JP4409135B2 - Manufacturing method of bioactive substance-containing preparation - Google Patents

Description

（式中、R¹は陰イオンを形成しうる基またはそれに変じうる基を示し、Xはフェニレン基とフェニル基が直接または原子鎖２以下のスペーサーを介して結合していることを示し、nは１または２の整数を示し、環Ａはさらに置換基を有していてもよいベンゼン環を示し、R²は陰イオンを形成しうる基またはそれに変じうる基を示し、R³はヘテロ原子を介して結合していてもよく、置換基を有していてもよい炭化水素残基を示す）で表される化合物またはその塩である上記（６）記載の製造法、
（１０）非ペプチド性化合物がロサルタン、エプロサルタン、カンデサルタンシレキセチル、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタンまたはオルメサルタンである上記（６）記載の製造法、
（１１）非ペプチド性化合物がカンデサルタンである上記（６）記載の製造法、
（１２）ポリマーが生体内分解性である上記（１）記載の製造法、
（１３）生体内分解性ポリマーがα−ヒドロキシカルボン酸類の単独もしくは共重合体、またはそれらの混合物である上記（１２）記載の製造法、
（１４）生体内分解性ポリマーが乳酸／グリコール酸の組成率が約１００／０〜約４０／６０モル％の乳酸／グリコール酸単独重合体または共重合体である上記（１３）記載の製造法、
（１５）生体内分解性ポリマーが乳酸単独重合体である上記（１３）記載の製造法、
（１６）生体内分解性ポリマーの重量平均分子量が約３，０００〜約５０，０００である上記（１２）記載の製造法、
（１７）固形物をポリマーのガラス転移温度を基準として、約＋２０〜約−６０℃の温度範囲内で高圧ガスと接触させる上記（１）記載の製造法、
（１８）固形物をポリマーのガラス転移温度を基準として、約０〜約−４０℃の温度範囲内で高圧ガスと接触させる上記（１７）記載の製造法、
（１９）固形物を高圧ガスと接触させる時間が約５分〜約４８時間である上記（１）記載の製造法、
（２０）固形物を高圧ガスと接触させる時間が約１０分〜約１２時間である上記（１９）記載の製造法、
（２１）高圧ガスが生理活性物質およびポリマーに対して不活性物質である上記（１）記載の製造法、
（２２）高圧ガスが二酸化炭素である上記（２１）記載の製造法、
（２３）高圧ガスの圧力が約１〜約７ＭＰａである上記（１）記載の製造法、
（２４）高圧ガスの圧力が約１〜約４ＭＰａである上記（２３）記載の製造法、
（２５）製剤が徐放性マイクロカプセルである上記（２３）記載の製造法、
（２６）徐放性マイクロカプセルが水中乾燥法で得られた上記（２５）記載の製造法、
（２７）上記（１）記載の製造法により得られる製剤、
（２８）上記（２５）記載の製造法により得られる徐放性マイクロカプセル、
（２９）上記（２８）記載の徐放性マイクロカプセルを含んでなる注射剤、
（３０）生理活性物質およびポリマーを含む固形物を形成させ、該固形物を高圧ガスと接触させることを特徴とする生理活性物質の初期放出の抑制方法、および
（３１）生理活性物質およびポリマーを含む固形物を形成させ、該固形物を高圧ガスと接触させることを特徴とする生理活性物質の変質抑制方法、
を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明における生理活性物質としては、動植物にとって有用な生理活性を有し、農薬あるいは動物薬として、あるいは臨床上用いることが出来る種々の薬物が挙げられる。本発明における生理活性物質としては、熱または溶媒に不安定な生理活性物質が好ましい。ここに、熱または溶媒に対して不安定な生理活性物質とは、乳化、脱溶媒あるいは乾燥など、加熱や有機溶媒との接触を伴う製剤工程において、熱または溶媒によって分解、代謝、失活または変性する生理活性物質をいう。農薬としては、例えば害虫防除剤、病害防除剤、雑草防除剤、植物成長調整剤、肥料等が挙げられ、動物薬としては、例えば抗菌剤、ビタミン剤、ホルモン剤、ワクチン、水産用製剤、殺虫消毒剤、ペット用薬剤等が挙げられる。安全で環境に優しい理想的な農薬・動物薬としては残留溶媒が少ないことは重要である。臨床上用いることが出来る種々の薬物としては特に限定されないが、例えば生理活性を有するペプチド系化合物、その他抗生物質、抗真菌薬、抗高脂血症薬、抗腫瘍薬、解熱薬、鎮痛薬、消炎薬、鎮咳去痰薬、鎮静薬、筋弛緩薬、抗てんかん薬、抗潰瘍薬、抗うつ薬、抗アレルギー薬、強心薬、不整脈治療薬、血管拡張薬、降圧利尿薬、糖尿病治療薬、抗凝血薬、止血薬、抗血小板薬、抗結核薬、ホルモン薬、麻薬拮抗薬、骨吸収抑制薬、骨形成促進薬、血管新生抑制薬が挙げられる。なかでも、熱によって二量体や多量体あるいは酸化体・脱アミド体等の類縁物質が生じるペプチド性もしくは非ペプチド性生理活性物質や、生体内分解性ポリマーとの反応物が生成するペプチド性もしくは非ペプチド性生理活性物質が本発明には好適に用いられる。
【０００９】
本発明における生理活性ペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることが出来る種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該「生理活性ペプチド」は、その分子量がモノマーとして、例えば約２００〜５００，０００のものが用いられ、好ましくは分子量約２，０００〜５００，０００のものが汎用される。さらに好ましくは分子量５，０００〜約５００，０００のペプチドが用いられる。
生理活性ペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。該生理活性ペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、さらにそれらの誘導体〜類縁体でもよい。該生理活性ペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明における生理活性ペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、ペプチド性神経伝達物質、造血因子、各種増殖因子、酵素、ポリペプチド系抗生物質、鎮痛性ペプチド、ワクチン等が用いられる。
【００１０】
ペプチドホルモンとしては、例えばインスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（サンドスタチン，米国特許第４，０８７，３９０号，同第４，０９３，５７４号，同第４，１００，１１７号，同第４，２５３，９９８号参照）、成長ホルモン（ＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイド等）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、その塩およびその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、サイモシン（チモシン）、モチリン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻 第５号 第６７６〜６９１頁（１９７８）〕参照｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）およびその誘導体（特開平６−８０５８４号、特開平７−２６９５号、ＥＰ６５８５６８号、特開平８−２４５６９６号、特開平８−２６９０９７号、ＷＯ９７／１５２９６号、ＷＯ９７／３１９４３号、ＷＯ９８／１９６９８号、ＷＯ９８／４３６５８号、特表平１０−５１１３６５号、ＷＯ９９／５５３１０号、特表平１１−５１３９８３号、ＣＡ２２７０３２０号、ＷＯ９９／６４０６１号、特表平１１−５１４９７２号、特表２０００−５００５０５号、ＷＯ２０００／６６１３８号、ＷＯ２０００／６６１４２号、ＷＯ２０００／７８３３３号、特開２００１−１１０９５号、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． ７（１）３５−４４（２００１）、Diabetologia ４３（１０）１３１９−１３２８（２０００）、ＷＯ２０００／３４３３１号、ＷＯ２０００／３４３３２号、米国特許第６，２６８，３４３号、米国公開２００１０１１０７１号、米国公開２００１００６９４３号、ＥＰ０７３３６４４号、ＷＯ２０００／７７０３９号、ＷＯ９９／４３７０７号、ＷＯ９９／４３３４１号、ＷＯ９９／４３７０６号、ＷＯ９９／４３７０８号、ＷＯ９９／４３７０５号、ＷＯ９９／２９３３６号、ＷＯ２０００／３７０９８号、ＥＰ０９６９０１６号、米国特許第５，９８１，４８８号、米国特許第５，９５８，９０９号、ＷＯ９３／２５５７９号、ＷＯ９８／４３６５８号、ＥＰ０８６９１３５号、米国特許第５，６１４，４９２号、米国特許第５，５４５，６１８号、米国特許第５，１２０，７１２号、米国特許第５，１１８，６６６号、ＷＯ９５／０５８４８号、ＷＯ９１／１１４５７号、ＥＰ０７０８１７９号、ＷＯ９６／０６６２８号、ＥＰ０６５８５６８号、ＷＯ８７／０６９４１号参照）、グルコース依存インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）、エクセンディンおよびその誘導体（ＷＯ２０００／６６６２９号、ＷＯ２０００／４１５４６号、ＷＯ９９／０７４０４号、ＷＯ２０００／０９６６６号、米国特許第５，４２４，２８６号参照）、メタスチンおよびその誘導体（ＷＯ２０００／２４８９０号参照）等が用いられる。ペプチドホルモンとしては、好ましくはインスリンおよび成長ホルモン等である。
【００１１】
成長ホルモン（以下、ＧＨと称する）としては、いずれの種由来のものでも良いが、好ましくはヒト成長ホルモン（以下、ｈＧＨと称する）である。また、脳下垂体等から抽出される天然由来も本発明に用いられるが、好ましくは遺伝子組換え型ＧＨ（特公平６−１２９９６号公報、特公平６−４８９８７号公報参照）であり、さらに好ましくはＮ末端にメチオニンを有さない天然型と同じ構造を有する組換え型ｈＧＨである。該ＧＨとしては金属塩であってもよいが、実質的に金属を含有しないＧＨも用いられる。ｈＧＨとしては、分子量約２２Ｋダルトンのみならず、分子量約２０Ｋダルトンのもの（特開平７−１０１８７７号公報、特開平１０−２６５４０４号公報参照）を用いてもよい。また、ｈＧＨの誘導体あるいはその関連タンパク質（ＷＯ９９／０３８８７号公報参照）を用いてもよい。
【００１２】
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカイン等が用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン類（アルファ型、ベータ型、ガンマ型等）、インターロイキン類（例、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２等）等が用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等が用いられる。サイトカインとしては、好ましくはリンホカイン等、さらに好ましくはインターフェロン等、特に好ましくはインターフェロンアルファ等である。
【００１３】
ペプチド性神経伝達物質としては、例えばサブスタンスＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ等が用いられる。
造血因子としては、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（例、Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーター等が用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ，酸性ＦＧＦ，塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−９等）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ等）、インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２等）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリー等が用いられる。
【００１４】
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン等が用いられる。
ポリペプチド系抗生物質としては、例えばポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン等が用いられる。
鎮痛性ペプチドとしては、例えばエンケファリン、エンケファリン誘導体〔米国特許第４，２７７，３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフィン、キョウトルフィン等が用いられる。
ワクチンとしては、例えば、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、狂犬病ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴ混合ワクチン、肺炎球菌ワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、ポリオワクチン、前立腺特異抗原ワクチン等が用いられる。
その他、生理活性ペプチドとしては、サイモポエチン、ダイノルフィン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）およびその誘導体（米国特許第４，２２９，４３８号参照）、およびその他の胸腺因子〔医学のあゆみ、第１２５巻，第１０号，８３５−８４３頁（１９８３年）〕、ニューロテンシン、ブラジキニンおよびエンドセリン拮抗作用を有するペプチド類（ヨーロッパ特許公開第４３６１８９号，同第４５７１９５号，同第４９６４５２号，特開平３−９４６９２号，同３−１３０２９９号公報参照）等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、生理活性ペプチドが金属を含有する場合、必要な場合には、生理活性ペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
【００１６】
本発明における非ペプチド性の生理活性物質としては、例えば滋養強壮保健薬、解熱鎮痛消炎薬、向精神病薬、抗不安薬、抗うつ薬、催眠鎮静薬、鎮痙薬、中枢神経作用薬、脳代謝改善剤、抗てんかん剤、交感神経興奮剤、胃腸薬、制酸剤、抗潰瘍剤、鎮咳去痰剤、鎮吐剤、呼吸促進剤、気管支拡張剤、抗アレルギー薬、歯科口腔用薬、抗ヒスタミン剤、強心剤、抗不整脈薬、利尿薬、血圧降下剤、血管収縮薬、冠血管拡張薬、末梢血管拡張薬、抗高脂血症剤、利胆剤、抗生物質、化学療法剤、抗糖尿病剤、骨粗しょう症用剤、骨格筋弛緩薬、鎮うん剤、ホルモン剤、アルカロイド系麻薬、サルファ剤、痛風治療薬、血液凝固阻止剤、抗悪性腫瘍剤、アルツハイマー病治療薬などから選ばれた１種または２種以上の成分が挙げられる。
【００１７】
滋養強壮保健薬としては、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ（酢酸ｄ−α−トコフェロールなど）、ビタミンＢ₁（ジベンゾイルチアミン、フルスルチアミン塩酸塩など）、ビタミンＢ₂（酪酸リボフラビンなど）、ビタミンＢ₆（塩酸ピリドキシンなど）、ビタミンＣ（アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムなど）、ビタミンＢ₁₂（酢酸ヒドロキソコバラミンなど）のビタミン；カルシウム、マグネシウム、鉄などのミネラル；アミノ酸、オリゴ糖、生薬などが挙げられる。解熱鎮痛消炎薬としては、例えばアスピリン、アセトアミノフェン、エテンザミド、イブプロフェン、塩酸ジフェンヒドラミン、dl-マレイン酸クロルフェニラミン、リン酸ジヒドロコデイン、ノスカピン、塩酸メチルエフェドリン、塩酸フェニルプロパノールアミン、カフェイン、無水カフェイン、トルフェナム酸、メフェナム酸、ジクロフェナクナトリウム、フルフェナム酸、サリチルアミド、アミノピリン、ケトプロフェン、インドメタシン、ブコローム、ペンタゾシンなどが挙げられる。向精神病薬としては、例えばクロルプロマジン、レセルピンなどが挙げられる。抗不安薬としては、例えばアルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、ジアゼパムなどが挙げられる。抗うつ薬としては、例えばイミプラミン、マプロチリン、アンフェタミンなどが挙げられる。
【００１８】
催眠鎮静薬としては、例えばエスタゾラム、ニトラゼパム、ジアゼパム、ペルラピン、フェノバルビタールナトリウムなどが挙げられる。鎮痙薬としては、例えば臭化水素酸スコポラミン、塩酸ジフェンヒドラミン、塩酸パパベリンなどが挙げられる。中枢神経作用薬としては、例えばシチコリン、ロチレニンなどが挙げられる。脳代謝改善剤としては、例えばビンポセチン、塩酸メクロフェノキセートなどが挙げられる。抗てんかん剤としては、例えばフェニトイン、カルバマゼピンなどが挙げられる。交感神経興奮剤としては、例えば塩酸イソプロテレノールなどが挙げられる。胃腸薬としては、例えばゲンチアナ、センブリ、ホミカ、オウバク、トウヒ、コンズランゴ、ケイヒ油などの健胃消化剤；塩酸ペルペリン、耐性乳酸菌、ビフィズス菌などの整腸剤などが挙げられる。制酸剤としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、沈降炭酸カルシウム、酸化マグネシウムなどが挙げられる。抗潰瘍剤としては、例えばランソプラゾール、オメプラゾール、ラベプラゾール、パントプラゾール、ファモチジン、シメチジン、塩酸ラニチジンなどが挙げられる。
【００１９】
鎮咳去痰剤としては、例えば塩酸クロペラスチン、臭化水素酸デキストロメルトファン、テオフィリン、グァヤコールスルホン酸カリウム、グアイフェネシン、リン酸コデインなどが挙げられる。鎮吐剤としては、例えば塩酸ジフェニドール、メトクロプラミドなどが挙げられる。呼吸促進剤としては、例えば酒石酸レバロルファンなどが挙げられる。気管支拡張剤としては、例えばテオフィリン、硫酸サルブタノールなどが挙げられる。抗アレルギー薬としては、例えばアンレキサノクス、セラトロダストなどが挙げられる。歯科口腔用薬としては、例えばオキシテトラサイクリン、トリアムシノロンアセトニド、塩酸クロルヘキシジン、リドカインなどが挙げられる。抗ヒスタミン剤としては、例えば塩酸ジフェンヒドラミン、プロメタジン、塩酸イソチペンジル、dl-マレイン酸クロルフェニラミンなどが挙げられる。強心剤としては、例えばカフェイン、ジゴキシンなどが挙げられる。抗不整脈薬としては、例えば塩酸プロカインアミド、塩酸プロプラノロール、ピンドロールなどが挙げられる。利尿薬としては、例えばイソソルビド、フロセミドなどが挙げられる。血圧降下剤としては、例えば塩酸デラプリル、カプトプリル、臭化ヘキサメトニウム、塩酸ヒドララジン、塩酸ラベタロール、塩酸マニジピン、ロサルタン、エプロサルタン、カンデサルタン シレキセチル（TCV-116）、カンデサルタン（CV-11974）、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタン、オルメサルタンなどが挙げられる。血圧降下剤としては、好ましくはカンデサルタン、カンデサルタン シレキセチル等、特に好ましくはカンデサルタン等である。
【００２０】
血管収縮剤としては、例えば塩酸フェニレフリンなどが挙げられる。冠血管拡張剤としては、例えば塩酸カルボクロメン、モルシドミン、塩酸ベラパミルなどが挙げられる。末梢血管拡張薬としては、例えばシンナリジンなどが挙げられる。抗高脂血症剤としては、例えばセリバスタンチンナトリウム、シンバスタチン、プラバススタチンナトリウムなどが挙げられる。利胆剤としては、例えばデヒドロコール酸、トレピブトンなどが挙げられる。抗生物質としては、例えばセファレキシン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、塩酸セフォチアム、塩酸セフォゾプラン、塩酸セフメノキシム、セフスロジンナトリウムなどのセフェム系抗生物質；アンピシリン、シクラシリン、スルベニシリンナトリウム、ナリジクス酸、エノキサシンなどの合成抗菌剤；カルモナムナトリウムなどのモノバクタム系抗生物質；ペネム系抗生物質及びカルバペネム系抗生物質などが挙げられる。化学療法剤としては、例えば塩酸スルファメチゾール、チアゾスルホンなどが挙げられる。抗糖尿病剤としては、例えばトルブタミド、ボグリボース、（塩酸）ピオグリタゾン、トログリタゾン、５−［［４−［２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エトキシ］フェニル］メチル］−２，４−チアゾリジンジオン （ＢＲＬ−４９６５３）、アカルボース、ミグリトール、エミグリテートなどが挙げられる。骨粗しょう症用剤としては、例えばイプリフラボンなどが挙げられる。骨格筋弛緩薬としては、例えばメトカルバモールなどが挙げられる。鎮うん剤としては、例えば塩酸メクリジン、ジメンヒドリナートなどが挙げられる。
【００２１】
ホルモン剤としては、例えばリオチロニンナトリウム、リン酸デキメタゾンナトリウム、プレドニゾロン、オキセンドロン、酢酸リュープロレリンなどが挙げられる。アルカロイド系麻薬としては、例えばアヘン、塩酸モルヒネ、トコン、塩酸オキシコドン、塩酸アヘンアルカロイド、塩酸コカインなどが挙げられる。サルファ剤としては、例えばスルファミン、スルファメチゾールなどが挙げられる。痛風治療薬としては、例えばアロプリノール、コルヒチンなどが挙げられる。血液凝固阻止剤としては、例えばジクマロールなどが挙げられる。抗悪性腫瘍剤としては、例えば５−フルオロウラシル、ウラシル、マイトマイシンなどが挙げられる。アルツハイマー病治療薬としては、例えばイデベノン、ビンポセチンなどが挙げられる。
【００２２】
本発明における非ペプチド性の生理活性物質としては、分子内に酸素原子を有する化合物、具体的にはエーテル結合またはカルボニル基を有する化合物が好ましい。そのような化合物としては、式（Ｉ）
【化３】

で表される化合物またはその塩が挙げられる。
上記式（Ｉ）中、Ｒ^１としての陰イオンを形成しうる基（プロトンとして遊離しうる水素原子を有する基）としては、例えば、（１）カルボキシル基、（２）テトラゾリル基、（３）トリフルオロメタンスルホン酸アミド基（−ＮＨＳＯ_２ＣＦ_３）、（４）リン酸基、（５）スルホン酸基、（６）Ｎ，Ｓ，Ｏのうちの１個または２個以上を含む５〜７員（好ましくは５〜６員）の単環状の置換されていてもよい複素環残基などが挙げられる。
【００２３】
上記した「Ｎ，Ｓ，Ｏのうちの１個または２個以上を含む５〜７員（好ましくは５〜６員）の単環状の置換されていてもよい複素環残基」としては、例えば、
【化４】

などが挙げられ、また、Ｒ^１で表される複素環残基と該複素環残基が結合するフェニル基との結合は、上記式中ｇが−ＮＨ−などを示す場合、上記に示すような炭素−炭素結合だけでなく、複数個存在する窒素原子の１つを介して結合していてもよい。例えば、Ｒ^１が
【化５】

【化６】

上記式中、ｇは−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）_ｍ−を示し、＞＝Ｚ，＞＝Ｚ’および＞＝Ｚ’’はそれぞれカルボニル基，チオカルボニル基または酸化されていてもよい硫黄原子（例、Ｓ，Ｓ（Ｏ），Ｓ（Ｏ)_２など）（好ましくはカルボニルまたはチオカルボニル基、さらに好ましくはカルボニル基）を示し、ｍは０，１または２を示す。
【００２４】
Ｒ^１で表される複素環残基としては、例えば、オキサジアゾロン環、オキサジアゾロチオン環またはチアジアゾロン環のようなプロトンドナーとしての−ＮＨ−や−ＯＨ基とプロトンアクセプターとしてのカルボニル基、チオカルボニル基またはスルフィニル基などを同時に有する環より１個の水素原子を除去して得られる基などが好ましい。また、Ｒ^１で示される複素環残基は、環状の置換基が結合して縮合環基を形成していてもよいが、Ｒ^１で表される複素環残基としては、５ないし６員環さらに５員環残基が好ましい。
Ｒ^１で表される複素環残基としては、式
【化７】

〔式中、ｉは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、ｊは＞＝Ｏ，＞＝Ｓまたは＞＝Ｓ（Ｏ）_mを示し、ｍは上記と同意義を示す〕で表される基（なかでも、２，５−ジヒドロ−５−オキソ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２，５−ジヒドロ−５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール−３−イル、とりわけ、２，５−ジヒドロ−５−オキソ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）などが好ましい。
また、上記複素環残基（Ｒ^１）は下記に示すように互変異性体が存在する。例えば、
【化８】

のようなａ’，ｂ’およびｃ’の３つの互変異性体が存在するが式
【化９】

で示される複素環残基は上記のａ’，ｂ’およびｃ’のすべてを含むものである。
【００２５】
Ｒ^１としての陰イオンを形成しうる基は、置換可能な位置において、置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基またはアシル基（例、低級（Ｃ_２−５）アルカノイル，ベンゾイルなど）などで保護されていてもよい。
置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基としては、例えば、（１）ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニル基１ないし3個で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基（例、メチル，トリフェニルメチル，ｐ−メトキシベンジル，ｐ−ニトロベンジルなど）、（２）低級（Ｃ_１−４）アルコキシ―低級（Ｃ_１−４）アルキル基（例、メトキシメチル，エトキシメチルなど）、（３）式−ＣＨ（Ｒ^４）−ＯＣＯＲ^５〔式中、Ｒ^４は（ａ）水素、（ｂ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルキル基（例、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなど）、（ｃ）炭素数２−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニル基または（ｄ）炭素数３−８のシクロアルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）を示し、Ｒ^５は（ａ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルキル基（例、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなど）、（ｂ）炭素数２−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニル基、（ｃ）炭素数３−８のシクロアルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数１−３の低級アルキル基（例、ベンジル、p−クロロベンジル、フェネチル、シクロペンチル メチル、シクロヘキシルメチルなど）、（ｄ）炭素数３−８のシクロアルキルもしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数２−３の低級アルケニル基（例、シンナミル等のビニル、プロペニル、アリル、イソプロペニルなどのアルケニル部を持つものなど）、（ｅ）置換されていてもよいアリール基（例、フェニル、p−トリル、ナフチル等のハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）、（ｆ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、n−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシなど）、（ｇ）炭素数２−８の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニロキシ基（例、アリロキシ、イソブテニロキシなど）、（ｈ）炭素数３−８のシクロアルキルオキシ基（例、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシなど）、（ｉ）炭素数３−８のシクロアルキル（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数１−３の低級アルコキシ基（例、ベンジロキシ、フェネチロキシ、シクロペンチルメトキシ、シクロヘキシルメトキシなどのメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシなどのアルコキシ部を持つものなど）、（ｊ）炭素数３−８のシクロアルキル（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数２−３の低級アルケニロキシ基（例、シンナミロキシ等のビニロキシ、プロペニロキシ、アリロキシ、イソプロペニロキシなどのアルケニロキシ部を持つものなど）または（ｋ）置換されていてもよいアリールオキシ基（例、フェノキシ、p−ニトロフェノキシ、ナフトキシ等のハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェノキシまたはナフトキシ基など）を示す〕で表される基などが挙げられる。
また、Ｒ^１としての陰イオンを形成しうる基は、上記した置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基またはアシル基（例、低級（Ｃ_２−５）アルカノイル，ベンゾイルなど）などの保護基以外に、置換可能な位置において、置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基（上記したＲ^１としての陰イオンを形成しうる基の保護基として例示された「置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基」と同様なものが挙げられる）、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、低級（Ｃ_１−４）アルコキシ、1ないし2個の低級（Ｃ_１−４）アルキルで置換されていてもよいアミノなどの置換基を有していてもよい。
上記式中、Ｒ^１としての陰イオンを形成しうる基（プロトンとして遊離しうる水素原子を有する基）に変じうる基は、生物学的すなわち生理的条件下（例えば、生体内酵素などによる酸化、還元あるいは加水分解などの生体内反応など）で陰イオンを形成しうる基に変じうる基（いわゆるプロドラッグ）であってもよく、また、シアノ、Ｎ−ヒドロキシカルバムイミドイル基（−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）−ＮＨ₂）、あるいは置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基またはアシル基でそれぞれ保護された（１）カルボキシル基、（２）テトラゾリル基、（３）トリフルオロメタンスルホン酸アミド基（−ＮＨＳＯ_２ＣＦ_３）、（４）リン酸基、（５）スルホン酸基、（６）Ｎ，Ｓ，Ｏのうちの１個または２個以上を含む５〜７員（好ましくは５〜６員）の単環状の置換されていてもよい複素環残基のように、化学的な反応により、Ｒ^１で表される陰イオンを形成しうる基に変じうる基（いわゆる合成中間体）であってもよい。
Ｒ^１としては、置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル（例、メチル，トリフェニルメチル，メトキシメチル，エトキシメチル，ｐ−メトキシベンジル，ｐ−ニトロベンジルなど）もしくはアシル基（例、低級（Ｃ_２−５）アルカノイル，ベンゾイルなど）で保護されていてもよいカルボキシル、テトラゾリルあるいは２，５−ジヒドロ−５−オキソ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル（好ましくは、テトラゾリル）またはシアノ、Ｎ−ヒドロキシカルバムイミドイル（好ましくはシアノ）が好ましく、とりわけシアノが好ましく用いられる。
【００２６】
上記式中、Ｘは隣接するフェニレン基とフェニル基が直接または原子鎖２以下のスペーサーを介して結合していること（好ましくは直接結合）を示し、原子鎖２以下のスペーサーとしては、直鎖部分を構成する原子数が１または２である２価の鎖であればいずれでもよく、側鎖を有していてもよい。具体的には直鎖部分を構成する原子数が１または２である低級（Ｃ_１−４）アルキレン、−ＣＯ−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−ＮＨ−，−Ｏ−ＣＨ_２−，−Ｓ−ＣＨ_２−，−ＣＨ＝ＣＨ−などが挙げられる。
上記式中、ｎは１または２（好ましくは１）の整数を示す。
上記式中、環Ａは置換基Ｒ^２以外にさらに置換基を有していてもよいベンゼン環を示し、該置換基としては、例えば、（１）ハロゲン（例、Ｆ，Ｃl，Ｂrなど），（２）シアノ，（３）ニトロ，（４）置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル，（５）低級（Ｃ_１−４）アルコキシ，（６）置換されていてもよいアミノ基（例、アミノ，Ｎ−低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ（例，メチルアミノなど），Ｎ，Ｎ−ジ低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ（例，ジメチルアミノなど），Ｎ−アリールアミノ（例、フェニルアミノなど）、脂環式アミノ（例、モルホリノ、ピベリジノ、ピペラジノ、Ｎ−フェニルピペラジノなど）など）、（７）式−ＣＯ−Ｄ’〔式中、Ｄ’は水酸基またはアルキル部分が水酸基，低級（Ｃ_１−４）アルコキシ，低級（Ｃ_２−６）アルカノイルオキシ（例、アセトキシ，ピバロイルオキシなど）、低級（Ｃ_１−６）アルコキシカルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ，エトキシカルボニルオキシなど）あるいは低級（Ｃ_３−６）シクロアルコキシカルボニルオキシ（例、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシなど）で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルコキシを示す〕で表わされる基，または（８）置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル（上記したＲ^１としての陰イオンを形成しうる基の保護基として例示された「置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基」と同様なものが挙げられる）もしくはアシル（例、低級（Ｃ_２−５）アルカノイル、ベンゾイルなど）で保護されていてもよいテトラゾリル、トリフルオロメタンスルホン酸アミド基、リン酸基あるいはスルホン酸基などが挙げられる。
これらの置換基は、ベンゼン環上の置換可能な位置に１〜２個同時に置換されていてもよいが、置換基Ｒ^２以外に環Ａがさらに有する置換基としては、置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル（例、水酸基、カルボキシル基，ハロゲンなどで置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキルなど），ハロゲンなどが好ましく、置換基Ｒ^２以外に環Ａが置換基を有さないことがより好ましい。
【００２７】
上記式中、Ｒ^２としての陰イオンを形成しうる基（プロトンとして遊離しうる水素原子を有する基）としては、例えば、（１）エステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシル基、（２）テトラゾリル基、（３）トリフルオロメタンスルホン酸アミド基（−ＮＨＳＯ_２ＣＦ_３）、（４）リン酸基、（５）スルホン酸基などが挙げられ、これらの基は置換されていてもよい低級アルキル基（上記したＲ^１としての陰イオンを形成しうる基の保護基として例示された「置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル基」と同様なものが挙げられる）もしくはアシル基（例、低級（Ｃ_２−５）アルカノイル、ベンゾイルなど）で保護されていてもよく、生物学的すなわち生理的条件下（例えば、生体内酵素などによる酸化、還元あるいは加水分解などの生体内反応など）で、または化学的に陰イオンを形成しうる基またはそれに変じうる基であればいずれでもよい。
Ｒ^２としてのエステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシルとしては、例えば式−ＣＯ−Ｄ〔式中、Ｄは（１）水酸基、（２）置換されていてもよいアミノ（例えば、アミノ、Ｎ−低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノなど）または（３）置換されていてもよいアルコキシ｛例、（ｉ）アルキル部分が水酸基，置換されていてもよいアミノ（例、アミノ、Ｎ−低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ、ピペリジノ、モルホリノなど），ハロゲン，低級（Ｃ_１−６）アルコキシ、低級（Ｃ_１−６）アルキルチオ、低級（Ｃ_３−８）シクロアルコキシあるいは置換されていてもよいジオキソレニル（例、５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イルなど）で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−６）アルコキシ基、または（ｉｉ）式−Ｏ−ＣＨ（Ｒ^６）−ＯＣＯＲ^７〔式中、Ｒ^６は（ａ）水素、（ｂ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルキル基（例、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなど）、（ｃ）炭素数２−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニル基または（ｄ）炭素数３−８のシクロアルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）を示し、Ｒ^７は（ａ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルキル基（例、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなど）、（ｂ）炭素数２−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニル基、（ｃ）炭素数３−８のシクロアルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数１−３の低級アルキル基（例、ベンジル、p−クロロベンジル、フェネチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなど）、（ｄ）炭素数３−８のシクロアルキルもしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数２−３の低級アルケニル基（例、シンナミル等のビニル、プロペニル、アリル、イソプロペニルなどのアルケニル部を持つものなど）、（ｅ）置換されていてもよいアリール基（例、フェニル、p−トリル、ナフチル等のハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）、（ｆ）炭素数１−６の直鎖もしくは分枝状の低級アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、t−ブトキシ、n−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシなど）、（ｇ）炭素数２−８の直鎖もしくは分枝状の低級アルケニロキシ基（例、アリロキシ、イソブテニロキシなど）、（ｈ）炭素数３−８のシクロアルキルオキシ基（例、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシなど）、（ｉ）炭素数３−８のシクロアルキル（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数１−３の低級アルコキシ基（例、ベンジロキシ、フェネチロキシ、シクロペンチルメトキシ、シクロヘキシルメトキシなどのメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシなどのアルコキシ部を持つものなど）、（ｊ）炭素数３−８のシクロアルキル（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）もしくは置換されていてもよいアリール基（例、ハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェニルまたはナフチル基など）で置換された炭素数２−３の低級アルケニロキシ基（例、シンナミロキシ等のビニロキシ、プロペニロキシ、アリロキシ、イソプロペニロキシなどのアルケニロキシ部を持つものなど）または（ｋ）置換されていてもよいアリールオキシ基（例、フェノキシ、p−ニトロフェノキシ、ナフトキシ等のハロゲン原子、ニトロ、低級（Ｃ_１−４）アルキル、低級（Ｃ_１−４）アルコキシなどを有していてもよいフェノキシまたはナフトキシ基など）を示す〕で表される基など｝を示す〕で表される基などが挙げられる。
Ｒ^２としては、エステル化されていてもよいカルボキシルが好ましく、その具体例としては、例えば、−ＣＯＯＨ及びその塩、−ＣＯＯＭe、−ＣＯＯＥt、−ＣＯＯtＢu、−ＣＯＯＰr、ピバロイルオキシメトキシカルボニル、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エトキシカルボニル、５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イルメトキシカルボニル、アセトキシメトキシカルボニル、プロピオニロキシメトキシカルボニル、n−ブチリロキシメトキシカルボニル、イソブチリロキシメトキシカルボニル、１−（エトキシカルボニロキシ）エトキシカルボニル、１−（アセトキシ）エトキシカルボニル、１−（イソブチリロキシ）エトキシカルボニル、シクロヘキシルカルボニルオキシメトキシカルボニル、ベンゾイルオキシメトキシカルボニル、シンナミロキシカルボニル、シクロペンチルカルボニロキシメトキシカルボニルなどが挙げられ、生物学的すなわち生理的条件下（例えば、生体内酵素による酸化・還元あるいは加水分解などの生体内反応など）で、または化学的に陰イオン（例、ＣＯＯ⁻、その誘導体など）を形成しうる基またはそれに変じうる基であればいずれであってもよく、カルボキシル基、またはそのプロドラッグ体であってもよい。
上記Ｒ^２としては、式−ＣＯ−Ｄ〔式中、Ｄは（１）水酸基または（２）アルキル部分が水酸基、アミノ、ハロゲン、低級（Ｃ_２−６）アルカノイルオキシ（例、アセトオキシ，ピバロイルオキシなど）、低級（Ｃ_３−８）シクロアルカノイルオキシ、低級（Ｃ_１−６）アルコキシカルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ，エトキシカルボニルオキシなど）、低級（Ｃ_３−８）シクロアルコキシカルボニロキシ（例、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシなど）、低級（Ｃ_１−４）アルコキシまたは低級（Ｃ_３−８）シクロアルコキシで置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルコキシを示す〕で表わされる基が好ましく、なかでも低級（Ｃ_１−４）アルキル（好ましくは、メチルまたはエチル）でエステル化されたカルボキシルが好ましい。
【００２８】
上記式中、Ｒ^３で表される「ヘテロ原子を介して結合していてもよく、置換基を有して炭化水素残基」における「炭化水素残基」としては、例えば、（１）アルキル基、（２）アルケニル基、（３）アルキニル基、（４）シクロアルキル基、（５）アリール基、（６）アラルキル基などが挙げられるが、なかでもアルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基が好ましい。
上記（１）のアルキル基としては、炭素数１〜８程度の低級アルキル基で直鎖状、分枝状のいずれでもよく、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ｉ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどがあげられる。
上記（２）のアルケニル基としては、炭素数２〜８程度の低級アルケニル基で直鎖状、分枝状のいずれでもよく、例えばビニル、プロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、イソブテニル、２−オクテニルなどがあげられる。
上記（３）のアルキニル基としては、炭素数２〜８程度の低級アルキニル基で直鎖状、分枝状のいずれでもよく、例えばエチニル、２−プロピニル、２−ブチニル、２−ペンチニル、２−オクチニルなどがあげられる。
上記（４）のシクロアルキル基としては、炭素数３〜６程度の低級シクロアルキルがあげられ、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどがあげられる。
上記したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基またはシクロアルキル基は水酸基、置換されていてもよいアミノ基（例、アミノ、Ｎ−低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ，Ｎ,Ｎ−ジ低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノなど）、ハロゲン、低級（Ｃ_１−４）アルコキシ基，低級（Ｃ_１−４)アルキルチオ基などで置換されていてもよい。
上記（５）のアラルキル基としては、例えばベンジル、フェネチルなどのフェニル−低級（Ｃ_１−４）アルキルなどがあげられ、上記（６）のアリール基としては、例えばフェニルなどがあげられる。
上記したアラルキル基またはアリール基は、そのベンゼン環上の任意の位置に、例えばハロゲン（例、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒなど）、ニトロ、置換されていてもよいアミノ基（例、アミノ，Ｎ−低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノ，Ｎ,Ｎ−ジ低級（Ｃ_１−４）アルキルアミノなど）、低級（Ｃ_１−４）アルコキシ（例、メトキシ、エトキシなど）、低級（Ｃ_１−４）アルキルチオ（例、メチルチオ，エチルチオなど）、低級（Ｃ_１−４）アルキル（例、メチル、エチルなど）などを有していてもよい。
上記したなかでも、Ｒ^３で表される「ヘテロ原子を介して結合していてもよく、置換基を有して炭化水素残基」における「炭化水素残基」としては、置換されていてもよいアルキルまたはアルケニル基（例、水酸基、アミノ基、ハロゲンまたは低級（Ｃ_１−４）アルコキシ基で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−５）アルキルまたは低級（Ｃ_２−５）アルケニル基など）が好ましく、とりわけ、低級（Ｃ_１−５）アルキル（より好ましくは、エチル）が好ましい。
Ｒ^３で表される「ヘテロ原子を介して結合していてもよく、置換基を有して炭化水素残基」における「ヘテロ原子」としては、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｍ−［ｍは０ないし２の整数を示す］、−ＮＲ’−［Ｒ’は水素原子または低級（Ｃ_１−４）アルキルを示す］などが挙げられ、なかでも−Ｏ−が好ましく用いられる。
上記したなかでも、Ｒ^３としては、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｍ−［ｍは０ないし２の整数を示す］または−ＮＲ’−［Ｒ’は水素原子または低級（Ｃ_１−４）アルキルを示す］を介して結合していてもよく、水酸基、アミノ基、ハロゲンおよび低級（Ｃ_１−４）アルコキシ基から選ばれる置換基で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−５）アルキルまたは低級（Ｃ_２−５）アルケニル基などが好ましく、とりわけ、低級（Ｃ_１−５）アルキルまたは低級（Ｃ_１−５）アルコキシ（より好ましくは、エトキシ）が好ましい。
【００２９】
式（Ｉ）で表される化合物のなかでも、式（Ｉ’）
【化１０】

（式中、Ｒ^１は（１）カルボキシル基、（２）テトラゾリル基または（３）式
【化１１】

〔式中、ｉは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、ｊは＞＝Ｏ，＞＝Ｓまたは＞＝Ｓ（Ｏ）_mを示し、ｍは上記と同意義を示す〕で表される基を示し、環Ａは置換基Ｒ^２以外に置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキル（例、水酸基、カルボキシル基，ハロゲンなどで置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルキルなど）またはハロゲンで置換されていてもよいベンゼン環（好ましくは、置換基Ｒ^２以外に置換基を有さないベンゼン環）を示し、Ｒ^２は式−ＣＯ−Ｄ〔式中、Ｄは（１）水酸基または（２）アルキル部分が水酸基、アミノ、ハロゲン、低級（Ｃ_２−６）アルカノイルオキシ（例、アセトオキシ，ピバロイルオキシなど）、低級（Ｃ_３−８）シクロアルカノイルオキシ、低級（Ｃ_１−６）アルコキシカルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ，エトキシカルボニルオキシなど）、低級（Ｃ_３−８）シクロアルコキシカルボニロキシ（例、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシなど）、低級（Ｃ_１−４）アルコキシまたは低級（Ｃ_３−８）シクロアルコキシで置換されていてもよい低級（Ｃ_１−４）アルコキシを示す〕で表わされる基を示し、
Ｒ^３は−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｍ−［ｍは０ないし２の整数を示す］または−ＮＲ’−［Ｒ’は水素原子または低級（Ｃ_１−４）アルキルを示す］を介して結合していてもよく、水酸基、アミノ基、ハロゲンおよび低級（Ｃ_１−４）アルコキシ基から選ばれる置換基で置換されていてもよい低級（Ｃ_１−５）アルキルまたは低級（Ｃ_２−５）アルケニル基（好ましくは、低級（Ｃ_１−５）アルキルまたは低級（Ｃ_１−５）アルコキシ；より好ましくは、エトキシ）を示す。〕で表されるベンズイミダゾール−７−カルボン酸誘導体またはその薬理学的に許容されうる塩などが好ましく、とりわけ、２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ビフェニル−４−イル］メチル］ベンズイミダゾール−７−カルボン酸〔Candesartan〕、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル ２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ビフェニル−４−イル］メチル］ベンズイミダゾール−７−カルボキシラート〔Candesartan cilexetil〕、ピバロイルオキシメチル ２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ビフェニル−４−イル］メチル］ベンズイミダゾール−７−カルボキシラート、２−エトキシ−１−［［２’−（２，５−ジヒドロ−５−オキソ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ビフェニル−４−イル］メチル］ベンズイミダゾール−７−カルボン酸またはその塩などが好ましい。
上記したベンズイミダゾール誘導体は、例えば、ＥＰ−４２５９２１号、ＥＰ−４５９１３６号、ＥＰ−５５３８７９号、ＥＰ−５７８１２５号、ＥＰ−５２０４２３号、ＥＰ−６６８２７２号などに記載の公知の方法又はそれに準じた方法などにより合成することが可能である。また、カンデサルタンシレキセチルを用いる場合には、ＥＰ−４５９１３６号に記載された安定なＣ型結晶を用いるのがよい。
【００３０】
本発明の徐放性製剤における生理活性物質の配合量は生理活性物質の種類等によって異なるが、例えば生理活性ペプチドの場合、通常約０．１〜５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．２〜３０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．５〜２０％（Ｗ／Ｗ）であり、非ペプチド性の生理活性物質の場合、通常約０．１〜６０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．２〜４０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．５〜３０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００３１】
本発明に用いられるポリマーとは、水に難溶または不溶で、生体適合性のある高分子重合物を示し、その例としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタアクリル酸、アクリル酸とメタアクリル酸との共重合体、ナイロン、テトロン、シリコンポリマー、デキストランステアレート、エチルセルロース、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリウレタン、エチレンビニルアセテート系共重合体、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド等が挙げられる。さらに、生体内分解性ポリマーとしては、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水縮重合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ-γ-ベンジル-L-グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例、スチレン-マレイン酸重合体等）等が挙げられる。これらはホモポリマーまたはコポリマーのいずれであってもよい。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、上記のα-ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−体のいずれも用いることができる。
これらの中では、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマー、例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例、乳酸重合体、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル等が好ましい。
生体内分解性ポリマーとしては、さらに好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体等、特に好ましくは乳酸−グリコール酸重合体等である。
【００３２】
本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の単重合体のみならず乳酸−グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸−グリコール酸重合体と称することがある。
生体内分解性ポリマーとして乳酸−グリコール酸重合体（乳酸−グリコール酸共重合体または単重合体）を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０〜約４０／６０が好ましく、約８５／１５〜約５０／５０がさらに好ましい。
乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００〜約５０，０００が好ましく、約３，０００〜約２５，０００がより好ましく、約５，０００〜約２０，０００がさらに好ましい。
乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２〜約４．０が好ましく、約１．５〜約３．５がさらに好ましい。
【００３３】
なお、本明細書での重量平均分子量および分散度に関し、前者は重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の値、後者はこの値から算出した値である。測定は、ＧＰＣカラムKF804L x 2（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いて行う。
【００３４】
また、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、末端基定量による数平均分子量と上記のＧＰＣ測定による数平均分子量がほぼ一致するポリマーであり、末端基定量による数平均分子量は以下のようにして算出される。
約１ｇ〜約３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン（２５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で、室温（２０℃）で攪拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量＝２００００×Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０．０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ｍｌ）
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対して、ＧＰＣ測定による数平均分子量は、各種分析・解析条件（例、移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、両測定による数平均分子量がほぼ一致するとは、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体において、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０．５倍から約２倍の範囲内であること、好ましくは約０．７倍から約１．５倍の範囲内であることをいう。
【００３５】
例えば、１種類以上のα−ヒドロキシカルボン酸類から無触媒脱水縮重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍以上に大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は、末端に遊離のカルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００３６】
末端に遊離のカルボキシル基を有する乳酸−グリコール酸重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水縮重合反応または無機固体酸触媒下での脱水縮重合反応による製造方法等）に従って製造することができる。
乳酸−グリコール酸重合体の分解・消失速度は、組成比あるいは重量平均分子量によって大きく変化するが、一般的にはグリコール酸分率が低いほど分解・消失が遅いため、グリコール酸分率を低くするかあるいは分子量を大きくすることによって放出期間を長くすること（例、約６ヶ月）ができる。逆に、グリコール酸分率を高くするあるいは分子量を小さくすることによって放出期間を短くすること（例、約１週間）もできる。例えば、１週間〜２ヶ月型徐放性製剤とするには、上記組成比および重量平均分子量の範囲の乳酸−グリコール酸重合体を用いるのが好ましい。
【００３７】
したがって、本発明において用いる生体内分解性ポリマーの組成は、目的とする生理活性物質の種類、所望の徐放期間等に応じて、適宜選択されることが好ましい。その具体例としては、例えば、生理活性物質としてＧＨを用いる場合、乳酸−グリコール酸重合体を用いることが好ましく、該乳酸−グリコール酸重合体としては、その乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が８５／１５〜約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体が好ましく、さらに好ましくは約７５／２５〜約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体である。またその重量平均分子量は約８，０００〜約２０，０００が好ましく、さらに好ましくは約１０，０００〜約２０，０００である。また、乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２〜約４．０が好ましく、さらに好ましくは約１．５〜約３．５である。
【００３８】
用いる乳酸−グリコール酸重合体は、上記公報記載の方法等、公知の方法に従い製造できる。該重合体は無触媒脱水縮重合で製造されたものが好ましい。該重合体の製造に使用され、重合体中に残留する有機溶媒は重合反応後に除去される。その方法としては、例えば加熱乾燥法、真空乾燥法、乾燥気体による気流乾燥法、あるいはこれらに準じた方法が挙げられるが、本発明の連続的に供給される高圧ガスと接触させる方法によって、より迅速に除去することができ、溶媒除去に要する時間が大幅に短縮される。上記ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とが、ほぼ一致する乳酸−グリコール酸重合体（ＰＬＧＡ）を用いることが好ましい。
また、該重合体は組成比および／または重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約１０，０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約１２，０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物等が用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５〜約７５／２５である。
【００３９】
また、本発明で用いる生体内分解性ポリマーは、上記した生体内分解性ポリマーの金属塩であってもよく、例えば、ＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の各種生体内分解性ポリマーの多価金属塩等が用いられる。好ましくは乳酸−グリコール酸重合体の多価金属塩（さらに好ましくは亜鉛塩，カルシウム塩，マグネシウム塩等、より好ましくは亜鉛塩等）等が用いられる。該多価金属塩の金属種としては、生体に悪影響を及ぼさない化合物であれば特に限定されず、例えば２価（例、鉄、亜鉛、銅、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、スズ、マンガン等）、３価（例、鉄、アルミニウム、マンガン等）、４価（例、スズ等）などの多価金属も用いることができる。
【００４０】
本明細書においては、生体内分解性ポリマーが金属塩の場合も含めて生体内分解性ポリマーと称することがあり、例えば乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩の場合も乳酸−グリコール酸重合体と称することがある。
これらの生体内分解性ポリマーの多価金属塩はＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の方法およびこれに準じる方法により製造することができる。
また、生体内分解性ポリマーの多価金属塩が亜鉛塩の場合には、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中で反応させることによって製造することもできる。
【００４１】
該製造法においては、まず生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中に共存させて、生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を製造する。この際、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０．１〜約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１〜約７０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約２〜約６０％（Ｗ／Ｗ）である。また、添加する酸化亜鉛量は、特開平１０−２３１２５２号公報に記載されたように、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば目的とする生理活性物質がペプチドの場合、生体内分解性ポリマー量の約０．００１〜約２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．０１〜約１．５％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約１％（Ｗ／Ｗ）であり、目的とする生理活性物質が非ペプチドの場合、生体内分解性ポリマー量の約０．００１〜約３０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．０１〜約２０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．１〜約１０％（Ｗ／Ｗ）である。
有機溶媒への生体内分解性ポリマーおよび酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。目的とする生理活性物質が非ペプチドの場合、生体内分解性ポリマー、酸化亜鉛および生理活性物質の三者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。
【００４２】
本発明の製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、通常約３０〜９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０〜９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０〜９０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００４３】
本発明の製剤は、まず生理活性物質および生体内分解性ポリマーを含む固形物を形成させ、ついでこれを高圧ガスと接触させることにより製造される。
生理活性物質および生体内分解性ポリマーを含む固形物は、例えば生理活性物質が生理活性ペプチドの場合、生理活性ペプチド溶液を凍結乾燥して得られる粉体（Ｓ相）を生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｓ／Ｏ型分散液から溶媒を除去することにより、あるいは生理活性ペプチドを水溶液とした水相（Ｗ相）を生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｗ／Ｏ型乳化液から溶媒を除去することにより、もしくは生理活性ペプチドを生体内分解性ポリマーとともに有機溶媒液（Ｏ相）に溶解させた液から溶媒を除去することにより、形成される。その方法としては、例えば（ａ）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法およびＷ／Ｏ／Ｗ法もしくはＯ／Ｗ法）、（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）および（ｃ）噴霧乾燥法、あるいはこれらに準じた方法等が挙げられる。本明細書において固形物とは、その構成物質が物理的または化学的に結合した物をいう。固形物としては、特に限定されるものではないが、マイクロカプセル等が挙げられる。
【００４４】
生体内分解性ポリマーの溶解に用いる有機溶媒は、沸点３０℃以上であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素類、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、石油ベンジン、石油エーテルなどの脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ベンジルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸などの有機酸類、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、アセトニトリル、プロピオニトリル、ピリジン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどの含窒素化合物類、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄化合物類等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。物質とりわけ有機化合物、例えば医薬品に含まれる溶媒は医薬品の特性上、製品から実質的に除去されていなければならない。また、食品や一般の化学品もその用途によって製品中に残留する溶媒が厳しく規制されている。医薬品中の残留溶媒量については、ＩＣＨに基づくガイドライン（“医薬品中の残留溶媒ガイドラインについて”、Pharm.Tech.Japan 16(5), 687-704, 2000）に許容値の記載があり、例えばクラス２に分類されるジクロロメタンの濃度限度値は６００ｐｐｍ、クラス３に分類されるアセトンの濃度限度値は０．５％（５，０００ｐｐｍ）である。
【００４５】
また、生体内分解性ポリマーの溶解に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることも好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム等）、アルコール類（例、エタノール、メタノール等）、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、酢酸エチル、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム等）と、アルコール類（例、エタノール、メタノール等）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約１００：１〜約１：１であり、好ましくは約３０：１〜約２：１の混合溶媒を用いることが望ましい。また、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０．０１〜約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．１〜約７０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約１〜約６０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００４６】
以下に、生理活性物質として生理活性ペプチドを用い、製剤として徐放性マイクロカプセルを製造する場合のマイクロカプセル化の方法について、より詳細に記載する。
【００４７】
(a-1)水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性ペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒および／または揮発性塩類を添加した後、凍結乾燥により生理活性ペプチド粉体（Ｓ相）を作成する。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性ペプチド粉体を添加し分散させる。この際、生理活性ペプチドと生体内分解性ポリマーとの比率（重量比）は、例えば約１：１０００〜約１：１、好ましくは約１：２００〜約１：５、さらに好ましくは約１：１００〜約１：５である。また、生理活性ペプチド粉体を有機溶媒液中に均一に分散させるため、外部物理的エネルギーを加えることが好ましい。その方法としては例えば、超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が用いられる。このときの有機溶媒液中での生理活性ペプチドの平均粒子径としては約１０μｍ以下、さらに好ましくは約０．１μｍ〜約１０μｍ、より好ましくは約０．５μｍ〜５μｍであることが望ましい。本発明における生理活性ペプチドの平均粒子径は、ホモジナイザーを用いて該生理活性ペプチドをジクロロメタン等の有機溶媒中で分散した後に、レーザー解析式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）により得られる値を示す。その際、生理活性ペプチドはジクロロメタン等の有機溶媒に、例えば約２０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で添加後、ホモジナイザー（例、ポリトロン（キネマチカ社））を用いて約２０，０００ｒｐｍで約３０秒〜１分間攪拌することにより分散液とされ、さらに上記粒度分布測定装置の測定可能な範囲となるように適宜、該有機溶媒で希釈し、供試される。
【００４８】
次いでこのようにして調製された有機溶媒分散液（Ｓ／Ｏ型分散液）を、さらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記と同様の外部物理的エネルギー、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、あるいはホモジナイザー等によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる。以後、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。この際の水相体積は、一般的には油相体積の約１倍〜約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは約２倍〜約５，０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５倍〜約２，０００倍から選ばれる。
【００４９】
上記外水相中には、乳化剤を加えてもよい。該乳化剤としては、一般的に安定なＳ／Ｏ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。これらは適宜組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは約０．００１％〜２０％（Ｗ／Ｗ）である。さらに好ましくは約０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｗ）、特に好ましくは約０．０５％〜５％（Ｗ／Ｗ）である。
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水による洗浄で除去し、再び蒸留水等に分散して凍結乾燥する。
本法において生理活性ペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等、好ましくはメタノール、エタノール等）、アセトン等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよいが、好ましくはアルコール類、特にエタノールを単独で用いることが望ましい。また、生理活性ペプチド水溶液への添加量（濃度）は、体積比において約０.０３ないし０.５％（Ｖ／Ｖ）であり、好ましくは約０.０６ないし０.２５％（Ｖ／Ｖ）、更に好ましくは約０.１ないし０.１５％（Ｖ／Ｖ）である。このような水混和性の有機溶媒の添加により得られる生理活性ペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）生理活性ペプチド粉体が作成できる。
本法において生理活性ペプチド水溶液に添加される揮発性の塩類としては、例えばアンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、好ましくは酢酸アンモニウム等）が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。揮発性の塩類の生理活性ペプチド水溶液への添加量は、モル比において約１０倍ないし約８０倍モルであり、好ましくは約１０倍ないし約７０倍モルであり、さらに好ましくは約１５倍ないし約７０倍モルであり、より好ましくは約２０倍ないし約７０倍モルであり、最も好ましくは約２０倍ないし約５０倍モルである。水混和性の有機溶媒を添加する場合と同様に、揮発性塩類の添加により得られる生理活性ペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）微細生理活性ペプチド粉体が作成できる。
本法において、生理活性ペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類は、単独で用いてもよいし、適宜組み合わせて用いてもよい。水混和性の有機溶媒及び揮発性の塩類を組み合せて用いる時は、上記のそれぞれの添加量に従って、生理活性ペプチド水溶液に添加することができる。
【００５０】
(a-2)水中乾燥法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性ペプチドに水または適当な緩衝液を添加し、生理活性ペプチド溶液（Ｗ相）を作成する。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性ペプチド溶液を添加し分散させる。このようにして得たＷ／Ｏ型乳化液をさらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ法と同様にＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを経由して、マイクロカプセルを得る。
【００５１】
(a-3)水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性ペプチドとともに生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、有機溶媒液（Ｏ相）をさらに水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記Ｓ／Ｏ／Ｗ法と同様にＯ／Ｗ型エマルションを経由して、マイクロカプセルを得る。
【００５２】
(b)相分離法（コアセルベーション法）
本法においては、上記(a-1)のＳ／Ｏ型分散液あるいは(a-2)のＷ／Ｏ型乳化液もしくは(a-3)の油相溶液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えマイクロカプセルを析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、上記分散液の約０．０１倍〜約１，０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０．０５倍〜約５００倍、特に好ましくは約０．１倍〜約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で使用した生体内分解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等が用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセルを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄してコアセルベーション剤を除去する。さらに、上記（ａ）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。
水中乾燥法およびコアセルベーション法でのマイクロカプセルの製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金属塩等の水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が適宜用いられる。
【００５３】
（c）噴霧乾燥法
本法においては、上記（a-1）のＳ／Ｏ型分散液あるいは（a-2）のＷ／Ｏ型乳化液もしくは（a-3）の油相溶液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、マイクロカプセルを製造する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際所望により、上記の分散液と同時に、マイクロカプセル粒子同志の凝集防止を目的として上記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。
【００５４】
上記方法により形成した、生理活性物質および生体内分解性ポリマーを含むマイクロカプセル等の固形物を、引き続いて高圧ガス（好ましくは二酸化炭素）と接触させることにより、有機溶媒をさらに抽出除去する。
【００５５】
具体的には、例えば（ａ）で得られた凍結乾燥マイクロカプセル粉末を抽出容器に入れ、二酸化炭素送液ポンプおよび圧力調節弁より成る抽出システムを用い、抽出処理を行う。また、（ａ）あるいは（ｂ）で得られる凍結乾燥前のマイクロカプセル懸濁液を抽出容器に入れ、同様に抽出処理を行うことも可能である。これらの場合には、徐放性製剤の品質を損なわないため、より緩和な条件で抽出処理を行うことが好ましい。
【００５６】
本発明における高圧ガスとは、ある温度で圧力が大気圧以上かつその温度での液化圧以下である気体である。
本発明に用いられる高圧ガスとしては、例えば二酸化炭素、亜酸化窒素、窒素、ヘリウム、アルゴン、アルカン（例、エタン、プロパン等）、そしてアルケン（例、エチレン等）等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよいが、好ましくは二酸化炭素を単独で用いることが望ましい。
製剤に接触する高圧ガスの温度が製剤の基剤として用いる生体内分解性ポリマーのガラス転移温度を越えて高すぎると製剤の融着、変形、生理活性物質の分解、劣化等の危険性が増大する。本発明におけるガラス転移温度とは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用い、加温速度毎分１０または２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度をいう。また、高圧ガスの温度が低温すぎると、有機溶媒の除去が不十分となる。有機溶媒は、１，０００ｐｐｍ 未満、好ましくは５００ｐｐｍ未満、より好ましくは１００ｐｐｍ未満程度まで除くのがよい。したがって、本発明において二酸化炭素を高圧ガスとして使用するときの有利な温度は生体内分解性ポリマーのガラス転移温度（通常約２０〜６０℃程度）を基準として＋２０〜−６０℃、好ましくは＋１０〜−５０℃、より好ましくは０〜−４０℃、さらに好ましくは−５〜−３０℃、最も好ましくは−１０〜−２５℃の温度範囲である。
【００５７】
選択された高圧ガスに応じて使用時の圧力の範囲は異なるが、一般に高圧ガスの圧力が高すぎるとマイクロカプセルの融着、変形、投与直後の初期放出の増大等の危険性が増大し、また低圧すぎると有機溶媒の除去が不十分となる。本発明において二酸化炭素を高圧ガスとして使用するときの有利な圧力は約１〜７MPa、好ましくは約１〜４MPa、より好ましくは約２〜４MPaである。
高圧ガスと接触させる時間も高圧ガスの圧力、温度、処理するマイクロカプセル量等によって異なるが、二酸化炭素を高圧ガスとして使用するときには約５分〜約４８時間が好ましい。さらに約１０分〜約１２時間が好ましい。
【００５８】
以下、図１を用いて高圧ガス状態の二酸化炭素を用いたマイクロカプセルの高圧ガス処理工程についてさらに詳細に説明する。図１は、本発明における高圧ガス処理に用いる装置の一例の概略図である。かかる高圧ガス処理装置は、例えば図１に示すごとく、液化炭酸ボンベ１、二酸化炭素送液ポンプ２、熱交換器３、抽出容器４、恒温槽５、検出器６、全自動圧力調整弁７および回収容器８で構成されている。処理すべきマイクロカプセルは抽出容器４に入れられ、装置を密閉した後、所定の温度に加温される。次に液化炭酸は液化炭酸ボンベ１から二酸化炭素送液ポンプ２により熱交換器３に送られ、所定の温度に加温され、高圧ガス状態に変換される。次いで、この高圧ガス状態の二酸化炭素は抽出容器４に吹き込まれ、マイクロカプセル中の溶媒を該高圧ガスに溶解・抽出させる。抽出された溶媒は、検出器６，自動圧力調整弁７を経て、回収容器８に回収される。系全体にかける圧力は最下流に接続した全自動圧力調整弁７によって制御される。所定の時間、該高圧ガスと接触させることにより、投与直後の生理活性物質の過剰量の初期放出が飛躍的に抑制され、また生理活性ペプチドの重合体や類縁物質や反応物を生成させることなく、残留有機溶媒を除去することができる。
【００５９】
本発明の徐放性製剤は微粒子状であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、皮下あるいは筋肉内注射に通常使用される注射針を通して投与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがないからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒子径として約０．１〜３００μｍ、好ましくは約１〜１５０μｍ、特に好ましくは約２〜１００μｍである。本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性物質の含量は、例えば生理活性ペプチドの場合、通常約０．１〜５０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０．２〜３０％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約０．５〜２０％（Ｗ／Ｗ）である。本発明の徐放性製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、通常約３０〜９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０〜９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０〜９０％（Ｗ／Ｗ）である。
本発明の徐放性製剤の初期放出率［投与後１日（２４時間）までの放出率］は、生理活性ペプチドの場合、好ましくは約４０％以下、さらに好ましくは約１〜４０％、より好ましくは約３〜３５％である。
【００６０】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化してなる製剤として、非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器等への注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮等への経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）等として投与することができる。
本発明の製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを分散剤（例、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸等の多糖類等）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）等と共に水性懸濁剤とすることにより実用的な徐放性注射剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油等の植物油あるいはこれにレシチン等のりん脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例、ミグリオール812）と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００６１】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば平均粒子径として約０．１〜約３００μｍの範囲が挙げられる。平均粒子径は、好ましくは約１〜約１５０μｍ、特に好ましくは約２〜約１００μｍの範囲である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００６２】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で、哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性物質により種々異なる。生理活性物質が、例えばインスリンである場合には、糖尿病等、インターフェロン−αである場合には、ウイルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎、ＨＢｅ 抗原陽性活動性肝炎等）、癌（例、腎癌、多発性骨髄腫等）等、エリスロポエチンの場合には貧血（例、腎透析時貧血等）等、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例、制ガン剤治療時）、感染症等、ＩＬ−２の場合には癌（例、血管内皮腫等）等、ＦＧＦの場合には骨折、創傷（床ずれ等）、歯周病、消化管潰瘍等、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症等、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）等、ＴＰＡの場合には血栓症等、腫瘍壊死因子の場合には癌等の治療または予防に有効である。また、ＧＨ含有徐放性製剤では、ＧＨの成長ホルモン作用に基づき、ＧＨ分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）の他、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨発育不全（軟骨異栄養症）、さらには成人成長ホルモン欠損症(成人ＧＨＤ）、ＡＩＤＳ等の消耗性疾患の治療にも適応できる。また、ＧＨはダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、あるいは若年性慢性関節症等の疾患にも適応され、有効な治療効果を得たとの報告もあり、ＧＨ含有徐放性製剤はこれらの疾患にも適応可能である。さらにはうっ血性心不全症等の治療または予防にも有効である。その他、ＧＨ含有徐放性製剤が適応できる対象としては、臓器移植時やＡＩＤＳ患者の薬物治療時の造血、低栄養状態の改善、腎性貧血、狭心症、高脂血症、肥満、火傷・創傷・潰瘍の治療促進、外科侵襲（手術・外傷）／術後の早期回復、敗血症、骨粗鬆症の骨折予防、骨粗鬆症による骨折患者の術後筋力早期回復、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、褥瘡等が挙げられる。また、虚弱老人の生活の質（ＱＯＬ）の向上を目的とする抗老化薬として、あるいはｈＧＨの神経保護作用により神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、脳血管障害など）の進展抑制および改善にも効果が期待できる。ＧＨを徐放性製剤化することにより、ＧＨ連日皮下注射剤よりも、これらの適応症に対してすぐれた薬効が得られる。生理活性物質がカンデサルタンである場合には、心肥大、心不全、心筋梗塞、脳卒中、虚血性末梢循環障害、心筋虚血、静脈機能不全、心筋梗塞後の心不全進行、糖尿病性腎症、腎炎、糸球体腎炎、動脈硬化症、血管肥厚、経皮的冠動脈形成術後の血管肥厚または閉塞、バイパス手術後の血管再閉塞、高アルドステロン症、糸球体硬化症、腎不全、緑内障、高眼圧症、高脂血症、狭心症、動脈瘤、冠動脈硬化症、脳動脈硬化症、末梢動脈硬化症、血栓症、中枢神経系疾患、アルツハイマー病、記憶欠乏症、うつ病、健忘症、老人性痴呆、知覚機能障害、多臓器不全、内皮機能障害に伴う疾患または強皮症の予防・治療、または不安症状、緊張症状、不快精神状態または消化不良の予防・改善に有効である。
【００６３】
徐放性製剤の投与量は、生理活性物質の種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該生理活性物質の有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性物質の投与量としては、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、好ましくは成人１人当たり約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回等、該生理活性物質の種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間〜２ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１週間〜１ヶ月型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性物質が、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０．００１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００６４】
徐放性製剤の有効成分である生理活性物質がＧＨの場合には、投与量は、ＧＨの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該ＧＨの有効濃度が体内で保持される量であればよい。上記した疾患の治療において、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、ＧＨの投与量は有効成分として、好ましくは、小児あるいは成人１人当たり約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重（約０．０３〜約１５ＩＵ／ｋｇ体重）の範囲から適宜選択して安全に投与することができる。さらに好ましくは約０．０５〜約１ｍｇ／ｋｇ体重（約０．１５〜約３ＩＵ／ｋｇ体重）の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回あるいは１ヶ月に１回等、ＧＨ含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間〜２ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１週間〜１ヶ月型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することがさらに好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。冷所のうち、とりわけ２〜８℃が好ましい。
【００６５】
【実施例】
以下に参考例、実施例および試験例を挙げて、さらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍｌ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄｌ／ｇ）１．６９０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍｌに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を３５９ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍｌに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍｌを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥することにより、ｈＧＨ含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を得た。同条件で６バッチのマイクロカプセルを製造し、得られた凍結乾燥マイクロカプセル粉末の収量は６．８ｇであった。
【００６６】
参考例２
遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、凍結乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０，粘度＝０．１５４ｄｌ／ｇ）１．８５０ｇと酸化亜鉛１０ｍｇとをジクロロメタン２．７ｍｌに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を１５５ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍｌに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００ｍｌを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０．２ｇを添加し凍結乾燥することにより、ｈＧＨ含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を得た。同条件で６バッチのマイクロカプセルを製造し、得られた凍結乾燥マイクロカプセル粉末の収量は７．６ｇであった。
【００６７】
参考例３
遺伝子組換え型hGH水溶液（最終hGH濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）に、酢酸アンモニウムの２０倍モル等量を添加し、ドライアイス−エタノール浴中で冷却したナス型フラスコの内壁面にペリスタリックポンプを用いて３０分間に１００ｍｌ滴下し急速凍結後、真空乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝６５／３５，粘度＝０．１６０ｄｌ／ｇ）１．５２１ｇと酸化亜鉛９ｍｇとをジクロロメタン２．４ｍｌに溶解した。この有機溶媒液に上記のｈＧＨ粉体を２７０ｍｇ添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を１８℃に冷却した０．１％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍｌに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した。上澄液を吸引操作で出来る限り除去した後のマイクロカプセル懸濁液に５０％エタノール水溶液５００ｍｌを加え、室温で１５分間緩徐にプロペラ撹拌した。次いで遠心分離（約１，５００ｒｐｍ）することによりマイクロカプセルを分取した後、蒸留水４００ｍｌを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール１８０ｍｇを添加し凍結乾燥することにより、ｈＧＨ含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を得た。更に残留溶媒除去のため、４６℃で７２時間真空乾燥してマイクロカプセルを得た。
【００６８】
参考例４
ヒト成長ホルモン含有マイクロカプセルの薬効評価
４週齢で下垂体摘出した雌性ＳＤラットに免疫抑制剤タクロリムス（プログラフ注射液、藤沢薬品工業）を投与することでｈＧＨに対する抗体産生を抑制し、６週齢の時点でマイクロカプセルを投与した後５週間の体重、体長および血清中ラットインスリン様成長因子Ｉ(rIGF-I)濃度を測定した。具体的には、プログラフ注射液５ｍｇを生理食塩水で希釈し、マイクロカプセル投与３日前およびマイクロカプセル投与直後、投与４、７および１１日後に５０μｇ／０．２ｍｌ／ラットの用量で、また投与１４、１８、２１、２５、２８および３２日後に７５μｇ／０．２ｍｌ／ラットの用量で皮下注射した。さらに、下垂体摘出ラットを生理学的により正常化するため、ホルモン補充も行なった。Ｌ−チロキシンナトリウム５水和物とコハク酸ヒドロコルチゾン（共に和光純薬）の混液（最終濃度それぞれ１μｇおよび５０μｇ／０．２ｍｌ／ラット）を週３回、つまりマイクロカプセル投与３日前および投与直後、投与２、４、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０および３２日後に皮下注射した。マイクロカプセルは２４ｍｇ ｈＧＨ／ｍｌとなるように分散媒（５％マンニトール、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）に分散し、その０．５ｍｌをエーテル麻酔下、ラット背部に皮下投与した。投与量はｈＧＨとして１２ｍｇとした。マイクロカプセル投与後、経時的にラットの体重および体長を３５日後まで測定した。また、尾静脈から経時的に採血し、血清を分取した。血清中ｒＩＧＦ−Ｉ濃度は、ラジオイムノアッセイ（DSL-2900、Diagnostic Systems Laboratories, Inc.）により測定した。
【００６９】
参考例５
カンデサルタン２．０ｇ、酸化亜鉛（白水化学工業製）０．３７ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸７５／２５（モル％）、重量平均分子量８，７００、和光純薬工業製）３．６ｇをジクロロメタン１２．７５ｍｌ、メタノール２．２５ｍｌおよび酢酸０．１３６ｍｌの混液に添加し、室温で一晩振とう撹拌して均一な溶液を得た。この溶液を予め１８℃に調節しておいた２０ｍＭ酢酸亜鉛添加０．１ 重量％ ポリビニルアルコール水溶液８００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、７，０００ｒｐｍでＯ／Ｗエマルションとした。このＯ／Ｗエマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタン、メタノールおよび酢酸を揮散させ、油相を固化させた後、遠心分離機を用いて３，０００ｒｐｍで捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行い、遊離薬物等を洗浄した。捕集されたマイクロカプセルはマンニトール０．８ｇを溶解した蒸留水を加えて再分散後、凍結乾燥して粉末として得られた。マイクロカプセル中へのカンデサルタンの封入率は９０．９％で、マイクロカプセル／マンニトール粉末中のカンデサルタン含量は２６．５％であった。
【００７０】
参考例６
１バッチを以下の処理量で行った。カンデサルタン２．０ｇ、酸化亜鉛（白水化学工業製）０．３７ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸７５／２５（モル％）、重量平均分子量８，７００、和光純薬工業製）３．６ｇをジクロロメタン１２．７５ｍｌ、メタノール２．２５ｍｌおよび酢酸０．１３６ｍｌの混液に添加し、室温で一晩振とう撹拌して均一な溶液を得た。この溶液を予め１８℃に調節しておいた１０ｍＭ酢酸亜鉛添加０．１重量％ポリビニルアルコール水溶液８００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、７，０００ｒｐｍでＯ／Ｗエマルションとした。このＯ／Ｗエマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタン、メタノールおよび酢酸を揮散させ、油相を固化させた後、遠心分離機を用いて３，０００ｒｐｍで捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行い、遊離薬物等を洗浄した。以上の操作を２バッチで行ったのち、２バッチのマイクロカプセルを混合後、マンニトール１．６ｇを溶解した蒸留水を加えて再分散後、凍結乾燥して粉末として得られた。マイクロカプセル中へのカンデサルタンの封入率は９０．７％で、マイクロカプセル／マンニトール粉末中のカンデサルタン含量は２６．４％であった。
【００７１】
実施例１
参考例１にて得られたｈＧＨ含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を各０．３ｇずつ使用して、下記の４条件で溶媒除去処理した。日本分光株式会社製の超臨界流体抽出装置の抽出容器（容量１０ｍｌ）にマイクロカプセル粉末を移し、装置を密閉したのち、恒温槽にて所定の温度に加温した。次に二酸化炭素をボンベ圧（約６〜７ＭＰａ）にて送液ポンプ（ＳＣＦ−Ｇｅｔ）を経て熱交換器に送り、所定の温度に加温して、全自動圧力調整弁（ＳＣＦ−Ｂｐｇ）によって系全体にかかる圧力を制御し、所定圧力の高圧ガス状態に変換した。次いで、該高圧二酸化炭素ガスを抽出容器に吹き込み、下記の４条件で溶媒除去処理した。
（１） 圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１５分間。
（２） 圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
（３） 圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間４５分間。
（４） 圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
【００７２】
実施例２
参考例２にて得られたｈＧＨ含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を各０．３ｇずつ使用して、下記の４条件で溶媒除去処理した。日本分光株式会社製の超臨界流体抽出装置の抽出容器（容量１０ｍｌ）にマイクロカプセル粉末を移し、装置を密閉したのち、恒温槽にて所定の温度に加温した。次に二酸化炭素をボンベ圧（約６〜７ＭＰａ）にて送液ポンプ（ＳＣＦ−Ｇｅｔ）を経て熱交換器に送り、所定の温度に加温して、全自動圧力調整弁（ＳＣＦ−Ｂｐｇ）によって系全体にかかる圧力を制御し、所定圧力の高圧ガス状態に変換した。次いで、該高圧二酸化炭素ガスを抽出容器に吹き込み、下記の４条件で溶媒除去処理した。
（１）圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
（２）圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
（３）圧力２ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１８０分間。
（４）圧力１ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間７２０分間。
【００７３】
実施例３
参考例５にて得られたカンデサルタン含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を各０．３ｇずつ使用して、下記の１８条件で溶媒除去処理した。日本分光株式会社製の超臨界流体抽出装置の抽出容器（容量１０ｍｌ）にマイクロカプセル粉末を移し、装置を密閉したのち、恒温槽にて所定の温度に加温した。次に二酸化炭素をボンベ圧（約６〜７ＭＰａ）にて送液ポンプ（ＳＣＦ−Ｇｅｔ）を経て熱交換器に送り、所定の温度に加温して、全自動圧力調整弁（ＳＣＦ−Ｂｐｇ）によって系全体にかかる圧力を制御し、所定圧力の高圧ガス状態に変換した。次いで、該高圧二酸化炭素ガスを抽出容器に吹き込み、下記の１８条件で溶媒除去処理した。
圧力２．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
圧力２．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
圧力２．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１２０分間。
圧力２．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１８０分間。
圧力２．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
圧力２．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
圧力２．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１２０分間。
圧力２．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１８０分間。
圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１５分間。
（１０）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
（１１）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
（１２）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１２０分間。
（１３）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１８０分間。
（１４）圧力３．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
（１５）圧力３．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間。
（１６）圧力３．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１２０分間。
（１７）圧力３．５ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間１８０分間。
（１８）圧力４．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間３０分間。
【００７４】
実施例４
参考例６にて得られたカンデサルタン含有凍結乾燥マイクロカプセル粉末を使用して、下記の３条件で溶媒除去処理した。日本分光株式会社製の超臨界流体抽出装置の抽出容器（容量１０ｍｌ）にマイクロカプセル粉末を移し、装置を密閉したのち、恒温槽にて所定の温度に加温した。次に二酸化炭素をボンベ圧（約６〜７ＭＰａ）にて送液ポンプ（ＳＣＦ−Ｇｅｔ）を経て熱交換器に送り、所定の温度に加温して、全自動圧力調整弁（ＳＣＦ−Ｂｐｇ）によって系全体にかかる圧力を制御し、所定圧力の高圧ガス状態に変換した。次いで、該高圧二酸化炭素ガスを抽出容器に吹き込み、下記の３条件で溶媒除去処理した。
（１）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間、マイクロカプセル仕込み量０．３ｇ。
（２）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間、マイクロカプセル仕込み量２ｇ。
（３）圧力３．０ＭＰａ、温度１５℃、抽出時間６０分間、マイクロカプセル仕込み量５ｇ。
【００７５】
試験例１
実施例１（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中の残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量およびｈＧＨ含量を以下の方法で測定した。
（１） 残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量
マイクロカプセル約１００ｍｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドに溶かし、正確に５ｍｌとし、試料溶液とした。別に、ジクロロメタン約１ｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドを加えて正確に２０ｍｌとした。この溶液をジメチルスルホキシドで正確に１００００倍希釈し、標準溶液とした。試料溶液および標準溶液１μｌにつき、下記の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行い、それぞれの液のジクロロメタンのピーク面積を自動積分法で測定し、ジクロロメタンの量を算出した。
検出器 ：水素炎イオン化検出器
カラム ：OVI-G43 膜厚3μm、 0.53mm i.d. × 30m (Supelco)
注入口温度 ：１４０℃
検出器温度 ：２６０℃
カラム温度 ：４０℃（１０ｍｉｎ保持）→２４０℃（３５℃／ｍｉｎ）→２４０℃（２０ｍｉｎ保持）→冷却→４０℃
キャリアーガス：ヘリウム
流量 ：３５ ｃｍ／ｓｅｃ
（２） ｈＧＨ含量
マイクロカプセル１０ｍｇを５ｍｌのメスフラスコに精密に量り、１．７５ｍｌのアセトニトリルを添加後、超音波処理に付した。得られたアセトニトリル溶液に３ｍｌの１５０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、超音波処理後、１５０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）でメスアップした。このうち１ｍｌを１５０００回転／分で１０分間遠心分離し、上澄液を孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過した。次いでこのｈＧＨ抽出液を下記条件のサイズ排除高速液体クロマトグラフィーに供してｈＧＨ含量を測定した。
カラム ：TSK-gel G2000SWXL，７．８ｍｍ i.d. × 300mm（東ソー）
移動相 ：０．０５ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素アンモニウム溶液
流速 ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】

表１の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは残留ジクロロメタン量が格段に減少した。また、マイクロカプセル中ｈＧＨ含量は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により減少しないことが確認された。
【００７７】
試験例２
実施例１（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中のｈＧＨ重合体およびｈＧＨ類縁たん白質の量を以下の方法で測定した。
（１） ｈＧＨ重合体
マイクロカプセル１０ｍｇを精密に量り、アセトニトリル２．５ｍｌを加えて、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、３０００回転／分で１０分間遠心分離した。上澄液を取り除き、残留物にアセトニトリル２．５ｍｌを加え、超音波照射により残留物を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、３０００回転／分で１０分間遠心分離した。上澄液を取り除き、残留物をデシケーター中で減圧乾燥した。これに希釈液（リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル混液（１３：７））１．２５ｍｌを加え、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ｈＧＨ標準品０．２ｍｌを希釈液０．２ｍｌに加えた。この液０．２ｍｌを希釈液４．８ｍｌに加えて標準溶液とした。試料溶液および標準溶液５０μｌにつき、下記の条件で液体クロマトグラフ法により測定を行った。試料溶液のｈＧＨの保持時間より早く溶出するピークのピーク面積および標準溶液のｈＧＨのピーク面積を自動積分法により測定し、重合体の含量を求めた。同時に希釈液５０μｌを注入し、ブランクから検出するピークは計算から控除した。
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：214nm）
カラム ：TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm i.d. × 300mm（東ソー）
カラム温度：２５℃付近の一定温度
移動相 ：０．０５ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素アンモニウム溶液
流速 ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
【００７８】
（２） ｈＧＨ類縁たん白質
マイクロカプセル４０ｍｇを精密に量り、アセトニトリル２ｍｌを加えて、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した。次にリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌを加えて、ときどき振り混ぜながら約２分間超音波照射した後、４℃、３５００回／分で１０分間遠心分離した。その上澄液を孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ｈＧＨ標準品０．１ｍｌを希釈液（リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル混液（１３：７））３．９ｍｌに加えて標準溶液とした。試料溶液および標準溶液２０μｌにつき、下記の条件で液体クロマトグラフ法により測定を行った。試料溶液のｈＧＨ以外の個々のピーク面積および標準溶液のｈＧＨのピーク面積を自動積分法により測定し、類縁たん白質の含量を求めた。同時に希釈液２０μｌ を注入し、ブランクから検出するピークは計算から控除した。

結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】

表２の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルではｈＧＨ重合体およびｈＧＨ類縁蛋白質の量が増加することはなかった。
【００８０】
試験例３
実施例１（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセルの平均粒子径およびin vivo初期放出率を以下の方法で測定した。
（１）マイクロカプセルの平均粒子径
マイクロカプセルの平均粒子径は粒度分布測定装置（MultisizerII,Coulter Electronics Ltd., Beds, UK）にて測定した。
（２）in vivo初期放出率
ラットはタクロリムスにより免疫抑制処理を施した。プログラフ注射液５ｍｇ（藤沢薬品工業）を生理食塩水で希釈し、マイクロカプセル投与３日前に０．４ｍｇ／０．２ｍｌ／ラット、マイクロカプセル投与直後、投与４、７および１１日後に０．２ｍｇ／０．２ｍｌ／ラット、投与１４、１８、２１、２５、２８および３２日後に０．３ｍｇ／０．２ｍｌ／ラットの投与量で皮下投与することで、ｈＧＨに対する抗体産生を抑制でき、投与後５週間にわたるラット血清中ｈＧＨ濃度を測定るすことが可能となった。
マイクロカプセルは１６ｍｇ ｈＧＨ／ｍｌとなるように分散媒（５％マンニトール、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）に分散した。得られた分散液０．７５ｍｌをエーテル麻酔下、ラット背部に皮下投与した。投与量はｈＧＨとして１２ｍｇとした。マイクロカプセル投与後、尾静脈から経時的に採血し、血清を分取した。
血清中ｈＧＨ濃度の測定はイムノラジオメトリックアッセイ（ＡｂビーズＨＧＨ、栄研化学）により測定した。
免疫抑制ラットにｈＧＨ溶液を５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下投与し、経時的に採血を行い、血清中ｈＧＨ濃度を測定した。ＡＵＣは台形法で算出した。マイクロカプセル投与２４時間後までのＡＵＣからｈＧＨ溶液皮下投与の場合のそれに相当するｈＧＨ投与量を算出し、マイクロカプセルの投与量１２ｍｇで除することにより初期放出率を算出した。
結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】

表３の結果から明らかなように、マイクロカプセルの平均粒子径は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により変化することはなく、凝集を起こさないことが確認された。また、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは初期放出率が格段に減少した。
【００８２】
試験例４
実施例２（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中の残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量およびｈＧＨ含量を以下の方法で測定した。
（１）残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量
マイクロカプセル約１００ｍｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドに溶かし、正確に５ｍｌとし、試料溶液とした。別に、ジクロロメタン約１ｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドを加えて正確に２０ｍｌとした。この溶液をジメチルスルホキシドで正確に１００００倍希釈し、標準溶液とした。試料溶液および標準溶液１μｌにつき、下記の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行い、それぞれの液のジクロロメタンのピーク面積を自動積分法で測定し、ジクロロメタンの量を算出した。
検出器 ：水素炎イオン化検出器
カラム ：OVI-G43 膜厚３μm、0.53mm i.d. × 30m (Supelco)
注入口温度 ：１４０℃
検出器温度 ：２６０℃
カラム温度 ：４０℃（１０ｍｉｎ保持）→２４０℃（３５℃／ｍｉｎ）→２４０℃（２０ｍｉｎ保持）→冷却→４０℃
キャリアーガス：ヘリウム
流量 ：３５ ｃｍ／ｓｅｃ
（２）ｈＧＨ含量
マイクロカプセル２０ｍｇを５ｍｌのメスフラスコに精密に量り、１．７５ｍｌのアセトニトリルを添加後、超音波処理に付した。得られたアセトニトリル溶液に３ｍｌの１５０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、超音波処理後、１５０ｍＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）でメスアップした。このうち１ｍｌを１５０００回転／分で１０分間遠心分離し、上澄液を孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過した。次いでこのｈＧＨ抽出液を下記条件のサイズ排除高速液体クロマトグラフィーに供してｈＧＨ含量を測定した。
カラム ：TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm i.d. × 300mm（東ソー）
移動相 ：０．０５ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素アンモニウム溶液
流速 ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】

表４の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは残留ジクロロメタン量が格段に減少した。また、マイクロカプセル中ｈＧＨ含量は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により減少しないことが確認された。
【００８４】
試験例５
実施例２（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中のｈＧＨ重合体およびｈＧＨ類縁たん白質の量を以下の方法で測定した。
（１）ｈＧＨ重合体
マイクロカプセル１０ｍｇを精密に量り、アセトニトリル２．５ｍｌを加えて、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、３０００回転／分で１０分間遠心分離した。上澄液を取り除き、残留物にアセトニトリル２．５ｍｌを加え、超音波照射により残留物を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、３０００回転／分で１０分間遠心分離した。上澄液を取り除き、残留物をデシケーター中で減圧乾燥した。これに希釈液（リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル混液（１３：７））１．２５ｍｌを加え、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した後、孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ｈＧＨ標準品０．２ｍｌを希釈液０．２ｍｌに加えた。この液０．２ｍｌを希釈液４．８ｍｌに加えて標準溶液とした。試料溶液および標準溶液５０μｌにつき、下記の条件で液体クロマトグラフ法により測定を行った。試料溶液のｈＧＨの保持時間より早く溶出するピークのピーク面積および標準溶液のｈＧＨのピーク面積を自動積分法により測定し、重合体の含量を求めた。同時に希釈液５０μｌ を注入し、ブランクから検出するピークは計算から控除した。
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：２１４ｎｍ）
カラム ：TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm i.d. × 300mm（東ソー）
カラム温度：２５℃付近の一定温度
移動相 ：０．０５ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素アンモニウム溶液
流速 ：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
（２）ｈＧＨ類縁たん白質
マイクロカプセル４０ｍｇを精密に量り、アセトニトリル２ｍｌを加えて、超音波照射により試料を分散させ、引き続き約２分間超音波照射した。次にリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌを加えて、ときどき振り混ぜながら約２分間超音波照射した後、４℃、３５００回／分で１０分間遠心分離した。その上澄液を孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ｈＧＨ標準品０．１ｍｌを希釈液（リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル混液（１３：７））３．９ｍｌに加えて標準溶液とした。試料溶液および標準溶液２０μｌにつき、下記の条件で液体クロマトグラフ法により測定を行った。試料溶液のｈＧＨ以外の個々のピーク面積および標準溶液のｈＧＨのピーク面積を自動積分法により測定し、類縁たん白質の含量を求めた。同時に希釈液２０μｌ を注入し、ブランクから検出するピークは計算から控除した。

結果を表５に示す。
【００８５】
【表５】

表５の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルではｈＧＨ重合体およびｈＧＨ類縁蛋白質の量が増加することはなかった。
【００８６】
試験例６
実施例２（１）〜（４）において得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセルの平均粒子径およびin vivo初期放出率を以下の方法で測定した。
（１） マイクロカプセルの平均粒子径
マイクロカプセルの平均粒子径は粒度分布測定装置（MultisizerII,Coulter Electronics Ltd., Beds, UK）にて測定した。
（２） in vivo初期放出率
ラットはタクロリムスにより免疫抑制処理を施した。プログラフ注射液５ｍｇ（藤沢薬品工業）を生理食塩水で希釈し、マイクロカプセル投与３日前に０．４ｍｇ／０．２ｍｌ／ラット、マイクロカプセル投与直後、投与４、７、１１、１４および１８日後に０．２ｍｇ／０．２ｍｌ／ラットの投与量で皮下投与した。マイクロカプセルは８ｍｇ ｈＧＨ／ｍｌとなるように分散媒（５％マンニトール、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）に分散した。得られた分散液０．７５ｍｌをエーテル麻酔下、ラット背部に皮下投与した。投与量はｈＧＨとして６ｍｇとした。マイクロカプセル投与後、尾静脈から経時的に採血し、血清を分取した。
血清中ｈＧＨ濃度の測定はイムノラジオメトリックアッセイ（AbビーズHGH、栄研化学）により測定した。
免疫抑制ラットにｈＧＨ溶液を５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下投与し、経時的に採血を行い、血清中ｈＧＨ濃度を測定した。ＡＵＣは台形法で算出した。マイクロカプセル投与２４時間後までのＡＵＣからｈＧＨ溶液皮下投与の場合のそれに相当するｈＧＨ投与量を算出し、マイクロカプセルの投与量６ｍｇで除することにより初期放出率を算出した。
結果を表６に示す。
【００８７】
【表６】

表６の結果から明らかなように、マイクロカプセルの平均粒子径は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により変化することはなく、凝集を起こさないことが確認された。また、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは初期放出率が格段に減少した。
【００８８】
試験例７
実施例３（１）〜（１８）において得られたカンデサルタン含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中の残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量およびカンデサルタン含量を以下の方法で測定した。
残留ジクロロメタン（ＤＣＭ）量
マイクロカプセル約１００ｍｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドに溶かし、正確に５ｍｌとし、試料溶液とした。別に、ジクロロメタン約１ｇを精密に量り、ジメチルスルホキシドを加えて正確に２０ｍｌとした。この溶液をジメチルスルホキシドで正確に１００００倍希釈し、標準溶液とした。試料溶液および標準溶液１μｌにつき、下記の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行い、それぞれの液のジクロロメタンのピーク面積を自動積分法で測定し、ジクロロメタンの量を算出した。
検出器 ：水素炎イオン化検出器
カラム ：OVI-G43 膜厚３μm、0.53mm i.d.×30m(Supelco)
注入口温度 ：140℃
検出器温度 ：260℃
カラム温度 ：40℃（10min保持）→260℃（35℃/min）（10min保持）
キャリアーガス：ヘリウム
流量 ：35cm/sec
カンデサルタン含量
マイクロカプセル５〜１０ｍｇを遠沈管に精密に量り、ＨＰＬＣ移動相３０ｍｌを添加後、１時間振とう攪拌した。続いて、２９５０回転／分で１０分間遠心分離し、上澄液を孔径０．５μｍのメンブランフィルターでろ過した。次いでこのカンデサルタン抽出液を下記条件の逆相高速液体クロマトグラフィーに供してカンデサルタン含量を測定した。
カラム：inertsil ODS-3 (4.6mm×150mm, GL science)
移動相：0.1M KH₂PO₄/AcCN/MeOH/AcOH=50/35/15/1 (v/v)
流速 ：１ml/min
検出 ：UV波長254nm
結果を表７に示す。
【００８９】
【表７】

表７の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは残留ジクロロメタン量が格段に減少した。また、マイクロカプセル中カンデサルタン含量は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により減少しないことが確認された。
【００９０】
試験例８
実施例４（１）〜（３）において得られたカンデサルタン含有マイクロカプセルおよび未処理の凍結乾燥マイクロカプセルについて、そのマイクロカプセル中の残留ジクロロメタン（DCM）量およびカンデサルタン含量を試験例７と同様の方法で測定した。
結果を表８に示す。
【００９１】
【表８】

表８の結果から明らかなように、未処理のマイクロカプセルに比べ、高圧ガス状態の二酸化炭素で処理したマイクロカプセルでは残留ジクロロメタン量が格段に減少した。また、マイクロカプセル中カンデサルタン含量は高圧ガス状態の二酸化炭素処理により減少しないことが確認された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、徐放性製剤の製造法において、生理活性物質および生体内分解性ポリマーを含む固形物を形成させ、該固形物を高圧ガスと接触させることにより、投与直後の生理活性物質の過剰量の初期放出が飛躍的に抑制され、投与直後から長期間にわたって一定量の生理活性物質を放出し、かつ生理活性物質の変質および残留有機溶媒が極めて少ない、医薬品として臨床上、非常に優れた性質を有する徐放性製剤が得られる。また、溶媒除去について、方法を変更することにより、脱溶媒に要する処理時間が大幅に短縮された。
【図面の簡単な説明】
【図１】高圧ガス状態の二酸化炭素を用いた溶媒除去装置を示す概略図である。
【符号の説明】
１：液化炭酸ボンベ、２：ＣＯ２送液ポンプ、３：熱交換器、４：抽出容器、５：恒温槽、６：検出器、７：自動圧力調整弁、８：回収容器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a physiologically active substance-containing preparation, and more particularly to a method for producing a preparation containing a physiologically active substance and a polymer unstable to heat or a solvent.
[0002]
[Prior art]
Peptidic or non-peptidic physiologically active substances are known to exhibit various pharmacological actions in the living body, and are applied as pharmaceuticals. However, since these physiologically active substances generally have a short half-life in vivo, they need to be administered frequently, and the physical burden on patients associated with injection cannot be ignored. For example, growth hormone is a typical hormone that is originally produced and secreted by the anterior pituitary gland, and it works in a wide variety of ways, including promoting the growth of the body, as well as being involved in sugar and lipid metabolism, anabolism, cell proliferation, and differentiation. It is a bioactive peptide with various physiological effects. Currently, it is mass-produced by E. coli using gene recombination technology and is widely clinically applied as a pharmaceutical all over the world. Growth hormone has a short in vivo half-life and is effective. In order to maintain the blood concentration, frequent administration is required. Especially in the case of pituitary dwarfism, daily subcutaneous administration for several months to more than 10 years has been given to infants and young patients. The reality is.
[0003]
Various studies on drug delivery systems have been conducted to address such problems inherent to bioactive substances. For example, a sustained release agent that releases a physiologically active peptide over a long period of time. Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-217691 (WO96 / 07399) contains a water-soluble peptide-based physiologically active substance as a water-insoluble to poorly water-soluble polyvalent metal salt with an aqueous zinc chloride solution and the like, and a biodegradable polymer. A method for producing a sustained-release preparation is disclosed.
[0004]
In addition, sustained-release preparations using biodegradable polymers maintain the activity of bioactive substances while suppressing the initial release of bioactive substances, particularly excessive release within one day, and are bioactive over a long period of time. It is desirable to be able to arbitrarily control substance release. Regarding this problem, JP-A-11-322631 discloses a bioactive peptide powder obtained by adding a water-miscible organic solvent and / or a volatile salt to a bioactive peptide aqueous solution and freeze-drying it. Disclosed is a method for producing a sustained-release preparation, wherein the organic solvent is removed after being dispersed in an organic solvent solution of a degradable polymer. JP-A-9-132524 discloses a method for producing sustained-release microcapsules containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer, wherein the biodegradable polymer has a glass transition temperature or higher after microencapsulation. And a method for producing a sustained-release preparation characterized by heating and drying for about 24 to 120 hours. These are methods for producing sustained-release preparations that have very little residual organic solvent and clinically excellent properties as pharmaceuticals.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, since the solvent removal method in the above production method requires a long time for solvent removal, there is room for improvement from the viewpoint of production cost in industrial implementation.
On the other hand, as a method for removing a solvent remaining in a substance (eg, a polymer) that is a constituent component when a pharmaceutical is formulated, a heat drying method, a vacuum drying method, and an air flow drying method using a dry gas are known. However, such a method has a strong affinity with a solvent, and for a thermally unstable substance, the removal of the solvent may be insufficient or the substance may be decomposed. In addition, when the boiling point of the solvent to be removed is high, the formulation characteristics may be impaired.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied, and in a method for producing a sustained-release preparation containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer, high pressure is applied for about 10 minutes to about 12 hours after solid formation. Unexpectedly, the initial release of an excessive amount of physiologically active substance immediately after administration is drastically suppressed by contacting with gas, and a certain amount of physiologically active substance is released over a long period from immediately after administration, and the residual organic solvent The present inventors have found that a sustained-release preparation having extremely excellent properties as a pharmaceutical can be produced, and the present invention has been completed based on these.
[0007]
That is, the present invention
(1) A method for producing a physiologically active substance-containing preparation, which comprises forming a solid containing a physiologically active substance and a polymer, and contacting the solid with a high-pressure gas;
(2) The production method according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a physiologically active substance unstable to heat or a solvent,
(3) The production method according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a physiologically active peptide having a molecular weight of about 2,000 to about 500,000,
(4) The production method according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a physiologically active peptide having a molecular weight of about 5,000 to about 500,000,
(5) The production method according to the above (4), wherein the physiologically active peptide is human growth hormone,
(6) The production method according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a non-peptidic compound,
(7) The production method according to the above (6), wherein the non-peptidic compound is a compound having an oxygen atom in the molecule,
(8) The production method according to the above (6), wherein the non-peptidic compound is a compound having an ether bond or a carbonyl group,
(9) The non-peptide compound is represented by the formula (I)
[Chemical formula 2]

(Where R ¹ Represents a group capable of forming an anion or a group capable of changing to it, X represents a phenylene group and a phenyl group bonded directly or via a spacer having an atomic chain of 2 or less, and n is an integer of 1 or 2 Ring A represents a benzene ring which may further have a substituent, and R ² Represents a group capable of forming an anion or a group capable of changing to R, and R ^Three Represents a hydrocarbon residue which may be bonded via a hetero atom and may have a substituent, or a salt thereof, or the production method according to the above (6),
(10) The production method according to the above (6), wherein the non-peptidic compound is losartan, eprosartan, candesartan cilexetil, candesartan, valsartan, telmisartan, irbesartan, tasosartan or olmesartan,
(11) The production method according to the above (6), wherein the non-peptide compound is candesartan,
(12) The production method according to the above (1), wherein the polymer is biodegradable,
(13) The production method according to the above (12), wherein the biodegradable polymer is a homopolymer or a copolymer of α-hydroxycarboxylic acids, or a mixture thereof.
(14) The production method according to the above (13), wherein the biodegradable polymer is a lactic acid / glycolic acid homopolymer or copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of about 100/0 to about 40/60 mol%. ,
(15) The production method according to the above (13), wherein the biodegradable polymer is a lactic acid homopolymer,
(16) The production method according to the above (12), wherein the biodegradable polymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 50,000,
(17) The production method according to the above (1), wherein the solid is brought into contact with a high-pressure gas within a temperature range of about +20 to about −60 ° C. based on the glass transition temperature of the polymer.
(18) The production method according to the above (17), wherein the solid is contacted with a high-pressure gas within a temperature range of about 0 to about −40 ° C. based on the glass transition temperature of the polymer.
(19) The process according to (1) above, wherein the time for contacting the solid with the high-pressure gas is about 5 minutes to about 48 hours,
(20) The method according to (19) above, wherein the time for contacting the solid with the high-pressure gas is about 10 minutes to about 12 hours,
(21) The production method according to the above (1), wherein the high-pressure gas is an inert substance for the physiologically active substance and the polymer,
(22) The production method according to the above (21), wherein the high-pressure gas is carbon dioxide,
(23) The production method according to the above (1), wherein the pressure of the high-pressure gas is about 1 to about 7 MPa,
(24) The production method according to the above (23), wherein the pressure of the high-pressure gas is about 1 to about 4 MPa,
(25) The production method according to the above (23), wherein the preparation is a sustained-release microcapsule,
(26) The production method according to the above (25), wherein the sustained-release microcapsule is obtained by an underwater drying method,
(27) A preparation obtained by the production method according to (1) above,
(28) Sustained release microcapsules obtained by the production method described in (25) above,
(29) An injection comprising the sustained-release microcapsule according to (28) above,
(30) A method for suppressing the initial release of a physiologically active substance, characterized by forming a solid substance containing a physiologically active substance and a polymer, and contacting the solid substance with a high-pressure gas;
(31) A method for suppressing alteration of a physiologically active substance, comprising: forming a solid substance containing a physiologically active substance and a polymer; and contacting the solid substance with a high-pressure gas.
Is to provide.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the physiologically active substance in the present invention include various drugs that have physiological activity useful for animals and plants and can be used as agricultural chemicals, animal drugs, or clinically. The physiologically active substance in the present invention is preferably a physiologically active substance that is unstable to heat or a solvent. Here, a physiologically active substance unstable to heat or a solvent means decomposition, metabolism, inactivation or deactivation by heat or a solvent in a preparation process involving heating or contact with an organic solvent such as emulsification, desolvation or drying. A biologically active substance that denatures. Pesticides include, for example, pest control agents, disease control agents, weed control agents, plant growth regulators, fertilizers, etc., and animal drugs include, for example, antibacterial agents, vitamin agents, hormone agents, vaccines, marine products, insecticides Examples include disinfectants and pet drugs. It is important that there is little residual solvent as an ideal pesticide and animal medicine that is safe and environmentally friendly. Various drugs that can be used clinically are not particularly limited. For example, physiologically active peptide compounds, other antibiotics, antifungals, antihyperlipidemics, antitumor drugs, antipyretic drugs, analgesics, Anti-inflammatory agent, antitussive expectorant, sedative, muscle relaxant, antiepileptic drug, antiulcer drug, antidepressant, antiallergic drug, cardiotonic drug, arrhythmia drug, vasodilator, antihypertensive diuretic, antidiabetic drug, anti Examples include coagulants, hemostatics, antiplatelet drugs, antituberculosis drugs, hormone drugs, narcotic antagonists, bone resorption inhibitors, osteogenesis promoters, and angiogenesis inhibitors. Among them, peptidic or non-peptidic physiologically active substances in which similar substances such as dimers, multimers, oxidants and deamidates are generated by heat, and peptidic or non-peptide bioactive substances generated by reaction Non-peptide physiologically active substances are preferably used in the present invention.
[0009]
Examples of the physiologically active peptide in the present invention include various peptides or proteins that have physiological activity useful for mammals and can be used clinically. The “bioactive peptide” has a molecular weight of, for example, about 200 to 500,000 as a monomer, and preferably has a molecular weight of about 2,000 to 500,000. More preferably, a peptide having a molecular weight of 5,000 to about 500,000 is used.
A typical activity of the bioactive peptide is hormonal action. The physiologically active peptide may be a natural product, a synthetic product, or a semi-synthetic product, and may be a derivative or an analog thereof. The mechanism of action of the physiologically active peptide may be either agonistic or antagonistic.
Examples of the physiologically active peptide in the present invention include peptide hormones, cytokines, peptide neurotransmitters, hematopoietic factors, various growth factors, enzymes, polypeptide antibiotics, analgesic peptides, vaccines and the like.
[0010]
Examples of peptide hormones include insulin, somatostatin, somatostatin derivatives (sandstatin, US Pat. Nos. 4,087,390, 4,093,574, 4,100,117, and 4,253,998). No.), growth hormone (GH), natriuretic peptide, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), ACTH derivatives (such as shrimp tide), melanocyte stimulating hormone (MSH), thyroid hormone releasing hormone (TRH), salts thereof And derivatives thereof (see JP-A-50-121273 and JP-A-52-116465), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin (HCG) , Thymosin (thymosin), mochi , Vasopressin, vasopressin derivatives {desmopressin [Japanese Journal of Endocrinology, Vol. 54, No. 5, pp. 676-691 (1978)]}, oxytocin, calcitonin, parathyroid hormone (PTH), glucagon, secretin, pancreosymine , Cholecystokinin, angiotensin, human placental lactogen, glucagon-like peptide (GLP-1) and its derivatives (JP-A-6-80584, JP-A-7-2695, EP658568, JP-A-8-245696, JP-A-8-245696) -269097, WO97 / 15296, WO97 / 31943, WO98 / 19698, WO98 / 43658, JP10-511365, WO99 / 55310, JP11-513983, CA2270320, WO99 / 6 No. 4061, No. 11-514972, No. 2000-500505, No. 2000-66138, No. WO2000 / 66142, No. WO2000 / 78333, No. 2001-11095, Tissue Eng. 7 (1) 35-44 (2001), Diabetologia 43 (10) 1319-1328 (2000), WO2000 / 34331, WO2000 / 34332, U.S. Patent 6,268,343, U.S. Publication 2001011071, U.S. Publication 2001006943, EP0773364, WO2000 / 77039, WO99 / 77039. 43707, WO99 / 43341, WO99 / 43706, WO99 / 43708, WO99 / 43705, WO99 / 29336, WO2000 / 37098, EP0969016, US Pat. No. 5,981,488, US Pat. , 958, 909, WO 93/25579, WO 98/43658, EP 0869135, US Pat. No. 5,614,492, US Pat. No. 5,545,618, US Pat. No. 5,120,712, National Patent No. 5,118,666, WO95 / 05848, WO91 / 11457, EP0708179, WO96 / 06628, EP0658568, WO87 / 06941), glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP), exendin And derivatives thereof (see WO2000 / 66629, WO2000 / 41546, WO99 / 07404, WO2000 / 09666, US Pat. No. 5,424,286), metastin and derivatives thereof (see WO2000 / 24890), etc. It is done. Peptide hormones are preferably insulin and growth hormone.
[0011]
The growth hormone (hereinafter referred to as GH) may be derived from any species, but is preferably human growth hormone (hereinafter referred to as hGH). In addition, natural sources extracted from the pituitary gland and the like are also used in the present invention, but preferably are recombinant GH (see Japanese Patent Publication Nos. 6-12996 and 6-48987), and more preferably Is a recombinant hGH having the same structure as the natural type without methionine at the N-terminus. The GH may be a metal salt, but GH substantially containing no metal is also used. As hGH, not only a molecular weight of about 22 K Dalton but also a molecular weight of about 20 K Dalton (see JP-A-7-101877 and JP-A-10-265404) may be used. Alternatively, hGH derivatives or related proteins (see WO99 / 03887) may be used.
[0012]
Examples of cytokines include lymphokines and monokines. Examples of lymphokines include interferons (alpha, beta, gamma, etc.) and interleukins (eg, IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, etc.). Etc. are used. Examples of monokines include interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF). The cytokine is preferably lymphokine or the like, more preferably interferon or the like, particularly preferably interferon alpha or the like.
[0013]
As peptide neurotransmitters, for example, substance P, serotonin, GABA and the like are used.
As the hematopoietic factor, for example, erythropoietin (EPO), colony stimulating factor (eg, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, etc.), thrombopoietin (TPO), platelet growth stimulating factor, megacaryocytopotentiator, etc. are used. .
Examples of various growth factors include basic or acidic fibroblast growth factor (FGF) or a family thereof (eg, EGF, TGF-α, TGF-β, PDGF, acidic FGF, basic FGF, FGF-9, etc.) ), Nerve cell growth factor (NGF) or their families (eg, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF, GDNF, etc.), insulin-like growth factors (eg, IGF-1, IGF-2, etc.), bone Factors involved in proliferation (BMP) or their families are used.
[0014]
Examples of the enzyme include superoxide dismutase (SOD), urokinase, tissue plasminogen activator (TPA), asparaginase, kallikrein and the like.
Examples of polypeptide antibiotics include polymyxin B, colistin, gramicidin, and bacitracin.
As the analgesic peptide, for example, enkephalin, enkephalin derivatives (see US Pat. No. 4,277,394, European Patent Application Publication No. 31567), endorphin, kyotorphin and the like are used.
Examples of the vaccine include influenza vaccine, Japanese encephalitis vaccine, rabies vaccine, hepatitis B vaccine, hepatitis A vaccine, cholera vaccine, DPT mixed vaccine, pneumococcal vaccine, diphtheria vaccine, tetanus vaccine, polio vaccine, prostate specific antigen vaccine Etc. are used.
Other bioactive peptides include thymopoietin, dynorphin, bombesin, cerulein, thymostimulin, thymic humoral factor (THF), blood thymic factor (FTS) and derivatives thereof (see US Pat. No. 4,229,438), And other thymic factors [Ayumi of Medicine, Vol. 125, No. 10, pp. 835-843 (1983)], peptides having neurotensin, bradykinin and endothelin antagonistic activity (European Patent Publication No. 436189, ibid.) No. 457195, No. 496452, JP-A-3-94692, JP-A-3-130299) and the like.
[0015]
In the present invention, when the physiologically active peptide contains a metal, if necessary, the metal contained in the physiologically active peptide may be removed in advance, and a known method may be used as a method for removing the metal. Used. For example, an insulin-hydrochloric acid aqueous solution is dialyzed against water or an ammonium acetate salt solution and then freeze-dried to obtain insulin with a minimum amount of metal in an amorphous state.
[0016]
Non-peptide physiologically active substances in the present invention include, for example, nourishing tonic health drugs, antipyretic analgesics, antipsychotics, anxiolytics, antidepressants, hypnotic sedatives, antispasmodics, central nervous system drugs, brain metabolism Improving agent, antiepileptic agent, sympathomimetic agent, gastrointestinal agent, antacid agent, antiulcer agent, antitussive expectorant, antiemetic agent, respiratory promoting agent, bronchodilator, antiallergic agent, oral and oral medicine, antihistamine agent, cardiotonic agent Antiarrhythmic drugs, diuretics, antihypertensives, vasoconstrictors, coronary vasodilators, peripheral vasodilators, antihyperlipidemic agents, biliary drugs, antibiotics, chemotherapeutic agents, antidiabetics, bone One or two selected from symptomatic agents, skeletal muscle relaxants, antidepressants, hormones, alkaloid narcotics, sulfa drugs, anti-gout agents, anticoagulants, antineoplastic agents, Alzheimer's disease agents, etc. The above components can be mentioned.
[0017]
For example, vitamin A, vitamin D, vitamin E (eg d-α-tocopherol acetate), vitamin B ₁ (Dibenzoyl thiamine, fursultiamine hydrochloride, etc.), vitamin B ₂ (Such as riboflavin butyrate), vitamin B ₆ (Such as pyridoxine hydrochloride), vitamin C (such as ascorbic acid, sodium L-ascorbate), vitamin B ₁₂ Vitamins (such as hydroxocobalamin acetate); minerals such as calcium, magnesium and iron; amino acids, oligosaccharides, herbal medicines and the like. Antipyretic analgesics and anti-inflammatory agents include, for example, aspirin, acetaminophen, etenzamide, ibuprofen, diphenhydramine hydrochloride, dl-chlorpheniramine maleate, dihydrocodeine phosphate, noscapine, methylephedrine hydrochloride, phenylpropanolamine hydrochloride, caffeine, anhydrous caffeine , Tolfenamic acid, mefenamic acid, diclofenac sodium, flufenamic acid, salicylamide, aminopyrine, ketoprofen, indomethacin, bucolome, pentazocine and the like. Examples of the psychotropic drug include chlorpromazine, reserpine and the like. Examples of the anxiolytic drug include alprazolam, chlordiazepoxide, diazepam and the like. Examples of the antidepressant include imipramine, maprotiline, amphetamine and the like.
[0018]
Examples of the hypnotic sedative include estazolam, nitrazepam, diazepam, perlapine, phenobarbital sodium and the like. Examples of antispasmodic agents include scopolamine hydrobromide, diphenhydramine hydrochloride, papaverine hydrochloride, and the like. Examples of the central nervous system drug include citicoline and rotilenin. Examples of the brain metabolism improving agent include vinpocetine and meclofenoxate hydrochloride. Examples of the antiepileptic agent include phenytoin and carbamazepine. Examples of the sympathomimetic agent include isoproterenol hydrochloride. Examples of the gastrointestinal agent include healthy gastrointestinals such as gentian, assembly, homica, spruce, spruce, tundurango and cinnamon oil; and intestinals such as perperine hydrochloride, resistant lactic acid bacteria and bifidobacteria. Examples of the antacid include magnesium carbonate, sodium hydrogen carbonate, magnesium aluminate metasilicate, synthetic hydrotalcite, precipitated calcium carbonate, magnesium oxide and the like. Examples of the anti-ulcer agent include lansoprazole, omeprazole, rabeprazole, pantoprazole, famotidine, cimetidine, ranitidine hydrochloride and the like.
[0019]
Examples of the antitussive expectorant include cloperastine hydrochloride, dextromelt fan hydrobromide, theophylline, potassium guaiacol sulfonate, guaifenesin, and codeine phosphate. Examples of the antiemetic include diphenidol hydrochloride and metoclopramide. Examples of the respiratory accelerator include levallorphan tartrate. Examples of bronchodilators include theophylline and salbutanol sulfate. Examples of antiallergic agents include amlexanox and seratrodast. Examples of the dental and oral medicine include oxytetracycline, triamcinolone acetonide, chlorhexidine hydrochloride, lidocaine and the like. Examples of the antihistamine include diphenhydramine hydrochloride, promethazine, isothipentyl hydrochloride, dl-chlorpheniramine maleate, and the like. Examples of the cardiotonic agent include caffeine and digoxin. Examples of the antiarrhythmic drug include procainamide hydrochloride, propranolol hydrochloride, pindolol and the like. Examples of the diuretic include isosorbide and furosemide. Examples of antihypertensive agents include delapril hydrochloride, captopril, hexamethonium bromide, hydralazine hydrochloride, labetalol hydrochloride, manidipine hydrochloride, losartan, eprosartan, candesartan cilexetil (TCV-116), candesartan (CV-11974), valsartan, telmisartan Irbesartan, tasosartan, olmesartan, and the like. The antihypertensive agent is preferably candesartan, candesartan cilexetil, etc., particularly preferably candesartan.
[0020]
Examples of the vasoconstrictor include phenylephrine hydrochloride. Examples of the coronary vasodilator include carbochromene hydrochloride, molsidomine, verapamil hydrochloride and the like. Examples of peripheral vasodilators include cinnarizine. Examples of the antihyperlipidemic agent include cerivastatin sodium, simvastatin, pravastatin sodium and the like. Examples of the astringent include dehydrocholic acid and trepibutone. Antibiotics include, for example, cephem antibiotics such as cephalexin, amoxicillin, pibmesilinum hydrochloride, cefotiam hydrochloride, cefozopran hydrochloride, cefmenoxime hydrochloride, cefthrodine sodium; Agents; monobactam antibiotics such as carmonam sodium; penem antibiotics and carbapenem antibiotics. Examples of the chemotherapeutic agent include sulfamethizole hydrochloride and thiazosulfone. Examples of the antidiabetic agent include tolbutamide, voglibose, (hydrochloric acid) pioglitazone, troglitazone, 5-[[4- [2- (methyl-2-pyridinylamino) ethoxy] phenyl] methyl] -2,4-thiazolidinedione (BRL- 49653), acarbose, miglitol, emiglitate and the like. Examples of the osteoporosis agent include ipriflavone. Examples of the skeletal muscle relaxant include metcarbamol. Examples of the antidepressant include meclizine hydrochloride and dimenhydrinate.
[0021]
Examples of hormone agents include liothyronine sodium, dexamethasone sodium phosphate, prednisolone, oxendron, leuprorelin acetate, and the like. Examples of alkaloid narcotics include opium, morphine hydrochloride, tocone, oxycodone hydrochloride, opium alkaloid hydrochloride, cocaine hydrochloride, and the like. Examples of the sulfa drugs include sulfamine and sulfamethizole. Examples of anti-gout drugs include allopurinol and colchicine. Examples of the blood coagulation inhibitor include dicumarol. Examples of the antineoplastic agent include 5-fluorouracil, uracil, mitomycin and the like. Examples of therapeutic agents for Alzheimer's disease include idebenone and vinpocetine.
[0022]
The non-peptide physiologically active substance in the present invention is preferably a compound having an oxygen atom in the molecule, specifically, a compound having an ether bond or a carbonyl group. Such compounds include those of formula (I)
[Chemical 3]

Or a salt thereof.
In the above formula (I), R ¹ Examples of the group capable of forming an anion (group having a hydrogen atom that can be liberated as a proton) include (1) carboxyl group, (2) tetrazolyl group, (3) trifluoromethanesulfonic acid amide group (-NHSO ₂ CF ₃ ), (4) phosphoric acid group, (5) sulfonic acid group, (6) 5-7 membered (preferably 5-6 membered) monocyclic containing one or more of N, S, O Or a heterocyclic residue which may be substituted.
[0023]
Examples of the above-mentioned “5- to 7-membered (preferably 5 to 6-membered) monocyclic optionally substituted heterocyclic residue containing one or more of N, S, O” include, for example, ,
[Formula 4]

Etc., and R ¹ In the above formula, when g represents —NH— or the like, the bond between the heterocyclic residue represented by the above and the phenyl group to which the heterocyclic residue is bonded is not only a carbon-carbon bond as shown above, It may be bonded via one of a plurality of nitrogen atoms. For example, R ¹ But
[Chemical formula 5]

[Chemical 6]

In the above formula, g is —CH. ₂ -, -NH-, -O- or -S (O) _m ->,> = Z,> = Z 'and> = Z''are each a carbonyl group, a thiocarbonyl group or an optionally oxidized sulfur atom (eg, S, S (O), S (O)) ₂ Etc.) (preferably a carbonyl or thiocarbonyl group, more preferably a carbonyl group), and m represents 0, 1 or 2.
[0024]
R ¹ Examples of the heterocyclic residue represented by the formula: —NH— or —OH group as a proton donor such as an oxadiazolone ring, an oxadiazolothione ring or a thiadiazolone ring; a carbonyl group as a proton acceptor; A group obtained by removing one hydrogen atom from a ring having a carbonyl group or a sulfinyl group at the same time is preferable. R ¹ The heterocyclic residue represented by may be bonded to a cyclic substituent to form a condensed ring group. ¹ As the heterocyclic residue represented by the formula, a 5- to 6-membered ring and a 5-membered ring residue are preferable.
R ¹ As the heterocyclic residue represented by the formula,
[Chemical 7]

[Wherein i represents -O- or -S-, j represents> = O,> = S or> = S (O). _m Wherein m is as defined above] (in particular, 2,5-dihydro-5-oxo-1,2,4-oxadiazol-3-yl, 2,5-dihydro -5-thioxo-1,2,4-oxadiazol-3-yl, 2,5-dihydro-5-oxo-1,2,4-thiadiazol-3-yl, especially 2,5-dihydro-5 -Oxo-1,2,4-oxadiazol-3-yl) and the like are preferable.
In addition, the heterocyclic residue (R ¹ ) Has tautomers as shown below. For example,
[Chemical 8]

There are three tautomers of a ′, b ′ and c ′ such as
[Chemical 9]

The heterocyclic residue represented by includes all of a ′, b ′ and c ′ described above.
[0025]
R ¹ And the group capable of forming an anion at the substitutable position is a lower (C _1-4 ) Alkyl group or acyl group (eg, lower (C _2-5 ) Alkanoyl, benzoyl, etc.).
Optionally substituted lower (C _1-4 ) As the alkyl group, for example, (1) a halogen atom, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) Lower (C) optionally substituted with 1 to 3 phenyl groups optionally having alkoxy or the like _1-4 ) Alkyl group (eg, methyl, triphenylmethyl, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, etc.), (2) lower (C _1-4 ) Alkoxy-lower (C _1-4 ) Alkyl group (eg, methoxymethyl, ethoxymethyl, etc.), (3) formula —CH (R ⁴ ) -OCOR ⁵ [In the formula, R ⁴ Is (a) hydrogen, (b) a linear or branched lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, n- Pentyl, isopentyl, neopentyl, etc.), (c) a linear or branched lower alkenyl group having 2-6 carbon atoms, or (d) a cycloalkyl group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) ) And R ⁵ (A) a linear or branched lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl) , Isopentyl, neopentyl, etc.), (b) a straight or branched lower alkenyl group having 2-6 carbon atoms, (c) a cycloalkyl group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) Or an optionally substituted aryl group (eg, halogen atom, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 A lower alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, benzyl, p-chlorobenzyl, phenethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, etc.) substituted with a phenyl or naphthyl group (which may have alkoxy etc.), ( d) C3-C8 cycloalkyl or optionally substituted aryl group (eg, halogen atom, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkenyl group having 2-3 carbon atoms substituted with an optionally substituted phenyl or naphthyl group having an alkenyl group (eg, vinyl such as cinnamyl, propenyl, allyl, isopropenyl, etc.) Etc.), (e) optionally substituted aryl groups (eg, halogen atoms such as phenyl, p-tolyl, naphthyl, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A phenyl or naphthyl group optionally having alkoxy or the like), (f) a linear or branched lower alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, neopentyloxy, etc.), (g) a linear or branched lower alkenyloxy group having 2 to 8 carbon atoms (eg Allyloxy, isobutenyloxy, etc.), (h) a cycloalkyloxy group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy, cycloheptyloxy, etc.), (i) a cycloalkyl having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl). , Cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) or an optionally substituted aryl group (eg, halogen atom) , Nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms substituted with an optionally substituted alkoxy or the like (eg phenyl or naphthyl group) (eg, methoxy such as benzyloxy, phenethyloxy, cyclopentylmethoxy, cyclohexylmethoxy, ethoxy, n-propoxy) , Having an alkoxy moiety such as isopropoxy), (j) a cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) or an optionally substituted aryl group (eg, a halogen atom, Nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkenyloxy group having 2 to 3 carbon atoms (eg, vinyloxy such as cinnamyloxy, propenyloxy, allyloxy, isopropenyloxy, etc.) substituted with an optionally substituted alkoxy or the like phenyl or naphthyl group) Or (k) an optionally substituted aryloxy group (eg, halogen atom such as phenoxy, p-nitrophenoxy, naphthoxy, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 And a group represented by the following formula: phenoxy or naphthoxy group which may have an alkoxy or the like).
R ¹ The group capable of forming an anion as described above is an optionally substituted lower group (C _1-4 ) Alkyl group or acyl group (eg, lower (C _2-5 In addition to protecting groups such as) alkanoyl, benzoyl, etc.), a lower group (C _1-4 ) Alkyl group (R mentioned above ¹ As an example of a protecting group for a group capable of forming an anion as “optionally substituted lower (C _1-4 And the like "), halogen atom, nitro, cyano, lower (C _1-4 ) Alkoxy, 1 to 2 lower (C _1-4 ) It may have a substituent such as amino which may be substituted with alkyl.
In the above formula, R ¹ The group that can be converted into a group capable of forming an anion (a group having a hydrogen atom that can be liberated as a proton) is a biological or physiological condition (for example, oxidation, reduction or hydrolysis by an in vivo enzyme, etc.) A group that can be converted into a group capable of forming an anion in a living body reaction (so-called prodrug), or a cyano, N-hydroxycarbamimidoyl group (—C (═N—OH) -NH ₂ ) Or optionally substituted lower (C _1-4 ) Protected with alkyl group or acyl group, respectively (1) carboxyl group, (2) tetrazolyl group, (3) trifluoromethanesulfonic acid amide group (—NHSO) ₂ CF ₃ ), (4) phosphoric acid group, (5) sulfonic acid group, (6) 5-7 membered (preferably 5-6 membered) monocyclic containing one or more of N, S, O As in the case of the optionally substituted heterocyclic residue, by chemical reaction, R ¹ The group which can be changed into the group which can form the anion represented by (what is called a synthetic intermediate) may be sufficient.
R ¹ Is optionally substituted lower (C _1-4 ) Alkyl (eg, methyl, triphenylmethyl, methoxymethyl, ethoxymethyl, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, etc.) or acyl groups (eg, lower (C _2-5 ) Carboxy, tetrazolyl or 2,5-dihydro-5-oxo-1,2,4-oxadiazol-3-yl (preferably tetrazolyl) which may be protected by alkanoyl, benzoyl, etc.), cyano, N -Hydroxycarbamimidoyl (preferably cyano) is preferred, with cyano being particularly preferred.
[0026]
In the above formula, X represents that an adjacent phenylene group and a phenyl group are bonded directly or via a spacer having an atomic chain of 2 or less (preferably a direct bond). Any divalent chain having 1 or 2 atoms constituting the moiety may be used, and it may have a side chain. Specifically, the lower part (C _1-4 ) Alkylene, -CO-, -O-, -S-, -NH-, -CO-NH-, -O-CH ₂ -, -S-CH ₂ -, -CH = CH- and the like.
In the above formula, n represents an integer of 1 or 2 (preferably 1).
In the above formula, ring A is a substituent R ² In addition to the above, an optionally substituted benzene ring is shown. Examples of the substituent include (1) halogen (eg, F, Cl, Br, etc.), (2) cyano, (3) nitro, (4) Lower optionally substituted (C _1-4 ) Alkyl, (5) lower (C _1-4 ) Alkoxy, (6) optionally substituted amino group (eg, amino, N-lower (C _1-4 ) Alkylamino (eg, methylamino), N, N-di-lower (C _1-4 ) Alkylamino (eg, dimethylamino, etc.), N-arylamino (eg, phenylamino, etc.), alicyclic amino (eg, morpholino, piperidino, piperazino, N-phenylpiperazino, etc.)), (7) Formula -CO-D '[wherein D' is a hydroxyl group or an alkyl moiety is a hydroxyl group, lower (C _1-4 ) Alkoxy, lower (C _2-6 ) Alkanoyloxy (eg, acetoxy, pivaloyloxy, etc.), lower (C _1-6 ) Alkoxycarbonyloxy (eg, methoxycarbonyloxy, ethoxycarbonyloxy, etc.) or lower (C _3-6 ) Lower (C) optionally substituted with cycloalkoxycarbonyloxy (eg, cyclohexyloxycarbonyloxy, etc.) _1-4 ) Represents an alkoxy group], or (8) an optionally substituted lower group (C _1-4 ) Alkyl (R as described above) ¹ As an example of a protecting group for a group capable of forming an anion as “optionally substituted lower (C _1-4 ) Alkyl group ”or acyl (eg, lower (C _2-5 And tetrazolyl, trifluoromethanesulfonic acid amide group, phosphoric acid group or sulfonic acid group which may be protected with alkanoyl, benzoyl, etc.).
One or two of these substituents may be substituted simultaneously at substitutable positions on the benzene ring. ² In addition to the above, the substituent that ring A further has may be a lower group (C _1-4 ) Alkyl (eg, lower (C) optionally substituted with hydroxyl, carboxyl, halogen, etc. _1-4 ) Alkyl etc.), halogen etc. are preferred, substituent R ² In addition, it is more preferable that ring A has no substituent.
[0027]
In the above formula, R ² As the group capable of forming an anion (group having a hydrogen atom that can be liberated as a proton), for example, (1) a carboxyl group which may be esterified or amidated, (2) a tetrazolyl group, (3 ) Trifluoromethanesulfonic acid amide group (-NHSO ₂ CF ₃ ), (4) phosphoric acid group, (5) sulfonic acid group, etc., and these groups are optionally substituted lower alkyl groups (the above-mentioned R ¹ As an example of a protecting group for a group capable of forming an anion as “optionally substituted lower (C _1-4 ) Alkyl group ”or an acyl group (eg, lower (C _2-5 ) Alkanoyl, benzoyl, etc.) and protected under biological or physiological conditions (eg in vivo reactions such as oxidation, reduction or hydrolysis by in vivo enzymes etc.) or chemically Any group may be used as long as it is capable of forming an ion or can be changed to that group.
R ² As carboxyl which may be esterified or amidated as, for example, the formula -CO-D [wherein D is (1) hydroxyl group, (2) optionally substituted amino (for example, amino, N- Lower (C _1-4 ) Alkylamino, N, N-di-lower (C _1-4 ) Alkylamino etc.) or (3) optionally substituted alkoxy {eg, (i) alkyl moiety hydroxyl group, optionally substituted amino (eg amino, N-lower (C _1-4 ) Alkylamino, N, N-di-lower (C _1-4 ) Alkylamino, piperidino, morpholino, etc.), halogen, lower (C _1-6 ) Alkoxy, lower (C _1-6 ) Alkylthio, lower (C _3-8 ) Cycloalkoxy or optionally substituted dioxolenyl (eg, 5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl, etc.) _1-6 ) An alkoxy group, or (ii) the formula -O-CH (R ⁶ ) -OCOR ⁷ [In the formula, R ⁶ Is (a) hydrogen, (b) a linear or branched lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, n- Pentyl, isopentyl, neopentyl, etc.), (c) a linear or branched lower alkenyl group having 2-6 carbon atoms, or (d) a cycloalkyl group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) ) And R ⁷ (A) a linear or branched lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl) , Isopentyl, neopentyl, etc.), (b) a straight or branched lower alkenyl group having 2-6 carbon atoms, (c) a cycloalkyl group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) Or an optionally substituted aryl group (eg, halogen atom, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 A lower alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, benzyl, p-chlorobenzyl, phenethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, etc.) substituted with a phenyl or naphthyl group which may have alkoxy etc.), ( d) C3-C8 cycloalkyl or optionally substituted aryl group (eg, halogen atom, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkenyl group having 2-3 carbon atoms substituted with an optionally substituted phenyl or naphthyl group having an alkenyl group (eg, vinyl such as cinnamyl, propenyl, allyl, isopropenyl, etc.) Etc.), (e) optionally substituted aryl groups (eg, halogen atoms such as phenyl, p-tolyl, naphthyl, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A phenyl or naphthyl group optionally having alkoxy or the like), (f) a linear or branched lower alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, neopentyloxy, etc.), (g) a linear or branched lower alkenyloxy group having 2 to 8 carbon atoms (eg Allyloxy, isobutenyloxy, etc.), (h) a cycloalkyloxy group having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy, cycloheptyloxy, etc.), (i) a cycloalkyl having 3-8 carbon atoms (eg, cyclopentyl). , Cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) or an optionally substituted aryl group (eg, halogen atom) , Nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms substituted with an optionally substituted alkoxy or the like (eg phenyl or naphthyl group) (eg, methoxy such as benzyloxy, phenethyloxy, cyclopentylmethoxy, cyclohexylmethoxy, ethoxy, n-propoxy) , Having an alkoxy moiety such as isopropoxy), (j) a cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.) or an optionally substituted aryl group (eg, a halogen atom, Nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 ) A lower alkenyloxy group having 2 to 3 carbon atoms (eg, vinyloxy such as cinnamyloxy, propenyloxy, allyloxy, isopropenyloxy, etc.) substituted with an optionally substituted alkoxy or the like phenyl or naphthyl group) Or (k) an optionally substituted aryloxy group (eg, halogen atom such as phenoxy, p-nitrophenoxy, naphthoxy, nitro, lower (C _1-4 ) Alkyl, lower (C _1-4 A group such as phenoxy or naphthoxy group which may have an alkoxy or the like) or a group represented by
R ² Is preferably an esterified carboxyl, and specific examples thereof include, for example, -COOH and salts thereof, -COOMe, -COOEt, -COOtBu, -COOPr, pivaloyloxymethoxycarbonyl, 1- ( (Cyclohexyloxycarbonyloxy) ethoxycarbonyl, 5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-ylmethoxycarbonyl, acetoxymethoxycarbonyl, propionyloxymethoxycarbonyl, n-butyryloxymethoxycarbonyl, isobutyryloxymethoxycarbonyl 1- (ethoxycarbonyloxy) ethoxycarbonyl, 1- (acetoxy) ethoxycarbonyl, 1- (isobutylyloxy) ethoxycarbonyl, cyclohexylcarbonyloxymethoxycarbonyl, benzoylo Cimethoxycarbonyl, cinnamyloxycarbonyl, cyclopentylcarbonyloxymethoxycarbonyl and the like, and biological or physiological conditions (for example, in vivo reactions such as oxidation / reduction or hydrolysis by in vivo enzymes) Or chemically anions (eg, COO ⁻ , Derivatives thereof, and the like, or any group that can be changed to that, may be a carboxyl group, or a prodrug thereof.
R above ² Is represented by the formula -CO-D [wherein D is (1) a hydroxyl group or (2) an alkyl moiety is a hydroxyl group, amino, halogen, lower (C _2-6 ) Alkanoyloxy (eg, acetooxy, pivaloyloxy, etc.), lower (C _3-8 ) Cycloalkanoyloxy, lower (C _1-6 ) Alkoxycarbonyloxy (eg, methoxycarbonyloxy, ethoxycarbonyloxy, etc.), lower (C _3-8 ) Cycloalkoxycarbonyloxy (eg, cyclohexyloxycarbonyloxy), lower (C _1-4 ) Alkoxy or lower (C _3-8 ) Lower (C) optionally substituted with cycloalkoxy _1-4 ) Represents alkoxy, and is preferably a lower group (C _1-4 ) Carboxyl esterified with alkyl (preferably methyl or ethyl) is preferred.
[0028]
In the above formula, R ³ Examples of the “hydrocarbon residue” in the “hydrocarbon residue having a substituent which may be bonded via a heteroatom” represented by: (1) an alkyl group, (2) alkenyl Group, (3) alkynyl group, (4) cycloalkyl group, (5) aryl group, (6) aralkyl group, etc., among which alkyl group, alkenyl group and cycloalkyl group are preferable.
The alkyl group of (1) may be linear or branched with a lower alkyl group having about 1 to 8 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, Examples include t-butyl, pentyl, i-pentyl, hexyl, heptyl, octyl and the like.
The alkenyl group in the above (2) may be either a linear or branched lower alkenyl group having about 2 to 8 carbon atoms, such as vinyl, propenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, isobutenyl, 2- Examples include octenyl.
The alkynyl group in (3) above may be a straight chain or branched chain having a lower alkynyl group having about 2 to 8 carbon atoms. For example, ethynyl, 2-propynyl, 2-butynyl, 2-pentynyl, 2- Examples include octynyl.
Examples of the cycloalkyl group (4) include lower cycloalkyl having about 3 to 6 carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
The alkyl group, alkenyl group, alkynyl group or cycloalkyl group described above is a hydroxyl group or an optionally substituted amino group (eg, amino, N-lower (C _1-4 ) Alkylamino, N, N-di-lower (C _1-4 ) Alkylamino), halogen, lower (C _1-4 ) Alkoxy group, lower (C _1-4 It may be substituted with an alkylthio group or the like.
Examples of the aralkyl group in (5) above include phenyl-lower (C) such as benzyl and phenethyl. _1-4 ) Alkyl and the like, and examples of the aryl group of the above (6) include phenyl.
The above-mentioned aralkyl group or aryl group is, for example, halogen (eg, F, Cl, Br, etc.), nitro, an optionally substituted amino group (eg, amino, N-lower) at an arbitrary position on the benzene ring. (C _1-4 ) Alkylamino, N, N-di-lower (C _1-4 ) Alkylamino), lower (C _1-4 ) Alkoxy (eg, methoxy, ethoxy, etc.), lower (C _1-4 ) Alkylthio (eg, methylthio, ethylthio, etc.), lower (C _1-4 ) Alkyl (eg, methyl, ethyl, etc.) may be included.
Among the above, R ³ The “hydrocarbon residue” in the “hydrocarbon residue having a substituent which may be bonded via a heteroatom” represented by the above is an optionally substituted alkyl or alkenyl group (example: , Hydroxyl group, amino group, halogen or lower (C _1-4 ) Lower (C) optionally substituted with an alkoxy group _1-5 ) Alkyl or lower (C _2-5 ) Alkenyl groups, etc.) are preferred, especially lower (C _1-5 ) Alkyl (more preferably ethyl) is preferred.
R ³ The “heteroatom” in the “hydrocarbon residue having a substituent which may be bonded via a heteroatom” represented by —O—, —S (O) _m -[M represents an integer of 0 to 2], -NR '-[R' is a hydrogen atom or lower (C _1-4 ) Represents alkyl] and the like. Among them, —O— is preferably used.
Among the above, R ³ As: -O-, -S (O) _m -[M represents an integer of 0 to 2] or -NR '-[R' is a hydrogen atom or lower (C _1-4 May be bonded via a hydroxyl group, an amino group, a halogen and a lower group (C _1-4 ) Lower (C) optionally substituted with a substituent selected from alkoxy groups _1-5 ) Alkyl or lower (C _2-5 ) Alkenyl groups and the like are preferred, especially lower (C _1-5 ) Alkyl or lower (C _1-5 ) Alkoxy (more preferably ethoxy) is preferred.
[0029]
Among the compounds represented by the formula (I), the compound represented by the formula (I ′)
[Chemical Formula 10]

(Wherein R ¹ Is (1) carboxyl group, (2) tetrazolyl group or (3) formula
Embedded image

[Wherein i represents -O- or -S-, j represents> = O,> = S or> = S (O). _m Wherein m is as defined above, and ring A is a substituent R ² Other than the lower (C _1-4 ) Alkyl (eg, lower (C) optionally substituted with hydroxyl, carboxyl, halogen, etc. _1-4 ) Alkyl etc.) or a benzene ring optionally substituted with halogen (preferably the substituent R ² Benzene ring having no substituent other than R) and R ² Is the formula -CO-D wherein D is (1) a hydroxyl group or (2) an alkyl moiety is a hydroxyl, amino, halogen, lower (C _2-6 ) Alkanoyloxy (eg, acetooxy, pivaloyloxy, etc.), lower (C _3-8 ) Cycloalkanoyloxy, lower (C _1-6 ) Alkoxycarbonyloxy (eg, methoxycarbonyloxy, ethoxycarbonyloxy, etc.), lower (C _3-8 ) Cycloalkoxycarbonyloxy (eg, cyclohexyloxycarbonyloxy), lower (C _1-4 ) Alkoxy or lower (C _3-8 ) Lower (C) optionally substituted with cycloalkoxy _1-4 ) Represents an alkoxy group]
R ³ Is -O-, -S (O) _m -[M represents an integer of 0 to 2] or -NR '-[R' is a hydrogen atom or lower (C _1-4 May be bonded via a hydroxyl group, an amino group, a halogen and a lower group (C _1-4 ) Lower (C) optionally substituted with a substituent selected from alkoxy groups _1-5 ) Alkyl or lower (C _2-5 ) Alkenyl group (preferably lower (C _1-5 ) Alkyl or lower (C _1-5 ) Alkoxy; more preferably ethoxy). The benzimidazole-7-carboxylic acid derivative represented by the formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof is preferred, and in particular, 2-ethoxy-1-[[2 ′-(1H-tetrazol-5-yl) biphenyl] -4-yl] methyl] benzimidazole-7-carboxylic acid [Candesartan], 1- (cyclohexyloxycarbonyloxy) ethyl 2-ethoxy-1-[[2 '-(1H-tetrazol-5-yl) biphenyl-4 -Yl] methyl] benzimidazole-7-carboxylate [Candesartan cilexetil], pivaloyloxymethyl 2-ethoxy-1-[[2 '-(1H-tetrazol-5-yl) biphenyl-4-yl] methyl] Benzimidazole-7-carboxylate, 2-ethoxy-1-[[2 '-(2,5-dihydro-5-oxo-1,2 And 4-oxadiazol-3-yl) biphenyl-4-yl] methyl] benzimidazole-7-carboxylic acid or a salt thereof.
The benzimidazole derivatives described above are known methods described in, for example, EP-425921, EP-457136, EP-553879, EP-578125, EP-520423, EP-668272, etc. Etc. can be synthesized. Moreover, when using candesartan cilexetil, it is good to use the stable C-type crystal described in EP-457136.
[0030]
The compounding amount of the physiologically active substance in the sustained-release preparation of the present invention varies depending on the type of the physiologically active substance, but for example, in the case of a physiologically active peptide, it is usually about 0.1 to 50% (W / W), preferably about 0. 2 to 30% (W / W), more preferably about 0.5 to 20% (W / W), and in the case of a non-peptide physiologically active substance, usually about 0.1 to 60% (W / W) W), preferably about 0.2 to 40% (W / W), more preferably about 0.5 to 30% (W / W).
[0031]
The polymer used in the present invention refers to a polymer that is hardly soluble or insoluble in water and biocompatible, and examples thereof include polystyrene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, acrylic acid, and the like. Copolymers with methacrylic acid, nylon, tetron, silicone polymer, dextranstearate, ethyl cellulose, acetyl cellulose, nitrocellulose, polyurethane, ethylene vinyl acetate copolymer, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, etc. . Furthermore, as the biodegradable polymer, for example, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acids (eg, citric acid, etc.) Polymers having a free carboxyl group synthesized from non-catalytic dehydration condensation polymerization or a mixture thereof, poly-α-cyanoacrylate, polyamino acid (eg, poly-γ-benzyl-L-glutamic acid, etc.) And maleic anhydride polymer (eg, styrene-maleic acid polymer). These may be either homopolymers or copolymers. The type of polymerization may be random, block or graft. In addition, when the α-hydroxycarboxylic acids, hydroxydicarboxylic acids, and hydroxytricarboxylic acids have an optically active center in the molecule, any of D-, L-, and DL-forms can be used.
Among these, biodegradable polymers having a free carboxyl group at the terminal, for example, polymers synthesized from α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, etc.) (eg, lactic acid polymers, lactic acid-glycols) Acid copolymers, etc.), poly-α-cyanoacrylic acid esters and the like are preferred.
The biodegradable polymer is more preferably a polymer synthesized from α-hydroxycarboxylic acids, and particularly preferably a lactic acid-glycolic acid polymer.
[0032]
In the present specification, not only a single polymer such as polylactic acid and polyglycolic acid but also a lactic acid-glycolic acid copolymer may be simply referred to as a lactic acid-glycolic acid polymer.
When a lactic acid-glycolic acid polymer (lactic acid-glycolic acid copolymer or homopolymer) is used as the biodegradable polymer, the composition ratio (mol%) is preferably about 100/0 to about 40/60, More preferred is 85/15 to about 50/50.
The weight average molecular weight of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 3,000 to about 50,000, more preferably about 3,000 to about 25,000, and still more preferably about 5,000 to about 20,000.
The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 1.2 to about 4.0, more preferably about 1.5 to about 3.5.
[0033]
Regarding the weight average molecular weight and dispersity in the present specification, the former has a weight average molecular weight of 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,050, 580. , 162, and 9 types of polystyrene as reference materials. The value in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography (GPC), the latter being a value calculated from this value. The measurement is performed using GPC column KF804L x 2 (manufactured by Showa Denko) and RI monitor L-3300 (manufactured by Hitachi, Ltd.) and chloroform as the mobile phase.
[0034]
Moreover, the biodegradable polymer having a free carboxyl group at the terminal is a polymer in which the number average molecular weight determined by terminal group determination and the number average molecular weight determined by GPC measurement are substantially the same, and the number average molecular weight determined by terminal group determination is It is calculated as follows.
About 1 g to about 3 g of biodegradable polymer is dissolved in a mixed solvent of acetone (25 ml) and methanol (5 ml), and 0.05N alcoholic potassium hydroxide is used with phenolphthalein as an indicator to convert the carboxyl group in this solution to 0.05 N alcoholic potassium hydroxide. The solution was immediately titrated with stirring at room temperature (20 ° C.), and the number average molecular weight by end group determination was calculated by the following formula.
Number average molecular weight by end group determination = 20000 × A / B
A: Mass of biodegradable polymer (g)
B: 0.05N alcoholic potassium hydroxide solution added by the end of titration (ml)
The number average molecular weight determined by end group quantification is an absolute value, whereas the number average molecular weight determined by GPC measurement depends on various analysis / analysis conditions (eg, selection of mobile phase type, column type, reference material, slice width, Since it is a relative value that varies depending on the choice of the baseline, etc., it is difficult to unambiguously quantify it, but the number average molecular weights obtained by both measurements are almost the same, for example, the weight synthesized from α-hydroxycarboxylic acids. In coalescence, the number average molecular weight determined by end group determination is in the range of about 0.5 times to about 2 times the number average molecular weight determined by GPC measurement, preferably in the range of about 0.7 times to about 1.5 times. It means that.
[0035]
For example, in a polymer synthesized from one or more α-hydroxycarboxylic acids by a non-catalytic dehydration condensation polymerization method and having a free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight determined by GPC measurement and the number average molecular weight determined by terminal group determination Almost matches. In contrast, in a polymer synthesized from a cyclic dimer by a ring-opening polymerization method using a catalyst and having essentially no free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight determined by terminal group quantification is the number determined by GPC measurement. This is much higher than about twice the average molecular weight. Due to this difference, a polymer having a free carboxyl group at the terminal can be clearly distinguished from a polymer having no free carboxyl group at the terminal.
[0036]
A lactic acid-glycolic acid polymer having a free carboxyl group at the end can be produced by a known production method such as the method described in JP-A No. 61-28521 (for example, a non-catalytic dehydration condensation polymerization reaction or an inorganic solid acid catalyst). In accordance with a dehydration condensation polymerization reaction below).
The decomposition / disappearance rate of the lactic acid-glycolic acid polymer varies greatly depending on the composition ratio or the weight average molecular weight. Generally, the lower the glycolic acid fraction, the slower the decomposition / disappearance, so the glycolic acid fraction is lowered. Alternatively, the release period can be lengthened (eg, about 6 months) by increasing the molecular weight. Conversely, the release period can be shortened (eg, about 1 week) by increasing the glycolic acid fraction or decreasing the molecular weight. For example, in order to obtain a one-week to two-month sustained-release preparation, it is preferable to use a lactic acid-glycolic acid polymer within the above composition ratio and weight average molecular weight range.
[0037]
Therefore, it is preferable that the composition of the biodegradable polymer used in the present invention is appropriately selected according to the type of the desired physiologically active substance, the desired sustained release period, and the like. As a specific example, for example, when GH is used as a physiologically active substance, a lactic acid-glycolic acid polymer is preferably used. As the lactic acid-glycolic acid polymer, the lactic acid / glycolic acid composition ratio (mol%) Is preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer of 85/15 to about 50/50, more preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer of about 75/25 to about 50/50. The weight average molecular weight is preferably about 8,000 to about 20,000, more preferably about 10,000 to about 20,000. Further, the dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid polymer is preferably about 1.2 to about 4.0, more preferably about 1.5 to about 3.5.
[0038]
The lactic acid-glycolic acid polymer to be used can be produced according to a known method such as the method described in the above publication. The polymer is preferably produced by non-catalytic dehydration condensation polymerization. The organic solvent used in the production of the polymer and remaining in the polymer is removed after the polymerization reaction. Examples of the method include a heat drying method, a vacuum drying method, a gas flow drying method using a dry gas, or a method according to these methods. It can be removed quickly and the time required for solvent removal is greatly reduced. It is preferable to use a lactic acid-glycolic acid polymer (PLGA) in which the number average molecular weight determined by the GPC measurement method and the number average molecular weight determined by the terminal group determination method are substantially the same.
The polymer may be used by mixing two kinds of lactic acid-glycolic acid polymers having different composition ratios and / or weight average molecular weights at an arbitrary ratio. Examples include a lactic acid-glycolic acid copolymer having a composition ratio (lactic acid / glycolic acid) (mol%) of about 75/25 and a weight average molecular weight of about 10,000, and a composition ratio (lactic acid / glycolic acid). ) (Mol%) and a mixture with a lactic acid-glycolic acid copolymer having a weight average molecular weight of about 12,000 is used. The weight ratio upon mixing is preferably about 25/75 to about 75/25.
[0039]
In addition, the biodegradable polymer used in the present invention may be a metal salt of the biodegradable polymer described above, for example, a polyvalent metal salt of various biodegradable polymers described in WO 97/01331. Etc. are used. Preferably, polyvalent metal salts of lactic acid-glycolic acid polymers (more preferably zinc salts, calcium salts, magnesium salts, etc., more preferably zinc salts, etc.) are used. The metal species of the polyvalent metal salt is not particularly limited as long as it is a compound that does not adversely affect the living body. For example, divalent (eg, iron, zinc, copper, calcium, magnesium, aluminum, tin, manganese, etc.), Multivalent metals such as trivalent (eg, iron, aluminum, manganese, etc.), tetravalent (eg, tin, etc.) can also be used.
[0040]
In the present specification, the biodegradable polymer may be referred to as a biodegradable polymer including the case where the biodegradable polymer is a metal salt. For example, when the lactic acid-glycolic acid polymer is a polyvalent metal salt, Sometimes called coalescence.
These polyvalent metal salts of biodegradable polymers can be produced by the method described in WO 97/01331 and a method analogous thereto.
Further, when the polyvalent metal salt of the biodegradable polymer is a zinc salt, it can be produced by reacting the biodegradable polymer and zinc oxide in an organic solvent.
[0041]
In the production method, a biodegradable polymer and zinc oxide are first allowed to coexist in an organic solvent to produce an organic solvent solution of the biodegradable polymer / zinc oxide body. In this case, the concentration of the biodegradable polymer in the solution varies depending on the molecular weight, the organic solvent, and the like, but is about 0.1 to about 80% (W / W), preferably about 1 to about 70% (W / W). W), more preferably about 2 to about 60% (W / W). The amount of zinc oxide to be added varies depending on the type of organic solvent, as described in JP-A-10-231252. For example, when the target bioactive substance is a peptide, the amount of biodegradable polymer About 0.001 to about 2% (W / W), preferably about 0.01 to about 1.5% (W / W), more preferably about 0.1 to about 1% (W / W) When the target physiologically active substance is a non-peptide, the amount of biodegradable polymer is about 0.001 to about 30% (W / W), preferably about 0.01 to about 20% (W / W), More preferably, it is about 0.1 to about 10% (W / W).
The biodegradable polymer and zinc oxide may be added to the organic solvent in the organic solvent solution of the biodegradable polymer in the form of powder or suspended in the organic solvent. In addition, an organic solvent solution of a biodegradable polymer may be added to an organic solvent suspension of zinc oxide. Moreover, an organic solvent may be added after mixing both in powder form. When the target physiologically active substance is a non-peptide, an organic solvent may be added after mixing the biodegradable polymer, zinc oxide and the physiologically active substance in powder form.
[0042]
The content of the biodegradable polymer contained in the preparation of the present invention is usually about 30 to 99.9% (W / W), preferably about 60 to 97% (W / W), more preferably about 70 to 90. % (W / W).
[0043]
The preparation of the present invention is produced by first forming a solid containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer, and then contacting this with a high-pressure gas.
For example, when the bioactive substance is a bioactive peptide, the solid substance containing the bioactive substance and the biodegradable polymer is obtained by lyophilizing the bioactive peptide solution from the powder (S phase). Dissolving the biodegradable polymer by removing the solvent from the S / O type dispersion dispersed in the dissolved organic solvent (O phase), or by dissolving the biodegradable polymer in the aqueous phase (W phase) containing a bioactive peptide as an aqueous solution A solution obtained by removing the solvent from the W / O emulsion dispersed in the organic solvent liquid (O phase) or dissolving the bioactive peptide together with the biodegradable polymer in the organic solvent liquid (O phase). It is formed by removing the solvent from Examples of the method include (a) underwater drying method (S / O / W method and W / O / W method or O / W method), (b) phase separation method (coacervation method), and (c) spraying. Examples thereof include a drying method or a method according to these methods. In the present specification, the solid substance means a substance in which the constituent substances are physically or chemically bound. Although it does not specifically limit as a solid substance, A microcapsule etc. are mentioned.
[0044]
The organic solvent used for dissolving the biodegradable polymer preferably has a boiling point of 30 ° C. or higher. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride, aliphatic hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, cyclohexane, petroleum benzine and petroleum ether, toluene, xylene and the like. Aromatic hydrocarbons, alcohols such as methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol and benzyl alcohol, polyhydric alcohols such as ethylene glycol and propylene glycol, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, formic acid , Organic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid and trichloroacetic acid, ethers such as diethyl ether, isopropyl ether, dioxane and tetrahydrofuran, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, Acetonitrile, propionitrile, pyridine, dimethylacetamide, nitrogen-containing compounds such as dimethyl formamide, sulfur-containing compounds such as dimethyl sulfoxide and the like. These may be mixed and used at an appropriate ratio. Substances, especially organic compounds, such as solvents in pharmaceuticals, must be substantially removed from the product due to the properties of the pharmaceuticals. In addition, the solvent remaining in products of foods and general chemicals is strictly regulated depending on the application. Regarding the amount of residual solvent in pharmaceutical products, there is a description of allowable values in the guidelines based on ICH (“Regarding Guidelines for Residual Solvents in Pharmaceutical Products”, Pharm.Tech.Japan 16 (5), 687-704, 2000). The concentration limit value of dichloromethane classified as 2 is 600 ppm, and the concentration limit value of acetone classified as class 3 is 0.5% (5,000 ppm).
[0045]
The organic solvent used for dissolving the biodegradable polymer preferably has a boiling point of 120 ° C. or lower. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (eg, dichloromethane, chloroform, etc.), alcohols (eg, ethanol, methanol, etc.), ethyl acetate, acetonitrile, and the like. These may be mixed and used at an appropriate ratio. When the organic solvent is used alone, for example, dichloromethane, ethyl acetate, acetonitrile and the like are preferable. When an organic solvent is used as a mixed solvent, for example, a combination of a halogenated hydrocarbon (eg, dichloromethane, chloroform, etc.) and an alcohol (eg, ethanol, methanol, etc.) or acetonitrile is preferred. The mixing ratio (volume ratio) between the halogenated hydrocarbon and the alcohol or acetonitrile is about 100: 1 to about 1: 1, preferably about 30: 1 to about 2: 1. . The concentration of the biodegradable polymer in the solution varies depending on the molecular weight, the organic solvent and the like, but is about 0.01 to about 80% (W / W), preferably about 0.1 to about 70% (W / W), more preferably about 1 to about 60% (W / W).
[0046]
Hereinafter, the method of microencapsulation in the case of producing sustained release microcapsules as a preparation using a physiologically active peptide as a physiologically active substance will be described in more detail.
[0047]
(a-1) Underwater drying method (S / O / W method)
According to this method, a water-miscible organic solvent and / or volatile salts are first added to a physiologically active peptide aqueous solution, and then a physiologically active peptide powder (S phase) is prepared by lyophilization. Next, the biodegradable polymer is dissolved in an organic solvent, and the physiologically active peptide powder is added and dispersed in the organic solvent solution. In this case, the ratio (weight ratio) between the bioactive peptide and the biodegradable polymer is, for example, about 1: 1000 to about 1: 1, preferably about 1: 200 to about 1: 5, and more preferably about 1: 100 to about 1: 5. Moreover, it is preferable to add external physical energy in order to disperse the bioactive peptide powder uniformly in the organic solvent liquid. For example, ultrasonic irradiation, a turbine-type stirrer, a homogenizer, or the like is used. In this case, the average particle diameter of the physiologically active peptide in the organic solvent solution is preferably about 10 μm or less, more preferably about 0.1 μm to about 10 μm, and more preferably about 0.5 μm to 5 μm. The average particle diameter of the physiologically active peptide in the present invention is a value obtained by a laser analysis type particle size distribution analyzer (SALD2000A: Shimadzu) after dispersing the physiologically active peptide in an organic solvent such as dichloromethane using a homogenizer. . At that time, the bioactive peptide is added to an organic solvent such as dichloromethane at a concentration of, for example, about 20 to 100 mg / ml, and then used at about 20,000 rpm for about 30 seconds to 1 using a homogenizer (eg, Polytron (Kinematica)). A dispersion is obtained by stirring for a minute, and further diluted with the organic solvent as appropriate so as to be within the measurable range of the particle size distribution measuring apparatus.
[0048]
Subsequently, the organic solvent dispersion liquid (S / O type dispersion liquid) thus prepared is further added to an aqueous solvent (W phase), and external physical energy similar to the above, for example, ultrasonic irradiation, turbine An S / O / W emulsion is formed with a mold stirrer or a homogenizer. Thereafter, the oil phase solvent is evaporated to produce microcapsules. The aqueous phase volume at this time is generally selected from about 1 to about 10,000 times the oil phase volume. More preferably, it is selected from about 2 times to about 5,000 times. Particularly preferably, it is selected from about 5 times to about 2,000 times.
[0049]
An emulsifier may be added to the outer aqueous phase. Any emulsifier may be used as long as it can form a generally stable S / O / W emulsion. Examples of the emulsifier include anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxyethylene castor oil derivatives, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, and hyaluronic acid. You may use these in combination suitably. The concentration of the emulsifier in the outer aqueous phase is preferably about 0.001% to 20% (W / W). More preferably, it is about 0.01% to 10% (W / W), and particularly preferably about 0.05% to 5% (W / W).
The microcapsules thus obtained are separated by centrifugation or filtration, and then the emulsifier attached to the surface of the microcapsules is removed by washing with distilled water, and dispersed again in distilled water or the like. Freeze-dry.
Examples of the water-miscible organic solvent added to the physiologically active peptide aqueous solution in this method include alcohols (eg, methanol, ethanol, isopropanol, etc., preferably methanol, ethanol, etc.), acetone and the like. These may be used by mixing at an appropriate ratio, but it is preferable to use alcohols, particularly ethanol alone. The addition amount (concentration) to the physiologically active peptide aqueous solution is about 0.03 to 0.5% (V / V) in volume ratio, preferably about 0.06 to 0.25% (V / V). More preferably about 0.1 to 0.15% (V / V). A physiologically active peptide aqueous solution obtained by adding such a water-miscible organic solvent is further lyophilized to allow easy handling (good operability) and fine (small particle size) physiologically active peptide. Powder can be made.
Examples of the volatile salts added to the physiologically active peptide aqueous solution in this method include ammonium salts (for example, ammonium acetate, ammonium bicarbonate, ammonium carbonate, ammonium chloride, preferably ammonium acetate). These may be mixed and used at an appropriate ratio. The addition amount of the volatile salt to the physiologically active peptide aqueous solution is about 10 times to about 80 times mol, preferably about 10 times to about 70 times mol, and more preferably about 15 times to about 70 times mol. 70-fold mole, more preferably about 20-fold to about 70-fold mole, and most preferably about 20-fold to about 50-fold mole. Similar to the case of adding a water-miscible organic solvent, the physiologically active peptide aqueous solution obtained by the addition of volatile salts is further lyophilized for easy handling (good operability) and fine ( A fine bioactive peptide powder having a small particle size can be prepared.
In this method, the water-miscible organic solvent and / or volatile salt added to the physiologically active peptide aqueous solution may be used alone or in appropriate combination. When a water-miscible organic solvent and volatile salts are used in combination, they can be added to the physiologically active peptide aqueous solution according to the respective addition amounts.
[0050]
(a-2) Underwater drying method (W / O / W method)
According to this method, first, water or a suitable buffer is added to the bioactive peptide to prepare a bioactive peptide solution (W phase). Next, the biodegradable polymer is dissolved in an organic solvent, and the above-mentioned bioactive peptide solution is added and dispersed in this organic solvent solution. The W / O type emulsion thus obtained is further added to an aqueous solvent (W phase), and the microcapsules are passed through the W / O / W type emulsion in the same manner as in the S / O / W method. Get.
[0051]
(a-3) Underwater drying method (O / W method)
According to this method, the biodegradable polymer together with the bioactive peptide is first dissolved in an organic solvent, an organic solvent liquid (O phase) is further added to the aqueous solvent (W phase), and the above S / O / W Similar to the method, microcapsules are obtained via an O / W emulsion.
[0052]
(b) Phase separation method (coacervation method)
In this method, the coacervation agent is gradually added to the S / O dispersion liquid (a-1) or the W / O emulsion liquid (a-2) or the oil phase solution (a-3) with stirring. In addition, microcapsules are precipitated and solidified. The coacervation agent is added in a volume of about 0.01 to about 1,000 times that of the dispersion. More preferably, the volume is about 0.05 times to about 500 times, particularly preferably about 0.1 times to about 200 times. Any coacervation agent may be used as long as it does not dissolve the biodegradable polymer used in the polymer, mineral oil, or vegetable oil compound that is miscible with the organic solvent that dissolves the biodegradable polymer. Specifically, for example, silicon oil, sesame oil, soybean oil, corn oil, cottonseed oil, coconut oil, linseed oil, mineral oil, n-hexane, n-heptane and the like are used. You may use these in mixture of 2 or more types. The microcapsules thus obtained are collected by filtration and then repeatedly washed with heptane or the like to remove the coacervation agent. Furthermore, it is washed in the same manner as in the above (a), and then freeze-dried.
In the production of microcapsules by the underwater drying method and the coacervation method, an aggregation inhibitor may be added to prevent aggregation between particles. Examples of the anti-aggregation agent include water-soluble polysaccharides such as mannitol, lactose, glucose, starches (eg, corn starch), hyaluronic acid or alkali metal salts thereof, proteins such as glycine, fibrin and collagen, sodium chloride, and phosphoric acid. Inorganic salts such as sodium hydrogen are appropriately used.
[0053]
(C) Spray drying method
In this method, the above S / O type dispersion liquid (a-1), the W / O type emulsion liquid (a-2) or the oil phase solution (a-3) is spray-dried using a nozzle ( Spraying into the drying chamber of the spray dryer), the organic solvent in the atomized droplets is volatilized in a very short time to produce microcapsules. Examples of the nozzle include a two-fluid nozzle type, a pressure nozzle type, and a rotating disk type. At this time, if desired, it is also effective to spray an aqueous solution of the anti-aggregation agent from another nozzle simultaneously with the above-mentioned dispersion for the purpose of preventing aggregation of the microcapsule particles.
[0054]
The organic solvent is further extracted and removed by bringing the solid material such as microcapsules containing the physiologically active substance and biodegradable polymer formed by the above method into contact with a high-pressure gas (preferably carbon dioxide).
[0055]
Specifically, for example, the freeze-dried microcapsule powder obtained in (a) is placed in an extraction container, and an extraction process is performed using an extraction system including a carbon dioxide feed pump and a pressure control valve. Moreover, it is also possible to put the microcapsule suspension before freeze-drying obtained in (a) or (b) into an extraction container and similarly perform the extraction treatment. In these cases, it is preferable to perform the extraction treatment under milder conditions so as not to impair the quality of the sustained-release preparation.
[0056]
The high-pressure gas in the present invention is a gas whose pressure is at least atmospheric pressure and not more than the liquefaction pressure at that temperature.
Examples of the high-pressure gas used in the present invention include carbon dioxide, nitrous oxide, nitrogen, helium, argon, alkanes (eg, ethane, propane, etc.), and alkenes (eg, ethylene, etc.). These may be used by mixing at an appropriate ratio, but it is preferable to use carbon dioxide alone.
If the temperature of the high-pressure gas in contact with the preparation exceeds the glass transition temperature of the biodegradable polymer used as the base of the preparation, the risk of fusion, deformation of the preparation, degradation or degradation of the bioactive substance increases. To do. The glass transition temperature in the present invention refers to a midpoint glass transition temperature obtained when a differential scanning calorimeter (DSC) is used and heated at a heating rate of 10 or 20 ° C. per minute. Moreover, when the temperature of the high-pressure gas is too low, the organic solvent is not sufficiently removed. The organic solvent should be removed to less than 1,000 ppm, preferably less than 500 ppm, more preferably less than 100 ppm. Therefore, an advantageous temperature when carbon dioxide is used as a high-pressure gas in the present invention is +20 to −60 ° C., preferably +10 to −20 ° C. based on the glass transition temperature of the biodegradable polymer (usually about 20 to 60 ° C.). The temperature range is -50 ° C, more preferably 0 to -40 ° C, still more preferably -5 to -30 ° C, and most preferably -10 to -25 ° C.
[0057]
The range of pressure at the time of use differs depending on the selected high-pressure gas, but in general, if the pressure of the high-pressure gas is too high, the risk of fusion, deformation of the microcapsules, an increase in the initial release immediately after administration increases, On the other hand, if the pressure is too low, removal of the organic solvent becomes insufficient. In the present invention, an advantageous pressure when carbon dioxide is used as a high-pressure gas is about 1 to 7 MPa, preferably about 1 to 4 MPa, and more preferably about 2 to 4 MPa.
The time for contacting with the high-pressure gas varies depending on the pressure, temperature, amount of microcapsules to be treated, etc., but when carbon dioxide is used as the high-pressure gas, it is preferably about 5 minutes to about 48 hours. Further, about 10 minutes to about 12 hours are preferable.
[0058]
Hereinafter, the high-pressure gas treatment step for microcapsules using carbon dioxide in a high-pressure gas state will be described in more detail with reference to FIG. FIG. 1 is a schematic view of an example of an apparatus used for high-pressure gas treatment in the present invention. For example, as shown in FIG. 1, the high-pressure gas processing apparatus includes a liquefied carbon dioxide cylinder 1, a carbon dioxide feed pump 2, a heat exchanger 3, an extraction container 4, a thermostatic bath 5, a detector 6, a fully automatic pressure regulating valve 7, and It consists of a collection container 8. The microcapsules to be processed are placed in the extraction container 4 and the apparatus is sealed, and then heated to a predetermined temperature. Next, the liquefied carbon dioxide is sent from the liquefied carbon dioxide cylinder 1 to the heat exchanger 3 by the carbon dioxide feed pump 2, heated to a predetermined temperature, and converted into a high-pressure gas state. Next, the carbon dioxide in the high-pressure gas state is blown into the extraction container 4 to dissolve and extract the solvent in the microcapsules in the high-pressure gas. The extracted solvent is recovered in the recovery container 8 via the detector 6 and the automatic pressure control valve 7. The pressure applied to the entire system is controlled by a fully automatic pressure regulating valve 7 connected to the most downstream side. By contacting with the high-pressure gas for a predetermined time, the initial release of an excessive amount of the physiologically active substance immediately after administration is drastically suppressed, and without generating a polymer, a related substance or a reactant of the physiologically active peptide. Residual organic solvent can be removed.
[0059]
The sustained-release preparation of the present invention is preferably in the form of fine particles. This is because sustained-release preparations do not cause excessive pain to patients when administered through needles usually used for subcutaneous or intramuscular injection. The particle size of the sustained-release preparation is, for example, about 0.1 to 300 μm, preferably about 1 to 150 μm, particularly preferably about 2 to 100 μm, as an average particle size. The content of the physiologically active substance contained in the sustained-release preparation of the present invention is usually about 0.1 to 50% (W / W), preferably about 0.2 to 30% (W / W), for example, in the case of a physiologically active peptide. W), more preferably about 0.5 to 20% (W / W). The content of the biodegradable polymer contained in the sustained-release preparation of the present invention is usually about 30 to 99.9% (W / W), preferably about 60 to 97% (W / W), more preferably about 70 to 90% (W / W).
The initial release rate [release rate until 1 day (24 hours) after administration] of the sustained-release preparation of the present invention is preferably about 40% or less, more preferably about 1 to 40%, more preferably in the case of a bioactive peptide. Preferably it is about 3 to 35%.
[0060]
The sustained-release preparation of the present invention is a parenteral preparation (eg, intramuscular, subcutaneous, organ injection, etc.) as, for example, a microcapsule or a preparation prepared by using microcapsules as a raw material into various dosage forms. Or an embedding agent, a transmucosal agent into the nasal cavity, rectum, uterus, etc.), an oral agent (eg, capsule (eg, hard capsule, soft capsule, etc.), solid preparation such as a granule, powder, or a suspension. Etc.) and the like.
The preparation of the present invention is particularly preferably for injection. For example, when the sustained-release preparation is a microcapsule, the microcapsule is used as a dispersant (eg, a surfactant such as Tween 80 or HCO-60, a polysaccharide such as carboxymethylcellulose, sodium alginate, or hyaluronic acid), a preservative. A practical sustained-release injection can be obtained by preparing an aqueous suspension together with (eg, methylparaben, propylparaben, etc.), an isotonic agent (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose, etc.) and the like. Slow release injection that can be used as an oily suspension by dispersing with vegetable oil such as sesame oil, corn oil, etc. or phospholipid such as lecithin, or medium chain fatty acid triglyceride (eg, Miglyol 812). Use as an agent.
[0061]
When the sustained-release preparation is, for example, a microcapsule, the particle size of the microcapsule may be within a range satisfying the degree of dispersion and needle penetration when used as a suspension injection, for example, the average particle size The range is about 0.1 to about 300 μm. The average particle size is preferably in the range of about 1 to about 150 μm, particularly preferably about 2 to about 100 μm.
In order to make the above-mentioned microcapsules into a sterile preparation, there are a method of sterilizing the whole manufacturing process, a method of sterilizing with gamma rays, a method of adding a preservative, and the like.
[0062]
The sustained-release preparation of the present invention has low toxicity and can be safely used for mammals (eg, humans, cows, pigs, dogs, cats, mice, rats, rabbits, etc.).
The indication of sustained-release preparations varies depending on the physiologically active substance used. When the physiologically active substance is insulin, for example, diabetes, etc., when it is interferon-α, viral hepatitis (eg, hepatitis C, HBe antigen positive active hepatitis, etc.), cancer (eg, renal cancer) In the case of erythropoietin, anemia (eg, anemia during renal dialysis, etc.), etc. In the case of G-CSF, neutropenia (eg, during treatment with anticancer drugs), infectious diseases, etc. In the case of IL-2, cancer (eg, hemangioendothelioma), etc. In the case of FGF, fractures, wounds (bed sores, etc.), periodontal disease, gastrointestinal ulcers, etc., in the case of FGF-9, thrombocytopenia In the case of NGF, it is effective for the treatment or prevention of senile dementia, neuropathy (neuropathy), in the case of TPA, thrombosis, etc., in the case of tumor necrosis factor, cancer and the like. In addition, in GH-containing sustained-release preparations, based on the growth hormone action of GH, in addition to GH secretion deficiency short stature (pituitary dwarfism), Turner syndrome, chronic kidney disease, cartilage dystrophy (cartilage dystrophy) In addition, it can be applied to the treatment of debilitating diseases such as adult growth hormone deficiency (adult GHD) and AIDS. In addition, there is a report that GH has been applied to diseases such as Down's syndrome, silver syndrome, osteogenesis imperfecta, or juvenile chronic arthropathy, and has obtained an effective therapeutic effect. It can also be applied to diseases. Furthermore, it is effective for the treatment or prevention of congestive heart failure. Other applicable GH-containing sustained-release preparations include hematopoiesis during organ transplantation and drug treatment for AIDS patients, improvement in malnutrition, renal anemia, angina, hyperlipidemia, obesity, burns・ Acceleration of wound / ulcer treatment, surgical invasion (surgery / trauma) / early recovery after surgery, sepsis, prevention of fracture of osteoporosis, early recovery of postoperative muscle strength in patients with osteoporosis, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) And pressure ulcers. In addition, as an anti-aging drug aimed at improving the quality of life (QOL) of frail elderly people, or for the prevention and improvement of neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebrovascular disorder, etc.) by the neuroprotective action of hGH Can be expected. By making GH into a sustained-release preparation, better efficacy for these indications can be obtained than GH daily subcutaneous injection. When the bioactive substance is candesartan, cardiac hypertrophy, heart failure, myocardial infarction, stroke, ischemic peripheral circulation disorder, myocardial ischemia, venous dysfunction, heart failure progression after myocardial infarction, diabetic nephropathy, nephritis, thread Globe nephritis, arteriosclerosis, vascular thickening, vascular thickening or occlusion after percutaneous coronary angioplasty, vascular reocclusion after bypass surgery, hyperaldosteronism, glomerulosclerosis, renal failure, glaucoma, ocular hypertension, high Lipemia, angina pectoris, aneurysm, coronary atherosclerosis, cerebral arteriosclerosis, peripheral arteriosclerosis, thrombosis, central nervous system disease, Alzheimer's disease, memory deficiency, depression, amnesia, senile dementia, perception It is effective in preventing or treating diseases associated with dysfunction, multiple organ failure, endothelial dysfunction or scleroderma, or preventing or improving anxiety symptoms, tension symptoms, uncomfortable mental status or indigestion.
[0063]
The dosage of the sustained-release preparation varies depending on the type and content of the physiologically active substance, the duration of release, the target disease, the target animal, etc., as long as the effective concentration of the physiologically active substance is maintained in the body. Good. The dose of the physiologically active substance can be appropriately selected from the range of about 0.0001 to about 10 mg / kg body weight per adult, for example, when the sustained-release preparation is a two-week preparation. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.05 to about 3 mg / kg body weight. The frequency of administration is once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, etc. The type and content of the physiologically active substance, dosage form, duration of release, target disease, target It can be selected appropriately depending on the animal. Preferably, it is a 1 week to 2 month sustained release preparation, more preferably a 1 week to 1 month sustained release preparation.
When the physiologically active substance that is an active ingredient of the sustained-release preparation is, for example, insulin, the dose for diabetic adults is usually about 0.001 to about 1 mg / kg body weight as an active ingredient, preferably about 0. It is recommended to select from the range of 0.01 to about 0.2 mg / kg body weight and administer once a week.
[0064]
When the physiologically active substance that is the active ingredient of the sustained-release preparation is GH, the dosage varies depending on the type and content of GH, the duration of release, the target disease, the target animal, etc., but the effective concentration of the GH As long as the amount is retained in the body. In the treatment of the above-mentioned diseases, for example, when the sustained-release preparation is a two-week preparation, the dosage of GH is preferably about 0.01 to about 5 mg / kg body weight (approximately about 0.01 to about 5 mg / kg body weight per child or adult) as an active ingredient. From 0.03 to about 15 IU / kg body weight), and can be safely administered. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.05 to about 1 mg / kg body weight (about 0.15 to about 3 IU / kg body weight). The frequency of administration can be appropriately selected according to the GH content, dosage form, duration of release, target disease, target animal, etc. once a week, once every two weeks, or once a month. Preferably, it is a 1 week to 2 month sustained release preparation, more preferably a 1 week to 1 month sustained release preparation.
The sustained-release preparation is preferably stored at room temperature or in a cold place. More preferably, the sustained release preparation is stored in a cold place. The normal temperature or cold place here is defined in the Japanese Pharmacopoeia. That is, the normal temperature means 15 to 25 ° C., and the cold place means 15 ° C. or less. Among the cold places, 2 to 8 ° C. is particularly preferable.
[0065]
【Example】
Reference examples, examples and test examples will be described in more detail below, but these do not limit the present invention.
Reference example 1
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask cooled by adding 20 times molar equivalent of ammonium acetate to a genetically modified hGH aqueous solution (final hGH concentration = 2 mg / ml) and cooled in a dry ice-ethanol bath 100 ml was added dropwise for 30 minutes, and after rapid freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. 1.690 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 65/35, viscosity = 0.160 dl / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 ml of dichloromethane. 359 mg of the above-mentioned hGH powder was added to this organic solvent liquid and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 ml of 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, microcapsules were collected by centrifugation (about 1,500 rpm). Next, after washing twice with 400 ml of distilled water, 0.2 g of D-mannitol was added and freeze-dried to obtain a freeze-dried microcapsule powder containing hGH. Six batches of microcapsules were produced under the same conditions, and the yield of the obtained freeze-dried microcapsule powder was 6.8 g.
[0066]
Reference example 2
A 20-fold molar equivalent of ammonium acetate was added to the recombinant hGH aqueous solution (final hGH concentration = 2 mg / ml) and freeze-dried to obtain hGH powder. 1.850 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50, viscosity = 0.154 dl / g) and 10 mg of zinc oxide were dissolved in 2.7 ml of dichloromethane. 155 mg of the above hGH powder was added to this organic solvent liquid and atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 ml of 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, microcapsules were collected by centrifugation (about 1,500 rpm). Next, after washing twice with 400 ml of distilled water, 0.2 g of D-mannitol was added and freeze-dried to obtain a freeze-dried microcapsule powder containing hGH. Six batches of microcapsules were produced under the same conditions, and the yield of the obtained freeze-dried microcapsule powder was 7.6 g.
[0067]
Reference example 3
Using a peristaltic pump on the inner wall of an eggplant-shaped flask that was added to a genetically modified aqueous hGH solution (final hGH concentration = 2 mg / ml) and added with 20-fold molar equivalent of ammonium acetate and cooled in a dry ice-ethanol bath 100 ml was added dropwise for 30 minutes, and after rapid freezing, vacuum drying was performed to obtain hGH powder. Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 65/35, viscosity = 0.160 dl / g) 1.521 g and zinc oxide 9 mg were dissolved in dichloromethane 2.4 ml. 270 mg of the above hGH powder was added to this organic solvent solution, and the mixture was atomized using Polytron (Kinematica). This S / O dispersion was added to 800 ml of a 0.1% aqueous polyvinyl alcohol solution cooled to 18 ° C., and stirred and emulsified using a homomixer. After stirring at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, microcapsules were collected by centrifugation (about 1,500 rpm). After removing the supernatant as much as possible by suction, 500 ml of 50% ethanol aqueous solution was added to the microcapsule suspension, and the mixture was gently stirred by a propeller at room temperature for 15 minutes. Next, after separating the microcapsule by centrifugation (about 1,500 rpm), after washing twice with 400 ml of distilled water, 180 mg of D-mannitol was added and lyophilized to obtain a freeze-dried microcapsule containing hGH. A powder was obtained. Furthermore, in order to remove residual solvent, it was vacuum-dried at 46 ° C. for 72 hours to obtain microcapsules.
[0068]
Reference example 4
Evaluation of drug efficacy of microcapsules containing human growth hormone
After administration of the immunosuppressant tacrolimus (Prograf injection, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) to female SD rats that had been hypophysectomized at 4 weeks of age, antibody production against hGH was suppressed, and microcapsules were administered at the age of 6 weeks of age. Body weight, body length and serum rat insulin-like growth factor I (rIGF-I) concentration were measured for 5 weeks. Specifically, 5 mg of Prograf injection solution was diluted with physiological saline and administered at a dose of 50 μg / 0.2 ml / rat 3 days before administration of microcapsules, immediately after administration of microcapsules, 4, 7 and 11 days after administration. , 18, 21, 25, 28 and 32 days later, subcutaneous injection at a dose of 75 μg / 0.2 ml / rat. In addition, hormone replacement was performed to physiologically normalize the hypophysectomized rats. A mixture of L-thyroxine sodium pentahydrate and hydrocortisone succinate (both Wako Pure Chemicals) (final concentrations of 1 μg and 50 μg / 0.2 ml / rat, respectively) was administered three times a week, that is, 3 days before and immediately after administration of the microcapsules. Subcutaneous injections were made after 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 28, 30 and 32 days. The microcapsules are dispersed in a dispersion medium (5% mannitol, 0.5% sodium carboxymethylcellulose, 0.1% Tween 80) so as to be 24 mg hGH / ml, and 0.5 ml thereof is subcutaneously administered to the back of the rat under ether anesthesia. did. The dose was 12 mg as hGH. After administration of the microcapsules, the body weight and length of the rats were measured over time until 35 days later. In addition, blood was collected over time from the tail vein, and serum was collected. Serum rIGF-I concentration was measured by radioimmunoassay (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories, Inc.).
[0069]
Reference Example 5
Candesartan 2.0 g, zinc oxide (manufactured by Hakusui Chemical Co., Ltd.) 0.37 g and lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid 75/25 (mol%), weight average molecular weight 8,700, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3.6 g was added to a mixed solution of 12.75 ml of dichloromethane, 2.25 ml of methanol and 0.136 ml of acetic acid, and stirred at room temperature overnight to obtain a uniform solution. This solution was poured into 800 ml of a 0.1 wt% polyvinyl alcohol aqueous solution containing 20 mM zinc acetate that had been adjusted to 18 ° C. in advance, and an O / W emulsion was prepared at 7,000 rpm using a turbine homomixer. This O / W emulsion was stirred at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, methanol and acetic acid, solidify the oil phase, and then collected at 3,000 rpm using a centrifuge. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged to wash free drug and the like. The collected microcapsules were redispersed by adding distilled water in which 0.8 g of mannitol was dissolved, and then lyophilized to obtain a powder. The encapsulation rate of candesartan in the microcapsules was 90.9%, and the content of candesartan in the microcapsules / mannitol powder was 26.5%.
[0070]
Reference Example 6
One batch was performed at the following throughput. Candesartan 2.0 g, zinc oxide (manufactured by Hakusui Chemical Co., Ltd.) 0.37 g and lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid 75/25 (mol%), weight average molecular weight 8,700, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3.6 g was added to a mixed solution of 12.75 ml of dichloromethane, 2.25 ml of methanol and 0.136 ml of acetic acid, and stirred at room temperature overnight to obtain a uniform solution. This solution was poured into 800 ml of a 0.1 wt% polyvinyl alcohol aqueous solution containing 10 mM zinc acetate which had been adjusted to 18 ° C. in advance, and an O / W emulsion was prepared at 7,000 rpm using a turbine homomixer. This O / W emulsion was stirred at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, methanol and acetic acid, solidify the oil phase, and then collected at 3,000 rpm using a centrifuge. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged to wash free drug and the like. After the above operation was performed in two batches, two batches of microcapsules were mixed, distilled water in which 1.6 g of mannitol was dissolved was added, redispersed, and lyophilized to obtain a powder. The encapsulation rate of candesartan in the microcapsule was 90.7%, and the content of candesartan in the microcapsule / mannitol powder was 26.4%.
[0071]
Example 1
The hGH-containing freeze-dried microcapsule powder obtained in Reference Example 1 was used in an amount of 0.3 g, and the solvent was removed under the following four conditions. The microcapsule powder was transferred to an extraction container (capacity 10 ml) of a supercritical fluid extraction apparatus manufactured by JASCO Corporation, and the apparatus was sealed, and then heated to a predetermined temperature in a thermostatic bath. Next, carbon dioxide is sent to the heat exchanger through a liquid feed pump (SCF-Get) at a cylinder pressure (about 6-7 MPa), heated to a predetermined temperature, and a fully automatic pressure regulating valve (SCF-Bpg). Thus, the pressure applied to the entire system was controlled and converted into a high-pressure gas state at a predetermined pressure. Next, the high-pressure carbon dioxide gas was blown into the extraction vessel, and the solvent was removed under the following four conditions.
(1) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 15 minutes.
(2) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
(3) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 45 minutes.
(4) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
[0072]
Example 2
Using 0.3 g of each hGH-containing freeze-dried microcapsule powder obtained in Reference Example 2, the solvent was removed under the following four conditions. The microcapsule powder was transferred to an extraction container (capacity 10 ml) of a supercritical fluid extraction apparatus manufactured by JASCO Corporation, and the apparatus was sealed, and then heated to a predetermined temperature in a thermostatic bath. Next, carbon dioxide is sent to the heat exchanger through a liquid feed pump (SCF-Get) at a cylinder pressure (about 6-7 MPa), heated to a predetermined temperature, and a fully automatic pressure regulating valve (SCF-Bpg). Thus, the pressure applied to the entire system was controlled and converted into a high-pressure gas state at a predetermined pressure. Next, the high-pressure carbon dioxide gas was blown into the extraction vessel, and the solvent was removed under the following four conditions.
(1) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
(2) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
(3) Pressure 2 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 180 minutes.
(4) Pressure 1 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 720 minutes.
[0073]
Example 3
Using 0.3 g each of candesartan-containing freeze-dried microcapsule powder obtained in Reference Example 5, the solvent was removed under the following 18 conditions. The microcapsule powder was transferred to an extraction container (capacity 10 ml) of a supercritical fluid extraction apparatus manufactured by JASCO Corporation, and the apparatus was sealed, and then heated to a predetermined temperature in a thermostatic bath. Next, carbon dioxide is sent to the heat exchanger through a liquid feed pump (SCF-Get) at a cylinder pressure (about 6-7 MPa), heated to a predetermined temperature, and a fully automatic pressure regulating valve (SCF-Bpg). Thus, the pressure applied to the entire system was controlled and converted into a high-pressure gas state at a predetermined pressure. Next, the high-pressure carbon dioxide gas was blown into the extraction vessel, and the solvent was removed under the following 18 conditions.
Pressure 2.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
Pressure 2.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
Pressure 2.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 120 minutes.
Pressure 2.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 180 minutes.
Pressure 2.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
Pressure 2.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
Pressure 2.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 120 minutes.
Pressure 2.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 180 minutes.
Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 15 minutes.
(10) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
(11) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
(12) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 120 minutes.
(13) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 180 minutes.
(14) Pressure 3.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
(15) Pressure 3.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes.
(16) Pressure 3.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 120 minutes.
(17) Pressure 3.5 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 180 minutes.
(18) Pressure 4.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 30 minutes.
[0074]
Example 4
Using the candesartan-containing freeze-dried microcapsule powder obtained in Reference Example 6, the solvent was removed under the following three conditions. The microcapsule powder was transferred to an extraction container (capacity 10 ml) of a supercritical fluid extraction apparatus manufactured by JASCO Corporation, and the apparatus was sealed, and then heated to a predetermined temperature in a thermostatic bath. Next, carbon dioxide is sent to the heat exchanger through a liquid feed pump (SCF-Get) at a cylinder pressure (about 6-7 MPa), heated to a predetermined temperature, and a fully automatic pressure regulating valve (SCF-Bpg). Thus, the pressure applied to the entire system was controlled and converted into a high-pressure gas state at a predetermined pressure. Next, the high-pressure carbon dioxide gas was blown into the extraction container, and the solvent was removed under the following three conditions.
(1) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes, microcapsule charge 0.3 g.
(2) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes, microcapsule charge 2 g.
(3) Pressure 3.0 MPa, temperature 15 ° C., extraction time 60 minutes, microcapsule charge 5 g.
[0075]
Test example 1
For the hGH-containing microcapsules and untreated lyophilized microcapsules obtained in Examples 1 (1) to (4), the amount of residual dichloromethane (DCM) and hGH content in the microcapsules were measured by the following methods.
(1) Residual dichloromethane (DCM) amount
About 100 mg of microcapsules were accurately weighed and dissolved in dimethyl sulfoxide to make exactly 5 ml to obtain a sample solution. Separately, about 1 g of dichloromethane was accurately weighed and dimethyl sulfoxide was added to make exactly 20 ml. This solution was diluted 10,000 times with dimethyl sulfoxide to obtain a standard solution. The sample solution and 1 μl of the standard solution were tested by the gas chromatograph method under the following conditions, and the peak area of dichloromethane in each solution was measured by an automatic integration method to calculate the amount of dichloromethane.
Detector: Hydrogen flame ionization detector
Column: OVI-G43 film thickness 3μm, 0.53mm id × 30m (Supelco)
Inlet temperature: 140 ° C
Detector temperature: 260 ° C
Column temperature: 40 ° C. (10 min hold) → 240 ° C. (35 ° C./min)→240° C. (20 min hold) → cooling → 40 ° C.
Carrier gas: helium
Flow rate: 35 cm / sec
(2) hGH content
10 mg of microcapsules were precisely weighed into a 5 ml volumetric flask and 1.75 ml of acetonitrile was added, followed by sonication. 3 ml of 150 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added to the resulting acetonitrile solution, and after sonication, the volume was increased with 150 mM phosphate buffer (pH 8.0). Of this, 1 ml was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 μm. Subsequently, this hGH extract was subjected to size exclusion high performance liquid chromatography under the following conditions to measure the hGH content.
Column: TSK-gel G2000SWXL, 7.8 mm id x 300 mm (Tosoh)
Mobile phase: 0.05 mol / l ammonium hydrogen carbonate solution
Flow rate: 0.6 ml / min
The results are shown in Table 1.
[0076]
[Table 1]

As is clear from the results in Table 1, the amount of residual dichloromethane was remarkably reduced in the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state as compared with untreated microcapsules. It was also confirmed that the hGH content in the microcapsules was not reduced by the high pressure gas state carbon dioxide treatment.
[0077]
Test example 2
For the hGH-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Examples 1 (1) to (4), the amounts of hGH polymer and hGH-related protein in the microcapsules were measured by the following method. .
(1) hGH polymer
10 mg of microcapsules were accurately weighed, 2.5 ml of acetonitrile was added, the sample was dispersed by ultrasonic irradiation, and then ultrasonic irradiation was performed for about 2 minutes, followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed, 2.5 ml of acetonitrile was added to the residue, the residue was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed and the residue was dried under reduced pressure in a desiccator. To this was added 1.25 ml of a diluted solution (phosphate buffer (pH 8.0) / acetonitrile mixture (13: 7)), and the sample was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes. The solution was filtered through a 0.5 μm membrane filter, and the filtrate was used as a sample solution. Separately, 0.2 ml of hGH standard was added to 0.2 ml of diluent. 0.2 ml of this solution was added to 4.8 ml of diluent to obtain a standard solution. The sample solution and 50 μl of the standard solution were measured by the liquid chromatograph method under the following conditions. The peak area of the peak eluting earlier than the hGH retention time of the sample solution and the hGH peak area of the standard solution were measured by an automatic integration method to determine the polymer content. Simultaneously, 50 μl of diluent was injected, and the peak detected from the blank was subtracted from the calculation.
Detector: UV absorption photometer (measurement wavelength: 214 nm)
Column: TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm id x 300mm (Tosoh)
Column temperature: constant temperature around 25 ° C
Mobile phase: 0.05 mol / l ammonium hydrogen carbonate solution
Flow rate: 0.6 ml / min
[0078]
(2) hGH related protein
40 mg of microcapsules were accurately weighed, 2 ml of acetonitrile was added, and the sample was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes. Next, 3 ml of phosphate buffer (pH 8.0) was added, and the mixture was sonicated for about 2 minutes with occasional shaking, and then centrifuged at 3500 times / minute for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 μm, and the filtrate was used as a sample solution. Separately, 0.1 ml of hGH standard product was added to 3.9 ml of a diluent (phosphate buffer (pH 8.0) / acetonitrile mixture (13: 7)) to obtain a standard solution. The sample solution and 20 μl of the standard solution were measured by liquid chromatography under the following conditions. The individual peak areas other than hGH of the sample solution and the hGH peak area of the standard solution were measured by an automatic integration method to determine the content of the related protein. At the same time, 20 μl of diluent was injected, and the peak detected from the blank was subtracted from the calculation.

The results are shown in Table 2.
[0079]
[Table 2]

As is clear from the results in Table 2, the amount of hGH polymer and hGH-related protein did not increase in the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state, compared to untreated microcapsules.
[0080]
Test example 3
For the hGH-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Examples 1 (1) to (4), the average particle size and in vivo initial release rate of the microcapsules were measured by the following methods.
(1) Average particle size of microcapsules
The average particle size of the microcapsules was measured with a particle size distribution analyzer (Multisizer II, Coulter Electronics Ltd., Beds, UK).
(2) In vivo initial release rate
Rats were immunosuppressed with tacrolimus. 5 mg of Prograf injection solution (Fujisawa Pharmaceutical) was diluted with physiological saline, 0.4 mg / 0.2 ml / rat 3 days before administration of microcapsules, 0.2 mg / day immediately after administration of microcapsules 4, 7 and 11 days after administration. Antibody production against hGH can be suppressed by subcutaneous administration at a dose of 0.3 mg / 0.2 ml / rat at 0.2 ml / rat, 14, 18, 21, 25, 28 and 32 days after administration. It became possible to measure the hGH concentration in rat serum over a week.
The microcapsules were dispersed in a dispersion medium (5% mannitol, 0.5% carboxymethyl cellulose, 0.1% Tween 80) so as to be 16 mg hGH / ml. 0.75 ml of the resulting dispersion was subcutaneously administered to the back of the rat under ether anesthesia. The dose was 12 mg as hGH. After administration of the microcapsules, blood was collected over time from the tail vein, and serum was collected.
The serum hGH concentration was measured by an immunoradiometric assay (Ab beads HGH, Eiken Chemical).
The hGH solution was subcutaneously administered to immunosuppressed rats at doses of 5, 10 and 20 mg / kg, blood was collected over time, and the serum hGH concentration was measured. AUC was calculated by the trapezoidal method. The hGH dose corresponding to the subcutaneous administration of hGH solution was calculated from the AUC up to 24 hours after administration of the microcapsules, and the initial release rate was calculated by dividing by the dose of 12 mg of the microcapsules.
The results are shown in Table 3.
[0081]
[Table 3]

As is clear from the results in Table 3, it was confirmed that the average particle size of the microcapsules was not changed by the carbon dioxide treatment in a high-pressure gas state, and no aggregation occurred. In addition, compared with untreated microcapsules, the initial release rate of the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state was significantly reduced.
[0082]
Test example 4
For the hGH-containing microcapsules and untreated lyophilized microcapsules obtained in Examples 2 (1) to (4), the amount of residual dichloromethane (DCM) and the hGH content in the microcapsules were measured by the following methods.
(1) Residual dichloromethane (DCM) amount
About 100 mg of microcapsules were accurately weighed and dissolved in dimethyl sulfoxide to make exactly 5 ml to obtain a sample solution. Separately, about 1 g of dichloromethane was accurately weighed and dimethyl sulfoxide was added to make exactly 20 ml. This solution was diluted 10,000 times with dimethyl sulfoxide to obtain a standard solution. The sample solution and 1 μl of the standard solution were tested by the gas chromatograph method under the following conditions, and the peak area of dichloromethane in each solution was measured by an automatic integration method to calculate the amount of dichloromethane.
Detector: Hydrogen flame ionization detector
Column: OVI-G43 film thickness 3μm, 0.53mm id x 30m (Supelco)
Inlet temperature: 140 ° C
Detector temperature: 260 ° C
Column temperature: 40 ° C. (10 min hold) → 240 ° C. (35 ° C./min)→240° C. (20 min hold) → cooling → 40 ° C.
Carrier gas: helium
Flow rate: 35 cm / sec
(2) hGH content
20 mg of microcapsules were precisely weighed into a 5 ml volumetric flask and 1.75 ml of acetonitrile was added, followed by sonication. To the obtained acetonitrile solution, 3 ml of 150 mM phosphate buffer solution (pH 8.0) was added, and after sonication, the volume was increased with 150 mM phosphate buffer solution (pH 8.0). Of this, 1 ml was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 μm. Subsequently, this hGH extract was subjected to size exclusion high performance liquid chromatography under the following conditions to measure the hGH content.
Column: TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm id x 300mm (Tosoh)
Mobile phase: 0.05 mol / l ammonium hydrogen carbonate solution
Flow rate: 0.6 ml / min
The results are shown in Table 4.
[0083]
[Table 4]

As is clear from the results in Table 4, the amount of residual dichloromethane was remarkably reduced in the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state as compared with untreated microcapsules. It was also confirmed that the hGH content in the microcapsules was not reduced by the high pressure gas state carbon dioxide treatment.
[0084]
Test Example 5
For the hGH-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Examples 2 (1) to (4), the amounts of hGH polymer and hGH related protein in the microcapsules were measured by the following method. .
(1) hGH polymer
10 mg of microcapsules were accurately weighed, 2.5 ml of acetonitrile was added, and the sample was dispersed by ultrasonic irradiation. Subsequently, ultrasonic irradiation was performed for about 2 minutes, followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed, 2.5 ml of acetonitrile was added to the residue, the residue was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes, and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed and the residue was dried under reduced pressure in a desiccator. To this was added 1.25 ml of a diluted solution (phosphate buffer (pH 8.0) / acetonitrile mixture (13: 7)), and the sample was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes. The solution was filtered through a 0.5 μm membrane filter, and the filtrate was used as a sample solution. Separately, 0.2 ml of hGH standard was added to 0.2 ml of diluent. 0.2 ml of this solution was added to 4.8 ml of diluent to obtain a standard solution. The sample solution and 50 μl of the standard solution were measured by the liquid chromatograph method under the following conditions. The peak area of the peak eluting earlier than the hGH retention time of the sample solution and the hGH peak area of the standard solution were measured by an automatic integration method to determine the polymer content. At the same time, 50 μl of diluent was injected, and the peak detected from the blank was subtracted from the calculation.
Detector: UV absorptiometer (measurement wavelength: 214 nm)
Column: TSK-gel G2000SWXL, 7.8mm id x 300mm (Tosoh)
Column temperature: constant temperature around 25 ° C
Mobile phase: 0.05 mol / l ammonium hydrogen carbonate solution
Flow rate: 0.6 ml / min
(2) hGH related protein
40 mg of microcapsules were accurately weighed, 2 ml of acetonitrile was added, and the sample was dispersed by ultrasonic irradiation, followed by ultrasonic irradiation for about 2 minutes. Next, 3 ml of phosphate buffer (pH 8.0) was added, and the mixture was sonicated for about 2 minutes with occasional shaking, and then centrifuged at 3500 times / minute for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 μm, and the filtrate was used as a sample solution. Separately, 0.1 ml of hGH standard product was added to 3.9 ml of a diluent (phosphate buffer (pH 8.0) / acetonitrile mixture (13: 7)) to obtain a standard solution. The sample solution and 20 μl of the standard solution were measured by liquid chromatography under the following conditions. The individual peak areas other than hGH of the sample solution and the hGH peak area of the standard solution were measured by an automatic integration method to determine the content of the related protein. At the same time, 20 μl of diluent was injected, and the peak detected from the blank was subtracted from the calculation.

The results are shown in Table 5.
[0085]
[Table 5]

As is clear from the results in Table 5, the amount of hGH polymer and hGH-related protein did not increase in microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state, compared to untreated microcapsules.
[0086]
Test Example 6
For the hGH-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Examples 2 (1) to (4), the average particle size and in vivo initial release rate of the microcapsules were measured by the following methods.
(1) Average particle size of microcapsules
The average particle size of the microcapsules was measured with a particle size distribution analyzer (Multisizer II, Coulter Electronics Ltd., Beds, UK).
(2) In vivo initial release rate
Rats were immunosuppressed with tacrolimus. 5 mg of Prograf injection solution (Fujisawa Pharmaceutical) was diluted with physiological saline, 0.4 mg / 0.2 ml / rat 3 days before administration of microcapsules, immediately after administration of microcapsules, 4, 7, 11, 14 and 18 days after administration. Subcutaneous administration was performed at a dose of 0.2 mg / 0.2 ml / rat. The microcapsules were dispersed in a dispersion medium (5% mannitol, 0.5% carboxymethyl cellulose, 0.1% Tween 80) so as to be 8 mg hGH / ml. 0.75 ml of the resulting dispersion was subcutaneously administered to the back of the rat under ether anesthesia. The dose was 6 mg as hGH. After administration of the microcapsules, blood was collected over time from the tail vein, and serum was collected.
The serum hGH concentration was measured by an immunoradiometric assay (Ab beads HGH, Eiken Chemical).
The hGH solution was subcutaneously administered to immunosuppressed rats at doses of 5, 10 and 20 mg / kg, blood was collected over time, and the serum hGH concentration was measured. AUC was calculated by the trapezoidal method. The hGH dose corresponding to the subcutaneous administration of hGH solution was calculated from the AUC until 24 hours after the microcapsule administration, and the initial release rate was calculated by dividing by the 6 mg microcapsule dose.
The results are shown in Table 6.
[0087]
[Table 6]

As is clear from the results in Table 6, it was confirmed that the average particle size of the microcapsules was not changed by the carbon dioxide treatment in the high-pressure gas state, and no aggregation occurred. In addition, compared with untreated microcapsules, the initial release rate of the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state was significantly reduced.
[0088]
Test Example 7
For the candesartan-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Examples 3 (1) to (18), the amount of residual dichloromethane (DCM) and the candesartan content in the microcapsules were measured by the following methods.
Residual dichloromethane (DCM) amount
About 100 mg of microcapsules were accurately weighed and dissolved in dimethyl sulfoxide to make exactly 5 ml to obtain a sample solution. Separately, about 1 g of dichloromethane was accurately weighed and dimethyl sulfoxide was added to make exactly 20 ml. This solution was diluted 10,000 times with dimethyl sulfoxide to obtain a standard solution. The sample solution and 1 μl of the standard solution were tested by the gas chromatograph method under the following conditions, and the peak area of dichloromethane in each solution was measured by an automatic integration method to calculate the amount of dichloromethane.
Detector: Hydrogen flame ionization detector
Column: OVI-G43 film thickness 3μm, 0.53mm id x 30m (Supelco)
Inlet temperature: 140 ° C
Detector temperature: 260 ° C
Column temperature: 40 ° C (10 min hold) → 260 ° C (35 ° C / min) (10 min hold)
Carrier gas: helium
Flow rate: 35cm / sec
Candesartan content
5-10 mg of microcapsules were accurately weighed into a centrifuge tube, and 30 ml of HPLC mobile phase was added, followed by shaking and stirring for 1 hour. Subsequently, the mixture was centrifuged at 2950 rpm for 10 minutes, and the supernatant was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.5 μm. Subsequently, this candesartan extract was subjected to reverse phase high performance liquid chromatography under the following conditions to measure the candesartan content.
Column: inertsil ODS-3 (4.6mm × 150mm, GL science)
Mobile phase: 0.1M KH ₂ PO _Four / AcCN / MeOH / AcOH = 50/35/15/1 (v / v)
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV wavelength 254nm
The results are shown in Table 7.
[0089]
[Table 7]

As is clear from the results in Table 7, the amount of residual dichloromethane was remarkably reduced in the microcapsules treated with carbon dioxide in a high-pressure gas state as compared to untreated microcapsules. In addition, it was confirmed that the candesartan content in the microcapsules was not decreased by the carbon dioxide treatment in a high-pressure gas state.
[0090]
Test Example 8
For the candesartan-containing microcapsules and untreated freeze-dried microcapsules obtained in Example 4 (1) to (3), the amount of residual dichloromethane (DCM) and candesartan content in the microcapsules were determined in the same manner as in Test Example 7. Measured with
The results are shown in Table 8.
[0091]
[Table 8]

As apparent from the results in Table 8, the amount of residual dichloromethane was significantly reduced in the microcapsules treated with carbon dioxide in the high-pressure gas state, compared to the untreated microcapsules. In addition, it was confirmed that the candesartan content in the microcapsules was not decreased by the carbon dioxide treatment in a high-pressure gas state.
[0092]
【The invention's effect】
According to the present invention, in a method for producing a sustained-release preparation, a solid substance containing a physiologically active substance and a biodegradable polymer is formed, and the solid substance is brought into contact with a high-pressure gas, whereby a physiologically active substance immediately after administration is formed. The initial release of excessive amounts of the drug is drastically suppressed, a certain amount of physiologically active substance is released over a long period from immediately after administration, and the alteration of the physiologically active substance and the residual organic solvent are extremely small. A sustained-release preparation having excellent properties is obtained. Moreover, the processing time required for solvent removal was significantly shortened by changing the method for solvent removal.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view showing a solvent removal apparatus using carbon dioxide in a high-pressure gas state.
[Explanation of symbols]
1: liquefied carbon dioxide cylinder, 2: CO2 feed pump, 3: heat exchanger, 4: extraction container, 5: thermostatic bath, 6: detector, 7: automatic pressure control valve, 8: recovery container

Claims (16)

A solid substance containing a non-peptide physiologically active substance and a biodegradable polymer which is a lactic acid / glycolic acid homopolymer or copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of 100/0 to 40/60 mol% is formed. the solid was, solid non-peptide physiologically active substance-containing Xu, characterized in that contacting with carbon dioxide pressure 1~7MPa in a temperature range of +. 20 to-60 ° C. the glass transition temperature of the polymer as a reference A method for producing releasable microcapsules.   The process according to claim 1, wherein the non-peptide physiologically active substance is a compound having an oxygen atom in the molecule.   The process according to claim 1, wherein the non-peptide physiologically active substance is a compound having an ether bond or a carbonyl group. Non-peptide physiologically active substance is represented by the formula (I)

(In the formula, R ¹ represents a group capable of forming an anion or a group capable of changing to it, X represents that a phenylene group and a phenyl group are bonded directly or via a spacer having an atomic chain of 2 or less, and n Represents an integer of 1 or 2, ring A represents an optionally substituted benzene ring, R ² represents a group capable of forming an anion or a group that can be changed thereto, and R ³ represents a heteroatom. 2. The production method according to claim 1, wherein the compound is a compound represented by the following formula: or a salt thereof.   The process according to claim 1, wherein the non-peptide physiologically active substance is losartan, eprosartan, candesartan cilexetil, candesartan, valsartan, telmisartan, irbesartan, tasosartan or olmesartan.   The process according to claim 1, wherein the non-peptide physiologically active substance is candesartan.   The process according to claim 1, wherein the biodegradable polymer is a lactic acid homopolymer.   The method according to claim 1, wherein the biodegradable polymer has a weight average molecular weight of 3,000 to 50,000.   The process according to claim 1, wherein the solid is brought into contact with carbon dioxide within a temperature range of 0 to -40 ° C based on the glass transition temperature of the polymer.   The process according to claim 1, wherein the time for contacting the solid with carbon dioxide is 5 minutes to 48 hours.   The method according to claim 10, wherein the time for contacting the solid with carbon dioxide is 10 minutes to 12 hours.   The method according to claim 1, wherein the pressure of carbon dioxide is 1 to 4 MPa.   The process according to claim 1, wherein the sustained-release microcapsules are obtained by an underwater drying method.   A sustained-release microcapsule obtained by the production method according to claim 1.   An injection comprising the sustained-release microcapsule according to claim 14. A solid substance containing a non-peptide physiologically active substance and a biodegradable polymer which is a lactic acid / glycolic acid homopolymer or copolymer having a composition ratio of lactic acid / glycolic acid of 100/0 to 40/60 mol% is formed. A non-peptide physiologically active substance, wherein the solid is contacted with carbon dioxide at a pressure of 1 to 7 MPa within a temperature range of +20 to −60 ° C. based on the glass transition temperature of the polymer. Suppression method.

Images