KR101629576B1 - 다파장 형광 이미지를 획득하는 장치 및 방법 - Google Patents

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김동욱
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한국기초과학지원연구원
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Abstract

샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치가 개시된다. 일 실시예는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부, 상기 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 상기 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경하는 광 조명부, 상기 복수의 변조 광 신호가 상기 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부, 상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조 주파수와 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 기초로 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 제어부를 포함한다

Description

다파장 형광 이미지를 획득하는 장치 및 방법{APPRTUS AND METHOD FOR OBTAINING MULTI-WAVELENGTH FLUORESCENCE IMAGE}
아래 실시예들은 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치 및 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법에 관한 것이다.
다색 형광 현미경 기술은 살아있는 세포나 조직의 관심영역을 서로 다른 형광 물질로 염색하고, 형광 물질을 광원으로 여기시킴에 따라 방출하는 형광 신호를 검출함으로써 세포 내 성분의 공간적 관계나 시간적 역학을 관찰할 수 있고, 다르게 염색된 개체 간의 잠재적인 분자 상호 작용을 모니터링할 수 있다. 그러나, 다양한 색의 형광 물질이 개발되었음에도 불구하고 형광 물질의 형광 스펙트럼 중복 때문에 동시에 이미징하는 다색 형광 현미경 기술에서 제한적으로 사용된다. 형광 스펙트럼이 중복된 2개 이상의 형광 물질을 구별하기 위해 유용한 형광 신호의 상당한 손실을 감안하면서도 좁은 통과 대역폭의 방출 필터(emission filter)들을 사용하여 중복된 형광 신호를 제거한다. 또한, 이러한 과정에서 약해진 형광 신호의 세기 증가를 위해 여기 광원의 세기를 증가시키지만, 증가된 여기 광원에 의해 살아있는 시료의 광독성(phototoxicity)이 발생하여 형광 신호 증가에 한계가 있다.
다색 형광 현미경 기술의 단점을 보완하는 종래 기술로는 멀티트랙킹(multitracking) 방법과 스펙트럼 이미징 방법이 있다. 멀티트랙킹(multitracking) 방법은 여기 광원의 스위칭에 의해 개별 형광 물질을 순차적으로 여기시켜 단일 형광 신호를 검출 방법으로 공초점 레이저 스캔 현미경에서 주로 사용된다. 스펙트럼 이미징 방법은 선형 언믹싱(linear unmixing) 이미지 분석을 이용하여 람다 스택(lambda stack)으로부터 혼합된 형광 신호를 분리하고 각 형광 물질의 공간적 분포를 구별한다.
대부분의 형광 물질은 형광 스펙트럼이 20~60 nm로 넓고 비대칭적이기 때문에 다색 형광 현미경 기술에서 형광 스펙트럼 중복은 필연적이며 특히, 서로 다른 형광 물질을 사용해야 하는 세포 내 co-localization 조사나 FRET(fluorescence resonance energy transfer), FRAP(fluorescence recovery after photobleaching) 응용분야에 필요한 단일 형광 신호의 정량적 측정에 대한 결과 분석을 어렵게 만든다.
2007년01월09일에 공개된 공개공보 제10-2007-0004821호가 있다. 상기 공개공보에는 내부에 형광 단백질을 가지는 검체 쪽으로 여기 광을 투사하기 위하여 변형된 분명한 광원을 포함하며, 상기 여기 광은 상기 검체에 들어가서 상기 검체 안에서 내부 광이 되고, 상기 내부 광은 상기 형광 단백질로부터 형광을 여기시키도록 변형되며, 상기 내부 광과 상기 형광이 확산되는 것을 특징으로 하는 광학 단층 촬영 시스템이 개시된다.
본 발명의 일 실시예는 다양한 형광 물질을 사용할 때 발생하는 형광 스펙트럼 중복에 의한 다색 형광 현미경 기술의 단점을 보완할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.
일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부; 상기 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 상기 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경하는 광 조명부; 상기 복수의 변조 광 신호가 상기 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및 상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조 주파수와 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 기초로 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 제어부를 포함한다.
상기 광 검출부는, 제1 광 검출기 및 제2 광 검출기 중 어느 하나를 이용하여 상기 복수의 형광 신호를 검출한다.
상기 제1 광 검출기가 이용되는 경우, 상기 제어부는, 미리 정해진 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 형광 이미지의 픽셀값에 반영함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득한다.
상기 미리 정해진 시간은 상기 형광 이미지의 픽셀과 대응하는 시간이다.
상기 제2 광 검출기가 이용되는 경우, 상기 제어부는, 미리 정해진 시간(t)동안 상기 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 상기 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득한다.
상기 미리 정해지 시간은 상기 형광 이미지를 획득하는 시간이다.
다른 일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부; 상기 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 상기 샘플을 스캔하는 스캐닝부; 상기 스캔을 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및
상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 형광 이미지의 픽셀값으로 반영하여 상기 형광 이미지를 획득하는 제어부를 포함한다.
또 다른 일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부; 상기 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사하는 광 조사부; 상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및 미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 제어부를 포함한다.
일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법은 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계; 상기 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 상기 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경하는 단계; 상기 복수의 변조 광 신호가 상기 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출하는 단계; 상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 복수의 변조 주파수 각각과 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 기초로 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.
상기 복수의 형광 신호를 검출하는 단계는, 제1 광 검출기 및 제2 광 검출기 중 어느 하나를 이용하여 상기 복수의 형광 신호를 검출한다.
상기 제1 광 검출기가 이용되는 경우, 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 단계는, 미리 정해진 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 형광 이미지의 픽셀값에 반영함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득한다.
상기 미리 정해진 시간은 상기 형광 이미지의 픽셀과 대응하는 시간이다.
상기 제2 광 검출기가 이용되는 경우, 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 단계는, 미리 정해진 시간(t) 동안 상기 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t동안 검출된 복수의 형광 신호를 상기 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득한다.
상기 미리 정해지 시간은 상기 형광 이미지를 획득하는 시간이다.
다른 일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법은 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계; 상기 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 상기 샘플을 스캔하는 단계; 상기 스캔을 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 형광 이미지의 픽셀값으로 반영하여 상기 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.
또 다른 일 측에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법은 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계; 상기 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사하는 단계; 상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 단계; 및 미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예는 FRET, FRAP을 통한 단백질의 상호작용의 정략적 분석 응용 분야와 세포 내에서 합성된 형광 단백질(형광 스펙트럼 중복이 넓음)을 통한 유전자 발현의 유무와 위치 또는 시간 등을 효율적으로 측정 및 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 다양한 형광 물질을 사용할 때 발생하는 형광 스펙트럼 중복에 의한 다색 형광 현미경 기술의 단점을 보완할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 형광 신호의 고속 퓨리에 변환을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 이용한 형광 이미지의 획득을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 이용한 형광 이미지의 획득을 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 8는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 통한 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 9는 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 통한 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
이하, 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
도 1은 일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치(이하, 획득 장치)는 여기 광원부(110), 광 조명부(120), 광 검출부(140), 및 제어부(150)를 포함한다.
여기 광원부(110)는 다양한 파장과 대역폭을 갖는 광 신호를 출력할 수 있다. 샘플(130)의 세포 또는 샘플(130)의 관심 영역은 형광 물질로 염색될 수 있다. 광 신호가 샘플(130)에 인가되는 경우, 형광 물질은 광 신호에 의해 여기된다. 상기 여기(excitation)에 기초하여, 형광 신호가 발생한다.
제어부(150)는 변조 신호(151)를 여기 광원부(110)에 인가할 수 있고, 여기 광원부(110)는 변조 신호(151)를 기초로 광 신호를 변조할 수 있다. 여기 광원부(110)는 서로 다른 변조 주파수(예를 들어, f1, f2, 및 fn)로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다. 즉, 여기 광원부(110)는 제1 변조 주파수로 변조된 제1 변조 광 신호, 제2 변조 주파수로 변조된 제2 변조 광 신호, 및 제n 변조 주파수로 변조된 제n 변조 광 신호를 출력할 수 있다. 제1 변조 광 신호, 제2 변조 광 신호, 및 제n 변조 광 신호 각각은 서로 다른 파장을 갖는다.
광 조명부(120)는 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플(130)에 인가되도록 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경한다. 복수의 변조 광 신호는 2색성 거울(121) 및 대물 렌즈(122)를 통해 샘플에 인가될 수 있다. 예를 들어, 광 조명부(120)는 광 분배기를 이용하여 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경할 수 있다. 또한, 광 조명부(120)는 면 조명(widefield illumination)과 점 조명(point illumination)이 가능할 수 있다. 또한, 광 조명부(120)는 2색성 거울(121) 또는 2색성 이상의 거울을 이용하여 여기 광원부(110)에서 출력된 복수의 변조 광 신호와 샘플(130)에서 방출된 형광 신호를 구분할 수 있다.
복수의 변조 광 신호가 샘플(130)에 인가된다. 예를 들어, 제1 변조 주파수로 변조된 제1 변조 광 신호, 제2 변조 주파수로 변조된 제2 변조 광 신호, 및 제n 변조 주파수로 변조된 제n 변조 광 신호가 샘플(130)에 인가된다. 샘플(130)에 포함된 형광 물질은 제1 변조 광 신호를 흡수하고, 제1 변조 광 신호에 의해 여기되어 제1 형광 신호를 방출한다. 제1 형광 신호는 제1 변조 광 신호의 제1 변조 주파수로 변조될 수 있다. 마찬가지로, 다른 형광 물질은 제2 변조 광 신호를 흡수할 수 있고, 흡수에 의해 여기되며, 여기에 따라 제2 형광 신호를 방출한다. 다른 형광 물질이 방출하는 제2 형광 신호는 제2 변조 광 신호의 제2 변조 주파수로 변조될 수 있다.
샘플(130)에 포함된 복수의 형광 물질 중 어느 하나는 샘플(130)에 인가된 복수의 변조 광 신호 중 어느 하나를 흡수함에 따라 여기된다. 여기를 기초로 상기 형광 물질은 형광 신호를 방출하고, 방출된 형광 신호는 상기 형광 물질이 흡수한 변조 광 신호의 변조 주파수로 변조될 수 있다.
광 검출부(140)는 복수의 변조 광 신호가 샘플(130)에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출한다.
제어부(150)는 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환한다. 예를 들어, 제어부(150)는 검출된 복수의 형광 신호에 고속 퓨리에 변환(Fast Fourier Transform, FFT)을 적용할 수 있다. 도 4를 참조하면서, 설명한다.
도 4는 일 실시예에 따른 형광 신호의 고속 퓨리에 변환을 설명하기 위한 도면이다.
도 4의 (a)는 제어부(150)가 광 검출부(140)로부터 전달받은 복수의 형광 신호이다. 즉, 도 4의 (a)는 광 검출부(140)가 제어부(150)로 출력한 복수의 형광 신호에 대한 정보이다. 도 4의 (a)에서 점선은 변조 주파수 f1로 변조된 형광 신호를 나타내고, 실선은 변조 주파수 f2로 변조된 형광 신호를 나타낸다. 제어부(150)는 검출된 복수의 형광 신호에 고속 퓨리에 변환을 적용할 수 있다.
도 4의 (b)는 고속 퓨리에 변환의 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (b)를 참조하면, 점선은 변조 주파수 f1로 변조된 형광 신호의 스펙트럼을 나타내고, 실선은 변조 주파수 f2로 변조된 형광 신호의 스펙트럼을 나타낸다. 도 4의 (b)에서 확인할 수 있듯이, 검출된 복수의 형광 신호는 서로 다른 주파수 성분을 갖고, 제어부(150)는 파장 필터를 사용하지 않고, 복수의 형광 신호 각각을 분리할 수 있다.
다시 도 1로 돌아와서, 제어부(150)는 주파수 영역의 신호에서 복수의 변조 주파수 각각과 대응하는 성분을 추출한다. 예를 들어, 제어부(150)는 주파수 영역의 신호에서 변조 주파수 f1로 변조된 형광 신호의 세기값을 추출할 수 있고, 변조 주파수 f2로 변조된 형광 신호의 세기값을 추출할 수 있다. 이 때, 추출된 형광 신호의 세기값은 단위가 없다. 제어부(150)는 추출된 성분을 기초로 샘플의 형광 이미지를 획득한다.
일 실시예에 있어서, 광 검출부(140)는 단일 포인트 광 검출기를 이용하여 복수의 형광 신호를 검출할 수 있다.
단일 포인트 광 검출기는 하나의 검출 영역(예를 들어, 이미지의 픽셀)을 갖는 광 검출기일 수 있다. 예를 들어, 단일 포인트 광 검출기는 포토 다이오드, 광 증배관일 수 있다. 이하, 도 5를 참조하면서, 단일 포인트 광 검출기를 이용하는 형광 이미지 획득을 설명한다.
도 5는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 이용한 형광 이미지의 획득을 설명하기 위한 도면이다.
단일 포인트 광 검출기가 이용되는 경우, 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치는 레이저 빔 스캐너를 포함할 수 있다. 레이저 빔 스캐너는 샘플을 레스터(raster) 스캔할 수 있다. 레스터 스캔 시, 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가될 수 있다. 스캐닝되는 동안, 샘플에서 복수의 형광 신호가 발생하고, 단일 포인트 광 검출기는 복수의 형광 신호를 연속적으로 검출할 수 있다. 도 5의 (a)를 살펴보면, 단일 포인트 광 검출기는 동시에 복수의 형광 신호를 검출할 수 있고, 끊김없이 연속적으로 복수의 형광 신호를 검출할 수 있다. 제어부(150)는 검출된 복수의 형광 신호를 이미지의 픽셀과 대응하는 시간마다 샘플링할 수 있고, 샘플링된 신호를 디지털 신호로 복원할 수 있다. 도 5의 (a)에서, 제어부(150)는 픽셀 1과 대응하는 시간 동안의 복수의 형광 신호를 디지털화할 수 있고, 디지털화된 신호에 FFT를 적용할 수 있다. 또한, 제어부(150)는 픽셀 2와 대응하는 시간 동안의 복수의 형광 신호를 디지털화할 수 있고, 디지털화된 신호에 FFT를 적용할 수 있다.
픽셀 1과 대응하는 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호는 서로 다른 변조 주파수를 가지므로, 변조 주파수에 따라 분리될 수 있다. 마찬가지로, 픽셀 2와 대응하는 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호는 서로 다른 변조 주파수를 가지므로, 변조 주파수에 따라 분리될 수 있다. 제어부(150)는 픽셀에 대응하는 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환할 수 있다. 제어부(150)는 변조 주파수에서 변조된 형광 신호의 세기값을 추출할 수 있다. 제어부(150)는 추출된 세기값을 픽셀의 픽셀값으로 반영할 수 있다.
제어부(150)는 변조 주파수 별로 형광 이미지를 획득할 수 있다. 예를 들어, 제어부(150)는 변조 주파수 f1에 대한 형광 이미지를 획득할 수 있고, 변조 주파수 f2에 대한 형광 이미지를 획득할 수 있다.
다시 도 1로 돌아와서, 광 검출부(140)는 멀티 포인트 광 검출기를 이용하여 복수의 형광 신호를 검출할 수 있다.
멀티 포인트 광 검출기는 검출 영역이 1D 또는 2D 배열을 이루는 광 검출기일 수 있다. 예를 들어, 멀티 포인트 광 검출기는 CCD 카메라일 수 있다. CCD 카메라는 검출 영역이 2D 배열이므로 한 번의 검출로 이미지를 획득할 수 있다. 도 6을 참조하면서 설명한다.
도 6은 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 이용한 형광 이미지의 획득을 설명하기 위한 도면이다.
도 6의 (a)를 참조하면, 변조 주파수 f1로 변조된 변조 광 신호와 변조 주파수 f2로 변조된 변조 광 신호를 기초로 두 개의 형광 물질에서 발생한 두 개의 형광 신호 중 어느 하나는 변조 주파수 f1로 변조되고 나머지 하나는 f2 로 변조된다. 도 6의 (a)의 점선으로 표시된 형광 신호는 변조 주파수 f1로 변조된 형광 신호이고, 실선으로 표시된 형광 신호는 변조 주파수 f2로 변조된 형광 신호이다. 상기 두 개의 형광 신호는 시간에 따라 세기가 변한다.
두 개의 변조 광 신호는 샘플의 모든 영역에 같이 조사되고, 상기 조사를 기초로 발생하는 형광 신호들은 멀티 포인트 광 검출기에 의해 연속적으로 검출된다. 멀티 포인트 광 검출기의 한 번의 검출을 통해 하나의 이미지가 획득될 수 있다. 연속적으로 형광 신호가 검출되는 경우, 형광 신호의 검출 횟수만큼의 이미지가 획득될 수 있다.
연속적으로 형광 신호가 검출되는 경우, 도 6의 (b)와 같이 3차원 데이터 배열(x, y, t)을 획득할 수 있다. 데이터 배열의 점(x, y)는 멀티 포인트 광 검출기로 획득한 이미지의 픽셀을 의미한다. 이미지의 획득시간 동안 검출된 3차원 데이터 배열의 점(x, y)에 해당하는 값들은 도 6의 (c)와 같이 연속적인 형광 신호를 샘플링하여 복원한 디지털 신호와 같다. 여기서, 도 6의 (c)에는 변조 주파수 f1로 변조된 형광 신호에 대한 디지털 신호가 표시된다.
디지털 신호에 고속 퓨리에 변환이 적용될 수 있다. 복수의 형광 신호는 서로 다른 변조 주파수를 가지므로, 주파수 영역에서 변조 주파수 별로 분리될 수 있다. 제어부(150)는 각각의 변조 주파수에서 형광 신호의 세기값을 추출할 수 있다. 제어부(150)는 추출한 세기값을 이미지의 픽셀의 픽셀값(상기 (x, y)값)으로 반영할 수 있다.
제어부(150)는 변조 주파수 별로 형광 이미지를 획득할 수 있다. 예를 들어, 제어부(150)는 변조 주파수 f1에 대한 형광 이미지를 획득할 수 있고, 변조 주파수 f2에 대한 형광 이미지를 획득할 수 있다.
다시 도 1로 돌아와서, 일 실시예에 따른 획득 장치는 변조 주파수로 변조된 형광 신호를 검출하기 때문에 형광 스펙트럼이 중첩된 복수의 형광 신호가 동시에 검출되어도 주파수 도메인으로 변환하여 각 변조 주파수에 대한 성분만 추출하고, 파장 간 중복 없이 형광 신호를 분리 검출할 수 있다.
도 2는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치(이하, 획득 장치)를 설명하기 위한 도면이다.
획득 장치는 여기 광원부(210), 스캐닝부(220), 광 검출부(230), 및 제어부(240)를 포함한다.
여기 광원부(210)는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다.
스캐닝부(220)는 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 샘플을 스캔한다. 예를 들어, 스캐닝부(220)는 레이저 빔 스캐너를 통해 샘플을 레스터 스캔할 수 있다.
광 검출부(230)는 스캔을 기초로 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출한다. 광 검출부(230)는, 예를 들어, 포토 다이오드, 광증배관을 포함할 수 있다.
제어부(240)는 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환한다. 또한, 제어부(240)는 주파수 영역의 신호에서 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 세기값을 형광 이미지의 픽셀값으로 반영하여 형광 이미지를 획득한다.
도 1, 도 4, 및 도 5를 통해 기술된 사항들은 도 2를 통해 기술된 사항들에 적용될 수 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
도 3은 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치(이하, 획득 장치)를 설명하기 위한 도면이다.
획득 장치는 여기 광원부(310), 광 조사부(320), 광 검출부(330), 및 제어부(340)를 포함한다. 여기 광원부(310)는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다.
광 조사부(320)는 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사한다. 예를 들어, 광 조사부(320)는 샘플의 모든 영역에 복수의 변조 광 신호를 조사할 수 있다.
광 검출부(330)는 상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출한다. 예를 들어, 광 검출부는 2D 검출영역을 갖는 CCD 카메라를 포함할 수 있다.
제어부(340)는 미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성한다. 또한, 제어부(340)는 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출한다. 또한, 제어부(340)는 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득한다. 도 1, 도 4, 및 도 6를 통해 기술된 사항들은 도 3를 통해 기술된 사항들에 적용될 수 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
도 7은 일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
일 실시예에 따른 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법은 이미지 획득 장치에 의해 수행될 수 있다.
이미지 획득 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다(710).
이미지 획득 장치는 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경한다(720).
이미지 획득 장치는 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출한다(730). 여기서, 복수의 형광 신호는 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조될 수 있다.
이미지 획득 장치는 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환한다(740).
이미지 획득 장치는 복수의 변조 주파수 각각과 대응하는 성분을 추출한다(750).
이미지 획득 장치는 추출된 성분을 기초로 샘플의 형광 이미지를 획득한다(760).
예를 들어, 이미지 획득 장치는 단일 포인트 광 검출기를 이용하여 복수의 형광 신호를 동시에 검출할 수 있다. 이미지 획득 장치는 미리 정해진 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호에 고속 퓨리에 변환을 적용할 수 있다. FFT의 적용 결과, 미리 정해진 시간 동안 검출된 복수의 형광 신호는 주파수 영역의 신호로 변환될 수 있다. 여기서, 미리 정해진 시간은 형광 이미지의 픽셀과 대응하는 시간일 수 있다. 주파수 영역의 신호에서, 이미지 획득 장치는 변조 주파수와 대응하는 성분값을 추출할 수 있고, 추출된 성분값을 형광 이미지의 픽셀 값에 적용할 수 있다. 이미지 획득 장치는 형광 스펙트럼의 중복이 없는 형광 이미지를 획득할 수 있다.
다른 일례로, 이미지 획득 장치는 멀티 포인트 광 검출기를 이용하여 복수의 형광 신호를 동시에 검출할 수 있다. 이미지 획득 장치는 검출된 복수의 형광 신호를 미리 정해진 시간 동안 연속 저장할 수 있다. 여기서, 미리 정해진 시간은 형광 이미지의 획득 시간일 수 있다. 이미지 획득 장치는 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 3차원 데이터 배열(x, y, t)을 생성할 수 있다. 또한, 이미지 획득 장치는 3차원 데이터 배열에서 (x, y)에 대해 t동안의 일련의 신호를 고속 퓨리에 변환할 수 있다. 또한, 이미지 획득 장치는 주파수 영역의 신호에서 변조 주파수의 성분값을 추출할 수 있고, 추출된 성분값을 상기 (x, y)의 값으로 적용함으로써 형광 이미지를 획득할 수 있다.
도 8는 일 실시예에 따른 단일 포인트 광 검출기를 통한 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다. 도 8을 통해 기술되는 방법은 획득 장치에 의해 수행될 수 있다.
획득 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다(810).
획득 장치는 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 상기 샘플을 스캔한다(820).
획득 장치는 스캔을 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출한다(830).
획득 장치는 상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환한다(840).
획득 장치는 상기 주파수 영역의 신호에서 변조된 형광 신호의 세기값을 추출한다(850),
획득 장치는 상기 세기값을 형광 이미지의 픽셀값으로 반영하여 상기 형광 이미지를 획득한다(860).
도 1, 도 4, 및 도 5를 통해 기술된 사항들은 도 8를 통해 기술된 사항들에 적용될 수 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
도 9는 일 실시예에 따른 멀티 포인트 광 검출기를 통한 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법을 설명하기 위한 순서도이다. 도 9를 통해 기술되는 방법은 획득 장치에 의해 수행될 수 있다.
획득 장치는 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력한다(910).
획득 장치는 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사한다(920).
획득 장치는 상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출한다(930).
획득 장치는 미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성한다(940).
획득 장치는 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환한다(950).
획득 장치는 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출한다(960).
획득 장치는 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득한다(970).
도 1, 도 4, 및 도 6를 통해 기술된 사항들은 도 9를 통해 기술된 사항들에 적용될 수 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
다색 형광 현미경 기술의 단점을 보완하는 멀티트랙킹 방법은 여기 광원의 스위칭(선택)을 위해 음향 광학 파장 가변 필터(acousto-optic tunable filter, AOTF)를 사용한다. 음향 광학 파장 가변 필터는 압전 변환기(piezoelectric transducer)와 크리스탈로 구성되며 압전 변환기에 인가된 라디오 주파수(radio frequency, RF) 신호의 주파수 및 세기를 변화시켜 출력 파장 선택 및 출력 세기를 변화시킬 수 있다. 음향 광학 파장 가변 필터에 사용되는 크리스탈(Tellurium Dioxide, Quartz)은 가시 영역에서 적외선 영역까지 빛을 통과 시킬 수 있어 필터의 최대 파장 가변 범위는 매우 넓다. 그러나, 일반적으로 파장 가변 허용범위는 압전 변환기의 전기-음향 대역폭(electro-acoustic bandwidth)이 1 옥타브 이하로 제한되기 때문에 한정된 파장 영역으로 제한된다. 또한, 음향 광학 파장 가변 필터의 통과 파장 대역폭도 크리스탈의 분산 상수(dispersion constant), 여기 광원의 입사각, 크리스탈 내부의 음향-광학 상호작용 길이(acousto-optic interaction length)에 의해 고정되어 있어 여기 광원의 파장 대역폭(full width half maximum, FWHM)에 따라 필터 성능 최적화 설계가 필요하다.
다색 형광 현미경 기술의 단점을 보완하는 스펙트럼 이미징 방법은 3차원 파장별 이미지 스택(x, y, λ)을 얻은 후 linear unmixing 이미지 분석을 이용한 이미지 처리 기술로 구성이 복잡하고 비용이 매우 고가이기 때문에 기술의 활용도가 떨어진다.
본 발명에 따른 일 실시예는 변조된 여기 광원에 의해 발생하는 변조된 형광 신호를 검출하기 때문에 형광 스펙트럼이 중첩된 다수의 형광 신호가 동시에 검출되어도 주파수 도메인으로 변환하여 각 변조 주파수에 대한 성분만 추출하면 파장 간 중복 없이 형광 신호를 분리 검출할 수 있다. 파장 대역폭이 수 nm인 연속파 레이저 광원과 수십 nm인 펄스 레이저 광원 모두 초퍼, 셔터와 같은 기계적인 장치나 광원 구동 전류를 제어하는 전기적 신호를 사용하여 간단하고 쉽게 광원의 세기를 변조시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 종래기술인 멀티트랙킹 방법과 달리, 여기 광원의 파장 영역이나 파장 대역폭에 대한 제한이 없어 다양한 형광물질을 이용하여 동시에 다 채널 형광 이미징을 위한 장치를 쉽고 용이하게 구현 할 수 있다.
이상에서 설명된 장치는 하드웨어 구성요소, 소프트웨어 구성요소, 및/또는 하드웨어 구성요소 및 소프트웨어 구성요소의 조합으로 구현될 수 있다. 이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

Claims (16)

  1. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부;
    상기 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 상기 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경하는 광 조명부;
    상기 복수의 변조 광 신호가 상기 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및
    상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조 주파수와 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 기초로 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 제어부
    를 포함하고,
    상기 제어부는,
    미리 정해진 시간(t)동안 상기 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 상기 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득하는,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광 검출부는,
    단일 포인트 광 검출기 및 멀티 포인트 광 검출기 중 어느 하나를 이용하여 상기 복수의 형광 신호를 검출하고,
    상기 단일 포인트 광 검출기는, 포토 다이오드 및 광증배관 중 적어도 하나를 포함하고,
    상기 멀티 포인트 광 검출기는, CCD(Charge Coupled Device)를 포함하는,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미리 정해지 시간은 상기 형광 이미지를 획득하는 시간인,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치.
  7. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부;
    상기 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 상기 샘플을 스캔하는 스캐닝부;
    상기 스캔을 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및
    미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하며, 상기 t동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 서로 다른 변조 주파수 각각에 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 제어부
    를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치.
  8. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 여기 광원부;
    상기 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사하는 광 조사부;
    상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 광 검출부; 및
    미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 제어부
    를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 장치.
  9. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계;
    상기 복수의 변조 광 신호가 복수의 형광 물질을 포함하는 샘플에 인가되도록 상기 복수의 변조 광 신호의 경로를 변경하는 단계;
    상기 복수의 변조 광 신호가 상기 샘플에 인가됨을 기초로 발생한 복수의 형광 신호를 검출하는 단계;
    상기 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 복수의 변조 주파수 각각과 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 기초로 상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하고,
    상기 샘플의 형광 이미지를 획득하는 단계는,
    미리 정해진 시간(t) 동안 상기 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t동안 검출된 복수의 형광 신호를 상기 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용함을 기초로 상기 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하는,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 복수의 형광 신호를 검출하는 단계는,
    단일 포인트 광 검출기 및 멀티 포인트 광 검출기 중 어느 하나를 이용하여 상기 복수의 형광 신호를 검출하는 단계
    를 포함하고,
    상기 단일 포인트 광 검출기는, 포토 다이오드 및 광증배관 중 적어도 하나를 포함하고,
    상기 멀티 포인트 광 검출기는, CCD(Charge Coupled Device)를 포함하는,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제9항에 있어서,
    상기 미리 정해지 시간은 상기 형광 이미지를 획득하는 시간인,
    샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법.
  15. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계;
    상기 복수의 변조 광 신호가 샘플에 인가되도록 상기 샘플을 스캔하는 단계;
    상기 스캔을 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 단계; 및
    미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 저장하고, 상기 저장된 복수의 형광 신호를 이용하여 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하며, 상기 t동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하여 상기 서로 다른 변조 주파수 각각에 대응하는 성분을 추출하고, 상기 추출된 성분을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법.
  16. 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 변조 광 신호를 출력하는 단계;
    상기 복수의 변조 광 신호를 샘플에 조사하는 단계;
    상기 조사를 기초로 상기 서로 다른 변조 주파수로 변조된 복수의 형광 신호를 검출하는 단계; 및
    미리 정해진 시간(t)동안 검출된 복수의 형광 신호를 기초로 (x, y, t)로 정의되는 3차원 데이터 배열을 생성하고, 상기 t 동안 검출된 복수의 형광 신호를 주파수 영역의 신호로 변환하고, 상기 주파수 영역의 신호에서 상기 변조된 형광 신호의 세기값을 추출하고, 상기 세기값을 상기 3차원 데이터 배열의 (x, y)값으로 적용하여 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하는 샘플의 형광 이미지를 획득하는 방법.
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