JP6229502B2 - Method for producing cell culture substrate having temperature responsiveness - Google Patents
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Description
本発明は、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a cell culture substrate having temperature responsiveness.
再生医療では細胞をシート状に加工した細胞シートによる治療が行われている。細胞培養基材を用いて培養された細胞を剥離させるためには、酵素処理のような方法で接着性タンパク質を破壊する必要があった。その際、結合していた細胞同士は離れてしまうという課題があった。これに対し、温度応答性を有する細胞培養基材を用いて細胞を培養した場合、低損傷で細胞を剥離させることが可能である。 In regenerative medicine, treatment with a cell sheet obtained by processing cells into a sheet shape is performed. In order to peel cells cultured using a cell culture substrate, it was necessary to destroy the adhesive protein by a method such as enzyme treatment. At that time, there was a problem that the cells that were bound to each other were separated. On the other hand, when cells are cultured using a cell culture substrate having temperature responsiveness, the cells can be detached with low damage.
特許文献１では、細胞培養基材に温度応答性ポリマーの原料であるモノマー水溶液を塗布し、放射線照射によって基材表面に温度応答性ポリマーを固定化している。この方法は、放射線重合で製造することで開始剤の添加が不要になっている点では優れているが、現在汎用的に使われている温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのモノマーには神経毒性があるため製造環境の安全性担保が難しくなるという問題点がある。 In Patent Document 1, a monomer aqueous solution that is a raw material of a temperature-responsive polymer is applied to a cell culture substrate, and the temperature-responsive polymer is immobilized on the surface of the substrate by irradiation with radiation. This method is excellent in that it does not require addition of an initiator by being produced by radiation polymerization, but it is a monomer of poly-N-isopropylacrylamide, which is a temperature-responsive polymer currently used for general purposes. Has a problem that it is difficult to guarantee the safety of the manufacturing environment because of its neurotoxicity.
特許文献２では基材表面に重合開始剤を固定化し、リビングラジカル重合法によって直鎖型の温度応答性ポリマーを基材に固定化している。この方法は精密に温度応答性ポリマーの鎖長と密度を制御することで細胞接着、剥離性を厳密に設計できる点で優れているが、基材の化学的な処理が煩雑であること、重合時間が長くて生産性が低いことが問題として挙げられる。 In Patent Document 2, a polymerization initiator is immobilized on the surface of a substrate, and a linear temperature-responsive polymer is immobilized on the substrate by a living radical polymerization method. This method is excellent in that the cell adhesion and peelability can be designed precisely by precisely controlling the chain length and density of the temperature-responsive polymer, but the chemical treatment of the substrate is complicated, polymerization The problem is that the time is long and the productivity is low.
特許文献３では、細胞培養基材上にアクリル酸エステル系モノマーと無機材料の複合体の層を形成し、その表面に開始剤層を塗布した後、温度応答性ポリマーの原料であるモノマーの水溶液を塗布してＵＶを照射し、温度応答性ポリマー層を固定化している。この方法では、細胞培養基材上に温度応答性ポリマー層を固定化するための前段階の工程が煩雑であり、毒性の高いモノマーを使用しているため製造環境の安全性の確保が課題であった。 In Patent Document 3, a layer of a complex of an acrylate monomer and an inorganic material is formed on a cell culture substrate, an initiator layer is applied to the surface, and then an aqueous solution of a monomer that is a raw material for a temperature-responsive polymer Is applied and irradiated with UV to immobilize the temperature-responsive polymer layer. In this method, the previous step for immobilizing the temperature-responsive polymer layer on the cell culture substrate is complicated, and since a highly toxic monomer is used, it is necessary to ensure the safety of the production environment. there were.
本発明者は、モノマーの重合による温度応答性ポリマー層の形成方法は効率的である一方で、部位によりモノマーの重合度が異なる場合や、基材間でモノマーの重合度が異なる場合があり、温度応答性等の品質にばらつきが生じるという問題があることを見出した。一方、あらかじめ重合させておいた温度応答性ポリマーはモノマーの二重結合に相当するような反応性官能基が残存していないため、電子線照射のみでは基材への充分な固定化が困難であるという課題があった。 The present inventor, while the method of forming a temperature-responsive polymer layer by polymerization of the monomer is efficient, the degree of polymerization of the monomer differs depending on the site, the degree of polymerization of the monomer may be different between the substrates, It has been found that there is a problem that the quality such as temperature responsiveness varies. On the other hand, since the temperature-responsive polymer that has been polymerized in advance does not have reactive functional groups corresponding to the double bonds of the monomers, it is difficult to sufficiently fix the substrate to the substrate only by electron beam irradiation. There was a problem that there was.
そこで本発明は、細胞培養基材の製造方法において、品質のばらつきと製造上の毒性の課題を解決し、かつ基材への温度応答性ポリマーの固定化を安定的に行う方法を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a method for solving a problem of quality variation and production toxicity in a method for producing a cell culture substrate and stably immobilizing a temperature-responsive polymer on the substrate. With the goal.
本発明者は、温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む塗工液を基材に配置し、塗工液が乾固する前に放射線を照射して温度応答性ポリマーを基材に固定化することにより、毒性のあるモノマーを用いることなく、また品質のばらつきなく、温度応答性ポリマーを基材に安定的に固定化できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventor places a coating liquid containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent and a solvent on the substrate, and irradiates the radiation before the coating liquid dries to fix the temperature-responsive polymer to the substrate. As a result, it has been found that a temperature-responsive polymer can be stably immobilized on a substrate without using toxic monomers and without variations in quality, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法であって、
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む塗工液を基材に配置する工程、および
基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含み、
放射線の照射を塗工液が乾固する前に実施する、
前記方法。
（２）塗工液が２〜１５重量％の温度応答性ポリマーを含む、（１）に記載の方法。
（３）放射線として、１００〜５００ｋＧｙの線量の電子線を照射する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）架橋剤が、ビスアクリルアミド系架橋剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for producing a cell culture substrate having temperature responsiveness,
A step of placing a coating liquid containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent, and a solvent on the substrate, and immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate by irradiating the coating liquid disposed on the substrate with radiation. Including the steps of:
Perform radiation before the coating solution dries.
Said method.
(2) The method according to (1), wherein the coating liquid contains 2 to 15% by weight of a temperature-responsive polymer.
(3) The method according to (1) or (2), wherein an electron beam with a dose of 100 to 500 kGy is irradiated as radiation.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the temperature-responsive polymer is poly-N-isopropylacrylamide.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the crosslinking agent is a bisacrylamide-based crosslinking agent.
本発明によれば、毒性の高いモノマーを使用しないため、製造上の安全性が高い。また、塗工液の乾燥工程が不要であるため、温度応答性ポリマーをムラなく固定化でき、安定的に製品を製造することが可能になる。 According to the present invention, since a highly toxic monomer is not used, production safety is high. Moreover, since the drying process of a coating liquid is unnecessary, a temperature-responsive polymer can be fixed uniformly and a product can be manufactured stably.
本発明は、細胞を培養して細胞シートを形成し、これを非浸襲的に回収するのに好適な、温度応答性を有する細胞培養基材の製造方法に関する。本発明の細胞培養基材の製造方法は、温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む塗工液を基材に配置する工程、および基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程を含む。本発明の方法では、放射線を照射する工程を塗工液が乾固する前に実施することから、塗工液の膜を均一に形成することにより、温度応答性ポリマーをムラなく基材に固定化でき、温度応答性を有する細胞培養基材を精度よく製造することが可能である。 The present invention relates to a method for producing a temperature-responsive cell culture substrate suitable for culturing cells to form a cell sheet and collecting it noninvasively. The method for producing a cell culture substrate of the present invention includes a step of placing a coating solution containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent, and a solvent on the substrate, and irradiating the coating solution placed on the substrate with radiation. A step of immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate. In the method of the present invention, since the step of irradiating the radiation is performed before the coating solution is dried, the temperature-responsive polymer is fixed to the substrate without unevenness by uniformly forming the coating solution film. It is possible to manufacture a cell culture substrate having temperature responsiveness with high accuracy.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着面）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、培養された細胞シートを細胞培養基材から分離させることで、細胞シートの回収をより一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。 The temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is hydrophobic at the cell culture temperature (usually about 37 ° C.) and hydrophilic at the temperature at the time of recovering the cultured cell sheet. The temperature at which the temperature-responsive polymer changes from hydrophobic to hydrophilic (critical solution temperature in water (T)) is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of recovery of the cell sheet after culture, The temperature is preferably lower than the cell culture temperature. By including such a temperature-responsive polymer component, since cell scaffolds (cell adhesion surfaces) are sufficiently secured during cell culture, cell culture can be performed efficiently. On the other hand, at the time of collecting the cell sheet after culturing, the hydrophobic part is changed to hydrophilic, and the cultured cell sheet is separated from the cell culture substrate, thereby making it easier to collect the cell sheet. be able to. In particular, a temperature-responsive polymer that exhibits hydrophilicity at a temperature lower than a predetermined critical dissolution temperature and exhibits hydrophobicity at a temperature equal to or higher than the same temperature is preferable. The critical solution temperature in such a temperature-responsive polymer is particularly called the lower critical solution temperature.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。さらに、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。これらのポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは他のポリマーとの混合物を用いてもよい。 Specifically, the temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is preferably a polymer having a lower critical solution temperature T of 0 to 80 ° C, preferably 0 to 50 ° C. If T exceeds 80 ° C., the cells may die, which is not preferable. If T is lower than 0 ° C., the cell growth rate is generally extremely reduced, or the cells are killed, which is not preferable. Such suitable polymers include acrylic polymers or methacrylic polymers. Specific suitable polymers include, for example, poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.), poly-Nn-propyl acrylamide (T = 21 ° C.), poly-Nn-propyl methacrylamide (T = 32 ° C.), poly-N-ethoxyethyl acrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T = about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.) ), And poly-N, N-diethylacrylamide (T = 32 ° C.). Furthermore, poly-N-ethylacrylamide, poly-N-isopropylmethacrylamide, poly-N-cyclopropylacrylamide, poly-N-cyclopropylmethacrylamide, poly-N-acryloylpyrrolidine, poly-N-acryloylpiperidine, polymethyl Examples include alkyl-substituted cellulose derivatives such as vinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyalkylene oxide block copolymers represented by block copolymers of polypropylene oxide and polyethylene oxide, and polyalkylene oxide block copolymers. Can be mentioned. Graft or block copolymers of these polymers with other polymers, or mixtures with other polymers may be used.
温度応答性ポリマーの重量平均分子量は、特に制限されないが、１００万以下であることが好ましく、６０万以下であることがより好ましく、４０万以下であることが特に好ましく、かつ５０００以上であることが好ましい。分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、１〜６程度であることが好ましい。重量平均分子量が１００万を超えると粘度が著しく高くなるため、ポリマーの重合中の溶剤の撹拌や再沈殿などのポリマーの精製作業に支障がでる、あるいは希釈剤として用いる水や有機溶媒が多量に必要となる場合があり、また、重量平均分子量が５０００を下回ると耐水性や耐熱性が低下する場合がある。 The weight average molecular weight of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but is preferably 1,000,000 or less, more preferably 600,000 or less, particularly preferably 400,000 or less, and 5000 or more. Is preferred. The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) is preferably about 1 to 6. When the weight average molecular weight exceeds 1,000,000, the viscosity becomes extremely high, which may hinder the purification of the polymer such as stirring and reprecipitation of the solvent during polymerization of the polymer, or a large amount of water or organic solvent used as a diluent. It may be necessary, and when the weight average molecular weight is less than 5000, water resistance and heat resistance may be lowered.
温度応答性ポリマーは、分子量に応じてグラフト密度を調整することが好ましい。例えば、比較的分子量の小さいポリマーは密に固定化し、比較的分子量の大きいポリマーは疎に固定化することが好ましい。 The temperature-responsive polymer preferably adjusts the graft density according to the molecular weight. For example, it is preferable to fix a polymer having a relatively small molecular weight densely and to fix a polymer having a relatively large molecular weight loosely.
架橋剤としては、放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤が好ましく用いられる。放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤として、好ましくは上記温度応答性ポリマーを形成するモノマーとは異なるものを用いる。例えば、温度応答性ポリマーとしてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いる場合、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド以外の架橋剤を用いる。それにより、製造上のモノマーによる毒性の問題を回避できるとともに、機器分析による架橋点の数の定量が容易となる。 As the crosslinking agent, a crosslinking agent having two or more radiation-reactive functional groups is preferably used. As the crosslinking agent having two or more radiation-reactive functional groups, a different one from the monomer that forms the temperature-responsive polymer is preferably used. For example, when poly-N-isopropylacrylamide is used as the temperature-responsive polymer, a crosslinking agent other than N-isopropylacrylamide is used. Thereby, the problem of toxicity due to the monomer in production can be avoided, and the number of crosslinking points can be easily determined by instrumental analysis.
放射線反応性官能基、例えば電子線反応性官能基は、放射線（例えば電子線）を照射することにより、基材に共有結合で結合することができるものであれば特に制限されない。放射線反応性官能基は、高エネルギー照射下でラジカルを形成することができる部分であり、放射線源にさらされるとフリーラジカルを発生し、架橋およびグラフトを達成する。放射線反応性官能基は、用いる温度応答性ポリマーにより適宜選択されるが、例えば、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、アジ基、一級、二級または三級の脂肪族基、脂環式基、ベンジル基などの芳香族基などが挙げられる。架橋剤は、これらの放射線反応性官能基を１種類のみ有するものでもよいし、複数種有するものでもよい。 A radiation-reactive functional group, for example, an electron beam-reactive functional group, is not particularly limited as long as it can be covalently bonded to a substrate by irradiation with radiation (for example, an electron beam). Radiation-reactive functional groups are moieties that can form radicals under high energy irradiation, generate free radicals when exposed to a radiation source, and achieve crosslinking and grafting. The radiation-reactive functional group is appropriately selected depending on the temperature-responsive polymer to be used. For example, acryloyl group, methacryloyl group, acrylamide group, methacrylamide group, azide group, primary, secondary or tertiary aliphatic group, fatty acid An aromatic group such as a cyclic group and a benzyl group is exemplified. The crosslinking agent may have only one kind of these radiation-reactive functional groups, or may have a plurality of kinds.
架橋剤は、放射線反応性官能基を２以上、好ましくは２つ有する。放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤を用いることにより、放射線照射により、架橋剤が、温度応答性ポリマーと基材の双方と共有結合を形成することができ、温度応答性ポリマーを基材に対し強固に固定化することができる。また、架橋剤が有する放射線反応性官能基の数を２とすることで、複数の分岐を持たない、より制御された表面を作製することが可能となる。 The cross-linking agent has two or more, preferably two, radiation-reactive functional groups. By using a cross-linking agent having two or more radiation-reactive functional groups, the cross-linking agent can form a covalent bond with both the temperature-responsive polymer and the base material by irradiation, and the temperature-responsive polymer is used as the base material. Can be firmly fixed. Further, by setting the number of radiation-reactive functional groups of the crosslinking agent to 2, it is possible to produce a more controlled surface that does not have a plurality of branches.
架橋剤の具体例として、ビスアクリルアミド系架橋剤が挙げられる。ビスアクリルアミド系架橋剤は、（メタ）アクリルアミド基を２つ有する２官能性架橋剤である。（メタ）アクリルアミド基には、アクリルアミド基とメタクリルアミド基が含まれる。ビスアクリルアミド系架橋剤の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−１，２−ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。特に、溶剤への溶解性の観点から、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが好ましい。ビスアクリルアミド系架橋剤を用いることにより、放射線照射により、架橋剤が、温度応答性ポリマーと基材の双方と共有結合を形成することができ、温度応答性ポリマーを基材に対し強固に固定化することができる。 Specific examples of the crosslinking agent include bisacrylamide-based crosslinking agents. The bisacrylamide-based crosslinking agent is a bifunctional crosslinking agent having two (meth) acrylamide groups. The (meth) acrylamide group includes an acrylamide group and a methacrylamide group. Specific examples of the bisacrylamide-based crosslinking agent include N, N′-methylenebisacrylamide, N, N′-methylenebismethacrylamide, N, N′-ethylenebisacrylamide, N, N′-ethylenebismethacrylamide, N , N′-1,2-dihydroxyethylenebisacrylamide, N, N′-hexamethylenebisacrylamide and the like. In particular, N, N′-methylenebisacrylamide is preferable from the viewpoint of solubility in a solvent. By using a bisacrylamide-based cross-linking agent, the cross-linking agent can form a covalent bond with both the temperature-responsive polymer and the substrate by irradiation, and the temperature-responsive polymer is firmly fixed to the substrate. can do.
ビスアクリルアミド系架橋剤は、エステル結合を持たず、加水分解に対して安定な架橋構造を形成することから、長期保存に適した安定な温度応答性ポリマー層を形成することができる。また、ビスアクリルアミド系架橋剤は低分子架橋剤であるため、長鎖の架橋剤に比べて反応性がゆるやかであり、良好な基材を製造するための濃度範囲を広く設定でき、製造管理がしやすくなる利点がある。これは、主鎖の長い架橋剤に比べると架橋反応の自由度が低いためである。 Since the bisacrylamide-based crosslinking agent does not have an ester bond and forms a crosslinked structure that is stable against hydrolysis, a stable temperature-responsive polymer layer suitable for long-term storage can be formed. In addition, since bisacrylamide-based cross-linking agents are low molecular cross-linking agents, their reactivity is moderate compared to long-chain cross-linking agents, and a wide concentration range can be set for manufacturing a good base material. There is an advantage that it becomes easy to do. This is because the degree of freedom of the crosslinking reaction is lower than that of a crosslinking agent having a long main chain.
架橋剤の別の例として、ポリアルキレングリコール末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が直接的または間接的（リンカーを解して）に導入された化合物が挙げられる。ポリアルキレングリコールは、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、すべての末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよく、一部の末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよい。 Another example of the crosslinking agent is a compound in which a radiation-reactive functional group is introduced directly or indirectly (through a linker) into a hydroxyl group at a polyalkylene glycol terminal. Polyalkylene glycol may be linear or branched, and may have a radiation-reactive functional group introduced at all terminal hydroxyl groups, or a radiation-reactive functional group introduced at some terminal hydroxyl groups. May be.
ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられ、架橋剤の好ましい具体例としては、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。ポリエチレングリコールは細胞培養用途での使用実績が多いため、ポリエチレングリコール鎖が培養基材表面に導入されることによる細胞培養用途への悪影響の懸念が少ない。また、ポリエチレングリコールは細胞非接着性の物質として知られているため、導入量を変化させることで、細胞の接着性を制御することが可能となる。 Specific examples of the polyalkylene glycol include polyethylene glycol, polypropylene glycol, and a copolymer of ethylene glycol and propylene glycol. Preferred specific examples of the crosslinking agent include polyethylene glycol diacrylate and polyethylene glycol dimethacrylate. Since polyethylene glycol has many uses in cell culture applications, there are few concerns about adverse effects on cell culture applications due to the introduction of polyethylene glycol chains on the surface of the culture substrate. In addition, since polyethylene glycol is known as a non-cell-adhesive substance, it is possible to control cell adhesion by changing the amount of introduction.
架橋剤のさらに別の例として、エトキシ化グリセリン（メタ）アクリレート、例えば、エトキシ化グリセリンジアクリレート、エトキシ化グリセリントリアクリレート、エトキシ化グリセリンジメタクリレート、およびエトキシ化グリセリントリメタクリレートなどが挙げられる。 Still other examples of cross-linking agents include ethoxylated glycerin (meth) acrylates such as ethoxylated glycerin diacrylate, ethoxylated glycerin triacrylate, ethoxylated glycerin dimethacrylate, and ethoxylated glycerin trimethacrylate.
塗工液は、温度応答性ポリマーと架橋剤を、溶媒に溶解することにより調製できる。温度応答性ポリマーおよび架橋剤を溶解する溶媒は、特に制限はないが、常庄下において沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、および水等が挙げられ、これらは組み合わせて使用してもよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン（もしくはジエチレン）グリコールまたはそのモノエチルエーテル等も使用可能であるが、好ましくはメタノール、エタノール、ｉ−プロパノールを用いる。メタノール、エタノール、ｉ−プロパノールは、基材として細胞培養に汎用されるポリスチレンを選択した場合において表面を侵さないため好ましい。必要であれば、上記溶液にはその他添加剤として、硫酸等で代表される酸類、モール塩等を配合してよい。 The coating liquid can be prepared by dissolving a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent in a solvent. The solvent for dissolving the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent is not particularly limited, but those having a boiling point of 120 ° C. or lower, particularly 60 to 110 ° C. are preferred under ordinary conditions. Specific examples of preferred solvents include methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, 2-butanol, and water, and these may be used in combination. Other solvents such as 1-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 2-butoxyethanol, and ethylene (or diethylene) glycol or monoethyl ether thereof can be used, but preferably methanol, ethanol, i -Propanol is used. Methanol, ethanol, and i-propanol are preferable because they do not attack the surface when polystyrene, which is widely used for cell culture, is selected as the base material. If necessary, an acid represented by sulfuric acid or the like, a Mole salt, or the like may be added to the above solution as other additives.
塗工液における温度応答性ポリマーの含有量は、ポリマーの分子量に応じて決定されるが、濃度が、好ましくは２重量％以上、より好ましくは３重量％以上、さらに好ましくは４重量％以上であり、好ましくは１５重量％以下、より好ましくは１２重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下である。塗工液における温度応答性ポリマーの濃度を一定以上とすることにより、塗工液内において温度応答性ポリマーが互いに近接して存在することとなり、塗工液を乾固させずにそのまま放射線を照射しても、十分な量の温度応答性ポリマーを、架橋剤を介して基材に固定化することができる。また、ポリマーのグラフト不足によって細胞が接着したものの剥離しない状況を回避でき、剥離性の良好な温度応答性ポリマー層を得ることができる。また、塗工液における温度応答性ポリマーの濃度を一定以下とすることにより、塗工液の粘度を制御でき、塗工液の均一な膜を容易に形成することができる。また、ポリマーのグラフト過多による細胞の接着不良が生じるのを防止できる。 The content of the temperature-responsive polymer in the coating solution is determined according to the molecular weight of the polymer, but the concentration is preferably 2% by weight or more, more preferably 3% by weight or more, and further preferably 4% by weight or more. Yes, preferably 15% by weight or less, more preferably 12% by weight or less, and still more preferably 10% by weight or less. By setting the concentration of the temperature-responsive polymer in the coating liquid to a certain level or more, the temperature-responsive polymers are present in the coating liquid in close proximity to each other, and radiation is directly applied without drying the coating liquid. Even so, a sufficient amount of the temperature-responsive polymer can be immobilized on the substrate via the crosslinking agent. In addition, it is possible to avoid a situation where cells adhere to each other due to insufficient grafting of the polymer but do not peel off, and a temperature-responsive polymer layer having good peelability can be obtained. In addition, by setting the concentration of the temperature-responsive polymer in the coating liquid to a certain level or less, the viscosity of the coating liquid can be controlled, and a uniform film of the coating liquid can be easily formed. Moreover, it is possible to prevent cell adhesion failure due to excessive polymer grafting.
放射線重合性組成物における架橋剤の含有量は、好ましくは放射線照射の直前における濃度が０．４重量％以上であり、好ましくは１．５重量％以下、より好ましくは１．０重量％以下、さらに好ましくは０．８重量％以下である。架橋剤の含有量を０．４重量％以上とすることで、温度応答性ポリマーを十分グラフトさせることができる。架橋剤の含有量を１．５重量％以下とすることで、過剰量の架橋剤による表面荒れを防ぐと同時に、温度応答性ポリマー層のグラフト過多による親水性の向上と細胞の接着不良を防止できる。 The content of the crosslinking agent in the radiation-polymerizable composition is preferably such that the concentration immediately before radiation irradiation is 0.4% by weight or more, preferably 1.5% by weight or less, more preferably 1.0% by weight or less, More preferably, it is 0.8 weight% or less. By setting the content of the crosslinking agent to 0.4% by weight or more, the temperature-responsive polymer can be sufficiently grafted. By controlling the content of the cross-linking agent to 1.5% by weight or less, surface roughness due to an excessive amount of the cross-linking agent is prevented, and at the same time, improvement in hydrophilicity and cell adhesion failure due to excessive grafting of the temperature-responsive polymer layer are prevented. it can.
特に、温度応答性ポリマーを４〜１０重量％の濃度で含み、架橋剤を０．４〜１．５重量％の濃度で含む塗工液が好ましい。このような塗工液を用いることにより、細胞培養時には細胞接着性に優れ、下限臨界溶解温度未満では剥離性に優れた温度応答性ポリマー層を得ることができる。 In particular, a coating solution containing a temperature-responsive polymer at a concentration of 4 to 10% by weight and a crosslinking agent at a concentration of 0.4 to 1.5% by weight is preferable. By using such a coating solution, it is possible to obtain a temperature-responsive polymer layer that is excellent in cell adhesion during cell culture and excellent in peelability at a temperature lower than the lower critical solution temperature.
基材は、その表面が、架橋剤の放射線反応性官能基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであることが好ましい。表面のみが、放射線反応性官能基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、基材表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。 The substrate preferably contains a material whose surface can be covalently bonded to the radiation-reactive functional group of the cross-linking agent by irradiation. Only the surface may contain a material that can be covalently bonded to the radiation-reactive functional group by irradiation, or the entire substrate may contain such a material. Examples of the material for the base material include glasses, plastics, ceramics, metals, and the like that are usually used for cell culture, but are not particularly limited as long as the material can be used for cell culture. An arbitrary layer may be provided on the surface of the substrate or the intermediate layer as long as the object of the present invention is not hindered, and an arbitrary treatment may be performed. For example, the substrate surface can be hydrophilized using a treatment technique such as ozone treatment, plasma treatment, sputtering, or the like.
基材を構成する材料であって、それ自体が放射線反応性官能基と共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 Materials that make up the substrate and can themselves form covalent bonds with radiation-reactive functional groups include polystyrene, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polyurethane, urethane acrylate, polymethyl Examples thereof include acrylic resins such as methacrylate, polyamide (nylon), polycarbonate, natural rubber having a conjugated bond, synthetic rubber having a conjugated bond, and silicon rubber containing polysilicon. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
放射線反応性官能基と共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 The base material surface-treated so as to be covalently bonded to the radiation-reactive functional group includes polyethylene terephthalate whose surface is easily adhered, synthetic resin whose surface is corona-treated or plasma-treated, and acrylic surface such as urethane acrylate. Examples thereof include a synthetic resin coated with a resin. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials. Examples of the synthetic resin include nylon, low density polyethylene, medium density polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, and the like. The synthetic resin may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
基材の形状としては、ディッシュ形状、フィルム形状、多孔質形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面に温度応答性ポリマーと架橋剤の層を形成した後、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。また、ディッシュ形状の容器の細胞培養面に、フィルム形状の基材を接着剤などにより貼り付けてもよい。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分が温度応答性ポリマーと架橋剤の層により被覆されればよい。 Examples of the shape of the substrate include a dish shape, a film shape, and a porous shape. When a film-shaped substrate is used, a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent is formed on the surface of the film-shaped substrate, and then processed into a shape suitable for cell culture (for example, a dish shape). Further, a film-shaped substrate may be attached to the cell culture surface of the dish-shaped container with an adhesive or the like. In processing, a member made of another material can be used in combination with the base material as necessary. When using a dish-shaped substrate, it is only necessary that at least the inner bottom portion of the dish serving as the cell adhesion surface is covered with a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent.
本発明で用いる基材としては、細胞培養において実績のある、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、多孔質ポリエチレンテレフタレート、多孔質ポリカーボネートが特に適している。 As the substrate used in the present invention, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, porous polyethylene terephthalate, and porous polycarbonate, which have a proven record in cell culture, are particularly suitable.
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒を含む塗工液を配置することにより基材上に形成する塗膜の塗布量は温度応答性ポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮するのに必要な塗布量である５０ｍｇ／ｍ２以上あればよいが、より好ましくは３ｇ／ｍ２以上が望ましい。塗布量の上限は特にないが、４０ｇ／ｍ２未満が好ましく、２０ｇ／ｍ２以下がより好ましい。塗布量が４０ｇ／ｍ２以上である場合には、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、並びに照射エネルギーに由来する膜内の対流によりポリマーの被覆量にムラが生じる場合がある。また、遊離のポリマーを洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は２０ｇ／ｍ２以下が望ましい。 The coating amount of the coating film formed on the substrate by arranging the coating solution containing the temperature-responsive polymer, the crosslinking agent, and the solvent is necessary for the temperature-responsive polymer to function (for example, temperature responsiveness). The application amount may be 50 mg / m 2 or more, more preferably 3 g / m 2 or more. The upper limit of the coating amount is not particularly, but preferably less than 40g / m 2, 20g / m 2 or less is more preferable. When the coating amount is 40 g / m 2 or more, the thickness is increased and the coating thickness is not stable, the thickness is increased and the radiation penetration / irradiation amount is not stable, and in the film derived from the irradiation energy Convection may cause unevenness in the coating amount of the polymer. Moreover, in order to shorten the washing time for washing the free polymer, the coating amount is desirably 20 g / m 2 or less.
塗工液の基材への小面積への塗布方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。 As a method for applying the coating liquid to a substrate on a small area, any known method may be used, and examples thereof include a coating method using a spin coater, a bar coater, and the like, and a spray coating method. As a coating method for a large area, a blade coating method, a gravure coating method, a rod coating method, a knife coding method, a reverse roll coating method, an offset gravure coating method and the like can be used.
ベタ形成においては、グラビアコート法、ロールコート法、スロットコート法、キスコート法、スプレーコート法、ファウンテンコーティング法等公知のコーティング法を用いることが出来る。又、絵柄層のパターン形成においては、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法等公知の印刷法を用いることが出来る。塗布方法として連続のコート法または印刷法を使用することもできる。連続のコート法または印刷法としては、具体的にはホットメルトコート、ホットラッカーコート、グラビアダイレクトコート、グラビアリバースコート、ダイコート、マイクログラビアコート、スライドコート、スリットリバースコート、カーテンコート、ナイフコート、エアコート、ロールコート等の塗布方法が使用できるが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば適用可能なものを使用することができる。 In the solid formation, a known coating method such as a gravure coating method, a roll coating method, a slot coating method, a kiss coating method, a spray coating method, or a fountain coating method can be used. In the pattern formation of the pattern layer, a known printing method such as a gravure printing method, a screen printing method, or an offset printing method can be used. As a coating method, a continuous coating method or a printing method can also be used. Specifically, the continuous coating method or printing method includes hot melt coating, hot lacquer coating, gravure direct coating, gravure reverse coating, die coating, micro gravure coating, slide coating, slit reverse coating, curtain coating, knife coating, and air coating. Application methods such as roll coating can be used, but these are merely examples, and those skilled in the art can use those applicable.
本発明の方法は、基材上に配置した温度応答性ポリマーおよび架橋剤に放射線を照射して、基材表面と温度応答性ポリマーとの架橋剤を介した結合反応を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応は、放射線照射によって、基材と架橋剤との間の共有結合や、架橋剤と温度応答性ポリマーとの間の共有結合が、放射線反応性官能基を介して形成される反応をさす。 The method of the present invention includes a radiation irradiation step of irradiating a temperature-responsive polymer and a cross-linking agent disposed on a substrate with radiation to advance a binding reaction between the substrate surface and the temperature-responsive polymer via the cross-linking agent. Including. As for the coupling reaction here, a covalent bond between the substrate and the crosslinking agent and a covalent bond between the crosslinking agent and the temperature-responsive polymer are formed through radiation-reactive functional groups by irradiation with radiation. Refers to a reaction.
本発明の方法では、放射線の照射を、塗工液が乾固する前に実施する。したがって、乾燥ムラにより、得られる温度応答性ポリマー層の細胞接着性や細胞剥離性において製品間のばらつきや面内のムラが生じるのを防止できる。塗工液が乾固する前に実施するとは、塗工液を基材上に配置した後、特段の乾燥工程を実施することなく、放射線の照射を実施することをさす。塗工液が乾固する前とは、溶媒が実質的にすべて蒸発して完全に乾固する前、すなわち塗膜に溶媒が残っていない状態の前であればよいが、好ましくは、溶媒が７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上の濃度で塗膜に残っている状態で放射線を照射する。そのためには、塗工液を基材上に配置した後すぐに放射線の照射を実施することが好ましい。また、塗工液を配置した後、基材に蓋をすることにより、溶媒の蒸発を防止してもよい。あるいは、塗膜周囲の温度を下げたり、塗膜周囲の溶媒の分圧を高めたりすることで、溶媒の蒸発および塗膜の乾燥を防止してもよい。溶媒の蒸発および塗膜の乾燥を防止するための上記手段は、単独で実施してもよいし、複数を組合せて実施してもよい。塗工液を基材上に配置した後すぐに放射線の照射を実施する場合は、いずれの手段を実施しなくてもよい。例えば、塗工液を基材上に配置した後、好ましくは５分以内、より好ましくは２分以内に、放射線を照射するとよい。 In the method of the present invention, irradiation with radiation is performed before the coating solution is dried. Therefore, it is possible to prevent variations between products and in-plane unevenness in cell adhesion and cell peelability of the resulting temperature-responsive polymer layer due to drying unevenness. Performing before the coating solution is dried means that the coating solution is placed on the substrate and then irradiated with radiation without performing a special drying step. The period before the coating liquid is dried may be before the solvent is evaporated completely and completely dried, that is, before the solvent remains in the coating film. Radiation is irradiated in a state where it remains in the coating film at a concentration of 75% by weight or more, more preferably 85% by weight or more, and still more preferably 90% by weight or more. For this purpose, it is preferable to carry out radiation irradiation immediately after the coating liquid is arranged on the substrate. Moreover, after disposing the coating liquid, the substrate may be covered to prevent the solvent from evaporating. Alternatively, evaporation of the solvent and drying of the coating film may be prevented by lowering the temperature around the coating film or increasing the partial pressure of the solvent around the coating film. The above-mentioned means for preventing the evaporation of the solvent and the drying of the coating film may be carried out alone or in combination. In the case where the irradiation of radiation is carried out immediately after the coating liquid is placed on the substrate, any means need not be carried out. For example, the radiation may be applied preferably within 5 minutes, more preferably within 2 minutes after the coating liquid is placed on the substrate.
使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。本発明においては、γ線と電子線がエネルギー効率の点から好ましく、特に生産性の点から電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば１００ｋＧｙ〜５００ｋＧｙが好ましく、１００ｋＧｙ〜３００ｋＧｙがより好ましい。γ線であれば５ｋＧｙ〜５０ｋＧｙが好ましい。照射する放射線の線量を一定以上とすることにより、乾固する前の塗工液の塗膜であっても温度応答性ポリマーを基材に固定化させるのに十分な量のラジカルを発生させることができる。照射する放射線の線量を一定以下とすることにより、基材へのダメージを抑制でき、また、過剰に温度応答性ポリマーが基材に固定化されて細胞接着性が損なわれるのを防ぐことができる。 Examples of the radiation used include α rays, β rays, γ rays, electron beams, ultraviolet rays, and the like. In the present invention, γ rays and electron beams are preferable from the viewpoint of energy efficiency, and electron beams are particularly preferable from the viewpoint of productivity. With respect to ultraviolet rays, it can be used by combining an appropriate polymerization initiator and an anchor agent with a substrate. The radiation dose range is preferably 100 kGy to 500 kGy, more preferably 100 kGy to 300 kGy, in the case of an electron beam. If it is a gamma ray, 5 kGy-50 kGy are preferable. By making the radiation dose to be irradiated above a certain level, sufficient amount of radicals can be generated to immobilize the temperature-responsive polymer on the base material even in the coating liquid coating before drying. Can do. By making the dose of radiation to be irradiated below a certain level, damage to the substrate can be suppressed, and it is possible to prevent cell-adhesion from being impaired due to excessive immobilization of the temperature-responsive polymer to the substrate. .
放射線の照射としては、加速電圧の低い装置による電子線の照射が好ましい。加速電圧の低い装置は、小さく価格も安価であるため、コストの観点からも有利である。照射する電子線の線量を一定以上とすることにより、加速電圧が低い場合でも、乾固する前の塗工液の塗膜であっても十分な量のラジカルを発生させることができ、温度応答性ポリマーを基材表面に十分な量で固定化することが可能である。電子線照射における加速電圧は、好ましくは３００ｋＶ以下、より好ましくは２００ｋＶ以下である。 As the radiation irradiation, electron beam irradiation is preferably performed using a device having a low acceleration voltage. A device with a low accelerating voltage is advantageous from the viewpoint of cost because it is small and inexpensive. By making the dose of the electron beam to be irradiated above a certain level, even when the acceleration voltage is low, a sufficient amount of radicals can be generated even in the coating liquid of the coating liquid before drying, and the temperature response It is possible to fix the functional polymer to the substrate surface in a sufficient amount. The acceleration voltage in electron beam irradiation is preferably 300 kV or less, more preferably 200 kV or less.
放射線照射後は、基材を洗浄することにより未反応の塗工液を除去する洗浄工程を更に実施することが好ましい。上述の各工程を経て形成された細胞培養基材には、溶媒だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応の架橋剤等が存在している。洗浄工程により、これらを除去することができる。洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には、高圧水洗、浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養基材に応じて適宜選択すればよい。 After the irradiation, it is preferable to further carry out a cleaning step of removing the unreacted coating liquid by cleaning the substrate. The cell culture substrate formed through the above-described steps includes not only a solvent but also free polymer molecules that are not immobilized, an unreacted crosslinking agent, and the like. These can be removed by a washing process. Although it does not specifically limit as a washing | cleaning method, Typically, high-pressure water washing, immersion washing, swing washing, shower washing, spray washing, ultrasonic washing, etc. are mentioned. The cleaning liquid typically includes various water-based, alcohol-based, hydrocarbon-based, chlorine-based, acid / alkali cleaning liquids. The combination of the washing method and the washing solution may be appropriately selected according to the cell culture substrate to be washed.
洗浄後の細胞培養基材は、乾燥させることが好ましい。乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風（温風）乾燥法、（遠）赤外乾燥法などが挙げられる。 The cell culture substrate after washing is preferably dried. Although it does not specifically limit as a drying method, Typically, a dry air drying method, a hot air (warm air) drying method, a (far) infrared drying method etc. are mentioned.
細胞培養基材表面における温度応答性ポリマーの被覆量は、０．２〜６．０μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、１．０〜４．０μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。被覆量が６．０μｇ／ｃｍ２を超過すると細胞は細胞培養基材表面上に付着せず、逆に被覆量が０．２μｇ／ｃｍ２未満だと培養細胞を基材から剥離回収することが困難となる。このようなポリマー被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）、被覆部若しくは非被覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、更に接触角測定等による表面分析を単独或は併用して求めることができる。 The coverage of the temperature responsive polymer in cell culture substrate surface is preferably 0.2~6.0μg / cm 2, more preferably 1.0~4.0μg / cm 2. If the coating amount exceeds 6.0 μg / cm 2 , the cells do not adhere to the surface of the cell culture substrate, and conversely, if the coating amount is less than 0.2 μg / cm 2 , the cultured cells can be detached and collected from the substrate. It becomes difficult. Such a polymer coating amount is, for example, the surface by Fourier transform infrared spectrometer total reflection method (FT-IR-ATR method), analysis by coating or non-coating dyeing or fluorescent substance dyeing, and contact angle measurement. Analysis can be determined alone or in combination.
本発明の細胞培養基材は、接着性細胞の培養に、特に好適に使用される。接着性細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞などの骨細胞などが挙げられる。 The cell culture substrate of the present invention is particularly preferably used for culturing adherent cells. Examples of adherent cells include liver cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermis Epidermal cells such as keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, mammary cells, pericytes, muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidney cells , Pancreatic islets of Langerhans, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, and bone cells such as chondrocytes.
これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。本発明の細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。 These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another. Furthermore, these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unipotency, and differentiation has ended. Any of cells may be sufficient. In addition, the cells may be cultivated as a single species, or two or more types of cells may be co-cultured. A cell sheet can be produced by culturing cells using the cell culture substrate of the present invention. The cell sheet thus prepared is suitable for use in regenerative medicine and the like because the adhesion factor on the surface is not impaired and the portion in contact with the cell culture surface has a uniform quality. In addition, the cell sheet can be applied to detection devices such as biosensors.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
＜実施例１＞
（温度応答性ポリマーの合成）
３００ｍｌ三口フラスコにＮ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）２２．６ｇと開始剤Ｎ，Ｎ’‐アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．０８２１ｇを入れ、メタノール１００ｍｌを加えて溶解させた。フラスコ内をアルゴン雰囲気下にし、６０℃で２４時間撹拌した。生成物を透析チューブによって３日間透析し、４日間凍結乾燥させ、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）と記載する）を得た。
（温度応答性細胞培養基材の作製）
Ｎｕｎｃ製細胞培養ペトリディッシュ（培養面積８．８ｃｍ２）を基材とした。ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）が１０ｗｔ％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが０．５ｗｔ％になるようにｉ−プロパノール（ＩＰＡ）に溶解させ、インキとした。このインキを２００μｌ滴下し、加速電圧２００ｋＶ、照射線量２５０ｋＧｙの電子線を照射し、温度応答性ポリマー層を基材に固定化した。高圧水洗によって固定化されていないポリマーを除去した。
<Example 1>
(Synthesis of temperature-responsive polymer)
A 300 ml three-necked flask was charged with 22.6 g of N-isopropylacrylamide (NIPAAm) and 0.0821 g of initiator N, N′-azobisisobutyronitrile (AIBN), and dissolved by adding 100 ml of methanol. The flask was placed in an argon atmosphere and stirred at 60 ° C. for 24 hours. The product was dialyzed with a dialysis tube for 3 days and freeze-dried for 4 days to obtain poly-N-isopropylacrylamide (hereinafter referred to as poly (NIPAAm)).
(Preparation of temperature-responsive cell culture substrate)
A Nunc cell culture petri dish (culture area 8.8 cm 2 ) was used as a base material. An ink was prepared by dissolving in i-propanol (IPA) so that poly (NIPAAm) was 10 wt% and N, N′-methylenebisacrylamide was 0.5 wt%. 200 μl of this ink was dropped and irradiated with an electron beam having an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 250 kGy, and the temperature-responsive polymer layer was fixed to the substrate. The non-immobilized polymer was removed by high pressure water washing.
＜実施例２＞
（温度応答性ポリマーの合成）
実施例１と同様にして、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）を得た。
（温度応答性細胞培養基材の作製）
Ｎｕｎｃ製細胞培養ペトリディッシュ（培養面積８．８ｃｍ２）を基材とした。ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）が１０ｗｔ％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが０．５ｗｔ％になるようにｉ−プロパノール（ＩＰＡ）に溶解させ、インキとした。このインキを２００μｌ滴下し、加速電圧２００ｋＶ、照射線量１２０ｋＧｙの電子線を照射し、温度応答性ポリマー層を基材に固定化した。高圧水洗によって固定化されていないポリマーを除去した。
<Example 2>
(Synthesis of temperature-responsive polymer)
In the same manner as in Example 1, poly (NIPAAm) was obtained.
(Preparation of temperature-responsive cell culture substrate)
A Nunc cell culture petri dish (culture area 8.8 cm 2 ) was used as a base material. An ink was prepared by dissolving in i-propanol (IPA) so that poly (NIPAAm) was 10 wt% and N, N′-methylenebisacrylamide was 0.5 wt%. 200 μl of this ink was dropped and irradiated with an electron beam having an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 120 kGy, and the temperature-responsive polymer layer was fixed to the substrate. The non-immobilized polymer was removed by high pressure water washing.
＜実施例３＞
（温度応答性ポリマーの合成）
実施例１と同様にして、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）を得た。
（温度応答性細胞培養基材の作製）
Ｎｕｎｃ製細胞培養ペトリディッシュ（培養面積８．８ｃｍ２）を基材とした。ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）が４ｗｔ％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが１．０ｗｔ％になるようにｉ−プロパノール（ＩＰＡ）に溶解させ、インキとした。このインキを２００μｌ滴下し、加速電圧２００ｋＶ、照射線量２５０ｋＧｙの電子線を照射し、温度応答性ポリマー層を基材に固定化した。高圧水洗によって固定化されていないポリマーを除去した。
<Example 3>
(Synthesis of temperature-responsive polymer)
In the same manner as in Example 1, poly (NIPAAm) was obtained.
(Preparation of temperature-responsive cell culture substrate)
A Nunc cell culture petri dish (culture area 8.8 cm 2 ) was used as a base material. An ink was prepared by dissolving in i-propanol (IPA) such that poly (NIPAAm) was 4 wt% and N, N′-methylenebisacrylamide was 1.0 wt%. 200 μl of this ink was dropped and irradiated with an electron beam having an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 250 kGy, and the temperature-responsive polymer layer was fixed to the substrate. The non-immobilized polymer was removed by high pressure water washing.
＜比較例１＞
（温度応答性ポリマーの合成）
実施例１と同様にして、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）を得た。
（温度応答性細胞培養基材の作製）
Ｎｕｎｃ製細胞培養ペトリディッシュ（培養面積８．８ｃｍ２）を基材とした。ポリ（ＮＩＰＡＡｍ）が１０ｗｔ％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが０．５ｗｔ％になるようにｉ−プロパノール（ＩＰＡ）に溶解させ、インキとした。このインキを２００μｌ滴下し、１時間室温に静置して乾固後、加速電圧２００ｋＶ、照射線量２５０ｋＧｙの電子線を照射し、温度応答性ポリマー層を基材に固定化した。高圧水洗によって固定化されていないポリマーを除去した。
<Comparative Example 1>
(Synthesis of temperature-responsive polymer)
In the same manner as in Example 1, poly (NIPAAm) was obtained.
(Preparation of temperature-responsive cell culture substrate)
A Nunc cell culture petri dish (culture area 8.8 cm 2 ) was used as a base material. An ink was prepared by dissolving in i-propanol (IPA) so that poly (NIPAAm) was 10 wt% and N, N′-methylenebisacrylamide was 0.5 wt%. After 200 μl of this ink was dropped and left to stand at room temperature for 1 hour to dry, an electron beam with an acceleration voltage of 200 kV and an irradiation dose of 250 kGy was irradiated to immobilize the temperature-responsive polymer layer on the substrate. The non-immobilized polymer was removed by high pressure water washing.
＜細胞培養評価＞
温度応答性ポリマーを固定化した細胞培養基材上にて、定法によりウシ血管内皮細胞を３７℃で培養した。培地は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）を使用した。培養１日経過後に顕微鏡観察を行い、細胞培養基材に細胞が接着しているかどうかを観察した。培養４日後に培養した細胞はコンフルエントの状態となり、２０℃で３０分インキュベートし冷却することで、細胞シートを剥離、回収可能か判断した。
結果を「接着性−剥離性」で、以下の表１に示す。
<Cell culture evaluation>
Bovine vascular endothelial cells were cultured at 37 ° C. by a conventional method on a cell culture substrate on which a temperature-responsive polymer was immobilized. As the medium, DMEM (manufactured by Sigma) containing 10% FBS was used. Microscopic observation was performed after 1 day of culture, and it was observed whether or not the cells adhered to the cell culture substrate. Cells cultured after 4 days of culture became confluent, and it was determined whether the cell sheet could be detached and recovered by incubating at 20 ° C. for 30 minutes and cooling.
The result is “Adhesiveness-Peelability” and is shown in Table 1 below.
表１における接着性の評価基準は以下のとおりである。
○：播種されて基材に接着した細胞のうち、９０％以上に伸展している様子が観察された。
△：播種されて基材に接着した細胞のうち、５０％程度に伸展している様子が観察された。
×：播種されて基材に接着、伸展する細胞が１０％未満であった。
The evaluation criteria for adhesiveness in Table 1 are as follows.
◯: It was observed that 90% or more of the cells seeded and adhered to the substrate were extended.
(Triangle | delta): A mode that it extended to about 50% among the seed | inoculated cells and adhere | attached on the base material was observed.
X: Less than 10% of cells were seeded and adhered to and spread on the substrate.
表１における剥離性の評価基準は以下のとおりである。
○：コンフルエントに到達した細胞がシート形状を保ったまま剥離し、細胞シートの回収に成功した。
△：コンフルエントに到達した細胞がシート形状を保ったまま剥離せず、５０％程度の細胞が低温処理によって剥離した。
×：コンフルエントに到達した細胞の１０％未満が剥離挙動を示すにとどまった。
The evaluation criteria for peelability in Table 1 are as follows.
A: Cells that reached confluence were detached while maintaining the sheet shape, and the cell sheet was successfully recovered.
(Triangle | delta): The cell which reached confluence did not peel, maintaining a sheet | seat shape, but about 50% of cells peeled by low-temperature processing.
X: Less than 10% of the cells that reached confluence only showed detachment behavior.
Claims (5)
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む塗工液を基材に配置する工程、および
基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含み、
放射線の照射を塗工液が乾固する前に実施する、
前記方法。 A method for producing a cell culture substrate having temperature responsiveness, comprising:
A step of placing a coating liquid containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent, and a solvent on the substrate, and immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate by irradiating the coating liquid disposed on the substrate with radiation. Including the steps of:
Perform radiation before the coating solution dries.
Said method.
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