JP6257156B2

JP6257156B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP6257156B2
Application number: JP2013041685A
Authority: JP
Inventors: 高見澤　伸拡; 伸拡高見澤
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2033-03-04
Also published as: US20140247337A1; EP2775336B1; JP2014170105A; US9784959B2; EP2775336A1

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、複数のセルをアレイ状に配置したマルチチャンネル検出器（光電子増倍管、ＰＭＴ）を備える走査型共焦点顕微鏡装置（ＬＳＭ）が知られている（例えば、特許文献１参照。）。該ＬＳＭは、標本に導入した蛍光試薬の蛍光波長プロファイルを短時間で取得できようになっている。また、該ＬＳＭは、蛍光波長に合わせて複数のセルをグループ化して各セルの出力を加算することで、単一のＰＭＴのように使用することができ、波長選択の自由度の向上とフィルタレス化を実現することができるようになっている。

特開２０１０−２５０１０２号公報

しかしながら、特許文献１に記載の走査型共焦点顕微鏡装置（ＬＳＭ）で使用するマルチチャンネル検出器は、セル毎に感度を調整することができないため、感度調整するときは加算する対象ではないセルも含めて全てのセルを同じ感度で一括して調整することになる。
したがって、一つのセルに励起光のような強い光が入射するとそのセルは感度劣化を起こしやすくなり、セルが不必要な感度劣化を起こしてしまうという問題が生じる。

本発明は、光検出器の不必要な劣化を防ぐことができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられた照明光を標本上で互いに交差する２方向に走査させる走査部と、前記標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のセルを有し、セルごとの感度調整が可能な光検出器と、該光検出器の前記複数のセルを使用するグループと使用しないグループとに分け、検出しようとする前記蛍光の波長に対応する前記セルを前記使用するグループに分類し、それ以外の前記セルを前記使用しないグループに分類するグルーピング制御部と、前記セルごとに印加する電圧を変更することによって、前記グル―ピング制御部によりグループ分けされた前記使用しないグループの前記セルの感度をＯＦＦまたは前記使用するグループの前記セルの感度に対して低減する感度制御部とを備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、標本から発せられた蛍光は、対物レンズにより集光されて分光素子によりスペクトル成分に分光された後、光検出器の複数のセルにスペクトル成分ごとに入射する。光検出器においては、グルーピング制御部により複数のセルが使用するグループと使用しないグループとに分けられ、使用するグループのセルに入射した蛍光のスペクトル成分がそれぞれ検出される。

この場合において、感度制御部により、使用しないグループのセルの感度をＯＦＦまたは使用するグループのセルの感度よりも低減することで、使用しないグループのセルに標本からの蛍光や、励起光のような蛍光よりも強度が強い光が入射することにより光検出器が不必要に劣化することを防ぐことができる。

上記発明においては、前記グルーピング制御部によりグループ分けされたセルのグループ設定を蛍光試薬ごとに登録する登録部を備え、前記走査部が、一方の走査方向の走査タイミングに同期する第１同期信号と他方の走査方向の走査タイミングに同期する第２同期信号とを前記感度制御部に入力する入力手段を備え、前記感度制御部が、前記走査部の入力手段から入力される前記第１同期信号または前記第２同期信号に同期して、前記登録された１の蛍光試薬に対するグループ設定に応じた感度制御から他の蛍光試薬に対するグループ設定に応じた感度制御に切り替えることとしてもよい。

このように構成することで、感度制御部により、蛍光波長の重なり（クロストーク）を除去しつつ、使用しないグループのセルの感度劣化を抑えて光検出器の不必要な劣化を防ぐことができる。

本発明によれば、光検出器の不必要な劣化を防ぐことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。図１のマルチチャンネル検出器の各セルのＯＮ／ＯＦＦ状態を示す図である。本発明の一実施形態の第１変形例に係るマルチチャンネル検出器の各セルの条件１のときのＯＮ／ＯＦＦ状態を示す図である。本発明の一実施形態の第１変形例に係るマルチチャンネル検出器の各セルの条件２のときのＯＮ／ＯＦＦ状態を示す図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、図１に示すように、標本（図示略）を載置するステージ１と、レーザ光（励起光）を発生する光源３と、光源３から発せられたレーザ光を反射して標本上で走査させるスキャナ（走査部）５と、スキャナ５により反射されたレーザ光を標本に照射し、標本において発生する蛍光を集光する対物レンズ７とを備えている。図１において、符合９は、スキャナ５からのレーザ光を反射して対物レンズ７に入射させる反射ミラーを示している。

また、顕微鏡装置１００は、光源３からのレーザ光をスキャナ５に向けて反射する一方、標本から対物レンズ７を介して光路を戻る蛍光を透過させるダイクロイックミラー１１と、ダイクロイックミラー１１を透過した蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール１３と、共焦点ピンホール１３を通過した蛍光を波長ごとのスペクトル成分に分光する分光素子１５と、分光素子１５により分光されたスペクトル成分を検出する複数のセル２１を有するマルチチャンネル検出器（光検出器）２０と、光源３およびマルチチャンネル検出器２０を制御等するＰＣ（ＰｅｒｓｏｎａｌＣｏｍｐｕｔｅｒ）３０と、標本の画像等を表示したりユーザから指示が入力されたりするディスプレイ１７とを備えている。

スキャナ５は、互いに交差する揺動軸回りに揺動可能な一対のガルバノミラー（図示略、走査ミラー）を備えており、これら一対のガルバノミラーの揺動角度を変化させることで、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、スキャナ５は、標本上においてレーザ光を２次元的に走査させることができるようになっている。

共焦点ピンホール１３は、対物レンズ７の瞳位置と共役な位置に配置されており、標本上におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させることができるようになっている。
分光素子１５としては、例えば、プリズムや回折格子が用いられる。

マルチチャンネル検出器２０は、複数のセル２１が１次元に配列されて構成されており、セル２１ごとに、分光素子１５により分光されたそれぞれ異なる波長の光が入射されるようになっている。また、マルチチャンネル検出器２０は、セル２１ごとに感度調整することができるようになっている。

各セル２１は、検出したスペクトル成分の輝度を電気信号に変換してＰＣ３０に送るようになっている。マルチチャンネル検出器２０としては、例えば、３２個のセル６５が１次元に配列されて構成される３２ＣＨマルチアノードＰＭＴ（浜松ホトニクス社製）を採用することができる。

ＰＣ３０は、ユーザからの指示に従い、マルチチャンネル検出器２０の複数のセル２１を使用するグループと使用しないグループとに分けるグルーピング制御部３１と、各セル２１の感度を制御する感度制御部３３と、各セル２１から送られてくる輝度の電気信号に基づいて標本の画像を生成する画像生成部３５とを備えている。

感度制御部３３は、グルーピング制御部３１によりセル２１がグループ分けされると、使用するグループのセル２１ａには電圧（ＨＶ）を印加し（ＯＮ）、一方、使用しないグループに分けられたセル２１ｂには電圧（ＨＶ）を印加しない（ＯＦＦ）ようになっている。これにより、感度制御部３３は、使用するグループのセル２１ａの感度をＯＮし、使用しないグループのセル２１ｂの感度をＯＦＦするようになっている。

ディスプレイ１７は、画像生成部３５により生成された標本の画像を表示するモニタを構成するとともに、ＧＵＩ（グラフィカル・ユーザ・インタフェース）を構成するようになっている。ディスプレイ１７に表示されるＧＵＩにより、ユーザは、マルチチャンネル検出器２０の各セル２１のグループを選択したり、光源３から発生させるレーザ光の波長を選択したりすることができるようになっている。

また、ディスプレイ１７には、標本の画像の他に、マルチチャンネル検出器２０のセル２１のＯＮ／ＯＦＦ状況を表示したり、グループごとのセル２１の番号やレーザ光の波長等を表示したりすることができるようになっている。

このように構成された顕微鏡装置１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００を用いて標本を観察するには、まず、ユーザにより、蛍光試薬によって多重染色した標本をステージ１に載置するとともに、分光素子１５の設定やマルチチャンネル検出器２０のセル２１のグループ分けおよびレーザ光の選択等を行う。

本実施形態においては、蛍光試薬として、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を用いることとする。
ユーザは、例えば、４５０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長域の蛍光がマルチチャンネル検出器２０に入射して、セル２１ごとの検出波長範囲が１０ｎｍとなるように分光素子１５を設定する。

また、ユーザは、ディスプレイ１７に表示されるＧＵＩから、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光ピーク波長域にあたる７番と８番（５００−５２０ｎｍ）の２つのセル２１と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の蛍光ピーク波長域にあたる１５番と１６番（５８０−６００ｎｍ）の２つのセル２１を選択する。さらに、ユーザは、光源３から発生させるレーザ光として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の励起波長（４８８ｎｍ）のレーザ光と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の励起波長（５４３ｎｍ）のレーザ光を選択する。

すると、ＰＣ３０のグルーピング制御部３１により、マルチチャンネル検出器２０の複数のセル２１の内、７番，８番，１５番および１６番のセル２１が使用するグループに分けられ、１−６番，９番−１４番および１７−３２番のセル２１が使用しないグループに分けられる。

このときディスプレイ１７には、例えば、７番および８番のセル２１ａがＧｒｏｕｐ１、励起波長が４８８ｎｍのレーザ光がＬａｓｅｒ１として表示され、１５番および１６番のセル２１ａがＧｒｏｕｐ２、励起波長が５４３ｎｍのレーザ光がＬａｓｅｒ２として表示される。

そして、感度制御部３３により、図２に示すように、使用するグループ１，２のセル２１ａ（７番，８番，１５番および１６番）の感度がＯＮされ、一方、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の励起波長のレーザ光の反射光が入射するセル２１ｂ（５番および１１番）の感度と、使用しないグループの他のセル２１ｂ（１−４番，６番，９番，１０番，１２−１４番および１７−３２番）の感度がＯＦＦされる。

次いで、光源３を作動させ、選択した励起波長のレーザ光を発生させる。例えば、励起波長が４８８ｎｍのレーザ光を光源３から発生させると、そのレーザ光は、ダイクロイックミラー１１により反射された後、スキャナ５において各ガルバノミラーにより反射されて、反射ミラー９を介して対物レンズ７により標本に照射される。

標本にこのレーザ光が照射されると、蛍光試薬のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ７により集光され、反射ミラー９およびスキャナ５を介して光路を戻り、ダイクロイックミラー１１を透過する。

そして、ダイクロイックミラー１１を透過した蛍光の内、標本におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみが共焦点ピンホール１３を通過し、分光素子１５によりスペクトル成分に分光される。分光されたスペクトル成分は、それぞれマルチチャンネル検出器２０の波長域が対応するセル２１に入射し、セル２１ごとにそれぞれの波長の輝度に応じた電気信号に変換されてＰＣ３０に送られる。

スキャナ５により画像の１フレーム分が走査されるまでこの動作が続けられ、画像生成部３５により、各セル２１から送られてくる輝度の電気信号に基づいて標本の画像が生成される。これにより、蛍光標識としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を利用した標本の画像がディスプレイ１７に表示される。

次に、励起波長が５４３ｎｍのレーザ光を光源３から発生させると、励起波長が４８８ｎｍのレーザ光と同様にして標本に照射され、蛍光試薬のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６が励起されて蛍光が発生する。標本において発生した蛍光は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光と同様にして、分光素子１５によりスペクトル成分に分光された後、マルチチャンネル検出器２０の波長域が対応するセル２１により検出される。そして、各セル２１からそれぞれの波長の輝度に応じた電気信号がＰＣ３０に送られる。

スキャナ５により画像の１フレーム分が走査されるまでこの動作が続けられ、各セル２１から送られてくる輝度の電気信号に基づいて、画像生成部３５により標本の画像が生成される。これにより、蛍光標識としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を利用した標本の画像がディスプレイ１７に表示される。

この場合において、標本にレーザ光が照射されることにより発生した蛍光とともに、標本において反射されたレーザ光が蛍光と同一の光路を通ってマルチチャンネル検出器２０に入射されるが、感度制御部３３により、使用しないグループのセル２１ｂの感度をＯＦＦすることで、所望の波長域（本実施形態においては、５００−５２０ｎｍおよび５８０−６００ｎｍ）以外の蛍光や標本において反射されたレーザ光が、使用しないグループの波長域が対応するセル２１ｂに入射し不必要な感度劣化を引き起こすことを抑制することができる。

具体的には、使用しないグループの１−６番，９番−１４番および１７−３２番のセル２１ｂに対して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の蛍光ピーク波長域以外のスペクトル成分が入射することによる検出器の不必要な劣化を抑制するとともに、５番および１１番のセル２１ｂに対して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の励起波長のレーザ光の反射光が入射することによる検出器の劣化も抑制することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１００によれば、感度制御部３３により、使用しないグループのセル２１ｂの感度をＯＦＦすることで、使用しないグループのセル２１ｂに標本からの蛍光や、レーザ光のような蛍光よりも強度が強い光が入射することによりマルチチャンネル検出器２０が不必要に劣化することを防ぐことができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、ＰＣ３０が、グルーピング制御部３１により蛍光試薬ごとにグループ分けされたセル２１のグループ設定を登録する登録部（図示略）を備え、感度制御部３３が、登録部に登録されている蛍光試薬ごとのセル２１のグループ設定に従い、スキャナ５のガルバノミラーの走査タイミングに同期して各セル２１の感度を各蛍光試薬に対応して交互に切り替えることとしてもよい。

また、スキャナ５が、一方のガルバノミラーの走査タイミングに同期する水平同期信号（第１同期信号）と、他方のガルバノミラーの走査タイミングに同期する垂直同期信号（第２同期信号）とを感度制御部３３に送る信号出力部（入力手段、図示略）を備えることとしてもよい。

また、感度制御部３３が、例えば、スキャナ５の信号出力部から送られてくる水平同期信号に同期して各セル２１の感度を切り替え、画像生成部３５が、蛍光試薬ごとに、輝度の電気信号を蓄積して標本の画像を生成することとすればよい。

このように構成された本変形例に係る顕微鏡装置１００の作用について説明する。
ユーザが、ディスプレイ１７に表示されるＧＵＩから、蛍光試薬の蛍光ピーク波長域にあたるセル２１を選択するとともに、その蛍光試薬の励起波長のレーザ光を選択すると、グルーピング制御部３１により、マルチチャンネル検出器２０の複数のセル２１が使用するグループと使用しないグループとに分けられ、感度制御部３３により、使用するグループのセル２１ａの感度がＯＮされ、励起光が入射するセル２１と、使用しないグループの他のセル２１ｂの感度がＯＦＦされるところまでは上記本実施形態と同様である。

本変形例においては、図３に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光ピーク波長域にあたる使用するグループのセル２１ａ（７番，８番）の感度をＯＮし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８のレーザ光が入射するセル２１ｂ（５番）および使用しないグループの他のセル２１ｂ（１−４番，６番，９−３２番）の感度をＯＦＦする設定が、登録部に条件１として登録される。

また、図４に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６の蛍光ピーク波長域にあたる使用するグループのセル２１ａ（１５番，１６番）の感度をＯＮし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６のレーザ光が入射するセル２１ｂ（１１番）および使用しないグループの他のセル２１ｂ（１−１０番，１２−１４番，１７−３２番）の感度をＯＦＦする設定が、登録部に条件２として登録される。

そして、光源３からレーザ光が発せられて、スキャナ５により標本上でレーザ光の走査が開始されると、感度制御部３３により、登録部に登録されている条件１，２の設定に従い、スキャナ５から送られてくる水平同期信号に同期して、各セル２１の感度が条件１，２間で交互に切り替えられる。

これにより、スキャナ５が１ラインを走査する度に各セル２１のＯＮ／ＯＦＦが各蛍光試薬に対応して交互に切り替えられ、画像生成部３５により、蛍光試薬ごとの標本の画像が生成される。
このようにすることで、蛍光波長の重なり（クロストーク）を除去しつつ、使用しないグループのセル２１ｂの感度劣化を抑えて、マルチチャンネル検出器２０の不必要な劣化を防ぐことができる。

本変形例においては、感度制御部３３が、セル２１の感度を水平同期信号に同期して切り替えることとしたが、これに代えて、感度制御部３３が、セル２１の感度を垂直同期信号に同期して切り替えることとしてもよい。このようにすることで、スキャナ５が画像の１フレーム分を走査する度に各セル２１のＯＮ／ＯＦＦが各蛍光試薬に対応して交互に切り替えられ、画像生成部３５により、蛍光試薬ごとの標本の画像が生成される。

また、上記一実施形態においては、感度制御部３３が、使用しないグループのセル２１ｂの感度をＯＦＦすることとしたが、第２変形例としては、感度制御部３３が、使用しないグループのセル２１ｂの感度を使用するグループのセル２１ａの感度に対して低減することとしてもよい。

このようにすることで、使用しないグループのセル２１ｂの感度を使用するグループのセル２１ａの感度と同じにする場合と比較して、使用しないグループのセル２１ｂに標本からの蛍光や、レーザ光のような蛍光よりも強度が強い光が入射されることによりマルチチャンネル検出器２０が不必要に劣化することを防ぐことができる。

以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の一実施形態およびその変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、例えば、上記一実施形態および変形例においては、蛍光試薬としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を例示して説明したが、これに限定されるものではない。また、使用するグループのセル２１ａと使用しないグループのセル２１ｂは、採用する蛍光試薬に応じて選択するものであり、上記一実施形態および変形例に例示したものに限定されるものではない。

５スキャナ
７対物レンズ
１５分光素子
２０マルチチャンネル検出器（光検出器）
２１セル
３１グルーピング制御部
３３感度制御部
１００顕微鏡装置

Claims

光源から発せられた照明光を標本上で互いに交差する２方向に走査させる走査部と、
前記標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のセルを有し、セルごとの感度調整が可能な光検出器と、
該光検出器の前記複数のセルを使用するグループと使用しないグループとに分け、検出しようとする前記蛍光の波長に対応する前記セルを前記使用するグループに分類し、それ以外の前記セルを前記使用しないグループに分類するグルーピング制御部と、
前記セルごとに印加する電圧を変更することによって、前記グルーピング制御部によりグループ分けされた前記使用しないグループの前記セルの感度をＯＦＦまたは前記使用するグループの前記セルの感度に対して低減する感度制御部とを備える顕微鏡装置。
前記グルーピング制御部によりグループ分けされたセルのグループ設定を蛍光試薬ごとに登録する登録部を備え、
前記走査部が、一方の走査方向の走査タイミングに同期する第１同期信号と他方の走査方向の走査タイミングに同期する第２同期信号とを前記感度制御部に入力する入力手段を備え、
前記感度制御部が、前記走査部の入力手段から入力される前記第１同期信号または前記第２同期信号に同期して、前記登録された１の蛍光試薬に対するグループ設定に応じた感度制御から他の蛍光試薬に対するグループ設定に応じた感度制御に切り替える請求項１に記載の顕微鏡装置。