JPH08509612A

JPH08509612A - Transgenic non-human animal capable of producing heterologous antibody

Info

Publication number: JPH08509612A
Application number: JP6524481A
Authority: JP
Inventors: ロンバーグ、ニルス; カイ、ロバート、エム．
Original assignee: Genpharm International Inc
Current assignee: Genpharm International Inc
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-04-25
Publication date: 1996-10-15
Also published as: AU6819494A; JP2012143252A; JP5550026B2; EP0754225A1; CA2161351A1; WO1994025585A1; JP2007054076A; EP0754225A4; JP5099405B2; CA2161351C

Abstract

(57)【要約】本発明は.ヒト以外の動物を利用してヒト抗体を得るための新規な方法である。本発明は.機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎮トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及び異種性免疫グロブリン重鎮トランスジーンの少なくとも１つのコピーを含み、抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、トランスジェニックマウス；このマウスから得られるハイブリドーマ、及びそれにより生産されるモノクローナル抗体である。 (57) [Summary] The present invention is a novel method for obtaining human antibodies using non-human animals. The invention relates to: a homozygous pair of a functionally disrupted endogenous heavy chain allele, a homozygous pair of a functionally disrupted endogenous light chain allele, at least one copy of a heterologous immunoglobulin heavy chain transgene. , And a transgenic mouse comprising at least one copy of a heterologous immunoglobulin heavy chain transgene, which carries out an antibody response following immunization with an antigen; a hybridoma obtained from this mouse, and a monoclonal antibody produced thereby. is there.

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物産業上の利用分野本発明は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物、そのようなトランスジェニック動物を産生するのに使うトランスジーン（transg ene）、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再配列させることのできるトランスジーン、異種抗体を産生することのできる不死化Ｂ細胞、多数のイソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジーン、内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を不活性化または抑制する方法およびそのためのトランスジーン、生殖細胞系列の再配列された可変領域配列に比較すると可変領域配列が体細胞変異を含んで成る異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジーン、ヒト一次配列を有する抗体を産生し且つヒト抗原に結合するトランスジェニック非ヒト動物、その様なトランスジュニック動物のＢ細胞から作られたハイブリドーマ、並びに該ハイブリドーマにより発現されるモノクローナル抗体に関する。従来の技術ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体治療および診断用途の開発に直面する主な障害の１つは、非ヒト免役グロブリンの不質的免疫原性である。例えば、免疫寛容性のヒト患者に治療量の齧歯類モノクローナル抗体を投与すると、患者は齧歯類免疫グロブリン配列に対して抗体を産生し、それらのヒト抗マウス抗体（ HAMA）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。よって、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グロブリンを作製することが望ましい。モノクローナル抗体を作製するための現在の技術は、動物（通常はラットまたはマウス）を抗原に予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物からＢ細胞を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することを伴う。ハイブリドーマ集団を抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリーニングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）についてもスクリーニングすることにより、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することが可能である。しかしながら、モノクローナル抗体を作製する現行法を、ヒト抗原に対して結合特異性を有するヒト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的には自己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうから、ヒト免疫グロブリンを産生するＢリンパ球を得ることは深刻な妨げになる。よって、ヒト抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行法は明らかに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ細胞源として非ヒト種を使用する場合にも、真の自己抗原に対するモノクローナル抗体を作製することに同じ制限が当てはまる。機能的異種免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物の作製は、自己抗原と反応す抗体を産生させることができる方法である。しかしながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生するハイブリドーマクローンを得るためには、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程を経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならない。そのような成熟はトランスジェニックＢ細胞上の表面IgＭの存在を必要とするが、療法利用にはIgＭ以外のイソタイプが所望される。よって、機能的Ｖ−Ｄ −Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接合多様性を生じることのできるトランスジーンおよびそのようなトランスジーンを有する動物が要求される。更に、そのようなトランスジーンとトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に必要とされる第一のイソタイプから優れた療法的効用を有する次なるイソタイプへのイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有する。多数の実験は、Ｉｇ遺伝子再配列に必要な特異的ＤＮＡ配列を決定するためのトランスフェクトされた細胞系の使用を報告している〔LewisおよびGellert（19 89），Cell，59，585-588〕。そのような報告は推定上の配列を同定し、そして再配列に使う組換え酵素へのそれらの配列の近づきやすさ（accesibility）が転写により変更されると結論づけている〔YancopoulosおよびAlt（1985），Cell，40 ，271-281〕。Ｖ（Ｄ）Ｊ結合のための配列は、報告によれば、高度に保存されたほぼ回文式のヘプタマーと、12または23bpのいずれかのスペーサーにより隔てられたあまり保存されていない高ＡＴナノマーである〔Tonegawa（1983），Na ture ，302，575-581；Hesseら（1989），Genes in Dev., 3，1053-1061〕。効率的組換えは、伝えられるところによれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列を含む部位の間でのみ起こる。Ｉｇ遺伝子再配列は、組織培養細胞において研究されているが、トランスシェニックマウスでは詳しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試験構成物を記載している少数の報告が発表されているに過ぎない〔Buchiniら、Natur e ，326: 409-411（1987）（再配列されていないニワトリλトランスジーン）；G oodhartら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4229-4233（1987）（再配列されていないウサギκ遺伝子）；およびBruggemannら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 86:6709-6713（1989）（ハイブリッドマウス−ヒト重鎖）〕。しかしながら、そのような実験の結果は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最小の再配列を生じることがある。更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多様な生物学的機能、例えばＦｃεを介したマスト細胞または好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγによる補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化により特定の特異性を有する機能的に多様な抗体を生成せしめることが更に望ましい。異種抗体の１または複数の鎖をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプスイッチを受ける異種トランスジーンについての報告は全くない。イソタイプをスイッチすることのできないトランスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産生するものに限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不可欠であるイソタイプ、例えばIgＭとおそらくIgＤを産生するものに限定され、それらの抗体は療法的効用が限定され得る。上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在することは明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するＤセグメントの全部または一部を含む機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免疫グロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。更に、（１）機能的なＢ細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用な異種抗体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプスイッチングを支えることができるトランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当第界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるＢ細胞源に対する要求も存在する。機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイッチングを受けることができる異種免役グロブリントランスジーンはそれらの要求を満たすことができる。上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化されている前記Ｂ細胞を提供することが本発明の目的である。この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供することが本発明の目的である。更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが本発明の目的である。更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが本発明の目的である。本発明の更なる目的は、本発明の１または複数のトランスジーンを作製するために使われる免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法を提供することである。上記の参考文献は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利がないと認めることと解釈してはならない。発明の要約異種抗体、例えばヒト抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。そのような異種抗体は、IgG1，IgG2，IgC3，IgG4，IgM，IgA 1，IgA2，IgA_sec，IgDまたはIgEを含む様々なイソタイプのものであることができる。そのようなトランスジェニッグ非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ細胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックＢ細胞および前Ｂ細胞が表面結合型免疫グロブリン、特にIgＭ（ことによるとIgＤ）イソタイプのものを産生することが必要である。そのようなIgＭ（またはIgＤ）表面結合型免疫グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期には一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は他のイソタイプを産生し得る。典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生するだろうが、μ_s（分泌型μ）およびμ_M（膜結合型μ）型、並びにμおよびδ免疫グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択一ＲＮＡスプライシングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従って、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なIgＧ，IgＡおよびIgＭイソタイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチングが起こることが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラススイッチであってもよく、または１もしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ機構から生じてもよい。本発明は、異種免疫グロブリントランスジーンおよびそのようなトランスジーンを有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生することができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジーン中の少なくとも１つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ− 関連欠失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランスジーン間および／または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことができる。そのようなトランスジーンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型Ｂ細胞成熟に必要である第一の免疫グコブリンイソタイプを産生し、そして療法的および／または診断的効用を有する１または複数の第二の異種イソタイプをコードし産生するようにスイッチすることができる。よって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するIgＧ，IgＡおよび／またはIgＥ抗体を産生することができる。本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェニック動物からのＢ細胞にも関し、そのようなＢ細胞は、特定抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１つの源として働くことができる。本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトランスジェニック動物から外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプスイッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供する。そのようなイソタイプスイッテは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたＢ細胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイン（例えばIL-4およびIFNγ）で処理することによって誘導することができる。更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を誘導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものであることができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプ（Ig Ｇ．IgＡおよびIgＭ）の異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび前記動物のＢ細胞から誘導されるモノクローナル抗体クローンが多様なイソタイプのものであり得るように、トランスジーンがイソタイプスイッチを果たす配列を含む方法を提供する。本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異なる時間順序で起こるように、トランスジーンのイソタイプスイッチを促進する方法を提供する。スイッチ領域は、様々なＣ_H遺伝子から移植しそしてトランスジーン構成物中の別のＣ_H遺伝子に連結せしめることができる。そのような移植スイッチ配列は典型的には結合されたＣ_H遺伝子とは独立的に機能し、そのため、トランスジーン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ−結合欠失配列が様々なＣ_H 遺伝子に連結され、２つのδ−結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイッチを果たすことができる。よって、特定のＣ_H遺伝子が異なるスイッチ配列に連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こるよりも頻繁にスイッチされるトランスジーンを作製することができる。本発明はまた、免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物においてトランスジーン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を含んでもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントランスジーン構成物、および免疫グロブリントランスジーン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免疫グロブリントランスジーンの容易なクローニングと作製のための特別な方法であって、２つのユニークNotI部位により隣接されたユニークXhoIおよびSaII制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、トランスジェニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中での該遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）並びに生成した再配列された免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の発現を可能にする。本発明の一観点によれば、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、再配列された異種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのＣ，Ｊ（および重鎖の場合にはＤ）セグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セグメントの実質的部分も含んで成る。一態様では、そのようなトランスジーン構成物は、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡから誘導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有するトランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを組み合わせることができる。本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリントランスジーン―即ちＤ組胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの―を抗原と接触せしめ、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体の産生を誘導する。本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベクターおよび方注も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、トランスジーン、好ましくはポジティブ−ネガティブ（positive-negative）選別ベクターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物にとって内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子セグメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。そのような内因性遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常領域遺伝子セグメントが挙げられる。本発明のこの観点によれば、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターを少なくとも１つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応答を開始することが実質的に不可能である。そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使うことができ、または異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの受容体として使うことができる。本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、１または複数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および組成物を提供する。そのような方法は、トランスジーンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジーンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑制は、破壊された内因性Ｉｇ遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。内因性Ｉｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、（１）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡをコードし発現するトランスジーン、（２）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリタイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ｉｇ鎖ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができる。本発明は、機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及び非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを含み、ヒト抗原（例えばCD４）といった抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明は同様に、前記機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子がＪ_H 領域相同組換えノックアウトであり、前記機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子がＪ_k領域相同組換えノックアウトであり、前記非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンがHC１又はHC２ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、前記非相同軽鎖トランスジーンがKC２又はKCleヒトκトランスジーンであり、前記抗原がヒト抗原であるような、ヒト以外のトランスジェニック動物をも提供する。本発明は同様に、内因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座を抑制、切除及び／又は機能的に分断するためのさまざまな実施態様をも提供している。本発明は同様に、ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列重鎖恒常領域を含むキメラ重鎖及びヒト配列重鎖の両方を発現するトランスジェニックマウスをも提供する。このようなキメラ重鎖は一般に、機能的に再配置されたヒトトランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域（γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）の間でのトランススイッチにより産生される。標準港的にはトランスジーンコードされたヒト配列軽鎖又は内因性マフス軽鎖と組合わされたこのようなキメラ重鎖を含む抗体は、予め定められた抗原での免疫化に応答して形成される。これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、第１の時点でヒト配列重鎖を産生（発現）し、第２（次に続く）時点でヒト可変領域及びマウス恒常領域（例えば、γ１，γ２ａ，γ ２ｂ，γ３）から成るキメラ重鎖を産生（発現）するべくトランススイッチするＢ細胞を含むことができる；このようなヒト配列及びキメラ重鎖は軽鎖をもつ機能的抗体内に組込まれる：このような抗体は、かかるトランスジェニックマウスの血清中に存在する。かくして換言すると、これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、ヒト配列重鎖を発現しその後、ヒト可変領域及び交互の恒常領域（例えばマウスγ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３：ヒトγ，α，ε）から成るキメラ又はアイソタイプスイッチを受けた重鎖を発現するべくスイッチ（トランススイッチ又はシススイッチによる）するＢ細胞を含むことができ；かかるヒト配列及びキメラ又はアイソタイプスイッチされた重鎖は軽鎖を伴う機能的抗体（ヒト又はマウス）の中に組込まれ；かかる抗体はかかるトランスジェニックマウスの血清内に存在する。本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのような開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはならない。（化２）及び（化３）はベクターpGPeの配列を示す。（化４）及び（化５）は遺伝子Ｖ_H49.8の配列を示す。表１は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトIgＭおよびIgＧの検出を示す。（化６）及び（化７）はＶＤＪ接合の配列を示す。表２は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメントに対する、pHClトランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＪセグメントの分布を示す。表３は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＤセグメントに対する、pHClトランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤセグメントの分布を示す。（化８）及び（化９）は、pHClトランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ中のフレーム内ＶＤＪ接合を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さを示す。表４は、pHClトランスジュニックマウスから分析された30クローンのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。表５は、指摘の実験において使用したライン112のトランスジェニックマウスを示す；（＋）は各トランスジーンの存在を示し、（＋＋）は該動物がＪ_HＤ突出トランスジーンについてホモ接合性であることを示す。（表Ａ）複数の0011マウスの遺伝子型を示す。＜表７＞トランスジェニックマウスにおけるHC２重鎖トランスジーン内の体細胞突然変異の発生を示す。具体的な説明上述したように、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗原と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応答を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、例えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的な免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの（同種異系間エピトープ）であろうからである。第二に、ハイブリドーマを形成させるためのＢ細胞の源として働く動物（一例ではヒト）が真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のＢ細胞源としてヒトを使う場合には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なされる。かくして予め定められたヒト抗原に対する抗体応答を誘発できるヒト抗体分泌Ｂ細胞が必要とされることから、予め定められたヒト抗原と特異的反応性をもつヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することには問題が多い。ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構成物を含有するトランスジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジーン、またはヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成「小遺伝子座」（下記、並びに1990年８月29日に出願された同時係属米国出願第07/574,748号および1990年８月31日に出願された同第07/575,962号、並びに1991年８月28日に出願されたPC T/US91/06185号中に記載されている）を含有するトランスジーンを使ってトランスジェニック非ヒト動物を作製する。そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原に対して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなトランスジェニック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことができ、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞をミエローマ細胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリトーマを製造することができる。様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造は以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列されたマウス免疫グロブリン重鎮または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたは γ１定常領域を含む機能的に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニックマウス中で発現されている。しかしながら、トランスジーンが再配列されていない（再配列されないＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで成る実験は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最少の再配列を生じることがあった。しかし、トランスジーン中のＣ_H遺伝子間での好結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない免疫グロブリントランスジーンの例は１つも報告されていない。本発明は同様に、基本的にヒト恒常領域配列に対するポリペプチド結合におけるヒトＶＤＪ配列から成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ候補を同定するための方法をも提供する。かかるハイブリドーマ候補は、（１）基本的にヒトＶＤＪ領域とヒト恒常領域から成る免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン、及び（２）基本的にヒトＶＤＪ領域及びマウス恒常領域から成るヘテロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランススイッチされたハイブリドーマを含むハイブリドーマクローンのプールから同定される。個々の又はプールされたハイブリドーマクローンの上清は、予め定められた抗原結合特異性をもつ抗体を選択するための結合条件下で、標準的には固定基質（例えばマイクロタイターウエル）上に吸着により不動化される抗原である予め定められた抗原と接触させられる。ヒト恒常領域に特異的に結合する抗原も同様に、抗体が少なくとも１つのヒト恒常領域エピトープに選択的に結合するもののマウス恒常領域エピトープには結合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上清及び予め定められた抗原と接触させられ、かくして予め定められた抗原及び特異的にヒト恒常領域と結合する抗体に結合されたハイブリドーマ上清（トランスジェニックモノクローナル抗体）で基不的に構成されている複合体を形成する（そして、これは検出可能な標識又はリポーターで標識付け可能である）。このような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン又はプールを表わす）。定義本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも２本の同一の軽ポリペプチド鎖と２本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重および軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重および軽ポリペプチド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキン末端部分）も含んで成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、或る種の食細胞および典型的補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する。本明細書中で使用する時、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有するかまたはＤＮＡ配列をコードする抗体である。本明細書中で使用する時、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。本明細書中で使用する時、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばIgＭまたは1gG₁）を言う。本明細書中で使用する時、「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはイソタイプが或るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうちの１つへ変化する現象を言う。本明細書中で使用する時、「非スイッチイソタイプ」は、イソタイプスイッチが起こらなかった時に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイプをコードするＣ_H遺伝子は、典型的には機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の最初のＣ_H遺伝子である。本明細書中で使用する時、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えを招くそれらのＤＮＡ配列を言う。「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の５′（即ち上流）にあるだろう。「スイッチ受容体」領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領域（例えばγ，ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は１つもないので、典型的には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。本明細書中で使用する時、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より詳しくは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコシル化パターンをトランスジーンのＣ_H遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコシル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質上類似していると特徴付けることができる。本明細書中で使用する時、「特異的結合」は、抗体が（１）予め決定された抗原に少なくとも１×10⁷ Ｍ^-1の親和力で結合し、そして（２）予め決定された抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも少なくとも２倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。本明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語は、対象物に用いた時に対象物が天然に見つけることができることを言う。例えば、天然源から単離することができ且つ人間によって実験室で故意に変更されていない、生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「天然に存在する」ものである。本明細書中で使用する時「再配列された」という用語は、Ｖセグメントがそれぞれ本質的に完全なＶ_HまたはＶ_Lドメインをコードする構造においてＤ−ＪまたはＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を言う。再配列された免夜グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較によって同定することができ；再配列された遺伝子座は少なくとも１つのヘプタマー／ナノマー相同性要素を有するだろう。Ｖセグメントに関して本明細書中で使用する時、「再配列されていない」または「生殖細胞配置」なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるようにＶセグメントが組換えられない配置を言う。核酸については、「実質的相同性」ともいうのは、最適な形で整列され比較された場合、２つの核酸又はその指定配列が、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98〜99.5％のヌクレオチドにおいて適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って同一であることを表わす。代替的には、選択的ハイブリダイゼーンョン条件下でストランドの補体に対しセグメントがハイブリッド形成するときに実質的な相同性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞リゼイト中に、又は部分的に精製された形又は実質的に純粋な形で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、Ｃ_sClハンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野において周知のその他の技術を含む標準的技術により、例えばその他の細胞核酸又はタンパク質といったその他の細胞成分はその他の汚染物質から精製された時点で、「分離され」又は「実質的に純粋な状態にされ」ている。F．Ausubel，et．al.，ed ．「分子生物学における現在のプロトコル」、Greene,Publishing and Wiley-In terscience、ニューヨーク（1987）参照。本発明の核酸組成物は、往々にして、ｃＤＮＡゲノミック又は混合物のいずれかからの未変性配列（修正された制限部位などを除く）にあるものの、標準的技術に従って遺伝子配列を提供するべくそこからの突然変異を受けることができる。コーディング配列については、これらの突然変異は望まれるとおりにアミノ酸配列に影響を及ぼしうる。特に、未変性にＤ，Ｊ．結合スイッチと実質的に相同な又はこれらから誘導されたＤＮＡ配列及び本書に記されているその他のこのような配列が考慮される（ここで「誘導された」というのは、１つの配列がもう１つの配列と同一であるか又はそれから修正されたものであることを表わす）。核酸は、他の核酸と機能的関係におかれたとき、それは「使用可能に連結される。」例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与えるとき、「作用可能に連結される。転写抑制配列に関し、作用可能に連結されるとは、連結されたＤＮＡ配列が隣接することを意味し、２つの蛋白質コード領域を連結するのに必要な場合、隣接しており、そしてリーディングフレーム内にある。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。異種抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物のデザインは、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントランスジーンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする。好ましい態様では、異種重鎖トランスジーンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従って、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つまたは複数をもたらすように本発明のトランスジーンが作製される：（１）高レベルで且つ細胞型特異的な発現、（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル形質導入、（６）体細胞高度突然変異（hyper-mutation）、および（７）免疫応答の間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性化。下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されるそれらの態様では、トランスジーンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない。更に、トランスジーンが機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含んで成る態様では、２番目の基準である幾能的な遺伝子再配列は、少なくとも既に再配列されているトランスジーンには不要である。分子免疫学に関する背景については、Fundamental Immunolo-gy，第２版（1989），Pau l William E.編，Raven Press，N.Y．を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる。本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞（ジャームライン）中に再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されていないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジーンの各々は少なくとも１つのＣ_H遺伝子を含んで成る。加えて、重鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物のＢ細胞中で多数のＣ_H遺伝子をコードする異種トランスジーンのイソタイプスイッチを支持することができる機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジーンＣ_H 遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在するものであることができ、またはトランスジーン構成物を受け入れることになっている種（トランスジェニック動物）に存在するものから誘導することもできる。例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジーン構成物は、それがマウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことができる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナーゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化されないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しクローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初めから合成することができる（Millsら、Nucl．Acids Res. 18:7305-7316（1991）；Siderrasら、Intl．Immunol. 1:631-642（1989）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、トランスジェニック動物の有意な率（少なくとも10パーセント）のＢ細胞中に検出される。本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎮をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、抗原に暴露されると、トランスジェニック非ヒト動物内でＶ，ＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）を支持し、そして好ましくは結果として得られる再配列された免疫グロブリン重鎖中へのＤ領域遺伝子セグメントの全部または部分の組み込みを支持する。本発明の別の観点によれば、該トランスジーンは、再配列された「小遺伝子座」を含んで成る。そのようなトランスジーンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪセグメントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセットを含んで成る。そのようなトランスジーン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシング用のスプライス供与体およびスプライス受容体、組換えシグナル等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、トランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる。あるいは、トランスジーン中に合成調節配列を組み込むこともでき、この場合、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知られている機能的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデザインされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容配列を特定するものである。例えば、ミニ遺伝子座は、天然に発生する生殖細胞系Ｉｇ遺伝子座と異なり、可欠ＤＮＡ部分（例えば介在配列；イントロン又はその一部分）の少なくとも１つの内部（すなわちこの部分の末端にはない）の欠失を有するゲノミック免疫グロブリン遺伝子座の一部分を含む。本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含有するトランスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジーンの一方は再配列された遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む。好ましい態様では、再配列されたトランスジーンが軽鎖免疫グロブリントランスジーンであり、再配列されていないトランスジーンが重鎖免疫グロブリントランスジーンである。抗体の構造および産生全ての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる２つの領域を含んで成る。重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域遺伝子（Ｃ_H）セグメントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＭクラスを限定し、一方でγ，γ２，γ３またはγ４定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＧクラス並びにIgＧのサブクラスIgＧ₁〜Ig Ｇ₄を限定する。同様に、α₁またはα₂定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体のIgＡクラス並びにIgＡ₁およびIgＡ₂サブクラスを限定する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれIgＤおよびIgＥ抗体クラスを限定する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、一緒になって抗体の抗原結合領域を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、特定の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグメントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変（Ｖ）遺伝子セグメントと連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初期可変領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグメントによってコードされ、各セグメントはその生物のゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺伝子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎮Ｖ遺伝子セグメント、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子セグメントを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の適当な免疫グロブリン遺伝子セグメントのＶ，ＤおよびＪファミリーから選ばれる。抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トランスジーンが再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分を組み込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持するシス作用性配列を含むことが好ましし。典型的には、発現されたトランスジーンによってコードされる重鎖（またはmRNA）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識可能なＤ領域配列を含有する。好ましくは、トランスジーンによってコードされるＶ領域の少なくとも約 10％、より好ましくは少なくとも約30％、最も好ましくは50％が認識可能なＤ領域配列を含有する。認識可能なＤ領域配列は一般に、重鎖トランスジーンのＤ領域遺伝子セグメント中に存在する配列に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドおよび／またはそのようなＤ領域ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52を含むならば、Ｖ遺伝子セグメント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に配列５'-TAACTGGG-３' を含有するトランスジーンによってコードされるmRNAは、Ｄ領域配列、特にDHQ5 2配列を含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHU52を含むならば、Ｖ遺伝子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ酸配列の間のＶ領域中に置かれたアミノ酸配列-OAF-を含有するトランスジーンによってコードされる重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列、特にDH Q52配列を含むものとして認識可能である。しかしながら、Ｄ領域セグメントをさまざまな程度までのさまざまな読み取り枠内でのＶＤＪジョイニング内に取り込むことができることから、特定のＤセグメントの取込みを見極めるには、トランスジーン内に存在するＤ領域セグメントに対する重鎖可変領域のＤ領域部域の比較が必要である。その上、組換え中の潜在的エキソヌクレアーゼ消化は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え中の不精確なＶ−Ｄ及びＤ− Ｊ連結を導く可能性がある。しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領域付加のために、幾つかのＤ領域は、認識可能であるが連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがある。例えば、ヌクレオチド配列５′-CTAAXTGGGG-３′（ここでＸはＡ，ＴまたはＧであり、該配列は重鎖Ｖ領域中にあり、Ｖ領域遺伝子配列とＪ領域遺伝子配列によって隣接されている）は、DH52配列５′-CTAACTGGG-３′に相当すると認識され得る。同様に、例えば、Ｖ領域中にありそしてアミノ未端側でトランスジーンＶ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されそしてカルボキシ末端側でトランスジーンＪ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されているポリペプチド配列-DAFDI-，-DYFDY-または-GAFDI-は、Ｄ領域配列として認識され得る。従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はトランスジーンＤ領域に由来する配列中に変異をもたらし得るので、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するための指標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のような場合にＤ領域として認識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一方の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、そして他方の側がＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知のＤ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）と実質的に同じであるかまたは実質的に相同である場合。ここで使用する用語「実質的な同一」は、ポリペプチド配列が参照配列に比較して少なくとも50％の配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくとも70％の配列一致を有する、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴を表す。配列一致の％は、参照配列の合計35％未満である小さな欠失または付加を除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも３アミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少なくとも８〜12ヌクレオチドまたは少なくとも３〜４アミノ酸であり、好ましくは12〜15ヌクレオチドもしくはそれ以上または少なくとも５アミノ酸である。ここで使用する用語「実質的な相同」は、ポリペプチド配列が参照配列に対して少なくとも80％の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数えることにより算出される。位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドンが異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き換えられる。例えば、配列-Lys-Glu-Arg-Val-は配列Asn-Asp-Ser-Va l-と実質的に相同である。何故なら、コドン配列-AAA-GAA-AGA-GUU-は、わずか３つの置換変異（２つの元のコドンのうちの３つに単一ヌクレオチド置換）を導入することによって-AAC-GAC-AGC-GUU-に変異せしめることができるからである。参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４アミノ酸残基である。典型的には参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以上である。一次レパートリー重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを作製する方法は、主としてＢ細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの結合前、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、大部分、一次レパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ，Ｄ，ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラスターとして見つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一の染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中「再配列されていない」ゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ，Ｄ，Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶとＪのみ）の適当なファミリーメンバーのいずれか１つの遺伝子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。そのような機能的再配列は、機能的な可変領域をコードするＤＮＡを形成する可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連続的であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ接合が作られ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られる。軽鎖および／または重鎖中の機能的可変領域のこの初期形態をコードするＤＮＡは、「機能的に再配列されたＤＮＡ」または「再配列されたＤＮＡ」と呼ばれる。重鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された重鎖ＤＮＡ」と呼ばれ、そして軽鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された軽鎖ＤＮＡ」と呼ばれる。本発明のトランスジーンの機能的再配列を記述するためにも同様な用語が使われる。機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え応答能のあるＶ，ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。組換えを指令するのに必要且つ十分なＲＳＳは、二分子対称ヘプタマー、高ＡＴノナマー、および12塩基対または23塩基対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それらのシグナルは、Ｄ− Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行いそして機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座および種の間で保存されている。Oettingerら（1990），Science, 248, 151 7-1523およびその中に引用された参考文献を参照のこと。配列CACAGTGまたはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次いで配列ACAAAAACCまたはその類似体を有するノナマーが存在する。それらの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメントのＪ側、即ち下流側上に見つかる。生殖細胞型たおよびＪ遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプタマーがある。Ｖ_L，Ｖ_HまたはＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列は、それらが組み換わるＪ_L，ＤまたはＪ_Hセグメントの前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配列との間のスペーサーは12塩基対の長さかまたは22〜24塩基対の長さかのいずれかである。Ｖ，ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間および重鎖のＤセグメントとＪセグメントとの間の可変的組換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確な場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびＪセグメントの最初のコドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上ではＤセグメントとＪ_Hセグメントとの間に起こり、10ヌクレオチドほどの多数に及ぶことがある。更に、ＤセグメントとＪ_Hセグメントとの間およびＶ_HセグメントとＤセグメントとの間に、ゲノムＤＮＡによりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている。ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメントおよび再配列された可変領域の下流に置かれた１または複数の定常領域遺伝子セグメントの転写は、一次ＲＮＡ転写物を生成し、これが適当なＲＮＡスプライシングを受けると、全長の重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするmRNAを生じる。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中への免疫グロブリンの挿入および／またはＢ細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル配列をコードするＤＮＡは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域を形成するのに使うＶセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コードされる免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合によって抗体分子を形成する）を生成するmRNAの翻訳を調節するためにmRNA中に適当な調節配列も存在する。可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起こり得る可変的組換えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般に、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生する。この分化過程の間に、機能的に再配列されたIg遺伝子内に含まれるもの以外の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体Ｂ細胞がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。二次レパートリー一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪおよびＶＤＪ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる一次応答によって産生される抗体は比較的低い親和性のものである。２つの異なる型のＢ細胞がこの初期応答を作成する：一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパトリーＢ細胞の前駆体〔Lintonら、Cell，59:1049-1059（1989）〕。最初の型のＢ細胞は或る種の抗原に応答してIgM分泌性形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に応答する。抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造が２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非IgＭサブタイプにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更されて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。前に指摘したように、Ig重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、３つの相補性決定領域（CDR1，CDR2およびCDR3；これは超可変領域１，２または３とも呼ばれる）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定されている〔Kabat ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（1991）U.S．Departme nt of Health and Human Services，Washington，DC；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。CDR1とCDR2は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方 CDR3は大部分がＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ，Ｄおよび遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。 CDR1，2または3を構成しない可変領域の部分は、一般に、FR1，FR2，FR3およびFR4と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。高度突然変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異されて異なるIg分子を有する新しいクローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクローンがヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き起こす。クローン選択は、典型的にはCDR1，CDR2および／またはCDR3領域中に新規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こる。異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物本発明の１観点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリントランスジーン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期胚中に導入することにより製造される。本発明に有用である非ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列して一次抗体応答を生ぜしめることができる任意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知である他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは齧歯類の他のメンバーである。しかしながら、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジおよびブタの種、齧歯科の他のメンバー、例えばラット、並びにウサギおよびモルモットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモットであり、最も好ましくはマウスである。本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列されていない形で重鎖および軽鎖トランスジーンに使われる。この態様では、そのようなトランスジーンがマウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジーンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固有のＤＮＡ配列を有する。それらは生殖細胞やＢ細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態でそしてＢ細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。本発明の別の態様では、トランスジーンは、再配列された重鎮および／または軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含んで成る。そのようなトランスジーンの機能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪセグメントに相当する特定セグメントは、マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能である免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配列に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコードされるアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を検出することができる。ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジーンを含有するトランスジェニックＢ細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。そのような再配列されたトランスジーンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動物中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を有することは容易に明らかであろう。再配列されていないトランスジーン本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン重鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。前記重鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。同様に、本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。本発明のこの観点でのそのような重鎖および軽鎖トランスジーンは、再配列されていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランスジーン中のＶ，ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖トランスジーン中のＶとＪセグメントの間には、適当な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）が置かれる。加えて、そのようなトランスジーンは、定常領域遺伝子セグメントをＶＪまたはＶＤＪ再配列された可変領域と結合するための適当なＲＮＡスプライシングシグナルも含む。複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのＣμおよびＣγ１を含む重鎖トランスジーン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロブリンクラススイッチ、例えばIgＭからIgＧへのクラススイッチを考慮した前記定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するような「スイッチ」領域が組み込まれる。そのような重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節配列（典型的にはTATAモチーフを含む）も含有する。プロモーター領域は、下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を指令することができるＤＮＡ配列として大体定義することができる。プロモーターは、効率的転写を指令するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列の例は、Rothmanら、I ntl．Immunol. 2: 621-627（1990）；Reidら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 840-844（1989）；Stavnezerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7704-7708（1 988）およびMillsら、Nucl．Acids Res. 18:7305-7316（1991）（この各々は参考として本明細書中に組み込まれる）を包含する、発表文献中に見つけることができる。それらの配列は、典型的にはスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50bp、好ましくはスイッチ領域の上流の少なくとも約200bp、より好ましくはスイッチ領域の少なくとも約200〜1000bpまたはそれ以上を含む。適当な配列はヒトＳγ１, Ｓγ２,Ｓγ３,Ｓγ４,Ｓα１,Ｓα２およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在するが、ヒトＳγ１およびＳγ３スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。それに代えて、又はそれと組合わせて、ネズミＩｇスイッチ配列を用いることができる。トランスジェニック非−ヒト動物と同じ種のＩｇスイッチ配列を用いるのが、しばしば有利である。特に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要素、例えばＩＦＮ誘導性エンハンサーがトランスジーンスイッチ配列のすぐ上流に含まれるのが好ましい。プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる。例えば、軽鎖トランスジーン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝子セグメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列は、トランスジーンの発現を増強し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジーンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような調節配列は、トランスジーンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的高いレベルのトランスジーン発現を提供するために用いられる。上述のプロモーターおよびエンハンサー調節配列は包括的に記載されているけれども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムＤＮＡから誘導することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖および軽鎖トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の対応する調節配列から誘導される。好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのような重鎖および軽鎖トランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのような動物に投与される特異抗原に対してIg介在型免疫応答を開始することができる。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生することのできるＢ細胞が産生される。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Mab）、例えばハイブリドーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。そういったヒトMabは、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫原性を有する。好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎖および軽鎖トランスジーンの作製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメントの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされた療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を生成せしめることができる。再配列されたトランスジーン別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖細胞中に機能的に少なくとも１つの再配列された異種重鎖免疫グロブリントランスジーンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎖トランスジーンを発現する一次レパートリーＢ細胞を含有する。そのようなＢ細胞は、好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親和性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトランスジーンは、少なくとも２つのＣ_H遺伝子とイソタイプイッチに必要な関連配列を含むだろう。本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含み、前記トランスジーンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再配列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する。そのような動物では、重鎖トランスジーンが少なくとも２つのＣ_H遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。本発明は更に、本発明のトランスジーンにおいて使うことができる合成可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製することを含んで成る。ここで前記ＶセグメントＤＮＡの各々は免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末端に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメントレパートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トランスジーンは、少なくとも２つのＣ_H遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。イソタイプスイッチＢリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたＶ_HおよびＶ_L領域によって決定される結合特異性を有するIgＭを最初に産生する。続いて、各Ｂ細胞とその子孫の細胞が同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッチすることができる。 μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、IgＭおよびIgＤを単一細胞中で同時発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重鎖イソタイプ（γ，αおよびε）は、遺伝子再配列現象がＣμおよびＣδエクソンを欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプスイッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子（δを除く）のすぐ上流に置かれたいわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。個々のスイッチセグメントは長さが２〜10kbであり、主として短い反復配列から成る。組換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。cDNA由来のＣ_Hプローブを用いるサザンブロット法または溶液ハイブリダイゼーション速度論を使った実験は、スイッチが細胞からのＣ_H配列の消失に関係し得ることを確証した。 μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、コード配列の約１〜２kb５′側に位置し、そして（GAGCT）_n（GGGGT）の形の配列の多数の縦列反復から成る。ここでｎは通常２〜５であるが、17ほどの大きさに及ぶことができる。〔T．Nikaido ら、Nature，292: 845-848（1981）を参照のこと。〕他のＣ_H遺伝子の５′にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Ｓα領域は配列決定されており、縦列に反復した80bpの相同性単位から成ることが判明した。一方、Ｓ_2a，Ｓ_2bおよびＳ₃は全て、互いに非常に類似している反復した49bpの相同性単位を含む〔P．Szurekら、J．Immuno l ，135: 620-626（1985）およびT．Nikaidoら、J．Biol．Chem. 257:7322-7329 （1982）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定されたＳ領域は、Ｓμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタマーGAGC TおよびGGGGTの多数の存在を含む〔T．Nikaidoら、J．Biol．Chem. 257: 7322-7 329（1982）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕；他のＳ領域では、それらのペンタマーはＳμのようには正確に縦列に反復されていないが代わりに大きな反復単位中に埋もれている。Ｓγ₁領域は追加の高次構造を有し、即ち、２つの直接反復配列が49bpの縦列反復の２つのクラスターの各々に隣接する〔 M.R.Mowattら、J．Immunol．136: 2674-2683（1986）を参照のこと；これは引用して本明細書中に組み込まれる〕。ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似していることがわかっている。実際、Ｃ_H遺伝子の５′側のヒトクローンとマウスクローンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっており、これは、それらの領域の生物学的重要性を確証する事実である。 μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合Ｓμ−Ｓα配列をもたらす。典型的には、組換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他のＳ領域中にも存在しない。一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生殖細胞Ｓ前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いで該配列を異なる位置で一直線上に連結することができる。〔T.H．Rabbittsら、Nuc leic Acids Res. 9: 4509-4524（1981）およびJ．Ravetchら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA ，77:6734-6738（1980）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である。リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコンビナーゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあらゆるイソタイプへのスイッチを触媒し、そして特異性がこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領域に向けることにある可能性もある。Ｔ細胞由来のリンホカインIL-4およびIFNγは、幾つかのイソタイプの発現を特異的に促進することが証明されている：IL-4はIgＭ，IgＧ2a，IgＧ2bおよびIg Ｇ3発現を減少させ、IgＥおよびIgＧ1発現を増加させる；IFNγはIgＧ2a発現を選択的に勅激し拮抗する一方、IgＥとIgＧ1発現の増加を誘導する〔Coffmanら、J．Immunol ．136:949-954（1986）およびSnapperら、Science 236: 944-947（19 87）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しかし、最もありそうな説明はリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するというものである。クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物（stelile transcript）に関係があるらしい〔Lutzekerら、Mol．Cell Biol．8: 1849（1988）；Stavnezerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:7704（1988）； E sserおよびRadbruch，EMBO J．8: 483（1989）；Bertonら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA 86:2829（1989）；Rothmanら、Int．Immunol．2:621（1990）；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。例えば、観察されるIL-4によるγ１繁殖不能転写物の誘導およびIFNγによる阻害は、IL-4がＢ細胞中での γ１へのクラススイッチを促進し、IFNγがγ１発現を阻害するという観察結果と一致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包含は、イソタイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖不能転写物の転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタイプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。それらの理由により、トランスジーンがイソタイプに使用する予定の各スイッチ領域の約１〜２kb上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサー要素を含み、より好ましくはスイッチ領域と生来関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５′隣接（即ち上流）領域を含む。この５′隣接領域は、典型的には長さが少なくとも50 ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。１つのスイッチ領域からの５′隣接配列をトランスジーン構成物用の別のスイッチ領域に作用可能に連結させることができる（例えば、ヒトＳγ１スイッチからの５′隣接配列をＳα₁スイッチのすぐ上流に融合させることができ；ネズミＳγ１フランキング領域をヒトγ１スイッチ配列の隣りに移植ることができ；あるいはネズミＳγ１スイッチをヒトγ１コード領域に移植することができる）けれども、或る態様では、トランスジーン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５′隣接配列を有することが好ましい。モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、当業者にとっては周知のさまざまな技術によって得ることができる。簡単に言うと、望ましい抗原で免疫化された動物からの脾細胞を、一般には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる。（Kohler及びMilstein，Eur．J．Immunol. ，6；511-519（1976）を参照のこと）。不死化の代替的方法としては、エプタイン−バーウイルス、オンコ遺伝子又はレトロウイルスでの形質転換、又はその他の当該技術分野において周知の方法が含まれる。単一の不死化された細胞から発生したコロニーは、抗原に対する望ましい特異性及び親和力を有する抗体の産生についてスクリーニングされ、かかる細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔内への注入を含むさまざまな技術によって増強できる。免疫グロブリンを産生するための動物の免疫化、モノクローナル抗体の産生；プローブとしての使用を目的とした免疫グロブリンの標識付け；イムノアフィニティ精製；及び免疫学的検定法を含め、これらの技術分野で有効なさまざまな技法が、例えば、Harlow及びLane、抗体：その研究室マニュアル、Cold Spring Harbor，New York（1988）の中で論述されている。トランスジェニック一次レパートリーＡ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座トランスジーン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免疫応答を開始させるのに十分な程度に多様である一次抗体レパートリーの作製である。再配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソン、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列整列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免疫グロブリンクラスの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領域に近いＶ領域が欠失されて新規重鎖クラスの発現をもたらす。各重鎖クラスについては、ＲＮＡスプライシングの別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。ヒト重鎖遺伝子座は、２Mbにわたる約200個のＶ遺伝子セグメント（今回のデーターは約50−100Ｖ遺伝子セグメントの存在を支持している。）、約40kbにわたる約30個のＤ遺伝子セグメント、３kbの範囲内に密集した６個のＪセグメント、および約300kbにわたる９個の定常領域遺伝子セグメントから成ると予想される。全遺伝子座は、染色体14の長い方の腕の遠位部分約2.5kbに及ぶ（図４）。Ｂ．遺伝子断片トランスジーン１．重鎖トランスジーン好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンは、ヒト由来の再配列されていないゲノムＤＮＡを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトランスジーンは670〜830kbの長さを有するNot I断片を含んで成る。この断片の長さは、３′制限部位が実際にマッピングされていないため、不明瞭である。しかしながら、α１とψα遺伝子セグメントとの間にあることが知られている。この断片は、６つの既知Ｖ_Hファミリーの全部のメンバー、Ｄ３およびＪ遺伝子セグメント、並びにμ，δ，γ３，γ１およびα１定常領域を含む。Bermanら、EMBO J． 7:727-738（1988）。このトランスジーンを含有するトランスジェニックマウス系は、Ｂ細胞の発達に必要とされる重鎖クラス（IgＭ）を正しく発現し、そしてほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリーと共に、少なくとも１つのスイッチされた重鎖クラス（IgＧ₁）を発現する。２．軽鎖トランスジーンヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有するゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に記載のようにして作製される。Ｃ．生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジーン単一ＤＮＡ断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの670-830kp Not I断片は、トランスジーン形成（transgenesis）の間に非ヒト動物の生体内で形成させることができる。そのような生体内トランスジーン作製は、２以上の重複するＤＮＡ断片を非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片の重複部分は、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎児性核内に含まれるレコンビナーゼに暴露されると、重複しているＤＮＡ断片が適切な方向において相同的に組み換わって670-830kbのNot I重鎖断片を形成する。生体内トランスジーン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製または操作が因難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジーンを形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トランスジーン作製は、ＹＡＣベクター〔MurrayおよびSzostak，Nature 305:189-19 3（1933）〕により操作することができるＤＮＡ断片よりも大きい免疫グロブリントランスジーンを作製するのに有用である。そのような生体内トランスジーン作製は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入する場合にも使うことができる。ゲノム免疫グロブリントランスジーンを形成させることに加えて、実施例に記載の如く「小遺伝子座」トランスジーンを形成させるのにも主体内相同組換えを使うことができる。生体内トランスジーン作製を利用する好ましい態様では、各々の重複するＤＮＡ断片は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤＮＡ断片の未端部分の間で重複する実質的に相同なＤＮＡ配列を有する。ＤＮＡ断片のそのような重複部分は、好ましくは約500bp〜約2000bp、最も好ましくは1.0kb〜2.0kbを含む。生体内でトランスジーンを形成させるための重複ＤＮＡ断片の相同組換えは、1992年３月19日に公開された「哺乳類細胞における相同性組換え（Homologous Recombination in Mammalian Cells）と称するPCT公開WO 92/03917に更に詳しく記載されている。Ｄ．小遺伝子座トランスジーン本明細書中で使用する時、「免疫グロブリン小遺伝子座」なる用語は、通常は約150kb未満、典型的には約25〜100kobのＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列が少なくとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮＡ配列に関して、通常は少なくとも約2〜5kb、好ましくは10〜25kbまたはそれ以上の欠失）を有するような、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ配列を言う：機能的可変（Ｖ）遺伝子セグメント、機能的連結（Ｊ）領域セグメント、少なくとも１つの機能的定常（Ｃ）領域遣伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の場合には、機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トランスジーンは、長さが少なくとも25kb、典型的には50〜80kbであるだろう。重領トランスジーンは、スイッチ領域に作用可能に連結された２つの定常領域を有する、典型的には約70〜80kb 、好ましくは少なくとも約60kbの長さであろう。更に、小遺伝子座の個々の要素は好ましくは生殖細胞（ジャームライン）配置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物の前駆体Ｂ細胞において遺伝子再配列を受けることができる。更に、少なくとも２つのＣ_H遺伝子と必要なスイッチ配列とを含んで成る重領小遺伝子座は、典型的には、異なる免疫グロブリンクラスの機能的抗体分子が生成されるように、イソタイプスイッチを受けることができる。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞中で生体内で起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系列の培養細胞中で起こり得る。他の好ましい態様では、免疫グロブリン重領および軽鎖トランスジーンはＶ_H ，ＤおよびＪ_H遺伝子セグメントを各々１つまたは複数並びにＣ_H遺伝子を２つ以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つが小遺伝子座トランスジーンに組み込まれる。重鎖トランスジーンのＣ_Hセグメントに関しては、トランスジーンが少なくとも１つのμ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遺伝子セグメント、最も好ましくはγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのIgＭ形とIgＧ形の間のクラススイッチおよび分泌形の高親和性非IgＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものである。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばIgＤ，IgＡおよびIgＥの産生をコードするものも使うことができる。当業者は、重鎖Ｃ_H遺伝子の発生の順序が該Ｃ_H遺伝子の供与体として働く種の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトランスジーンも作製するだろう。更に、当業者は、１つの種の複数の個体からＣ_H遺伝子を選択することができ（例えば、同種異系Ｃ_H遺伝子）、そしてイソタイプスイッチを受けることができる過剰のＣ_H遺伝子として前記遺伝子をトランスジーン中に組み込むことができる。次いで、結果として生じたトランスジーン非ヒト動物は、或る態様では、トランスジーンＣ_H遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含する様々なクラフの抗体を生産することができる。更にまた、当業者は、異なる種からＣ_H遺伝子を選択してトランスジーン中に組み込むことができる。各Ｃ_H遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるが、使用するスイッチ配列は必ずしもＣ_H遺伝子の隣に天然に存在するものである必要はない。種間のＣ_H遺伝子組み合わせは、様々な種からのＣ_H遺伝子に相当する多様なクラスの抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物をもたらすだろう。種間Ｃ_Hトランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを作製するためのＢ細胞の源として働くことができる。ヒトの重鎖Ｊ領域セグメントは、３kbのＤＮＡ長さにおいて密集した６個の機能的Ｊセグメントと３個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイズであることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の５′部分と一緒に単一の23kb SFiI／SpeI片として単離できること〔Sadoら、Biochem．Biophys．Res ．Commun．154: 246-271（1988）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のＪ領域遺伝子セグメントを使うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した３′調節要素の全部を含むことが適当である。更に、この断片は完全なＪ領域を含むため、重鎖エンハンサーとμスイッチ領域を含む〔Millsら、Nature 306:809（1983）；YancopoulosおよびAlt，Ann．Re v．Immunol. 4:339-368（1986）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。それは、ＶＤＪ結合を開始させて一次レパートリーＢ細胞を形成させる転写開始部位も含む〔YancopoulosおよびAlt，Cell 40:271-281（1985）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。あるいは、23kb SFiI/SpeI断片の代わりに、Ｄ領域の一部を含む36kb BssHII/SpeI断片を使うことができる。そのような断片の使用は、効率的Ｄ−Ｊ結合を促進させる５′隣接配列の量を増加させる。ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５個の相同な9kbの亜領域から成る〔s iebenlistら、Nature 294:631-635（1981）〕。各亜領域は10個までの個々のＤセグメントを含む。それらのセグメントの一部はマッピングされており、それを図４に示す。２つの異なる方策を使って小遺伝子座Ｄ領域を作製する。第一の方策は、１つまたは２つの反復Ｄ亜領域を含む短いＤＮＡの連続鎖の中に置かれたそれらのＤセグメントのみを使うものである。候補となるのは、12個の個々のＤセグメントを含む単一の15kb断片である。ＤＮＡのこの断片は２つの連続するEcoRI断片から成り、そして完全に配列決定されている〔Ichiharaら、EMBO J．7:4141-4150（1988）〕。12のＤセグメントが一次レパートリーに十分であろう。しかしながら、Ｄ領域の分散性質があるとすれば、別の方策は、幾つかの不連続Ｄ断片含有断片を一緒に連結して、より多数のセグメントを有する一層小型のＤＮＡ断片を作製することである。例えば、特徴的な隣接ノナマーまたはヘプタマー配列（前傾）の存在により、および文献への参照により、追加のＤセグメント遺伝子を同定することができる。重鎮小遺伝子座トランスジーンを作製するのには、少なくとも１つ、好ましくは複数のＶ遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメントは、「異種性抗体を生産することができるトランスジェニック非−ヒト動物」（Transgenic Non-Human Animal Capable of Producing Heterologous Artibodies）と称する。1992年３月19日に公開されたPCT公開WO 92/03918に記載の通りに単離することができる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメント、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、1992年３月19日に公開されたPCT公開WO 92/03918に記載の通りに単離することができる。小遺伝子座軽領トランスジーンは、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮＡ断片、少なくとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片から、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常領域配列（各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば約75 kbの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジーン構成物を形成せしめることができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして再配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定常領域配列（例えばμ およびγ）およびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖トランスジーン構成物は、1990年８月29日出願の同時係属出願USSN 07/574,748に記載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相同であり且つ再配列を受けることのできる複数のＤＮＡ断片から同様に形成せしめることができる。Ｅ．イソタイプスイッチを受けることができるトランスジーン構成物理想的には、クラススイッチを受けることになっているトランスジーン構成物は、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列（例えばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプスイッチを受けることができるトランスジーン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好ましくはヒトγ１スイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50塩基対、好ましくは少なくとも約200塩基対、より好ましくは少なくとも500〜1000塩基対またはそれ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ１スイッチ配列に作用可能に連結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存在しないＣ_H遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめることができる。例えば、限定のつもりでないが、ヒトγ１スイッチ領域をヒトα２Ｃ_H遺伝子の上流に連結してもよく、またはマウスγ１スイッチ領域をヒトＣ_H遺伝子に連結してもよい。トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ（例えばδ− 関連欠失）を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400bpの直接反復配列（σμおよびεμ）〔Yasuiら、Eur．J．Immunol. 19:1399（1989）〕の包含を伴う。それらの二配列の間の相同組換えはIgＤ型のみのＢ細胞においてμ遺伝子を欠失せしめる。重鎖トランスジーンは、次の式によって表すことができる（V_H）_x-（D）_y-（J_H）_z-（S_D）_m-（C₁）_n-［（T）-（S_A）_p-（C₂）］_q 上式中、Ｖ_Hは重鎖可変領域遺伝子セグメントであり、Ｄは重領Ｄ（多様性）領域遺伝子セグメントであり、Ｊ_Hは重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、Ｓ_Dはイソタイプスイッチが起こるようなＳ_a受容体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる供与体領域セグメントであり、Ｃ₁はＢ細胞発達において使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）をコードする重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、Ｔは少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調節領域セグメントであり、Ｓ_Aはイソタイプスイッチが起こるような選択されたＳ_D供与体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる受容体領域セグメントであり、Ｃ₂はμ以外のイソタイプ（例えばγ₁，γ₂，γ₃，γ₄，α₁，α₂，ε ）をコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、ｘ，ｙ，ｚ，ｍ，ｎ，ｐおよびｑは整数であり、ｘは１〜100、ｎは０〜10、ｙは１〜50、ｐは１〜10、ｚは１〜50、ｑは０〜50、ｍは０〜10である。典型的には、トランスジーンがイソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少なくとも１であり、ｍは少なくとも１であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｍはｎと等しいかまたはそれより大きくなければならない。Ｖ_H，Ｄ，Ｊ_H，Ｓ_D，Ｃ₁，Ｔ，Ｓ_AおよびＣ₂セグメントは様々な種、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡから選択することができる。Ｖ_Hセグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在する、Ｖ_Hセグメント、例えばＶ_H251から選択することができる。典型的には、約２個のＶ_Hセグメント、好ましくは約４個、より好ましくは少なくとも約10個のＶ_Hセグメントが含まれる。典型的には少なくとも１個のＤセグメントが含まれるが、好ましくは少なくとも10個のＤセグメントが含まれ、態様によっては、10個以上のＤセグメントが含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメントを含む。典型的には少なくとも１個のＪ_Hセグメントがトランスジーンに含まれるが、約６個のＪ_Hセグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個以上のＪ_Hセグメントを含み、非ヒトＪ_Hセグメントを１つも含まない。Ｓ_Dセグメントは該トランスジーンのＳ_Aセグメントとの組換え現象に参加することができる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、Ｓ_DおよびＳ_A領域はＳμ，Ｓγ₁，Ｓγ₂，Ｓγ₃，Ｓγ₄，Ｓα，Ｓα₂およびＳεといったスイッチ領域である。好ましくは、スイッチ領域はマウスまたはヒトであり、より好ましくはＳ_DがヒトまたはマウスＳμであり、Ｓ_AがヒトまたはマウスＳγ₁ 、である。非古典的イソタイプスイッチ（δ関連欠失）では、Ｓ_DおよびＳ_A領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する400塩基対の直接反復配列である。Ｃ₁セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ミしくはμ遺伝子であり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。Ｔセグメントは、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッチ領域に隣接する５′隣接配列を含む。Ｔセグメントは典型的には長さが少なくとも約50 ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。好ましくはＴセグメントは、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する５ ′隣接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在しないシス作用性転写調節配列（例えばウイルスのエンハンサーおよびプロモーター、例えばSV40、アデノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス中に見つかるもの）を含んでもよいことは当業者にとって明白である。Ｃ₂セグメントは、典型的にはγ₁，γ₂，γ₃，γ₄，α₁，α₂またはεＣ_H遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣ_H遺伝子であり、より好ましくはヒトγ₁またはγ₃遺伝子である。様々な種からの下流（スイッチされる）イソタイプ遺伝子としてマウスγ_2aおよびγ_2bを使ってもよい。重鎖トランスジーンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含む場合、該トランスジーンの全長は典型的には150キロ塩基対未満であろう。一般に、該トランスジーンは、生来の重鎖Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろう。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換が存在するだろう。Ｆ．Ｉｇトランスジーン中の機能的イソタイプスイッチを決定する方法トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界で公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては次のものが挙げられ、それらは単独でまたは組み合わせて使用される。１．δ以外の少なくとも１つのトランスジーン下流Ｃ_H遺伝子に相同である配列とトランスジーンＶ_H−Ｄ_H−Ｊ_H再配列された遺伝子に相同である隣接配列とを含有するmRNA転写物の検出；そのような検出はノーザンハイブリダイゼーション、Ｓ₁ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲ増幅、cDNAクローニングまたはその他の方法によることができる。２．トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジュニック動物のＢ細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流Ｃ_H遺伝子によりコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、そのようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもできる。３．トランスジェニック動物のＢ細胞からのＤＮＡ中の、またはハイブリドーマ細胞からのゲノムＤＮＡ中の、該トランスジーン中のイソタイプスイッチの発生と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイブリダイゼーンョン、ＰＣＲ増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成することができる。４．イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチに関与する特徴的な酵素の産生（例えば「スイッチレコンビナーゼ」）、あるいは現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。各々のトランスジェニック系列はトランスジーンの異なる組み込み部位とトランスジーン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジーンと隣接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レベルのヒト免疫グロブリン、特にIgＧイソタイプのものを発現し、且つ最少コピー数の該トランスジーンを含有するマウスの系統を同定しそれを使用することが好ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝子発現の問題を最少にする。トランスジーンは典型的には宿主染色体ＤＮＡ中、最も普通には生殖細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は、適宜および所望により、当業界において既知であるかまたは後に開発される他のベクターおよびトランスジェニック法に置換することができる。内因性非ヒト重鎖恒常領域遺伝子に対するトランススイッチが起こって、キメラ重鎖及びかかるキメラヒト／マウス重鎖を含む抗体を産生する可能性がある。かかるキメラ抗体は、本書で記述するいくつかの用途には望まれるかもしれないが、望ましくない場合もある。Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能的破壊好結果に再配列された免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制することにより優性作用を有すると予想される。しかしながら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパートリーを容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用に合わせて容易に改変することができる。簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性細胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グロブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その細胞の一部において、導入されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わり、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を宿主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移殖する。それらの胚の一部が変異細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キメラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系列を獲得することが可能である〔Capecchi（1989）Science, 244, 1288-1292 により概説されている〕。マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか５％に寄与するため、重鎖および／またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破壊するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ−Ｃイントロンエンハンサーの欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮＡ構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の排除はＢ細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎖セグメントにクラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノックアウト）する方策を下記に概説する。マウスμおよびκ遺伝子を破壊するためには、Jaenischおよび共同研究者〔Zi jlstraら（1989），Nature，342, 435-438〕によりマウスβ２ミクログロブリン遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした標的ベクターを用いる。プラスミドpMCIneoからのネオマイシン耐性遺伝子（neo）を標的遺伝子のコード領域中に挿入する。PMCIneo挿入断片はneo発現を指令するのにハイブリッドウイルスプロモーター／エンハンサー配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性である。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込みのための選択マーカーとしてneoを使うことができる。ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーとしてHSVチミジンキナーゼ（tk）遺伝子を該構成物の未端に付加する（Zijls traら、前掲）。重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方策はＪ領域の削除である。この領域はマウスではかなり小さく、わずか1.3kbに及ぶ。遺伝子標的ベクターを作製するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部を含む15kbのKpnＩ断片をマウスゲノムライブラリーから単離する。1.3kbのＪ領域をpMCIneoからの1.1kb挿入断片により置き換える。次いで該Kpn I断片の５′末端にHSV tk遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構成物の正しい組込みは、neo遺伝子によるマウスＪ_H領域の置換をもたらすだろう。neo遺伝子を基にしたプライマーとＤ領域中のKpn I部位の５′のマウス配列に相同のプライマーとを使って、ＰＣＲにより組換え体をスクリーニングする。あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎖遺伝子座を破壊（ノックアウト）する。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ 15kbのKpn I断片を必要とする。pMCIneoからの1.1kb挿入断片をエクソンII中のユニークBamHI部位のところに挿入し、そしてHSK tk遺伝子を３′Kpn I未端に付加する。neo挿入断片の片側における二重交差（これはtk遺伝子を削除する）を選択する。それらは、選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により検出される。ＰＣＲプライマーの一方はneo配列に由来し、そして他方は標的ベクターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊は実施例に記載される。Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制内因性Ｉｇ遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれたトランスジーンから産生されるアンチセンスＲＮＡにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／または１または複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な抗血清の投与により達成することができる。アンチセンスポリヌクレオチド特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に彼壊するためにアンチセンスＲＮＡトランスジーンを使うことができる〔Pepinら（1991）Nature 355: 725；Hele ne，C．およびToulme，J．（1990）Biochi-mica Biophys．Acta 1049: 99；Stou t，J．およびCaskey，T．（1990）Somat．Cell Mol．Genet． 16: 369；Munirら（1990）Somat．Cell Mol．Genet． 16: 383；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。「アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）参照配列、例えば内因性IgのＣ_H またはＣ_L領域配列の全部または一部に相補的であり、且つ（２）相補的な標的配列、例えば染色体遺伝子座またはIg mRNAに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失または転位を含んでもよい。相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズしそして該mRNA種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよび／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことができる、可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる〔Chingら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86:10006-10010（1989）；Broderら、Ann．Int．Med. 113: 6 04-613（1990）；Loveauら、FEBS Letters 274: 53-56（1990）；Holcenbergら、WO91/11535；U.S.S.N 07/530,165（「新規ヒトCRIPTO遺伝子」）；WO91/09865 ；WO91/04753；WO90/13641およびEP386563；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。アンチセンス配列は、長さが少なくとも約15の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約30以上の連続ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列である。しかしながら、或る態様では、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として特異的ハイブリダイゼーションが保持される限り、アンチセンス配列は相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失を有することができる。一般的に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再配列後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子配列に一致するセンス配列が特に転写を妨害することによって発現を抑制する働きをすることがある。従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に関して、１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ｉｇ遺伝子座によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および／または特異性を変更することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成するのに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジェニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしくは間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞質に接近しそして特定のmRNA種の翻訳を阻害することが証明されている。ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成分を含んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよい〔Dagleら（1990）Nucleic Acids Res. 18: 4751〕。ある用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を含んでもよい〔Nielsenら（1991）Science 254 : 1497〕。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般法については、Antisens e RNA and DNA （1988），D.A．Melton編，Cold Spring Harbor Labo-ratory，Co ld Spring Harbor，NYを参照のこと。１または複数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写、ＲＮＡプロセシング、および／または同起源のmRNA種の翻訳を阻害し、それによってコードされる各ポリペプチドの量を減少させる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内で１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻害することにより治療機能を提供することができる。可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジーンから転写されたアンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ｉｇ配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約25〜35％以上トランスジーンＩｇｆ発現を阻害しないであろう）。抗血清抑制内因性Ｉｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに１または複数の内因性Ｉｇ鎖に対する抗血清を注入することにより達成することができる〔Weissら（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:211；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。抗血清は、１または複数の内因性Ｉｇ鎖とは特異的に反応するが本発明のＩｇトランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ鎖とは最少の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よって、Weissら（前掲）のものにより代表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジーンによりコードされる１または複数の異種Ｉｇ鎖の発現を許容する。抗体の適切な抗体供給源としては、以下のものが含まれる：（１）特異的にマウスμ，γ，κ又は入鎖に結合するものの本発明のヒトＩｇトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖と反応しない、モノクローナル抗体といったようなモノクローナル抗体、（２）混合物が、内因性Ｉｇ鎖の単一種上の多重エピトープと、多重内因性Ｉｇ鎖（例えばマウスμ及びマウスγ）と、又は多重エピトープ及び多重の鎖又は内因性免疫グロブリンと結合するような、かかるモノクローナル抗体の混合物；（３）ポリクローナル抗血清又はその混合物。標準的には、かかる抗血清（単鎖）は、内因性Ｉｇ鎖の単一種（例えばマウスμ，マウスγ，マウスκ，マウスλ ）又は内因性Ｉｇ鎖の多重種）に結合するため単一特異性のものであり、最も好ましくは、かかる抗血清は、本発明のトランスジーンによりコードされたヒト免疫グロブリン鎖に対町して無視できる結合力しか有していない：及び／又は（４）内因性Ｉｇ鎖の単一又は多重種に対し結合し、最も好ましくは本発明のトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対して無視できるほどの結合力しかもたないポリクローナル抗血清とモノクローナル抗体の混合物。一般にポリクローナル抗体が好まれ、かかる実質的に単一特異性のポリクローナル抗体は、有利には、ヒト以外の動物種（例えばマウス）から誘導される抗体での予備吸着及び／又は例えば不動化されたヒトＩｇを含む親和性樹脂上での抗血清又はその精製分画のアフィニティクロマトグラフィ（ここで結合された分画は抗血清中の望ましい抗ヒトＩｇについて富化されており、この結合分画は標準的には低pH又はカオトロピック塩溶液という条件で溶離される）によりヒト免疫グロブリンに対して生成された抗血清から産生できる。内因性の（例えばマウスの）免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体により誘導された細胞の枯渇を増強させるため、細胞分裂及び／又は補体固定を利用することができる。例えば、一実施態様においては、マウスＩｇを発現する外植された造血細胞及び／又はヒトＩｇトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスから得たＢ−系列のリンパ球の半ビボ枯渇のために抗体が利用される。かくして、造血細胞及び／又はＢ系列リンパ球が、ヒトＩｇトランスジーンを宿す（好ましくはヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンの両方を宿す）ヒト以外のトランスジェニック動物から外植され、外植された細胞は、（１）内因性免疫グロブリン（例えばマウスμ及び／又はκ）に結合し、（２）トランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する実質的な結合力に欠ける抗体（単数又は複数）と共にインキュベートされる。このような抗体は、明確化を期して「抑制抗体」と呼ばれる。外植された細胞集団は、抑制抗体（単複）に結合する細胞を選択的に枯渇させられる；このような枯渇は、（１）未結合細胞から抑制抗体結合細胞を除去するための物理的分離（例えば、抑制抗体に結合している細胞を不動化し除去するため固体支持体又は磁気ビードに抑制抗体を結合させることができる）、（２）抑制抗体により結合された細胞の抗体依存型細胞死滅（例えば、ADCC、補体固定、又は抑制抗体に連関された毒素による）、及び（３）抑制抗体により誘発されたクローンアネルギー、などのさまざまな方法により達成できる。往々にして、内因性Ｉｇ鎖産生の抗体抑制のために用いられる抗体は、補体を固定することができる。ウサギ又はモルモットといったように半ビボ／インビトロ枯渇のための便利な補体源と充分反応するようにかかる抗体を選択できることが往々にして好ましい。インビボ枯渇については、一般に抑制抗体がヒト以外のトランスジェニック動物種においてエフェクター機能を有することが好ましい。かくして、トランスジェニックマウスでの使用のためには、一般に、マウスエフェクター機能（例えば、ADCC及び補体固定）を含む抑制抗体が好ましい。１変形実施態様においては、内因性免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビボ／インビトロ枯渇のために、予め定められた内因性免疫グロブリン鎖に特異的に結合する抑制抗体が用いられる。ヒト免疫グロブリントランスジーンを宿すヒト以外のトランスジェニック動物からの細胞外植体（例えばリンパ球試料）は抑制抗体と接触させられ、抑制抗体に特異的に結合する細胞は枯渇させられ（例えば、不動化、補体固定などにより）、かくして内因性（非ヒト）免疫グロブリンを発現する細胞（例えばマウスＩｇを発現するリンパ球）内で枯渇された細胞副次集団を生成する。結果として得られた枯渇したリンパ球集団（Ｔ細胞、ヒトＩｇ−陽性Ｂ細胞など）は、内因性抗体を産生する能力が実質的に無い同じ種の免疫適合性ある（すなわちMHC適合性ある）ヒト以外の動物（例えばSCIDマウス、RAG-１又はRAG-２ノックアウトマウス）の体内へとトランスファさせることができる。再構成された動物（マウス）を次に抗原で免疫化させ（又は外植体を提供したドナー動物を免疫化するのに使用した抗原を用いて再免疫化させる）、高親和性（親和性成熟した）抗体及びかかる抗体を産生するＢ細胞を得ることができる。かかるＢ細胞は、従来の細胞融合によりハイブリドーマを生成するのに使用でき、スクリーニングできる。抗体抑制はその他の内因性Ｉｇの失活／抑制方法（例えばＪ_Hノックアウト、Ｃ_Hノックアウト、Ｄ−領域切除、アンチセンス抑制、補償されたフレーム／フト失活）と組合わせて使用することもできる。完全な内因性Ｉｇ遺伝子座失活或る種の実施態様では、ヒト可変領域及び非ヒト（例えばマウス）恒常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないような形で（例えばトランスジーン及び内因性Ｉｇ配列の間のトランス切換えにより）、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全な失活を行なうことが望ましい。Ｊ_H領域においてのみ機能的に分断されている（原文with→whichの誤り）内因性重鎖対立遺伝子を支持するノックアウトマウスは、標準的にはトランスジーンによりコードされた再配置されたヒト可変領域（ＶＤＪ）が内因性マウス恒常領域に連鎖された融合タンパク質として発現されるトランススイッチを頻繁に示すが、その他のトランススイッチされた連結も可能である。この潜在的問題を克服するためには、一般に、制限的な意味なく以下のものを含むさまざまな方法のうちのいずれかにより内因性重鎖遺伝子座を完全に失活することが望ましい：（１）少なくとも１つ、好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を、相同組換えによって機能的に分断及び／又は欠失させること、（２）少なくとも１つ好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を突然変異させて、終止コドン（又はフレームシフト）をコードし、切形又はフレームシフトされた産物（トランススイッチされた場合）を産生すること、及び当業者にとっては明白なその他の方法及び戦略。重鎖恒常領域遺伝子及び／又はＤ−領域遺伝子の実質的部分又は全ての欠失は、特に「ヒット・エンド・ラン」タイプなどの相同組換えターゲティングベクターによる逐次欠失を含むさまざまな方法によって達成できる。同様にして、内因性軽鎖恒常領域遺伝子を切除するための少なくとも１つの内因性軽鎖遺伝子（例えばκ）の機能的分断及び／又は欠失が往々にして好ましい。頻繁に、非相同トランスジーンがＪセグメント（単複）内のフレームシフト及びトランスジーン恒常領域遺伝子のうちの単数又は複数のもの（好ましくは全て）の初期領域（すなわちアミノ未端コーディング部分）内の補償フレームシフト（例えば原読取り枠を再生させるため）を含んでいるようなフレームシフトされたトランスジーンを利用することが好ましい。内因性IgＨ遺伝子座恒常遺伝子（補償フレームシフトを含まないもの）に対するトランススイッチは、切形又はミスセンス産物を結果としてもたらすことになり、その結果、トランススイッチされたＢ細胞は欠失されるか又は選択されなくなり、かくしてトランススイッチされた表現型は抑制されることになる。内因性Ｉｇ遺伝子産物発現（例えば、マウス重鎖及び軽鎖配列）及び／又はトランススイッチされた抗体（例えばヒト可変／マウス恒常キメラ抗体）の実質的に完全な機能的失活を実施するためにはアンチセンス抑制及び抗体抑制も同様に使用することができる。内因性（例えばマウスの）Ｉｇ鎖発現の基本的に完全な抑制を行なうためには、失活及び抑制戦略のさまざまな組合せを使用することが可能である。（トランス−スイッチ）いくつかの変形態様においては、トランススイッチされた免疫グロブリンを産生することが望ましい場合がある。例えば、このようなトランススイッチされた重鎖は、キメラのものでありうる（すなわち非マウス（ヒト）可変領域及びマウス恒常領域）。このようなトランススイッチされたキメラ免疫グロブリンを含む抗体は、非ヒト（例えばマウス）恒常領域を有することが望まれるさまざまな利用分野（例えば、ヒト恒常領域を結合しない二次抗体の結合のためといったようなマウス免疫学的決定因子の存在について宿主内のエフェクター機能の保持のため）のために使用することができる。１例を挙げると、或る種の抗原に関して、マウス可変領域能力範囲（レパートリー）に比べて、ヒト可変領域能力範囲が有利である可能性がある。おそらくは、ヒトＶ_H，Ｄ，Ｊ_H，Ｖ_L及びＪ_L遺伝子は、進化の間に、或る種の進化上重要な抗原を結合する免疫グロブリンをコードするその能力のために選択されてきたのであろう：マウスの能力範囲のための進化上選択的な圧力を提供した抗原は、ヒトの能力範囲を形作るのに進化的圧力を提供した抗原と全く異なるものである可能性がある。マウス恒常領域（例えばトランススイッチされたマウスの）アイソタイプと組合わされたときヒト可変領域能力範囲を有利なものにするその他の能力範囲の利点も存在しうる。マウス恒常領域の存在は、ヒト恒常領域に比べ利点を提供する可能性がある。例えば、トランススイッチによりヒト可変領域に連鎖されたマウスγ恒常領域は、予め定められた抗原（例えばヒトIL−２レセプター）と反応性あるキメラ抗体（好ましくはモノクローナル）を、マウス内のＴリンパ球が機能的ヒトIL−２レセプターを発現する移植細胞対宿主病のマウスモデルといったマウス疾病モデルの中でテストできるように、マウスエフェクター機能（例えばADCC、マウス補体固定）を有する抗体を提供しうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を（例えば供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニング又はPCR増幅により）分離させ、望ましいヒト恒常領域をコードする配列にスプライシングして、免疫原性が好ましくは最小限にされているヒトの治療用途により適したものであるヒト配列抗体をコードすることが可能である。結果として得られる完全にヒトのコーディング配列（単複）を有するポリヌクレオチド（単複）を宿主内で発現させ（例えば哺乳動物細胞中の発現ベクターから）、医薬品のため精製することが可能である。いくつかの利用分野では、マウス恒常領域をヒト恒常領域と置換することなく直接キメラ抗体を使用することができる。トランススイッチされたキメラ抗体のその他の変形態様及び用途は、当事者にとって明日であろう。本発明は、一般にヒト重鎖トランスジーンと内因住マウス重鎖恒常領域遺伝子の間のトランススイッチの結果として得られるキメラ抗体を発現するＢリンパ球を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。このようなキメラ抗体は、一般にマウスのスイッチされた（すなわち非μ、非δ）アイソタイプであるマウス恒常領域とヒト配列可変領域を含む。予め定められた抗原に対するキメラ抗体を作ることのできるヒト以外のトランスジェニック動物は、通常、ヒト可変及びヒト恒常領域遺伝子をコードするヒト重鎖及びヒト軽鎖トランスジーンの両方が組込まれた場合、完全にヒトの配列の抗体を作る能力もある。最も標準的には、機能的に分断された重鎖遺伝子座及び／又は軽鎖遺伝子座について同型接合であるが、トランススイッチできる単数又は複数の内因性重鎖恒常領域遺伝子（例えばγ，α，ε）を保持し、頻繁にシス連鎖したエンハンサーを保持する。このようなマウスは、通常アシュバントと組合わせた形で予め定められた抗原を用いて免疫化され、マウス恒常領域配列に連鎖されたヒト配列可変領域から成る重鎖を含む検出可能な量のキメラ抗体を含む免疫応答が生み出される。標準的には、かかる免疫化された動物の血清は少なくとも約１μｇ／ml往々にして約10μｇ/ml以上、頻繁には30μｇ／ml以上、そして最高50〜100μｇ／ml 以上の濃度でこのようなキメラ抗体を含みうる。キメラヒト可変／マウス恒常領域重鎖を含む抗体を含む抗血清は標準的に、ヒト可変／ヒト恒常領域（完全ヒト配列）重鎖を含む抗体をも含んでいる。トランススイッチされたキメラ抗体は通常、（１）ヒト可変領域とマウス恒常領域（標準的にはマウスガンマ）から成るキメラ重鎖及び（２）ヒトのトランスジーンコーディングを受けた軽鎖（標準的にはけカッパ）又はマウス軽鎖（標準的にはカッパノックアウトパックグラウンド内のラムダ）を含んでいる。かかるトランススイッチされたキメラ抗体は、一般に、約１×10⁷ Ｍ^-1以上、好ましくは５×10 ⁷Ｍ^-1以上、より好ましくは１×10⁸ Ｍ^-1〜１×10⁹ Ｍ^-1以上の親和力で予め定められた抗原（例えば免疫原）に結合する。頻繁には、予め定められた抗原は、ヒトタンパク質、例えばヒト細胞表面抗原（例えばCD４，CD８，IL−２レセプター、EGFレセプター、PDGFLレセプター）、その他のヒト生物学的巨大分子（例えばトロンボモジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリル−ルイス抗原、Ｌ−セレクチン）又は非ヒト疾病関連巨大分子（例えば細菌性 LPS、ビリオン・カプシドタンパク質又は外被糖タンパク質）などである。本発明は、次のものを含むゲノムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する：すなわち、（１）（例えば、機能的スイッチ組換え配列、標準的には機能的エンハンサーに対するシス連鎖における）トランススイッチすることのできる少なくとも１つのマウス恒常領域遺伝子を含む同型接合で機能的に分断された内因性重鎖遺伝子、（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードし発現するよう再配置することができかつトランススイッチすることのできる（例えばシス連鎖されたＲＳＳを有する）ヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には（３）機能的ヒト軽鎖可変領域をコードするべく再配置しかつヒト配列軽鎖を発現することのできるヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン；さらに任意には、（４）同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座（κ、好ましくはκ及びλ）；そしてさらに任意に（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えばγ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）によりコードされたマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清。かかるトランスジェニックマウスはさらに、約１×10⁴ Ｍ^-1以上、好ましくは約５×10⁴ Ｍ^-1以上、より好ましくは１×10⁷ Ｍ^-1〜１×10⁹ Ｍ^-1以上の親和力で、予め定められたヒト抗原（例えば、CD４，CD８，CEA）に結合するキメラ抗体を含む血清を含みうる。頻繁には、こうして産生されたモノクローナル抗体が少なくとも８×10⁷ Ｍ^-1の親和力をもつハイブリドーマを作ることができる。往々にして非ヒト抗原に結合することができる、マウス恒常領域とヒト可変領域から成る重鎖を含むキメラ抗体が同様に血清中に、又はハイブリドーマから分泌された抗体として、存在しうる。いくつかの変形態様においては、無傷の重鎖恒常領域遺伝子を保持する失活した内因性マウス重鎖遺伝子座を有し、トランススイッチできるヒト重鎖トランスジーンを有し、任意には単数又は複数の失活した内因性マウス軽鎖遺伝子座を伴い、ヒト軽鎖トランスジーンをも有するトランスジェニックマウスを生成することが望ましい。かかるマウスは有利にも、トランススイッチにより、完全にヒトの重鎖を含む抗体及びキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を交互に発現することのできるＢ細胞を産生することができる。このマウスの血清には、完全にヒトの重鎖を含む抗体及び、好ましくは完全にヒトの軽鎖と組合わせた状態でキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を含む抗体が含まれる。ハイブリドーマは、このマウスのＢ細胞から生成されうる。一般にこのようなキメラ抗体はトランススイッチにより生成でき、ここで、インビボで産生能あるＶ−Ｄ−Ｊ再配置によりコードされるヒト可変領域及びヒト恒常領域、標準的にはヒトμをコードするヒトトランスジーンは、非トランスジーン免疫グロブリン恒常遺伝子スイッチ配列（ＲＳＳ）でのスイッチ組換えを受け、かくして、標準的に内因性マウス免疫グロブリン重鎖恒常領域又は第２のトランスジーン上でコードされた非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域である、前記トランスジーンによりコードされていないヒト重鎖恒常領域とトランスジーンコーディングを受けたヒト可変領域を作動的に連鎖させる。シス−スイッチというのは、トランスジーン内のＲＳＳ要素の組換えによるアイソタイプスイッチのことであるが、トランススイッチには、往々にしてトランスジーンを宿す染色体とは異なる染色体上で、トランスジーンＲＳＳとこのトランスジーンの外側のＲＳＳ要素の間での組換えが関与する。トランススイッチは、一般に、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子と、（非μアイソタイプ、標準的にはγの）内因性マウス恒常領域遺伝子のＲＳＳ又は往々にして別々の染色体上に組込まれている第２のトランスジーン上に含まれたヒト恒常領域遺伝子のＲＳＳのいずれか一方の間で起こる。トランススイッチが第１の、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子（例えばμ）のＲＳＳと、第２のトランスジーン上に含まれたヒト重鎖恒常領域遺伝子のＲＳＳの間で起こる場合、実質的に完全にヒトの配列をもつ非キメラ抗体が産生される。制限的な意味のない例として、ヒト重鎖恒常領域（例えば、γ１）及び作動的に連鎖されたＲＳＳ（例えばγ１ＲＳＳ）をコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンコーディングと受けたヒトμ鎖を含む抗体を発現するトランスジェニックマウスのＢ細胞（又はＢ細胞集団）から生成されたハイブリドーマ細胞の集団内に導入（例えばトランスフェクション）することができる。結果として得られたハイブリドーマ細胞を、導入されたポリヌクレオチドの存在について、及び／又は、ヒトμ鎖の可変領域（イディオタイプ／抗原反応性）を有しかつ導入されたポリヌクレオチド配列（例えば、ヒトγ１）によりコードされる恒常領域をもつ重鎖を含むトランススイッチされた抗体の発現について、選択することができる。トランスジーンにコードされたヒトμ鎖のＲＳＳと下流のアイソタイプ（例えばγ１）をコードする導入されたポリヌクレオチドのＲＳＳの間のトランススイッチ組換えは、かくしてトランススイッチされた抗体を生成することができる。本発明はと同様に、（１）トランススイッチすることのできる少なくとも１つのマウス恒常領域遺伝子（例えばγ２ａ，γ２ｂ，γ１，γ３）を含む、同型接合で機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座、（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列重鎖を発現することができ、かつアイソタイプスイッチ（及び／又はトランススイッチ）を受けることのできるヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には（３）機能的ヒト軽（例えばカッパ）鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列軽鎖を発現することができるヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン、そしてさらに任意には（４）同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座（標準的にはκ、好ましくはκとλの両方）、そしてさらに任意には（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えば、γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）によりコードされるマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清、を含むゲノムを含むトランスジェニックマウスを予め定められた抗原で免疫化する段階を含む、このようなトランススイッチされたキメラ抗体を産生するための方法も提供している。親和性標識：スイッチされたアイソタイプについての選択有利なことに、体細胞突然変異のプロセスは、トランススイッチ（及びシススイッチ）と結びつけられる。体細胞突然変異は、Ｂ細胞のクローン後代によりコードされる抗体親和力の範囲を拡張する。例えば、スイッチ（トランス−又はシス−）を受けたハイブリドーマ細胞により産生された抗体は、スイッチを受けなかったハイブリドーマ細胞内に存在するよりも広い抗原結合親和力範囲を示す。従って、第１のヒト重鎖恒常領域（例えばμ）に対するポリペプチド結合において第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む第１の抗体を発現するハイブリドーマ細胞集団（標準的にはクローンの）を、第２の重鎖恒常領域（例えばヒトγ、 α又はε恒常領域）に対するポリペプチド結合において前記第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細胞クローン変異株についてスクリーニングすることができる。かかるクローン変異株は、インビトロでシススイッチを生成する天然クローン変異によって、又はＴ細胞誘導されたリンホカイン（例えばIL−４及びＩＦＮγ ）といったアイソタイプスイッチを促進する作用物質の投与を通してといったようなクラススイッチ（トランス−又はシス−）の誘発によって、又はトランススイッチのための基質として役立つべき非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域遺伝子及び機能的ＲＳＳを含むポリヌクレオチドの導入によって、又は上述のものの組合せなどによって、産生させることができる。往々にして、作動的に連鎖されたＲＳＳを伴うヒト下流アイソタイプ恒常領域（例えばγ１，γ３など）を含むポリヌクレオチドが同様に、ハイブリドーマ細胞内に導入され、トランス・スイッチメカニズムを介してアイソタイプスイッチを促進する。クラススイッチ及び親和性成熟は、本発明のトランスジェニック動物から誘導されたＢ細胞の同じ集団内で発生する。従って、クラススイッチされたＢ細胞（又はそれから誘導されたハイブリドーマ）の同定を、高親和力のモノクローナル抗体を得るための１つのスクリーニング段階として使用することができる。シス −スイッチ（トランスジーン内スイッチ）、トランススイッチ又はその両方といったクラススイッチ事象を容易にするため、さまざまなアプローチを利用することができる。例えば、付随するＲＳＳ要素及びスイッチ調節要素（例えば不稔写しプロモーター）を伴うμ及びγの両方の恒常領域遺伝子を含む単一の連続ヒトゲノミックフラグメントを、トランスジーンとして使用することができる。しかしながら、望まれる単一の隣接するヒトゲノミックフラグメントの一部分は、例えばクローニング宿主などの中で複製されるときの不安定さの問題などにより、効果的にクローニングすることが困難でありうる：特にδとγ３の間の領域は、特にμ遺伝子、γ３遺伝子、Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントを含む隣接するフラグメントのように効率良くクローニングしにくいことが判明する可能性がある。同様に例として、ヒトμ遺伝子、ヒトγ３遺伝子、ヒトＶ遺伝子（単複）、ヒトＤ遺伝子セグメント及びヒトＪ遺伝子セグメントから成り、介入する（イントロンの）又はその他の形で可欠な配列（例えば単数又は複数のＶ，Ｄ、及び／又はＪセグメント及び／又は単数又は複数の非μ恒常領域遺伝子）の単数又は複数の欠失を伴う、不連続のヒトトランスジーン（ミニ遺伝子）、がある。このようなミニ遺伝子は、効率良い免疫グロブリンの発現及びスイッチのための必須要素の全てにまたがるゲノミックＤＮＡの単一の隣接セグメントを分離することに比べで、いくつかの利点を有する。例えば、このようなミニ遺伝子は、クローニングし難い配列（例えば、不安定配列、毒物配列など）を内含しうるＤＮＡの大きい断片を分離する必要性を無くする。さらに、シス−又はトランス−スイッチのためのアイソタイプスイッチのために必要な要素（例えば、ヒトγ不稔写しプロモータ）を含むミニ遺伝子座は、有利にもインビボで体細胞突然変異及びクラススイッチを受けることができる。多くの真核性ＤＮＡ配列がクローニングし難いものであることが立証されているため、可欠配列を削除することが有利であることが判明する。一変形態様においては、高い結合親和力（例えば１×10⁷ Ｍ^-1以上、好ましくは１×10⁸ Ｍ^-1以上、より好ましくは１×10⁹ Ｍ^-1以上）をもつ抗体を産生するハイブリドーマクローンは、産生力ある（枠内）Ｖ−Ｄ−Ｊ再配置を受けることができる内因性マウス重鎖遺伝子座が実質的に欠如しアイソタイプスイッチを行なうことのできる（以上参照）ヒト重鎖トランスジーンを宿すトランスジェニックマウスのＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞のプールから、ヒト（又はマウス）非μ重鎖恒常領域に対するポリペプチド結合においてヒト配列重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマを選択することによって得られる。これらの抗体は、インビボ又は細胞培養中でのシス−スイッチ及び／又はトランス−スイッチの結果として産生される「スイッチされた重鎖」を含むことから、「スイッチされた抗体」と呼ばれる。スイッチされた抗体を産生するハイブリドーマは、一般に、体細胞突然変異プロセスを受けており、このハイブリドーマのプールは一般により広い抗原結合親和力範囲を有することになり、この中から高親和力の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することができる。標準的には、予め決定された抗原について実質的な結合親和力（１×10⁷ Ｍ^-1〜１×10⁸ Ｍ^-1以上）をもつヒト配列抗体を分泌し、このヒト配列抗体がヒト免疫グロブリン可変領域（単複）を含んでいるようなハイブリドーマを、２段階プロセスを含む方法により選択することができる。１つの段階は、（例えば、スイッチされた重鎖に特異的に結合しスイッチされていないアイソタイプ、例えばμ、に対して実質的に結合しない不動化された免疫グロブリンに対しハイブリドーマ細胞を結合することにより）、スイッチされた重鎖を含む免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定し分離することにある。もう１つの段階は、（例えばハイブリドーマクローン上清のELISA、標識づけされた抗原を用いたFACS分析などにより）実質的な結合親和力で予め定められた抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定することにある。標準的には、スイッチされた抗体を分泌するハイブリドーマの選択は，予め定められた抗原を結合するハイブリドーマ細胞を同定する前に行なわれる。予め定められた抗原に対する実質的な結合親和力をもつスイッチされた抗体を発現するハイブリドーマ細胞が分離され、標準的には個々の選択されたクローンとして当該技術分野において既知の適切な成長条件下で培養される。任意には、この方法には、モノクローナル抗体の発現に適した条件下で前記選択されたクローンを培養する段階が含まれる。のモノクローナル抗体を収集し、これを治療、予防及び／又は診断の目的で投与することができる。往々にして、選択されたハイブリドーマクローンは、予め定められた抗原に結合する（又はこれに対する結合力を付与する）免疫グロブリン（例えば可変領域）をコードする免役グロブリン配列を分離するためのＤＮＡ又はＲＮＡ源として役立ちうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を分離し（例えばPC R増幅又は供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングによる）、好ましくは免疫原性が最小限にされるヒトの治療用途により適したヒト配列抗体をコードするべく望ましいヒト恒常領域をコードする配列に対しスプライシングする。結果として得られた完全にヒトのコーディング配列（単複）をもつポリヌクレオチド（単複）を宿主細胞（例えば哺乳細胞同の発現ベクターから）の中で発現させ、医薬品のために精製することが可能である。キセノ（異種）エンハンサーヒト免疫グロブリン（例えば重鎖）をコードすることのできる非相同トランスジーンは、有利にも、マウスゲノムから誘導されていない、及び／又は非相同トランスジーンのエキソンとシスで自然に結びつけられていないシス−連鎖されたエンハンサーを含んでいる。例えば、ヒトκトランスジーン（例えばκミニ遺伝子座）は有利にも、ヒトＶ_K遺伝子、ヒトＪ_K遺伝子、ヒトＣ_K遺伝子及びキセノエンハンサーを含んでいる可能性があり、標準的には、このキセノエンハンサーは、標準的にＪ_K遺伝子とＣ_K遺伝子の間にあるか又はＣ_K遺伝子の下流に位置づけされた、ヒト重鎖イントロンエンハンサー及び／又はマウス重鎖イントロンエンハンサーを含む。例えば、マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー（Ban er ji etal．（1983）Cell 33: 729）は、プラスミドpKVe２の0.9kbのXba Iフラグメント上で分離されうる（下記参照）。ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー（Hayday etal．（1984）Nature 307 ：334）は、1.4kbのMlu I／Hind IIIフラグメントとして分離されうる（下記参照）。基本的にマウスＪ−μイントロンエンハンサーに対しシスで連鎖されたヒトＪ−μイントロンエンハンサーで構成されている組合されたキセノエンハンサーといった、トランスジーンに対する転写的に活性なキセノエンハンサーの付加は、特にこのトランスジーンがヒトκといった軽鎖をコードする場合、トランスジーンの高い発現レベルを付与することができる。同様に、ラット３′エンハンサーを、ヒト重鎖とコードできるミニ遺伝子座構成体内に有利にも含み入れることができる。核酸「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザインしたその配列を最適に整列しそして比較した時に、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98％〜99.5％のヌクレオチドが同一であることを指摘する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が存在する。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で、存在することができる。核酸は、標準技術により、例えばアルカリ／SDS処理、CsClバンド沈降、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された時、「単離され」または「実質的に純粋にされ」る。F ．Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York（1987）を参照のこと。本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しばしばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修飾された制限部位等を除く）を変異せしめることができる。コード配列については、それらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ，Ｄ，Ｊ，定常，スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的に相同であるかまたはそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導される」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されていることを指摘する）。核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」という。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に作用するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列については、作用可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であって、そして２種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続であって且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。特定の好ましい態様本発明の好ましい態様は、実施例５，６，８または14に記載の軽鎖トランスジーンの単一コピーを含有する動物と交配させた実施例12に記載のトランスジーン（例えばpHC1またはpHC2）の少なくとも１回のコピー、典型的には２〜10回のコピー、時には25〜50回以上のコピーを含有する動物、並びに実施例10に記載のＪ_H 欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの３つの特性について同型接合に交配される。そのような動物は次の遺伝子型を有する：再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座（実施例12に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、再配列されたヒトκ軽鎖構成物（実施例14に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、および機能的Ｊ_Hセグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝子座のところの欠失（実施例10に記載）。そのような動物は、Ｊ_Hセグメントの欠失について同型接合であるマウスと交配させる（実施例10）と、Ｊ_H欠失について同型接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については半接合である子孫を生産する。生じた動物に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に使う。そのような動物から単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみを含むため、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。というのは、実施例９および 12に記載のようにして導入されたＪ_H領域に広がる欠失によって、両方の内因性マウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、Ｂ細胞の実質的部分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうからである。好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのものと実質的に同じである、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を示すだろう。例えば、内因性Ig遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブリンレベルは約0.1〜10mg／ml血清、好ましくは0.5〜5mg／ml、理想的には少なくとも約1.0mg／mlの範囲であろう。IgMからIgGにスイッチすることができるトランスジーンをトランスジェニックマウスに導入した時、血清IgＧ対IgＭの成熟マウス比は好ましくは約10：１である。もちろん、IgＧ対IgＭ比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の約10％より多く、好ましくは40〜80％が、もっぱらヒトIgＧタンパク質のみを発現する。レパートリーは理想的には非トランスジェニックマウス中にしめされるものとほぼ等しく、通常は少なくとも約10％ほど高く、好ましくは25〜50％またはそれ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるＶ，ＪおよびＤ領域の数に主として依存して、通常少なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン（理想的にはIgＧ）、好ましくは10⁴〜10⁶またはそれ以上の免疫グロブリンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリンは、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。抗原性タンパク質としては、ハトチトクロームＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマイトジェン（PWM）、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコッカスプロテインＡ、マッコウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサータンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは、予め選択された抗原に対して、少なくとも約10⁷ Ｍ ^-1、好ましくは10⁸ Ｍ ^-1 〜10⁹ Ｍ ^-1またはそれ以上の親和性を示すだろう。いくつかの実施態様においては、予め定められた抗原タイプに対する抗体応答において表わされるＶ遺伝子の選択を制限する目的で、予め定められた能力範囲をもつマウスを生成することが好まれる可能性がある。予め定められた能力範囲をもつ重鎖トランスジーンは例えば、人間における予め定められた抗原タイプに対する抗体応答で好んで用いられるヒトＶ_H遺伝子を含みうる。代替的には、さまざまな範囲により（例えば、予め定められた抗原に対する高い親和力のＶ領域をコードする確率が低い；体細胞突然変異及び親和力激化を受ける傾向が弱い；又は一定の人間に対する免疫原性をもつ）、規定された能力範囲からいくつかのＶ_H遺伝子を除外することができる。様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジーンの再配列の前に、それらの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容易に同定することができる。上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記載したけれども、他の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトランスジーンにより定義される。トランスジェニック動物の４つのカテゴリーが定義され得るＩ．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 II．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 III．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 IV．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。トランスジェニック動物の上記カデゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともκ遺伝子）が相同組換え（または他の方法）により破壊されている場合にはII＞Ｉ＞III＞IVであり、そして内因性軽鎖遺伝子が破壊されておらず且つ対立遺伝子排除により優性になるに違いない場合にはＩ＞II＞ III＞IVである。実施例方法および材料トランスジェニックマススは、Hoganら、“Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って誘導される。胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作される〔Terato-carcinomas an d embryonic stem cells：a practical approach，E.J．Robertson編，IRL Pres s，Washington，D.C.，1987；Zjilstraら、Nature 342:435-438（1989）およびS chwartzberg，P.ら、Science 246:799-803（1989）；この各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。ＤＮＡクローニング方法は、J．Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborator y Manual，第２版，1989，Cold Spring Harbor Labo-ratory Press，Cold Sprin g Harbor，N.Y．（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って実施される。オリコヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従ってApplied Bi osystemsのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。ハイブリドーマ細胞および抗体は、“Antibodies：A Laboratory Manual”，H arlowおよびDavid Lane編，Cold Spring Harbor Labo-ratory（1988）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作される。実施例１ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーンこの実施例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングとマイクロインジェクションを記載する。 Marzluff，W.F．ら、“Transcription and Translation：A Pva-ctical Appro ach”，B.D．HammesおよびS.J．Higgins編，89-129頁，IRL Press，Oxford（198 5）により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋め込み、EDTAとプロテイナーゼＫで溶解せしめて高分子量ＤＮＡを暴露させ、このＤＮＡを次いでM．FinneyによりCurrent Protocols in Molecular Biology（F ．Ausubelら編，John Wiley & Sons,増補４版，1988，第2.5.1章）中に記載された通りにアガロース中で制限酵素Not lで消化する。次いで、Not I消化されたＤＮＡを、Anand，R．ら、Nucl．Acids Res.，17:34 25-3433（1989）により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。Not I断片に富む画分をサザンブロットハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によりコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよびγ１定常領域と一緒に６種のＶ_Hファミリーの全部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら（1988 ）前掲によりHeLa細胞から670kb断片として同定されているが、本発明者らはヒト胎盤および精子ＤＮＡからは830kb断片としてであることを発見した〕。このNot I断片を含む画分（図４参照）をプールし、そして酵母細胞中のベクターpYACNNの、Not I部位にクローニングする。プラスミドpYACNNは、pYAC-4 Ne o〔Cook，H.ら、Nucl．Acids Res. 16:11817（1988）〕をEcoRIで消化しそしてオリゴヌクレオチド５′−AAT TGC GGC CGC−３′の存在下で連結せしめることにより調製する。 Brownsteinら（1939），Science, 244, 1348-1351およびGreen，E．ら、Proc ．Natl．Acad．Sct．USA 87:1213-1217（1990）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、重鎖NotI断片を含むYACクローンを単離する。M．Finncy（前掲）により記載されたパルスフィールドゲル電気泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからクローン化NotI挿入断片を単離する。１ mMのスペルミンの添加によりこのＤＮＡを凝縮させ、上述の単細胞胚の核に直接マイクロインジュクトする。実施例２生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーンヒトκ軽鎖の地図はLorenz．W.ら、Nucl．Acids Res. 15:9667-9677（1987）に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。全てのＣκ、３′エンハンサー、全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの異なるＶセグメントを含む450kbのXho I−Not I断片を実施例１に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェクトする。実施例３生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン前記成分の全部と少なくとも20個多いＶセグメントとを含む750kp MluI−Not I断片を実施例１に記載の如く単離し、そしてBssHIIで消化して約400kbの断片を生成せしめる。 450kb XhoI−Not I断片と約400kb MluI−BssH II断片は、Bss H II制限部位と Xho I制限部位とにより限定される配列重複を有する。マウス接合子のマイクロインジェクションによるそれらの２断片の相同組換えは、450kb Xho I／Not I断片（実施例２）中に見つかるものよりも少なくとも15〜20個追加のＶセグメントを含むトランスジーンをもたらす。実施例４重鎖小遺伝子座の作製Ａ．pGP1およびpGP2の作製 pBR322をEcoRIとStyIで消化し、下記のオリゴヌクレオチドと連結せしめることにより、図８に記載の制限部位を有する147塩基対の挿入断片を含むpGP1を作製する。それらのオリゴの概括的重複は図９にも示される。オリゴヌクレオチドは下記のものである：このプラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離することができる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性Not I部位により隣接された大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、pUC系プラスミドに比べて比較的低コピー数であるpBR322に由来する（pGP1は複製開始点の近くにpBR322 コピー数調節領域を保持している）。低コピー数は挿入配列の潜在的毒性を減少させる。加えて、pGP1は、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に挿入された、trpA由来の強力な転写ターミネーター配列〔Christie，G.E.ら、Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 78:4180（1981）〕も含む。これは、アンピシリンプロモーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る種の挿入断片に関係する毒性を減少させる。プラスミドpPG2は、ポリリンカー中に追加の制限部位（Sfi I）を導入するようにpGp1から誘導される。pGP1をMluIとSpeIで消化し、該プラスミドのポリリンカー部分の中の認識配列を切除する。このように消化されたpGP1に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せしめてpGP2を作製する。 pGP2はMluＩ部位とSpeI部位の間に置かれた追加のSfiI部位を含むこと以外はp GPlと同じである。これは挿入断片をSfiIで並びにNotIで完全に切除することを可能にする。Ｂ．pRE3（ラットエンハンサー３′）の作製ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重鎖構成物中に導入する。 Petterssonら、Nature 344:165-168（1990）により記載された重鎖領域３′エンハンサーを単離し、クローニングする。次のオリゴヌクレオチド：を使って、ラットIGH３′エンハンサー配列をＰＣＲ増幅せしめる。こうして形成された３′エンハンサーをコードする二本鎖ＤＮＡをBamHIとSph Iで切断し、BamHI/SphIで切断されたpGP2中にクローニングしてpRE3（ラットエンハンサー３′）を得る。Ｃ．ヒトＪ−μ領域のクローニングこの領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離された２以上の断片を組み合わせることによりクローニングする。図９を参照のこと。オリゴヌクレオチドGGA CTG CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCC AAGを使って、全部のヒトＪセグメントを含む6.3koBamHI／HindIII断片〔MaTsudaら、EMBO J ．7: 1047-1051（1988）；Ravetechら、Cell 27:583-591（1981）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離する。オリゴヌクレオチドCAC CAA GTT GAC CTG CCT GGT CAC AGA CCTG AC CAC CTA TGAを使って、エンハンサー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣接の10kb HindIII／BamHI断片〔Yasuiら、Eur．J．Immunol. 19:1399-1403（198 9）〕を同様にして単離する。プローブとしてクローンpMUM挿入断片（pMUMは、μ膜エクソン１オリゴヌクレオチド：CCT GTG GAC CAC CGC CTC CAC CTT CAT CGT CCT CTT CCT CCTを使ってヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された４kb EcoRI/HindIII断片である）を使って隣接の３′1.5kbBamHI断片を同様に単離し、そしてpUCC19中にクローニングする。 pGP1をBamHIとBgl IIで消化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する。図９からの断片（ａ）および（ｂ）を前記消化pGP1中にクローニングする。次いで５′BamHI部位がBamHI／Bgl II融合により破壊されるように置かれたクローンを単離する。それをpMUと命名する（図10参照）。pMUをBamHIで消化し、図９からの断片（ｃ）を挿入する。HindIII消化により方向性を確認する。生じたプラスミドpHIG1（図10）は、ＪおよびＣμセグメントをコードする18kb挿入断片を含有する。Ｄ．Ｃμ領域のクローニング pGP1をBamHIとHindIIIで消化し、次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する（図14）。このように処理された図14の断片（ｂ）および図14の（ｃ）を、BamHI/HindIIIで切断したpGP1中にクローニングする。HindIII消化により断片（ｃ）の正しい方向を確認し、Ｃμ領域をコードする12kb挿入断片を含むpCON1 を得る。 pHIG1は、Not I部位により隣接されたポリリンカー中にSFiI３′部位とSpeI５ ′部位を有する18kb挿入断片内にＪセグメント、スイッチおよびμ配列を含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使われるだろう。pCON1はＪ領域を欠き12k b挿入断片のみを含むこと以外はpHIG1と同じである。再配列されたＶＤＪセグメントを含む断片の作製におけるpCON1の使用については後で記載する。Ｅ．γ−１定常領域のクローニング（pREG2）ヒトγ−１領域のクローニングは図16に描写される。 Yamamuraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2152-2156（1986）は、組込み時に部分的に削除されたトランスジーン構成物からの膜結合ヒトγ−１の発現を報告している。彼らの結果は、３′BamHI部位が、５kb未満のＶ−Ｃイントロンを有する経膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭となることを指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない遺伝子では、最初のγ−１定常エクソンの５′末端から５kb未満のところで始まる配列中にスイッチ領域全体が含まれる。従ってそれは５′5.3kb Hind III断片中に含まれる〔Eltison，J.W．ら、Nucl eic.Acids Res. 10:4071-4079（1982）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。Takahashiら、Cell 29:671-679（1982）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）もまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告しており、この断片と7.7kb Hind III−BamHI断片とを合わせると我々がトランスジーン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定遺伝子のイントロン中に存在する少なくとも15の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。 γ−１の第三エクソン（Ｃ_H３）に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使って、γ−１領域を含むファージクローンを同定し単離する。 7.7kb Hind III−Bgl III断片（図11中の断片（a））をHindIII／Bgl IIで切断されたpRE3中にクローニングしてpREG1を作製する。上流の5.3kb Hind III断片（図11中の断片（b））をHindIII消化されたpREG1中にクローニングしてpREG2 を作製する。BamHI／Spe I消化により正しい方向を確かめる。Ｆ．ＣγとＣμの結合上述したプラスミドpHIG1はヒトＪセグメントとＣμ定常領域エクソンを含む。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジーンを提供するために、pHIG 1をSfi Ｉで消化した（図10）。プラスミドpREG2もSfiIで消化し、ヒトＣγエクソンとラット３′エンハンサー配列を含む13.5kb挿入断片を得た。それらの配列を連結し、31.5kb挿入断片上にヒトＪセグメント、ヒトＣμ定常領域、ヒトＣγ １定常領域およびラット３′エンハンサー配列を含むプラスミドpHIG3′を作製した（図12）。 pCON1をSfiIで消化し、そしてpREG2をSfi Iで消化して得られたヒトＣγ領域とラット３′エンハンサーとを含むSfi I断片と連結せしめることにより、ヒトＣμおよびヒトＣγ１をコードするがＪセグメントを含まない第二のプラスミドを作製する。得られたプラスミドpCON（図12）は、ヒトＣμ、ヒトγ１およびラット３′エンハンサー配列を有する26kbのNotI／Spe I挿入断片を含有する。Ｇ．ＤセグメントのクローニングヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図13に描写される。Ｄセグメントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを、多様性領域配列〔Y．Ichiharaら、EMBO J．7: 4141-4150（1988）］に特異的なプローブを使って同定しそして単離する。次のオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴDXP1を使って同定されたファージクローンから、DLR1，OXP1，DXP'1およびUA1を含む5.2kb XhoI断片（図13中の断片（ｂ））を単離する。オリゴDXP4を使って同定されたファージクローンから、DXR4，DA4およびDK4を含む3.2kb XbaI断片（図13中の断片（ｃ））を単離する。図13中の断片（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を結合し、pGPlのXba I／XhoI部位中にクローニングして、10.6kb挿入断片を含むpHIG2を形成せしめる。このクローニングは連続的に行われる。まず、図13の5.2kb断片（ｂ）と図13 の2.2kb断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてXhoIとX ba Iで消化されたpGP1中にクローニングする。生じたクローンを該5.2kbおよび2 .2kb挿入断片を用いてスクリーニングする。5.2kbおよび2.2kb挿入断片での試験に陽性であるそれらのクローンの半分が、BamHI消化により確かめると正しい方向で5.2kb挿入断片を有する。次いで図13の3.2kb XbaI断片を、断片（ｂ）と（ｄ）を含むこの中間プラスミド中にクローニングし、pHIG2を形成せしめる。このプラスミドは、ユニーク５′Sfi I部位とユニーク３′Spe I部位を有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全なポリリンカーはNotI部位により隣接される。Ｈ．重鎖小遺伝子座の作製下記は、１または複数のＶセグメンントを含むヒト重鎖小遺伝子座の作製を説明する。 Newkirkら、J．Clin．Invest. 81:1511-1518（1988）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）のハイブリドーマ中に含まれるＶセグメントとして同定されたものに相当する再配列されていないＶセグメントを、次のオリゴヌクレオチドを使って単離する。再配列されていないＶセグメントの制限地図を調べで、消化すると３′および５′隣接配列と一緒に再配列されていないＶセグメントを含む約２kbの長さを有するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定する。５′開始配列はプロモーターおよび他の調節配列を含み、一方３′隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組換え配列を提供するだろう。この約3.0kbＶセグメント挿入断片をpGB2のポリリンカー中にクローニングし、pVH1を形成せしめる。 pVH1をSfiIで消化し、得られた断片をpHIG2のSfiI部位にクローニングしてpHI G5′を作製する。pHIG2はＤセグメントのみを含むので、生成したpHIG5′プラスミドはＤセグメントと一緒に単一のＶセグメントを含む。pHIG5中に含まれる挿入断片のサイズは、10.6kb＋Ｖセグメント挿入断片のサイズである。 Not IとSpeIでの消化によりpHIG5から挿入断片を切り出す。Ｊ，ＣμおよびＣ γ１セグメントを含むpHIG3′をSpeIとNotIで消化し、そして上記配列とラット３′エンハンサーとを含む３kb断片を単離する。それらの２断片を一緒にして、 NotIで消化されたpGP1中に連結せしめ、Ｖセグメント、９つのＤセグメント、６つの機能的なＪセグメント、Ｃμ、Ｃγおよびラット３′エンハンサーを含むpH IGを作製する。この挿入断片のサイズは約43kb＋Ｖセグメント挿入断片のサイズである。Ｉ．相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製前の章で指摘したように、pHIGの挿入断片は単一のＶセグメントを使用すると約43〜45kbである。この挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニングすることができる限界かまたはそれに近い。より多数のＶセグメントの使用に備えるために、接合子またはＥＳ細胞内での相同組換えによってラット３ ′エンハンサー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメントおよび多数のヒトＶセグメントを含むトランスジーンを形成する、重複ＤＮＡ断片の生体内相同組換えを下記に記載する。ヒトＪセグメントを含む6.3kb BamHI／HindIII断片（図９中の断片（ａ）を参照のこと）を、次のアダプター：を使って、Mlu I／Spe Iで消化されたpHIG5′中にクローニングする。生成したプラスミドをpHIG5’O（重複）と命名する。このプラスミド中に含まれる挿入断片はヒトＶ，ＤおよびＪセグメントを含む。pVH1からの単一Ｖセグメントが使われる時、この挿入断片のサイズは約17kb＋2kbである。この挿入断片を単離し、そしてヒトＪ，Ｃμ，γ１およびラット３′エンハンサー配列を含む pHIG3′からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片は、２つのＤＮＡ断片の間の約6.3kbの重複部分に備えるヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注入すると、生体内相同組換えが起こり、pHIG中に含まれる挿入断片と同等のトランスジーンを生成する。このアプローチは生体円で形成されるトランスジーン中への多数のＶセグメントの付加に備える。例えば、単一のＶセグメントをpHIG5′中に組み込む代わりに、（１）単離されたゲノムＤＮＡ、（２）ゲノムＤＮＡから誘導された連結ＤＮＡ、または（３）合成ＶセグメントレパートリーをコードするＤＮＡ、上に含まれる多数のＶセグメントをpHIG2のSfiI部位にクローニングしてpHIG5′V_Nを作製する。次いで図９のＪセグメント断片（ａ）をpHIG5′V_N中にクローニングし、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、pHIG3′から単離した挿入断片上に含まれるＪセグメントと重複するＪセグメントと多数のＶセグメントを含むようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えが起こり、多数のＶセグメントおよび多数のＪセグメント、多数のＤセグメント、Ｃμ領域、Ｃγ１領域（全てヒト由来）並びにラット３′エンハンサー配列をコードするトランスジーンを生成する。実施例５軽鎖小遺伝子座の作製Ａ．pEμｌの作製 pEμｌの作製は図16に描写される。オリゴ：を使ってファージクローンから678bpのXbaI−EcoRI断片〔J.Banerjiら、Cell 33 :729-740（1983）〕においてマウス重鎖エンハンサーを単離する。このＥμ断片を、EcoRI部位の平滑末端フィルインにより、EcoRV／Xba I消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpEμｌと命名する。Ｂ．κ軽鎖小遺伝子座の作製 κ構成物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、５つのヒトＪκセグメント全部、ヒトＪ−Ｃκエンハンサー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的にはヒト３′κエンハンサーを含む〔K．Meyerら、EMBO J. 8:1959-1964（1989）〕。マウスのκエンハンサーはＣκから９kb下流である。しかしながら、ヒトではまだ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重鎖Ｊ−Ｃμエンハンサーの１コピーも含む。この小遺伝子座は次の４つの成分断片から作製される：（ａ）マウス遺伝子座との類推によりヒトＣκエクソンと３′ヒトエンハンサーとを含む16kb Sma I断片；（ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５′隣接５kb SmaI断片；（ｃ）pEμｌから単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサー（この配列は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遺伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎖エンハンサーはおそらくイントロンκエンハンサーよりも早い段階で活性であろう。）；および（ｄ）１または複数のＶセグメントを含む断片。この構成物の調製は次の通りである。ヒト胎盤ＤＮＡをSmaIで消化し、電気泳動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡをBamHIで消化し、電気泳動により分画する。SmaIで消化したゲルから16kb画分を単離し、同様にBa mHI消化したＤＮＡを含むゲルから11kb領域を単離する。 16kb Sma I画分を、XhoIで消化されXho I制眼消化生成物をフィルインするためにクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理されているラムダFIX II（Stra tagene，La Jolla，California）中にクローニングする。16kb Sma I画分の連結はSma I部位を破壊するがXho I部位はそのまま残す。 11kb BamHI画分を、クローニング前にBamHIで消化したラムダFIX II（Stratag ene，La Jolla，California）中にクローニングする。各ライブラリーからのクローンを、Ｃκ特異的オリゴ；を用いて探査する。ＣκがSmaIに隣接するように、16kb Xho I挿入断片をXho Iで切断されたpEμ ｌ中にザブクローニングする。生じたプラスミドをpKap1と命名する。上記Ｃκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλEMBLBL3/BamHIライブラリーを探査し、11kbクローンを同定する。５kb SmaI断片（図25の断片（ｂ））をサブクローニングし、次いでSmaIで消化されたpKap1中に挿入する。正しい方向のＪセグメント、ＣκおよびＥμエンハンサーを含むそれらのプラスミドをpKap2と命名する。その後、１または複数のＶκセグメントをpKap2のMluI中にサブクローニングし、ヒトＶκセグメント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメントおよびヒトＥμエンハンサーをコードするプラスミドpKapHを生ぜしめる。pKapHを、NotIで消化することによりこの挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製する。こうして精製された挿入断片を上述の如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトする。Ｃ．生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製 11kb BamHI断片を、その３′未端がSfiI部位の方に向くように、BamHIで消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpKAPintと命名する。pKA Pint中のBamHIと部位Spe I部位との間のポリリンカー中に１または複数のＶκセグメントを挿入してpKapHVを作製する。pKapHVの挿入断片をNotIでの消化により切り出し、そして精製する。pKap2からの挿入断片をNotIでの消化により切り出し、精製する。それらの２断片の各々は、pKapHVからの断片が、pK ap2から得られる挿入断片中に含まれる５kb SmaI断片と実質的に相同であるＪκ セグメントを含む５kbのＤＮＡ配列を含むという点で、相同性領域を含有する。それ故に、それらの挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると相同組換えして、Ｖκ，ＪκおよびＣκをコードするトランスジーンを形成することができる。実施例６免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムクローンの単離この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは４コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その２コピーは融合相手の細胞系からのものであり、２コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのものである。それらの４コピーのうち、数個が再配列することができるという事実にもかかわらず、ただ１つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。Ａ．二本鎖cDNA ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしくは分泌形態またはその両形態のκ軽鎖含有IgMを合成する他の細胞系を、ポリＡ⁺ RNAの単離に使用する。次いで該RNAを、逆転写酵素を使ったオリゴdT開始cDNAの合成に使用する。次いで一本鎖cDNAを単離し、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼ酵素を使って３′未端にＧ残基を付加する。次いでＧ未端が付けられた一本鎖DONAを精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチト；を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒される）のための鋳型として用いる。二本鎖cDNAを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするmRNAの５′未端のヌクレオテド配列を決定するために使用する。次いで、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖遺伝子のクローニング方法は、下記のＢ部に要約される。Ｂ．軽鎖Ａ部に記載された二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマー：を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分に特異的な配列（TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT AT C AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−カッパと称することにする。 Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびSmaIを含む幾つかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、³²Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−カッパを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをSmaIおよび第二の酵素（Ｖセグメントの内側にSmaI部位がある場合にはBamHIまたはKpnI）で切断する。いずれかの生成した非平滑末端をT4 DNAポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化ＤＮＡ分子を与える。次いで制限部位をコードするリンカー（断片中にどの部位が存在しないかに応じてBamHI，EcoRIまたはXhoI）を付加し、そして対応するリンカー酵素で切断してBamHI，EcoRIまたはXhoI末端を有するＤＮＡ断片を与える。次いで該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をラムダBMBL3またはラムダFIX（Stratagene，La Jol la，California）中にクローニングする。ユニークプローブｏ−カッパを使って、Ｖセグメント含有クローンを単離する。陽性クローンからＤＮＡを単離し、そしてpKap1のポリリンカー中にサブクローニングする。生じたクローンをpRKLと命名する。実施例７免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムクローンの単離この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリン重鎖μ遺伝子のクローニングを記載する。この実施例に記載の手順は、μ重鎖遺伝子の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。上述した如く、二本鎖cDNAを調製し単離する。この二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマー：を使った３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分に特異的な配列（ACA GGA GAC GAG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT AT C AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−ミューと称することにする。 Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびMluI（MluIは、Ｊセグメントとμ CHlとの間を開裂する稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異なる制眼エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、³²Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−ミューを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをMluIと第二の酵素で切断する。次いでMluI またはSpeIアダプターリンカーを末端に連結せしめ、切断して上流部位をMluIまたはSpeIに変換する。次いで該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をプラスミドpG P1中に直接クローニングする。ユニークプローブｏ−ミューを使ってＶセグメント含有クローンを単離し、その挿入断片をMluIでまたはMlu I／Spe I で切断されたプラスミドpCON2中にサブクローニングする。生じたクローンをpRM GHと命名する。実施例８ヒトκ小遺伝子座トランスジーンの作製軽鎖小遺伝子座 κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、Ｊκ−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊ κｌを含む5,7kb ClaI／Xho I断片をＪκ2-5とＣκを含む13kb XhoI断片と一緒にpGP1d中にクローニングし、そしてプラスミドpKcorを作製するのに使った。このプラスミドは、4.5kbの５′隣接配列と９kbの３′隣接配列と共に、Ｊκ1-5、 κインロトンエンハンサーおよびＣκを含有する。それはＶセグメントのクローニング用のユニークな５′Xho I部位と追加のシス作用性調節配列の挿入用のユニークな３′Sal I部位も有する。Ｖκ遺伝子Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、ヒトＶκセグメントを含むクローンを単離した。ＤＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。それらのクローンは、TATAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12bスペーサー−ノナマー配列を含有する。該クローンのうちの３つをマッピングし、配列決定した。該クローンのうちの２つ、65.5と65.8が機能的であり、それらがTA TAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12bスペーサー −ノナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン65.4は、非規準的組換えヘプタマーを含むことからＶκＩ偽遺伝子をコードすると思われる。 VkIIIファミリー遺伝子をコードする機能的クローンのうちの１つＶκ65-8 を使って軽鎖小遺伝子座構成物を作製した。pKC1 Ｖκ65-8を含む7.5kb XhoI／Sal I断片をpKcorの５′Xho I部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC1（図38）を作製した。注入前にNotIでの消化により該トランスジーン挿入断片を単離した。精製した挿入断片を、受精した（C57BL/6×CBA）Ｆ₂マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、次いでHoganら（Methods of Manipulating the Mouse Emb ryo，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，New York）に記載の通りに、生存している胚を偽妊娠雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンブロット分析によりトランスジーン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準に比較したバンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、そしてHarlow およびLane（Antibodies：A Laboratory Manual，1988，Cold Spring Harbor La boratory，New York）により記載された通りに、トランスジーンによりコードされるヒトIgκタンパク質の存在についてELISAにより分析した。マイクロタイタープレートウエルをヒトIgκ（クローン6Bl，＃0173，AMAC In c.，Westhook，ME）、ヒトIgＭ（クローンAF6，＃0285，AMAC Inc.，Westbrook ，ME）およびヒトIgG1（クローンJL512，＃0280,AMAC Inc，Westbrook，ME）に特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル中に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニディー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg（多価）を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出した。図41は、８匹のマウス（I.D．＃676，674，673，670，666，665，664および49 6）からの血清のELISAアッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の７匹はpK C1トランスジーン挿入断片が注入された胚から発育し、そして８番目のマウスは pHC1トランスジーン（前記）のマイクロインジェクションにより生まれたマウスに由来する。pKC1注入胚からの７匹のマウスのうちの２匹（I.D．＃666と664 ）は、ＤＮＡサザンブロット分析により分析するとトランスジーン挿入断片を含んでおらず、５匹（I.D．＃676，674，673，670および665）は該トランスジーンを含んでいた。 pKC1トランスジーン陽性動物の一匹を除く全てが検出可能なレベルのヒトIgκ タンパク質を発現し、残りの一匹の非発現性動物はＤＮＡサザンブロット分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい。pHC1陽性トランスジェニックマウスはヒトIgＭとIgＧ１を発現するがIgκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の特異性を証明する。pKC2 Ｖκ65.5を含む８kb XhoI／Sal I断片をpKC1の５′Xho I部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC2を作製した。２つのＶκセグメントを含む生成トランスジーン挿入断片をマイクロインジェクンョン前にNotIでの消化により単離した。pKVe2 この構成物は、Ｊκの５′に1.2kbの追加配列を含みそしてＶκ65.8の３′の4 .5kbの配列を欠いていること以外は、pKC1と同じである。該構成物は更に、マウス重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Banerjiら、Cell 33:729-740（1982）〕を含む0.9kb XbaI断片と、下流に挿入されたヒト重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Haydayら、Nature 307:334-340（1984）〕を含む1.4kb MluI−HindIII断片を含有する。この構成物を、対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始する可能性について試験する。異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔MeyerおよびNeube rger，EMBO J. 8:1959-1964（1989）；Pettersonら、Nature 344:165-168（1990 ）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕を有する類似構成物を作製することができる。再配列された軽鎖トランスジーンヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するためにκ軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図39に示す。ＰＣＲ増幅させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子65.5から単離した3.7kbの５′隣接配列を含むベクターpK5nx中にクローニングする。次いで、Ｊκ2-4、Ｊκイントロンエンハンサー、Ｃκおよび９kbの下流配列を含むベクターpK31sのユニークX hoI部位中に、５′転写調節配列に融合させたＶＪセグメントをクローニングする。生じたプラスミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トランスジーンを含有し、このトランスジーンは胚へのマイクロインジェクションのために NotIで切り出すことができる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿入のために３′末端にユニークSalI部位も含有する。ヒト脾臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列されたκ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２つの合成オリゴヌクレオチド（o-130，o-131）を使った。オリゴヌクレオチドo- 130（gga ccc aga （g,c）gg aac cat gga a（g,a）（g,a,t,c））は、ＶκIII ファミリー軽鎖遺伝子の５′領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣと重複している。オリゴヌクレオチドo-131（gtg caa tca att ctc gag ttt gac tac aga c）は、Ｊκ１の約150bp ３′よりの配列に相補的であり、Xho I 部位を含む。それらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκ１セグメントに連結された再配列されたｖκIII遺伝子に相当するヒト脾臓ＤＮＡからの0.7kbのＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをNcoIとXhoIで消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラスミドpNNO3中にクローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定すると、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つのクローンが同定された。追加の機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクローンは上記軽鎖発現カセット（図39）中に個別にクローニングすることができる。再配列された軽鎖構成物を用いで生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小這伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、一次レパートリーの多様性の全てが重鎖により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現するマウス株を生産することができる。軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異からであることができる。全ての軽鎖が様々な異なる重鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないので、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス株を生成せしめ試験することができる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対に、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖ＶＤＪ連結が起こるような軽鎖を有することから生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わせは、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加をもたらし、かくしてヒトIg発現性ハイブリドーマの単離を容易にすることができる。プラスミドpIGM1，pHC1，pIGH1，pKC1およびpKC2のNotI挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入断片を、受精した（C57BL/6×CBA）F2マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そしてHoganらにより記載された通りに〔Hoganら、Methods of Manipulating the Mo use Embryo ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York（1986）〕、生存している胚を偽妊娠雌中に移した。実施例９相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹（ES）細胞中での相同組換えによるマウス内因性κ遺伝子座の不活性化に次いで、不活性化されたκ対立遺伝子を有する標的ES細胞を初期マウス胚（胚盤胞）中に注入することによるマウス生殖細胞系中への変異遺伝子の導入を記載する。方策は、Ｊκ遺伝子とＣκセグメントに及ぶ遺伝子座の4.5kbセグメントが削除されそして選択マーカーneoにより置き換えられているマウスκ遺伝子座に相同なＤＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換えによりＪκ遺伝子とＣκ遺伝子を欠失せしめることである。κ標的ベクターの作製プラスミドpGEM7（KJ1）（M.A．Rucinicki，Whitehead Institute）は、クローニングベクター7Zf（+）中のマウスホスホグリセレートキナーゼ（pgk）プロモーター〔Xba I／TaqI断片；Abra，C.N.ら、Gene 60:65-74（1987）〕の転写調節下に、トランスフェクトされたES細胞の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子（neo）を含む。このプラスミドは、マウスpgk遺伝子の３′領域に由来する、 neo遺伝子にとって異種のポリアデニル化部位〔Pvu II／HindIII断片；Boer，PH .ら、Biochemical Genetics 28:299-308（1990）〕も含む。このプラスミドをκ 標的ベクターの作製のための出発点として使った。第一段階はneo発現カセットの３′のκ遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。Ｃκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとＪκ遺伝子セグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ：を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウス κ鎖配列（図25ａ）を単離した。陽性ファージクローンから２断片において、即ち1.2kb BglII／Sac I断片と6. 8kb SacI断片として、マウスＣκセグメントの３′に及ぶ８kb BglII／SacI断片を単離し、それをBglII／Sac Iで消化されたpGEM（KJ1）中にサブクローニングし、プラスミドpNEO-K3′を作製した（図25ｂ）。Ｊκ領域の５′に及ぶ1.2kb EcoRl／Sph I断片も陽性ファージクローンから単離した。この断片のSphI部位にSphI／Xba I／Bgl II／BcoRIアダプターを連結せしめ、生じたEcoRI断片をneo遺伝子および下流の３′κ配列と同じ５′→３′方向で、EcoRIで消化されたpNEO-K3’に連結せしめ、pNEO-K5'3'（図25ｃ）を作製した。次いで、Mansourら、Nature 336: 348-352（1988）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、相同組換え体を有するBS クローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス（HSV）テミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含めた。プラスミドpGEM7（TK）からHSV TKカセットを得た。このカセットは、pGEM7（KJ1）について上述したのと同様に、マウスpgkプロモーターとポリアデニル化配列とにより隣接されたHSV TK遺伝子の構造配列を含む。pGEM7（TK）のEcoRI部位をBamHI部位に変更し、そしてTKカセットをBam HI/HindIII断片として切り出し、pGP1b中にサブクローニングしてpGP1b -TKを作製した。このプラスミドをXho I部位のところで線状化し、Ｊκの５′からのゲノム配列とＣκの３′からのゲノム配列とにより隣接されたneo遺伝子を含む、pNEO-K5'3'由来のXhoI断片をpGP1b-TK中に挿入し、標的ベクターJC KI（図25ｄ）を作製した。J/C K1を用いた相同組換え後のゲノムκ遺伝子座の推定構造を図25ｅに示す。κ対立遺伝子の標的不活性化によるES細胞の作製および分析使用したES細胞は、本質的には記載された通りに〔Robertson，E．J.，Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertso n編（Oxford: IRL Press）71-112頁（1987）〕、分裂上不活性なSNL76/7支持細胞層〔McMahonおよびBradley，A．Cell 62:1073-1085（1990）〕上で増殖させた AB-1系であった。他の適当さES系としては、E14系〔Hooperら、Nature 326: 292 -295（1987）〕、D3系〔Doetschmanら、J.Embryol Exp．Morph． 87:27-45（198 5）］、およびCCB系〔Robertsonら、Nature 323:445-448（1986）〕が挙げられるが、それらに限定されない。特異的な標的変異を有するES細胞からマウス系統をうまく作製できるのは、ES細抱の多分化能性（即ち、宿主胚盤胞中に注入されれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞に貢献することができるそれらの能力）に依存している。任意の与えられたES細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用することになっているES細胞の特定集団がESゲノムの生殖細胞伝達を行うことができるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。この理由により、遺伝子標的の前に、AB-1細胞の親集団の一部をC57B1/6J胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の大部分がESゲノムを子孫に伝達できるかどうかを確かめる。 κ鎖不活性化ベクターJ/C K1をNotIで消化し、そして記載された方法〔Hasty ，P.R．ら、Nature 350:243-246（1991）〕によりAB-1細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100mm皿上に２〜５×10⁶細胞／皿の密度で塗抹した。24時間後、G418（200μg/mlの活性成分）およびFIAU（0.5 μＭ）を培地に添加し、10〜11日に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについで分析した。サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Laird，P.W．ら、Nucl．Acids Res． 19:4293（1991）〕クローンからＤＮＡを単離し、XbaIで消化し、そして標特的プローブとして図25ｅに指摘の800bp BcoRI／Xba I断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の3.7kb XbaI断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な1.8kb バンドを検出した（図25ａおよびｅを参照のこと）。サザンブロット分析によりスクリーニングした901個のG418およびFIAU耐性クローンのうち、７つのクローンがκ遺伝子のうちの１つへの相同組換えを示す1.8kb XbaIバンドを表した。それらの４つのクローンを更にBglII，Sac IおよびPstI酵素で消化し、κ遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的に組み込まれたことを確認した。標徴的800bp BcoRI／Xba I断片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型ＤＮＡのBglII，S ac IおよびPst I消化物がそれぞれ4.1，5.4，および７kbの断片を生成し、一方標的されたκ対立遺伝子の存在はそれぞれ2.4，7.5および5.7kbの断片により指摘された（図25ａおよびｅを参照のこと）。XbaI消化物により検出された７つの陽性クローンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴的である期待のBg lII，Sac IおよびPstI制限断片を示した。不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製前の章で記載した標的されたESクローンのうちの５つを、記載の如く〔Bradle y，A．，Teratocarcinomas and Embrvonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J．Robertson編（Oxford: IRL Press），113-151頁（1987）〕C57B1/6J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子宮に移し、注入ES細胞から誘導された細胞と宿主の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製する。黒いC57B1/6J背景上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、それらの大部分が皮膜着色への過剰のES細胞の貢献（70％以上）を示した。ABI ES細胞は XY細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コロニー形成された雄ES細胞による雌胚の性転換のために雄であった。雄のキメラをC57BL/6Jと交配させ、ESゲノムの生殖細胞伝達の指標である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの２つからのキメラ体が一貫しでアグーチ子孫を生産した。κ遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローンに標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からのBglII消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図25ｅ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50 ％が4.1kbの野生型バンドに加えて2.4kbのハイブリダイズするBglIIバンドを示した。この結果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫のκ遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピーの正常κ遺伝子座を有する野生型マウス、１コピーの標的κ遺伝子と１つのＮＴκ遺伝子を有する異型接合体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスからのκ配列の欠失は、Ｊκに特異的なプローブ（プローブＣ、図25ａ）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Ｊκプローブのハイブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察されたが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかった。これは、標的変異の結果としての欠失によりκ遺伝子座の両方のコピーが不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。実施例10 相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹（ES）細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子の活性化を記載する。方策は、Ｊ_H領域が削除されそして選択マーカー遺伝子neoにより置き換えられている重鎖配列を含むベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Ｊセグメントを欠失せしめることである。重鎖標的ベクターの作製Ｊ_H４特異的オリゴヌクレオチドプローブを使って、D3 ES細胞系〔Gosslerら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:9065- 9069（1986）〕から誘導されたゲノムファージライブラリーから、Ｊ_H領域を含むマウス重鎖配列（図26ａ）を単離した。Ｊ_H領域に及ぶ3.5kbのゲノムSac I／Stu I断片を陽性ファージクローンから単離し、それをSac I／Sma Iで消化されたpUC18中にサブクローニングした。生じたプラスミドをpuc18 Ｊ_Hと命名した。トランスフェクトされたES細胞の薬剤選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子（neo）は、プラスミドp6EM7（KJ1）の修復変形から誘導された。文献中の報告〔Yenofskiら、Pfoc．Natl．Acad．Sci．U.S .A．87 : 3435-3439（1990）〕は、pGEM7（KJ1）中に使用されるneo遺伝子の源として働いたpMC1neo〔ThomasおよびCappechi，Cell 51：503-512（1987）〕を含む幾つかの常用の発現ベクターのneoコード配列の点変異を証明している。この変異はneo遺伝子産物活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野生型neoクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。pGEM7（K J1）中のHindIII部位を合成アダプターの付加によってSalI部位に変更し、そしてXbaI／Sal Iでの消化によりneo発現カセットを切り出した。次いでneo断片の両端をＤＮＡ polIのクレノウ形での処理により平滑未端化し、pUC18 Ｊ_HのNaeI 部位中にサブクローニングし、プラスミドpUC18 J_H-neo（図26ｂ）を作製した。標的ベクターの更なる作製は、プラスミドpGP1bの誘導体において行った。pGP 1bを制限酵素NotIで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチド：と連結せしめた。生じたプラスミド（pGETと命名）を使ってマウス免疫グロブリン重鎖標的構成物を構築した。 Mansourら、Nature 336: 348-352（1988）により記載されたようにして、相同組換え体を有するESクローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含めた。プラスミドpGEM（TK ）からEcoRIとHindIIIでの消化によりHSV TK遺伝子を得た。このTK DNA断片をpG MTのEcoRI部位とHindIII部位との間にサブクローニングし、プラスミドpGMT-TK （図26ｃ）を作製した。標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージクローンからXhoIでのＤＮＡの限定消化およびXbaIでの部分消化により、Ｊ_H領域の５′に位置する5.9kbのゲノムXba I／Xho I断片を誘導した。図26ａに示されるように、このXba I部位はゲノムＤＮＡ中には存在せず、むしろ陽性ファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐに隣接するファージ配列から誘導される。この断片をXba I／Xho Iで消化されたpGMT-TK中にサブクローニングし、プラスミドpGMT-TK-J_H5'（図27ｄ）を作製した。作製の最終段階は、neo遺伝子および隣接するゲノム配列を含むpUC18 Ｊ_H-neo からの2.8kb BcoRI断片の切除を含んだ。この断片をクレノウポリメラーゼにより平滑未端にし、同様に平滑未端化されたpGM7T-TK-Ｊ_H 5'のXhoI部位中にサブクローニングした。生じた構成物Ｊ_HKO1（図27ｅ）は、Ｊ_H遺伝子座を隣接する6 .9kbのゲノム配列を含み、neo遺伝子が中に挿入されているＪ_H領域に及ぶ2.3kb の欠失を有する。図27ｆは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝子の構造を示す。実施例11 標的されたES細胞の生産および分析本質的には記載された通りに〔Robertson，E.J.（1987）Terato-Carcinomas a nd Embryonic Stem Cells：A Practical Approach, E.J．Robertson編（Oxford ：IRL Press），71-112頁〕、分裂上不活性なSNL76/7支持細胞層〔McMahonおよびBradley，Cell 62: 1073-1085（1990）］上でAB-1 BS細胞を増殖させた。前の実施例に記載した通り、標的指向性構成物Ｊ_HKO1によるES細胞のエレクトロポレーションの前に、ESゲノムの生殖細胞伝達能力を有することが証明されたAB-1由来のキメラの作製により、ES細胞の多分化能性を決定した。重鎖不活性化ベクターＪ_HKO1を、Not Iで消化し、そして記載された方法〔Has tyら、Nature 350: 243-246（1991）〕によりAB-1細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100mm皿上に１〜２×10⁶細胞／皿の密度で塗抹した。24時間後、G418（200mg／mlの活性成分）およびFIAU（0.5mM）を培地に添加し、８〜10日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Lairdら、Nucl．Acids Res. 19:4293（1991）〕クローンからＤＮＡを単離し、StuIで消化し、そしてプローブＡとして図27ｆに示される500bp EcoRI／Stu I断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の4.7kb Stu I断片を検出し、一方で３kbバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに標徴的である（図26ａおよび27ｆを参照のこと）。サザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした525個のG418およびFITU二重耐性クローンのうち、12個が標的指向ベクターとの組換えに標徴的な３kb断片を含むことがわかった。それらのクローンがＪ_H遺伝子座のところに期待の標的現象（図27ｆに示されるような）を示すことは、HindIII、Spe IおよびHpa Iでの更なる消化により確認された。 HindIII、Spe IおよびHpa Iで消化されたＤＮＡのサザンブロットへのプローブＡ（図27ｆ参照）のハイブリダイゼーションは、野生型遺伝子座についてはそれぞれ2.3kb、＞10kbおよび＞10kbのバンドをもたらし、一方標的された重鎖遺伝子座についではそれぞれ5.3kb、3.8kbおよび1.9kbのバンドが予想される（図1 27ｆ参照）。StuI消化物により検出された12個の陽性クローンの全てが、標的Ｊ_H 遺伝子に標徴的な推定HindIII、Spe IおよびHpa Iバンドを示した。加えて、ne o-特異的プローブ（プローブＢ、図27ｆ）を使った12個のクローン全てのStuI消化物のサザンブロット分析は３kbの推定断片のみを生じ、それらのクローンが各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを証明した。Ｊ_H欠失を有するマウスの作製前の章で記載した標的されたESクローンのうちの３つを解凍し、記載の如く〔 Bradley，A．（1987）Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practica lApproach ，E.J．Robertson編（Oxford: IRL Press），113-151頁（1987）〕［5 7B1/6J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子宮に移した。黒色C57B1/6J背景上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。２つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３つ目の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が皮膜着色へのES細胞のかなりの貢献度（70％以上）を示した。ABI ES細胞はXY細胞系であり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ES細胞により性転換されたために雄であった。雄キメラをC57BL/6J雌と交配させ、ESゲノムの生殖細胞伝達の標徴である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの両方からのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。重鎖遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローン中に標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からの StuI消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図27ｆ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50％が4.7kbの野生型バンドに加えて約３kbのハイブリダイズするStuIバンドを示した。この結果は、標的されたＪ_H遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合鉢交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピーの正常Ｊ_H遺伝子座を有する野生型マウス、該遺伝子の１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接合体、およびＪ_H変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスからのＪ_H配列の欠失は、Ｊ_Hに特異的なプローブ（プローブＣ、図26）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。昇型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料において4.7kb断片へのＪ_Hプローブのハイブリダイゼーンョンが観察されたが、一方でＪ_H変異体同型接合体からの試料には全くシグナルが検出されなかった。これは、Ｊ_H配列の欠失により重鎖遺伝子の両方のコピーが変異されている新規マウス株の生成を証明する。実施例12 重鎖小遺伝子座トランスジーンＡ．大型ＤＮＡ列をクローニングするためのプラスミドベクターの作製１．pGP1a プラスミドpBR322をBcoRIとStyIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：と連結せしめた。生じたプラスミドpGP1aを、稀少切断性制限酵素NotIにより切除することができる非常に大型ＤＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それは、trpA 遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル〔Christieら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 78:4180（1981）〕の下流に（アンピシリン耐性遺伝子AmpRに関して）No tI制限部位を含む。この終結シグナルは、AmpR遺伝子からの読み通し転写を排除することにより、NotI部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下させる。加えて、このプラスミドは、pBR322コピー数調節領域を保持しているためにpU Cプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜在的毒性を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片に対する選択を減少させる。ベクターpGP1b，pGP1c，pGP1dおよびpGP1fはpGP1aから誘導され、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカー配列を下記に与える。それらの各プラスミドは大型トランスジーン挿入断片の作製に利用することができ、該挿入断片はNotIで切り出すことができ、その結果トランスジーンＤＮＡをマイクロインジェクション前にベクター配列から精製することができる。２．pGP1b pGP1aをNotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：と連結せしめた。生じたプラスミドpGP1bは、NotIにより隣接された短いポリリンカー領域を含む。これは、NotIにより切除することができる大型挿入断片の作製を容易にする。３．pGPe 次のオリゴヌクレオチド：を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓ＤＮＡ由来の免疫グロブリン重鎖３′エンハンサー〔S．Pettersonら、Nature344:165-168（1990）〕を増幅せしめた。増幅生成物をBamHIとsph Iで消化し、そしてBamHI／Sph Iで消化されたpNNO3 （pNNO3は、記載順に次の制限部位：NotI，BamHI NcoI，Cla I，EcoRV，XbaI,S ac I，Xho I，Sph I，Pst I，Bgl II，EcoRl，SmaI，KpnI，HindIIIおよびNotI を有するポリリンカーを含むpUC由来のプラスミドである）中にクローニングした。生じたプラスミドpRE3をBamHIとHindIIIで消化し、そしてラットIg重鎖３′ エンハンサーを含む挿入断片を、BamHI／HindIIIで消化されたpGP1b中にクローニングした。生じたプラスミドpGPe（図28および（化２）及び（化３））は、配列をクローニングすることができそして次いでNotI消化によって３′エンハンサーと一緒に切り出すことができる幾つかのユニーク制限部位を含有する。Ｂ．IgMを発現する小遺伝子座トランスジーンpIGM1の作製１．Ｊ−μ定常領域クローンの単離およびpJM1の作製ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA）中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ1.3を単離した。６つのＪセグメント全部並びにＤセグメントDHQ52および重鎖Ｊμイントロンエンハンサーを含む、６kbのHindIII／Kpn I断片をこのクローンから単離した。同じライフラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド：を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ2.1を単離した。μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、10.5kbのHindIII／Xho I断片をこのクローンから単離した。それらの２断片を、Kpn I／Xho Iで消化されたpNNO3と一緒に連結せしめ、プラスミドpJM1を得た。２．pJM2 ファージクローンλ2.1から４kbのXho I断片を単離した。該断片は、ある種の IgO発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素〔H.Yas uiら、Eur．J．Immunol. 19:1399（1989）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を含む、pJM1の配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、そしてXhoIで切断されクレノウで処理されたpJM1と連結せしめる。生じたプラスミドpJM2（図29）は、内部のXhoI部位を失っているが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として３′Xh olを保持している。pJNM2は完全なヒトＪ領域、重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連欠失に関与する２つの0.4kbの直接反復σμおよびΣμを含有する。３．Ｄ領域クローンの単離およびpDH1の作製次のヒトＤ領域特異的オリゴヌクレオチド：を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クローンについてスクリーニングした。ファージクローンλ4.1とλ4.3を単離した。Ｄ要素Ｄ_K1，Ｄ_N1およびＤ_M2 〔Y．Icilharaら、EMBO J．7: 4141（1988）〕を含む5.5kbのXhoI断片をファージクローンλ4.1から単離した。Ｄ要素Ｄ_LR1Ｄ_XP1，Ｄ_XP'1およびＤ_A1を含む上流の隣接5.2kb hoI断片をファージクローンλ4.3から単離した。それらのＤ領域XhoI断片の各々をプラスミドベクターpSP72（Promega，Madison，WI）のSalI 部位中にクローニングし、２配列を結合するXhoI部位を破壊した。次いで上流断片をXhoIとSmaIで切り出し、下流断片をEcoRVとXhoIで切り出した。得られた単離断片をSalIで消化されたpSP2と一緒に連結せしめ、プラスミドpDH1を与えた。 pDH1は、少なくとも７つのＤセグメントを含みXhoI（５′）およびBcoRV（３′ ）で切り出すことができる10.6kbの挿入断片を含有する。４．pCOR1 プラスミドpJM2をAsp718（Kpn Iのアイソシゾマー）で消化し、そしてDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて突出末端をフィルインした。次いで生じたDN AをClaIで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をpDH1のXhoI／EcoRV挿入断片およびXloI／Cla Ｉ消化pGPeと連結せしめ、pCOR1を作製した（図30）。５．pVH251 ２つのヒト重鎖可変領域セグメントＶ_H251とＶ_H105〔Humphriesら、Nature 33 1: 446（1988）〕を含む10.3kbのゲノムHindIII断片をpSP72中にサブクローニングし、プラスミドpVH251を与えた。６．pIGN1 プラスミドpCOR1をXloIで部分消化し、そしてpVH251の単離XhoI／Sal I挿入断片を上流のXhoI部位にクローニングし、プラスミドpIGM1（図31）を作製した。p IGM1は、下記の配列要素の全部がNotIでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離することができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトすることができるように、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪ_Hセグメント全部、ヒトμエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部およびヒト Σμ要素を、ラット重鎖３′エンハンサーと共に含有する。Ｃ．IgMとIgGを発現する小遺伝子座トランスジーンpHC1の作製１．γ定常領域クローンの単離次のヒトIgG定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド：を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ29 .4とλ29.5を単離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ29.4の４kb H indIII断片を使って、ファージベクターラムダFIX^TMII（Stratagene，La Jolla ，CA）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。ファージクローンλSgl.13を単離した。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、鋳型として上記３つのファージクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。ファージクローンλ29.5とλSγ1.13は両方ともγ１サブクラスであると決定された。２．pγe1 γ１コード領域を含むファージクローンλ29.5の7.8kb Hind III断片をpUC18 中にクローニングした。生じたプラスミドpLT1をXhoIで消化し、クレノウ断片で処理し、そして再連結せしめて円部Xho I部位を破壊した。生じたクローンp LT1xkをHindIIIで消化し、挿入断片を単離し、pSP72中にクローニングしてプラスミドクローンpLT1xksを作製した。ポリリンカーXhoI部位とヒト配列由来のBam HI部位のところでのpLT1xksの消化は、γ１定常領域コードエクソンを含む7.6kb 断片を与えた。この7.6kb XhoI／BamHI断片を、ファージクローンλ29.5からの隣接の下流4.5kb BamHI断片と一緒に、XhoI／BamHIで消化されたpGPe中にクローニングし、プラスミドpγe1を作製した。pγe1は、ラット重鎖３′エンハンサーに連結された、５kbの下流配列と共にγ１定常領域コードエクソンの全部を含有する。３．pγe2 γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物（sterile trans-cript）〔P.S iderasら、［nternational Immunol. 1:631（1989）〕の第一エクソンとを含む5 .3kbのHindIII断片をファージクローンλSγ1.13から単離し、そしで挿入断片の５′末端の近隣にポリリンカーXhoI部位を有するpSP71中にクローニングし、プラスミドクローンpSγ1sを作製した。pSγ1sのXhoI／Sal I挿入断片をXho Iで消化されたpγe1中にクローニングし、プラスミドクローンpγe2を作製した（図32 ）。pγe2は、ラット重鎖３′エンハンサーに連結された、下流の５kb配列と共に、γ１定常領域コードエクソン全部並びに上流のスイッチ領域および繁殖不能転写物エクソンを含有する。４．pHC1 プラスミドpIGM1をXhoIで消化し、43kb挿入断片を単離し、そしてXhoIで消化されたpγe2中にクローニングし、プラスミドpHC1を作製した（図31）。pHC1は、下記の配列要素の全部がNotIでの消化によりベクター配列を含まない単−断片において単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製することができるように、ラット重鎖３′エンハンサーと共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪ_Hセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（関連のスイッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。Ｄ．IgMとIgGを発現する小遺伝子鎖トランスジーンpHC2の作製１．ヒト重鎖Ｖ領域遺伝子VH49.8の単離ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダFIX^TMII（Stratagene，La Jolla，C A）を、次のヒトVH1ファミリー特異的オリゴヌクレオチド：を用いてスクリーニングした。ファージクローンλ49.8を単離し、そして可変セグメントVH49.8を含む6.1kbX baI断片をpNNO3中にサブクローニングし（ポリリンカーClaI部位がVH49.8の下流にそしてポリリンカーXhoI部位が上流にくるように）、プラスミドpVH49.8を作製した。この挿入断片の800bp領域を配列決定すると、VH49.8は転写解読枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することがわかり、よって該遺伝子が機能的であることを指摘する（表２）（化４）（化５）。２．pV2 プラスミドpUC12中にサブクローニングされたヒトＶ_HIVファミリー遺伝子Ｖ_H4 -21〔I．Sanzら、EMBO J. 8: 3741（1989）〕を含む４kb XbaIゲノム断片をSmaI とHindIIIで切り出し、ポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。平滑末端化された断片を、ClaIで消化されクレノウで処理されたpVH49.8中にクローニングした。生じたプラスミドpV2は、挿入断片の３′未端のユニークSalI部位および５′未端のユニークXhoI部位を使って、同じ方同でVH4-21の上流に連結された、ヒト重鎖遺伝子VH49.8を含む。３．pSγ1-5' 近隣の上流3.1kb XbaI断片と一緒に0.7kb XbaI／HindIII断片（プラスミドpγ e2中の5.3kbγ１スイッチ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を表す）をファージクローンλSgl.13から単離し、そしてHindIII／XbaIで消化されたpUC18ベクター中にクローニングした。生じたプラスミドpSγ1-5'は、γ１イソタイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能転写物（sterile tr anscript）〔P．Siderasら、International Immunol.，1: 631（1989）〕の開始部位の上流の配列を表す3.8kb挿入断片を含む。該転写物はイソタイプスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを促進するためにそれらの配列がトランスジーン構成物中に含まれる。４．pVGE1 pSγ1-5'挿入断片をSmaIとHindIIIで切り出し、クレノウ酵素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリンカー：と連結せしめた。この連結生成物をSalIで消化し、SalIで消化されたpV2に連結せしめた。生じたプラスミドpVPは、２つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントVH49.8とVH4 -21（表２（化４）及び（化５）参照）の下流に連結された3.8kbのγ１スイッチ５′隣接配列を含む。SalIでの部分消化およびXhoIでの完全消化の後、アガロースゲル上での15kb断片の精製により、pVP挿入断片を単離する。次いで該挿入断片をpγe2のXhoI部位中にクローニングし、プラスミドクローンpVGE1（図33）を作製する。pVGE1は、ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に２つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領域との間のユニークSalI部位を用いて、Ｄ，Ｊおよびμ遺伝子セグメントをクローニングすることができる。γ１遺伝子の３′末端にラット重鎖３′エンハンサーが連結され、そして挿入断片全体はNotI部位により隣接される。５．pHC2 プラスミドクローンpVGE1をSal Iで消化し、pIGM1のXho I挿入断片をその中にクローニングした。生じたクローンpHC2（図31）は、４つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒトＪ_Hセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（繁殖不能転写物開始部位の上流の４kb隣接配列と共に、関連のスイッチ領域と繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。それらのヒト配列は、前記配列要素全部をNotIでの消化によりベクター配列を含まない単一鎖上に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を生ぜしめることができるように、ラット重鎖３′エンハンサーに連結される。該挿入断片の５′末端のユニークXhoI部位を使って、追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎖小遺伝子座の組換え多様性を更に増大させることができる。Ｅ．トランスジェニックマウスプラスミドpIGM1およびpHC1のNotI挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精した（C57BL/6×CBA） F2マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生存している胚を、Hoganらにより記載された通りに（B．Hogan，F．CostantiniおよびE．Lacy，M ethods of Manipulating the Mouse Embryo，1986，Cold Spring Harbor Labora tory，New York）偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンブロット分析によりトランスジーン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準物に比較したハンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。３〜８週齢において、それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよびLa ne （E．HarlowおよびD．Lane,Antibodies: A Laboratory Manual，1988，Cold Spring Harbor Laboratory，NeW York）により記載されたように、トランスジーンによりコードされるヒトIgＭおよびIgＧ１の存在についてELISAによりアッセイした。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトIgＭに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンAF6，♯0285，AMAC，Inc．Westbrook，ME）およびヒトIgＧに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンJL512，＃0280，AMAC，I nc．Westbrook，ME）によりコーティングした。該ウエル中に血清試料を連続的に希釈し、予備吸着させることによってマスウ免疫グロブリンとの交差反応性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒト Ig（多価）を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。表１と図34は、プラスミドpHC1のトランスジーン挿入断片を注入した胚から発育した２匹の動物の血清中のヒトIgＭおよびIgＧ１の存在についてのBLISAアッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トランスジェニックマウスは全て、ヒトIgＭおよびIgＧの発現について陰性であった。pIGM1 NotI挿入断片を含有する２系統のマウス（系統＃6と15）はヒトIgＭを発現するがヒトIg Ｇ１を発現しない。我々はpHC1挿入断片を含む６つの系のマウスを試験した。その結果、４系統（系＃26，38，57および122）がヒトIgＭとヒトIgＧ１の両方を発現し、２系統のマウス（系続＃19および21）は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1トランスジェニックマウスは、マイクロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該トランスジーンの存在についてモザイクであり得る、いわゆるＧ₀マウスであった。サザンブロット分析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジーンの１つまたは少数のコピーを含むことを示した。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭ、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、トランスジーン配列がＶＤＪ連結、転写およびイソタイプスイッチを指令することにおいて正しく機能しているという証拠を提供する。１匹の動物（＃18）は、サザンブロット分析によりトランスジーンについて陰性であり、検出可能レベルのヒトIgＭまたはIgＧ１を全く示さなかった。２番目の動物（＃38）は、サザンブロッティングによりアッセイすると該トランスジーンの約５コピーを含んでおり、そして検出可能レベルのヒトIgＭとIgＧ１の両方を示した。トランスジーンを注入した胚から発育した11匹の動物についてのELISAアッセイの結果を下表（表１）に要約する。表１表１は、組み込まれたトランスジーンＤＮＡの存在と血清中のトランスジーンによりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。pHC1トランスジーンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。それらは共に低コピー動物であり、該トランスジーンの完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝的モザイクを有している（動物＃21について評価された細胞あたり＜１コピーにより指摘される）ことがあり、そしてトランスジーン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。あるいは、トランスジーンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合がある。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭの検出、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、トランスジーン配列がＶＤＪ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正しく機能することを指摘する。Ｆ．cONAクローンＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達および対立遺伝子排除におけるトランスジーンがコードするヒトＢ細胞レセプターの関与に関するpHC1トランスジーンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓mRNAから誘導した免疫グロブリンcDNAクローンの構造を調べた。ＤおよびＪセグメント用法、Ｎ領域の付加、CDR3の長さ分布、並びに殿能的mRNA分子をもたらす接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジーンによりコードされる重鎖の総合的多様性を調べた。VH105とVH251を組み込んだIgMおよびIgＧをコードする転写物を調べた。第11週の雄第二世代57系列pHC1トランスジェニックマウスからポリアデニル化ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始一本鎖cDNAを合成した。次いで得られたcDNAを、次の４つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使った４つの各ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用した：VH251特異的オリゴ−149 ctagct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg（g,a,t,c）； VH105特異的オリゴ−150 gtt gct cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg cag ctg（g,a,t,c）；ヒトγ１特異的オリゴ−151 ggc gct cga gtt cca cga cac cg t cac cgg ttc；およびヒトμ特異的オリゴ−152 cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc tcg 。反応１はプライマーo-149とo-151を使ってVH251−γ１転写物を増幅せしめ、反応２はプライマーo-149とo-152を使ってVH251−μ転写物を増幅せしめ、反応３はプライマーo-150とo-151を使ってVH105−γ１転写物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーo-150とo-152を使ってVH105−μ転写物を増幅せしめた。得られた0.5kbのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。対応するBLISAデータ（図40）と一致して、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。ＰＣＲ産物をXhoIで消化し、プラスミドpNNO3中にクローニングした。４つのＰＣＲ増幅の各々からの９個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドＤＮＡを単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの２つがＤまたはＪセグメントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正常のＲＮＡスプライシング生成物からは誘導することができなかったので、おそらくＰＣＲ増幅中に導入された欠失から生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうちの１つは、２つの個々のクローンの混合物であることがわかり、そして他の３つのクローンは読み取り可能なＤＮＡ配列を生成しなかった（おそらくＤＮＡ試料が十分に純粋でなかったためであろう）。残りの30個のクローンからのＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を（化６）（及び化７）にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でないこと、またはトランスジーン発現性Ｂ細胞の単一クローンが優性でないことを示す。どの２配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性が２個のＶセグメント、10個のＤセグメントおよび６個のセグメントのみを含む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。該トランスジーン中に含まれるＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部および10個のＤセグメントの７個がＶＤＪ接合部に使われる。加えて、両定常領域遺伝子（μとγ１）が転写物中に含まれる。VH105プライマーは実施した反応においてVH105に特異的であることがわかった。従って、反応３および４からのクローンの多くがVH251転写物を含んでいた。更に、連結反応３のＰＣＲ産物から単離されたクローンはIgＧよりもむしろIgＭをコードすることがわかった；しかしながら、これは、ＤＮＡを同一ゲル上で単離したため、反応４からのＰＣＲ産物による汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を決定した同様な実験が、細菌Yamadaらにより報告された〔J．Exp．Med. 1 73: 395-407（1991）；これは参考として本明細書中に組み込まれる］。このヒトＰＢＬからのデータをpHC1トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較した。Ｇ．Ｊセグメント選択表２は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかるＪセグメントに対して、pHC1トランスジーンによりコードされる転写物中に取り込まれるＪセグメントの分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系ともＪ４セグメントが優性セグメントであり、次いでＪ６セグメントが優性である。Ｊ２はヒトＰＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメントである。表２Ｈ．Ｄセグメント選択 Yamadaらにより分析されたクローンの49％（82のうち40）が、pHC1トランスジーン中に含まれるＤセグメントを含んでいた。他の11クローンは、該著者らにより既知Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含んだ。それらの指定されなかった11個のクローンのうちの２つは、pHC1構成物中に含まれるDIR2セグメントの逆位から誘導されるようだ。Ichinaraら〔EMBO J．7: 4141（1988）〕により予想されそしてSanz〔J．Immunol．147:1720-1729（1991）〕により観察されたこの機構を、Yamadaら〔J．Exp．Med. 171:395-407（1991）〕は考慮に入れなかった。表２は、pHC1トランスジェニックマウスについてのＤセグメント分布とYamadaらによりヒトＰＢＬ転写物について観察されたものとの比較である。 Yamadaらのデータを、DIR2使用を包含しそしてpHD1トランスジーン中にないＤセグメントを除外するように再編集した。表３は、Ｄセグメント組み込みの分布がトランスジェニックマウスとヒトＰＢＬとにおいて非常に類似していることを証明する。２つの優性なヒトＤセグメントDXP'IとDN1は、トランスジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。２つの分布間の最も大きな相違点は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのDHQ5 2の高頻度である。DHQ52の高頻度はヒト胎児肝臓中のＤセグメント分布を思い出させる。Sanzは重鎖転写物の14％がDHQ52配列を含んだことを報告している。pHC 1中に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、Sanzにより分析された胎児転写物の31％がDHQ52を含んでいる。これは、本発明者らがpHC1トランスジェニックマウス中に観察した27％と同等である。表３Ｉ．ＶＤＪ接合部の機能性表４は、pHC1トランスジェニック動物から分析された30個のクローンからのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、30個のＶＤＪ接合部のうちの 23個（77％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠円（in-frame）であることを示す。Ｊ．CDR3の長さ分布表４は、pHC1トランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ接合部を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さをヒトＰＢＬ中のそれと比較したものである。ヒトＰＢＬデータは同じくYamadaらから得られたものである。両分布は類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒトＰＢＬから観察されたものよりもわずかに小さいCDR3ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウスにわける CDR3の平均長さは10.3アミノ酸である。これはSanz〔J．Immunol．147:1720-172 9（1991）〕によりヒトCDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同じである。表４実施例13 再配列された重鎖トランスジーンＡ．再配列されたヒト重鎖ＶＤＪセグメントの単離ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA）中にクローニングされた２種のヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを含むλ1.3の１kb PacI／HindIII断片を用いてスクリーニングする。陽性クローンを、次のＶ_H特異的オリゴヌクレオチド：の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する。ＶプローブとＪ−μプローブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そして再配列されたＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を決定する。Ｂ．再配列されたヒト重鎖トランスジーンの作製機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライスシグナル）を、プラスミド由来のXhoI部位が挿入断片配列の５′未端に隣接するように、プラスミドベクターpSP72中にサブクローニングする。機能的ＶＤＪセグメントを含むサブクローンをXhoIとPac I（Pac IはＪ−μイントロンエンハンサー近くの部位を認識する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片をXhoI／Pac I で消化されたpHC2中にクローニングし、機能的ＶＤＪセグメント、Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ要素、μ定常領域コードエクソンおよびγ１定常領域（これは繁殖不能転写物関連配列、γ１スイッチおよびコードエクソンを含む）を有するトランスジーン構成物を作製する。上述したように、このトランスジーン構成物をNotIで切り出し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。実施例14 軽鎖トランスジーンＡ．プラスミドベクターの作製１．プラスミドベクターpGP1c プラスミドベクターpGP1aをNotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1cは、NotI部位により隣接されたXmaI，XhoI，SalI,Hind IIIおよびBamHI制限部位を有するポリリンンカーを含む。２．プラスミドベクターpGP1d プラスミドベクターpGP1aをNotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1dは、NotI部位により隣接されたSalI，HindIII,Cla I，BamHIおよびXhoI制限部位を有するポリリンンカーを含む。Ｂ．ＪκおよびＣκクローンの単離ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒトκ 軽鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：を用いてスクリーニングし、そしてファージクローン136.2と136.5を単離する。 136.2からＪκ１セグメントを含む7.4kb XhoI断片を単離し、プラスミドpNNO3中にサブクローニングしてプラスミドクローンp36.2を作製する。Ｃκ遺伝子セグメントと共にＪκセグメント２〜５を含む近隣の13kb XhoI断片をファージクローン136.5から単離し、そしてプラスミドpNNO3中にサブクローニングしてプラスミドクローンp36.5を作製する。それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊκ１の7.2kb上流で始まりＣκの９kb下流で終わる領域に及ぶ。Ｃ．再配列された軽鎖トランスジーンの作製１．再配列された可変サグメントを発現させるためのＣκベクターpCK1 Ｃκ遺伝子を含むプラスミドクローンp36.5の13kb Xho I断片を、９kbの下流配列と一緒に、該挿入断片の５′未端がプラスミドXho I部位に隣接した状態で、プラスミドベクターpGP1cのSal I部位中にクローニングする。生じたクローン pCK1は、再配列されたＶＪκセグメントを含むクローン化断片をユニーク５′Xh o I部位に収容することができる。次いで該トランスジーンを、NotIで切り出し、ゲル電気泳動によってベクター配列から精製する。得られたトランスジーン構成物は、ヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト３′κエンハンサーを含むことができる。２．再配列された可変セグメントを発現させるための重鎖エンハンサー含有Ｃκ ベクターpCK2 マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔J．Banerjiら、Cell33: 729-740 （1983）〕を含むマウスゲノムＤＮＡの0.9kb XbaI断片をpUC18中にサブクローニングし、プラスミドpJH22.1を作製した。このプラスミドをSphIにより線状化し、クレノウ酵素を用いて末端をフィルインした。クレノウ処理されたＤＮＡを次いでHindIIIで消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサー〔Haydayら、Nature 307:334-340（1984）〕を含むファージクローンλ1.3（前の実施例）のMluI（クレノウ）／HindIII断片をそれと連結した。生じたプラスミドpMHB1は、両者が単一のBamHI／HindIII断片上に切除されるように、pUC18中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエンハンサーから成る。この2.3kb断片を単離し、pGP1c中にクローニングしてpMHE2を作製する。pMHE2をSalIで消化し、p36.5の13kb Xho I挿入断片をその中にクローニングする。生じたプラスミドpCK2は、マウスとヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーがトランスジーン挿入断片の３′未端に融合していること以外は、pCK1 と同一である。最終トランスジーンの発現を調節するために、異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔MeyerおよびNeu berger，EMBO J．8:1959-1964（1989）；Pttersonら、Nature 344:165-168（199 0）〕を使って類似構成物を作製することができる。３．再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA）中にクローニングされた２つのヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、p36.5の3.5kb XhoI／Sma I断片を含むヒトκ軽鎖Ｊ領域を用いてスクリーニングした。陽性クローンを、次のＶκ特異的オリゴヌクレオチド：とのハイブリダイゼーションについて試験した。ＶプローブとＪプローブの両方とハイブリダイズしたクローンを単離し、そして再配列されたＶＪκセグメントのＤＮＡ配列を決定する。４．再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライススグナル）をベクターpCK1およびpCK2のXhoI部位中にサブクローニングし、再配列されたκ軽鎖トランスジーンを作製する。NotIでの消化により該トランスジーン構成物をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断片をマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製する。ヒトκ 鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を含有するトランスジェニック動物（実施例14）と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。ＶＪκ組合せの全部が、広域スペクトルの種々の重鎖ＶＤＪ組合せと安定な重鎖−軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたＶＪκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジーン構成物を作製し、そして重鎖小遺伝子座トランスジーンを発現するマウスと交配させる。二重トランスジェニック（重鎖構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、末梢血、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに特異的な蛍光抗体（Phavmingen，San Diego，CA）で染色し、そしてFACScan分析装置（Becton Dickinson，San Jose，CA）を使ってフローサイトメトリーにより分析する。最大数のＢ細胞の表面上に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ且つ免疫細胞区分に悪影響を与えない（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体を用いたフローサイトメトリー分析によりアッセイした時）再配列された軽鎖トランスジーン構成物を、ヒトモノクローナル抗体の産生のために選択する。Ｄ．再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーンの作製１．小遺伝子座トランスジーンを作製するためのＪκ，Ｃκ含有ベクターpJCK1 p36.5の13kbのＣκ含有XhoI挿入断片をクレノウ酵素で処理し、HindIIIで消化されクレノウ処理されたプラスミドpGP1d中にクローニングする。挿入断片の５ ′未端がベクター由来のClaI部位に隣接するようなプラスミドクローンを選択する。生じたプラスミドp36.5-1dをCla Iで消化し、クレノウで処理する。p36.2のＪκ１含有7.4kb XhoI挿入断片をクレノウで処理し、そしてClaIで消化されクレノウ処理されたp36.5-1d中にクローニングする。p36.2挿入断片がp36.5挿入断片と同じ方向にあるクローンを選択する。このクローンpJCK1（図35）は、7.2kbの上流配列および９kbの下流配列と一緒に、完全なヒトＪκ領域およびＣκ領域を含む。該挿入断片はヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーも含み、ヒト３′κエンハンサーを含むこともある。該挿入断片は、追加の３′隣接配列、例えば重鎖または軽鎖エンハンサーをクローニングする目的でユニーク３′SalI部位により隣接される。ユニークXhoI部位は、再配列されていないＶκ遺伝子セグメント中でクローニングする目的で該挿入断片の５′未端に置かれる。ユニークSalIおよびXh o I部位は、最終のトランスジーン構成物をベクター配列から単離するために使われるNotI部位により隣接される。２．再配列されていないＶκ遺伝子セグメントの単離およびヒトIg軽鎖タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴー65（上述）を使って、ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetecch Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを探査する。生じたクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断するための基準は、転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列を含むことである。選択された可変遺伝子セグメントを含ＵＤＮＡ断片をプラスミドpJCK1のユニークXhoI部位にクローニングし、小遺伝子座構成物を作製する。得られたクローンをNotIで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジーンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろう。ヒトκ鎖を発現する動物を、重鎖小遺伝子座を含有するトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを得る。実施例15 ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーンこの実施例は、接合子中へのマイクロインジェクンョンまたはES細胞中への組み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングを記載する。 Marzluff，W.F.ら,（1985）Transcription and Tvanslation：A Practical Ap proach ，B.D．HammesおよびS.J．Higgins編，89-129頁，IRL Press，Oxfordにより記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはPBSで洗浄したヒト精母細胞）を0.5％低融点アガロースブロック中に埋め込み、そして核については500mM EDTA，１％SDS中の１mg／mlのプロテイナーゼＫにより、精母細胞については500mM EDTA，１％SDS，10mM DTT中の１mg／ml のプロテイナーゼＫにより、50℃にで18時間溶解せしめる。該ブロックを40μg/ mlのPMSF／TE中で50℃にで30分間インキュベートすることにより、プロテイナーゼＫを不活性化する。次いでM．FinneyによりCurrent Protocols in Molecular Biology （F.Ausubelら編，John Wiley & Sons，増補４，1988，例えば第2.5.1章）中に記載されたように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素NotIで消化する。 Not Iで消化したＤＮＡを、次いでAnandら，Nuc．Acids Res．17:3425-3433（ 1989）により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。NotI断片に富む画分をサザンハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によってコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ１定常領域と共に６つのＶ_Hファミリー全部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら（1988），前掲によればHeLa細胞から670kb断片として同定されているけれども、本発明者らはそれがヒト胎盤および精子ＤＮＡからのは830kb断片であることを発見した〕。このNotI断片を含む画分（図４参照）を記載の如く〔McCormickら、Technique 2:65-71（1990）〕ベクターpYACNNのNotI部位中に連結せしめる。プラスミドpYACNNは、pYACneo（C lontech）をBcoRIで消化しそしでオリゴヌクレオチド５′−AAT TGC GGC CGC −３′の存在下で連結せしめることにより、調製される。 Traverら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 86:5898-5902（1989）により記載された通りに、重鎖、NotI断片を含むYACベクターを単離する。クローン化されたNot I挿入断片を、M．Finney（前掲）により記載されたようなパルスフィールドゲル電気泳動により高分子量酵母ＤＮＡから単離する。１mMスペルミンの添加によりＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。あるいは、ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動により単離し、そしてリポフェクション〔Gnirkeら、EMBO J．10:1629-1634（1991）〕によりES細胞中に導入するか、またはYACをスフェロプラスト融合によりES細胞中に導入する。実施例16 不連続ゲノム重鎖IgトランスジーンＶ_H６、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を含むヒトゲノムＤＮＡの85kb SpeI断片は、本質的には実施例１に記載した通りのYACクローニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来の断片、例えば多コピーのＶ₁〜Ｖ₅を含む上記の670-830kb NotI断片の上流の570kb NotI断片、を含有するYACを上述の如く単離する。〔Bermanら（1988），前掲は、各々が多数のＶセグメントを含有する２つの570kb NotI断片を検出した。〕この２断片を実施例１に記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。典型的には、２つの異なＤＮＡ断片の同時注入は、染色体内の同一部位のところへの両断片の組込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくとも１コピーを含む生じたトランスジェニック動物の約50％が、定常領域含有断片の上流に挿入されたＶセグメント断片を有する。それらの動物のうち、85kb Spe I断片の位置に関する570kb NotI断片の方向性に依存して、約50％がＤＮＡ逆位によりＶ− ＤＪ結合を行い、そして約50％が欠失によりＶ−ＤＪ結合を行うだろう。生じたトランスジェニック動物からＤＮＡを単離し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションにより両方のトランスジーンを含んでいることが示された動物（詳しくは、多数のヒトＶセグメントとヒト定常領域遺伝子の両方を含む動物）を、標準枝術に従って、ヒト免疫グロブリンを発現する能力について試験する。実施例17 トランスジェニックＢ細胞中の機能的に再配列された可変領域配列の同定着目の抗原を使って、次の遺伝的特性：Ｊ_Hの欠失（実施例10）については内因性所有鎖遺伝子座中の同型接合性；再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（実施例５および14）の単一コピーについては半接合性；および再配列されたヒトκ軽鎖トランスジーン（実施例６および14）の単一コピーについては半接合性、を有するマウスを免疫化する〔HarlowおよびLane，Antibodies:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor，New York（1988）を参照のこと〕。免疫化スケジュールの後、脾臓を取り出し、脾細胞を使ってハイブリドーマを調製する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリドーマクローンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの試料を、ユニークな６塩基対配列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル上で分画する。サザンブロットハイブリダイゼーションを使って２〜10 kb範囲内の２つのＤＮＡ断片を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重鎖ＶＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列されたヒト軽鎖ＶＪ配列の単一コピーを含む。それらの２断片をアガロースゲル上でサイズ分画し、pUC18 中に直接クローニングする。クローン化された挿入断片を、定常領域配列を含む重鎖および軽鎖発現カセット中にそれぞれサブクローニングする。プラスミドクローンpγe1（実施例12）を重鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＤＪ配列をXhoI部位中にクローニングする。プラスミドクローンpC K1を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＪ配列をXhoI部位中にクローニングする。生じたクローンを一緒に使ってSP₀細胞をトランスフェクトせしめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめる〔M,S．Coら、Proc．NatI．Acad ．Sci USA 88:2869（1991）〕。あるいは、上述のクローン化ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離し、cDNAを合成するのに使う。発現されるヒト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよびＶＪ配列を、次いでＰＣＲにより増幅し、クローニングする〔J．W．Larrichら（1989）Biol．Tec hnlogy, 7:934-938〕。それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコードずるオリゴヌクレオチドを合成し、そしてC．Queenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:5454-5458（1989）により記載されたようにして合成発現ベクターを作製する。複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤皿球上の抗原のような複合抗原により好結果に免疫化することができ、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論に類似した速度論で応答することができることを証明する。血液細胞は一般に適当な免疫原であり、赤血球と白血球の表面上には多数の異なる型の抗原を含んで成る。ヒト血液による免疫化一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座（Ｊ_HＤ）を有し且つヒト重鎖小遺伝子構成物（HCl）を含有するトランスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系112と命名する。血液を洗浄し、50mlのハンクス溶液中に再懸濁し、１×10⁸細胞／mlに希釈した。次いで28ゲージの針と１ccの注射器を使って0.2ml（２×10⁷細胞）を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを６週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験することにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増大させるために尾部静脈内への１×10⁸細胞による免疫化を１回行った。表５マウス＃2343と2348は所望の表現型を有する：重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遺伝子トランスジェニック。ハイブリドーマの作製上述の通り免疫化された約16週齢のトランスジェニックマウス（表５）のマウス脾細胞を非分泌性ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞系X63 Ag8.653から成る融合相手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含有するハイフリドーマ上清を、例えばフローサイトメトリーにより、同定した。フローサイトメトリーフローサイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者からの赤血球をハンクス溶液中で４回洗浄し、50,000個の細胞を1.1mlのポリプロピレン微小管中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清または抗血清と共に染色媒質〔フェノールレッドまたはビオチン（Irvine Scientific）、３％新生ウシ血清、0.1％ナトリウムアジドを含まない１×RPMI培地〕中で氷上で30分間インキュベートした。対照は他の遺伝子型を有する同腹マウスから成った。次いで細胞をSorvaII RT600B中で1000rpmで５〜10分間４℃にて遠心することにより洗浄した。細胞を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検出した。２種類のモノクローナル試薬を使って試験した。１つはFITCで標識されたマウス抗ヒトμ重鎖抗体（Pharmagen．San Diego，CA）であり、もう１つは PEで標識されたラット抗マウスκ軽鎖抗体（Becton-Dickenson，San Jose，CA）であった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血（赤血球と白血球）および白血球のみを標的細胞として使用した。両方の組が陽性結果を与えた。トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または他の個体からの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒトIgＭ FITC標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した。結果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス2343および2348）からの血清がヒトIgＭ反応性を示し、一方全ての同腹動物（2344，23 45，2346，2347）からの血清は該反応性を示さなかった。正常マウス血清（ＮＳ）とリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対照として使用した。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように濾過された。比較を与えるためにｘ軸とｙ軸上に線が引かれている。融合体2348からの100の上清に関してフローサイトメトリーを実施した。４つの上清が血球細胞抗原に対する陽性反応性を示した。実施例18 アンチセンスＲＮＡによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少Ａ，アンチセンスＩｇ配列の発現用のベクター１．クローニングベクターpGP1hの作製ベクターpGP1b（前の実施例に記載）をXho IとBamHIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：と連結せしめてプラスミドpGP1hを作製した。このプラスミドは、次の制限部位：NotI，EcoRI，BgIII，Asp718，Xho I，BamHI，Hind III，NotIを含むポリリンカーを含有する。２．pBCE1の作製プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトＶ_H−Ｖファミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、pV H251（前の実施例に記載）の0.8kb XbaI／Bgl II断片を、Xba I／Bgl IIで消化したベクターpNNO3中に挿入してプラスミドpVH251Nを作製した。ヒト成長ホルモン遺伝子〔hGH；Seeburg（1982）DNA 1:239-249〕のコードエクソンを含む2.2kb BamHI／EcoRI ＤＮＡ断片を、BamHI／BcoRIで消化したpGH1h 中にクローニングした。生じたプラスミドをBamHIで消化し、そしてpVH251NのBa mHI／EcoRI断片をhGH遺伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドpVhghを作製した。マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Banerjiら（1983）Cell 33:729-7 40〕を含むマウスゲノムＤＮＡの0.9kb XbaI断片をpUC18中にサブクローニングしてプラスミドpJH22.1を作製した。このプラスミドをSphIで直鎖状にし、末端をクレノウ酵素でフィルインした。次いでクレノウ処理したＤＮＡをHindIIIで消化し、そしてヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Haydayら（1984）Natu re 307:334-340〕を含むファージクローンλ1.3（上記実施例）の1.4kb MluI（クレノウ）／HindIII断片をそれと連結せしめた。得られたプラスミドpMHE1は、単一のBamHI/HindIII断片において切り出すことができるようにpUC18中に一緒に連結されたマウスおよびヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーから成る。 pMHE1のBamHI／HindIII断片をBamHI／HindIIIで切断されたpVhgh中にクローニングし、Ｂ細胞発現ベクターpBCE1を作製した。このベクター（図42に描写）はユニークXhoIおよびAsp718クローニング部位を含有し、その中にアンチセンスＤＮＡ断片をクローニングすることができる。それらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎖プロモーター−エンハンサー組み合わせにより指令され、下流のhGH遺伝子配列はイントロン配列に加えてトランスジーン構成物の発現を促進するポリアデニル化配列を提供する。pBCE1から作製されたアンチセンストランスジーン構成物はNotIでの消化によりベクター配列から分離することができる。Ｂ．IgMアンチセンストランスジーン構成物下記オリゴヌクレオチド：を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスIgM定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた0.3 kbのＰＣＲ産物をAsp718とXhoIで消化し、そしてAsp718／XhoIで消化したpBCE1 中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pMAS1を作製した。pMA S1の精製済NotI挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgＭのmRNAとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってマウスIgＭタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。 pMAS1とpHC1のようなヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座とを含有する二重トランスジェニックマウス（両構成物の同時注入によるかまたは一重トランスジェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重鎖小遺伝子座のみについてトランスジェニックであるマウスよりも高い比率のＢ細胞上に、ヒトトランスジーンによってコードされるIgレセプターを発現するだろう。ヒト対マウスIgレセプター発現細胞の比は、一部はＢ細胞の分化と発展を促進する因子および細胞に対する２集団間の競争のためである。IgレセプターはＢ細胞発達において重要な役割を果たすので、表面上に減少したレベルのIgＭを発現する（マウスIg特異的アンチセンスダウンレギュレーションのため）マウスIgレセプター発現Ｂ細胞も、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだろう。Ｃ．Igκアンチセンストランスジーン構成物次の２つのオリゴヌクレオチド：を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスIgκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた0. 3kbのＰＣＲ産物をAsp718とXho Iで消化し、そしてAsp718／Xho Iで消化したpBC E1中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pKAS1を作製した。p MAS1の精製済NotI挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgκ mRNAとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってpMAS1について上述したのと同様にマウスIgκタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。実施例19 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と免疫応答を証明する。マウスの免疫化１分子あたり400以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシアニン（Calbiochem，La Jolla，California）（KLH-DNP）を以前発表された方法（P ractical Immunology，L．HudsonおよびF.C．Hay，Blackwell Scientific出版，第９頁，1980年）に従ってミョウバン沈澱させた。ミョウバン沈澱させたKLH-DN P400μgを100μｌのリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム100μgと一緒に各マウスに腹腔内注射した。６日後に眼窩後洞出血により血清試料を収集した。血清中のヒト抗体反応性の分析間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）を使って抗体の反応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘモシアニン（Calbiochem）、ハプテンおよび／または修飾アミノ基に対する反応性の同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定にはKLH-ON Pを使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免疫グロブリンとの交差反応性を全く持たない1gＭおよびIgＧサブクラスに特異的な酵素接合体により検出した。簡単に言えば、ＰＢＳ中５μg/mlのタンパク質を37℃にて一晩乾燥することによりマイクロタイタープレートを抗原コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワトリ血清、0.5％ Tween-20中に希釈した血清試料をウエル中で室温にて１時間インキュベートし、次いで同希釈剤中の抗ヒトIgG FcおよびIgG F（ab'）−西洋ワサビペルオキシダーゼまたは抗ヒトIgM Fc−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベートした。室温で１時間後、ABTS基質（Sigma，St．Louis，Missouri）の添加により酵素活性を評価し、30分後に415-490nmで読み取った。トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎖の関与図43は、KLH-DNPによる免疫化に対する３匹の同腹子マウスの応答を表す。第1 296号のマウスは再配列されていないヒトIgＭおよびIgＧトランスジーンを有し、マウスIg重鎖破壊についで同型接合性であった。第1299号のマウスは無破壊の背景上にトランスジーンを有し、1301号のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも遺伝しなかった。別の同腹子である第1297号のマウスはヒトトランスジーンを有し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化対照として実験に組み入れた。結果は、ヒトIgＧとIgＭ応答は両方ともタンパク質への接合という状況においてハプテンに対して発生したことを証明する。ヒトIgＭはKLHに対しても発生したが、この時点では有意なレベルのヒトIgＧは存在しなかった。同じマウスからの免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった。実施例20 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好結果の免疫化および免疫応答を証明し、そしてヒトトランスジーンの可変領域配列中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含んで成る抗体応答の証明この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的円内性（マウス）重鎖生産の欠失をもたらすＪ領域のところへのトランスジーンの導入（前掲）により作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座について同型接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも１つの完全な再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（HCl、前掲）も含み、該トランスジーンは単一の機能的Ｖ_H遺伝子（Ｖ_H251）、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトγ１定常領域遺伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランスジーン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス（前掲）をヒト抗原による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対して免疫応答を生じる能力を有することを証明した。HCl-26系統のマウス３匹とHC l-57系統のマウス３匹（前掲）にヒト抗原を注射した。ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）100μgを不完全フロイントアジュバント中で０日目に注射し、次いで更に７，14，21および28 日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈澱ＣＥＡを毎週注射した。ＣＥＡの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グループ中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。マイクロタイタープレート上に固定化したヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをELISAアッセイにより測定した。ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについてのELISAアッセイの結果をそれぞれ図44および45に示す。７日目までは両系統について有意なヒトμ鎖Ig抗体価が検出され、約21日目まで上昇が観察された。ヒトγ鎖Igについては、有意な抗体価は遅れ、前者がHCl-57系統で14日目そして後者はHCl-26系統で21日目に明らかになった。ヒトγ鎖Igの抗体価は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ig応答は、平坦域に達した後、遅れて発生する上昇し続けるγ鎖応答と組み合わせると、親和性の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的である。21日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモシアニン（KLH）に対する反応性の欠失を示した。これは、抗体応答が特異的な形でＣＥＡに対して向けられたことを指摘する。それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックである動物が、（１）ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク質、ＣＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμからγへのクラススイッチにより例示されるようなイソタイプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ、そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すことを示す。一般に、それらのデータは、（１）ヒトIgトランスジェニックマウスが異種抗体を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジーン重鎖可変領域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、（３）一次および二次応答形成に典型的な時期に渡る応答速度論、（４）IgMから1gGへの、トランスジーンによってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および（５）トランスジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有することを指摘する。ヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座における体細胞変異の証明 HCl トランスジーンの多重コピーを含有するHCl-57系統のトランスジェニックマウスを免疫グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、HCl トランスジーンを含み且つ内因性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前掲）。それらのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（前掲）。それらのマウスのうちの１匹を、1.5カ月の期間に渡る反復腹腔内注射により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、脾臓、鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単離した。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮＡから第一鎖cDNAを合成し、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：を用いてＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。それらのプライマーはVH251/γ１cDNA配列を特異的に増幅する。増幅された配列をXhoIで消化し、ベクターpNNO3中にクローニングした。23個のランダムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図46〜51に示す；生殖細胞配列からの配列変異が指摘され、ドットは配列が生殖細胞と同じであることを示す。VH251 トランスジーンの生殖細胞配列と該cDNA配列との比較は、クローンのうちの３個が完全に未変異であり、他の23個は体細胞変異を含むことを明らかにした。３個の未変異配列のうちの１つは枠外（out-of-frame）ＶＤＪ連結に由来する。特定の位置において観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起こる〔caiら（1992）J．Exp ．Med. 176:1073；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異の総体的頻度は約１％である；しかしながら、CDR1内の頻度は約５％にまで及び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重鎖配列の抗原指令型親和性成熟を証明する。実施例21 この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座トランスジーンを形成する２つの別々のポリヌクレオチドを同時導入することによる、好結果のトランスジーンの形成を証明する。２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーンの作製１．配列されていない機能的Ｖκ遺伝子セグメントvk65.3，vk65.5，vk65.8およびvk65.15の単離Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ−65（5'-agg ttc agt ggc agt g gg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc -3'）を使って、ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laborat-ories，Inc.，Palo Alto，CA）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。陽性ファージクローンからのＶκセグメントを含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。得られたクローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われるクローンを選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む：転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法により単離された４つの異なるプラスミドクローンからの４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメント（vk65.3，vk65.5，vk65.8およびvk65.15）のＤＮＡ配列を図52〜5 5に示す。４つのプラスミドクローンp65.3f，p65.5gl，p65.8およびp65.15f）を下記に説明する。（1 a）p65.3f ファージクローンλ65.3の３kb XbaI断片を、ベクター由来のSal I部位が該挿入断片の３′末端に近位になり且つベクター由来のBamHI部位が該挿入断片の５ ′末端に近位になるようにpUC19中にサブクローニングした。このクローンの３k b BamHI／Sal I挿入断片をpGP1f中にサブクローニングしてp65.3fを得た。（1 b）p65.5gl ファージクローンλ65.5の6.8kb EcoRI断片を、ベクター由来のXho I部位が該挿入断片の５′未端に近位になり且つベクター由来のSalI部位が該挿入断片の３ ′末端に近位になるようにpGP1f中にサブクローニングした。得られたプラスミドをp65.5glと命名した。（1 c）p65.8 ファージクローンλ65.8の6.5kb HindIII断片をpSP72中にクローニングしてp6 5.8を得た。（1 d）p65.15f ファージクローンλ65.16の10kb EcoRI断片をpUC18中にサブクローニングしてプラスミドp65.15.3を作製した。該プラスミド挿入断片中のＶκ遺伝子セグメントを4.6kb EcoRI／HindIII小断片にマッピングし、これをpGP1f中にサブクローニングした。得られたクローンp65.15fは、挿入断片の５′および３′未端にそれぞれユニークXho I部位およびSal I部位が置かれている。２．pKV4 p65.8のXho I／Sal I挿入断片をp65.15fのXhoI部位中にクローニングしてプラスミドpKV2を作製した。p65.5glのXho I／Sal I挿入断片をpKV2のXho I部位中にクローニングしてpKV3を作製した。pKV3のXho I／Sal I挿入断片をp65.3fのXhoI 部位中にクローニングしてプラスミドpKV4を作製した。このプラスミドは、４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメントを含む単一の21kb Xho I／Sal I挿入断片を含有する。Not Iを使って挿入断片全体を切り出すことができる。３．pKC1B （3 a）pKcor ヒトゲノムＤＮＡファージλクローンに由来する２つのXhoI断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である13kbのＪκ２−Ｊκ５／Ｃκ含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてHindIIIで消化されクレノウ処理されたプラスミドpGP1d中にクローニングした。挿入断片の５′末端がベクター由来のCla I部位に近いプラスミドクローン（pK-31）を選択した。第二のXho I 断片である、Ｊκ１を含有する7.4kbのＤＮＡ断片を、３′挿入断片Xho I部位がベクターSal I部位への連結により破壊されるように、Xho I／Sal Iで消化されたpSP72中にクローニングした。得られたクローンp36.2sは、Ｊκ１の4.5kb上流に挿入断片由来のCla I部位、およびＪκ１とＪκ２の間に天然に存在するXho I部位の少し下流にポリリンカー由来のClaＩ部位を含有する。このクローンをCla I消化して4.7kb断片を遊離せしめ、該断片を正しい５′→３′方向において、Cla Iで消化されたpK-31中にクローニングし、全部で５個のヒトＪκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、Ｃκ、4.5kbの５′隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラスミドpKcorは、挿入断片のそれぞれ５′および３′側にユニークな隣接XhoI部位およびSal I部位を含有する。（3 b）pKcorB ヒト３′κエンハンサーを含有する４kb BamHI断片〔Judde，J.G．およびMax, E.E.，Mol．Cell Biol．12:5206（1992）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を、５′未端がベクターのXho I部位に近位になるようにpGP1f中にクローニングした。得られたプラスミドp24BfをXho Iで切断し、pKcorの17.7kb Xh o I／Sal I断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中にクローニングした。得られたプラスミドpKcorBは、該挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユニークXho IおよびSal I部位を含有する。（3 c）pKC1B pKcorBのXhoI／Sal I挿入断片をp65.3fのSal I部位の中にクローニングして軽鎖小遺伝子座トランスジーンプラスミドpKC1Bを作製した。このプラスミドは、５個のＪκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトＣκ、およびヒト３ ′κエンハンサーを含有する。この25kb挿入断片全体をNotI消化により単離することができる。 4．Co4 プラスミドpKV4とpKC1Bからの２つのNotI挿入断片を各々2.5μg/mlの濃度でマイクロインジェクション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランスジーン動物は、２断片が一緒に組み込まれたトランスジーン挿入断片（Co4と命名、図56に示した組換えの生成物）を含有する。pKV4挿入断片の３′の３kbとpKC1B挿入断片の５′ の３kbは全く同じである。幾つかの組み込み現象は３kbの共通配列に渡って２断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Co4は遺伝子座はトランスジェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指令するだろう。本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる。それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限するつもりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更が可能である。本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたかのように、参考として本明細書中に組み込まれる。実施例２２この例は、ヒトＩｇトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖を含みかつ特異的免疫原と反応性をもつモノクローナル抗体を分泌するマウスのハイブリドーマクローンの産生の成功を実証している。ヒト重鎖トランスジーン産物を取込むモノクローナル抗体の生成１．ヒト重鎖トランスジーンを宿すマウスの免疫化内因性重鎖遺伝子（上記実施例２０を参照）のノックアウト（すなわち機能的分断）について同型接合でトランスジーンをコードするヒト重鎖を含むマウスを、精製されたヒトＣＥＡで免疫化し、その後適切な免疫応答期間の後に脾細胞を収穫した。従来の技術を用いて（Kohler及びMilstein，Eur.J.Immunol.，6：511 -519（1976）；Harlow及びLane、「抗体：その究所所マニュアル、Cold Spring Harbor，New York（1988）参照）ハイブリドーマを生成するべく、マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させた。免疫化のために用いられたマウスは、単一の機能的Ｖ_H遺伝子（Ｖ_H251）、ヒトＤ及びＪセグメント、ヒトμ恒常領域、及びヒトγ１恒常領域遺伝子を含むヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを内含していた。それが由来したトランスジェニック系統はＨＣ１ −５７（上記）と呼称された。ミョウバン上で不溶化させた精製ヒトガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（Cyrstal Ch em、シカゴ，IL又はScripps Labs．サンディエゴ，CA）を１００μｇ、完全フロイントアジュバントの中で、０日目に注入し、その後さらに７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈降したＣＥＡを週に一度注入した。さらに２０μｇの可溶性ＣＥＡを８３日目に静脈内で投与し、その後９２日目に、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのミョウバン沈降させたＣＥＡを注入した。骨髄腫細胞と脾細胞の融合に先立って血清試料中に、ＣＥＡに対するヒト重鎖応答を確認した。９５日目に動物を安楽死させ、脾臓を除去し、ポリエチレングリコールを用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ATCC CRL 1580，American Ty pe Culture Collection，Rockville，MD）と融合させた。２週間後、ＥＬＩＳＡによりヒト重鎖μ又はγ恒常領域エピトープを含む、ＣＥＡと特異的に反応する抗体の存在について、融合ウエルからの上清をスクリーニングした。簡単に言うと、２５μg／mlでＰＶＣマイクロタイタープレート上に精製されたヒトＣＥＡをコーティングさせ、これを、ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅｎ、５％のニワトリ血清内で１：４又は１：５に希釈された培養上清と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、その後ひきつづき、ヒトＩｇＧＦｃに対し特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼで接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭＦｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research，West Grove，PA）を付加した。さらに洗浄した後、ＡＢＴＳ基質の付加により、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を確認した。独立した２つの融合ウエルがＣＥＡに対する実質的な結合力をもつ抗体を含んでいることがわかった。クローニングの後、ＥＬＩＳＡにより、ヒトμ鎖及びマウスκ鎖の存在について、両方のハイブリドーマが陽性であることがわかった。類似の検定を用いて、いかなるマウスＩｇＧもＩｇＭも検出されなかった。２つの独立した親ハイブリドーマのサブクローニングの結果、９２−０９Ａ− ４Ｆ７−Ａ５−２及び９２−０９Ａ−１Ｄ７−１−７−１と呼称される２つのクローンが得られた。両方の系統共、ブタペスト条約に基づきＡＴＣＣ特許培養寄託所に寄託され、それぞれＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１３０７及びＨＢ１１３０８を受けた。これらの細胞系統からの培養上清に関し、ＥＬＩＳＡを用いていくつかの精製された標的タンパク質に対する反応性についてテストすることによって、特異性を評価した。図５７に示されているように、さまざまな抗原に対するモノクローナル抗体の反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ検定は、ＣＥＡ及びＣＥＡ関連抗原ＮＣＡ−２のみが有意の反応性を示すことを立証したが、これは、ヘテロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域について制限された反応性の発達を表わしている。実施例２３この例は、ヒトＩｇミニ遺伝子座トランスジーンによりコードされる再配置されたヒトＶＤＪ遺伝子を、キメラヒト／マウスＩｇ鎖をコードするべく例えばトランススイッチメカニズムによって、内因性Ｉｇ恒常領域遺伝子を含む写しとして転写させることができるということを立証している。キメラヒト−マウス重鎖をコードするトランス−スイッチ写しの同定内因性重鎖Ｊセグメント欠失について同型接合の高度免疫されたＨＣ１系統５７のトランスジェニックマウスからＲＮＡを分離させた（上記）。本書に参考として内含されているTaylor et al.（1993）Nucleic ACids Res．20：6287に従ってｃＤＮＡを合成し、以下の２つのプライマを用いてＰＣＲにより増幅した：オリゴヌクレオチドｏ−１４９は、ＨＣ１でコードされた可変遺伝子セグメントＶ_H251に特異的であり、一方ｏ−２４９は、次のような特異性順序でマウス及びヒトの両方のガンマ配列に対しハイブリッド形成する：マウスγ１＝マウスγ２ｂ＝マウスγ３＞マウスγ２ａ≫ヒトγ１ＰＣＲ産物から生成された無作為に選択した１０個のクローンからのＤＮＡ配列を決定し、これらを図５８に示す。２つのクローンが、ヒトＶＤＪ及びマウス γ１を含んでいた；４つのクローンがヒトＶＤＪ及びマウスγ２ｂを含んでいた。又４つのクローンがヒトＶＤＪとマウスγ３を含んでいた。これらの結果は、トランスジェニックＢ細胞の一分画の中で、トランスジーンでコードされたヒトＶＤＪが、クラススイッチ又は類似の組換えにより内因性マウス重鎖遺伝子座内に組換わったということを表わしている。実施例２４この例は、ヒトＩｇ鎖をコードし発現するクローンから、キメラヒト／マウスＩｇ鎖をコードするクローンを弁別するためのハイブリドーマプールのスクリーニング方法について記述する。例えば、Ｊ領域で分断された内因性重鎖遺伝子座について同型接合でありヒトＩｇ重鎖トランスジーンを含むトランスジェニックマウスから作られたハイブリドーマクローンのプールの中で、トランススイッチされたヒトＶＤＪ−マウス恒常領域重鎖をコードするハイブリドーマクローンを、ヒトＶＤＪ−ヒト恒常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンから同定し分離することが可能である。キメラＩｇ鎖を除去するためのハイブリドーマのスクリーニングスクリーニングプロセスには、単独で又は任意には組合わせた形で実施できる次の２つの段階が関与している：（１）予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーン及び（２）ハイブリドーマ候補の二次的分子特徴づけ。好ましくは、ヒトＶＤＪ領域及びヒト恒常領域を発現するハイブリドーマ候補の初期同定のためには、予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーンが用いられる。（例えば、トランスジェニックマウス内での抗体応答を惹起するのに用いられる免疫原などの）抗原との陽性の反応性を示すハイブリドーマを、マウスμ，γ ，κ及びλ及びヒトμ，γ及びκと特異的に反応するモノクローナル抗体のパネルを用いてテストした。ヒト重鎖及び軽鎖に対して陽性でありかつマウス鎖について陰性であるハイブリドーマだけが、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマ候補として同定される。かくして、ハイブリドーマ候補は、特定の抗原との反応性を有し、ヒト恒常領域の特徴であるエピトープを有することがわかる。ＲＮＡをハイブリドーマ候補から分離し、最初のストランドのｃＤＮＡを合成するのに使用する。この最初のストランドのｃＤＮＡを次に、（１本鎖ＤＮＡを連結する）ＲＮＡリガーゼを用いて、予め定められた配列の唯一の１本鎖オリゴヌクレオチドに連結する。連結されたｃＤＮＡを次に、２組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより２つの反応において増幅させる。セットＨ（重鎖）は、（ＥＬＩＳＡの結果に応じて）ヒトμ又はヒトγ１のいずれかへと特異的にアニールするオリゴ、及び、オリゴ−Ｘ配列へとアニールするオリゴを含む。こうして、ヒトミニ遺伝子座内へトランス再配置している可能性のあるマウスＶセグメントを含め、特別なＶセグメントの検出に対抗する偏りが防止される。第２の組のプライマ、つまりセットＬ（軽鎖）は、ヒトκへと特異的にアニールするオリゴと、オリゴ−Ｘへと特異的にアニールするオリゴを含む。ＰＣＲ産物を分子クローニングし、ヒト及びマウスＩｇ配列に対する配列比較に基づいてハイブリドーマが唯一のヒト抗体を産生しているか否かを確かめるため、そのいくつかのＤＮＡ配列を決定する。実施列２５この例は、ヒト軽鎖（κ）ミニ遺伝子座を宿すトランスジェニックマウスの産生を実証する。ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックマウスＫＣ１（上記のようなκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーンョンによるヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリから分離された）ファージクローンからの１３KbのＸｈｏＩＪκ２−Ｋκを含むフラグメントをクレノウ酵素で処理し、ｐＫ−３１を産生するべくｐＧＰ１ｄのクレノウ処理されたＨｉｎｄ III部位にクローニングさせた。これにより、インサートＸｈｏＩ部位が破壊され、唯一のポリリンカー誘導されたＸｈｏＩ部位は」κ２の隣りの５′末端に位置づけされた。唯一のポリリンカー誘導されたＣｌａＩ部位をこのＸｈｏＩ部位とインセット配列の間に位置設定し、一方唯一のポリリンカー誘導されたＳａｌＩ部位をインサートの３′末端に位置設定する。Ｊκ１及び上流配列を含む７．５kbのＸｈｏＩフラグメントも同様に、（上述のようにκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによりヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリーから分離された）ヒトゲノミックＤＮＡファージクローンから分離した。この７．５kbのＸｈｏＩフラグメントをｐＳＰ７２（Promega，Madison，Wisconsin）のＳａｌＩ部位内にクローニングさせ、かくして両方のＸｈｏＩ部位を破壊し、Ｊκ１の３′にポリリンカーＣｌａＩ部位を位置づけた。結果として得られたクローンをＣｌａＩで消化させると、上流配列を４．５kbとＪκ１を含む４．７kbのフラグメントが放出された。この４．７kbのフラグメントをｐＫ−３１のＣｌａＩ部位内にクローニングさせ、ｐＫｃｏｒを作り出した。残りの唯一の５′ＸｈｏＩ部位をポリリンカー配列から誘導する。再配置されていないヒトＶκIII遺伝子セグメント６５．８（プラスミドｐ６５．８、実施例２１）を含む６．５kbのＸｈｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡフラグメントをｐＫｃｏｒのＸｈｏＩ部位内にクローニングしてプラスミドｐＫＣ１を生成させた。ｐＫＣ１のＮｏｔＩインサートを１／２日目のマウス胎児内に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。２つの独立したｐＫＣ１誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣ１−６７３及びＫＣ１−６７４は、サザンブロットハイブリダイゼーンョンにより、それぞれトランスジーンのおよそ１及び１０〜２０のコピーの組込みを含むものとして見積られた。ＫＣ１ｅマウス及びヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを両方共含む２．３kbのインサートを切除するため、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIを用いてプラスミドｐＭＨＥ１（実施例１３及び１８）を消化した。このフラグメントをクレノウ処理し、ＳａｌＩリンカー（NeW Bngland Biolabs，Beverly，Massachusetts）に連結させ、ｐＫＣ１の唯一の３′ＳａｌＩ部位の中にクローニングさせてプラスミドｐＫＣ１ｅを生成した。ｐＫＣ１ｅのＮｏｔＩインサートを１／２日目のマウス胎児に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。４つの独立したｐＫＣ１ｅ誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに使用した。これらの系統ＫＣ１ｅ−１３９９，ＫＣ１ｅ−１４０３，ＫＣ１ｅ−１５２７及びＫＣ１ｅ−１５３６は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約２０〜５０，５〜１０，１〜５及び３〜５のコピーの組込みを含むものであると見積られた。ｐＫＣ２再配置されていないヒトＶκIII遺伝子セグメント６５．５（プラスミドｐ６５．５ｇｌ、実施例２１）を含む６．８kbのＸｈｏＩ／ＳａｌＩＤＮＡフラグメントをｐＫＣ１の唯一の５′ＸｈｏＩ部位内にクローニングしてプラスミドｐＫＣ２を生成した。このミニ遺伝子座トランスジーンは、２つの異なる機能的Ｖ κIII遺伝子セグメントを含む。１／２日目のマウス胎児の中にｐＫＣ２のＮｏｔＩインサートを微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。５つの独立したｐＫＣ２誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座の両方を含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣ２−１５７３，ＫＣ２−１５７９，ＫＣ２−１５８８，ＫＣ２−１６０８及びＫＣ２− １６１０は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約１〜５，１０〜５０，１〜５，５０〜１００及び５〜２０のコピーの組込みを含むものと見積られた。実施例２６この例は、ヒトκトランスジーンを支持するトランスジェニックマウスが、機能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成する抗原誘発された抗体応答を発生させることができるということを示している。ヒトＩｇκ軽鎖と結びつけられた抗体応答ＨＣ１−５７ヒト重鎖及びＫＣ１ｅヒトκトランスジーンを含むトランスジェニックマウスを精製されたヒト可溶性ＣＤ４（ヒト糖タンパク質抗原で免疫化した。ポリスチレンラデックス粒子（Polysciences，Warrington，PA）に対する接合（コンジュゲーション）により不溶化された精製ヒトＣＤ４（NEN Researchの製品、Westwood，MA）を２０μｇ、０日目にジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（Cal bio chem，San Oiego，CA）を伴う食塩水中で腹腔内注射し、その後２０日目及び３４日目にさらに注射を行なった。２５日目と４０日目に眼窩後方出血をとり、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＭ又はヒトＩｇＧ重鎖を含むＣＤ４に対する抗体の存在についてスクリーニングした。簡単に言うと、ＰＶＣのマイクロタイタープレート上に２．５μｇ／mlで精製されたヒトＣＤ４をコーティングし、ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％のニワトリ血清中で１：４／１：５に希釈された培養上清と共にインキュベートさせた。プレートを洗浄し、その後、ヒトＩｇＧＦｃに特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭＦｃ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research，Westr Grove，PA）を付与した。ＡＢＴＳ基質の付加によるさらなる洗浄後に、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を見極めた。両方の出血において、抗原との反応性をもつヒトμを検出したが、γ反応性は基本的に検出不能であった。４０日目に、ヤギ抗ヒトκペルオキシダーゼ接合体（Sigma，St.Louis，MO）での同じ検定を用いて抗原反応性ヒトκ鎖についても試料をテストした。この時点でＣＤ４を結合するκ反応性が検出された。検定の結果は、図５９に示されている。実施例２７この例は、機能的に分断されたマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座（重鎖及びκ鎖遺伝子座）について同型接合であり、しかも、機能的ヒト重鎖及び機能的ヒト軽鎖をコードするべく産生的に再配置することのできるヒト軽鎖トランスジーンとヒト重鎖トランスジーンを並行して宿すマウスの生成の成功を示している。このようなマウスは「００１１」マウスと呼ばれ、ここで最初の２ケタの２つのゼロはこのマウスに機能的な重鎖及び軽鎖遺伝子座が欠如していることを表わし、次の２ケタの１は、このマウスがヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンについて半接合であることを表わしている。この例は、かかる００１１マウスに予め定められた抗原に対する特異的抗体応答を発生させる能力があること、又かかる抗体応答にアイソタイプスイッチが関与しうることを示している。００１１／００１２マウス：内因性Ｉｇノックアウト＋ヒトＩｇトランスジーン上述のＨＣ１−２６トランスジェニックマウス系統といったヒトＨＣ１トランスジーンも宿し、機能的Ｊ_H領域が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座（ＪＨＤ＋＋又はＪＨ△＋＋と呼ばれる）について同型接合であったマウスを、機能的Ｊ_H領域の欠如した機能的に分断された内因性カッパ鎖遺伝子座（ここではＪＫＤ＋＋又はＪＫ△＋＋と呼ばれる、図９参照）についで同型接合のマウスと同系交配させて、ＪＨＤ＋＋／ＪＫＤ＋＋と呼ばれるＨＣ１トランスジーンを含む機能的に分断された重鎖及びカッパ鎖遺伝子座（重領／カッパ鎖ノックアウト）について同型接合のマウスを産生した。かかるマウスを、同系交配により産生させ、ゲノミックＤＮＡのサザンブロットにより評価されるとおりの遺伝子型に基づいて選択した。ＨＣ１−２６＋／ＪＫＤ＋＋／ＪＨＤ＋＋マウスと呼ばれるこれらのマウスを、ヒトカッパ鎖トランスジーンを宿すマウス（系統ＫＣ２−１６１０，ＫＣ１ｅ−１３９９及びＫＣ１ｅ−１５２７；実施例２５参照）と同系交配させ、機能的に分断された重鎖及び軽鎖遺伝子座について同型接合でしかもＨＣ１トランスジーン及びＫＣ２又はＫＣ１ｅトランスジーンについて半接合である子孫マウスを同定するのに、ゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析を用いた。このようなマウスは番号で呼称され、以下の略号を用いてその遺伝子型に関して同定された：すなわち、ＨＣ１−２６＋はＨＣ１−２６系統のヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン組込みに対する半接合を表わし；ＪＨＤ＋＋はＪ_Hノックアウトに対する同型接合を表わし；ＪＫＤ＋＋はＪκノックアウトに対する同型接合を表わし；ＫＣ２−１６１０＋は、系統ＫＣ２−１６１０の場合と同じように組込まれたＫＣ２ヒトκトランスジーンについての半接合を表わし；ＫＣ１ｅ −１５２７＋は、系統ＫＣ１ｅ−１５２７の場合と同じように組込まれたＫＣ１ｅヒトκトランスジーンについての半接合を表わし；ＫＣ１ｅ−１３９９＋は、系統ＫＣ１ｅ−１３９９の場合と同じように組込まれたＫＣ１ｅヒトκトランスジーンについての半接合を表わす。結果として得られた個々の子孫には各々数字で表わした呼称（例えば６２９５，６９０７など。）が与えられ、各々Ｊ_Hノックアウト対立遺伝子、Ｊκノックアウト対立遺伝子、ＨＣ１−２６トランスジーン及びκトランスジーン（ＫＣ２又はＫＣ１ｅ）の存在について評価され、各遺伝子座において半接合（＋）又は同型接合（＋＋）のいずれかであることが決定された。表１０は、子孫マウスのいくつかの番号呼称、性別及び遺伝子型を示している。我々は、生後６週間の雌マウスから脾臓をとり出した。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、マウス＃７６５５は、ＨＣ１（系統２６）及びＫＣ２（系統１６１０）トランスジーン取込みについて半接合であり、マウスμ及びκ Ｊ領域のＪＨ△及びＪκ△ターゲティングされ欠失について同型接合であることが見極められた。マウス＃７６５６は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、ＫＣ２（系統１６１０）トランスジーン組込みについて半接合でありマウスμ及びκＪ領域のＪＨ△及びＪκΔターゲッティングされた欠失について同型接合であることが見極められた。マウス＃７７７７は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、マウスμ及びκＪ領域のＪＨ△及びＪκ△ターゲティングされた欠失について半接合であると見極められた。これらの欠失が劣性であることから、このマウスは表現型上野生型であるはずである。００１１マウスにおける内因性Ｉｇ鎖の発現（１）野生型マウス（７７７７）、（２）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン（７６５６）を宿す０００１マウス及び（３）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン及びヒト重鎖トランスジーン（７６５５）を宿す００１１マウスから外植されたリンパ球を選別するため、ヒトμ、マウスμ、ヒトκ、マウスκ、又はマウスλのいずれかと反応性ある抗体のパネルを用いたＦＡＣＳ分析を使用した。我々は、Mishell及びShiigi（Mishell，B.B．& Shiigi.S.M．（eds）細胞免疫学における選択された方法。W.H.Freeman & Co.，New York，1980）により記述されているように、脾臓から単細胞懸濁液を調製し、ＮＨ₄Ｃｌで赤血球を溶解させた。リンパ球を以下の試薬で染色する：ヨウ化プロピジウム（分子プローブ、Eugene，OR）、ＦＩＴＣ接合された抗ヒトＩｇＭ（クローンＧ２０−１２７； Pharmingen，サンディエゴ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＭ（クローンＲ６−６０．２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、フィコエリトリン接合された抗ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Cal Tag，サウスサンフランシスコ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharming en，サンディエゴ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２：Pharmingen，サンディエゴ，CA）。我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロ−血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Bect on Dickinson，サンホゼ，CA）を用いて染色された細胞を分析した。マクロファージ及び残留赤血球を、前方及び側方散乱をゲート・オンすることにより排除する。死濁細胞は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲート・アウトすることにより排除する。図６０及び図６１のフローサイトメトリーデータは、サザンブロットハイブリダイゼーションデータを確認し、マウス＃７６５５がヒト μ及びヒトκの両方を発現し、あったとしても比較的わずかなマウスμ又はマウスκを発現することを実証している。それでも、Ｂ細胞の有意な分画（約７０〜８０％）がヒト重鎖及びマウスλ軽鎖から成るハイブリッドＩｇレセプターを発現すると思われる。図６０は、細胞表面上でヒトμ又はマウスμを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトμに対し陽性であるが、相対的にマウスμが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は、多くのヒトμ又はマウスμを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウス μを発現するが、ヒトμが欠如している。図６１は、細胞表面上でヒトκ又はマウスκを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトκについで陽性であるが、相対的マウスκが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は多くのヒトκ又はマウスκを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスκ を発現するが、ヒトκが欠如している。図６２は、細胞表面上でマウスλを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はマウスλについて陽性である；０００１マウス（７６５６）リンパ球は、有意なマウスλを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスλを発現するが、００１１マウス（７６５５）に比べ相対的に低いレベルにある。図６３は、ヒトκ（トランスジーンでコードされたもの）に比べての内因性マウスλについて陽性のＢ細胞の相対的分布を示す。左上の図版は、機能的内因性重鎖及び軽鎖対立遺伝子を有しヒトトランスジーン（単複）が欠如している野生型マウスからの細胞の結果を示す；細胞はマウスラムダについて陽性である。右上の図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ＋＋）を有しＫＣ１ｅ− １３９９系統のヒトκトランスジーンの組込みを宿すマウス（＃５８２２）からの細胞を示す；細胞は、おおまかに比例する量でヒトκ又はマウスλについて陽性である。左下図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ＋＋）を有しＫＣ２− １６１０系統のヒトκトランスジーン組込みを宿すマウス（＃７１３２）からの細胞を示す：ヒトκに対してよりマウスλに対してより多くの細胞が陽性であり、ＫＣ２−１６１０トランスジーン組込みがＫＣ１ｅ−１３９９トランスジーン組込みほど効率が良くないということを表わしている可能性がある。右下図版は、ヒトκミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）を宿し機能的内因性マウスκ 対立遺伝子が欠如しているマウスからの細胞を示す。図６３に示されているデータは同様に、トランスジーン間の表現型の可変性をも実証している。かかる可変性は、組込まれたトランスジーンの結果もたらされる単数又は複数の表現型上の特徴（例えばアイソタイプスイッチ、高レベル発現、低マウスＩｇバックグラウンド）を発現する個々のトランスジーン及び／又はトランスジェニック系統について選択するのが望ましいことであるということを表わしている。一般に、（１）トランスジーン、（２）トランスジーン組込みの部位、及び／又は（３）遺伝的背景により異なっている多数の個別のトランスジェニック系統を形成するため、別々に単一又は多数のトランスジーン種（例えばｐＫＣ１ｅ，ｐＫＣ２，ＫＣｏ４）が利用される。次のような望ましいパラメータについて個々のトランスジェニック系統を検査する：（１）予め定められた抗原に対する免疫応答を高める能力、（２）トランスジーンでコードされた恒常領域内のアイソタイプスイッチの頻度及び／又は内因性（例えばマウス）Ｉｇ恒常領域遺伝子に対するトランススイッチの頻度、（３）トランスジーンでコードされた免疫グロブリン鎖及び抗体の発現レベル、（４）内因性（例えばマウス）免疫グロブリン、免疫グロブリン配列の発現レベル、及び（５）産生的ＶＤＪ及びＶＪ再配置の頻度。標準的には、トランスジーンでコードされる（例えばヒト）免疫グロブリン鎖を最大濃度で産生するトランスジェニック系統が選択される：好ましくは、選択された系統は、トランスジェニック動物の血清中で少なくとも約４０μｇ／mlのトランスジーンコードされた重鎖（例えばヒトμ又はヒトγ）及び／又は少なくとも約１００μｇ／mlのトランスジーンコードされた軽鎖（例えばヒトκ）を産生する。マウスの免疫化を受けていない血清及び特異的抗原つまりヒトＣＤ４での免疫化の後の血清の中のヒト及びマウス免疫グロブリン鎖の発現について、マウスを検査した。図６４はさまざまな遺伝子型の別々の４匹の免疫化を受けていない００１１マウスの血清の中に存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒト κ、マウスκ及びマウスλ鎖の相対的発現を示している（ｎｔ＝テストせず）；ヒトκが最も豊富な軽鎖として優勢であり、ヒトμ及びマウスγ（推定上はトランススイッテの産物）が最も豊富な重鎖であるが、系統間で可変性が存在しており、このことは、ヒト鎖の発現を可能にしながらマウス鎖の発現を最小限にする有利な遺伝子型組合せを同定するための選択段階の有用性を表わしている。マウス＃６９０７及び７０８８は、ヒトμからヒトγへのアイソタイプスイッチ（トランスジーン内のシス・スイッチ）を示している。図６５は、さまざまな００１１遺伝子型のマウス内のヒトμ（ｈｕμ）、ヒト γ（ｈｕγ）、ヒトκ（ｈｕκ）、マウスμ（ｍｓμ）、マウスγ（ｍｓγ）、マウスκ（ｍｓκ）、及びマウスλ（ｍｓλ）についての血清免疫グロブリン鎖レベルを示している。００１１マウス内の特異的抗体応答００１１マウス（＃６２９５）を、次の免疫化計画に従って免疫原性用量のヒトＣＤ４を用いて免疫化した：０日目、ＣＤ４マウス免疫血清１００μｌの腹腔内注入；１目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する；１５日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する；２９日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤＡ（American Bio-Tech）を注入する；４３日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する。図６７は、抗ＣＤ４応答におけるヒトμ、ヒトκ及びヒトγ鎖の存在を立証する３週間目及び７週間目のＣＤ４免疫化に対する相対的抗体応答を示す。ヒトγ 鎖は、７週間目の血清中で著しく増大した発生量で存在し、野生型動物におけるアイソタイプスイッチのものと似た時間的関係で重鎖トランスジーン内でのシス −スイッチ（アイソタイプスイッチ）が発生していることを表わしている。図６８は、さまざまなヒト重鎖及び軽鎖トランスジーンの概略的寄せ集めを示す。実施例２８この例は、マウスλ軽鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。マウスラムダ軽鎖遺伝子座のターゲティングされた失活Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスＶλＪλ及びＣλ遺伝子セグメントは、５′→３′アレイの形に配置された３つのグループにまとめられておらず、その代りに散在させられている。最も５′の部分は２つのＶセグメント（Ｖλ２及びＶλＸ）で構成されており、これら２つのセグメントの後には、３′方向に続行して各々独自のＪセグメント（Ｊλ２Ｃλ２及び偽遺伝子Ｊλ４Ｃλ４）と結びつけられた２つの恒常領域エキソンが続いている。次にくるのは最も広く用いられるＶセグメント（Ｖλ１）であり、このセグメントの後には恒常領域エキソンの第２のクラスター（Ｊλ３Ｃλ３及びＪλ１Ｃλ１）が続いている。全体として、遺伝子座は約２００kbにまたがり、２つのクラスター間の間隔は〜２０〜９０Kbである。ラムダ遺伝子座の発現には、優越してＪλ２までのＶλ２又はＶλＸの再配置そして稀にのみＪλ３又はＪλ１に対してさらに３′の再配置が関与する。Ｖλ １はＪλ３及びＪλ１の両方と組換え可能である。かくして、遺伝子座の組換え及び発現を充分に削除するため、ラムダ遺伝子座を突然変異させることが可能である。２つのラムダ遺伝子クラスターの間の距離は、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を失活させる上で用いられたとおりに、単一のち密なターゲッティングされた欠失の生成を介して遺伝子座の発現を失活することを困難にする。その代り、発現ラムダ軽鎖を削除することになる小さい単一の欠失は、Ｊλ２Ｃλ２からＪλ１Ｃλ１までに広がる約１２０kbにまたがっている（図６９）。こうしてラムダ恒常領域エキソンの全てならびにＶλ１遺伝子セグメントが除去され、遺伝子座の失活が確保される。欠失された１２０kbがＰＧＫ発現カット内で選択可能な標識遺伝子ｎｅｏと置換されている、置換型ターゲティングベクター（Thomas及びCapecehi（1987）前掲書中）が構築される。このマーカーは、ラムダ遺伝子座に対する相同性を提供するため欠失にフランキングするゲノミックラムダ配列内に埋め込まれており、同様に、ベクターを相同的に組込んだ細胞についての富化を可能にするため、相同性領域の１つの端部にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むこともできる。ターゲティングされている染色体ＤＮＡに対し同質遺伝子型のターゲティングベクターの使用が相同組換えの効率を増強することが報告されていることから、ラムダ遺伝子座ゲノミッククローン配列は、ターゲティングされているＥＳ系統と同質遺伝子型の系１２９／Ｓｖゲノミックファージライブラリのスクリーニングによって得られる。ラムダ遺伝子座に対する相同性の長さで相異のあるターゲティングベクターが構築される。第１のベクター（図７０中のベクター１）は、合計約８〜１２kbのラムダ遺伝子座配列によりフランキングされた標識遺伝子を含む。置換ベクターが数kbのＤＮＡの付加又は検出を媒介するターゲティング事象については、これは、充分以上の相同性範囲であることが実証されてきた（Hasty et al．（1991 ）、前掲書中；Thomas et al.（1992）前掲書中）。フランキングラムダ配列をさらに約４０〜６０kb伴うベクターも又構築される（図７０中のベクター２）。少なくとも８０KbのヒトＩｇミニ遺伝子座が日常的にクローニングされ、プラスミドベクターｐＧＰ１の中で増殖される（Taylor et al.（1993）前掲書中）ラムダ遺伝子座の失活のための代替的なアプローチでは、同じＥＳ細胞内において、例えば２つの恒常領域クラスター又は２つのＶ領域遺伝子座の突然変異といった２つの独立した突然変異が利用される。恒常領域が両方共各々ＤＮＡの〜６kb内に内含されているのに対しＶ遺伝子座の１つは〜１９kbにまたがっていることから、ターゲティングベクターはＪλ２Ｃλ２／Ｊλ４Ｃλ４及びＪλ３Ｃλ３／Ｊλ１Ｃλ１遺伝子座を独立して欠失するように構築される。図７０に示されているように、各々のベクターは、各欠失にフランキングする合計〜８〜１２Kbのラムダ遺伝子座ゲノミックＤＮＡによりとり囲まれた、ＰＧＫ発現カセット円の選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ又はｐａｃ）から成る。陽性−陰性選択による相同組換え事象のため富化するべく、ターゲティングベクターに対し、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を付加することが可能である。恒常領域遺伝子のうちの１つの欠失を支持するクローンが生成されるように、ＥＳ細胞を２つのベクターで逐次的にターゲッティングさせる。次にこれらのクローンを２つのベクターで逐次的にターゲティングさせて、恒常領域遺伝子座の１つの欠失を支持するクローンが生成されるようにし、その後これらのクローンを残りの機能的恒常領域クラスターの欠失を生成するべくターゲティングさせる。両方のターゲティング事象がかくして同じ細胞に対し向けらられていることから、２つのターゲティングのために異なる選択可能なマーカーを使用することが好ましい）。図７０に示されている概略的な例においては、ベクターのうち一方はｎｅｏ遺伝子を含み、もう一方はｐａｃ（ピュロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいる。第３の潜在的に優性な選択可能マーカーは、ｈｙｇ（ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ）遺伝子である。ｐａｃ及びｈｙｇ遺伝子は両方共、Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座の中にｎｅｏ遺伝子座をターゲティングするためにうまく使用されるＰＧＫ発現構成体の中に挿入され得る。２つのラムダ恒常領域クラスターは密に連鎖されるされていることから、２つの突然変異が同じ染色体上にあることが重要である。好ましくは独立した２つのターゲディング事象により同じ対立遺伝子を突然変異させる確率は５０％あり、突然変異の連鎖は、２重にターゲティングされたＥＳ細胞から誘導されたキメラの繁殖（交配）中のその同時分離により確立される。実施例２８この例は、マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた失活ＥＳ細胞内での遺伝子ターゲティングによりマウス重鎖遺伝子座恒常領域遺伝子のうちの少なくとも１つ好ましくは実質的に全てを欠失するために、図９１に示された構造をもつ相同組換え遺伝子ターゲティングトランスジーンを使用する。図９１は、ターゲティングトランスジーンの全体的概要図を示す。セグメント（ａ）は、欠失されるべき恒常領域遺伝子（単複）の上流にある（すなわちＪ_H 遺伝子に近接する）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列である；セグメント（ｂ）は、ｐｇｋ−ｎｅｏといった正の選択マーカーを含み；セグメント（ｃ）は欠失すべき恒常領域遺伝子（単複）の下流にある（すなわち恒常領域遺伝子（単複）及びＪ_H遺伝子に対し遠位にある）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列である；又任意のものであるセグメント（ｄ）は、負の選択マーカー遺伝子（例えばＨＳＶ−ｔｋ）を含む。図７１は、「免疫グロブリン遺伝子」、Honj o T．Alt,FW及びRabbits TH（eds）Academic Press，NY（1989）p129からとったマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。ターゲティングトランスジーンは、図９１に従った構造を有し、ここで（１）（ａ）セグメントは、クローンＪＨ８．１の１１．５kbのインサート（Chen eta l.（1993）Int,Immunol. 5：647）又は、マウスＣμ遺伝子の上流にある少なくとも約１〜４kbの配列を含む同等の部分であり、（２）（ｂ）セグメントは上述のとおりのｐｇｋ−ｎｅｏであり、（３）（ｃ）セグメントは、５′−gtg ttg cgt gta tca gct gaa acc tag aaa cag ggt gac cag−３′という配列をもつ末端標識づけされたオリゴヌクレオチドでマウスゲノミッククローンライブラリをスクリーニングすることにより分離されたマウスＣα遺伝子のファージクローンから分離された４〜６kbのインサート又は図７２に示された１６７４bpの配列を含んでおり、（４）（ｄ）セグメントは上述のＨＳＶ−ｔｋ発現カセットを含んでいる。代替的には、第１のターゲティングが相同性領域すなわち恒常領域遺伝子（単複）、第１種の正の選択マーカー遺伝子（ｐｇｋ−ｎｅｏ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフランキングする配列に相同なセグメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる、単数又は複数の重鎖恒常領域遺伝子の段階的欠失を実施する。かくして、（ａ）でグメントは、Ｃγ３の上流にある領域に相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントはＣγ２ａの上流にある領域に対して相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができる。このターゲティングトランスジーンはＣγ３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遺伝子を欠失させる。この第１のターゲティングトランスジーンはＥＳ細胞内に導入され、適正にターゲティングされた組換え体が選択され（例えばＧ４１８で）、適正にターゲティングされたＣ領域欠失を生み出す。次にＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失について負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵで）。結果として得られる適正にターゲティングされた第１図のＣ欠失組換え体は、Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遺伝子が欠如した重鎖遺伝子座を有する。第２のターゲティングトランスジーンは、相同性領域すなわち、恒常領域遺伝子（単複）、第１の種とは異なる第２種の正の選択マーカー遺伝子（例ｇｐｔ又はｐａｅ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフランキングする配列と相同なセグメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる。かくして、（ａ）セグメントは、Ｃ εの上流にある領域に対し相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントは、Ｃαの上流にある領域に相同で少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができる。このターゲティングトランスジーンはＣε及びＣα遺伝子を欠失させる。この第２のターゲティングトランスジーンは、第１のターゲティング事象から得られた適正にターゲティングされたＣ−領域組換え型ＥＳ細胞の中へ導入される。第２のノックアウト事象のために適正にターゲティングされている（すなわち第２のターゲティングトランスジーンでの相同組換えによる）細胞は、第２種の正の選択マーカー遺伝子に特異的な選択薬剤（例えば、ｇｐｔについて選択するためのミコフェノール酸；ｐａｃについて選択するためのピュロマイシン）を用いて選択される。その後、ＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失についての負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵを用いて）。結果として得られるこれらの適正にターゲティングされた第２回目のＣ領域組換え体は、Ｃγ３，Ｃγ１，Ｃγ２ｂ，Ｃγ２ａ，Ｃε及びＣα遺伝子が欠如した重鎖遺伝子座を有する。単数又は複数のＣ領域遺伝子が欠如した適正にターゲティングされた第１回又は第２回目の組換え型ＥＳ細胞を、上述のとおり、胚盤胞注入のために使用し、キメラマウスを産生する。ターゲティングされた重鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝播が樹立され、結果として得られた創立者マウスの繁殖（交配）を行なってＣ領域ノックアワトに対して同型接合のマウスを生成する。このようなＣ領域ノックアウトマウスは、Ｊ_Hノックアワトマウスに比べていくつかの利点を有する：− 例を挙げると、Ｃ領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランスジーンと内因性重鎖遺伝子座恒常領域の間のトランススイッチを受ける能力が低下しており（又はこの能力が完全に欠如している）、かくしてトランスジェニックマウス内のキメラヒト／マウス重鎖の頻度を減少している。μ及びデルタも同様に頻繁に相同ターゲティングによって欠失させられているものの、マウスガンマ遺伝子のノックアウトが好まれる。内因性マウス重鎖遺伝子座内のその他のターゲティングされた病巣と合わせて、Ｃ領域ノックアウトを行なうことが可能である：中でも、マウス重鎖遺伝子座の産生的ＶＤＪ再配置を排除するため及びヒト重鎖トランスジーンとマウス重鎖遺伝子座の間のトランススイッチを排除又は削減するために、Ｊ_HノックアウトとＣ領域欠失を組合わせることが可能である。いくつかの実施態様については、内因性重鎖遺伝子座の単数又は複数のＣ領域遺伝子が特定的に欠如しているもののその他のいくつかのＣ領域遺伝子を保持しているマウスを産生することが望ましい可能性がある。例えば、キメラヒト／マウスＩｇＡが有利な表現型を付与し実質的にマウスの望ましい有用性と干渉しない場合、このＩｇＡのトランススイッチによる産生を可能にするべくマウスＣα遺伝子を保持することが好ましい可能性がある。実施例２９この例は、ヒトトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスから得られるリンパ球試料からの内因性（マウス）免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビボ枯渇を実証する。マウスＩｇを発現するリンパ球は、トランスジーン（単複）によりコードされるヒト免疫グロブリンに対する実質的結合力が欠如している抗マウス免疫グロブリン抗体に対する特異的結合により選択的に枯渇される。マウスＩｇ−発現Ｂ細胞の半ビボ枯渇ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＨＣ２）及びヒト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）に対して同型接合のマウスをＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）同系繁殖マウスと繁殖（交配）させ、２２１１マウス（すなわち、機能的内因性マウス重鎖遺伝子座に対し同型接合で、機能的内因性マウス軽鎖遺伝子座に対し同型接合で、かつヒト重鎖トランスジーンの１つのコピーとヒト軽鎖トランスジーンの１つのコピーを有するマウス）を得る。かかる２２１１マウスは同様にＢ６主要及び非主要組織適合抗原をも発現する。これらのマウスを、免疫原性用量の抗原でプライミングさせ、約１週間後に脾細胞を分離させる。標準的方法（Wyso ckiet al.（1978）Proc.Natl.Acad.Sci．（U.S.A.）75；28 44；MACS磁気細胞選別、Miltenyi Biotec Inc，Sunnyvale，CA）に従った固相連結された抗体依存型細胞分離及び、それに続く、マウスＩｇに関し陽性の残留細胞を実質的に除去するための抗体依存型補体媒介の細胞溶解（「細胞免疫学における選択された方法」、Mishell BB及びShiigi SM（eds），W.H.Freeman and C ompany，New York，1980，p211〜212）によって、マウスＩｇに関して陽性のＢ細胞を除去する。枯渇された試料中の残りの細胞（例えば、ヒトＩｇについて陽性なＢ細胞、Ｔ細胞）を、好ましくは発生するＢ細胞に対する付加的な抗マウスＩｇ抗体と合わせて、ＳＣＩＤ／Ｂ６又はＲＡＧ／Ｂ６マウスに静脈内注射する。再構成されたマウスを次に、さらに抗原に対し免疫化させ、ハイブリドーマクローンを産生するための抗体及び親和力の成熟した細胞を得る。実施例３０体細胞キメラ内の完全にヒトの抗体の産生体細胞キメラマウス内で完全にヒトの抗体を産生するための方法が記述される。これらのマウスは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖トランスジーンを有し、機能的マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子が欠如した胚幹（ＥＳ）細胞を、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２欠損マウスからの胚盤胞の中に導入することによって生成される。ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２欠損マウス（Mombaerts et al.（1992）Cell 68: 869；Shinkai et al.（1992）Cell 68：855）には、ＶＤＪ再配置を開始しＩｇｓをコードする遺伝子セグメント及びＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を組立てることができないため、マウスＢ及びＴ細胞が欠如している。Ｂ及びＴ細胞の産生におけるこの欠陥は、ＲＡＧ−２欠損動物から誘導された胚盤胞内への野生型ＥＳ細胞の注入によって補完できる。結果として得られたキメラマウスは、注入されたＥＳ細胞から完全に誘導された成熟したＢ及びＴ細胞を産生する（Chen et al（ 1993）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90：4528）。キメラのＢ及び／又はＴ細胞全ての中に、規定の突然変異及び／又は外因性ＤＮＡ構成体を導入するために、注入されたＥＳ細胞の遺伝子操作を使用する。Ch en et al.（1993）,Proc.Natl.Acad.Sci．USA 90：4528-4532）ＲＡＧ胚盤胞内に注入された時点で、Ｂ細胞が無い状態でＴ細胞を作るキメラを産生した、Ｉｇ重鎖遺伝子座の同型接合失活を有する生成されたＥＳ細胞（原文不明瞭）。突然変異体ＥＳ細胞内への再配置されたマウス重鎖のトランスフェクションの結果、Ｂ細胞の発達が救われ、キメラ内でＢ細胞及びＴ細胞の両方が再生されることになる。マウスＩｇ重鎖又はカッパ軽鎖の合成が無い状態で完全にヒトの抗体を発現するキメラマウスを生成することが可能である。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の両方の失活について同型接合であるＥＳ細胞の中に、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖構成体を導入する。このときＥＳ細胞を、ＲＡＧ２欠損マウスから誘導された胚盤胞の中に注入する。結果として得られるキメラは、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子を発現することはできないもののヒトＩｇ遺伝子は発現する注入されたＥＳ細胞から排他的に誘導されたＢ細胞を含んでいる。免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の失活について同型接合のＥＳ細胞の生成それぞれ既知の手順に従った（Chen et al（1993）EMBO J．12：821；及びChe n et al.（1993）Int.Immunol. 前掲書中）、ＥＳ細胞内でのＩｇＪ_H及びＪκ／Ｃκ配列のターゲティングされた欠失により、失活されたＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を支持するマウスを生成した。２つの突然変異体系のマウスを合わせて繁殖させて、両方のＩｇ遺伝子座の失活について同型接合の系を生成した。この２重突然変異体の系を、ＥＳ細胞の誘導のために使用した。使用されたプロトコルは、基本的に、Robertsonにより記述されたものであった（１９８７、「奇形ガン腫及び胚幹細胞；１つの実践的アプローチ」中。 p71〜112。E.J.Robertson編、ＩＲＬプレス）。簡単に言うと、同系接合の２重突然変異体マウスの自然交配により、胚盤胞が生成された。受胎した雌を妊娠２．５日目に卵巣摘出し、妊娠７日目に子宮から「遅延した」胚盤胞を洗い流し、支持細胞上で培養して、それらの未分化状態の維持を助けた。その形態で同定できる胚盤胞の内部細胞質量からの幹細胞をとり出し、解離させ、支持細胞上で継代させた。正常な核型をもつ細胞を同定し、雄細胞系統は、キメラを生成しマウスの生殖細胞に寄与するその能力についてテストされることになる。雄キメラははるかに多くの子孫を産生できることから、雌系統よりも雄ＥＳ細胞の方が好ましい。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖欠損ＥＳ細胞内へのヒト１ｇ遺伝子の導入ＨＣＳ及びＫＣ−ＣＯ４といったミニ遺伝子座構成体又はＪ１．３ＰといったＹＡＣクローンのいずれかとして、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を突然変異体ＥＳ細胞内に導入する。ヒトＩｇＤＮＡでのＥＳ細胞のトランスフェクションを、電気穿孔又は陽イオン脂質でのリポフェクションといった技術によって行なう。ヒトＤＮＡを取込んだＥＳ細胞の選択を可能にするため、選択可能マーカーを構成体に連結させるか又はＥＳ細胞へと構成体と同時トランスフェクションさせる。突然変異体ＥＳ細胞は、Ｉｇ遺伝子失活を生成した遺伝子ターゲディング事象の結果としてネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含んでいることから、ヒトＩｇ遺伝子をＥＳ細胞内に導入するため、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）又はピュロマイシンＮ− アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）といったさまざまな選択可能なマーカーが使用される。ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は、異なる選択可能マーカーを用いて、突然変異体ＥＳ細胞内に同時に又は逐次的に導入することができる。トランスフェクションの後、適切な選択可能マーカーで細胞を選択し、ヒト遺伝子配列の組込みを確認し分析するべく凍結しＤＮＡ分析する目的で薬剤耐性コロニーを拡張させる。キメラの生成記述されているとおり（Bradley，A．（1987），「奇形ガン腫及び胚幹細胞：１つの実践的アプローチ」中、p113〜151，E.J.Robertson編、ＩＲＬプレス）ＲＡＧ−２胚盤胞内にヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子を含むＥＳクローンを注入し、偽妊娠の雌の子宮内にトランスファさせる、血清試料のＥＬＩＳＡ検定により、ヒト抗体の存在について子孫をスクリーニングする。ヒトモノクローナル抗体の免疫化及び産生のために陽性動物を使用する。実施例３１この例は、スイッチ組換えを受けるＢ細胞の欠失へと導くマウス重鎖遺伝子座内へのターゲティングされたフレームシフト突然変異の、ＥＳ細胞同の相同組換えを介しての導入について記述する。フレームシフトされたマウスは、ヒト配列免疫グロブリンをコードするマウス以外の（例えばヒトの）トランスジーンを宿すための適切な宿主である。新しいフレームソフトされたマウスは、なかでも、重鎖トランスジーン（単複）及び／又は軽鎖トランスジーンによりコードされる非マウス（例えばヒト）配列免疫グロブリンを発現させるため、及び導入されたトランスジーンからのクラススイッチされた親和力が成熟したヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの分離のために使用可能である。４つのマウスＪＨ遺伝子でグメントのうちの１つの中、そしてマウスμ遺伝子の第１のエキソンの中に、フレームシフトを導入する。導入された２つのフレームシフト突然変異は、互いに補償し合い、かくして、機能的ＶＤＪ連結のためにＢ細胞がフレームシフトされたＪＨを使用するときの完全に機能的なマウスμ重鎖の発現を可能にする。残りのＪＨ遺伝子内で補償されないμ内のフレームシフトのため、その他の３つのＪＨセグメントのいずれも機能的ＶＤＪジョイニングに使用することができない。代替的には、多数のマウスＪＨ遺伝子の中に、補償するフレームシフトを工作することもできる。補償されフレームシフトされた免疫グロブリン重鎖対立遺伝子に対し同型接合のマウスは、ほぼ生理学的レベルの末梢Ｂ細胞及び、マウスとヒトのμを両方共含むほぼ生理学的レベルの血清ＩｇＭを有する。しかしながら胚中心内に動員されたＢ細胞は、頻繁に、非μアイソタイプへのクラススイッチを受ける。内因性マウスμ鎖を発現するＢ細胞内のこのようなクラススイッチは、残りの非μＣ_H 遺伝子が補償するフレームシフトを有していないことから、補償されていないフレームシフトｍＲＮＡの発現を導く。結果として得られるＢ細胞は、Ｂ細胞レセプタを発現せず、欠失される。従って、マウス重鎖を発現するＢ細胞はそれらがアイソタイプスイッチの起こる分化段階にひとたび達した時点で欠失される。しかしながら、アイソタイプスイッチの能力をもちかかるアイソタイプ制限フレームシフトを含まない、非マウス（例えばヒト）トランスジーンによりコードされる重鎖を発現するＢ細胞は、アイソタイプスイッチ及び／又は親和力成熟などを含むさらなる発達の能力をもつ。従って、フレームシフトを受けたマウスはマウス重鎖（μ）に関して二次応答が損なわれているが、トランスジーンコードされた重鎖に関しては有意な二次応答を有する。クラススイッチを受けることのできる重鎖トランスジーンがこの突然変異体バックグラウンド内に導入された場合、非−ＩｇＭ二次応答は、Ｂ細胞を発現するトランスジーンにより支配される。かくしてこれらのフレームシフトされたマウスからハイブリドーマを発現する親和力成熟したヒト配列免疫グロブリンを分離することが可能である。さらに、フレームシフトされたマウスは一般に、ヒト重鎖トランスジーンが可変領域の制限された能力範囲しかコードできない場合に有利でありうるマウスＩｇＭの免疫防御レベルを有する。ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るために、トランスジェニック突然変異体マウスを免疫化し、その脾蔵を骨髄腫細胞系統と融合させ、結果として得られたハイブリドーマを、トランスジーンでコードされたヒト非μアイソタイプの発現についてスクリーニングする。さらに、フレームシフトしたマウスは、シススイッチのための活性基質として役立つ転写されたＶＤＪに隣接した機能的μスイッチ配列を含むことになり（Gu et al,（1993）Cell 73； 1155）、かくしてキメラヒト／マウス抗体を発現するトランススイッチされたＢ細胞レベルを低下させるため、ＪＨ欠失したマウスに比べ有利でありうる。フレームシフトベクターの構築２つの別々のフレームシフトベクターを構築する。これらのベクターのうちの１つは、マウスＪ４遺伝子セグメントの３′末端で２つのヌクレオチドを導入するのに用いられ、もう１つのベクターは、マウスμ遺伝子のエキソン１の５′末端からこれらの同じ２つのヌクレオチドを欠失させるために用いられる。１．ＪＨベクターホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下でヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター内に、マウス重鎖Ｊ領域及びμイントロンエンハンサーを網羅する３．４kbのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをザブクローニングする（ｔｋ／ｎｅｏカセット、Hasty et al. ，（1991）Nature 350：243）。次に以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて２つの異なるＰＣＲフラグメントを生成するための基質として、このクローンを使用する：ＳｐｈＩ及びＫｐｎＩで消化される１．２kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ１及びｏ−Ａ２を使用する。ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化される０．６kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ３及びｏ−Ａ４を使用する。次にこれら２つの消化されたフラグメントを、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩで消化されたプラスミドＡの中にクローニングし、プラスミドＢを生成する。プラスミドＢは、Ｊ４の末端に２ヌクレオチド挿入を含み、さらに挿入の上流に新しいＫｐｎＩ部位を含む。挿入のための診断マーカーとして、ＫｐｎＩ部位を使用する。相同組換え効率を増大させるため、プラスミドの５′ＸｈｏＩ部位及び３′ＥｃｏＲＩ部位の中に、付加的フランキング配列をクローニングすることができる。その後、ＳｐｈＩ又はインサート内に単一の部位をもつもう１つの制限酵素で、結果として得られたプラスミドを消化し、胚幹細胞へと電気穿孔させ、これらの細胞を次に、Hasty et al（1991）、前掲書中、により記述されているとおりに、Ｇ４１８で選択させる。サザンブロットハイブリダイゼーションにより相同組換え体を同定し、次にHasty et alにより記述されているとおりにＦＩＡＵにより選択させて、２塩基対挿入とＪＨ４内の新たなＫｐｎＩ部位のみを含む欠失されたサブクローンを得る。これらを、ＫｐｎＩ消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、ＰＣＲ増幅されたＪＨ４ＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確認する。結果として得られたマウスは、突然変異されていない配列：すなわちから突然変異体配列すなわち、へと変換されたＪＨ４セグメントを含む。μエキソン１ベクターＪＨ４遺伝子セグメント内への２塩基対挿入を工作するべく上述したものと類似のインビトロ突然変異誘発を用いて、第１のμエキソンの５′末端で２塩基対欠失を含むベクターを作り出すため、ＰＣＲ産物及びゲノミックサブクローンを組立てる。さらに突然変異をマーキングするため、ＡをＧに変更することにより新しいＸｍｎＩ部位も下流に導入する。突然変異を受けていないμ遺伝子の配列は以下のとおりである：突然変異を受けたμ遺伝子の配列は以下のとおりである。突然変異体配列を含む相同組換えベクターを、ＪＨ４挿入を含むＥＳ細胞系統へと線形化させ電気穿孔させる。ネオマイシン耐性クローンから相同組換え体を同定する。ＪＨ挿入と同じ染色体上のフレームシフト挿入を含むこれらの相同組換え体を、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。野生型１１．３kbから突然変異体９kbまでのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩを含むＪ−μイントロンのサイズを減少させる新しいＫｐｎＩ部位とＪＨ４挿入を結びつける。次に、ＦＩＡＵを用いて、挿入されたｔｋ／ｎｅｏカセットの欠失のために、結果として得られたクローンを選択する。突然変異体μエキソンを含むクローンを、ＸｍｎＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。突然変異は、ＰＣＲ増幅されたμ エキソン１ＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確認される。フレームシフトされたマウスの生成次に、ＪＨ４内の２塩基対挿入及びμエキソン１内の２塩基対欠失の両方を含むＥＳ細胞系統を、キメラを生成するべく偽妊娠の雌の体内に挿入される胚盤胞段階の胚の中に導入する。キメラ動物を繁殖させて生殖細胞系列の伝播を得、結果として得られた動物を同型接合まで繁殖させて、補償されたフレームシフトされた重鎖遺伝子座に対し同型接合でかつマウス重鎖を発現するＢ細胞内の二次体液性免疫応答が損なわれている突然変異体動物を得る。例えばｐＨＣ１又はｐＨＣ２といったヒト重鎖トランスジーンを、フレームシフトされたマウスＩｇＨ遺伝子座をもつマウスの中にかかるヒトトランスジーンを宿すマワスを交雑育種することによってマウス重鎖フレームシフトバックグラウンドへと繁殖させることができる。同系交配及び戻し交配を介して、μ補償されフレームシフトされたマウスＩｇＨ対立遺伝子に対してマウスＩｇＨ遺伝子座で同型接合で（すなわちマウスの非μ鎖ではなくμ鎖のみの補償された枠内発現をすることのできる）しかも機能的ヒト重鎖トランスジーン（例えばｐＨＣ１又はｐＨＣ２）の少なくとも１つの組込みコピーを宿すマウスを産生させる。かかるマウスは任意には、上述のとおりの内因性マウスκ及び／又はλ遺伝子のノックアウトを内含していてよく、又任意には、ヒト又はその他の非マウス軽鎖トランスジーン（例、ｐＫＣ１ｅ，ｐＫＣ２など）を含む可能性がある。代替的には、トランスジーン恒常領域遺伝子（単複）内のフレームシフトにより補償されるフレームシフトがトランスジーンＪ遺伝子（単複）に含まれるように、ヒトトランスジーン（単複）（重鎖及び／又は軽鎖）には補償フレームシャフトが含まれていてもよい、内因性恒常領域遺伝子に対するトランススイッチは、補償されず、切形の又はナンセンス産生を産生する；かかる補濱されていないトランススイッチされた免疫グロブリンを発現するＢ細胞に対し選択を行ない、これを枯渇させる。実施例３２Ｄ領域切除による内因性重鎖の失活この例は、マウス生殖細胞系統免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を非機能的な再配置されたＶＤＪセグメントで置換するための正−負選択相同組換えベクターについて記述する。結果として得られる対立遺伝子は、対立遺伝子内重鎖クラススイッチを受けかくしてトランススイッチレベルを活性トランスジーン遺伝子座まで減少させている状態で、正常な非産生的対立遺伝子としてＢ細胞内で機能する。Ｄ領域ターゲディング構成体マウスＤ領域の上流にある８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを、Gen BankにリストアップされたＤＦＬ１６．１セグメントに対する公表済み配列の約５０の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウス系１２９ファージライブラリから分離し、サブクローニングする。ＤＦＬ１６．１は、上流Ｄセグメント（すなわち、Ｖ領域遺伝子クラスターに近位で、恒常領域遺伝子クラスタに遠位のもの）である。同様に、ＪＨ３，ＪＨ４，Ｅμ，Ｓμ及びμ恒常領域の最初の２つのコーティングエキソンを含む９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントを、マウス系１２９ゲノミックファージライブラリーから分離しサブクローニングする。次にマウスハイブリドーマ（あらゆる系）から５〜１０kbの再配置されたＶＤＪを分離し、停止コドンを含む合成リンカーをＪセグメント内に挿入する。Ｖ置換再配置が可能であるため、枠外ＶＤＪ連結よりもＪの内部の停止リンカーが好まれる。これら３つのフラグメントをＰＧＫｎｅｏ正の選択カセット及びＰＧＫＨＳＶｔｋ負の選択カセットと合わせて組立てて、相同組換えにより１２９−誘導ＥＳ細胞（例えばＡＢＩ）内のマウスＤ領域を削除するための正−負選択ベクターを形成する。ターゲティングベクターは、それ自体９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントに連結される再配置された５〜１０kbの再配置済み、ＶＤＪにそれ自体連結されている正の選択カセット（例えばＰＧＫｎｅｏ）に８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを連結させることによって形成される。次に、ターゲティング構成体のいずれかの端部で負の選択カセット（例えばＰＧＫＨＳＶｔｋ）を連結させる。かかるＤ領域ターゲティングベクターの構成は、図７３に概略的に示されている。Ｄ領域ターゲディング構成体を、ＡＢ１ＥＳ細胞内にトランスファし、正及び負の選択を上述のとおりに行ない、適正にターゲティングされたＥＳ細胞をクローニングする。胚盤胞注入のために、適正にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを使用し、キメラマウスを産生する。Ｄ領域失活された重鎖対立遺伝子を宿す創立者マウスを産生するため、キメラマウスを繁殖させる。機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如した同型接合体を産生するため、子孫の同系交配を行なう。このような同型接合体を用いて、ヒトＩｇトランスジーン（例えばｐＨＣ１，ｐＨＣ２，ｐＫＣ２，ｐＫＣ１ｅ，ＫＣｏ４）を宿すマウスまで交雑育種し、（さらに、機能的Ｄ領域が欠如した同型接合体までもどし交配することにより）、機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如しかつヒト重（鎖）トランスジーン（そして好ましくはヒト軽鎖トランスジーンも）を宿すマウスを生み出す。いくつかの機能的内因性軽鎖遺伝子座（例えばλ遺伝子座）が残る実施態様においては、一般に、トランスジーンがヒト軽鎖（例えばκ）ポリペプチドの高レベル発現を誘導する転写制御配列を含み、かくしてトランスジーンの遺伝子座が残りの内因性軽鎖（例えばλ）遺伝子座と有効に競合できるようにすることが好ましい。例えば、Ｃｏ４カッパ軽鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物内の内因性λ遺伝子座と有効に競合する能力に関してｐＫＣ１に比べ一般に好まれている。実施例３３この例は、ヒトＶκ遺伝子座の一部分を含む酵母人工染色体とヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座の同時注入によるヒト軽鎖トランスジーンＶ遺伝子の能力範囲の拡張について記述する。Ｖκ含有ＹＡＣＤＮＡとκミニ遺伝子座の同時注入による機能的ヒト軽鎖Ｖセグメントの導入一般に入手可能なＩＣＲＦＹＡＣライブラリーのクローン４×１７Ｅ１から、増幅されていないＹＡＣＤＮＡとして、ヒトＶκ遺伝子座の一部を含む約４５０KbのＹＡＣクローンを得た（Larin et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci(U. S.A.) 88：4123；Imperial Cancer Research Fund、ゲノム分析研究所、ロンドン，UK）。メーカーの仕様に従って標準的なパルフフィールドゲル電気泳動法により、予め増幅することなく、４５０kbのＹＡＣクローンを分離した（ＣＨＥＦＤＲ−II、電気泳動セル、Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）。臭化エチジウムを用いて６つの個別のパルスフィールドゲルを染色し、ＹＡＣクローンＤＮＡを含むゲル材料をゲルから切除し、次に三角形のゲルトレイ内に流し込まれた新しい（標準ゲル緩衝液中の低融点アガロース）ゲル内にこれを埋込む。標準電気泳動緩衝液に加えて２ＭのＮａＯＡｃを伴う狭いアガロースゲルを用いて頂点において、結果として得られた三角形のゲル（６つの切除されたＹＡＣ含有ゲルブロックを内含する）を伸展させた。次にゲルを、標準ゲル緩衝液中に浸漬された電気泳動チァンバ内に入れた。Ｙ形状のゲルフォーマは、電流（流動？）が狭く高いソルトゲル部分までだけ流れるように、緩衝液の表面より上に立上っている。緩衝液内へのＮａＯＡｃの拡散を防ぐため、高ソルトゲル切片全体にわたり、アクリルのブロックを置いた。次に、ＹＡＣＤＮＡを切片化された（埋込まれた）もとの切除ゲルから狭い高ソルトゲル部分内へと電気泳動させた。低ソルトゲルから高ソルトゲルへの遷移の時点で、三角形のゲルの頂点でＤＮＡの移動を有効に停止させる抵抗の低下が存在する。電気泳動及び臭化エチジウムでの染色の後、濃縮したＹＡＣＤＮＡを残りのゲルから切り離し、アガロースをＧＥＬａｓｅ（Bpi Centre Technologies，Mad ison，Wisconsin）で消化した。次に、結果として得られたＹＡＣ含有液体に塩化セシウムを付加し、１．６８ｇ／mlの密度を得た。この溶液を３６時間３７０００rpmで遠心分離し、あらゆる汚染物質からＹＡＣＤＮＡを分離した。結果として得られた密度勾配の０．５ml分画を分離し、５mMのＴｒｉｓ（pH７．４）、５mMのＮａＣ１、０．１ＭのＥＤＴＡに対してピークＤＮＡ分画を透析した。透析の後、結果として得られたＹＡＣＤＮＡの０．６５ml溶液の濃縮は、２ μｇ／mlのＤＮＡを含んでいることがわかった。このＹＡＣＤＮＡを、２０：１：１（マイクログラムＹＡＣ４×１７Ｅ１：ＫＣ１Ｂ：ＫＶ４）の比率で、プラスミドｐＫＣ１Ｂ及びｐＫＶ４からの精製されたＤＮＡインサートと混合した。半日のＢ６ＣＢＦ２の胚の前核の中に、結果として得られた２μｇ／mlの溶液を注入し、９５の存続する微量注入された胚を偽妊娠の雌の卵管内に移送した。微量注入された胚から発達した１２匹のマウスが生まれた。実施例３４この例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座に対して同型接合でありかつＨＣ１又はＨＣ２重鎖トランスジーンを含む免疫化したトランスジェニックマウスの中でのクラススイッチ、体細胞突然変異及びＢ細胞発達について記述する。ヒト配列生殖細胞系統配置ミニ遺伝子座が真正遺伝子座と置換できることを実証するために、我々は、ヒト生殖細胞系統一配置ＩｇＨトランスジーンを含む系を用いて、内因性ＩｇＨが欠如したマウス系を繁殖させた。２つのトランスジーンミニ遺伝子座ＨＣ１及びＨＣ２は、それぞれ１つ及び４つの機能可変（Ｖ）セグメント、１０及び１６の多様性（Ｄ）セグメント、６つのジョイニング（ＪＨ）セグメント全て、及び両方のμ及びγ１恒常領域セグメントを含む。ミニ遺伝子座は、コーディングセグメントに密に連鎖されている−ＪＨ−μイントロンエンハンサー及びμ及びγ１スイッチ配列といった−ヒトシス作用性調節配列を含む。これらは同様に、ラットＩｇＨ遺伝子座の３′末端から誘導された付加的なエンハンザー要素も含んでいる。我々は、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニックマウスを、記述のとおり（前出）ＪＨセグメント（ＪＨＤマウス）が欠如し従って機能的重鎖再配置を受けることのできない幹細胞由来の突然変異マウスと交配させた。結果として得られたトランスジェニック−ＪＨＤマウスは、導入された重鎖配列に依存するＢ組用包を含んでいる。免疫化及びハイブリドーマ我々は、５０〜１００μｇの抗原の腹腔内注入によりマウスを免疫化した。抗原には、ヒトのガン胎児性抗原（ＣＥＡ；Crystal Chem，Chicago，IL）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ；Pierce，RockFord，IL）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Pierce，RocKFord，IL）が含まれていた。一次注入のために、我々は抗原を完全フロイントアジュバントと混合し、その後の注入については不完全フロイントアジュバント（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）を用いた。脾細胞を、非分泌性マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ATCC，CRL1 580）と融合させた。我々は、ＥＬＩＳＡにより、ヒト重鎖配列を含む特異的及び非特異的抗体の存在について血清試料及びハイブリドーマ上清を検定した。非特異的抗体の検出のために、我々は、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体（マウスＭＡｂαヒトＩｇＧ１、クローンＨＰ６０６９、Cal bio chem，La Jolla，CA；マウスＭＡｂαヒトＩｇＭ、クローンＣＨ６、The Binding Site，Birmingham，UK）でマイクロタイターウエルをコーティングし、ペルオキシダーゼ接合抗血清（ポリクローナルヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）からのホースラディッシュペルオキシダーゼ接合の親和性精製されたｆａｂフラグメント、ｃａｔ＃１０９−０３６−０９８；親和性精製されたホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたポリクローナルウサギαヒトＩｇＭ（ｆc），ｃａｔ＃３０９−０３５−０９５。 Jackson Immuno Research，West Grove，PA）を用いて発達させた。抗原特異的抗体の検出のため、我々はマイクロタイターウエルを抗原でコーティングし、ペルオキシダーゼ接合されたヒト重鎖アイソタイプ特異血清を用いて発達させた。我々は、過酸化水素及び２，２′−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアソリン−ｂ−スルフォン酸、Sigma Chem Co.，St.Louis，Mo）でのインキュベーションにより、結合ペルオキシダーゼを検出した。反応産物を４１５nmで吸収により測定し、４９０nmでの吸収について補正する。フローサイトメトリー我々は、脾臓、骨髄及び腹腔から単細胞懸濁液を調製し、Mishell及びShiigi により記述されているとおりにＮＨ₄Ｃｌで赤血球を容解した。次の試薬でリンパ球を染色した：すなわち、フィコエリトリン接合された抗マウスＩｇκ（クローンＸ３６；Becton DicKinson，san Joss．CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＤ（クローンＳＢＡ１，Southern Biotech，AL），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＣＤ５（クローン５３−７．３；Becton Dickinson，San Jose．CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６）；Pharmingen，San Diego，CA）及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３− ６Ｂ２；Pharmingen，San Diego，CA）、我々はＦＡＣＳｃａｎクローン血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Becton Dickinson，San Jose．CA）を用いて染色した細胞を分析した。前方及び側方散乱器上でのゲーティングにより、大部分のマクロファージ、好中球及び残留赤血球を排除する。Ｂ細胞区画の救助ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物の腹腔内では、ＣＤ⁵⁺Ｂ細胞の正常レベル及び従来のＣＤ^5-Ｂ細胞の正常レベルの約４分の１が見られる。トランスジェニック腹腔ＣＤ５^+B細胞は、正常な動物内での記述されたいわゆるＢ−１細胞に類似している：すなわち、これらは従来のＢ及びＴリンパ球よりも大きく、脾臓内で見られる従来のＢ細胞よりも低いレベルのＢ２２０を発現し、より高い割合のγ軽鎖発現細胞を含んでいる。脾臓Ｂ細胞の９０％以上がκを発現し、一方最高５０％の腹腔Ｂ細胞がλを発現する。かくして、従来のＢ細胞のレベルは全ての組織内で均等に減少している一方で、自已更新の能力がはるかに大きいものとして報告されているＢ−１のレベルは、ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物において正常であると思われる。クラススイッチトランスジェニック−ＪＨＤマウスにおいては、抗原に対して反腹的に露呈することにより、ヒトγ１抗体ならびにμ抗体が結果として産生される。我々は、一週間の間隔でトランスジェニック−ＪＨＤマウス内にヒトＣＥＡを注入し、４週間にわたり抗原特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ１の血清レベルを監視した（図７４）。１週間目に、検出可能なＩｇＭ応答があるがＩｇＧ１応答は全く無い。しかしながらＩｇＧ１応答は２週間後ＩｇＭ応答よりも大きく、ＩｇＭ応答が比較的恒常な状態にとどまっているのに対して増大し続けている。このパターン、すなわち初期のＩｇＭ応答とそれに続くＩｇＧ反応は、二次免疫応答に典型的なものであり、これは、トランスジーン内に内含されているシス作用性配列が、クラススイッチを導くサイトカインに対し応答しているかもしれないということを示唆している。我々は、各々文献中で論述されてきた非μアイソタイプの発現について考えられる３つのメカニズムを考慮した。これらのメカニズムとはすなわち、μ 遺伝子の欠失が関与しない交互のスプライシング；フランキング反復配列間の相同組換えを介してのμ遺伝子の欠失が関与した「δ−型」スイッチ；そしてスイッチ領域間の非相同組換えである。以下で記述する我々の実験の結果はスイッチ領域組換えモデルを表わしている。アイソタイプシフトを説明するのに２つのタイプの非欠失性交互スプライシングメカニズムを喚起することができる。第１に、μ及びγ１の両方をカバーする単一の写しをトランスジーンから発現させることが可能である；この写しは抗原に対する露出により誘発されたサイトカインに応答して交互にスプライシングさせることができた。代替的には、サイトカイン誘発されたγ１の上流で開始する不稔写しを、μ写しにトランススプライシングさせることができた。これらのメカニズムのうちのいずれかがヒトγ１配列の発現の原因であったならば、μ及び γ１の両方を発現するハイブリドーマを分離できるということを期侍したであろう。しかしながら、ヒトμ又はヒトγ１のいずれかを発現する数百のハイブリドーマをスクリーニングしてきたものの、かかる二重産生者（μ⁺，γ１⁺）ハイブリドーマは全く発見されなかった。このことは、γ１の発現にμ遺伝子の欠失が伴っていることを表わしている。 μ遺伝子の欠失は、μとγ１スイッチ領域の間の非相同組換えによって、又はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている２つのフランキングする４００bpの直接反復（σμ及びΣμ）の間の相同組換えによって媒介されうる。σμ 及びΣμの間の欠失組換えは、いくつかのヒトＢ細胞のＩｇＤ⁺，ＩｇＭ^-表現型の原因であることが報告されてきた。第１のメカニズムすなわち非相同スイッチ組換えは可変的な長さのスイッチ産物を産生するはずであるが、一方第２のメカニズムずなわちσμ／Σμ紐換えはつねに同じ産物を生成するはずである。我々は、μを発現するもの１つとγ１を発現するもの２つの計３つのハイブリドーマ（図７５）から分離したゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析を行なった。 γ１スイッテ領域のうち２つの中にのみトランスジーンγ１の上流にゲノミック再配置が発見される（図７６）。さらに、観察した構造のうちいずれもσμとΣ μの間の相同組換えと両立性がない。従って、我々の結果は、トランスジーンでコードされたμ及びγ１のスイッチ領域の間での欠失性非相同組換えによって媒介されるγ１アイソタイプ発現のためのモデルと一貫性を有する。トランススイッチヒトγ１に加えて、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤマウスの血清中にマウスγが見い出される。これらの動物から、マウスγ発現ハイブリドーマも得られた。非トランスジェニック同型接合ＪＨＤ動物は、検出可能なレベルのマウス免疫グロブリンを発現しないことから、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤ動物内のマウスγの発現は、トランススイッチ現象のせいであると思われる。我々が分析したトランスジェニック・ハイブリドーマの全ては、マウス又はヒトのいずれかの恒常領域配列を発現するものの両方を発現することはない。従ってトランススプライシングメカニズムが関与する可能性は低い。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンを分離するためのＰＣＲ増幅を用い、結果として得られるクローンのうちの１０個のヌクレオチド配列を決定した（図７７）。ＰＣＲ増幅中の５′オリゴヌクレオチドはトランスジーンコードされたＶＨ２５１に特異的であり、３′オリゴヌクレオチドはマウスγ１，γ２ｂ及びγ３配列に特異的である。これら３つのマウス恒常領域の全てを取込んだトランススイッチ産物の例が見られる。体細胞突然変異図７に示されているトランススイッチ産物の可変領域内のヌクレオチドの約１％が、生殖細胞系統コーディングを受けていない。これはおそらく、休細胞突然変異のせいであると思われる。突然変異を受けた配列は内因性遺伝子座にトランスロケートされていたため、これらの突然変異を導くシス作用性配列は、マウス γスイッチから３′のどこにでも位置設定することができた。しかしながら以下で論述するとおり、かかるトランスロケーションを受けなかったＶＤＪセグメント内の体細胞突然変異も観察される。そしてこの結果は、重鎖体細胞突然変異が必要とする配列がトランスジーン内に内含されているということを表わしている。ＨＣ１及びＨＣ２構成体が、トランスジェニック−ＪＨＤマウス内で体細胞突然変異が起こるのに充分なシス作用性配列を含んでいるか否かを決定するため、我々は、２つの独立したＨＣ１トランスジェニック系統そして１つのＨＣ２系統から誘導されたｃＤＮＡクローンを分離し部分的に配列決定した。トランスジェニック−ＪＨＤマウスからのγ１写しのいくつかが、広範な体細胞突然変異を伴うＶ領域を含んでいることがわかる。これらの突然変異を受けた写しの頻度は、免疫化の反復に伴って増大するように思われる。図７８及び７９は、２組のｃＤＮＡ配列を示す：すなわち１組は、ＲＮＡを分離する５日前に抗原の一回の注入で免疫化したＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導体されている；第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注入することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている；第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注入することによっで高度免疫させたＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている（原文重複）。露呈後５日目から１３のＶ領域のうちわずか２つだげがいずれかの生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。これらのＶの各々は単一のヌクレオチド変更しか含まず、この試料について０．１％未満の全体的体細胞突然変異頻度を与えている。これとは対照的に、高度免疫された動物からの１３のＶ配列のいずれも完全に生殖細胞系統ではなく、全体的体細胞突然変異頻度は１６％である。単一の組織試料から分離されたμ及びγ１写しの比較は、体細胞突然変異の頻度がクラススイッチを受けたトランスジーンコピーの場合よりも高いということを示している。我々は高度免疫したＣＨ１系統５７トランスジェニック−ＪＨＤマウスからの４７の独立したμ及びγ１ｃＤＮＡクローンを分離し、部分的に配列決定した（図８０及び８１）。μｃＤＮＡクローンのほとんどは、生殖細胞系統配列との関係において修正されておらず、一方γ１クローンの半数以上は、多数の生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。γ１発現細胞は、μ発現細胞とは全く異なり、２つのプロセスは必ずしも連関されていないものの、クラススイッチと体細胞突然変異は、Ｂ細胞の同じ副次集団内で起こっている。高度免疫を受けていないＣＨ１トランスジェニックマウス内にＶＨ２５１遺伝子の広範な体細胞突然変異は見られないが、特定の実験を受けていないＨＣ２トランスジェニックマウスにおいてはＶＨ５６ｐ１及びＶＨ５１ｐ１遺伝子の中で著しい体細胞突然変異が発見された。生後９週間の免疫化を受けていない雌のＨＣ２トランスジェニック動物から脾臓及びリンパ節ＲＮＡを分離した。我々は、Ｖ及びγ１特異的プライマを用いてＨＣ２トランスジーン内の４つのＶ領域の各々を取込むγ１写しを個別に増幅した。特異的ＰＣＲ産物の各々の相対的収量はＶＨ５６ｐ１≫ＶＨ５１ｐ１＞ＶＨ４．２１＞ＶＨ２５１であった。この技術は厳密に定量的ではないものの、ＨＣ２マウス内でのＶセグメントの使用における偏りを表わす可能性がある。図８２は、４つのＶ特異的プライマ全ての等モル混合物を用いたＰＣＲ増幅から誘導された、無作為にとり上げた２３個のγ１ｃＤＮＡ配列を示している。ここでも又、ＶＨ５６ｐ１（１９／２３クローン）に向かっての偏りが見られる。さらに、ＶＨ５６ｐ１配列は、Ｖ遺伝子セグメント内で２．１％の全体的頻度で、著しい体細胞突然変異を示している。ＣＤＲ３配列を検査すると、１９のうち１７の個別のＶＨ５６ｐ１クローンが固有のものであるけれども、それらがわずか７つの異なるＶＤＪ組換え事象のみから誘導されている、ということがわかる。従って、特定の実験を受けていない動物において、恐らくは内因性病原体又は自已抗原によりＶＨ５６ｐ１発現Ｂ細胞が選択されるように思われる。この同じ遺伝子がヒトの胎児能力範囲内で過剰表示されることが適切である可能性がある。要約上流シス作用性配列は、個々のスイッチ領域の機能性を規定し、クラススイッチには必要なものである。ＨＣ１トランスジーン内のクラススイッチが二次応答に関与する細胞に大幅に制眼されており、全Ｂ細胞集団を横切って無作為に発生しないという我々の観察は、トランスジーンと共に内含される最低限の配列が充分なものであるということを示唆している。この構成体の中に内含されるγ配列は、γ１不稔写しの開始部位の上流わずか１１６個のヌクレオチドのところで始まっていることから、スイッチ調節領域はち密なものである。我々の結果から、これらの重要なシス作用性調節要素が個々のγ遺伝子に密に連鎖されているか又はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている３′重鎖エンハンサーと結びつけられているかであるということが立証される。ＨＣ１及びＨＣ２インサートは、体細胞突然変異を受けている可能性の高い配列に対するマーカーとして役立ちうるトランスジーン自律性クラススイッチを受けていることから、我々は内因性遺伝子座へのトランスロケーションに由来したものでない高度に突然変異を受けた写しを容易に見い出すことができた。我々は、３つの独立したトランスジェニック系統（２つのＨＣ１系統及び１つのＨＣ２系統）の中に体細胞突然変異を受けたγ写しを見い出した。従って、トランスジーンの組込み部位にフランキングする配列がこのプロセスに影響を及ぼすという可能性は低い：その代り、トランスジーン配列は、体細胞突然変異を導くのに充分なものである。実施例３５この実施例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座について同型接合であり、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖をコードするトランスジーン配列を含むマウスからのハイブリドーマの生成について記述する。ここで記述されるハイブリドーマは、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌し、Ｔ細胞上で発現される予め定められた抗原に結合する。この実施例は同様に、ヒト由来の免疫原ヒトＣＤ４に応えてヒト配列抗体を作るマウスの能力、及びヒト抗原と反応性あるヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るための供給源としてのかかるマウスの適性をも立証する。Ａ．ヒトＣＤ４抗原で免疫化されたＨＣ１トランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成機能的に分断されたＪ_H遺伝子座について同型接合でしかも、ヒト配列重鎖をコードするべく再配置可能なトランスジーン及びヒト配列軽鎖をコードするべく再配列可能なトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスを免疫化した。マウスの遺伝子型はＨＣ１−２６⁺ＫＣ１ｅ−１５３６⁺Ｊ_HＤ^+/+Ｊ_KＤ^-であり、これはマウス重鎖失活に対する同型接合、及びＨＣ１ヒト配列重鎖トランスジーン及びＫＣ１ｅヒト配列軽鎖トランスジーン生殖細胞系統コピーの存在を表わしていた。マウスを、安定した形でトランスフェクションされたポリヌクレオチドによりコードされたマウス−ヒトハイブリッドＣＤ４分子を発現するＥＬ４細胞系統（ＡＴＣＣ）の変異体で免疫化した。発現されたＣＤ４分子は、実質的にヒト様のＣＤ４配列を含む。１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を伴う１００μｌのＰＢＳの中の約５×１０⁶の細胞を、０日目に腹腔内注入を介してマウス体内に導入した。７日目、１４日目、２１日目、２８日目、６０日目及び７７日目に接種をくり返し行ない、１８日目、３５日目及び６７日目にテスト出血を行なった。８１日目に脾臓を除去し、標準的な方法（ＰＥＧ融合）により約１．２×１０⁷の融合パートナー細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３細胞系統：ＡＴＣＣ）に対して約７．２×１０⁷の牌細胞を融合させ、ＲＰＭＩ１６４０１５％ＦＣＳ，４mMグルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウムにＨＡＴ及びＰＳＮ培地を加えたものの中で培養させた。多数の融合を実施した。ハイブリドーマを成長させ、ＣＨＯ細胞内で発現された精製組換え型可溶性ヒト配列ＣＤ４（American Bio-Technologies，Inc.（ABT），Cambridge，MA）及び／又はNEN-DuPontから得られるＣＤ４といった市販の供給源に対する結合力について、ＥＬＩＳＡを用いて上清をテストした。ＡＢＴ試料は、ヒトＣＤ４のＶ₁ 〜Ｖ₃ドメインから成る精製された５５kDのヒトＣＤ４分子を含んでいた。検定プレートに対して、組換え型ヒト配列ＣＤ４（ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で産生されたもの）を吸着させ、ハイブリドーマ上清からの抗体を捕獲するのに用い、次に捕獲した抗体を・ヒトμ、ヒトκ、ヒトγ、マウスμ又はマウスκのいずれかを結合する抗体のパネルに対する結合力について評価した。１つのハイブリドーマを、１Ｆ２と呼ばれるその培養プレートウエルからサブクローニングした。ＡＢＴＣＤ４調製物に対して結合された１Ｆ２抗体は、ヒトμ及びヒトκについて陽性であり、ヒトγ、マウスγ及びマウスκについて陰性であった。Ｂ．ヒトＣＤ４及びヒトＩｇＥで免疫化されたＨＣ２トランスジェニックマウスから誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成重鎖トランスジーンＨＣ２は図７８，７９に示され、上で記述したきた（実施例３４参照）。図６８に記されているヒト軽鎖トランスジーンＫＣｏ４は、マウスゲノム内の単一部位での２つの個別にクローニングされたＤＮＡフラグメントの同時組込みにより生成される。フラグメントは４つの機能的Ｖ_kセグメント、５Ｊセグメント、Ｃ_kエキソンそしてイントロン及び下流の両方のエンハンサー要素を含んでいる（実施例２１参照）（Meyer及びMeuberger（1989），EMBO J．8：1959-1964 ；Judde及びMax（1992），Mol.Cell Biol. 12：5206-5216）。２つのフラグメントは共通の３kb配列を共有していることから（図６７参照）、これらは、重複する配列の間の相同組換えの後、隣接する４３kbのトランスジーンとしてゲノミックＤＮＡの中に潜在的に組込まれうる。かかる組換え事象は、重複するＤＮＡフラグメントの微量注入の時点で頻繁に発生することが立証されてきた（Pieper et al.（1992），Nucleic Acids Res. 20：1259-1264）。同時注入されたＤＮＡは同様に接合体内に同時組込みされる傾向をもち、個々にクローニングされたフラグメント内に含まれた配列は、その後Ｂ細胞の発達中ＤＮＡ再配置により連結されることになる。表１１は、トランスジェニック系統のうち少なくとも２つからのトランスジーンインサートが機能的であることを示す。４つのトランスジーンコーディングを受けたＶセグメントの各々及び５Ｊセグメントの各々を取込んだＶＪ連結の例が、この３６クローンの組の中に表わされている。上記の表はＫＣｏ４トランスジェニックマウスにおけるヒト軽鎖Ｖ及びＪセグメノトの使用を示す。この表は、示されたヒトカッパー配列を含有する、２つのトランスジェニック系に由来するｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲクローンの数を示す。ｗ個々のＫＣｏ４トランスジェニックマウス（マウス＃８４９０、３ｍｏ．、雄性ＫＣｏ４系４４３７；マウス＃８８６７、２．５ｍｏ．、雌性、ＫＣｏ４系４４３６）から単離された脾臓ＲＮΛを用いてｃＤＮＡを合成した。Ｃｋ特異的オリゴヌクレオチド５′TAG AAG GAA TTC AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA G TT CCA ３′、並びに２つのＶｋ特異的オリゴヌクレオチド５′AGC TTC TCG AGC TCC TGC TGC TCT GTT TCC CAG GTG CC ３′及び５′CAG CTT CTC GAG CTC CTG CTA CTC TGG CTC（C,A）CA GAT ACC ３′の１：３混合物を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そしでプラスミドベクター中にクローニングした。各動物からの無作為にとり上げた１８個のクローンにつき、ジデオキシチェンターミネージョン法により部分ヌクレオチド配列を決定した。各クローンの配列を末組換え（unrearranged）トランスジーンのジャームライン配列と比較した。２３の軽鎖ミニ遺伝子座陽性及び１８の重鎖陽性マウスが、注射した胚から発達した。機能的マウス重鎖及びκ軽鎖遺伝子座が無い状態でヒト重鎖及びκ軽鎖を含むマウスを得るため、内因性マウス重鎖（系ＪＨＤ）及びκ軽鎖遺伝子座（系ＪＣＫＤ）の中にターゲティングされた突然変異を含むマウスを用いて、これらのマウス及びその後代を繁殖させた。これらのマフスはλＢ細胞のみを含んでいる。表７は、体細胞突然変異がトランスジェニックマウスのトランスジーンコーディングを受けたヒト重鎖写しの可変領域の中で発生することを示している。ＨＣ２トランスジェニックマウスからの２３のｃＤＮＡクローンを部分的に配列決定して可変領域内の生殖細胞系統コーディングされていないヌクレレチドの頻度を決定した。データには各クローンからのＶセグメントコドン１７〜９４の配列のみが含まれており、Ｎ領域は含まれていない。ＲＮＡは、マウス５２５０の脾臓及びリンパ節から分離した（ＨＣ２系統２５５０半接合、ＪＨＤ同型接合）、記述されているとおり（参考）一本鎖ｃＤＮＡを合成し、γ写しをＰＣＲで増幅した。増幅したｃＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、ジデオキン読み終り方法により２３の無作為にとり上げたクローンを部分的に配列決定した。ＰＣＲ導入されたヌクレオチド変更の頻度は、恒常領域配列から＜０．２％として見積られる。表７フローサイトメトリー我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Be cton Oickinson，San Jose．CA）を用いて染色した細胞を分析した。以下の試薬を用いて脾細胞を染色した；ヨウ化プロビシウム（分子プローブ、Eugene，OR）、フィコエリトリン接含されたα−ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Caltag ，S.San Francisco，CA）、フィコエリトリン接合されたα−マウスＩｇκ（クローンＸ３６；Becton Dickinson，San Jose．CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharmingen，San diego，CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−マウスＩｇμ（クローンＲ６−６０．２；Pharmingen，San dieg o，CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−ヒトＩｇμ（クローンＧ２０−１２７；Pharm ingen，San Oicgo，CA）、及びＣｙ−クロム接合された抗−マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，San Diego-CA）。ヒトＩｇトランスジーンの発現図８３は、ＪＨＤ及びＪＣＫＤの両方の突然変異について同型接合であるＫＣｏ４及びＨＣ２マウスからの脾細胞のフロー血球計算法による分析を示す。ヒト配列ＨＣ２トランスジーンは、ＪＨＤ突然変異バックグラウンド内でのＢ細胞の発達を救助し、脾臓内のＢ２２０⁺細胞の相対的数を野生型動物の約半分まで回復させた。これらのＢ細胞はトランスジーンコーディングを受けた重鎖を用いた細胞表面免疫グロブリンレセプタを発現した。ヒトＫＣｏ４トランスジーンは同様に機能的であり、無傷の内因性λ軽鎖遺伝子座をうまく競合した。重鎖及び軽鎖ヒトトランスジーンを両方共含む（２重トランスジェニック）ＪＨＤ／ＪＣＫＤ同型接合突然変異体マウスの中のＢ脾細胞のほぼ９５％が、完全にヒト細胞表面ＩｇＭκを発現した。血清Ｉｇレベルを以下のとおりＥＬＩＳＡによって決定した：ヒトμ：マウスＭａｂαヒトＩｇＭ（クローンＣＨ６、結合部位、Birmingham，UK）でコーディングされペルオキシダーゼ接合されたウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５−０９５，Jackson Immuno Research,（West Grove，PA）で発達させられたマイクロタイターウエル。ヒトγ：マウスＭＡｂαヒトＩｇＧ１（クローンＨＰ６０６９，CalbiChem，La Jolla，CA）でコーティングされ、ペルオキシダーゼ接合されたヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）（ｃａｔ＃１０９−０３６−０９８，Jackson Immuno Research，West Grove，PA）で発達させられたマイクロタイターウエル。ヒトκ：マウスＭａｂαヒトＩｇκ（ｃａｔ＃０１７３，AMAC，Inc，Ｉｇκ （ｃａｔ＃Ａ７１６４，Sigma Chem．Co.，St.Louis，MO）でコーティングされたマイクロタイターウエル。マウスγ：ヤギαマウスＩｇＧ（ｃａｔ＃１１５− ００６−０７１，JacKson Immuno Research，West Grove，PA）でコーティングされたマイクロタイターウエル。マウスλ：ラットＭＡｂαマウスＩｇλ（ｃａｔ＃０２１７１Ｄ，Pharmingen，San Diego，CA）でコーテイングされ、ペルオキシダーゼ接合されたウサギαマウスＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５ −０９５，Jackson Immuno Research，West Grove，PA）で発達させられたマイクロタイターウエル。結合したペルオキシダーゼを、過酸化氷素反び２，２′− アジノ−ビス−１３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸、Sigma Chem ．Co.，St.Louis，MO）を用いたインキュベーションにより検出する。反応産物を、４１５nmでの吸収により測定する。２重トランスジェニックマウスは、血清中で完全にヒトの抗体をも発現する。図８４は、いくつかの異なるトランスジェニック創立者動物から誘導された重及びカッパ軽鎖失活について同型接合である１８の個々の２重トランスジェニックマウスに関する免疫グロブリンタンパク質の測定された血清レベルを示す。我々は、検出可能なレベルのヒトμ，γ１及びκを発見した。我々は以上で、発現されたヒトγ１がトランスジーンμ及びγ１スイッチ領域の間のゲノミック組換えによる真正なクラススイッチの結果として得られるということを示した。その上、我々は、トランスジーン内部のクラススイッチが重鎖可変領域の本細胞突然変異により達成されることを発見した。ヒト免疫グロブリンに加えて、我々は血清内のマウスγ及びλをも発見した。内因性遺伝子座が完全に無傷であることからマウスλタンパク質の存在が予想されろ。我々は他の箇所で、マウスγ発現が、内因性重鎖遺伝子座内へのトランスジーンＶＤＪセグメントのトランススイッチ組換えの結果であるということを示した。当初野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンについて立証されていたこのトランススイッチ現象（Ourdik et al.（1989），Proc.Na tl,Acad,Sci,USA 86：2346-2350；Gerstein et al.（1990），細胞63：537-548 ）は、下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなおも無傷であることから、突然変異体ＪＨＤバックグラウンド内で起こる。２重トランスジェニックマウス内のヒトＩｇＭκの血清濃度は約０．１mg／ml であり、動物間又は系統間での偏差はほとんど無い。しかしながら、ヒトγ１、マウスγ及びマウスλレベルは０．１〜１０マイクログラム／mlの範囲に及んでいる。個々の動物間で見られたγレベルの変動は、γが誘発可能な恒常領域であるという事実の結果である可能性がある。発現はおそらく、動物の健康、抗原に対する露呈そして場合によってはＭＨＣタイプといった要因により左右されると思われる。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック系統と相関すると思われる唯一のパラメータである。１回の組込みあたりのトランスジーンのコピー数が最も少ない（約１〜２コピー）ＫＣｏ４系統４４３６マウスは、最高の内因性λレベルを有し、一方ＫＣｏ４系統の４４３７マウス（組込み一回あたり〜１０コピー）は最低のλレベルを有する。これは、κトランスジーンに続いて内因性λが再配置し、血清λレベルが選択されずその代りに前駆体Ｂ細胞プールの相対的サイズを反映しているような１つのモデルと一貫性をもつ。多数の軽鎖インサートを含むトランスジーン遺伝子座は、１つ以上のＶ〜Ｊへの組換え事象を受ける機会を有する可能性があり、そのうちの１つが機能的なものとなる確率は増大する。かくして、高いコピー系統は、より小さい潜在的λ細胞プールを有することになる。ヒトＣＤ４及びＩｇＥでの免疫化免疫応答に参加するトランスジェニックＢ細胞の能力をテストするために、我々はヒトタンパク質抗原で２重トランスジェニックマウスを免疫化し、ＥＬＩＳＡにより抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。腹腔内注入により完全フロイントアジュバント内のポリスチレン溶球（ｃａｔ＃０８２２６，Poly sciences Inc.，Warrington，PA）に共役結合された５０μｇの組換え型ｓＣＤ４（ｃａｔ，＃０１３１０１，American Bio-Technologies Inc.，Cambridge，M A）でマウスを免疫化した。マウスの各々は、内因性μ及びκ遺伝子座の分断について同型接合であり、ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２系統２５００及びヒトκ 軽鎖トランスジーンＫＣｏ４系統４４３７について半接合である。方法血清試料を、組換え型ｓＣＤ４でコーティングされたマイクロタイターウエルへと希釈させた。ペルオキシダーゼ接合されたウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（Ja ckson Immuno Research，West Gtove，PA）又はペルオキシダーゼ接合されたヤギの抗ヒトＩｇκ（Sigma，St.Louis，MO）を用いて、ヒト抗体を検出した。図８５は、組換えヒト可溶性ＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウスの一次応答を示す。免疫化された４匹の動物は全て、抗原特異的ヒトＩｇＭ応答を１週間目に示す。ＣＤ４特異的血清抗体は、ヒトμ重鎖及びヒトκ軽鎖の両方を含んでいる。ＨＣ２トランスジーンの二次応答に参加する能力を評価するため、我々は、抗原を反復的に注入することによりトランスジェニックマウスを高度免疫し、誘発された抗体の重鎖アイソタイプを監視した。ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接合であるマウスを、０日目に完全フロイントアジュバント内の２５μｇのヒトＩｇＥκ（The Binding Site， Birmingham，UK）で免疫化した。その後、約一週間おきで不完全フロイントアジュバント中でＩｇＥκをマウスに注入した。血清試料を１対１０の割合で希釈さぜ、ヒトＩｇＥ，λでコーティングされたプレート上で抗原特異的ＥＬＩＳＡを行なった。図８６は、これらの動物からの免疫応答の標準的時間的経過を示している。我々は、完全フロイントアジュバント中のヒトＩｇＥを２重トランスジェニックマウスに注入し、その後週一回、不完全フロイントアジュバント内のＩｇＥで追加免疫した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭκであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧκ が現われた。これらのマウス内の誘発された血清抗体は、ヒトＩｇＭ又はＢＳＡに対していかなる反応反応性も示さなかった。ヒトＩｇＧの経時的発達、（原文抜け）。我々は、重鎖トランスジーンのインビトロでのクラススイッチを受ける能力もテストした；同じ重鎖構成体（ＨＣ２、系統２５５０）について半接合である脾臓Ｂ細胞が精製された形の動物は、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−４の存在下で、ヒトＩｇＭからヒトＩｇＧ１へとスイッチする。しかしながら、インビトロスイッチは、ＬＰＳ及び組換え型マフスＩＬ−２又はＬＰＳ独目の存在下で起こらなかった。２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００１１）マウスの脾臓、リンパ節、腹膜及び骨髄内にヒトＩｇＭ発現細胞が見られる。腹腔には正常な数のＢ細胞が含まれているものの、骨髄及び脾臓中のトランスジェニックＢ細胞の絶対数は、正常値の約１０〜５０％である。トランスジーン依存性のＢ細胞の発達における遅延の結果として、減少がもたらされる可能性がある。２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００１１）マウスは同様に、これらのマウスにおけるヒトμ、γ１及びκのレベルが有意なものである状態で、血清中で完全にヒトの抗体を発現する。発現されたヒトγ１は、トランスジーンμとγ１のスイッチ領域の間でのゲノミック組換えによる真正のクラススイッチの結果として得られる。さらに、トランスジーン内のクラススイッチには、トランスジーンによりコードされた重鎖可変領域の体細胞突然変異が伴う。ヒト免疫グロブリンに加えて、これらのマウス内にはマウスμ及びマウスλが見られる。マウスμ発現は、トランスジーンＶＤＪ遺伝子が内因性マウス重鎖遺伝子座内に組込まれるトランススイッチ組換えの結果であると思われる。もともと野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンについて文献内に見られたトランススイッチは、マウス下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなおも無傷であることから、我々のＪ_H ^-/-バックグラウンド内で起こる。トランスジェニックＢ細胞の免疫応答に参加する能力を実証するため、我々は、ヒトタンパク質抗原で００１１マウスを免疫化し、抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを監視した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧの発現が続く（図８６及び図８８）。ヒトＩｇＧ抗体が現われる前の遅延は、抗原に対する二次応答とクラススイッチの間の結びつきと一貫性をもつ。ヒトＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいては、ＣＤ４抗原に対するヒトＩｇＧの反応性は、２×１０^-2〜１．６×１０^-4の範囲の血清濃度で検出可能であった。抗ヒトＣＤ４ハイブリドーマの同定ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接合のトランスジェニックマウスを、０日目に完全フロイントアジュバント内の組換え体ヒトＣＤ４２０μｇで免疫化した。その後、約一週間の間隔をおいて不完全フロイントアジュバント中のＣＤ４をマウスに注入した。図８８は、トランスジェニックマウスの血清中のヒトＣＤ４に対するヒト抗体応答を示す。血清試料を１：５０で希釈し、ヒトＣＤ４でコーティングされたプレート上で抗原特異性ＥＬＩＳＡを行なった。各々のラインは、個々の試料の測定値を表わす。黒丸はＩｇＭを、白丸はＩｇＧを表わす。ライン＃７４９４（００１２；ＨＣ１−２６＋；ＪＨＤ＋＋；ＪＫＤ＋＋；ＫＣ２−１６１０＋＋）のマウスを０日目、１３日目、２０日目、２８日目、３３日目及び４７日目にヒトＣＤ４で免疫化すると、ヒトκ及びヒトμ又はγから成る抗ヒトＣＤ４抗体を産生した。２８日目に、血清中にヒトμ及びヒトκが見られた。４７日目までに、ヒトＣＤ４に対する血清応答には、ヒトμ及びヒトγならびにヒトκが含まれていた。５０日目に、Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞で脾細胞を融合させ、培養した。７００のウエルのうち４４（６．３％）がヒトγ及び／又はκ抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいた。これらのウエルのうち３つは、ヒト γ抗ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいることが確認されたが、ヒトκ鎖（おそらくはマウスλを発現する）が欠如していた。９つの１次ウエルは、完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでおり、さらなる特徴づけのため選択された。完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を発現する１つのこのようなハイブリドーマを２Ｃ１１−８と呼称した。限界希釈法により一次ハイブリドーマをクローニングし、ＣＤ４に対して反応性あるヒトμ及びκモノクローナル抗体の分泌について評価した。９つのハイブリドーマのうち５つがＣＤ４ＥＬＩＳＡにおいて陽性にとどまった。ヒトＣＤ４についてのこれらのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体の特異性は、オバルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘマシアニン及びガン胎児性抗原を含むその他の抗原との反応性が欠如していることによって実証された。これらのモノクローナル抗体が細胞表面上のＣＤ４（例えば未変性ＣＤ４）を認識できるか否かを見極めるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞系統、ＳｕｐＴ１との反応性について、これら５つのクローンの上清もテストした。５つのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体のうち４つがこれらのＣＤ４＋細胞と反応した。これらのＩｇＭ κモノクローナル抗体の特異性をさらに確実にするため、これらの抗体で、分離されたばかりのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を染色した。５つの一次ハイブリッドのうちの４つから誘導されたクローンからの上清はＣＤ４＋リンパ球のみに結合し、ＣＤ８＋リンパ球には結合しなかった（図８７）。図８７は、ヒトＰＢＬとのＩｇＭκ抗ＣＤ４モノクローナル抗体の反応性を示す。ヒトＰＢＬを各クローンからの上清又はアイソタイプ整合された負の対照モノクローナル抗体及びそれに続くＰＥに接合されたマウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（上段）又はＦＩＴＣに接合されたマウス抗ヒトＣＤ８Ａｂ（下段）のいずれかを用いてインキュベートした。それぞれＦＩＴＣ又はＰＥに接合されたマウス抗ヒトμで、あらゆる結合したヒトＩｇＭκを検出した。クローンの１つ、２Ｃ１１−８（右側）及び対照ＩｇＭκ（左側）についての代表的結果が示されている。予想通り、負の対照ＩｇＭκはＴ細胞と反応せず、ヤギ抗ヒトμは、おそらくはヒトＢ細胞である約１０％のＰＢＬと反応した。ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の産生のレベルの高さ及び優れた成長は、発達のためのクローナルハイブリドーマ細胞を選択する上で重要な要因である。ハイブリドーマの１つ２Ｃ１１−８からのデータは、最高５pg／細胞／日が産生されうることを示している（図８９）。第２のクローンの場合にも類似の結果が見られた。一般に観察されるように、細胞が定常期成長に入るにつれて産生は劇的に増大する。図８９は、細胞の成長及び小規模培養におけるヒトＩｇＭκ 抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の分泌を示す。総量２mlの中に１mlあたり２×１０⁵細胞の割合で重複培養を播種した。その後４日間２４時間毎に、培養を収穫した。生存可能な細胞を計数することにより細胞の成長を決定し、全ヒトμ（上の図版）についてＥＬＩＳＡによりＩｇＭκ産生の量を計った。ＩｇＭκの量を細胞の数で除することにより、一日細胞一個あたりの産生を計算した（下の図版）。図９０は、ヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体のエピトープ地図作製を示す。ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８（ＨＢ１１６６８）により認識されるエピトープを位置設定するため競合結合フロー血球計算実験を使用した。これらの研究のためには、ＣＤ４上の重複しないユニークエピトープに結合するマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａ及びＲＰＡ−Ｔ４を用いた。減少する濃度のＲＰＡ−ＴＡ又はＬｅｕ−３ａのいずれかで予備インキュベートされその後ひきつづき２Ｃ１１−８で染色させたＣＤ４＋細胞のＰＥ螢光を、ＰＥ接合されたヤギ抗ヒトＩｇＭで検出した。Ｌｅｕ３ａによるヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８の結合については濃度依存性競合が存在したが、ＲＰＡ−Ｔ４によるその結合については存在しなかった。かくして、２Ｃ１１−８により認識されたエピトープは、モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより認識されたエピトープと類似していたか又は同一であったが、ＲＰＡ−Ｔ４により認識されたものとは全く異なっていた。要約すると、我々は、末変性ヒトＣＤ４と特異的に反応しヒトＰＢＬＳをＣＤ４⁺及びＣＤ４^-副次集団へと弁別するのに用いることのできるヒトＩｇＭκモノクローナル抗体を分泌する複数のハイブリドーマクローンを産生した。これらの抗体のうち少なくとも１つはモノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより構成されたエピトープに又はその近くに結合する。このエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体は、温合型の白血球応答を阻害するものであることが示されてきた（Engleman et al.，J.Eyp.Med．（1981）153：193）。モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａのキメラバージョンは、菌状息肉腫を患う患者においていくつかの臨床的効力を示した（Knox et al.（1991）Blood 77：20）。我々は同様に、ヒトＣＤ４免疫化に応答したマウスの一匹からハイブリドーマ細胞系統も分離した。クローニングされたハイブリドーマのうちの５つは、組換え型ヒトＣＤ４に結合しその他の糖タンパク質抗原のパネルと交叉反応しない（ＥＬＩＳＡにより測定される通り）ヒトＩｇＧκ（ヒトγ１／ヒトκ）抗体を分泌する。ＩｇＧκハイブリドーマ、４Ｅ４．２及び２Ｃ５．１の２つにより分泌されたモノクローナル抗体に対する免疫化用ヒトＣＤ４抗原の結びつき及び解離の速度を測定した。実験的に誘導された結合定数（Ｋａ）はそれぞれ抗体４Ｅ４．２及び２Ｃ５．１について約９×１０⁷ Ｍ^-1及び８×１０⁷ Ｍ^-1であった。これらのＫａの値は、その他の者による臨床的試験において用いられてきた（Chen et al.（1993）Int.Immunol. 6：647）マウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ４抗体の範囲内に入る。ここで、ヒト免疫グロブリンを発現するＢ細胞が発達を受け、マウス免疫系の情況の下で抗原に応答するという結論を下したい。抗原反応性は免疫グロブリン重鎖アイソタイプスイッチ及び可変領域体細胞突然変異を導く。我々は又、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るのに従来のハイブリドーマ技術を用いることかできるということも実証してきた。従ってこれらのトランスジェニック抗体は、ヒト標的抗原に対するヒト抗体の供給源である。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。上記表Ｂは本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの分化のクラスター（cluster of differentiation）（ＣＤ）の例のリストである。上記表Ｃは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの非−ＣＤ抗原の例のリストである。本発明のトランスジェニックマウスを表Ｄから選択されたヒト−病原体又は抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは、ヒト病原体と結合する抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト病原体に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。上記表Ｄは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生せしめるための、ヒト病原体及びその抗原の例のリストである。上記の表Ｅは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを発生させるためのヒト病原体及びそれらの抗原の例のリストである。本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記載してきたが、請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。図面の簡単な説明図１図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。図２図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。図３図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。図４図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。図５図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５kb断片に次いでラット鎖３′エンハンサ−配列を含む７００bp断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。図６図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。図７図７はｐＧＰ１の作製を示す。図８図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカーの構成を示す。図９図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。図１０図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。図１１図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３′ ）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。図１２図１２は、ｐＨＩＧ３′およびｐＣＯＮの作製を示す。図１３図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。図１４図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。図１５図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ 遺伝子セグメントを包含する断片を示す。図１６図１６はｐＥμの構造を示す。図１７図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。図１８図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。図１９図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。図２０図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。図２１図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。図２２図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。図２３図２３は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。図２４図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。図２５図２５はκ鎖標的用ベクターの構造を示す。図２６図２６はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。図２７図２７はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。図２８図２８はベクターｐＧＰｅの地図を示す。図２９図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。図３０図３０はベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。図３１図３１はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。図３２図３２はｐγｅ２の構造を示す。図３３図３３はｐＶＧＥ１の構造を示す。図３４図３４はｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。図３５図３５はｐＪＣＫ１の構造を示す。図３６図３８は合成重鎖可変領域の作製を示す。図３７図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＣＭ₁，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。図３８図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１，ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。図３９図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。図４０図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。図４１図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。図４２図４２はプラスミドｐＢＣＥ１の略図である。図４３図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（３７Ａ），ＫＬＨ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（３７Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。図４４図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥΛ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免役処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。図４５図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。図４６図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に麦示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図４７図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によっで免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図４８図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組識から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対すろヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図４９図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図５０図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行にわいて、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図５１図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。図５２図５２は、ヒストグラム形式での図４０のデータを示す；推定アミノ酸残基位置が縦座標として示され（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方向である）そして配列変異の頻度が横座標として示される。図５３図５３は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。図５４図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。図５５図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。図５６図５６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換えによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。図５７抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクローナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。図５８ヒトＶＤＪ及びマウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。図５９ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。図６０３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウス μについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。図６１３つのマワス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウス κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。図６２３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。図６３４つのマウス遺Ｅ子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒト κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。図６４免疫化されていない血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。図６５さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。図６６００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。図６７ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗体力価を示す。図６８ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、及び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。図６９ Storb et al.（1989）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。図７０相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。図７１「免疫グロブリン遺伝子」、Honjo，T，Alt，FW，及びRabbits TH（eds）Acad emic Press，NY（1989）p129から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。図７２マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。図７３マウス重鎖遺伝子座Ｊ₄遺伝子内に２つのbpフレームシフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。図７４高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。図７５クラススイッテ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃＩ／ＳｆｉＩ消化されたＤＮＡのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ −５Ｈ１−５、ヒトγ１⁺／μ^-；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１⁺ ／μ^-；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１^-，μ⁺。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。ブロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３′半部分にまたがる２．３kbのＢｇｌII／ＳｆｉＩＤＮＡフラグメントから誘導されたプローブでハイブリッド形成される。 μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つの γ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２− ２は、それぞれ、５．１kb及び５．３kbのＰａｃＩ／ＳｒｉＩフラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。図７６図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子にば、μを欠失するべく組換えできる４００bpの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えによるクラススイッチは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４kbと７ kbの間のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッチ領域の間で組換えを受けていると思われる。図７７トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ節のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。図７８再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。図７９図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クローンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列内の小文字はＨＣ１トランスジーン内に含まれている既知のＤセグメントに対する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表Ｄされている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらは単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対しで１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頻度は１．６％（５２／３，１９８bp）。図８０広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団内で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図６８参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。図８１図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５，６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図８０及び８１の凡例を参照のこと。図８２ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１セグメントでの体細胞突然変異の全体的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。図８３分祈された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ＋／−，ＪＣκ＋／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０＋，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒト μ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細胞のヒストグラム（対数螢光：ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基つくｅ−パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０＋細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの百分率として与えられている。図８４２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４２重トランスジェニックマウスからのマウスＴ及びλ及びヒトμ，γ 及びκ。マウス：（＋）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（○）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピー）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コビー、ＫＣｏ４系統４４３７。図８５ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免疫化後（●）の血清について報告されている。図８６図８６：インビボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたペルオキソダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正方形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でペルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ 試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４４；ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。図８７ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。図８８トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４ＩｇＭａｎｆＩｇＧを示す。図８９トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃ１１−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。図９０培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。図９１重鎖恒常領域遺伝子といった遺伝子を欠失させるための相同組換えターゲッティングトランスジーンの構造を概略的に示す。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。Detailed Description of the Invention Invention title Transgenic non-human animal capable of producing heterologous antibody Industrial applications The present invention provides a transgenic non-human animal capable of producing a heterologous antibody, The transgene used to produce such transgenic animals. ene), for functional rearrangement of a heterologous D gene in VDJ recombination Transgene, immortalized B cells capable of producing heterologous antibody, Methods for producing isotype heterologous antibodies and transgenes therefor, including Methods for inactivating or suppressing expression of causative immunoglobulin loci and methods thereof For transgene, germline rearranged variable region sequences Methods and methods for producing heterologous antibodies whose variable region sequences comprise somatic mutations For producing a transgene, an antibody having a human primary sequence and binding to a human antigen A transgenic non-human animal, such a B cell of a transgenic animal? Hybridoma produced from the same, and monochrome expressed by the hybridoma Internal antibody. Conventional technology Facing the development of biotherapeutic and diagnostic applications for monoclonal antibodies in humans One of the major disorders is the innate immunogenicity of non-human immunoglobins. For example, exempt When a therapeutic dose of a rodent monoclonal antibody is administered to a human patient who is tolerant to epidemics, the patient will Produce antibodies against rodent immunoglobulin sequences and their human anti-mouse antibody ( HAMA) can neutralize therapeutic antibodies and cause acute toxicity. Therefore, a promising treatment And / or human immunoglobs reactive with specific human antibodies that are diagnostic targets It is desirable to make phosphorus. Current techniques for producing monoclonal antibodies are currently used in animals (usually rats and Are pre-exposed to the antigen or sensitized with the antigen and the B Cells and collecting a library of hybridoma clones. U Screen the hybridoma population for antigen-binding specificity (idiotype) And also screened for immunoglobulin class (isotype) To select a hybridoma clone that secretes the desired antibody by Is possible. However, current methods for producing monoclonal antibodies have been linked to human antigens. When applied for the purpose of producing human antibodies with conspecificity, humans typically It will not produce an immune response to self-antigens and will therefore produce human immunoglobulins. Obtaining live B lymphocytes is a serious obstacle. Therefore, it is currently necessary to prepare human monoclonal antibodies that specifically react with human antigens. The law is clearly inadequate. As a source of B cells for producing hybridomas Even when using human species, it is possible to produce monoclonal antibodies against the true self-antigen. The same restrictions apply to that. Transgenic animals containing a functional heterologous immunoglobulin transgene Is a method capable of producing an antibody that reacts with a self-antigen. Only However, expression of therapeutically useful antibodies, or hybrids that produce such antibodies. In order to obtain a dorma clone, the transgenic animal should undergo the B lymphocyte development process. Must produce transgenic B cells that can mature through Yes. Such maturation requires the presence of surface IgM on transgenic B cells However, isotypes other than IgM are desired for therapeutic use. Therefore, functional V-D A transgene capable of undergoing J rearrangement to generate recombinational diversity and conjugative diversity And animals having such transgenes are required. Furthermore, that Such transgenes and transgenic animals are preferably essential for B cell maturation. From the required first isotype to the next isotype with excellent therapeutic efficacy Contains a cis-acting sequence that promotes isotype conversion of Numerous experiments have been performed to determine the specific DNA sequence required for Ig gene rearrangement. We have reported the use of transfected cell lines [Lewis and Gellert (19 89),Cell,59, 585-588]. Such reports identified putative sequences, and The accessibility of those sequences to the recombinase used for rearrangement is transferred. Concludes that it will be modified by photocopying [Yancopoulos and Alt (1985),Cell,40 , 271-281]. The sequence for the V (D) J bond is reportedly highly conserved. Separated palindromic heptamers with either 12 or 23 bp spacers. It is a highly conserved high AT nanomer produced by Tonegawa (1983),Na ture ,302, 575-581; Hesse et al. (1989),Genes in Dev.,3, 1053-1061]. efficiency Recombination reportedly has spacer regions of different lengths It occurs only between the sites containing the recombination signal sequence. Ig gene rearrangements have been studied in tissue culture cells but Nick Mouse has not been studied in detail. Rearrangement test system introduced into mouse Only a few reports describing the product have been published [Buchini et al.Natur e ,326: 409-411 (1987) (non-rearranged chicken lambda transgene); G oodhart et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4229-4233 (1987) (rearranged Not the rabbit κ gene); and Bruggemann et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 86: 6709-6713 (1989) (hybrid mouse-human heavy chain)]. However , The results of such experiments are variable and, in some cases, transgene incompleteness. May result in total or minimal rearrangement. In addition, the Fc portion of the molecule allows for diverse biological functions of the antibody molecule, such as Fcε. Interaction with mast cells or basophils, and by Fcμ or Fcγ The function of exerting binding of complement, which has specific specificity due to isotype change It is further desirable to generate a biologically diverse antibody. Transgene containing a transgene encoding one or more chains of a heterologous antibody Nick animals have been created but are subject to successful isotype switching. There are no reports of seed transgenes. Of isotype switching Non-transgenic animals produce heterologous antibodies of a single isotype More specifically, isotypes that are essential for B cell maturation, such as IgM And probably IgD-producing antibodies, whose antibodies have limited therapeutic utility. Can be Based on the above, by the gene sequence of the first species produced in the second species There is a need for methods to efficiently produce encoded heterologous antibodies Is clear. More specifically, all of the D segments that contribute to recombination diversity. Heterologous immune group capable of undergoing functional VDJ gene rearrangement including Roblin Transgene and Transgenic Animal Requirements Demand in the Industry Exists. Furthermore, (1) functional B cell development occurs, and (2) therapeutically useful Support V-D-J recombination and isotype switching so that various heterologous antibodies are produced. The requirements for transgenes and transgenic animals Exists in this world. Therapeutic or diagnostic product in the particular species for which the antibody is designed A B cell source capable of producing hybridomas producing clonal antibodies There is also a demand to do so. Functional VDJ Recombinant and / or Isotype Switch Heterologous immune globulin transgenes that are subject to Can meet. According to the above-mentioned purpose, a tiger which can produce a heterologous antibody, for example, a human antibody A transgenic non-human animal is provided. Furthermore, is such a transgenic animal capable of expressing a heterologous antibody? B cells, which provided a source of monoclonal antibodies specific for a particular antigen. It is an object of the present invention to provide said B cells that have been immortalized for this purpose. According to this above-mentioned purpose, it is possible to produce such a heterologous monoclonal antibody. It is a further object of the invention to provide a hybridoma cell that is capable. Furthermore, rearranged to be useful in the production of the non-human transgenic animals described above. Missing and rearranged heterologous immunoglobulin heavy and light chain transgenes It is an object of the invention to provide. Furthermore, it disrupts the endogenous immunoglobulin loci in transgenic animals. It is an object of the present invention to provide a method of doing so. Furthermore, it induces heterologous antibody production in the transgenic non-human animals described above. It is an object of the present invention to provide a method of doing so. A further object of the invention is to produce one or more transgenes of the invention. The immunoglobulin variable region gene segment repertoire used for Is to provide a method. The above references are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Be done. The inventors of the present invention found that prior inventions were not entitled to such disclosure by virtue of prior invention. It should not be construed as mediocre. SUMMARY OF THE INVENTION Transgenic non-human capable of producing heterologous antibody, eg human antibody Animals are provided. Such heterologous antibodies include IgG1, IgG2, IgC3, IgG4, IgM, IgA 1, IgA2, IgA_sec, Of various isotypes, including IgD or IgE it can. In order for such transgenic non-human animals to mount an immune response, B Transgenic B cells and pre-B cells to effect cell development and antigen-stimulated maturation. Cells are surface-bound immunoglobulins, especially of the IgM (possibly IgD) isotype. It is necessary to produce. Such IgM (or IgD) surface bound immunity Globulin expression is required only during antigen-stimulated maturation of B cell development, Produces only isotypes that have been switched once, while mature B cells can Can produce Cells of the B cell lineage typically produce only a single isotype at one time Wax, μ_s(Secretory μ) and μ_M(Membrane bound μ) type, and μ and δ immune groups A cis or trans alternative RNA splice, such as occurs naturally in the robin chain Sing can result in the simultaneous expression of multiple isotypes by a single cell. Follow And multiple isotypes of heterologous antibodies, particularly therapeutically useful IgG, IgA and IgM isoforms. In order to produce a heterologous antibody of a certain type, isotype switching must occur. And are required. Such isotype switching is a classic class switch May be present or derived from one or more nonclassical isotype switch mechanisms. You may turn. The present invention provides heterologous immunoglobulin transgenes and such transgenes. And a transgenic animal having the same, wherein the transgenic animal is provided. Produces multiple isotype heterologous antibodies by undergoing isotype switching Can be The classical isotype switch is at least in the transgene It is caused by a recombination phenomenon involving one switch sequence region. Non-classical isota Ipswitch is, for example, a homologous recombination between human σμ sequence and human Σμ sequence (δ- Related deletion). Other non-classical switch mechanisms, such as transformers in particular Intergenic and / or interchromosomal recombination may perform isotype switching it can. Such transgenes and transgenic animals contain antigen-stimulated B cells. Produces the first immune gcobrin isotype required for cell maturation and is therapeutically And / or encodes one or more second heterogeneous isotypes with diagnostic utility Can be switched to produce. Therefore, the transgenesis of the present invention The non-human animal is, in one aspect, encoded by a human immunoglobulin gene sequence. And an IgG, IgA and / or IgE antibody that binds to a specific human antigen with high affinity Can be produced. The present invention provides a transgene capable of expressing heterologous antibodies of various isotypes. It also relates to B cells from nicked animals, such B cells being specific for a particular antigen. Immortalized to provide a source of specific monoclonal antibodies. Such B cells Hybridoma cells derived from S. cerevisiae are one of such heterologous monoclonal antibodies. Can serve as one source. The present invention is directed to or in such non-human transgenic animals as described above. In vivo isotypes in B cell line lymphocytes explanted from transgenic animals. Unrearranged and rearranged heterologous immunity, which can undergo switch Provides globulin heavy and light chain transgenes. Such isotypes Itte occurs naturally or is a transgenic animal or explanted B Cell line lymphocytes with isotype switch promoters such as lymphoid cells derived from T cells Can be induced by treatment with a protein (eg IL-4 and IFNγ). Furthermore, the present invention provides heterologous antibody production in the transgenic non-human animals described above. Methods of deriving, wherein such antibodies are of various isotypes be able to. These methods can be applied to heterologous antibodies, especially switched isotypes (Ig G. IgA and IgM) transgenic non-human animals for the production of heterologous antibodies Generating an antigen-stimulated immune response in. The present invention relates to a heterologous immunoglobulin produced in a transgenic animal and Monoclonal antibody clones derived from the B cells of the animal have various isotypes. Sequence in which the transgene performs an isotype switch, such as A method including is provided. The present invention further contemplates that the switch between specific isotypes is dependent on the germline immunoglobulin signature. Occurs much more frequently or less frequently than typically occurs in the locus, or Promotes transgene isotype switching to occur in different time sequences Provide a way to The switch area has various C_HTransplant from Gene and Tran Another C in the Sgene composition_HIt can be linked to a gene. Such a move Plant switch arrays are typically combined C_HIt functions independently of genes and Therefore, the switch in the transgene construct is the original function of the combined switch region. Will. Alternatively, along with the switch sequence, the delta-binding deletion sequence has various C_H Is linked to the gene and is non-classical due to a deletion of the sequence between the two delta-bond deleted sequences. You can play the switch. Therefore, the specific C_HSwitch sequences with different genes Occurs when using a switch region that is linked to and thereby naturally bound It is possible to make transgenes that are switched more frequently. The present invention also provides a transgenic containing immunoglobulin transgene. Determine if transgene sequence isotype switching occurs in animals Provide a way to determine. The present invention provides for some of these, including germline immunoglobulin locus sequences (deletion An immunoglobulin transgene construct containing a subset of And a method of making an immunoglobulin transgene construct. The present invention A special method for easy cloning and production of immunoglobulin transgenes And the unique XhoI and SaII controls flanked by two unique NotI sites. Includes methods that require a vector that uses a restriction site. The transgene of the present invention comprises at least one variable gene segment, one DN encoding a connecting gene segment and one constant region gene segment Includes a heavy chain transgene comprising A. Immunoglobulin light chain trans Is at least one variable gene segment, one connecting gene segment And a DNA encoding one constant region gene segment. Light chain And gene segments encoding heavy chain gene segments are Heterologous or transgenic for the transgenic non-human animal Nick immunoglobulin heavy and light chain gene sequences from species not composed of non-human animals Corresponding to the DNA encoding the pigment. According to one aspect of the invention, individual gene segments are not rearranged and Rearranged to encode a functional immunoglobulin light or heavy chain A transgene is created that does not. Such unrearranged tran Sgene, when transgenic non-human animals are exposed to antigen, Recombination (functional rearrangement) of the gene segment with the resulting rearranged Allows expression of immunoglobulin heavy and / or light chains. According to one aspect of the invention, a heterologous heavy and light chain immunoglobulin transgene Comprises relatively large pieces of rearranged heterologous DNA. Such a fragment Is typically C, J (and in the case of heavy chains from the heterologous immunoglobulin locus) D) comprises a substantial portion of the segment. In addition, such fragments are It also comprises a substantial portion of the cement. In one aspect, such transgene constructs contain regulatory sequences, such as promoters. Inducer, enhancer, class switch region, recombination signal, heterologous DNA It includes the derived corresponding sequence and the like. Alternatively, such regulatory sequences may be used in the present invention. Incorporation into the transgene from the same or related species as the non-human animal used be able to. For example, for use in transgenic mice, rodent immunization Human immunoglobulin inheritance in a transgene with a lobulin enhancer sequence. You can combine child segments. In the method of the present invention, light chain and heavy chain immunoglobulins that are not germline rearranged Transgene—ie, one that undergoes VDJ binding during D-differential differentiation—contacts with antigen At most, induce the production of xenoantibodies in secondary repertoire B cells. Vectors that disrupt the endogenous immunoglobulin loci in the non-human animals used in the present invention. Vectors and castors are also included in the present invention. Such vectors and methods are Lancegene, preferably positive-negative selection Vector, which is used in the non-human animal it uses in the present invention. Genes encoding heavy and / or light chain immunoglobulins that are endogenous Configured to target functional disruption of a class of segments. Such an internal cause Sex gene segments include diversity regions, connecting regions and constant region gene segments. Ment. According to this aspect of the invention, at least a positive-negative selection vector is used. Positive-negative selection after contact with embryonic stem cells of a single non-human animal. A cell in which another vector is integrated into the genome of a non-human animal by homologous recombination Select After transplantation, the resulting transgenic non-human animal will contain the vector As a result of homologous integration, it is likely to initiate an immunoglobulin-mediated immune response. Qualitatively impossible. Such immunodeficient non-human animals would then be immunodeficient. Can be used for research or heterologous immunoglobulin heavy and light chain transgenes Can be used as a receptor for The present invention also provides one or more without disrupting the endogenous immunoglobulin loci. Vectors, methods and methods useful for suppressing expression of immunoglobulin chains of multiple species A composition is provided. Such a method is encoded by the transgene 1 Or by transgene, allowing the expression of multiple immunoglobulin chains Useful for suppressing the expression of one or more encoded immunoglobulin chains . Unlike genetic disruption of the endogenous immunoglobulin chain locus, immunoglobulin chain Inhibition of expression is associated with a trans that is homozygous for the disrupted endogenous Ig locus. It does not require the time consuming breeding required to establish a transgenic animal. An additional advantage of the suppression method over the endogenous Ig gene disruption method is, in certain aspects, , Chain repression is reversible in individual animals. For example, Ig chain suppression is (1 ) An antisense RNA that specifically hybridizes to an endogenous Ig chain gene sequence A transgene that encodes and expresses (2) a gene that is specific for the endogenous Ig chain gene sequence. Antisense oligonucleotides that hybridize, and (3) endogenous Ig chains Can be achieved using an immunoglobulin, which binds specifically to the polypeptide It The present invention provides a homozygous pair of functionally disrupted endogenous heavy chain alleles, functionally A homozygous pair of disrupted endogenous light chain alleles, a heterologous immunoglobulin heavy chain tiger. At least one copy of the gene, and a heterologous immunoglobulin heavy chain trans An antigen, such as a human antigen (eg CD4), which contains at least one copy of the gene Non-human transgenic animals that produce an antibody response following immunization with To serve. The present invention also provides that the functionally disrupted endogenous heavy chain allele is J_H Is a region homologous recombination knockout, said functionally disrupted endogenous light chain allele The gene is J_kA region homologous recombination knockout, wherein the heterologous immunoglobulin heavy chain The transgene is an HC1 or HC2 human minigene transgene, wherein The light chain transgene is KC2 or KCle human κ transgene, and the antigen is Non-human transgenic animals, which are human antigens, are also provided. The present invention also suppresses, excises and / or represses the endogenous human immunoglobulin loci. Various embodiments for functional decoupling are also provided. The invention also includes a key sequence comprising a human sequence heavy chain variable region and a mouse sequence heavy chain constant region. Also provided is a transgenic mouse expressing both the mela heavy chain and the human sequence heavy chain. To do. Such chimeric heavy chains are generally functionally rearranged human transgenes. And the endogenous mouse heavy chain constant region (γ1, γ2a, γ2b, γ3). Produced by sswitch. For standard ports, transgene-coded human distribution An antibody comprising such a chimeric heavy chain in combination with a lane light chain or an endogenous muffus light chain is , Formed in response to immunization with a predetermined antigen. These embodiments The transgenic mice produce (express) human sequence heavy chain at the first time point and ( Human variable region and mouse constant region (eg, γ1, γ2a, γ) Transswitch to produce (express) a chimeric heavy chain consisting of 2b, γ3) B cells can be included; such human sequences and chimeric heavy chains have light chains. Active antibody: Such an antibody can Present in the serum of. Thus, in other words, the transgenic mice of these embodiments are human The sequence heavy chain is expressed and then human variable regions and alternating constant regions (eg mouse γ1 , Γ2a, γ2b, γ3: chimera or isotype consisting of human γ, α, ε) Switch to express the heavy chain that has undergone the switch (transswitch or sysswitch). B-cells containing such human sequences and such chimeric or isomeric sequences. The type-switched heavy chain is assembled into a functional antibody (human or mouse) with a light chain. Such antibodies are present in the serum of such transgenic mice. The references cited herein are for their disclosure prior to the filing date of the present application. Provided only to show that According to the prior invention, the present inventors Should not be construed as an admission that any person is entitled to any prior disclosure. No. (Chemical formula 2) and (Chemical formula 3) show the sequences of the vector pGPe. (Chemical formula 4) and (Chemical formula 5) are gene V_HThe sequence of 49.8 is shown. Table 1 shows the detection of human IgM and IgG in the serum of the transgenic mouse of the present invention. Show the output. (Chemical formula 6) and (Chemical formula 7) show sequences of VDJ junction. Table 2 compares the J segment found in adult peripheral blood lymphocytes (PBL). A J-segment incorporated into a transcript encoded by the pHCl transgene The distribution of the ment is shown. Table 3 compares the D segments found in adult peripheral blood lymphocytes (PBL). D segment incorporated into the transcript encoded by the pHCl transgene The distribution of the ment is shown. (Chemical formula 8) and (Chemical formula 9) are used in pHCl transgenic mice or human PBLs. The length of the CDR3 peptide from the transcript with in-frame VDJ junction is shown. Table 4 shows 30 clones of VDJ region analyzed from pHCl transgenic mice. The deduced amino acid sequence of the region is shown. Table 5 shows the line 112 transgenic mice used in the indicated experiments. (+) Indicates the presence of each transgene, and (++) indicates that the animal is J._HD collision It is shown to be homozygous for the outgoing transgene. (Table A) Shows the genotypes of several 0011 mice. <Table 7> Body in HC2 heavy chain transgene in transgenic mice Shows the occurrence of cellular mutations. Specific explanation As mentioned above, specific human anti-tumor agents that are promising therapeutic and / or diagnostic targets. It is desirable to produce human immunoglobulins that react with the stock. However, There are problems with human immunoglobulins that specifically bind to antigen. First, immunized animals, which act as a source of B cells, are immune to a given antigen. You must give an answer. In order for an animal to mount an immune response, a given antigen must Must come and the animal must be tolerant to the antigen. Therefore, For example, a human monoclonal antibody with an idiotype that binds to a human protein If it is desired to produce the body, self-tolerance is substantially dependent on human proteins. It will prevent a successful immune response. Because of the potential of the antigen to be immunogenic The only epitope derived from a protein polymorphism in the human population (homologous This is because it may be an allogeneic epitope). Second, animals that act as a source of B cells to form hybridomas (eg. Humans) will generate an immune response to the authentic self-antigen, Minor autoimmune diseases can occur. When humans are used as a source of B cells for hybridomas In the case such autoimmunization is considered illogical by modern moral norms. To be done. Human antibody secretion thus capable of eliciting an antibody response to a predetermined human antigen Since B cells are required, they have specific reactivity with predetermined human antigens. There are many problems in developing hybridomas that secrete human immunoglobulin chains . One that can be used to obtain human antibodies that specifically react with human antigens The methodology is based on transfections containing the human immunoglobulin transgene constructs of the invention. This is the production of a transgenic mouse. Briefly, human immunoglobulin heavy chain and And a transgene containing all or part of the light chain locus, or human heavy chain And a synthetic “small locus” (see below, And co-pending US Application No. 07 / 574,748 filed August 29, 1990 and 1990 No. 07 / 575,962 filed on August 31, and PC filed on August 28, 1991 (Described in T / US91 / 06185). Make a transgenic non-human animal. Such transgenic non-human animals contain human immunoglobulin genes. Has the ability to produce an encoded immunoglobulin chain, and is moreover capable of binding to human antigens. And could generate an immune response. Therefore, such a transgene Non-human animals can serve as a source of immune serum that reacts with specific human antigens. , Fusing B cells from such transgenic animals with myeloma cells By secreting a monoclonal antibody that specifically reacts with human antigens. Ibrithomas can be produced. Production of transgenic mice containing various forms of immunoglobulin genes Have been previously reported. Rearranged to produce transgenic mice Mouse immunoglobulin heavy chain or light chain genes are used. In addition, μ or Functionally rearranged human Ig gene containing the γ1 constant region is transgenic It is expressed in the mouse. However, the transgene is not rearranged (Non-rearranged VDJ or VJ) immunoglobulin gene. Experiments are variable and, in some cases, incomplete or minimal transgenes. May cause rearrangement. However, C in the transgene_HBetween genes Rearranged or unrearranged immunity subject to consequent isotype switching No example of a globulin transgene has been reported. The present invention also relates primarily to polypeptide binding to human constant region sequences. A monoclonal antibody containing a human immunoglobulin chain consisting of a human VDJ sequence Also provided is a method for identifying a secreting hybridoma candidate. Such a hybrid The dorma candidate is (1) an immunoglobulin consisting essentially of human VDJ region and human constant region. A hybridoma clone expressing a brin chain, and (2) basically a human VDJ region Expresses a heterohybrid immunoglobulin chain consisting of a region and mouse constant region Pool of hybridoma clones containing transswitched hybridomas Identified from. The supernatants of individual or pooled hybridoma clones were Standard under binding conditions to select antibodies with defined antigen-binding specificity. Are immobilized on a fixed substrate (eg microtiter well) by adsorption. It is contacted with the original, predetermined antigen. Similarly, for an antigen that specifically binds to the human constant region, the antibody is at least one human. Although it selectively binds to a constant region epitope, it does not bind to a mouse constant region epitope. Contact the hybridoma supernatant and the predetermined antigen under binding conditions that do not match. Touched, thus binding to a predetermined antigen and specifically to human constant regions Hybridoma supernatant bound to antibody (transgenic monoclonal antibody ) Form a complex (and this is a detectable label) Or it can be labeled with a reporter). The detection of the formation of such complexes is Hybridoma clones or pools that express immunoglobulin chains.Definition As used herein, the term "antibody" means at least two identical light polypeptides. It refers to a glycoprotein comprising a peptide chain and two identical heavy polypeptide chains. Heavy And the light polypeptide chain each contain a variable domain containing a binding domain that interacts with the antigen. Region (usually the amino terminal portion of the polypeptide chain). Heavy and light polypep Each of the tide chains also contains the constant region of the polypeptide chain (usually the carboquine terminal portion). And part of its sequence consists of various cells of the immune system, certain phagocytes and typical Mediates immunoglobulin binding to host tissues containing the first component of the complement system (Clq) . As used herein, a "heterologous antibody" is a trangenic antibody that produces such an antibody. Defined in relation to the transgenic non-human organism. It is a non-transgenic Has an amino acid sequence that corresponds to that found in an organism that does not consist of human animals Or an antibody encoding a DNA sequence. As used herein, a "heterohybrid antibody" is derived from different organisms. Antibody having a light chain and a heavy chain. For example, a human heavy chain associated with a mouse light chain The antibody having is a heterohybrid antibody. As used herein, "isotype" refers to the heavy chain constant region gene for coding. Antibody class (eg IgM or 1gG)₁) Say. As used herein, “isotype switch” refers to the class or antibody of an antibody. A phenomenon in which a sotype changes from one Ig class to another Ig class. U As used herein, "non-switched isotype" is an isotype switch. Refers to the class of heavy chains produced when no. Non switch isotype C to code_HThe gene is typically immediately following the functionally rearranged VDJ gene. First C downstream_HIt is a gene. As used herein, the term "switch sequence" refers to a switch that results in recombination. We refer to these DNA sequences. A "switch donor" sequence, typically the μ switch region Is 5 '(ie upstream) of the constant region which will be deleted during switch recombination right. The "switch receptor" region contains the constant region and alternative constant region that would be deleted. Between regions (eg, γ, ε, etc.). There is no unique site where recombination always occurs Therefore, the final gene sequence will typically not be predictable from the construct. As used herein, “glycosylation pattern” refers to proteins, more specifically Or the pattern of hydrocarbon units covalently bound to immunoglobulin proteins Is defined as One of ordinary skill in the art will understand the glycosylation pattern of a heterologous antibody in a transgene. C_HGlycos in nonhuman transgenic animal species than in the species from which the gene is derived. Glycosylation of a heterologous antibody can occur when it is perceived as more similar to the silylation pattern. Silation pattern is an antibody produced by a non-human transgenic animal species Should be characterized as being substantially similar to the naturally occurring glycosylation pattern above. You can As used herein, "specific binding" means that the antibody (1) has a predetermined anti-binding activity. At least 1 × 10 on the hara⁷ M^-1Binding with an affinity of, and (2) a predetermined anti- Less than binding affinity to non-specific antigens other than the original (eg BSA, casein) Both have a 2-fold higher affinity and preferentially bind to a predetermined antigen. As used herein, the term "naturally-occurring" means when applied to an object. Say that the object can be found naturally. For example, isolated from natural sources Organisms that are capable of being generated and have not been intentionally modified by humans in the laboratory. A polypeptide or polynucleotide sequence present in It exists in. As used herein, the term "rearranged" refers to the V segment Each is essentially a perfect V_HOr V_LIn the structure encoding the domain DJ or Is the heavy or light chain immunoglobulin locus located immediately adjacent to the J segment Say the arrangement. Rearranged nocturnal globulin loci compared to germline DNA Can be identified by; the rearranged locus contains at least one hepta Will have mer / nanomer homology elements. As used herein with respect to V segments, "unrearranged" or The term "germ cell placement" refers to the immediate proximity of the D or J segment. Refers to the arrangement in which the V segments are not recombined. For nucleic acids, “substantial homology” also refers to optimally aligned and compared. The two nucleic acids or their designated sequences have at least about 80% nucleotides, Usually at least about 90% to 95%, more preferably at least about 98-99.5% Reotide is shown to be identical with appropriate nucleotide insertions or deletions. I forgot. Alternatively, to complement strands under selective hybridisation conditions. There is substantial homology when the segments hybridize. Nucleic acid Can be in whole cells, in cell lysates, or in partially purified form or substantially pure. It can exist in a stylish form. Nucleic acid is treated with alkali / SDS, C_sCl handing Rum chromatography, agarose gel electrophoresis and other techniques known in the art. Standard techniques, including other techniques known to those skilled in the art, for example other cellular nucleic acids or tampering Other cellular constituents, such as protein, can be "mineralized" once they have been purified from other contaminants. “Separated” or “substantially pure”. F. Ausubel, et. al., ed ． "Current Protocols in Molecular Biology'', Greene, Publishing and Wiley-In See terscience, New York (1987). The nucleic acid compositions of the present invention are often either cDNA genomic or a mixture. Although it is in the native sequence (excluding modified restriction sites) from the Can be mutated therefrom to provide a gene sequence according to the technique . For coding sequences, these mutations may be It can affect the sequence. In particular, unmodified D, J. Substantially homologous to the coupling switch Or DNA sequences derived from them and other amino acid sequences described herein. Such sequences are considered (here, "induced" means that one sequence is Represents the same or modified from one sequence). Nucleic acid is "operably linked when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid. It For example, a promoter or enhancer may affect the transcription of a sequence. , "Operably linked. Regarding transcriptional repression sequences, operably linked. Means that the linked DNA sequences are adjacent to each other and means that the two protein coding regions are Adjacent, and within the reading frame, if necessary to connect the zones is there. For switch arrays, operably linked means that the array is a switch set. It means that replacement can be performed.Transgenic non-human animal capable of producing heterologous antibody Transgenic non-human responsive to foreign antigen stimulation by a heterologous antibody repertoire. The animal design is based on the heterologous immune glob contained inside the transgenic animal. Requires the phosphotransgene to function correctly through the B cell development pathway . In a preferred embodiment, the correct function of the heterologous heavy chain transgene is isotype switching. Including chi. Therefore, it results in an isotype switch and one or more of the following: The transgene of the present invention is produced to provide: (1) high level and Cell-type specific expression, (2) functional gene rearrangement, (3) allele exclusion activity Sexualization and response thereto, (4) expression of sufficient primary repertoire, (5) si Gunal transduction, (6) somatic hypermutation, and (7) Dominantization of the transgene antibody locus during the immune response. As will be apparent from the disclosure below, not all of the above criteria need to be met. For example , A functional disruption of the endogenous immunoglobulin loci in transgenic animals In those embodiments, the transgene need not activate allelic exclusion . In addition, the transgene is functionally rearranged heavy and / or light chain immunogroups. In an embodiment comprising the lobulin gene, the second criterion, the multipotent gene rearrangement Rows are not needed at least for transgenes that have already been rearranged. Molecular exemption For background on epidemiology,Fundamental Immunolo-gy, 2nd edition (1989), Pau l William E. Ed., Raven Press, N.Y. checking ... This is here for reference Incorporated in. In one aspect of the present invention, in germ cells (germ lines) of transgenic animals Reordered, unreordered, or reordered with Heterologous immunoglobulin heavy and light chain transgenes in combination with those without Transgenic non-human animals are provided which contain Heavy chain transgy Each of the at least one C_HComprising a gene. In addition, the heavy chain trans Is a large number of C in B cells of transgenic animals._HDifferences encoding genes A functional isotype capable of supporting the isotype switch of the seed transgene A switch arrangement may be included. Such a switch sequence is transgene C_H Naturally present at germline immunoglobulin loci from species that act as sources of genes Can accept or accept transgene constructs. Can also be derived from those present in the species (transgenic animal) It For example, the human transgene used to produce transgenic mice The construct is similar to that naturally occurring in the mouse heavy chain locus. Switch sequence may result in a higher frequency of isotype switching. it can. Because, probably the mouse switch array is a mouse switch combiner The enzyme system is optimized for function, while the human switch sequence is optimized. Because there will not be. The switch sequence should be isolated and cloned by conventional cloning techniques. Can be rotated or expressed with respect to immunoglobulin switch region sequences. Starting with overlapping synthetic oligonucleotides designed based on the sequence information presented (Mills et al.,Nucl. Acids Res. 18: 7305-7316 (1991) ; Siderras et al.Intl. Immunol. 1:631-642 (1989), which are hereby incorporated by reference. Incorporated in the book). A functionally rearranged heterologous heavy chain for each of the above transgenic animals. And light chain immunoglobulin transgenes are significant in transgenic animals. Detected in a proportion (at least 10 percent) of B cells. The transgene of the present invention comprises at least one variable gene segment, one DN encoding a connecting gene segment and one constant region gene segment Includes a heavy chain transgene comprising A. Immunoglobulin light chain trans Is at least one variable gene segment, one connecting gene segment And a DNA encoding one constant region gene segment. Light chain And gene segments encoding heavy chain gene segments are Heterologous or transgenic for the transgenic non-human animal Nick immunoglobulin heavy and light chain gene sequences from species not composed of non-human animals Corresponding to the DNA encoding the pigment. According to one aspect of the invention, individual gene segments are not rearranged and Rearranged to encode a functional immunoglobulin light chain or heavy chain A transgene is created that does not. Such unrearranged tran When exposed to the antigen, Sgene, in transgenic non-human animals, V, D and And supporting the recombination (functional rearrangement) of the J gene segment, and preferably Resulting rearranged immunoglobulin heavy chain D region gene segmes Support the incorporation of all or part of the component. According to another aspect of the invention, the transgene is a rearranged "minilocus. Is included. Such transgenes are typically C, D and J segments. Of the V segment. like that In transgene constructs, various regulatory sequences, such as promoters, enhancers , A class switch region, splice donors and splices for RNA processing Rice receptors, recombination signals, etc. contain corresponding sequences derived from heterologous DNA Consists of Alternatively, such regulatory sequences may be the same or identical to the non-human animal used in the invention. It can be incorporated into the transgene from related species. For example, Transji Human immunoglobulin gene sequence in the transgene for use in the transgenic mouse. Can be combined with a rodent immunoglobulin enhancer sequence . Alternatively, synthetic regulatory sequences can be incorporated into the transgene, in which case , Such synthetic regulatory sequences are known to occur naturally in the mammalian genome. Is not homologous to the functional DNA sequence present. Synthetic regulatory sequences are designed according to common rules. For example, splice acceptor sites or promoters / enhancers It specifies the permissible sequence of erfs. For example, the mini locus differs from the naturally occurring germline Ig locus in that At least one of the essential DNA portions (eg intervening sequences; introns or parts thereof) Genomic immunity with two internal (ie not at the end of this part) deletions Contains a portion of the lobrin locus. The present invention also relates to germline containing heavy and light chain transgenes. Also for transgenic animals, one of the transgenes is rearranged One gene segment, the other contains an unrearranged gene segment . In a preferred embodiment, the rearranged transgene is a light chain immunoglobulin trans The transgene, which is a gene that has not been rearranged, is a heavy chain immunoglobulin It's Nsgene.Antibody structure and production The basic structure of all immunoglobulins is two light chain polypeptides and two heavy chain polypeptides. It is based on a unit consisting of a polypeptide. Each light chain has a variable light chain region and a constant light chain region. It comprises two regions known as zones. Similarly, immunoglobulin heavy chains are It comprises two regions called the variable heavy chain region and the constant heavy chain region. The heavy or light chain constant region is a heavy or light chain constant region gene (C_H) Segume It is encoded by a genomic sequence called an entity. For a particular heavy chain gene segment Use limits the class of immunoglobulins. For example, in humans, μ constant region inheritance Offspring segment limits the IgM class of the antibody, while γ, γ2, γ3 or γ4 constants Normal region gene segment is IgG class of antibody and IgG subclass of IgG₁~ Ig G_FourTo limit. Similarly, α₁Or α₂Antibodies using constant region gene segments IgA class and IgA₁And IgA₂Limit the subclass. δ and ε stationary region Region gene segments define the IgD and IgE antibody classes, respectively. The variable regions of the heavy and light immunoglobulin chains together form the antigen-binding region of the antibody. Including the area. Diversity in this region of the antibody to allow it to bind a wide range of antigens Therefore, the DNA encoding the early or primary repertoire variable region is A number of different DNA segments derived from a family of constant variable region gene segments Ment. In the case of the light chain variable region, such a family is variable (V) It comprises a gene segment and a linked (J) gene segment. Therefore, The initial variable region is composed of one V gene segment and one J gene segment. Each segment is encoded, and each segment contains V and J residues contained in the genomic DNA of the organism. Selected from the gene segment family. In the case of the heavy chain variable region, Or the DNA encoding the primary repertoire variable region is one heavy chain V gene segment. Ment, one heavy chain diversity (D) gene segment and one J gene segment And each segment is a suitable immunoglobulin gene in the genomic DNA. Selected from the V, D and J families of child segments. To increase the diversity of sequences that contribute to the formation of antibody binding sites, heavy chain trans All or part of the D region is assembled in the VDJ gene sequence in which the gene has been rearranged. It contains a cis-acting sequence supporting a functional VDJ rearrangement that can be incorporated. Is preferred. Typically, the heavy protein encoded by the expressed transgene At least about 1% of the strand (or mRNA) contains a recognizable D region sequence in the V region To do. Preferably, at least about the V region encoded by the transgene 10%, more preferably at least about 30%, and most preferably 50% is recognizable D area Containing the array of regions. The recognizable D region sequence is generally a heavy chain transgene D region gene segment. At least about 8 consecutive nucleotides corresponding to the sequence present in the sequence and / Or an amino acid sequence encoded by such a D region nucleotide sequence is there. For example, if the transgene contains the D region gene DHQ52, the V gene Sequence 5'-TAACTGGG-3 'in the V region between the sequence of the segment and the J gene segment sequence. MRNA encoded by a transgene containing a D region sequence, especially DHQ5 Recognizable as containing two sequences. Similarly, for example, transgene is D If the region gene DHU52 is included, the V gene segment amino acid sequence and the J gene sequence Containing the amino acid sequence -OAF- located in the V region between the segment amino acid sequences The heavy chain polypeptide encoded by the transgene contains D region sequences, particularly DH. It is recognizable as containing the Q52 sequence. However, the D region segment can be read to varying degrees to varying degrees. Since it can be incorporated into VDJ Joining within a frame, To determine the uptake of the ment, the D region segment existing in the transgene It is necessary to compare the D region subregion of the heavy chain variable region to. In addition, the latent Resident exonuclease digestion is associated with inaccurate VD and D- during VDJ recombination. May lead to J-junction. However, due to somatic mutation or N region addition, some D regions , It may be recognizable, but may not match exactly with the continuous D region sequence. For example, the nucleotide sequence 5'-CTAAXTGGGG-3 '(where X is A, T or G Yes, the sequence is in the heavy chain V region and depends on the V region gene sequence and the J region gene sequence. Are adjacent to each other) corresponding to the DH52 sequence 5'-CTAACTGGG-3 ' obtain. Similarly, for example, in the V region and at the amino terminal end the transgene V Flanked by amino acid sequences encoded by the gene sequences and carboxy By the amino acid sequence encoded by the transgene J gene sequence on the terminal side The adjacent polypeptide sequences -DAFDI-, -DYFDY- or -GAFDI- are located in the D region. Can be recognized as a column. Therefore, somatic mutations and N region additions are sequences derived from the transgene D region. To determine the presence of a recognizable D region sequence, as it may result in mutations in The following definitions are given as indicators. The amino acid sequence or nucleotide sequence is In such a case, it can be recognized as the D region: (1) the sequence is present in the V region, One side is adjacent by V gene sequence (nucleotide sequence or deduced amino acid sequence) And the J gene sequence (nucleotide sequence or putative amino acid sequence) on the other side. No. acid sequence), and (2) said sequence is a known D gene sequence (nu A nucleotide sequence or deduced amino acid sequence) or substantially If homologous to. As used herein, the term “substantially identical” refers to a polypeptide sequence that is compared to a reference sequence. Have at least 50% sequence identity and the nucleic acid sequence is at least as compared to the reference sequence. Also characterizes polypeptide or nucleotide sequences with 70% sequence identity. Represent The percentage of sequence matches are small deletions or additions that are less than 35% of the total reference sequence. Calculated excluding. The reference sequence is a subset of a larger sequence, eg the complete D May be a gene; however, the reference sequence is the length in the case of a polynucleotide Is at least 8 nucleotides and, in the case of a polypeptide, is at least 3 nucleotides in length. It is a mino acid residue. Typically, the reference sequence will be at least 8-12 nucleotides or Is at least 3-4 amino acids, preferably 12-15 nucleotides or More or at least 5 amino acids. As used herein, the term “substantial homology” means that a polypeptide sequence is relative to a reference sequence. Represents a property of a polypeptide sequence having at least 80% homology. Sequence homology % Of sexes counts identical amino acids or position-conservative amino acid substitutions as homologous. It is calculated by Is position-conservative amino acid substitution a single nucleotide substitution? Can occur from A single nucleotide substitution to replace the codon for the first amino acid If the codons of the second amino acid can be different, the first amino acid must be the second amino acid. Replaced by acid. For example, the sequence -Lys-Glu-Arg-Val- is the sequence Asn-Asp-Ser-Va. Substantially homologous to l-. Because the codon sequence-AAA-GAA-AGA-GUU- Introduced three substitution mutations (single nucleotide substitutions in three of the two original codons) Because it can be mutated to -AAC-GAC-AGC-GUU- . The reference sequence may be a subset of a larger sequence, eg the complete D gene The reference sequence, however, is at least 4 amino acid residues in length. Typical The reference sequence is at least 5 amino acids, preferably 6 amino acids or That is all.Primary repertoire Methods for making DNA encoding heavy and light chain immunoglobulin genes are described in It mainly consists in developing B cells. Various immunoglobulin gene segment Before binding the V, D, J and constant (C) gene segments, most of the Classes of V, D, J and C gene segments in the precursors of repertoire B cells Found as a tar. Usually, all of the heavy or light chain gene segments are single They are located relatively close and closely on the chromosome. Various immunoglobulin gene sequences Such genomic DNA before recombination of the fragment is "rearranged" herein. Referred to as "no" genomic DNA. V, D, J (or light chain) during B cell differentiation Inheritance of any one of the appropriate family members (only V and J for genes) Functionally rearranged heavy and light chain immunoglobs with recombined offspring segments Form the phosphorus gene. Such functional rearrangements form the DNA encoding the functional variable region. It is a rearrangement of variable region segments. This gene segment rearrangement process is continuous Seems to be. First, the heavy chain DJ junction is created, then the heavy chain V-DJ junction And a light chain VJ junction is created. This is the functional variable region in the light and / or heavy chain. The DNA encoding the early form of Escherichia coli is "functionally rearranged DNA" or It is called "sequenced DNA". In the case of heavy chains, such DNA is "rearranged. Heavy chain DNA ", and in the case of light chains, such DNA is" rearranged. Light chain DNA ". Describe the functional rearrangement of the transgene of the present invention Similar terms are used for. Variable region gene segments for forming functional heavy and light chain variable regions Recombination of the V. D and J segments flanked by recombination competence. It is mediated by the signal sequence (RSS). Necessary and sufficient to direct recombination RSS is a bimolecular symmetric heptamer, high AT nonamer, and 12 base pairs or 23 salts. It comprises an interrupted spacer region of either of the base pairs. Those signals are D- Different genetics that undergo J (or VJ) recombination and are functionally interchangeable Conserved among the constellations and species. Oettinger et al. (1990),Science, 248, 151 See 7-1523 and references cited therein. A non-conserved sequence followed by a heptamer comprising the sequence CACAGTG or an analogue thereof. There is a spacer followed by a nonamer with the sequence ACAAAAACC or an analogue thereof It The sequences are found on the J side, ie, the downstream side, of each V and D gene segment. Use Immediately before the germline and J gene segments, two recombination sequences were re-established. There is a sequence of signals, first separated by nonamers and then non-conserved sequences, then There is a ptamer. V_L, V_HOr heptamer and nonama after D segment -Arrangement is J_L, D or J_HComplementary to the one in front of the segment Target. The spacer between the heptamer and nonamer sequences is a 12 base pair long chain. Or 22 to 24 base pairs in length. In addition to rearrangement of the V, D and J segments, the V segment of the light chain and the J segment Variable recombination between the heavy chain D segment and the heavy chain D segment. Thus further diversity in the primary repertoire of immunoglobulin heavy and light chains Is born. Such a variety of recombination can be made by the exact It is generated by the displacement (deviation) of various places. Such a shift in the light chain is Typically within the last codon of the V gene segment and the first of the J segment It occurs inside a codon. Similar bond shifts are associated with D segments on heavy chain chromosomes. J_HIt occurs between segments and can be as large as 10 nucleotides. Furthermore, D segment and J_HBetween segment and V_HSegment and D segment And some nucleotides not encoded by the genomic DNA Sometimes. The addition of those nucleotides is known as N-region diversity . VJ and / or VDJ rearrangement followed by rearranged variable region gene segment And one or more constant region genes located downstream of the rearranged variable region Transcription of the segment produces a primary RNA transcript, which is the appropriate RNA splice. When processed, it produces mRNA encoding full-length heavy or light chain immunoglobulin. Jijiru Such heavy and light chains are used to bind immunoglobulins into the transmembrane region of B cells. It contains a leader sequence for insertion and / or secretion from B cells. This signal The DNA encoding the sequence forms the variable region of an immunoglobulin heavy or light chain. It is contained within the first exon of the V segment used for Coded immunity Roblin heavy and light chain polypeptides, which are antibodies by proper association with each other The appropriate regulatory sequence in the mRNA to regulate the translation of the There are columns. Occurring during such rearrangements and such ligations in the variable region gene segment. The end result of possible variable recombination is the production of a primary antibody repertoire. General In addition, each B cell differentiated to this stage produces a single primary repertoire antibody. It During this differentiation process, except those contained within the functionally rearranged Ig gene. A cellular phenomenon occurs that suppresses the functional rearrangement of the gene segment of. Diploid B cells The process by which A maintains such monospecificity is called allelic exclusion.Secondary repertoire Express an immunoglobulin from within a set of sequences that comprises a primary repertoire B cell clones are readily available to respond to foreign antigens. Simple VJ And due to the limited diversity produced by VDJ coupling, the so-called first-order response The antibodies produced by this are of relatively low affinity. Two different types of B cells Generate this initial response: the precursors of the primary antibody-forming cells and the secondary repository B cells. Cell precursor [Linton et al.,Cell,59: 1049-1059 (1989)]. The first type of B cell is Mature into IgM-secreting plasma cells in response to certain antigens. The other B cell is a T cell Responds to initial exposure to antigen by entering the dependent maturation process. On the cell surface during T cell-dependent maturation of B cell clones sensitized by antigen The structure of the antibody molecule changes in two ways. First, the constant region is a non-IgM subtype. And the variable region sequence is altered by multiple single amino acid substitutions. Can generate higher affinity antibody molecules. As previously pointed out, each variable region of the Ig heavy or light chain contains an antigen binding region. . Somatic mutations during the secondary response were identified by amino acid and nucleic acid sequencing as three Complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3; It has been determined to occur throughout the V region, including Et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991) U.S. Departme nt of Health and Human Services, Washington, DC; this is hereby incorporated by reference Incorporated in the book]. CDR1 and CDR2 are located inside the variable gene segment, while CDR3 is mostly between V gene segment and J gene segment or V, D and And the result of recombination between gene segments. The parts of the variable region that do not constitute CDR1, 2 or 3 are generally FR1, FR2, FR3 and FR3. And called a framework area named FR4. See FIG. Altitude During the mutation, the rearranged DNA is mutated to have a new Ig molecule Give rise to clones. Those clones with higher affinity for foreign antigens Is selectively increased by helper T cells, causing affinity maturation of the expressed antibody Rub Clone selection is typically novel in the CDR1, CDR2 and / or CDR3 regions It results in the expression of clones containing the mutation. However, the specificity of the antigen binding region And mutations outside those regions that affect affinity also occur.Transgenic non-human animal capable of producing heterologous antibody In one aspect of the invention, the transgenic non-human animal comprises at least one book. The immunoglobulin transgene of the invention (see below) is added to a non-human animal zygote or early stage. It is produced by introducing it into the embryo. Non-human animals useful in the present invention are generally And rearrange the immunoglobulin gene segments to produce a primary antibody response. It includes any mammal capable of Such non-human transgenic animals Examples include transgenic pigs, transgenic rats, and tigers. Transgenic rabbits, transgenic cows, and others known in the art Of the transgenic animal species, particularly mammalian species. Particularly preferred non-hi Animals are mice or other members of rodents. However, the invention is not limited to the use of mice. Rather, primary and secondary Any non-human mammal capable of mounting a sub-antibody response can be used. Such animals include non-human primates such as chimpanzees, cows, sheep and And pig species, other members of rodent dentistry, such as rats, and rabbits and moles. Motto is mentioned. Particularly preferred animals are mice, rats, rabbits and guinea pigs. And most preferably mouse. In one aspect of the invention, various gene segments from the human genome are rearranged. Not used for heavy and light chain transgenes. In this aspect, The una transgene is introduced into the mouse. Light and / or heavy chain transdies The non-rearranged gene segment of the mouse is an endogenous immune group in the mouse genome. Has a DNA sequence unique to human species that is distinguishable from the lobulin gene segment It Morphology that they are not rearranged in somatic cells that do not consist of germ cells or B cells And in B cells can be readily detected in rearranged form. In another aspect of the invention, the transgene is a rearranged heavy chain and / or It comprises a light chain immunoglobulin transgene. Of such a transgene A specific segment corresponding to a functionally rearranged VDJ or VJ segment is , Clearly distinguishable from endogenous immunoglobulin gene segments in mice Containing an immunoglobulin DNA sequence. Such differences in DNA sequence are due to the amino acid sequence encoded by mouse B cells. Encoded by such a human immunoglobulin transgene when compared to the sequence It is also reflected in the amino acid sequence. Therefore, the human immunoglobulin gene segment Antibodies specific for immunoglobulin epitopes encoded by The human immunoglobulin amino acid sequence in the transgenic non-human animal Can be detected. Tran containing an unrearranged transgene from humans or other species Sgenic B cells are functional when the appropriate gene segments are functionally recombined. Form light chain and heavy chain variable regions rearranged into Such rearranged The antibodies encoded by the Lancegene are nonhuman antibodies used in the practice of the invention. Have DNA and / or amino acid sequences that are heterologous to those normally encountered in It will be readily apparent to do so.Unrearranged transgene As used herein, "unrearranged immunoglobulin heavy chain trans "Gene" means at least one variable gene segment, one diversity gene segment Ment, one connecting gene segment and one constant region gene segment It comprises the encoding DNA. Each gene segment of the heavy chain transgene Is an immunoglobulin of a species that does not consist of a non-human animal into which the transgene is introduced. Or derived from the DNA encoding the heavy chain gene segment. It has the corresponding sequence. Similarly, as used herein, "unrearranged immunoglobulin light chain "Transgene" means at least one variable gene segment, one linked gene D encoding a child segment and at least one constant region gene segment Comprising NA. Here, each gene segment of the light chain transgene is Immunoglobulin of a species not comprising a non-human animal into which the light chain transgene is introduced Or derived from the DNA encoding the light chain gene segment. It has the corresponding sequence. Such heavy and light chain transgenes in this aspect of the invention are rearranged. It contains the above-mentioned gene segment in unopened form. That is, heavy chain trans Between the V, D and J segments in the light chain and the V and J segments in the light chain transgene A suitable recombination signal sequence (RSS) is placed between the fragments. In addition, Transgenes such as the VJ or VDJ redistributed constant region gene segments. It also contains an appropriate RNA splicing signal for binding to the aligned variable region . Multiple C region gene segments such as Cμ and Cγ1 from the human genome In order to facilitate isotype switching within the heavy chain transgene containing Region upstream and downstream of the variable region gene segment. Blin class switch, eg considering the class switch from IgM to IgG A "switch" region, as described below, to allow recombination between constant regions Is incorporated. Such heavy and light chain immunoglobulin transgenes include: A transcriptional regulatory sequence containing a promoter region located upstream of a variable region gene segment. It also contains rows (typically containing the TATA motif). The promoter region, when operably linked to a downstream sequence, causes transcription of the downstream sequence. It can be roughly defined as a DNA sequence that can be directed. Promoter Requires the presence of additional cis-acting sequences linked to direct efficient transcription. There is a need. More preferably, other non-fertility transcripts involved in transcription Contains an array. Examples of sequences involved in the expression of non-fertility transcripts are described by Rothman et al.I ntl. Immunol. 2: 621-627 (1990); Reid et al.,Proc．Natl. Acad. Sci. USA 86: 840-844 (1989); Stavnezer et al.,Proc．Natl. Acad. Sci. USA 85: 7704-7708 (1 988) and Mills et al.,Nucl. Acids Res. 18: 7305-7316 (1991) (each of which is herein incorporated by reference) Can be found in the published literature, including. The sequences are typically at least about 50 bp immediately upstream of the switch region, preferably Preferably at least about 200 bp upstream of the switch region, more preferably the switch region Range of at least about 200-1000 bp or more. A suitable sequence is human Sγ1, Exist immediately upstream of Sγ2, Sγ3, Sγ4, Sα1, Sα2 and Sε switch regions However, sequences immediately upstream of the human Sγ1 and Sγ3 switch regions are preferred. So Alternatively, or in combination with it, a murine Ig switch array can be used. Wear. Using Ig switch sequences of the same species as transgenic non-human animals However, there are often advantages. In particular, interferon (IFN) -induced transcriptional regulation is required. The element, eg, the IFN-inducible enhancer, immediately upstream of the transgene switch sequence. Is preferably included in In addition to promoters, other regulatory sequences that function primarily in B-lineage cells are used . For example, preferably the J segment on the light chain transgene and the constant region gene sequence The light chain enhancer sequence placed between the Used to strengthen and thereby promote allelic exclusion. Heavy chain transge In the case of corn, regulatory enhancers are also used. Such regulatory sequences are Maximize transcription and translation of clones, resulting in allelic exclusion and comparison Used to provide high levels of transgene expression. The above promoter and enhancer regulatory sequences should be comprehensively described. Nevertheless, such regulatory sequences may be heterologous to the non-human animal, and The transgene immunoglobulin gene segment is derived from the genomic DNA from which it is obtained. Can be guided. Alternatively, such regulatory gene segments include heavy chain and And light chain transgenes in the genome of non-human animals or closely related species Derived from the corresponding regulatory sequences. In a preferred embodiment, the gene segment is derived from human. Such a heavy chain And transgenic non-human animals containing the light chain transgene Can initiate an Ig-mediated immune response against specific antigens administered to such animals It B cells capable of producing xenogeneic human antibodies are produced in such animals. Be done. After immortalization, and with an appropriate monoclonal antibody (Mab), eg hybrid After selection of the arm, a source of therapeutic human monoclonal antibodies is provided. Such a thing Mab has substantially reduced immunogenicity when administered therapeutically to humans. A preferred embodiment is a heavy and light chain transgene containing human gene segments. Although fabrication is disclosed, the invention is not so limited. In this regard, the book The teachings described herein provide for immunoglobulin gene segmentation from non-human species. It should be understood that it can be easily modified to suit the use of the component. For example, In addition to therapeutic treatment of humans with antibodies, encoded by appropriate gene segments Monoclonal antibody for use in veterinary science with therapeutic antibodies Can be generated.Rearranged transgene In another aspect, the transgenic non-human animal is a transgenic animal. At least one rearranged heterologous heavy chain immunoglobulin functionally in germ cells Contains Lancegene. Such animals may be rearranged heavy chain tigers as described above. It contains primary repertoire B cells that express insulin. Such B cells , Preferably undergoing somatic mutation upon contact with the antigen and being highly parental to the antigen Heterologous antibodies can be formed that have compatibility with specificity. The rearranged tiger Nsgene has at least two C_HRelationships between genes and isotype switches Will include columns. The invention also includes a germ cell having a heavy chain and a light chain transgene, wherein One of the transgenes contains the rearranged gene segment and the other one Also relates to transgenic animals containing non-sequenced gene segments . In such animals, the heavy chain transgene has at least two C_HGene and a It will have the relevant sequences necessary for the sotype switch. The invention further provides synthetic variables that can be used in the transgenes of the invention. The present invention also relates to a method for producing a repertoire of gene segments. The method is Comprising generating a population of lobulin V segment DNA. Where V Each of the segmented DNA encodes an immunoglobulin V segment, and each end It contains a restriction endonuclease cleavage recognition site at the end. Immunoglobulin V segment The population of DNA is then linked in a chain to form a synthetic immunoglobulin V segment. Form a repertoire. Such a synthetic variable region heavy chain transgene is At least two C_HIt has genes and related sequences required for isotype switching. Let's do it.Isotype switch During the development of B lymphocytes, the cells produce productively rearranged V_Hand V_LIgM with binding specificity determined by the region is first produced. continue , Each B cell and its progeny cells synthesize an antibody having the same L and H chain V regions However, they can switch heavy chain isotypes. The use of mu or delta constant regions is mostly for simultaneous IgM and IgD in single cells. It is determined by alternating splicing, which allows it to be expressed. Other heavy chains The isotypes (γ, α and ε) have gene rearrangement events of Cμ and Cδ exons. Is essentially expressed only after deletion of This gene rearrangement process is isotype Called a switch, typically placed immediately upstream of each heavy chain gene (except δ) It occurs by recombination between so-called switch segments. Each switch segment is 2-10 kb in length and is mainly composed of short repeats. Consists of The exact location of recombination varies for each individual class-switch phenomenon. cDNA reason Coming C_HSouthern blotting or solution hybridization using a probe In the experiment using kinetics, the switch is_HMay be related to sequence loss I confirmed that. The switch (S) region of the μ gene, Sμ, is located approximately 1 to 2 kb 5'of the coding sequence. And then (GAGCT)_nIt consists of multiple tandem repeats of an array of the form (GGGGT). here Where n is usually 2 to 5, but can range up to 17 or so. [T. Nikaido ,Nature,292: See 845-848 (1981). ] Other C_HThe 5'of the gene also contains a similar internal repetitive switch sequence spanning several kilobase pairs. The column is found. The Sα region has been sequenced and has a tandemly repeated 80 bp phase. It was found to consist of homosexual units. On the other hand, S_2a, S_2bAnd S₃Are all to each other It contains a highly similar repeated 49 bp homology unit [P. Szurek et al.J. Immuno l ,135: 620-626 (1985) and T.W. Nikaido et al.J. Biol. Chem. 257:7322-7329 (1982); these are incorporated herein by reference]. all The sequenced S region of Pentagonis GAGC is a basic repeat sequence of the Sμ gene. Includes multiple occurrences of T and GGGGT [T. Nikaido et al.J. Biol. Chem. 257: 7322-7 329 (1982); which is incorporated herein by reference]; in other S regions , Their pentamers are not exactly tandemly repeated like Sμ, but instead Buried in a large repeating unit. Sγ₁The region has an additional conformation, ie Two direct repeats flank each of two clusters of 49 bp tandem repeats [ M.R.Mowatt et al.J. Immunol．136: See 2674-2683 (1986); quoted Incorporated into the present specification]. The switch regions of human heavy chain genes are very similar to their mouse homologs I know that. In fact, C_HHuman clones on the 5'side of the gene and mouse clones It has been found that the similarity between regions is limited to the S region, which is Is a fact that confirms the biological importance of. Switch recombination between the μ and α genes results in a complex Sμ-Sα sequence. Typically, the specific sites where recombination always occurs are in the Sμ region as well as in other S regions. Does not exist. In general, unlike the enzymatic mechanism of VJ recombination, the switch mechanism is clearly Various alignments of repetitive homology regions of the germ cell S precursor can be adapted, The sequences can be linked at different positions in a straight line. [T.H. Rabbitts et al.Nuc leic Acids Res. 9: 4509-4524 (1981) and J. Ravetch et al.Proc. Natl. Acad . Sci. USA ,77: 6734-6738 (1980); these are hereby incorporated by reference. Incorporated in. ] The details of the mechanism that selectively activates the switch to a specific isotype are unknown. . Exogenous influencers such as lymphokines and cytokines are isotype-specific records. Although it may upregulate umbinase, this enzymatic mechanism is Catalyze the switch to, and specificity targets the target of this enzymatic mechanism to the specific switch region. It may be in the area. T cell-derived lymphokines IL-4 and IFNγ show expression of several isotypes. It has been demonstrated to specifically promote: IL-4 is IgM, IgG2a, IgG2b and Ig. Decrease G3 expression and increase IgE and IgG1 expression; IFNγ increases IgG2a expression Selectively stimulates and antagonizes, while inducing increased expression of IgE and IgG1 [Coffman et al.J. Immunol ．136:949-954 (1986) and Snapper et al.,Science 236: 944-947 (19 87); these are incorporated herein by reference]. Most of the experiments related to T cell action on switches are specific to a particular set of switches. The increase observed in cells with replacement is preswitched cells or pre The possibility that could reflect the selection of committed cells could not be ignored. Only But the most likely explanation is that lymphokines actually promote switch recombination. Is Umono. Induction of class switching begins upstream of the switch segment in a non-fertile transcript It seems to be related to (stelile transcript) [Lutzeker et al.Mol. Cell Biol．8: 1849 (1988); Stavnezer et al.Proc．Natl．Acad. Sci. USA 85: 7704 (1988); E sser and Radbruch,EMBO J．8: 483 (1989); Berton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2829 (1989); Rothman et al.,Int. Immunol．2:621 (1990); this Each of which is incorporated herein by reference]. For example, in the observed IL-4 Induction of γ1 non-proliferative transcripts and inhibition by IFNγ by IL-4 in B cells Observations that IFNγ inhibits γ1 expression by promoting a class switch to γ1 Matches Thus, the inclusion of regulatory sequences that affect transcription of non-fertile transcripts is It can also affect the speed of the isotype switch. For example, certain non-fertile transcription Increasing transcription of an entity is typically isotypic with neighboring switch sequences. It can be expected to increase the frequency of pswitch recombination. For those reasons, each switch the transgene will use for isotypes It is desirable to include transcriptional regulatory sequences within about 1-2 kb upstream of the H region. Those turns The transcriptional regulatory sequence preferably comprises a promoter and enhancer elements, 5'adjacent that is naturally associated with the switch region (ie, is present in the germ cell configuration) Includes (ie, upstream) regions. This 5'adjacent region is typically at least 50 in length. Nucleotides, preferably at least about 200 nucleotides in length, more preferably Is at least 500 to 1000 nucleotides. The 5'flanking sequence from one switch region is replaced by another switch for transgene construction. Can be operably linked to the nick region (eg, human Sγ1 switch 5 ′ flanking sequences from Sα₁Can be fused just upstream of the switch; mouse The Sγ1 flanking region can be grafted next to the human γ1 switch sequence; Or a murine Sγ1 switch can be transplanted into the human γ1 coding region) However, in one aspect, each switch region included in the transgene construct comprises: Has a 5'flanking sequence immediately upstream in the naturally occurring germ cell arrangement Is preferred. Monoclonal antibody Monoclonal antibodies are obtained by a variety of techniques well known to those of ordinary skill in the art. be able to. Briefly, splenocytes from animals immunized with the desired antigen are , Generally immortalized by fusion with myeloma cells. (Kohler and Milstein,Eur. J. Immunol. ,6511-519 (1976)). With alternative methods of immortalization Traits with eptain-bar virus, oncogenes or retroviruses. Conversion or other methods well known in the art. Colonies generated from a single immortalized cell should have the desired specificity for the antigen. Screened for the production of antibodies with specificity and affinity and The yield of monoclonal antibody produced by the It can be enhanced by various technologies. Animal for producing immunoglobulin Immunization, production of monoclonal antibodies; immunization for use as a probe This includes labeling of lobulin; immunoaffinity purification; and immunoassays. Various techniques useful in these technical fields are described in, for example, Harlow and Lane,Antibody: Laboratory manual , Cold Spring Harbor, New York (1988) There is.Transgenic primary repertoire A.Human immunoglobulin loci An important requirement for transgene function is the secondary immunity to a wide range of antigens. By creating a primary antibody repertoire that is diverse enough to initiate an epidemiological response is there. The rearranged heavy chain gene contains signal peptide exons and variable region exo And a tandem of multidomain constant regions each encoded by several exons It consists of alignment areas. Each constant region gene is a constant of a different immunoglobulin class Code the part. During B cell development, a V region close to the constant region was deleted Provides heavy chain class expression. RNA splicing for each heavy chain class An alternative pattern of transmembrane forms leads to both transmembrane and secretory immunoglobulins. The human heavy chain locus contains approximately 200 V gene segments (currently Supports the presence of an approximately 50-100V gene segment. ), About 40kb Approximately 30 D gene segments spanning 3 J segmen clustered within 3 kb And is expected to consist of 9 constant region gene segments spanning approximately 300 kb Be done. The entire locus extends approximately 2.5 kb distal to the longer arm of chromosome 14 (Figure 4). . B.Gene fragment transgene 1.Heavy chain transgene In a preferred embodiment, the immunoglobulin heavy and light chain transgenes are of human origin. It comprises native unrearranged genomic DNA. For heavy chains, the preferred tiger The gene comprises a Not I fragment with a length of 670-830 kb. The length of this fragment It is ambiguous because the 3'restriction site has not actually been mapped. Only However, it is known to be between α1 and ψα gene segment. this The fragment consists of 6 known Vs_HAll members of the family, D3 and J gene segments Ment, and μ, δ, γ3, γ1 and α1 constant regions. Berman et al.EMBO J. 7:727-738 (1988). Transgenic mice containing this transgene The Us system correctly expresses the heavy chain class (IgM) required for B cell development and Enough repertoire to initiate a secondary response to most antigens. With Lee, at least one switched heavy chain class (IgG₁) Express . 2.Light chain transgene Contains all required gene segments and regulatory sequences from the human light chain locus Genomic fragment can be similarly prepared. Such constructs are described in this example. Prepared as described. C.Transgenes produced intracellularly by in vivo recombination It is not necessary to isolate all or part of the heavy chain locus on a single DNA fragment. For example, the 670-830 kp Not I fragment from the human immunoglobulin heavy chain locus is Can be formed in vivo in non-human animals during transgenesis so Wear. Such in vivo transgene production involves the duplication of two or more overlapping DNA fragments. It is carried out by introducing into the embryonic nucleus of a non-human animal. The overlapping part of the DNA fragment , Having DNA sequences that are substantially homologous. Recombiners contained in the fetal nucleus When exposed to DNA, overlapping DNA fragments will assemble homologously in the proper orientation. It then forms a 670-830 kb Not I heavy chain fragment. In vivo transgene production is due to its size produced by existing techniques. Are numerous immunoglobulin transgenes that are difficult or impossible to manipulate It should be understood that it can be used to form For example, in vivo tiger Nsgene is produced by YAC vector [Murray and Szostak,Nature 305:189-19 3 (1933)], an immunoglobulin larger than a DNA fragment that can be manipulated by It is useful for making transgenes. Such an in vivo transgene Production is essentially complete immunization of a species that does not consist of transgenic non-human animals. It can also be used to introduce the lobulin locus into non-human animals. In addition to forming a genomic immunoglobulin transgene, see the examples. Intra-subject homologous recombination is also used to form the "small gene locus" transgene as shown. Can be used. In a preferred embodiment utilizing in vivo transgene production, each overlapping DN The A fragment is preferably the end portion of the first DNA fragment and the unend portion of the second DNA fragment. It has substantially homologous DNA sequences that overlap between minutes. Such as DNA fragments The overlapping portion preferably comprises from about 500 bp to about 2000 bp, most preferably 1.0 kb to 2.0 kb. Mu. Homologous recombination of overlapping DNA fragments to form a transgene in vivo , Published on March 19, 1992, entitled "Homologous Recombination in Mammalian Cells (Homologous Further details in PCT publication WO 92/03917, entitled Recombination in Mammalian Cells) Well described.D. Small locus transgene As used herein, the term "immunoglobulin minilocus" usually refers to A DNA sequence of less than about 150 kb, typically about 25-100 kob, said DNA sequence Is at least one substantial discontinuity (eg, for homologous genomic DNA sequences, Usually has at least about 2-5 kb, preferably 10-25 kb or more deletions) A DNA sequence containing at least one of each of the following: functionally variable ( V) gene segment, functionally linked (J) region segment, at least one machine Functional constant (C) region gene segment and function in the case of heavy chain minilocus Diversity (D) domain segment. The light chain minilocus transgene is short in length It will be at least 25 kb, typically 50-80 kb. The heavy transgene Has two constant regions operably linked to the H region, typically about 70-80 kb Will preferably be at least about 60 kb in length. In addition, individual elements of the minilocus Are preferably in a germ cell (germ line) arrangement, and the Express functional antibody molecules with diverse antigenic specificities that are fully encoded by the prime As described above, the gene rearrangement in the precursor B cells of the transgenic animal Can be Furthermore, at least two C_HGenes and required switch sequences Overlapping minilocles typically comprise functions of different immunoglobulin classes. The isotype switch can be subjected to specific antibody molecules. So Isotype switches such as B are present in transgenic non-human animals In vivo in cells or explanted from transgenic non-human animals Can occur in cultured cells of the B cell lineage. In another preferred embodiment, the immunoglobulin heavy and light chain transgenes are V_H , D and J_HOne or more gene segments each and C_HTwo or more genes Including above. At least one of the appropriate types of gene segments is a minilocus Incorporated into the transgene. C of the heavy chain transgene_HRegarding segments Is a transgene with at least one μ gene segment and at least one Other constant region gene segments, more preferably the γ gene segment, It is preferable that the γ3 or γ1 gene segment is included. This priority Is a class switch between the IgM and IgG forms of the encoded immunoglobulin and This is in consideration of production of secretory form of high affinity non-IgM immunoglobulin. Other constants A constant region gene segment, such as one encoding the production of IgD, IgA and IgE Can also be used. Those skilled in the art will appreciate that heavy chain C_HThe order of gene development is the C_HOf species that act as gene donors Tran may differ from the naturally occurring spatial order found in germ cells I will also make Suzene. Furthermore, one of ordinary skill in the art will appreciate that C from multiple individuals of one species_HGene can be selected (For example, allogeneic C_HGene), and can undergo isotype switching Excess C_HIt is possible to integrate the gene as a gene into the transgene. Wear. The resulting transgene non-human animal is then, in one aspect, Transgene C_HIncludes all of the allotypes symbolized by the species from which the gene was obtained It is possible to produce antibodies of various crafts. Furthermore, the person skilled in the art will appreciate that from different species_HSelect a gene during the transgene Can be incorporated. Each C_HA functional switch sequence is included with the gene, The switch array used is not always C_HMust be naturally present next to a gene It doesn't matter. C between species_HGene combinations include C from various species_HCorresponds to a gene Transgenic non-human animals capable of producing diverse classes of antibodies Will do it. Species C_HTransgenic non-human animals containing a transgene The product is B for producing a hybridoma producing a monoclonal for veterinary medicine. Can act as a source of cells. The human heavy chain J region segment contains 6 densely packed features at a DNA length of 3 kb. It comprises an active J segment and three pseudogenes. It's a relatively small size And their segments together with the 5'portions of the μ and δ genes. Be isolated as a single 23 kb SFiI / SpeI fragment [Sado et al.Biochem. Biophys. Res . Commun. 154: 246-271 (1988); which is incorporated herein by reference. ], The entire J region gene segment is used in the minilocus construct. Is preferred. In addition, this fragment spans the region between the μ and δ genes. Therefore, it is appropriate to include all of the cis-linked 3'regulatory elements required for mu expression. is there. Furthermore, since this fragment contains the complete J region, it contains the heavy chain enhancer and μ switch region. Range [Mills et al.,Nature 306:809 (1983); Yancopoulos and Alt,Ann. Re v. Immunol. Four:339-368 (1986); these are incorporated herein by reference. ]. It initiates VDJ binding to form primary repertoire B cells. Including the start site [Yancopoulos and Alt,Cell 40: 271-281 (1985); this is Incorporated herein by reference]. Alternatively, replace the 23 kb SFiI / SpeI fragment. Alternatively, a 36 kb BssHII / SpeI fragment containing part of the D region can be used. Like that The use of large fragments increases the amount of 5'flanking sequences that promote efficient DJ binding. . The human D region consists of 4 or 5 homologous 9 kb subregions linked in tandem [s iebenlist et al.Nature 294:631-635 (1981)]. Each subregion has up to 10 individual D Contains segments. Some of those segments are mapped and As shown in FIG. The minilocus D region is created using two different strategies. First person The strategy was placed in a continuous strand of short DNA containing one or two repeating D subregions. Only those D segments are used. Candidates are 12 individual D's A single 15 kb fragment containing the segment. This piece of DNA consists of two consecutive EcoRI fragments and is completely sequenced. Has been established [Ichihara et al.EMBO J．7:4141-4150 (1988)]. 12 D segment Would be sufficient for the primary repertoire. However, there is a dispersive nature of the D region If so, another strategy is to ligate several discontinuous D-fragment containing fragments together, To make smaller DNA fragments with multiple segments. For example , By the presence of a characteristic flanking nonameric or heptamer sequence (anterior), and Additional D segment genes can be identified by reference to the contribution. At least one, and preferably at least one, for producing a heavy locus transgene Uses multiple V gene segments. Redistribute with or without flanking sequences V-segments that are neither aligned nor rearranged "can produce heterologous antibodies. "Transgenic Non-Human Animal" Capable of Producing Heterologous Artibodies). March 19, 1992 It can be isolated as described in published PCT publication WO 92/03918. Rearranged or unrearranged V cell with or without flanking sequences. Segment, D segment, J segment and C gene were released on March 19, 1992. It can be isolated as described in opened PCT publication WO 92/03918. Is the minilocus light transgene a human lambda or kappa immunoglobulin locus? Can be manufactured in the same manner. That is, for example, multiple DNA fragments, V, D, J and constant region mapping from at least 2, 3 or 4 DNA fragments. Encoding a sequence, each sequence being substantially homologous to a human gene sequence, eg about 75 Forming an immunoglobulin heavy chain minilocus transgene construct of kb Can be. Preferably said sequence is operably linked to a transcriptional regulatory sequence, and Can be rearranged. Two or more appropriately placed constant region sequences (eg μ And γ) and switch regions, switch recombination also occurs. Typical light chain Lancegene constituents are in co-pending application USSN 07 / 574,748 filed August 29, 1990. As described, it is substantially homologous to human DNA and is capable of undergoing rearrangement. It can be similarly formed from a plurality of DNA fragments.E. FIG. Transgene constructs capable of undergoing isotype switching Ideally, a transgene construct that is supposed to undergo class switching. Should contain all of the cis-acting sequences necessary to regulate the non-fertile transcript. It Naturally occurring switch regions and upstream promoter and regulatory sequences (eg IFN-inducible element) is a trans that can undergo an isotype switch Preferred cis-acting sequences contained in the gene construct. Switch area, preferred Preferably at least about 50 base pairs, preferably small, just upstream of the human γ1 switch region. At least about 200 base pairs, more preferably at least 500-1000 base pairs or more. The above sequence is operably linked to a switch sequence, preferably the human γ1 switch sequence. Will be done. In addition, switch regions are naturally present next to a particular switch region. Not C_HIt can be linked upstream (and in the vicinity) of the gene. For example, While not intending to be limited, the human γ1 switch region is replaced by human α2C._HUpstream of the gene Or the mouse γ1 switch region may be linked to human C_HCan be linked to a gene Yes. Non-classical isotype switches (eg δ- in transgenic mice) An alternative method for obtaining (related deletions) is a 400 bp direct repeat sequence flanking the human μ gene. (Σμ and εμ) [Yasui et al.Eur. J．Immunol. 19: 1399 (1989)] Accompany. Homologous recombination between these two sequences results in the mu gene in IgD-only B cells. Is deleted. The heavy chain transgene can be represented by the formula: (V_H)_x-(D)_y-(J_H)_z-(S_D)_m-(C₁)_n-[(T)-(S_A)_p-(C₂)]_q In the above formula, V_HIs a heavy chain variable region gene segment, D is a heavy D (diversity) region gene segment, J_HIs a heavy chain J (connecting) region gene segment, S_DIs an S that causes an isotype switch_aRecombination with receptor domain segment A donor region segment that can participate in the phenomenon, C₁Encodes the isotype used in B cell development (eg μ or δ) A heavy chain constant region gene segment that T is a cis-acting transcriptional regulatory region segment containing at least a promoter Yes, S_AIs a selected S such that an isotype switch occurs_DDonor area segment Is a receptor region segment that can participate in recombination with C₂Is an isotype other than μ (eg γ₁, Γ₂, Γ₃, Γ_Four, Α₁, Α₂, Ε ) Is a blocked constant region gene segment encoding x, y, z, m, n, p And q are integers, x is 1 to 100, n is 0 to 10, y is 1 to 50, p is 1 to 10, z is 1 to 50, q is 0 to 50, and m is 0 to 10. Typically, transgene is Q is at least 1 and m is small At least 1, n is at least 1, and m is equal to or equal to n Must be bigger. V_H, D, J_H, S_D, C₁, T, S_AAnd C₂Segments are of various species, preferably May be selected from mammalian species, more preferably human and mouse germline DNA. You can V_HThe segment is a V that naturally occurs in human germ cells._HSegment, eg V_H251You can choose from. Typically about 2 V_HSegment, preferred Preferably about 4, more preferably at least about 10 V_HContains segments. Typically at least one D segment is included, but preferably at least one Also includes 10 D segments, and in some embodiments, 10 or more D segments. Get caught Some preferred embodiments include human D segments. Typically at least one J_HThe segment is included in the transgene, About 6 J_HIt is preferred to include segments, some preferred embodiments have about 6 J above_HIncluding segments, non-human J_HIt does not contain any segments. S_DThe segment is S of the transgene_AParticipate in recombination phenomenon with segments Is a donor region that can be. In the classic isotype switch, S_Dand S_AArea is Sμ, Sγ₁, Sγ₂, Sγ₃, Sγ_Four, Sα, Sα₂And Sε This is the switch area. Preferably the switch region is mouse or human, More preferably S_DIs human or mouse Sμ, and S_AIs human or mouse Sγ₁ ,. In nonclassical isotype switching (δ-related deletion), S_DAnd S_Aregion Is preferably a 400 base pair direct repeat sequence flanking the human μ gene. C₁The segment is typically the μ or δ gene, preferably the μ gene And more preferably human or mouse μ gene. The T segment typically resides in a naturally occurring (ie germ cell) switch region. Includes flanking 5'flanking sequences. T-segments are typically at least about 50 in length Nucleotides, preferably at least about 200 nucleotides in length, more preferably Is at least 500-1000 nucleotides in length. Preferably the T segment is , Immediately upstream of the human or mouse switch region in germ cell configuration 5 'It is a flanking sequence. A cis gene in which the T segment does not naturally occur in animal germ cells. Operative transcriptional regulatory sequences (eg viral enhancers and promoters, eg Found in SV40, adenovirus, and other viruses that infect eukaryotic cells It is obvious to those skilled in the art that the above may be included. C₂The segment is typically γ₁, Γ₂, Γ₃, Γ_Four, Α₁, Α₂Or εC_HHeredity Offspring, preferably those isotypes of human C_HA gene, and more preferred Human γ₁Or γ₃It is a gene. Downstream (switched) from various species Mouse γ as a sotype gene_2aAnd γ_2bMay be used. Heavy chain transgy If the gene contains an immunoglobulin heavy chain minilocus, the full length of the transgene is typically Typically less than 150 kilobase pairs. Generally, the transgene will be other than the native heavy chain Ig locus. U For example, there are deletions of unwanted regions or substitutions with corresponding regions from other species. Would. F.Methods for determining functional isotype switches in the Ig transgene The occurrence of isotype switching in transgenic non-human animals is well known in the art. Can be identified by any method known in. In a preferred embodiment, The following may be mentioned, which may be used alone or in combination. 1. at least one transgene downstream C other than δ_HAn array that is homologous to a gene Rows and Transgene V_H-D_H-J_HWith flanking sequences that are homologous to the rearranged gene Detection of mRNA transcripts containing; N, S₁Nuclease protection assay, PCR amplification, cDNA cloning or its Other methods are possible. 2. In the serum of a transgenic animal, or of the transgenic animal Downstream C in the culture supernatant of hybridoma cells prepared from B cells_HBy gene Detection of encoded immunoglobulin proteins. Here by immunochemical method, It can also be demonstrated that such a protein comprises a functional variable region. It 3. In DNA from B cells of transgenic animals, or hybrids Evolution of the isotype switch in the transgene in genomic DNA from maternal cells Detection of DNA rearrangements consistent with live. Such detection is based on Southern blot hybrid Achieved by using the method, PCR amplification, genomic cloning or other methods Can be 4. Other signs of isotype switching, eg production of non-fertile transcripts, switches Production of a characteristic enzyme involved in (eg, "switch recombinase"), or Is the identification of other signs that can be detected, measured or observed by current technology. Each transgenic line has different transgene integration sites and Represent potentially different tandem alignments of the transgene insert, and Higher levels are required because different arrangements of each of the flanking DNA sequences can affect gene expression. Expression of human immunoglobulin, especially of the IgG isotype, and minimal copy It is preferred to identify and use a mouse strain containing a number of the transgene. Good. Single-copy transgenic animals have a possible incomplete allele Minimize offspring problems. Transgenes are typically found in host chromosomal DNA, most commonly germline DN. Germline transgenic breeding animals integrated into A and thereafter Are bred by breeding. However, the practitioner may Other vectors and transs known or later developed in the art It can be replaced by a genetic method. A transswitch to the endogenous non-human heavy chain constant region gene occurs, It is possible to produce antibodies containing La heavy chains and such chimeric human / mouse heavy chains. Such chimeric antibodies may be desirable for some of the uses described herein However, there are cases where it is not desirable. G.Functional disruption of the endogenous immunoglobulin gene chain Expression of successfully rearranged immunoglobin heavy and light chain transgenes Suppresses rearrangement of endogenous immunoglobulin genes in transgenic non-human animals It is expected to have a dominant effect by controlling. However, endogenous antibodies Another way to generate a deficient non-human animal is to harbor an endogenous immunoglobulin locus. This is due to mutation. Using fetal stem cell technology and homologous recombination Thus, the endogenous immunoglobulin repertoire can be easily eliminated. following Describe a functional disruption of the mouse immunoglobulin locus. However, disclosure Vectors and methods are readily adapted for use in other non-human animals. It can change. Simply put, this technique is pluripotent capable of differentiating into germ cell tissues. It involves the inactivation of genes by homologous recombination in cell lines. Mouse immunity A DNA construct containing an altered copy of lobulin is introduced into the nucleus of fetal stem cells. That Recombination with endogenous copy of the introduced DNA mouse gene in a part of the cell And replace it with a modified copy. Cells with newly engineered genetic damage It is injected into host mouse embryos and reimplanted into recipient females. Some of those embryos are Develop into chimeric mice with germ cells that are completely derived from the heterologous cell line. Therefore, By crossing the chimeric mice, a new mouse with the introduced genetic damage was introduced. It is possible to acquire a line [Capecchi (1989)Science, 244, 1288-1292 ]]. Since the mouse lambda locus contributes only 5% of immunoglobulins, heavy chain and Inactivation of the / or kappa light chain locus is sufficient. Break each of those loci There are three ways to destroy, deletion of J region, JC intron enhancer And the disruption of the constant region coding sequence by the introduction of a stop codon. DN From the point of view of A-component design, the last choice is the easiest. μ gene Elimination disrupts maturation of B cells, thereby allowing either functional heavy chain segment Prevent class switching. Knock out those loci The strategy is outlined below. To disrupt the mu and kappa genes in mice, Jaenisch and coworkers [Zi jlstra et al. (1989),Nature,342, 435-438] by mouse β2 microglobulin A targeting vector based on the design used for successful disruption of the gene is used. The Neomycin resistance gene (neo) from rasmid pMCIneo is the target gene coding region Insert in the area. The PMC Ineo insert is a hybrid virus to direct neo expression. Use promoter / enhancer sequences. This promoter is in fetal stem cells Is active in. Therefore, the choice marker for the incorporation of the knockout composition. You can use neo as a car. Negative selection marker for random insertion phenomenon HSV thymidine kinase (tk) gene is added to the end of the construct (Zijls tra et al., supra). The preferred strategy for disrupting the heavy chain locus is the deletion of the J region. This area Is quite small in mice and extends to just 1.3 kb. Create a gene targeting vector For this purpose, a 15 kb KpnI fragment containing all of the secreted A constant region exons was Isolate from the genomic library. Inserted 1.3kb J region with 1.1kb from pMCIneo Replace with fragments. Then add the HSV tk gene to the 5'end of the Kpn I fragment. It The correct integration of this construct by homologous recombination is due to the Su J_HWill result in a replacement of the area. Primer based on neo gene and D region By PCR using a primer homologous to the mouse sequence 5'of the Kpn I site of Screen recombinants. Alternatively, the heavy chain locus is destroyed by destroying the coding region of the μ gene ( Knock out). This approach is the same as the one used above It requires a 15 kb Kpn I fragment. The 1.1 kb insert from pMCIneo was inserted into exon II Insert at the unique BamHI site and attach the HSK tk gene to the 3'Kpn I end. Add A double crossover on one side of the neo insert (which deletes the tk gene) select. They were detected by PCR amplification from a pool of selected clones. Be done. One of the PCR primers is derived from the neo sequence and the other is the target vector Derived from the mouse sequence outside of. Functional disruption of the mouse immunoglobulin locus Described in the examples. G.Suppression of expression of endogenous immunoglobulin loci Prevents the expression of the endogenous Ig locus in addition to the functional disruption of the endogenous Ig locus Another method is suppression. Suppression of the endogenous Ig gene is one or more integrated Antisense RNA produced by the transgene Specific for gogonucleotides and / or for one or more endogenous Ig chains This can be achieved by administration of antiserum.Antisense polynucleotide Antisense RN to partially or wholly disrupt the expression of a particular gene A transgene can be used [Pepin et al. (1991)Nature 355: 725; Hele ne, C. And Toulme, J. (1990)Biochi-mica Biophys. Acta 1049: 99 ； Stou t, J. And Caskey, T .; (1990)Somat. Cell Mol. Genet. 16: 369; Munir et al. (1990)Somat. Cell Mol. Genet. 16: 383; each of these is hereby incorporated by reference Incorporated in the book]. An "antisense polynucleotide" is (1) a reference sequence, for example C of an endogenous Ig._H Or C_LTarget complementary to all or part of the region sequence and (2) complementary A sequence, such as a chromosomal locus or a poly that specifically hybridizes to Ig mRNA. Nucleotides. Such complementary antisense polynucleotides are related Specific hybridization to the target sequence Including nucleotide substitutions, additions, deletions or rearrangements, as long as the property is retained Good. As a complementary antisense polynucleotide, it is specifically Bridging and transcription and / or RNA processing and / or of the mRNA species Or soluble antisene, which can prevent translation of the encoded polypeptide. RNA or DNA oligonucleotides [Ching et al.,Proc. Natl . Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989); Broder et al.,Ann. Int. Med. 113: 6 04-613 (1990); Loveau et al.,FEBS Letters 274: 53-56 (1990); Holcenberg et al. , WO91 / 11535; U.S.S.N 07 / 530,165 ("Novel human CRIPTO gene"); WO91 / 09865 WO91 / 04753; WO90 / 13641 and EP386563; each of which is herein incorporated by reference Incorporated in]. Antisense sequences are contiguous nucleotides of at least about 15 in length, and more preferred. At least one immunoglobulin inheritance of at least 30 consecutive nucleotides in length A polynucleotide sequence that is complementary to a child sequence. However, in some ways Specific hybridization as a property of antisense polynucleotides Antisense sequences are compared to complementary immunoglobulin gene sequences as long as Can have substitutions, additions or deletions. Generally, antisense sequences Encodes an immunoglobulin chain or immunoglobulin after DNA rearrangement Is complementary to an endogenous immunoglobulin gene sequence that has the potential to encode the chain. It In some cases, sense sequences that correspond to immunoglobulin gene sequences are specifically transcribed. May act to suppress the expression by interfering with. Antisense polynucleotides thus direct the production of the encoded polypeptide. Inhibit. In this regard, transcription and / or transcription of one or more endogenous Ig loci Or, an antisense polynucleotide that inhibits translation is at the endogenous Ig locus Non-human animal's ability to produce an immunoglobulin chain encoded by and / or The specificity can be changed. Antisense polynucleotides are used in transfectant cells or transfectants. Reconstitutes all or part of an individual's hematopoietic stem cell population in a genetic cell, for example In transgenic pluripotent hematopoietic stem cells used for It can be produced from heterologous expression cassettes in non-human animals. Or anti Sense polynucleotides are either circulatory or in vitro in culture or in vivo. Contains soluble oligonucleotides that are administered to any external environment in interstitial fluid Can consist of Soluble antisense oligonucleosides present in the external environment Tide has been shown to approach the cytoplasm and inhibit translation of specific mRNA species. There is. In some embodiments, the antisense polynucleotide comprises a methylphosphonate component. Or a phosphorothionate or O-methyl ribonucleotide May be used, and chimeric oligonucleotides may be used [Dagle et al. (1990)Nucleic Acids Res. 18: 4751]. Antisense oligos for some applications Nucleotides may include polyamide nucleic acids [Nielsen et al. (1991).Science 254 : 1497]. For general instructions on antisense polynucleotides, seeAntisens e RNA and DNA (1988), D.A. Melton, Cold Spring Harbor Labo-ratory, Co See ld Spring Harbor, NY. Transcription using antisense polynucleotides complementary to one or more sequences , RNA processing, and / or translation of cognate mRNA species, Thus reducing the amount of each encoded polypeptide. Such antisense Polynucleotides inhibit the formation of one or more endogenous Ig loci in vivo By doing so, a therapeutic function can be provided. As a soluble antisense polynucleotide or as an antisense transgene In any case as an antisense RNA transcribed from Polynucleotides are preferential to endogenous Ig sequences in physiological conditions in vivo. Selected to hybridize to Most typically, the selected antisense The polynucleotide is encoded by the heavy or light chain transgene of the invention. Will not hybridize as much to the heterologous Ig sequences (ie, Thisense oligonucleotides inhibit transgene Igf expression by about 25-35% or more Will not).Antiserum suppression Partial or complete suppression of endogenous Ig chain expression is associated with one or more endogenous Can be achieved by injecting antiserum against the sex Ig chains [Weiss et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 211; which is hereby incorporated by reference Incorporated]. Antisera react specifically with one or more endogenous Ig chains Has minimal reactivity with heterologous Ig chains encoded by the Ig transgenes of the invention. With or with no reactivity. Therefore, Weiss et al ( Administration of selected antisera according to a schedule typified by Suppresses endogenous Ig chain expression, but is encoded by the transgene of the present invention 1. Alternatively, it allows the expression of multiple heterologous Ig chains. Suitable antibody sources of antibodies include the following: (1) The human Ig of the present invention, which specifically binds to mouse μ, γ, κ or an incoming chain Monochrome that does not react with human immunoglobulin chains encoded by Lancegene Monoclonal antibody, such as (2) The mixture comprises multiple epitopes on a single species of endogenous Ig chain and multiple endogenous Ig Chain (eg mouse μ and mouse γ), or multiple epitopes and multiple chains or within A mixture of such monoclonal antibodies which bind to the causative immunoglobulin. (3) Polyclonal antiserum or a mixture thereof. Typically, such antisera (single chain ) Is a single species of endogenous Ig chain (eg mouse μ, mouse γ, mouse κ, mouse λ). ) Or a multispecies of endogenous Ig chains) and is monospecific, Preferably, such an antiserum is a human immunoenzyme encoded by the transgene of the present invention. It has negligible binding force against the chain of epidemics: and / or (4) binds to a single or multiple species of endogenous Ig chain, most preferably Negligible for human immunoglobulin chains encoded by Lancegene A mixture of a polyclonal antiserum and a monoclonal antibody having only the binding strength of. one Polyclonal antibodies are generally preferred and such substantially monospecific polyclonal The antibody is advantageously an antibody derived from a non-human animal species (eg mouse). Antiserum on affinity resin containing pre-adsorbed and / or eg immobilized human Ig Or affinity chromatography of the purified fraction (the bound fraction is Enriched for desirable anti-human Ig in serum, this bound fraction is Is eluted under conditions of low pH or chaotropic salt solution). It can be produced from antisera raised against Briin. By antibodies of lymphocytes expressing endogenous (eg mouse) immunoglobulin chains Use of cell division and / or complement fixation to enhance cell-induced depletion of cells can do. For example, in one embodiment, an explant that expresses mouse Ig. Transgenic mice harboring isolated hematopoietic cells and / or human Ig transgene Of B-lineage lymphocytes obtained from UsHalf-vivoAntibodies are used for depletion. Scratch Then, hematopoietic cells and / or B lineage lymphocytes harbor the human Ig transgene ( It preferably harbors both a human heavy chain transgene and a human light chain transgene) Cells explanted from transgenic animals other than humans are: Binds to a causative immunoglobulin (eg mouse μ and / or κ) and (2) trans Lack of substantial binding to the human immunoglobulin chain encoded by the gene Are incubated with the antibody (s). Such antibodies are called "suppressor antibodies" for clarity. Explanted cells The population is selectively depleted of cells that bind the suppressor antibody (s); Depletion is (1) physical separation to remove inhibitory antibody-bound cells from unbound cells (For example, to immobilize and remove cells that bind to the inhibitory antibody, a solid support or Inhibitor antibody can be bound to magnetic beads), (2) Inhibitor antibody binding -Dependent cell killing of killed cells (for example, ADCC, complement fixation, or inhibition of inhibitory antibodies). Clonal anergy induced by a related toxin) and (3) an inhibitory antibody Can be achieved by various methods such as. Frequently, the antibodies used to suppress antibody production of endogenous Ig chains will complement complement. Can be fixed. Like a rabbit or a guinea pigHalf-vivo/Inbit B Being able to select such antibodies to react well with a convenient source of complement for depletion Are often preferred.In vivoFor depletion, inhibitory antibodies are generally It is preferred to have effector function in the transgenic animal species. Thus, for use in transgenic mice, it is generally Inhibitory antibodies that contain vector functions (eg ADCC and complement fixation) are preferred. In one variation, the lymphocytes expressing endogenous immunoglobulin are expressed asHalf-bi Bo /In vitroSpecific for a predetermined endogenous immunoglobulin chain due to depletion An inhibitory antibody that binds to is used. The human immunoglobulin transgene Explants (eg lymphocyte samples) from transgenic non-human animals are suppressed. Cells that are contacted with the anti-antibody and specifically bind to the inhibitor antibody are depleted (eg, Immobilization, complement fixation, etc.) and thus endogenous (non-human) immunoglobulins Depleted within cells expressing E. coli (eg, lymphocytes expressing mouse Ig) Generate the next group. The resulting depleted lymphocyte population (T cells, human Ig-positive B cells, etc. Are immunocompatible with the same species that are substantially incapable of producing endogenous antibodies. That is, MHC compatible non-human animals (eg SCID mouse, RAG-1 or RAG-2) Knockout mouse). Reconstructed The animal (mouse) is then immunized with the antigen (or the donor animal provided with the explant is Reimmunize with the antigen used to immunize), high affinity (affinity maturation) Antibodies) and B cells that produce such antibodies can be obtained. Such B cells Can be used to generate hybridomas by conventional cell fusion, You can Antibody suppression is another method of inactivating / suppressing endogenous Ig (for example, J_HKnock Quout, C_HKnockout, D-region excision, antisense suppression, compensated flux Can also be used in combination. Complete endogenous Ig locus inactivation In certain embodiments, human variable regions and non-human (eg, mouse) constant regions are included. In such a way that the containing hybrid immunoglobulin chain cannot be formed (eg By a transswitch between the Sgene and the endogenous Ig sequence), the endogenous Ig gene It is desirable to perform a complete deactivation of the Zodiac. J_HFunctionally divided only in the area Knockers supporting an endogenous heavy chain allele Uto mice are normally rearranged humans encoded by the transgene. As a fusion protein in which the variable region (VDJ) is linked to the endogenous mouse constant region Frequently expressed transswitches, but other transswitched Connection is also possible. To overcome this potential problem, in general, without limiting meaning, Completely inactivate an endogenous heavy chain locus by any of a variety of methods, including (1) at least one, and preferably all endogenous heavy chain constitutive regions. Region gene is functionally disrupted and / or deleted by homologous recombination, (2 ) Mutating at least one and preferably all endogenous heavy chain constant region genes Encodes a stop codon (or frameshift) and is truncated or frameshifted Produced products (if transswitched), and for those skilled in the art Other methods and strategies that are obvious. Of the heavy chain constant region gene and / or the D-region gene Substantial part or all deletions may be homologous, especially of the "hit end run" type. Reached by a variety of methods, including sequential deletions with recombinant targeting vectors Can be achieved. Similarly, at least for excising the endogenous light chain constant region gene Often the functional disruption and / or deletion of one endogenous light chain gene (eg κ) preferable. Frequently, the heterologous transgene causes frame shifts within the J segment (s). And one or more of the transgene constant region genes (preferably all ) The compensated frameshift within the initial region (ie, the amino end coding portion) Frame-shifted such as containing (eg to replay the original reading frame) It is preferred to utilize a transgene. Endogenous IgH locus homeostatic gene ( Transformer switch (for which the compensation frame shift is not included) The result is a ssense product, which results in transswitching. B cells that have been deleted are either deleted or deselected and thus transswitched. Phenotypes are suppressed. Endogenous Ig gene product expression (eg mouse heavy and light chain sequences) and / or Substantial of lance switched antibody (eg human variable / mouse constant chimeric antibody) In order to achieve complete functional inactivation, antisense suppression and antibody suppression are also required. Can be used. To achieve essentially complete suppression of endogenous (eg mouse) Ig chain expression Various combinations of deactivation and suppression strategies can be used. (Transformer-switch) In some variations, a transswitched immunoglobulin is produced. It may be desirable to live. For example, such a transformer switched The heavy chain can be chimeric (ie, non-mouse (human) variable region and mouse). Constant area). Including such trans-switched chimeric immunoglobulins Antibodies have a variety of interests in which it is desired to have non-human (eg, mouse) constant regions. Fields of use (eg for binding secondary antibodies that do not bind human constant regions) Of effector functions in the host for the presence of various mouse immunological determinants Can be used for For example, for some antigens, Compared to the mouse variable region ability range (repertoire), the human variable region ability range is May be profitable. Probably human V_H, D, J_H, V_LAnd J_LGenes are a type of Selected for its ability to encode immunoglobulins that bind evolutionarily important antigens Has been: providing evolutionary selective pressure for the mouse's range of abilities Antigens are quite different from those that provided evolutionary pressure to shape human competence It could be one. Mouse constant regions (eg transswitched mice Of the human variable region when combined with an isotype of There may also be benefits in other capacity ranges. The presence of the mouse constant region is consistent with the human constant region. May offer advantages over areas. For example, the mouse γ constant region linked to the human variable region by a transswitch. Is a chimeric antibody reactive with a predetermined antigen (eg, human IL-2 receptor). In the body (preferably monoclonal), T lymphocytes in mice are functional human IL-2 Mouse disease models such as transplanted cells expressing receptors versus mouse models of host disease Mouse effector functions (eg ADCC, mouse complement Antibodies can be provided. This is followed by human variable region coding Sequence (eg cDNA cloning from a source (hybridoma clone)) Or by PCR amplification) and split into sequences encoding the desired human constant region. Lysed for therapeutic use in humans where immunogenicity is preferably minimized. It is possible to encode a human sequence antibody that is more suitable. Resulting Polynuclear with Completely Human Coding Sequence (s) Reotide (s) are expressed in the host (eg expression vector in mammalian cells It is possible to purify it for pharmaceuticals. In some applications, the mau It is possible to use a chimeric antibody directly without replacing the human constant region with the constant region. it can. Other variants and uses of transswitched chimeric antibodies are described in It will be tomorrow for the person. The present invention generally relates to human heavy chain transgenes and endogenous mouse heavy chain constant region genes. B lymphocytes expressing chimeric antibody resulting from transswitch between Non-human transgenic animals are provided. Such chimeric antibody Are generally mouse switched (ie non-μ, non-δ) isotypes Contains mouse constant regions and human sequence variable regions. Chimera against a predetermined antigen Non-human transgenic animals capable of producing antibodies are usually human variable. And both human heavy and light chain transgenes encoding human constant region genes It also has the ability to produce antibodies of fully human sequence when incorporated. Most typically, functionally separated heavy and / or light chain loci It is homozygous for, but is capable of transswitching, one or more endogenous heavy chain constants. A frequently cis-linked enhancer that carries a constant region gene (eg, γ, α, ε) Hold. Such mice are usually pre-determined in combination with Ashbant. Human sequence variable immunized with selected antigen and linked to mouse constant region sequences An immune response is generated that includes a detectable amount of chimeric antibody that includes a heavy chain of regions It Typically, the serum of such immunized animals will be at least about 1 μg / ml. About 10 μg / ml or more, often 30 μg / ml or more, and up to 50-100 μg / ml Such chimeric antibodies may be included at the above concentrations. Antisera containing antibodies containing chimeric human variable / mouse constant region heavy chains are typically It also includes antibodies that contain heavy chain variable / human constant regions (fully human sequences). Trang Chimeric antibodies that have been switched are usually (1) human variable region and mouse constant region (standard Chimeric heavy chain (quasi-mouse gamma) and (2) human transgene Light chains (typically brushed kappa) or mouse light chains (typically capped). Includes Lambda in Pannock Out Pack Grounds. Such a transswitched chimeric antibody generally has a molecular weight of about 1 × 10 5.⁷ M^-1that's all, Preferably 5 × 10⁷M^-1Above, more preferably 1 x 10⁸ M^-1~ 1 x 10⁹ M^-1that's all Binds to a predetermined antigen (eg, immunogen) with an affinity of Frequently predetermined Targeted antigens include human proteins such as human cell surface antigens (eg CD4, CD8 , IL-2 receptor, EGF receptor, PDGFL receptor), other human biology Macromolecules (eg thrombomodulin, protein C, carbohydrate antigens, sialy Le-Lewis antigen, L-selectin) or non-human disease-related macromolecules (eg bacterial) LPS, virion capsid protein or envelope glycoprotein) and the like. The present invention provides a non-human transgenic animal containing a genome that includes: Providing: (1) (eg a functional switch recombination sequence, typically Because it transswitches (in the cis-chain to the functional enhancer) Functionally disrupted by homozygotes containing at least one mouse constant region gene An endogenous heavy chain gene, (2) a functional human heavy chain variable region encoding and expressing Can be placed and transswitched (eg cis-chained) Heavy chain transgene (with RSS); optionally (3) functional Rearranged to encode the light chain variable region and express the human sequence light chain. Human light chain (eg kappa) transgene; and optionally (4) homozygous Functionally disrupted endogenous light chain locus (κ, preferably κ and λ); And optionally (5) a human sequence variable region encoded by a human transgene And endogenous mouse heavy chain constant region genes (eg, γ1, γ2a, γ2b, γ3) Serum containing an antibody containing a chimeric heavy chain consisting of a mouse constant region sequence encoded by . Such transgenic mice also have approximately 1 x 10^Four M^-1Or more, preferably About 5 × 10^Four M^-1Above, more preferably 1 x 10⁷ M^-1~ 1 x 10⁹ M^-1More affinity , A chimeric antibody that binds to a predetermined human antigen (eg, CD4, CD8, CEA) It may include body-containing serum. Often, the monoclonal antibody thus produced At least 8 × 10⁷ M^-1A hybridoma having the affinity of can be produced. Going Mouse constant region and human variable region that can bind to non-human antigens A chimeric antibody containing a heavy chain consisting of Present as an isolated antibody. In some variations, an inactivated, carrying an intact heavy chain constant region gene. Human heavy chain trans that has an endogenous mouse heavy chain locus and can be transswitched Gene, optionally with one or more inactivated endogenous mouse light chain loci. And to generate transgenic mice that also carry the human light chain transgene. Is desirable. Such mice are advantageously fully human due to the transswitch. Alternating heavy chain-containing antibodies and chimeric (human variable / mouse constant) heavy chain-containing antibodies B cells capable of expression can be produced. In the serum of this mouse, An antibody comprising a fully human heavy chain and, preferably, in combination with a fully human light chain. Antibodies including antibodies that include chimeric (human variable / mouse constant) heavy chains in the form. Ha Ibridomas can be generated from the B cells of this mouse. Generally, such chimeric antibodies can be produced by transswitch, where:I Nvivovo Variable region and human encoded by VDJ rearrangement capable of producing The human transgene, which encodes a constant region, typically human μ, is a non-transgene. Receptor for switch recombination with immunoglobulin constant gene switch sequence (RSS) Thus, it is normally the endogenous murine immunoglobulin heavy chain constant region or second A heterologous (eg, human) heavy chain constant region encoded on Lancegene, wherein Human heavy chain constant region not encoded by transgene and transgene Operatively linked the human variable regions that have undergone the grading. System switch Is the isotype switch by recombination of RSS elements in the transgene. However, transswitches often contain chromosomes that harbor the transgene. On different chromosomes, transgene RSS and RS outside of this transgene Recombination between S elements is involved. Transswitches are generally expressed transgene heavy chain constant region genes. And the RS of the endogenous mouse constant region gene (of non-μ isotype, typically γ) S or a second transgene, often integrated on a separate chromosome. Occurring between either one of the RSSs of the human constant region genes. The expressed transgene heavy chain constant region gene, with the first transswitch ( Eg μ) RSS and the human heavy chain constant region contained on the second transgene. Non-chimeric antibody with substantially completely human sequence when occurring between gene RSS Is produced. As a non-limiting example, human heavy chain constant regions (eg, γ1 ) And a polynucleotide encoding an operably linked RSS (eg, γ1 RSS) Expresses an antibody containing human μ chain that has undergone transgene coding Hybrids generated from B cells (or B cell populations) of transgenic mice It can be introduced (e.g., transfected) into a population of dora cells. The resulting hybridoma cells were transformed with the presence of the introduced polynucleotide. And / or human mu chain variable region (idiotype / antigen reactivity) Encoded by a polynucleotide sequence having and having been introduced (eg, human γ1) The expression of a transswitched antibody containing a heavy chain with a constant region You can choose. Transgene-encoded human μ chain RSS and downstream Of an introduced polynucleotide encoding an isotype of E. coli (eg, γ1) Transswitch recombination between S thus produces the transswitched antibody. Can be made. The present invention, as well as (1) at least one transformer switchable Homozygous ligation containing the mouse constant region genes (eg, γ2a, γ2b, γ1, γ3) of Functionally separated endogenous heavy chain locus, (2) functional human heavy chain variable region Can be rearranged to encode and express human sequence heavy chain and is isotyped A human heavy chain trans that can undergo a switch (and / or transswitch) Sgene; optionally further comprising (3) a functional human light (eg, kappa) chain variable region. Can be rearranged to express the human sequence light chain (eg, Top) Transgene, and optionally (4) functionally disrupted with homozygous junctions. An endogenous light chain locus (typically kappa, preferably both kappa and lambda), and And optionally (5) the human sequence variable region encoded by the human transgene and And endogenous mouse heavy chain constant region genes (eg, γ1, γ2a, γ2b, γ3) Serum containing an antibody containing a chimeric heavy chain consisting of a mouse constant region sequence encoded by Immunize a transgenic mouse containing a genome containing, with a predetermined antigen To produce such a transswitched chimeric antibody, including the steps of: The method of is also provided. Affinity labeling: selection for switched isotypes Advantageously, the process of somatic mutation involves transswitch (and syst Itch). Somatic mutations are caused by the clonal progeny of B cells. Extend the range of antibody affinity provided. For example, a switch (transformer or The antibody produced by the hybridoma cells that received the It shows a broader range of antigen-binding affinities than is present in intact hybridoma cells. Therefore, there is no effect on polypeptide binding to the first human heavy chain constant region (eg, μ). Expressing a first antibody containing a heavy chain comprising a first human heavy chain variable region Ma cell populations (typically clonal) to a second heavy chain constant region (eg, human γ, The first human heavy chain variable in polypeptide binding to the α or ε constant region) A hybridoma cell clone mutant expressing an antibody containing a heavy chain containing a region Can be screened. Such a clonal mutant strain,In vitroNatural clone that produces cis switch in Lymphokines induced by mutations or by T cells (eg IL-4 and IFNγ Through the administration of agents that promote isotype switching, such as By induction of such class switch (trans- or cis-), or Heterologous (eg human) heavy chain constant region genes to serve as substrates for the switch And a set of the above, or by the introduction of a polynucleotide comprising a functional RSS It can be produced by combination and the like. Often operatively linked Polynucleotides containing human downstream isotype constant regions (eg, γ1, γ3, etc.) with RSS The oligonucleotide is also introduced into the hybridoma cells and trans-switched. Facilitates isotype switching through a mechanism. Class switch and affinity maturation derived from transgenic animals of the invention Occur within the same population of B cells. Therefore, class-switched B cells ( (Or hybridomas derived therefrom) with high affinity monoclonal It can be used as one screening step to obtain antibodies. Sith -Switch (switch in transgene), transformer switch or both Different approaches can be used to facilitate different class switch events. You can For example, accompanying RSS elements and switch control elements (eg, Single continuous human containing both μ and γ constant region genes with Genomic fragments can be used as transgenes. However, a portion of the single contiguous human genomic fragment desired Can cause problems such as instability when replicated in cloning hosts, etc. More, it may be difficult to clone effectively: especially the region between δ and γ3 The region is particularly the μ gene, γ3 gene, V gene, D gene segment and J gene. Difficult to clone as efficiently as adjacent fragments containing segments It may turn out to be. Similarly, as an example, human μ gene, human γ3 gene, human V gene (s), human gene Consists of a human D gene segment and a human J gene segment, Ron's) or otherwise essential sequences (eg, one or more V, D, and / or Is a J segment and / or one or more non-μ constant region genes) There is a discontinuous human transgene (minigene), with a deletion of. like this Minigenes are essential elements for efficient immunoglobulin expression and switching Relative to separating a single contiguous segment of genomic DNA that spans all of the Overall, it has several advantages. For example, such minigenes may have sequences that are difficult to clone (eg, unstable Sequence, toxic sequence, etc.) without the need to separate large pieces of DNA To do. In addition, isotype switches for cis- or trans-switches A minilocus containing the elements necessary for (eg, the human γ-sterile transcription promoter) is , AdvantageouslyIn vivoCan undergo somatic mutation and class switching in . Many eukaryotic DNA sequences have proven difficult to clone. Therefore, it has proved to be advantageous to delete the non-essential sequences. In one variation, a high binding affinity (eg 1 × 10 5⁷ M^-1Or more, preferably Is 1 × 10⁸ M^-1Above, more preferably 1 x 10⁹ M^-1Producing antibodies with Hybridoma clones undergo a productive (framed) VDJ rearrangement To perform isotype switching due to the substantial lack of the endogenous mouse heavy chain locus Transgenic hosting a human heavy chain transgene that can be traced (see above) From a pool of hybridoma cells derived from B cells of Kumaus, human (or (Mouse) human sequence heavy chain variable in polypeptide binding to non-μ heavy chain constant region Obtained by selecting a hybridoma expressing an antibody containing a heavy chain containing regions Can be These antibodies areIn vivoOr cis-switch and / or in cell culture Includes the "switched heavy chain" produced as a result of trans-switching. Therefore, it is called a "switched antibody". Hybridomas that produce switched antibodies generally have somatic mutation mutations. The hybridoma pool has generally undergone a broader antigen-binding parent. A hybrid that has a range of Japanese power and secretes an antibody with high affinity from this range. A clone can be selected. As a standard, the And substantial binding affinity (1 x 10⁷ M^-1~ 1 x 10⁸ M^-1Human sequence antibody having the above) And the human sequence antibody contains human immunoglobulin variable region (s). Such hybridomas can be selected by a method that includes a two-step process. Wear. One step is (eg, to specifically bind to the switched heavy chain to switch Not isotype,For exampleis substantially immobile to μ, immobilized By binding the hybridoma cells to the immunoglobulin), switch And isolation of hybridoma cells that secrete immunoglobulins containing selected heavy chains There is something to do. Another step is (eg, ELISA of hybridoma clone supernatant, labeling Predetermined with a substantial binding affinity (such as by FACS analysis with the selected antigen) The purpose is to identify hybridoma cells that bind to the antigen. Normally, the switch The selection of hybridomas that secrete the isolated antibody binds the predetermined antigen. Is performed before identifying the hybridoma cells. Against a predetermined antigen Hybridoma cells expressing a switched antibody with substantial binding affinity Separated and standardized in the art as individual selected clones, typically. Cultured under known growth conditions. Optionally, this method includes monoclonal Culturing said selected clone under conditions suitable for antibody expression . Of monoclonal antibodies of the same are collected and used for therapeutic, preventive and / or diagnostic purposes. Can be given. Often, selected hybridoma clones bind to a predetermined antigen. Immunoglobulins (eg, variable regions) that combine (or confer binding strength thereto) As a source of DNA or RNA for isolating the immunoglobulin sequences encoding Can be useful. Following this, the human variable region coding sequences are isolated (eg, PC R amplification or cDNA cloning from a source (hybridoma clone) Humans), which is more suitable for therapeutic use in humans, where immunogenicity is minimized. Splices to sequences encoding the desired human constant region to encode a string antibody. Thing Has the resulting fully human coding sequence (s) Polynucleotide (s) in a host cell (eg from a mammalian cell expression vector) It can be expressed in and purified for pharmaceuticals. Xeno enhancer Heterologous trans capable of encoding human immunoglobulin (eg heavy chain) The gene is advantageously not derived from the mouse genome and / or is a heterologous gene. A cis-chain that is not naturally associated in cis with the exon of Lansgene Includes enhancers. For example, the human kappa transgene (eg, kappa minigene (Zodiac) is advantageously a human V_KGene, human J_KGene, human C_KGene and xeno It may contain an enhancer, and this xeno enhancer is standard. Is standard J_KGene and C_KBetween genes or C_KLocated downstream of the gene Human heavy chain intron enhancer and / or mouse heavy chain intron Including enhancer. For example, the mouse heavy chain J-μ intron enhancer (Ban er ji et al. (1983)Cell 33: 729) is the 0.9 kb Xba I flag of plasmid pKVe2. Can be separated on thereference). Human heavy chain J-μ intron enhancer (Hayday et al. (1984)Nature 307 : 334) can be isolated as a 1.4 kb Mlu I / Hind III fragment (see below).three Teru ). Basically, a cis-linked human J-μ intron enhancer Combined xeno enhancer consisting of J-μ intron enhancer A transcriptionally active xenoenhancer to the transgene Is a transgene, especially if this transgene encodes a light chain such as human kappa. High expression levels of the gene can be imparted. Similarly, rat 3'enhan Sir can be advantageously included in a minilocus construct that can encode a human heavy chain. You canNucleic acid The term "substantially homologous" refers to the optimization of two nucleic acids or their designed sequences. At least about 80% nucleotides, usually less when aligned and compared to With about 90% to 95%, more preferably at least about 98% to 99.5% nucleotides. Point out that they are the same. Alternatively, the segment can be selectively hybridized. Substantial homology exists when hybridized to the complement of its strand under different conditions . Nucleic acid can be in whole cells, in cell lysates, or partially purified or purified. It can exist in a qualitatively pure form. Nucleic acids can be prepared by standard techniques such as alkaline / SDS treatment, CsCl band precipitation, and color Chromatography, agarose gel electrophoresis and other methods known in the art Allows other cellular components or other contaminants, such as other cellular nucleic acids or tamper "Isolated" or "substantially pure" when separated and purified from the protein. F ． Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987). The nucleic acid compositions of the invention are often prepared according to standard techniques for providing gene sequences. Often the native sequence (modified) from either cDNA, genomic DNA or a mixture. (Excluding restriction sites that have been created) can be mutated. For the coding sequence, These mutations may affect the amino acid sequence if desired. Especially the native V, D, J, constants, switches and other such sequences substantially as described herein. DNA sequences that are homologous to or derived from "Derived" means that one sequence is identical or altered to another sequence. And point out). Nucleic acid is "operably linked when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. Ru. ” For example, a promoter or enhancer may direct transcription of the coding sequence. If used, they are operably linked to the coding sequence. Transcriptional regulatory sequence Operably linked means that the DNA sequences to be linked are contiguous. , And if it is necessary to link the two protein coding regions, It means that it exists and is within the reading frame. Can work with switch arrays Means that the sequence is capable of undergoing switch recombination. .Certain preferred embodiments A preferred embodiment of the invention is the light chain transgene described in Examples 5, 6, 8 or 14. The transgene described in Example 12 crossed with an animal containing a single copy of the gene. At least one copy of (eg pHC1 or pHC2), typically 2-10 copies Pea, sometimes animals containing 25-50 or more copies, as well as J described in Example 10._H It is the offspring bred from the deletion animal. Animals are homozygous for their three properties Mated to join. Such animals have the following genotypes: unrearranged human heavy chain small inheritance Single copy (per haploid set of chromosomes) of the locus (as described in Example 12), rearranged Cloned human kappa light chain construct (as described in Example 14). ), And functional J_HEach endogenous mouse heavy chain inheritance removes all of the segments Deletion at the locus (described in Example 10). Such animals are J_HSegmental When mated with mice that are homozygous for the deletion (Example 10), J_HAbout deletion And homozygous and hemizygous for human heavy and light chain constructs Produce grandchildren. Antigens are injected into the resulting animals and human Used to produce internal antibody. B cells isolated from such animals are those in which they have only a single copy of each gene. Is monospecific for human heavy and light chains. Moreover, they are Monospecific for mouse or mouse heavy chain. Of Example 9 and J introduced as described in 12_HBoth endogenous due to region-wide deletions This is because the mouse heavy chain gene copy is non-functional. In addition, a substantial portion of B cells The fractions will be monospecific for human or mouse light chains. Because they are rearranged Expression of a single copy of the human kappa light chain gene is endogenous to a substantial portion of B cells. Will Allelic and Isotopic Elimination of Mouse Kappa and Lambda Chain Rearrangements? It is. The transgenic mouse of the preferred embodiment is ideally that of a native mouse Shows immunoglobulin production with a significant repertoire that is substantially the same as right. For example, in an embodiment where the endogenous Ig gene is inactivated, the total immune globulin Phosphorus levels are about 0.1-10 mg / ml serum, preferably 0.5-5 mg / ml, ideally low It will be in the range of at least about 1.0 mg / ml. Toggle that can switch from IgM to IgG When Lancegene was introduced into transgenic mice, serum IgG vs. IgM The adult mouse ratio is preferably about 10: 1. Of course, the IgG to IgM ratio is immature Much lower for mice. Generally, from about 10% of spleen and lymph node B cells Many, preferably 40-80%, express exclusively human IgG protein. The repertoire is ideally shown in non-transgenic mice. About equal, usually at least about 10% higher, preferably 25-50% or more It will be more expensive. On the number of different V, J and D regions introduced into the mouse genome To a large extent, usually at least about 1000 different immunoglobulins (ideally Is IgG), preferably 10^Four~Ten⁶Or more immunoglobulin is produced Let's do it. The immunoglobulins are typically about half the high antigenic proteins. Or you will recognize more. Examples of antigenic proteins include pigeon cytochrome C, chicken lysozyme, and candy. Licorice mitogen (PWM), bovine serum albumin, blue mussel Anine, influenza hemagglutinin, staphylococcus protein A, map Whale myoglobin, influenza neuraminidase and lambda repressor -Including but not limited to proteins. Some of the above immunoglobulins Is at least about 10 for the preselected antigen.⁷ M ^-1, Preferably 10⁸ M ^-1 ~Ten⁹ M ^-1Or it will show greater affinity. In some embodiments, antibody response to a predetermined antigen type For the purpose of limiting the selection of the V gene represented in It may be preferred to generate mice with. Predetermined ability range A heavy chain transgene with, for example, a predetermined antigen type in humans Human V preferably used in antibody response against_HIt may contain a gene. Alternatively, Depending on the range (eg, V regions with high affinity for a predetermined antigen) Is less likely to code for; is less prone to somatic mutation and intensification of affinity; Or having a certain immunogenicity to humans), some of the prescribed V_HGenes can be excluded. Before rearrangement of the transgene containing various heavy or light chain gene segments , Their gene segments are, for example, hybridized or DNA sequenced. By sequencing, it was determined that it originated from a species other than the transgenic animal. It can be easily identified. Although a preferred embodiment of the transgenic animal of the present invention has been described above, Other aspects are described in the disclosure herein, and more specifically in the Examples. Defined by Sgene. Four categories of transgenic animals defined Can be done I. Unrearranged heavy-chain immunoglobulin transgene and rearranged light A transgenic animal containing a chain immunoglobulin transgene. II. Unrearranged heavy chain immunoglobulin transgene and rearranged A transgenic animal containing no light chain immunoglobulin transgene. III. Rearranged heavy chain immunoglobulin transgene and unrearranged A transgenic animal containing a light chain immunoglobulin transgene. IV. Rearranged heavy chain immunoglobulin transgene and rearranged light chain immunity. A transgenic animal containing a globulin transgene. The preferred order of preference for the above cadegory of transgenic animals is the endogenous light chain. The gene (or at least the kappa gene) is destroyed by homologous recombination (or other method). II> I> III> IV if disrupted, and disruption of the endogenous light chain gene I> II> if not done and must be dominant by allelic exclusion III> IV. ExampleMethods and materials Transgenic masses are described in Hogan et al., “Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual ”, Cold Spring Harbor Laboratory (This is for reference (Incorporated herein). Fetal stem cells are engineered according to published methods [Terato-carcinomas an d embryonic stem cells: a practical approach, E.J. Robertson, IRL Pres s, Washington, D.C., 1987; Zjilstra et al.Nature 342:435-438 (1989) and S chwartzberg, P. et al.Science 246:799-803 (1989); each of these is for reference Will be incorporated into the detailed text]. The DNA cloning method is described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2nd Edition, 1989, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Sprin g Harbor, N.Y. (Which is incorporated herein by reference) To be done. Oriconucleotides are labeled according to the specifications given by the manufacturer. Synthesized on osystems oligonucleotide synthesizer. Hybridoma cells and antibodies are described in "Antibodies: A Laboratory Manual", H arlow and David Lane, Cold Spring Harbor Labo-ratory (1988) (Incorporated herein by reference).Example 1 Genome heavy chain human Ig transgene This example demonstrates that the human genome is microinjected into mouse zygotes. Cloning and microinjection of chain immunoglobulin transgene Enter. Marzluff, W.F. Et al., “Transcription and Translation: A Pva-ctical Appro ach ”, B.D. Hammes and S.J. Higgins, 89-129, IRL Press, Oxford (198 Nuclei are isolated from fresh human placental tissue as described by 5). Isolation Nucleated cells (or PBS-washed human spermatocytes) in low melting agarose matrix Buried Embedding, dissolve with EDTA and proteinase K, expose high molecular weight DNA, DNA of M. Finney provides Current Protocols in Molecular Biology (F ． Ausubel et al., John Wiley & Sons, 4th Augmentation, 1988, Chapter 2.5.1). Digest with the restriction enzyme Not l in agarose as described above. The Not I digested DNA was then digested with Anand, R. et al. ,Nucl. Acids Res.,17: 34 25-3433 (1989) by pulsed field gel electrophoresis. Fractionate. Fractions rich in Not I fragment were subjected to Southern blot hybridization. Assayed to detect one or more sequences encoded by this fragment. So Such sequences are aligned with the heavy chain D segment, J segment, μ and γ1 constant regions. 6 types of V_HIncludes all representatives of the family [This fragment was derived from Berman et al. (1988) ) As previously identified as a 670 kb fragment from HeLa cells, the present inventors It was found from the placenta and sperm DNA as a 830 kb fragment]. Fractions containing this Not I fragment (see Figure 4) were pooled and Clone into the Not I site of pYACNN. The plasmid pYACNN is pYAC-4 Ne. o [Cook, H. et al.Nucl. Acids Res. 16: 11817 (1988)] with EcoRI and Ligation in the presence of oligonucleotide 5'-AAT TGC GGC CGC-3 ' Prepare by. Brownstein et al. (1939),Science, 244, 1348-1351 and Green, E. ,Proc . Natl. Acad. Sct. USA 87: 1213-1217 (1990) (these are the present specification for reference) Incorporated into the YAC clone containing the heavy chain NotI fragment. Isolate. M. Pulsed Field Gel Electron described by Finncy (supra) The cloned NotI insert is isolated from high molecular weight yeast DNA by electrophoresis. 1 This DNA is condensed by the addition of mM spermine and is directly attached to the nucleus of the above-mentioned single cell embryo. Microinject.Example 2 Genomic kappa light chain human Ig transgene formed by in vivo homologous recombination The map of human kappa light chain is Lorenz. W. et al.Nucl. Acids Res. Fifteen: 9667-9677 (1987) , Which is incorporated herein by reference. All Cκ, 3 ′ enhancers, all J segments and at least 5 A 450 kb Xho I-Not I fragment containing different V segments was isolated as described in Example 1. Separate and microinject into the nucleus of single cell embryos.Example 3 Genomic kappa light chain human Ig transgene formed by in vivo homologous recombination 750 kp MluI-Not containing all of the above components and at least 20 more V segments The I fragment was isolated as described in Example 1 and digested with BssHII to give a fragment of approximately 400 kb. Generate it. The 450 kb XhoI-Not I fragment and the approximately 400 kb MluI-BssHII fragment were designated as BssHII restriction sites. It has a sequence overlap defined by the Xho I restriction site. Mouse zygote micro Homologous recombination of these two fragments by injection resulted in a 450 kb Xho I / Not I fragment. At least 15-20 additional V segments than found in the strip (Example 2) Results in a transgene containing.Example 4 Construction of heavy chain minilocus A.Construction of pGP1 and pGP2 Digest pBR322 with EcoRI and StyI and ligate it with the oligonucleotides below. To produce pGP1 containing a 147 base pair insert having the restriction sites shown in FIG. To make. The general overlap of those oligos is also shown in FIG. The oligonucleotides are: This plasmid is isolated from the vector sequence for microinjection Flanked by rare cleavable Not I sites to construct large inserts capable of Containing a large polylinker. This plasmid is more Is derived from pBR322, which has a relatively low copy number (pGP1 is located near the origin of replication. Holds the copy number control area). Low copy number reduces potential toxicity of inserts Let In addition, pGP1 is located between the ampicillin resistance gene and the polylinker. Inserted strong transcription terminator sequence from trpA [Christie, G.E. et al.Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4180 (1981)] is also included. This is ampicillinp Relates to certain inserts by preventing read-through transcription from the lomotor Reduce toxicity. Plasmid pPG2 will introduce an additional restriction site (Sfi I) in the polylinker. Derived from pGp1. pGP1 was digested with MluI and SpeI and The recognition sequence in the car part is cut off. Link the next adapter oligonucleotide to the digested pGP1. To produce pGP2. pGP2 is p except that it contains an additional SfiI site located between the MluI and SpeI sites. Same as GPl. This ensures that the insert is completely excised with SfiI as well as NotI. to enable. B.Construction of pRE3 (rat enhancer 3 ') Introducing an enhancer sequence downstream of the rat constant region into the heavy chain construct . Pettersson et al.Nature 344:165-168 (1990) described heavy chain region 3'd. The enhancer is isolated and cloned. The following oligonucleotides: Is used to PCR amplify the rat IGH 3'enhancer sequence. The double-stranded DNA encoding the 3'enhancer formed in this way was replaced with BamHI and Sph. I-digested and cloned into BamHI / SphI-digested pGP2 to clone pRE3 (rat Enhancer 3 '). C.Cloning of the human J-μ region Substantially part of this region is a fragment of two or more fragments isolated from the lambda phage insert Cloning by combining. See FIG. Oligonucleotide GGA CTG CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCC AAG We used a 6.3koBamHI / HindIII fragment containing the entire human J segment [MaTsuda et al.EMBO J ．7: 1047-1051 (1988); Ravetech et al.,Cell 27:583-591 (1981), this Are incorporated herein by reference] to a human genomic DNA library? Isolated from Oligonucleotide CAC CAA GTT GAC CTG CCT GGT CAC AGA CCTG AC CAC CTA Using TGA, neighbors containing enhancers, switches and constant region coding exons The adjacent 10 kb HindIII / BamHI fragment [Yasui et al.Eur. J. Immunol. 19: 1399-1403 (198 9)] is similarly isolated. The clone pMUM insert as a probe (pMUM is the μ membrane exon 1 oligonucleotide). Ochid: Using CCT GTG GAC CAC CGC CTC CAC CTT CAT CGT CCT CTT CCT CCT 4kb EcoRI / HindIII fragment isolated from human genomic DNA library) The flanking 3'1.5 kb BamHI fragment was similarly isolated using and cloned into pUCC19. To run. pGP1 was digested with BamHI and BglII and then treated with calf intestinal alkaline phosphatase To do. Fragments (a) and (b) from Figure 9 are cloned into the digested pGP1. Next The claw was placed so that the 5'BamHI site was destroyed by the BamHI / BglII fusion. Isolate. Name it pMU (see Figure 10). Fig. 9 digesting pMU with BamHI Insert the fragment (c) from Confirm the direction by HindIII digestion. The generated Rasmid pHIG1 (FIG. 10) is an 18 kb insert that encodes the J and Cμ segments. Contains. D.Cμ region cloning pGP1 was digested with BamHI and HindIII and then treated with calf intestinal alkaline phosphatase. (Fig. 14). The thus treated fragment (b) of FIG. 14 and (c) of FIG. , Clone into pGP1 cut with BamHI / HindIII. Fragmented by HindIII digestion Confirming the correct orientation of (c), pCON1 containing a 12 kb insert encoding the Cμ region Get. pHIG1 has an SFiI 3 ′ site and a SpeI 5 site in the polylinker flanked by Not I sites. Because it contains the J segment, switch and μ sequence within the 18 kb insert with the 'site And will be used for rearranged VDJ segments. pCON1 lacks J area and is 12k b Same as pHIG1 except that it only contains the insert. Rearranged VDJ Segme The use of pCON1 in the construction of fragments containing It E. FIG. γ-1 constant region cloning (pREG2) Cloning of the human γ-1 region is depicted in Figure 16. Yamamura et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156 (1986) is embedded Expression of membrane-bound human γ-1 from a transgene construct that was sometimes partially deleted Reporting. Their results show that the 3'BamHI site has a VC intron of less than 5 kb. Of a sequence containing transmembrane rearranged and switched gamma gene copies with Point out that. Therefore, not rearranged, not switched In the gene, it begins less than 5 kb from the 5'end of the first γ-1 constant exon. The entire switch area is included in the array. It is therefore contained in the 5'5.3 kb Hind III fragment [Eltison, J.W. ,Nucl eic.Acids Res. Ten: 4071-4079 (1982); incorporated herein by reference Lost]. Takahashi et al.Cell 29: 671-679 (1982) (This specification is for reference. Have also been reported to contain this switch sequence. , This fragment was combined with the 7.7 kb Hind III-Bam HI fragment to give us the transgene It must contain all of the sequences required for the construct. Intron sequences are specific The nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides present in the offspring intron. It is a column. The third exon of γ-1 (C_HUse the following oligonucleotides that are specific to 3) Thus, a phage clone containing the γ-1 region is identified and isolated. Cut the 7.7 kb Hind III-Bgl III fragment (fragment (a) in Figure 11) with Hind III / Bgl II. Clone into the cut pRE3 to create pREG1. Upstream 5.3kb Hind III disconnection One piece (fragment (b) in Figure 11) was cloned into HindIII-digested pREG1 to create pREG2. To make. Confirm correct direction by BamHI / Spe I digestion. F.Coupling of Cγ and Cμ The plasmid pHIG1 described above contains the human J segment and the Cμ constant region exon. . To provide a transgene containing the Cμ constant region gene segment, pHIG 1 was digested with Sfi I (Figure 10). Plasmid pREG2 was also digested with SfiI to give human Cγex A 13.5 kb insert containing the Son and rat 3'enhancer sequences was obtained. An array of them Ligated to the human J segment, human Cμ constant region, human Cγ on the 31.5 kb insert. Construction of plasmid pHIG3 'containing 1 constant region and rat 3'enhancer sequence (Figure 12). Human Cγ region obtained by digesting pCON1 with Sfi I and pREG2 with Sfi I By ligation with an Sfi I fragment containing the rat and the rat 3'enhancer. Second plasmid encoding Cμ and human Cγ1 but not J segment To make. The resulting plasmid pCON (Figure 12) contains human Cμ, human γ1 and LA It contains a 26 kb NotI / SpeI insert with the 3'enhancer sequence. G.Cloning of D segment The strategy for cloning the human D segment is depicted in Figure 13. D segment The phage clones from the human genome library containing Column [Y. Ichihara et al.EMBO J．7: 4141-4150 (1988)]. Identified and isolated. The following oligonucleotides are used. From the phage clones identified using oligo DXP1, DLR1, OXP1, DXP'1 A 5.2 kb XhoI fragment containing UA1 and UA1 (fragment (b) in FIG. 13) is isolated. DXR4, DA4 and DK4 from phage clones identified using oligo DXP4 The containing 3.2 kb XbaI fragment (fragment (c) in Figure 13) is isolated. The fragments (b), (c) and (d) in FIG. 13 were ligated to each other, and the Xba I / Xho I sites of pGPl were ligated. It is cloned in to form pHIG2 containing the 10.6 kb insert. This cloning is done continuously. First, the 5.2 kb fragment (b) of FIG. 13 and FIG. 2.2 kb fragment (d) was treated with calf intestinal alkaline phosphatase, and XhoI and XhoI Clone into pGP1 digested with baI. The resulting clone was cloned into the 5.2 kb and 2 Screen with the .2 kb insert. Testing with 5.2 kb and 2.2 kb inserts Half of those clones that are positive for It has a 5.2 kb insert in the orientation. Then, the 3.2 kb XbaI fragment of FIG. Clone into this intermediate plasmid containing d) and allow pHIG2 to form. This The plasmids in the plasmids are polys with a unique 5'Sfi I site and a unique 3'Spe I site. It contains a diversity segment cloned into the linker. Full polylinker Are flanked by NotI sites. H.Construction of heavy chain minilocus The following describes the creation of a human heavy chain minilocus containing one or more V segment. Reveal Newkirk et al.J. Clin. Invest. 81: 1511-1518 (1988) (This is a reference for reference. Identified as a V segment contained in the hybridoma (incorporated in the text) The unrearranged V segment corresponding to the Chid To isolate. Check the restriction map of the unrearranged V segment, and when digested 3'and It has a length of approximately 2 kb containing unrearranged V segments with 5'flanking sequences. The unique restriction sites that provide the DNA fragments that identify 5'start sequence is a promo And other regulatory sequences, while the 3'flanking sequences are the set required for V-DJ binding. Will provide a replacement array. This approximately 3.0 kb V segment insert was used as a template for pGB2 Clone into the plasmid and allow pVH1 to form. pVH1 was digested with SfiI and the resulting fragment was cloned into the SfiI site of pHIG2 to create pHI2. Create G5 '. Since pHIG2 contains only the D segment, the generated pHIG5 'plus The mid contains a single V segment along with the D segment. Insertion included in pHIG5 The size of the insert is 10.6 kb plus the size of the V segment insert. The insert is excised from pHIG5 by digestion with Not I and Spe I. J, Cμ and C pHIG3 'containing the γ1 segment was digested with SpeI and NotI, and the sequence and rat A 3 kb fragment containing the 3'enhancer is isolated. Put those two pieces together, Ligated into NotI-digested pGP1, V segment, 9 D segments, 6 PH containing two functional J segments, Cμ, Cγ and rat 3'enhancer Create an IG. The size of this insert is approximately 43 kb + the size of the V segment insert. Is. I.Construction of heavy chain minilocus by homologous recombination As pointed out in the previous section, the pHIG insert uses a single V segment. It is about 43 to 45 kb. This insert size is easily cloned into a plasmid vector. It is at or near the limit at which it can be trained. Of more V segments Rat 3 was prepared by homologous recombination in zygotes or ES cells in preparation for use. 'Enhancer sequence, human Cμ, human Cγ1, human J segment, human D segment Overlapping DN's forming a transgene containing multiple human V segments In vivo homologous recombination of the A fragment is described below. 6.3 kb BamHI / HindIII fragment containing human J segment (see fragment (a) in Figure 9) The following adapters: For cloning into pHIG 5'digested with Mlu I / Spe I. The resulting plasmid is named pHIG5'O (overlap). Included in this plasmid The inserted insert contains human V, D and J segments. Single V segment from pVH1 When the insert is used, the size of this insert is approximately 17 kb + 2 kb. This insert And contains the human J, Cμ, γ1 and rat 3'enhancer sequences Combine with insert from pHIG3 '. Both inserts are between two DNA fragments Of the human J sequence with an approximately 6.3 kb overlap. These are the same in mouse zygotes. When injected at the same time, in vivo homologous recombination occurs, which is equivalent to the insert fragment contained in pHIG. Generate a transgene. This approach involves multiple V-segments into the transgene formed by the living circle. To prepare for the addition of For example, instead of incorporating a single V segment into pHIG5 ' In addition, (1) isolated genomic DNA, (2) ligation D derived from genomic DNA NA, or (3) DNA encoding the synthetic V segment repertoire, Multiple V-segments were cloned into the SfiI site of pHIG2 and pHIG5'V_NMade To make. Then, the J segment fragment (a) of FIG._NCloned in , And the insert is isolated. This insert is an insert isolated from pHIG3 '. Includes J segment and many V segments that overlap with J segment included above Like Co-injection into the nucleus of mouse zygotes resulted in homologous recombination. , V segment and J segment, D segment, Cμ region Region, Cγ1 region (all derived from human) and rat 3 ′ enhancer sequence Generate a transgene.Example 5 Generation of light chain minilocus A.Preparation of pEμl Generation of pEμl is depicted in FIG. Oligo: XbaI-EcoRI fragment of 678 bp from the phage clone [J. Banerji et al.Cell 33 : 729-740 (1983)], the mouse heavy chain enhancer is isolated. This Eμ fragment was digested with EcoRV / XbaI by blunt-end fill-in at the EcoRI site. Cloned into pGP1. The resulting plasmid is named pEμl. B.Construction of κ light chain minilocus The kappa construct comprises at least one human Vκ segment, five human Jκ segment All, the human J-Cκ enhancer, the human κ constant region exon, and ideally Contains the human 3'kappa enhancer [K. Meyer et al.EMBO J. 8: 1959-1964 (1989) ]. The mouse kappa enhancer is 9 kb downstream from Ckappa. However, in humans Has not yet been identified. In addition, the construct is a mouse heavy chain J-Cμ enhancer Including 1 copy of. This minilocus is made up of four component fragments: (A) Human Cκ exon and 3 ′ human enhancer by analogy with mouse loci A 16 kb Sma I fragment containing (B) 5'flanking 5 kb SmaI fragment containing all five J segments; (C) Mouse heavy chain intron enhancer isolated from pEμl (this sequence , To induce expression of light chain constructs as early as B cell development. Because the heavy chain gene is transcribed earlier than the light chain gene, this heavy chain enhancer Probably more active than the intron kappa enhancer. );and (D) A fragment containing one or more V segments. The preparation of this construct is as follows. Human placenta DNA was digested with SmaI and electrophoresed Fractionate on agarose by motion. Similarly, human placental DNA was digested with BamHI, Fraction by electrophoresis. The 16 kb fraction was isolated from the SmaI digested gel and the Ba The 11 kb region is isolated from the gel containing the mHI digested DNA. The 16 kb Sma I fraction was digested with Xho I to fill in the Xho I ocular digestion product. Lambda FIX II (Stra is treated with Klenow fragment DNA polymerase for tagene, La Jolla, California). Concatenation of 16kb Sma I fractions Destroys the Sma I site but leaves the Xho I site intact. The 11 kb BamHI fraction was digested with BamHI prior to cloning with lambda FIX II (Stratag ene, La Jolla, California). Clones from each library were cloned into Cκ-specific oligos; To explore. The 16 kb Xho I insert was cut with Xho I so that Cκ was adjacent to SmaI. Zab clone into l. The resulting plasmid is named pKap1. The λEMBLBL3 / BamHI library was constructed using the above Cκ-specific oligonucleotide. Explore and identify 11 kb clone. Substituting the 5 kb SmaI fragment (fragment (b) in Figure 25) It is cloned and then inserted into Smal digested pKap1. J in the right direction Those plasmids containing the segment, Cκ and Eμ enhancer were designated as pKap2. Name it. Subcloning of one or more Vκ segments into MluI of pKap2 Human Vκ segment, human Jκ segment, human Cκ segment and human This gives rise to the plasmid pKapH which encodes the Eμ enhancer. pKapH with NotI The insert is excised by digestion and subjected to agarose gel electrophoresis. Purify more. The insert fragment thus purified was used as described above in the pronucleus of mouse zygotes. Microinjected into. C.Construction of κ light chain minilocus by in vivo homologous recombination Digest the 11 kb BamHI fragment with BamHI with its 3'end facing towards the SfiI site. Cloned into pGP1. The resulting plasmid is named pKAPint. pKA One or more Vκ cells in the polylinker between BamHI and the site Spe I in Pint. Insert a ligation fragment to create pKapHV. Digestion of pKapHV insert with NotI Cut out and purify. Digestion of insert from pKap2 with NotI Cut out and purify. Each of these two fragments is a fragment from pKapHV Jκ that is substantially homologous to the 5 kb SmaI fragment contained in the insert obtained from ap2 It contains a region of homology in that it contains a 5 kb DNA sequence containing the segment. Therefore, their inserts are microinjected into the mouse zygote. Homologous recombination with to form a transgene encoding Vκ, Jκ and Cκ Can beExample 6 A genomic clone corresponding to the rearranged and expressed copy of the immunoglobulin kappa light chain gene. Loan isolation This example demonstrates immunoglobulin from cultured cells expressing the immunoglobulin of interest. The cloning of the κ light chain gene is described. Such cells are given immunity It may contain multiple alleles of the globulin gene. For example, 4 for hybridoma Containing two copies of the kappa light chain gene, two of which are from the cell line of the fusion partner. 2 copies are from the original B cells expressing the immunoglobulin of interest . Due to the fact that some of those four copies can be rearranged Nonetheless, only one encodes the immunoglobulin of interest. Described in this example The procedure in 1 allows for selective cloning of the expression copy of the kappa light chain. A.Double-stranded cDNA Cells from human hybridomas or lymphomas, or cell surface morphology Other polymorphs that synthesize secretory or both forms of κ light chain-containing IgM, polyA⁺ Used for RNA isolation. The RNA is then digested with the oligo dT initiation cDNA using reverse transcriptase. Used for synthesis. The single-stranded cDNA is then isolated and the polynucleotide terminal A G residue is added to the 3'end using a transferase enzyme. Then G is attached The purified single-stranded DONA and the following oligonucleotides as primers: For Second-Strand Synthesis (Catalyzed by DNA Polymerase Enzymes) Using DNA Used as. The double-stranded cDNA is isolated and the heavy and light chains of the expressed immunoglobulin molecule are encoded. It is used to determine the 5'non-end nucleoted sequence of the mRNA to be labeled. Then Genomic clones of those expressed genes are isolated. Expressed light chain gene The cloning method for E. coli is summarized in Part B below. B.Light chain The double-stranded cDNA described in Part A was denatured and the following oligonucleotide primer -: As a template for the third round of DNA synthesis using. This primer is a sequence (TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA) and PCR of newly synthesized DNA chain Unique sequences that can be used as primers for amplification (GTA CGC CAT AT C AGC TGG ATG AAG). This sequence is used to Immer: To amplify by PCR. The PCR amplified sequence was purified by gel electrophoresis and used as a primer The following oligonucleotides: As a template for the dideoxy sequencing reaction using. The immunoglobulin information is then transcribed using the first 42 nucleotides of the sequence. Synthesize a unique probe to isolate the identified gene. Synthesis of this DNA The 42 nucleotide segment will be referred to hereinafter as o-kappa. Isolated from an Ig-expressing cell line and individually and in several different restriction enzymes including SmaI. Southern blot of digested DNA pairwise with endonuclease,³²P Probing with labeled unique oligonucleotide o-kappa. Unique system A restriction endonuclease site is identified upstream of the rearranged V segment. DNA from the Ig-expressing cell line was then transferred to SmaI and a second enzyme (of the V segment If there is a SmaI site on the side, cut with BamHI or KpnI). Either generated Treated non-blunt ends with T4 DNA polymerase enzyme to give blunt-ended DNA molecules It Then a linker that encodes the restriction site (which site does not exist in the fragment? Add BamHI, EcoRI or XhoI as appropriate and cleave with the corresponding linker enzyme To give a DNA fragment having BamHI, EcoRI or XhoI ends. Then the DNA Was size-fractionated by agarose gel electrophoresis and contained the expressed V segment. The fraction containing the DNA fragment that undergoes lambda BMBL3 or lambda FIX (Stratagene, La Jol la, California). With unique probe o-kappa , V segment containing clones are isolated. DNA was isolated from positive clones and And subclon into the polylinker of pKap1. The resulting clone was named pRKL Name it.Example 7 A genomic clone corresponding to the rearranged and expressed copy of the immunoglobulin heavy chain μ gene. Loan isolation This example demonstrates immunoglobulin from cultured cells expressing the immunoglobulin of interest. The cloning of the heavy chain μ gene is described. The procedure described in this example is based on μ heavy chain. This allows for selective cloning of the expression copy of the gene. Double-stranded cDNA is prepared and isolated as described above. Denature this double-stranded cDNA, The following oligonucleotide primers: As a template for the third round of DNA synthesis using. This primer is a sequence specific to the constant part of μ heavy chain information (ACA GGA GAC GAG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC) and PCR of newly synthesized DNA chain Unique sequences that can be used as primers for amplification (GTA CGC CAT AT C AGC TGG ATG AAG). This sequence is used to Immer: To amplify by PCR. The PCR amplified sequence was purified by gel electrophoresis and used as a primer The following oligonucleotides: Used as a template for the dideoxy sequencing reaction using. The immunoglobulin information is then transcribed using the first 42 nucleotides of the sequence. Synthesize a unique probe to isolate the identified gene. Synthesis of this DNA The 42 nucleotide segment will be referred to hereinafter as o-mu. Isolated from Ig-expressing cell lines and individually and MluI (MluI is the J segment and μ Several different ocular endometries, including a rare-cleaving enzyme that cleaves between CH1 and Southern blot of DNA digested in pair with nuclease³²P mark Probe with the unique oligonucleotide o-mu. Unique restrictions An endonuclease site is identified upstream of the rearranged V segment. The DNA from the Ig expressing cell line is then cut with MluI and a second enzyme. Then MluI Alternatively, a SpeI adapter linker can be ligated to the end and cut to set the upstream site at MluI or Or convert to SpeI. Then, the DNA was size-resolved by agarose gel electrophoresis. The fraction containing the DNA fragment containing the V segment to be expressed is expressed as plasmid pG. Clone directly into P1. With unique probe o-mu A V segment containing clone was isolated and its insert was either Mlu I or Mlu I / Spe I Subcloned into the plasmid pCON2 which has been cut with. The resulting clone is pRM Name it GH.Example 8 Construction of human kappa small locus transgene Light chain minilocus Human genomic DNA phage using kappa light chain specific oligonucleotide probe The library was screened and clones spanning the Jκ-C region were isolated. J 5.7 kb ClaI / XhoI fragment containing κl together with 13 kb XhoI fragment containing Jκ2-5 and Cκ Was cloned into pGP1d and used to generate the plasmid pKcor. This Plasmid of Jκ1-5, together with 4.5 kb of 5'flanking sequence and 9 kb of 3'flanking sequence, It contains the kappa inroton enhancer and CK. It's a V segment claw A unique 5'Xho I site for cloning and additional cis-acting regulatory sequences for insertion. It also has a neat 3'Sal I site.Vκ gene Human genomic DNA library using Vκ light chain-specific oligonucleotide probe Screening the dilibrary and isolating clones containing the human Vκ segment did. Functional V segments were identified by DNA sequence analysis. Clones of them Is a TATA box, leader and variable peptide (including two cysteine residues) Open reading frame, splice sequence, and recombinant heptamer-12b sp It contains a sequencer-nonamer sequence. Map and map three of the clones. The row was decided. Two of the clones, 65.5 and 65.8, were functional and they were TA Coding TA box, leader and variable peptide (including 2 cysteine residues) Open reading frame, splice sequence, and recombinant heptamer-12b spacer -Suspected to contain nonameric sequences. The third clone, 65.4, is a non-canonical recombination Since it contains a heptamer, it seems to encode the VκI pseudogene. Vκ65-8, one of the functional clones encoding VkIII family genes Was used to generate a light chain minilocus construct.pKC1 Inserting a 7.5 kb XhoI / SalI fragment containing Vκ65-8 into the 5'XhoI site of pKcor Was used to create the kappa light chain minilocus pKC1 (FIG. 38). For digestion with NotI before injection The transgene insert was isolated from. The purified insert was fertilized (C57BL / 6 x CBA) F₂In the pronucleus of the mouse embryo Cloning, followed by Hogan et al. (Methods of Manipulating the Mouse Emb ryo, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Embryos were transferred to pseudopregnant females. Mice developed from injected embryos were The presence of transgene sequences was analyzed by Southern blot analysis of A. Already The band intensity compared to a control containing a known amount of cloned DNA indicated that the The gene copy number was evaluated. Serum was isolated from those animals, and Harlow And Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor La boratory, New York), coded by Transgene as described by Was analyzed by ELISA for the presence of human Igκ protein. Add microtiter plate wells to human Igκ (clone 6Bl, # 0173, AMAC In c., Westhook, ME), human IgM (clone AF6, # 0285, AMAC Inc., Westbrook , ME) and human IgG1 (clone JL512, # 0280, AMAC Inc, Westbrook, ME) Coated with specific mouse monoclonal antibody. Serum sample in the well Serially diluted to minimize cross-reactivity with mouse immunoglobulin Affinide purified alkaline phosphatase-conjugated goat anti-hidden pre-adsorbed Ig (multivalent) was used to detect the presence of specific immunoglobulins. FIG. 41 shows eight mice (ID # 676, 674, 673, 670, 666, 665, 664 and 49). 6 shows the results of an ELISA assay of sera from 6). The first 7 of those mice are pK Developed from embryos injected with the C1 transgene insert, and the eighth mouse Mau born by microinjection of pHC1 transgene (above) It comes from Su. Two out of seven mice from pKC1 injected embryos (ID # 666 and 664). ) Contains the transgene insert when analyzed by DNA Southern blot analysis. No, five (I.D. # 676, 674, 673, 670 and 665) were the transgene. Was included. Detectable levels of human Igκ in all but one of the pKC1 transgene-positive animals The other non-expressing animal expressing the protein was subjected to DNA Southern blot analysis. Based on it seems to be a genetic mosaic. pHC1 positive transgenic mice are It expresses IgM and IgG1 but not Igκ, which is a reagent used in the assay. Prove the peculiarity of.pKC2 Inserting an 8 kb XhoI / SalI fragment containing Vκ65.5 into the 5'XhoI site of pKC1 Was used to create the kappa light chain minilocus pKC2. A generator containing two Vκ segments Lancegene insert isolated by digestion with NotI prior to microinjection did.pKVe2 This construct contains an additional 1.2 kb sequence 5 ′ of Jκ and a 4 ′ 3 ′ of Vκ65.8. Same as pKC1 except that it lacks the .5 kb sequence. The composition further comprises a mau S heavy chain Jm intron enhancer [Banerji et al.Cell 33: 729-740 (1982)) Fragment containing a 0.9 kb XbaI fragment and a human heavy chain Jm intron enhancer inserted downstream. Sir [Hayday et al.Nature 307:334-340 (1984)] including 1.4 kb MluI-HindIII fragment Contains pieces. This construct is a small light chain that is responsible for allelic exclusion and isotype exclusion. Test for the possibility of initiating an initial rearrangement of the locus. Different enhancers , Mouse or rat 3'κ or heavy chain enhancer [Meyer and Neube rger,EMBO J. 8:1959-1964 (1989); Petterson et al.Nature 344:165-168 (1990 ); These are incorporated herein by reference] can do.Rearranged light chain transgene Functionally rearranged light chain gene amplified from human B cell DNA by PCR A kappa light chain expression cassette was designed to reconstitute. The strategy is shown in Figure 39. P The CR-amplified light chain gene was isolated from 65.5 of the kappa light chain gene and flanked by 3.7 kb 5 '. Clone into vector pK5nx containing the sequence. Next, Jκ2-4, Jκint Unique X of vector pK31s containing ron enhancer, Cκ and 9 kb downstream sequence Cloning VJ segment fused to 5'transcriptional regulatory sequence in hoI site It The resulting plasmid contains the reconstituted, functionally rearranged kappa light chain transgene. Contained in the transgene for microinjection into the embryo. It can be cut out with NotI. The plasmid contains additional cis-acting regulatory sequences. It also contains a unique SalI site at the 3'end for 2 to amplify rearranged kappa light chain gene derived from human spleen genomic DNA Two synthetic oligonucleotides (o-130, o-131) were used. Oligonucleotide o- 130 (gga ccc aga (g, c) gg aac cat gga a (g, a) (g, a, t, c)) is VκIII The first A of the leader sequence, which is complementary to the 5'region of the family light chain genes and It overlaps with TC. Oligonucleotide o-131 (gtg caa tca att ctc gag ttt gac tac aga c) is complementary to the sequence from about 150 bp 3'of Jκ1, and Xho I Including parts. The two oligonucleotides are linked to the Jκ1 segment. 0.7 kb DNA from human spleen DNA corresponding to the rearranged vκIII gene Amplify the fragment. PCR amplified DNA was digested with NcoI and XhoI to add individual PCR products It was cloned into the mid pNNO3. When the DNA sequences of the 5 clones were determined, Two clones with a functional VJ junction (open reading frame) were identified. Additional machine Effectively rearranged light chain clones are also collected. Functionally rearranged clone Can be individually cloned into the light chain expression cassette (Figure 39) above. Again Transgenic mice produced using sequenced light chain constructs are allowed to By mating with a transgenic mouse, the primary repertoire Expresses a spectrum of fully human antibodies conferred by heavy chains Mouse strain can be produced. One source of light chain diversity can be from somatic mutations. All light Since the chains are not equivalent in their ability to bind a variety of different heavy chains, each Different mouse strains containing different light chain constituents can be generated and tested. Wear. The advantage of this strategy is opposite to the use of unrearranged light chain minilocus. , Having a light chain that readily pairs with the heavy chain and immediately results in heavy chain VDJ ligation Resulting in increased light chain alleles and isotype exclusion. This combination Strains result in an increased frequency of B cells that express fully human antibodies, thus It can facilitate the isolation of hybridomas expressing Ig. The NotI inserts of plasmids pIGM1, pHC1, pIGH1, pKC1 and pKC2 are agarose It was isolated from the vector sequence by gel electrophoresis. The purified inserts , Microinjected into the pronucleus of fertilized (C57BL / 6 x CBA) F2 mice, and then As described by Hogan et al. [Hogan et al.Methods of Manipulating the Mo use Embryo , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986)] Embryos were transferred into pseudopregnant females.Example 9 Inactivation of the mouse kappa light chain gene by homologous recombination This example demonstrates that mouse endogenous kappa gene by homologous recombination in embryonic stem (ES) cells. Subsequent to the inactivation of the locus, target ES cells carrying the inactivated κ allele Mutations in the mouse germline by injection into early mouse embryos (blastocysts) Describe the introduction of the gene. The strategy was to delete the 4.5 kb segment of the locus spanning the Jκ gene and Cκ segment. To the mouse kappa locus that has been deleted and replaced by the selectable marker neo. Jκ gene and Cκ gene are inherited by homologous recombination using a vector containing the same DNA sequence. To delete the offspring.Construction of κ targeting vector Plasmid pGEM7 (KJ1) (M.A. Rucinicki, Whitehead Institute) Mouse Phosphoglycerate Kinase (pgk) Pro in the Zoning Vector 7Zf (+) Motor [Xba I / Taq I fragment; Abra, C.N. et al.,Gene 60: 65-74 (1987)] Subnodes, neomycin resistance gene used for drug selection of transfected ES cells Including child (neo). This plasmid is derived from the 3'region of the mouse pgk gene, Polyadenylation site heterologous to neo gene [Pvu II / Hind III fragment; Boer, PH .,Biochemical Genetics 28: 299-308 (1990)]. This plasmid is κ Used as a starting point for the production of targeting vector. The first step is the neo expression cassette Was to insert a homologous sequence into the 3'kappa locus. Oligonucleotide probe specific for Cκ locus And oligonucleotide probes specific for the Jκ gene segment: Using a genomic phage library derived from liver DNA using The kappa chain sequence (Fig. 25a) was isolated. In two fragments from the positive phage clone, namely the 1.2 kb BglII / SacI fragment and 6. As an 8 kb SacI fragment, an 8 kb BglII / SacI fragment extending 3 ′ of the mouse Cκ segment Isolated and subcloned into BglII / SacI digested pGEM (KJ1) Then, the plasmid pNEO-K3 ′ was prepared (FIG. 25b). A 1.2 kb EcoRl / Sph I fragment extending 5'of the Jκ region was also isolated from the positive phage clone. Released. Connect the SphI / XbaI / BglII / BcoRI adapter to the SphI site of this fragment. The resulting EcoRI fragment was the same 5 '→ 3' as the neo gene and the downstream 3'κ sequence. Ligated with EcoRI-digested pNEO-K3 'to generate pNEO-K5'3' (Fig. 25c). did. Then Mansour et al.Nature 336: 348-352 (1988) (this specification is for reference) BS with homologous recombinants as described by To prepare for the enrichment of clones, herpes simplex virus (HSV) The Midine Kinase (TK) gene was included. HSV TK cassette from plasmid pGEM7 (TK) Got This cassette is used in the same manner as described above for pGEM7 (KJ1). Construction of the HSV TK gene flanked by the spgk promoter and a polyadenylation sequence. Including the construction sequence. The EcoRI site of pGEM7 (TK) was changed to the BamHI site and the TK cassette was changed. Excised as a Bam HI / Hind III fragment and subcloned into pGP1b to generate pGP1b. -Created TK. This plasmid was linearized at the Xho I site and And the neo gene flanked by the genomic sequence from 3'of Cκ. The XhoI fragment derived from pNEO-K5'3 'was inserted into pGP1b-TK, and the target vector JC KI ( Figure 25d) was made. Putative structure of genomic kappa locus after homologous recombination using J / C K1 The structure is shown in Figure 25e.Generation and analysis of ES cells by targeted inactivation of κ allele The ES cells used were essentially as described [Robertson, E .; J.,Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertso n (Oxford: IRL Press) 71-112 (1987)], a mitotically inactive SNL76 / 7 support cell. Cell layer [McMahon and Bradley, A .;Cell 62: 1073-1085 (1990)]. It was AB-1 series. Other suitable ES systems include the E14 system [Hooper et al.Nature 326: 292 -295 (1987)], D3 system [Doetschman et al., J. Embryol Exp. Morph. 87: 27-45 (198 5)], and CCB systems [Robertson et al.,Nature 323:445-448 (1986)] But is not limited to them. ES cell to mouse strain with specific target mutation Was successfully generated by the pluripotency of ES cells (ie, injected into the host blastocyst). Can participate in embryogenesis and contribute to the germ cells of the resulting animal. Their ability to do). Pluripotency of any given ES cell line was cultivated at culture time and It can vary depending on the attention. The only definitive assay for pluripotency is the use That a specific population of ES cells that are supposed to be involved in germ cell transmission of the ES genome It is to determine whether it is possible to generate a possible chimera. This reason For some reason, a portion of the parental population of AB-1 cells was injected into C57B1 / 6J blastocysts prior to gene targeting. , Whether the cells are capable of producing chimeric mice, and See if most can transfer the ES genome to their offspring. The kappa chain inactivation vector J / C K1 was digested with NotI and the method described [Hasty , P.R. ,Nature 350:243-246 (1991)] in AB-1 cells. I've done it. 2-5 x 10 electroporated cells on a 100 mm dish⁶cell/ The density of the dish was smeared. After 24 hours, G418 (200 μg / ml active ingredient) and FIAU (0.5 μM) was added to the medium to develop drug resistant clones over 10-11 days. Claw Samples were harvested, trypsinized, divided into two parts and grown further. Then, each Freeze half of the cells from the loan and the other half between the vector and the target sequence. The recombination was followed by analysis. DNA analysis was performed by Southern blot hybridization. As stated [Laird, P.W. ,Nucl. Acids Res. 19: 4293 (1991)] clone to DN A was isolated, digested with XbaI, and 800 bp as indicated in Figure 25e as a characteristic probe. The BcoRI / XbaI fragment was probed. This probe is 3.7 kb in the wild type locus XbaI fragment and a characteristic 1.8 kb in the locus homologous to the target vector Bands were detected (see Figures 25a and e). By Southern blot analysis Of the 901 G418 and FIAU resistant clones screened, 7 clones Represents a 1.8 kb XbaI band indicating homologous recombination into one of the kappa genes. So These four clones were further digested with BglII, SacI and PstI enzymes, It was confirmed that the vector was homologously integrated in one of them. Typical 800 bp When probed with the BcoRI / XbaI fragment (probe A), wild-type DNA BglII, S The ac I and Pst I digests produced 4.1, 5.4, and 7 kb fragments, respectively, while The presence of the targeted κ allele is indicated by the 2.4, 7.5 and 5.7 kb fragments, respectively. Plucked (see Figures 25a and e). 7 detected by XbaI digest All of the positive clones have the expected Bg that are characteristic of homologous recombination at the kappa light chain. lII, Sac I and Pst I restriction fragments are shown.Generation of mice with inactivated κ chain Five of the targeted ES clones described in the previous section were cloned as described [Bradle y, A. ,Teratocarcinomas and Embrvonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (Oxford: IRL Press), pp. 113-151 (1987)] C57B1 / 6J blastocyst Cells and host cells derived from the injected ES cells and injected into the uterus of a pseudopregnant female. Chimeric mice derived from a mixture with the main blastocyst are generated. On black C57B1 / 6J background In, the amount of Agouti coat coloring from the ES cell line Visually identify the extent of contribution. Offspring obtained from blastocyst injection of the target clone Approximately half are chimeras (ie, showed agouti as well as black coloring) Most showed the contribution of excess ES cells to film coloring (> 70%). ABI ES cells The XY cell line, and the majority of these high chimeras are colonized male ES cells. It was male because of the sex reversal of the female embryo by the vesicle. A male chimera is bred with C57BL / 6J and dominant as an indicator of germ cell transmission in the ES genome. Observe the offspring for the presence of Agouti coat color. 2 of those clones The chimera from T. radix consistently produced agouti progeny. The only copy of the kappa locus Targeting the injected ES clone, each agouti progeny inherited the mutant locus. Had a 50% chance Southern blot of BglII digested DNA from tail biopsy samples Analysis revealed that the probe used to identify the target ES clone (Probe A, Figure 25e) Was used to screen the target gene. As expected, about 50 of the Agouti descendants % Shows a 2.4 kb hybridizing BglII band in addition to the 4.1 kb wild type band. did. This result demonstrates germline transmission of the targeted kappa locus. In order to generate mice homozygous for the mutation, heterozygotes were Crosses were made and progeny kappa genotyped as described above. As expected, atypical Three genotypes were derived from zygotic mating: have two copies of the normal kappa locus Wild-type mouse having one copy of target κ gene and one NTκ gene Mice, and mice that are homozygous for the kappa mutation. Those latter mice? The κ sequence was deleted using a probe specific for Jκ (probe C, FIG. 25a). Confirmed by Southern blot hybridization. High of the Jκ probe Hybridization was observed in DNA samples from heterozygous and wild-type progeny However, no hybridization signal was detected in the homozygotes. won. This is because both copies of the kappa locus are deleted by deletion as a result of the targeted mutation. Demonstrate the development of a new mouse strain in which is inactivated.Example 10 Inactivation of the mouse heavy chain gene by homologous recombination. This example demonstrates endogenous mouse immunization by homologous recombination in embryonic stem (ES) cells. The activation of the globulin heavy chain gene is described. Measure is J_HThe area is deleted and With a vector containing the heavy chain sequence replaced by the selectable marker gene neo The deletion of the endogenous heavy chain J segment by homologous recombination.Construction of heavy chain targeting vector J_H4-specific oligonucleotide probe Using the D3 ES cell line [Gossler et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 9065- 9069 (1986)], a genomic phage library derived from_HIncluding area The murine heavy chain sequence (Fig. 26a) was isolated. J_HA 3.5 kb genomic Sac I / Stu I fragment spanning the region was isolated from the positive phage clone. Separated, it was subcloned into Sac I / Sma I digested pUC18. Occur Plasmid for puc18 J_HIt was named. Drug selection of transfected ES cells Another neomycin resistance gene (neo) is used to repair the plasmid p6EM7 (KJ1). Derived from deformation. Report in literature [Yenofski et al.,Pfoc. Natl. Acad. Sci. US .A. 87 : 3435-3439 (1990)] is the source of the neo gene used in pGEM7 (KJ1). PMC1neo [Thomas and Cappechi,Cell 51: 503-512 (1987)] We demonstrate point mutations in the neo coding sequence of several commonly used expression vectors. This mutation reduces the activity of the neo gene product, but the restriction fragment containing the mutation It was repaired by replacing the corresponding sequence from the type neo clone. pGEM7 (K The HindIII site in J1) was changed to a SalI site by adding a synthetic adapter, and then The neo expression cassette was excised by digestion with XbaI / SalI. Then the neo fragment Both ends were blunted by treatment with DNA pol I Klenow, and pUC18 J_HNaeI Subcloned into the site and plasmid pUC18 J_H-neo (Fig. 26b) was made. Further construction of the targeting vector was carried out in a derivative of the plasmid pGP1b. pGP 1b was digested with the restriction enzyme NotI and the following oligonucleotides were used as adapters: It was connected with. Construction of mouse immunoglobulin heavy chain target using the resulting plasmid (designated pGET) I built things. Mansour et al.Nature 336: Homology as described by 348-352 (1988). To prepare for the enrichment of ES clones with recombinants, herpes simplex in the construct The viral (HSV) thymidine kinase (TK) gene was included. Plasmid pGEM (TK The HSV TK gene was obtained by digestion with EcoRI and HindIII. This TK DNA fragment is pG Subcloning between the EcoRI and HindIII sites of MT, plasmid pGMT-TK (Fig. 26c) was prepared. Positive genomic phage clones to provide extensive regions of homology to the target sequence. Restriction digestion of DNA from the loan with XhoI and partial digestion with XbaI_Hregion A 5.9 kb genomic Xba I / Xho I fragment located 5'of was derived. Shown in Figure 26a Thus, this Xba I site is not present in the genomic DNA, but rather a positive phage. From the phage sequence immediately adjacent to the cloned genomic heavy chain insert in the clone Be induced. This fragment was subcloned into pGMT-TK digested with Xba I / Xho I. And plasmid pGMT-TK-J_H5 '(Figure 27d) was made. The final stage of production is pUC18 J containing the neo gene and adjacent genomic sequences._H-neo Included excision of the 2.8 kb BcoRI fragment from This fragment was cloned by Klenow polymerase. PGM7T-TK-J, which has been smoothed and unsmoothed in the same way_H Sub in the 5'XhoI site Cloned. Resulting composition J_HKO1 (Fig. 27e) is J_H6 adjacent to loci J containing the .9 kb genomic sequence with the neo gene inserted_H2.3kb spanning the area Has a deletion of. Figure 27f shows the endogenous heavy chain gene after homologous recombination with the targeting construct. Shows the structure of.Example 11 Production and analysis of targeted ES cells Essentially as described [Robertson, E.J. (1987)Terato-Carcinomas a nd Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Edited by Robertson (Oxford : IRL Press), pp. 71-112], a mitotically inactive SNL76 / 7 feeder layer [McMahon and And Bradley,Cell 62: 1073-1085 (1990)] and AB-1 BS cells were grown. previous As described in the examples, targeting construct J_HElectroporation of ES cells by KO1 It has been demonstrated that the ES genome has the ability to transmit germ cells prior to The pluripotency of ES cells was determined by the generation of conventional chimeras. Heavy chain inactivation vector J_HKO1 was digested with Not I and the method described [Has ty et al.Nature 350: 243-246 (1991)] to electroporate AB-1 cells. I'm sorry. 1-2 x 10 electroporated cells on a 100 mm dish⁶Cells / dish Smeared at density After 24 hours, G418 (200 mg / ml active ingredient) and FIAU (0.5 mM) Was added to the medium, and drug resistant clones were developed for 8 to 10 days. Clone Harvested, trypsinized, divided into two parts and grown further. Then each claw Freeze half of the cells from the vector and the other half the homologous pair between the vector and the target sequence. The change was analyzed. DNA analysis was performed by Southern blot hybridization. As stated [Laird et al.,Nucl. Acids Res. 19: 4293 (1991)] Isolate DNA from clone , Digested with StuI, and the 500 bp EcoRI / Stu shown in Figure 27f as probe A. Probing with I fragment. This probe is a 4.7 kb Stu I fragment in the wild type locus. While the 3 kb band was targeted for homologous recombination between the targeting vector and the endogenous sequence. Characteristic (see Figures 26a and 27f). Southern blot hybridise Of 525 G418 and FITU double resistant clones screened by Of these, 12 were found to contain a 3 kb fragment characteristic of recombination with the targeting vector. It was. Those clones are J_HExpected target phenomenon at the locus (shown in Figure 27f) Is shown by further digestion with HindIII, Spe I and Hpa I. Was confirmed. Probing HindIII, Spe I and Hpa I digested DNA to Southern blots Hybridization of bubu A (see FIG. 27f) was not observed for wild-type loci. The 2.3 kb,> 10 kb, and> 10 kb bands, respectively, yielded the targeted heavy chain residue. Bands of 5.3 kb, 3.8 kb, and 1.9 kb are expected for the gene locus, respectively (Fig. 1 See 27f). All of the 12 positive clones detected by the StuI digest were targeted J_H Putative HindIII, Spe I and Hpa I bands characteristic of the gene were shown. In addition, ne StuI quenching of all 12 clones using o-specific probe (Probe B, Figure 27f). Southern blot analysis of the product yielded only a 3 kb putative fragment, which clones Each proved to contain a single copy of the targeting vector.Generation of mice with J _H deletion Thaw 3 of the targeted ES clones described in the previous section and Bradley, A. (1987)Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells: A Practica lApproach , E.J. Robertson (Oxford: IRL Press), pp. 113-151 (1987)] [5 Injected into 7B1 / 6J blastocysts and transferred to the uterus of pseudopregnant females. Black C57B1 / 6J on background At the same time, the amount of Agouti coat coloring from the ES cell line was used to determine the contribution of ES cells to the chimera. Visually identify the degree of contribution. Offspring obtained from blastocyst injection of two target clones Approximately half of the grandchildren are chimeric (ie, showed agouti and black coloring), 3 The eye target clones did not give rise to chimeric animals. Most of these chimeras are hides It showed a significant contribution of ES cells to membrane staining (70% or more). ABI ES cells are XY cells In the system In most of the chimeras, the colonized female embryo was transsexualized by male ES cells. He was a male because he was killed. A male chimera was mated with a C57BL / 6J female to obtain germ cells in the ES genome. Observe offspring for the presence of a dominant agouti coat color, a hallmark of transmission. Chimeras from both of those clones consistently produced agouti progeny did. Only one copy of the heavy chain locus was targeted in the injected ES clone, so Gooch offspring had a 50% chance of inheriting the mutant locus. From tail biopsy sample Southern blot analysis of StuI digested DNA was used to identify the target ES clones. A lobe (probe A, FIG. 27f) was used to screen the target gene. . As expected, about 50% of agouti progeny had about 3 kb of HA in addition to the 4.7 kb wild-type band. The bridging StuI band was shown. This result shows that the targeted J_HLoci Demonstrate germline transmission. To produce mice homozygous for the mutation, heterozygotes were bred to each other. , And the heavy chain genotype of the offspring was determined as described above. As expected, heterozygous Three genotypes were derived from pot crosses: 2 copies of normal J_HHave loci Wild-type mouse, heterozygous with one target copy and one normal copy of the gene Coalesce, and J_HMice homozygous for the mutation. Those latter mice? Rano J_HSequence deletion is J_HUsing a probe specific to (probe C, Fig. 26) Confirmed by Zan blot hybridization. Ascending zygotic offspring and wild type J to 4.7 kb fragment in DNA sample from offspring_HHybrid hybrid probe Was observed, but J_HNo signal in samples from mutant homozygotes Was not detected. This is J_HBoth copies of the heavy chain gene due to sequence deletion Demonstrate the generation of a new mouse strain in which is mutated.Example 12 Heavy chain locus transgene A.Construction of plasmid vector for cloning large DNA sequence 1.pGP1a Plasmid pBR322 was digested with BcoRI and StyI and the following oligonucleotides: It was connected with. The resulting plasmid pGP1a can be excised with the rare-cutting restriction enzyme NotI. Modify to clone very large DNA constructs. It is trpA A strong transcription termination signal derived from a gene [Christie et al.Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 78: 4180 (1981)] downstream (for ampicillin resistance gene AmpR) No Includes tI restriction site. This termination signal eliminates read-through transcription from the AmpR gene Reduce the potential toxicity of coding sequences inserted into the NotI site . In addition, this plasmid retains the pBR322 copy number regulatory region and therefore pU Low copy number compared to C plasmid. This low copy number is also a potential Further reduce toxicity and reduce selection for large inserts by DNA replication Let The vectors pGP1b, pGP1c, pGP1d and pGP1f are derived from pGP1a and Containing different polylinker cloning sites. The polylinker sequence is shown below give. Each of these plasmids can be used to make large transgene inserts. The insert can then be excised with NotI, resulting in transgene DNA It can be purified from the vector sequence prior to microinjection. 2.pGP1b pGP1a was digested with NotI and the following oligonucleotides: It was connected with. The resulting plasmid, pGP1b, contains a short polylinker region flanked by NotI. Mu. This facilitates the generation of large inserts that can be excised by NotI . 3.pGPe The following oligonucleotides: Immunoglobulin derived from rat liver DNA by polymerase chain reaction technique using Phosphorus heavy chain 3'enhancer [S. Petterson et al.Nature344:165-168 (1990)] It was amplified. Amplification products were digested with BamHI and sphI, and BamHI / SphI digested pNNO3 (PNNO3 has the following restriction sites in the order listed: NotI, BamHI NcoI, ClaI, EcoRV, XbaI, S ac I, Xho I, Sph I, Pst I, Bgl II, EcoRl, SmaI, KpnI, HindIII and NotI Is a pUC-derived plasmid containing a polylinker with It was The resulting plasmid pRE3 was digested with BamHI and HindIII, and rat Ig heavy chain 3 ' The insert containing the enhancer was cloned into pGP1b digested with BamHI / HindIII. I learned. The resulting plasmid pGPe (Figure 28 and (Chemical Formula 2) and (Chemical Formula 3)) The sequence can be cloned and then 3'enhancered by NotI digestion. Contains several unique restriction sites that can be excised with B.Construction of transgene pIGM1 expressing the small locus expressing IgM 1.Isolation of J-μ constant region clone and construction of pJM1 Phage vector λEMBL3 / SP6 / T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alt human placenta genomic DNA library cloned into J region specific oligonucleotides: Were screened and the phage clone λ1.3 was isolated. Six All J segment and D segment DHQ52 and heavy chain Jμ intron enhance A 6 kb HindIII / KpnI fragment containing the sir was isolated from this clone. Same lie Fullery the human μ-specific oligonucleotide: Was screened and the phage clone λ2.1 was isolated. μ switch area A 10.5 kb HindIII / XhoI fragment containing all the region and mu constant region exons It was isolated from a clone. These two fragments were combined with Kpn I / Xho I digested pNNO3 Ligated together and the plasmid pJM1 was obtained. 2.pJM2 A 4 kb Xho I fragment was isolated from phage clone λ2.1. The fragment is The so-called Σμ element involved in the δ-related deletion of the μ gene in IgO-expressing B cells [H. Yas ui et al.Eur. J. Immunol. 19: 1399 (1989); which is incorporated herein by reference. The sequence immediately downstream of the sequence of pJM1 is included. This fragment is DNA Treated with Klenow fragment of Polymerase I and digested with XhoI and treated with Klenow Ligated with pJM1 The resulting plasmid pJM2 (Figure 29) contains an internal XhoI site. However, as a result of incomplete reaction by Klenow enzyme, 3'Xh holding ol pJNM2 is a complete human J region, heavy chain J-μ intron enhancer Sir, μ switch region and μ constant region all exons, and μ gene δ association It contains two 0.4 kb direct repeats σμ and Σμ involved in the deletion. 3.Isolation of D region clone and construction of pDH1 The following human D region specific oligonucleotides: Was used to screen a human placenta genomic library for D region clones. I'm sorry The phage clones λ4.1 and λ4.3 were isolated. D element D_K1, D_N1And D_M2 [Y. Icilhara et al.EMBO J．7: 4141 (1988)] and a 5.5 kb XhoI fragment Isolated from clone λ 4.1. D element D_LR1D_XP1, D_XP'1And D_A1including The upstream flanking 5.2 kb hoI fragment was isolated from phage clone λ4.3. Those D territories Each of the region XhoI fragments was SalI of the plasmid vector pSP72 (Promega, Madison, WI). It was cloned into the site and the XhoI site joining the two sequences was destroyed. Then upstream One piece was cut out with XhoI and SmaI, and the downstream fragment was cut out with EcoRV and XhoI. Obtained single The dissociated fragment was ligated with SalI-digested pSP2, resulting in plasmid pDH1. pDH1 contains at least 7 D segments and contains XhoI (5 ') and BcoRV (3' ) Contains a 10.6 kb insert that can be excised with. 4.pCOR1 Plasmid pJM2 was digested with Asp718, an isoschizomer of Kpn I, and The Klenow fragment of Melase I was used to fill in the protruding ends. Then the resulting DN A was digested with ClaI and the insert was isolated. Insert this insert into pDH1 XhoI / EcoRV Fragments and XloI / ClaIIt was ligated with digested pGPe to prepare pCOR1 (FIG. 30). 5.pVH251 Two human heavy chain variable region segments V_H251 and V_H105 (Humphries et al.Nature 33 1: 446 (1988)] containing a 10.3 kb genomic HindIII fragment in pSP72. And provided the plasmid pVH251. 6.pIGN1 The plasmid pCOR1 was partially digested with XloI and the isolated XhoI / SalI insert of pVH251 was digested. The piece was cloned into the upstream XhoI site to create plasmid pIGM1 (FIG. 31). p IGM1 is a single sequence that does not contain vector sequences due to digestion with NotI of all the following sequence elements. Can be isolated in one fragment and can be microinjected into the pronucleus of mouse embryos. Two functional human variable region segments, at least 8 human D segments, 6 human J_HAll segments, human μ enhancer ー, human σμ element, human μ switch region, human μ code exon and human The Σμ element is contained with the rat heavy chain 3 ′ enhancer. C. IConstruction of transgene pHC1 at the small locus expressing gM and IgG 1.Isolation of γ constant region clones Oligonucleotides specific for the following human IgG constant region genes: Was used to screen a human genomic library. Phage clone λ29 .4 and λ29.5 were isolated. 4 kb H of phage clone λ29.4 containing γ switch region Using the indIII fragment, phage vector lambda FIX^TMII (Stratagene, La Jolla , CA) was searched for a human placenta genomic DNA library cloned in The phage clone λSgl.13 was isolated. Determine subclasses of different γ clones In order to use the subclones of each of the above three phage clones as templates, And the following oligonucleotide as a primer: Was used to perform a dideoxy sequencing reaction. Both phage clones λ29.5 and λSγ1.13 are determined to be γ1 subclass Was done. 2.pγe1 The 7.8 kb Hind III fragment of phage clone λ29.5 containing the γ1 coding region was pUC18. Cloned in. The resulting plasmid pLT1 was digested with XhoI and the Klenow digestion was performed. Strips were treated and religated to disrupt the circular Xho I site. Resulting clone p LT1xk was digested with HindIII and the insert was isolated and cloned into pSP72 for cloning. Smid clone pLT1xks was prepared. Bam from polylinker XhoI site and human sequence Digestion of pLT1xks at the HI site resulted in a 7.6 kb fragment containing the γ1 constant region coding exons. Gave a piece. This 7.6 kb XhoI / BamHI fragment from the phage clone λ29.5 Along with the flanking downstream 4.5 kb BamHI fragment, it was cleaved into pGPe digested with XhoI / BamHI. To prepare the plasmid pγe1. pγe1 is a rat heavy chain 3'enhancer Contains all of the γ1 constant region coding exons with a 5 kb downstream sequence linked to To do. 3.pγe2 γ1 switch region and pre-switch non-fertile transcript (sterile trans-cript) [P.S. ideras et al.[Nternational Immunol. 1:631 (1989)] and the first exon 5 A .3 kb HindIII fragment was isolated from the phage clone λSγ1.13, and the insert Cloning into pSP71, which has a polylinker XhoI site near the 5'end, Lasmid clone pSγ1s was prepared. Eliminate the XhoI / SalI insert of pSγ1s with XhoI It was cloned into the cloned pγe1 to generate plasmid clone pγe2 (FIG. 32). ). pγe2 co-localizes with the downstream 5 kb sequence linked to the rat heavy chain 3'enhancer. In addition, all γ1 constant region coding exons as well as upstream switch region and non-fertility Contains transcript exons. 4.pHC1 Plasmid pIGM1 was digested with XhoI, the 43 kb insert was isolated and digested with XhoI. It was cloned into the prepared pγe2 to prepare the plasmid pHC1 (FIG. 31). pHC1 is , A single-fragment in which all of the following sequence elements do not contain vector sequences due to NotI digestion In the mouse embryo and microinjected into the pronucleus of mouse embryos The rat heavy chain 3'enhancer is used in combination with the 2 functional human variable region segments, at least 8 human D segments , 6 humans J_HAll segments, human J-μ enhancer, human σμ element, human Μ switch region, all human μ coding exons, human Σμ element, and human γ1 Constant region (including the associated switch region and non-fertile transcript-related exons Mu) is included. D.Construction of small gene chain transgene pHC2 expressing IgM and IgG 1.Isolation of human heavy chain V region gene VH49.8 Human placenta genomic DNA library Lambda FIX^TMII (Stratagene, La Jolla, C A) with the following human VH1 family-specific oligonucleotides: Was used to screen. The phage clone λ49.8 was isolated and 6.1 kbX containing the variable segment VH49.8 The baI fragment was subcloned into pNNO3 (polylinker ClaI site downstream of VH49.8 Plasmid so that the polylinker XhoI site is upstream). Made. The 800 bp region of this insert was sequenced and VH49.8 was aligned in the open reading frame. Found to have a complete splicing and recombination signal, Therefore, it is pointed out that the gene is functional (Table 2) (Chemical formula 4) (Chemical formula 5). 2.pV2 Human V subcloned into plasmid pUC12_HIV family gene V_HFour -21 [I. Sanz et al.EMBO J. 8: 3741 (1989)] containing a 4 kb XbaI genomic fragment with SmaI And HindIII and treated with Klenow fragment of polymerase I. Blunt end Cloned fragment was cloned into pVH49.8 digested with ClaI and treated with Klenow did. The resulting plasmid, pV2, contains a unique SalI site at the 3'end of the insert and It was ligated upstream of VH4-21 in the same way, using the unique XhoI site at the 5'end, Contains the human heavy chain gene VH49.8. 3.pSγ1-5 ' 0.7 kb XbaI / HindIII fragment together with nearby upstream 3.1 kb XbaI fragment (plasmid pγ The sequence immediately upstream of and adjacent to the 5.3 kb γ1 switch region-containing fragment in e2 (Represented) was isolated from phage clone λSgl.13 and digested with HindIII / XbaI. Cloned into pUC18 vector. The resulting plasmid pSγ1-5 ′ was γ1 Non-fertile transcripts found in B cells before switching to isotype (sterile tr anscript) [P. Sideras et al.International Immunol.,1: 631 (1989)] It contains a 3.8 kb insert representing the sequence upstream of the site. The transcript is an isotype switch And the upstream cis-acting sequences are often important for transcriptional regulation. Promotes correct expression of non-fertile transcripts and associated switch recombination Therefore, their sequences are included in the transgene construct. 4.pVGE1 The pSγ1-5 'insert was excised with SmaI and HindIII, treated with Klenow enzyme and then digested. The following oligonucleotide linkers: It was connected with. The ligation product was digested with SalI and ligated into SalI-digested pV2. I'm sorry. The resulting plasmid pVP contains two functional human variable gene segments VH49.8 and VH4. -21 (see Table 2 (Chemical Formula 4) and (Chemical Formula 5)) linked with a 3.8 kb γ1 switch downstream Contains 5'flanking sequences. After partial digestion with SalI and complete digestion with XhoI, agarose The pVP insert is isolated by purification of the 15 kb fragment on sgel. Then the insertion is cut off The clone was cloned into the XhoI site of pγe2 and the plasmid clone pVGE1 (Figure 33) Create. pVGE1 is 2 upstream of the human γ1 constant gene and associated switch regions. Contains one human heavy chain variable gene segment. Between the variable and constant regions Cloning the D, J and μ gene segments using the Nike SalI site be able to. The rat heavy chain 3'enhancer is linked to the 3'end of the γ1 gene. , And the entire insert is flanked by NotI sites. 5.pHC2 The plasmid clone pVGE1 was digested with Sal I and the Xho I insert of pIGM1 was inserted into it. Cloned. The resulting clone pHC2 (Figure 31) contains four functional human variable regions. Segments, at least 8 D segments, 6 human J_HAll segments, Human J-μ enhancer, human σμ element, human μ switch region, human μ code All exons, human Σμ element, and human γ1 constant region (non-fertile transcript start site With 4 kb flanking sequences upstream of Escherichia coli, associated switch regions and non-fertility transcript associated exo Including). These human sequences were obtained by digesting all of the above sequence elements with NotI to obtain vector sequences. Isolated on a single strand containing no and microinjected into the pronucleus of mouse embryos In order to be able to give rise to transgenic animals, rat heavy chain 3'ene Connected to the Hansar. Use the unique XhoI site at the 5'end of the insert to add An additional human variable gene segment was cloned into this heavy chain minilocus The recombinant diversity of can be further increased. E. FIG.Transgenic mouse The NotI inserts of plasmids pIGM1 and pHC1 were analyzed by agarose gel electrophoresis. Isolated from vector sequence. The purified insert was fertilized (C57BL / 6 x CBA) Microinjected into the pronucleus of F2 mouse embryos and As described by Hogan et al. (B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy, M. ethods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986, Cold Spring Harbor Labora tory, New York) transferred to a pseudopregnant female. Mice developed from injected embryos, Analyze for the presence of transgene sequences by Southern blot analysis of tail DNA did. Hand strength compared to a control containing a known amount of cloned DNA The transgene copy number was evaluated. Serum was isolated from these animals at 3-8 weeks of age, and Harlow and La ne (E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Transgenic as described by Spring Harbor Laboratory, NeW York). By ELISA for the presence of human IgM and IgG1 encoded by I did. The wells of a microtiter plate are filled with mouse Ig specific for human IgM. Clonal antibody (clone AF6, # 0285, AMAC, Inc. Westbrook, ME) and human Mouse monoclonal antibody specific to mouse IgG (clone JL512, # 0280, AMAC, I nc. Westbrook, ME). Sera samples serially in the wells Cross-reactivity with mousse immunoglobulin by diluting with Minimized affinity-isolated alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human Ig (polyvalent) was used to detect the presence of specific immunoglobulins. Table 1 and FIG. 34 show the results from embryos injected with the transgene insert of plasmid pHC1. BLISA assay for the presence of human IgM and IgG1 in the sera of two raised animals. The result of the say is shown. Control non-transgenic mice tested by this assay All the mice were negative for expression of human IgM and IgG. pIGM1 NotI insertion Two strains of mice containing the fragment (strains # 6 and 15) express human IgM, but human Ig Does not express G1. We tested 6 lines of mice containing the pHC1 insert. So As a result, 4 strains (lines # 26, 38, 57 and 122) produced both human IgM and human IgG1. 2 strains of mice (strains # 19 and 21) were expressed with detectable levels of human immunity. It did not express lobulin. PHC1 transgenic mice that did not express human immunoglobulin were Presence of the transgene, which was developed directly from the cloned embryo Can be mosaic about, so-called G₀It was a mouse. Southern blot Analysis revealed that many of these mice had one or a few of the transgenes per cell. It was shown to include a copy. Human IgM in the serum of pIGM1 transgenic animals , And detection of human IgM and IgG1 in the serum of pHC1 transgenic animals was performed by Lancegene sequences direct VDJ ligation, transcription and isotype switching Provide evidence that it is working correctly in. One animal (# 18) Negative for the transgene by Zanblot analysis and no detectable levels of No human IgG or IgG1 was shown. The second animal (# 38) is Southern Contains about 5 copies of the transgene when assayed by blotting , And showed detectable levels of both human IgM and IgG1. Transgene The results of the ELISA assay for 11 animals developed from injected embryos are shown in the table below (Table It is summarized in 1). Table 1 Table 1 shows the presence of integrated transgene DNA and the transgene in serum. Shows the correlation with the immunoglobulin encoded by pHC1 Transgy Two of the animals found to contain It did not express brin. They are both low copy animals and the transgene Does not contain a complete copy of, or the animal has a genetic mosaic (Indicated by <1 copy per cell evaluated for Animal # 21) , And the transgene-containing cells may not have transferred to the hematopoietic lineage. Alternatively, transgenes may be integrated in genomic regions that do not lead to their expression. There is a case. Detection of human IgM in the serum of pIGM1 transgenic animals, In addition, the detection of human IgM and IgG1 in the serum of pHC1 transgenic animals was performed using Transgene sequences are positive in directing VDJ binding, transcription and isotype switching. Point out that it works well. F.cONA clone For VDJ ligation and class switching, and B cell development and allelic exclusion PHC1 gene involved in the involvement of the transgene-encoded human B cell receptor To evaluate the functionality of lancegene, transgenic mouse spleen mRNA or The structure of the immunoglobulin cDNA clone derived from the above was investigated. D and J segment Usage, addition of N region, length distribution of CDR3, and junction that brings functional mRNA molecule Focusing on the frequency of I investigated the characteristics. Transcripts encoding IgM and IgG incorporating VH105 and VH251 Examined. Polyadenylation from 11th week male second generation 57 line pHC1 transgenic mice RNA was isolated. This RNA was used to synthesize oligo dT initiated single stranded cDNA. Then, use the obtained cDNA with the following four synthetic oligonucleotides as primers. Used as template for each of the four PCR amplification reactions used: VH251 specific ori Go-149 ctagct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg (g, a, t, c); VH105 specific oligo-150 gtt gct cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg cag ctg (g, a, t, c); human γ1-specific oligo-151 ggc gct cga gtt cca cga cac cg t cac cgg ttc; and human μ-specific oligo-152 cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc tcg. Reaction 1 is VH251-γ1 transcription using primers o-149 and o-151 Reaction 2 amplified the VH251-μ transcript using primers o-149 and o-152. After amplification, reaction 3 uses primers o-150 and o-151 to increase the VH105-γ1 transcript. And then reaction 3 uses the primers o-150 and o-152 to generate the VH105-μ transcript. It was amplified. The resulting 0.5 kb PCR product was isolated from an agarose gel. Corresponding BLISA device The .mu. Transcript was more abundant than the .gamma. Transcript, consistent with the data (FIG. 40). P The CR product was digested with XhoI and cloned into plasmid pNNO3. 4 PCs Double-stranded plasmid DNA from minipreps of 9 clones from each of the R amplifications Isolated and dideoxy sequencing reaction was performed. Two of the clones It was found to be a deletion product containing no D or J segment. They are normal Since it could not be derived from the RNA splicing product, It may have resulted from the deletion introduced during PCR amplification. One of the DNA samples One was found to be a mixture of two individual clones, and the other three clones. Lorne produced no readable DNA sequences (probably enough DNA samples. Probably because it was not pure in minutes). The DNA sequences of the VDJ junctions from the remaining 30 clones were converted to ). Each sequence is unique and the single pathway of gene rearrangement is not dominant Or that a single clone of transgene-expressing B cells is not dominant. You The fact that no two sequences are similar is due to the immense diversity of immunoglobulins. Contains only 2 V-segments, 10 D-segments and 6 segments It is also an indication that it can be expressed from a small minilocus. During the transgene Both included V-segments, all 6 J-segments and 10 D-segments Seven of the components are used for the VDJ joint. In addition, both constant region genes (μ and γ1) are included in the transcript. VH105 ply Mer was found to be specific for VH105 in the reactions performed. Therefore, anti Many of the clones from responses 3 and 4 contained the VH251 transcript. Furthermore, the connection A clone isolated from the PCR product of response 3 encodes IgM rather than IgG However, this was because the DNA was isolated on the same gel, It may represent contamination with the PCR product from reaction 4. Adult peripheral blood lymphocytes ( Amplification of immunoglobulin heavy chain sequences from PBL) and DNA at the VDJ junction Similar sequencing experiments were reported by the bacterium Yamada et al.J. Exp. Med. 1 73: 395-407 (1991); which is incorporated herein by reference]. This human Compare data from PBLs with our data from pHC1 transgenic mice did. G.J segment selection Table 2 is for the J segment found in adult PBL immunoglobulin transcripts. , A J segment incorporated into the transcript encoded by the pHC1 transgene The distributions of were compared. Their distribution profiles are very similar and both systems are The J4 segment is the dominant segment, followed by the J6 segment. J2 is the rarest segment in human PBL and in transgenic animals It Table 2 H.D segment selection 49% (40 out of 82) of the clones analyzed by Yamada et al. The D segment contained in the chain was included. The other 11 clones were Included sequences that were not assigned to any of the known D segments. Their designation Two of the 11 clones that were not cloned were DIR2 segment contained in the pHC1 construct. It seems to be derived from the inversion of Mento. Ichinara et al.EMBO J．7: 4141 (1988)] Predicted by and Sanz [J. Immunol．147:1720-1729 (1991)] This mechanism was developed by Yamada et al.J. Exp. Med. 171:395-407 (1991)] is taken into consideration I couldn't. Table 2 shows the D segment for pHC1 transgenic mice. Comparison with cloth and that observed for human PBL transcripts by Yamada et al. The data of Yamada et al. Was used for D-separation that included the use of DIR2 and was not in the pHD1 transgene Re-edited to exclude the cement. Table 3 shows the distribution of D segment integration in transgenic mice and human PB. It proves to be very similar in L. Two dominant human D segment DXP'I and DN1 are also frequently found in transgenic mice. Two minutes The biggest difference between the cloths is that DHQ5 in transgenic mice compared to humans. 2 high frequency. The high frequency of DHQ52 recalls the D segment distribution in human fetal liver. Let Sanz reported that 14% of the heavy chain transcripts contained the DHQ52 sequence. pHC Exclude D segment not found in 1 from analysis, analyzed by Sanz 31% of fetal transcripts contain DHQ52. This is due to the fact that we Equivalent to 27% observed in EN mice. Table 3 I.VDJ joint functionality Table 4 shows V from 30 clones analyzed from pHC1 transgenic animals. The deduced amino acid sequence of the DJ region is shown. The translated sequence is one of the 30 VDJ junctions. 23 (77%) are frame circles (in-frame) for variable segment and J segment Indicates that. J.CDR3 length distribution Table 4 shows transcripts with in-frame VDJ junctions in pHC1 transgenic mice. Is a comparison of the length of the CDR3 peptide from that with that in human PBL. Human P BL data was also obtained from Yamada et al. Both distributions are similar, , The distribution of transgenic mice is less than that observed in human PBLs It was biased towards the smaller CDR3 peptide. Divide into transgenic mice The average length of CDR3 is 10.3 amino acids. This is SanzJ. Immunol．147:1720-172 9 (1991)] and substantially the average size reported for human CDR3 peptides. Is the same. Table 4 Example 13 Rearranged heavy chain transgene A.Isolation of rearranged human heavy chain VDJ segment Phage vector λEMBL3 / SP6 / T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alt o, CA) two human leukocyte genomic DNA libraries cloned into , A 1 kb PacI / HindIII fragment of λ1.3 containing the human heavy chain J-μ intron enhancer. Screen with strips. Positive clones are_HSpecific oligonucleotide Ochid: Test for hybridization with a mixture of A clone that hybridizes with both the V and J-μ probes was isolated, Then, the DNA sequence of the rearranged VDJ segment is determined. B.Generation of rearranged human heavy chain transgene Fragments containing the functional VJ segment (open reading frame and splice signal) , So that the XhoI site from the plasmid is adjacent to the 5'end of the insert sequence. Subcloned into the Smid vector pSP72. Includes functional VDJ segment The subclones were cloned into Xho I and Pac I (Pac I is the region near the J-μ intron enhancer. Digestion with a rare cleaving enzyme that recognizes a position) and insert the insert into XhoI / PacI Cloned into pHC2 digested with E. coli and functional VDJ segment, J-μint Ron enhancer, μ switch element, μ constant region coding exon and γ1 constant Region, which contains the non-fertile transcript-related sequence, the γ1 switch and the coding exon. A transgene construct having As mentioned above, this transformer The gene construct was excised with NotI and microinjected into the pronucleus of mouse embryos. To produce a transgenic animal.Example 14 Light chain transgene A.Construction of plasmid vector 1. Plasmid vector pGP1c Plasmid vector pGP1a was digested with NotI and the following oligonucleotides: To be connected in it. The resulting plasmid pGP1c is flanked by NotI sites. Containing a polylinker with restriction sites for XmaI, XhoI, SalI, HindIII and BamHI. Mu. 2. Plasmid vector pGP1d Plasmid vector pGP1a was digested with NotI and the following oligonucleotides: To be connected in it. The resulting plasmid, pGP1d, is flanked by NotI sites. Containing a polylinker with SalI, HindIII, ClaI, BamHI and XhoI restriction sites. Mu. B.Isolation of Jκ and Cκ clones Phage vector λEMBL3 / SP6 / T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alt human placenta genomic DNA library cloned into Light chain J region specific oligonucleotides: And phage clones 136.2 and 136.5 are isolated. A 7.4 kb XhoI fragment containing the Jκ1 segment was isolated from 136.2 and was isolated in plasmid pNNO3. Subcloning into plasmid clone p36.2. Cκ gene segment And a neighboring 13 kb XhoI fragment containing Jκ segments 2 to 5 together with Clone 136.5 and subcloned into plasmid pNNO3 Create the mid clone p36.5. When these two clones are put together, Jκ1 Spans the region beginning 7.2 kb upstream of and ending 9 kb downstream of CK. C.Generation of rearranged light chain transgene 1. Cκ vector pCK1 for expressing rearranged variable sag The 13 kb Xho I fragment of plasmid clone p36.5 containing the Cκ gene was transferred to the 9 kb downstream site. With the sequence and the 5'end of the insert adjacent to the plasmid Xho I site. , Clone into the Sal I site of plasmid vector pGP1c. Resulting clone pCK1 is a unique 5'Xh cloned fragment containing the rearranged VJκ segment. Can be housed in the I site. Then the transgene is cut out with NotI , Purified from the vector sequence by gel electrophoresis. The obtained transgene structure The product will contain the human J-Cκ intron enhancer and will contain human 3'κ Enhancers can be included. 2. Heavy chain enhancer-containing CK for expressing rearranged variable segment Vector pCK2 Mouse heavy chain J-μ intron enhancer [J. Banerji et al.Cell33: 729-740 (1983)] and a 0.9 kb XbaI fragment of mouse genomic DNA is subcloned into pUC18. To prepare plasmid pJH22.1. Linearize this plasmid with SphI Then, the ends were filled in using Klenow enzyme. Klenow-treated DNA It was then digested with HindIII and the human heavy chain μ intron enhancer [Hayday et al. ,Nature 307:334-340 (1984)] containing phage clone λ1.3 (previous example) The MluI (Klenow) / HindIII fragment of was ligated with it. The resulting plasmid, pMHB1, is excised on a single BamHI / HindIII fragment. Thus, the murine and human heavy chain μ intron enhances ligated together in pUC18. It consists of a sir. This 2.3 kb fragment was isolated and cloned into pGP1c to generate pMHE2. To make. pMHE2 was digested with SalI and the 13kb XhoI insert of p36.5 was cloned into it. To run. The resulting plasmid pCK2 contains mouse and human heavy chain J-μ intronenes. PCK1 except that the hancer is fused to the 3'end of the transgene insert. Is the same as Different enhancers to regulate expression of the final transgene Ie, mouse or rat 3'κ or heavy chain enhancer [Meyer and Neu berger,EMBO J．8:1959-1964 (1989); Ptterson et al.Nature 344:165-168 (199 0)] can be used to make similar constructs. 3. Isolation of rearranged kappa light chain variable segment Phage vector λEMBL3 / SP6 / T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alt o, CA) two human leukocyte genomic DNA libraries cloned into , A human κ light chain J region containing the 3.5 kb XhoI / SmaI fragment of p36.5 I'm sorry Positive clones were cloned into the following Vκ specific oligonucleotides: Was tested for hybridization with. Both V probe and J probe A clone that hybridized with and isolated and rearranged VJκ segment DNA sequence of 4. Generation of transgenic mice containing rearranged human light chain constructs The fragment containing the functional VJ segment (open reading frame and splice signal) Κ light subcloned and rearranged into the XhoI site of vectors pCK1 and pCK2 Create a chain transgene. The transgene construct was digested with NotI to digest the transgene construct. Isolated from the vector sequence. The insert fragment purified on agarose gel was placed in front of mouse embryos. Microinject into the nucleus to make transgenic mice. Human κ The animal expressing the chain is transformed into a transgenic animal containing the heavy chain small gene (actual By mating with Example 14), a mouse that completely expresses human antibody is produced. All of the VJκ combinations are stable with a wide spectrum of various heavy chain VDJ combinations. Since each chain-light chain complex cannot be formed, different rearranged V The Jκ clone was used to generate several different light chain transgene constructs and And a mouse expressing a heavy chain minilocus transgene. Double transformer From the transgenic (both heavy and light chain constructs) animals, the peripheral blood, spleen and reassortant And isolated human and mouse heavy and light chain immunoglobulins. Staining with specific fluorescent antibody (Phavmingen, San Diego, CA) and FACScan analysis By flow cytometry using an instrument (Becton Dickinson, San Jose, CA) analyse. Produces the highest levels of human heavy / light chain complexes on the surface of the greatest number of B cells And does not adversely affect immune cell division (B and T cell subset-specific antibodies Rearranged light chain (as assayed by flow cytometric analysis used) Lancegene constructs are selected for the production of human monoclonal antibodies. D.Generation of unrearranged light chain minilocus transgene 1. Jκ, Cκ-containing vector pJCK1 for producing a small locus transgene The 13 kb Cκ-containing XhoI insert of p36.5 was treated with Klenow enzyme and digested with HindIII. And cloned into the Klenow-treated plasmid pGP1d. 5 of inserts Select a plasmid clone whose'end is flanked by ClaI sites from the vector. It The resulting plasmid p36.5-1d is digested with Cla I and treated with Klenow. p36.2 The Jκ1-containing 7.4 kb XhoI insert was treated with Klenow and digested with ClaI. Clone into know-treated p36.5-1d. p36.2 insert is p36.5 insert Select a clone in the same direction as. This clone, pJCK1 (Figure 35), has a length of 7.2 kb. Complete human Jκ and Cκ regions together with upstream and 9 kb downstream sequences Including. The insert also contains the human J-Cκ intron enhancer, the human 3'κ enhancer. It may also include a sensor. The insert may contain additional 3'flanking sequences, such as heavy chain or Flanked by unique 3'SalI sites for the purpose of cloning the light chain enhancer To be done. The unique XhoI site is located in the unrearranged Vκ gene segment. It is placed at the 5'end of the insert for the purpose of rolling. Unique SalI and Xh The oI site is used to isolate the final transgene construct from the vector sequence. Flanked by NotI sites. 2. Isolation of unrearranged Vκ gene segment and human Ig light chain protein Of transgenic animals expressing quality Using the Vκ-specific oligonucleotide Oligo-65 (supra), phage In vector λEMBL3 / SP6 / T7 (Clonetecch Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) The human placental genomic DNA cloned in. From the resulting clone Variable gene segments are sequenced and clones that appear to be functional are selected. Machine Criteria for determining potency include open reading frames, complete splice acceptor and donor. Body sequence, as well as complete recombination sequences. The UDNA fragment containing the selected variable gene segment was inserted into the plasmid pJCK1 Clone into the XhoI site to generate the minilocus construct. Obtained claw Digested with NotI, the insert was isolated, and microinjected into the pronucleus of mouse embryos. To produce transgenic animals. Transgy of those animals Will undergo VJ binding during B cell development. Animal expressing human κ chain Are mated with transgenic animals containing the heavy chain minilocus to complete human antibody. Obtain fully expressing mice.Example 15 Genome heavy chain human Ig transgene This example shows that microinjection into zygotes or assembly into ES cells. Human genomic heavy chain immunoglobulins introduced into mouse germ cells by immobilization The lance gene cloning is described. Marzluff, W.F. et al., (1985)Transcription and Tvanslation: A Practical Ap proach , B.D. Hammes and S.J. Higgins, 89-129, IRL Press, Oxford Nuclei are isolated from fresh human placental tissue as described previously. Isolated nucleus (Or human spermatocytes washed with PBS) embedded in 0.5% low melting point agarose block 1 mg / ml proteinase in 500 mM EDTA, 1% SDS for inoculation and nuclei ZE K for spermatocytes 1 mg / ml in 500 mM EDTA, 1% SDS, 10 mM DTT The proteinase K of the above is dissolved at 50 ° C. for 18 hours. 40 μg / block Proteinase by incubation in 50 ml of PMSF / TE for 30 min at 50 ° C Inactivate ZEK. Then M. By FinneyCurrent Protocols in Molecular Biology (Edited by F. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Supplement 4, 1988, eg Chapter 2.5.1). The DNA is digested with the restriction enzyme NotI in agarose as described in (1). The DNA digested with Not I was then digested with Anand et al.Nuc. Acids Res．17: 3425-3433 ( Fractionation by pulsed field gel electrophoresis as described by 1989). . Fractions rich in NotI fragment were assayed by Southern hybridization and Detect one or more sequences encoded by the fragment. Such an array is 6 Vs with heavy chain D segment, J segment and γ1 constant region_Hfamily -Contains all representatives [This fragment is described in Berman et al. (1988), supra in HeLa cells. Although it has been identified as a 670 kb fragment from the And from the sperm DNA were found to be 830 kb fragments]. Contains this NotI fragment Fractions (see Figure 4) as described [McCormick et al.Technique 2:65-71 (1990)] The vector pYACNN is ligated into the NotI site. The plasmid pYACNN contains pYACneo (C lontech) was digested with BcoRI and the oligonucleotide 5'-AAT TGC GGC CGC was prepared. It is prepared by ligation in the presence of -3 '. Traver et al.Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 5898-5902 (1989) The YAC vector containing the heavy chain, NotI fragment is isolated as described above. Cloned Not The I insert was transformed into M. Pulsed field gels as described by Finney (supra) Isolate from high molecular weight yeast DNA by electrophoresis. With the addition of 1 mM spermine The DNA is concentrated and microinjected directly into the nuclei of single cell embryos as described above. Alternatively, the DNA is isolated by pulse field gel electrophoresis and the lipofin Operation [Gnirke et al.EMBO J．Ten: 1629-1634 (1991)] introduced into ES cells Or YAC is introduced into ES cells by spheroplast fusion.Example 16 Discontinuous genomic heavy chain Ig transgene V_H6, D segment, J segment, μ constant region and some γ constant regions The 85 kb SpeI fragment of human genomic DNA containing was essentially as described in Example 1. Was isolated by YAC cloning. Fragments from germline variable regions, eg If there are many copies of V₁~ V_Five570kb NotI fragment upstream of the above 670-830kb NotI fragment containing YACs containing, are isolated as described above. [Berman et al. (1988), supra, each Two 570 kb NotI fragments containing multiple V segments were detected. ] These two fragments Are co-injected into the nucleus of mouse single cell embryos as described in Example 1. Co-injection of two different DNA fragments typically involves co-injection at the same site in the chromosome. Results in the incorporation of both fragments into the filter. Therefore, at least one copy of each of the two fragments Approximately 50% of the resulting transgenic animals containing It has an inserted V segment fragment. The position of the 85 kb Spe I fragment in those animals Depending on the orientation of the 570 kb NotI fragment with respect to the position, approximately 50% of the V- It will perform DJ binding, and about 50% will perform V-DJ binding due to the deletion. occured DNA isolation from transgenic animals and Southern blot hybridisation Animals shown to contain both transgenes by isomerization (see Preferably, an animal containing both a large number of human V segments and human constant region genes) The ability to express human immunoglobulin is tested according to standard branching techniques.Example 17 Identification of functionally rearranged variable region sequences in transgenic B cells Using the antigen of interest, the following genetic characteristics: J_HFor the deletion of (Example 10) Homozygous in the causative possession chain locus; unrearranged human heavy chain minilocus Semizygous for a single copy of Lancegene (Examples 5 and 14); For a single copy of the sequenced human kappa light chain transgene (Examples 6 and 14) Immunize mice with hemizygosity (Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York (1988)]. After the immunization schedule, the spleen is removed and the splenocytes are used for hybridomas. Prepare. Individual hybridomas that secrete antibodies that are reactive with the antigen of interest Genomic DNA is prepared using cells from the clone. A sample of genomic DNA is Digested with several different restriction enzymes that recognize a unique 6 base pair sequence, and Fraction on a gel. 2-10 using Southern blot hybridization Two DNA fragments within the kb range are identified. One of the fragments is the rearranged human The single chain VDJ sequence, the other of the rearranged human light chain VJ sequence. Contains a single copy. The two fragments were size-fractionated on an agarose gel and pUC18 Clone directly into The cloned insert contains a constant region sequence Subcloned into heavy and light chain expression cassettes respectively. Plasmid clone pγe1 (Example 12) was used as a heavy chain expression cassette and The sequenced VDJ sequence is cloned into the XhoI site. Plasmid clone pC Using K1 as the light chain expression cassette, the rearranged VJ sequence was cloned into the XhoI site. Learn. SP using the resulting clone together₀Transfect cells Therefore, an antibody that reacts with the antigen of interest is produced [M, S. Co et al.Proc. NatI. Acad . Sci USA 88: 2869 (1991)]. Alternatively, mRNA was isolated from the cloned hybridoma cells described above and the cDNA was combined. Used to make. The expressed human heavy and light chain VDJ and VJ sequences are listed below. PCR-amplified and cloned [J. W. Larrich et al. (1989)Biol. Tec hnlogy, 7:934-938]. After determining the nucleotide sequence of those clones, An oligonucleotide encoding the same polypeptide was synthesized, and C.I. Queen et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5454-5458 (1989) as described by To produce a synthetic expression vector.Immunization of transgenic animals with complex antigens In the next experiment, transgenic animals were tested for complex antigens such as those on human red dishes. Can be successfully immunized, and the response observed in normal mice. Answer Prove that you can respond with kinetics similar to kinetics. Blood cells are generally suitable immunogens, with numerous foreign substances on the surface of red and white blood cells. Comprising different types of antigens.Immunization with human blood Endogenous functionally disrupted collection of human blood tubes from a single donor Heavy chain locus (J_HD) and containing a human heavy chain minigene construct (HCl) Used to immunize transgenic mice. Live those mice with system 112 To name. Blood was washed and resuspended in 50 ml Hank's solution, 1 x 10⁸Cells / ml Diluted. Then use a 28 gauge needle and a 1 cc syringe to prepare 0.2 ml (2 x 10⁷Cells) It was injected intraperitoneally. This immunization protocol was repeated almost every week for 6 weeks. Taking blood from retro-orbital bleeds, collecting serum and testing it for specific antibodies The serum antibody titer was monitored by. Preimmune hemorrhage was taken as a control. Masa At the end of the last immunization, the animals are sera to obtain serum or hybridomas. Three days prior to sacrifice, into the tail vein to increase hybridoma production. 1 x 10⁸Immunization with cells was performed once. Table 5 Mice # 2343 and 2348 have the desired phenotype: Human heavy chain small inheritance on a heavy chain disruption background Child transgenic.Preparation of hybridoma Mau of about 16-week-old transgenic mice (Table 5) immunized as described above. Fusion phase consisting of non-secretory HAT-sensitive myeloma cell line X63 Ag8.653 Hybridomas were prepared by fusing with the hands. Hybrido macro Immunoglobulin that has a specific binding affinity for blood cell antigens Of the hybridoma-containing supernatant, for example by flow cytometry did.Flow cytometry Serum and hybridoma supernatants were tested using flow cytometry. provider Erythrocytes from S. alba are washed 4 times in Hanks' solution and 50,000 cells are added to 1.1 ml of polyp. Placed in ropylene microtubules. Co-incubate cells with supernatant from hybridoma or antiserum Staining medium [phenol red or biotin (Irvine Scientific), 3% new 30 minutes on ice in live bovine serum, 1x RPMI medium without 0.1% sodium azide Incubated for a period of time. Controls consisted of littermate mice with other genotypes. Next Cells by centrifuging in Sorva II RT600B at 1000 rpm for 5-10 minutes at 4 ° C. Washed. After washing the cells twice, use a fluorogenic reagent to remove the antibodies on the cell surface. Detected. Tested with two monoclonal reagents. One is labeled with FITC Mouse anti-human μ heavy chain antibody (Pharmagen. San Diego, Calif.). Rat anti-mouse kappa light chain antibody labeled with PE (Becton-Dickenson, San Jose, CA) Met. Both of these reagents gave similar results. Whole blood (red and white blood cells ) And white blood cells only were used as target cells. Both sets gave positive results. Sera from transgenic mice and littermate controls with erythrocytes from donors or Incubate with any of the white blood cells from other individuals, wash, and then anti-hidden Color was developed with IgM FITC labeled antibody and analyzed in a flow cytometer. Conclusion Fruits are mice transgenic for the human minilocus (mouse 2343 and mouse 2343). And 2348) show human IgM reactivity, while all littermates (2344,23) 45, 2346, 2347) did not show the reactivity. Normal mouse serum (NS ) And phosphate buffered saline (PBS) were used as negative controls. Red blood cells unfiltered And white blood cells were filtered to contain only lymphocytes. To give a comparison Lines are drawn on the x-axis and the y-axis. Flow for 100 supernatants from fusion 2348 Cytometry was performed. 4 supernatants show positive reactivity to blood cell antigens did.Example 18 Reduction of endogenous mouse immunoglobulin expression by antisense RNA A, vector for expression of antisense Ig sequences 1. Construction of cloning vector pGP1h The vector pGP1b (described in the previous example) was digested with Xho I and BamHI and the Ligonucleotide: It was ligated to the plasmid pGP1h. This plasmid contains the following restriction sites : Polyline containing NotI, EcoRI, BgIII, Asp718, XhoI, BamHI, HindIII, NotI Contains a car. 2. Construction of pBCE1 Promoter-leader sequence exon, first intron and human V_H-V PV containing part of the second exon of the Amily immunoglobulin variable gene segment A 0.8 kb XbaI / BglII fragment of H251 (described in the previous example) was digested with XbaI / BglII. The plasmid pVH251N was prepared by inserting it into the vector pNNO3. Human growth hormone gene [hGH; Seeburg (1982)DNA 1:239-249] A 2.2 kb BamHI / EcoRI DNA fragment containing exon was digested with BamHI / BcoRI to obtain pGH1h Cloned in. The resulting plasmid was digested with BamHI and pVH251N Ba Insert the mHI / EcoRI fragment in the same direction as the hGH gene to create plasmid pVhgh did. Mouse heavy chain J-μ intron enhancer [Banerji et al. (1983)Cell 33: 729-7 Subcloning of a 0.9 kb XbaI fragment of mouse genomic DNA containing 40] into pUC18 Then, the plasmid pJH22.1 was prepared. This plasmid was linearized with SphI and the ends Was filled in with Klenow enzyme. Then, the Klenow-treated DNA was treated with HindIII Digested and human heavy chain J-μ intron enhancer [Hayday et al. (1984)Natu re 307:334-340] containing 1.4 kb MluI of the phage clone λ1.3 (Example above) ( The Klenow) / HindIII fragment was ligated with it. The resulting plasmid pMHE1 is Together in pUC18 so that it can be excised in a single BamHI / HindIII fragment. It consists of a linked mouse and human heavy chain J-μ intron enhancer. Cloning the BamHI / HindIII fragment of pMHE1 into pVhgh cut with BamHI / HindIII To prepare B cell expression vector pBCE1. This vector (depicted in Figure 42) Contains unique XhoI and Asp718 cloning sites in which antisense D The NA fragment can be cloned. Expression of those antisense sequences , Directed by the upstream heavy chain promoter-enhancer combination, The downstream hGH gene sequence is responsible for the expression of transgene constructs in addition to intron sequences. A facilitating polyadenylation sequence is provided. Antisense prepared from pBCE1 The lance gene construct can be separated from the vector sequence by digestion with NotI. It B. IgM antisense transgene construct The following oligonucleotides: By polymerase chain reaction (PCR) using mouse spleen cDNA as a substrate Used as a primer for amplification of mouse IgM constant region sequences. Obtained 0.3 The kb PCR product was digested with Asp718 and XhoI and pBCE1 digested with Asp718 / XhoI. It was cloned in to create the antisense transgene construct pMAS1. pMA S1 purified NotI insert, either alone or in one or more additional transgenes In combination with the construct, microinjection into the pronucleus of half-day mouse embryos A transgenic mouse was produced. This construct hybridizes with mouse IgM mRNA. Expression of RNA transcripts in B-cells and thus of mouse IgM protein Down regulate. A duplex containing pMAS1 and a human heavy chain transgene minilocus such as pHC1. Transgenic mice (either by co-injection of both constructs or by single transfection) Nick mice) are produced only for the human heavy chain minilocus. Human transgenes on a higher proportion of B cells than in transgenic mice It will express the Ig receptor encoded by the protein. Human vs mouse Ig receptor The ratio of cell-expressing cells is in part to the factors and cells that promote B cell differentiation and development. This is because of the competition between the two groups. Ig receptors play an important role in B cell development Therefore, it expresses reduced levels of IgM on the surface (mouse Ig-specific Mouse Ig receptor-expressing B cells (for antisense down-regulation) Cells expressing the human receptor will also not compete. C. Igκ antisense transgene construct The following two oligonucleotides: By polymerase chain reaction (PCR) using mouse spleen cDNA as a substrate Used as a primer for amplification of mouse Igκ constant region sequences. Got 0. The 3 kb PCR product was digested with Asp718 and Xho I, and pBC digested with Asp718 / Xho I. The antisense transgene construct pKAS1 was cloned into E1. p MAS1 purified NotI insert, either alone or in one or more additional transgenes Microinjection into the pronucleus of half-day mouse embryos in combination with A transgenic mouse was produced. This construct hybridizes with mouse Igκ mRNA. It expresses RNA transcripts in soybean B cells and is therefore as described above for pMAS1. Down-regulates the expression of mouse Igκ protein as well.Example 19 This example demonstrates successful immunization in transgenic mice of the invention. Prove an immune response.Immunization of mice Blue mussel hemocyani combined with more than 400 dinitrophenyl groups per molecule (Calbiochem, La Jolla, California) (KLH-DNP) previously published method (P ractical Immunology, L. Hudson and F.C. Hay, Blackwell Scientific Publishing, Alum precipitation according to page 9, 1980). Alum-precipitated KLH-DN 400 μg of P was added to 100 μl of dimethyldioctabromide in phosphate buffered saline (PBS). Each mouse was injected ip with 100 μg decyl ammonium. 6 days later orbital Serum samples were collected by sinus bleeding.Analysis of human antibody reactivity in serum Using the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Reactivity and specificity were evaluated. Some to analyze antibody induction by immunogens Target antigens were tested. Blue mussel to identify reactivity to protein components Reactivity to cyanine (Calbiochem), haptens and / or modified amino groups of Bovine serum albumin for identification, and KLH-ON for reactivity to total immunogen P was used. Human antibody binding to antigen cross-reacts with mouse immunoglobulin Detected by enzyme conjugates specific for 1gM and IgG subclasses without . Briefly, drying 5 μg / ml protein in PBS at 37 ° C overnight More microtiter plates were antigen coated. PBS, 5% chicken Serum, serum samples diluted in 0.5% Tween-20 were placed in wells for 1 hour at room temperature. Anti-human IgG Fc and IgG F (ab ')-cubated in the same diluent after incubation Biperoxidase or anti-human IgM Fc-horseradish peroxidase Incubated. ABTS substrate (Sigma, St. Louis, Missouri) after 1 hour at room temperature The enzyme activity was assessed by the addition of and read after 30 minutes at 415-490 nm.Involvement of human heavy chain in immune response in transgenic mice FIG. 43 represents the response of 3 littermate mice to immunization with KLH-DNP. First No. 296 mouse has unrearranged human IgM and IgG transgenes , Mouse Ig heavy chain disruption was followed by homozygosity. No. 1299 mouse is non-destructive The 1301 mouse has a transgene on the background, and both of these gene sets I didn't inherit it. Another littermate, mouse 1297, carries the human transgene. And was hemizygous for mouse heavy chain disruption. Experiment with it as a non-immunized control Incorporated into. The results show that human IgG and IgM responses are both conjugated to proteins. Prove that it happened to the hapten. Human IgM also develops against KLH However, there were no significant levels of human IgG present at this time. From the same mouse Titers of human antibodies against the same target antigen were not significant in pre-immune serum samples .Example 20 This example demonstrates the use of human antigens in the transgenic mice of the invention. Demonstrate the resulting immunization and immune response, and identify the variable regions of the human transgene. Demonstrate that non-random somatic mutations occur in the row.Of the antibody response comprising human immunoglobulin heavy chains to human glycoprotein antigens Proof The transgenic mice used in this experiment had functional circular (mouse) weights. By introducing a transgene at the J region that results in deletion of strand production (supra). Of the functionally disrupted mouse immunoglobulin heavy chain locus It was type-bondable. The transgenic mouse has at least one complete reconstitution. It also includes a non-sequenced human heavy chain minilocus transgene (HCl, supra), Transgene is a single functional V_HGene (V_H251), human μ constant region gene, And the human γ1 constant region gene. Human immunoglobulin trans Transgenic mice (above), which were shown to express To immunize with human antigens Have the potential to generate an immune response. HC-26 mice and HC Three mice of the l-57 strain (supra) were injected with human antigen. Incomplete 100 μg of purified human carcinoembryonic antigen (CEA) insolubilized on alum Injection in day 0 in whole Freund's adjuvant followed by additional 7, 14, 21 and 28 Weekly injection of alum-precipitated CEA in incomplete Freund's adjuvant on day one . Serum samples were collected by retro-orbital hemorrhage each day prior to CEA injection. Each group Equal volumes of sera from each of the 3 mice were pooled for analysis. Contains human μ chain bound to human CEA immobilized on microtiter plate Immunoglobulin and immunoglobulin containing human γ chain are measured by ELISA assay did. Human immunoglobulin containing μ chain and immunoglobulin containing human γ chain The results of the ELISA assay are shown in Figures 44 and 45, respectively. For both lines until the 7th day A significant human μ chain Ig antibody titer was detected, and an increase was observed up to about 21 days. Hi For gamma chain Ig, the significant antibody titer was delayed, with the former on the 14th day and later on the HCl-57 strain. The person was revealed on the 21st day with the HCl-26 strain. The antibody titer of human γ chain Ig was It continued to show an increase with time. The observed human μ chain Ig response reached a plateau And then with a rising γ-chain response, which occurs late, leads to affinity maturation. It is characteristic of the pattern observed with it. The analysis of the 21st day sample was performed using irrelevant It showed a loss of reactivity to the original blue mussel hemocyanin (KLH). this is Point out that the antibody response was specifically directed against CEA. These data are for unrearranged human immunoglobulin loci. The animals that are transgenic are (1) human antigens (eg, human glycoproteins, CEA) and (2) by the observed μ to γ class switch. Can receive an isotype switch (class switch) And (3) characterizing the affinity maturation in their humoral immune response Is shown. In general, these data show that (1) human Ig transgenic mice Having the ability to induce heterologous antibodies, (2) a single transgene heavy chain variable region Region has the ability to respond to restricted antigens, (3) primary and secondary response forms Response kinetics over a period typical for growth, (4) From IgM to 1gG, transgene Thus encoded class switch of humoral immune response, and (5) transgene Indicating that an animal has the ability to produce human sequence antibodies against human antigens. To pick.Evidence for somatic mutations in the human heavy chain transgene minilocus. Transgenic HCl-57 lines containing multiple copies of the HCl transgene Mice were bred to immunoglobulin heavy chain-deficient mice and contained the HCl transgene. And mice were obtained that contained a disruption in both alleles of the endogenous mouse heavy chain (supra). That These mice express human μ and γ1 heavy chains along with mouse κ and λ light chains ( (See above). Repeated intraperitoneal injection of one of these mice over a period of 1.5 months Was hyperimmunized against human carcinoembryonic antigen. This mouse was sacrificed and splenic Isolation of lymphoid cells from the viscera, groin and mesenteric lymph nodes, and Peyer's patches did. The cells were combined and total RNA was isolated. First strand cDNA is synthesized from the RNA , The following two oligonucleotide primers: Was used as a template for PCR amplification. Those primers specifically amplify the VH251 / γ1 cDNA sequence. Amplified layout The row was digested with XhoI and cloned into the vector pNNO3. 23 random crosses The DNA sequences of the inserts of the clones are shown in Figures 46-51; Pointed out, the dots indicate that the sequence is the same as in germ cells. VH251 Transji A comparison of the germline sequences of the clones with the cDNA sequences showed that 3 of the clones were completely Mutations, and the other 23 revealed somatic mutations. One of the three unmutated sequences is derived from out-of-frame VDJ ligation . Somatic mutations observed at specific locations were observed in human lymphocytes Occur with similar frequency and distribution pattern [cai et al. (1992)J. Exp . Med. 176:1073; which is incorporated herein by reference]. Somatic mutation Has an overall frequency of about 1%; however, the frequency within CDR1 extends to about 5%. Point out the choice of amino acid changes that affect antigen binding. This is the human heavy chain Demonstrate the antigen-directed affinity maturation of the sequence.Example 21 This example shows that upon recombination a complete human light chain minilocus transgene is formed. Successful transfection by co-introducing two separate polynucleotides that Prove the formation of suzene.Unrearranged light chain minilocus tiger by co-injection of two overlapping DNA fragments Making Genes 1.Non-sequenced functional Vκ gene segments vk65.3, vk65.5, vk65.8 and And vk65.15 isolated Oligo-65 (5'-agg ttc agt ggc agt g which is a Vκ-specific oligonucleotide gg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc -3 ') ー Black EMBL3 / SP6 / T7 (Clonetech Laborat-ories, Inc., Palo Alto, CA) The humanized placenta genomic DNA library was probed. Positive phage A DNA fragment containing the Vκ segment from the loan was ligated into a plasmid vector. It was cloned. The variable gene fragment from the resulting clone was sequenced and appeared to be functional. Selected clones. Criteria for determining functionality include: open reading frame, Complete splice acceptor and donor sequences, as well as complete recombinant sequences. This way Functional Vκ genes from four different plasmid clones isolated by The DNA sequences of the child segments (vk65.3, vk65.5, vk65.8 and vk65.15) are shown in FIGS. Shown in 5. Four plasmid clones p65.3f, p65.5gl, p65.8 and p65.15f) This will be explained below. (1 a) p65.3f The 3 kb XbaI fragment of phage clone λ65.3 was inserted at the Sal I site derived from the vector. The BamHI site derived from the vector located proximal to the 3'end of the insert fragment is 5'of the insert fragment. Subcloned into pUC19 proximal to the'end. 3k of this clone b The BamHI / Sal I insert was subcloned into pGP1f to give p65.3f. (1 b) p65.5gl The 6.8 kb EcoRI fragment of phage clone λ65.5 contains the vector-derived Xho I site The SalI site derived from the vector, which is proximal to the 5'end of the insert, is 3'of the insert. Subcloned into pGP1f proximal to the'-end. The obtained plasm The file was named p65.5gl. (1 c) p65.8 The 6.5 kb HindIII fragment of phage clone λ65.8 was cloned into pSP72 to create p6 Got 5.8. (1 d) p65.15f Subcloning the 10 kb EcoRI fragment of phage clone λ65.16 into pUC18 The plasmid p65.15.3 was created. Vκ gene segment in the plasmid insert Mapped to a small fragment of 4.6 kb EcoRI / HindIII, which was sub-divided into pGP1f. Cloned. The resulting clone, p65.15f, contains the 5'and 3'ends of the insert. A unique Xho I site and Sal I site are placed at each end. 2.pKV4 The Xho I / Sal I insert of p65.8 was cloned into the Xho I site of p65.15f for cloning. Smid pKV2 was created. Insert the Xho I / Sal I insert of p65.5gl into the Xho I site of pKV2. It cloned and pKV3 was produced. Insert the Xho I / Sal I insert of pKV3 into Xho I of p65.3f Plasmid pKV4 was created by cloning into the site. This plasmid has 4 Contains a single 21 kb Xho I / Sal I insert containing the functional Vκ gene segment of To do. Not I can be used to excise the entire insert. 3.pKC1B (3 a) pKcor Two XhoI fragments derived from human genomic DNA phage λ clone were used as plasmids. Subcloned into vector. The first fragment, 13 kb Jκ2-Jκ5 / Cκ-containing fragment was treated with Klenow enzyme and digested with HindIII and treated with Klenow Cloned into the prepared plasmid pGP1d. The 5'end of the insert is the vector A plasmid clone (pK-31) close to the Cla I site from which it was derived was selected. Second Xho I A 7.4 kb DNA fragment containing Jκ1 was added to the 3'insert Xho I site. Digested with Xho I / Sal I so that it is destroyed by ligation into the vector Sal I site. Cloned into pSP72. The resulting clone p36.2s contains the Cla I site derived from the insert fragment at 4.5 kb upstream of Jκ1, And a polylinker slightly downstream of the naturally occurring Xho I site between Jκ1 and Jκ2. -Derived ClaI site. Cla I digestion of this clone releases a 4.7 kb fragment At least in the correct 5 '→ 3'direction into Cla I digested pK-31. Cloned, total of 5 human Jκ segments, human intron enhancer , CK, and a plasmid containing 4.5 kb of 5'flanking sequence were prepared. This plus The mid pKcor is a unique flanking XhoI site on the 5'and 3'sides of the insert, respectively. And a Sal I site. (3 b) pKcorB A 4 kb BamHI fragment containing the human 3'kappa enhancer [Judde, J.G. And Max, E.E.,Mol. Cell Biol．12: 5206 (1992); which is incorporated herein by reference Inserted] into pGP1f so that the 5'end is proximal to the Xho I site of the vector. I've roasted. The resulting plasmid p24Bf was digested with Xho I and the pKcor 17.7 kb Xh The oI / SalI fragment was cloned into it in the same orientation as the enhancer fragment. The resulting plasmid, pKcorB, contains the unique 5'and 3'ends of the insert, respectively. It contains the Xho I and Sal I sites. (3 c) pKC1B The XhoI / SalI insert of pKcorB was cloned into the SalI site of p65.3f to make it light. The small chain locus transgene plasmid pKC1B was constructed. This plasmid 5 Jκ segments, human intron enhancer, human Cκ, and human 3 It contains a'κ enhancer. The entire 25 kb insert is isolated by NotI digestion be able to. Four.Co4 Two NotI inserts from plasmids pKV4 and pKC1B were used at a concentration of 2.5 μg / ml each. Mix in icloinjection buffer and as described in the above example. Co-injected into the pronucleus of half-day mouse embryos. 2 transgene animals generated The transgene insert (named Co4; the set shown in Figure 56) with the pieces integrated together. Replacement product). 3 kb of 3'of pKV4 insert and 5'of pKC1B insert 3 kb are exactly the same. Some integration phenomena occur with 2 breaks over the 3 kb consensus sequence. Indicates that homologous recombination has occurred between the pieces. Co4 is transgene It will direct the expression of a repertoire of human sequence light chains in Kumaus. The foregoing description of the preferred embodiments of the present invention is provided for purposes of illustration and description. . They are not intended to be exclusive and also limit the invention to the precise disclosures. I'm not going. Many modifications and variations are possible in light of the above teaching. All publications and patent applications mentioned herein are as if each publication or patent were filed. Was it pointed out that the patent application is expressly and individually incorporated by reference into this specification? Are incorporated herein by reference.Example 22 This example shows a human immunoglobulin chain encoded by the human Ig transgene. Of a mouse that secretes a monoclonal antibody that contains and is reactive with a specific immunogen Demonstrate successful production of hybridoma clones.Generation of Monoclonal Antibodies Incorporating Human Heavy Chain Transgene Product 1.Immunization of mice harboring the human heavy chain transgene Endogenous heavy chain gene (see Example 20 above)reference) Knockout (ie functional) Mice containing a human heavy chain homozygous for the transgene. , Immunized with purified human CEA, and then splenocytes after an appropriate immune response period Harvested Using conventional techniques (Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.,6: 511 -519 (1976);Harlow and Lane,Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988)reference) To generate hybridomas, mouse splenic Vesicles were fused with mouse myeloma cells. The mice used for immunization were single Functional V_HGene (V_H251), Human D and J segments, human μ constant region, and And the human non-rearranged heavy chain minilocus containing the human and γ1 constant region genes It included Lansgene. The transgenic line from which it was derived is HC1 It was designated -57 (supra). Purified human carcinoembryonic antigen (CEA) (Cyrstal Chromium insolubilized on alum em, Chicago, IL or Scripps Labs. San Diego, CA) 100 μg, complete flow Injected into int adjuvant on day 0, then on days 7, 14 Alum sedimented in incomplete Freund's adjuvant on days 21 and 28 CEA was infused once a week. An additional 20 μg of soluble CEA was given intravenously on day 83. And then on day 92, 50 μg of mi in incomplete Freund's adjuvant was administered. Alum-precipitated CEA was injected. Blood prior to fusion of myeloma cells and splenocytes A human heavy chain response to CEA was confirmed in clear samples. On day 95, euthanize the animals, remove the spleen, and use polyethylene glycol. P3X63-Ag8.653 mouse myeloma cells (ATCC CRL 1580, American Ty pe Culture Collection, Rockville, MD). 2 weeks later, ELISA Specifically reacts with CEA containing human heavy chain μ or γ constant region epitope Supernatants from fusion wells were screened for the presence of antibody. Simply say And human CEA purified on PVC microtiter plates at 25 μg / ml Coated with PBS, 0.5% Tween, 5% chicken. Incubated with culture supernatant diluted 1: 4 or 1: 5 in serum. The plate was washed, and then continued to show the specific IgG for human IgG Fc. Goat antiserum conjugated to radish peroxidase or human IgM Fc Rabbit antiserum specific for 5Mu (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) Was added. After further washing, the captured antibody is added by the addition of the ABTS substrate. The presence of bound conjugate was confirmed. Two independent fusion wells for CEA It was found to contain an antibody having a substantial binding force. After cloning, Hybridization of both human mu and murine kappa chains was detected by ELISA. It turned out that the horse was positive. Any mouse IgG using a similar assay Neither IgM was detected. Subcloning of two independent parent hybridomas resulted in 92-09A- 4F7-A5-2 and 92-09A-1D7-1-7-1. I got a loan. Both strains are ATCC patent cultivated under the Budapest Treaty. Deposited at the depository and received ATCC designations HB11307 and HB11308, respectively. I did. For culture supernatants from these cell lines, several ELISAs were used to By testing for reactivity against the purified target protein, The opposite sex was evaluated. As shown in FIG. 57, monoclones against various antigens An ELISA assay for determining the reactivity of local antibodies is based on CEA and CEA. It was demonstrated that only the continuous antigen NCA-2 showed significant reactivity, which was heterozygous. Limited development of reactivity for variable regions of hybrid immunoglobulin molecules It represents.Example 23 This example shows a rearrangement encoded by the human Ig mini locus transgene. Cloned human VDJ gene to encode a chimeric human / mouse Ig chain. By the lance switch mechanism, a copy containing an endogenous Ig constant region gene It proves that it can be transcribed.Identification of a trans-switch transcript encoding a chimeric human-mouse heavy chain Hyperimmunized HC1 strain 5 homozygous for endogenous heavy chain J segment deletion RNA was isolated from 7 transgenic mice (supra). For reference in this book Included in Taylor et al. (1993)Nucleic ACids Res. 20: Follow 6287 CDNA was synthesized and amplified by PCR using the following two primers: Oligonucleotide o-149 is a variable gene segment encoded by HC1. To V_H251O-249, on the other hand, o-249 was found in mice and mice in the following specificity order. Hybridize to both human and human gamma sequences: Mouse γ1 = mouse γ2b = mouse γ3> mouse γ2a >> human γ1 DNA sequences from 10 randomly selected clones generated from PCR products The columns were determined and these are shown in FIG. Two clones are human VDJ and mouse contained γ1; four clones contained human VDJ and mouse γ2b . Also, four clones contained human VDJ and mouse γ3. These results are Transgene-encoded human in a fraction of transgenic B cells VDJ is located within the endogenous mouse heavy chain locus by class switching or similar recombination It has been changed to.Example 24 This example shows a clone from a human Ig chain-encoding and expressing chimeric human / mouse Hybridoma pool scree for discriminating clones encoding Ig chains Describe the training method. For example, an endogenous heavy chain locus interrupted at the J region Transgenic for a human Ig heavy chain transgene homozygous for Transswitch in a pool of hybridoma clones made from mice And a hybridoma clone encoding a human VDJ-mouse constant region heavy chain , A human VDJ-human constant region heavy chain-expressing hybridoma clone It is possible to separate.Screening hybridomas for removal of chimeric Ig chains The screening process can be performed alone or in any combination. The following two steps are involved: (1) Preliminary ELISA-based screen And (2) Secondary molecular characterization of hybridoma candidates. Preferably human VDJ Regions and human constant regions are used for initial identification of hybridoma candidates. A screen based on a standard ELISA is used. (Eg used to elicit an antibody response in transgenic mice Hybridomas showing positive reactivity with antigens (such as immunogens) Panel of monoclonal antibody specifically reacting with γ, κ and λ and human μ, γ and κ It was tested using Positive for human heavy and light chains and for mouse chains Hybridomas that are negative and negative for the hive expressing human immunoglobulin chains Identified as a candidate for redoma. Thus, a hybridoma candidate is a candidate for a particular antigen. Reacts with and is found to have an epitope that is characteristic of the human constant region . Isolate RNA from hybridoma candidates and synthesize first strand cDNA Used to do. The cDNA of this first strand is then (single strand DNA Ligation) RNA ligase is used to create a unique single-stranded oligo of a predetermined sequence. Connect to nucleotides. The ligated cDNA is then combined with two sets of oligonucleotides. Amplify in two reactions by PCR using the deprimer. Set H ( Heavy chain) is assigned to either human μ or human γ1 (depending on the results of the ELISA). Includes oligos that anneal differentially and oligos that anneal to the oligo-X sequence. Mu. Thus, Mau, which may be translocated into the human mini-locus, Bias against detection of special V-segments, including . The second set of primers, set L (light chain), specifically anneals to human kappa. And oligos that specifically anneal to oligo-X. PCR product Based on sequence comparisons against human and mouse Ig sequences To determine if the hybridoma is producing the only human antibody, Determine some DNA sequences.Work line 25 This example shows the generation of transgenic mice harboring the human light chain (κ) minilocus. Demonstrate life.Human κ mini-locus transgenic mouse KC1 (Hybridization for κ-specific oligonucleotides as described above Phage clone isolated from a human genomic DNA phage library by The 13 Kb XhoI Jκ2-Kκ-containing fragment from Klenow And Klenow-treated Hind of pGP1d to produce pK-31 It was cloned into the III site. This destroys the insert XhoI site. And the only polylinker-derived XhoI site was located at the 5 ′ end next to κ2. It was placed. The only polylinker-derived ClaI site is the XhoI site Located between the and the inset sequence, while the only polylinker-derived Sal Position the I site at the 3'end of the insert. Similarly, a 7.5 kb XhoI fragment containing Jκ1 and upstream sequences (see above) By hybridization to κ-specific oligonucleotides such as Human genomic DN (isolated from a genomic DNA phage library) Separated from the A phage clone. This 7.5 kb XhoI fragment is pS Clone into the SalI site of P72 (Promega, Madison, Wisconsin) , Thus destroying both XhoI sites and adding the polylinker ClaI to the 3'of Jκ1. The site was located. Digestion of the resulting clone with ClaI resulted in A 4.5 kb flow sequence and a 4.7 kb fragment containing Jκ1 were released. This 4.7 kb fragment was cloned into the ClaI site of pK-31. Let's create pKcor. The remaining unique 5'XhoI site was Derive from the line. Unrearranged human VκIII gene segment 65.8 ( 6.5 kb XhoI / SalID containing plasmid p65.8, Example 21) The NA fragment was cloned into the XhoI site of pKcor and used as a plasmid pKC1 was generated. The NotI insert of pKC1 was added to the mouse embryo on day 1/2. Transgenic mice were generated by microinjection in pups. Two independent pKs Established a C1-induced transgenic line to identify the heavy and light chain minilocus Both were used to breed mice. These lines KC1-673 and K C1-674 is a Transcription based on Southern Blot Hybridization. Estimated to include integration of approximately 1 and 10-20 copies of gene It wasKC1e A 2.3 kb cDNA containing both mouse and human heavy chain J-μ intron enhancers. Plasmids pM using BamHI and HindIII to excise inserts. HE1 (Examples 13 and 18) was digested. Klenow this fragment , SalI Linker (NeW Bngland Biolabs, Beverly, Massachusetts) Cloned into the unique 3'SalI site of pKC1 Generated pKC1e. pKC1e NotI insert on day 1/2 mouse Transgenic mice were generated by microinjection into the fetus. 4 independent pKs Established a C1e-induced transgenic line, heavy and light chain minilocus Both were used to breed mice. These strains KC1e-139 9, KC1e-1403, KC1e-1527 and KC1e-1536 are About 20 ~ Estimated to include the incorporation of 50, 5-10, 1-5 and 3-5 copies It waspKC2 Unrearranged human VκIII gene segment 65.5 (plasmid p6 6.8 kb XhoI / SalI DNA flag containing 5.5 gl, Example 21) Ment was cloned into the unique 5'XhoI site of pKC1 to obtain plasmid p KC2 was generated. This minilocus transgene has two distinct functional V Contains the kappa III gene segment. No pKC2 in mouse fetus on day 1/2 The tI insert was microinjected to generate transgenic mice. Five Germans Established pKC2-induced transgenic lines and established heavy and light chain mini It was used to breed mice containing both loci. These strains KC2-1 573, KC2-1579, KC2-1588, KC2-1608 and KC2- 1610 was transcribed by Southern blot hybridization. Of about 1-5, 10-50, 1-5, 50-100 and 5-20 copies of the gene Estimated to include embedded.Example 26 In this example, transgenic mice carrying the human kappa transgene To generate an antigen-induced antibody response that forms an antibody containing a competent human kappa chain It shows that you can do it.Antibody response associated with human Igκ light chain Transgene containing HC1-57 human heavy chain and KC1e human kappa transgene Nick mice were immunized with purified human soluble CD4 (human glycoprotein antigen It was Contact with polystyrene Radex particles (Polysciences, Warrington, PA) Purified human CD4 (in NEN Research) insolubilized by conjugation Product, Westwood, MA) 20 μg, dimethyldioctadecylammonium bromide on day 0 Intraperitoneal injection in saline with Ni (Cal bio chem, San Oiego, CA) Further injections were given at 20 and 34 days after. Posterior orbital hemorrhage was taken on the 25th and 40th days, and human IgM or Screened for the presence of antibodies to CD4 containing human IgG heavy chain . Briefly, purified on a PVC microtiter plate at 2.5 μg / ml Coated human CD4, PBS, 0.5% Tween-20, 5% Incubate with culture supernatant diluted 1: 4/1: 5 in chicken serum Let The plate was washed and then horseradish specific for human IgG Fc Species specific to goat antiserum conjugated to shish peroxidase or human IgM Fc5Mu Heterogeneous rabbit antiserum (Jackson Immuno Research, Westr Grove, PA) was added . After further washing by the addition of ABTS substrate, the bound antibody bound to the captured antibody was We identified the existence of coalescence. In both bleeds, human μ was tested for reactivity with the antigen. However, γ reactivity was basically undetectable. On day 40, goat anti-human κ Antigen reaction using the same assay with luoxidase conjugate (Sigma, St. Louis, MO) Samples were also tested for sexing human kappa chains. Kappa reactivity to bind CD4 at this point Was detected. The results of the assay are shown in Figure 59.Example 27 This example is a functionally disrupted mouse heavy and light chain locus (heavy and kappa chain Locus) homozygous for functional human heavy chain and functional human light chain And a human light chain transgene that can be productively rearranged to encode It shows the successful generation of mice harboring the heavy chain transgene in parallel. This Una mice are called "0011" mice, where the first two digits of the two zeros are Demonstrating the lack of functional heavy and light chain loci in this mouse, One of the two digits shows that this mouse is a human heavy chain transgene and a human light chain transgene. It means that it is a semi-junction. This example shows such a 0011 mouse Has the ability to generate a specific antibody response against a predetermined antigen, and It has been shown that an isotype switch may be involved in such an antibody response.0011/0012 mouse: endogenous Ig knockout + human Ig transgene Human HC1 Tran, such as the HC1-26 transgenic mouse strain described above. Functional J_HFunctionally disrupted endogenous heavy chain inheritance lacking regions Mice homozygous for the locus (called JHD ++ or JH △ ++) A functional J_HFunctionally disrupted endogenous kappa chain locus lacking a region This is called JKD ++ or JK △ ++, see Fig. 9), followed by the same type of mating HC1 transgene called JHD ++ / JKD ++ after inbred with Us Functionally disrupted heavy and kappa chain loci containing Out) homozygous mice were produced. Such mice were produced by inbreeding to obtain genomic DNA of Southern block. Selection was based on genotype as assessed by G. HC1-26 + / J These mice, called KD ++ / JHD ++ mice, were transformed with the human kappa chain tran. Mice harboring Sgene (strains KC2-1610, KC1e-1399 and KC1 e-1527; see Example 25) and functionally disrupted heavy chain and Homozygous for the light chain locus and the HC1 transgene and KC2 or K Genomes were used to identify offspring mice that were hemizygous for the C1e transgene. Southern blot analysis of DNA was used. Such mice are designated by a number and refer to their genotype using the following abbreviations: Was identified as follows: HC1-26 + is a human heavy chain mini-family of the HC1-26 strain. JHD ++ represents J, a semi-junction for transgene integration._Hknock Represents homozygous for out; JKD ++ is homozygous for Jκ knockout Represents conjugation; KC2-1610 + is similar to strain KC2-1610 Represents the hemizygosity for the KC2 human kappa transgene integrated into Kc1e; -1527+ is KC1 integrated in the same way as for strain KC1e-1527. e represents the hemizygous for the human kappa transgene; KC1e-1399 + KC1e human kappa trans integrated as in the case of strain KC1e-1399 Represents a semi-junction about Gene. The resulting individual offspring are each designated numerically (eg 6295). , 6907 etc. ) Is given to each J_HKnockout allele, Jκ knock Out allele, HC1-26 transgene and kappa transgene (KC2 Or KC1e) for the presence of hemizygous (+) or It was determined to be either homozygous (++). Table 10 shows the progeny mouse Some number designations, genders and genotypes are indicated. We removed spleens from 6 week old female mice. Southern blot hive Mouse # 7655 showed that HC1 (strain 26) and KC2 (Strain 1610) Hemizygous for transgene uptake, mouse μ and κ Homozygous for JHΔ and JκΔ targeted deletions in the J region Was identified. Mouse # 7656 is Southern blot hybridized Show that KC2 (strain 1610) transgene integration is The same for JHΔ and JκΔ targeted deletions in the us μ and κJ regions. It was determined that it was a mold joint. Mouse # 7777 is a Southern blot hive JHΔ and JκΔ targeting of mouse μ and κJ regions by redidation Was determined to be hemizygous for the deleted deletion. These deletions are recessive Therefore, this mouse should be phenotypically wild type.[0011] Expression of endogenous Ig chains in mice (1) Wild-type mouse (7777), (2) Heavy chain and kappa knockout conflict The 0001 gene harboring the human light chain transgene (7656) homozygously for the gene Human and homozygous for the (3) heavy chain and kappa knockout alleles 0011 containing a light chain transgene and a human heavy chain transgene (7655) To select lymphocytes explanted from the mouse, human μ, mouse μ, human κ, mouse FACS analysis using a panel of antibodies reactive with either mouse κ or mouse λ It was used. We are Mishell and Shiigi (Mishell, B.B. & Shiigi.S.M. (Eds)Cell immunity Selected methods in science . W.H.Freeman & Co., New York, 1980) Prepare single cell suspensions from spleens as described and_FourLyse red blood cells with Cl Let Stain lymphocytes with the following reagents: propidium iodide (molecular probe , Eugene, OR), FITC-conjugated anti-human IgM (clone G20-127; Pharmingen, San Diego, CA), FITC-conjugated anti-mouse IgM (claw) R6-60.2; Pharmingen, San Diego, CA), phycoerythrin-conjugated Anti-human Igκ (clone HP6062; Cal Tag, South San Francisco , CA), FITC-conjugated anti-mouse Igλ (clone R26-46; Pharming En, San Diego, CA), FITC-conjugated anti-mouse B220 (clone RA 3-6B2; Pharmingen, San Diego, CA), and Cy-chromoconjugated anti-antibody. Mouse B220 (clone RA3-6B2: Pharmingen, San Diego, CA). We use a FACScan flow cytometer and LYSIS II software (Bect cells were analyzed using on Dickinson, San Jose, CA). Gating on macrophage and residual red blood cells, forward and side scatter Eliminate by. Dead cells gate out propidium iodide-positive cells Eliminate by The flow cytometry data in Figures 60 and 61 are Confirmed Zanblot hybridization data and confirmed that mouse # 7655 is human It expresses both μ and human κ, and relatively few if any mouse μ or mouse It has been demonstrated to express Sκ. Nevertheless, a significant fraction of B cells (about 70- 80%) emit hybrid Ig receptors composed of human heavy chain and mouse λ light chain. It seems to appear. FIG. 60 shows the relative distribution of B cells expressing human μ or mouse μ on the cell surface. Shown: 0011 mouse (7655) lymphocytes are positive for human μ, but relative Deficient in mouse mu; 0001 mouse (7656) lymphocytes Does not express human μ or mouse μ; wild-type mouse (7777) lymphocytes are mice expresses μ but lacks human μ. Figure 61 shows the relative distribution of B cells expressing human kappa or mouse kappa on the cell surface. Shown; 0011 mouse (7655) lymphocytes are positive for human kappa Lack of paired mouse κ; 0001 mouse (7656) lymphocytes Does not express mouse κ or mouse κ; wild-type mouse (7777) lymphocytes are mouse κ But lacks human kappa. FIG. 62 shows the relative distribution of B cells expressing mouse λ on the cell surface; 00 11 mouse (7655) lymphocytes are positive for mouse λ; 0001 mau (7656) lymphocytes do not express significant mouse λ; wild type mice (77 77) Lymphocytes express mouse λ, but are comparable to 0011 mice (7655) It is at a relatively low level. FIG. 63 shows that endogenous maternal relative to human kappa (transgene-encoded). The relative distribution of B cells positive for us λ is shown. The upper left image shows functional intrinsic Wild with heavy and light chain alleles and lacking human transgene (s) Results of cells from type 2 mice are shown; cells are positive for mouse lambda. right The image above has a K knockout background (JKD ++) and KC1e- From a mouse (# 5822) harboring the integration of human κ transgene of 1399 strain Cells are shown for human κ or mouse λ in roughly proportional amounts. It is sex. The lower left plate has a κ knockout background (JKD ++) and KC2- From a mouse harboring the 1610 strain of human kappa transgene integration (# 7132) Show cells: more cells are positive for mouse λ than for human κ , KC2-1610 transgene integrated into KC1e-1399 transgene It may indicate that it is not as efficient as embedded. The lower right plate is , A functional endogenous mouse κ harboring the human κ minilocus transgene (KCo4) Cells from mice lacking alleles are shown. The data shown in FIG. 63 also show phenotypic variability between transgenes. Has also demonstrated. Such variability results from the integrated transgene. One or more phenotypic features (eg isotype switch, high level expression) Transgene and / or a low mouse Ig background) and / or That it is desirable to select for transgenic lines. It represents. Generally, (1) transgene, (2) transgene integration Multiple individual transgenes that differ by site and / or (3) genetic background To form a single strain, separate single or multiple transgene species (eg, pKC1e, pKC2, KCo4) are used. Inspect individual transgenic lines for desirable parameters such as: Yes: (1) Ability to enhance immune response to a predetermined antigen, (2) Tran Frequency and / or within isotype switches within the constant region encoded by the gene The frequency of transswitches to the causative (eg mouse) Ig constant region genes, ( 3) the expression level of the immunoglobulin chain encoded by the transgene and the antibody, ( 4) Expression levels of endogenous (eg mouse) immunoglobulins, immunoglobulin sequences , And (5) frequency of productive VDJ and VJ rearrangements. As standard, Transgene Trans produces maximal concentrations of (eg, human) immunoglobulin chains encoded by A transgenic line is selected: Preferably, the selected line is a transgenic strain. Of at least about 40 μg / ml transgene-encoded in serum of the Chains (eg human μ or human γ) and / or at least about 100 μg / ml of tran It produces a sugene-encoded light chain (eg, human kappa). Immunization of mice with unimmunized serum and specific antigen, human CD4 For the expression of human and mouse immunoglobulin chains in serum after conjugation, mice were Inspected. Figure 64 shows 0 unimmunized four separate genotypes 0 011 human μ, human γ, mouse μ, mouse γ, human present in serum of mouse shows relative expression of kappa, mouse kappa and mouse lambda chains (nt = untested); Human κ predominates as the most abundant light chain, with human μ and mouse γ (putatively The product of N. suitte) is the most abundant heavy chain, but there is variability between strains. Which minimizes mouse chain expression while allowing human chain expression. It demonstrates the utility of the selection step to identify advantageous genotype combinations. Mau # 6907 and 7088 are isotype switches from human μ to human γ (to This shows the cis switch in Lancegene. FIG. 65 shows human μ (huμ), human in mice of various 0011 genotypes. γ (huγ), human κ (huκ), mouse μ (msμ), mouse γ (msγ), Serum immunoglobulin chains for mouse κ (msκ) and mouse λ (msλ) Shows the level.0011 Specific antibody response in mice 0011 mice (# 6295) were immunized at an immunogenic dose according to the following immunization regimen. Immunized with CD4: 100 μl of CD4 mouse immune serum on day 0 Internal injection; 1st, 20 μg human C on latex lysate with DDA in 100 μl Inject D4 (American Bio-Tech); Day 15, with DDA in 100 μl Inject 20 μg human CD4 (American Bio-Tech) on latex lymphocytes; On day 29, 20 μg human CDA on latex lysate with DDA in 100 μl (American Bio-Tech); day 43, latte with DDA in 100 μl Inject 20 μg of human CD4 (American Bio-Tech) on X.x lymphocytes. Figure 67 demonstrates the presence of human mu, human kappa and human gamma chains in the anti-CD4 response. 3 shows the relative antibody response to CD4 immunization at 3 and 7 weeks. Human γ The chains were present in serum at week 7 with a significantly increased abundance, and in wild-type animals Cys within the heavy chain transgene with a temporal relationship similar to that of isotype switches. -Indicates that a switch (isotype switch) has occurred. Figure 68 shows a schematic assemblage of various human heavy and light chain transgenes. YouExample 28 This example provides a targeted knockout of the mouse lambda light chain locus To do.Targeted inactivation of the mouse lambda light chain locus Unlike the Ig heavy and kappa light chain loci, the mouse VλJλ and Cλ genes The segments are organized into three groups arranged in a 5 '→ 3' array. No, it is scattered instead. The most 5'part is two V segment (Vλ2 and VλX), and after these two segments, Continuing in the 3'direction, each unique J segment (Jλ2Cλ2 and pseudogene Jλ4 Two constant region exons associated with Cλ4) follow. Next comes It is the most widely used V segment (Vλ1), and is followed by a constant. A second cluster of constant region exons (Jλ3Cλ3 and Jλ1Cλ1) follows There is. Overall, the locus spans about 200 kb, between the two clusters. The spacing is ~ 20-90 Kb. Rearrangement of Vλ2 or VλX to Jλ2 predominantly for expression of the lambda locus And only rarely is there a further 3'rearrangement to Jλ3 or Jλ1. Vλ 1 is capable of recombination with both Jλ3 and Jλ1. Thus locus recombination And it is possible to mutate the lambda locus in order to completely eliminate expression. is there. The distance between the two lambda gene clusters is the mouse Ig heavy chain and the kappa light chain. Single dense targeting, as used to inactivate loci It makes it difficult to inactivate the expression of the locus through the generation of the deleted deletion. Instead The small single deletion that would delete the expressed lambda light chain is Jλ2Cλ2? To Jλ1Cλ1 spanning about 120 kb (Fig. 69). Thus All of the lambda constant region exons as well as the Vλ1 gene segment were deleted The deactivation of the gemini is secured. The deleted 120 kb was placed with the marker gene neo selectable within the PGK expression cut. Substitutional targeting vector (Thomas and Capecehi (1987)Before In the publication ) Is built. This marker provides homology to the lambda locus Embedded in a genomic lambda sequence that flanks the deletion to Similarly, to allow enrichment for cells that have homologously integrated the vector, It is also possible to include the HSV-tk gene at one end of the homologous region. Targeting Use of isogenic targeting vector for chromosomal DNA Has been reported to enhance the efficiency of homologous recombination, suggesting that the lambda locus Genomic clone sequence is isogenic with the targeted ES strain Obtained by screening a system 129 / Sv genomic phage library of Be done. Targeting vectors that differ in length of homology to the lambda locus Be built. The first vector (Vector 1 in FIG. 70) has a total length of about 8-12 kb. It contains a marker gene flanked by lambda locus sequences. Replacement vector This is the case for targeting events that mediate the addition or detection of several kb of DNA. Has been demonstrated to be more than sufficiently homologous (Hasty et al. (1991) ),In the above publication; Thomas et al. (1992)In the above publication). Flanking lambda array A vector with an additional 40-60 kb is also constructed (vector 2 in Figure 70). At least 80 Kb of human Ig mini locus has been routinely cloned and Propagated in the mid vector pGP1 (Taylor et al. (1993)In the above publication) An alternative approach for inactivation of the lambda locus is within the same ES cell. And, for example, mutations in two constant region clusters or two V region loci Two independent mutations are utilized. Both constant regions are contained within ~ 6 kb of the DNA, whereas the V locus Since one of them spans ~ 19 kb, the targeting vector is Jλ2 Independent deletion of the Cλ2 / Jλ4Cλ4 and Jλ3Cλ3 / Jλ1Cλ1 loci Is built to do. As shown in Figure 70, each vector With a total of ~ 8-12 Kb of lambda locus genomic DNA flanking the loss A boxed, selectable marker on the circle of PGK expression cassettes (eg neo or Consists of pac). To enrich for homologous recombination events with positive-negative selection It is possible to add the HSV-tk gene to the targeting vector. is there. So that clones are generated that support the deletion of one of the constant region genes, ES cells are targeted sequentially with the two vectors. Then these Sequencing of the constant region loci by targeting the loan sequentially with the two vectors Ensure that clones supporting one deletion are generated and then these clones Target to generate deletions in the remaining functional constant region clusters . Whether both targeting events are thus directed to the same cell From It is preferable to use different selectable markers for the two targeting Good). In the schematic example shown in Figure 70, one of the vectors contains the neo gene and the other contains pac (puromycin N-acetyl trans Ferrase) gene. A third potentially dominant selectable marker is hyg (hygromycin phosphine). Transtransferase) gene. The pac and hyg genes are both Ig To target the neo locus into the heavy and kappa light chain loci It can be inserted into a successfully used PGK expression construct. Two lambda constant domains Since the clusters are closely linked, the two mutations are on the same chromosome. It is important to be on top. Preferably by two independent targeting events There is a 50% chance of mutating the same allele, and the mutation chain is double During breeding (mating) of chimeras derived from ES cells targeted to Established by simultaneous separation.Example 28 This example provides a targeted knockout of the mouse heavy chain locus. ItTargeted inactivation of the mouse heavy chain locus Inheritance of mouse heavy chain locus constant region by gene targeting in ES cells In order to delete at least one and preferably substantially all of the offspring, FIG. Use a homologous recombination gene targeting transgene with the indicated structure . Figure 91 shows a general overview of the targeting transgene. segment (A) is upstream of the constant region gene (s) to be deleted (ie J_H Cloned genomic DNA sequence (close to the gene); (B) contains a positive selectable marker such as pgk-neo; segment (c ) Is downstream of the constant region gene (s) to be deleted (ie, the constant region gene) (Single) and J_HCloned genomic DN (distal to gene) Segment (d), which is the A sequence; and is optional, is the negative selectable marker gene Child (eg HSV-tk). FIG. 71 showsImmunoglobulin gene", Honj o T. Taken from Alt, FW and Rabbits TH (eds) Academic Press, NY (1989) p129. A map of the mouse heavy chain locus is shown. The targeting transgene has a structure according to FIG. 91, where (1) The segment (a) is the 11.5 kb insert of clone JH8.1 (Chen eta). l. (1993)Int, Immunol. Five: 647) or at least upstream of the mouse Cμ gene Both are equivalent parts containing a sequence of about 1 to 4 kb, and the (2) and (b) segments are as described above. Pgk-neo as shown in (3) and (c) segment is 5'-gtg ttg. cgt gta tca gct gaa acc tag aaa cag ggt gac cag-3 ' A mouse genomic clone library with end-labeled oligonucleotides Phage clone of mouse Cα gene isolated by screening The 4-6 kb insert isolated from or the 1674 bp sequence shown in FIG. And the (4) (d) segment contains the HSV-tk expression cassette described above. I'm out. Alternatively, the first targeting may be homology or constant region genes (single Compound), a first-type positive selection marker gene (pgk-neo) and HSV-tk negative Segments (a) and (c) homologous to the sequence flanking the selection marker of A stepwise deletion of the containing heavy chain constant region gene (s) is performed. Scratch Then, in (a), the pigment is at least about 1 homologous to the region upstream of Cγ3. It can contain a 4 kb sequence and the (c) segment is located in the region upstream of Cγ2a. It may include at least about 1-4 kb of sequence homologous to it. This targeting transgene is Cγ3, Cγ1, Cγ2b and Cγ2a. Delete the gene. This first targeting transgene is in ES cells Introduced and properly targeted recombinants are selected (eg with G418 ), Produces a properly targeted C region deletion. Next, HSV-tk cassette Negative choices are made for loss of credit (eg, ganciclovir or Is FIAU). The resulting properly targeted C deficiency of FIG. The non-recombinant is a heavy chain gene lacking the Cγ3, Cγ1, Cγ2b and Cγ2a genes. Have a constellation. The second targeting transgene is a homology region, that is, a constant region gene. Offspring (s), a positive selectable marker gene of the second species different from the first species (eg gpt or Is homologous to the sequence flanking the pae) and HSV-tk negative selectable markers. It includes segments (a) and (c). Thus, the (a) segment is C may contain at least about 1-4 kb of sequence homologous to the region upstream of ε , (C) segment is homologous to a region upstream of Cα and has at least about 1 to 4 kb It can include an array. This targeting transgene is Cε and Cα Delete the gene. This second targeting transgene is derived from the first targeting event. Introduced into the properly targeted C-region recombinant ES cells obtained It Properly targeted for the second knockout event (ie (By homologous recombination with a second targeting transgene) cells of the second type Positive selectable marker gene-specific selection agents (eg Mycophenolic acid for; puromycin for selecting for pac) Selected using. Then a negative selection for the loss of the HSV-tk cassette Performed (eg, using ganciclovir or FIAU). As a result These properly targeted second round C region recombinants obtained by Heavy chain inheritance lacking Cγ3, Cγ1, Cγ2b, Cγ2a, Cε and Cα genes Have a constellation. Properly targeted first or second lacking one or more C region genes Used a second round of recombinant ES cells for blastocyst injection as described above, Produces chimeric mice. Germline transmission of targeted heavy chain alleles Seeding was established, and the resulting founder mice were bred (crossed) to the C region. Generate mice homozygous for the region knockout. Such C region knock Out Mouse is J_HIt has several advantages over knock-awato mice:- By way of example, C region knockout mice show that human heavy chain transgene and endogenous The ability to undergo a transswitch between the heavy chain locus constant regions is diminished (or Completely lack this ability), and thus the key in transgenic mice. It has a reduced frequency of melahit / mouse heavy chains. μ and delta are frequently homologous as well Although deleted by targeting, the mouse gamma gene knockout Quout is preferred. Together with other targeted lesions within the endogenous mouse heavy chain locus , C region knockouts are possible: mouse heavy chain loci, among others To eliminate the productive VDJ rearrangement of Escherichia coli and human heavy chain transgene and mouse heavy chain To eliminate or reduce transswitches between loci, J_Hknock out It is possible to combine the and C region deletions. For some embodiments, Specific absence of one or more C region genes at the endogenous heavy chain locus To generate mice carrying several other C region genes There is a possibility that For example, chimeric human / mouse IgA confers an advantageous phenotype This IgA trans-sweat is substantially free of interference with the desired usefulness of the mouse. It may be preferable to retain the mouse Cα gene to allow production by the mouse. There is a potential.Example 29 This example is obtained from a transgenic mouse that harbors the human transgene. Of lymphocytes expressing endogenous (mouse) immunoglobulin from a lymphocyte sampleHalf-bi Bo Demonstrate exhaustion. Lymphocytes expressing mouse Ig are transgene (s) Antibodies lacking substantial binding to human immunoglobulins encoded by It is selectively depleted by specific binding to mouse immunoglobulin antibodies.Ex vivo depletion of mouse Ig-expressing B cells Human heavy chain mini-locus transgene (HC2) and human light chain mini-locus Mice homozygous for Lancegene (KCo4) were C57BL / 6 (B6) 2211 mice (ie, functionally endogenous) were bred (crossed) with inbred mice. Homozygous for the mouse heavy chain locus and for the functional endogenous mouse light chain locus A homozygous and one copy of the human heavy chain transgene and the human light chain transgene Mice with one copy of the clone). Such 2211 mice are also B It also expresses 6 major and minor major histocompatibility antigens. These mice were given an immunogenic dose The antigen is used for priming and splenocytes are separated after about 1 week. Standard method (Wyso cki et al. (1978)Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)75; 28 44; MACS Magnetic Cell Sorting, Miltenyi Biotec Inc, Sunnyvale, CA) Ligated antibody-dependent cell separation followed by residual residual cells positive for mouse Ig. Antibody-dependent complement-mediated cytolysis ("For cell immunology Selected method to kick ”, Mishell BB and Shiigi SM (eds), W.H. Freeman and C Ompany, New York, 1980, p211-212) B positive for mouse Ig. Remove cells. The remaining cells in the depleted sample (eg positive for human Ig) B-cells, T-cells), preferably anti-mouse against the developing B-cells Inject SCID / B6 or RAG / B6 mice intravenously with Ig antibody . The reconstituted mouse is then further immunized against the antigen and the hybridoma Obtain antibodies and affinity matured cells to produce the loan.Example 30 Production of fully human antibodies within somatic cell chimeras Methods for producing fully human antibodies in somatic chimeric mice are described . These mice have human immunoglobulin (Ig) heavy and light chain transgenes. And lacking functional mouse Ig heavy chain and kappa light chain genes. Transfecting blastocysts into blastocysts from RAG-1 or RAG-2 deficient mice Therefore, it is generated. RAG-1 and RAG-2 deficient mice (Mombaerts et al. (1992)Cell 68: 869; Shinkai et al. (1992)Cell 68: 855), VDJ relocation started and Ig Assembling the gene segment encoding s and the T cell receptor (TCR) Mouse B and T cells are missing. For the production of B and T cells This deficiency is due to the fact that wild-type ES cells in blastocysts derived from RAG-2 deficient animals are expressed. It can be complemented by the injection of vesicles. The resulting chimeric mice were injected Produces mature B and T cells that are fully derived from ES cells (Chen et al ( 1993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90: 4528). In all of the chimeric B and / or T cells, the defined mutation and / or exogenous D Genetic engineering of the infused ES cells is used to introduce the NA construct. Ch en et al. (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90: 4528-4532) Chimera that makes T cells in the absence of B cells when injected into RAG blastocysts Produced ES cells with homozygous inactivation of the Ig heavy chain locus Unclear sentence). Transfection of relocated mouse heavy chain into mutant ES cells As a result, B cell development is rescued and both B and T cells within the chimera Will be played. Fully human antibody expression without mouse Ig heavy chain or kappa light chain synthesis It is possible to generate a chimeric mouse. Mouse Ig heavy chain and kappa light chain Among ES cells that are homozygous for both gene inactivation, human Ig heavy chain and light Introduce a chain construct. At this time, ES cells were derived from RAG2-deficient mice Inject into blastocyst. The resulting chimera contains mouse Ig heavy chain and caps. The human Ig gene can be expressed but not the pa light chain gene. B cells that are exclusively derived from the derived ES cells.Inactivation of immunoglobulin heavy chain and kappa light chain genes in homozygous ES cells Generate Each followed known procedures (Chen et al (1993)EMBO J.12: 821; and Che n et al. (1993)Int.Immunol. In the above publication), IgJ in ES cells_HAnd Jκ / Ig heavy chain and kappa inactivated by targeted deletion of the Cκ sequence Mice bearing the light chain locus were generated. Combine two mutant strains of mice And propagated to generate homozygous lines for inactivation of both Ig loci. This double mutant system was used for the induction of ES cells. Used pro Tocol was basically described by Robertson (1987, " Teratocarcinoma and embryonic stem cells; one practical approach ”. p71-112. Edited by E.J. Robertson, IRL Press). Simply put, 2 of similar joints Blastocysts were generated by spontaneous mating of heavy mutant mice. Pregnant pregnant female On day 2.5, ovariectomy, and on day 7 of gestation, wash out any "delayed" blastocysts from the uterus. , Cultured on feeder cells to help maintain their undifferentiated state. Identified by its form Stem cells from the inner cell mass of blastocysts that can be generated It was passed on. Cells with normal karyotype were identified, and the male cell line generated chimeras. It will be tested for its ability to contribute to the germ cells of Uss. Male chimera Can produce far more offspring, so male ES cells are preferred over female lines. Good.Introduction of human 1g gene into ES cells lacking mouse Ig heavy chain and kappa light chain Minilocus constructs such as HCS and KC-CO4 or J1.3P The human immunoglobulin heavy and light chain genes were cloned as either of the YAC clones. Naturally, it is introduced into mutant ES cells. Transfection of ES cells with human Ig DNA By using techniques such as electroporation or lipofection with cationic lipids. I will do it. Selectable to allow selection of ES cells that have incorporated human DNA Linking the marker to the construct or co-transfecting the construct into ES cells To let you know. Mutant ES cells generated a gene target that produced Ig gene inactivation. Neomycin phosphotransferase (neo) as a result of the Ding event Since it contains a gene, the human Ig gene was introduced into ES cells, Igromycin phosphotransferase (hyg) or puromycin N- Various selectable markers such as acetyl transferase (pac) Is used. Human Ig heavy and light chain genes have been mutated using different selectable markers. It can be introduced into somatic ES cells simultaneously or sequentially. Transfection Then select cells with the appropriate selectable marker to ensure integration of the human gene sequence. Drug resistant colonies are expanded for the purpose of freezing and DNA analysis for recognition and analysis.Chimera generation As described (Bradley, A. (1987), “Teratocarcinoma and embryonic stem cells: One Practical Approach, "p113-151, edited by E.J. Robertson, IRL Press) R Injecting an ES clone containing human Ig heavy and light chain genes into AG-2 blastocyst, By ELISA assay of serum samples, transferred into the uterus of pseudopregnant females, Screen offspring for the presence of human antibodies. Human monoclonal antibody Positive animals are used for immunization and production.Example 31 This example shows the mouse heavy chain locus leading to the loss of B cells undergoing switch recombination. ES cell homologous recombination of a targeted frameshift mutation into Describe the introduction through the software. Frame-shifted mice have human sequences Host a non-mouse (eg, human) transgene that encodes an immunoglobulin It is a suitable host for The new frame-softened mouse is, among other things, a heavy chain transgene (single or double). And / or a non-mouse (eg, human) sequence encoded by the light chain transgene. To express lane immunoglobulins and from the transgene introduced. The proportion of hybridomas expressing mature human sequence antibodies with sswitched affinity It can be used for separation. One of the four mouse JH genes Introduce a frameshift in the middle and in the first exon of the mouse μ gene . The two frameshift mutations introduced compensate each other and thus When B cells use frame-shifted JH for functional VDJ ligation Allows expression of a fully functional mouse mu heavy chain. Compensated within the rest of the JH gene None of the other three JH segments due to frame shift within μ It cannot be used for functional VDJ Joining. Alternatively, multiple mau It is also possible to engineer a compensating frameshift in the JH gene. Homozygous for a compensated and frameshifted immunoglobulin heavy chain allele Mice have near-physiological levels of peripheral B cells and both mouse and human μ. It has near physiological levels of serum IgM containing. However, it is mobilized within the germinal center B cells frequently undergo class switching to non-μ isotypes. Endogenous Such a class switch in B cells that express the murine mu chain is associated with residual non-μC._H Since the gene does not have a compensating frameshift, the uncompensated frame is Directs expression of lamshift mRNA. The resulting B cells are B cell reservoirs. Is not expressed and is deleted. Therefore, B cells expressing mouse heavy chains are It is deleted once the stage of differentiation in which the isotype switch occurs is reached. Shi However, the isotype limitation frame that has the ability of the isotype switch Encoded by a non-mouse (eg, human) transgene that does not contain a mushift B cells expressing a heavy chain that undergoes isotype switching and / or affinity maturation With the ability of further development including. Therefore, mice undergoing frameshifting have a secondary response with respect to mouse heavy chain (μ). Is impaired, but a significant secondary response is observed for transgene-encoded heavy chains. Have an answer. This is a heavy chain transgene that can receive a class switch. When introduced into a natural mutant background, non-IgM secondary responses are Is governed by a transgene that expresses. Thus these frame shifts -Affinity matured human sequence immunoglobs expressing hybridomas from isolated mice It is possible to separate phosphorus. Furthermore, frame-shifted mice are generally In addition, the human heavy chain transgene can encode only a limited range of variable regions. In other cases, it has an immune protection level of mouse IgM which may be advantageous in some cases. To make hybridomas that secrete human sequence monoclonal antibodies, Immunize a transgenic mouse and fuse its spleen to a myeloma cell line. And the resulting hybridomas were cloned into a transgene-encoded human. Screen for expression of non-μ isotypes. In addition, frame shift Mice showed a transcribed VDJ that served as an active substrate for the cis switch. Would include adjacent functional μ-switch sequences (Gu et al, (1993)Cell 73; 1155), thus transswitched B expressing chimeric human / mouse antibodies It may be advantageous over JH-deficient mice because it reduces cell levels.Fret Construction of the boom shift vector Two separate frameshift vectors are constructed. Of these vectors One introduces two nucleotides at the 3'end of the mouse J4 gene segment The other vector used to clone the mouse mu gene is exon 1 at the 5'end. Used to delete these same two nucleotides from the end. 1. JH vector Herpes thymidine kinase under the control of the phosphoglycerate kinase promoter. Mouse heavy chain in a plasmid vector containing the gene and neomycin resistance gene. 3.4 kb XhoI / EcoR covering the J region and μ intron enhancer Subcloning the I fragment (tk / neo cassette, Hasty et al. , (1991)Nature 350: 243). Then use the following oligonucleotide primers As a substrate for generating two different PCR fragments. Use: To amplify a 1.2 kb fragment digested with SphI and KpnI, Oligonucleotides o-A1 and o-A2 are used. With KpnI and XbaI To amplify the 0.6 kb fragment that is digested, the oligonucleotide oA 3 and o-A4 are used. These two digested fragments are then combined with Sp Cloning into plasmid A digested with hI / XbaI, plasmid B To generate. Plasmid B contains a 2 nucleotide insertion at the end of J4, and further upstream of the insertion Contains a new KpnI site. KpnI site as a diagnostic marker for insertion To use. To increase the efficiency of homologous recombination, the 5'XhoI site and 3'E of the plasmid Additional flanking sequences can be cloned into the coRI site . Then with SphI or another restriction enzyme with a single site in the insert , Digest the resulting plasmid and electroporate into embryonic stem cells, Cells of Hasty et al (1991),In the above publicationAs described by, Then, it is selected by G418. Homology by Southern blot hybridization Recombinants were identified and then FIAU as described by Hasty et al. More selective, 2 base pair insertions and deletions containing only the new KpnI site in JH4 To obtain the selected subclone. These are the Southern blots of KpnI digested DNA. Of the PCR amplified JH4 DNA identified by Confirm by DNA sequence analysis. The resulting mice have the unmutated sequence: From the mutant sequence i.e. Including the JH4 segment converted to.μ exon 1 vector Similar to those described above to engineer a two base pair insertion within the JH4 gene segment. SimilarIn vitroUsing mutagenesis, 2 base pairs at the 5'end of the first mu exon PCR products and genomic subclones were generated to create a vector containing the deletion. Assemble. To mark further mutations, by changing A to G A new XmnI site is also introduced downstream. The sequence of the mu gene that has not been mutated is as follows: The sequence of the mutated μ gene is as follows. A homologous recombination vector containing a mutant sequence, an ES cell line containing a JH4 insertion And electroporate. Homologous recombinants from neomycin resistant clones Identify. These homologous sets containing a frameshift insertion on the same chromosome as the JH insertion The recombinants were subjected to Southern blot hybridisation of DNA digested with KpnI / BamHI. It is identified by quantification. K from wild type 11.3 kb to mutant 9 kb A new Kpn that reduces the size of J-μ intron containing pnI / BamHI Tie the I site with the JH4 insertion. Then, using FIAU, the inserted tk / The resulting clones are selected for deletion of the neo cassette. suddenly A clone containing the mutant μ exon was cloned into a Southern blot of DNA digested with XmnI. Identify by hybridisation. Mutations were PCR amplified μ Confirmed by DNA sequence analysis of exon 1 DNA.Generating a frame-shifted mouse Second, it included both a 2 base pair insertion in JH4 and a 2 base pair deletion in μ exon 1. A blastocyst into which an ES cell line is inserted into a pseudopregnant female to generate a chimera Introduced into stage embryo. Chimeric animals are bred to obtain germline transmission and The resulting animals are bred to homozygosity and compensated for frameshifting. Secondary body in B cells homozygous for the defined heavy chain locus and expressing mouse heavy chain Obtain mutant animals with impaired humoral immune response. The human heavy chain transgene, eg pHC1 or pHC2, is Human transgene in a mouse with a mutated mouse IgH locus By cross-breeding Mawas harboring mouse heavy chain frameshift background Can be bred to the und. Μ compensated via inbreeding and backcrossing Mouse IgH locus against the mouse frame-shifted mouse IgH allele Homozygous in (ie, compensated in-frame expression of only μ chain but not mouse non-μ chain) And a functional human heavy chain transgene (eg pHC1 or Produces mice harboring at least one integrated copy of pHC2). Scarecrow The mouse optionally has a knockout of the endogenous mouse κ and / or λ genes as described above. Quout, and optionally human or other non-mouse light chain It may include insulin (eg, pKC1e, pKC2, etc.). Alternatively, by frameshifting within the transgene constant region gene (s). A frameshift that is compensated for is included in the transgene J gene (s) In addition, the human transgene (s) (heavy and / or light chains) have A transswitch for an endogenous constant region gene that may contain , Not compensated, producing truncated or nonsense production; such not supplemented Selecting against B cells expressing transswitched immunoglobulins, Deplete this.Example 32 Inactivation of endogenous heavy chain by excision of D region This example shows a non-functional rearrangement of the mouse germline immunoglobulin heavy chain D region. For a positive-negative selection homologous recombination vector for replacement with the selected VDJ segment. Describe. The resulting allele is the intraallelic heavy chain class switch. Thus reducing transswitch levels to the active transgene locus. Under depletion, it functions in B cells as a normal non-productive allele.D-region targeting construct The 8-15 kb DNA fragment upstream of the mouse D region was transferred to Gen Bank. Approximately 50 runs of published sequence for the updated DFL16.1 segment. Using an oligonucleotide probe containing a contiguous nucleotide, the mouse strain 12 9 Separated from phage library and subcloned. DFL 16.1 is Upstream D segment (ie, proximal to the V region gene cluster, homeostatic region inheritance Distal to the child cluster). Similarly, the first two coats of JH3, JH4, Eμ, Sμ and μ constant region. A 9.5 kb BamHI fragment containing the ng exon was cloned into the mouse strain 129 Geno. Isolate from the Mick phage library and subclone. Next, rearranged VD of 5 to 10 kb from mouse hybridoma (all systems) J is separated and a synthetic linker containing a stop codon is inserted within the J segment. V placement Because of the possible rearrangement, the terminating linker inside J is preferred to the out-of-frame VDJ ligation. Get caught These three fragments were cloned into the PGKneo positive selection cassette and PGKHSV Assembled with tk negative selection cassette and 129-induced ES by homologous recombination Positive-negative selection vector for deleting mouse D region in cells (eg ABI) Form. The targeting vector itself is a 9.5 kb BamHI fragment. Rearranged 5-10 kb rearranged to be linked to the host, linked to VDJ itself A positive selection cassette (for example, PGKneo) that has been prepared has a DNA fragment of 8 to 15 kb. It is formed by connecting the segments. Next, of the targeting construct A negative selection cassette (eg PGKHSVtk) is ligated at either end. The construction of such a D region targeting vector is shown schematically in FIG. 73. . Transfer of D-region targeting construct into AB1 ES cells And negative selection as described above to properly target ES cells. To roast. Properly targeted ES cell clones for blastocyst injection Lone is used to produce chimeric mice. Heavy chain alleles inactivated in the D region Chimeric mice are bred to produce founder mice that harbor. Functional intrinsic weight The offspring are inbred to produce homozygotes lacking the chain locus. Using such homozygotes, the human Ig transgene (eg pHC1, pHC2, pKC2, pKC1e, KCo4) -bearing mice are cross-bred, Furthermore, by backcrossing to homozygotes lacking a functional D region), It lacks a functional endogenous heavy chain locus and contains a human heavy (chain) transgene (and More preferably, the human light chain transgene is also generated). In embodiments where some functional endogenous light chain loci (eg lambda locus) remain In general, the transgene is a high level of human light chain (eg, κ) polypeptide. It contains transcriptional regulatory sequences that induce bell expression, and thus the transgene locus It is preferable to be able to compete effectively with the rest of the endogenous light chain (eg lambda) loci. Good. For example, the Co4 kappa light chain transgene is used in transgenic animals. Is generally preferred over pKC1 for its ability to effectively compete with the endogenous λ locus within Have been.Example 33 This example shows a yeast artificial chromosome containing a portion of the human Vκ locus and a human κ light chain mini. Expansion of human light chain transgene V gene capacity by co-injection of loci Describe it.Functional human light chain V cell by co-injection of Vκ containing YAC DNA and κ minilocus Introduction of From the publicly available ICRF YAC library clone 4x17E1 , About 4 containing part of the human Vκ locus as unamplified YAC DNA A 50 Kb YAC clone was obtained (Larin et al. (1991).Proc.Natl.Acad.Sci (U. SA) 88: 4123; Imperial Cancer Research Fund, Institute for Genome Analysis, Rondo , UK). For standard Parffield gel electrophoresis according to manufacturer's specifications The 450 kb YAC clone was isolated without preamplification (CHEF DR-II, electrophoresis cell, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Ethyl bromide 6 individual pulse field gels were stained with dium and YAC clone D The gel material containing NA was excised from the gel and then poured into a triangular gel tray. Embed it in a fresh (low melting point agarose in standard gel buffer) gel. standard Use narrow agarose gel with 2M NaOAc in addition to electrophoresis buffer. In point, the resulting triangular gel (6 excised YAC containing gels (Including the lublock) was extended. The gel is then immersed in standard gel buffer. It was put in the electrophoretic chamber. The Y-shaped gel former has a narrow current (flow?) As it flows, it rises above the surface of the buffer. NaOAc in the buffer Blocks of acrylic were placed throughout the high-salt gel section to prevent spreading . Next, the YAC DNA was narrowed from the original excised gel that was sectioned (embedded). Electrophoresis was performed into the high salt gel area. Transition from low salt gel to high salt gel At the time of transfer, a decrease in resistance that effectively stops DNA transfer at the apex of the triangular gel Exists. After electrophoresis and staining with ethidium bromide, the concentrated YAC DNA was GELase (Bpi Center Technologies, Mad) Digested with ison, Wisconsin). The resulting YAC-containing liquid is then salted. Cesium chloride was added to give a density of 1.68 g / ml. 370 this solution for 36 hours YAC DNA was separated from any contaminants by centrifugation at 00 rpm. result The 0.5 ml fraction of the density gradient obtained as above was separated, and 5 mM Tris (pH 7.4) was added. The peak DNA fraction was dialyzed against 5 mM NaCl, 0.1 M EDTA. After dialysis, the resulting 0.65 ml solution of YAC DNA was concentrated to 2 It was found to contain μg / ml of DNA. This YAC DNA was converted to 20: At a ratio of 1: 1 (microgram YAC4 × 17E1: KC1B: KV4), Mixed with purified DNA inserts from rasmid pKC1B and pKV4 . Resulting 2 μg / ml solution in pronuclei of half-day B6CBF2 embryos And 95 surviving microinjected embryos were transferred into the oviduct of pseudopregnant females. Twelve mice developed from microinjected embryos were born.Example 34 Is this example homozygous for the inactivated endogenous immunoglobulin locus? Immunized transgenic mice containing one HC1 or HC2 heavy chain transgene Describe class switching, somatic mutations and B cell development in us . Realize that the human sequence germline-placed minilocus can replace the authentic locus. To demonstrate, we have established a system containing the human germline one-arrangement IgH transgene. Was used to breed a mouse line lacking endogenous IgH. Two transgies The minilocus HC1 and HC2 have one and four function-variable (V) cells, respectively. Segment, 10 and 16 Diversity (D) segments, 6 Joining (JH ) All segments and both μ and γ1 constant region segments are included. Mini heredity Constellation is tightly linked to the coding segment-JH-μintron Including human cis-acting regulatory sequences such as enhancers and μ and γ1 switch sequences. Mu. These likewise have additional genes derived from the 3'end of the rat IgH locus. It also includes enhancer elements. We have HC1 and HC2 transgenic Us as described (Above) It lacks the JH segment (JHD mouse) and therefore Mating with stem cell-derived mutant mice unable to undergo functional heavy chain rearrangement I let you. The resulting transgenic-JHD mice were transformed with It contains a B-pack that depends on the strand sequence.Immunization and hybridoma We immunized mice with an intraperitoneal injection of 50-100 μg of antigen. Anti Human carcinoembryonic antigen (CEA; Crystal Chem, Chicago, IL), chicken Bird egg white lysozyme (HEL; Pierce, RockFord, IL) and keyhole limpet Tohemocyanin (KLH; Pierce, RocKFord, IL) was included. Primary injection To do this, we mix the antigen with complete Freund's adjuvant and then Incomplete Freund's adjuvant (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) It was Spleen cells were transformed into non-secretory mouse myeloma P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL1 580). We have determined by ELISA that specific and non-specific antibodies containing human heavy chain sequences are present. Serum samples and hybridoma supernatants were assayed for presence. For the detection of non-specific antibodies For this purpose, we used a human heavy chain isotype-specific antibody (mouse MAbα human IgG 1, clone HP6069, Cal bio chem, La Jolla, CA; mouse MAbα human MicroTie with IgM, clone CH6, The Binding Site, Birmingham, UK) The wells are coated with peroxidase-conjugated antiserum (polyclonal Affinity of horseradish peroxidase conjugation from gui α human IgG (fc) Affinity purified fab fragment, cat # 109-036-098; affinity Purified horseradish peroxidase-conjugated polyclonal horse Gi α human IgM (fc), cat # 309-035-095. Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Antigen specific For the detection of static antibodies, we coated the microtiter wells with antigen, Developed with peroxidase-conjugated human heavy chain isotype-specific serum . We use hydrogen peroxide and 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiaso Incubation with phosphorus-b-sulfonic acid, Sigma Chem Co., St. Louis, Mo) The bound peroxidase was detected by the PCR. The reaction product is absorbed by absorption at 415 nm. Measured and corrected for absorption at 490 nm.Flow cytometry We prepared single-cell suspensions from spleen, bone marrow and peritoneal cavity, and prepared Mishell and Shiigi NH as described by_FourErythrocytes were resolved with Cl. Phosphorus with the following reagents Paspheres were stained: phycoerythrin-conjugated anti-mouse Igκ (black Xon X36; Becton DicKinson, san Joss. CA), FITC-conjugated anti-mouse IgD (clone SBA1, Southern Biotech, AL), FITC-conjugated anti-maize Us CD5 (clone 53-7.3; Becton Dickinson, San Jose. CA), F ITC-conjugated anti-mouse Igλ (clone R26-46); Pharmingen, San Diego, CA) and Cy-chromoconjugated anti-mouse B220 (clone RA3-. 6B2; Pharmingen, San Diego, CA), we are a FACScan clone hemocytometer Calculator and LYSISII software (Becton Dickinson, San Jose. CA) The stained and stained cells were analyzed. Large gating on the front and side scatterers Exclude some macrophages, neutrophils and residual red blood cells.B cell compartment rescue HC1 transgenic-CD in JHD animals intraperitoneally⁵⁺Normal B cell Bell and conventional CD^Five-About one-quarter of the normal level of B cells is found. Transji ENCI Celiac CD5^{+ B}The cells are the so-called B-1 cells described in normal animals. Similar to: they are larger than traditional B and T lymphocytes and It expresses lower levels of B220 than the conventional B cells found in the viscera, and is more highly expressed. Γ light chain expressing cells are included. Over 90% of splenic B cells express κ, while Up to 50% of peritoneal B cells express λ. Thus, conventional B cell levels are Have a much larger capacity for self-renewal, while decreasing evenly within all organizations B-1 levels reported as HCI transgenic-JHD It seems normal in the thing.Class switch Transgenic-JHD mice are exposed antianticipally to the antigen As a result, human γ1 antibody and μ antibody are produced as a result. we, Human CEA was injected into transgenic-JHD mice at weekly intervals. Serum levels of antigen-specific IgM and IgG1 were monitored over a week (FIG. 74). . At week 1, there is a detectable IgM response but no IgG1 response. However However, the IgG1 response was greater than the IgM response after 2 weeks, and the IgM response was relatively constant. It continues to grow while it remains normal. This pattern The early IgM response and the subsequent IgG response are typical of secondary immune responses. Yes, this is because the cis-acting sequences contained within the transgene Suggesting that they may be responding to the cytokines that guide the switch ing. We have investigated the expression of non-μ isotypes, which have been discussed in the literature. Three possible mechanisms were considered. What these mechanisms are Alternating splicing without gene deletion; phase between flanking repeats A "δ-type" switch involving the deletion of the μ gene via the same recombination; Non-homologous recombination between regions. The results of our experiments described below are switch It represents a region recombination model. Two types of non-deleted alternating splicins to explain isotype shifts It can evoke a gutting mechanism. First, it covers both μ and γ1 It is possible to express a single transcript from the transgene; this transcript is the antigen Spliced in response to cytokines induced by exposure to I was able to make it. Alternatively, start upstream of cytokine-induced γ1 Sterile transcripts could be trans-spliced to μ transcripts. These If any of the canisms were responsible for the expression of the human γ1 sequence, μ and We hoped that we could isolate hybridomas expressing both γ1. U However, hundreds of hybrids expressing either human μ or human γ1 Have been screened for⁺, Γ1⁺) Hive No redoma was found. This means that there is a deletion of μ gene in the expression of γ1. It means that it is accompanied. The deletion of the μ gene may be due to non-homologous recombination between the μ and γ1 switch regions, or Two flanking 40 contained within the HC1 and HC2 transgenes It can be mediated by homologous recombination between direct repeats of 0 bp (σμ and Σμ). σμ And the deletion recombination between Σμ and IgD of several human B cells⁺, IgM^-Phenotype Has been reported to be the cause. First mechanism, heterogeneous switch Recombination should produce switch products of variable length, while the second mechanism Nism Zu, that is, σμ / Σμ reshuffling should always produce the same product. we Are three hybridomas, one expressing μ and the other expressing γ1 Southern blot analysis of the genomic DNA isolated from (Fig. 75) was performed. Genomics upstream of the transgene γ1 only in two of the γ1 switch regions A relocation is found (Fig. 76). Furthermore, for all observed structures, σμ and Σ Not compatible with homologous recombination between μ. Therefore, our result is transgene By deletional non-homologous recombination between the encoded μ and γ1 switch regions, Consistent with the model for mediated γ1 isotype expression.Transformer switch Blood of HC1 and HC2 transgenic-JHD mice in addition to human γ1 Mouse γ is found during clearing. From these animals, mouse γ-expressing hybrids Ma was also obtained. Non-transgenic homozygous JHD animals have detectable levels Since it does not express the mouse immunoglobulin of Expression of mouse γ in Nick-JHD animals is due to the transswitch phenomenon I think that the. All of the transgenic hybridomas we analyzed It is possible to express both those expressing constant region sequences of either human or human Absent. Therefore, it is unlikely that the trans-splicing mechanism is involved. Tiger Using PCR amplification to isolate cDNA clones of the nsswitch product The nucleotide sequence of 10 of the resulting clones was determined (Fig. 77). ). The 5'oligonucleotide during PCR amplification was transgene encoded VH 251 specific, the 3'oligonucleotides are mouse γ1, γ2b and γ3. It is sequence specific. Transs that incorporate all of these three mouse constant regions You can see examples of itch products.Somatic mutation About 1 of the nucleotides in the variable region of the transswitch product shown in FIG. % Do not have germline coding. This is probably a resting cell sudden Probably due to mutation. The mutated sequence is transcribed at the endogenous locus. Since it was located, the cis-acting sequences that lead to these mutations are I was able to set the position anywhere from 3'from the γ switch. However below As discussed in the article, VDJ segment who did not receive such translocation Somatic mutations within the gut are also observed. And this result shows that the heavy chain somatic mutation Indicates that the required sequence is contained within the transgene . HC1 and HC2 constructs somatically project in transgenic-JHD mice To determine whether it contains enough cis-acting sequences for the mutation to occur, We have two independent HC1 transgenic lines and one HC2 line A cDNA clone derived from S. cerevisiae was isolated and partially sequenced. Transje Some of the γ1 transcripts from Nick-JHD mice carry extensive somatic mutations. It can be seen that the V region is included. The frequency of copies that have received these mutations is It appears to increase with repeated immunizations. 78 and 79 show two sets of cds. NA sequences are shown: 1 set of one injection of antigen 5 days before RNA isolation From the HC1 (strain 26) transgenic-JHD mouse immunized with Has been done; The second set is three injections on different days starting 5 months before RNA isolation. HC1 (strain 26) transgenic-JH hyperimmunized by Is derived from D mice; the second set begins 5 months before RNA isolation HC1 hypersensitized by injecting the antigen three times on different days (strain 26 ) Transgenic-derived from JHD mice (textual duplication). After exposure From the 5th day, only 2 out of 13 V regions have any germline coordinates. It contains nucleotides that have not been subjected to labeling. Each of these V is a single Total somatic cell ablation of less than 0.1% for this sample containing only cleotide modifications The mutation frequency is given. In contrast, 13 V from hyperimmunized animals None of the sequences are completely germline and the overall somatic mutation frequency is 16 %. A comparison of μ and γ1 transcripts isolated from a single tissue sample shows the frequency of somatic mutations. The degree is higher than that of a transgene copy that has undergone a class switch Is shown. We hyperimmunized CH1 strain 57 transgenic-JHD 47 independent μ and γ1 cDNA clones from mouse were isolated and partially distributed. Rows were determined (Figures 80 and 81). Most μcDNA clones are germline It has not been modified in relation to the sequence, whereas more than half of the γ1 clones have It contains a number of non-germline coding nucleotides. γ1 Expressing cells are quite different from mu-expressing cells because the two processes are not always linked. Nonetheless, class switching and somatic mutations do not occur in the same subpopulation of B cells. is happening. VH251 inheritance in non-hyperimmunized CH1 transgenic mice No widespread somatic mutations in offspring, but HC2 Among the VH56p1 and VH51p1 genes in transgenic mice Significant somatic mutations were discovered. Female non-immunized H at 9 weeks of age Spleen and lymph node RNA was isolated from C2 transgenic animals. we, Each of the four V regions within the HC2 transgene using V and γ1 specific primers Each γ1 copy that captured each was individually amplified. The relative yield of each specific PCR product is VH56p1 >> VH51p1> VH4.21> VH251. This technology Although not strictly quantitative, in the use of V segments in HC2 mice It may represent a bias. Figure 82 Is PCR amplification using an equimolar mixture of all four V-specific primers? 23 shows 23 randomly picked γ1 cDNA sequences derived from the above. This Again, there is a bias towards VH56p1 (19/23 clone). Furthermore, the VH56p1 sequence has an overall frequency of 2.1% within the V gene segment. , Showing significant somatic mutations. Examining the CDR3 sequence out of 19 Although 17 individual VH56p1 clones are unique, they Or derived from only 7 different VDJ recombination events . Therefore, in animals that have not undergone specific experiments, it is likely that an endogenous pathogen or VH56p1 expressing B cells appear to be selected by autologous antigen. This same It may be appropriate for genes to be over-represented within the fetal capacity of humans .wrap up The upstream cis-acting sequences define the functionality of individual switch regions and It is necessary for Ji. Secondary response of class switch in HC1 transgene Cells that are significantly involved in the oncogene, and are randomly generated across the entire B cell population Our observation that this is not the case is that the minimal sequence included with the transgene is sufficient. It suggests that it is a minor thing. Γ sequence contained in this construct Begins at 116 nucleotides upstream of the start site of the γ1 sterile transcript. Because of the tight fit, the switch control area is dense. Our results indicate that these important cis-acting regulatory elements are tightly associated with individual gamma genes. 3'fold linked or contained within the HC1 and HC2 transgenes It is demonstrated that it is associated with the chain enhancer. HC1 And HC2 inserts against sequences likely to undergo somatic mutations Undergoing a transgene autonomic class switch that can serve as a marker Therefore, we did not derive from translocation to the endogenous locus. I could easily find a highly mutated copy. We have three Of independent transgenic lines (two HC1 lines and one HC2 line) I found a gamma copy that had a somatic mutation in it. Therefore, the transgene suite It is possible that sequences flanking the integration site might affect this process. Low: Instead, the transgene sequence is sufficient to guide somatic mutations Is.Example 35 This example is homozygous for the inactivated endogenous immunoglobulin locus. With a transgene sequence encoding a human sequence heavy chain and a human sequence light chain. The production of hybridomas from sucrose is described. Hybrids described here Antibody secretes a monoclonal antibody containing a human sequence heavy chain and a human sequence light chain, It binds to a predetermined antigen expressed on the cell. This example is similar to human The ability of the mouse to produce human sequence antibodies in response to the immunogenic human CD4 from To produce a hybridoma secreting a human sequence monoclonal antibody reactive with the source The suitability of such mice as a source for A.Derived from HC1 transgenic mice immunized with human CD4 antigen Of isolated human Ig monoclonal antibody Functionally separated J_HThe sequence is homozygous for the locus and the human sequence heavy chain To encode transgene and human sequence light chain that can be rearranged to encode Transgenic mice harboring the rearrangeable transgene were immunized. Ma The genotype of us is HC1-26⁺KC1e-1536⁺J_HD^{+ / +}J_KD^-And This is homozygous for mouse heavy chain inactivation, and the HC1 human sequence heavy chain transgene. And the presence of a KC1e human sequence light chain transgene germline copy I was there. Mice were transfected with stably transfected polynucleotides. EL4 cell line expressing the encoded mouse-human hybrid CD4 molecule ( ATCC) variant. The expressed CD4 molecule is substantially human-like Contains the CD4 sequence. With 100 μl Complete Freund's Adjuvant (CFA) About 5 x 10 in 100 μl PBS⁶Cells on day 0 via intraperitoneal injection It was introduced into the mouse body. 7th, 14th, 21st, 28th, 60th and Repeated vaccination on 77th day, test on 18th, 35th and 67th day Performed blood. On day 81, the spleen was removed and about standard procedure (PEG fusion) 1.2 x 10⁷Fusion partner cells (P3 × 63Ag8.653 cell line: A About 7.2 × 10 for TCC)⁷Cells of the above are fused, and RPMI1640 1 HAT and PSN in 5% FCS, 4 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate The cells were cultured in the medium added. A number of fusions were performed. Hybridomas were grown and purified recombinant soluble human expressed in CHO cells. Sequence CD4 (American Bio-Technologies, Inc. (ABT), Cambridge, MA) and And / or binding to commercially available sources such as CD4 from NEN-DuPont One The supernatant was tested using an ELISA. ABT samples are human CD4 V₁ ~ V₃It contained a purified 55 kD human CD4 molecule consisting of a domain. Test For plates, recombinant human sequence CD4 (produced in CHO-K1 cells Used to capture the antibody from the hybridoma supernatant, and then the The captured antibody is bound to either human μ, human κ, human γ, mouse μ or mouse κ. The binding strength of the matching antibody to the panel was evaluated. One hybridoma was subcultured from its culture plate well called 1F2 Cloned. The 1F2 antibody bound to the ABT CD4 preparation was Positive for human μ and human κ and negative for human γ, mouse γ and mouse κ. It was sex. B.HC2 transgenic mice immunized with human CD4 and human IgE Of human Ig monoclonal antibody derived from The heavy chain transgene HC2 is shown in Figures 78 and 79 and has been described above (implementation See Example 34). The human light chain transgene KCo4 described in FIG. Co-incorporation of two individually cloned DNA fragments at a single site Is generated by. Fragment has four functional V_kSegment, 5J segment G, C_kIncluding exons and intron and downstream enhancer elements (See Example 21) (Meyer and Meuberger (1989),EMBO J． 8: 1959-1964 Judde and Max (1992),Mol.Cell Biol. 12: 5206-5216). Two Fragmen Since they share a common 3 kb sequence (see Figure 67), they overlap. After homologous recombination between the two sequences, a genomic 43 kb transgene is created. Potentially integrated into the DNA. Such recombination events frequently occur at the time of microinjection of overlapping DNA fragments. Has been proven to occur (Pieper et al. (1992),Nucleic Acids Res. 20: 1259-1264). Co-injected DNA is also co-integrated into the zygote The sequences contained within the individually cloned fragments that tend to It will be ligated by post-B cell developmental DNA rearrangements. Table 11 shows Functional transgene inserts from at least two of the transgenic lines Indicates that it is target. V segment with 4 transgene codings Of the 36 clones is an example of VJ ligation incorporating each of Are represented in the set. The above table shows human light chain V and J segments in KCo4 transgenic mice. Indicates the use of Menoto. This table shows two containing human kappa sequences shown. The number of PCR clones amplified from the cDNA derived from the transgenic system Show. w Individual KCo4 transgenic mice (mouse # 8490, 3mo ． , Male KCo4 strain 4437; mouse # 8867, 2.5 mo. , Female, KCo CDNA was synthesized using spleen RNΛ isolated from 4 system 4436). Ck special Heterologous oligonucleotide 5'TAG AAG GAA TTC AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA G TT CCA 3 ', as well as two Vk specific oligonucleotides 5'AGC TTC TCG AGC TCC TGC TGC TCT GTT TCC CAG GTG CC 3'and 5'CAG CTT CTC GAG CTC CTG CTA CTC TGG CTC (C, A) CA GAT ACC 3'by PCR using a mixture of 3 ' The cDNA was amplified. The PCR product was digested with XhoI and EcoRI And then cloned into a plasmid vector. Randomly picked from each animal For the 18 clones that were raised, copy them by the dideoxycentration method. The nucleotide sequence was determined. Unrearranged the sequence of each clone The transgene germline sequences were compared. Twenty-three light chain minilocus positive and eighteen heavy chain positive mice developed from injected embryos. Reached Human heavy and kappa light chains in the absence of functional mouse heavy and kappa light chain loci In order to obtain a mouse containing, the endogenous mouse heavy chain (line JHD) and κ light chain locus ( Using a mouse containing a targeted mutation in the strain JCKD) These mice and their progeny were bred. These muffs contain only λB cells There is. Table 7 shows that the somatic mutations in the transgenic mice of transgenic mice It is shown to occur in the variable region of the human heavy chain transcript that has undergone ligation. HC Partial sequencing of 23 cDNA clones from 2 transgenic mice To determine the frequency of non-germline-encoded nucleoletides in the variable region Decided. The data show the sequence of V segment codons 17-94 from each clone. Only the N region is not included. RNA is the spleen of mouse 5250 And isolated from lymph nodes (HC2 strain 2550 hemizygous, JHD homozygous), As mentioned (reference), single-stranded cDNA was synthesized and the γ transcript was amplified by PCR. It was The amplified cDNA was cloned into a plasmid vector and read by dideoquin. Twenty-three randomly picked clones were partially sequenced by the termination method. P The frequency of nucleotide changes introduced by CR was set to <0.2% from the constant region sequence. Estimated. Table 7 Flow cytometry We use a FACScan flow cytometer and LYSIS II software (Be cton Oickinson, San Jose. The stained cells were analyzed using CA). The following reagents Were used to stain splenocytes; Provicium iodide (Molecular probe, Eugene, OR) , Phycoerythrin-conjugated α-human Igκ (clone HP6062; Caltag , S. San Francisco, CA), Phycoerythrin-conjugated α-mouse Igκ Loan X36; Becton Dickinson, San Jose. CA), FITC-joined α-ma Us Igλ (clone R26-46; Pharmingen, San diego, CA), FITC Conjugated α-mouse Igμ (clone R6-60.2; Pharmingen, San dieg o, CA), FITC-conjugated α-human Igμ (clone G20-127; Pharm ingen, San Oicgo, CA), and Cy-chromium conjugated anti-mouse B220 ( Clone RA3-6B2; Pharmingen, San Diego-CA).Expression of human Ig transgene Figure 83: KC homozygous for both JHD and JCKD mutations Flow cytometric analysis of splenocytes from o4 and HC2 mice is shown. Human The sequence HC2 transgene shows that B cells within the JHD mutation background B220 in the spleen to rescue development⁺Relative numbers of cells up to about half of wild type animals It was restored. These B cells used a transgene-encoded heavy chain. Expressed cell surface immunoglobulin receptors. Human KCo4 transgene is the same Functionally competed well for the intact endogenous lambda light chain locus. Heavy and light JHD / JCK containing both chained human transgenes (double transgenic) Approximately 95% of B splenocytes in D homozygous mutant mice are fully human cell surface. Surface IgMκ was expressed. Serum Ig levels were determined by ELISA as follows: human μ: mouse Coding with Mabα human IgM (clone CH6, binding site, Birmingham, UK) Α-human IgM (fc) (cat # 3) conjugated with peroxidase 09-035-095, developed by Jackson Immuno Research, (West Grove, PA). Set microtiter well. Human γ: mouse MAbα human IgG1 (black HP 6069, CalbiChem, La Jolla, CA) Sidase-conjugated goat α human IgG (fc) (cat # 109-036-09) 8, Jackson Immuno Research, West Grove, PA) Iterwell. Human κ: mouse Mabα human Igκ (cat # 0173, AMAC, Inc, Igκ (Cat # A7164, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) Microtiter well. Mouse γ: goat α mouse IgG (cat # 115- 006-071, JacKson Immuno Research, West Grove, PA) Microtiter wells. Mouse λ: rat MAbα mouse Igλ (ca t # 02171D, Pharmingen, San Diego, CA), Peru Rabbit α mouse IgM (fc) conjugated with oxidase (cat # 309-035). -095, Jackson Immuno Research, West Grove, PA) Crotiter Well. The bound peroxidase is bound to ice peroxide 2,2'- Azino-bis-13-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid, Sigma Chem ． Co., St. Louis, MO). Reaction product Is measured by absorption at 415 nm. Double transgenic mice also express fully human antibodies in serum. FIG. 84 shows the effects derived from several different transgenic founder animals. And 18 individual double transgenics that are homozygous for Kappa light chain inactivation 3 shows measured serum levels of immunoglobulin proteins for mice. we Found detectable levels of human μ, γ1 and κ. We are over and expressed Recombination between the transgene μ and γ1 switch regions It is shown that it is obtained as a result of a genuine class switch by. Moreover , We found that the class switch inside the transgene suddenly changes the heavy chain variable region of this cell. It was discovered that it could be achieved by a difference. In addition to human immunoglobulins, we have also found mouse γ and λ in serum. The existence of the mouse lambda protein is expected due to the complete integrity of the endogenous locus. Rero. We have shown elsewhere that mouse γ expression transduces into the endogenous heavy chain locus. Shown to be the result of transswitch recombination of the Gene VDJ segment did. Initially the wild-type heavy chain allele and the rearranged VDJ transgene This transformer switching phenomenon, which was proved as follows (Ourdik et al. (1989),Proc.Na tl, Acad, Sci, USA 86: 2346-2350; Gerstein et al. (1990),cell63: 537-548 ) Indicates that the downstream heavy chain constant region and its respective switch element are still intact. From the mutant JHD background. Serum concentration of human IgMκ in double transgenic mouse is about 0.1 mg / ml And there is almost no deviation between animals or strains. However, human γ1, Mouse γ and mouse λ levels range from 0.1 to 10 micrograms / ml There is. The variation in γ levels seen between individual animals is a constant region in which γ can be induced. May be the result of the fact that Expression probably depends on animal health, antigen Exposure and, in some cases, factors such as MHC type Seem. Mouse lambda serum levels correlate with individual transgenic lines The only parameter that seems to be. The lowest number of transgene copies per integration (about 1-2 copies) -) KCo4 strain 4436 mice have the highest levels of endogenous lambda, while KCo4 4 lines of 4437 mice (~ 10 copies per integration) had the lowest lambda levels Have. This is due to the rearrangement of the κ transgene followed by the relocation of endogenous λ and Were not selected, but instead reflected the relative size of the precursor B cell pool It is consistent with one model. Transgenes containing multiple light chain inserts The locus may have the opportunity to undergo one or more VJ recombination events , The probability that one of them will be functional increases. Thus, a high copy The lineage will have a smaller potential lambda cell pool.Immunization with human CD4 and IgE To test the ability of transgenic B cells to participate in the immune response, we Have immunized double transgenic mice with human protein antigen and Serum levels of antigen-specific immunoglobulins were measured by A. By intraperitoneal injection Polystyrene lymphocytes in complete Freund's adjuvant (cat # 08226, Poly 50 μg recombinant sCD covalently linked to sciences Inc., Warrington, PA) 4 (cat, # 013101, American Bio-Technologies Inc., Cambridge, M Mice were immunized with A). Each of the mice has a disruption of the endogenous μ and κ loci. It is homozygous for the human heavy chain transgene HC2 strain 2500 and human kappa. It is hemizygous for the light chain transgene KCo4 line 4437.Method Serum samples from recombinant sCD4 coated microtiter wells Diluted to. Peroxidase-conjugated rabbit α human IgM (fc) (Ja ckson Immuno Research, West Gtove, PA) or peroxidase conjugated Human antibodies were detected using Ghi anti-human Igκ (Sigma, St. Louis, MO). FIG. 85: Transgenic mice immunized with recombinant human soluble CD4 Shows the primary response of All four immunized animals show an antigen-specific human IgM response at 1 week . CD4 specific serum antibodies contain both human mu heavy chain and human kappa light chain. To evaluate the ability of the HC2 transgene to participate in the secondary response, we will Hyperimmunize and induce transgenic mice by repetitive infusion of stock The heavy chain isotype of the antibody was monitored. Human heavy chain transgene HC2 and Mice homozygous for the human kappa light chain transgene KCo4 were tested on day 0. 25 μg of human IgEκ in complete Freund's adjuvant (The Binding Site, Birmingham, UK). After that, about every other week, incomplete Freund's horse mackerel Mice were injected with IgEκ in tubant. Serum samples were diluted 1:10 Antigen-specific ELISA on plates coated with human IgE, λ I did. Figure 86 shows a standard time course of immune response from these animals. I Have double-transfected human IgE in complete Freund's adjuvant. Infused and then added once weekly with IgE in incomplete Freund's adjuvant I was immunized. The initial human antibody response is IgMκ, followed by antigen-specific human IgGκ Appeared. Induced serum antibodies in these mice were either human IgM or BSA. It did not show any reactivity to. Development of human IgG over time, Missing). We also have the ability to undergo class switching of heavy chain transgenes in vitro. Tested; spleens that are hemizygous for the same heavy chain construct (HC2, strain 2550) Animals with purified spleen B cells were tested in the presence of LPS and recombinant mouse IL-4. Switch from human IgM to human IgG1. However, in vitro The switch was activated in the presence of LPS and recombinant muff IL-2 or LPS alone. I didn't. Spleen, phosphorus of double transgenic / double knockout (0011) mouse Human IgM-expressing cells are found in paranodes, peritoneum and bone marrow. Normal number of B in the abdominal cavity Abundance of transgenic B cells in bone marrow and spleen, although containing cells The number is about 10-50% of the normal value. For transgene-dependent B cell development A delay can result in a reduction. Double transge Nick / Double Knockout (0011) mice are also found in these mice as well. Fully human in serum with significant levels of μ, γ1 and κ Express the antibody. The expressed human γ1 is a transgene μ and γ1 switch Obtained as a result of authentic class switching by genomic recombination between regions It In addition, the class switch in the transgene is coded by the transgene. Associated with somatic mutation of the heavy chain variable region. In addition to human immunoglobulin, Mouse μ and mouse λ are found in these mice. Mouse μ expression Transgene VDJ gene integrated into the endogenous mouse heavy chain locus It seems to be the result of switch recombination. Originally wild-type heavy chain alleles and redistribution The transswitch found in the literature for the placed VDJ transgene is The mouse downstream heavy chain constant region and its respective switch element are still intact. And from our J_H ^-/-It happens in the background. To demonstrate the ability of transgenic B cells to participate in the immune response, we , Immunize 0011 mice with human protein antigens and develop antigen-specific immunoglobulins Were monitored for serum levels. Early human antibody response is IgM, followed by antigen-specific Expression of human IgG follows (Figure 86 and Figure 88). Before the appearance of human IgG antibodies Delay is consistent with the link between secondary responses to antigens and class switching . In transgenic mice immunized with human CD4, the CD4 antigen The reactivity of human IgG against 2 × 10^-2~ 1.6 × 10^-FourSerum concentration in the range It was detectable by.Identification of anti-human CD4 hybridoma For the human heavy chain transgene HC2 and the human kappa light chain transgene KCo4 Homozygous transgenic mice were treated with complete Freund's adjuvant on day 0. Immunized with 20 μg of recombinant human CD4. After that, about one week interval The mice were infused with CD4 in incomplete Freund's adjuvant. 88 Shows a human antibody response to human CD4 in the serum of transgenic mice . Serum samples were diluted 1:50 and plated on human CD4 coated plates An antigen specific ELISA was performed. Each line represents the measured value of an individual sample. You Black circles represent IgM and white circles represent IgG. Line # 7494 (0012; HC1-26 +; JHD ++; JKD ++; K C2-1610 ++) mice on day 0, day 13, day 20, day 28, day 33. Immunization with human CD4 on days and 47 resulted in the formation of human κ and human μ or γ. Anti-human CD4 antibody was produced. On day 28, human μ and human κ were found in serum. By day 47, human C Serum responses to D4 included human μ and human γ and human κ. On day 50, splenocytes were fused with P3x63-Ag8.653 mouse myeloma cells. , Cultured. Of the 700 wells, 44 (6.3%) had human γ and / or κ CD4 monoclonal antibody was included. 3 of these wells are human Although it was confirmed to contain a γ anti-CD4 monoclonal antibody, Apparently it expresses mouse λ). The nine primary wells are completely Containing an IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody of Selected for. Expresses fully human IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody One such hybridoma was designated 2C11-8. Cloning primary hybridoma by limiting dilution method and reacting with CD4 Human human mu and kappa monoclonal antibody secretion was evaluated. 9 hives Five of the lidomas remained positive in the CD4 ELISA. Human CD4 The specificity of these human IgMκ monoclonal antibodies for , Bovine serum albumin, human serum albumin, keyhole limpet hemaciani And its lack of reactivity with other antigens, including carcinoembryonic antigen. Was proven. These monoclonal antibodies bind CD4 (eg, native CD4) on the cell surface Reactivity with CD4 + T cell line, SupT1, to determine whether it can be recognized For these, the supernatants of these 5 clones were also tested. Five human IgMκ mono Four of the clonal antibodies reacted with these CD4 + cells. These IgM To further ensure the specificity of the kappa monoclonal antibody, the Freshly stained human peripheral blood lymphocytes (PBL) were stained. 5 primary hybrids Supernatant from clones derived from 4 of the It bound and did not bind to CD8 + lymphocytes (Figure 87). FIG. 87 shows the reactivity of IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody with human PBL. You Human PBL was isolated from the supernatant from each clone or an isotype-matched negative control model. Mouse anti-human CD4 monochrome conjugated to noclonal antibody followed by PE Mouse anti-human CD8 Ab conjugated to internal antibody (top) or FITC (bottom) Were used for incubation. Respectively bonded to FITC or PE Any bound human IgMκ was detected with mouse anti-human μ. Clone one Two, representative results for 2C11-8 (right) and control IgMκ (left) are shown. Has been done. As expected, the negative control IgMκ did not react with T cells, and goat anti-human μ , Possibly with human B cells, reacted with about 10% PBL. High level of production and excellent growth of IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody Is an important factor in selecting clonal hybridoma cells for development. It Data from one of the hybridomas, 2C11-8, shows up to 5 pg / cell / day It can be produced (FIG. 89). Similar results are obtained for the second clone. The fruit was seen. Produced as cells enter stationary phase growth, as is generally observed Increases dramatically. Figure 89. Human IgMκ in cell growth and small scale culture. 3 shows the secretion of anti-CD4 monoclonal antibody. 2 x 1 per ml in the total volume of 2 ml 0^FiveDuplicate cultures were seeded at the rate of cells. Harvest the culture every 24 hours for the next 4 days did. Cell growth was determined by counting viable cells, and the total human μ (upper The amount of IgMκ production was measured by ELISA. The amount of IgMκ Production per cell per day was calculated by dividing by the number of cells (see image below ). FIG. 90: Epitope mapping of human IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody Is shown. IgMκ anti-CD4 monoclonal antibody 2C11-8 (HB 1166 8) Competitive binding flow cytometry to locate the epitope recognized by Used the exam. For these studies, unique unique epitopes on CD4 Mouse anti-CD4 monoclonal antibodies Leu3a and RPA-T4 Was used. Pre-injected with either decreasing concentrations of RPA-TA or Leu-3a PE of CD4 + cells that were incubated and subsequently stained with 2C11-8. Fluorescence was detected with PE-conjugated goat anti-human IgM. Human I by Leu3a Concentration-dependent binding of gMκ anti-CD4 monoclonal antibody 2C11-8 There was competition but not for its binding by RPA-T4. Or Furthermore, the epitope recognized by 2C11-8 is the monoclonal antibody Le. RP which was similar or identical to the epitope recognized by u3a, but It was quite different from that recognized by A-T4. In summary, we specifically react with unmodified human CD4 to bind human PBLS to CD. 4⁺And CD4^-Human IgMκ mono that can be used to discriminate into subpopulations Multiple hybridoma clones secreting clonal antibodies were produced. these At least one of the antibodies was composed of the monoclonal antibody Leu3a Binds to or near the epitope. Mono induced to this epitope Clonal antibodies have been shown to inhibit the warm leukocyte response. (Engleman et al., J. Eyp. Med. (1981) 153: 193). Monoclonal antibody L A chimeric version of eu3a has been used in several clinical trials in patients with mycosis fungoides. (Knox et al. (1991) Blood 77:20). We also similarly examined hybridomas from one mouse that responded to human CD4 immunization. Cell lines were also separated. Five of the cloned hybridomas were recombinant It binds to human human CD4 and does not cross-react with a panel of other glycoprotein antigens ( Human IgGκ (human γ1 / human κ) antibodies were analyzed as determined by ELISA). Secrete. Secreted by two IgGκ hybridomas, 4E4.2 and 2C5.1 And dissociation of human CD4 antigen for immunization against isolated monoclonal antibodies Was measured. Experimentally derived binding constants (Ka) were determined by the antibody 4E4, respectively. ． About 9 x 10 for 2 and 2C5.1⁷ M^-1And 8 × 10⁷ M^-1Met. This These Ka values have been used in clinical trials by others (Chen. et al. (1993)Int.Immunol. 6: 647) within the range of mouse IgG anti-human CD4 antibody to go into. Here, B cells that express human immunoglobulin undergo development and enter the mouse immune system. I would like to conclude that under the circumstances it will respond to the antigen. Antigen reactivity is immunoglobulin Heavy chain isotype switching and variable region somatic mutations are introduced. We also have this Conventional hybridoma techniques for obtaining monoclonal human sequence antibodies from these mice. We have also demonstrated that we can use surgery. Therefore these trans Ethnic antibodies are a source of human antibodies against human target antigens. Human transgenic mice of the invention selected from Tables B and C below Immunize with the antigen. A transgenic mouse is a human that binds to the human antigen. Produce antibodies. Using B cells from immunized transgenic mice, A hybridoma secreting a monoclonal antibody against the selected human antigen To make. Table B above immunizes the transgenic mice of the present invention and pairs them with human antigens. To generate hybridomas that produce monoclonal antibodies that 3 is a list of examples of clusters of differentiation (CD). Table C, above, immunizes the transgenic mice of the invention and To generate hybridomas that produce monoclonal antibodies against 3 is a list of examples of non-CD antigens. The transgenic mice of the invention were selected from human-pathogens or anti-humans selected from Table D. Immunize with Hara. Transgenic mice have antibodies that bind to human pathogens. Produce. Using B cells from immunized transgenic mice, the selection Create hybridomas that secrete monoclonal antibodies against selected human pathogens To make. Table D, above, immunizes transgenic mice of the present invention and human pathogens. To generate a hybridoma producing a monoclonal antibody against 1 is a list of examples of human pathogens and their antigens. Table E above immunizes transgenic mice of the present invention and To generate hybridomas that produce monoclonal antibodies to the body Is a list of examples of pathogens and their antigens. While the invention has been described in some detail by way of illustration for purposes of clarity of understanding, It will be apparent that some changes and modifications can be made within the scope of. Brief description of the drawings FIG. FIG. 1 shows unrearranged genomic DNA and rearranged immunoglobules. Complementarity determining regions CDR1, CDR2 and And CDR3, and framework regions FR1, FR2, FR3 and FR4 Represents FIG. Figure 2 represents the human lambda chain locus. Figure 3 Figure 3 represents the human kappa chain locus. Figure 4 Figure 4 represents the human heavy chain locus. Figure 5 Figure 5 shows a 25 kb fragment containing human γ3 and γ1 constant regions followed by rat chain Rearranged IgM gene linked to a 700 bp fragment containing the 3'enhancer sequence Represents a transgen construct containing offspring. Figure 6 Figure 6 is used to form the light chain transgene by in vivo homologous recombination. It is a restriction map of the human kappa chain locus, showing the fragments that can be cloned. Figure 7 FIG. 7 shows the production of pGP1. Figure 8 FIG. 8 shows the constitution of the polylinker contained in pGP1. Figure 9 FIG. 9 shows the fragments used to make the human heavy chain transgenes of the present invention. Figure 10 FIG. 10 shows the production of pHIG1 and pCON1. Figure 11 FIG. 11 shows that pRE3 (rat enhancer 3 ′ was used to form pREG2). 3) shows a human Cγ1 fragment inserted in 12 Figure 12 shows the production of pHIG3 'and pCON. FIG. FIG. 13 shows the human D region segment used in the construction of the transgene of the present invention. The containing fragment is shown. 14 FIG. 14 shows the production of pHIG2 (D segment containing plasmid). Figure 15 FIG. 15 shows human Jκ and human Cκ used for production of the transgen of the present invention. The fragment containing the gene segment is shown. FIG. FIG. 16 shows the structure of pEμ. FIG. 17 FIG. 17 shows the production of pKapH. FIG. Figure 18 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the production of a positive-negative selection vector for FIG. 19 Figure 19 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the construction of a positive-negative selection vector for Figure 20 Figure 20 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the construction of a positive-negative selection vector for Figure 21 FIG. 21 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the construction of a positive-negative selection vector for FIG. 22 FIG. 22 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the construction of a positive-negative selection vector for FIG. 23 FIG. 23 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin light chain locus. 2 shows the production of a positive-negative selection vector for Figure 24 FIG. 24 shows a functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 2 shows the construction of a positive-negative selection vector for Figure 25 FIG. 25 shows the structure of a vector for targeting the κ chain. FIG. 26 FIG. 26 shows the structure of a mouse heavy chain targeting vector. FIG. 27 FIG. 27 shows the structure of a mouse heavy chain targeting vector. FIG. 28 FIG. 28 shows a map of the vector pGPe. FIG. 29 FIG. 29 shows the structure of vector pJM2. Figure 30 FIG. 30 shows the structure of the vector pCOR1. Figure 31 Figure 31 shows the transgenic constructs of pIGM1, pHC1 and pHC2. . Figure 32 FIG. 32 shows the structure of pγe2. FIG. 33 FIG. 33 shows the structure of pVGE1. FIG. 34 Figure 34 is an assay result of human Ig expression in pHC1 transgenic mice. Show the result. Fig. 35 FIG. 35 shows the structure of pJCK1. Fig. 36 Figure 38 shows the production of synthetic heavy chain variable regions. FIG. 37 FIG. 37 shows the heavy chain minilocus construct pICM.₁, PHC1 and pHC2 schematics Is. Figure 38 Figure 38 shows the heavy chain minilocus construct pIGG1 and the kappa light chain minilocus construct p. 1 is a schematic representation of KC1, pKVe1 and pKC2. FIG. 39 FIG. 39 represents a strategy for rearranging a functionally rearranged light chain gene. Figure 40 FIG. 40 shows the serum ELISA results. Figure 41 Figure 41. ELISA assay of sera from 8 transgenic mice. Represents the result of. FIG. 42 Figure 42 is a schematic representation of plasmid pBCE1. Figure 43 FIG. 43 shows KLH-DNP (37A), KLH (37B) and BSA-DN. KL by measuring IgG and IgM levels specific for P (37C) FIG. 5 represents the immune response of transgenic mice of the invention to H-DNP. Figure 44 FIG. 44 comprises human carcinoembryonic antigen (CEΛ) and comprises human μ chain. ELISA data demonstrating the presence of antibodies are shown; each panel shows post-immunization instructions. Shown are the reciprocal serial dilutions from pooled serum samples obtained from mice on day. Figure 45 Figure 45 comprises human carcinoembryonic antigen (CEA) and comprises human gamma chain. ELISA data demonstrating the presence of antibodies are shown; each panel shows post-immunization instructions. Shown are the reciprocal serial dilutions from pooled serum samples obtained from mice on day. Figure 46 Figure 46. HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). Nucleotides against germline sequences in each row The change is indicated above the change in the deduced amino acid sequence (if any). Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. FIG. 47 Figure 47. HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). Nucleotides against germline sequences in each row Do changes are displayed above changes (if any) in the deduced amino acid sequence. Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. FIG. 48 Figure 48. HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA) 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). In each line, the nucleoti Do changes are displayed above changes (if any) in the deduced amino acid sequence. Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. FIG. 49 Figure 49. HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA) 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). Nucleotides against germline sequences in each row Do changes are displayed above changes (if any) in the deduced amino acid sequence. Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. Figure 50 Figure 50: HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA) 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). Nucleotides for germline sequences across each line Do changes are displayed above changes (if any) in the deduced amino acid sequence. Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. FIG. 51 Figure 51: HC1 Tran immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA) 23 generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of transgenic mouse Aligned variable region sequences of a randomly selected cDNA of Compared to the column (top row). Nucleotides against germline sequences in each row Do changes are displayed above changes (if any) in the deduced amino acid sequence. Heavy chain CD The regions corresponding to R1, CDR2 and CDR3 are indicated. By germ cells Nucleotides that are not encoded are shown in upper case. The deduced amino acid sequence is It is given below the nucleotide sequence using the conventional one-letter notation. Figure 52 Figure 52 shows the data of Figure 40 in histogram format; putative amino acid residue positions. Position as ordinate (left is amino-terminal direction, right is carboxy-terminal direction) And the frequency of sequence variation is shown as the abscissa. Fig. 53 Figure 53 is a human D designated vk65.5 containing a Vκ gene segment. The nucleotide sequence of the NA fragment is shown; the Vκ coding region deduced amino acid sequence is also shown. The splicing sequence and recombination signal sequence (heptamer / nonamer) are in frame Shown in. FIG. 54 FIG. 54 shows a human D designated vk65.8 containing a Vκ gene segment. The nucleotide sequence of the NA fragment is shown; the Vκ coding region deduced amino acid sequence is also shown. The splicing sequence and recombination signal sequence (heptamer / nonamer) are in frame Shown in. FIG. 55 Figure 55: Human named vk65.15 containing Vκ gene segment The nucleotide sequence of the DNA fragment is shown; the deduced amino acid sequence of the Vκ coding region is also shown The splicing sequence and recombination signal sequence (heptamer / nonamer) Shown in. FIG. 56 FIG. 56 shows light chain minimization by homologous recombination between two overlapping fragments injected simultaneously. Shows the formation of loci. Fig. 57 Monoclonal reactive with CEA and non-CEA antigens showing specificity of antigen binding The result of ELISA about an antibody is shown. Fig. 58 By PCR to amplify a transcript containing human VDJ and mouse constant region sequences The DNA sequences of the 10 amplified cDNAs are shown. FIG. 59. Human heavy chain minilocus transgene and human kappa minilocus transgene ELISA for various dilutions of sera obtained from mice supporting both Results are shown; mice were immunized with human CD4 and are shown The data are for human κ, human μ, or human γ, which are reactive with human CD4, respectively. Represents an antibody with a pitope. Fig. 60 Human μ or mouse as determined by FACS for 3 mouse genotypes The relative distribution of lymphocyte staining for μ is shown. FIG. 61 Human kappa or mouse as determined by FACS for three Maawas genotypes The relative distribution of lymphocyte staining for κ is shown. FIG. 62 For mouse λ determined by FACS for 3 mouse genotypes 3 shows the relative distribution of lymphocyte staining of. Fig. 63 Mouse λ or human as determined by FACS for 4 mouse E progeny The relative distribution of lymphocyte staining for κ is shown. FIG. 64 Human μ, human γ, human κ, mouse μ, mouse γ in non-immunized serum, The amounts of mouse κ and mouse λ chains are shown. Figure 65 Human μ in the serum of unimmunized 0011 mice of various genotypes, The amount of human γ, human κ, mouse μ, mouse γ, mouse κ, and mouse λ chains. A random plot is shown. FIG. 66 1 shows the anti-human CD4 titer in mice. FIG. 67 Immunization of 0011 mice with human CD4 followed by 3 or 7 weeks post immunization The anti-CD4 antibody contained in the serum collected in Section 1 containing human μ, human γ, or human κ chain Indicates physical strength. Fig. 68 Human heavy chain mini-locus transgene PHC1 and PHC2, and light chain mini gene The transgene pKC1, pKC1e and PKC2 and C at designated sites Overview of the light chain minilocus transgene created by homologous recombination between o4 It is a schematic diagram. FIG. 69 Storb et al. (1989) supra, of the murine lambda light chain locus, taken from A chain map is shown. The stippled boxes represent pseudogenes. FIG. 70 Schematic representation of inactivation of the mouse λ locus by homologous gene targeting There is. FIG. 71 "Immunoglobulin gene, Honjo, T, Alt, FW, and Rabbits TH (eds) Acad Location of the BALB / c mouse heavy chain locus from p129, emic Press, NY (1989) The figure is shown. Structural genes are indicated by closed boxes in the upper line. Second and third The line indicates the restriction site with the displayed symbols. Fig. 72 1 shows the nucleotide sequence of a mouse heavy chain locus α constant region gene. FIG. 73 Mouse heavy chain locus J_FourTo introduce a two bp frameshift into the gene The structure of a frame shift vector (plasmid B) is shown. Fig. 74 Figure 6 shows the isotype-specific response of transgenic animals during hyperimmunization. Reactivity The relative levels of human μ and γ1 were determined by a colorimetric ELISA assay (y-axis) It is shown. We used an intraperitoneal injection of CEA in Freund's adjuvant , HC1 in 3 homozygous JHD backgrounds, 3-7 week old males Transgenic animals of line 57 (# 1991, # 2356, # 2357) Immunized. The figure shows CEA coated microtiter wells. Binding of 250-fold dilutions of pooled serum (collected prior to each injection) I am drawing. Fig. 75 Transgene-encoded γ1 gene mediated by clathsite recombination Shows isotype expression. Genomics of integrated transgenes in two different human γ1-expressing hybridomas The nomic structure is consistent with recombination between the μ and γ1 switch regions. Fig. 75 Is PacI / SfiI isolated from three transgene expressing hybridomas. 5 shows a Southern blot of digested DNA. From left to right: clone 92-09A -5H1-5, human γ1⁺/ Μ^-Clone 92-90A-4G2-2, human γ1⁺ / Μ^-Clone 92-09A-4F7-A5-2, human γ1^-, Μ⁺. Three ha All ibridomas are semi-zygotic for JHD shedding for HC1-57 incorporation. And a homozygous 7 month old mouse (mouse # 1991). Block Is a 2.3 kb BglII / Sf spanning the 3 ′ half of the human γ1 switch region. It hybridizes with a probe derived from the iI DNA fragment. No switch products were found in the μ-expressing hybridomas, but γ1-expressing hybridomas 92-09A-5H1-5 and 92-09A-4G2- 2 ligated the 5.1 kb and 5.3 kb PacI / SriI fragments, respectively. Includes switch products that result in fruit. FIG. 76 FIG. 76 shows that a mu-to-γ1 class switch can be produced. FIG. 3 is a diagram of two deletion mechanisms according to FIG. For human μ gene, recombine to delete μ The possible 400 bp direct repeats (σμ and Σμ) are flanking. this Class switching by mechanism is always a 6.4 kb PacI / SfiI library. Generate a lagment, while the recombinant clone between the μ and γ1 switch regions The switches show 4 kb and 7 kb, showing size variation between individual switch events. Generate a PacI / SfiI fragment between kb. Considered in Figure 75 Two γ1-expressing hybridomas undergo recombination between the μ and γ1 switch regions. It seems that Fig. 77 Chimera human / mouse immunoglobulin heavy chain produced by transswitch Show. The cDNA clone of the transswitch product is a hyperimmunized HC1 tiger. Transgenic-JHD mouse (# 2357; description of animal and immunization plan) (See legend to FIG. 74)). It was generated by reverse transcription and PCR amplification of the compound. 10 randomly picked ku The partial nucleotide sequence of the loan is shown. Lowercase is the coded reproduction Represents a cell line, capital letters indicate a number that cannot be assigned to a known germline sequence. Indicates cleotide. These are somatic mutations, N nucleotides or truncated D segment It is possible that the The double-sided type represents the mouse γ sequence. FIG. 78 Somatic cells in hyperimmunized VH251 transgene rearranged It indicates that it will undergo mutation. Fig. 79 In Fig. 78, the CH1 line 26 showing the primary reaction to the antigen and in Fig. 79 showing the secondary reaction Nucleotide sequence of an IgG heavy chain variable region cDNA clone from a mouse . Germline sequences are shown at the top; nucleotide changes from germline are Described for loans. One cycle shows identity with germline sequences However, the capital letters indicate that no germline source was identified. The array is It is organized according to the usage of the J segment. Each germ cell of J segment The systematic sequence is shown. Lowercase letters within the CDR3 sequence are included within the HC1 transgene. Represents an identity to a rare known D segment. Assigned D segment Table D is at the end of each sequence. Unallocated sequences are in the N region It can be derived from addition or somatic mutation. Or, in some cases, these are simply It is too short to separate random N nucleotides from a known D segment. There are some things that cannot be distinguished. Primary Response of Figure 78: 13 randomly picked VH25 1-γ1 cDNA clone. Four-week-old female HC1 strain 26-JHD mouse ( # 2599) was injected once with KLH and complete Freund's adjuvant. 5 Spleen cell RNA was isolated after a day. Overall frequency of somatic mutations within the V segment The degree is 0.06% (2 / 3,198 bp). Secondary Response of Figure 79: 13 Random VH251-γ1 cDNA clone described in 1. Two-month-old female HCl strain 2 6-JHD mice (# 3204) with HEL and Floy 3 times over 1 month Injecting adjuvant (primary injection was complete adjuvant and booster was 1 Incomplete adjuvant at weeks 3 and 4); spleen and lymph node RN after 4 months A was separated. The overall frequency of humoral mutations within the V segment is 1.6% (5 2/3, 198 bp). Figure 80 Extensive somatic mutations have been shown to be restricted to the γ1 sequence: somatic cells Mutations and class switches occur within the same population of B cells. High against CEA Transgene of HC1 strain 57 immunized once (see Figure 68 for immunization schedule) V isolated from spleen and lymph node cells of ENIC-JHD mouse (# 2357) Partial nucleotide sequence of the H251 cDNA clone. Figure 80: IgM: 23 Randomly picked VH251-μcDNA clone of. The circumference of CDRs 1 and 2 Nucleotide sequence of a 156 bp segment containing the surrounding residues. Whole somatic mutation The target level is 0.1% (5 / 3,744 bp). 81 Figure 81: Randomly picked VH251-γ1 cDNA clones of IgG: 23. N. Nucleotide sequence of a segment containing CDRs 1-3 and surrounding residues. V segment The overall frequency of somatic mutations in the ment is 1.1% (65 / 5,658 bp) It For comparison with the μ sequence in FIG. 80; for the first 156 nucleotides The mutation frequency is 1.1% (41 / 3,588 bp). For explanation of symbols , See legends in Figures 80 and 81. Fig. 82 VH51P1 and VH56P1 show wide body in unimmunized mice Indicates a cell mutation. Female HC2 strain 255 unimmunized at 9 weeks of age 0 transgenic-IgG heavy chain variable regions from JHD mice (# 5250) A partial nucleotide sequence of a region cDNA clone. With 19VH56p1 segment The overall frequency of somatic mutations is 2.2% (101 / 4,674 bp). The overall frequency of somatic mutations within a single VH51p1 segment is 2.0% (5 / 246 bp). See legend to Figures 78 and 79 for explanation of symbols That. Figure 83 A double transgenic mouse with a prayed endogenous Ig locus It contains IgMκ positive B cells. Spleen of 4 mice with different genotypes FACS of cells isolated from E. coli. Left column: control mouse (# 9944, female 6 weeks old) , JH +/−, JCκ +/−; heterozygous wild-type mouse heavy and κ-light chain loci , Non-transgenic). Column 2: Human Heavy Chain Transgenic (# 9877 , Female JH − / −, JCκ − / −, HC2 strain 2550 ± 6 weeks old; disrupted HC2 transgenes homozygous for the mouse heavy and kappa one light chain loci About half-joint). Column 3: Human κ-light chain transgenic (# 9878, Six-week-old female JH-/-, JCκ-/-, KCo4 strain 4437+; disrupted KCo4 transgenes homozygous for the mouse heavy and kappa light chain loci. Semi-jointed about the). Right column: Double transgenic (# 9879, 6 weeks old) Female eyes, JH-/-m JCκ-/-, HC2 strain 2550+, KCo4 strain 4 437+; homozygous for the disrupted mouse heavy and kappa k-light chain loci. , HC2 and KCo4 transgene hemizygous). Upper row: mouse λ light chain ( Splenocytes stained for expression of x-axis) and human kappa light chain (y-axis). Second stage: Human Splenocytes stained for expression of mu heavy chain (x-axis) and human kappa light chain (y-axis), third Row: stained for expression of mouse mu heavy chain (x-axis) and mouse kappa light chain (y-axis). Splenocytes. Bottom row: His of splenocytes stained for expression of mouse B220 antigen. Togram (logarithmic fluorescence: x axis: cell number: y axis). Table for each of the two color plates The relative number of cells in each of the inlaid shown was determined by propidium iodide staining and light scattering. Given as a percentage of the e-parameter gate. Displayed in the lower row The fraction of B220 + cells in each of the It is given as a fraction. FIG. 84 Secreted immunoglobulin levels in the serum of double transgenic mice. 18 individual HC2 / Homozygous for endogenous heavy and kappa 1 light chain locus disruptions Mouse T and λ from KCo4 double transgenic mice and human μ, γ And κ. Mouse: (+) HC2 strain 2550 (up to 5 HC per integration) 2 copies), KCo4 strain 4436 (one or two KCo4 copies per integration) -); (○) HC2 system 2550, KCo4 system 4437 (max. High 10 copies of KCo4); (x) HC2 line 2550, KCo4 line 458 3 (up to 5 copies of KCo4 per integration); (□) HC2 strain 2572 (30-50 HC2 copies per integration, KCo4 strain 4437; (△) HC2 line 5467 (20-30 HC2 Coby, KCo4 for each installation) Line 4437. Figure 85 3 shows a human antibody response to human antigens. Figure 85: Recombinant human soluble CD4 Primary response to. The levels of human IgM and human kappa light chains were determined by four double transgenes. Serum before bleeding (○) and after immunization (●) from EN mice was reported. ing. Fig. 86 Figure 86: Switch to human IgG occurs in vivo. Nonspecific cross reaction 1.5 μ / ml extra IgE, κ and 1% normal mouse serum to inhibit sex Peroxidase-conjugated polyclonal anti-human IgG used in the presence of Was used to detect human IgG (circle). Human kappa light chain (square) is 1% normal Polyclonal anti-human kappa conjugated with peroxidase in the presence of normal mouse serum It was detected using a reagent. One mouse (# 9344; HC2 strain 2550, K Representative results from Co4 line 4436) are shown. Each point has a duplicate It represents the average of the two minus the background absorption. Fig. 87 On a hybridoma that discriminates human CD4 + lymphocytes from human CD8 + lymphocytes Figure 4 shows FACS analysis of human PBL with Qing. FIG. 88 Human α-CD4 IgM anf IgG in the serum of transgenic mice Is shown. Fig. 89 Α-human CD4 hybridoma monoclonal of transgenic mouse, Competitive binding comparing 2C11-8 with RPA-TA and Leu-3A monoclonals This shows a joint experiment. Figure 90 Production data for Ig expression of cultured 2C11-8 hybridomas are shown. You FIG. 91 Homologous recombination targeting for deleting genes such as heavy chain constant region genes 1 schematically shows the structure of the ing transgene. Human transgenic mice of the invention selected from Tables B and C below Immunize with the antigen. A transgenic mouse is a human that binds to the human antigen. Produce antibodies. Using B cells from immunized transgenic mice, A hybridoma secreting a monoclonal antibody against the selected human antigen To make.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／１５５，３０１ (32)優先日 1993年11月18日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／１６１，７３９ (32)優先日 1993年12月３日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／１６５，６９９ (32)優先日 1993年12月10日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２０９，７４１ (32)優先日 1994年３月９日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カイ、ロバート、エム. アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94115、サンフランシスコ、５、ブロードウエーストリート 2127─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (31) Priority claim number 08/155, 301 (32) Priority date November 18, 1993 (33) Priority claiming countries United States (US) (31) Priority claim number 08 / 161,739 (32) Priority date December 3, 1993 (33) Priority claiming countries United States (US) (31) Priority claim number 08 / 165,699 (32) Priority date December 10, 1993 (33) Priority claiming countries United States (US) (31) Priority claim number 08 / 209,741 (32) Priority date March 9, 1994 (33) Priority claiming countries United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV , MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TT, UA, U S, UZ, VN (72) Inventor Kai, Robert, Em. California, United States 94115, San Francisco, 5, Broad Way Street 2127

Claims

Claims: 1. A homozygous pair of a functionally disrupted endogenous heavy chain allele, a homozygous pair of a functionally disrupted endogenous light chain allele, a heterologous immunoglobulin heavy chain trans. A transgenic mouse comprising at least one copy of a gene and at least one copy of a heterologous immunoglobulin heavy chain transgene, which immunizes with an antigen followed by an antibody response. 2. The functionally disrupted endogenous heavy chain allele is a J _H region homologous recombination knockout, and the functionally disrupted endogenous light chain allele is a J _k region homologous recombination knockout. The heterologous immunoglobulin heavy chain transgene is an HC1 or HC2 human minigene transgene, the heterologous light chain transgene is a KC2 or KCle human kappa transgene, and the antigen is a human antigen. 1. The transgenic mouse according to 1. [Claim 3] The transgenic mouse according to claim 1, wherein the antibody response includes a population of antibodies containing human μ chain-containing immunoglobulin and human γ chain-containing immunoglobulin. 4. The antibody response comprises a population of antibodies, the population comprising: heavy and light chains consisting essentially of human sequence variable regions and human sequence constant regions; and human sequences. The transgenic mouse according to claim 1, which comprises an antibody containing a heavy chain basically composed of a variable region and a mouse sequence constant region. 5. The transgenic mouse according to claim 4, wherein the mouse sequence constant region is a mouse γ constant region. 6. The transgenic mouse of claim 1, wherein the heterologous antibody comprises a population of heterologous immunoglobulins that specifically bind to human CD4 with a dissociation constant of about 8 × 10 ⁷ M ⁻¹ . Claim 7 HCl-26 +; JHD ++; JKD ++; KC2-1610 ++; HCl-26 +; JHD ++; JKD ++; KC2-1610 +; HCl-26 +; JHD ++; JKD ++; KCle-1527 +; and HCl-26 The transgenic mouse according to claim 2, which has a genotype selected from the group consisting of +; JHD ++; JKD ++; KCle-1399 +. 8. A genotype selected from the group consisting of HCl-26 +; JHD ++; JKD ++; KCle-1527 + and HCl-26 +; JHD ++; JKD ++; KCle-1399 +, wherein the antibody response is: A population of antibodies comprising a human μ chain-containing immunoglobulin, a human γ chain-containing immunoglobulin, and a chimeric immunoglobulin each containing a heavy chain consisting essentially of a human variable region and a mouse constant region, respectively. The transgenic mouse described. 9. (1) A homozygous functionally disrupted endogenous heavy chain locus comprising at least one mouse constant region gene capable of transswitching, comprising a functional switch recombination sequence, and (2) A transgenic mouse comprising a genome comprising a human heavy chain transgene comprising a functional switch recombination sequence repositionable to encode a functional human heavy chain variable region and capable of undergoing a transswitch. 10. The transgenic mouse of claim 9, further comprising a human light chain transgene that can be rearranged to encode a functional human light chain variable region and expresses a human sequence light chain. 11. The transgenic mouse of claim 9, further comprising a homozygous functionally disrupted cognate light chain locus. 12. A serum comprising an antibody comprising a chimeric heavy and light chain consisting of a human sequence variable region encoded by a human transgene and a mouse constant region sequence encoded by an endogenous mouse heavy chain constant region gene. Item 11. The transgenic mouse according to item 11. 13. The transgenic mouse according to claim 12, wherein the serum further contains an antibody containing a human heavy chain and a light chain consisting essentially of a human variable region and a human constant region. Claim 14 A transgenic mouse comprising serum having a detectable amount of a chimeric heavy chain encoded by a sequence generated by a transswitch between a human transgene and an endogenous mouse heavy chain constant region gene. 15. A transgenic mouse comprising B cells that transswitch to produce a human sequence heavy chain at a first time point and a chimeric heavy chain consisting of a human variable region and a mouse constant region at a second time point. 16. A chimeric antibody comprising a chimeric heavy chain comprising a human sequence heavy chain variable region, a mouse sequence heavy chain constant region and a mouse sequence heavy chain constant region, and further producing a human sequence heavy chain variable region and human sequence heavy chain. A transgenic mouse containing B cells that produce an antibody containing a human heavy chain containing a constant region. 17. The transgenic mouse of claim 16, wherein the chimeric antibody comprises a human sequence light chain. 18. The transgenic mouse of claim 17, wherein the chimeric antibody binds to a predetermined antigen (eg, immunogen) with an affinity of at least about 1 × 10 ⁷ M ⁻¹ . 19. The transgenic mouse according to claim 18, wherein the predetermined antigen is human CD4 or human CEA. 20. Two human V _H gene segments, 8 human D gene segments, 6 human J _H gene segments, 1 human J-μ enhancer, 1 human μ switch region, 1 fully human μ C _H gene, 1 one of the human abortive transcription promoter, one human γ switch region, one has a complete human rC _H gene and genome comprising a human heavy chain transgene comprising a heavy chain 3 'enhancer, human of the unplaced heavy chain transgene Lacking the mouse V _H gene segment, mouse D gene segment, mouse J _H gene segment, mouse C _H gene, mouse switch region, and mouse heavy chain enhancer, the B lymphocytes of this mouse are VDJ jointed. Rearranges the unlocated human heavy chain transgene by Heavy chain and V-D-J genes in-frame joining encoding the variable regions are produced, transgenic mice that are expressed in a polypeptide bond to the encoded constant region by fully human rC _H gene . 21. The human heavy chain transgene comprises a 5.3 kb Hind II I fragment of the human heavy chain locus containing the first exon of the preswitch sterile and the γ1 switch region, and the B lymphocytes are the human. An in-frame joined VDJ gene encoding a heavy chain variable region that is rearranged with the heavy chain transgene and expressed as a human μ or human γ chain in the B lymphocytes of this transgenic mouse. The transgenic mouse according to claim 20, which is formed. 22. The transgene further comprises a 0.7 kb Xba I / Hind III fragment of the human heavy chain locus, wherein the 0.7 kb Xba I / Hind III fragment is essentially immediately upstream of the 5.3 kb γ1 fragment. 22. The transgenic mouse of claim 21, which is comprised of sequences flanking the lever fragment and further comprises a 3.1 kb Xba I fragment flanking upstream of the human heavy chain locus. 23. The human heavy chain transgene comprises a human γ1 constant region comprising an associated exon associated with a switch region and a transcription, and a flanking sequence of about 4 kb upstream from the transcription initiation site, and 5. A rat heavy chain 3'enhancer which can be PCR-amplified with an oligonucleotide primer 5'CAG GAT CCA GAT ATC AGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC31 51GAG CAT GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAG CCT TCC 3'is included. 22. The transgenic mouse according to 22. 24. The transgenic mouse of claim 23, wherein the human heavy chain transgene comprises a NotI insert of pHCl. 25. The transgenic mouse of claim 24, comprising an intact germline copy of one of the NotI inserts of pHCl and expressing in human serum both human μ and human γ1 chains. 26. The human heavy chain transgene undergoes an isotype switch, thus the in-frame joined VDJ gene is first expressed within a peptide bond to the human mu constant region and then the B of the transgenic mouse is expressed. 26. The transgenic mouse of claim 25, which is to encode a human heavy chain variable region expressed in a peptide bond to the human gamma constant region in lymphocytes. 27. A human V _H gene segment, a human D gene segment and a human J _H gene which express human μ and human γ1 chains in serum and have been joined in-frame as a VDJ gene in each human μ or human γ1 chain. A transgenic mouse containing an intact, integrated germline copy of the NotI insert of pHCl or pIGM1, containing a variable region consisting essentially of the polypeptide sequence encoded by the segment. 28. The transgenic mouse of claim 20, further comprising a functionally disrupted endogenous heavy chain locus lacking the mouse _JH gene segment. Refinement 29 An intact human heavy chain transgene which expresses in its serum an immunoglobulin chain which comprises a human or human γ1 constant region and is encoded by said human heavy chain transgene, and which basically consists of a NotI insert of pHCl. Transgenic mice with integrated germline copies. 30. A method for producing an antibody comprising human immunoglobulin in the serum of a transgenic mouse, the step of immunizing the transgenic mouse of claim 1 or 20 with a predetermined antigen and humoral immunity. A method comprising collecting serum from this animal after a suitable time for response. 31. A hybridoma comprising a B cell of the transgenic mouse of claim 1 or 20 fused with a second cell capable of immortalizing the B cell, which is immunized with a predetermined antigen. A hybridoma that regenerates a monoclonal antibody containing a human heavy chain, and the monoclonal antibody binds to the predetermined antigen. 32. The hybridoma according to claim 31, wherein the predetermined antigen is a human antigen. 33. The hybridoma of claim 32, wherein the human antigen is CEA, CD4 or NCA-2. 34. The hybridoma of claim 31, wherein the monoclonal antibody binds a human antigen with an affinity of at least 1 x 10 ⁷ M ^-1 . 35. The hybridoma of claim 31, wherein the hybridoma comprises a functionally disrupted mouse immunoglobulin allele. 36. The hybridoma of claim 34, wherein the monoclonal antibody binds to human CD4 with an affinity of about 8 x 10 ⁷ M ^-1 . 37. A human monoclonal antibody regenerated by the hybridoma according to claim 31. 38. The human monoclonal antibody according to claim 37, wherein the human antigen is CEA, CD4 or NCA-2. 39. The hybridoma of claim 31, wherein the predetermined antigen is human CD antigen. 40. The hybridoma of claim 31, wherein the predetermined antigen is a human non-CD antigen. 41. The hybridoma according to claim 31, wherein the predetermined antigen is a human pathogen or an antigen of a human pathogen.