JP5738199B2 - 精製されたPlasmodiumおよびワクチン組成物 - Google Patents
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Description
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
Plasmodium種寄生虫の実質的に精製された調製物。
(項目2)
前記寄生虫が、代謝的に活性である、項目1に記載の調製物。
(項目3)
前記寄生虫が、感染性スポロゾイトである、項目2に記載の調製物。
(項目4)
賦形剤をさらに含む、項目3に記載の調製物。
(項目5)
前記Plasmodium種が、P.falciparumである、項目4に記載の調製物。
(項目6)
前記賦形剤が、ヒト血清アルブミンを含む、項目4に記載の調製物。
(項目7)
前記スポロゾイトが、蚊から精製される、項目4に記載の調製物。
(項目8)
前記スポロゾイトが、唾液腺材料の精製前調製物から精製される、項目7に記載の調製物。
(項目9)
前記スポロゾイトが、宿主の感染後に前記寄生虫がマラリアの疾患病状をもたらすことができないように、十分に弱毒化される、項目4に記載の調製物。
(項目10)
前記スポロゾイトが、一つ以上の導入遺伝子を含む、項目4に記載の調製物。
(項目11)
前記スポロゾイトの種が、P.falciparumである、項目10に記載の調製物。
(項目12)
25,000スポロゾイトあたり15ナノグラム未満の付随材料を含む、項目4に記載の調製物。
(項目13)
25,000スポロゾイトあたり1ナノグラム未満の付随材料を含む、項目12に記載の調製物。
(項目14)
25,000スポロゾイトあたり0.12ナノグラム未満の付随材料を含む、項目12に記載の調製物。
(項目15)
付随材料の少なくとも98%が、前記精製前材料から除去されている、項目8に記載の調製物。
(項目16)
付随材料の少なくとも99.9%が、前記精製前材料から除去されている、項目8に記載の調製物。
(項目17)
付随材料の少なくとも99.97%が、前記精製前材料から除去されている、項目8に記載の調製物。
(項目18)
前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、項目9に記載の調製物。
(項目19)
前記弱毒化が、放射線曝露により確立される、項目18に記載の調製物。
(項目20)
前記放射線曝露が、少なくとも100Gyであるが、1000Gyを超えない照射である、項目19に記載の調製物。
(項目21)
前記曝露が、150Gyである、項目20に記載の調製物。
(項目22)
無菌的に調製され、汚染を伴わない、項目12に記載の調製物。
(項目23)
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主においてPlasmodium種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であり、前記方法は、前記Plasmodium種の代謝的に活性の弱毒化スポロゾイトの実質的に精製された調製物の少なくとも一用量の投与を含み、前記Plasmodium種の病原性寄生虫への後の曝露時に、前記マラリアの病理学的発現が前記宿主において防止される、方法。
(項目24)
前記調製物が、賦形剤をさらに含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記賦形剤が、ヒト血清アルブミンを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
少なくとも二用量の前記調製物の投与を含む、項目23に記載の方法。
(項目27)
三以上の用量の前記調製物の投与を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、項目23に記載の方法。
(項目29)
前記弱毒化が、放射線曝露により確立される、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記Plasmodium種が、P.falciparum、P.vivax、P.ovale、P.knowlesiまたはP.malariaeである、項目23に記載の方法。
(項目31)
前記種が、P.falciparumである、項目30に記載の方法。
(項目32)
代謝的に活性のPlasmodiumスポロゾイトの精製のための方法であり、前記方法は、
(a)スポロゾイトと付随非スポロゾイト材料とを含む、水性精製前調製物を提供するステップと;
(b)
(i)10ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第一排除フィルタと;
(ii)約1.2ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第二排除フィルタと;
(iii)1.2ミクロンまたはそれより小さな材料を通過させ、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第三メンブレンフィルタと;
を含む、一組のサイズ排除フィルタに、前記スポロゾイト調製物を順次通すステップと;
(c)前記スポロゾイトを保持することができる孔径の収集フィルタに、実質的に精製されたスポロゾイトを収集するステップと;
(d)前記回収された実質的に精製されたスポロゾイトを、前記収集フィルタから除去し、これにより、付随非スポロゾイト材料を実質的に伴わない精製スポロゾイト調製物を
生成するステップと
を含む、方法。
(項目33)
前記第一フィルタ、前記第二フィルタ、および前記第三フィルタがシステムにおいて順次接続され、前記スポロゾイトがある流量で前記フィルタを横断して通過する、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記システムが、少なくとも3L/時/m 2 であるが1500L/時/m 2 を超えない流量を有する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記流量が、少なくとも125L/時/m 2 であるが250L/時/m 2 を超えない、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記第一排除フィルタが、10ミクロンの公称孔径を有する、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記第二排除フィルタが、0.6ミクロンの公称孔径を有する、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記第三フィルタが、1.2ミクロンの孔径を有する、項目33に記載の方法。
(項目39)
前記収集フィルタが、0.4ミクロンの孔径を有する、項目33に記載の方法。
(項目40)
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料の量が、25,000スポロゾイトあたり15ナノグラム未満である、項目33に記載の方法。
(項目41)
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料の量が、25,000スポロゾイトあたり1ナノグラム未満である、項目33に記載の方法。
(項目42)
前記精製スポロゾイト調製物中の前記付随非スポロゾイト材料が、25,000スポロゾイトあたり0.12ナノグラム未満である、項目33に記載の方法。
(項目43)
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも98%が除去されている、項目33に記載の方法。
(項目44)
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも99.9%が除去された、項目33に記載の方法。
(項目45)
前記精製前調製物中の付随材料の少なくとも99.97%が除去される、項目33に記載の方法。
(項目46)
ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において、Plasmodium種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与する方法であり、前記方法が、前記Plasmodium種の病原性スポロゾイトの実質的に精製された調製物の少なくとも一用量の投与と同時の抗マラリア剤のレジメンの投与を含み、前記Plasmodium種の病原性寄生虫に対する後の曝露時に前記宿主において前記マラリアの病理学的発現が防止される、方法。
(項目47)
前記抗マラリア剤が、クロロキンである、項目46に記載の方法。
「約」または「およそ」という用語は、当技術分野での慣行通り、一標準偏差以内を意味する。
Plasmodium種寄生虫が、Anopheles種蚊宿主、最も典型的にはAnopheles stephensi宿主において、培養ならびにin vivoで無菌的に成長させられる。Plasmodium種肝臓ステージ寄生虫を純培養する方法(Kappe等、米国特許出願公開第2005/0233435号)、ならびに弱毒化および非弱毒化Plasmodium種スポロゾイトを生産する方法、特に蚊において寄生虫を成長させ弱毒化し、弱毒化および非弱毒化スポロゾイトを採取する方法が当技術分野で公知であり、記載されている(Hoffman&Luke,米国特許第7,229,627号;米国特許出願公開第2005/0220822号を参照。
生きたPlasmodium種、例えばfalciparum、vivax、malariae、またはovaleを精製する方法が、本明細書に開示される。
粉砕された解剖産物(精製前調製物)が、一度に一つの管にまとめて受けられる。これが、SGM精製前調製物である。これは約100,000〜10億のスポロゾイト、好ましくは少なくとも100万のスポロゾイト、より好ましくは少なくとも2,500万のスポロゾイトに相当する。精製前調製物中のSGMの測定量は、通常25,000スポロゾイトあたり300ng〜12,000ngの間、より典型的には25,000スポロゾイトあたり400ng〜1,100ngの間である。それから精製前調製物は、賦形剤により10mlに希釈される。溶液およびサンプルは、精製の間15〜30℃の間に保たれる。
蠕動ポンプを用いて、希釈された精製前調製物が、少なくとも1ml/分であるが1000ml/分を超えない、好ましくは少なくとも2ml/分であるが500ml/分を超えない、より好ましくは少なくとも3mL/分で200mL/分を超えない流速で、一連のサイズ排除フィルタを横断してポンプ輸送される。対応する各フィルタを横断する流量は、少なくとも1L/時/m2であるが2000L/時/m2を超えず、好ましくは3L/時/m2〜1500L/時/m2、最も好ましくは少なくとも125L/時/m2であるが250L/時/m2を超えない。フィルタは、通常は医療グレードのシリコーン管により、直列に接続される。最初のフィルタ(フィルタ#1)または最初の二つのフィルタ(フィルタ#1および#2)はマトリックスフィルタであり、ポリプロピレンでできているのが好ましいが、ナイロン、混合セルロースエステルおよびホウ珪酸ガラスまたは当業者に周知のその他の材料が使用されうる。最後から二番目のフィルタ(フィルタ#3)はメンブレンフィルタであるのが好ましく、トラックエッチドポリカーボネートフィルタであるのが最も好ましいが、当業者に周知の同様の性質を有する他のフィルタが使用されうる。無病原体手順では、フィルタは無菌である。一実施形態においては、三つのフィルタ(フィルタ#1、フィルタ#2およびフィルタ#3)が直列に接続され、フィルタ#4での全量濾過によりスポロゾイトが捕捉される。追加のフィルタが、用いられうる。あるいは、(第59段落で後述されるように)一つまたは二つのフィルタだけが使用されうるが、三つのフィルタの使用が最適である。一実施形態においては、フィルタ#1は、少なくとも約2.5ミクロンであるが約30ミクロンを超えない、好ましくは少なくとも5ミクロンであるが20ミクロンを超えない公称孔径のメンブレンマトリクスである。一実施形態においては、使用されるフィルタは、約10ミクロンの公称孔径と、17.5cm2の濾過面積を有する。(Polygard(登録商標)−CN Optiscale−Millipore Cat.No.SN1HA47HH3)。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は1800cm2である。フィルタ#2(これもメンブレンマトリックス)の公称孔径は、少なくとも約0.3ミクロンであるが約1.2ミクロンより大きくない。一実施形態においては、孔径は約0.6ミクロンであり、濾過面積は17.5cm2である。(Polygard(登録商標)−CN Optiscale filter−Millipore Cat.No.SN06A47HH3)−Plasmodiumの直径よりも小さい。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は、1800cm2である。一実施形態においては、フィルタ#3は、正確な孔直径および一貫した孔径のトラックエッチドメンブレンフィルタであり、少なくとも1.2ミクロンであるが3ミクロンより大きくない、すなわち先行するフィルタの公称孔径より大きな孔径を有する。一実施形態においては、使用されるフィルタは、1.2ミクロンの孔径と11.3cm2の濾過面積を有する。(Isopore membrane,直径47mm−Millipore Cat.No.RTTP04700)Swin−Locフィルタホルダに保持された(Whatman Cat.No.420400)。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は、127cm2である。濾過された材料は、フィルタ#4で、直径90mmで28.7cm2の濾過面積の、0.8ミクロンを超えない、好ましくは0.6ミクロンを超えない、好ましくは0.2ミクロンを超えないトラックエッチド孔径の、Isoporeメンブレンが取り付けられた撹拌限外濾過セル(Millipore,model 8200)に捕捉される。一実施形態においては、孔径は0.4ミクロンである(Millipore Cat.No.HTTP09030)。スケールアップ実施形態においては、濾過面積は162cm2である。別のスケールアップ実施形態においては、濾過面積は63cm2である。システムは、溶媒で数回洗浄される。残余分体積が撹拌セルにおいて約40mlに達したら、撹拌セル容器出口が開かれ、約5〜10mlの残余残留分を残して重力により排液され、窒素等の圧縮ガスまたはピストン等の機械デバイスからの圧力の印加等の他の方法により残余分体積が減少されてもよいが、重力が好適な方法である。この残余残留分が、精製溶媒を用いた合計約35mlへの三回の洗浄とともに、典型的には無菌35ml オークリッジまたは同様の遠心管(管のサイズは調製物の体積に応じて変動)に、回収されて移される。35ml オークリッジ管内の溶媒中の精製スポロゾイトが、5,000g〜25,000g、好ましくは16,300gで、2分〜12分間、好ましくは5分間の遠心分離されて、スポロゾイトがペレット化される。上清溶媒がデカントされる。このステップは、上清中に残るより小さなさらなる浮遊材料および可溶性材料を除去することにより、スポロゾイト調製物をさらに精製する。
Plasmodiumスポロゾイトの弱毒化を誘導するいくつかの手段が、公知である。これらには、遺伝性遺伝子改変、遺伝子変異、放射線曝露、ならびに変異原性化学物質への曝露、代謝阻害化学物質への曝露、および高または低温度または圧力等の環境条件への曝露が含まれる。
精製放射線照射弱毒化P.falciparumスポロゾイトの感染効力のレベルは、免疫蛍光アッセイ(IFA:immunofluorescence assay)を用いて、ヒト肝細胞培養におけるP.falciparum肝臓ステージ抗原−1(PfLSA−1:Liver Stage Antigen−1)の発現を測定することにより評価されうる。PfLSA−1は、スポロゾイトにより発現されないが、肝細胞への侵入に成功後のP.falciparum寄生虫(弱毒化および野生型の両方)により発現されるタンパク質である(図3)。PfLSA−1の発現は、弱毒化スポロゾイトが代謝的に活性であることを示す。
弱毒化および病原性の、生きたPlasmodiumスポロゾイトを含む医薬組成物、ならびに、疾患を防止するための防止用ワクチン組成物として、およびワクチンおよび薬物のテストにおいてボランティアを感染させるための病原性チャレンジ組成物として、これらの組成物を使用する方法が提供されている(特にHoffman、米国特許出願公開第2005/0220822号を参照)。様々なカテゴリの弱毒化スポロゾイトが、ワクチン用に検討されている。これらには、遺伝性遺伝子改変、遺伝子変異、放射線曝露、および化学物質曝露を含む様々な方法により弱毒化されたスポロゾイトが含まれる。寄生虫の直接的遺伝子操作によりつくられる様々な弱毒化分離株が、P.falciparum(van Schaijk等、PLoS ONE(2008)3:e3549)ならびにネズミ特異的Plasmodium種(Kappe等、米国特許第7,122,179号;van Dijk等、PNAS(2005)102:12194−12199;Labaied等、Infect Immun.(2007)75:3758)について記載されている。一実施形態においては、ヒト特異的Plasmodiumの放射線照射弱毒化が、ガンマ放射線への曝露により達成される。(Hoffman,S.L.等(2002)185:1155−1164)。本明細書に提供される精製プロセスは、完全感染性スポロゾイトならびに弱毒化スポロゾイトの精製を対象とする。
付随SGMの測定−ELISA
提供される方法により、任意のPlasmodium種のスポロゾイトを精製しうる。本明細書に提供される実施例は、P.falciparumのスポロゾイト(PfSPZ)の精製を記載する。しかし、他の実施形態は、P.vivax、P.ovale、P.malariae、および/またはP.knowlesiを利用する。さらに他の実施形態は、これらの寄生虫の混合物を利用する。さらに他の実施形態は、各種の弱毒化スポロゾイトを利用する。さらに他の実施形態は、その寄生虫とは異質のDNA配列または遺伝子を含み発現する弱毒化スポロゾイトを利用する。
i)蚊からの唾液腺摘出
蚊唾液腺に対するウサギ抗血清を生成するために、生後10〜14日の昆虫飼育場飼育Anopheles stephensi蚊を、4□Cの冷蔵庫中におよそ5分間置いて静止させた。静止した蚊を、70%エタノールを含むペトリ皿に短時間置き、それから、1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)を含むペトリ皿に移した。各蚊から一対の唾液腺を、顕微鏡ガラススライド上で1X PBS中において手で解剖し、20〜30μlの1X PBSを含む1.7ml透明無菌マイクロチューブ(Axygen Scientific Inc.CA)へ移した。毎日およそ100の蚊を解剖し、30μlのPBS中の100対の唾液腺を−70□Cでフリーザ内に置いた。一回の免疫化のために十分な唾液腺が得られたら、バイアルをフリーザから除去し、室温に解凍してプールした。
一次接種のためには、1,000匹の蚊から唾液腺を解剖し、−70℃で保存した。接種の日に、ドライアイス/エタノールバスを用い室温で解凍する三つの追加的凍結融解サイクルによりサンプルを解凍し、プールし、溶解した。唾液腺を600μlの最終体積の1X PBSにおいて再構築し、Montanide ISA 720(SEPPIC,Inc.,Fairfield,NJ)で乳化した。
2mlガラスバイアル(アジュバントコントロールの二つのバイアル;アジュバント中唾液腺の二つのバイアル)を得た。750μlのMontanide ISA 720アジュバントを、5ミクロンフィルタシリンジに通した。700μlの濾過されたアジュバントを、各ガラスバイアルに注射した。300μlのPBSをコントロールバイアルに、300μlのPBS中唾液腺を実験バイアルに加えた。バイアルを、ゴムストッパでカバーした。各バイアルを、アルミニウムシールキャップでさらキャップしシールをクリンパで押圧した。バイアルを、ボルテックスパッドの小穴に置き、テープで留め、30分間ボルテックスした。
一次免疫化のためには、二つのガラスバイアルを用いて、1,000匹の蚊からの抗原を乳化し(各々1,000μlの300:700体積比の唾液腺/PBS:Montanideアジュバントを含む)、合計2mlのエマルジョン体積を得た。後続の免疫化のためには、500匹の蚊からの抗原を、2,000μlの合計体積で同様に乳化した。従って、抗原の濃度の半分が、一次接種材料と同じエマルジョン体積において後続の免疫化で注射された。すべての免疫化におけるコントロールウサギは、300:700の体積比のPBS:アジュバントを含む2mlのエマルジョンを受けた。すべてのエマルジョンが、乳化の1時間以内にウサギに接種された。
表1は、本明細書に提供される実施例において使用されるポリクローナル抗体を生成するために用いた免疫化スケジュールを提供する。このスケジュールは、ポリクローナル抗体調製の方法について制限することを目的とせず、本明細書において使用される抗体の例および開示としてのみ提供される
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、付随材料を定量した。例として、P.falciparumスポロゾイトの調製物におけるA.stephensi唾液腺に由来する唾液腺材料(SGM)を定量した。SGM標準液(非感染蚊の唾液腺から調製)の希釈物および粗唾液腺調製物からのスポロゾイトのサンプルならびに精製スポロゾイト調製物のサンプルを伴うELISAプレート(Nunc MaxiSorp Cert,N/Ster,PS,96well Flat−Bottom Immuno Plate,Cat.No.439454)を、アッセイのために調製した。一次抗体は、1:200で希釈されたウサギ抗SGM血清(上のAに記載)であった。二次抗体は、1:5,000で希釈されたアルカリホスファターゼ結合抗ウサギIgGであった(Promega,Cat.No.S373B)。KPL Blue Phos SubstrateおよびStop Kits(KPL,Cat No.50−88−06および50−89−00)を用いた。Molecular Devices Microplate Readerで、635nmでプレートを読みとった。
キャンペーン3におけるスポロゾイトの精製
本開示のサイズ排除濾過を用いて、粉砕された唾液腺調製物からスポロゾイトを精製した。スポロゾイトは、精製プロセスの間中、精製溶媒中に維持した。精製の終わりに、目視(鏡検)、バイオ負荷テスト(USP<61>)、ミコプラズマおよびスピロプラズマのテスト、ウイルス汚染物質のin vitro決定;ならびにSGM−ELISAアッセイのためにサンプルを除去した。
精製のための材料の調製:272〜356匹の間の蚊からの粉砕された解剖産物を、全てまとめて管に受け取った。解剖産物のサンプル(5μl)を除去し、プール後目視のために22oCで取り置いた(図1a)。そして、残りの解剖産物を、精製溶媒で10mlに希釈した。この時点でサンプル(合計100μl)を計数(20μl)およびSGMアッセイ(60μl)のため除去した。すべての溶液およびサンプルを、精製の間約22℃に保った。
キャンペーン6におけるスポロゾイトの精製
上記の実施例2に記載のようにサイズ排除濾過を用いて、粉砕唾液腺調製物からスポロゾイトを精製した。スポロゾイトは、精製プロセスの間中、精製溶媒中に維持した。目視(鏡検)、微生物学的テスト、およびSGM−ELISAアッセイによるサンプル中のSGMの量の定量のためにサンプルを除去した。実施例2のようにサンプルを調製し精製した。
キャンペーン5、6および7からの放射線照射(150GY)P.falciparumスポロゾイトによるヒト肝細胞系統(HC−04[1F9])のインフェクション。
放射線照射(100、120、142.5、150Gy)または放射線非照射P.falciparumスポロゾイトによるヒト幹細胞系統(HC−04[1F9])のインフェクション。
Claims (35)
- 代謝的に活性な、Plasmodium種スポロゾイトの精製された調製物であって、25,000スポロゾイトあたり85ナノグラム未満の付随材料を含む、精製された調製物。
- 25,000スポロゾイトあたり15ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項1に記載の精製された調製物。
- 25,000スポロゾイトあたり1ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項1に記載の精製された調製物。
- 25,000スポロゾイトあたり0.12ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項1に記載の精製された調製物。
- 前記スポロゾイトが、唾液腺材料の精製前調製物から精製されており、ここで、付随材料の少なくとも98%が、前記精製前調製物から除去されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の精製された調製物。
- 前記付随材料の少なくとも99.9%が前記精製前調製物から除去されている、請求項5に記載の精製された調製物。
- 前記付随材料の少なくとも99.97%が前記精製前調製物から除去されている、請求項5に記載の精製された調製物。
- 無菌的に調製されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の精製された調製物。
- 前記スポロゾイトが、一つ以上の導入遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の精製された調製物。
- 前記Plasmodium種スポロゾイトの種が、P.falciparum、P.vivax、P.malariae、P.knowlesiおよびP.ovaleからなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の精製された調製物。
- 前記スポロゾイトが、宿主の感染後に前記寄生虫がマラリアの疾患病状をもたらすことができないように、十分に弱毒化されており、前記弱毒化が、遺伝性遺伝子改変もしくは遺伝子変異の導入により、または放射線曝露、化学物質暴露、もしくは環境曝露により、確立される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の精製された調製物。
- 前記弱毒化が、放射線曝露により確立され、前記放射線曝露が、少なくとも100Gyであるが、1000Gyを超えない照射である、請求項11に記載の精製された調製物。
- 前記放射線曝露が約150Gyである、請求項12に記載の精製された調製物。
- ヒト宿主または他の哺乳動物宿主においてPlasmodium種寄生虫感染により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与するのに使用するための請求項11〜13のいずれか1項に記載の精製された調製物を含む組成物であって、前記精製された調製物は、無菌的に調製されており、前記Plasmodium種の病原性寄生虫への後の曝露時に、前記マラリアの病理学的発現が前記宿主において防止され、前記組成物の少なくとも一用量が投与されるものであることを特徴とする、組成物。
- 少なくとも二用量または少なくとも三用量の前記組成物が投与されるものであることを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において、Plasmodium種寄生虫により誘導されるマラリアに対する防御免疫を付与するのに使用するための請求項1〜10のいずれか1項に記載の精製された調製物を含む組成物であって、前記組成物の少なくとも一用量が、抗マラリア剤と組み合わされて投与されるものであることを特徴とし、防御免疫が、前記ヒト宿主または他の哺乳動物宿主において付与される、組成物。
- 前記抗マラリア剤が、クロロキンである、請求項16に記載の組成物。
- 代謝的に活性なPlasmodiumスポロゾイトの種の精製のための方法であって、前記方法は、
a.Plasmodiumスポロゾイトと付随非スポロゾイト材料とを含む、水性精製前調製物を提供するステップと;
b.
i)10ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第一排除フィルタと;
ii)約1.2ミクロンより大きい付随材料を保持するが、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第二排除フィルタと;
iii)1.2ミクロンまたはそれより小さな材料を通過させ、前記スポロゾイトの通過を許容することができる孔径の、第三メンブレンフィルタと;
を含む、一組のサイズ排除フィルタに、前記水性精製前調製物を順次通すステップと;
c.前記スポロゾイトを保持することができる孔径の収集フィルタに、全量濾過により、前記精製されたスポロゾイト調製物を収集するステップと;
d.前記精製されたスポロゾイト調製物を、前記収集フィルタから取り出すステップであって、前記精製されたスポロゾイト調製物が、実質的に精製されたPlasmodium種スポロゾイトを含むステップと
を含み、前記精製されたスポロゾイト調製物が25,000スポロゾイトあたり85ナノグラム未満の付随材料を含む、方法。 - 前記精製前調製物が、Plasmodiumに感染したAnopheles蚊の唾液腺に由来する、請求項18に記載の方法。
- 前記第一フィルタ、前記第二フィルタ、および前記第三フィルタがシステムにおいて順次接続され、前記スポロゾイトがある流量で前記フィルタを横断して通過する、請求項18または19に記載の方法。
- 前記システムが、少なくとも3L/時/m2であるが1500L/時/m2を超えない流量を有する、請求項20に記載の方法。
- 前記システムが、少なくとも125L/時/m 2 であるが250L/時/m 2 を超えない流量を有する、請求項21に記載の方法。
- 前記第一排除フィルタが、少なくとも2.5ミクロンであるが30ミクロンを超えない公称孔径を有する、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一排除フィルタが、10ミクロンの公称孔径を有する、請求項23に記載の方法。
- 前記第二排除フィルタが、少なくとも0.3ミクロンであるが1.2ミクロンを超えない公称孔径を有する、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第二排除フィルタが、0.6ミクロンの公称孔径を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記第三フィルタが、少なくとも1.2ミクロンであるが3ミクロンを超えない孔径を有する、請求項18〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第三排除フィルタが、1.2ミクロンの孔径を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記収集フィルタが、0.4ミクロンの孔径を有する、請求項18〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記精製されたスポロゾイト調製物が、25,000スポロゾイトあたり15ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項18〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記精製されたスポロゾイト調製物が、25,000スポロゾイトあたり1ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記精製されたスポロゾイト調製物が、25,000スポロゾイトあたり0.12ナノグラム未満の付随材料を含む、請求項30に記載の方法。
- 付随材料の少なくとも98%が前記精製前調製物から除去されている、請求項18〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記付随材料の少なくとも99.9%が前記精製前調製物から除去されている、請求項33に記載の方法。
- 前記付随材料の少なくとも99.97%が前記精製前調製物から除去されている、請求項33に記載の方法。
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