【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血液中の有害成分を除去
するための吸着体の製造法に関する。さらに詳しくは、
血液あるいは血漿、血清中からリポ蛋白、とくに極低密
度リポ蛋白(VLDL)および（または）低密度リポ蛋白(LD
L) を選択的に吸着除去するための吸着体の製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】血液中に
存在するリポ蛋白のうちVLDL、LDL はコレステロールを
多く含み、動脈硬化の原因となることが知られている。
とりわけ家族性高脂血症などの高脂血症、高コレステロ
ール症においては、正常値の数倍のVLDLおよび（また
は）LDL値を示し、冠動脈の硬化などをひきおこす。
【０００３】これらの疾患の治療には食事療法、薬物療
法が行なわれているが、効果に限度があり、副作用も懸
念されている。とくに家族性高脂血症に対してはVLDL、
LDLを多く含んだ患者の血漿を分離したのち、正常血漿
またはアルブミンなどを成分とする補液と交換してVLDL
値、LDL 値を低下させる、いわゆる血漿交換療法が現在
のところほぼ唯一の効果的な治療法である。
【０００４】しかしながら、血漿交換療法は周知のごと
く、(1) 高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用いる必要
がある、(2) 肝炎ウィルスなどの感染の惧れがある、
(3) 有害成分のみでなく有用成分も同時に除去してしま
う、すなわち、リポ蛋白のばあい、有用である高密度リ
ポ蛋白(HDL) も同時に除去してしまう、などの欠点を有
する。
【０００５】叙上の欠点を解消する目的で膜による有害
成分の選択的除去が試みられているが、選択性の点で満
足できるものはいまだえられていない。
【０００６】また、同じ目的で抗原、抗体などを固定し
た、いわゆる免疫吸着体を用いる試みがなされており、
該方法は選択性の点ではほぼ満足できるものの、用いる
抗原、抗体の入手が困難かつ高価であるという欠点を有
する。
【０００７】さらには、除去対象物質に特異的な親和性
（アフィニティー）を有する物質（以下、リガンドとい
う）を担体に固定した、いわゆるアフィニティークロマ
トグラフィーの原理による吸着体も試みられている。該
方法に用いられるリガンドは抗原、抗体などに比べれば
入手しやすい物質が多いが、生体に由来する物質が多い
ため、体外循環治療に用いるには滅菌操作などに対する
安定性、価格、安全性などの点で満足しうるものはあま
りない。
【０００８】この中でデキストラン硫酸および（また
は）その塩はリガンドとして優れており、これを多孔質
セルロースゲルに共有結合を介して固定することによっ
て、高効率でかつ安全に、しかも選択性よくリポ蛋白を
吸着除去しうる体外循環治療用吸着体がえられる。
【０００９】しかしながら、デキストラン硫酸および
（または）その塩は、固定化反応に利用できる官能基と
して反応性の低い水酸基しかなく、必要量のデキストラ
ン硫酸および（または）その塩を固定するのが困難であ
った。
【００１０】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、デキ
ストラン硫酸および（または）その塩も、担体によって
は効率よく固定できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、多
孔質セルロースゲルとエピクロルヒドリンおよび（また
は）ポリオキシラン化合物とを反応させてエポキシ基を
導入し、ついでデキストラン硫酸および（または）その
塩を反応させて固定する、体外循環治療用リポ蛋白吸着
体の製造法に関する。
【００１２】
【実施例】デキストラン硫酸および（または）その塩と
は、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc
mesenteroides) などにより生産される多糖であるデキ
ストランの硫酸エステルおよび（または）その塩であ
り、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、塩としてはナトリウ
ム、カリウムなどの水溶性塩が好ましい。
【００１３】なお、本発明に使用するデキストラン硫酸
および（または）その塩は、リポ蛋白の吸着効率や安全
性の面から比較的低分子量でかつイオウ含量が高いもの
が望ましい。目安としては、極限粘度が0.12dl/g以下、
イオウ含量が15重量％以上である。
【００１４】本発明でいう極限粘度とは、デキストラン
硫酸および（または）その塩をナトリウム塩とし、中性
の1M食塩水溶液中、25℃で測定したものである。
【００１５】担体として用いられる多孔質セルロースゲ
ルは、他の担体（とくに合成高分子系担体）に比べ、担
体上の単位活性基あたりのデキストラン硫酸および（ま
たは）その塩の固定量が多く、好都合であり、その他に
もつぎのような長所を有している。
【００１６】(1) 機械的強度が高く、カラムなどに充填
して、血液、血漿などの体液を流したばあいの圧力損失
が小さく、目詰りなどをおこしにくい。
【００１７】(2) 充分な大きさの細孔が多数存在し、吸
着除去対象物質が細孔内に侵入できるようにせしめう
る。なお、球状蛋白質およびウィルスを用いて測定した
排除限界分子量は100 万〜１億の範囲が適当である（た
だし排除限界分子量とは細孔内に侵入できない（排除さ
れる）分子のうち最も小さい分子量をもつものの分子量
をいう）。
【００１８】(3) 同様の細孔径、空孔率を有する合成ポ
リマーハードゲルに比べ、強じんで、破砕の恐れが少な
い。
【００１９】(4) 表面に固定化反応に用いうる官能基ま
たは容易に活性化しうる官能基としてヒドロキシル基が
存在する。
【００２０】(5) 高圧蒸気滅菌などの滅菌操作による変
化が少ない。
【００２１】なお、(2) の球状蛋白質およびウィルスを
用いて測定した排除限界分子量（以下、排除限界分子量
という）に関しては、排除限界分子量100 万未満の担体
を用いたばあいには、VLDL、LDL の除去量が小さく実用
に耐えないが、排除限界分子量が100 万〜数百万とVLD
L、LDL の分子量に近い担体でもある程度実用に供しう
るものがえられる。一方、排除限界分子量が１億をこえ
ると、リガンドの固定量が減少して結果的に吸着量が減
り、またゲルの強度も低下するため好ましくない。かか
る理由のため本発明に用いる多孔質セルロースゲルは排
除限界分子量が100 万〜１億の範囲であるのが適当であ
る。
【００２２】また、多孔質セルロースゲルの表面は、合
成高分子などでコーティングされていてもよい。
【００２３】多孔質セルロースゲルの粒子径は小さい方
が吸着能力の点で好ましいが、粒子径があまりに小さく
なるとカラムに充填したばあいの圧力損失が大きくな
り、好ましくなく、１〜5,000 μの範囲であることが好
ましい。
【００２４】デキストラン硫酸および（または）その塩
を多孔質セルロースゲルに固定する方法には種々ある
が、体外循環治療に用いるにはリガンドが脱離しないこ
とが重要であるので、リガンドが結合の強固なエポキシ
基を介して多孔質セルロースゲルに固定されていること
が必要である。
【００２５】固定化方法としては、結合が強固でリガン
ドの脱離の危険性が少ないエピクロルヒドリン法、また
はビスエポキサイドなどのポリオキシラン化合物を用い
る方法が採用される。デキストラン硫酸および（また
は）その塩の固定化量については、有意なリポ蛋白吸着
量をうるにはカラム体積１mlあたり0.2mg 以上が好まし
く、また経済性を考慮すると100mg 以下が望ましい。
【００２６】なお、固定化反応終了後未反応のデキスト
ラン硫酸および（または）その塩は回収して精製などの
工程を経て再使用することもできる。
【００２７】また、デキストラン硫酸および（または）
その塩を固定した多孔質セルロースゲルは、未反応の活
性基をモノエタノールアミンなどで不活性化しておくこ
とが望ましい。
【００２８】本発明による吸着体を体外循環治療に用い
るには種々の方法があるが、入口と出口に体液成分（血
球、蛋白質など）は通過するが吸着体は通過できないフ
ィルター、メッシュなどを装着したカラムに充填し、該
カラムを体外循環回路に組み込み、血液、血漿などの体
液をカラムに通して行なう方法が代表的である。
【００２９】つぎに参考例および実施例をあげて本発明
の方法をさらに詳しく説明するが、本発明はかかる実施
例のみに限定されるわけではない。
【００３０】参考例１
架橋ポリアクリレートであるトヨパールHW65（東洋曹達
（株）製、排除限界分子量5,000,000 、粒子径50〜100
μm ）10mlに飽和NaOH水溶液６ml、エピクロルヒドリン
15mlを加え、攪拌しながら50℃で２時間反応させたの
ち、ゲルをアルコールおよび水の順で洗浄してエポキシ
化されたゲルをえた。導入されたエポキシ基の量は、カ
ラム体積１mlあたり250 μmol であった。
【００３１】えられたゲル２mlに、極限粘度（デキスト
ラン硫酸および（または）その塩をナトリウム塩とし、
中性の1M食塩水溶液中、25℃で測定したもの、以下同
様）0.027dl/g 、イオウ含量17.7重量％のデキストラン
硫酸ナトリウム0.5gおよび水２mlを加えた（デキストラ
ン硫酸ナトリウムの濃度は約13重量％）。ついでpH11に
調整し、45℃で16時間振とう後ゲルを濾別して2M食塩
水、0.5M食塩水および水の順で洗浄してデキストラン硫
酸ナトリウムが固定されたゲルをえた。固定されたデキ
ストラン硫酸ナトリウムの量は、カラム体積１mlあたり
0.4mg であり、エポキシ基１μmol あたりの固定量は1.
6 μg であった。
【００３２】実施例１
多孔質セルロースゲルであるCSKA-3（チッソ（株）製、
排除限界分子量50,000,000、粒子径45〜105 μm ）10ml
に、20％NaOH４g 、ヘプタン12g およびノニオン系界面
活性剤TWEEN20 を１滴加えた。40℃で２時間攪拌後、エ
ピクロルヒドリン５g を加えて２時間攪拌し、ゲルを水
洗濾過してエポキシ化セルロースゲルをえた。導入され
たエポキシ基の量はカラム体積１mlあたり30μmol であ
った。
【００３３】えられたゲル２mlに極限粘度0.027dl/g 、
イオウ含量17.7重量％のデキストラン硫酸ナトリウム0.
12g および水２mlを加え（デキストラン硫酸ナトリウム
の濃度は約2.5 重量％）、pH11に調整して45℃で16時間
振とうした。ゲルを濾別して、2M食塩水、0.5M食塩水お
よび水の順で洗浄し、デキストラン硫酸ナトリウムが固
定されたセルロースゲルをえた。
【００３４】固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの
量はカラム体積１mlあたり0.15mgであり、エポキシ基１
μmol あたりの固定量は５μg であった。
【００３５】実施例２
固定化反応時のデキストラン硫酸ナトリウムの濃度を13
重量％にしたほかは、実施例１と同様にして固定化反応
を行なった。固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの
量はカラム体積１mlあたり2.3mg で、エポキシ基１μmo
l あたりの固定量は76μg であった。
【００３６】試験例
参考例１および実施例１〜２でえられたゲルをモノエタ
ノールアミンを用いて未反応のエポキシ基を不活性化さ
せたのち、それぞれ１mlをカラムに充填し、該カラムに
高脂血症患者の血漿（総コレステロール濃度308mg/dl）
６mlを流し、流出した血漿中のLDL 濃度を総コレステロ
ールを指標として測定した（用いた血漿中のコレステロ
ールはほとんどがLDL に由来するため）。
【００３７】結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【発明の効果】本発明の方法により製造された吸着体を
体外循環治療に用いると、血液あるいは血漿、血清中か
らリポ蛋白、とくに極低密度リポ蛋白(VLDL)および（ま
たは）低密度リポ蛋白(LDL) を選択的に吸着除去しう
る。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing an adsorbent for removing harmful components in blood. For more details,
Lipoproteins, especially very low density lipoprotein (VLDL) and / or low density lipoprotein (LD)
It relates to a method for producing an adsorbent for selectively adsorbing and removing L). [0002] Of the lipoproteins present in blood, VLDL and LDL are known to contain a large amount of cholesterol and cause arteriosclerosis.
In particular, in hyperlipidemia such as familial hyperlipidemia and hypercholesterolemia, VLDL and / or LDL values which are several times higher than the normal value are exhibited, which causes hardening of the coronary arteries. Diets and drug therapies are used to treat these diseases, but their effects are limited and side effects are also a concern. VLDL, especially for familial hyperlipidemia
After separating the plasma of patients containing a large amount of LDL, replace it with normal plasma or a replacement fluid containing albumin as a component and
So-called plasmapheresis, which lowers LDL and LDL levels, is currently the only effective treatment. However, as is well known in plasma exchange therapy, (1) it is necessary to use expensive fresh plasma or plasma preparation, (2) there is a risk of infection with hepatitis virus, etc.
(3) Not only harmful components but also useful components are removed at the same time, that is, in the case of lipoproteins, useful high-density lipoprotein (HDL) is also removed at the same time. Attempts have been made to selectively remove harmful components by means of a membrane for the purpose of eliminating the above-mentioned drawbacks, but no one that is satisfactory in terms of selectivity has been obtained yet. For the same purpose, attempts have been made to use so-called immunoadsorbents on which antigens, antibodies, etc. are immobilized.
Although this method is almost satisfactory in terms of selectivity, it has the drawback that the antigens and antibodies used are difficult and expensive to obtain. Furthermore, an adsorbent based on the principle of so-called affinity chromatography, in which a substance having a specific affinity for the substance to be removed (hereinafter referred to as a ligand) is immobilized on a carrier, has been attempted. Many of the ligands used in the method are more easily available than antigens, antibodies, etc., but many of them are derived from living organisms, and therefore, they are stable against sterilization, cost, and safety when used for extracorporeal circulation treatment. There is not much that can be satisfied in terms of. Among these, dextran sulfate and / or its salt is excellent as a ligand, and by immobilizing this on a porous cellulose gel via a covalent bond, lipoprotein is highly efficient and safe, and with high selectivity. An adsorbent for extracorporeal circulation treatment capable of adsorbing and removing proteins is obtained. However, dextran sulfate and / or its salt have only hydroxyl groups with low reactivity as a functional group available for the immobilization reaction, and it is difficult to immobilize the required amount of dextran sulfate and / or its salt. there were. As a result of intensive studies, the present inventors have found that dextran sulfate and / or its salt can also be efficiently fixed depending on the carrier, and have completed the present invention. [0011] Means for Solving the Problems That is, the present invention provides a multi
Porous cellulose gel and epichlorohydrin and (also
Reacts with a polyoxirane compound to form an epoxy group
Introduced and then dextran sulfate and / or its
The present invention relates to a method for producing a lipoprotein adsorbent for treating extracorporeal circulation , which comprises reacting and fixing salt . [Examples] Dextran sulfate and / or its salt are Leuconostoc (Leuconostoc).
Destran sulfate and / or its salt, which is a polysaccharide produced by mesenteroides, etc., and may be linear or branched, and the salt is preferably a water-soluble salt such as sodium or potassium. It is desirable that the dextran sulfate and / or its salt used in the present invention has a relatively low molecular weight and a high sulfur content in terms of lipoprotein adsorption efficiency and safety. As a guideline, the intrinsic viscosity is 0.12dl / g or less,
The sulfur content is 15% by weight or more. The intrinsic viscosity as referred to in the present invention is measured by using dextran sulfate and / or its salt as a sodium salt in a neutral 1M saline solution at 25 ° C. The porous cellulose gel used as a carrier has a large fixed amount of dextran sulfate and / or its salt per unit active group on the carrier, as compared with other carriers (particularly synthetic polymer carriers), which is convenient. In addition, it has the following advantages. (1) Mechanical strength is high, pressure loss is small when a column or the like is filled with a body fluid such as blood or plasma, and clogging is less likely to occur. (2) A large number of pores having a sufficient size are present so that the substance to be adsorbed and removed can enter the pores. It is appropriate that the exclusion limit molecular weight measured using globular proteins and viruses be in the range of 1 million to 100 million (however, the exclusion limit molecular weight is the smallest of the molecules that cannot enter (exclude) in the pores). Refers to the molecular weight of those with. (3) Compared with a synthetic polymer hard gel having the same pore size and porosity, it is stronger and less likely to be crushed. (4) A hydroxyl group is present on the surface as a functional group that can be used in the immobilization reaction or a functional group that can be easily activated. (5) Little change due to sterilization operations such as high-pressure steam sterilization. Regarding the exclusion limit molecular weight (hereinafter referred to as exclusion limit molecular weight) measured using the globular protein and virus of (2), VLDL, Although the amount of LDL removed is small and not practical, the exclusion limit molecular weight is 1 million to several million and VLD
Even a carrier having a molecular weight close to that of L or LDL can be practically used to some extent. On the other hand, when the exclusion limit molecular weight exceeds 100 million, the amount of immobilized ligand decreases, resulting in a decrease in the amount of adsorption and also the strength of the gel, which is not preferable. For this reason, the exclusion limit molecular weight of the porous cellulose gel used in the present invention is suitably in the range of 1,000,000 to 100,000,000. The surface of the porous cellulose gel may be coated with a synthetic polymer or the like. It is preferable that the particle size of the porous cellulose gel is small in terms of adsorption ability, but if the particle size is too small, pressure loss becomes large when packed in a column, which is not preferable, and it is in the range of 1 to 5,000 μ. Preferably there is. There are various methods for immobilizing dextran sulfate and / or its salt on a porous cellulose gel, but since it is important that the ligand is not detached for use in extracorporeal circulation therapy, the binding of the ligand is strong. Epoxy
It is necessary to be fixed to the porous cellulose gel through the base . [0025] In the immobilization how the method of using a polyoxirane compound such as binding epichlorohydrin method risk of elimination with less robust ligand or a bis epoxide, is employed. The immobilized amount of dextran sulfate and / or its salt is preferably 0.2 mg or more per 1 ml of the column volume in order to obtain a significant lipoprotein adsorption amount, and is preferably 100 mg or less in consideration of economy. After the completion of the immobilization reaction, the unreacted dextran sulfate and / or its salt can be recovered and reused after a step such as purification. Also, dextran sulfate and / or
It is desirable that the unreacted active groups of the porous cellulose gel having the salt immobilized thereon be inactivated with monoethanolamine or the like. There are various methods of using the adsorbent according to the present invention for extracorporeal circulation treatment, but a filter, mesh, etc., which allows passage of body fluid components (blood cells, proteins, etc.) but not the adsorbent, is attached to the inlet and outlet. A typical method is to fill the above column, install the column in an extracorporeal circulation circuit, and pass a body fluid such as blood or plasma through the column. Next, the method of the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited to such Examples. Reference Example 1 Cross-linked polyacrylate Toyopearl HW65 (manufactured by Toyo Soda Co., Ltd., exclusion limit molecular weight 5,000,000, particle size 50-100)
μm) 10 ml saturated aqueous NaOH solution 6 ml, epichlorohydrin
After adding 15 ml and reacting at 50 ° C. for 2 hours with stirring, the gel was washed with alcohol and water in this order to obtain an epoxidized gel. The amount of introduced epoxy groups was 250 μmol / ml column volume. 2 ml of the obtained gel was treated with an intrinsic viscosity (dextran sulfate and / or its salt as a sodium salt,
Measured at 25 ° C in a neutral 1M saline solution, the same shall apply hereinafter) 0.027 dl / g, 0.5 g of dextran sulfate sodium having a sulfur content of 17.7% by weight and 2 ml of water were added (concentration of sodium dextran sulfate was about 13% by weight). %). Then, the pH was adjusted to 11, and after shaking at 45 ° C. for 16 hours, the gel was filtered off and washed with 2M saline, 0.5M saline and water in this order to obtain a dextran sodium sulfate-immobilized gel. The fixed amount of dextran sulfate sodium per column volume of 1 ml
It is 0.4 mg, and the fixed amount per 1 μmol of epoxy group is 1.
It was 6 μg. Example 1 A porous cellulose gel CSKA-3 (manufactured by Chisso Corporation,
Exclusion limit molecular weight 50,000,000, particle size 45-105 μm) 10 ml
To this was added 4 g of 20% NaOH, 12 g of heptane and 1 drop of the nonionic surfactant TWEEN20. After stirring at 40 ° C. for 2 hours, 5 g of epichlorohydrin was added and stirred for 2 hours, and the gel was washed with water and filtered to obtain an epoxidized cellulose gel. The amount of epoxy groups introduced was 30 μmol per 1 ml of column volume. 2 ml of the obtained gel has an intrinsic viscosity of 0.027 dl / g,
Dextran sulfate sodium with a sulfur content of 17.7% by weight.
12 g and 2 ml of water were added (concentration of dextran sulfate sodium was about 2.5% by weight), pH was adjusted to 11, and the mixture was shaken at 45 ° C. for 16 hours. The gel was separated by filtration and washed with 2M saline, 0.5M saline and water in this order to obtain a dextran sodium sulfate-immobilized cellulose gel. The amount of immobilized dextran sulfate sodium was 0.15 mg per 1 ml of column volume, and the amount of epoxy group 1
The fixed amount per μmol was 5 μg. Example 2 The concentration of sodium dextran sulfate during the immobilization reaction was adjusted to 13
The immobilization reaction was performed in the same manner as in Example 1 except that the content was changed to wt%. The amount of immobilized dextran sulfate sodium was 2.3 mg per 1 ml of column volume, and the epoxy group was 1 μmo.
The fixed amount per l was 76 μg. Test Example The gels obtained in Reference Example 1 and Examples 1 and 2 were inactivated by using monoethanolamine to inactivate unreacted epoxy groups, and 1 ml of each was packed in a column, and the column was packed in the column. Plasma of hyperlipidemic patients (total cholesterol concentration 308 mg / dl)
6 ml was poured, and the LDL concentration in the outflowing plasma was measured using total cholesterol as an index (since most of the cholesterol in the plasma used was derived from LDL). The results are shown in Table 1. [Table 1] EFFECTS OF THE INVENTION When the adsorbent produced by the method of the present invention is used for extracorporeal circulation therapy, lipoproteins, particularly very low density lipoprotein (VLDL) and / or low levels in blood, plasma or serum are obtained. Density lipoprotein (LDL) can be selectively adsorbed and removed.