものよりも大きく、あるいは増幅された混合物に存在しな いであろう。設計されたプライマーの組を用いるＰ１またはＢＡＣクローンのか かる増幅実験および配列決定の組合せによって、イントロン／エキソン構造を確 立し、最終的に家系からのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列を得ることができる。 もし候補遺伝子のイントロン／エキソン構造が複雑であれば、かなり迅速な第 ２のアプローチは、設計されたプライマーの組を用いるＰＣＲ増幅用の基質とし て使用される血縁血液から抽出されたリンパ球ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡか ら増幅された断片を配列決定することを含む。もし候補遺伝子がリンパ球で有意 な程度まで発現されれば、かかる実験は、通常、イントロン／エキソン結合の知 識なくして直接的に配列決定できる増幅断片を生じる。 ゲル電気泳動によってかかる配列決定反応の産物を分析して、欠失または挿入 、あるいはアミノ酸変化または他の有害効果を引き起こす置換のごとき突然変異 を含有する配列中位置を決定した。 乳房で発現されたＢＲＣＡ２領域内のいずれの配列も、ＢＲＣＡ２についての 候補遺伝子であるとみなされる。所与の候補遺伝子がＢＲＣＡ２に対応するとい う強制的証拠は、家系家族が該候補の欠陥対立遺伝子を含有するという証明に由 来する。 ２．特異的方法 ハイブリッド選択 ハイブリッド選択の２つの異なる方法をこの仕事で用いた 。 方法１：ｃＤＮＡ調製および選択 ランダム起点ｃＤＮＡは、乳腺、卵巣、胎児脳および胎盤組織のポリ（Ａ）+ ＲＮＡから、および細胞系Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３７）の全ＲＮＡ から調製した。ｃＤＮＡにホモポリマーをテールし、次いで、従前に記載されて るごとくに、２連続ラウンドの固定化Ｐ１またはＢＡＣ ＤＮＡへのハイブリダ イゼーションにつきハイブリッドを選択した（Parimooら、１９９１：Ｒｏｍｍ ｅｒｎら、１９９４）。２ないし４の重複するＰ１および／またはＢＡＣクロー ンの群を個々の選択実験で使用した。ハイブリダイズするｃＤＮＡを収集し、Ｇ ５０ Fine Sephadexカラムを通し、テールドプライマーを用いて増幅した。次 いで、産物をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルでサイズを選択し、ＲｃｏＲ Ｉで消化し、子ウシアルカリ性フォスファターゼ(Boehringer Mannheim)で処理 してあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)に連結させた。連結産物はコンピ テントＤＨ５αイー・コリ (E．coli)細胞(Life Techno1ogies，Inc.)に形質転 換した。 回収ｃＤＮＡの特徴付け （ゲノムＤＮＡの各２５０キロベースからの）各連結からの２００ないし３０ ０の個々のコロニーを拾い、順序付けおよび貯蔵用のマイクロタイタープレート に格子状に配した。培養を、アンピシリンを含むＬＢ寒天で裏打ちされたHybond Ｎ膜(Amersham)にレプリカ移動させた。コロニーを増殖させ、引き続いて標準的 な手法で溶解させた。ｃＤＮＡクローンの最初の分析は、リボソーム配列用のプ レスクリーニングおよび重複および冗長度の検出用の引き続いての交差スクリー ニンクを含むものであった。 クローンのほぼ１０−２５％は排除した。というのは、それらは全ＲＮＡから 得られた放射性ｃＤＮＡと強力にハブリダイズするからである。プレスクリーニ ングでハイブリダイズしなかった各選択実験からの２５ないし５０クローンから のプラスミドをさらなる分析のために単離した。そのヒト物質としてのみの染色 体１３を含有するハムスターハイブリッド細胞系（ＧＭ１０８９８Ａ）の、出発 クローンのＤＮＡの制限消化物への、およびヒトゲノムＤＮＡへのハイブリダイ ゼーションによって、回収ｃＤＮＡ断片が、個々の出発ゲノムクローン起源であ ることが確認された。該クローンは、暫定的に、ゲノムクローンの重複または非 重複インターバルに基づいて群に帰属させた。テストしたクローンのうち、ほぼ ８５％は出発クローンに適切にマップされた。 方法２（Lovettら、１９９１)；ｃＤＮＡ調製 ヒト乳腺、脳、リンパ球および胃からのポリ（Ａ）富化ＲＮＡを、テールドラ ンダムプライマーＸＮ12 [５’−（ＮＨ2）−ＧＴＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＮ］（配列番号３） およびSuperscript I I 逆転写酵素(Gibco)用いて逆転写した。第２鎖の合成お よび末端仕上げの後、Sepharose CL-4Bカラム(PharmaciaＰｈ)でｄｓ ｃＤＮＡ を精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、それらの５’末端（ｍＲＮＡに対 して５’側）への、 [５’−ＧＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＧＣＣＧＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣＡ −（ＮＨ2）（配列番号５）］ にアニールされた二本鎖オリゴＲＰ ５’−（ＮＨ2）−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡTＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧ ＴＴＣ（配列番号４）］ の連結によって、ＤＮＡを「係留した」。係留されたｃＤＮＡを、次いで、Seph aroseCL-4Bカラム上で再度精製した。 選択 乳腺、脳、リンパ球および胃組織からのｃＤＮＡを、ＲＰ （ＲＰ.Ａ:５’−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡACＧＧＣＣＧＴＣＡＴ）（配 列番号５）および ＸＰＣＲ［５’−（ＰＯ4）−ＧＴＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣ（ 配列番号７）] の入れ子バージョンを用いてまず増幅させ、Sepharose CL-4B上での分画によっ て精製した。選択プローブは、ＨｉｎｄｆｌおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩで の消化によって精製Ｐ１、ＢＡＣまたはＰＡＣから調製した。一本鎖プローブは 製造業者の推奨に従ってホトビオチン(Gibco BRL)で光標識した。プローブ、ｃ ＤＮＡおよびＣｏｔ−１ ＤＮＡは２.４Ｍ ＴＥＡ−ＣＬ、１０ｍＭ ＮａＰＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした ｃＤＮＡをストレプトアビジン−常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ）上に捕獲し、溶出さ せ、ＲＰ ［ＲＰ.Ｂ；５’−(ＰＯ4)−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＧＧ ＣＣＧＴＣＡＴＴＧ（配列番号８）］ およびＸＰＣＲのさらなる入れ子バージョンで再増幅させ、Sepharose CL-6B上 でサイズ選択した。選択し、増幅したｃＤＮＡをプローブおよびＣ0ｔ−１ Ｄ ＮＡのさらなるアリコットとハイブリダイズさせた。捕獲し、溶出させた産物を ＰＲ.ＢおよびＸＰＣＲで再度増幅し、ゲル電気泳動によってサイズ選択し、脱 リン酸化ＨＩｎｃＩＩ 切断ｐＵＣ１８にクローン化した。連結産物をＸＬ２− Ｂｌｕｅ超コンピテント細胞(Stratagene)に形質転換した。 分析 各単一−プローブ選択実験からのほぼ１９２コロニーを、ベクタープライマー を用いるコロニ−ＰＣＲによって増幅させ、二連にてＺｅｔａ Ｐｒｏｂｅ ナ イロンフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にブロットした。ランダム起点Ｃ0ｔ−１ ＤＮＱＡまたはプローブＤＮＡ（Ｐ１、ＢＡＣまたはＰＡＣ）いずれかでの標準 的手法を用いて該フィルターをハイブリダイズさせた。プローブ−陽性Ｃ0ｔ− １陰性クローンを、ＡＢＩ ３７７シーケンサー上でベクタープライマーを用い て両方向で配列決定した。 エキソン トラッピング ＢＡＣ、Ｐ１およびＰＡＣの最小重複セットを用いてエキソン増幅を行って、 ＢＲＣＡ２候補領域から多数の遺伝子を単離した。１−３の重複ゲノムクローン の形態の１００−３００ ｋｂのＤＮＡを含有するゲノムクローンのプールを組 立た。ゲノムクローンをＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩで消化し、ｐＳ ＰＬ３スプライシングベクターのＰｓｔＩまたはＢａｍＨＩ部位に連結した。エ キソン増幅技術を行い（Cheurchら、１９９３）、Uracil DNA Glycosylateクロ ーニングシステム（ＢＲＬ）からのｐＡＭＰ１プラスミドにおいて末端産物をク ローン化した。ほぼ６０００クローンを拾い、９６ウェルプレートで増殖させ、 フィルターにスタンプし、ハイブリダイゼーションによってベクターおよび反復 配列 の存在につき分析した。各クローンインサートをＰＣＲ増幅し、エキソンのグリ ッドへのハイブリダイゼーションおよび親ゲノムＤＮＡのドットブロットによっ て冗長度、位置決めおよびヒト特異性につきテストした。ユニーク候補エキソン を配列決定し、データベースに対してサーチし、ｃＤＮＡライブラリーへのハイ ブリダイゼーションで使用した。 ５’ＲＡＣＥ ビオチン捕獲ＲＡＣＥと呼ばれる修飾されたＲＡＣＥプロトコルによってＢＲ ＣＡ２の５’末端を同定した。ヒト乳腺および胸腺からのポリ（Ａ）富化ＲＮＡ を、テールドランダムプライマーＸＮ12 [５’（ＮＨ2）−ＧＴＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮ（配列番号３）］ およびSuperscriptＩＩ逆転写酵素(Gibco BRL)を用いて逆転写した。RNA鎖をＮ ａＯＨ中で加水分解し、Sepharose CL-4B(Pharmacia)上の分画によつて第１鎖ｃ ＤＮＡを精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて７ｂｐランダム５’突出を持 つ二本鎖オリゴ ［dｓ ＵＣＡ: ５’−（ＰＯ4）−ＧＴＧＡＣＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣＧＣＧ ＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡ（配列番号１０）］にアニールした５’−ＣＣＴＴＣＡ ＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＧＴＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮ−（ＮＨ2）（配列 番号９）］ のそれらの３’末端への連結によって第１鎖ｃＤＮＡを「係留」した。連結後、 Sepharose CL-4B上の分画によって係留ｃＤＮＡを再度精製した。ビオチン化逆 方向プライマー［５’−（Ｂ）−ＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣ ＡＣＴＡ］（配列番号１１）およびＵＣＡの入れ子バージョン［ＵＣＰ.Ａ:５’ −ＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧ（配列番号１２）]を用いてＢＲＣ Ａ２の５’末端を増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分画し、ゲル精製 し、ストレプトアビジン−常磁性粒子（Ｄｙｎａｌ)上に捕獲した。捕獲ｃＤＮ Ａを、入れ子逆方向プライマー［５’−ＧＴＴＣＧＴＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴ ＴＡＴＧＴＴＣＡＧ］（配列番号１３）およびＵＣＡのさらなる入れ子バージョ ン[ＵＣ Ｐ．Ｂ ５’−ＣＣＴＴＣＡＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＧ]（配列番号１ ４）を用いて捕獲ｃＤＮＡを再度増幅した。このＰＣＲ反応はアガロースゲル上 の単一の鋭いバンドを与えた；該ＤＮＡをゲル精製し、ＡＢＩ ３７７シーケン サー上で両方向にて配列決定した。 ｃＤＮＡクローン ヒトｃＤＮＡライブラリーを32Ｐ−標識ハイブリッド選択またはエキソン捕獲 クローンでスクリーニングした。三次プラークから溶出したファージをベクター −特異的プライマーてＰＣＲ増幅し、次いで、ＡＢＩ ３７７シーケンサーで配 列決定した。 ノーザンブロット 多数のヒト組織から由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡのレーン当たり２μｇで負荷 した多重組織ノーザン（ＭＩＮ）フィルターはClonetechから購入した。回収ｃ ＤＮＡ ＧＴ ７１３（ＢＲＣＡ２エキソン３−７）、λ ｗＣＰＦ１Ｂ８．１ （エンソン２０へのエキソン１１の３’末端)、およびグルセルアルデヒド−３ −リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対応する32Ｐ−ランダム−プライマ ー標識プローブを用いてフィルターをプローブした。プレハイブリダイゼーショ ンは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５×デンハルトの混合 物、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡおよび２μｇ／ｍｌ ポリ（Ａ）中、 ４２゜Ｃにおけるものであった。ハイブリダイゼーションは、４％までのデキス トラン硫酸およびプローブを添加した同一溶液中におけるものであった。ストリ ンジエンシー洗浄は、５０°Ｃにおける０.１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にお けるものであった。 ＲＴ−ＰＣＲ分析 ５つのヒト乳癌細胞系（ＺＲ−７５−１、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ 、ＭＤＡ−ＭＢ４６８およびＢＴ−２０）および３つのヒト前立腺癌細胞系（Ｌ ＮＣａＰ）ＤＵ１４５およびＰＣ−3）（Claude Labrie博士、CHUL Research Ce nterによって供給されたＲＮＡ）から抽出された全ＲＮＡ１０μｇは、プライマ ーｍＨ２０−ＩＤ０５＃ＲＡ ［５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＣ］（配列番号１５） およびSuperscript II逆転写酵素(Gibco BRL)を用いて逆転写した。しかる後、 プライマーＣＧ０２６＃ＦＢ： [５’−ＧＴＧＣＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧ］（配列番号１６ ）およびｍＨ２０−ＩＤ０５＃ＲＡ（これは、エキソン１１へのエキソン７／８ 結合からの島ホップに対して用いたプライマー対である；ＰＣＲ産物は約１.５ ５ｋｂである）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物は１.２％アガ ロースゲル上で分画した。 ＰＣＲ増幅および突然変異スクリーニング ＢＲＣＡ２の全ての２６コーディングエキソンおよびそれらの関連するスプラ イス部位を、記載されているごとくにゲノムＤＮＡから増幅した（Kambら、１９ ９４ｂ）。プライマーのＤＮＡ配列（そのうちいくつかは増幅および配列決定で 用いたフランキングイントロン配列に存在する）は表２に出現する。エキソンの いくつかは（２ないし１０、１１−５、１１−６、１１−７および２３ないし２ ７）は、単一工程方法によって増幅した。これらのエキソンについてのＰＣＲ条 件は：９５゜Ｃの単一の変性工程（１分間）；４０サイクルの９６゜Ｃ（６秒間 ）、Ｔann．＝５５゜Ｃ（１５秒間）、７２゜Ｃ（１分間）であった。他のエキ ソン（１１−２２）は一次プラスマーＰＣＲ反応後に入れ子再増幅を必要とした 。これらのケースにおいて、最初の増幅は前記したごとく表２の最初の２欄にお けるプライマーにて１９サイクルで行った。これらのエキソンについての入れ子 再増幅は、表２の第３欄に現れるプライマーにて同一条件において２８または３ ２サイクルの間行った。緩衝液条件は記載されているものであった（Kambら、１ ９９４ｂ）。Ｑiaexビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて産物を０.８％アガロースゲル から精製した。精製産物を、Ａｍｐｌｉ−ＣｙｃｌｅTM配列決定キット（Perkin Elmer,Branchburg、ＮＪ）を用いるα−Ｐ32 ｄＡＴＰでのサイクル配列決定 によって分析した。６％ポリアクリルアミドゲル上で反応産物を分画した。全て の（Ａ）反応は相互に隣接して負荷し、続いて（Ｃ）反応等を行った。多形の検 出は、肉眼で行い、他の鎖について確認した。 実施例４ ＢＲＣＡ２の同定 全長ＢＲＣＡ２配列の組立 増幅用の鋳型としてｃＤＮＡを用い、ハイブリッド選択、エキソン捕獲、ｃＤ ＮＡライブラリースクリーニング、ゲノム配列決定、およびＰＣＲ実験から得ら れたいくつかのより小さい配列を組み合せることによって、ＢＲＣＡ２Ｃの全長 配列を組立た（すなわち、「島ホッピング」）（図２）。予測される翻訳スター ト部位を含めたｍＲＮＡの極端５’末端を、修飾された５’ＲＡＣＥプロトコル によって同定した（Stoneら、１９９５）。配列における最初のヌクレオチド（ ヌクレオチド１）は、非鋳型Ｇである（ｍＲＮＡキャップが当該配列に含まれる 指標）。ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡの内部に位置したエキソンの１つ（エキソン１１ ）はほぼ５ｋｂである。公開ドメイン（ｆｔｐ：／／ゲノム、ｗｕｓｔｌ.ｅｄ ｕ／ｐｕｂ／ｇｓｃｌ／ｂｒｃａ）におけるおおまか９００ｂｋのゲノム配列の 分析によって、エキソン１１の一部を同定した。このゲノム配列は、１６０配列 ｃｏｎｔｉｇの組に我々によって決定されたゲノム配列と縮合させた。縮合ゲノ ム配列をオープンリーブングフレーム（ＯＲＦ）につき走査すると、長ＯＲＦに わたるほぼ６ｋｂの隣接ストレッチが同定された。２つの従前に同定されている 候補遺伝子断片にての島ホッピング実験によってこの配列を一緒に連結した。現 行複合ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡ配列は１１，３８５ｂｐからなるが、、ポリアデニル 化シグナルまたはポリ（Ａ）テールを含まない。このｃＤＮＡ配列を配列番号１ および図３に示す。 ＢＲＣＡ２遺伝子およびＢＲＣＡ２ポリペプチドの構造 ｃＤＮＡの仮説翻訳は、ヌクレオチド２２９で始まリ、３４１８アミノ酸の予 測蛋白質をコードするＯＲＦを明らかとした。該ペプチドは配列組成とは別の他 の蛋白質に対する識別できる同様性を担持しない。アミノ末端にはシグナル配列 はなく、明らかな膜貫通領域はない。ＢＲＣＡ１と同様に、ＢＲＣＡ２蛋白質は 大いに荷電している。残基のほぼ１／４は酸性または塩基性であった。 ｃＤＮＡおよびゲノム配列の比較によってＢＲＣＡ２遺伝子構造を決定した。 ＢＲＣＡ２は、ほぼ７０ｋｂのゲノムＤＮＡにわたって分布した２７エキソンか らなる。上流に伸びるＢＲＣＡ２の５’末端におけるＣｐＧ−リッチ領域は、Ｇ ｐＧ「島」としばしば関連する調節シグナルの存在を示唆する。サザーンブロッ ト実験に基づくと、ＢＲＣＡ２Ｃはユニークであるらしく、ヒトゲノムにおいて 近いホモローグはない。 ＢＲＣＡ２の発現実験 ヒト複数組織ノーザンフィルターに対する標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーシ ョンは、精巣のみで検出可能であった１１−１２ｋｂ転写体を明らかとした。こ の転写体のサイズは、ＢＲＣＡ２ ｍＲＮＡ配列は我々の複合ｃＤＮＡから失わ れたものはほとんどないことを示唆する。ノーザンフィルターは乳腺ＲＮＡは含 まないので、ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ実験は、５つの乳房お よび３つの前立腺癌細胞系ＲＮＡで行った。全ての系は陽性シグナルを生じた。 加えて、ＢＲＣＡ２アンプリコン（１−ＢｒＣＧ２０６→５ｋｂ）および５’Ｒ ＡＣＥのＰＣＲを用いて、増幅用の鋳型としての乳腺および胸腺ｃＤＮＡを比較 した。両方の場合において、産物は胸腺からよりも乳房からより効率的に増幅し た。 ＢＲＣＡ２における生殖系突然変異 １８の推定ＢＲＣＡ２家系からの個体を、ＤＮＡ配列決定分析によってＢＲＣ Ａ２生殖系突然変異につきスクリーニングした（Woosterら、１９９４）。１２ の家系は男性乳癌の少なくとも１つのケースを有し、４つの家系は２以上のケー スを有し；および４つの家系は連鎖ＢＲＣＡ２ハプロタイプを有する卵巣癌に罹 患した少なくとも１つの個体を含む。１８家系の各々は、少なくとも６９％のＢ ＲＣＡ２突然変異を有する事後確率を有し、９つの家系は９０％を超える事後確 率を有する。これらの組合せた確率に基くと、１８家系のうち１６は、ＢＲＣＡ ２突然変異を分離すると予測される。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、９つ の家系からの複数個体において、全コーディンク配列および関連するスプライス 結合を突然変異につきスクリーニンクした（表３）。残存する９つの家系からの 個体は、ゲノムＤＮＡのみを用いて突然変異につきスクリーニングした。これら の後 者のスクリーニング実験は、コーディング配列（エキソン１５を除く全てのエキ ソン）の９９％およびスプライス結合の２つの除く全てを含むものであった。 配列改変は１８家系のうち９家系で同定された。１つを除く全ては、リーディ ングフレームを改変するヌクレオチド欠失を含み、予測されたＢＲＣＡ２蛋白質 の切形に導く。１つの例外は、３つのヌクレオチドの欠失を含有した（家系１０ １９）。全ての９つの突然変異は相互に異なった。 家系のサブセットは、転写体喪失につきテストした。ｃＤＮＡ試料は９つの家 系の群で入手可能であった、該群における９つの家系のうち３つは、フレームシ フト突然変異を有した。ゲノムＤＮＡでヘテロ接合性であることが知られている 特異的多形部位は、家系個体からのｃＤＮＡで調べた。これらの多形部位におけ るヘミ接合性の出現は、ｍＲＮＡレベルの減少に導く突然変異のための証拠と解 釈された。検出可能な配列改変を持たない６ケースのうちただ１つ（家系２３６ ７）において、かかる調節突然変異が推定された。加えて、フレームシフト突然 変異を持つ３つの家系のうち１つ（家系２０４４）は、転写体喪失の徴候を呈し た。これは、ＢＲＣＡ２コーディング配列におけるいくつかの突然変異は、蛋白 質配列を破壊するに加えて、転写体を脱安定化させる可能性があることを意味す る。かかる突然変異はＢＲＣＡ１で観察されている（Friedmanら、１９９５）。 かくして、家系（１０ないし１８）の５６％は、改変ＢＲＣＡ２遺伝子を含有し た。 癌におけるＢＲＣＡ２の役割 現在までに同定されているほとんどの腫瘍サプレッサー遺伝子は、機能が存在 しない、非機能的または機能が低下した蛋白質産物を生起する。ＴＰ５３突然変 異の大部分はミスセンスであり；これらのうちのいくつかは、野生型産物の機能 に干渉する異常ｐ５３分子を生じることが示されている（Shaulianら、１９９１ ２；Srivastavaら、１９９３）。作用の同様の優性陰性メカニズムは、切形分子 を生じるいくつかの腺腫ポリポシス・コリ（polyposiscoli）（ＡＰＣ）対立遺 伝子（Sｕら、１９９３）、および蛋白質のＤＮＡ結合を改変するＷｉｌｍ腫瘍 遺伝子（ＷＴ１）における点突然変異を提案している（Littleら、１９９３）。 ＢＲＣＡ２コーディング配列で観察された突然変異の性質は、優性陰性蛋白質ま たは非機能的蛋白質の産生に合致する。実施例５ ＢＲＣＡ２遺伝子の分析 ＢＲＣＡ２遺伝子の構造および機能は、以下の方法に従って決定した。 生物学的実験 ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡを含有する哺乳動物発現ベクターを構築し、当該遺伝子 における病巣を持つ適当な乳房カルシノーマ細胞にトランスフェクトした。野生 型ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡならびに改変ＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡを利用する。改変Ｎ ＲＣＡ２ ｃＤＮＡは、改変ＢＲＣＡ２対立遺伝子から得ることができ、後記す るごとくに生産した。培養における（例えば、細胞形態、倍化時間、器壁依存性 増殖）および動物における（例えば、腫瘍原性）表現型復帰変異を調べる。該実 験は、当該遺伝子の野生型および突然変異体形態（セクションＢ）を使用する。 分子遺伝学実験 イン・ビトロ突然変異誘発を行って、欠失突然変異体およびミスセンス突然変 異体を構築する（個体コドンにおける単一塩基対置換およびクラスター荷電→ア ラニン走査突然変異誘発による）。該突然変異体を生物学的、生化学および生物 物理学実験で使用する。 メカニズム実験 公知および未知ＤＮＡ配列に結合するＢＲＣＡ２蛋白質の能力を調べる。プロ モーターをトランス活性化するその能力は、哺乳動物細胞における一過性レポー ター発現系によって分析する。粒子−捕獲および酵母２−ハイブリッド系のごと き常法手法を用いて、いずれかの機能的パートナーを見出し、同定する。パート ナーの性質および機能を特徴付ける。今度は、これらのパートナーは薬物発見の ための標的である。 構造実験 組換え蛋白質はイー・コリ、酵母、昆虫および／または哺乳動物細胞で産生さ せ、これを結晶学的およびＮＭＲ実験で使用する。蛋白質の分子モデリングも使 用する。これらの実験は構造−駆動薬物設計を容易とする。実施例６ 試料においてＢＲＣＡ２の存在を検出するための２工程アッセイ Antonarakisら（１９８５）によって開示されている方法に従って患者試料を 加工し、１％アガローカゲルを通して分離し、サザーンブロット分析のためにナ イロン膜に移す。ＧＳ Gene Linker(Bio-Rad)を用い、１５０ｍＪにて、膜をＵ Ｖ架橋結合させる。図３に示した配列から選択したＢＲＣＡ２ＡプローブをｐＴ Ｚ１８Ｕにサブクローンする。Ｍ１３Ｋ０７へルパーファージ（Bio-Rad、リッ チモンド、ＣＡ）で感染させたイー・コリＭＶ１１９０にファゲミド(phagemid) を形質転換する。標準的な手法（Sambrookら、１９８９参照）に従って一本鎖Ｄ ＮＡを単離する。 ０.５Ｍ ＮａＰＯ4中の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で、６５゜ Ｃにて、ブロットを１５−３０分間プレハイブリダイズさせる。該方法に続いて Nguyenら、１９９２に記載されている方法を行う。２５−３０ｎｇ／ｍｌ−本鎖 標準プローブＤＮＡを含む７％ ＳＤＳ、０.５Ｍ ＮａＰＯ4中、６５゜Ｃにて 、ロットを一晩ハイブリダイズさせる。ポストハイブリダイゼーション洗浄は、 ６５゜Ｃにおける５％ＳＤＳ、４０ｍＭ ＮａＰＯ4中での２回の３０分間洗浄 、続いての１％ＳＤＳ、４０ｍＭ ＮａＰＯ4中での２回の３０分間洗浄よりな るものであった。 次に、ブロットを室温にて５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）です すぎ、室温にて、３０−６０分間、ＰＢＳ中の０.２％カゼインと共に３０−６ ０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で５分間すすぐ。次いで、６Ｍ尿素、０.３ Ｍ ＮａＣｌおよび５×デンハルト溶液よりなるハイブリダイゼーション緩衝液 にて、４５゜Ｃの震盪水浴中、ブロットを５−１０分間プレインキュベートする (Sambrookら、１９８９）。緩衝液を除去し、５０−７５μｌ／ｃｍ2の新鮮なハ イブリダイゼーション緩衝液＋ユニバーサルプライマー部位（ＵＰ−ＡＰ、Bio- Rad)に相補的なヌクレオチド配列との２.５ｎＭ共有結合架橋オリゴヌクレオチ ド−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートで置き換える。４５゜Ｃにて、ブ ロットを２０−３０分間ハイブリダイズさせ、４５゜Ｃにおいて、６Ｍ素、１ ×標準生理食塩水クエン酸塩（ＳＳＣ)、０．１％ＳＤＳ中での２回の１０分間 の洗浄および１×ＳＳＣ、０．１％トリトン Ｘ−１００中の１回の１０分間の 洗浄としてブロットをインキュベートする。ブロットを室温にて１×ＳＳＣで１ ０分間すすぐ。 ０．１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０２％アジ化ナトリウ ム、ｐＨ１０.０からなる基質緩衝液中、震盪しつつ、ブロットを室温にて１０ 分間インキュベートする。基質緩衝液および０．２ｍＭ ＡＭＰＰＤ （３−（ ２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ） フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩、Bio-Rad)を含むヒートシー ル可能バッグに個々のブロットを入れる。震盪しつつ室温で２０分間インキュベ ーションした後、過剰のＡＭＰＰＤ溶液を除去する。ブロットをＸ−線フィルム に一晩暴露する。陽性バンドはＢＲＣＡ２の存在を示す。 実施例７ ＢＲＣＡ２に対するポリクローナル抗体の作成 ＢＲＣＡ２コーディング配列のセグメントをイー・コリにおいて融合蛋白質と して発現させる。過剰発現蛋白質をゲル溶出によって精製し、これを用いて、Ha rlowおよびLane、１９８８によって記載されているものと同様の手法を用いてウ サギおよびマウスを免疫化する。この手法は、種々の他の蛋白質に対してＡｂを 生じることが示されている（例えば、Kraemerら、１９９３参照）。 略言すると、図３で示される配列から選択したＢＲＣＡ２コーディング配列の ストレッチを、プラスミドＰＥＴ５Ａにおいて融合蛋白質としてクローン化する （Novagen，Inc.，マジソン、ＷI）。ＩＰＴＧでの誘導の後、予測される分子量 を持つ融合蛋白質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認する。融合蛋白質 を電気泳動によってゲルから精製する。Ｎ−末端における蛋白質配列決定によっ て、ＢＲＣＡ２融合産物としての蛋白質の同定を確認する。次に、精製蛋白質を ウサギにおいて免疫源として使用する。フロイントの完全アジュバント中、１０ ０μｇの蛋白質でウサギを免疫化し、最初フロイントの不完全アジュバント中の 免疫源１００μｇ、続いてＰＢＳ中の免疫源１００μｇにて、３週間間隔にて２ 回ブースター注射する。血清を含有する抗体をその後２週間収集する。 この手法を反復して、ＢＲＣＡ２遺伝子の突然変異体形態に対する抗体を得る 。野生型ＢＲＣＡ２に対する抗体と組み合わせて、これらの抗体を用いて、種々 の組織および生物学的流体における突然変異体形態の存在および相対的レベルを 検出する。 実施例８ ＢＲＣＡ２に特異的なモノクローナル抗体の作成 モノクローナル抗体は以下のプロトコルに従って作成する。良く知られている ようにグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてキイホールリンペットヘモシア ニンにコンジュゲートさせた無傷ＢＲＣＡ２またはＢＲＣＡ２ペプチド（野生型 および突然変異体）を含む免疫源でマウスで免疫化する。 免疫源をアジュバントと混合する。各マウスには、１０ないし１００μｇの免 疫源の４回の注射を摂取させ、第４回目の注射の後、血液試料をマウスから採取 して、血清が免疫源に対する抗体を含有するか否かを決定する。血清力価はＥＬ ＩＳＡまたはＲＩＡによって測定する。免疫源に対する抗体の存在を示す血清を 持つマウスを、ハイブリドーマ産物につき選択する。 脾臓を免疫マウスから摘出し、単一細胞懸濁液を調製する（Har1owおよびLane .１９８８参照）。細胞融合は、KohlerおよびMilstein、１９７５によって実質 的に記載されているごとくに行う。略言すると、HarlowおよびLane、１９８８に 記載されているごとくにポリエチレングリコールを用い、Ｐ３.６５.３骨髄腫細 胞(American Type Culture Collection，ロックビル、ＭＤ）を免疫脾臓細胞と 融合させる。９６ウェル培養プレート中、２×１０5細胞／ウェルの密度にて細 胞を平板培養する。個々のウェルを増殖につき調べ、野生型または突然変異体Ｂ ＲＣＡ２標的蛋白質を用い、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、増殖したウェル の上清をＢＲＣＡ２特異的抗体の存在につきテストする。陽性ウェル中の細胞を 増殖させ、サブクローンしてモノクローナル性を確立し、確認する。 所望の特異性を持つクローンを増殖させ、マウスにおいて腹水としてまたは中 空繊維系において生育させて、特徴付けおよびアッセイ開発用の十分量の抗体を 得る。 実施例９ ＢＲＣＡ２についてのサンドイッチアッセイ プレート、チューブ、ビーズまたは粒子のごとき固体表面にモノクローナル抗 体を付着させる。好ましくは、抗体を９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル 表面に付着させる。ＢＲＣＡ２ぺプチド／蛋白質（野生型または突然変異体）を 含有する１００μｌ試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）を固相抗体に添 加する。試料を室温で２時間インキュベートする。次に、試料流体をデカントし 、固相を緩衝液で洗浄して未結合物質を除去する。（ＢＲＣＡ２ぺプチド／蛋白 質上の抗原決定基に対する）第２のモノクローナル抗体１００μｌを固相に添加 する。この抗体をディテクター分子（例えば、125Ｉ、酵素、蛍光体または色原 体）で標識し、第２抗体を持つ固相を室温で２時間インキュベートする。第２の 抗体をデカントし、固相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。 試料に存在するＢＲＣＡ２ペプチド／蛋白質の量に比例する結合標識の量を定 量する。野生型ＢＲＣＡ２に特異的なモノクローナル抗体ならびにＢＲＣＡ２で 同定された突然変異の各々に特異的なモノクローナル抗体を用いて別のアッセイ を行う。 実施例１０ 乳癌に罹患したアシケナズユダヤ人婦人に共通な６１７４ｄｅｌＴ突然変異 ６１７４ｄｅｌＴ突然変異（表３参照）は、乳癌を有するアシケナズユダヤ人 婦人の多くの場合に存在することが判明している（Neuhausenら、１９９６）。 ＃発端者の２群は、この実験についての確認よりなるものであった。最初の群は 開始の年齢および陽性家族履歴両者に基づいて確認した。最初の群は、乳癌の家 族履歴の有り無しを問わず４１歳以前に乳癌に罹患した発端者よりなるものであ っ た。第２の群に含ませる基準は、発端者が、５０歳以下で乳癌または卵巣癌に罹 患した１人以上の一親等親族がいる４１および５１歳の間の乳癌に罹患している もの；あるいは発端者が、５０歳以前に乳癌または卵巣癌に罹患した２人以上の 二親等親族がいる４１および５１歳の間の乳癌に罹患していること；あるいは発 端者が、一次乳癌および一次卵巣癌双方を持つ４１および５１歳の間で罹患して いることであった。発端者は、医療腫瘍学および遺伝子カウンセリングクリニッ クを介して確認し、全ての適当な患者に研究参画を供するように努力した。家族 履歴は、自己−報告アンケートによって得た。診断の組織学的確認は、全てのケ ースにおいて発端者につき得た。宗教的背景は、自己報告またはインタビューに よって全ての発端者に対して確認した。 突然変異検出 ＢＲＣＡ２ ６１７４ｄｅｌＴ突然変異は、標準的ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）手法（Saikiら、１９８５； Mullisら、１９８６；WeberおよびMay，１９ ８９）に従い、各患者からのゲノムＤＮＡを増幅することによって検出した。Ｐ ＣＲで使用したプライマーは、 ＢＣ１１−ＲＰ：ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＧＴＣＡＧＴＣ（配列番号： １１５）（順方向プライマー）および ＢＣ１１−ＬＰ：ＴＴＴＧＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＡＴＡＣＣ（配列番 号：１１６）（逆方向プライマー） である。反応は、２０ｎｇ ＤＮＡを含有する１０.０μｌの合計容量で行い、 ５５゜Ｃでアニールした。この手法は、野生型試料において９７ｂｐ長さの、６ １７４ｄｅｌＴ突然変異が存在する場合は９６ｂｐの長さのＰＣＲ産物を生じる 。放射性標識ＰＣＲ産物は、６５Ｗにて２時間、標準６％ポリアクリルアミド変 性配列決定ゲル上の電気泳動に付した。次いで、ゲルを乾燥し、オートラジオグ ラフィーに付した。１ｂｐ欠失を呈する全てのケースを配列決定して、６１７４ ｄｅｌＴ突然変異を確認した。配列決定では、試料の半分を１組のＰＣＲプライ マーで増幅し、コーディング鎖を配列決定し、試料の他の半分は第２組のＰＣＲ プライマーで増幅し、非コーディング鎖を配列決定した。１の組のＰＣＲプライ マー は、 ＴＤ−ＳＦＢ：ＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＡＧＣＡＣＧＣ（配列番号：１１７ ）（順方向プライマー）および ＣＧＯＲＦ−ＲＨ：ＧＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＣＧＴＴＡＣＴ（配列番号：１１ ８）（逆方向プライマー） であった。この結果、野生型において３４２ｂｐの、６１７４ｄｅｌＴ突然変異 を含有する試料につき３４１ｂｐの増幅産物が得られた。この組の試料について は、配列決定プライマーのためのＣＧＯＲＦ−ＲＨプライマーを用い、増幅ＤＮ Ａを配列決定した。試料の他の半分は、ＢＣ１１−ＲＰ順方向プライマーおよび ＣＧＯＲＦ−ＲＨ逆方向プライマーを用いて増幅し、野生型試料で１８３ｂｐの 、６１７４ｄｅｌＴ突然変異を含有する試料で１８２ｂｐの断片が得られた。こ れを、配列決定プライマーとしてＢＣ１１−ＲＰを用いて配列決定した。 結果 ４２歳前の乳癌を持つアシケナズユダヤ人家系の１８人の婦人の内６人は６１ ７４ｄｅｌＴ突然変異を有していた。これは、４２歳前に乳癌を有した非ユダヤ 人婦人の対照群に突然変異が存在するゼロケースに匹敵する。これらのケースは 、家族履歴に関することなく確認された。表４は、研究の結果を示す。６１７４ ｄｅｌＴ突然変異を持つ６つのケースのうち４つは、一親等または二親等親族に おいて乳癌または卵巣癌の家族履歴を有していた。複数試料が分析のために入手 可能である２つの各家系において、６１７４ｄｅｌＴ突然変異は乳癌または卵巣 癌の２以上のケースと共分離した。４２−５０歳で乳癌を持ち、および乳癌また は卵巣癌に罹患した少なくとも１つのさらなる親族の履歴をつ２７人のアシケナ ジムの第２のコホートは、６１７４ｄｅｌＴ突然変異の頻度のさらなる見積もり を供した。２７人婦人のこの群において、２人はＢＲＣＡ２ ６１７４ｄｅｌＴ 突然変異につきへテロ接合性であった。これらの個体のうち１人は、卵巣癌およ び乳癌を共に持つ一親等親族を有していた。示されたデータより、およびＢＲＣ Ａ１突然変異（Offitら、１９９６；Langstonら、１９９６）と同様の浸透度を 仮定し、アシケナジムにおける６１７４ｄｅｌＴ突然変異の頻度は１０００人当 た りほぼ３人であると見積もることができる。しかしながら、もしこの突然変異の 浸透度がＢＲＣＡ１よりも低いと、この突然変異の頻度はより高いであろう。ア シケナズユダヤ人家系の個体における６１７４ｄｅｌＴ突然変異のキァリア頻度 のより正確な見積もりは、大規模な集団研究から出現するであろう。 鍵： a-家族履歴にかかわりなく確めた b-このグループの家族履歴は、乳または卵巣癌と診断された１の一親等または２ の二親等親族、１は５０歳前として定義した 実施例１１ ＢＲＣＡ２は、乳房癌腫ならびに卵巣癌および膵臓癌を含めた他の癌における 低体細胞突然変異率を示す。 ＢＲＣＡ２は腫瘍サプレッサー遺伝子である。この遺伝子のホモ接合欠失は乳 癌ならびに他の癌に至り得る。膵臓異種移植片におけるホモ接合欠失は、ポジシ ョナルクローニングによってＢＲＣＡ２を単離する努力において役立つ。もし１ つのＢＲＣＡ２対立遺伝子の欠如および残りの対立遺伝子における突然変異（へ テロ接合性またはＬＯＨの喪失）があると、癌の結果となり得る。また、両対立 遺伝子における突然変異は、癌の進展に至り得る。ここに研究のために、異なる 癌に由来する１５０細胞系の分析は、ＢＲＣＡ２遺伝子のホモ接合喪失であるケ ースを明らかとしなかった。ホモ接合性喪失が明らかに稀であるゆえに、ＢＲＣ Ａ２における点突然変異のごときより小さい病巣を実験するように研究を行った 。複合突然変異体へテロ接合体および突然変異体ホモ接合体は稀であるので、腫 瘍サプレッサー遺伝子不活化はほとんど常にＬＯＨを含む。残りの対立遺伝子は 、もし不活性であると、典型的には、破壊的突然変異を含有する。これらを同定 するためには、注目する遺伝子座においてＬＯＨを呈する腫瘍または細胞系を予 備選択するのが有用である。 ＬＯＨを呈する腫瘍および細胞系の同定 １０４の一次乳房腫瘍試料の群および２６９の細胞系の組を、ＢＲＣＡ２領域 におけるＬＯＨにつきテストした。一次腫瘍については、蛍光を用いて３つの短 いタンデムリピートマーカー（ＳＴＲ）を定量的に比較した。蛍光的にタッグを 付したＳＴＲの以下の３つの組： （１）ｍＭ４２４７.４Ａ.２Ｆ１ ＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣ （配列番号：１１９） ｍＭ４２４７.４Ａ.２Ｒ２ ＡＧＡＡＡＧＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＧ （配列番号：１２０） （２）ＳＴＲ２５７−ＦＣ ＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧ （配列番号：１２１） ＳＴＲ２５７−ＲＤ ＴＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＧＧ（ 配列番号：１２２） （３）ｍＭＢ５６１Ａ−３.１ＦＡ２ ＧＡＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴ ＧＴＣ（配列番号：１２３） ｍＭＢ５６１Ａ−３．ＩＲＢ ＡＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣ （Ｇ配列番号：１２４） でのＰＣＲによって、ほぼ１０ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅した。ＡＢＩ ３７７ シーケンサーを用いてＰＣＲ産物を解像し、Genescanソフトウェア（ＡＢＩ）で 定量した。腫瘍については、正常および腫瘍試料から増幅した対立遺伝子の間の 明瞭なピーク高差異は、ＬＯＨを有するものとしてスコア取りした。細胞系につ いては、もし１つのＳＴＲがへテロ接合性であると、試料は非−ＬＯＨとしてス コア取りした。１つのケースにおいてのみ、単−塩基多形の後になつての分析に 基づいて誤って呼ばれた細胞系または腫瘍があった。マーカーについてのヘテロ 接合性指標は:ＳＴＲ４２４７＝０.８９；ＳＴＲ２５７＝０.７２；ＳＴＲ５６ １Ａ＝０.８８である（S.Neuhausen、私信；B.Swed1und，未公開データ）。それ らの組み合わせたへテロ接合性指標に基づいて、マーカーが特定の個人（連鎖平 衡を仮定）において全てホモ接合性であるチャンスは、２５０のうち１に過ぎな い。一次腫瘍試料における正常細胞の存在のため、ＬＯＨは、専ら、腫瘍で喪失 した対立遺伝子からのシグナルをほとんど排除しない。むしろ、２つの対立遺伝 子の相対的強度は改変される。これは、正常組織からの対立遺伝子ピーク高を腫 瘍からのピーク高と比較することによって明瞭に観察できる（図５Ａ−５Ｄ）。 この分析に基づいて、３０腫瘍（２９％）はＢＲＣＡ２遺伝子座においてＬＯＨ を有するものとして分類された（図５）。従前の見積もりと同様の図（Col1ins ら、１９９５；C1eton-Jansenら、１９９５）。 ＬＯＨは、異なる方法で、細胞系の組で評価された。全ての３つのＳＴＲのホ モ接合性は不確定であり、かつ正常細胞は存在しないので、全てのＳＴＲにおけ る見掛けのホモ接合性はＢＲＣＡ２領域におけるＬＯＨとして解釈された。この 基準を用い、細胞系の８５／２６９はＬＯＨを呈した（表５）。頻度は、考慮し た 特定の腫瘍細胞型に従って変化した。例えば、４／６卵巣細胞系および３１／６ ２肺癌細胞系は、１７／８１メラノーマ系および２／１１乳癌細胞系と比較して 、ＬＯＨを呈した。 ＬＯＨ一次乳房腫瘍および細胞系の配列分析 ＢＲＣＡ２領域でＬＯＨを示した前記にて同定した３０の一次乳癌は、配列変 異体のためのＤＮＡ配列分析によってスクリーニングした。９５％を超えるコー ディング配列およびスプライス接合を調べた。ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ ３７ ７(App1ied Biosystems Division，Perkin-Elmer)で、または手動で行った。放 射性活性突然変異スクリーニングでは、Ｑｉａｇｅｎビーズ(Qiagen，Inc.)によ って増幅産物を精製した。ＤＮＡ配列は、Cyclist配列決定キット(Stratagene) を用いて生じさせ、６％ポリアクリルアミドゲルで解像した。平行して、Ｔａｑ ＦＳ配列決定キットを用い、蛍光標識色素を用いる非放射性配列決定を行い、続 いてＡＢＩ ３７７シーケンサーで電気泳動を行った。試料を９６−ウェルトレ イに格子状に入れて、ＰＣＲおよび配列決定を容易とした。特定のＰＣＲおよび 配列決定反応の脱落は、＞９５％適用範囲が各試料で得られるまで反復した。配 列情報は、Sequencherソフトウェア(Gene Codes Corporation)で分析した。全て の検出された突然変異は、新しく増幅したＰＣＲ産物を配列決定することによっ て確認して、配列改変がＰＣＲ人工物による可能性排除した。 セルラインおよび原発性乳癌のL0H分析 パーセンテージL0Hは２つの方法： 合計およびパーセンテージの平均（平均）として算出した ３０試料のうち、２つの検体はフレームシフト突然変異を、１つはナンセンス 突然変異を、および２つはミスセンス変化を含んでいた（が、これらの腫瘍のう ち１つはフレームシフトも含んでいた）。ナンセンス突然変異は、Ｃ−末端で１ ５６コドンを欠失し、これは、ＢＲＣＡ２のＣ−末端が腫瘍サプレッサー活性で 重要であることを示唆する。また、全ての配列変異体はこれらの癌キャリアから の対応する正常ＤＮＡで存在した。ＬＯＨについての予備選択が突然変異検出に 対する全体的偏り（例えば、突然変異の優性挙動、複合へテロ接合性）を導入す るというありそうにない可能性を排除するために、ＢＲＣＡ２においてへテロ接 合性であることが示されている１２試料もスクリーニングした。これらのうち３ つは、正常試料でも見出されるミスセンス変化を明らかとした。かくして、４２ 乳癌腫試料の組において（そのうち３０はＢＲＣＡ２遺伝子座でＬＯＨを呈した ）、体細胞突然変異は同定されなかった。フレームシフト突然変異およびナンセ ンス変化は、これらの患者において乳癌の進展に影響する病気素因突然変異であ るらしい。ミスセンス変異体は稀であり；それらは１１５の染色体の分析の間に 、各々、１回観察されたに過ぎなかった。これらのデータから、稀な中性多形お よび病気素因突然変異を区別するのは不可能である。 ＬＯＨを呈した８５の細胞系のうち（表５参照）、５８は配列変化についても スクリーニングした。各試料の９５％を超えるコーディング配列をスクリーニン グした。たった一つのフレームシフト突然変異が、このＤＮＡ配列分析によって 同定された。この突然変異（６１７４ｄｅｌＴ）は膵臓癌細胞系に存在し、ＢＴ １１１-次腫瘍試料で見出されたもの、および従前に検出された生殖系フレーム シフト（Tavtigianら、１９９６）と同一である。これは、この特定のフレーム シフトが比較的普通の生殖系ＢＲＣＡ２突然変異であるらしいことを示唆する。 加えて、多数のミスセンス配列変異体が検出された（表６Ａおよび６Ｂ）。 膵臓腫瘍細胞系における可能な生殖系ＢＲＣＡ２突然変異の検出は、ＢＲＣＡ ２突然変異が膵臓癌の病気素因であり得ることを示唆する（徹底的には究明され ていない確率)。また、この突然変異は、膵臓異種移植片で観察されたホモ接合 性欠失によって従前に示唆されている（Shutteら、１９９５）、散発性膵臓癌に お けるＢＲＣＡ２の関与に重きを加える。３つの膵臓細胞系のみが我々の研究で調 べられたので、膵臓癌におけるＢＲＣＡ２突然変異のさらなる調査が正当化され る。生殖系突然変異がＢＲＣＡ２中で同定された リストはＢＲＣＡ２のGenbankエ ントリーに基く突然変異ポジションである(Schutteら，1995) 共通多形およびサイレント置換はＤＮＡ配列決定によってＢＲＣＡ２中に検出し た。幾つかの稀なサイレント変異型が遺伝子機能に影響し得るため（例えば、ス プライシング(RichardおよびBeckmann,1995))、これらは「PM」に先行させてい ない。示した多形の頻度には第２のヌクレオチド対が含まれる。以前の実験で報 告された頻度を括弧内に示す(Tavtigianら,1996)。数字付けは表６Ａと同様であ る。産業上の利用性 前記したごとく、本発明は、個体のＢＲＣＡ２対立遺伝子をテストするのに使 用される物質および方法ならびに該対立遺伝子の正常または病気素因性質の解釈 を提供する。正常危険性よりも高い個体は、適当には、それらのライフスタイル を修飾し得る。ＢＲＣＡ２の場合では、ほとんどの有意な非遺伝的危険因子は早 期全期間妊娠の保護効果である。従って、危険な婦人は早期子供獲得または設計 された療法が早期全期間妊娠のホルモン効果を刺激すると考慮し得る。高危険度 の婦人は、早期検出を努力し、乳房自己検査を習い実行することが大いに動機付 けられる。かかる婦人は、正規の乳房造影図を得るよう大いに動機付けられ、一 般集団よりも早い年齢で恐らくは開始するであろう。より高い頻度にて卵巣スク リーニングがなされ得る。ＢＲＣＡ２遺伝子座の配列分析に基づく診断方法は、 腫瘍検出および分類に適用し得る。配列分析を用いて、前駆体病巣を診断し得る 。該方法の進歩およびＢＲＣＡ２および他の原因遺伝子座についての情報の蓄積 により、癌を良性および悪性に別けることが可能となる。 乳癌を持つ婦人は、もしそれらが病気素因であり、従って、それらが病気素因 でないというよりむしろ、さらなる癌を有するかも知れなければ、外科手法に従 うことができる。ペプチドまたは小さな分子（合理的薬物デザイン）いずれかを 用い、他の療法を開発し得る。ペプチドは、ミスセンス遺伝子産物それ自体また はミスセンス遺伝子産物の一部であり得る。別法として、治療剤は、有害遺伝子 機能を模擬するもう１つの分子、または受け継いだ遺伝子座の有害効果に逆作用 することを求めるペプチドまたは非ペプチド分子であり得る。また、療法は、有 害対立遺伝子の効果に逆作用する蛋白質を作成させるために、正常ＢＲＣＡ２対 立遺伝子を個体に導入することを介する、遺伝子ベースのものであり得る。これ らの遺伝子療法は、多くの形態を取ることができ、腫瘍が形成されるのを妨げる 、一旦癌が発生したらそれを治癒する、あるいは癌が転移するのを停止させるこ とに向けることができる。 本発明の方法および組成物は、種々の具体例の形態で一体化することができ、 そのうちのいくつかここに開示したにすぎないことは理解されるであろう。他の 具体例が存在し、本発明の精神を逸脱しないことは当業者に明らかであろう。か くして、記載した具体例は例示的なもので、限定的なものと解釈されるべきでは ない。参照のリスト American Cancer Society,Cancer Facts ＆ Figures-1992.(American Cancer So ciety,Atlanta,GA). 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Specifically, the present invention Several mutant alleles are associated with cancer, especially breast cancer in women and men To isolate and detect human cancer predisposition gene (BRCA2) that causes susceptibility The method and materials used. More specifically, the present invention relates to the BRCA2 gene Germline mutations and their use in the diagnosis of predisposition to breast cancer. Further In addition, the present invention provides a somatic mutation in the BRCA2 gene in human breast cancer, and It relates to its use in the diagnosis and prognosis of human breast cancer. In addition, the present invention relates to other Somatic mutations in the BRCA2 gene in human cancers, and diagnosis and And its use in prognosis. The present invention also relates to gene therapy, protein replacement therapy. Mutations in the BRCA2 gene, including methods and protein mimetics It also relates to the treatment of human cancer. In addition, the present invention relates to a screening agent for the treatment of cancer. About Finally, the present invention provides a method for diagnosing a predisposition to breast cancer. It relates to screening of the BRCA2 gene for mutations.   Publications and other materials used herein are for the purpose of describing the background of the invention. Sources, especially where further explanations relevant to the implementation are provided. Are considered part of this specification, and for the sake of simplicity, the author and And by publication year, each grouped in the attached reference list.Background of the Invention   The genetics of cancer is complex, with multiple dominant, positive regulatory genes in the transformed state ( Cancer genes) as well as complex recessive and negative regulatory genes (tumor suppressor genes). 1 More than 00 oncogenes have been characterized. A dozen identified tumor suppressor genes Sa Although not yet, the number is expected to increase to over 50 species (Knudson, 1993) .   The involvement of so many genes is made in cells to maintain the integrity of normal tissue. It emphasizes the complexity of moving growth control mechanisms. This complexity is another way So it is clear. To date, all or even most human cancers have No single gene has been shown to be involved in the disease. The most common oncogene Mutations are found in the H-ras gene found in 10-15% of all solid tumors. (Anderson et al., 1992). The most frequently mutated tumor suppressor genes are The TP53 gene, homozygously deleted in approximately 50% of all tumors examined, And CD homozygously deleted in 46% of the tumor cell lines examined KN2 (Kamb et al., 1994a). For all transformed cells Without a common target, destroy or destroy cancer cells while leaving normal tissue harmless. The dream of "magic bullet" that can be returned seems to be fulfilled Not in Hope for new creation of specifically targeted antitumor drug is cell division Identify tumor suppressor or oncogenes that play a common role in the control of cancer Can take on abilities.   Tumor suppressor genes that have been cloned and characterized include: 1) Retinoblastoma (RB) 1); 2) Wilms tumor (WT1); 3) Li-Fraumeni syndrome (TP53) 4) Familial colorectal gland tumor (APC); 5) Neurofibromatosis type 1 (NF1); 6) Neurofibromatosis type 2 (NF2); 7) von Hippel-Lindau syndrome (VHL) 8) multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A); and 9) melanoma (CD KN2);   There are many genetically mapped but not yet isolated tumor suppressor loci. Endocrine neoplasia type 1 (MEN1); Lynch cancer familial syndrome type 2 (LCFS2) Neuroblastoma (NB); basal cell nevus syndrome (BCNS); -Deman syndrome (BWS); renal cell carcinoma (RCC); tuberous sclerosis type 1 (TSC1 ); And the genes for tuberous sclerosis type 2 (TSC2). Current Tumor suppressor genes characterized by DNA binding protein (WT1), Transcription regulatory gene (RB1), GTP ace activating protein or GAP (NF1 ), Cell constitution Component (NF2), membrane-bound receptor kinase (MEN2A), cell cycle regulation Nodal genes (CDKN2) and known proteins (APC and VHL) With similarity to various protein types, including others without significant similarity Codes things.   In many cases, tumor suppressor genes originally identified through genetic studies Deletion or mutation has been shown in some sporadic tumors . This result indicates that the region of chromosomal aberrations is both a genetic predisposition to cancer and sporadic cancer. It indicates that the location of important tumor suppressor genes involved may be represented.   One of the salient features of several tumor suppressor genes characterized to date First, they are frequently deleted in certain types of cancer. The Deletions are often single allele deletions, so-called heterozygous deletions (LOH ), But may also include heterozygous deletions of both alleles. About LOH Is a pre-existing inherited mutation or a secondary sporadic mutation The remaining allele is non-functional. Imagine.   Breast cancer is one of the most important diseases affecting women. In recent ratios American women have one of eight risks of developing breast cancer by age 95 (American Cancer Society, 1992). In late stage breast cancer treatment Is often useless and ugly, and is an early step in the medical management of the disease. Detection has become very important. Ovarian cancer, albeit less frequently than breast cancer Often die quickly or are the fourth most common cancer death in American women This is a common cause. Genetic factors contributing to uncertain rates of breast cancer incidence are all cases About 5% of cases diagnosed before the age of 40, or approximately 25% of cases diagnosed before age 40 ( Claus et al., 1991). Breast cancer is at an inflection point near age 50 in the age-specific incidence curve. There are two types based on early age onset and late age onset. One Mutation in BRCA1 is thought to be responsible for almost 45% of familial breast cancers. Of at least 80% of family members with both breast and ovarian cancer It is thought to be the cause (Easton et al., 1993).   The BRCA1 gene was mapped in 1990 (Hall et al., 1990; Narod). Et al., 1991) and were isolated after intense efforts (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1994). The second locus, BRCA2, has recently been mapped to chromosome 13 (Wooster et al., 19 94), which appears to be a cause of early onset breast cancer at a rate approximately equal to BRCA1 Nest cancers appear to confer a lower risk. Rest for early-onset breast cancer Susceptibility to unmapped genes for familial cancer and residuals such as TP53 It is divided between the rarer germline mutations in the gene (Malkin et al., 1990). Hair Heterozygous carrier with a defective form of the vasodilator ataxia gene is Higher risk (Swift et al., 1976; Swift et al., 1991). rear Early-onset breast cancer is not as dangerous in proportion as early-onset breast cancer, but It is often familial (Cannon-Albright et al., 1994; Mettlin et al., 1990). However However, the percentage of such cases due to genetic susceptibility is not known. No.   Breast cancer has long been recognized as a partially familial disease (Ande rson, 1972). A vast number of researchers have examined facts about genetic succession, Concludes that it is largely consistent with dominant inheritance for the susceptibility locus or loci (Bishop and Gardner, 1980; Go et al., 1983; Williams and Anderson, 198 4; Bishop et al., 1988; Noewman et al., 1988; Claus et al., 1991). According to recent results, At least three loci carrying susceptibility to breast cancer as well as other cancers Proven to exist. These loci are located at TP on chromosome 17p. 53 loci (Malkin et al., 1990), 17q-linked known as BRCA1 Susceptibility loci (Hall et al., 1990) and the rest unmapped One or more loci to be conferred. Hall et al. (1990) have early age onset Breast Cancer Susceptibility Inherited to a Species Linked to Chromosome 17q21 However, subsequent fruit from this group using a more appropriate genetic model Studies have partially contested the limitation to early age breast cancer (Margaritte et al., 1992). ).   Mostly Cloning Chromosome 13 Linkage-Breast Cancer Predisposition Gene (BRCA2) This strategy requires accurate gene localization experiments. Functional of BRCA2 The simplest model for the role is that BRCA2 alleles predisposing to cancer Recessive to the wild-type allele; ie, at least one wild-type BR Cells containing the CA2 allele are not cancerous; But However, a cell containing one wild-type BRCA2 allele and one predisposition allele. Vesicles are due to random mutations or chromosomal deletions during cell division (unseparated) From the wild-type allele. Suddenly All progeny of the mutant cells lack the wild-type function of BRCA2 and can develop tumors. According to this model, the predisposition allele of BRCA2 is recessive and Fertility is also inherited in a dominant manner: one predisposition allele (and one wild-type versus Women) whose mammary epithelial cells have the wild-type BRCA2 allele. There is a risk of developing cancer because the offspring can be deleted naturally. This model is Cancer suppression, a class of genes that include the cystoma gene and the neurofibromatosis gene Cancer susceptibility loci known as genes or anti-oncogenes Applied to By inference, this model, as recently suggested (Smith Et al., 1992), can explain the BRCA1 function.   The second possibility is that the BRCA2 predisposition allele is truly dominant; The wild-type allele of RCA2 can overcome the oncogenic function of the predisposition allele I can't; Thus, both wild-type and mutant alleles Cells that carry the BRCA2 do not necessarily have to be BRCA2 wild-type cells before they give rise to malignant cells. Would not have deleted the pea. Instead, predisposed individuals Breast cells will cause some other stochastic change (s) leading to cancer .   If the BRCA2 predisposition allele is recessive, the BRCA2 gene Is expected to be expressed in tissues but not functionally in breast cancer You. Conversely, if the BRCA2 predisposition allele is dominant, wild-type B The RCA2 gene may or may not be expressed in normal breast tissue. Can get. However, the predisposition allele appears to be expressed in breast cancer cells.   The BRCA2 chromosome 13 linkage is a multiple-case linkage that was not linked to BRCA1. Separately by investigating 15 families with early-onset breast cancer cases (Wooster et al., 1994). These surveys were defined by 13q12-13. Markers D13S289 and D13, which position BRCA2 in the defined physical area 6 centiMorgan (cM) between 13S267 or approximately 6,000,000 base pairs It claims that the gene is located within a large region. Of these areas The size and their associated uncertainties are important for isolating the BRCA2 gene. Design and implement physical mapping and / or cloning strategies And have made it difficult. Like BRCA1, BRCA2 is an early-onset breast milk for women. It appears to confer a high risk of cancer. However, BRCA2 is male milk It appears to confer an increased risk of cancer, but a substantially increased risk of ovarian cancer (Wooster et al., 1994).   Identification of breast cancer susceptibility loci enables early detection of susceptible individuals, Would greatly increase our ability to understand the initial steps leading to U. Because susceptibility loci often change during tumor progression, Cloning is a better diagnostic and prognostic product, and better It can also be important in developing good cancer therapies.Summary of the Invention   The present invention relates generally to the field of human genetics. Specifically, the present invention Susceptibility to breast cancer in cancer, especially women and men Used to isolate and detect the human breast cancer predisposition gene (BRCA2) that causes Methods and materials. More specifically, the present invention relates to the BRCA2 gene It relates to germline mutations and their use in diagnosing a predisposition to breast cancer. further The present invention relates to somatic mutations in the BRCA2 gene in human breast cancer, and to humans. To its use in the diagnosis and prognosis of breast cancer. In addition, the present invention relates to other sources. Somatic mutations in the BRCA2 gene in cancer and the diagnosis and Regarding its use in prognosis. The present invention also relates to gene therapy, protein replacement therapy. Cancer having a mutation in BRCA2, including cancer and protein mimetics Also related to the treatment of. Further, the present invention relates to the screening of drugs for treating cancer. You. Finally, the present invention relates to mutations that are useful for diagnosing a predisposition to breast cancer. BRCA2 gene screening.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 is a schematic map of STS, P1, BAC and YAC in the BRCA2 region. Is shown.   FIG. 2 shows the cDNA clone used to combine the BRCA2 transcribed sequence, Sequence between hybrid selected clones, cDNA PCR products and genomic sequences -Show spatial relationships; 2-Br-C: RACE is human breast and human thymus cDNA Is a biotin-captured RACE product obtained from both. cDNA clone λ sC713.1 contains a pool of human testis and HepG2 cDNA libraries. Identified by screening with hybrid selected clone GT713 Was. Sequence 1-BR: CG026 → 5 kb is an exon (within λsC713.1) 7/8 Begins at the junction and ends within a hybrid selection clone that is part of exon 11 PCR products. Exon 11 sequence is a published domain And genomic sequences in radioisotope-labeled DNA sequencing gels Corrected by comparison with lid selected clones. Located within that exon Hybrid selected clone (clone name starting with nH or GT) It describes in. cDNA clones λwCBF1B8.1, λwCBF1A5.1, λ wCBF1A5.12, λwCBF1B6.2 and λwCBF1B6.3 Exo pools of mammary gland, placenta, testis and HepG2 cDNA libraries Trapping clones wXBF1B8, wXPF1A5 and wXBF1B 6 and identified by screening. Clone λwCBF1B6.3 Is a chimera (indicated by the dashed line) whose 5 'end is Contains significant duplication. Indicates a translation initiator. Show translation terminator You.   3A-3D show the DNA sequence of the BRCA2 gene (also described in SEQ ID NO: 1). ).   FIG. 4 shows the genomic organization of the BRCA2 gene. Exons (squares and / or Is a vertical line), the genomic sequence (ftp: / /Genome.wust1.edu/pub/gscl/brca;) (horizontal line). each The name of the genome sequence is described on the left side of the figure. Sequence 92M18.00541 and 9 2M18.01289 actually overlaps. Know the distance between other genomic sequences Not. Exon, both in public databases and our database Genomic sequences overlapping with 21 were not included. Exons 1, 11 and 21 Are numbered. The "*" is close enough that it cannot be split on this scale Two adjacent exons are shown.   5A-5D show loss of heterozygosity of primary breast cancer. (LOH) analysis is shown. The STR marker allele is at the bottom of the chromatogram. Show. Shown is one example of a tumor heterozygous form in BRCA2 (FIG. 5A and FIG. 5A). And 5B) and one example of a tumor with LOH in BRCA2 (FIG. 5). C and 5D). The fluorescence units are on the ordinate; the size in base pairs is on the abscissa. You. N is for normal (FIGS. 5A and 5C) and T is for tumor (FIG. 5B and 5D).Detailed description of the invention   The present invention relates generally to the field of human genetics. Specifically, the present invention Susceptibility to breast cancer in cancer, especially women and men Method for isolating and detecting human breast cancer predisposition gene (BRCA2) And materials. More specifically, the present invention relates to the reproductive system in the BRCA2 gene. System mutations and their use in diagnosing a predisposition to breast cancer. In addition, the book The present invention relates to somatic mutations in the BRCA2 gene in human breast cancer and human breast cancer. It relates to its use in the diagnosis and prognosis of cancer. In addition, the present invention relates to other human cancers. Mutations in the BRCA2 Gene in Japan and Diagnosis and Prognosis of Human Cancer Regarding its use in. The present invention also provides gene therapy, protein replacement therapy and Of human cancer having a mutation in BRCA2, including cancer and protein mimetics About treatment. Further, the present invention relates to screening for a drug for treating cancer. Most Later, the present invention relates to mutations that are useful for diagnosing a predisposition to breast cancer. It relates to screening of the BRCA2 gene.   The present invention relates to the entire BRCA2 or mutant BRCA2 locus or Is a portion, preferably at least 8 bases in length and containing up to about 100 kb A polynucleotide is provided. Such a polynucleotide is an antisense polynucleotide. It may be a nucleotide. The present invention also includes such isolated polynucleotides. Recombinant constructs, such as recombinant constructs suitable for expression in transformed host cells. provide.   A polynucleotide comprising a part of the BRCA2 locus in the subject; A method for detecting the expression product is also provided. Further, such a method is described in BRCA2 Amplifying a portion of the locus, and further comprising the BRCA2 locus. Obtaining a series of polynucleotides as primers for amplifying said portion of May be included. The method comprises diagnosing a predisposition to cancer, or diagnosing or Useful for any prognosis.   Also, the present invention provides that at least 5 of the BRCA2 loci are encoded. Isolated antibodies that specifically bind to an isolated polypeptide consisting of Alternatively, a monoclonal antibody is provided.   The present invention also provides a method for detecting a polynucleotide containing a part of the BRCA2 locus. Also provided is a kit for detection in the body, said kit comprising a BRCA sealed in a suitable container. Polynucleotide complementary to a portion of two loci, and for use thereof Including instructions.   In addition, the present invention provides for the polymerization of nucleotides to reduce at least the BRCA2 locus. Preparation of a polynucleotide comprising obtaining a sequence of eight nucleotides Also provided are methods for preparing the polynucleotides by polymerizing amino acids to form BRCA2 Obtaining a sequence containing at least 5 amino acids encoded in the locus Consists of     In addition, the present invention screens the BRCA2 gene to identify mutations You It also provides a way to In addition, such a method can amplify a portion of the BRCA2 locus. And further amplifying said portion of the BRCA2 locus. A step of obtaining a series of polynucleotides that are primers for No. The method is used for either diagnosing a predisposition to cancer or diagnosing or prognosing cancer. To identify mutations.   In addition, the present invention screens for the predicted BRCA2 mutant allele. To identify mutations in the BRCA2 gene.   In addition, the present invention provides a method for screening an agent for treating cancer, and Methods are provided for identifying agents suitable for restoring product function.   Finally, the present invention relates to the generation of gene-based therapeutics directed to cancer cells. Provide a means. This therapeutic agent restores the function of the BRCA2 protein, Insert into an appropriate vector or deliver to target cells in a more direct manner Of a polynucleotide comprising all or part of the BRCA2 locus Can be taken. In addition, the therapeutic agent may include any part or all of the protein sequence of BRCA2. It can also take the form of a polypeptide based on it. These reduce the activity of BRCA2. It can be functionally replaced in vivo.   The BRCA2 locus, which predisposes individuals to breast cancer, encodes the BRCA2 protein. It is a discovery of the present invention that the gene is a mutated gene. In this specification, The gene is called BRCA2. Mutations in the BRCA2 locus in the germline Of the present invention suggests that predisposition to breast cancer in both men and women is there. Finally, somatic mutations in the BRCA2 locus have also been linked to breast and other cancers. It is also important to provide an indicator of the prognosis of these cancers or of these cancers. It is a discovery of the invention. Mutation events at the BRCA2 locus include the coding sequence And deletions, insertions and point mutations within non-coding sequences can be included.   On chromosome 13 of the human genome with an estimated size of about 6,000,000 base pairs Loci eliciting susceptibility to cancer, including breast cancer, starting from the region of And the smaller region of 1,000,000 to 1,500,000 bases was identified.   The region containing the BRCA2 locus was identified using various genetic techniques. the first BRCA2 region by recombination with genetic markers using genetic mapping technology The area was defined. Widely spread family with multiple cases of breast cancer ("kindred") ), The chromosomal region containing the BRCA2 gene was correctly located. The region containing the BRCA2 locus was identified by markers D13S289 and D13S267. Is physically restricted by   By using the genetic markers provided by the present invention, human yeast artificial Regions from chromosome (YAC) or human bacterial artificial chromosome (BAC) libraries A clone covering the target was identified. Also, by doing this, Identified and prepared the more easily manipulated P1 and BAC clones, and It was also possible to construct flanks from a subset of clones. These P1, Y AC and BAC provide the basis for cloning the BRCA2 locus For example, to develop reagents that are effective in diagnosing and treating breast and / or ovarian cancer The basis for is provided. The BRCA2 gene and other potential susceptibility genes It has been isolated from this region. The isolation is performed in the region from P1 and BAC. Software trapping using whole or partial cDNA ( May contain coding exons from adjacent or non-adjacent genomic DNA sequences Method for identifying unique sequences), hybrid selection techniques and direct A cDNA library was screened using indirect screening. Using these methods, sequences of loci expressed in breast and other tissues can be sequenced. Obtained. These candidate loci were analyzed to identify sequences that confer cancer susceptibility. The present inventors have found that chromosome 13 linkage known as BRCA2- Mutation in the coding sequence of the BRCA2 locus in the family Found that there is. The present invention relates to the early development of certain cancers that are critical to patient survival. Not only facilitate the detection of cancer, but also detect susceptible individuals before they develop cancer. Can also be.Collective resources   Large, well-reported Utah ancestry provides good resources for human genetics research It is extremely important in doing so. Each large ancestry independently has a BRCA in its family. Provides the ability to detect if the two susceptibility alleles are segregated. BRCA Recombinants useful for locating and isolating the two loci include the presence of susceptible alleles Could only be obtained from families large enough to confirm. The large sibs are The penetrance of the BRCA2 sensitive allele was reduced by both age and gender. To find useful and useful siblings, making it extremely important to study breast cancer. It is important. Large sibs are from kin haplotypes close to the deceased individual Essential for building haplotypes of individuals who have died by inference.   Although other populations can provide useful information, such studies are generally very large. Efficient, the family is usually much smaller and therefore less beneficial. Utah Year The age-adjusted breast cancer incidence rate is 20%, which is lower than the average United States ratio. Utah The lower incidence in the state is probably due to the case found in Utah families. Greater for younger children at first pregnancy, increasing the probability of carrying a genetic predisposition CauseGenetic mapping   Once a series of beneficial families are available, genes can be used to link disease to chromosomal regions. Markers are required. Such markers include restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Bo tstein et al., 1980), with VNTR (variable number of tandem repeats) Markers (Jeffreys et al., 1985; Nakamura et al., 1987), and short tandem repeats (S TR), especially large amounts based on CpA repeats (Weber and May, 1989; Litt et al., 1989). Ras DNA polymorphisms are included. In order to create a genetic map, strong genetics The offspring markers are selected, and the DNA is extracted from members of the family to be studied. Test gene markers.   Genetic markers useful for locating loci associated with the disease By covering the body tightly or by analyzing specific regions of the chromosome in detail , Can be selected on an ad hoc basis. Gene markers linked to disease A preferred method for screening is to assess the degree of family benefit and determine of Measure the ideal distance between polymorphic genetic markers and then ideally for maximum efficiency Includes selecting markers from known spaced genetic maps You. The benefit of the family is that the marker is likely to be heterozygous in unrelated individuals. Measured by percentage. S detected by amplification of the target nucleic acid sequence using PCR It is also most effective to use TR markers; such markers are very valuable Is easy to assay (Weber and May, 1989); a multiplex strategy Can be assayed simultaneously (Skolnick and Wallace, 1988). Greatly reduce the number of experiments.   Once linkage is established, a marker that flank the disease locus, That is, one or more markers adjacent to the disease locus; It is necessary to find one or more distal markers. If possible, inform Candidate markers can be selected from the genetic map. Also known If there is no marker, a new marker is created by STR technology as shown in the examples. Can be identified.   Genetic mapping is usually an iterative process. In the present invention, BRCA Start by defining flanking genetic markers around the two loci Then, these French markers are replaced with other markers, which are in turn close to the BRCA2 locus. Replace with marker. The first step is clearly defined by a large, extended family. Results in a recombination event either distal or adjacent to a particular genetic marker It is particularly helpful in locating some BRCA2 loci (Wooster et al., 1994). .   Until the present invention was disclosed, the area surrounding BRCA2 was not well mapped. , The marker was almost absent. Thus, short repeats are cosmids, Developed from P1, BAC and YAC, physically mapped, new gene markers The area was analyzed to develop a car. The new STRs are both polymorphic , BRCA2 region.Physical mapping   The area was physically mapped using three different methods. The first is B Use of a yeast artificial chromosome (YAC) to clone the RCA2 region. The second is a series of P1, BACs covering the region containing the BRCA2 locus. And the creation of cosmid clones.   Yeast artificial chromosome (YAC)  A region small enough to contain the BRCA2 locus Once defined, the group is identified by identifying a series of overlapping YACs covering the region. Physical isolation of the DNA in the region proceeded. Useful YACs are St. Louis and CEPH YAC Can be isolated from a known library, such as a library, Are widely distributed, each containing approximately 50,000 YACs. The isolated YACs From a publicly accessible library, Michigan Genome Cent er can be obtained from a number of sources including: Obviously, these YACs If accessed, they place them in the smallest region containing the BRCA2 locus. YACs exist and you cannot understand which YACs are outside it Therefore, without disclosing the present invention, the value of a particular YAC selected by the present inventors was Will not understand.   P1 and BAC clone  In the present invention, the P1 and BAC clones are Advantageously, it is advantageous to proceed by covering this area. YAC Insa These inserts, which are smaller in size than the They make them more useful as purification probes. Furthermore, from yeast cells Having cloned DNA in bacterial cells also greatly increases simplicity, Thus, the target DNA can be manipulated, and the hybridization The signal-to-noise ratio of the sail can be improved.   P1 and BAC clones were isolated from YACs, as described herein, From the entire human genome using specific labeling sites (STS) from P1 and BAC Obtained by screening the constructed library.   These P1 and BAC clones are scattered repetitive sequence (IRS) PCR and And / or gel electrophoresis following restriction enzyme digestion and resulting DNA fragment Comparison ("fingerprint") (Maniatis et al.) , 1982). The clone can also be characterized by the presence of STS. The Using fingerprints to cover the area but not excessively Define an adjacent set of clones. In the present specification, this is referred to as the “minimum tile path”. (Minimum tiling path). " Such a minimum tile path is the BRCA2 genetic It forms the basis for subsequent experiments to identify cDNAs that may originate from the locus.   P1 clone (Sternberg, 1990; Sternberg et al., 1990; Pierce et al., 1992; Shizu ya et al., 1992) describe a PCR primer provided by the inventors for screening. Isolated by Genome Sciences using immer. BAC is Mel Simon Dr. lab hybridization technology and our lab PCR Obtained by pool analysis. Strategy using P1 and BAC clones To cover the genomic region using an independent set of clones not derived from YAC. -It became possible. This protects against possible deletions in the YAC. These new sequences from the P1 and BAC clones are described below. Provides material for further screening for candidate genes.Gene isolation   Presence of a potential coding sequence for the locus to be isolated There are a variety of techniques for testing genomic clones for (A) zoo blot, (b) HTF islands Identifying (c) exon trapping, (d) cDNA to P1, BAC Or YAC, and (e) cDNA library Screening.   (A) Zoe Blot  The first technique is to hybridize cosmids to Southern blots. Soybeans are evolutionarily conserved and therefore (monkey, cow, chicken, pig , Such as mice and rats) from closely related species that vary to humans To identify the DNA sequence that provides a positive hybridization signal to the DNA That is. Southern blots containing such DNA from various species are commercially available. (Clonetech, catalog number 7753-1).   (B)Identifying HFT islands  The second technique often involves the coding domain Find regions rich in nucleotides C and G occurring near or in It is included. Such a sequence is a restriction enzyme specific to a site containing a CpG dimer. Frequently cleaves in these regions, so HFT (Hpal small fragment, Hpalti nyfragment) or CpG islands (Lindsay et al., 1987).   (C)Exon Trapping  The third technology is exon trapping This method involves a splicing junction and therefore the coding region of the gene. Identify sequences in genomic DNA likely to contain the region. Exon amplification (Buckler Exons are selected from the above DNA clones and amplified. D Xenon amplification is flanked by functional 5 'and / or 3' splice sites. Based on selection of rare RNA sequences. Breast using the product of the exon amplification Screen cDNA libraries and manage them for further study Identify a number of candidate genes. Exon Trapping is a computer program DNA sequenced using software or by software trapping Can be performed on a small segment.   (D)Hybridizing cDNA to P1, BAC or YAC  No. Technique 4 is a method for hybridizing cDNA to cosmid, P1, BAC or YAC. Should be identified in the cloned genomic DNA using solicitation, and Then, a modified form of selective enrichment technology that can transcribe the sequence to be recovered (Kandpal et al., 1990). The selective enrichment technique modified for the purpose of the present invention The DNA from the BRCA2 region present in the YAC is From an appropriate library that hybridizes to the ligated DNA. The DNA was selected and the bound DNA was subsequently amplified and purified, resulting in a clone. Greatly enriches the cDNA in the region represented by the genomic DNA included.   (E)Identification of cDNA  The fifth technique involves the cDN corresponding to the BRCA2 locus. A is to be identified. Estimated chords selected using any of the above techniques Using a hybridization probe containing the Various libraries including libraries and any other necessary libraries Select Lee.   Other variants of the direct selection of cDNA can also be used to select candidate BRCA2 genes. Can be found (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993). This method is cosmid, P1 or BAC DNA is used as a probe. The probe DNA was Digest with a blunt restriction enzyme such as II. Next, a double-stranded adapter was added to the DNA. And use the biotin-labeled primer in the subsequent PCR amplification reaction. Provides the binding site for the primer. Target cDNA can be random primed or oligo (DT) By synthesizing the second strand following any of the primed first strands, For example, from mRNA from a tissue sample such as breast tissue. cDNA end The ends are blunted and ligated to a double-stranded adapter. This adapter is an extension for PCR. Served as a width part. The target and probe sequences are denatured and human C0t-1   Mix with DNA to block repetitive sequences. Perform solution hybridization C0Hybridization of rare target cDNA molecules by increasing t-1 / 2 value To ensure that The annealed material was then captured on avidin beads. Wash with high stringency, elute retained cDNA, and perform PCR. And amplify. The selected cDNA is cloned into a plasmid vector for analysis. Before doing so, we will enrich for further rounds.   Testing cDNA for Candidateness   Evidence that the cDNA is at the BRCA2 locus is due to the abnormal BRCA2 gene. Affected family members producing abnormal or abnormal levels of BRCA2 gene product By finding the sequence in DNA extracted from the DNA. Such BRCA Two-susceptibility alleles co-segregate with disease in large families Will. It also means that non-family individuals with breast cancer are seconded to individuals in the general population. Will be much more frequent. Finally, tumors are often found in the reproductive system Because of other somatic mutations in other mutated loci, we have Is identical or identical to the BRCA2 sensitive allele in DNA extracted from tumor tissue. Shows that the normal germline BRCA2 allele mutated in a sequence Expected to be issued. BRCA2 sequence from tumor tissue and from the reproductive system of the same individual Compare BRCA2 alleles or germline BRCA from cancer cases Whether the two alleles are compared to those from unaffected individuals depends on the normal function of the gene product. The key is to find mutations that are serious enough to cause obvious collapse. These mutations can take many forms. The heaviest forms encode abnormal proteins. That would cause the gene to be loaded or significantly alter protein expression. May be a shift mutation or a large deletion. To a less disruptive mutation Has no effect on cysteine residues, which will have a significant effect on the protein produced. Changes from it, from basic to acidic amino acids or vice versa, hydrophobicity To hydrophilic amino acids or vice versa, or secondary, tertiary or quaternary Small in-frame readings and deletions, such as other mutations that may affect protein structure And non-conservative base pair substitutions. Silent mutation or conservative amino Those that produce acid substitutions would not generally be expected to disrupt protein function. U.   Diagnostic and prognostic methods of the present invention detect changes in wild-type BRCA2 locus Is done. In addition, the method detects the wild-type BRCA2 locus, This can be done by confirming the lack of a predisposition to cancer at the locus. "Wild-type gene alterations" include deletions in coding and non-coding regions. All forms of mutations are included, including, insertions, and point mutations. Deletion remains It may be the whole gene or only a part of the gene. The point mutation ends Stop codons, frameshift mutations or amino acid substitutions can occur. Somatic cell sudden Mutations occur only in certain tissues, such as tumor tissues, and are inherited in the reproductive system. Not done. Germline mutations can be found in any body tissue, Inherited. If only a single allele is somatically mutated, The living condition is indicated. However, both alleles have somatic mutations If present, a late neoplasm is indicated. Therefore, the occurrence of the BRCA2 mutation The look provides both diagnostic and prognostic information. (For example, BRCA2 deficiency Undeleted B (as found on the sister chromosome of the chromosome carrying the loss) RC The A2 allele is responsible for other mutations such as insertions, small deletions and point mutations. Can be screened for. Many sudden changes found in tumor tissue It is believed that the differences may lead to reduced expression of the BRCA2 genetic pre-product . However, mutations that lead to non-functional gene products may also lead to cancer. U. Point mutation events can result in a loss of mRNA expression or in the promoter of a gene. Such as can occur in the regulatory region. Point mutations also abolish proper RNA processing This can be due to loss of expression of the BRCA2 gene product or mRNA stability or This leads to a decrease in translation efficiency.   Useful diagnostic techniques include, but are not limited to, Fluorescence in situ hybridization (FISH), direct D NA sequencing, PFGE analysis, Southern blot analysis, single-stranded conformation analysis (SS CA), RN Ace protected asse allele-specific oligonucleotide (ASO) , Dot blot analysis and PCR-SSCP.   A predisposition to cancer, such as breast cancer and other cancers identified herein, is based on the BRCA2 gene. Confirmation by testing any human tissue for offspring mutations Can be. For example, a person who has inherited a germline BRCA2 mutation will develop cancer and Will tend to. This means that DNA from any tissue of the human body can be tested. Can be determined. At its simplest, blood is collected and from blood cells DNA can be extracted. In addition, prenatal diagnosis is based on the BRCA2 gene Testing for fetal, placental, or amniotic cells for mutations I can. For example, wild, whether by point mutation or deletion Alteration of the type BRCA2 allele can be achieved by any of the means discussed herein. Can also be detected.   There are several methods that can be used to detect DNA sequence variants You. Direct DNA sequencing, either manual sequencing or automated fluorescent sequencing, , Sequence variants can be detected. For genes as large as BRCA2 However, manual sequencing is very labor intensive, but under optimal conditions, Rarely miss mutations in coding sequences. Another approach is ,one This is the main-chain conformation polymorphism assay (SSCA) (Orita et al., 1989). This method is All sequences, especially when the DNA fragment size is greater than 200 bp Changes cannot be detected, but optimized to detect most DNA sequence variants can do. Although the reduced detection sensitivity is disadvantageous, the throughput can be reduced using SSCA. Is attractive because it can increase An alternative method of direct sequencing is feasible. Then shift on SSCA gel Fragments with different mobilities to determine the exact nature of the DNA sequence variation Is determined. Other approaches based on detecting mismatches between two complementary DNA strands include: , Clamped denaturing gel electrophoresis (CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplex analysis (HA) (White et al., 1992) and chemical mismatch cleavage (CMC) (Grompe et al., 1989). All of the above methods are large No deletions, duplications or insertions detected, and affects transcription or protein translation No regulatory mutation will be detected. Protein truncation assay or uncontrolled assay Other methods that may be able to detect class mutations such as b Only mutations will be detected, no missense mutations will be detected. DN For a review of the latest available methods for detecting A sequence variants, see Grompe (1993). Can be found in a recent overview. If the mutation is identified, allele-specific Allele specific such as Rigonucleotide (ASO) hybridization Using a simple detection approach to quickly run many other samples for that same mutation. Screening can be done quickly.   To detect changes in the wild-type BRCA2 gene in tissues, the surrounding normal It is helpful to isolate tissue free of tissue. Rich in tumor cell tissue preparation The method of forming is known in the art. For example, the tissue may be paraffin or It can be isolated from cryostat sections. Cancer cells are flow cytometric Can also be separated from normal cells. These technologies and normal technology Other techniques for separating tumor cells from vesicles are known in the art. Tumor tissue Mutations are more difficult to detect if they are very contaminated with normal cells.   DNA digested with one or more restriction enzymes, preferably with various restriction enzymes Quickly detect polymorphisms in DNA sequences by viewing a series of Southern blots Preliminary analysis can be performed. Each blot contains a series of normal individuals and a series of cancer cases. Contain tumors, tumors, or both. (Near or near the BRCA2 locus When the probe is probed with a sequence containing the same, the length is different from that of the control DNA. Southern blots showing the hybridized fragments show potential mutations Is shown. When using restriction enzymes that generate very large restriction fragments For this, pulse field gel electrophoresis (PFGE) is used.   The detection of point mutations involves molecular cloning of the BRCA2 allele (s) and Sequencing the allele (s) using techniques well known in the art You can do it by doing Alternatively, the gene sequence may be identified using known techniques. And can be amplified directly from genomic DNA preparations from tumor tissue. About Thus, the DNA sequence of the amplified sequence can be determined.   A more complete but still indirect test to confirm the presence of a susceptibility allele There are six well-known methods for testing: 1) Single-strand formation conformational analysis ( SSCA) (0rita et al., 1989); 2) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE ) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RN Ace protection assay (Fin kelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) Allele-specific oligonucleotides (ASO) (Conner et al., 1983); 5) E. coli mutS protein Use of proteins that recognize nucleotide mismatches such as white matter (Modrich, 1991); And 6) Allele specific PCR (Rano and Kidd, 1989). Allele specific For PCR, a specific BRCA2 mutation was added at the 3 'end of the primer. Use primers that hybridize. No specific BRCA2 mutation present In that case, no amplification product is observed. Amplification refractory mutation system (AmplificationRef ractory Mutation System) (ARMS) has also been published in European Patent Application Publication No. 0332435. And Nowton et al., 1989. Gene insertions and deletions are also detected by cloning, sequencing and amplification can do. In addition, restriction of the gene or surrounding marker genes Using single-length polymorphism (RFLP), allelic changes or polymorphic fragments in Insertions can be recorded. Such a method can be used to identify the BRC found in affected individuals. Particularly useful in screening relatives of the individual for the presence of the A2 mutation It is. Others for detecting insertions and deletions as known in the art Can also be used.   The first three methods (SSCA, DGGE and RN Ace protection assays) And a new electrophoretic band appears. Intramolecular base pairing with single-stranded sequence changes , SSCA detects bands that migrate differently. R N-ace protection includes one or more smaller fragments of the mutated polynucleotide. Includes cutting into lugs. DGGE was prepared using a denaturing gradient gel, Detect differences in migration speed of the mutated sequence compared to the sequence. Allele specific In a specific oligonucleotide assay, the oligonucleotide Designed to detect and the presence or absence of a hybridization signal The assay is performed by detecting the presence. In the mutS assay, sudden changes Arrangements containing nucleotide mismatches in heteroduplexes between different and wild-type sequences Protein binds only to rows.   Mismatches according to the present invention are defined as hybrids in which the two strands are not 100% complementary. It is a nucleic acid duplex that has been re-sized. Deletions of total homology include deletions, insertions, It may be by position or substitution. Using mispairing detection in or in genes A point mutation in the mRNA product of can be detected. These techniques are arrays Although less sensitive than determinations, they are simpler to perform on large numbers of tumor samples. One example of a mismatched disconnection technique is the RN Ace Protection Act. In the practice of the present invention, The method involves the use of a labeled ribosome that is complementary to the human wild-type BRCA2 gene coding sequence. Includes the use of probes. The riboprobe and mRNA isolated from tumor tissue Or annealing (hybridizing) together with any of the DNAs, followed by Enzyme RN capable of detecting some mismatches in duplex RNA structures Digest with Asin A. If a mismatch is detected by RN Acin A, Cuts the site of the mismatch. Therefore, the annealed RNA preparation is electrophoresed. When separated on a gel matrix, mismatches are detected and RN A If cleaved, full-length data for riboprobes and mRNA or DNA Smaller RNA products will be observed than duplex RNA. The re The voprobe need not be the full length of the BRCA2 mRNA or gene, It can be any segment. Riboprobe is mRCA of BRCA2 When only A or the gene is included, a large number of these probes are used to It is desirable to screen the entire mRNA sequence.   Similarly, mismatches can be made through enzymatic or chemical cleavage using DNA probes. Can be detected. See, for example, cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; See 1986. Alternatively, mispairing for paired duplexes Detecting Mismatch by Shift in Duplex Electrophoretic Mobility You can also. See, for example, Cariello, 1988. Riboprobe or DNA If any of the probes are used, PCR (see below) To amplify cellular mRNA or DNA that may contain mutations Can be Especially when the change is a significant transposition such as a deletion or insertion Detects changes in BRCA2 DNA even using Southern hybridization can do.   The DNA sequence of the BRCA2 gene amplified by using PCR Screening can also be performed using a specific probe. This probe is nuclear Acid oligomers, each of which has a BRC carrying a known mutation It contains the region of the A2 gene sequence. For example, one oligomer is BRCA2 It can be about 30 nucleotides in length corresponding to a portion of the gene sequence. Heel Screening of PCR amplification products using a set of allele-specific probes To identify the presence of a previously identified mutation in the BRCA2 gene. Can be. Hybridization of allele-specific probe with amplified BRCA2 sequence Dicing can be performed, for example, on a nylon filter. String Hybridization to specific probes under gentle hybridization conditions Digestion results in mutations identical to those in the allele-specific probe. This indicates that it is present in tumor tissue.   The most definitive test for mutations in candidate loci is A direct comparison of the BRCA2 sequence with that from the control population. Otherwise For example, to sequence messenger RNA after amplification by PCR, for example. This eliminates the need to determine the exon structure of the candidate gene. Can be.   Mutations from cancer patients that fall outside the coding region of BRCA2 are Non-coding, such as introns or regulatory regions near or in the A2 gene Inspection can be performed by inspecting the scanning area. Non-coding area Early suggestions for the importance of mutations in cancer were earlier in cancer patients than in control individuals. Emerges of messenger RNA molecules of abnormal size or abundance It can result from a blot experiment.   Altered BRCA2 mRNA expression can be any of those known in the art. It can be detected by technology. These include Northern blot analysis, PCR Amplification and RN ace protection are included. Reduced mRNA expression is due to wild-type BR The changes in the CA2 gene are shown. Changes in wild-type BRCA2 are 2 It can also be detected by screening for changes in the protein. An example For example, tissue may be screened using a monoclonal antibody that is immunoreactive with BRCA2. Training. Lack of cognate antigen indicates BRCA2 mutation Will. Even with the use of an antibody specific for the product of the mutant allele, A different BRCA2 gene product can be detected. Such an immunological assay It can be done in any convenient manner known in the art. these Western blots, immunohistochemical assays, and ELISA assays B is included. Use any means to detect the altered BRCA2 protein However, a change in the wild-type BRCA2 gene can be detected. Protein binding Functional assays such as determination can be used. In addition, BRCA2 biochemical Assays that detect function can be used. Mutant BRCA2 gene product Finding indicates a change in the wild-type BRCA2 gene.   Mutant BRCA2 genes or gene products are expressed in serum, stool, urine and saliva. It can also be detected in other human body samples. Mutant BRCA The same techniques discussed above for the detection of two genes or gene products Of human body samples. Cancer cells peel off from the tumor and the body Appears in the sample. In addition, the BRCA2 gene product itself can be secreted into the extracellular space. Can be found in these body samples even in the absence of cancer cells. Such body Screening body samples can provide a simple and early method for many types of cancer. Diagnosis can be achieved. In addition, the mutant BRCA2 gene or By testing such body samples for gene products, chemotherapy or radiation The progress of the radiation therapy can be monitored more easily.   The diagnostic method of the present invention is directed to any of the methods wherein BRCA2 has a role in tumor development. It can also be applied to tumors. The diagnostic method of the present invention allows a clinician to Useful for them because they can determine the process.   The pair of primers of the present invention is a primer for specific BRCA2 alleles using PCR. Useful for determining nucleotide sequences. The pair of single-stranded DNA primers is BRCA 2 To prime the amplified DNA synthesis of the gene itself, on chromosome 13 Can be annealed to sequences in or around the BRCA2 gene . With these complete sets of primers, the BRCA2 gene coding sequence All nucleotides, ie, exons, can be synthesized. With a set of primers Preferably, both intron and exon sequences can be synthesized. versus Progenitor specific primers can also be used. Such primers are specific B Anneal only to the RCA2 mutant allele, and thus suddenly as a template The product will only be amplified in the presence of the mutant allele.   To facilitate subsequent cloning of the amplified sequence, primers It may have a restriction enzyme site sequence added to the 'end. Thus, the primer All the nucleotides required for the formation of the restriction enzyme site It is derived from the BRCA2 sequence or a sequence adjacent to BRCA2 except for the tide. Heel Enzymes and sites are well known in the art. The primer itself is It can be synthesized using techniques well known in the art. Generally, the city Sales Primers can be prepared using the oligonucleotide synthesizer You. SEQ ID NO: 1 and the BRCA2 open reading frame shown in FIG. The sequence, the design of specific primers, is in addition to those disclosed below, Well within the range.   The nucleic acid probes provided by the present invention are useful for various purposes. that is, Southern blots on genomic DNA to detect point mutations already discussed above It can be used for hybridization and RN ace protection. This The lobe can be used to detect the PCR amplification product. It is with other technologies Can also be used to detect BRCA2 gene or mRNA mismatches.   Individuals with the wild-type BRCA2 gene will have cancer arising from the BRCA2 allele. Not found to have. However, it interferes with BRCA2 protein function These mutations are involved in cancer pathology. Therefore, the function is lost or altered. Altered (or mutated) BRCA producing a protein with an altered function The presence of the two genes directly correlates with an increased risk of cancer. BRCA2 gene burst To detect mutations, a biological sample is prepared and analyzed for the BRCA2 allele. Analyze for differences between the sequence and the sequence of the wild-type BRCA2 allele. suddenly A mutant BRCA2 allele is first identified by any of the techniques described above. be able to. The mutant alleles are then sequenced to identify specific mutation pairs. Identify specific mutations in progeny. Alternatively, the mutant BRCA2 allele The gene identifies the mutated (altered) BRCA2 protein using conventional techniques Can be identified first. The mutant allele is then sequenced. Determine to identify specific mutations for each allele. Then mutation In particular, mutations leading to altered function of the BRCA2 protein may be diagnosed and diagnosed according to the invention. And prognostic methods.Definition   The invention uses the following definitions:   "Polynucleotide amplification" refers to polymerase chain reaction (PCR), ligation amplification (Well Or ligase chain reaction, LCR) and amplification methods based on the use of Qβ replicase Use a method such as These methods are well known and widely known in the art. Well implemented. For example, U.S. Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202 and Innis et al., 1990 (for PCR); and Wu et al., 1989a (for LCR). I was referenced. Reagents and hardware for performing PCR are commercially available. Primers useful for amplifying sequences from the BRCA2 region are preferably It is complementary to a sequence in the RCA2 region or a sequence in the region flanking the target region therein. And specifically hybridize to it. BRCA2 sequence produced by amplification Can be sequenced directly. Alternatively, less desirable, The amplified sequence (s) can also be cloned prior to sequence analysis. Enzyme amplification Methods for direct cloning and sequence analysis of isolated genomic segments are described in Scharf, 198. Described by 6.   “Analyte polynucleotide” and “Analyte strand” are expected to contain the target sequence Refers to single-stranded or double-stranded polynucleotides, including biological samples Type of sample.   "Antibodies" The present invention relates to BRCA2 polypeptides and fragments thereof. Or a BRCA2 region, particularly a polynucleic acid from the BRCA2 locus or a portion thereof. Polyclonal and / or capable of specifically binding to a reotide sequence Monoclonal antibodies and their fragments, and their immunological binding The equivalent is also provided. The term "antibody" can refer to a homogeneous molecule or a plurality of different molecules Used to refer to both mixtures, such as serum products composed of. Polypeptide Is prepared synthetically in a peptide synthesizer (for example, a keyhole-adsorptive hemocyanin). Una) can be conjugated to a carrier protein and injected into rabbits for several months. it can. About immunoreactivity to a BRCA2 polypeptide or fragment And test the rabbit serum. Monoclonal antibodies are used to express protein polypeptides in mice. , Fusion proteins or their fragments. Can be. Monoclonal antibodies were screened by ELISA and BR Test for specific immunoreactivity with CA2 polypeptide or fragment thereof I do. See Harlow and Lane, 1988. These antibodies can be used in assays and Will be useful in medicine.   Once a sufficient amount of the desired polypeptide has been obtained, it can be used for various purposes. Wear. A typical application is the generation of antibodies specific for binding. These antibodies May be either polyclonal or monoclonal; Well-known in vitro or in vivo )). For the generation of polyclonal antibodies Select a suitable target immune system, typically a mouse or rabbit. Substantially purified The antigen obtained by the appropriate method for the animal or by familiarizing the And present it to the immune system in a manner determined by other parameters. Injection Suitable sites are footpads, intramuscular, intraperitoneal, or intradermal. Of course, other The species can be substituted for mice and rabbits. Then adjust to the specificity of interest The polyclonal antibody is purified using techniques known in the art.   Immunological responsiveness is usually assayed by immunoassay. Im usually take In a no assay, the source of the antigen, e.g., by the same cells as the antigen in the same manner Some purification of the source of the generated antigen is involved. Various immunoassay methods are available It is well known in the art. For example, Harlow and Lane, 1988 or Goding, See 1986.   10-8M-1Or preferably 10-9-10-TenM-1Or stronger affinity Monoclonal antibodies having are typically, for example, Harlow and Lane, 1988 or Will be generated by the standard technique described in Goding, 1986. Briefly, an appropriate animal is selected and according to the desired immunization protocol. When appropriate In the meantime, the spleen of such animal is excised and immobilized myelose under appropriate selection conditions. The individual spleen cells are fused to the ma cells. The cells were then clonally separated and The clone supernatant was tested for its production of an appropriate antibody specific for the target region of the antigen. Test.   Other suitable techniques include, for antigenic polypeptides, or alternatively, Of lymphocytes for selection of a library of antibodies in a vector or similar vector. Includes in vitro exposure. See Huse et al., 1989. Polype of the present invention Peptide peptides or antibodies can be used with or without modification You. Often, polypeptides and antibodies are labeled with substances that provide a detectable signal. It will be labeled by linking either covalently or non-covalently. A wide variety of labeling and conjugate technologies are known, including And has been widely reported on both occasions. Suitable labels include radionuclides, enzymes, Quality, cofactors, inhibitors, fluorescent agents, chemiluminescent agents, magnetic particles and the like. Or Patents teaching the use of such markers include U.S. Patent Nos. 3,817,837; 3,850,752; Nos. 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 and 4,366, No. 241 is included. It is also possible to produce recombinant immunoglobulins (US See U.S. Pat. No. 4,816,567).   "Binding partner" refers, for example, to an antigen and an antigen-specific antibody or an enzyme and its Molecules that can bind to ligand molecules with high specificity, such as inhibitors U. Generally, the specific binding partner will bind with sufficient affinity under isolation conditions. Test (in the case of polynucleotide hybridization) The body copy / complementary duplex must be immobilized. Specific binding par Toners are known in the art and include, for example, biotin and avidin or Streptavidin, IgG and protein A, a vast, known receptor library Gand couples, as well as complementary polynucleotide strands, are included. Complementary ports In the case of a renucleotide binding partner, the partner is usually at least about 1 It is 5 bases long and can be at least 40 bases long. The polynucleotide May consist of DNA, RNA or synthetic nucleotide analogs .   "Biological sample" refers to a subject polynucleotide or polypeptide from an individual. A sample of tissue or fluid expected to contain, but is not limited to E.g., plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymph, external sections of skin, respiration, intestine, and urine Genital tract, tears, saliva, blood cells, tumors, organs, tissues, and in vitro cells A sample of the culture construct is included.   "Diagnosing" or "prognosing" as used herein in the context of a neoplasm The term 1) classifies lesions as neoplasms, 2) determines the severity of neoplasms, 3) Used to indicate monitoring of disease progression before, during and after treatment.   An "encoding" polynucleotide may be in its natural state or When manipulated by the methods described, it encodes a polypeptide, It is transcribed and / or translated to mRNA and / or polypeptide Or a fragment thereof. The antisense strand is the complement of such a nucleic acid Yes, and the coding sequence can be deduced therefrom.   "Isolated" or "substantially pure" "isolated" or "substantially" "Enantiomerically pure" nucleic acids (eg, RNA, DNA, or mixed polymers) refer to natural Human sequences or proteins, such as ribosomes, polymerases, and many other humans Genomic sequences and proteins are substantially separated from other cellular components that naturally accompany Are separated. The term refers to a nucleus removed from its naturally occurring environment Recombinant or cloned DNA isolates and chemistry containing acid sequences or proteins Includes synthetic analogs, as well as analogs biologically synthesized by foreign systems .   "BRCA2 allele" means a normal allele at the BRCA2 locus, Individuals are predisposed to developing cancer in many areas, including, for example, breast, ovarian and gastric cancers. Allele that carries the variant created in Such a predisposition allele is "B Also referred to as “RCA2 sensitive allele”.   "BRCA2 locus", "BRCA2 gene", "BRCA2 nucleic acid" or "BRCA2 polynucleotide" refers to each and every one of them in the BRCA2 region. Polynucleotides that are present in normal tissues , Some of which alleles predispose individuals to breast, ovarian and gastric cancer Create Mutations at the BRCA2 locus can affect the initiation of other types of tumors. May be involved in activities and / or progressions. The locus is partially Minutes are indicated by mutations that predispose an individual to developing cancer. These bumps The mutation falls within the BRCA2 region described below. The BRCA2 locus contains Cody Element, intervening sequence, and regulatory element controlling transcription and / or translation Is intended to be included. The BRCA2 locus contains all pairs of DNA sequences. Standing It is intended that gene variants are included.   These terms as applied to nucleic acids include, for example, protein fusions and deletions. Encodes a BRCA2 polypeptide, fragment, homologue or variant. Refers to nucleic acids. The nucleic acid of the present invention comprises a gene encoding natural BRCA2 or A gene having substantial homology to the gene encoding BRCA2 or a part thereof Sequences that are either derived from the gene or are substantially similar thereto Will have. The coding sequence of the BRCA2 polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 and FIG. 3 together with the amino acid sequence shown in FIG.   The polynucleotide compositions of the present invention include both sense and antisense strands. , RNA, cDNA, genomic DNA, synthetic forms, and mixed polymers Chemically or biochemically modified, as will be readily understood by those skilled in the art. And may contain unnatural or derivatized nucleotide bases. Such modifications include, for example, labeling, methylation, naturally occurring nucleotides with analogs One or more substitutions, uncharged bonds (eg, methyl phosphonate, Sulfotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged bonds (eg, Phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.), pendant groups (eg, poly Peptides, etc.), intercalators (eg, acridine, psoralen) Others), chelating agents, alkylating agents, and modified bonds (eg, alpha anomeric nucleic acids, etc.) Internucleotide modifications such as are included. In addition, the ability of hydrogen bonding and Mimetic a polynucleotide that binds to a given sequence through other chemical interactions Also included are synthetic molecules. Such molecules are known in the art, and Examples include those in which a phosphate bond in the molecular skeleton is replaced with a peptide bond.   The present invention provides a recombinant nucleic acid comprising all or part of the BRCA2 region. The recombinant construct can replicate autonomously in the host cell. Its origin also Converts polynucleotides of genomic, cDNA, semi-synthetic or synthetic origin by manipulation Such recombinant polynucleotides include: 1) Polynucleotides naturally associated therewith. Does not associate with all or part of the tide; 2) other than those to which it naturally binds. Or 3) not naturally occurring.   Thus, a recombinant nucleic acid comprising other non-naturally occurring sequences is provided by the present invention. Is done. Although the wild-type sequence can be used, it is often May have been changed by replacement or insertion.   Libraries of various types of cDNAs or genomes can be prepared using the natural The nucleic acid can be screened as a source, or, for example, Amplification of sequences present in genomic DNA or other natural sources by PCR Can be obtained. Selection of a cDNA library is usually performed by selecting the Corresponds to an RNA rich tissue source. Phage libraries are usually preferred However, other types of libraries can be used. Library claw Spread on a plate, transfer to a substrate for screening, denature, Probe for the presence of   The DNA sequence used in the present invention usually has at least about 5 codons (15 nucleotides). C), more usually at least about 7-15 codons, most preferably at least about Will contain 35 codons. One or more introns may also be present . This number of nucleotides is usually approximately specific for the sequence encoding BRCA2. Is the minimum length required for a successful probe to hybridize to   Techniques for nucleic acid manipulation are generally described, for example, in Sambrook et al., 1989 or Ausbel et al., 1992. It is listed. Reagents useful for applying such techniques, such as restriction enzymes, Widely known in the art, New England BioLabs, Boehringer Mannhe im, Amersham, Promega Biotec, U.S. Biochemicals, New England Nucl It is commercially available from distributors such as ear and many other sources. The present invention The recombinant nucleic acid sequence used to produce the fusion protein of And A variety of natural gene sequences can be combined with various cDNAs using appropriate probes. Or from a genomic library. GenBank, National Institute   See ofHealth.   "BRCA2 region" is defined by the markers tdj3820 and YS-G-B10T. Human chromosome 13 portion. In this region, the BR containing the BRCA2 gene The CA2 locus is included.   As used herein, “BRCA2 locus”, “BRCA2 allele” and And the term "BRCA2 region" refer to all such loci, alleles or regions. A double-stranded DNA comprising the locus, allele or region NA.   As used herein, the "part" of the BRCA2 locus or region or allele "Minute" is at least about 8 nucleotides, or preferably about 15 nucleotides, Or more preferably has a minimum size of at least about 25 nucleotides. Defined and may have a minimum size of at least about 40 nucleotides.   "BRCA2 protein" or "BRCA2 polypeptide" is a BRCA2 gene. The protein or polyprotein encoded by the locus, its variants or fragments Refers to a peptide. The term "polypeptide" refers to a polymer of amino acids and their equivalents. And does not refer to a specific length of the product; Ligonucleotides and proteins are included within the definition of polypeptide. Also, This term is used for polypeptides such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, etc. It does not refer to or exclude modifications of the tide. Included in the definition are: For example, one or both, both natural or unnatural (including, for example, unnatural amino acids, etc.) Or an analog of two or more amino acids, a polypeptide having a substitution bond, and Other modifications known in the art. Usually, such polypeptides are However, it is at least about 50% homologous to the BRCA2 sequence, preferably about 90%. %, More preferably at least about 95% homology. Also included Under high or low stringency conditions the nucleic acid encoding BRCA2 Protein encoded by hybridizing DNA, and BRCA2 protein Closely related polypeptides recovered by antiserum against the quality (group) or It is a protein.   The length of the polypeptide sequences compared for homology will generally be at least about 1 6 amino acids, usually at least about 20 residues, more usually at least about 24 residues, Typically it will have at least about 28 residues, preferably more than about 35 residues.   "Operably linked" means that the aforementioned components are in their intended manner. A juxtaposition that is in a functional relationship. For example, if the promoter is If it affects its transcription or expression, the promoter is added to the coding sequence. Operablely coupled.   "Probe" has a predisposition to or is associated with most cancers Polynucleotide polymorphisms associated with the BRCA2 allele may be stringent. Or under moderately stringent hybridization and washing conditions , A polynucleotide probe that forms a stable hybrid with that of the target sequence And hybridization. The probe is complete with the target sequence Stringent conditions are used when expected to be complementary to Will. If some mismatches are expected, for example, the probe is completely complementary If a variant that is not likely to be -It may reduce stringency. Conditions exclude nonspecific / accidental binding , Ie, to minimize noise. Such indicators are neutral (neut ral) to identify DNA polymorphisms as well as mutations Further analysis is required to establish detection of the A2 sensitive allele.   The probe for the BRCA2 allele is the sequence of the BRCA2 region or its cDNA. Can be derived. The probe may be located on all or part of the BRCA2 region. Which expands and allows specific hybridization to the BRCA2 region May be an appropriate length. If the target sequence contains a sequence identical to the probe sequence In some cases, the probe is short, for example, in the range of about 8-30 base pairs. You may. Because, even under stringent conditions, the hybrid It will be relatively stable. If some mispairing with the probe is expected In other words, it is expected that the probe will hybridize to the mutant region. Longer probe that hybridizes to the target sequence with the required specificity. Can be used.   The probe may include an isolated polynucleotide attached to a label or reporter molecule. And other polynucleotide sequences having sequence similarity by standard methods. Can be used to isolate. For techniques for preparing and labeling probes, see Sambrook. See 1989, or Ausubel et al., 1992. Other similar polynucleotides Can be selected by using a homologous polynucleotide. Alternative As such, the polynucleotides encoding these or similar polypeptides are Can be synthesized or selected by extra use in the genetic code. For example , By silent changes (which create various restriction sites) or Alternatively, various codon substitutions can be introduced to optimize expression in a particular system. Wear. Mutations may be introduced to improve the properties of the polypeptide, possibly Improve affinity, interchain affinity, or the rate of polypeptide degradation or metabolism Can be   Probes containing synthetic oligonucleotides or other polynucleotides of the invention Is derived from naturally occurring or recombinant single- or double-stranded polynucleotides Or can be chemically synthesized. Probe is Nick Trans Solution, Klenow fill-in reaction or Labeling can also be done by other methods known in the art.   Portions of the polynucleotide sequence having at least about 8 nucleotides are usually A polynucleic acid comprising at least about 15 nucleotides and encoding BRCA2 A probe that is about 6 kb smaller than the leotide sequence, usually about 1.0 kb smaller, Is preferred. Using the probe, mRNA encoding BRCA2 is Can also be determined whether it is present in the organization.   "Protein modifications or fragments" are those that are substantially homologous to the primary structural sequence. BRCA2 polypeptides or fragments thereof are provided by the invention. For example, in vivo or in vitro chemical and biochemical modifications or Include those incorporating abnormal amino acids. Such modifications include, for example, Acetylation, carboxylation, phosphorylation, Cosylation, ubiquitination, such as labeling with radionuclides and various enzymatic modifications Included. Various methods for labeling polypeptides and species useful for such purpose Various substitutions or labels are well known in the art,32Radioactive like P Binds to ligands, labeled antiligands (eg, antibodies), fluorophores, chemiluminescent agents, and enzymes Ruri Gand acts as a member of specific binding pairs for labeled ligands The resulting anti-ligands are included. Sensitivity required for label selection, binding to primer Simplicity, stability requirements, and available equipment. Labeling polypeptides Methods are well-known in the art. Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., See 1992.   In addition to substantially full-length polypeptides, the invention relates to the biology of the polypeptides. Also provided are chemically active fragments. Important biological activities include ligand binding, Epidemiological activity and other biological activities unique to BRCA2 polypeptides are included. Immunity Activities include immune function in the target immune system, as well as epitaxy of BRCA2 protein. Binding immunity, acting as either a competitor or alternative antigen for Both having epidemiological epitopes are included. “Epi” used in this specification "Top" refers to the antigenic determinant of a polypeptide. The epitope is Could contain three amino acids in a helical conformation that is unique to the group. General Typically, the epitope is at least 5 such amino acids, more usually at least Consists of 8-10 such amino acids. Determine the helical conformation of such amino acids Methods are known in the art.   Use tandemly repeated polypeptide segments as immunogens for immunological purposes And thereby produce very antigenic proteins. As an alternative , Such polypeptides are very effective competitors for specific binding. Will use. Specific for BRCA2 polypeptide or a fragment thereof Typical antibody production is described below.   The present invention relates to fusion polypeptides comprising BRCA2 polypeptides and fragments. Also provide Homologous polypeptides are two or more BRCA2 polypeptides It can be fused between sequences or between the sequence of BRCA2 and related proteins. Wear. Similarly, a heterologous protein that will exhibit a combination of properties or activities of the inducible protein Fusions can be constructed. For example, ligand-binding or other domains Can be "swapped" between different new fusion polypeptides or fragments it can. Such homologous or heterologous fusion polypeptides can have, for example, altered strength or May show binding specificity. Fusion partners include immunoglobulin, bacterial β -Galactosidase, trpE, protein A, β-lactamase, α-amylase, And lucol dehydrogenase, and yeast α-mating factor. For example, Go See dowski et al., 1988.   Fusion proteins are typically prepared by any of the recombinant nucleic acid methods described below. Thus, they can be made or chemically synthesized. Synthesize polypeptide The technique is described, for example, in Merrifield, 1963.   "Protein purification" refers to cells transformed with a recombinant nucleic acid encoding BRCA2. Species for isolating a BRCA2 polypeptide from a sample of another organism, such as from Refers to various methods, which are well known in the art. For example, Repeptides can be used, for example, for immunoaffinity using the antibodies provided by the invention. -Purification by chromatography. Various methods for protein purification Are well known in the art and include Deutscher, 1990 and Scopes, 1 982 are included.   The terms “isolated,” “substantially pure,” and “substantially homogeneous” Used interchangeably, a component with a protein or polypeptide in its natural state. The protein or polypeptide isolated from the component is described. Monomeric protein Is when at least about 60-75% of the sample exhibits a single polypeptide sequence Substantially pure. Substantially pure proteins typically have about 60-90% w / W, more usually more than about 95%, preferably more than about 99% pure protein sample Will be included. Protein purity or homogeneity depends on the polyacrylamide of the protein sample. Visualization of single polypeptide bands in the gel staining following degel electrophoresis Such may be indicated by a variety of means well known in the art. Some kind Purposes include HPLC or other well-known in the art used for purification. A higher degree of separation can be provided by using the means of (1).   The BRCA2 protein is isolated in its native state from the natural contaminants that accompany it. If they do, they contain substantially no naturally related components. Thus, Chemically synthesized or synthesized in a different cell line from cells of natural origin Polypeptide is substantially free of its naturally related components. Would. Proteins can be isolated using protein purification techniques well known in the art. To be substantially free of naturally related components it can.   A polypeptide produced as an expression product of an isolated or engineered gene sequence An "isolated polypeptide" as used herein, even when expressed in an allogeneic cell type It is. Molecules expressed by synthetically produced forms or by heterologous cells are uniquely isolated Molecule.   A “recombinant nucleic acid” is a nucleic acid that does not occur in nature, or is an isolated nucleic acid. A separate segment of a row is a nucleic acid made by the other two artificial combinations. This artificial combination often involves chemical synthesis means, or isolated segments of nucleic acids. , For example, by a genetic engineering technique. Normal By performing such operations, typically while introducing or removing sequence recognition sites, Replace codons with extra codons encoding identical or conservative amino acids. Another As a method, do it and link together the nucleic acid segments of the desired function to Generate combinations of functions.   "Regulatory sequences" are defined as (gene transcription, messenger RNA translation, splice Gene loci that affect gene expression (including singing, stability, etc.) Usually refers to a sequence within 100 kb of the coding region, It may be more distant.   “Substantial homology or similarity” with other nucleic acids (or their complements) (appropriate At least about 60% when optimally aligned (with nucleotide insertions or deletions) Of the nucleotide bases, usually at least about 70%, more usually at least Also about 80%, preferably at least about 90%, more preferably at least about 9% If nucleotide sequence identity exists at 5-98% nucleotide bases, The nucleic acid or fragment is “substantially homologous” to another. Or substantially similar).   Alternatively, the nucleic acid or fragment thereof is selectively hybridized. Under conditions, to another nucleic acid (or its complement), to a strand, or to its complement If it will hybridize, there is substantial homology or (similarity) I do. Hybridization that is substantially more selective than total lack of specificity If this occurs, there is hybridization selectivity. Typically At least about 55% over a stretch of at least about 14 nucleotides Preferably at least about 65%, more preferably at least about 75%, Alternatively, if there is at least about 90% homology, selective hybrids Redidation will occur. See Kanehisa, 1984. Described As such, comparisons of homologue lengths may span longer stretches Yes, and in certain embodiments, often at least about 9 nucleotides, Usually at least about 20 nucleotides, more usually at least 24 nucleotides. Otides, typically of at least about 28 nucleotides, more typically less At least about 32 nucleotides, preferably at least about 36 or more Over a stretch of nucleotides.   Nucleic acid hybridization is based on base pairs, as will be readily understood by those skilled in the art. Length, length of complementary strand, and nucleotide bases between hybridizing nucleic acids Influenced by conditions such as salt concentration, temperature, or organic solvent, in addition to the number of mismatches Will be done. Stringent temperature conditions generally exceed 30 ° C , Typically above 37 ° C, preferably above 45 ° C. Would. Stringent salt conditions are typically less than 1000 mM, typically less than 500 mM , Preferably less than 200 mM. However, the combination of parameters is Much more important than any single parameter measurement. For example, Wetmur And Davidson, 1968.   Probe sequences also hybridize specifically to duplex DNA under certain conditions. Can be redied to form triplexes or other higher dimensional DNA complexes. You. Preparation of such probes and appropriate hybridization conditions are described in the art. Well known in the field.   The terms “substantial homology” or “substantial identity” refer to peptides. If the polypeptide or protein in question is a naturally occurring protein or At least about 30% identity, usually at least about 70% identity , Preferably at least about 95% identity.   "Substantially similar function" refers to wild-type BRCA2 nucleic acid or wild-type BRCA. 2 polypeptide refers to the function of the modified nucleic acid or modified protein. U. The modified polypeptide is substantially homologous to the wild-type BRCA2 polypeptide. And will have substantially the same function. The modified polypeptide changes And / or may include modified amino acids. Functional similarity In addition to the properties, modified polypeptides have other useful properties, such as a longer half-life. I can do it. The similarity in function (activity) of the modified polypeptides is determined by the wild-type BRCA2 polypeptide. It may be substantially identical to the activity of the peptide. Alternatively, the function of the modified polypeptide ( Activity) may be higher than the activity of the wild-type BRCA2 polypeptide. . The modified polypeptide is synthesized using conventional techniques, or is modified by a modified nucleic acid. And generated using conventional techniques. The modified nucleic acids are prepared by conventional techniques. Made. A nucleic acid having a function substantially similar to wild-type BRCA2 gene function is To produce the modified protein described above.   Homology for polypeptides is typically determined using sequence analysis software. Set. For example, "The Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group ”, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 Univer See sityAvenue, Madison, Wisconsin, 53705. Protein analysis software Are similar using similarity measures assigned to various substitutions, deletions, and other modifications The sequences to be matched. Conservative substitutions typically include substitutions within the following groups: Yes: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid , Glutamic acid; asparagine, glutamine; serine, threonine; Luginine; and phenylalanine, tyrosine.   A “fragment”, “portion” or “segment” of a polypeptide is At least about 5 to 7 contiguous amino acids, often at least about 7 to 9 contiguous amino acids Amino acids, typically at least about 9 to 13 contiguous amino acids, Also Preferably at least about 20 to 30 or more contiguous amino acids Stretch or amino acid residue.   When the polypeptide of the present invention is soluble, for example, nitrocellulose, Iron, column packing (eg Sepharose beads), magnetic beads, glass wool Solids such as plastic, metal, or polymer gels, cells or other substrates It can be coupled to a body support. Such supports include, for example, It can take the form of holes, wells, dipsticks or membranes.   "Target region" refers to a region of a nucleic acid to be amplified and / or detected. "Target distribution The term "sequence" is used to describe a probe or primer that is stable under the desired conditions. Refers to a sequence that will form an hybrid.   The practice of the present invention will not be limited to chemical, molecular biology, microbiology, recombinant, unless otherwise indicated. Conventional techniques of DNA, genetics and immunology are used. For example, Maniatis et al., 1982; Sa mbrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 19 See 91. Human genetic mapping including mapping of human chromosome 13 A general discussion of technologies and materials used can be found, for example, in White and Lalouel, 1988. Have been.Preparation of recombinant or chemically synthesized nucleic acids: vectors, transformation, host cells   Large amounts of the polynucleotides of the present invention may be produced by replication in a suitable host cell. Can be produced. A natural or synthetic plasmid encoding the fragment of interest Renucleotide fragments are introduced into prokaryotic or eukaryotic cells and A recombinant polynucleotide construct, usually a DNA construct, Will be captured. Usually, the polynucleotide construct will be isolated from yeast or bacteria. May be suitable for replication in a unicellular host, but may be To an object or other eukaryotic cell line (with or without integration into the genome) An introduction may also be intended. Purification of nucleic acids produced by the methods of the invention has been described. See, for example, Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1992.   The polynucleotides of the present invention can be produced by chemical synthesis, for example, Beaucage and The phosphoramidite method described by Carruthers, 1981, or Matteuc It can also be produced by the triester method of ci and Carruthers, 1981. Can be performed on a commercially available automated oligonucleotide synthesizer. Double stranded flag Mention a complementary strand and allow the strands to anneal together under appropriate conditions Or by using a DNA polymerase with appropriate primer sequences From a single-stranded product of any of the chemically synthesized by adding complementary strands be able to.   Polynucleotide constructions prepared for introduction into prokaryotic or eukaryotic hosts Include the intended polynucleotide fragment encoding the polypeptide of interest. A replication system recognized by the host containing Is transcriptionally operably linked to the segment encoding the polypeptide; and It will also include translation initiation regulatory sequences. Expression vectors include, for example, an origin of replication or Are autonomously replicating sequences (ARS) and expression control sequences, promoters, enhancers and And ribosome binding sites, RNA splicing sites, polyadenylation sites, Transcription terminator sequence and required processing such as mRNA stabilizing sequence A logging information part can be included. The secretion signal is suitably the native BRCA From two proteins or from other receptors or if identical Proteins from the secreted polypeptides of related species or related species Allowing it to pass through and / or stay within it, and thus its functional topology Is achieved or secreted from cells. Take Vectors are well known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., 1989 or Is prepared by standard recombinant techniques discussed in Ausubel et al., 1992. Can be.   Appropriate promoters and other necessary vector sequences may be functional in the host. And suitably include those naturally associated with the BRCA2 gene. Can be Examples of operable combinations of cell lines and expression vectors include Described in Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1992; See 1988. Many useful vectors are known in the art, Sales by Stratagen, New England BioLabs, Promega Biotech, etc. Can be obtained from sellers. trp, lac and phage promoter, tRNA Promoters such as promoters and glycolytic enzyme promoters Can be used mainly. Useful yeast promoters include metallothionein, 3 -Phosphoglycerate kinase, or enolase or glyceraldehyde Other glycolytic enzymes such as -3-phosphate dehydrogenase, maltose and And enzymes that contribute to galactose utilization. For use in yeast expression Suitable vectors and promoters are further described in Hitzeman et al., EP 73,675A. Has been described. Suitable non-natural mammalian promoters include the early and And late promoter (Fiers et al., 1978) or rodent Moloney leukemia virus , Mouse sarcoma virus, chicken sarcoma virus, type II adenovirus, bovine nipple A promoter from an oncovirus or polyoma may be included. In addition, the structure The construct is amplified such that multiple copies of the gene can be generated (eg, DH FR). Appropriate enhancers and other expression control sequences See “Enhancers and Eukaryotic Gene Expression”, Cold SpringHarbor   See also Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).   Although such expression vectors can replicate autonomously, they are well known in the art. It can also replicate by insertion into the genome of the host cell You.   Expression and cloning vectors include selectable markers, Include genes encoding proteins necessary for the survival or growth of the transformed host cells. U. Presence of this gene ensures that only host cells expressing the insert will grow Is done. Typical selection genes encoding proteins include: a) antibiotics or other venoms Resistance to toxic substances such as ampicillin, neomycin, methotrexate and others Conferring sex; b) complement nutritional deficiencies or c) not available from complex media Nutrients, for example, for Bacilii, the gene encoding D-alanine racemase Supply the child. Selection of an appropriate selection marker depends on the host cell, and may vary depending on the host. Suitable markers are well known in the art.   Vectors containing the nucleic acid of interest are transcribed in vitro and the resulting RNA is further processed. Introduction into host cells by well known methods, for example, by injection (Kubo et al., 1988). Or electroporation; calcium chloride, rubidium chloride Using calcium phosphate, calcium phosphate, DEAE-dextran or other substances Microprojectile bombardment; Lipofection; (the vector is an infectious agent such as the retroviral genome And, depending on the type of cellular host, including infection; and other methods). Can be introduced directly into host cells by methods well known in the art. it can. See, generally, Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1992. Above all Polystyrene by any method known in the art, including those described above. The introduction of a nucleotide into a host cell is referred to herein as "transformation." The cell into which the above-described nucleic acid is introduced means that it also includes the progeny of such a cell. I do. The abundant nucleic acids and polypeptides of the invention may be BRCA2 nucleic acids or parts thereof. In a vector or other expression carrier compatible with prokaryotic or eukaryotic host cells. Can be prepared. The most commonly used prokaryotes Use other prokaryote such as Bacillus subtilis or Pseudomonas Can be a strain of Escherichia coli.   By mammals or yeasts, molds, plants, insects, or amphibians or birds Other eukaryotic host cells can also be useful for producing the proteins of the present invention. For culture The growth of mammalian cells in cells is well known per se. Jakoby and Pastan , 1979. Examples of commonly used mammalian host cell lines include For example, provide higher expression, desirable glycosylation patterns or other characteristics It will be appreciated by those skilled in the art that other cell lines may be appropriate for Wax, VER0 and HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, Rabini WI38, BHK) and COS cell lines.   Clones are selected by using markers that depend on the mode of vector construction. Select. The markers may be on the same or different DNA molecules, preferably the same DNA May be on a molecule. In prokaryotic hosts, for example, ampicillin, tetra Select transformants by resistance to cyclins or other antibiotics be able to. The production of specific products based on temperature sensitivity is also a suitable marker. Can work.   Prokaryotic or eukaryotic cells transformed with the polynucleotides of the present invention are In addition to producing the nucleic acids and polypeptides of the invention, for example, BRCA2 polypep It may also be useful for studying the characteristics of Pide.   Antisense polynucleotide sequences will be understood by those skilled in the art. Useful for interrupting or reducing the expression of the BRCA2 locus. example For example, all or part of the BRCA2 locus or the BRCA2 region (particularly Other sequences from the polynucleotide vector containing the CA2 locus). Can be placed under the control of a promoter in antisense orientation and introduced into cells You. Expression of such antisense constructs in cells will result in BRCA2 transcription and / or Or will interfere with translation and / or reproduction.   Probes and primers based on the BRCA2 gene sequence disclosed herein Used to identify homologous BRCA2 gene sequences and proteins of other species. these BRCA2 gene sequences and proteins are described in the present book for the species from which they were isolated. Used in the diagnostic / prognostic, therapeutic and drug screening methods disclosed herein.Usage: nucleic acid diagnostics and diagnostic kits   To detect the presence of the BRCA2 allele predisposing an individual to cancer Prepares a biological sample, such as blood, to determine the presence or absence of the susceptibility allele of BRCA2. Analyze for absence. Neoplasm, progression of precursor lesion toward malignancy, or To detect the presence of a prognostic indicator, a biological sample of the lesion is prepared and B Analyze for the presence or absence of the mutant allele of RCA2. these Test results and interpretive information will be used for communication to the individuals tested. Returned to health care provider. Such a diagnosis can be made by a diagnostic laboratory. Or alternatively, manufactures a diagnostic kit to Can be sold to individuals for diagnosis.   First, the screening method involves amplification of the relevant BRCA2 sequence. . In another preferred embodiment of the invention, the screening method comprises a non- -A PCR based strategy is included. Such screening methods include 2 Includes step label amplification methods, which are well known in the art. PCR And non-PCR based screening strategies are both high level The target sequence can be detected with sensitivity.   The most common method today is target amplification. Here, the target nucleic acid sequence is Amplify with polymerase. One particularly preferred method using polymerase-operated amplification The method is the polymerase chain reaction (PCR). Polymerase chain reaction and others The polymerase-operated amplification assay uses a polymerase-operated amplification cycle. To achieve over 1,000,000 times increase in copy number. Once amplified, gain Sequenced or used as a substrate for DNA probes it can.   Using probes (eg, in screening for cancer susceptibility) Biological sample to be analyzed, such as blood or serum, when detecting the presence of a specific sequence To extract nucleic acids if desired. The sample nucleic acid is prepared by various methods, Detection of target sequence; eg, denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotting Can be promoted. The target region of the analyte nucleic acid is usually at least partially Must be single-stranded and hybridize to the target sequence of the probe. No. If the sequence is naturally single-stranded, no denaturation will be required. Only However, if the sequence is double-stranded, it is probably necessary to denature the sequence. Will be. Denaturation can be performed by various techniques known in the art. it can.   The analyte nucleic acid and the probe are the target sequence in the probe and the putative target in the analyte. Incubate under conditions that promote stable hybridization with targeted sequences . The region of the probe used to bind to the analyte is targeted to human chromosome 13. It can be made completely complementary to the region. Therefore, to prevent false positives High stringency conditions are preferred. However, high stringency Is that the probe is complementary to a region of the chromosome that is unique in the genome Used only in cases. The stringency of hybridization depends on temperature, High intensity, including on-strength, base composition, probe length, and formamide concentration It is determined by a number of factors during the hybridization and during the washing step. This These factors are reviewed, for example, in Maniatis et al., 1982 and Sambrook et al., 1989. You. In some circumstances, triplets may be used to provide a means to detect the target sequence. To form higher dimensional hybrids such as Can be desirable.   In each case, the detection of the resulting hybrid is usually performed using a labeled probe. It is done by being. Alternatively, the probe may be unlabeled Is specific for the labeled ligand, either directly or indirectly The binding may be detectable. Appropriate signs and Methods for labeling lobes and ligands are known in the art, For example, (nick translation, random prime or kinizing ( radioisotope labels that can be incorporated by known methods such as kinasing)) , Biotin, fluorescent groups, chemiluminescent groups (eg, dioxetane, especially activated (trigge red) dioxetane), enzymes and antibodies. A variant of this basic scheme is Known in the art, the separation of a hybrid to be detected from a foreign material Variants that facilitate and / or amplify the signal from the labeling group are included . Many of these variants are described, for example, in Matthews and Kricka, 1988; Landegren et al. Mittlin, 1989; U.S. Patent No. 4,868,105 and European Patent Publication No. 225,807. It is outlined in the issue.   As noted above, non-PCR based screening assays are also part of the present invention. Is intended. An exemplary non-PCR based approach is described in Example 6. This hand The method uses a nucleic acid probe (or a normal phosphodiester To the low-level DNA target . The probe should be free of covalent bonds that would interfere with the specificity of the hybridization. Has an enzyme covalently linked to the probe. Next, this enzyme-probe con Ju The gate-target nucleic acid complex is isolated from the free probe enzyme conjugate and the enzyme is Substrates can be added for detection. Enzyme activity is determined by color development or luminescence Change in the output of theThree-106Double the increase in sensitivity Occurs. Oligodeoxynucleotide-alkaline phosphatase conjugate On the preparation of a gel and its use as a hybridization probe See Jablonski et al., 1986.   Two-step label amplification methods are known in the art. These assays are Small ligands such as goxigenin and biotin) specifically bind to BRCA2 It works on the principle that it binds to a nucleic acid probe that can. An exemplary probe is a book It can be developed based on the sequence set forth in patent application SEQ ID NO: 1 and in FIG. You. Allele-specific probes are also contemplated within the scope of this example, and exemplary alleles The gene-specific probes include those listed in Table 2, including Probes that include the mutation are included.   In one example, the small ligand attached to the nucleic acid probe is an antibody-enzyme conjugate. Specific recognition by the gate. In one embodiment of this example, digoxige Nin is bound to the nucleic acid probe. Hybridization involves chemiluminescent substrate It is detected by a turning antibody-alkaline phosphatase conjugate. this Methods for labeling nucleic acid probes according to specific examples are described, for example, in Martin et al., 1990. Was referred to. In a second example, the small ligand is specific for the first ligand. Recognized by a second ligand-enzyme conjugate that can be complexed to It is. A well-known example of this example is the biotin-avidin type interaction. is there. Methods for labeling nucleic acid probes and biotin-avidin based assays See Rigby et al., 1977 and Nguyen et al., 1992 for their use in And   A nucleic acid probe capable of detecting BRCA2 using the nucleic acid probe assay of the present invention. It is also contemplated within the scope of the present invention that one would use a cocktail of gloves. . Thus, in one example for detecting the presence of BRCA2 in a cell sample, , Using more than one probe complementary to BRCA2, Alternatively, two, three or five different nucleic acid probe sequences. To the patient Another example for detecting the presence of a mutation in the BRCA2 gene sequence in Using more than one probe complementary to BRCA2, Are allele-specific mutations identified in a population of patients with changes in BRCA2 Probes that can bind differently are included. In this specific example, Any type of probe can be used, preferably a predisposition to cause the individual to have breast cancer. Probes corresponding to the major gene mutation identified as Some candidate probes contemplated within the scope of the present invention include the alleged Probes containing gene-specific mutations, and 5 'and 3' Includes both probes having the BRCA2 region shown in SEQ ID NO: 1 and FIG. Is done.Usage: Peptide diagnosis and diagnostic kit   Neoplastic symptoms of lesions are detected based on changes in wild-type BRCA2 polypeptide You can also. Such changes are determined by sequence analysis using conventional techniques. Can be. More preferably, antibodies (polyclonal or monoclonal) And to determine the difference in the BRCA2 peptide or its absence. Antibodies are Examples 9 and 10 can be prepared as discussed above under the title Are further shown in FIG. Other techniques for raising and purifying antibodies are well known in the art. And select one of these techniques to make the preparation claimed in the present invention. Can be achieved. In a preferred embodiment of the invention, the antibody is B RCA2 protein was immunoprecipitated and subjected to Western or immunopolyacrylamide gel. Will react with BRCA2 protein on the blot. Another preferred embodiment In some examples, the antibody is purified from paraffin or frozen tissue using immunohistochemical techniques. The BRCA2 protein in the sections will also be detected.   Preferred specific examples of the method for detecting BRCA2 or a mutant thereof include: Using monoclonal, and / or polyclonal antibodies Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmune Noah Say (RIA), immunoradiometric assay (IRMA) and immunoenzymes Assay (IEMA) is included. An exemplary sandwich assay is described in U.S. Patent Nos. 4,376,110 and 4,486, which are expressly incorporated herein by reference. No. 530, described by David et al. And exemplified in Example 9.Usage: drug screening   The present invention is particularly directed to BRC in any of a variety of drug screening techniques. Compounds can be prepared by using the A2 polypeptide or a binding fragment thereof. It is also useful for screening.   The BRCA2 polypeptide or fragment used in such a test may be in solution Free, immobilized on a solid support, or carried on the cell surface ( borne). One of drug screening The method preferably comprises the use of a polypeptide or fragment in a competitive binding assay. Or prokaryotes stably transformed with a recombinant polynucleotide that expresses Product host cells are used. Such cells, either in living or immobilized form The cells can be used in a standard binding assay. For example, BRCA2 polypep Measuring the formation of a complex between the tide or fragment and the agent to be tested Or a library known as a BRCA2 polypeptide or fragment. Inspect the extent to which complex formation with gand is hindered by the agent to be tested be able to.   Thus, the present invention provides an agent and a BRCA2 polypeptide or fragment thereof. And then contacting (i) the agent by methods well known in the art. For the presence of a complex between and BRCA2 polypeptide or fragment Or (ii) between the BRCA2 polypeptide or fragment and the ligand Provide a drug screening method comprising assaying for the presence of a complex I do. In such a competitive binding assay, the BRCA2 polypeptide or flag Mentions are typically labeled. Protein: protein complex and free (Uncomplexed) free BRCA2 polypeptide or fragment present in the labeled amount. Account Is the binding of the agent to be tested to BRCA2 or BRCA2: ligan, respectively. It is a measure of its interference with bondability.   Another technique for drug screening is suitable for BRCA2 polypeptides. Providing a very thorough screening of compounds with reasonable binding affinity, Is described in PCT International Publication No. WO 84/03564 by Geysen published September 13, 1984. It is noted. Briefly, a huge variety of small peptide test compounds can be added Synthesized on a solid substrate, such as the surface of a tick pin or some other. Pepti The test compound is reacted with the BRCA2 polypeptide and washed. Then combine BRCA2 polypeptide is detected by methods well known in the art. Put out. Purified BRCA2 is used for the drug screening technique described above. , Can be coated directly on the plate. However, the polypeptide The BRCA2 polypeptide is captured on a solid phase using a non-neutralizing antibody to capture the antibody. Can be immobilized.   The present invention provides a neutralizing antibody capable of specifically binding to a BRCA2 polypeptide. For binding to BRCA2 polypeptides or fragments thereof The use of competitive drug screening assays that compete with the compound is also contemplated. Like this Using one or more antibodies to determine one or more antigenic determinants of a BRCA2 polypeptide Can be detected.   Additional techniques for drug screening include non-functional BRCA2 genes This includes the use of host eukaryotic cell lines or cells (as described above). This These host cell lines or cells are grown in the presence of the drug compound. Host Measuring the rate of proliferation of the cells and the compound modulating the proliferation of BRCA2-deficient cells Is determined.Usage: rational drug design   The ultimate goal of rational drug design is, for example, the biologically active An agent that is a more active or stable form of the peptide, or for example, a polypeptide The polypeptide to produce a drug that enhances or interferes with the function of in vivo Structural analogs of the compounds, or (eg, agonists, antagonists, inhibitors To generate structural analogs of small molecules that interact with it. An example See, for example, Hodgson et al., 1991. In one approach, the goal first (Eg, a BRCA2 polypeptide) or, eg, a BRCA2-receptor Alternatively, the three-dimensional structure of the ligand complex can be calculated by computer By deling, most typically by a combination of approaches. Ah Less often, useful information about the structure of a polypeptide can include homologous proteins. It can also be obtained by modeling based on the structure of white matter. Rational de One example of a rug design is the development of HIV protease inhibitors (Ericks on et al., 1990). In addition, peptides (eg, BRCA2 polypeptides) can be alanine. Analyze by scan (Wells, 1991). In this technique, amino acid residues are Replace with Ala and determine its effect on the activity of the peptide. Each amino acid of the peptide Noic acid residues are analyzed in this way to determine critical regions of the peptide.   In addition, target-specific antibodies selected by functional assays are isolated and then The crystal structure can also be elucidated. In principle, this approach is A drug core (pharmacore) on which subsequent drug design can be based. functional Anti-idiotypic antibodies (anti-ids) against various pharmacologically active antibodies It is also possible to bypass protein crystallography altogether. Mirror image to mirror image The binding site of the anti-ids is expected to be an analog of the original receptor. Then, using anti-id, a chemically or biologically generated bank of peptides The peptides can be identified and isolated. Then, the selected peptide is a drug Will act as an agent core.   Thus, for example, having improved BRCA2 polypeptide activity or stability. Or an inhibitor, agonist, or agonist of BRCA2 polypeptide activity. Drugs can be designed to act as antagonists and others. Cloning B The availability of the RCA2 sequence allows for a sufficient amount of the BRCA2 polypeptide to be available. Analysis experiments such as X-ray crystallography. In addition, the book The knowledge of the BRCA2 protein sequence described in this specification is an alternative to X-ray crystallography. Or in addition to those using computer modeling technology. U.Usage: gene therapy   According to the present invention, the method comprises providing a cell carrying a mutant BRCA2 allele. Providing wild-type BRCA2 function is also provided. Providing such functions Must inhibit neoplastic growth of recipient cells. Wild type BRCA The two genes, or parts of the genes, are vectored so that the genes remain extrachromosomal. Can be introduced into cells. In such a situation, the gene is It will be expressed by the cell from an external location. Mutation of gene fragment B When introduced into a cell carrying the RCA2 allele and expressed therein Indicates that the BRCA2 protein is required for non-neoplastic growth of cells. Must code part of the quality. More preferably, wild-type BRCA 2 gene or a part thereof is an endogenous mutant BRCA2 gene present in a cell This is the situation where a gene is introduced into a mutant cell so as to recombine. Such recombination Requires a double recombination event that results in a correction of the BRCA2 gene mutation . Vectors for introducing both recombinant and extrachromosomal maintainable genes are Any suitable vector known in the art can be used. Elek Cells such as troporation, calcium phosphate co-precipitation and virus transduction Methods for introducing DNA into DNA are known in the art, Within the abilities of Cells transformed with the wild-type BRCA2 gene were Can be used as a system to experiment with cancer mitigation and drug treatments that promote such mitigation it can.   As generally discussed above, the BRCA2 gene or fragment Where possible, to increase the amount of expression products of such genes in cancer cells. For example, it can be used for gene therapy. Such gene therapy involves BRCA2 poly Cancerous or pre-existing levels of the peptide are absent or reduced compared to normal cells Particularly suitable for use in both cancerous cells. Mutant gene is "normal" Even in tumor cells that are expressed in It is also useful for increasing the expression level of a given BRCA2 gene.   Gene therapy has been approved, for example, as described by friedman, 1991. Will be carried out according to the method specified. Cells from the patient's tumor were first described above Analyze by diagnostic methods to confirm BRCA2 polypeptide production in tumor cells Will be. Linked to expression control elements and can replicate inside tumor cells. Virus and plasmid vectors containing a copy of the BRCA2 gene See below for further details). U.S. Patent No. 5,252,479 and P Suitable vectors such as those disclosed in CT International Publication No.WO 93/07282 are known. I have. Then (to reach any tumor cells that can translocate to other sites ) Inject the vector into the patient either locally at the tumor site or systemically Shoot. Transfected gene is permanently integrated into the genome of each target tumor cell If not, the treatment may have to be repeated periodically.   A gene transfer system known in the art may be used for the gene therapy of the present invention. It may be useful for performing the method. These include viral and non-viral trans A fur method is included. For example, SV40 (Madzak et al., 1992), adenovirus (Berk ner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson et al., 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990); Xinia virus (Moss, 1992), adeno-associated virus (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 199). Herpesviruses including Papovaviridae, such as 1), HSV and EBV (Mar golskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakfield and Geller, 1987; Free se et al., 1990), and birds (Brandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al., 1). 992), rodents (Mil1er, 1992; Mil1er et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltim ore, 1985; Miller et al., 1988) and human (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al. Includes retroviruses of Buchschacher and Panganibian, 1992) origin Various viruses have been used as gene transfer vectors. most Minute Human Gene Therapy Proto The call is based on a disabled mouse retrovirus.   Non-viral gene transfer methods known in the art include phosphate Such as calcium coprecipitation (Graham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980) Biological techniques; for example, microinjection (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 198). 0; mechanical techniques such as Brinster et al., 1981; Constantini and Lacy, 1981); Somal-mediated membrane fusion-mediated transfer (Felgner et al., 1987; Wang and Huan) g, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1992); DNA uptake and receptor-mediated DNA transfer (Wolff et al., 1990; Wu et al., 19). 91; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989b; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cot. Tenel et al., 1990; Curiel et al., 1991a; Curiel et al., 1991b). Virus-borne Gene transfer involves direct in vivo gene transfer using liposome delivery In conjunction with the transfer, the viral vector is transformed into a tumor rather than surrounding non-dividing cells. It can be directed to the tumor cells. Alternatively, retrovirus vector production Ruline can be injected into the tumor (Cu1ver et al., 1992). Then the production cells Injection provides a continuous source of the vector particles. This technology works with inoperable brain Approved for use in humans with tumors.   In an approach combining biological and physical gene transfer methods , Plasmid DNA of any size was identified for adenovirus and hexon proteins. After binding to a different polylysine-conjugated antibody, the resulting complex Ligation to ills vector. The cells are then infected using the trimolecular complex. . Efficient binding, internalization by the adenovirus vector And degradation of the endosome before the coupled DNA is damaged Is accepted.   The liposome / DNA complex is directly mediated by in vivo gene transfer Is shown. Gene transfection in standard liposome preparations The fur step is non-specific, for example, after direct in situ administration, Defined in vivo uptake and expression have been reported in tumor sediments (Nabel, 1 992).   Directly target DNA to breast and ovarian tissues, such as breast or ovarian epithelial cells Gene transfer is preferred. Receptor-mediated gene transfer is For example, via a polylysine to a protein ligand (usually a covalently closed supercoil This is done by conjugating the DNA (in the form of a plasmid). Ligand Is selected based on the presence / tissue type of the corresponding ligand receptor on the cell surface of the target cell. Select. One suitable receptor / ligand pair includes the estrogen receptor and its Estrogen (and estrogen analogs) can be included. This These ligand-DNA conjugates can be injected directly into the blood if desired. And leads to receptor binding and internalization of the DNA-protein complex. It can be directed to these target tissues. Overcoming the problem of intracellular destruction of DNA To disrupt endosomal function, including co-infection with adenovirus. Can be.   The treatment includes two steps that can be performed alone or in combination. First In the process, prepubertal women carrying the BRCA2 sensitive allele are identified Some or all of the epithelial progenitor cells have at least one functional normal BRCA2 allele Treat with a gene delivery vehicle to receive additional copies of the gene. This In the step, the treated individual has the effect of the susceptibility allele It has a reduced risk of breast cancer to a degree countered by its presence. Prophylactic treatment In the second step of the treatment, predisposed young women, especially those who undertook the proposed gene therapy treatment Women use hormonal therapy to mimic effects on breasts during full gestation Receive.Usage: peptide therapy   The peptide having BRCA2 activity carries the mutant BRCA2, Alternatively, it can be applied to cells lacking BRCA2. BRCA2 protein The quality sequence is disclosed in SEQ ID NO: 2. The protein may be, for example, a known expression vector. Can be produced by expressing the cDNA sequence in bacteria using it can. Alternatively, the BRCA2 polypeptide is a BRCA2-producing mammalian cell. It can also be extracted from vesicles. In addition, BRCA2 protein was synthesized using synthetic chemistry technology. White matter can also be synthesized. All of these techniques involve the BRCA2 protein A preparation according to the invention can be provided. The preparation is substantially free of other human proteins. Not included. This is best achieved by synthesis in microorganisms or in vitro. Easy to do.   Active BRCA2 molecules can be obtained, for example, by microinjection, or Can be introduced into cells by using liposomes. As an alternative Allowing some active molecules to be taken up by cells, active or by diffusion Can be. Extracellular application of BRCA2 gene product is not sufficient to affect tumor growth It can be. The application of molecules with BRCA2 activity may be part of the neoplastic state Must lead to a reversal. Other molecules having BRCA2 activity (eg, pep Pride, drugs, or organic compounds) can also affect such reversal . Modified polypeptides having substantially similar functions are also used in peptide therapy.Usage: Transformed host   Similarly, cells or animals carrying a mutant BRCA2 allele are identified. , A model system for experimenting and testing substances with therapeutic potential Can be used as The cells are typically cultured epithelial cells. this is , Isolated from individuals with BRCA2 mutations, either somatic or germline can do. Alternatively, the cell line may be BRCA2, as described above. It can also be designed to carry mutations in the allele. Test substance Determine neoplastic transformation of cells after application to cells . Fixed-independent growth, carcinogenicity in nude mice, cell invasion, and growth Any properties of neoplastic transformed cells, including factor dependence Can also be inspected. Assays for each of these properties are available in the art. Is known for.   Animals to be tested for therapeutic agents should be available after mutagenesis in all animals or in germline cells or Can be selected after processing of the conjugate. Such treatment usually involves a second animal Insertion of a mutant BRCA2 allele from a species, as well as disrupted Insertion of homologous genes is included. Alternatively, the animal's endogenous BRCA2 gene (Group) is due to insertion or deletion mutations or other genetic alterations using conventional techniques. (Capecchi, 1989; Va1ancius and Smithies, 1991; H Asty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al. 1992; Donehower et al., 1992). Evaluate tumor growth after administering test substance to animals Must. If the test substance interferes with or inhibits tumor growth, The test substance is a candidate therapeutic for the treatment of cancer identified herein. These animal models Provides an important test carrier for candidate therapeutic products.   The present invention is described by the following examples, which are intended to be illustrative and not limiting. It is not intended to limit the invention. Standard techniques well known in the art, Alternatively, the technology described below is used.   Example 1 Identification and study of families likely to have chromosome 13-linked breast cancer susceptibility loci   Extended family and multiple relatives with multiple cases of breast cancer available for study Identified Population Serving a Large Group of Identifies Pedigrees Vulnerable to Broad Cancer did. The very large number of meiosis present in these large families is at the BRCA2 locus. Provide the ability to detect whether or not the DNA isolates Increased opportunities to happen in. This provides an opportunity to establish linkage to the BRCA2 region. Greatly improved, considerably easier to reduce BRCA2 region to manageable size Which allows the identification of the BRCA2 locus itself.   Each kindred has access to all probands or cancer cases through all available relatives. It extended to all informational first-degree relatives. In these families, Additional breast cancer cases and individuals with cancer at other sites of interest that appear Was identified via the main registration linkage file. Not confirmed at Utah Cancer Registry We examined all breast cancers reported in older families. Medical records or Obtained death certificate. Providing a blood sample from which DNA has been extracted. Therefore, each key linking the individual and all informational individuals was involved. Also, In order for the genotypes of the deceased cases to be inferred from the genotypes of their relatives, Spouse and relatives of the deceased were also sampled.   A family with three or more cancer cases with a deducible genotype was Selected in a chain experiment on cars. These are studies of proliferative breast disease and breast cancer Includes inpatients ascertained from a consolidated database on (Skolnick et al., 19 90). The criteria for selection of these families include two sisters or mothers with breast cancer and It was the presence of her daughter. In addition, as part of our breast cancer linkage study, 1980 Linkage for the existence of families of family and male and female breast cancer clusters studied since then Includes families identified from the database and self-referring families with early-onset breast cancer Was. We surveyed these families and expanded them in our clinic as described above .   For each sample collected in these families, use standard laboratory protocols. DNA was extracted from blood or paraffin-embedded tissue blocks. In this experiment Genotypes were restricted to short tandem repeat (STR) markers. That In general, they have high heterozygosity and the PCR method requires very little DNA. Because it provides a quick turnaround while using Help with this effort Is located on the short arm in the region of the Rb tumor suppressor locus Chromosome features for clones containing 2, 3 or 4 short tandem repeats By screening the heterologous cosmid library, STR Marker was developed. Markers not developed in our laboratory All oligonucleotide sequences were obtained from published reports or from Breast Cancer Obtained as part of the LinkageConsortium or from other researchers. Allele Blind at standard lane markers used to maintain consistent coding of offspring By examination, all genotype films were scored. All key samples are Received double typing for related markers.   The LOD score for each kindred was the two recombination fraction values 0.001 and 0.1. Was calculated. (See Ott 1985 for LOD score calculation). The likelihood is , Calculated under the model derived by Claus et al., 1991, the model Biography Offspring frequency 0.003, lifespan risk of about 0.80 in female genetic carriers, and Estimating population-based age-specific risks for breast cancer in gene carriers Was. Allele frequencies for markers used in the LOD score calculation were Calculated from our own laboratory type of unrelated individuals in the H panel (White and And Lalouel, 1988).   Family 107 is the largest report to date by any group Chromosome 13-linked breast cancer family. Linkage to chromosome 13 for this family The evidence is overwhelming. In smaller families, sporadic cancers can be identified by linkage analysis and And the correct identification of key recombinants is greatly confused.   Improve the characterization of our recombinants and strip closer flanking markers A dense map of a relatively small area on chromosome 13 is needed to Was. Our approach uses existing STR markers provided by other researchers. And any newly developed from our laboratory in our chromosome-linked pedigrees One was to analyze the markers. FIG. 1 shows the 10 samples used in the gene analysis. 2 shows the marker positioning. Table 1 shows for each of the 19 families in our experiment The LOD score for the linkage was given, which reduced the region to approximately 1.5 Mb. I let you.  Table 1 also shows the post hoc confirmation of families with BRCA2 mutations based on LOD scores. The rates and a priori probabilities are also given. Four of these markers (D13S17, D13 S260, D13S310 and D13S267) were previously known. other Six markers were found as part of our study for BRCA2. I Are the recombination in pedigree 107 with the marker tdj 3820 at the left border Right border, which is almost the same position as the human body and AC6 and D13S310 (FIG. 1) Recombination in kindred 2043 with the marker YS-GBB10T in The area could be reduced to 1.5 megabases based on body. further , A pancreatic tumor cell line in the BRCA2 region that can be driven by BRCA2 itself A homozygous deletion was found in FIG. 1; this deletion was called the Schutte / Kern deletion in FIG. (Schutte et al., 1995). Schutte / Kerncotig in FIG. These physical maps cover these authors.   Example 2 Development of genetic and physical sources in areas of interest   To increase the number of highly polymorphic loci in the BRCA2 region, Is our lab from P1, BAC and YAC that are physically mapped to the area Developed a number of STR markers. These markers are (See Table 1 and the discussion above).   Using the STS in the desired region, the YACs containing them were identified. Next Use these YACs to identify subclones in P1 or BAC did. These subclones were then scanned for the presence of short tandem repeats. Cleaned. Clones with strong signals were preferentially selected. That That they have a very large number of repeats and / or Because it seems to represent a completely faithful repetition. Both of these features are polymorphic It is known to increase the probability (Weber et al., 1990). These clones Was sequenced directly from the vector to locate the repeat. We are at the end of the repeat Short tandem repeats can be achieved by using one of the complementary potential primer sets. A unique sequence on one side of the target was obtained. Primers based on this unique sequence To reverse sequence across the repeat in the other direction, and place a second primer adjacent to it. A unique sequence for the design of the immer was obtained. The STR is then changed to a small group of unrelated Screen for polymorphism in individuals and test against hybrid panels And confirmed their physical location. Then a new one that meets these criteria Markers were typed in a set of unrelated individuals from Utah to study this population. The optimal allele frequency was obtained. Many of the other markers reported in this study also Testing on unrelated individuals yielded similarly suitable allele frequencies.   Using the method described above, the new STR is polymorphic and maps to the BRCA2 region. Found from these YACs. FIG. 1 shows that STB in the BRCA2 region. 1 shows a schematic map of S, P1, BAC and YAC.   Example 3 Candidate cD for BRCA2 locus by genomic analysis of contig region Identification of NA clone   1. General method Complete screening of plausible areas   Although considerable labor, the first method of identifying candidate cDNAs uses known techniques. Using. The method screens P1 and BAC clones in the contig. To identify the putative coding sequence. Then Clones containing the predicted coding sequence were Identify candidate cDNA clones for further analysis using as probes on the monitor did. The clone is placed in a putative coding sequence by one of two methods. Rows were screened.   The P1 clone to be analyzed is digested with restriction enzymes and human DNA is transformed into vector DNA. Released. The DNA is applied at 20 volts for 16 hours at 14 cm 0.5. Separation overnight by% agarose gel electrophoresis. Excising the human DNA band from the gel, Gelwe in 0.5 x Tris acetate buffer at 100 volts for at least 2 hours. Judge Was electroeluted (Maniatis et al., 1982). Then, the eluted Not I Digested DNA (-15 kb to 5.0 kb) with EcoRI restriction enzyme A small fragment (-0.5 kb to 5.0 kb) is obtained, which emits DNA. Melts easily in the next step of labeling with sex nucleotides. Hexamer random origin The DNA fragment was labeled by a labeling method (Boehringer-Mannheim, Cat. # 1004760). Was. The labeled DNA was spermine precipitated (100 μl TE, 5 μl 0.1 M spermine and 5 μl of 10 mg / ml salmon sperm DNA), uptake Unrequired radionucleotides were removed. Then, the labeled DNA was brought to 65 ° C. And resuspend in 100 μl of 0.5 M NaCl for 5 minutes, then follow manufacturer's instructions (G ibco / BRL, catalog number # 6279SA), human C02- with t-1 DNA Blocked in 4 hours. C0The probe blocked at t-1 is subjected to blocking solution. Incubated overnight at 42 ° C on filter in solution. Filter 2 × SSC) Wash in 0.1% SDS for 30 minutes at room temperature, then wash in 5% Washed at 5 ° C. for 30 minutes. Then, the filter was washed with K including an intensifying screen. Odak XAR-5 film was exposed at -70 ° C for 3 days. Thus, the block The fragments are hybridized with a pool of EcoRI fragments from the insert or individually with each fragment. Let it soy.   Human DNA from the clone in the region was fully inserted or Isolated as an RI fragment and labeled as described above. cDNA filter is 0. More stringent wash of 1 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes Under the same conditions except for receiving twice in the interim, various cDNA libraries were Ibrary filters were screened.   Most of the cDNA libraries used to date in our experiments (normal breast Tissue, breast tissue from an 8 month pregnant woman and a library from breast grade) Prepared by Clonetech, Inc. CDNA library generated from breast tissue of 8-month-old pregnant woman The library was cloned into Clonetech (catalog number HL) in a lambda gt-10 vector. 1037a) and grown on C600Hfl bacterial host cells. Normal milk Chamber and malignant breast tissue samples were isolated from a 37 year old Caucasian woman and 1 g of each tissue was R Sent to Clonetech for NA processing and cDNA library construction Was. The latter two libraries provide both random and oligo-dT priming. To select the size of the final product, which is then Into a vector and the bacterial XL as described by the manufacturer. Grow in the 1-Blue strain. Additional tissue-specific cDNA libraries , Human fetal brain (Stratagene, catalog number, 936026), human testis (Clonete ch catalog HL3024), human thymus (C1onetech kalog HL1127n), human brain (C1onet ech catalog HL11810), human placenta (Clonetech catalog 1075b), and And human skeletal muscle (Clonetech catalog HL1124b).   The cDNA library was plated on NZCYM plates with their host cells. Plate culture and filter lift from each plate according to Maniatis et al. (1982). Created in duplicate. Purify insect (human) DNA from candidate genomic clones Radiolabeled to differential activity. Next, the radioactive DNA was applied to the cDNA filter. Upon hybridization, their cDNAs were identified, which were the candidate cosmid clones. Corresponding to the gene located within. Pick up the cDNA identified by this method, Re-plated, labeled clone insert or its derived EcoRI fragment Screening again with DNA confirmed their positive status. Then, Clones that were positive after the second round of screening were expanded and DNA was purified for Southern blot analysis and sequencing. Manufacturer As described in these protocols, plasmids from lambda vectors were Purify clones as plasmids via ex vivo excision, or Isolated from lambda vector as restriction fragment and subcloned into plasmid vector did.   Southern blot analysis was performed in duplicate, one of which was probed as the original genome insert. Contains the sequence to which the cDNA insert hybridizes using the autologous DNA I checked. The second blot is a cDNA insert from the largest cDNA clone. To determine which clones represent the same gene. Specified. All cDNs that hybridize to genomic clones and are unique A is sequenced and the DNA is analyzed so that the sequence represents a known or unique gene. It was decided whether or not. All cDNA clones that appear to be unique It was further analyzed as the BRCA2 locus. Specifically, the clone was Hybridized to blots and breast specific in normal vs. breast tumor RNA And differential expression were sought. In addition, they were cloned in the BRCA2 region. To confirm their location. Locus degree To map the full length cDNAs, their sequences were isolated from the YAC and the original. Used as a PCR probe on the clone surrounding and containing the identified clone Was. The intron-exon boundaries were then further defined by sequence analysis. I let it.   We have identified EcoRI from the cosmid BAC and P1 clones in the region. Screen normal, 8-month pregnant and fetal brain cDNA libraries with fragments I was leaning. A potential BRCA2 cDNA clone was cloned from three libraries. Identified from within. Pick the clone, re-plate, and screen again with the original probe. Leaning confirmed that they were positive.   Analysis of hybrid-selected cDNA   By Southern blot hybridization to the probe DNA, Check the cDNA fragments obtained from the direct selection and make sure they are contig It was confirmed that it was derived. Those that pass this test, for all of them Was sequenced. The set of DNA sequences thus obtained is then paired with each other. And checked again to find duplicate independent clones.     A method for direct selection of cDNA (Lovent et al., 1991; Futeral) 1993) Utilized using P1 and BAC DNA as probes. The probe DNA Is digested with a blunt-ended restriction enzyme such as HaeIII. Next, the double-stranded adapter Ligation to the DNA and subsequent PCR using biotinylated primers Serves as a binding site for a primer in an amplification reaction. Random start or Synthesis of the first strand of the Rigo (dT) origin, followed by the synthesis of the second strand, results in a tissue sample, eg, For example, target cDNA was generated from mRNA derived from breast tissue. The cDNA The ends are blunt and ligated to a double-stranded adapter. These adapters are used for PCR Serve as an amplification site. The target and probe sequences are denatured and human C0t- Block each sequence by mixing with 1. Perform Southern hybridization , High C0t-1 / 2 value, and hybridization of rare target cDNA molecules Be certain. The annealed material is then captured on avidin beads, and Elute the retained cDNA and amplify it by PCR . Before cloning into a plasmid vector for analysis, the cDNA is To enrich the und.   HIF island analysis   A method for identifying a cosmid to be used as a probe on a cDNA library is as follows. HIF island analysis. HIF islands are highly unmethylated CpG dinucleotides. A segment of DNA containing a high frequency (Tono1io et al., 1990) Recognition sequence clusters restriction sites of enzymes containing CpG dinucleotides Clarified by Enzymes known to be useful in HIF-islet analysis Is AscI) NotI, BssHII, EagI, SacII, NaeI, Na rI, SmaI, and MluI (Anand, 1992).   Analysis of candidate clones   One or more candidate genes resulting from the above are sequenced and the information is substituted for each predicted gene. Used in offspring identification and classification. Nucleotide sequence comparison and all By translation in the frame, followed by comparison with the known amino acid sequence, the DNA sequence Was compared with a known gene. This is because local and remote sequence databases (eg, For sequence comparison to GenBank, see Genetic Data Environment (GDE) Version 2.2 software and client / server software package Sun Basic Local Alignment Search Tool (Blast) series Achieved by running on a SPARC workstation. Cosmid And a collection of cDNA clones identified at P1 resulted in reconstructed sequences. All candidate genes representing the new sequence were further analyzed to determine the putative BRCA2 gene. We tested their candidate for loci.Mutation screening   To screen for mutations in affected relatives, two different apros Followed. First, carrying the susceptibility allele of BRCA2 Genomic DNA isolated from family members known to be It was used as a template for gene sequence amplification. If the PCR primer is an intron / If adjacent to or overlapping the exon boundary, the amplified fragment A larger than expected from the A sequence or present in the amplified mixture. Would be. Whether a P1 or BAC clone using the designed primer set The combination of such amplification experiments and sequencing confirms intron / exon structures. And finally obtain the DNA sequence of the genomic DNA from the pedigree.   If the intron / exon structure of the candidate gene is complex, the The second approach is to use the designed primer set as a substrate for PCR amplification. CDNA synthesized from lymphocyte mRNA extracted from related blood used for Sequencing the amplified fragments. If candidate gene is significant in lymphocytes To the extent expressed, such experiments usually involve knowledge of intron / exon binding. This yields an amplified fragment that can be sequenced directly without knowledge.   The products of such sequencing reactions are analyzed by gel electrophoresis and deleted or inserted. Or mutations such as substitutions that cause amino acid changes or other deleterious effects The position in the sequence containing was determined.   Any sequence within the BRCA2 region expressed in the breast will Considered to be a candidate gene. Given that given candidate gene corresponds to BRCA2 The compelling evidence is based on proof that the family members contain the candidate defective allele. Come.   2. Specific method Hybrid selection  Two different methods of hybrid selection were used in this work .   Method 1: cDNA preparation and selection   The random origin cDNA is poly (A) of mammary gland, ovary, fetal brain and placental tissue+ Total RNA from RNA and of cell line Caco-2 (ATCC HTB 37) Prepared from Tail the homopolymer to the cDNA and then proceed as described previously. As described above, two consecutive rounds of hybridization to immobilized P1 or BAC DNA Hybrids were selected for the experiments (Parimoo et al., 1991: Romm ern et al., 1994). 2 to 4 overlapping P1 and / or BAC claws Groups were used in individual selection experiments. The hybridizing cDNA is collected and G Amplified using a tailed primer through a 50 Fine Sephadex column. Next The product is then digested with EcoRI, size selected on agarose gel, and RcoR Digested with I and treated with calf alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) Was linked to the previously described pBluescript (Stratagene). The linked product is Transformed tent DH5α E. coli cells (Life Technologies, Inc.) Changed.   Characterization of recovered cDNA   200 to 30 from each ligation (from each 250 kilobases of genomic DNA) Microtiter plate for picking 0 individual colonies, sequencing and storage In a grid pattern. Cultures were grown on Hybond lined with LB agar containing ampicillin Replica transfer to N membrane (Amersham). Colonies are grown and subsequently Was dissolved by a suitable method. The first analysis of the cDNA clones is Subsequent cross-screening for rescreening and duplicate and redundancy detection It contained garlic.   Approximately 10-25% of the clones were excluded. Because they are from total RNA This is because it strongly hybridizes with the obtained radioactive cDNA. Press cleaner From 25 to 50 clones from each selection experiment that did not hybridize Plasmids were isolated for further analysis. Staining only as a human substance Starting of a hamster hybrid cell line (GM10898A) containing body 13 Hybridization of clones to restriction digests of DNA and to human genomic DNA As a result of the purification, the recovered cDNA fragments are derived from the individual starting genomic clones. Was confirmed. The clones may be provisionally duplicated or non-overlapping of genomic clones. Groups were assigned based on overlapping intervals. Of the clones tested, almost 85% mapped properly to the starting clone.   Method 2 (Lovett et al., 1991); cDNA preparation   Poly (A) -enriched RNA from human mammary gland, brain, lymphocytes and stomach is Ndam Primer XN12     [5 '-(NHTwo) -GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNN NNNNNNNN] (SEQ ID NO: 3) And reverse transcription using Superscript II reverse transcriptase (Gibco). Second strand synthesis and After finishing and terminating, ds cDNA was separated on a Sepharose CL-4B column (Pharmacia Ph). Was purified. Using T4 DNA ligase, their 5 'end (for mRNA To the 5 'side)     [5'-GAACAATGACGGCCGTTAGAATTCTACTCA − (NHTwo) (SEQ ID NO: 5)] Double-stranded oligo RP annealed   5 '-(NHTwo) -TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG TTC (SEQ ID NO: 4)] DNA was "tethered" by the ligation. The tethered cDNA is then separated by Seph Purified again on an aroseCL-4B column.   Choice   CDNA from mammary gland, brain, lymphocytes and gastric tissue was   (RP.A: 5'-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCAT) Column numbers 5) and   XPCR [5 '-(POFour) -GTAGTGCAAGGCTCGAGAAC ( SEQ ID NO: 7)] First amplified using a nested version of And purified. Selection probes are Hindfl and Exonuclease III Prepared from purified P1, BAC or PAC by digestion of Single-stranded probes Photolabeled with photobiotin (Gibco BRL) according to the manufacturer's recommendations. Probe, c DNA and Cot-1 DNA were 2.4 M TEA-CL, 10 mM NaPOFour, Hybridized in 1 mM EDTA. Hybridized The cDNA was captured on streptavidin-paramagnetic particles (Dynal) and eluted. RP [RP.B; 5 '-(POFour) -TGAGTAGAATTCTAACGG CCGTCATTG (SEQ ID NO: 8)] And re-amplified with additional nested versions of XPCR, on Sepharose CL-6B I chose the size. The selected and amplified cDNA is0t-1 D Hybridized with an additional aliquot of NA. Capture and elute the product Amplify again by PR.B and XPCR, size select by gel electrophoresis, It was cloned into phosphorylated HIincII cut pUC18. The ligation product was XL2- Blue supercompetent cells (Stratagene) were transformed.   analysis   Approximately 192 colonies from each single-probe selection experiment were Amplified by colony-PCR using Zeta Probe The blot was blotted on an iron filter (Bio-Rad). Random starting point C0t-1 Standards with either DNQA or probe DNA (P1, BAC or PAC) The filters were hybridized using a manual procedure. Probe-Positive C0t- 1 negative clones were cloned using vector primers on an ABI 377 sequencer. And sequenced in both directions.   Exon trapping   Exon amplification was performed using a minimally overlapping set of BAC, P1 and PAC, A number of genes were isolated from the BRCA2 candidate region. 1-3 duplicate genomic clones A pool of genomic clones containing 100-300 kb DNA in the form of Standing up. Genomic clones were digested with PstI or BamHI + BglII and pS It was ligated to the PstI or BamHI site of the PL3 splicing vector. D Performed the xon amplification technique (Cheurch et al., 1993) and performed a Uracil DNA Glycosylate End products in the pAMP1 plasmid from the Got a loan. Approximately 6000 clones were picked and grown in 96-well plates, Stamp the filters and hybridize the vector and repeat Array Was analyzed for the presence of Each clone insert was amplified by PCR and exon Hybridization and dot blot of parental genomic DNA. Were tested for redundancy, positioning and human specificity. Unique candidate exon Were sequenced, searched against a database, and Used for hybridization.   5'RACE   BR modified by a modified RACE protocol called biotin capture RACE The 5 'end of CA2 was identified. Poly (A) -enriched RNA from human mammary gland and thymus With tailed random primer XN12     [5 '(NHTwo) -GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNN NNNNNNN (SEQ ID NO: 3)] And using Superscript II reverse transcriptase (Gibco BRL). RNA strand to N The first strand c is hydrolyzed in aOH and fractionated on Sepharose CL-4B (Pharmacia). DNA was purified. Has 7bp random 5 'overhang using T4 DNA ligase Double-stranded oligo   [Ds UCA: 5 '-(POFour) -GTGACTAATCGATACGCG 5'-CCTTCA annealed to TGTGAAGGTGA (SEQ ID NO: 10)] CACGCGTATCGATTAGTCACNNNNNNNN- (NHTwo) (Array No. 9)] The first strand cDNA was "tethered" by ligation to its 3 'end. After consolidation, The tethered cDNA was purified again by fractionation on Sepharose CL-4B. Biotinylated reverse Direction primer [5 '-(B) -TTGAAGAACAAACAGGACTTTTC ACTA] (SEQ ID NO: 11) and a nested version of UCA [UCP.A: 5 ' -CACCTTCACACGCGTATCG (SEQ ID NO: 12)] The 5 'end of A2 was amplified. Fractionation of PCR products on agarose gel and gel purification And captured on streptavidin-paramagnetic particles (Dynal). Capture cDN A with a nested reverse primer [5'-GTTCGTAATTGTTGTTTTTT TATGTTCAG] (SEQ ID NO: 13) and additional nested versions of UCA [UC P. B 5'-CCTTCACACGCGTATCGATTAG] (SEQ ID NO: 1 The captured cDNA was amplified again using 4). This PCR reaction was run on an agarose gel. The DNA was gel purified and ABI 377 sequencing was performed. Sequenced in both directions on the sir.   cDNA clone   Human cDNA library32P-labeled hybrid selection or exon capture Screened with clones. Phage eluted from tertiary plaque -PCR amplification with specific primers followed by distribution on an ABI 377 sequencer Column decided.   Northern blot   Poly (A) + RNA from multiple human tissues loaded at 2 μg per lane The obtained multiple tissue Northern (MIN) filter was purchased from Clonetech. Collection c DNA GT 713 (BRCA2 exons 3-7), λ wCPF1B8.1 (3 'end of exon 11 to enson 20), and glyceraldehyde-3 -Corresponds to phosphate dehydrogenase (GAPDH)32P-random-primer The probe was probed with a labeled probe. Prehybridization Is a mixture of 50% formamide, 5 × SSPE, 1% SDS, 5 × Denhardt In 0.2 mg / ml denatured salmon testis DNA and 2 μg / ml poly (A) It was at 42 ° C. Hybridization is up to 4% dex It was in the same solution to which tran sulfate and probe were added. Story Wash in 0.1 × SSC / 0.1% SDS at 50 ° C. It was something I could do.   RT-PCR analysis   Five human breast cancer cell lines (ZR-75-1, T-47D, MDA-MB-231) , MDA-MB468 and BT-20) and three human prostate cancer cell lines (L NCaP) DU145 and PC-3) (Dr. Claude Labrie, CHUL Research Ce) 10 μg of total RNA extracted from RNA supplied by -MH20-ID05 # RA   [5'-TTTGGATCATTTTCACCACTGTC] (SEQ ID NO: 15) And reverse transcription using Superscript II reverse transcriptase (Gibco BRL). After a while Primer CG026 # FB:     [5'-GTGCTCATAGTCAGAAATGAAG] (SEQ ID NO: 16 ) And mH20-ID05 # RA (this is exon 7/8 to exon 11) Primer pair used for island hops from ligation; PCR product approximately 1.5 5 kb) to amplify single-stranded cDNA. PCR product is 1.2% agar Fractionated on rohse gel.   PCR amplification and mutation screening   All 26 coding exons of BRCA2 and their associated spras Chair sites were amplified from genomic DNA as described (Kamb et al., 1992). 94b). DNA sequences of primers (some of which are used for amplification and sequencing) (Present in the flanking intron sequence used) appear in Table 2. Exon's Some (2-10, 11-5, 11-6, 11-7 and 23-2 7) was amplified by a single step method. PCR articles for these exons These were: a single denaturation step at 95 ° C (1 minute); 40 cycles of 96 ° C (6 seconds) ), Tann. = 55 ° C (15 seconds) and 72 ° C (1 minute). Other ex Song (11-22) required nested reamplification after the primary plasma PCR reaction . In these cases, the first amplification is shown in the first two columns of Table 2 as described above. The primers were run in 19 cycles. Nesting about these exons Re-amplification was performed at 28 or 3 under the same conditions with the primers appearing in the third column of Performed for two cycles. Buffer conditions were as described (Kamb et al., 1). 994b). 0.8% agarose gel using Qiaex beads (Qiagen) Was purified. The purified product is used for Ampli-Cycle.TMSequencing kit (Perkin  Α-P using Elmer, Branchburg, NJ)32  Cycle sequencing with dATP Was analyzed by Reaction products were fractionated on a 6% polyacrylamide gel. all The reaction (A) was loaded adjacent to each other, followed by the reaction (C). Polymorphism detection Ejection was carried out with the naked eye to check for other chains. Example 4 Identification of BRCA2 Assembly of full length BRCA2 sequence   Using cDNA as template for amplification, hybrid selection, exon capture, cD From NA library screening, genomic sequencing, and PCR experiments By combining several smaller sequences, the full length of BRCA2C The array was assembled (ie, “island hopping”) (FIG. 2). Predicted translation star Modified 5 'RACE protocol at the extreme 5' end of the mRNA, including the (Stone et al., 1995). The first nucleotide in the sequence ( Nucleotide 1) is a non-template G (the mRNA cap is included in the sequence index). One of the exons located inside the BRCA2 cDNA (exon 11 ) Is approximately 5 kb. Public domain (ftp: // genome, wustl.ed u / pub / gscl / brca) The analysis identified a portion of exon 11. This genome sequence has 160 sequences The contig set was condensed with the genomic sequence determined by us. Condensed geno Scanning the open sequence frame (ORF) into a long ORF An adjacent stretch of approximately 6 kb across was identified. Two previously identified The sequences were ligated together by an island hopping experiment with candidate gene fragments. Present The row composite BRCA2 cDNA sequence consists of 11,385 bp but contains polyadenyl It does not contain an activation signal or poly (A) tail. This cDNA sequence is represented by SEQ ID NO: 1. And FIG.   Structure of BRCA2 gene and BRCA2 polypeptide   The hypothetical translation of the cDNA begins at nucleotide 229 with a prediction of 3418 amino acids. The ORF encoding the protein was identified. The peptide has a different sequence composition. Does not carry discernable similarity to proteins. Signal sequence at amino terminus There is no apparent transmembrane region. Like BRCA1, the BRCA2 protein is Heavily charged. Approximately 1/4 of the residues were acidic or basic.   The BRCA2 gene structure was determined by comparing the cDNA and genomic sequences. BRCA2 has 27 exons distributed over approximately 70 kb of genomic DNA. Become. The CpG-rich region at the 5 'end of BRCA2 extending upstream Suggests the presence of regulatory signals often associated with pG "islets". Southern Block BRCA2C seems to be unique based on There is no close homolog.   BRCA2 expression experiment   Hybridization of labeled cDNA to human multiple tissue Northern filter Revealed an 11-12 kb transcript that was detectable only in testis. This Transcript size indicates that the BRCA2 mRNA sequence is missing from our composite cDNA Suggests that little has been done. Northern filters do not contain mammary gland RNA. As a result, RT-PCR experiments using BRCA2 cDNA And three prostate cancer cell line RNAs. All systems produced a positive signal. In addition, the BRCA2 amplicon (1-BrCG206 → 5 kb) and 5′R Use ACE PCR to compare mammary and thymic cDNAs as templates for amplification did. In both cases, the product is amplified more efficiently from the breast than from the thymus Was.   Germline mutations in BRCA2   Individuals from 18 putative BRCA2 families were analyzed for BRC by DNA sequencing analysis. Screened for A2 germline mutations (Wooster et al., 1994). 12 Of families have at least one case of male breast cancer and four families have more than one case. And four families have ovarian cancer with a linked BRCA2 haplotype. Includes at least one affected individual. Each of the 18 families has at least 69% B Nine families have a posterior probability of more than 90% with a posterior probability of having an RCA2 mutation Having a rate. Based on these combined probabilities, 16 out of 18 families have BRCA Two mutations are expected to segregate. 9 using cDNA or genomic DNA Multiple coding sequences and associated splices in multiple individuals from Binding was screened for mutations (Table 3). From the remaining nine families Individuals were screened for mutations using only genomic DNA. these After Screening experiments were performed on the coding sequence (all exons except exon 15). Song) and all but two of the splice junctions.  Sequence alterations were identified in 9 out of 18 families. All but one are readyy BRCA2 protein containing nucleotide deletions that alter the Lead to the truncated shape. One exception contained a deletion of 3 nucleotides (family 10 19). All nine mutations differed from each other.   A subset of the families was tested for transcript loss. cDNA sample is 9 houses Three of the nine families in the group that were available in the family Ft mutation. Known to be heterozygous in genomic DNA Specific polymorphic sites were examined with cDNA from pedigree individuals. At these polymorphic sites The emergence of hemizygosity leads to evidence for mutations leading to reduced mRNA levels and solutions. Was released. Only one of the six cases with no detectable sequence alteration (family 236 In 7), such a regulatory mutation was deduced. In addition, suddenly the frameshift One of three families with the mutation (family 2044) exhibited signs of transcript loss. Was. This indicates that some mutations in the BRCA2 coding sequence Means that in addition to disrupting the quality sequence, it may destabilize the transcript You. Such a mutation has been observed in BRCA1 (Friedman et al., 1995). Thus, 56% of families (10-18) contain the modified BRCA2 gene. Was.   Role of BRCA2 in cancer   Most tumor suppressor genes identified to date have function Do not result in non-functional or impaired protein products. TP53 sudden change Most of the differences are missenses; some of these are functions of the wild-type product. (Shaulian et al., 1991). 2: Srivastava et al., 1993). A similar dominant negative mechanism of action is the truncated molecule Adenoma Polyposiscoli (APC) Alleles That Cause Acute Gene (Su et al., 1993) and Wilm tumors that alter DNA binding of proteins A point mutation in the gene (WT1) has been proposed (Little et al., 1993). The nature of the mutations observed in the BRCA2 coding sequence indicates that the mutation is dominant negative. Or production of non-functional proteins.Example 5 Analysis of BRCA2 gene   The structure and function of the BRCA2 gene were determined according to the following method.   Biological experiments   Construction of a mammalian expression vector containing BRCA2 cDNA, Were transfected into appropriate mammary carcinoma cells with lesions in. wild Utilizing type BRCA2 cDNA as well as modified BRCA2 cDNA. Modification N The RCA2 cDNA can be obtained from the modified BRCA2 allele and is described below. Produced as if. In culture (eg cell morphology, doubling time, vessel wall dependence Proliferation) and phenotypic reversion in animals (eg, tumorigenic). The fruit The experiment uses wild-type and mutant forms of the gene (Section B).   Molecular genetics experiments   In vitro mutagenesis was performed to detect deletion mutants and missense mutations. Build variants (single base pair substitutions at individual codons and cluster charge → Lanin scanning mutagenesis). The mutant can be used for biological, biochemical and biological Used in physics experiments.   Mechanism experiment   The ability of the BRCA2 protein to bind to known and unknown DNA sequences is determined. Professional Its ability to transactivate motors is a key factor in transient reporting in mammalian cells. Analyzed by the expression system. Per particle-capture and yeast 2-hybrid system Any functional partner is found and identified using conventional techniques. part Characterize the nature and function of the nut. Now these partners are looking for drug discovery Is a target for   Structural experiment   Recombinant proteins may be produced in E. coli, yeast, insect and / or mammalian cells. Which are used in crystallographic and NMR experiments. Also uses molecular modeling of proteins To use. These experiments facilitate structure-driven drug design.Example6   Two-step assay for detecting the presence of BRCA2 in a sample   Patient samples were prepared according to the method disclosed by Antonarakis et al. (1985). Processed, separated through a 1% agarose gel, and separated for Southern blot analysis. Transfer to iron membrane. Using GS Gene Linker (Bio-Rad), the membrane was V Crosslink. The BRCA2A probe selected from the sequence shown in FIG. Subclone into Z18U. M13K07 helper phage (Bio-Rad, Phagemid on E. coli MV1190 infected with Is transformed. Single-stranded D according to standard procedures (see Sambrook et al., 1989). Isolate NA.   0.5M NaPOFour65% in 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) At C, blots are prehybridized for 15-30 minutes. Following the method The method described in Nguyen et al., 1992 is performed. 25-30ng / ml-main chain 7% SDS containing standard probe DNA, 0.5M NaPOFourMedium, at 65 ° C , Hybridize the lot overnight. Post-hybridization washes 5% SDS at 65 ° C, 40 mM NaPOFourWashing for 30 minutes twice Followed by 1% SDS, 40 mM NaPOFourThan two 30 minute washes in Was something.   Next, blot the blot for 5 minutes at room temperature in phosphate buffered saline (pH 6.8) Rinse, at room temperature for 30-60 minutes, 30-6 with 0.2% casein in PBS. Incubate for 0 minutes and rinse in PBS for 5 minutes. Then 6M urea, 0.3 Hybridization buffer consisting of M NaCl and 5 × Denhardt's solution Pre-incubate blot for 5-10 minutes in a 45 ° C. shaking water bath (Sambrook et al., 1989). Remove buffer, 50-75 μl / cmTwoThe fresh ha Hybridization buffer + universal primer site (UP-AP, Bio- 2.5 nM covalently bridged oligonucleotide with a nucleotide sequence complementary to Replace with do-alkaline phosphatase conjugate. At 45 ° C, The lot is hybridized for 20-30 minutes and at 45 ° C, 6M X 2x 10 min in standard saline citrate (SSC), 0.1% SDS Wash and 1 × 10 min in 1 × SSC, 0.1% Triton X-100 Incubate the blot as a wash. The blot was incubated with 1x SSC at room temperature. Rinse for 0 minutes.   0.1 M diethanolamine, 1 mM MgClTwo0.02% sodium azide Blots at room temperature with shaking in a substrate buffer consisting of pH 10.0 at room temperature. Incubate for minutes. Substrate buffer and 0.2 mM AMPPD (3- ( 2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3'-phosphoryloxy) Phenyl-1,2-dioxetane, disodium salt, Bio-Rad) Place the individual blots in a reusable bag. Incubate at room temperature for 20 minutes with shaking After that, the excess AMPPD solution is removed. X-ray film on blot Exposure overnight. Positive bands indicate the presence of BRCA2.   Example 7 Preparation of polyclonal antibody against BRCA2   A segment of the BRCA2 coding sequence is combined with a fusion protein in E. coli. To be expressed. The overexpressed protein was purified by gel elution and used to rlow and Lane, 1988, using techniques similar to those described by Immunize herons and mice. This approach uses Ab for various other proteins. Has been shown to occur (see, for example, Kraemer et al., 1993).   Briefly, the BRCA2 coding sequence selected from the sequence shown in FIG. The stretch is cloned as a fusion protein in plasmid PET5A (Novagen, Inc., Madison, WI). Predicted molecular weight after induction with IPTG Overexpression of the fusion protein with is confirmed by SDS / PAGE. Fusion protein Is purified from the gel by electrophoresis. Protein sequencing at the N-terminus To confirm the identity of the protein as a BRCA2 fusion product. Next, the purified protein Used as an immunogen in rabbits. In Freund's complete adjuvant, 10 Rabbits were immunized with 0 μg of protein and initially in Freund's incomplete adjuvant. 100 μg of immunogen followed by 100 μg of immunogen in PBS at 2 Inject booster times. The antibody containing serum is collected for the next two weeks.   This procedure is repeated to obtain antibodies against mutant forms of the BRCA2 gene . Using these antibodies in combination with antibodies against wild-type BRCA2, The presence and relative levels of mutant forms in human tissues and biological fluids To detect.   Example 8 Preparation of monoclonal antibody specific to BRCA2   A monoclonal antibody is prepared according to the following protocol. Well-known Keyhole limpet hemasia using glutaraldehyde or EDC Intact BRCA2 or BRCA2 peptide conjugated to Nin (wild type And mutants).   The immunogen is mixed with the adjuvant. Each mouse receives 10 to 100 μg of Four injections of the source were taken and a blood sample was taken from the mice after the fourth injection To determine whether the serum contains antibodies to the immunogen. Serum titer is EL Measured by ISA or RIA. Serum indicating the presence of antibodies to the immunogen The carrying mouse is selected for the hybridoma product.   The spleen is removed from the immunized mouse and a single cell suspension is prepared (Har1ow and Lane .1988). Cell fusion is substantially achieved by Kohler and Milstein, 1975. Perform as described above. In short, Harlow and Lane, 1988 Use polyethylene glycol as described and use P3.65.3 myeloma. Cells (American Type Culture Collection, Rockville, MD) with immune spleen cells Fuse. 2x10 in 96 well culture plateFiveFine at cell / well density Plate the cells. Individual wells are examined for growth and wild type or mutant B Wells grown by ELISA or RIA using RCA2 target protein Are tested for the presence of BRCA2-specific antibodies. Cells in positive wells Expand and subclone to establish and confirm monoclonality.   Clones with the desired specificity are propagated in mice as or ascites. Grow in empty fiber systems to provide sufficient antibodies for characterization and assay development obtain.   Example 9 Sandwich assay for BRCA2   Monoclonal antibodies against solid surfaces such as plates, tubes, beads or particles Attach body. Preferably, the antibodies are added to the wells of a 96-well ELISA plate. Attach to surface. BRCA2 peptide / protein (wild type or mutant) Add 100 μl sample (eg, serum, urine, tissue cytosol) to solid phase antibody Add. Incubate the sample at room temperature for 2 hours. Next, decant the sample fluid Wash the solid phase with buffer to remove unbound material. (BRCA2 peptide / protein 100 μl of the second monoclonal antibody (for antigenic determinants on the quality) is added to the solid phase I do. This antibody is linked to a detector molecule (eg,125I, enzyme, phosphor or chromogen The solid phase bearing the second antibody is incubated at room temperature for 2 hours. Second The antibody is decanted and the solid phase is washed with buffer to remove unbound material.   Determine the amount of bound label proportional to the amount of BRCA2 peptide / protein present in the sample. Weigh. Monoclonal antibodies specific to wild-type BRCA2 and BRCA2 Separate assays using monoclonal antibodies specific for each of the identified mutations I do.   Example 10 6174delT mutation common in Ashkenaz Jewish women with breast cancer   The 6174delT mutation (see Table 3) is a Ashkenaz Jew with breast cancer. It has been found to be present in many cases in women (Neuhausen et al., 1996). # Two groups of probands consisted of confirmation of this experiment. The first group is Confirmation was based on both age of onset and positive family history. The first group is breast cancer homes Includes probands with breast cancer before age 41, with or without tribal history Tsu Was. The criteria for inclusion in the second group are that the proband should have breast or ovarian cancer before age 50. Having breast cancer between the ages of 41 and 51 with one or more first-degree relatives affected Or two or more probands with breast or ovarian cancer before age 50 Having breast cancer between the ages of 41 and 51 with a second-degree relative; Hazard afflicted between the ages of 41 and 51 with both primary breast and primary ovarian cancer Was to be. The proband has medical oncology and gene counseling clinics. , And endeavored to provide study participation to all appropriate patients. family History was obtained by a self-report questionnaire. Histological confirmation of the diagnosis Gained in the proband in the case. Religious background can be self-reported or interviewed Therefore, it was confirmed for all probands.   Mutation detection   The BRCA2 6174delT mutation was constructed using the standard polymerase chain reaction (PC R) Method (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986; Weber and May, 19) 89) and was detected by amplifying genomic DNA from each patient. P Primers used for CR   BC11-RP: GGGAAGCTTCATAAGTCAGTC (SEQ ID NO: 115) (forward primer) and   BC11-LP: TTTGTAATGAAGCATCTGATACC (SEQ ID NO: No .: 116) (Reverse primer) It is. The reaction was performed in a total volume of 10.0 μl containing 20 ng DNA, Annealed at 55 ° C. This technique is 97 bp long, 6 The presence of the 174delT mutation results in a 96 bp long PCR product . Radiolabeled PCR products were converted to standard 6% polyacrylamide at 65 W for 2 hours. It was subjected to electrophoresis on a sex sequencing gel. The gel is then dried and autoradiographed. Attached to Raffy. All cases exhibiting a 1 bp deletion were sequenced and 6174 The delT mutation was confirmed. For sequencing, one half of the sample was The coding strand is sequenced and the other half of the sample is Amplified with primers and non-coding strand was sequenced. One set of PCR plies Mar Is   TD-SFB: AATGATGAATGTAGCACGC (SEQ ID NO: 117 ) (Forward primer) and   CGORF-RH: GTCTGAATGTTCGTTTACT (SEQ ID NO: 11 8) (Reverse primer) Met. This resulted in a 342 bp 6174delT mutation in the wild type. A 341 bp amplification product was obtained for the sample containing About this set of samples Uses the CGORF-RH primer for sequencing primers and amplifies DN A was sequenced. The other half of the sample contains BC11-RP forward primer and Amplified using CGORF-RH reverse primer, 183 bp wild type sample A 182 bp fragment was obtained in the sample containing the 6174delT mutation. This It was sequenced using BC11-RP as sequencing primer.   result   Six out of 18 women of the Ashkenaz Jewish ancestry with breast cancer 42 years old are 61 It had a 74delT mutation. This is a non-Semitic who had breast cancer 42 years ago. This is comparable to the zero case where the mutation is present in the control group of women and women. These cases are , Confirmed without regard to family history. Table 4 shows the results of the study. 6174 Four of the six cases with the delT mutation are associated with first or second degree relatives. Had a family history of breast or ovarian cancer. Multiple samples obtained for analysis In each of the two possible families, the 6174delT mutation was associated with breast cancer or ovary. Co-segregated with more than one case of cancer. Have breast cancer at the age of 42-50, and Has a history of at least one additional relative with ovarian cancer. Jim's second cohort provides further estimates of the frequency of the 6174delT mutation. Was provided. In this group of 27 women, two were BRCA2 6174 delT Heterozygous for the mutation. One of these individuals had ovarian cancer and Had first-degree relatives with breast cancer. From data shown, and BRC A similar penetrance to the A1 mutation (Offit et al., 1996; Langston et al., 1996). Assuming that the frequency of the 6174delT mutation in Ashkenazi was around 1000 Was It can be estimated that there are almost three people. However, if this mutation If the penetrance is lower than BRCA1, the frequency of this mutation will be higher. A Carrier frequency of the 6174delT mutation in individuals of Shikenaz Jewish descent More accurate estimates of will emerge from large population studies.  key:  a- Confirmed regardless of family history b-The family history of this group is one first degree or two diagnosed with breast or ovarian cancer. Second degree relative of 1 defined as 50 years old   Example 11   BRCA2 is found in breast carcinoma and other cancers including ovarian and pancreatic cancer 9 shows the low somatic mutation rate.   BRCA2 is a tumor suppressor gene. Homozygous deletion of this gene It can lead to cancer as well as other cancers. Homozygous deletions in pancreatic xenografts are positive. Useful in efforts to isolate BRCA2 by regional cloning. If 1 Lack of two BRCA2 alleles and mutations in the remaining alleles Terrorism or loss of LOH) can result in cancer. Also conflict Mutations in the gene can lead to cancer progression. Different for research here An analysis of 150 cell lines derived from the cancer showed a loss of homozygosity for the BRCA2 gene. Did not reveal the source. Because the loss of homozygosity is clearly rare, BRC Studies were conducted to experiment with smaller foci such as point mutations in A2 . Since compound mutant heterozygotes and mutant homozygotes are rare, tumors Tumor suppressor gene inactivation almost always involves LOH. The remaining alleles If inactive, it typically contains a disruptive mutation. Identify these To achieve this, a tumor or cell line that exhibits LOH at the locus of interest is predicted. It is useful to make a selection.   Identification of tumors and cell lines presenting LOH   A group of 104 primary breast tumor samples and a set of 269 cell lines Were tested for LOH. For primary tumors, three short Tandem repeat markers (STR) were quantitatively compared. Tag fluorescently The following three sets of attached STRs: (1) mM4247.4A.2F1 ACCATCAAACACATCATCC (SEQ ID NO: 119)     mM4247.4A.2R2 AGAAAGTAACTTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 120)   (2) STR257-FC CTCCTGAAACTGTTCCCTTTGG (SEQ ID NO: 121)       STR257-RD TAATGGTGCTGGGGATATTTGG ( (SEQ ID NO: 122)   (3) mMB561A-3.1FA2 GAATGTCGAAGAGCTT GTC (SEQ ID NO: 123)   mMB561A-3. IRB AAACATACCGCTTAGCCAGAC (G SEQ ID NO: 124) Around 10 ng of genomic DNA was amplified by PCR. ABI 377 Resolve the PCR product using a sequencer and use Genescan software (ABI) Quantified. For tumors, between the alleles amplified from normal and tumor samples Distinct peak height differences were scored as having LOH. About cell lines Thus, if one STR is heterozygous, the sample is non-LOH I took the core. In one case only, after single-base polymorphism, There were cell lines or tumors that were misnamed based. Hetero for markers The bondability index is: STR4247 = 0.89; STR257 = 0.72; STR56 1A = 0.88 (S. Neuhausen, personal communication; B. Swed1und, unpublished data). It Based on their combined heterozygosity index, markers can be identified for a particular individual (chain linkage). Chance of being all homozygous in only one of 250) No. LOH is exclusively lost in tumors due to the presence of normal cells in the primary tumor sample Hardly eliminates signals from the selected alleles. Rather, two alleles The relative strength of the offspring is modified. This increases the peak allele height from normal tissue. It can be clearly observed by comparing with the peak height from the tumor (FIGS. 5A-5D). Based on this analysis, 30 tumors (29%) had LOH at the BRCA2 locus. (FIG. 5). Diagram similar to previous estimates (Col1ins Et al., 1995; C1eton-Jansen et al., 1995).   LOH was evaluated in different ways on a set of cell lines. E for all three STRs Since mozygosity is uncertain and there are no normal cells, all STRs Any apparent homozygosity was interpreted as LOH in the BRCA2 region. this Using the criteria, 85/269 of the cell lines exhibited LOH (Table 5). Frequency should be considered Was It varied according to the specific tumor cell type. For example, the 4/6 ovarian cell line and 31/6 The two lung cancer cell lines were compared to the 17/81 melanoma line and the 2/11 breast cancer cell line. , LOH.   Sequence analysis of LOH primary breast tumors and cell lines   The 30 primary breast cancers identified above, which showed LOH in the BRCA2 region, had sequence alterations. Screened by DNA sequence analysis for variants. More than 95% The coding sequence and splice junction were examined. DNA sequencing was performed using ABI 37 7 (Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer) or manually. Release In the radioactive mutation screening, Qiagen beads (Qiagen, Inc.) were used. Thus, the amplification product was purified. DNA sequence is determined by Cyclist sequencing kit (Stratagene) And resolved on a 6% polyacrylamide gel. In parallel, Taq Perform non-radioactive sequencing using fluorescent labeled dyes using the FS sequencing kit, And electrophoresed on an ABI 377 sequencer. 96-well tray The cells were placed in a lattice to facilitate PCR and sequencing. Specific PCR and The omission of the sequencing reaction was repeated until> 95% coverage was obtained for each sample. Arrangement Column information was analyzed with Sequencher software (Gene Codes Corporation). all Detected mutations were detected by sequencing the newly amplified PCR product. And confirmed that sequence alterations were not possible due to PCR artifacts. L0H Analysis of Cell Lines and Primary Breast Cancer The percentage L0H can be determined in two ways: Calculated as the average of the sum and percentage   Of the 30 samples, two were frameshift mutations and one was nonsense Mutations, and two contained missense changes (but not in these tumors). One included frame shifts). The nonsense mutation is 1 at the C-terminus. 56 codons were deleted, indicating that the C-terminus of BRCA2 was Significant. In addition, all sequence variants were obtained from these cancer carriers. Of the corresponding normal DNA. Preselection of LOH for mutation detection Introduce an overall bias (eg, dominant behavior of mutations, complex heterozygosity) Heterogeneous access to BRCA2 to rule out the unlikely possibility of Twelve samples that were shown to be compatible were also screened. 3 of these First, it revealed a missense change that was also found in normal samples. Thus, 42 In a set of breast carcinoma samples (30 of which exhibited LOH at the BRCA2 locus) ), No somatic mutations were identified. Frameshift mutation and Nance Alterations are disease-predisposing mutations that affect breast cancer progression in these patients. It seems to be. Missense mutants are rare; they have been identified during the analysis of 115 chromosomes. , Each was observed only once. From these data, rare neutral polymorphisms And disease-predisposing mutations cannot be distinguished.   Of the 85 cell lines that exhibited LOH (see Table 5), 58 also showed sequence changes. Screened. Screening over 95% of coding sequence in each sample I did it. Only one frameshift mutation was identified by this DNA sequence analysis. Identified. This mutation (6174delT) is present in a pancreatic cancer cell line, What was found in the 111-next tumor sample, and the germline frame previously detected Identical to shift (Tavtigian et al., 1996). This is this particular frame This suggests that the shift appears to be a relatively common germline BRCA2 mutation. In addition, a number of missense sequence variants were detected (Tables 6A and 6B).   Detection of a possible germline BRCA2 mutation in a pancreatic tumor cell line 2 suggests that the mutation may be a predisposition to pancreatic cancer (thorough investigation Not probability). In addition, the mutation was homozygous in pancreatic xenografts. Sporadic pancreatic cancer, previously suggested by sex loss (Shutte et al., 1995) You Weight of BRCA2 involvement in Only three pancreatic cell lines were studied in our study Have warranted further investigation of BRCA2 mutations in pancreatic cancer. You.List of germline mutations identified in BRCA2 Mutation position based on the entry tree (Schutte et al., 1995) Common polymorphisms and silent substitutions were detected in BRCA2 by DNA sequencing. Was. Because some rare silent variants can affect gene function (eg, Pricing (Richard and Beckmann, 1995)), which preceded 'PM'. Absent. The indicated polymorphic frequencies include the second nucleotide pair. Report from previous experiment The reported frequency is shown in parentheses (Tavtigian et al., 1996). Numbering is the same as in Table 6A. You.Industrial applicability   As mentioned above, the present invention is used to test an individual's BRCA2 allele. Substances and methods used and interpretation of the normal or disease predisposing properties of the allele I will provide a. Individuals with higher than normal dangers are appropriately assigned to their lifestyle Can be modified. In the case of BRCA2, most significant non-genetic risk factors are early It is a protective effect on pregnancy during the entire period. Dangerous women therefore have early child acquisition or design It can be considered that the given therapy stimulates the hormonal effects of pregnancy for the entire early period. High risk Women are highly motivated to strive for early detection and learn and perform breast self-examination Be killed. Such women are greatly motivated to obtain legitimate mammograms, It will probably start earlier than the general population. Ovarian screen more frequently A leaning can be done. A diagnostic method based on sequence analysis of the BRCA2 locus Applicable for tumor detection and classification. Predictive lesions can be diagnosed using sequence analysis . Advances in the method and accumulation of information about BRCA2 and other causative loci This makes it possible to classify cancer into benign and malignant.   Women with breast cancer are more likely to be predisposed if they are predisposed Rather, if they may have additional cancer, follow surgical procedures. I can. Either peptides or small molecules (rational drug design) Can be used to develop other therapies. Peptides are either missense gene products themselves or May be part of the missense gene product. Alternatively, the therapeutic agent may be a deleterious gene Counteracts the deleterious effects of another molecule that mimics the function or inherited locus Can be a peptide or non-peptide molecule that is sought to be In addition, therapy To generate a protein that counteracts the effects of the harmful allele, It can be gene-based, through introducing a progeny into the individual. this Their gene therapy can take many forms and prevent tumors from forming Once the cancer has developed, it can be cured or stopped from spreading. And can be turned to.   The methods and compositions of the present invention can be integrated in the form of various embodiments, It will be appreciated that some of them are only disclosed herein. other It will be apparent to one skilled in the art that specific examples exist and do not depart from the spirit of the invention. Or Thus, the specific examples described are illustrative and should not be construed as limiting. Absent.List of references American Cancer Society, Cancer Facts & Figures-1992. (American Cancer So ciety, Atlanta, GA). Anand, R. (1992) .Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press). Anderson, et al. (1980) .Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: 5399-5403. Anderson, D.E. (1972) .J. Natl. Cancer Inst. 48: 1029-1034. Anderson, J.A., et al. (1992). J. Otolaryngology 21: 321. Antonarakis, S.E., et al. (1985) .New Eng. J. Med. 313: 842-848. Ausubel, F.M., et al. (1992) .Current Protocols in Molecular Biology, (J. Wilc. y and Sons, N.Y.) 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【手続補正書】 【提出日】１９９９年３月１日（１９９９．３．１） 【補正内容】 補正した請求の範囲 １．（ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ２ポリペプチド をコードするＤＮＡ； （ｂ）該ＢＲＣＡ２ポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイズし、か つそれに対して少なくとも９５％相補性であるＤＮＡ； （ｃ）野生型ＢＲＣＡ２遺伝子核酸； （ｄ）乳癌への素因に関連する該ポリペプチドの突然変異形態をコードするＤ ＮＡの突然変異形態を含むＤＮＡ、または対応するＲＮＡ；および （ｅ）野生型ＢＲＣＡ２遺伝子核酸にハイブリダイズし、かつそれに対して少 なくとも９５％相補性であって、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異によって該遺伝 子機能を欠失しているか、または遺伝子機能が変化している細胞に野生型ＢＲＣ Ａ２遺伝子機能を供給するための遺伝子療法で使用するための野生型ＢＲＣＡ２ 遺伝子核酸と実質的に同一の機能を有する核酸；よりなる群から選択される単離 核酸。 ２．（ｉ）配列番号：１記載のヌクレオチド配列または対応するＲＮＡ、およ び（ｉｉ）配列番号：１記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異型または対応 するＲＮＡよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載の単 離核酸。 ３．乳癌または卵巣癌への素因に関連する配列番号：１記載のヌクレオチド配 列の突然変異形態を含むＤＮＡまたは対応するＲＮＡである請求項１記載の単離 核酸。 ４．（ａ）ヌクレオチドポジション２７７および２７８のＡＣが欠失している 配列番号：１； （ｂ）ポジション９８２−９８５の４個のヌクレオチドが欠失している配列番 号：１； （ｃ）ポジション４７０６−４７０９の４個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｄ）ヌクレオチドポジション８５２５のＣが欠失している配列番号：１； （ｅ）ポジション９２５４−９２５８の５個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｆ）ヌクレオチドポジション４０７５および４０７６のＧＴが欠失している 配列番号：１； （ｇ）ポジション９９９−１００３の５個のヌクレオチドが欠失している配列 番号：１； （ｈ）ヌクレオチドポジション６１７４のＴが欠失している配列番号：１； （ｉ）ポジション４１３２−４１３４の３個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｊ）ポジション４５１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｋ）ポジション１０９３のＡの代りにＣを有する配列番号１； （ｌ）ポジション１２９１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｍ）ポジション１４９３のＡが欠失している配列番号：１； （ｎ）ポジション２１１７のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｏ）ポジション２４１１のＡの代りにＣを有する配列番号：１； （ｐ）ポジション４８１３のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ｑ）ポジション５８６８のＴの代りにＧを有する配列番号：１； （ｒ）ポジション５９７２のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｓ）ポジション６３２８のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｔ）ポジション７０４９のＧの代りにＴを有する配列番号：１； （ｕ）ポジション７４９１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｖ）ポジション９５３７のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｗ）ポジション１０２０４のＡの代りにＴを有する配列番号：１； （ｘ）ポジション１０２９８のＣの代りにＧを有する配列番号：１； （ｙ）ポジション１０４６２のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｚ）ポジション２０３のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ａａ）ポジション１３４２のＣの代りにＡを有する配列番号：１； （ｂｂ）ポジション２４５７のＴの代りにＣを有する配列番号：１； （ｃｃ）ポジション３１９９のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｄｄ）ポジション３６２４のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｅｅ）ポジション３６６８のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｆｆ）ポジション４０３５のＴの代りにＣを有する配列番号：１； （ｇｇ）ポジション７４７０のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｈｈ）ポジション１５９３のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｉｉ）ポジション４２９６のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ｊｊ）ポジション５６９１のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｋｋ）ポジション６０５１のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｌｌ）ポジション６８２８のＴの代りにＣを有する配列番号：１；および （ｍｍ）ポジション６９２１のＴの代りにＣを有する配列番号：１よりなる群 から選択される請求項３記載の単離核酸。 ５．（ａ）ＢＲＣＡ２遺伝子調節配列を含む野生型、および （ｂ）ＢＲＣＡ２ポリペプチドの発現をイン・ビボ(in vivo)で阻害または妨 害する突然変異を有するＢＲＣＡ２遺伝子調節配列よりなる群から選択されるＢ ＲＣＡ２遺伝子調節配列に作動可能に連結されている請求項１〜４いずれか１項 記載の単離核酸。 ６．請求項１〜４いずれか１項記載の少なくとも１５個の隣接する核酸を有す る単離核酸であって、ここに核酸配列が、試料中の（ｉ）配列番号：１記載のヌ クレオチド配列、その対立遺伝子変異型およびその突然変異形態から選択される ヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、または（ｉｉ）該ＤＮＡに対応するＲＮＡ； を検出するためのハイブリダイゼーション・プローブとしての使用に適している ことを特徴とする該核酸。 ７．突然変異を包含する、請求項３または４記載の少なくとも１５個の隣接す る核酸を有する請求項６記載の単離核酸。 ８．（ａ）請求項１〜４、６または７いずれか１項記載の単離核酸を含むべク ター；および （ｂ）請求項１〜４いずれか１項記載の単離核酸を含むベクターよりなる群か ら選択されるベクターであって、 ここに、該核酸が、当該ベクターについて宿主細胞中の該核酸の発現を指示す ることができるプロモーター配列に作動可能に連結されていることを特徴とする 該ベクター。 ９.請求項８記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞 。 １０．請求項１記載の配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ２ポ リペプチドまたは該ポリペプチドの修飾形態であるポリペプチドの産生方法であ って、（ｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件下にて該ポリペプチドをコード する発現ベクターを含有する請求項９記載の宿主細胞を培養し；次いで、 （ｉｉ）該ポリペプチドを回収することを特徴とする該方法。 １１．他のヒト蛋白質を実質的に含まないヒトＢＲＣＡ２ポリペプチドの調製 物であって、 （ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｂ）配列番号：２記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同性を有するア ミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｃ）請求項３記載の核酸の発現によって得ることができる突然変異ヒトＢＲ ＣＡ２ポリペプチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれか１に記載したポリペプチドの抗原 性フラグメント； （ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）いずれか１のポリペプチドとの融合蛋白質 ；および （ｆ）野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドに実質的に相同であって、実質的に同様 の機能を有するポリペプチド、その機能性部分および該野生型ＢＲＣＡ２ポリペ プチドの機能を模倣する分子； よりなる群から選択される、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異によって野生型ＢＲ ＣＡ２遺伝子機能を欠失したか、または該遺伝子機能が変化している細胞に野生 型ＢＲＣＡ２遺伝子機能または該野生型と実質的に同様のＢＲＣＡ２機能を供給 するためのペプチド療法で使用するための該調製物。 １２．請求項１１記載の１またはそれを超えるポリペプチドに特異的に結合す ることができる抗体であって、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で ある該抗体。 １３．抗体産生用の免疫原としての請求項１１記載のポリペプチドペプチドの 使用。 １４．核酸増幅反応によるＢＲＣＡ２遺伝子のヌクレオチド配列のヌクレオチ ド配列を決定するための一本鎖オリゴヌクレオチド・プライマー対であって、こ こに該プライマーの配列がヒト第１３染色体由来であって、核酸増幅反応におけ る該プライマーの使用の結果、ＢＲＣＡ２遺伝子の配列の全体または一部分に対 応するＤＮＡおよび／またはＲＮＡが合成されることを特徴とする該プライマー 。 １５．配列番号：１記載のヌクレオチド配列を有するＢＲＣＡ２遺伝子の配列 および／またはヒトにおける乳癌への素因に関連するその突然変異形態の全体ま たは一部分を判定するための請求項１４記載のプライマー対。 １６．予想される突然変異ＢＲＣＡ２対立遺伝子のヌクレオチド配列と野生型 ＢＲＣＡ２ヌクレオチド配列とを比較することを含む予想される突然変異ＢＲＣ Ａ２対立遺伝子中の突然変異ＢＲＣＡ２ヌクレオチド配列の同定方法であって、 ここに予想される突然変異配列と野生型配列との間の相異により突然変異ＢＲＣ Ａ２ヌクレオチド配列を同定することを特徴とする該同定方法。 １７．突然変異検出用のキットであって、 （ａ）核酸増幅反応によってＢＲＣＡ２遺伝子のヌクレオチド配列を決定するた めの１セットの一本鎖オリゴヌクレオチド・プライマー、ここに該プライマーの 配列がヒト第１３染色体由来であって、核酸増幅反応における該プライマーの使 用の結果、ＢＲＣＡ２遺伝子の配列の全体または一部分に対応するＤＮＡおよび ／またはＲＮＡが合成されることを特徴とする該プライマー、ならびにＢＲＣＡ ２遺伝子中の変化を検出することに関する指示書； （ｂ）ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異に対する少なくとも１の対立遺伝子−特異的 オリゴヌクレオチド・プローブ、およびＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異を検出す ることに関する指示書；ならびに （ｃ）ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異に対して特異的な少なくとも１のオリゴヌク レオチド・プライマー、およびＢＲＣＡ２中の突然変異を検出することに関する 指示書；よりなる群から選択される該キット。 １８．潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法であって： （ａ）（ｉ）ＢＲＣＡ２ポリペプチド結合パートナー、（ｉｉ）配列番号：２ 記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび該結合パートナーに結合する該 アミノ酸配列の一部分を有するポリペプチドよりなる群から選択されるＢＲＣＡ ２ポリペプチド、ならびに（ｉｉｉ）癌治療剤であると予想される化合物を合し 、次いで、ＢＲＣＡ２ポリペプチドのその結合パートナーに対する結合量を測定 すること； （ｂ）ＢＲＣＡ２ポリペプチド結合パートナーと癌治療剤であると予想される 化合物とを合し、該結合パートナーの生物活性を測定すること； （ｃ）癌治療剤であると予想される化合物の存在下にて、癌への素因に関連す る変化したＢＲＣＡ２遺伝子を含有する形質転換真核生物宿主細胞を増殖させ、 次いで、該宿主細胞の増殖速度を測定すること；ならびに （ｄ）癌への素因に関連する変化したＢＲＣＡ２遺伝子をそのゲノム中に運搬 しているトランスジェニック動物に癌治療剤であると予想される化合物を投与し 、次いで、癌病変の発病または増殖を判定すること；よりなる群から選択される 該方法。 １９．変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子を運搬するトランスジェニック動物。 ２０．変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子が、（ａ）欠失を含む変化したＢＲＣＡ ２対立遺伝子、（ｂ）ナンセンス突然変異を含む変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子 、（ｃ）フレームシフト突然変異を含む変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子、（ｄ） ミスセンス突然変異を含む変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子、ならびに（ｅ）破壊 された対立遺伝子である変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子よりなる群から選択され る、請求項１９記載のトランスジェニック動物。 ２１．ヒト対象における乳癌への素因を診断する方法であって、該対象の組織 試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列中に、その遺伝子調節領域中にまたはその発現 産物中に生殖系列変化が存在するか否かを判定することを含み、該対象の生殖系 列配列中の該変化が該癌への素因の指標であることを特徴とする該方法。 ２２．ヒト対象における病変からの試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列中に、そ の遺伝子調節配列中にまたはその発現産物中に変化が存在するか否かを判定する ことを含むＢＲＣＡ２遺伝子座における新生生物について該ヒト対象における病 変を診断する方法であって、ここに該変化がＢＲＣＡ２遺伝子座における新生生 物の指標であることを特徴とする該方法。 ２３．該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列と、配列番号：１記載の配列および その野生型対立遺伝子変異型から選択される１またはそれを超える野生型ＢＲＣ Ａ２遺伝子配列の配列とを比較することを特徴とする、請求項２１または２２記 載の方法。 ２４．該発現産物が、ＢＲＣＡ２遺伝子のｍＲＮＡおよびＢＲＣＡ２遺伝子に よってコードされるＢＲＣＡ２ポリペプチドよりなる群から選択されることを特 徴とする請求項２１または２２記載の方法。 ２５．変化がＢＲＣＡ２遺伝子の調節領域中に検出されることを特徴とする請 求項２１または２２記載の方法。 ２６．以下の手順： （ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上で、試料からの一本鎖ＤＮＡの電気泳 動移動度のシフトを観察し； （ｂ）ＢＲＣＡ２遺伝子プローブが試料から単離したゲノミックＤＮＡへハイ ブリダイズするのに適した条件下にて、該プローブを該ＤＮＡにハイブリダイズ させ； （ｃ）該試料からのゲノミックＤＮＡへの対立遺伝子特異的なプローブのハイ ブリダイゼーションを判定し； （ｄ）該試料からのＢＲＣＡ２遺伝子の全体または一部分を増幅させて増幅配 列を生成し、その増幅配列を配列決定し； （ｅ）該試料中の特異的ＢＲＣＡ２突然変異対立遺伝子の存在を核酸増幅に よって判定し； （ｆ）該試料からのＢＲＣＡ２遺伝子の全体または一部分を分子クローニング してクローン化配列を生成し、そのクローン化配列を配列決定し； （ｇ）分子（１）該試料から単離されたBＲＣＡ２遺伝子のゲノミックＤＮＡ またはＢＲＣＡ２ ｍＲＮＡと、（２）ヒト野生型ＢＲＣＡ２遺伝子ＤＮＡに相 補的な核酸プローブとが相互にハイブリダイズしてデュプレックスを形成する場 合に、（１）と（２）との分子間に誤対合が存在するか否かを判定し； （ｈ）該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子配列を増幅し、次いで、その増幅配列を野 生型ＢＲＣＡ２遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせ； （ｉ）該組織中のＢＲＣＡ２遺伝子配列を増幅し、次いで、その増幅配列を突 然変異ＢＲＣＡ２遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせ； （ｊ）欠失突然変異についてスクリーニングし； （ｋ）点突然変異についてスクリーニングし； （ｌ）挿入突然変異についてスクリーニングし； （ｍ）該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子と、ＢＲＣＡ２遺伝子配列または突然変異 ＢＲＣＡ２遺伝子配列を含む１または２種以上の核酸プローブとのイン・サイチ ュ（in situ）ハイブリダイゼーションを判定し； （ｎ）イムノブロッティングし； （ｏ）免疫組織化学し； （ｐ）該組織から単離されたＢＲＣＡ２遺伝子蛋白質と、ＢＲＣＡ２突然変異 対立遺伝子のポリペプチド発現産物に特異的に結合することができる結合パート ナーおよび／または配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ２ポリペ プチドに対する結合パートナーとの間の結合相互作用をアッセイし；次いで、 （ｑ）該結合パートナーの生化学活性の阻害についてアッセイする； の１または２以上を行うことを特徴とする請求項２１〜２５いずれか１項記載の 方法。[Procedure amendment] [filing date] 1999, March 1 (1999.3.1) [correction contents] the scope of the claims has been corrected 1. (A) a DNA encoding a BRCA2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a DNA that hybridizes to the DNA encoding the BRCA2 polypeptide and is at least 95% complementary thereto; (C) a wild-type BRCA2 gene nucleic acid; (d) a DNA comprising a mutant form of DNA encoding a mutant form of the polypeptide associated with a predisposition to breast cancer, or a corresponding RNA; and (e) a wild-type A cell that hybridizes to the BRCA2 gene nucleic acid and is at least 95% complementary thereto and that has lost or has altered the function of the gene by mutation in the BRCA2 gene. Wild-type BRCA2 gene for use in gene therapy to supply BRC A2 gene function An isolated nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid having substantially the same function as a nucleic acid; 2 . Claims: (i) a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the corresponding RNA, and (ii) an allelic variant of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the corresponding RNA. 2. The isolated nucleic acid according to 1. 3 . 2. The isolated nucleic acid of claim 1, which is a DNA or corresponding RNA comprising a mutated form of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 associated with a predisposition to breast or ovarian cancer. 4 . (A) SEQ ID NO: 1 with deletion of AC at nucleotide positions 277 and 278; (b) SEQ ID NO: 1 with deletion of 4 nucleotides at positions 982-985; (c) position 4706. SEQ ID NO: 1 wherein 4 nucleotides at 4709 are deleted; (d) SEQ ID NO: 1 wherein C at nucleotide position 8525 is deleted; (e) 5 nucleotides at position 9254-9258 are deleted. SEQ ID NO: 1 missing the GT at nucleotide positions 4075 and 4076; (g) SEQ ID NO: 5 missing the five nucleotides at positions 999-1003. 1; (h) SEQ ID NO: 1 lacking T at nucleotide position 6174; (i) 3 at positions 4132-4134 SEQ ID NO: 1 with C instead of G at position 451; (k) SEQ ID NO: 1 with C instead of A at position 1093; ) SEQ ID NO: 1 having C instead of G at position 1291; (m) SEQ ID NO: 1 having A deleted at position 1493; (n) SEQ ID NO: having T instead of C at position 2117: 1; (o) SEQ ID NO: 1 with C instead of A at position 2411; (p) SEQ ID NO: 1 with A instead of G at position 4813; (q) G instead of T at position 5868. (R) SEQ ID NO: 1 with T instead of C at position 5972; (s) SEQ ID NO: 1 with T instead of C at position 6328; (t) position 7049 (W) SEQ ID NO: 1 with C instead of G at position 7491; (v) SEQ ID NO: 1 with G instead of A at position 9537; (w ) SEQ ID NO: 1 having T instead of A at position 10204; (x) SEQ ID NO: 1 having G instead of C at position 10298; (y) SEQ ID NO: having G instead of A at position 10462: 1; (z) SEQ ID NO: 1 with A instead of G at position 203; (aa) SEQ ID NO: 1 with A instead of C at position 1342; (bb) C instead of T at position 2457. (Cc) SEQ ID NO: 1 having G instead of A at position 3199; (dd) SEQ ID NO: 1 having G instead of A at position 3624; (ee) positive (Ff) SEQ ID NO: 1 having C instead of T at position 4035; (gg) SEQ ID NO: 1 having G instead of A at position 7470. (Hh) SEQ ID NO: 1 having G instead of A at position 1593; (ii) SEQ ID NO: 1 having A instead of G at position 4296; (jj) having G instead of A at position 5691. (Kk) SEQ ID NO: 1 with G instead of A at position 6051; (11) SEQ ID NO: 1 with C instead of T at position 6828; and (mm) T at position 6921. 4. The isolated nucleic acid of claim 3, wherein the nucleic acid is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 having C instead. 5 . B selected from the group consisting of (a) a wild-type containing a BRCA2 gene regulatory sequence, and (b) a BRCA2 gene regulatory sequence having a mutation that inhibits or prevents the expression of a BRCA2 polypeptide in vivo. The isolated nucleic acid of any one of claims 1 to 4, which is operably linked to a RCA2 gene regulatory sequence. 6 . An isolated nucleic acid having at least 15 contiguous nucleic acids according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleic acid sequence is (i) the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 in a sample, an allele thereof. DNA having a nucleotide sequence selected from gene variants and mutant forms thereof, or (ii) RNA corresponding to the DNA; characterized in that it is suitable for use as a hybridization probe for detecting The nucleic acid. 7 . 7. An isolated nucleic acid according to claim 6 having at least 15 adjacent nucleic acids according to claim 3 or 4, which comprises a mutation. <8 . (A) a vector comprising the isolated nucleic acid according to any one of claims 1 to 4, 6 or 7; and (b) a vector comprising the isolated nucleic acid according to any one of claims 1 to 4. Wherein the nucleic acid is operably linked to a promoter sequence capable of directing the expression of the nucleic acid in a host cell for the vector. . 9. A host cell transformed or transfected with the vector of claim 8. 10 ． 2. A method for producing a BRCA2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to claim 1 or a polypeptide which is a modified form of said polypeptide, wherein (i) under conditions suitable for production of said polypeptide. Culturing the host cell according to claim 9, which comprises an expression vector encoding said polypeptide; and (ii) recovering said polypeptide. 11 . A preparation of a human BRCA2 polypeptide substantially free of other human proteins, comprising: (a) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) at least the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polypeptide having an amino acid sequence with 95% homology; (c) a mutant human BRCA2 polypeptide obtainable by expression of the nucleic acid of claim 3; (d) (a), (b) or (c) ) An antigenic fragment of the polypeptide of any one of: (e) a fusion protein with any one of (a), (b) or (c); and (f) substantially a wild-type BRCA2 polypeptide. Polypeptides that are substantially homologous and have substantially similar functions, functional portions thereof, and molecules that mimic the function of the wild-type BRCA2 polypeptide; A wild type BRCA2 gene function or a wild type BRCA2 gene function or a wild type BRCA2 gene function is deleted from a cell selected from the group consisting of: The preparation for use in peptide therapy to provide similar BRCA2 function. 12 . An antibody capable of specifically binding to one or more polypeptides of claim 11, wherein the antibody is a polyclonal or monoclonal antibody. 13 . Use of the polypeptide peptide of claim 11 as an immunogen for the production of antibodies. 14 . A single-stranded oligonucleotide primer pair for determining the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the BRCA2 gene by a nucleic acid amplification reaction, wherein the primer sequence is derived from human chromosome 13 and The primer characterized in that DNA and / or RNA corresponding to all or a part of the sequence of the BRCA2 gene are synthesized as a result of using the primer. 15 . 15. A primer pair according to claim 14, for determining the whole or a part of the sequence of the BRCA2 gene having the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 and / or its mutated form associated with a predisposition to breast cancer in humans. 16 . A method of identifying a mutated BRCA2 nucleotide sequence in a predicted mutated BRC A2 allele comprising comparing the nucleotide sequence of the predicted mutated BRCA2 allele with a wild-type BRCA2 nucleotide sequence, comprising: Identifying a mutated BRC A2 nucleotide sequence by differences between the mutated sequence to be made and the wild-type sequence. 17 . A kit for mutation detection, comprising: (a) a set of single-stranded oligonucleotide primers for determining the nucleotide sequence of the BRCA2 gene by a nucleic acid amplification reaction, wherein the sequence of the primers is derived from human chromosome 13 Wherein the use of the primer in a nucleic acid amplification reaction results in the synthesis of DNA and / or RNA corresponding to all or a part of the sequence of the BRCA2 gene, and a change in the BRCA2 gene. (B) at least one allele-specific oligonucleotide probe for the BRCA2 gene mutation, and instructions for detecting the mutation in the BRCA2 gene; and (c) the BRCA2 gene. At least specific for the mutation The oligonucleotide primers, and instructions for detecting a mutation in BRCA2; the kit selected from the group consisting of: 18 . A method for screening potential cancer therapeutics, comprising: (a) (i) a BRCA2 polypeptide binding partner, (ii) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and the amino acid binding to the binding partner Combining a BRCA2 polypeptide selected from the group consisting of polypeptides having a portion of the sequence, and (iii) a compound predicted to be a cancer therapeutic, and then determining the amount of BRCA2 polypeptide binding to its binding partner. (B) combining a BRCA2 polypeptide binding partner with a compound expected to be a cancer therapeutic and measuring the biological activity of the binding partner; (c) anticipated to be a cancer therapeutic Transformed genes containing an altered BRCA2 gene associated with a predisposition to cancer in the presence of a compound Growing a biological host cell, and then measuring the growth rate of the host cell; and (d) treating cancer in a transgenic animal carrying in its genome an altered BRCA2 gene associated with a predisposition to cancer. Administering a compound suspected of being an agent, and then determining the onset or growth of a cancerous lesion; said method selected from the group consisting of: 19 . A transgenic animal carrying an altered BRCA2 allele. 20 . The altered BRCA2 allele comprises: (a) an altered BRCA2 allele containing a deletion, (b) an altered BRCA2 allele containing a nonsense mutation, (c) an altered BRCA2 allele containing a frameshift mutation, 20. The transgenic animal of claim 19, wherein the transgenic animal is selected from the group consisting of (d) an altered BRCA2 allele containing a missense mutation, and (e) an altered BRCA2 allele that is a disrupted allele. 21 . A method of diagnosing a predisposition to breast cancer in a human subject, comprising determining whether there is a germline alteration in the sequence of the BRCA2 gene in the tissue sample of the subject, in the gene regulatory region or in the expression product Determining that the change in the germline sequence of the subject is indicative of a predisposition to the cancer. 22 . Determining the presence or absence of a change in the sequence of the BRCA2 gene in a sample from a lesion in a human subject, in its gene regulatory sequence, or in its expression product. A method of diagnosing a lesion in a subject, wherein the change is indicative of a neoplasm at the BRCA2 locus. 23 . Comparing the sequence of the BRCA2 gene in the sample with the sequence of SEQ ID NO: 1 and one or more wild-type BRC A2 gene sequences selected from the wild-type allelic variants thereof. 23. The method of claim 21 or claim 22. 24 . The method according to claim 21 or 22, wherein the expression product is selected from the group consisting of BRCA2 gene mRNA and BRCA2 polypeptide encoded by the BRCA2 gene. 25 . The method according to claim 21 or 22, wherein the change is detected in a regulatory region of the BRCA2 gene. 26. The following procedures: (a) Observe the shift in electrophoretic mobility of single-stranded DNA from the sample on a non-denaturing polyacrylamide gel; (b) Hybridize the BRCA2 gene probe to genomic DNA isolated from the sample (C) determining hybridization of the allele-specific probe to the genomic DNA from the sample; (d) from the sample under conditions suitable for (E) determining the presence of a specific BRCA2 mutant allele in the sample by nucleic acid amplification; (f) amplifying the whole or a portion of the BRCA2 gene of SEQ ID NO: 1 to generate an amplified sequence; 2.) Molecularly cloning all or a portion of the BRCA2 gene from the sample to generate a cloned sequence, (G) molecule (1) genomic DNA or BRCA2 mRNA of BRCA2 gene isolated from the sample and (2) nucleic acid probe complementary to human wild-type BRCA2 gene DNA hybridize with each other. Determining whether there is a mismatch between the molecules of (1) and (2) when forming a duplex; (h) amplifying the BRCA2 gene sequence in the sample; Hybridizing the amplified sequence to a nucleic acid probe containing the wild-type BRCA2 gene sequence; (i) amplifying the BRCA2 gene sequence in the tissue, and then hybridizing the amplified sequence to a nucleic acid probe containing the mutated BRCA2 gene sequence. (J) screening for deletion mutations; (k) screening for point mutations; (l) insertion mutations (M) determining in situ hybridization between the BRCA2 gene in the sample and one or more nucleic acid probes containing a BRCA2 gene sequence or a mutated BRCA2 gene sequence; (o) immunohistochemistry; (p) a binding partner capable of specifically binding to a BRCA2 gene protein isolated from the tissue and a polypeptide expression product of a BRCA2 mutant allele. And / or assaying for a binding interaction with a binding partner for a BRCA2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and then (q) assaying for inhibition of the biochemical activity of the binding partner. Or performing two or more operations. The method of Zureka preceding claim.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／５７６，５５９ (32)優先日 平成７年12月21日(1995．12．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５８５，３９１ (32)優先日 平成８年１月11日(1996．1．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６３９，５０１ (32)優先日 平成８年４月29日(1996．4．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ， ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 エイチエスシー・リサーチ・アンド・ディ ベロップメント・リミテッド・パートナー シップ カナダ国、エム５ジー・１エックス８、オ ンタリオ、トロント、ユニバーシティ・ア ベニュー555番 (71)出願人 アンド・ルシェルシュ・インコーポレイテ ッド カナダ、ジー１ダブリュー・２ジェイエ ス、ケベック、サント―フワイ、ドゥ・ ラ・プロムナード2989番 (72)発明者 タブティジャン，ショーン・ブイ アメリカ合衆国84103ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、イースト・ファースト・アベ ニュー・ナンバー３、557番 (72)発明者 カンブ，アレキサンダー アメリカ合衆国84102ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、イースト・600・サウス1103 番 (72)発明者 シマール，ジャック カナダ、ジー３エイ・１ゼット９、ケベッ ク、サン・オギュスタン・ドゥ・デスムー レ、ピレ4808番 (72)発明者 コーチ，ファーガス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州セ ント・デイビッズ、アイベン・アベニュ ー・ナンバー２ビー、250番 (72)発明者 ロメンス，ヨハンナ・エム カナダ、エム５ティ・２エックス４、オン タリオ、トロント、マッコール・ストリー ト105番 (72)発明者 ウェーバー，バーバラ・エル アメリカ合衆国19066ペンシルベニア州メ リオン、モールウィッド・ロード331番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 16/18 C07K 19/00 19/00 C12Q 1/68 A C12N 5/10 C12N 5/00 B C12Q 1 / 68 A61K 37/02 (31) Priority claim number 08 / 576,559 (32) Priority date December 21, 1995 (December 21, 1995) (33) Priority claim country United States (US) (31) ) Priority claim number 08 / 585,391 (32) Priority date January 11, 1996 (Jan. 11, 1996) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08/639 , 501 (32) Priority date April 29, 1996 (April 29, 1996) (33) Priority country United States (US) (81) Designated country OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM , GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, T ), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, CA, CN, CU, CZ, EE, FI, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK , MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, UZ, VN (71) Applicant HSCC Research and Development Limited Partnership Canada M5G1X8, Ontario, Toronto, University Avenue 555 (71) Applicant And LeChelsch, Inc. Canada, G1W2J, Quebec, Sa Tofuy, de la Promenade 2989 (72) Inventor Tabtijan, Sean Buoy 84103, United States 84103 Inventor East First Avenue No. 3, 557 (72) Salt Lake City, Utah , Camb, Alexander 84103 U.S.A., Salt Lake City, Utah, East 600 South, 1103 (72) Inventor Simard, Jack Canada, G3A 1 Zet 9, Quebec, Saint-Augustin-de-Desmooth Re, Pile No. 4808 (72) Inventor Coach, Fergus United States 19087 Pennsylvania, St. Davids, Iven Avenue No. 2B, No. 250 (72) Inventor Romans, Johanna M Canada, M5T-2 X4, Ontario, Toronto, McCall Street 105 (72) Inventor Weber, Bara el United States 19,066 Pennsylvania main Lyon, Moruwiddo Road 331 No.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＢＲＣＡ２ポリペプチドをコードする単離核酸であって、ここに該ポリペ プチドが配列番号：２記載のアミノ酸配列または機能的に同等であるかもしくは 乳癌への素因に関連する修飾形態を有することを特徴とする該単離核酸。 ２．配列番号：１記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、その相補体、または 相当するＲＮＡである請求項１記載の単離核酸。 ３．配列番号：１記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異型、その相補体、 または対応するＲＮＡである請求項１記載の単離核酸。 ４．配列番号：２記載のＢＲＣＡ２ポリペプチドの突然変異形態をコードする 請求項１記載の単離核酸。 ５．配列番号：１記載のヌクレオチド配列の突然変異形態を含むＤＮＡ、その 相補体、または対応するＲＮＡである請求項４記載の単離核酸。 ６．（ａ）ヌクレオチドポジション２７７および２７８のＡＣが欠失している 配列番号：１； （ｂ）ポジション９８２−９８５の４個のヌクレオチドが欠失している配列番 号：１； （ｃ）ポジション４７０６−４７０９の４個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｄ）ヌクレオチドポジション８５２５のＣが欠失している配列番号：１； （ｅ）ポジション９２５４−９２５８の５個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｆ）ヌクレオチドポジション４０７５および４０７６のＧＴが欠失している 配列番号：１； （ｇ）ポジション９９９−１００３の５個のヌクレオチドが欠失している配列 番号：１； （ｈ）ヌクレオチドポジション６１７４のＴが欠失している配列番号：１； （ｉ）ポジション４１３２−４１３４の３個のヌクレオチドが欠失している配 列番号：１； （ｊ）ポジション４５１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｋ）ポジション１０９３のＡの代りにＣを有する配列番号１； （ｌ）ポジション１２９１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｍ）ポジション１４９３のＡが欠失している配列番号：１； （ｎ）ポジション２１１７のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｏ）ポジション２４１１のＡの代りにＣを有する配列番号：１； （ｐ）ポジション４８１３のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ｑ）ポジション５８６８のＴの代りにＧを有する配列番号：１； （ｒ）ポジション５９７２のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｓ）ポジション６３２８のＣの代りにＴを有する配列番号：１； （ｔ）ポジション７０４９のＧの代りにＴを有する配列番号：１； （ｕ）ポジション７４９１のＧの代りにＣを有する配列番号：１； （ｖ）ポジション９５３７のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｗ）ポジション１０２０４のＡの代りにＴを有する配列番号：１； （ｘ）ポジション１０２９８のＣの代りにＧを有する配列番号：１； （ｙ）ポジション１０４６２のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｚ）ポジション２０３のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ａａ）ポジション１３４２のＣの代りにＡを有する配列番号：１； （ｂｂ）ポジション２４５７のＴの代りにＣを有する配列番号：１； （ｃｃ）ポジション３１９９のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｄｄ）ポジション３６２４のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｅｅ）ポジション３６６８のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｆｆ）ポジション４０３５のＴの代りにＣを有する配列番号：１； （ｇｇ）ポジション７４７０のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｈｈ）ポジション１５９３のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｉｉ）ポジション４２９６のＧの代りにＡを有する配列番号：１； （ｊｊ）ポジション５６９１のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｋｋ）ポジション６０５１のＡの代りにＧを有する配列番号：１； （ｌｌ）ポジション６８２８のＴの代りにＣを有する配列番号：１；および （ｍｍ）ポジション６９２１のＴの代りにＣを有する配列番号：１ から選択される配列番号：１記載のヌクレオチド配列の突然変異形態を含むＤＮ Ａである請求項５記載の単離核酸。 ７．ＢＲＣＡ２調節配列を含有するＤＮＡである請求項１〜６いずれか１項記 載の単離核酸。 ８．配列番号：１記載の核酸配列またはその対立遺伝子変異型が、ＢＲＣＡ２ ポリペプチドの発現をイン・ビボ（in vivo）で阻害または妨害する突然変異を 有するＢＲＣＡ２調節配列に作動可能に連結されている請求項２または３記載の 単離核酸。 ９．請求項１〜６いずれか１項記載の少なくとも１５個の隣接する核酸を有す る単離核酸であって、試料中の（ｉ）配列番号：１記載のヌクレオチド配列、そ の対立遺伝子変異型およびその突然変異形態から選択されるヌクレオチド配列を 有するＤＮＡ、または（ｉｉ）該ＤＮＡに対応するＲＮＡ；を検出するためのハ イブリダイゼーション・プローブとしての使用に適している該核酸。 １０．突然変異を包含する、請求項４〜６いずれか１項記載の少なくとも１５ 個の隣接する核酸を有する請求項９記載の単離核酸。 １１．請求項１〜１０いずれか１項記載の単離核酸と宿主細胞中で作動可能な レプリコンとを含む複製クローニングベクター。 １２．ＢＲＣＡ２ポリペプチドのコーディング配列またはその修飾形態が、該 べクター用の宿主細胞中で該コーディング配列を直接発現させることができる適 当な制御配列に作動可能に連結されている請求項１〜６いずれか１項記載の単離 核酸を含む発現ベクター。 １３．請求項１１または１２記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 １４．請求項１記載の配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ２ポ リペプチドまたは該ポリペプチドの修飾形態であるポリペプチドの産生方法で あって、（ｉ）該ＢＲＣＡ２ポリペプチドの産生に適した条件下にて該ポリペプ チドをコードする発現ベクターを含有する請求項１３記載の宿主細胞を培養し； 次いで、 （ｉｉ）該ポリペプチドを回収することを特徴とする該産生方法。 １５．さらに、回収したポリペプチドを標識することを特徴とする請求項１４ 記載の方法。 １６．他のヒト蛋白質を実質的に含んでいないヒトＢＲＣＡ２ポリペプチドの 調製物であって、ここに該ポリペプチドは配列番号：２記載のアミノ酸配列を有 することを特徴とする該調製物。 １７．他のヒト蛋白質を実質的に含んでいないヒトＢＲＣＡ２ポリペプチドの 調製物であって、ここに該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２記載のア ミノ酸配列を有する野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドと実質的な配列相同性を有し 、該ポリペプチドが野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドと実質的に類似する機能を有 していることを特徴とする該調製物。 １８．他の蛋白質を実質的に含んでいないポリペプチドの調製物であって、こ こに該ポリペプチドが配列番号：１記載の核酸配列の突然変異形態の発現によっ て得ることができる突然変異ヒトＢＲＣＡ２ポリペプチドであることを特徴とす る該調製物。 １９．請求項１８記載のポリペプチドの調製物であって、ここに該ポリペプチ ドが請求項６記載の配列番号：１の突然変異形態によってコードされていること を特徴とする該調製物。 ２０．該ポリペプチドが標識されている請求項１６〜１９いずれか１項記載の 調製物。 ２１．請求項１６〜１９いずれか１項記載の１または２以上のポリペプチドに 特異的に結合することができる抗体。 ２２．請求項２１記載の抗体を得るための免疫原としての使用に適した請求項 １６〜１９いずれか１項記載のポリペプチドの抗原性フラグメント。 ２３．融合蛋白質の形態である請求項１６〜１９または２２いずれか１項記載 のポリペプチド。 ２４．抗体産生用の免疫原としての請求項１６〜１９、２２または２３いずれ か１項記載のポリペプチドの使用。 ２５．１または２以上の抗体生成物が実質的に標識されているか、または固体 支持体に結合されている請求項２４記載の使用。 ２６．核酸増幅反応によるＢＲＣＡ２遺伝子のヌクレオチド配列の決定用の一 本鎖オリゴヌクレオチド・プライマー対であって、ここに該プライマーの配列が ヒト第１３染色体由来であって、核酸増幅反応における該プライマーの使用の結 果、ＢＲＣＡ２遺伝子の配列の全体または一部分に対応するＤＮＡまたはＲＮＡ が合成されることを特徴とする該プライマー。 ２７．配列番号：１記載のヌクレオチド配列を有するＢＲＣＡ２遺伝子、その 対立遺伝子変異型または突然変異形態の配列の全体または一部分を決定するため の請求項２６記載のプライマー対。 ２８．予想される突然変異体ＢＲＣＡ２対立遺伝子のヌクレオチド配列と野生 型ＢＲＣＡ２ヌクレオチド配列とを比較することからなり、ここに予想される突 然変異体配列と野生型配列との間の相異により突然変異体ＢＲＣＡ２ヌクレオチ ド配列を同定することを特徴とする予想される突然変異ＢＲＣＡ２対立遺伝子中 の突然変異体ＢＲＣＡ２ヌクレオチド配列の同定方法。 ２９．ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異に特異的な少なくとも１種のオリゴヌクレオ チド・プライマーと、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異を検出することに関する指 示書とを含む乳癌に対する感受性を生じるＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異を検出 するためのキット。 ３０．ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異に対する少なくとも１種の対立遺伝子特異的 オリゴヌクレオチドと、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異を検出することに関する 指示書とを含む乳癌および卵巣癌に対する感受性を生じるＢＲＣＡ２遺伝子中の 突然変異を検出するためのキット。 ３１．野生型ＢＲＣＡ２遺伝子機能または野生型に実質的に類似するＢＲＣＡ ２機能を、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異によって該遺伝子機能が欠失したか、 または遺伝子機能が変化した細胞に供給する方法であって、該細胞のトランスフ ォーム状態を抑制する核酸を該細胞に導入することからなり、ここに該核酸が野 生型ＢＲＣＡ２遺伝子核酸、野生型ＢＲＣＡ２遺伝子核酸の一部分、該野生型Ｂ ＲＣＡ２遺伝子核酸に実質的に相同性であってかつ実質的にそれに類似する機能 を有する核酸、および該野生型ＢＲＣＡ２遺伝子核酸に実質的に相同性である核 酸の一部分よりなる群から選択されることを特徴とする該方法。 ３２．該核酸がＢＲＣＡ２遺伝子調節配列を含有することを特徴とする請求項 ３１記載の方法。 ３３．該核酸が該細胞のゲノムに組込まれていることを特徴とする請求項３１ 記載の方法。 ３４．野生型ＢＲＣＡ２遺伝子機能または野生型に実質的に類似するＢＲＣＡ ２機能を、ＢＲＣＡ２遺伝子中の突然変異によって該遺伝子機能が欠失したか、 または遺伝子機能が変化した細胞に該機能を供給する方法であって、該細胞のト ランスフォーム状態を抑制する分子を該細胞に導入することからなり、ここに該 分子が野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチド、該野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドの一部 分、野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドに実質的に相同的なポリペプチド、該野生型 ＢＲＣＡ２ポリペプチドに実質的に相同的な該ポリペプチドの一部分、および該 野生型ＢＲＣＡ２ポリペプチドの機能を模倣する分子よりなる群から選択される ことを特徴とする該方法。 ３５．（ｉ）ＢＲＣＡ２結合パートナー、（ｉｉ）配列番号：１記載のＤＮＡ 配列によってコードされるポリペプチドおよび該結合パートナーに結合する該ア ミノ酸配列の一部分を有するポリペプチドよりなる群から選択されるＢＲＣＡ２ ポリペプチド、ならびに（ｉｉｉ）癌治療剤であると予想される化合物；を合し 、次いで、ＢＲＣＡ２ポリペプチドのその結合パートナーに対する結合量を測定 することを特徴とする潜在的な癌治療剤をスクリーニングする方法。 ３６．ＢＲＣＡ２結合パートナーと癌治療剤であると予想される化合物とを合 し、次いで、該結合パートナーの生物活性を測定することを特徴とする潜在的な 癌治療剤をスクリーニングする方法。 ３７．癌治療剤であると予想される化合物存在下にて、変化したＢＲＣＡ２遺 伝子を含有するトランスフォームした真核生物宿主細胞を増殖させ、次いで、該 宿主細胞の増殖速度を測定することを特徴とする潜在的な癌治療剤をスクリーニ ングする方法。 ３８．該治療剤であると予想される化合物を、第２の動物からの変化したＢＲ ＣＡ２対立遺伝子をそのゲノム中に運搬しているトランスジェニック動物に投与 し、次いで、癌病変の発病または増殖を判定することを特徴とする潜在的な癌治 療剤をスクリーニングする方法。 ３９．変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子を運搬するトランスジェニック動物。 ４０．変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子が、欠失、ナンセンス突然変異、フレー ムシフト突然変異およびミスセンス突然変異よりなる群から選択される変化を有 するＢＲＣＡ２遺伝子を含む請求項３９記載のトランスジェニック動物。 ４１．変化したＢＲＣＡ２対立遺伝子が破壊された対立遺伝子である請求項３ ９記載のトランスジェニック動物。 ４２．ヒト対象の組織試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列、その遺伝子調節配列 またはその発現産物中に生殖系変化が存在するか否かを判定することからなり、 ここに該対象の生殖系配列中の変化が該癌への素因を示すことを特徴とするヒト 対象において乳癌への素因を診断する方法。 ４３．ヒト対象における病変からの試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列、その遺 伝子調節配列またはその発現産物中に変化が存在するか否かを判定することから なり、ここに該変化がＢＲＣＡ２遺伝子座の新生生物の指標であることを特徴と するＢＲＣＡ２遺伝子座の新生生物についてヒト対象における病変を診断する方 法。 ４４．該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子の配列と、配列番号：１記載の配列および その野生型対立遺伝子変異型から選択される１または２種以上の野生型ＢＲＣＡ ２遺伝子配列とを比較することを特徴とする請求項４２または４３記載の方法。 ４５．該発現産物が、ＢＲＣＡ２遺伝子のｍＲＮＡおよびＢＲＣＡ２遺伝子に よってコードされているＢＲＣＡ２ポリペプチドよりなる群から選択される請求 項４２または４３記載の方法。 ４６．変化が、ＢＲＣＡ２遺伝子の調節領域中で検出される請求項４２または ４３記載の方法。 ４７．以下の手順： （ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上で、該試料からの一本鎖ＤＮＡの電気 泳動移動度におけるシフトを観察する； （ｂ）ＢＲＣＡ２遺伝子プローブのＢＲＣＡ２遺伝子へのハイブリダイゼーシ ョンに適した条件下にて、該試料から単離されたゲノムＤＮＡに該ＢＲＣＡ２遺 伝子プローブをハイブリダイズさせる； （ｃ）該試料からのゲノムＤＮＡへの対立遺伝子特異的なプローブのハイブリ ダイゼーションを判定する； （ｄ）該試料からのＢＲＣＡ２遺伝子の全体または一部分を増幅させて増幅配 列を生成し、その増幅配列を配列決定する； （ｅ）該試料中の特異的ＢＲＣＡ２突然変異対立遺伝子の存在を核酸増幅によ って判定し； （ｆ）該試料からのＢＲＣＡ２遺伝子の全体または一部分を分子クローニング してクローン化配列を生成し、そのクローン化配列を配列決定する； （ｇ）（１）該試料から単離されたＢＲＣＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡまたはＢ ＲＣＡ２ ｍＲＮＡと、（２）ヒト野生型ＢＲＣＡ２遺伝子ＤＮＡに相補的な核 酸プローブとが互いにハイブリダイズしてデュプレックスを形成する場合に、（ １）と（２）との分子間に誤対合が存在するか否かを判定する； （ｈ）該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子配列を増幅し、次いで、その増幅配列を野 生型ＢＲＣＡ２遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせる； （ｉ）該組織中のBＲＣＡ２遺伝子配列を増幅し、次いで、その増幅配列を突 然変異BＲＣＡ２遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせる； （ｊ）欠失突然変異についてスクリーニングする； （ｋ）点突然変異についてスクリーニングする； （ｌ）挿入突然変異についてスクリーニングする； （ｍ）該試料中のＢＲＣＡ２遺伝子と、ＢＲＣＡ２遺伝子配列または突然変異 体ＢＲＣＡ２遺伝子配列を含む１または２種以上の核酸プローブとのイン・サイ チュ（in situ）ハイブリダイゼーションを判定する； （ｎ）イムノブロッティング； （ｏ）免疫組織化学； （ｐ）該組織から単離されたＢＲＣＡ２遺伝子蛋白質と、ＢＲＣＡ２突然変異 対立遺伝子のポリペプチド発現産物に特異的に結合することができる結合パート ナーおよび／または配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するＢＲＣＡ２ポリペ プチドに対する結合パートナーとの間の結合相互作用をアッセイする；および、 （ｑ）該結合パートナーの生化学活性の阻害についてアッセイする； の１または２以上を行うことを特徴とする請求項４２−４６いずれか１項記載の 方法。[Claims]   1. An isolated nucleic acid encoding a BRCA2 polypeptide, wherein said polypeptide is The peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or is functionally equivalent, or The isolated nucleic acid having a modified form associated with a predisposition to breast cancer.   2. DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, its complement, or 2. The isolated nucleic acid according to claim 1, which is a corresponding RNA.   3. An allelic variant of the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, its complement, Or the isolated nucleic acid of claim 1, which is a corresponding RNA.   4. Encodes a mutated form of the BRCA2 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2 The isolated nucleic acid according to claim 1.   5. DNA comprising a mutated form of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, The isolated nucleic acid according to claim 4, which is a complement or a corresponding RNA.   6. (A) AC at nucleotide positions 277 and 278 is deleted SEQ ID NO: 1;   (B) the sequence number in which four nucleotides at positions 982 to 985 are deleted No .: 1;   (C) A sequence in which four nucleotides at positions 4706-4709 have been deleted. Column number: 1;   (D) SEQ ID NO: 1 wherein C at nucleotide position 8525 is deleted;   (E) a sequence in which 5 nucleotides at positions 9254-9258 have been deleted. Column number: 1;   (F) GT at nucleotide positions 4075 and 4076 is deleted SEQ ID NO: 1;   (G) Sequence in which 5 nucleotides at positions 999-1003 have been deleted. Number: 1;   (H) SEQ ID NO: 1 wherein T at nucleotide position 6174 is deleted;   (I) a sequence in which three nucleotides at positions 4132-4134 are deleted Column number: 1;   (J) SEQ ID NO: 1 with C instead of G at position 451;   (K) SEQ ID NO: 1 with C instead of A at position 1093;   (L) SEQ ID NO: 1 with C at position 1291 instead of G;   (M) SEQ ID NO: 1 in which A at position 1493 is deleted;   (N) SEQ ID NO: 1 having T instead of C at position 2117;   (O) SEQ ID NO: 1 with C in place of A at position 2411;   (P) SEQ ID NO: 1 with A in place of G at position 4813;   (Q) SEQ ID NO: 1 with G in place of T at position 5868;   (R) SEQ ID NO: 1 with T instead of C at position 5972;   (S) SEQ ID NO: 1 having T instead of C at position 6328;   (T) SEQ ID NO: 1 with T instead of G at position 7049;   (U) SEQ ID NO: 1 with C instead of G at position 7491;   (V) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 9537;   (W) SEQ ID NO: 1 with T in place of A at position 10204;   (X) SEQ ID NO: 1 with G instead of C at position 10298;   (Y) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 10462;   (Z) SEQ ID NO: 1 with A in place of G at position 203;   (Aa) SEQ ID NO: 1 having A instead of C at position 1342;   (Bb) SEQ ID NO: 1 with C instead of T at position 2457;   (Cc) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 3199;   (Dd) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 3624;   (Ee) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 3668;   (Ff) SEQ ID NO: 1 with C instead of T at position 4035;   (Gg) SEQ ID NO: 1 with G at position 7470 instead of A;   (Hh) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 1593;   (Ii) SEQ ID NO: 1 with A in place of G at position 4296;   (Ij) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 5691;   (Kk) SEQ ID NO: 1 with G in place of A at position 6051;   (11) SEQ ID NO: 1 with C in place of T at position 6828; and   (Mm) SEQ ID NO: 1 with C instead of T at position 6921 A DN comprising a mutated form of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 selected from The isolated nucleic acid according to claim 5, which is A.   7. 7. A DNA containing a BRCA2 regulatory sequence. The isolated nucleic acid described above.   8. The nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an allelic variant thereof is BRCA2 Mutations that inhibit or prevent polypeptide expression in vivo 4. The BRCA2 regulatory sequence of claim 2 or 3 operably linked. Isolated nucleic acid.   9. Has at least 15 adjacent nucleic acids according to any one of claims 1 to 6. An isolated nucleic acid, comprising: (i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in a sample; Nucleotide sequences selected from allelic variants of DNA for detecting (ii) RNA corresponding to said DNA; The nucleic acid suitable for use as an hybridization probe.   10. 7. At least 15 according to any one of claims 4 to 6, comprising a mutation. 10. The isolated nucleic acid of claim 9 having a number of adjacent nucleic acids.   11. Operable in a host cell with the isolated nucleic acid of any one of claims 1 to 10. A replication cloning vector comprising a replicon.   12. The coding sequence of a BRCA2 polypeptide or a modified form thereof An appropriate vector capable of directly expressing the coding sequence in a vector host cell. 7. The isolation of any one of claims 1 to 6, wherein the isolation is operably linked to a control sequence. An expression vector containing a nucleic acid.   13. A host cell transformed with the vector according to claim 11.   14． A BRCA2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to claim 1. A method for producing a polypeptide which is a modified form of the polypeptide or the polypeptide. (I) the polypeptide under conditions suitable for the production of the BRCA2 polypeptide; Culturing the host cell according to claim 13, which comprises an expression vector encoding a tide; Then (Ii) The production method, wherein the polypeptide is recovered.   15. Further, the recovered polypeptide is labeled. The described method.   16. A human BRCA2 polypeptide substantially free of other human proteins A polypeptide, wherein the polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Said preparation.   17． A human BRCA2 polypeptide substantially free of other human proteins A preparation wherein the amino acid sequence of the polypeptide is Has substantial sequence homology to a wild-type BRCA2 polypeptide having a amino acid sequence Has a function substantially similar to that of the wild-type BRCA2 polypeptide. Said preparation.   18. A preparation of a polypeptide substantially free of other proteins, Here, the polypeptide is capable of expressing a mutant form of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Characterized in that it is a mutant human BRCA2 polypeptide obtainable by The preparation.   19. 19. A preparation of the polypeptide according to claim 18, wherein said polypeptide is Is encoded by the mutated form of SEQ ID NO: 1 according to claim 6. The preparation characterized in that:   20. The method according to any one of claims 16 to 19, wherein the polypeptide is labeled. Preparation.   21. 20. One or more polypeptides according to any one of claims 16 to 19 An antibody that can specifically bind.   22. Claims suitable for use as an immunogen to obtain the antibody of claim 21. 20. An antigenic fragment of the polypeptide according to any one of 16 to 19.   23. 23. Any one of claims 16 to 19 or 22, which is in the form of a fusion protein. Polypeptide.   24. 24. Any of claims 16 to 19, 22 or 23 as an immunogen for antibody production. Use of the polypeptide according to claim 1.   25. One or more antibody products are substantially labeled or solid. The use according to claim 24, wherein the use is bound to a support.   26. One for determination of nucleotide sequence of BRCA2 gene by nucleic acid amplification reaction A single-stranded oligonucleotide primer pair, wherein the sequence of the primer is The use of the primer in a nucleic acid amplification reaction derived from human chromosome 13 As a result, DNA or RNA corresponding to the whole or a part of the sequence of the BRCA2 gene Said primer is synthesized.   27. BRCA2 gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, To determine all or part of the sequence of an allelic variant or mutant form The primer pair according to claim 26.   28. Nucleotide sequence of predicted mutant BRCA2 allele and wild-type Comparison with the BRCA2 type B nucleotide sequence. However, due to differences between the mutant and wild-type sequences, the mutant BRCA2 nucleoti Mutated BRCA2 allele characterized by identifying the sequence A method for identifying a mutant BRCA2 nucleotide sequence.   29. At least one oligonucleotide specific for BRCA2 gene mutation Primers and instructions for detecting mutations in the BRCA2 gene Detects mutations in BRCA2 gene causing susceptibility to breast cancer Kit to do.   30. At least one allele specific for BRCA2 gene mutation Oligonucleotides and detecting mutations in the BRCA2 gene And BRCA2 gene causing susceptibility to breast and ovarian cancer, including Kit for detecting mutations.   31. BRCA substantially similar to wild-type BRCA2 gene function or wild-type 2 functions have been deleted by mutation in the BRCA2 gene, Alternatively, a method for supplying cells with altered gene function, wherein the cells are transfected. Introducing a nucleic acid that suppresses the homeotic state into the cell, where the nucleic acid is A wild-type BRCA2 gene nucleic acid, a part of a wild-type BRCA2 gene nucleic acid, A function substantially homologous and substantially similar to the RCA2 gene nucleic acid And a nucleus substantially homologous to the wild-type BRCA2 gene nucleic acid The method, wherein the method is selected from the group consisting of a portion of an acid.   32. The nucleic acid contains a BRCA2 gene regulatory sequence. 31. The method according to 31.   33. 32. The nucleic acid of claim 31, wherein the nucleic acid is integrated into the genome of the cell. The described method.   34. BRCA substantially similar to wild-type BRCA2 gene function or wild-type 2 functions have been deleted by mutation in the BRCA2 gene, Alternatively, a method of supplying a cell with altered gene function to the cell, Introducing a molecule that suppresses the transform state into the cell, The molecule is a wild-type BRCA2 polypeptide, a part of the wild-type BRCA2 polypeptide. A polypeptide substantially homologous to a wild-type BRCA2 polypeptide; A portion of said polypeptide substantially homologous to a BRCA2 polypeptide; Selected from the group consisting of molecules that mimic the function of a wild-type BRCA2 polypeptide The method characterized by the above-mentioned.   35. (I) a BRCA2 binding partner, (ii) the DNA of SEQ ID NO: 1. The polypeptide encoded by the sequence and the antigen binding to the binding partner. BRCA2 selected from the group consisting of polypeptides having a portion of a amino acid sequence A polypeptide, and (iii) a compound suspected of being a cancer therapeutic agent; And then measuring the amount of BRCA2 polypeptide bound to its binding partner A method of screening for a potential cancer therapeutic agent.   36. Combining a BRCA2 binding partner with a compound suspected of being a cancer therapeutic And then measuring the biological activity of said binding partner. A method for screening a therapeutic agent for cancer.   37. BRCA2 residue changed in the presence of a compound expected to be a cancer therapeutic agent The transformed eukaryotic host cell containing the gene is grown and then Screenini potential cancer therapeutics characterized by measuring the growth rate of host cells How to play.   38. A compound suspected of being the therapeutic agent is treated with an altered BR from a second animal. Administration to transgenic animals carrying the CA2 allele in their genome And then determining the onset or growth of the cancerous lesion. How to screen for remedies.   39. A transgenic animal carrying an altered BRCA2 allele.   40. The altered BRCA2 allele is a deletion, nonsense mutation, Mutations selected from the group consisting of 40. The transgenic animal according to claim 39, comprising the BRCA2 gene.   41. 4. The altered BRCA2 allele is a disrupted allele. 9. The transgenic animal according to 9.   42. Sequence of BRCA2 gene in tissue sample of human subject, gene regulatory sequence thereof Or determining whether a germline change is present in the expression product, Wherein a change in the subject's germline sequence is indicative of a predisposition to the cancer. A method of diagnosing a predisposition to breast cancer in a subject.   43. Sequence of the BRCA2 gene in a sample from a lesion in a human subject, From determining whether there is a change in the gene regulatory sequence or its expression product Wherein the change is an indicator of a neoplasm at the BRCA2 locus. For diagnosing lesions in human subjects for neoplasms at the BRCA2 locus Law.   44. The sequence of the BRCA2 gene in the sample, the sequence of SEQ ID NO: 1 and One or more wild-type BRCAs selected from the wild-type allelic variants The method according to claim 42 or 43, wherein the two gene sequences are compared.   45. The expression product is converted to BRCA2 gene mRNA and BRCA2 gene. Accordingly, a claim selected from the group consisting of the encoded BRCA2 polypeptides Item 44. The method according to Item 42 or 43.   46. 43. The change is detected in the regulatory region of the BRCA2 gene. 43. The method of claim 43.   47. The following steps:   (A) Electricity of single-stranded DNA from the sample on a non-denaturing polyacrylamide gel Observe the shift in migration mobility;   (B) Hybridization of BRCA2 gene probe to BRCA2 gene Genomic DNA isolated from the sample under conditions suitable for the BRCA2 fragment. Hybridize the gene probe;   (C) hybridization of an allele-specific probe to genomic DNA from the sample Determine the dization;   (D) amplifying the whole or a part of the BRCA2 gene from the sample, Generating a sequence and sequencing the amplified sequence;   (E) determining the presence of the specific BRCA2 mutant allele in the sample by nucleic acid amplification. Judge;   (F) Molecular cloning of all or part of the BRCA2 gene from the sample Generating a cloned sequence and sequencing the cloned sequence;   (G) (1) Genomic DNA or B of BRCA2 gene isolated from the sample RCA2 mRNA and (2) a nucleus complementary to human wild-type BRCA2 gene DNA When the acid probe hybridizes to each other to form a duplex, Determine whether there is a mismatch between the molecules of 1) and (2);   (H) amplifying the BRCA2 gene sequence in the sample; Hybridizing to a nucleic acid probe comprising the native BRCA2 gene sequence;   (I) amplify the BRCA2 gene sequence in the tissue, and then Hybridizing to a nucleic acid probe containing the mutated BRCA2 gene sequence;   (J) screening for deletion mutations;   (K) screening for point mutations;   (L) screening for insertion mutations;   (M) the BRCA2 gene in the sample and the BRCA2 gene sequence or mutation In situ with one or more nucleic acid probes comprising a somatic BRCA2 gene sequence Determine in situ hybridization;   (N) immunoblotting;   (O) immunohistochemistry;   (P) a BRCA2 gene protein isolated from the tissue, and a BRCA2 mutation A binding part that can specifically bind to an allelic polypeptide expression product And / or a BRCA2 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Assaying the binding interaction between the binding partner for the peptide; and   (Q) assaying for inhibition of the biochemical activity of the binding partner; The method according to any one of claims 42 to 46, wherein one or more of the following is performed. Method.
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