JP5160005B2 - Sustained release formulation - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、投与直後の初期放出が少なく、長期間にわたって一定量の生理活性物質を放出する徐放性製剤およびその分散媒等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性ペプチドは、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。例えば、成長ホルモン（以下、ＧＨと略記することがある）は、元来下垂体前葉で産生・分泌される代表的なホルモンで、身体の成長促進に働くほか、糖・脂質代謝、蛋白同化、細胞増殖や分化に関与する等、幅広く多彩な生理作用を有する生理活性ペプチドであり、現在では遺伝子組換え技術を用いて大腸菌により大量生産され、医薬品として全世界で広く臨床応用されている。しかし、ＧＨは生体内半減期が短く、有効血中濃度を維持するためには頻回投与が必要である。とりわけ、ＧＨ分泌不全性低身長症の場合には、乳幼児あるいは若年患者に対して、数ヶ月から１０年以上の長期にわたる連日皮下投与がなされているのが実状である。
このような生理活性ペプチド性医薬品固有の問題に対処するため、薬物送達システムに関する種々の研究が行われてきた。例えば、生理活性ペプチドを長期間にわたって持続放出する徐放剤である。特開平８−２１７６９１号公報（ＷＯ９６／０７３９９号）には、水溶性ペプチド性生理活性物質を塩化亜鉛水溶液等により水不溶性ないし水難溶性多価金属塩とし、これと生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤の製造法が開示されている。また、特開平１１−３２２６３１号公報には、生理活性ペプチド水溶液に、水混和性有機溶媒および／または揮発性塩類を添加し凍結乾燥することにより得られる生理活性ペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法が開示されている。また、特開平９−１３２５２４号公報には、生理活性物質と生体内分解性ポリマーとを含有する徐放性マイクロカプセルの製造法において、マイクロカプセル化後に該生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で約２４〜１２０時間加熱乾燥することにより、残留有機溶媒が極めて少ない、医薬品として臨床上、非常に優れた性質を有する徐放性マイクロカプセルの製造法が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
徐放性製剤は生理活性物質の活性を保持しながら、長期間にわたって一定量の生理活性物質を放出できることが望ましく、そのために投与直後の初期放出を抑制する手段が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意研究を進め、アルカリ金属イオン濃度を約１０μｇ／ｍＬ以下とすることにより得られた微細粉末化した生理活性物質および生体内分解性ポリマーを含む徐放性製剤において、カチオン性物質またはポリオール類をマイクロカプセル等のマトリックスと共存させることにより、予想外にも投与直後の生理活性物質の初期放出が飛躍的に抑制され、長期間にわたって一定量の生理活性物質を放出し、医薬品として臨床上、非常に優れた性質を有する徐放性製剤を製造できることを見出し、これらに基づいて本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）生理活性物質を含有したマトリックスとカチオン性物質および／またはポリオール類とを組み合わせてなる生理活性物質の初期放出が抑制された徐放性製剤、
（２）生理活性物質を含有したマトリックスとカチオン性物質および／またはポリオール類とを混合してなる上記（１）記載の徐放性製剤、
（３）生理活性物質を含有したマトリックスの表面にカチオン性物質および／またはポリオール類が保持された上記（１）記載の徐放性製剤、
（４）カチオン性物質が塩基性物質または水溶性多価金属塩である上記（１）記載の徐放性製剤、
（５）塩基性物質が塩基性アミノ酸である上記（４）記載の徐放性製剤、
（６）塩基性アミノ酸がアルギニンまたはリシンである上記（５）記載の徐放性製剤、
（７）塩基性物質が塩基性添加物である上記（４）記載の徐放性製剤、
（８）塩基性添加物が塩化ベンザルコニウムまたはＮ−メチルグルカミンである上記（７）記載の徐放性製剤、
（９）塩基性物質が塩基性ペプチド、塩基性ポリアミンまたは塩基性多糖類である上記（４）記載の徐放性製剤、
（１０）塩基性ペプチドがプロタミンまたはその塩である上記（９）記載の徐放性製剤、
（１１）塩基性ポリアミンがスペルミジンまたはスペルミンである上記（９）記載の徐放性製剤、
（１２）塩基性多糖類がキトサンである上記（９）記載の徐放性製剤、
（１３）水溶性多価金属塩が水溶性亜鉛塩である上記（４）記載の徐放性製剤、
（１４）水溶性亜鉛塩が塩化亜鉛または酢酸亜鉛である上記（１３）記載の徐放性製剤、
（１５）ポリオール類がポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールである上記（１）記載の徐放性製剤、
（１６）生理活性物質が生理活性ペプチドである上記（１）記載の徐放性製剤、
（１７）生理活性ペプチドが分子量約２００〜約５００，０００である上記（１６）記載の徐放性製剤、
（１８）生理活性ペプチドが分子量約５，０００〜約５００，０００である上記（１６）記載の徐放性製剤、
（１９）生理活性ペプチドがホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子または酵素である上記（１６）記載の徐放性製剤、
（２０）生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンである上記（１６）記載の徐放性製剤、
（２１）マトリックス基剤が生体内分解性ポリマーである上記（１）記載の徐放性製剤、
（２２）生体内分解性ポリマーがα−ヒドロキシカルボン酸類の単独もしくは共重合体またはそれらの混合物である上記（２１）記載の徐放性製剤、
（２３）生体内分解性ポリマーが乳酸／グリコール酸の組成比が約１００／０〜約４０／６０モル％の共重合体である上記（２１）記載の徐放性製剤、
（２４）生体内分解性ポリマーが乳酸単独重合体である上記（２１）記載の徐放性製剤、
（２５）生体内分解性ポリマーの重量平均分子量が約３，０００〜約５０，０００である上記（２１）記載の徐放性製剤、
（２６）マトリックスがマイクロカプセルである上記（１）記載の徐放性製剤、
（２７）注射用である上記（１）記載の徐放性製剤、
（２８）生理活性物質を含有したマトリックスとカチオン性物質および／またはポリオール類と分散媒とを含有する上記（１）記載の徐放性製剤、
（２９）上記（２８）記載の徐放性製剤製造用のカチオン性物質および／またはポリオール類を含有する分散媒、
（３０）カチオン性物質が塩基性物質または水溶性多価金属塩である上記（２９）記載の分散媒、
（３１）塩基性物質が塩基性アミノ酸である上記（３０）記載の分散媒、
（３２）塩基性アミノ酸がアルギニンまたはリシンである上記（３１）記載の分散媒、
（３３）塩基性物質が塩基性添加物である上記（３０）記載の分散媒、
（３４）塩基性添加物が塩化ベンザルコニウムまたはＮ−メチルグルカミンである上記（３３）記載の分散媒、
（３５）塩基性物質が塩基性ペプチド、塩基性ポリアミンまたは塩基性多糖類である上記（３０）記載の分散媒、
（３６）塩基性ペプチドがプロタミンまたはその塩である上記（３５）記載の分散媒、
（３７）塩基性ポリアミンがスペルミジンまたはスペルミンである上記（３５）記載の分散媒、
（３８）塩基性多糖類がキトサンである上記（３５）記載の分散媒、
（３９）水溶性多価金属塩が水溶性亜鉛塩である上記（３０）記載の分散媒、
（４０）水溶性亜鉛塩が塩化亜鉛または酢酸亜鉛である上記（３９）記載の分散媒、
（４１）ポリオール類がポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールである上記（２９）記載の分散媒、
（４２）浸透圧調整剤を含有する上記（２９）記載の分散媒、
（４３）浸透圧調整剤が糖類または塩類である上記（４２）記載の分散媒、
（４４）粘稠化剤を含有する上記（２９）記載の分散媒、
（４５）粘稠化剤が水溶性多糖類である上記（４４）記載の分散媒、
（４６）界面活性剤を含有する上記（２９）記載の分散媒、
（４７）界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記（４６）記載の分散媒、
（４８）注射用である上記（２９）記載の分散媒、
（４９）生理活性物質を含有したマトリックスを含有する徐放性製剤にカチオン性物質および／またはポリオール類を混合することを特徴とする生理活性物質の初期放出の抑制方法、
（５０）生理活性物質溶液中のアルカリ金属イオン濃度を約１０μｇ／ｍＬ以下とすることにより得られる生理活性物質微細粒子、
（５１）生理活性物質が生理活性ペプチドである上記（５０）記載の微細粒子、
（５２）生理活性ペプチドがホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子または酵素である上記（５１）記載の微細粒子、
（５３）生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンである上記（５１）記載の微細粒子、
（５４）重量平均粒子径が約０．５μｍ〜約２．０μｍである上記（５０）記載の微細粒子、
（５５）生理活性物質溶液中のアルカリ金属イオン濃度を約１０μｇ／ｍＬ以下である生理活性物質溶液を用いることを特徴とする、生理活性物質微細粒子の製造法、
（５６）溶液にさらに酢酸アンモニウムを含有する上記（５０）記載の微細粒子、
（５７）上記（５０）記載の微細粒子を含有した徐放性製剤、
（５８）徐放性製剤の基剤が生体内分解性ポリマーである上記（５７）記載の徐放性製剤、
（５９）生体内分解性ポリマーがα―ヒドロキシカルボン酸類の単独もしくは共重合体、またはそれらの混合物である上記（５８）記載の徐放性製剤、
（６０）生体内分解性ポリマーが乳酸／グリコール酸の組成比が約１００／０〜約４０／６０モル％の共重合体である上記（５８）記載の徐放性製剤、
（６１）生体内分解性ポリマーが乳酸単独重合体である上記（５８）記載の徐放性製剤、
（６２）生体内分解性ポリマーの重量平均分子量が約３，０００〜約５０，０００である上記（５８）記載の徐放性製剤、および
（６３）マイクロカプセルである上記（５７）記載の徐放性製剤を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における生理活性物質としては、特に限定されないが、例えば生理活性を有するペプチド系化合物（以下、「生理活性ペプチド」という）、その他抗生物質、抗真菌薬、抗高脂血症薬、抗腫瘍薬、解熱薬、鎮痛薬、消炎薬、鎮咳去痰薬、鎮静薬、筋弛緩薬、抗てんかん薬、抗潰瘍薬、抗うつ薬、抗アレルギー薬、強心薬、不整脈治療薬、血管拡張薬、降圧利尿薬、糖尿病治療薬、抗凝血薬、止血薬、抗血小板薬、抗結核薬、ホルモン薬、麻薬拮抗薬、骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、血管新生抑制薬が挙げられる。このうち、特にペプチド系化合物が好ましい。
本発明における生理活性ペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることが出来る種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該「生理活性ペプチド」は、その分子量がモノマーとして、例えば約２００ないし５００，０００のものが用いられ、好ましくは分子量約１，０００ないし５００，０００のものが汎用される。さらに好ましくは分子量５，０００ないし約５００，０００のペプチドが用いられる。
生理活性ペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。該生理活性ペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、さらにそれらの誘導体ないし類縁体でもよい。該生理活性ペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明における生理活性ペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、ペプチド性神経伝達物質、造血因子、各種増殖因子、酵素、ペプチド系抗生物質、鎮痛性ペプチド等が用いられる。
ペプチドホルモンとしては、例えばインスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（サンドスタチン，米国特許第４，０８７，３９０号，同第４，０９３，５７４号，同第４，１００，１１７号，同第４，２５３，９９８号参照）、成長ホルモン（ＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイド等）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、その塩およびその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、サイモシン（チモシン）、モチリン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻 第５号 第６７６ないし６９１頁（１９７８）〕参照｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）およびその誘導体（特開平６−８０５８４号、特開平７−２６９５号、ＥＰ６５８５６８号、特開平８−２４５６９６号、特開平８−２６９０９７号、ＷＯ９７／１５２９６号、ＷＯ９７／３１９４３号、ＷＯ９８／１９６９８号、ＷＯ９８／４３６５８号、特表平１０−５１１３６５号、ＷＯ９９／５５３１０号、特表平１１−５１３９８３号、ＣＡ２２７０３２０号、ＷＯ９９／６４０６１号、特表平１１−５１４９７２号、特表２０００−５００５０５号、ＷＯ２０００／６６１３８号、ＷＯ２０００／６６１４２号、ＷＯ２０００／７８３３３号、特開２００１−１１０９５号、Tissue Eng. ７（１）３５−４４（２００１）、Diabetologia ４３（１０）１３１９−１３２８（２０００）、ＷＯ２０００／３４３３１号、ＷＯ２０００／３４３３２号、米国特許第６，２６８，３４３号、米国公開２００１０１１０７１号、米国公開２００１００６９４３号、ＥＰ０７３３６４４号、ＷＯ２０００／７７０３９号、ＷＯ９９／４３７０７号、ＷＯ９９／４３３４１号、ＷＯ９９／４３７０６号、ＷＯ９９／４３７０８号、ＷＯ９９／４３７０５号、ＷＯ９９／２９３３６号、ＷＯ２０００／３７０９８号、ＥＰ０９６９０１６号、米国特許第５，９８１，４８８号、米国特許第５，９５８，９０９号、ＷＯ９３／２５５７９号、ＷＯ９８／４３６５８号、ＥＰ０８６９１３５号、米国特許第５，６１４，４９２号、米国特許第５，５４５，６１８号、米国特許第５，１２０，７１２号、米国特許第５，１１８，６６６号、ＷＯ９５／０５８４８号、ＷＯ９１／１１４５７号、ＥＰ０７０８１７９号、ＷＯ９６／０６６２８号、ＥＰ０６５８５６８号、ＷＯ８７／０６９４１号参照）、メタスチンおよびその誘導体（ＷＯ２０００／２４８９０号参照）等が用いられる。ペプチドホルモンとしては、好ましくはインスリンおよび成長ホルモン等である。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカイン等が用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン類（アルファ型、ベータ型、ガンマ型等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２等）等が用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等が用いられる。サイトカインとしては、好ましくはリンホカイン等、さらに好ましくはインターフェロン等、特に好ましくはインターフェロンアルファ等である。
ペプチド性神経伝達物質としては、例えばサブスタンスＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ等が用いられる。
【０００７】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーター等が用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−瘁ＡＴＧＦ−竅ＡＰＤＧＦ，酸性ＦＧＦ，塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−９等）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ等）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２等）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリー等が用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン等が用いられる。
ペプチド系抗生物質としては、例えばポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン等が用いられる。
鎮痛性ペプチドとしては、例えばエンケファリン、エンケファリン誘導体〔米国特許第４，２７７，３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフィン、キョウトルフィン等が用いられる。
その他、生理活性ペプチドとしては、サイモポエチン、ダイノルフィン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）およびその誘導体（米国特許第４，２２９，４３８号参照）、およびその他の胸腺因子〔医学のあゆみ、第１２５巻，第１０号，８３５−８４３頁（１９８３年）〕、ニューロテンシン、ブラジキニンおよびエンドセリン拮抗作用を有するペプチド類（ヨーロッパ特許公開第４３６１８９号、同第４５７１９５号，同第４９６４５２号、特開平３−９４６９２号、同３−１３０２９９号公報参照）等が挙げられる。
本発明に特に好ましく適用される生理活性ペプチドとしては、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）およびこれと同様の作用を有する誘導体あるいはＬＨ−ＲＨ拮抗物質、成長ホルモン、インスリン等が挙げられ、中でも成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンが好ましい。
【０００８】
本発明において、生理活性ペプチドが金属を含有する場合、必要な場合には、生理活性ペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
成長ホルモンとしては、いずれの種由来のものでも良いが、好ましくはヒト成長ホルモンである。また、脳下垂体等から抽出される天然由来も本発明に用いられるが、好ましくは遺伝子組換え型ＧＨ（特公平６−１２９９６号公報、特公平６−４８９８７号公報参照）であり、さらに好ましくはＮ末端にメチオニンを有さない天然型と同じ構造を有する組換え型ｈＧＨである。該ＧＨとしては金属塩であってもよいが、実質的に金属を含有しないＧＨも用いられる。ｈＧＨとしては、分子量約２２Ｋダルトンのみならず、分子量約２０Ｋダルトンのもの（特開平７−１０１８７７号公報、特開平１０−２６５４０４号公報参照）を用いてもよい。また、ｈＧＨの誘導体あるいはその関連タンパク質（ＷＯ９９／０３８８７号公報参照）を用いてもよい。
【０００９】
本発明の徐放性製剤における生理活性物質の配合量は生理活性物質の種類等によって異なるが、例えば生理活性ペプチドの場合、通常約０．１〜５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．２ないし３０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．５ないし２０％（Ｗ／Ｗ）である。
本発明におけるマトリックスとは、基剤（例えば、生体内分解性ポリマー）で生理活性物質を含有した固形物であり、必要に応じて添加物をも含有するものであり、実質的に徐放性を制御している単位であり、例えばマイクロカプセル、埋込用ロッド等の形態がある。
本発明に用いられる生体内分解性ポリマーとしては、例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水重縮合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例えば、スチレン−マレイン酸重合体等）等が挙げられる。これらはホモポリマーまたはコポリマーのいずれであってもよい。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、上記のα−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−体のいずれも用いることができる。
これらの中では、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマー、例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例えば、乳酸重合体、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル等が好ましい。
生体内分解性ポリマーとしては、さらに好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体等、特に好ましくは乳酸−グリコール酸重合体等である。
【００１０】
本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の単重合体のみならず乳酸−グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸−グリコール酸重合体と称することがある。
生体内分解性ポリマーとして乳酸−グリコール酸重合体（乳酸−グリコール酸共重合体または単重合体）を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましく、約８５／１５ないし約５０／５０がさらに好ましい。
乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００ないし約５０，０００が好ましく、約３，０００ないし約２５，０００がより好ましく、約５，０００から約２０，０００がさらに好ましい。
乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２ないし約４．０が好ましく、約１．５ないし約３．５がさらに好ましい。
【００１１】
なお、本明細書での重量平均分子量および分散度に関し、前者は重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の値、後者はこの値から算出した値である。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いて行う。
【００１２】
また、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、末端基定量による数平均分子量と上記のＧＰＣ測定による数平均分子量がほぼ一致するポリマーであり、末端基定量による数平均分子量は以下のようにして算出される。
約１ｇないし約３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン（２５ｍＬ）とメタノール（５ｍＬ）との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で、室温（２０℃）で攪拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量＝２００００×Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ｍＬ）
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対して、ＧＰＣ測定による数平均分子量は、各種分析・解析条件（例えば、移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、両測定による数平均分子量がほぼ一致するとは、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体において、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０．５倍から約２倍の範囲内であること、好ましくは約０．７倍から約１．５倍の範囲内であることをいう。
例えば、１種類以上のα−ヒドロキシカルボン酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍以上に大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は、末端に遊離のカルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００１３】
末端に遊離のカルボキシル基を有する乳酸−グリコール酸重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応または無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法等）に従って製造することができる。
乳酸−グリコール酸重合体の分解・消失速度は、組成比あるいは重量平均分子量によって大きく変化するが、一般的にはグリコール酸分率が低いほど分解・消失が遅いため、グリコール酸分率を低くするかあるいは分子量を大きくすることによって放出期間を長くすること（例えば、約６ヶ月）ができる。逆に、グリコール酸分率を高くするあるいは分子量を小さくすることによって放出期間を短くこと（例えば、約１週間）もできる。例えば、１週間ないし２ヶ月型徐放性製剤とするには、上記組成比および重量平均分子量の範囲の乳酸−グリコール酸重合体を用いるのが好ましい。
【００１４】
したがって、本発明において用いる生体内分解性ポリマーの組成は、目的とする生理活性ペプチドの種類、所望の徐放期間等に応じて、適宜選択されることが好ましい。その具体例としては、例えば、生理活性ペプチドとしてＧＨを用いる場合、乳酸−グリコール酸重合体を用いることが好ましく、該乳酸−グリコール酸重合体としては、その乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が８５／１５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体が好ましく、さらに好ましくは約７５／２５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体である。またその重量平均分子量は約８，０００ないし約２０，０００が好ましく、さらに好ましくは約１０，０００ないし約２０，０００である。また、乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２ないし約４．０が好ましく、さらに好ましくは約１．５ないし約３．５である。
用いる乳酸−グリコール酸重合体は、上記公報記載の方法等、公知の方法に従い製造できる。該重合体は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。上記ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とが、ほぼ一致する乳酸−グリコール酸重合体（ＰＬＧＡ）を用いることが好ましい。
また、該重合体は組成比および／または重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約１０，０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約１２，０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物等が用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５ないし約７５／２５である。
【００１５】
また、本発明で用いる生体内分解性ポリマーは、上記した生体内分解性ポリマーの金属塩であってもよく、例えば、ＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の各種生体内分解性ポリマーの多価金属塩等が用いられる。好ましくは乳酸−グリコール酸重合体の多価金属塩（さらに好ましくは亜鉛塩，カルシウム塩，マグネシウム塩等、より好ましくは亜鉛塩等）等が用いられる。該多価金属塩の金属種としては、生体に悪影響を及ぼさない化合物であれば特に限定されず、例えば２価（例、鉄、亜鉛、銅、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、スズ、マンガン等）、３価（例、鉄、アルミニウム、マンガン等）、４価（例、スズ等）などの多価金属も用いることができる。
本明細書においては、生体内分解性ポリマーが金属塩の場合も含めて生体内分解性ポリマーと称することがあり、例えば乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩の場合も乳酸−グリコール酸重合体と称することがある。
これらの生体内分解性ポリマーの多価金属塩はＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の方法およびこれに準じる方法により製造することができる。
また、生体内分解性ポリマーの多価金属塩が亜鉛塩の場合には、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中で反応させることによって製造することもできる。
有機溶媒への生体内分解性ポリマーおよび酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。
本発明の徐放性製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、通常約３０ないし９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０ないし９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０ないし９０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００１６】
本発明における徐放性製剤の製造時に、生体内分解性ポリマーの溶解に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール等）、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、酢酸エチル、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等）と、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール等）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約１００：１ないし約１：１であり、好ましくは約３０：１ないし約２：１の混合溶媒を用いることが望ましい。また、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０．０１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．１ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約１ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００１７】
本発明におけるカチオン性物質とは、塩基性物質あるいは水溶性多価金属塩を示す。
塩基性物質としては塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン等）、塩基性ペプチド（例えば、プロタミン、硫酸プロタミン、塩酸プロタミン、リン酸プロタミン等のプロタミンまたはその塩等）、塩基性ポリアミン（例えば、スペルミジン、スペルミン等）、塩基性多糖類（例えば、キトサン等）、塩基性添加物（例えば、塩化ベンザルコニウム、Ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）等）等が挙げられる。水溶性多価金属塩としては、水溶性亜鉛塩（例えば、塩化亜鉛、酢酸亜鉛）、水溶性カルシウム塩、水溶性マグネシウム塩等が挙げられる。
本発明におけるポリオール類としては、ポリエチレングリコールやプロピレングリコール等が挙げられる。
本発明におけるカチオン性物質および／またはポリオール類の投与量（添加量）は、カチオン性物質、ポリオール類の種類、対象動物、投与部位等によって種々異なるが、好ましくは小児あるいは成人１人あたり約０．０００１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。カチオン性物質、ポリオール類の投与量（添加量）は、該カチオン性物質、ポリオール類の使用実績範囲量であることが好ましい。例えば、カチオン性物質が硫酸プロタミンである場合、小児あるいは成人に対する投与量は皮下投与の場合は使用実績量３．５ｍｇ以下が好ましい。カチオン性物質がアルギニンである場合は、小児あるいは成人に対する投与量は皮下投与の場合は使用実績量４０ｍｇ以下、筋肉内投与の場合は１６２０ｍｇ以下が好ましい。
本発明の徐放性製剤に含まれるカチオン性物質および／またはポリオール類の含量は、製剤全体に対して、約０．０００１〜８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．００１〜４０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．０１〜２０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００１８】
本発明における徐放性製剤とは、マトリックス形成後に、必要に応じて賦形剤（例えば、マンニトール）を加えて処理（例えば、凍結乾燥）したものをいう。
本発明における生理活性物質の初期放出率とは、動物（ラット）に徐放性製剤を投与後１日以内に放出された生理活性物質量の投与用量に対する割合を示す。
本発明の徐放性製剤は、生理活性物質を含有したマトリックスとカチオン性物質および／またはポリオール類とが共存しておればよく、両者が混合されている場合の他、両者が別々の容器に含有されていて用時調製（懸濁）してもよい。また、例えば、１つの容器（例えば、デュアルチャンバー・プレフィルドシリンジ等）内で、マトリックスとカチオン性物質および／またはポリオール類と分散媒の三者が互いに接触することなく独立して存在し、投与する直前に三者が混合されるような形態をとることも可能である。
本発明の徐放性製剤におけるカチオン性物質および／またはポリオール類は、マトリックスの内部には存在しておらず、マトリックスの表面（外部）に保持（付着）されているか、または、分散媒に含有されていてもよい。
【００１９】
本発明における分散媒とは、徐放性製剤を懸濁液として注射する際に使用する液媒体を示し、好ましくは水溶性媒体を示す。分散媒は通常、浸透圧調整剤（等張化剤）、粘稠化剤（懸濁化剤）、界面活性剤、保存剤（安定化剤）、無痛化剤、局所麻酔剤等を含有する。浸透圧調整剤（等張化剤）としては例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等が、粘稠化剤（懸濁化剤）としては例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、デキストラン等の多糖類等が、界面活性剤としては例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ＨＣＯ−６０等が、保存剤（安定化剤）としては例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等が、無痛化剤としては例えばベンジルアルコール等が、局所麻酔剤としては例えば塩酸キシロカイン、クロロブタノール等が用いられる。さらに、必要に応じてｐＨ調整剤（例えば、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、あるいは各種緩衝剤）を含有する。また、上記水性分散媒に加え、油性分散媒も使用される。ゴマ油、コーン油等の植物油あるいはこれにレシチン等のりん脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例えば、ミグリオール８１２）等が油性分散媒として使用できる。
【００２０】
本発明における生理活性物質を含有したマトリックスは、生理活性物質溶液を凍結乾燥して得られる粉体（Ｓ相）を生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｓ／Ｏ型分散液から溶媒を除去することにより、あるいは生理活性物質を水溶液とした水相（Ｗ相）を生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｗ／Ｏ型乳化液から溶媒を除去することにより、もしくは生理活性物質を生体内分解性ポリマーとともに有機溶媒液（Ｏ相）に溶解させた液から溶媒を除去することにより、製造される。その製造法としては、例えば（ａ）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法およびＷ／Ｏ／Ｗ法もしくはＯ／Ｗ法）、（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）および（ｃ）噴霧乾燥法、あるいはこれらに準じた方法等が挙げられる。以下に生理活性物質を含有したマトリックスとして、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
【００２１】
（ａ−１）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性物質水溶液に水混和性の有機溶媒および／または揮発性塩類を添加した後、凍結乾燥により生理活性物質粉体（Ｓ相）を作成する。この際、微細な粉体を得るためには、生理活性物質溶液中の塩濃度、例えばアルカリ金属（ナトリウム、カリウム、カルシウムなど）イオン濃度が低いことが好ましい。例えば、アルカリ金属がナトリウムである場合には、そのイオン濃度は約１０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性物質粉体を添加し分散させる。この際、生理活性物質と生体内分解性ポリマーとの比率（重量比）は、例えば約１：１０００ないし約１：１、好ましくは約１：２００ないし約１：５、さらに好ましくは約１：１００ないし約１：５である。また、生理活性物質粉体を有機溶媒液中に均一に分散させるため、外部物理的エネルギーを加えることが好ましい。その方法としては例えば、超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が用いられる。この時の有機溶媒液中での生理活性物質の平均粒子径としては約１０μｍ以下、さらに好ましくは約０．１μｍないし約５μｍ、より好ましくは約０．５μｍないし約２μｍであることが望ましく、本発明により得られた生理活性物質粉体を用いることにより容易に達成される。本発明における生理活性物質の平均粒子径は、ホモジナイザーを用いて該生理活性物質をジクロロメタン等の有機溶媒中で分散した後に、レーザー解析式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）により得られる値を示す。その際、生理活性物質はジクロロメタン等の有機溶媒に、例えば約２０ないし１００ｍｇ／ｍＬの濃度で添加後、ホモジナイザー（例えば、ポリトロン（キネマチカ社））を用いて約２０，０００ｒｐｍで約３０秒ないし１分間攪拌することにより分散液とされ、さらに上記粒度分布測定装置の測定可能な範囲となるように適宜、該有機溶媒で希釈し、供試される。
次いでこのようにして調製された有機溶媒分散液（Ｓ／Ｏ型分散液）を、さらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記と同様の外部物理的エネルギー、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、あるいはホモジナイザー等によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる。以後、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。この際の水相体積は、一般的には油相体積の約１倍ないし約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは約２倍ないし約５，０００倍から選ばれる。
特に好ましくは約５倍ないし約２，０００倍から選ばれる。
上記外水相中には、乳化剤を加えてもよい。該乳化剤としては、一般的に安定なＳ／Ｏ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。これらは適宜組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは約０．００１％ないし２０％（Ｗ／Ｗ）である。さらに好ましくは約０．０１％ないし１０％（Ｗ／Ｗ）、特に好ましくは約０．０５％ないし５％（Ｗ／Ｗ）である。
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水による洗浄で除去し、再び蒸留水等に分散して凍結乾燥する。
【００２２】
本法において生理活性物質水溶液に添加される水混和性の有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等、好ましくはメタノール、エタノール等）、アセトン等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよいが、好ましくはアルコール類、特にエタノールを単独で用いることが望ましい。また、生理活性物質水溶液への添加量（濃度）は、体積比において約０．０３ないし０．５％（Ｖ／Ｖ）であり、好ましくは約０．０６ないし０．２５％（Ｖ／Ｖ）、さらに好ましくは約０．１ないし０．１５％（Ｖ／Ｖ）である。このような水混和性の有機溶媒の添加により得られる生理活性物質水溶液を、さらに凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）生理活性物質粉体が作成できる。
本法において生理活性物質水溶液に添加される揮発性の塩類としては、例えばアンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、好ましくは酢酸アンモニウム等）が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。揮発性の塩類の生理活性物質水溶液への添加量は、モル比において約１０倍ないし約８０倍モルであり、好ましくは約１０倍ないし約７０倍モルであり、さらに好ましくは約１５倍ないし約７０倍モルであり、より好ましくは約２０倍ないし約７０倍モルであり、最も好ましくは約２０倍ないし約５０倍モルである。水混和性の有機溶媒を添加する場合と同様に、揮発性塩類の添加により得られる生理活性物質水溶液を、さらに凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）微細生理活性物質粉体が作成できる。
本法において、生理活性物質水溶液に添加される水混和性の有機溶媒および／または揮発性の塩類は、単独で用いてもよいし、適宜組み合わせて用いてもよい。水混和性の有機溶媒および揮発性の塩類を組み合せて用いる時は、上記のそれぞれの添加量に従って、生理活性物質水溶液に添加することができる。
【００２３】
（ａ−２）水中乾燥法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性物質に水または適当な緩衝液を添加し、生理活性物質溶液（Ｗ相）を作成する。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性物質溶液を添加し分散させる。このようにして得たＷ／Ｏ型乳化液をさらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ法と同様にＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを経由して、マイクロカプセルを得る。
（ａ−３）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性物質とともに生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、有機溶媒液（Ｏ相）をさらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ法と同様にＯ／Ｗ型エマルションを経由して、マイクロカプセルを得る。
【００２４】
（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）
本法においては、上記（ａ−１）のＳ／Ｏ型分散液あるいは（ａ−２）のＷ／Ｏ型乳化液もしくは（ａ−３）の油相溶液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えマイクロカプセルを析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、上記分散液の約０．０１倍ないし約１，０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０．０５倍ないし約５００倍、特に好ましくは約０．１倍ないし約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で使用した生体内分解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等が用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセルを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄してコアセルベーション剤を除去する。さらに、上記（ａ）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。
水中乾燥法およびコアセルベーション法でのマイクロカプセルの製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例えば、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金属塩等の水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が適宜用いられる。
【００２５】
（ｃ）噴霧乾燥法
本法においては、上記（ａ−１）のＳ／Ｏ型分散液あるいは（ａ−２）のＷ／Ｏ型乳化液もしくは（ａ−３）の油相溶液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、マイクロカプセルを製造する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際所望により、上記の分散液と同時に、マイクロカプセル粒子同志の凝集防止を目的として上記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られたマイクロカプセルは、さらに、上記（ａ）と同様に洗浄し、必要であれば加温（要すれば減圧下）により、水分および有機溶媒をさらに除去する。
本発明における生理活性物質を含有したマトリックスとして、埋込用ロッドを製造する場合の製造方法としては、生理活性物質と基剤の混合物を基剤のガラス転移温度以上に加温後、鋳型に入れて成形する方法（mold）や押し出し成形法（extrude）等がある。形状としては、ロッド状のものの他、自在に選択できる。あるいは、予め生理活性物質と基剤の混合物を何らかの方法で微細粉末化あるいはマイクロカプセル化しておき、ステンレスチューブあるいはテフロンチューブに充填し、圧縮成形することでロッド状の埋込用製剤が製造できる。この時、必要に応じて基剤のガラス転移温度以上に加温しても良い。例えば、水中乾燥法で得たマイクロカプセルを内径２．０ｍｍのテフロンチューブに充填し、６０℃で１５分間加熱後、直径２．０ｍｍの棒で圧縮し冷却後成形することで、外径２．０ｍｍのロッド状製剤が得られる。
【００２６】
本発明の徐放性製剤は微粒子状であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、皮下あるいは筋肉内注射に通常使用される注射針を通して投与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがないからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒子径として約０．１ないし３００μｍ、好ましくは約１ないし１５０μｍ、特に好ましくは約２ないし１００μｍである。本発明の徐放性製剤における生理活性物質の配合量は生理活性物質の種類等によって異なるが、例えば生理活性ペプチドの場合、通常約０．１〜５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．２ないし３０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．５ないし２０％（Ｗ／Ｗ）である。また、本発明の徐放性製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、例えば約３０ないし９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０ないし９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０ないし９０％（Ｗ／Ｗ）である。
本発明における徐放性製剤の生理活性物質の初期放出率［投与後１日（２４時間）までの放出率］は、好ましくは投与用量の約５０％以下、より好ましくは約１ないし約３０％、さらに好ましくは約２ないし約２０％、もっとも好ましくは約２ないし約１５％である。なお、該初期放出率は本発明の徐放性製剤皮下投与後２４時間までの血中濃度のＡＵＣ（Area Under the Concentration-Time Curve）を、生理活性ペプチド溶液皮下投与後２４時間までのＡＵＣから得られる投与量−ＡＵＣ直線に適用させることにより初期放出量が得られ、さらに初期放出率が算出される。
【００２７】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例えば、筋肉内、皮下、臓器等への注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮等への経粘膜剤等）、経口剤（例えば、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）等として投与することができる。
本発明の徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、上記分散媒を加え水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用徐放製剤が得られる。また、上記油性分散媒を加え油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００２８】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば平均粒子径として約０．１ないし約３００μｍの範囲が挙げられる。平均粒子径は、好ましくは約１ないし約１５０μｍ、特に好ましくは約２ないし約１００μｍの範囲である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２９】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で、哺乳動物（例えば、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性物質により種々異なる。生理活性物質が、例えばインスリンである場合には、糖尿病等、インターフェロンアルファである場合には、ウイルス性肝炎（例えば、Ｃ型肝炎、ＨＢｅ 抗原陽性活動性肝炎等）、癌（例えば、腎癌、多発性骨髄腫等）等、エリスロポエチンの場合には貧血（例えば、腎透析時貧血等）等、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例えば、制ガン剤治療時）、感染症等、ＩＬ−２の場合には癌（例えば、血管内皮腫等）等、ＦＧＦの場合には骨折、創傷（床ずれ等）、歯周病、消化管潰瘍等、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症等、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）等、ＴＰＡの場合には血栓症等、腫瘍壊死因子の場合には癌等の治療または予防に有効である。また、ＧＨ含有徐放性製剤では、ＧＨの成長ホルモン作用に基づき、ＧＨ分泌不全性低身長症の他、ターナー症候群、慢性腎不全、軟骨発育不全症（軟骨異栄養症）、さらには成人成長ホルモン欠損症（成人ＧＨＤ）の治療やＡＩＤＳ等の消耗性疾患の治療にも適応できる。また、ＧＨはダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、あるいは若年性慢性関節症等の疾患にも適応され、有効な治療効果を得たとの報告もあり、ＧＨ含有徐放性製剤はこれらの疾患にも適応可能である。さらには鬱血性心不全等の治療または予防にも有効である。その他、ＧＨ含有徐放性製剤が適応できる対象としては、臓器移植時やＡＩＤＳ患者の薬物治療時の造血、低栄養状態の改善、腎性貧血、狭心症、高脂血症、肥満、火傷・創傷・潰瘍の治療促進、外科侵襲（手術・外傷）／術後の早期回復、敗血症、骨粗鬆症の骨折予防、骨粗鬆症による骨折患者の術後筋力早期回復、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、褥瘡等が挙げられる。また、虚弱老人の生活の質（ＱＯＬ）の向上を目的とする抗老化薬として、あるいはｈＧＨの神経保護作用により神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、脳血管障害など）の進展抑制および改善にも効果が期待できる。ＧＨを徐放性製剤化することにより、ＧＨ連日皮下注射剤よりも、これらの適応症に対してすぐれた薬効が得られる。
【００３０】
徐放性製剤の投与量は、生理活性物質の種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該生理活性物質の有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性物質の投与量としては、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、好ましくは成人１人当たり約０．０００１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０．０５ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回等、該生理活性物質の種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし２ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性物質が、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００１ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ないし約０．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００３１】
徐放性製剤の有効成分である生理活性物質が、ＧＨの場合には、投与量は、ＧＨの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該ＧＨの有効濃度が体内で保持される量であればよい。上記した疾患の治療において、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、ＧＨの投与量は有効成分として、好ましくは、小児あるいは成人１人当たり約０．０１ないし約５ｍｇ／ｋｇ体重（約０．０３ないし約１５ＩＵ／ｋｇ体重）の範囲から適宜選択して安全に投与することができる。さらに好ましくは約０．０５ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重（約０．１５ないし約３ＩＵ／ｋｇ体重）の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回あるいは１ケ月に１回等、ＧＨ含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし２ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することがさらに好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。冷所のうち、とりわけ２ないし８℃が好ましい。
【００３２】
【実施例】
以下に参考例、実施例、比較例および試験例を挙げて、さらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍＬ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄＬ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３００ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥した。さらに残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥してｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００３３】
参考例２
マンニトール５ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、酢酸を用いてｐＨ５〜７に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３４】
実施例１
マンニトール５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン２ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、酢酸を用いてｐＨ５〜７に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３５】
実施例２
マンニトール５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン２ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３６】
実施例３
マンニトール５ｇ、塩化ベンザルコニウム０．１ｇおよびポリソルベート８００．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３７】
実施例４
マンニトール５ｇ、硫酸プロタミン１０ｍｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３８】
実施例５
マンニトール５ｇ、塩化亜鉛４２ｍｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００３９】
実施例６
マンニトール５ｇ、塩酸リシン１．７ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４０】
実施例７
マンニトール５ｇ、水溶性キトサン（ＰＲＯＮＯＶＡ社製、ウルトラピュアグレード、塩酸塩、ＣＬ１１３）１０ｍｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４１】
実施例８
マンニトール５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約６０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、ポリエチレングリコール４００を３０ｍＬ加えた後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４２】
実施例９
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍＬ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄＬ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３００ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇおよび硫酸プロタミン０．４ｍｇを添加し凍結乾燥した。さらに残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥してｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４３】
実施例１０
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍＬ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄＬ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３００ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇおよび塩酸Ｌ−アルギニン０．２５ｇを添加し凍結乾燥した。さらに残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥してｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４４】
実施例１１
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍＬ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄＬ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３００ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇおよびＮ−メチルグルカミン０．２５ｇを添加し凍結乾燥した。さらに残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥してｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４５】
実施例１２
実施例９で得た硫酸プロタミンを含有するマイクロカプセルを内径２．０ｍｍのテフロンチューブに充填し、６０℃で１５分間加熱した。加熱後棒で圧縮し冷却後成形した。外径２．０ｍｍ、長さ約１ｃｍのロッド状製剤を得た。
【００４６】
実施例１３
マンニトール５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン０．２ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、酢酸を用いてｐＨ５〜７に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４７】
実施例１４
マンニトール５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン１．２ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、酢酸を用いてｐＨ５〜７に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４８】
実施例１５
マンニトール５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン２．４ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、酢酸を用いてｐＨ５〜７に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００４９】
実施例１６
マンニトール１．５ｇ、塩酸Ｌ−アルギニン２．４ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００５０】
実施例１７
マンニトール５ｇ、塩酸リシン２．１ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００５１】
実施例１８
マンニトール５ｇ、Ｎ−メチルグルカミン１ｇ、メチルセルロース０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、塩酸を用いてｐＨ６に調整した後、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００５２】
実施例１９
マンニトール５ｇ、酢酸亜鉛１ｇ、メチルセルロース０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００５３】
実施例２０
マンニトール５ｇ、水溶性キトサン（ＰＲＯＮＯＶＡ社製、ウルトラピュアグレード、塩酸塩、ＣＬ１１３）０．１ｇ、メチルセルロース０．５ｇおよびポリソルベート８０ ０．１ｇを約９０ｍＬの注射用蒸留水に溶解し、注射用蒸留水で１００ｍＬにメスアップした。得られた溶液を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過後、マイクロカプセル注射用分散媒とした。
【００５４】
実施例２１
ナトリウムを９．６μｇ／ｍＬ含む遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍＬ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄＬ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍＬに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３００ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍＬに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約２，０００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍＬを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥した。さらに残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥してｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００５５】
実施例２２
ナトリウムを７．３μｇ／ｍＬ含む遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）を使用し、以下、実施例２１と同様にｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００５６】
比較例１
ナトリウムを１６．３μｇ／ｍＬ含む遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍＬ）を使用し、以下、実施例２１と同様にｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００５７】
試験例１
参考例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例１で製造した分散媒を加えて得た分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
ＳＤラット（雄性、６週齢）はタクロリムスにより免疫抑制処理を施した。プログラフ注射液５ｍｇ（藤沢薬品工業）を生理食塩水で希釈し、マイクロカプセル投与３日前に０．４ｍｇ／０．２ｍＬ／ラット、マイクロカプセル投与直後、投与４、７および１１日後に０．２ｍｇ／０．２ｍＬ／ラット、投与１４、１８、２１、２５、２８および３２日後に０．３ｍｇ／０．２ｍＬ／ラットの投与量で皮下投与することで、ｈＧＨに対する抗体産生を抑制でき、投与後５週間にわたるラット血清中ｈＧＨ濃度をすることが可能となった。
参考例１で得たマイクロカプセルは１６ｍｇ ｈＧＨ／ｍＬとなるように、実施例１で製造した分散媒に分散した。得られた分散液０．７５ｍＬをエーテル麻酔下、ラット背部に皮下投与した。投与量はｈＧＨとして１２ｍｇとした。マイクロカプセル投与後、尾静脈から経時的に採血し、血清を分取した。血清中ｈＧＨ濃度の測定はイムノラジオメトリックアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学）により測定した。
（２）初期放出率
免疫抑制ＳＤラットにｈＧＨ溶液を５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下投与し、経時的に採血を行い、血清中ｈＧＨ濃度を測定した。ＡＵＣは台形法で算出した。マイクロカプセル投与２４時間後までのＡＵＣからｈＧＨ溶液皮下投与の場合のそれに相当するｈＧＨ投与量を算出し、マイクロカプセルの投与量１２ｍｇで除することにより初期放出率を算出した。
実施例１の分散媒を加えて得た分散液投与群における初期放出率は６％であった。この結果から明らかなように、塩酸Ｌ−アルギニン含有分散媒を用いたマイクロカプセル投与群では、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００５８】
試験例２
参考例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例２、実施例３、実施例４あるいは実施例５で製造した各分散媒を加えて得た各分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例２、実施例３、実施例４あるいは実施例５の各分散媒を加えて得た各分散液投与群における初期放出率は、それぞれ５％、６％、３％および７％であった。この結果から明らかなように、塩酸Ｌ−アルギニン、塩化ベンザルコニウム、硫酸プロタミンあるいは塩化亜鉛を含有する分散媒を用いたマイクロカプセル投与群では、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。これら塩基性物質あるいは水溶性多価金属塩を含有する分散媒による初期放出の抑制効果が明らかとなった。
【００５９】
試験例３
実施例９で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに参考例２で製造した分散媒を加えて得た分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例９で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに参考例２の分散媒を加えて得た分散液投与群における初期放出率は８％であった。この結果から明らかなように、塩基性物質である硫酸プロタミンをマトリックスの表面に保持する徐放性マイクロカプセル投与群では、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００６０】
試験例４
参考例１および実施例１０で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例８で製造した分散媒を加えて得た各分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
参考例１および実施例１０で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例８の分散媒を加えて得た各分散液投与群における初期放出率は、それぞれ７％および５％であった。この結果から明らかなように、ポリオール類であるポリエチレングリコール４００を含有する分散媒で懸濁した徐放性マイクロカプセル製剤投与群では、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００６１】
試験例５
参考例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例１３、実施例１４、あるいは実施例１５で製造した各分散媒を加えて得た各分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例１３、実施例１４あるいは実施例１５の各分散媒を加えて得た各分散液投与群における初期放出率は、それぞれ１１％、７％および６％であった。この結果から明らかなように、塩酸Ｌ−アルギニンを含有する分散媒を用いたマイクロカプセル投与群では、その添加量の増大に伴い初期放出が小さくなり、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。分散媒中塩酸Ｌ−アルギニン量に依存した初期放出の抑制効果が明らかとなった。
【００６２】
試験例６
参考例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例１６で製造した分散媒を加えて得た各分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例１６の分散媒を加えて得た各分散液投与群における初期放出率は、４％であった。この結果から明らかなように、塩酸Ｌ−アルギニンを含有する分散媒を用いたマイクロカプセル投与群では、分散媒を等張にするためマンニトールを減量しても、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。初期放出の抑制効果は塩酸Ｌ−アルギニン量に依存し、マンニトールは減量しても影響がないことが明らかとなった。
【００６３】
試験例７
参考例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルに実施例１７、実施例１８、実施例１９あるいは実施例２０で製造した各分散媒を加えて得た各分散液を用いて以下の試験を実施した。
（１）ラットでのin vivo放出性
試験例１（１）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける血清中ｈＧＨ濃度推移を評価した。
（２）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例１７、実施例１８、実施例１９あるいは実施例２０の各分散媒を加えて得た各分散液投与群における初期放出率は、それぞれ８％、１１％、１０％および７％であった。この結果から明らかなように、塩酸リシン、Ｎ−メチルグルカミン、酢酸亜鉛あるいはキトサンを含有する分散媒を用いたマイクロカプセル投与群では、初期放出が小さく、その後１ヵ月に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。これら塩基性物質、水溶性多価金属塩あるいは塩基性多糖類を含有する分散媒による初期放出の抑制効果が明らかとなった。
【００６４】
試験例８
実施例２１あるいは比較例１で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルについて以下の試験を実施した。
（１）ジクロロメタン中のｈＧＨ重量平均粒子径
平均粒子径は、ホモジナイザー（ポリトロン（キネマチカ社））約２０，０００ｒｐｍ、約３０秒処理により、ｈＧＨをジクロロメタン中で分散した後に、レーザー解析式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）の測定可能な範囲となるように適宜、ジクロロメタンで希釈し、測定した。
（２）マイクロカプセル中ｈＧＨ封入率
マイクロカプセル１０ｍｇに１．７５ｍＬのアセトニトリルを添加後、超音波処理に付した。得られたアセトニトリル溶液に３．２５ｍＬの１０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）を添加、再度超音波処理し、主薬であるｈＧＨを抽出した。次いでこのｈＧＨ抽出液を下記条件のサイズ排除高速液体液体クロマトグラフィーに供してｈＧＨ含量を測定し、封入率を算定した。
カラム： ＴＳＫｇｅｌＧ ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ）
溶離液： ５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３
流速： ０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長： ２１４ｎｍ
（３）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例２１あるいは比較例１のジクロロメタン中ｈＧＨ重量平均粒子径は、それぞれ１．２μｍおよび２．４μｍ、マイクロカプセル中ｈＧＨ封入率は、それぞれ８５％および７３％、免疫抑制ラットにおける初期放出率は、１８％および４０％であった。この結果から明らかなように、ヒト成長ホルモン溶液中ナトリウム濃度を約１０μｇ／ｍＬ以下とすることにより、重量平均粒子径が約０．５μｍ〜約２．０μｍのヒト成長ホルモン微細粒子を得ることが可能となり、ｈＧＨ封入率が高く、しかも初期放出の少ないマイクロカプセルが得られた。すなわち、生理活性物質溶液中塩濃度を低下させることにより、薬物が微細化され、高封入率で初期放出が抑制された徐放性製剤が得られることが明らかとなった。
【００６５】
試験例９
実施例２２で得たｈＧＨ含有マイクロカプセルについて以下の試験を実施した。
（１）ジクロロメタン中のｈＧＨ重量平均粒子径
試験例８（１）と同様の操作により、ジクロロメタン中のｈＧＨ重量平均粒子径を評価した。
（２）マイクロカプセル中ｈＧＨ封入率
試験例８（２）と同様の操作により、マイクロカプセル中ｈＧＨ封入率を評価した。
（３）初期放出率
試験例１（２）と同様の操作により、免疫抑制ＳＤラットにおける初期放出率を評価した。
実施例２２のジクロロメタン中ｈＧＨ重量平均粒子径は、１．２μｍ、マイクロカプセル中ｈＧＨ封入率は、８３％、免疫抑制ラットにおける初期放出率は、１４％であった。この結果から明らかなように、ヒト成長ホルモン溶液中ナトリウム濃度を約１０μｇ／ｍＬ以下とすることにより、重量平均粒子径が約０．５μｍ〜約２．０μｍのヒト成長ホルモン微細粒子を得ることが可能となり、ｈＧＨ封入率が高く、しかも初期放出の少ないマイクロカプセルが得られた。すなわち、生理活性物質溶液中塩濃度を低下させることにより、薬物が微細化され、高封入率で初期放出が抑制された徐放性製剤が得られることが明らかとなった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、塩基性物質あるいは水溶性多価金属塩をマトリックス外部あるいはその分散媒に添加することにより、投与直後の生理活性物質の初期放出が飛躍的に抑制され、投与直後から長期間にわたって一定量の生理活性物質を放出し、かつ生理活性物質の変質および残留有機溶媒が極めて少ない、医薬品として臨床上、非常に優れた性質を有する徐放性製剤が得られる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sustained-release preparation that releases a certain amount of a physiologically active substance over a long period of time and has a small initial release immediately after administration, a dispersion medium thereof, and the like.
[0002]
[Prior art]
Physiologically active peptides are known to exhibit various pharmacological actions in living organisms, and are being applied as pharmaceuticals. However, since these physiologically active peptides generally have a short half-life in vivo, frequent administration is necessary, and there are some cases in which the physical burden on the patient accompanying injection cannot be ignored. For example, growth hormone (hereinafter sometimes abbreviated as GH) is a typical hormone that is originally produced and secreted in the anterior pituitary gland. In addition to promoting the growth of the body, sugar and lipid metabolism, anabolism, It is a physiologically active peptide with a wide variety of physiological effects, such as being involved in cell growth and differentiation, and is currently mass-produced by Escherichia coli using genetic recombination technology and is widely clinically applied worldwide as a pharmaceutical product. However, GH has a short in vivo half-life and needs to be administered frequently in order to maintain an effective blood concentration. In particular, in the case of GH deficiency short stature, the fact is that daily subcutaneous administration over a long period of several months to 10 years or more is given to infants or young patients.
In order to address such problems inherent to bioactive peptide drugs, various studies on drug delivery systems have been conducted. For example, a sustained release agent that releases a physiologically active peptide over a long period of time. Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-217691 (WO96 / 07399) contains a water-soluble peptide-based physiologically active substance as a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt with an aqueous zinc chloride solution and the like, and a biodegradable polymer. A method for producing a sustained-release preparation is disclosed. JP-A-11-322631 discloses a bioactive peptide powder obtained by adding a water-miscible organic solvent and / or a volatile salt to a physiologically active peptide aqueous solution and freeze-drying it. Disclosed is a method for producing a sustained-release preparation, wherein the organic solvent is removed after the polymer is dispersed in an organic solvent solution. JP-A-9-132524 discloses a method for producing sustained-release microcapsules containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer, wherein the biodegradable polymer has a glass transition temperature or higher after microencapsulation. Has disclosed a method for producing sustained-release microcapsules that have extremely low residual organic solvent and have clinically very excellent properties as pharmaceuticals by heating and drying for about 24 to 120 hours.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
It is desirable that sustained-release preparations can release a certain amount of physiologically active substance over a long period of time while maintaining the activity of the physiologically active substance. Therefore, a means for suppressing the initial release immediately after administration is required.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and include a pulverized bioactive substance and biodegradable polymer obtained by reducing the alkali metal ion concentration to about 10 μg / mL or less. In a releasable formulation, by allowing a cationic substance or polyol to coexist with a matrix such as a microcapsule, the initial release of the physiologically active substance immediately after administration is unexpectedly suppressed, and a certain amount of physiology is maintained over a long period of time. The inventors have found that a sustained-release preparation having a clinically superior property can be produced as a pharmaceutical by releasing an active substance, and the present invention has been completed based on these.
[0005]
That is, the present invention
(1) A sustained-release preparation in which the initial release of a physiologically active substance, which is a combination of a matrix containing a physiologically active substance and a cationic substance and / or polyol, is suppressed,
(2) The sustained-release preparation according to the above (1), wherein a matrix containing a physiologically active substance and a cationic substance and / or polyol are mixed.
(3) The sustained release preparation according to the above (1), wherein a cationic substance and / or polyols are held on the surface of a matrix containing a physiologically active substance,
(4) The sustained-release preparation according to the above (1), wherein the cationic substance is a basic substance or a water-soluble polyvalent metal salt,
(5) The sustained release preparation according to the above (4), wherein the basic substance is a basic amino acid,
(6) The sustained release preparation according to the above (5), wherein the basic amino acid is arginine or lysine,
(7) The sustained release preparation according to the above (4), wherein the basic substance is a basic additive,
(8) The sustained release preparation according to the above (7), wherein the basic additive is benzalkonium chloride or N-methylglucamine.
(9) The sustained release preparation according to the above (4), wherein the basic substance is a basic peptide, a basic polyamine, or a basic polysaccharide,
(10) The sustained release preparation according to the above (9), wherein the basic peptide is protamine or a salt thereof,
(11) The sustained release preparation according to the above (9), wherein the basic polyamine is spermidine or spermine,
(12) The sustained release preparation according to the above (9), wherein the basic polysaccharide is chitosan,
(13) The sustained-release preparation according to the above (4), wherein the water-soluble polyvalent metal salt is a water-soluble zinc salt,
(14) The sustained release preparation according to the above (13), wherein the water-soluble zinc salt is zinc chloride or zinc acetate,
(15) The sustained-release preparation according to the above (1), wherein the polyol is polyethylene glycol or propylene glycol,
(16) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a physiologically active peptide,
(17) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the physiologically active peptide has a molecular weight of about 200 to about 500,000,
(18) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the physiologically active peptide has a molecular weight of about 5,000 to about 500,000,
(19) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the physiologically active peptide is a hormone, cytokine, hematopoietic factor, growth factor or enzyme,
(20) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the physiologically active peptide is human growth hormone,
(21) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the matrix base is a biodegradable polymer,
(22) The sustained-release preparation according to the above (21), wherein the biodegradable polymer is a homopolymer or copolymer of α-hydroxycarboxylic acids or a mixture thereof,
(23) The sustained release preparation according to the above (21), wherein the biodegradable polymer is a copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of about 100/0 to about 40/60 mol%,
(24) The sustained release preparation according to the above (21), wherein the biodegradable polymer is a lactic acid homopolymer,
(25) The sustained release preparation according to the above (21), wherein the biodegradable polymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 50,000,
(26) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the matrix is a microcapsule,
(27) The sustained release preparation according to the above (1), which is for injection,
(28) The sustained release preparation according to the above (1), comprising a matrix containing a physiologically active substance, a cationic substance and / or a polyol and a dispersion medium,
(29) A dispersion medium containing a cationic substance and / or polyol for producing a sustained-release preparation according to the above (28),
(30) The dispersion medium according to (29), wherein the cationic substance is a basic substance or a water-soluble polyvalent metal salt,
(31) The dispersion medium according to (30), wherein the basic substance is a basic amino acid,
(32) The dispersion medium according to the above (31), wherein the basic amino acid is arginine or lysine,
(33) The dispersion medium according to (30), wherein the basic substance is a basic additive,
(34) The dispersion medium according to (33), wherein the basic additive is benzalkonium chloride or N-methylglucamine.
(35) The dispersion medium according to (30), wherein the basic substance is a basic peptide, a basic polyamine, or a basic polysaccharide,
(36) The dispersion medium according to the above (35), wherein the basic peptide is protamine or a salt thereof,
(37) The dispersion medium according to the above (35), wherein the basic polyamine is spermidine or spermine,
(38) The dispersion medium according to (35), wherein the basic polysaccharide is chitosan,
(39) The dispersion medium according to (30), wherein the water-soluble polyvalent metal salt is a water-soluble zinc salt,
(40) The dispersion medium according to the above (39), wherein the water-soluble zinc salt is zinc chloride or zinc acetate,
(41) The dispersion medium according to the above (29), wherein the polyol is polyethylene glycol or propylene glycol,
(42) The dispersion medium according to the above (29), which contains an osmotic pressure adjusting agent,
(43) The dispersion medium according to the above (42), wherein the osmotic pressure adjusting agent is a saccharide or a salt,
(44) The dispersion medium according to the above (29), which contains a thickening agent,
(45) The dispersion medium according to (44), wherein the thickening agent is a water-soluble polysaccharide.
(46) The dispersion medium according to the above (29), which contains a surfactant,
(47) The dispersion medium according to (46), wherein the surfactant is a nonionic surfactant,
(48) The dispersion medium according to the above (29), which is for injection,
(49) A method for suppressing the initial release of a physiologically active substance, comprising mixing a cationic substance and / or a polyol with a sustained release preparation containing a matrix containing a physiologically active substance,
(50) Fine particles of physiologically active substance obtained by setting the alkali metal ion concentration in the physiologically active substance solution to about 10 μg / mL or less,
(51) The fine particles according to the above (50), wherein the physiologically active substance is a physiologically active peptide,
(52) Fine particles according to the above (51), wherein the physiologically active peptide is a hormone, cytokine, hematopoietic factor, growth factor or enzyme,
(53) Fine particles according to the above (51), wherein the physiologically active peptide is human growth hormone,
(54) Fine particles according to the above (50), wherein the weight average particle diameter is about 0.5 μm to about 2.0 μm,
(55) A method for producing fine particles of a physiologically active substance, characterized by using a physiologically active substance solution having an alkali metal ion concentration in the physiologically active substance solution of about 10 μg / mL or less,
(56) The fine particles according to the above (50), further containing ammonium acetate in the solution,
(57) A sustained-release preparation containing the fine particles according to the above (50),
(58) The sustained release preparation according to the above (57), wherein the base of the sustained release preparation is a biodegradable polymer,
(59) The sustained release preparation according to the above (58), wherein the biodegradable polymer is a homopolymer or a copolymer of α-hydroxycarboxylic acids, or a mixture thereof,
(60) The sustained release preparation according to the above (58), wherein the biodegradable polymer is a copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of about 100/0 to about 40/60 mol%.
(61) The sustained release preparation according to the above (58), wherein the biodegradable polymer is a lactic acid homopolymer,
(62) The sustained release preparation according to the above (58), wherein the biodegradable polymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 50,000, and
(63) A sustained-release preparation as described in (57) above, which is a microcapsule.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The physiologically active substance in the present invention is not particularly limited. For example, a peptide compound having physiological activity (hereinafter referred to as “physiologically active peptide”), other antibiotics, antifungal agents, antihyperlipidemic agents, antitumors Drug, antipyretic, analgesic, anti-inflammatory, antitussive expectorant, sedative, muscle relaxant, antiepileptic, antiulcer, antidepressant, antiallergic, cardiotonic, arrhythmia, vasodilator, antihypertensive Examples include diuretics, antidiabetics, anticoagulants, hemostatics, antiplatelet drugs, antituberculosis drugs, hormone drugs, narcotic antagonists, bone resorption inhibitors, osteogenesis promoters, and angiogenesis inhibitors. Of these, peptide compounds are particularly preferred.
Examples of the physiologically active peptide in the present invention include various peptides or proteins that have physiological activity useful for mammals and can be used clinically. The “bioactive peptide” has a molecular weight of, for example, about 200 to 500,000 as a monomer, and preferably has a molecular weight of about 1,000 to 500,000. More preferably, a peptide having a molecular weight of 5,000 to about 500,000 is used.
A typical activity of the bioactive peptide is hormonal action. The physiologically active peptide may be a natural product, a synthetic product, or a semi-synthetic product, and may be a derivative or analog thereof. The mechanism of action of the physiologically active peptide may be either agonistic or antagonistic.
Examples of the physiologically active peptide in the present invention include peptide hormones, cytokines, peptide neurotransmitters, hematopoietic factors, various growth factors, enzymes, peptide antibiotics, analgesic peptides and the like.
Examples of peptide hormones include insulin, somatostatin, somatostatin derivatives (sandstatin, US Pat. Nos. 4,087,390, 4,093,574, 4,100,117, and 4,253,998). No.), growth hormone (GH), natriuretic peptide, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), ACTH derivatives (such as shrimp tide), melanocyte stimulating hormone (MSH), thyroid hormone releasing hormone (TRH), salts thereof And derivatives thereof (see JP-A-50-121273 and JP-A-52-116465), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin (HCG) , Thymosin (thymosin), mochi , Vasopressin, vasopressin derivatives {desmopressin [Japanese Journal of Endocrine Society, Vol. 54, No. 5, pp. 676 to 691 (1978)]}, oxytocin, calcitonin, parathyroid hormone (PTH), glucagon, secretin, pancreosymine , Cholecystokinin, angiotensin, human placental lactogen, glucagon-like peptide (GLP-1) and its derivatives (JP-A-6-80584, JP-A-7-2695, EP658568, JP-A-8-245696, JP-A-8-245696) -269097, WO97 / 15296, WO97 / 31943, WO98 / 19698, WO98 / 43658, JP10-511365, WO99 / 55310, JP11-513983, CA2270320, WO9 / No. 64061, Kohyo No. 11-514972, JP-T-2000-500505, JP WO2000 / 66 138, No. WO2000 / 66 142, No. WO2000 / seventy-eight thousand three hundred thirty-three, JP 2001-11095, Tissue Eng.7(1) 35-44 (2001), Diabetologia43(10) 1319-1328 (2000), WO2000 / 34331, WO2000 / 34332, U.S. Patent 6,268,343, U.S. Publication 2001011071, U.S. Publication 2001006943, EP0773364, WO2000 / 77039, WO99 / 77039. 43707, WO99 / 43341, WO99 / 43706, WO99 / 43708, WO99 / 43705, WO99 / 29336, WO2000 / 37098, EP0969016, US Pat. No. 5,981,488, US Pat. , 958, 909, WO 93/25579, WO 98/43658, EP 0869135, US Pat. No. 5,614,492, US Pat. No. 5,545,618, US Pat. No. 5,120,712, National Patent No. 5,118,666, WO95 / 05848, WO91 / 11457, EP0708179, WO96 / 06628, EP0658568, WO87 / 06941), metastin and derivatives thereof (see WO2000 / 24890), etc. Is used. Peptide hormones are preferably insulin and growth hormone.
Examples of cytokines include lymphokines and monokines. Examples of lymphokines include interferons (alpha, beta, gamma, etc.) and interleukins (eg, IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, etc.). Etc. are used. Examples of monokines include interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF). The cytokine is preferably lymphokine or the like, more preferably interferon or the like, particularly preferably interferon alpha or the like.
As peptide neurotransmitters, for example, substance P, serotonin, GABA and the like are used.
[0007]
Examples of hematopoietic factors include erythropoietin (EPO), colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, etc.), thrombopoietin (TPO), platelet growth stimulating factor, megacaryocytopotentiator and the like.
Examples of the various growth factors include basic or acidic fibroblast growth factor (FGF) or a family thereof (for example, EGF, TGF- 瘁 ATGF-ＰＤAPDGF, acidic FGF, basic FGF, FGF-9, etc.), Nerve cell growth factor (NGF) or a family thereof (eg, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF, GDNF, etc.), insulin-like growth factor (eg, IGF-1, IGF-2, etc.), bone growth Factors involved (BMP) or their families are used.
Examples of the enzyme include superoxide dismutase (SOD), urokinase, tissue plasminogen activator (TPA), asparaginase, kallikrein and the like.
Examples of peptide antibiotics include polymyxin B, colistin, gramicidin, and bacitracin.
As the analgesic peptide, for example, enkephalin, enkephalin derivatives (see US Pat. No. 4,277,394, European Patent Application Publication No. 31567), endorphin, kyotorphin and the like are used.
Other bioactive peptides include thymopoietin, dynorphin, bombesin, cerulein, thymostimulin, thymic humoral factor (THF), blood thymic factor (FTS) and derivatives thereof (see US Pat. No. 4,229,438), And other thymic factors [Ayumi of Medicine, Vol. 125, No. 10, pp. 835-843 (1983)], peptides having neurotensin, bradykinin and endothelin antagonistic activity (European Patent Publication No. 436189, ibid.) No. 457195, No. 496452, JP-A-3-94692, JP-A-3-130299) and the like.
Examples of the physiologically active peptide particularly preferably applied to the present invention include luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) and derivatives having the same action or LH-RH antagonists, growth hormone, insulin, etc. Growth hormone, especially human growth hormone, is preferred.
[0008]
In the present invention, when the physiologically active peptide contains a metal, if necessary, the metal contained in the physiologically active peptide may be removed in advance, and a known method may be used as a method for removing the metal. Used. For example, an insulin-hydrochloric acid aqueous solution is dialyzed against water or an ammonium acetate salt solution and then freeze-dried to obtain insulin with a minimum amount of metal in an amorphous state.
The growth hormone may be derived from any species, but is preferably human growth hormone. In addition, natural sources extracted from the pituitary gland and the like are also used in the present invention, but preferably are recombinant GH (see Japanese Patent Publication Nos. 6-12996 and 6-48987), and more preferably Is a recombinant hGH having the same structure as the natural type without methionine at the N-terminus. The GH may be a metal salt, but GH substantially containing no metal is also used. As hGH, not only a molecular weight of about 22 K Dalton but also a molecular weight of about 20 K Dalton (see JP-A-7-101877 and JP-A-10-265404) may be used. Alternatively, hGH derivatives or related proteins (see WO99 / 03887) may be used.
[0009]
The compounding amount of the physiologically active substance in the sustained-release preparation of the present invention varies depending on the type of the physiologically active substance, but for example, in the case of a physiologically active peptide, it is usually about 0.1 to 50% (W / W), preferably about 0. .2 to 30% (W / W), more preferably about 0.5 to 20% (W / W).
The matrix in the present invention is a solid substance containing a physiologically active substance as a base (for example, a biodegradable polymer), and also contains an additive as necessary, and is substantially sustained-release. For example, there are forms such as a microcapsule and an embedding rod.
Examples of the biodegradable polymer used in the present invention include α-hydroxycarboxylic acids (for example, glycolic acid and lactic acid), hydroxydicarboxylic acids (for example, malic acid), and hydroxytricarboxylic acids (for example, citric acid). A polymer having a free carboxyl group or a mixture thereof, poly-α-cyanoacrylate, polyamino acid (for example, poly-γ-benzyl-L-). Glutamic acid, etc.), maleic anhydride polymers (for example, styrene-maleic acid polymers, etc.) and the like. These may be either homopolymers or copolymers. The type of polymerization may be random, block or graft. In addition, when the α-hydroxycarboxylic acids, hydroxydicarboxylic acids, and hydroxytricarboxylic acids have an optically active center in the molecule, any of D-, L-, and DL-forms can be used.
Among these, biodegradable polymers having a free carboxyl group at the terminal, for example, polymers synthesized from α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, etc.) (eg, lactic acid polymer, lactic acid-glycol) Acid copolymers, etc.), poly-α-cyanoacrylic acid esters and the like are preferred.
The biodegradable polymer is more preferably a polymer synthesized from α-hydroxycarboxylic acids, and particularly preferably a lactic acid-glycolic acid polymer.
[0010]
In the present specification, not only a single polymer such as polylactic acid and polyglycolic acid but also a lactic acid-glycolic acid copolymer may be simply referred to as a lactic acid-glycolic acid polymer.
When a lactic acid-glycolic acid polymer (lactic acid-glycolic acid copolymer or homopolymer) is used as the biodegradable polymer, the composition ratio (mol%) is preferably about 100/0 to about 40/60, More preferred is 85/15 to about 50/50.
The weight average molecular weight of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 3,000 to about 50,000, more preferably about 3,000 to about 25,000, and even more preferably about 5,000 to about 20,000.
The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 1.2 to about 4.0, more preferably about 1.5 to about 3.5.
[0011]
Regarding the weight average molecular weight and dispersity in the present specification, the former has a weight average molecular weight of 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,050, 580. , 162, and 9 types of polystyrene as reference materials. The value in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography (GPC), the latter being a value calculated from this value. The measurement is performed using GPC column KF804L x 2 (manufactured by Showa Denko) and RI monitor L-3300 (manufactured by Hitachi, Ltd.) and chloroform as the mobile phase.
[0012]
Moreover, the biodegradable polymer having a free carboxyl group at the terminal is a polymer in which the number average molecular weight determined by terminal group determination and the number average molecular weight determined by GPC measurement are substantially the same, and the number average molecular weight determined by terminal group determination is It is calculated as follows.
About 1 g to about 3 g of biodegradable polymer is dissolved in a mixed solvent of acetone (25 mL) and methanol (5 mL), and the carboxyl group in this solution is converted to 0.05 N alcoholic potassium hydroxide using phenolphthalein as an indicator. The solution was immediately titrated with stirring at room temperature (20 ° C.), and the number average molecular weight by end group determination was calculated by the following formula.
Number average molecular weight by end group determination = 20000 × A / B
A: Mass of biodegradable polymer (g)
B: 0.05N alcoholic potassium hydroxide solution (mL) added by the end of titration
The number average molecular weight determined by end group quantification is an absolute value, whereas the number average molecular weight determined by GPC measurement depends on various analysis / analysis conditions (for example, selection of mobile phase type, column type, reference material, slice width, Since it is a relative value that varies depending on the choice of the baseline, etc., it is difficult to unambiguously quantify it, but the number average molecular weights obtained by both measurements are almost the same, for example, the weight synthesized from α-hydroxycarboxylic acids. In coalescence, the number average molecular weight determined by end group determination is in the range of about 0.5 times to about 2 times the number average molecular weight determined by GPC measurement, preferably in the range of about 0.7 times to about 1.5 times. It means that.
For example, in a polymer synthesized from one or more α-hydroxycarboxylic acids by a non-catalytic dehydration polycondensation method and having a free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight by GPC measurement and the number average molecular weight by terminal group determination Almost matches. In contrast, in a polymer synthesized from a cyclic dimer by a ring-opening polymerization method using a catalyst and having essentially no free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight determined by terminal group quantification is the number determined by GPC measurement. This is much higher than about twice the average molecular weight. Due to this difference, a polymer having a free carboxyl group at the terminal can be clearly distinguished from a polymer having no free carboxyl group at the terminal.
[0013]
A lactic acid-glycolic acid polymer having a free carboxyl group at the end can be produced by a method known per se, for example, a method described in JP-A No. 61-28521 (for example, non-catalytic dehydration polycondensation reaction or inorganic solid acid catalyst). In accordance with a dehydration polycondensation reaction below).
The decomposition / disappearance rate of the lactic acid-glycolic acid polymer varies greatly depending on the composition ratio or the weight average molecular weight. Generally, the lower the glycolic acid fraction, the slower the decomposition / disappearance, so the glycolic acid fraction is lowered. Alternatively, the release period can be lengthened (eg, about 6 months) by increasing the molecular weight. Conversely, the release period can be shortened (for example, about one week) by increasing the glycolic acid fraction or decreasing the molecular weight. For example, in order to obtain a one-week to two-month sustained-release preparation, it is preferable to use a lactic acid-glycolic acid polymer within the above composition ratio and weight average molecular weight range.
[0014]
Therefore, it is preferable that the composition of the biodegradable polymer used in the present invention is appropriately selected according to the type of the desired bioactive peptide, the desired sustained release period, and the like. As a specific example, for example, when GH is used as a physiologically active peptide, a lactic acid-glycolic acid polymer is preferably used, and the lactic acid-glycolic acid polymer has a lactic acid / glycolic acid composition ratio (mol%). Is preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer of 85/15 to about 50/50, more preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer of about 75/25 to about 50/50. The weight average molecular weight is preferably about 8,000 to about 20,000, more preferably about 10,000 to about 20,000. The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 1.2 to about 4.0, more preferably about 1.5 to about 3.5.
The lactic acid-glycolic acid polymer to be used can be produced according to a known method such as the method described in the above publication. The polymer is preferably produced by non-catalytic dehydration polycondensation. It is preferable to use a lactic acid-glycolic acid polymer (PLGA) in which the number average molecular weight determined by the GPC measurement method and the number average molecular weight determined by the terminal group determination method are substantially the same.
The polymer may be used by mixing two kinds of lactic acid-glycolic acid polymers having different composition ratios and / or weight average molecular weights at an arbitrary ratio. Examples include a lactic acid-glycolic acid copolymer having a composition ratio (lactic acid / glycolic acid) (mol%) of about 75/25 and a weight average molecular weight of about 10,000, and a composition ratio (lactic acid / glycolic acid). ) (Mol%) and a mixture with a lactic acid-glycolic acid copolymer having a weight average molecular weight of about 12,000 is used. The weight ratio upon mixing is preferably about 25/75 to about 75/25.
[0015]
In addition, the biodegradable polymer used in the present invention may be a metal salt of the biodegradable polymer described above, for example, a polyvalent metal salt of various biodegradable polymers described in WO 97/01331. Etc. are used. Preferably, polyvalent metal salts of lactic acid-glycolic acid polymers (more preferably zinc salts, calcium salts, magnesium salts, etc., more preferably zinc salts, etc.) are used. The metal species of the polyvalent metal salt is not particularly limited as long as it is a compound that does not adversely affect the living body. For example, divalent (eg, iron, zinc, copper, calcium, magnesium, aluminum, tin, manganese, etc.), Multivalent metals such as trivalent (eg, iron, aluminum, manganese, etc.), tetravalent (eg, tin, etc.) can also be used.
In the present specification, the biodegradable polymer may be referred to as a biodegradable polymer including the case where the biodegradable polymer is a metal salt. For example, when the lactic acid-glycolic acid polymer is a polyvalent metal salt, Sometimes called coalescence.
These polyvalent metal salts of biodegradable polymers can be produced by the method described in WO 97/01331 and a method analogous thereto.
Further, when the polyvalent metal salt of the biodegradable polymer is a zinc salt, it can be produced by reacting the biodegradable polymer and zinc oxide in an organic solvent.
The biodegradable polymer and zinc oxide may be added to the organic solvent in the organic solvent solution of the biodegradable polymer in the form of powder or suspended in the organic solvent. In addition, an organic solvent solution of a biodegradable polymer may be added to an organic solvent suspension of zinc oxide. Moreover, an organic solvent may be added after mixing both in powder form.
The content of the biodegradable polymer contained in the sustained-release preparation of the present invention is usually about 30 to 99.9% (W / W), preferably about 60 to 97% (W / W), more preferably about 70 to 90% (W / W).
[0016]
The organic solvent used for dissolving the biodegradable polymer during the production of the sustained-release preparation in the present invention preferably has a boiling point of 120 ° C. or lower. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (eg, dichloromethane, chloroform, etc.), alcohols (eg, ethanol, methanol, etc.), ethyl acetate, acetonitrile, and the like. These may be mixed and used at an appropriate ratio. When the organic solvent is used alone, for example, dichloromethane, ethyl acetate, acetonitrile and the like are preferable. When an organic solvent is used as a mixed solvent, for example, a combination of a halogenated hydrocarbon (eg, dichloromethane, chloroform, etc.) and an alcohol (eg, ethanol, methanol, etc.) or acetonitrile is preferred. The mixing ratio (volume ratio) of the halogenated hydrocarbon and the alcohol or acetonitrile is from about 100: 1 to about 1: 1, preferably from about 30: 1 to about 2: 1. . The concentration of the biodegradable polymer in the solution varies depending on the molecular weight, the organic solvent and the like, but is about 0.01 to about 80% (W / W), preferably about 0.1 to about 70% (W / W), more preferably about 1 to about 60% (W / W).
[0017]
The cationic substance in the present invention refers to a basic substance or a water-soluble polyvalent metal salt.
Basic substances include basic amino acids (for example, arginine, lysine, etc.), basic peptides (for example, protamine such as protamine, protamine sulfate, protamine hydrochloride, protamine phosphate, or salts thereof), basic polyamines (for example, spermidine). , Spermine, etc.), basic polysaccharides (eg, chitosan, etc.), basic additives (eg, benzalkonium chloride, N-methylglucamine (meglumine), etc.) and the like. Examples of the water-soluble polyvalent metal salt include water-soluble zinc salts (for example, zinc chloride and zinc acetate), water-soluble calcium salts, water-soluble magnesium salts and the like.
Examples of the polyols in the present invention include polyethylene glycol and propylene glycol.
The dose (addition amount) of the cationic substance and / or polyol in the present invention varies depending on the cationic substance, the kind of polyol, the subject animal, the administration site, etc., but preferably about 0 per child or adult. It can be appropriately selected from the range of .0001 to about 100 mg / kg body weight. It is preferable that the dosage (addition amount) of the cationic substance and the polyol is a used range amount of the cationic substance and the polyol. For example, when the cationic substance is protamine sulfate, the dose for children or adults is preferably 3.5 mg or less when used subcutaneously. When the cationic substance is arginine, the dosage for children or adults is preferably 40 mg or less when used subcutaneously and 1620 mg or less when administered intramuscularly.
The content of the cationic substance and / or polyol contained in the sustained-release preparation of the present invention is about 0.0001 to 80% (W / W), preferably about 0.001 to 40%, based on the whole preparation. (W / W), more preferably about 0.01 to 20% (W / W).
[0018]
The sustained-release preparation in the present invention refers to a product that has been processed (for example, freeze-dried) after adding a matrix (for example, mannitol) as necessary after matrix formation.
The initial release rate of the physiologically active substance in the present invention indicates the ratio of the amount of physiologically active substance released within 1 day after administration of the sustained release preparation to an animal (rat) with respect to the administered dose.
In the sustained-release preparation of the present invention, a matrix containing a physiologically active substance and a cationic substance and / or polyols may be present together. It may be contained and prepared (suspended) at the time of use. In addition, for example, the matrix and the cationic substance and / or the polyols and the dispersion medium exist independently without being in contact with each other in one container (for example, a dual chamber prefilled syringe). It is also possible to take a form in which the three parties are mixed immediately before.
The cationic substances and / or polyols in the sustained-release preparation of the present invention are not present inside the matrix, but are held (attached) on the surface (external) of the matrix, or are contained in the dispersion medium. May be.
[0019]
The dispersion medium in the present invention refers to a liquid medium used when a sustained-release preparation is injected as a suspension, preferably an aqueous medium. The dispersion medium usually contains an osmotic pressure adjusting agent (isotonizing agent), a thickening agent (suspending agent), a surfactant, a preservative (stabilizing agent), a soothing agent, a local anesthetic, and the like. . Examples of the osmotic pressure adjusting agent (isotonic agent) include sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose, and examples of the thickening agent (suspending agent) include sodium carboxymethylcellulose, sodium alginate, hyaluronic acid, dextran. Such as polysorbate 80 (Tween 80), HCO-60, and the like as preservatives (stabilizers) such as methylparaben and propylparaben, and soothing agents such as Benzyl alcohol and the like, and as a local anesthetic, for example, xylocaine hydrochloride, chlorobutanol and the like are used. Furthermore, a pH adjuster (for example, hydrochloric acid, acetic acid, sodium hydroxide, or various buffers) is contained as necessary. In addition to the aqueous dispersion medium, an oily dispersion medium is also used. Vegetable oils such as sesame oil and corn oil or those mixed with phospholipids such as lecithin, or medium chain fatty acid triglycerides (for example, miglyol 812) can be used as the oily dispersion medium.
[0020]
In the matrix containing a physiologically active substance in the present invention, a powder (S phase) obtained by lyophilizing a physiologically active substance solution is dispersed in an organic solvent liquid (O phase) in which a biodegradable polymer is dissolved. By removing the solvent from the S / O type dispersion, or by dispersing the aqueous phase (W phase) in which the physiologically active substance is an aqueous solution in the organic solvent liquid (O phase) in which the biodegradable polymer is dissolved, W It is produced by removing the solvent from the / O type emulsion, or by removing the solvent from the solution obtained by dissolving the physiologically active substance in the organic solvent liquid (O phase) together with the biodegradable polymer. Examples of the production method include (a) underwater drying method (S / O / W method and W / O / W method or O / W method), (b) phase separation method (coacervation method) and (c). Examples thereof include a spray drying method or a method according to these methods. In the following, a manufacturing method for manufacturing, for example, microcapsules as a matrix containing a physiologically active substance will be described.
[0021]
(A-1) Underwater drying method (S / O / W method)
According to this method, a water-miscible organic solvent and / or volatile salt is first added to a physiologically active substance aqueous solution, and then a physiologically active substance powder (S phase) is prepared by lyophilization. At this time, in order to obtain a fine powder, the salt concentration in the physiologically active substance solution, for example, the alkali metal (sodium, potassium, calcium, etc.) ion concentration is preferably low. For example, when the alkali metal is sodium, the ion concentration is preferably about 10 μg / mL or less. Next, the biodegradable polymer is dissolved in an organic solvent, and the above physiologically active substance powder is added and dispersed in the organic solvent liquid. In this case, the ratio (weight ratio) between the physiologically active substance and the biodegradable polymer is, for example, about 1: 1000 to about 1: 1, preferably about 1: 200 to about 1: 5, and more preferably about 1: 100 to about 1: 5. In addition, it is preferable to apply external physical energy in order to uniformly disperse the physiologically active substance powder in the organic solvent liquid. For example, ultrasonic irradiation, a turbine-type stirrer, a homogenizer, or the like is used. The average particle size of the physiologically active substance in the organic solvent solution at this time is preferably about 10 μm or less, more preferably about 0.1 μm to about 5 μm, more preferably about 0.5 μm to about 2 μm. It is easily achieved by using the physiologically active substance powder obtained by the invention. The average particle diameter of the physiologically active substance in the present invention is a value obtained by a laser analysis type particle size distribution analyzer (SALD2000A: Shimadzu) after dispersing the physiologically active substance in an organic solvent such as dichloromethane using a homogenizer. . At that time, the physiologically active substance is added to an organic solvent such as dichloromethane at a concentration of, for example, about 20 to 100 mg / mL, and then used at about 20,000 rpm for about 30 seconds to 1 using a homogenizer (for example, Polytron (Kinematica)). A dispersion is obtained by stirring for a minute, and further diluted with the organic solvent as appropriate so as to be within the measurable range of the particle size distribution measuring apparatus.
Subsequently, the organic solvent dispersion liquid (S / O type dispersion liquid) thus prepared is further added to an aqueous solvent (W phase), and external physical energy similar to the above, for example, ultrasonic irradiation, turbine An S / O / W emulsion is formed with a mold stirrer or a homogenizer. Thereafter, the oil phase solvent is evaporated to produce microcapsules. The aqueous phase volume at this time is generally selected from about 1 to about 10,000 times the oil phase volume. More preferably, it is selected from about 2 times to about 5,000 times.
Particularly preferably, it is selected from about 5 times to about 2,000 times.
An emulsifier may be added to the outer aqueous phase. Any emulsifier may be used as long as it can form a generally stable S / O / W emulsion. Examples of the emulsifier include anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxyethylene castor oil derivatives, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, and hyaluronic acid. You may use these in combination suitably. The concentration of the emulsifier in the outer aqueous phase is preferably about 0.001% to 20% (W / W). It is more preferably about 0.01% to 10% (W / W), particularly preferably about 0.05% to 5% (W / W).
The microcapsules thus obtained are separated by centrifugation or filtration, and then the emulsifier attached to the surface of the microcapsules is removed by washing with distilled water, and dispersed again in distilled water or the like. Freeze-dry.
[0022]
Examples of the water-miscible organic solvent added to the physiologically active substance aqueous solution in this method include alcohols (eg, methanol, ethanol, isopropanol, etc., preferably methanol, ethanol, etc.), acetone and the like. These may be used by mixing at an appropriate ratio, but it is preferable to use alcohols, particularly ethanol alone. The amount (concentration) added to the physiologically active substance aqueous solution is about 0.03 to 0.5% (V / V) in volume ratio, preferably about 0.06 to 0.25% (V / V). ), More preferably about 0.1 to 0.15% (V / V). By further freeze-drying a physiologically active substance aqueous solution obtained by adding such a water-miscible organic solvent, it is easy to handle (good operability) and fine (small particle size) physiologically active substance Powder can be made.
Examples of volatile salts added to the physiologically active substance aqueous solution in this method include ammonium salts (eg, ammonium acetate, ammonium bicarbonate, ammonium carbonate, ammonium chloride, preferably ammonium acetate). These may be mixed and used at an appropriate ratio. The amount of the volatile salt added to the physiologically active substance aqueous solution is about 10 times to about 80 times mol, preferably about 10 times to about 70 times mol, and more preferably about 15 times to about 70 times mol. 70-fold mole, more preferably about 20-fold to about 70-fold mole, and most preferably about 20-fold to about 50-fold mole. Similar to the case of adding a water-miscible organic solvent, the physiologically active substance aqueous solution obtained by the addition of volatile salts is further freeze-dried for easy handling (good operability) and fine ( A fine physiologically active substance powder having a small particle diameter can be prepared.
In this method, the water-miscible organic solvent and / or volatile salts added to the physiologically active substance aqueous solution may be used alone or in appropriate combination. When a water-miscible organic solvent and volatile salts are used in combination, they can be added to the physiologically active substance aqueous solution according to the respective addition amounts.
[0023]
(A-2) Underwater drying method (W / O / W method)
According to this method, first, water or a suitable buffer solution is added to a physiologically active substance to prepare a physiologically active substance solution (W phase). Next, the biodegradable polymer is dissolved in an organic solvent, and the physiologically active substance solution is added and dispersed in the organic solvent solution. The W / O type emulsion thus obtained is further added to an aqueous solvent (W phase), and the microcapsules are passed through the W / O / W type emulsion in the same manner as in the S / O / W method. Get.
(A-3) Underwater drying method (O / W method)
According to this method, a biodegradable polymer together with a physiologically active substance is first dissolved in an organic solvent, an organic solvent liquid (O phase) is further added to the aqueous solvent (W phase), and the above S / O / W Similar to the method, microcapsules are obtained via an O / W emulsion.
[0024]
(B) Phase separation method (coacervation method)
In this method, the coacervation agent is gradually added to the S / O dispersion liquid (a-1) or the W / O emulsion liquid (a-2) or the oil phase solution (a-3) with stirring. In addition, microcapsules are precipitated and solidified. The coacervation agent is added in a volume of about 0.01 to about 1,000 times that of the dispersion. More preferably, the volume is about 0.05 times to about 500 times, particularly preferably about 0.1 times to about 200 times. Any coacervation agent may be used as long as it does not dissolve the biodegradable polymer used in the polymer, mineral oil, or vegetable oil compound that is miscible with the organic solvent that dissolves the biodegradable polymer. Specifically, for example, silicon oil, sesame oil, soybean oil, corn oil, cottonseed oil, coconut oil, linseed oil, mineral oil, n-hexane, n-heptane and the like are used. You may use these in mixture of 2 or more types. The microcapsules thus obtained are collected by filtration and then repeatedly washed with heptane or the like to remove the coacervation agent. Furthermore, it is washed in the same manner as in the above (a), and then freeze-dried.
In the production of microcapsules by the underwater drying method and the coacervation method, an aggregation inhibitor may be added to prevent aggregation between particles. Examples of the aggregation inhibitor include mannitol, lactose, glucose, starches (for example, corn starch), water-soluble polysaccharides such as hyaluronic acid or alkali metal salts thereof, proteins such as glycine, fibrin, collagen, sodium chloride, phosphoric acid Inorganic salts such as sodium hydrogen are appropriately used.
[0025]
(C) Spray drying method
In this method, the S / O type dispersion liquid (a-1) or the W / O type emulsion liquid (a-2) or the oil phase solution (a-3) is spray-dried using a nozzle ( Spraying into the drying chamber of the spray dryer), the organic solvent in the atomized droplets is volatilized in a very short time to produce microcapsules. Examples of the nozzle include a two-fluid nozzle type, a pressure nozzle type, and a rotating disk type. At this time, if desired, it is also effective to spray an aqueous solution of the anti-aggregation agent from another nozzle simultaneously with the above-mentioned dispersion for the purpose of preventing aggregation of the microcapsule particles. The microcapsules thus obtained are further washed in the same manner as in the above (a), and if necessary, moisture and the organic solvent are further removed by heating (under reduced pressure if necessary).
As a manufacturing method in the case of manufacturing an implantable rod as a matrix containing a physiologically active substance in the present invention, a mixture of a physiologically active substance and a base is heated to a temperature higher than the glass transition temperature of the base, and then placed in a mold. There are methods such as molding and extrusion (extrude). The shape can be freely selected in addition to the rod shape. Alternatively, a rod-shaped implantable preparation can be produced by preliminarily finely pulverizing or microencapsulating a mixture of a physiologically active substance and a base by some method, filling a stainless steel tube or a Teflon tube, and compressing the mixture. At this time, you may heat more than the glass transition temperature of a base as needed. For example, microcapsules obtained by an underwater drying method are filled into a Teflon tube having an inner diameter of 2.0 mm, heated at 60 ° C. for 15 minutes, compressed with a rod having a diameter of 2.0 mm, cooled, and then molded. A 0 mm rod-shaped preparation is obtained.
[0026]
The sustained-release preparation of the present invention is preferably in the form of fine particles. This is because sustained-release preparations do not cause excessive pain to patients when administered through needles usually used for subcutaneous or intramuscular injection. The particle size of the sustained-release preparation is, for example, about 0.1 to 300 μm, preferably about 1 to 150 μm, particularly preferably about 2 to 100 μm, as an average particle size. The compounding amount of the physiologically active substance in the sustained-release preparation of the present invention varies depending on the type of the physiologically active substance, but for example, in the case of a physiologically active peptide, it is usually about 0.1 to 50% (W / W), preferably about 0. .2 to 30% (W / W), more preferably about 0.5 to 20% (W / W). The content of the biodegradable polymer contained in the sustained-release preparation of the present invention is, for example, about 30 to 99.9% (W / W), preferably about 60 to 97% (W / W), more preferably Is about 70 to 90% (W / W).
The initial release rate [release rate until 1 day (24 hours) after administration] of the sustained-release preparation in the present invention is preferably about 50% or less, more preferably about 1 to about 30% of the administered dose. More preferably from about 2 to about 20%, most preferably from about 2 to about 15%. In addition, the initial release rate is calculated from AUC (Area Under the Concentration-Time Curve) in blood concentration up to 24 hours after subcutaneous administration of the sustained-release preparation of the present invention, from AUC up to 24 hours after subcutaneous administration of physiologically active peptide solution. By applying the obtained dose-AUC line, an initial release amount is obtained, and an initial release rate is calculated.
[0027]
The sustained-release preparation of the present invention is formulated into various dosage forms, for example, as microcapsules or using microcapsules as a raw material, and is administered parenterally (for example, intramuscular, subcutaneous, organ injections or implants, Transmucosal agents for nasal cavity, rectum, uterus, etc.), oral preparations (eg, capsules (eg, hard capsules, soft capsules, etc.), solid preparations such as granules, powders, liquids such as suspensions, etc. ) And the like.
The sustained-release preparation of the present invention is particularly preferably for injection. For example, when the sustained-release preparation is a microcapsule, a practical sustained-release preparation for injection can be obtained by adding the above dispersion medium to form an aqueous suspension. Moreover, it is set as the sustained-release injection which can be actually used as an oil suspension by adding the oil dispersion medium.
[0028]
When the sustained-release preparation is, for example, a microcapsule, the particle size of the microcapsule may be within a range satisfying the degree of dispersion and needle penetration when used as a suspension injection, for example, the average particle size The range is about 0.1 to about 300 μm. The average particle size is preferably in the range of about 1 to about 150 μm, particularly preferably about 2 to about 100 μm.
In order to make the above-mentioned microcapsules into a sterile preparation, there are a method of sterilizing the whole manufacturing process, a method of sterilizing with gamma rays, a method of adding a preservative, and the like.
[0029]
The sustained-release preparation of the present invention has low toxicity and can be safely used for mammals (eg, humans, cows, pigs, dogs, cats, mice, rats, rabbits, etc.).
The indication of sustained-release preparations varies depending on the physiologically active substance used. When the physiologically active substance is insulin, for example, diabetes, etc., when it is interferon alpha, viral hepatitis (for example, hepatitis C, HBe antigen positive active hepatitis, etc.), cancer (for example, renal cancer, In the case of erythropoietin, such as anemia (eg, anemia during renal dialysis), etc. In the case of G-CSF, neutropenia (eg, during treatment with anticancer drugs), infection, etc. -2 for cancer (eg, hemangioendothelioma), etc., for FGF, fractures, wounds (bed sores, etc.), periodontal disease, gastrointestinal ulcers, etc., for FGF-9, thrombocytopenia, etc. In the case of NGF, it is effective for the treatment or prevention of senile dementia, neuropathy (neuropathy), in the case of TPA, thrombosis, etc., in the case of tumor necrosis factor, cancer or the like. In addition, in GH-containing sustained-release preparations, based on the growth hormone action of GH, in addition to GH secretion deficiency short stature, Turner syndrome, chronic renal failure, cartilage dystrophy (cartilage dystrophy), and adult growth It can also be applied to the treatment of hormone deficiency (adult GHD) and debilitating diseases such as AIDS. In addition, there is a report that GH has been applied to diseases such as Down's syndrome, silver syndrome, osteogenesis imperfecta, or juvenile chronic arthropathy, and has obtained an effective therapeutic effect. It can also be applied to diseases. Furthermore, it is effective for the treatment or prevention of congestive heart failure. Other applicable GH-containing sustained-release preparations include hematopoiesis during organ transplantation and drug treatment for AIDS patients, improvement in malnutrition, renal anemia, angina, hyperlipidemia, obesity, burns・ Acceleration of wound / ulcer treatment, surgical invasion (surgery / trauma) / early recovery after surgery, sepsis, fracture prevention of osteoporosis, early recovery of postoperative muscle strength in patients with osteoporosis, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) And pressure ulcers. In addition, as an anti-aging drug aimed at improving the quality of life (QOL) of frail elderly people, or for the prevention and improvement of neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebrovascular disorder, etc.) by the neuroprotective action of hGH Can be expected. By making GH into a sustained-release preparation, better efficacy for these indications can be obtained than GH daily subcutaneous injection.
[0030]
The dosage of the sustained-release preparation varies depending on the type and content of the physiologically active substance, the duration of release, the target disease, the target animal, etc., as long as the effective concentration of the physiologically active substance is maintained in the body. Good. The dose of the physiologically active substance can be appropriately selected from the range of about 0.0001 to about 10 mg / kg body weight per adult, for example, when the sustained-release preparation is a two-week preparation. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.05 to about 1 mg / kg body weight. The frequency of administration is once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, etc. The type and content of the physiologically active substance, dosage form, duration of release, target disease, target It can be selected appropriately depending on the animal. Preferably, it is a 1 week to 2 month sustained release preparation, more preferably a 1 week to 1 month sustained release preparation.
When the physiologically active substance that is an active ingredient of the sustained-release preparation is, for example, insulin, the dose for diabetic adults is usually about 0.001 to about 1 mg / kg body weight as an active ingredient, preferably about 0. It is recommended to select from the range of 0.01 to about 0.2 mg / kg body weight and administer once a week.
[0031]
When the physiologically active substance that is an active ingredient of the sustained-release preparation is GH, the dosage varies depending on the type and content of GH, duration of release, target disease, target animal, etc. The concentration may be an amount that can be maintained in the body. In the treatment of the above-mentioned diseases, for example, when the sustained-release preparation is a two-week preparation, the dose of GH is preferably about 0.01 to about 5 mg / kg body weight (approximately 0.03 to about 15 IU / kg body weight) and can be safely administered. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.05 to about 1 mg / kg body weight (about 0.15 to about 3 IU / kg body weight). The frequency of administration can be appropriately selected according to the GH content, dosage form, duration of release, target disease, target animal, etc. once a week, once every two weeks or once a month. Preferably, it is a 1 week to 2 month sustained release preparation, more preferably a 1 week to 1 month sustained release preparation.
The sustained-release preparation is preferably stored at room temperature or in a cold place. More preferably, the sustained release preparation is stored in a cold place. The normal temperature or cold place here is defined in the Japanese Pharmacopoeia. That is, normal temperature means 15 to 25 ° C., and cold place means 15 ° C. or less. Of the cold places, 2 to 8 ° C. is particularly preferable.
[0032]
【Example】
Reference examples, examples, comparative examples and test examples will be described in more detail below, but these examples do not limit the present invention.
Reference example 1
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask that was added to a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) and added with 20-fold molar equivalent of ammonium acetate and cooled in a dry ice-ethanol bath. 100 mL was dropped in 30 minutes, and after quick freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycol = 65/35, viscosity = 0.160 dL / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 mL of dichloromethane. To this organic solvent solution, 300 mg of the above hGH powder was added and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 mL of a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to evaporate dichloromethane, the microcapsules were separated by centrifugation (about 2,000 rpm). Next, after washing twice with 400 mL of distilled water, 0.2 g of D-mannitol was added and freeze-dried. Furthermore, in order to remove the residual solvent, vacuum drying was performed at 46 ° C. for 3 days to obtain hGH-containing microcapsules.
[0033]
Reference example 2
5 g of mannitol, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, adjusted to pH 5-7 with acetic acid, and then made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0034]
Example 1
Dissolve 5 g of mannitol, 2 g of L-arginine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 in about 90 mL of distilled water for injection, adjust the pH to 5-7 with acetic acid, and then use distilled water for injection. The volume was made up to 100 mL. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0035]
Example 2
5 g of mannitol, 2 g of L-arginine hydrochloride and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0036]
Example 3
5 g of mannitol, 0.1 g of benzalkonium chloride and 800.1 g of polysorbate were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0037]
Example 4
5 g of mannitol, 10 mg of protamine sulfate and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0038]
Example 5
5 g of mannitol, 42 mg of zinc chloride and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0039]
Example 6
5 g of mannitol, 1.7 g of lysine hydrochloride and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0040]
Example 7
5 g of mannitol, 10 mg of water-soluble chitosan (manufactured by PRONOVA, Ultrapure grade, hydrochloride, CL113) and 0.1 g of polysorbate 80 are dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, and after addition of 30 mL of polyethylene glycol 400, for injection The volume was made up to 100 mL with distilled water. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0041]
Example 8
5 g of mannitol and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 60 mL of distilled water for injection, 30 mL of polyethylene glycol 400 was added, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0042]
Example 9
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask that was added to a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) and added with 20-fold molar equivalent of ammonium acetate and cooled in a dry ice-ethanol bath. 100 mL was dropped in 30 minutes, and after quick freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycol = 65/35, viscosity = 0.160 dL / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 mL of dichloromethane. To this organic solvent solution, 300 mg of the above hGH powder was added and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 mL of a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to evaporate dichloromethane, the microcapsules were separated by centrifugation (about 2,000 rpm). Next, after washing twice with 400 mL of distilled water, 0.2 g of D-mannitol and 0.4 mg of protamine sulfate were added and freeze-dried. Furthermore, in order to remove the residual solvent, vacuum drying was performed at 46 ° C. for 3 days to obtain hGH-containing microcapsules.
[0043]
Example 10
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask that was added to a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) and added with 20-fold molar equivalent of ammonium acetate and cooled in a dry ice-ethanol bath. 100 mL was dropped in 30 minutes, and after quick freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycol = 65/35, viscosity = 0.160 dL / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 mL of dichloromethane. To this organic solvent solution, 300 mg of the above hGH powder was added and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 mL of a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, microcapsules were collected by centrifugation (about 1,500 rpm). Next, after washing twice with 400 mL of distilled water, 0.2 g of D-mannitol and 0.25 g of L-arginine hydrochloride were added and freeze-dried. Furthermore, in order to remove the residual solvent, vacuum drying was performed at 46 ° C. for 3 days to obtain hGH-containing microcapsules.
[0044]
Example 11
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask that was added to a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) and added with 20-fold molar equivalent of ammonium acetate and cooled in a dry ice-ethanol bath. 100 mL was dropped in 30 minutes, and after quick freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycol = 65/35, viscosity = 0.160 dL / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 mL of dichloromethane. To this organic solvent solution, 300 mg of the above hGH powder was added and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 mL of a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, microcapsules were collected by centrifugation (about 1,500 rpm). Next, after washing twice with 400 mL of distilled water, 0.2 g of D-mannitol and 0.25 g of N-methylglucamine were added and freeze-dried. Furthermore, in order to remove the residual solvent, vacuum drying was performed at 46 ° C. for 3 days to obtain hGH-containing microcapsules.
[0045]
Example 12
The microcapsules containing protamine sulfate obtained in Example 9 were filled in a Teflon tube having an inner diameter of 2.0 mm and heated at 60 ° C. for 15 minutes. After heating, it was compressed with a stick, cooled and molded. A rod-shaped preparation having an outer diameter of 2.0 mm and a length of about 1 cm was obtained.
[0046]
Example 13
5 g of mannitol, 0.2 g of L-arginine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethyl cellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, adjusted to pH 5-7 with acetic acid, and then distilled for injection. The volume was made up to 100 mL with water. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0047]
Example 14
5 g of mannitol, 1.2 g of L-arginine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 are dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, adjusted to pH 5-7 with acetic acid, and then distilled for injection. The volume was made up to 100 mL with water. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0048]
Example 15
5 g of mannitol, 2.4 g of L-arginine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, adjusted to pH 5-7 with acetic acid, and then distilled for injection. The volume was made up to 100 mL with water. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0049]
Example 16
1.5 g of mannitol, 2.4 g of L-arginine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, and made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0050]
Example 17
5 g of mannitol, 2.1 g of lysine hydrochloride, 0.5 g of sodium carboxymethylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, and the volume was made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0051]
Example 18
5 g of mannitol, 1 g of N-methylglucamine, 0.5 g of methylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 are dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, adjusted to pH 6 with hydrochloric acid, and then made up to 100 mL with distilled water for injection. Up. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0052]
Example 19
5 g of mannitol, 1 g of zinc acetate, 0.5 g of methylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 were dissolved in about 90 mL of distilled water for injection and made up to 100 mL with distilled water for injection. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0053]
Example 20
5 g of mannitol, 0.1 g of water-soluble chitosan (manufactured by PRONOVA, ultra pure grade, hydrochloride, CL113), 0.5 g of methylcellulose and 0.1 g of polysorbate 80 are dissolved in about 90 mL of distilled water for injection, and distilled water for injection Up to 100 mL. The obtained solution was filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and then used as a dispersion medium for microcapsule injection.
[0054]
Example 21
Inside of an eggplant-shaped flask which was added with 20 times molar equivalent of ammonium acetate to a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) containing 9.6 μg / mL sodium and cooled in a dry ice-ethanol bath 100 mL of a peristaltic pump was dropped on the wall surface for 30 minutes, and after quick freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycol = 65/35, viscosity = 0.160 dL / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 mL of dichloromethane. To this organic solvent solution, 300 mg of the above hGH powder was added and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 mL of a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to evaporate dichloromethane, the microcapsules were separated by centrifugation (about 2,000 rpm). Next, after washing twice with 400 mL of distilled water, 0.2 g of D-mannitol was added and freeze-dried. Furthermore, in order to remove the residual solvent, vacuum drying was performed at 46 ° C. for 3 days to obtain hGH-containing microcapsules.
[0055]
Example 22
Using a genetically modified hGH aqueous solution (hGH concentration = 2 mg / mL) containing 7.3 μg / mL sodium, hGH-containing microcapsules were obtained in the same manner as in Example 21.
[0056]
Comparative Example 1
Using a genetically modified hGH aqueous solution containing 16.3 μg / mL sodium (hGH concentration = 2 mg / mL), hGH-containing microcapsules were obtained in the same manner as in Example 21.
[0057]
Test example 1
The following tests were carried out using the dispersion obtained by adding the dispersion medium produced in Example 1 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1.
(1) In vivo release in rats
SD rats (male, 6 weeks old) were immunosuppressed with tacrolimus. 5 mg of Prograf Injection (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) was diluted with physiological saline, 0.4 mg / 0.2 mL / rat 3 days before administration of microcapsules, 0.2 mg / day immediately after administration, 4, 7 and 11 days after administration of microcapsules. Subcutaneous administration at a dose of 0.3 mg / 0.2 mL / rat at 0.2 mL / rat, 14, 18, 21, 25, 28 and 32 days after administration can suppress antibody production against hGH, and 5 It became possible to make hGH concentration in rat serum over a week.
The microcapsules obtained in Reference Example 1 were dispersed in the dispersion medium produced in Example 1 so as to be 16 mg hGH / mL. 0.75 mL of the obtained dispersion liquid was subcutaneously administered to the back of the rat under ether anesthesia. The dose was 12 mg as hGH. After administration of the microcapsules, blood was collected over time from the tail vein, and serum was collected. The serum hGH concentration was measured by an immunoradiometric assay (Ab beads HGH, Eiken Chemical).
(2) Initial release rate
The immunosuppressed SD rats were subcutaneously administered with hGH solution at doses of 5, 10 and 20 mg / kg, blood was collected over time, and the serum hGH concentration was measured. AUC was calculated by the trapezoidal method. The hGH dose corresponding to the subcutaneous administration of hGH solution was calculated from the AUC up to 24 hours after administration of the microcapsules, and the initial release rate was calculated by dividing by the dose of 12 mg of the microcapsules.
The initial release rate in the dispersion-administered group obtained by adding the dispersion medium of Example 1 was 6%. As is apparent from this result, in the microcapsule administration group using the L-arginine hydrochloride-containing dispersion medium, the initial release was small, and a high blood hGH concentration over the next month was achieved.
[0058]
Test example 2
The following tests were carried out using each dispersion obtained by adding each dispersion medium produced in Example 2, Example 3, Example 4 or Example 5 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rates in the respective dispersion liquid administration groups obtained by adding the respective dispersion media of Example 2, Example 3, Example 4 or Example 5 were 5%, 6%, 3% and 7%, respectively. . As is clear from this result, in the microcapsule administration group using a dispersion medium containing L-arginine hydrochloride, benzalkonium chloride, protamine sulfate, or zinc chloride, the initial release is small, and then the blood is high for one month. hGH concentration was achieved. The suppression effect of the initial release by the dispersion medium containing these basic substances or water-soluble polyvalent metal salts was revealed.
[0059]
Test example 3
The following tests were carried out using the dispersion obtained by adding the dispersion medium produced in Reference Example 2 to the hGH-containing microcapsules obtained in Example 9.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rate in the dispersion-administered group obtained by adding the dispersion medium of Reference Example 2 to the hGH-containing microcapsules obtained in Example 9 was 8%. As is clear from this result, in the sustained-release microcapsule administration group in which protamine sulfate, which is a basic substance, is retained on the surface of the matrix, the initial release was small, and a high blood hGH concentration over the next month was achieved. .
[0060]
Test example 4
The following tests were carried out using the respective dispersions obtained by adding the dispersion medium produced in Example 8 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1 and Example 10.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rates in the respective dispersion-administered groups obtained by adding the dispersion medium of Example 8 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1 and Example 10 were 7% and 5%, respectively. As is clear from this result, in the sustained-release microcapsule preparation administration group suspended in a dispersion medium containing polyethylene glycol 400, which is a polyol, the initial release is small, and the high blood hGH concentration over the next month is high. Achieved.
[0061]
Test Example 5
The following tests were carried out using each dispersion obtained by adding each dispersion medium produced in Example 13, Example 14 or Example 15 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rates in the respective dispersion liquid administration groups obtained by adding the respective dispersion media of Example 13, Example 14 or Example 15 were 11%, 7% and 6%, respectively. As is clear from this result, in the microcapsule administration group using the dispersion medium containing L-arginine hydrochloride, the initial release decreases with an increase in the amount of addition, and a high blood hGH concentration over one month thereafter. Achieved. The suppression effect of the initial release depending on the amount of L-arginine hydrochloride in the dispersion medium was revealed.
[0062]
Test Example 6
The following tests were carried out using the respective dispersions obtained by adding the dispersion medium produced in Example 16 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rate in each dispersion-administered group obtained by adding the dispersion medium of Example 16 was 4%. As is apparent from this result, in the microcapsule administration group using the dispersion medium containing L-arginine hydrochloride, even when the amount of mannitol is reduced to make the dispersion medium isotonic, the initial release is small, and then in one month. High blood hGH concentrations were achieved. It was clarified that the inhibitory effect on the initial release depends on the amount of L-arginine hydrochloride, and mannitol has no effect even when the amount is reduced.
[0063]
Test Example 7
The following tests were carried out using each dispersion obtained by adding each dispersion medium produced in Example 17, Example 18, Example 19 or Example 20 to the hGH-containing microcapsules obtained in Reference Example 1.
(1) In vivo release in rats
In the same manner as in Test Example 1 (1), the change in serum hGH concentration in immunosuppressed SD rats was evaluated.
(2) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The initial release rates in the respective dispersion-administered groups obtained by adding the respective dispersion media of Example 17, Example 18, Example 19 or Example 20 were 8%, 11%, 10% and 7%, respectively. . As is clear from this result, in the microcapsule administration group using a dispersion medium containing lysine hydrochloride, N-methylglucamine, zinc acetate or chitosan, the initial release was small, and then the high blood hGH concentration over the next month Was achieved. The suppression effect of the initial release by the dispersion medium containing these basic substances, water-soluble polyvalent metal salts or basic polysaccharides was revealed.
[0064]
Test Example 8
The following tests were performed on the hGH-containing microcapsules obtained in Example 21 or Comparative Example 1.
(1) hGH weight average particle diameter in dichloromethane
The average particle size is a measurable range of a laser analysis particle size distribution analyzer (SALD2000A: Shimadzu) after dispersing hGH in dichloromethane by a treatment of about 20,000 rpm for about 30 seconds at a homogenizer (Polytron (Kinematica)). As appropriate, it was diluted with dichloromethane and measured.
(2) hGH encapsulation rate in microcapsules
1.75 mL of acetonitrile was added to 10 mg of microcapsules, and then subjected to ultrasonic treatment. To the obtained acetonitrile solution, 3.25 mL of 10 mM phosphate buffer solution (pH 8.0) was added and sonicated again to extract hGH as the main drug. Subsequently, this hGH extract was subjected to size exclusion high performance liquid chromatography under the following conditions, the hGH content was measured, and the encapsulation rate was calculated.
Column: TSKgelG 3000SWXL(Tosoh)
Eluent: 50 mM NH4HCO3
Flow rate: 0.6mL / min
Detection wavelength: 214nm
(3) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The hGH weight average particle size in dichloromethane of Example 21 or Comparative Example 1 is 1.2 μm and 2.4 μm, respectively, the hGH encapsulation rate in microcapsules is 85% and 73%, respectively, and the initial release rate in immunosuppressed rats is 18% and 40%. As is clear from this result, it is possible to obtain human growth hormone fine particles having a weight average particle diameter of about 0.5 μm to about 2.0 μm by setting the sodium concentration in the human growth hormone solution to about 10 μg / mL or less. Thus, a microcapsule with a high hGH encapsulation rate and a low initial release was obtained. That is, it has been clarified that by reducing the salt concentration in the physiologically active substance solution, a sustained-release preparation can be obtained in which the drug is refined and the initial release is suppressed with a high encapsulation rate.
[0065]
Test Example 9
The following tests were performed on the hGH-containing microcapsules obtained in Example 22.
(1) hGH weight average particle diameter in dichloromethane
The hGH weight average particle diameter in dichloromethane was evaluated by the same operation as in Test Example 8 (1).
(2) hGH encapsulation rate in microcapsules
The hGH encapsulation rate in the microcapsules was evaluated by the same operation as in Test Example 8 (2).
(3) Initial release rate
The initial release rate in immunosuppressed SD rats was evaluated by the same operation as in Test Example 1 (2).
The hGH weight average particle size in dichloromethane of Example 22 was 1.2 μm, the hGH encapsulation rate in microcapsules was 83%, and the initial release rate in immunosuppressed rats was 14%. As is clear from this result, it is possible to obtain human growth hormone fine particles having a weight average particle diameter of about 0.5 μm to about 2.0 μm by setting the sodium concentration in the human growth hormone solution to about 10 μg / mL or less. Thus, a microcapsule with a high hGH encapsulation rate and a low initial release was obtained. That is, it has been clarified that by reducing the salt concentration in the physiologically active substance solution, a sustained-release preparation can be obtained in which the drug is refined and the initial release is suppressed with a high encapsulation rate.
[0066]
【Effect of the invention】
According to the present invention, by adding a basic substance or a water-soluble polyvalent metal salt to the outside of the matrix or its dispersion medium, the initial release of the physiologically active substance immediately after administration is drastically suppressed. Thus, a sustained-release preparation having a clinically excellent property as a pharmaceutical product is obtained, which releases a certain amount of the physiologically active substance over a long period of time and has very little alteration of the physiologically active substance and residual organic solvent.

Claims (10)

生理活性物質を含有したマトリックス基剤が生体内分解性ポリマーであるマイクロカプセルと、
アルギニン、リシン、塩化ベンザルコニウム、Ｎ−メチルグルカミン、プロタミンもしくはその塩、スペルミジン、スペルミン、キトサン、塩化亜鉛、および酢酸亜鉛から選択されるカチオン性物質と、
水溶性媒体である分散媒
とを含有する注射用徐放性製剤であって、
生理活性物質が生理活性ペプチドであり、
生体内分解性ポリマーがα−ヒドロキシカルボン酸類の単独もしくは共重合体またはそれらの混合物であり、
分散媒中に、製剤全体に対して０．０１〜２０％（Ｗ／Ｗ）であるカチオン性物質が存在する、生理活性物質の初期放出が抑制された注射用徐放性製剤。 A microcapsule in which a matrix base containing a bioactive substance is a biodegradable polymer ;
A cationic substance selected from arginine, lysine, benzalkonium chloride, N-methylglucamine, protamine or a salt thereof, spermidine, spermine, chitosan, zinc chloride, and zinc acetate ;
A sustained-release preparation for injection containing a dispersion medium that is a water-soluble medium ,
The physiologically active substance is a physiologically active peptide,
The biodegradable polymer is a homo- or copolymer of α-hydroxycarboxylic acids or a mixture thereof;
A sustained-release preparation for injection in which an initial release of a physiologically active substance is suppressed , wherein a cationic substance in an amount of 0.01 to 20% (W / W) is present in the dispersion medium. 生理活性物質を含有したマイクロカプセルとカチオン性物質とを混合してなる請求項１に記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to claim 1 , wherein a microcapsule containing a physiologically active substance and a cationic substance are mixed. 生理活性ペプチドが分子量２００〜５００，０００である請求項１または２記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to claim 1 or 2 , wherein the physiologically active peptide has a molecular weight of 200 to 500,000. 生理活性ペプチドが分子量５，０００〜５００，０００である請求項３記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to claim 3 , wherein the physiologically active peptide has a molecular weight of 5,000 to 500,000. 生理活性ペプチドがホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子または酵素である請求項１〜４のいずれかに記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to any one of claims 1 to 4, wherein the physiologically active peptide is a hormone, cytokine, hematopoietic factor, growth factor or enzyme. 生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンである請求項１〜５のいずれかに記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to any one of claims 1 to 5, wherein the physiologically active peptide is human growth hormone. 生体内分解性ポリマーが乳酸／グリコール酸の組成比が１００／０〜４０／６０モル％の共重合体である請求項１〜６のいずれかに記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to any one of claims 1 to 6 , wherein the biodegradable polymer is a copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of 100/0 to 40/60 mol%. 生体内分解性ポリマーが乳酸単独重合体である請求項１〜６のいずれかに記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to any one of claims 1 to 6 , wherein the biodegradable polymer is a lactic acid homopolymer. 生体内分解性ポリマーの重量平均分子量が３，０００〜５０，０００である請求項１〜８のいずれかに記載の注射用徐放性製剤。The sustained-release preparation for injection according to any one of claims 1 to 8 , wherein the biodegradable polymer has a weight average molecular weight of 3,000 to 50,000. 生理活性物質を含有したマトリックス基剤が生体内分解性ポリマーであるマイクロカプセルを含有する注射用徐放性製剤であって、
生理活性物質が生理活性ペプチドであり、
生体内分解性ポリマーがα−ヒドロキシカルボン酸類の単独もしくは共重合体またはそれらの混合物である、注射用徐放性製剤に、アルギニン、リシン、塩化ベンザルコニウム、Ｎ−メチルグルカミン、プロタミンもしくはその塩、スペルミジン、スペルミン、キトサン、塩化亜鉛、および酢酸亜鉛から選択されるカチオン性物質を含む水溶性媒体である分散媒を、製剤全体に対して０．０１〜２０％（Ｗ／Ｗ）であるカチオン性物質が存在するように混合することを特徴とする生理活性物質の初期放出の抑制方法。A sustained-release preparation for injection containing microcapsules in which a matrix base containing a bioactive substance is a biodegradable polymer ,
The physiologically active substance is a physiologically active peptide,
The biodegradable polymer is a homo- or copolymer of α-hydroxycarboxylic acids or a mixture thereof, and a sustained-release preparation for injection , arginine, lysine, benzalkonium chloride, N-methylglucamine, protamine or the like The dispersion medium, which is a water-soluble medium containing a cationic substance selected from salt, spermidine, spermine, chitosan, zinc chloride, and zinc acetate , is 0.01 to 20% (W / W) based on the entire preparation. A method for suppressing the initial release of a physiologically active substance , comprising mixing so that a cationic substance is present .
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