JP4682275B2 - Method for determining prognosis of mammalian neuroblastoma - Google Patents
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Description
本発明は哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定するためのプローブ、プライマー又はキットに関する。 The present invention relates to a method for determining the prognosis of a neuroblastoma in a mammal. The present invention also relates to a probe, primer or kit for determining the prognosis of mammalian neuroblastoma.
神経芽細胞腫（neuroblastoma）は、最も頻度の高い小児固形腫瘍である。この腫瘍には、悪性増殖する予後不良群と、機構は不明ながら自然退縮する予後良好群が存在する。予後を正確に予測できれば、不必要な放射線治療や化学療法を避けることが出来る。現在、予後の予測にはN-mycの増幅、TrkAの高発現などがマーカーとして用いられているが、より正確な診断のために新規マーカーの開発が求められている。 Neuroblastoma is the most common childhood solid tumor. In this tumor, there are a poor prognosis group in which malignant growth occurs and a good prognosis group in which the mechanism is unknown but the mechanism is spontaneously regressed. If the prognosis can be accurately predicted, unnecessary radiotherapy and chemotherapy can be avoided. Currently, amplification of N-myc, high expression of TrkA, and the like are used as markers for prognosis prediction, but development of a new marker is required for more accurate diagnosis.
哺乳動物では、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象がある。ＤＮＡのメチル化修飾は、5'-CG-3'で示される塩基配列（Cはシトシンを表し、Gはグアニンを表す。以下、当該塩基配列をCpGアイランドまたはCGIと記すこともある。）中のシトシンに限られる。近年、CGIのシトシンのメチル化の程度が正常細胞とガン細胞とで異なることが報告され、CGIのシトシンのメチル化のガンへの関与が注目されている。ガンに関与するCGIとしては、主に乳癌への関与が示唆されているHeparan sulfate D-Glucosaminyl 3-O-sulfotransferase遺伝子のCGIが知られており、該遺伝子のメチル化を指標にして乳癌などのガンを判定する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。一方、神経芽細胞種についてもいくつかの遺伝子のメチル化が知られていたが、神経芽細胞種に強く関連し、神経芽細胞種の予後の判定に使用することができるCGIマーカーはほとんど知られていなかった。
本発明は、神経芽細胞腫の予後を正確に予測するための方法を提供することを課題とする。本発明はまた、神経芽細胞腫の予後を予測するための検査キットを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for accurately predicting the prognosis of neuroblastoma. Another object of the present invention is to provide a test kit for predicting the prognosis of neuroblastoma.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、予後不良の神経芽細胞腫において、プロトカドヘリンβ１６遺伝子などのCGIのシトシンのメチル化頻度が予後良好群に比べて著しく増加していることを発見した。これらのシトシンのメチル化頻度を測定することによって、神経芽細胞腫の予後を正確に予測することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have made extensive studies to solve the above problems. As a result, in neuroblastoma with a poor prognosis, it was found that the methylation frequency of cytosine of CGI such as protocadherin β16 gene was remarkably increased as compared with the good prognosis group. By measuring the methylation frequency of these cytosines, it was found that the prognosis of neuroblastoma can be accurately predicted, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法であって、該哺乳動物の染色体DNA上の、プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定し、該メチル化頻度に基いて神経芽細胞腫の予後を判定することを特徴とする方法。
（２） 前記遺伝子が、プロトカドヘリンβ１６をコードする遺伝子である、（１）の方法。
（３） さらに、プロトカドヘリンβ１６以外のプロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする１種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、（２）の方法。
（４） 前記遺伝子が、プロトカドヘリンα１をコードする遺伝子である、（１）の方法。
（５） さらに、プロトカドヘリンα１以外のプロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする１種類以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定する、（４）の方法。
（６） メチル化特異的PCR法によってメチル化頻度を測定することを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７） プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを１つ以上含む配列を有するプライマー。
（８） プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを１つ以上含む配列を有するプローブ。
（９） （７）又は（８）のプライマー又はプローブを含む、神経芽細胞腫の予後判定用キット。
That is, the present invention is as follows.
(1) A method for determining the prognosis of a neuroblastoma of a mammal, which encodes a protein belonging to the protocadherin β family and a protein belonging to the protocadherin α family on the chromosomal DNA of the mammal Measuring the frequency of cytosine methylation in CpG islands contained in one or more genes selected from the group consisting of genes encoding hepatocyte growth factor-like protein, DKFZp451I127 gene or cytochrome p450 CYP26C1 gene, A method for determining a prognosis of neuroblastoma based on the methylation frequency.
(2) The method according to (1), wherein the gene is a gene encoding protocadherin β16.
(3) The method of (2), wherein the methylation frequency of cytosine in the CpG island contained in one or more genes encoding a protein belonging to the protocadherin β family other than protocadherin β16 is further measured.
(4) The method according to (1), wherein the gene is a gene encoding protocadherin α1.
(5) The method according to (4), wherein the methylation frequency of cytosine in a CpG island contained in one or more genes encoding a protein belonging to the protocadherin α family other than protocadherin α1 is further measured.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the methylation frequency is measured by a methylation-specific PCR method.
(7) CpG island included in gene encoding protein belonging to protocadherin β family, gene encoding protein belonging to protocadherin α family, gene encoding hepatocyte growth factor-like protein, DKFZp451I127 gene or cytochrome p450 CYP26C1 gene A primer having a sequence containing one or more cytosines.
(8) CpG islands contained in genes encoding proteins belonging to the protocadherin β family, genes encoding proteins belonging to the protocadherin α family, genes encoding hepatocyte growth factor-like proteins, DKFZp451I127 gene or cytochrome p450 CYP26C1 gene A probe having a sequence containing one or more cytosines.
(9) A prognosis determination kit for neuroblastoma comprising the primer or probe according to (7) or (8).
以下に本発明を詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.
本発明の方法は、哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法であって、該哺乳動物の染色体DNA上の、プロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンのメチル化頻度を測定し、該メチル化頻度に基いて神経芽細胞腫の予後を判定することを特徴とする方法である。ここで、哺乳動物の種類は特に制限されないが、ヒトが好ましい。 The method of the present invention is a method for determining the prognosis of a neuroblastoma of a mammal, which belongs to the protocadherin α family, a gene encoding a protein belonging to the protocadherin β family on the chromosomal DNA of the mammal. The methylation frequency of cytosine in the CpG island contained in one or more genes selected from the group consisting of a gene encoding a protein, a gene encoding a hepatocyte growth factor-like protein, DKFZp451I127 gene or cytochrome p450 CYP26C1 gene It is a method characterized by measuring and determining the prognosis of neuroblastoma based on the methylation frequency. Here, the kind of mammal is not particularly limited, but human is preferable.
哺乳動物の染色体ＤＮＡは、該哺乳動物由来の検体から常法によって抽出することができる。また、市販のDNA抽出キットなどを用いて抽出してもよい。哺乳動物由来の検体としては、例えば、神経や副腎髄質等由来の生体試料を挙げることができる。これらは手術によって摘出された組織であってもよいし、手術によって摘出された組織から調製されるプライマリー細胞などの細胞であってもよい。なお、メチル化頻度の測定には、必ずしも抽出又は精製された染色体DNAを用いる必要はなく、これらの組織や細胞をホモゲナイズしたような試料を直接用いることも可能である。 Mammalian chromosomal DNA can be extracted from a sample derived from the mammal by a conventional method. Moreover, you may extract using a commercially available DNA extraction kit. Examples of mammal-derived specimens include biological samples derived from nerves, adrenal medulla and the like. These may be tissues removed by surgery or cells such as primary cells prepared from tissues removed by surgery. It is not always necessary to use extracted or purified chromosomal DNA for the measurement of methylation frequency, and it is also possible to directly use a sample obtained by homogenizing these tissues and cells.
CpGアイランド（CGI）とは、染色体DNA上に存在する5’-C→G-3’配列（5’-シトシン-グアニン-3’配列）を意味する。本発明において、神経芽細胞腫の予後の判定に用いることのできるCGIとしては、プロトカドヘリンβ（PCDHB）ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンα（PCDHA）ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質（hepatocyte growth factor-like protein：HLP）をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、またはチトクロムp450 CYP26C1（CYP26C1）遺伝子に含まれるCGIを挙げることができる。 CpG island (CGI) means a 5'-C → G-3 'sequence (5'-cytosine-guanine-3' sequence) present on chromosomal DNA. In the present invention, CGI that can be used for determining the prognosis of neuroblastoma includes a gene encoding a protein belonging to the protocadherin β (PCDHB) family, a gene encoding a protein belonging to the protocadherin α (PCDHA) family And CGI contained in the gene encoding hepatocyte growth factor-like protein (HLP), DKFZp451I127 gene, or cytochrome p450 CYP26C1 (CYP26C1) gene.
PCDHBファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、PCDHB１〜１８をコ
ードする遺伝子を挙げることができるが、プロトカドヘリンβ１６（PCDHB16）をコードする遺伝子（PCDHB16遺伝子）が特に好ましい。本発明においては、PCDHBファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子は、タンパク質コード領域、プロモーター領域、及び３’非翻訳領域を含む遺伝子を意味する。この中で、PCDHB16遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NG_000017の149533〜154349で示される遺伝子を挙げることができる。PCDHB16遺伝子に含まれるCGIとしては、上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、NG_000017の152547〜152659（配列番号１）及び151812〜152302の配列中に存在するCGIを挙げることができる。具体的には、例えば、NG_000017で登録されている塩基配列において、152552、152559、152564、152644、152651、152656番目（配列番号１の6,13,18,94,98,105,110）で示されるシトシンなどを挙げることができる。
Examples of a gene encoding a protein belonging to the PCDHB family include a gene encoding PCDHB1-18, and a gene encoding protocadherin β16 (PCDHB16) (PCDHB16 gene) is particularly preferable. In the present invention, a gene encoding a protein belonging to the PCDHB family means a gene comprising a protein coding region, a promoter region, and a 3 ′ untranslated region. Among these, examples of the PCDHB16 gene include genes represented by 149533 to 154349 of GenBank Accession No. NG_000017. Examples of CGI contained in the PCDHB16 gene include CGI contained in the above-mentioned region, and preferably, CGI present in the sequence of 152547 to 152659 (SEQ ID NO: 1) and 151812 to 152302 of NG_000017. it can. Specifically, for example, in the base sequence registered in NG_000017, the cytosine indicated by the 152552, 152559, 152564, 152644, 152651, 152656th (6, 13, 18, 94, 98, 105, 110 of SEQ ID NO: 1), etc. Can be mentioned.
なお、プロトカドヘリンβ（PCDHB）ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は非常に保存性が高いため、PCDHB16以外のPCDHBファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、PCDHB１〜15、17及び18をコードする遺伝子においても、PCDHB16遺伝子のCGIのシトシンに相当するシトシンが存在する場合が多い。これらの遺伝子もPCDHB16遺伝子同様、Accession No. NG_000017で登録されている。例えば、PCDHB2遺伝子の場合、上記のPCDHB16のシトシン（配列番号１の6,13,18,94,98,105,110のシトシン）に対応するシトシンとして、NG_000017の６４７９８、６７８０５、６７８１０、６４８８６、６４８９０、６４８９７、６４９０２番目のシトシンが挙げられる。したがって、PCDHB１〜15、17及び18遺伝子のうちの１種類以上の遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンと、PCDHB16遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定してもよい。例えば、配列番号２〜５のプライマーはPCDHB2〜18遺伝子に共通する領域に設定されたプライマーであるため、これらのプライマーを用いることで、PCDHB16遺伝子のCGIのメチル化頻度と、PCDHB2〜15、17及び18遺伝子のCGIのメチル化頻度とを組み合わせて測定することができる。なお、各遺伝子のシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定する場合、上記のように各遺伝子のメチル化頻度を同時に測定してもよいし、別々に測定してそれぞれのメチル化頻度の平均値をとるなどしてもよい。 In addition, since the nucleotide sequence of a gene encoding a protein belonging to the protocadherin β (PCDHB) family is very conserved, genes encoding proteins belonging to the PCDHB family other than PCDHB16, that is, PCDHB1-15, 17 and 18 In many cases, a cytosine corresponding to the CGI cytosine of the PCDHB16 gene is also present in the gene coding for. These genes are registered under Accession No. NG_000017 as well as the PCDHB16 gene. For example, in the case of the PCDHB2 gene, as cytosine corresponding to the above-mentioned PCDHB16 cytosine (6, 13, 18, 94, 98, 105, 110 of SEQ ID NO: 1), NG_000017 64798, 67805, 67810, 64886, 64890, 64897, 64902 The second cytosine. Therefore, the CGI cytosine contained in one or more of the PCDHB1-15, 17 and 18 genes may be combined with the methylation frequency of CGI cytosine contained in the PCDHB16 gene. For example, since the primers of SEQ ID NOs: 2 to 5 are primers set in a region common to the PCDHB2 to 18 genes, by using these primers, the CGI methylation frequency of the PCDHB16 gene and the PCDHB2 to 15, 17 And the methylation frequency of CGI of 18 genes can be measured in combination. When measuring the methylation frequency of cytosine of each gene in combination, the methylation frequency of each gene may be measured at the same time as described above, or the average value of each methylation frequency may be measured separately. You may take.
PCDHB１〜15、17及び18遺伝子もPCDHB16遺伝子と同様に高メチル化されている可能性が高いため、これらの遺伝子に含まれるCGIのシトシンを独自にメチル化頻度測定してもよい。このように、PCDHBファミリーをコードする遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンは神経芽細胞腫において高頻度にメチル化されているため、哺乳動物の染色体DNA上のこれらの遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。 Since the PCDHB1-15, 17 and 18 genes are also likely to be highly methylated like the PCDHB16 gene, the CGI cytosine contained in these genes may be independently measured for methylation frequency. Thus, since CGI cytosine contained in the gene encoding the PCDHB family is frequently methylated in neuroblastoma, the CGI cytosine methyl contained in these genes on mammalian chromosomal DNA By measuring the conversion frequency, it can be used to determine the prognosis of neuroblastoma.
PCDHAファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、PCDHA１〜１４をコードする遺伝子を挙げることができるが、プロトカドヘリンα１（PCDHA1）をコードする遺伝子（PCDHA1遺伝子）が特に好ましい。本発明においては、PCDHAファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子は、タンパク質コード領域、プロモーター領域、及び３’非翻訳領域を含む遺伝子を意味する。この中で、PCDHA1遺伝子は、例えば、GenBank Accession NG_000016の52164〜248436で示される遺伝子を挙げることができる。PCDHA1遺伝子に含まれるＣＧＩとしては上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、GenBank Accession No. NG_000016の53686〜53806（配列番号６）、及び52822〜53571の配列中に存在するCGIを挙げることができる。具体的には、例えば、NG_000016で登録されている塩基配列において、５３６９６、５３６９８、５３７０５、５３７８６、５３７９１番目（配列番号６の11,13,20,101,106）で示されるシトシンなどを挙げることができる。 Examples of the gene encoding a protein belonging to the PCDHA family include a gene encoding PCDHA1-14, and a gene encoding protocadherin α1 (PCDHA1) (PCDHA1 gene) is particularly preferable. In the present invention, a gene encoding a protein belonging to the PCDHA family means a gene comprising a protein coding region, a promoter region, and a 3 'untranslated region. Among these, examples of the PCDHA1 gene include genes shown by 52164 to 248436 of GenBank Accession NG_000016. Examples of CGI contained in the PCDHA1 gene include CGI contained in the above region. Preferably, CGI present in the sequences of 5686 to 53806 (SEQ ID NO: 6) and 52822 to 53571 of GenBank Accession No. NG_000016. Can be mentioned. Specifically, for example, cytosine represented by 53696, 53698, 53705, 53786, 53791 (11, 13, 20, 101, 106 of SEQ ID NO: 6) and the like can be mentioned in the base sequence registered in NG_000016.
なお、プロトカドヘリンα（PCDHA）ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は非常に保存性が高いため、PCDHA1以外のPCDHAファミリーに属するタンパ
ク質をコードする遺伝子、すなわち、PCDHA2〜14をコードする遺伝子においても、PCDHA1遺伝子のCGIのシトシンに相当するシトシンが存在する場合が多い。これらの遺伝子もPCDHA1遺伝子同様、Accession No. NG_000016で登録されている。例えば、PCDHA2遺伝子の場合、上記のPCDHA1のシトシン（配列番号６の11,13,20,101,106のシトシン）に対応するシトシンとして、NG_000016の６２３７０、６２３７２、６２３７９、６２４６０、６２４６５番目のシトシンが挙げられる。したがって、PCDHA２〜14遺伝子のうちの１種類以上の遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンと、PCDHA1遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定してもよい。配列番号７〜１０のプライマーはPCDHA１〜14遺伝子に共通する領域に設定されたプライマーであるため、これらのプライマーを用いることで、PCDHA1遺伝子のCGIのメチル化頻度と、PCDHA2〜14遺伝子のCGIのメチル化頻度とを組み合わせて測定することができる。なお、各遺伝子のシトシンのメチル化頻度を組み合わせて測定する場合、上記のように各遺伝子のメチル化頻度を同時に測定してもよいし、別々に測定してそれぞれのメチル化頻度の平均値をとるなどしてもよい。
In addition, since the nucleotide sequence of a gene encoding a protein belonging to the protocadherin alpha (PCDHA) family is very conserved, a gene encoding a protein belonging to the PCDHA family other than PCDHA1, that is, a gene encoding PCDHA2 to 14 In many cases, a cytosine corresponding to the CGI cytosine of the PCDHA1 gene is present. These genes are registered under Accession No. NG_000016 as well as the PCDHA1 gene. For example, in the case of the PCDHA2 gene, 62370, 62372, 62379, 62460, 62465th cytosine of NG_000016 can be mentioned as the cytosine corresponding to the above cytosine of PCDHA1 (cytosine of 11, 13, 20, 101, 106 of SEQ ID NO: 6). Therefore, the methylation frequency of CGI cytosine contained in one or more kinds of PCDHA2 to 14 genes and CGI cytosine contained in PCDHA1 gene may be measured in combination. Since the primers of SEQ ID NOs: 7 to 10 are primers set in a region common to the PCDHA1 to 14 genes, by using these primers, the CGI methylation frequency of the PCDHA1 gene and the CGI of the PCDHA2 to 14 genes It can be measured in combination with methylation frequency. When measuring the methylation frequency of cytosine of each gene in combination, the methylation frequency of each gene may be measured at the same time as described above, or the average value of each methylation frequency may be measured separately. You may take.
また、PCDHA2〜14遺伝子もPCDHA1遺伝子と同様に高メチル化されている可能性が高いため、これらの遺伝子に含まれるCGIのシトシンを独自にメチル化頻度測定してもよい。このように、PCDHAファミリーをコードする遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンは神経芽細胞腫において高頻度にメチル化されているため、哺乳動物の染色体DNA上のこれらの遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。 Since the PCDHA2 to 14 genes are also highly likely to be highly methylated like the PCDHA1 gene, the CGI cytosine contained in these genes may be independently measured for methylation frequency. Thus, since CGI cytosine contained in the gene encoding the PCDHA family is frequently methylated in neuroblastoma, the CGI cytosine methyl contained in these genes on mammalian chromosomal DNA By measuring the conversion frequency, it can be used to determine the prognosis of neuroblastoma.
肝細胞増殖因子様タンパク質（hepatocyte growth factor-like protein：HLP）をコードする遺伝子（HLP遺伝子）は、本発明においては、該タンパク質のタンパク質コード領域、プロモーター領域、及び３’非翻訳領域を含む遺伝子を意味し、例えば、GenBank Accession No. U37055の4078〜8843で示される遺伝子を挙げることができる。HLP遺伝子に含まれるＣＧＩとしては、上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、GenBank Accession No. U37055の6845〜6940（配列番号１１）及び6953〜7110に存在するCGIを挙げることができる。具体的には、例えば、U37055で登録されている塩基配列において、6845,6861,6863、6919、6922、6931番目（配列番号１１の1,17,19,75,78,87）で示されるシトシンなどを挙げることができる。HLP遺伝子に含まれるＣＧＩのシトシンは神経芽細胞腫において高メチル化されているため、哺乳動物の染色体DNAのHLP遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。 In the present invention, a gene (HLP gene) encoding a hepatocyte growth factor-like protein (HLP) is a gene comprising a protein coding region, a promoter region, and a 3 ′ untranslated region of the protein. For example, the gene shown by 4078-8843 of GenBank Accession No. U37055 can be mentioned. Examples of CGI contained in the HLP gene include CGI contained in the above region, preferably CGI present in GenBank Accession No. U37055, 6845-6940 (SEQ ID NO: 11) and 6953-7110. Can do. Specifically, for example, in the nucleotide sequence registered in U37055, cytosine represented by positions 6845, 6686, 6863, 6919, 6922, and 6931 (1, 17, 19, 75, 78, 87 of SEQ ID NO: 11) And so on. Since CGI cytosine contained in the HLP gene is highly methylated in neuroblastoma, neuroblastoma is determined by measuring the methylation frequency of CGI cytosine contained in the HLP gene of mammalian chromosomal DNA. Can be used to determine the prognosis.
DKFZp451I127遺伝子のCGIとは、例えば、GenBank Accession No. AC026779の90988〜91336で示される遺伝子を挙げることができる。DKFZp451I127遺伝子に含まれるＣＧＩとしては、上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、GenBank Accession
No. AC026779の90988〜91084（配列番号１６）に存在するCGIを挙げることができる。また、GenBank Accession No. AC026779の91325〜91745に存在するCGIであってもよい。具体的には、例えば、AC026779で登録されている塩基配列において、９１０００、９１００６、９１０７８番目（配列番号１６の13,19,91）で示されるシトシンなどを挙げることができる。DKFZp451I127遺伝子に含まれるCGIのシトシン残基は神経芽細胞腫において高メチル化されているため、哺乳動物のDNAのDKFZp451I127遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。
Examples of the CGI of the DKFZp451I127 gene include genes represented by 90988 to 91336 of GenBank Accession No. AC026779. Examples of CGI contained in the DKFZp451I127 gene include CGI contained in the above region, preferably GenBank Accession
CGI existing in Nos. AC026779, 90988 to 91084 (SEQ ID NO: 16) can be mentioned. Moreover, CGI which exists in GenBank Accession No. AC026779 91325-91745 may be sufficient. Specifically, for example, cytosine shown at 91000, 91006, and 91078 (SEQ ID NO: 16, 13, 19, 91) in the base sequence registered in AC026779 can be exemplified. Since the cytosine residue of CGI contained in DKFZp451I127 gene is hypermethylated in neuroblastoma, neuroblasts can be obtained by measuring the methylation frequency of cytosine of CGI contained in DKFZp451I127 gene of mammalian DNA. It can be used to determine the prognosis of a tumor.
チトクロムp450 CYP26C1遺伝子のCGIとは、例えば、GenBank Accession No. AL358613の10896〜18329で示される遺伝子を挙げることができる。CYP26C1遺伝子のＣＧＩとしては、上記領域に含まれるCGIを挙げることができるが、好ましくは、GenBank Accession No. AL358613の11646-11759（配列番号２１）及び11222〜11851に存在するCGIを挙げるこ
とができる。具体的には、例えば、AL358613で登録されている塩基配列において、１１６４６、１１６４８、１１６６３，１１６６６番目（配列番号２１の1,3,18,21,99）で示されるシトシンなどを挙げることができる。CYP26C1遺伝子に含まれるCGIのシトシンは神経芽細胞腫において高メチル化されているため、哺乳動物の染色体DNAのCYP26C1遺伝子に含まれるCGIのシトシンのメチル化頻度を測定することにより、神経芽細胞腫の予後の判定に利用することができる。
Examples of the CGI of cytochrome p450 CYP26C1 gene include the gene represented by 10896-18329 of GenBank Accession No. AL358613. Examples of CGI of the CYP26C1 gene include CGI included in the above region, preferably CGI existing in 11646-11759 (SEQ ID NO: 21) and 11222 to 11851 of GenBank Accession No. AL358613. . Specifically, for example, cytosine shown at 11646, 11648, 11663, 11666 (1, 3, 18, 21, 99 of SEQ ID NO: 21) in the base sequence registered in AL358613 can be exemplified. . Since CGI cytosine contained in the CYP26C1 gene is hypermethylated in neuroblastoma, neuroblastoma can be determined by measuring the methylation frequency of CGI cytosine contained in the CYP26C1 gene of mammalian chromosomal DNA. Can be used to determine the prognosis.
本発明においては、上記のようなCGIのシトシンのメチル化頻度を測定する。測定対象のシトシンは1個でもよいし、複数でもよい。複数のシトシンについて測定する場合、同一遺伝子の複数のシトシンについて測定してもよいし、上記遺伝子のうちの2種類以上の遺伝子のシトシンについて測定してもよい。「メチル化頻度」とは、例えば、測定対象となるCpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの総和(UM+M)に対する、メチル化シトシン（M）の割合[M/(UM+M)]で表すことができる。複数のシトシンについて調べるときは、例えば、各シトシンについて算出したメチル化頻度の平均値や総和、または、各シトシンのメチル化頻度に神経芽細胞腫に対する相関係数を乗じた値の総和などをメチル化頻度とすることも可能である。なお、メチル化特異的PCRなどによってメチル化頻度を調べるときは、DNAの増幅数などをメチル化頻度としてもよい。 In the present invention, the methylation frequency of CGI cytosine as described above is measured. One or more cytosine may be measured. When measuring about several cytosine, you may measure about the several cytosine of the same gene, and may measure about the cytosine of two or more types of genes of the said gene. `` Methylation frequency '' is, for example, the sum of methylated cytosine and unmethylated cytosine (UM + M) when examining the presence or absence of cytosine methylation in CpG to be measured for multiple haploids, It can be represented by the ratio [M / (UM + M)] of methylated cytosine (M). When examining a plurality of cytosines, for example, the average value or sum of methylation frequencies calculated for each cytosine, or the sum of values obtained by multiplying the methylation frequency of each cytosine with a correlation coefficient for neuroblastoma is methylated. It is also possible to set the frequency. When the methylation frequency is examined by methylation-specific PCR or the like, the number of DNA amplification may be used as the methylation frequency.
シトシン残基のメチル化頻度を測定する方法としては、まず、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（bisulfite）を用いて染色体DNAを化学処理し、該化学処理された配列を解析する方法を挙げることができる。亜硫酸水素ナトリウム処理により、非メチル化シトシンはチミン（ウラシル）に変換されるが、メチル化されているシトシンはチミン（ウラシル）に変換されず、シトシンのままである。したがって、この違いを利用して、メチル化の有無を検出することができる。亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（bisulfite）を用いて染色体DNAを化学処理するための条件としては、例えば、まず染色体DNAをアルカリ溶液（ｐH9〜14）中で亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（bisulfite）（溶液中の濃度：例えば、終濃度3M）等で約10〜16時間（一晩）、55℃で処理する条件を例示することができる。 As a method of measuring the methylation frequency of cytosine residues, first, a method of chemically treating chromosomal DNA using bisulfite such as sodium bisulfite and analyzing the chemically treated sequence is mentioned. Can do. Sodium bisulfite treatment converts unmethylated cytosine to thymine (uracil), but methylated cytosine is not converted to thymine (uracil) and remains cytosine. Therefore, the presence or absence of methylation can be detected using this difference. As a condition for chemically treating chromosomal DNA using bisulfite such as sodium bisulfite, for example, first, chromosomal DNA is first subjected to bisulfite (such as sodium bisulfite) in an alkaline solution (pH 9 to 14). Bisulfite) (concentration in solution: for example, final concentration of 3M) and the like can be exemplified by conditions of treatment at 55 ° C. for about 10 to 16 hours (overnight).
このようにして亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩処理を行った染色体DNAについて、メチル化の有無を測定する方法としては、例えば、以下の３種類の方法を挙げることができる。 Examples of methods for measuring the presence or absence of methylation of chromosomal DNA subjected to bisulfite treatment such as sodium bisulfite in this way include the following three methods.
第一の方法は、重亜硫酸塩処理を行ったDNAを鋳型にし、メチル化特異的プライマー、又は非メチル化特異プライマーを用いてそれぞれPCRを行い、各増幅産物の量を比較することによりメチル化頻度を検出する方法である。この方法は、一般にメチル化特異的ＰＣＲ法とも呼ばれ、Hermanら(Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 9821-9826, 1996)によって報告されている方法である。 In the first method, bisulfite-treated DNA is used as a template, methylation-specific primers or unmethylated-specific primers are used for PCR, and methylation is performed by comparing the amounts of each amplification product. This is a method of detecting the frequency. This method is generally called a methylation-specific PCR method, and is a method reported by Herman et al. (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 9821-9826, 1996).
メチル化特異的ＰＣＲ法においては、メチル化特異的プライマーとして、解析対象であるCGIのシトシンを含む配列又はその相補配列を有するプライマーを用いる。一方、非メチル化特異的プライマーとして、解析対象であるCGIのシトシンを含む配列又はその相補配列において、該シトシンがチミンに置換された配列を有するプライマー（Forward Primer）又はメチル化部位のシトシンに対応するグアニンがアデニンに置換された配列を有するプライマー（Reverse Primer）を用いる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの3'末端近傍にCGI中のシトシンを含むように設計することが好ましい。また、解析を容易にするために、プライマーの一方を標識してもよい。 In the methylation-specific PCR method, a primer having a sequence containing CGI cytosine to be analyzed or a complementary sequence thereof is used as a methylation-specific primer. On the other hand, as a non-methylation specific primer, it corresponds to a primer (Forward Primer) having a sequence containing cytosine of CGI to be analyzed or a complementary sequence thereof, wherein the cytosine is replaced with thymine, or a cytosine at a methylation site A primer (Reverse Primer) having a sequence in which guanine to be substituted for adenine is used. Such a primer is preferably designed to contain cytosine in CGI near the 3 ′ end of the primer in order to increase the specificity of methyl and non-methyl. Further, in order to facilitate analysis, one of the primers may be labeled.
PCRは通常の遺伝子増幅に用いる条件で行うことができる。例えば、94℃、30秒次いで5
5〜65℃、60秒さらに72℃、45秒のサイクルを40サイクル行う条件で行うことができる。ただし、各遺伝子について最適条件を検討することがより好ましい。上記PCRにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合には、解析対象とするシトシンがメチル化されているDNAが増幅される。一方、非メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないDNAが増幅される。したがって、これらの増幅産物の量を検出し、その量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化頻度を調べることができる。検出は、例えば、増幅産物について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動行い、泳動後のゲルをエチジウムブロミドなどで染色することにより行うことができる。また、ＤＮＡ染色の代わりに予め蛍光物質などで標識されたプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の量を標識物質由来の蛍光強度などにより検出することもできる。
PCR can be performed under the conditions used for normal gene amplification. For example, 94 ° C, 30 seconds, then 5
It can be performed under the condition of 40 cycles of 5 to 65 ° C., 60 seconds, and further 72 ° C. and 45 seconds. However, it is more preferable to examine optimum conditions for each gene. In the PCR, in the case of PCR using a methylation specific primer, DNA in which cytosine to be analyzed is methylated is amplified. On the other hand, in the case of PCR using unmethylated specific primers, DNA in which cytosine to be analyzed is not methylated is amplified. Therefore, the methylation frequency of the target cytosine can be examined by detecting the amounts of these amplification products and comparing the amounts. The detection can be performed, for example, by performing polyacrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis on the amplification product, and staining the gel after electrophoresis with ethidium bromide or the like. Alternatively, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent substance or the like instead of DNA staining, and the amount of the amplified product can be detected based on the fluorescence intensity derived from the labeled substance.
さらに、メチル化頻度測定の定量性を高めるために、定量PCRを行うことが好ましい。定量PCRとは、まず、メチル化シトシンを含むDNAを定量するための標準DNA及び非メチル化シトシンを含むDNAを定量するための標準DNAを所定量用意し、被験DNA及び上記標準DNAを鋳型にしてPCRをそれぞれ行う。そして、被験DNAを用いて増幅されたPCR産物の量を、標準DNAを用いて増幅されたPCR産物の量と比較することによって、被験DNA中に含まれる目的配列の量を算出する。メチル化シトシンを含むDNAを定量するための標準DNAとは、メチル化部位がシトシンのままであるDNAをいい、非メチル化シトシンを含むDNAを定量するための標準DNAとは、メチル化部位がチミンとなったDNAをいう。このような標準DNAとしては、メチル化用プライマーを用いて増幅されたDNAが組み込まれたプラスミド又は非メチル化用プライマーを用いて増幅されたDNAが組み込まれたプラスミドなどを使用することができる。所定量のDNAとしては、例えば、標準DNAまたは被験DNAを含む溶液を、それぞれ1,10,100,1000,10000倍に希釈した溶液を用意し、それぞれ鋳型として反応液に加えることができる。増幅産物の量の確認は、例えば、電気泳動で行うこともできるが、いわゆるリアルタイムPCRにより行うことが好ましい。リアルタイムPCRに使用する装置としては、iCycler Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories）などが挙げられ、検出試薬としてはSYBR Green PCR Core Reagents（PE Biosystems）などが挙げられる。 Furthermore, it is preferable to perform quantitative PCR in order to improve the quantitativeness of methylation frequency measurement. Quantitative PCR means first preparing a predetermined amount of standard DNA for quantifying DNA containing methylated cytosine and standard DNA for quantifying DNA containing unmethylated cytosine, and using the test DNA and the standard DNA as a template. Perform PCR each time. Then, the amount of the target sequence contained in the test DNA is calculated by comparing the amount of the PCR product amplified using the test DNA with the amount of the PCR product amplified using the standard DNA. Standard DNA for quantifying DNA containing methylated cytosine refers to DNA in which the methylated site remains cytosine, and standard DNA for quantifying DNA containing unmethylated cytosine is a methylated site. The DNA that became thymine. As such standard DNA, a plasmid in which DNA amplified using a methylation primer is incorporated, a plasmid in which DNA amplified using a non-methylation primer is incorporated, or the like can be used. As the predetermined amount of DNA, for example, solutions containing standard DNA or test DNA diluted 1,10,100,1000,10000 times, respectively, can be prepared, and each can be added as a template to the reaction solution. The amount of the amplification product can be confirmed by, for example, electrophoresis, but is preferably performed by so-called real-time PCR. Examples of the apparatus used for real-time PCR include iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories), and examples of detection reagents include SYBR Green PCR Core Reagents (PE Biosystems).
以上のようにしてメチル化特異的PCR法でメチル化頻度を測定する場合は、メチル化DNAの増幅産物の量の、メチル化DNAの増幅産物及び非メチル化DNAの増幅産物の量の総和に対する割合をメチル化頻度とすることができる。 When the methylation frequency is measured by the methylation-specific PCR method as described above, the amount of the amplified product of the methylated DNA with respect to the total amount of the amplified product of the methylated DNA and the amplified product of the unmethylated DNA. The ratio can be the methylation frequency.
以下に、PCDHB16遺伝子の場合、メチル化特異的ＰＣＲに用いるためのプライマーを例示する。これらのプライマーは、PCDHB２〜１８遺伝子において配列が保存されている領域に設定されているため、PCDHB２〜１８遺伝子のCGIのシトシンのメチル化を同時に測定することができる。また、これらのプライマーは重亜硫酸塩処理により、メチル化されていないシトシンがチミン（ウラシル）に変換することを考慮して設計されている。
＜メチル化特異的プライマー＞
M1：5'- aatggcgagg tgcgtatc -3'（配列番号２）
M2：5'-aacgtaacga taaccgaacg -3'（配列番号３）
＜非メチル化特異的プライマー＞
UM1：5'- tataatggtg aggtgtgtat t -3'（配列番号４）
UM2：5'-caacataaca ataaccaaac a -3'（配列番号５）
In the case of the PCDHB16 gene, primers for use in methylation-specific PCR are exemplified below. Since these primers are set in a region where the sequence is conserved in the PCDHB2-18 gene, it is possible to simultaneously measure cytosine methylation of CGI of the PCDHB2-18 gene. In addition, these primers are designed in consideration of conversion of unmethylated cytosine to thymine (uracil) by bisulfite treatment.
<Methylation specific primer>
M1: 5'-aatggcgagg tgcgtatc-3 '(SEQ ID NO: 2)
M2: 5'-aacgtaacga taaccgaacg-3 '(SEQ ID NO: 3)
<Unmethylated specific primer>
UM1: 5'-tataatggtg aggtgtgtat t-3 '(SEQ ID NO: 4)
UM2: 5'-caacataaca ataaccaaac a -3 '(SEQ ID NO: 5)
メチル化頻度解析の第二の方法としては、重亜硫酸塩処理を行ったDNAについて、塩基配列を直接的に解析する方法を挙げることができる。測定対象であるCGIのシトシンを含む断片をPCR法により直接シークエンスするか、または、ＰＣＲで得られた増幅産物をプラスミドに組み込んで、これを用いて当該ＤＮＡの塩基配列を解析してもよい。 As a second method of methylation frequency analysis, there can be mentioned a method of directly analyzing the base sequence of bisulfite-treated DNA. The CGI cytosine fragment to be measured may be directly sequenced by the PCR method, or the amplified product obtained by PCR may be incorporated into a plasmid and used to analyze the base sequence of the DNA.
直接シークエンス又はＰＣＲに用いるプライマーは、解析対象とするシトシンの５’側の塩基配列または３’側の塩基配列を基にして設計するとよい。プライマー設計のための塩基配列は、解析対象とするCGI中のシトシンを含まないように選定することが好ましい。そして、プライマー設計のために選定された塩基配列が、シトシンを全く含まない場合には、選定された塩基配列またはかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をプライマーの塩基配列とすることができる。また、プライマー設計のために選定された塩基配列がシトシンを含むが、これらがメチル化されるものではない場合には、これらシトシンがチミン（ウラシル）に変換されることを考慮してプライマーを設計する。即ち、全てのシトシンがチミン（ウラシル）となった塩基配列または該塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプライマーを設計する。なお、プライマー設計のために選定された塩基配列に、メチル化シトシンが含まれる場合には、メチル化を受けていないシトシンがチミン（ウラシル）に変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはチミン（ウラシル）に変換されないことを考慮してプライマーを設計する。この場合、上記のＰＣＲには、メチル化特異的プライマー対と非メチル化特異的プライマー対とを等量ずつ混合して用いることが好ましい。 Primers used for direct sequencing or PCR may be designed based on the 5′-side base sequence or 3′-side base sequence of cytosine to be analyzed. The base sequence for primer design is preferably selected so as not to contain cytosine in the CGI to be analyzed. If the base sequence selected for primer design does not contain cytosine at all, the selected base sequence or a base sequence complementary to the base sequence can be used as the primer base sequence. . In addition, if the base sequence selected for primer design contains cytosine, but these are not methylated, the primer is designed taking into account that these cytosines are converted to thymine (uracil). To do. That is, a primer having a base sequence in which all cytosines are thymine (uracil) or a base sequence complementary to the base sequence is designed. If the base sequence selected for primer design contains methylated cytosine, unmethylated cytosine is converted to thymine (uracil) and methylated cytosine is Primers are designed considering that they are not converted to thymine (uracil). In this case, it is preferable to mix and use an equal amount of a methylation specific primer pair and an unmethylation specific primer pair for the PCR.
シークエンスは常法に従って行うことができる。シークエンスによって得られる各塩基を示す波形データにおいて、解析対象とするシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ウラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。 The sequence can be performed according to a conventional method. In the waveform data showing each base obtained by sequencing, the area of the peak showing cytosine detected at the position corresponding to the cytosine to be analyzed is compared with the area of the peak showing thymine (uracil), and the analysis object The frequency of cytosine methylation can be measured.
第三の方法として、重亜硫酸塩処理を行ったDNAについて、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブをハイブリダイゼーションさせ、前記ＤＮＡと当該プローブとの結合の有無を調べる方法を挙げることもできる。 A third method is a method in which a DNA that has been subjected to bisulfite treatment is hybridized with a probe that can identify the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed, and the presence or absence of binding between the DNA and the probe is examined. It can also be mentioned.
メチル化の有無を識別可能なプローブとして、メチル化用と非メチル化用の2種類のプローブを用いることができる。メチル化用プローブは、解析対象とするシトシンを含む塩基配列において、メチル化部位のシトシンはシトシンのままで、メチル化部位以外のシトシンはチミン（ウラシル）に変換された配列を有する核酸プローブである。一方、非メチル化用プローブとしては、解析対象とするシトシンを含む塩基配列において、メチル化部位も含めて全てのシトシンがチミン（ウラシル）に変換された配列を有する核酸プローブである。プローブはオリゴヌクレオチドプローブでもよいし、RNAプローブでもよい。尚、このようなプローブは、ＤＮＡとプローブとの結合の有無についての解析を容易にするためにビオチンや蛍光物質などで標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じて担体上に固定して用いてもよいが、この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出された染色体ＤＮＡを予め標識しておくとよい。 Two types of probes for methylation and unmethylation can be used as probes that can identify the presence or absence of methylation. The probe for methylation is a nucleic acid probe having a sequence in which cytosine at the methylation site remains cytosine and cytosine other than the methylation site is converted to thymine (uracil) in the base sequence containing cytosine to be analyzed. . On the other hand, the non-methylated probe is a nucleic acid probe having a sequence in which all cytosines including methylated sites are converted to thymine (uracil) in the base sequence containing cytosine to be analyzed. The probe may be an oligonucleotide probe or an RNA probe. Such a probe may be used after being labeled with biotin, a fluorescent substance or the like in order to facilitate analysis of the presence or absence of binding between DNA and the probe. In addition, the probe may be used by being immobilized on a carrier in accordance with a normal method. In this case, it is preferable to label chromosomal DNA extracted from a mammal-derived specimen in advance.
ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., ManiatisT.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下に行われる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量と、非メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。 Hybridization is carried out in the usual manner described in, for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press. It can be done according to this. Hybridization is usually performed under stringent conditions. Here, “stringent conditions” refers to, for example, the usual washing conditions for Southern hybridization at 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% A condition for hybridization at a salt concentration corresponding to SDS is mentioned. After such hybridization, the frequency of cytosine methylation to be analyzed is compared by comparing the amount of DNA binding to the methylation-specific probe with the amount of DNA binding to the non-methylation-specific probe. Can be measured.
また、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（bisulfite）を用いずに解析する方法として、ＤＮＡをシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素を用いて解析する方法が
挙げられる。当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」（以下、メチル化感受性制限酵素と記すこともある。）とは、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該DNAは切断されず、一方、認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該DNAは切断される。この違いを利用してメチル化を検出することができる。メチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII（ccgg）、BstUI（cgcg）等を挙げることができる。
Moreover, as a method for analyzing without using bisulfite such as sodium bisulfite, there is a method for analyzing DNA using a restriction enzyme that can identify the presence or absence of cytosine methylation. The “restriction enzyme capable of distinguishing the presence or absence of cytosine methylation” (hereinafter sometimes referred to as a methylation-sensitive restriction enzyme) used in the method means that a recognition sequence containing methylated cytosine is not digested. Means a restriction enzyme capable of digesting a recognition sequence containing unmethylated cytosine. When the cytosine contained in the recognition sequence is methylated, the DNA is not cleaved by the action of a methylation sensitive restriction enzyme, whereas the cytosine contained in the recognition sequence is not methylated When the methylation sensitive restriction enzyme is allowed to act, the DNA is cleaved. This difference can be used to detect methylation. Specific examples of the methylation sensitive enzyme include HpaII (ccgg), BstUI (cgcg), and the like.
具体的な方法としては、染色体DNAを上記制限酵素で消化した後、この制限酵素消化物を鋳型に、制限酵素認識部位の前後に設定したプライマーを用いてPCRを行い、増幅の有無を調べる方法を挙げることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。また、当該制限酵素による消化の有無は、消化後にサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたＤＮＡの長さを調べてもよい。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には制限酵素で切断されず、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長いＤＮＡが検出される。検出された長いＤＮＡの量と短いＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。さらに、メチル化部位の前後に設定したプライマーを用いたPCRで増幅した後、増幅産物を制限酵素で消化し、PCR産物の長さにより解析する方法も挙げることができる。 As a specific method, after digesting chromosomal DNA with the above restriction enzyme, PCR is performed using the restriction enzyme digested product as a template and primers set before and after the restriction enzyme recognition site to examine the presence or absence of amplification. Can be mentioned. When cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, when the cytosine to be analyzed is not methylated, an amplification product cannot be obtained. In addition, the presence or absence of digestion with the restriction enzyme may be examined by performing Southern hybridization after digestion to determine the length of the hybridized DNA. When cytosine to be analyzed is methylated, it is not cleaved by a restriction enzyme, and a longer DNA is detected than when cytosine is not methylated. By comparing the amount of detected long DNA and the amount of short DNA, the frequency of cytosine methylation to be analyzed can be measured. Furthermore, after amplification by PCR using primers set before and after the methylation site, the amplified product is digested with a restriction enzyme and analyzed by the length of the PCR product.
例えば、PCDHB16遺伝子の場合、GenBank Accession No. NG_000017の塩基配列において塩基番号151811、152302などで示されるシトシンはHpaIIの認識配列に含まれており、上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。 For example, in the case of the PCDHB16 gene, cytosine represented by base numbers 151811 and 152302 in the base sequence of GenBank Accession No. NG_000017 is included in the recognition sequence of HpaII, and the methylation frequency of the cytosine is measured by the above method. Can do.
本発明の方法においては、上記のような方法により求めたメチル化頻度に基いて、神経芽細胞腫の予後を判定する。正確に判定するためには、あらかじめ、測定対象のシトシンについて、予後良好または予後不良と判定するメチル化頻度の基準を数値化しておくことが好ましい。その上で、該基準値と、測定値とを比較し、被験哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定することができる。例えば、配列番号２〜５のプライマーを用いたメチル化特異的PCRにより、PCDHB16遺伝子のシトシンのメチル化頻度を判定に使用する場合、６０％以上のメチル化頻度であれば予後不良、それ未満であれば予後良好と判定することができる。また、被験哺乳動物のメチル化頻度を、健常な哺乳動物又は予後良好群の哺乳動物のメチル化頻度と比較することにより予後を判定してもよい。予後は、例えば、神経芽細胞腫が自然退縮する予後良好群、または、数ヶ月または1年以内に死亡する予後不良群に判定することができるが、神経芽細胞腫の臨床の各ステージに分類されるように判定してもよい。 In the method of the present invention, the prognosis of neuroblastoma is determined based on the methylation frequency obtained by the method as described above. In order to make an accurate determination, it is preferable to quantify in advance a methylation frequency criterion for determining whether cytosine to be measured is good prognosis or poor prognosis. In addition, the reference value and the measured value can be compared to determine the prognosis of the test mammal's neuroblastoma. For example, when the methylation frequency of cytosine of the PCDHB16 gene is used for determination by methylation-specific PCR using the primers of SEQ ID NOs: 2 to 5, if the methylation frequency is 60% or more, the prognosis is poor. If there is, it can be determined that the prognosis is good. Further, the prognosis may be determined by comparing the methylation frequency of the test mammal with the methylation frequency of a healthy mammal or a mammal in a good prognosis group. The prognosis can be determined, for example, as a good prognosis group in which neuroblastoma spontaneously regresses or a poor prognosis group that dies within a few months or one year, but is classified into clinical stages of neuroblastoma. It may be determined so as to be performed.
本発明はまた、神経芽細胞腫の予後を判定するためのキットを提供する。本発明のキットは、上述したような神経芽細胞腫の予後不良群においてメチル化頻度の高いCGIの検出に用いることのできる、PCR用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含むキットを挙げることができる。PCR用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブとしては、上述したようなプロトカドヘリンβファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子、プロトカドヘリンαに属するタンパク質をコードする遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質をコードする遺伝子、DKFZp451I127遺伝子又はチトクロムp450 CYP26C1遺伝子に含まれるCpGアイランドのシトシンを含む配列を有するオリゴヌクレオチドなどを例示することができる。プライマー又はプローブの長さは特に制限されないが、１０〜５０ｍｅｒが好ましく、１５〜３５ｍｅｒがより好ましい。なお、プライマー又はプローブの
配列は、亜硫酸水素ナトリウム等によりメチル化されていないシトシンがチミン（ウラシル）に変換されることを考慮して決定する。プローブは検出のための標識物質が結合したものであってもよい。さらに、プローブは担体上に固定化された検出用チップであってもよい。本発明のキットをメチル化特異的PCR用とする場合は、プライマーのほかにポリメラーゼ等、PCR用試薬を含んでいてもよい。また、ハイブリダイゼーションキットとする場合は、プローブのほかに検出用の基質や酵素を含むものであってもよい。
The present invention also provides a kit for determining the prognosis of neuroblastoma. Examples of the kit of the present invention include a kit containing a PCR primer or a hybridization probe that can be used for detection of CGI having a high methylation frequency in the above-mentioned neuroblastoma poor prognosis group. PCR primers or hybridization probes include genes encoding proteins belonging to the protocadherin β family as described above, genes encoding proteins belonging to protocadherin α, genes encoding hepatocyte growth factor-like proteins, DKFZp451I127 Examples thereof include oligonucleotides having a sequence containing cytosine of a CpG island contained in a gene or cytochrome p450 CYP26C1 gene. The length of the primer or probe is not particularly limited, but is preferably 10 to 50 mer, more preferably 15 to 35 mer. The sequence of the primer or probe is determined considering that cytosine that is not methylated by sodium bisulfite or the like is converted to thymine (uracil). The probe may be bound with a labeling substance for detection. Further, the probe may be a detection chip immobilized on a carrier. When the kit of the present invention is used for methylation-specific PCR, PCR reagents such as polymerase may be included in addition to the primers. Further, when a hybridization kit is used, it may contain a detection substrate or enzyme in addition to the probe.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
神経芽細胞腫の臨床ステージは国際神経芽細胞腫分類（International Neuroblastoma Staging System）によって分類した。染色体DNAはOncogene 1999; vol.18:p1061-1066に記載の方法に従って抽出した。 The clinical stage of neuroblastoma was classified by the International Neuroblastoma Staging System. Chromosomal DNA was extracted according to the method described in Oncogene 1999; vol.18: p1061-1066.
＜予後不良群でメチル化頻度の高いCGIの単離＞
MS-RDA法（特開平11-146788号公報）を用いて、神経芽細胞腫の予後不良群でメチル化頻度の高いシトシンを含むフラグメントの取得を試みた。予後良好群の検体として、予後の良好な神経芽細胞腫5例から調製したプライマリー細胞を用いた。一方、予後不良群の検体としては、予後不良の神経芽細胞腫由来の5種類のセルライン（CHP134、IMR32、GAMB、NGP、TGW）を用いた。なお、これらの5種類のセルラインはJapanses Collection of Bioresources (Tokyo, Japan)又はAmerican Type Culture Collection (ATCC: Manassas, VA,米国)から入手した。
<Isolation of CGI with high methylation frequency in poor prognosis group>
Using the MS-RDA method (Japanese Patent Laid-Open No. 11-146788), an attempt was made to obtain a fragment containing cytosine with high methylation frequency in a group with poor prognosis of neuroblastoma. Primary cells prepared from 5 neuroblastoma patients with good prognosis were used as specimens in the good prognosis group. On the other hand, five types of cell lines (CHP134, IMR32, GAMB, NGP, TGW) derived from neuroblastoma with poor prognosis were used as samples in the poor prognosis group. These five cell lines were obtained from the Japanses Collection of Bioresources (Tokyo, Japan) or the American Type Culture Collection (ATCC: Manassas, VA, USA).
これらの細胞から単離した染色体DNAを用いてMS-RDA法を行った結果、神経芽細胞腫に特異的なフラグメントが96クローン得られた。これらの96クローンのうち、重複しない30クローンについて、BigDye Terminator kit（PE Biosystems, Foster City, CA）及びABI自動DNAシーケンサー（PE Biosystems）を用いて塩基配列を決定した。その結果、7クローンは、それぞれ、プロトカドヘリンβ１６（PCDHB16）遺伝子、プロトカドヘリンα１（PCDHA1）遺伝子、肝細胞増殖因子様タンパク質（HLP）遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、FLJ37440遺伝子、ジンクフィンガータンパク質297（ZNF297）遺伝子及びチトクロムp450 CYP26C1（CYP26C1）遺伝子に由来するものであった。これらは、それぞれ、GenBank Accession No. NG_000017の塩基番号151812〜152302、NG_000016の塩基番号52822〜53571、U37055の塩基番号6953〜7110、AC026779の塩基番号91325〜91745、AC092645の塩基番号73684〜74289、Z97183の塩基番号34892〜35447、AL358613の塩基番号11222〜11851に相当する配列であった（図１）。 As a result of performing MS-RDA using chromosomal DNA isolated from these cells, 96 clones specific to neuroblastoma were obtained. Of these 96 clones, 30 non-overlapping clones were sequenced using BigDye Terminator kit (PE Biosystems, Foster City, Calif.) And ABI automatic DNA sequencer (PE Biosystems). As a result, the 7 clones were protocadherin β16 (PCDHB16) gene, protocadherin α1 (PCDHA1) gene, hepatocyte growth factor-like protein (HLP) gene, DKFZp451I127 gene, FLJ37440 gene, zinc finger protein 297 (ZNF297) gene, respectively. And derived from the cytochrome p450 CYP26C1 (CYP26C1) gene. These are base numbers 151812 to 152302 of GenBank Accession No.NG_000017, base numbers 52822 to 53571 of NG_000016, base numbers 6953 to 7110 of U37055, base numbers 91325 to 91745 of AC026779, base numbers 73684 to 74289 of AC092645, Z97183, respectively. Sequence corresponding to nucleotide numbers 11492 to 11851 of AL358613 (FIG. 1).
＜メチル化特異的PCR(MS-PCR)によるメチル化頻度の解析＞
上記遺伝子のうち、PCDHB16、PCDHA1、HLP、DKFZp451I127、CYP26C1の5種類の遺伝子について、メチル化特異的PCRを行い、メチル化頻度と神経芽細胞腫の予後との相関を調べた。まず、上記MS-RDAによる解析に用いた5種類のプライマリー細胞及び5種類のセルラインから、染色体DNAを抽出した。次に、得られたDNAを、TEバッファー中で、亜硫酸水素ナトリウム（溶液中の濃度3M）を用いて一晩、55℃で処理した。
<Analysis of methylation frequency by methylation-specific PCR (MS-PCR)>
Among the above genes, methylation-specific PCR was performed on five types of genes, PCDHB16, PCDHA1, HLP, DKFZp451I127, and CYP26C1, to investigate the correlation between methylation frequency and neuroblastoma prognosis. First, chromosomal DNA was extracted from the five types of primary cells and the five types of cell lines used in the MS-RDA analysis. The resulting DNA was then treated overnight at 55 ° C. with sodium bisulfite (concentration 3M in solution) in TE buffer.
上記処理により得られたDNAを鋳型とし、各遺伝子について以下の表１の条件でMS-PCRを行った。 Using the DNA obtained by the above treatment as a template, each gene was subjected to MS-PCR under the conditions shown in Table 1 below.
これらのPCRによって増幅される領域は、PCDHB16遺伝子がGenBank Accession No. NG_000017の152547-152659又は152544-152660、PCDHA１遺伝子がGenBank Accession No. NG_000016の53686-53806又は53681-53807、HLP遺伝子がGenBank Accession No. U37055の6845-6940又は6840-6945、DKFZp451I27遺伝子がGenBank Accession No. AC026779の90988-91084又は90987-91094、CYP26C1遺伝子がGenBank Accession No. AL358613の11646-11759又は11643-11752である（図１に□で示した）。なお、上記プライマーはメチル化されていないシトシン（Ｃ）が亜硫酸水素ナトリウムによりチミン（ウラシル）（Ｔ／Ｕ）に変換されることを考慮して設計されたものである。さらに、上記PCDHB16遺伝子増幅用プライマーは、PCDHB２〜１５、17及び18遺伝子も同時に増幅するものであり、これらの遺伝子のシトシンも同時に解析することができる。また、上記PCDHA1遺伝子増幅用プライマーは、PCDHA２〜18遺伝子も同時に増幅するものであり、これらの遺伝子のシトシンも同時に解析することができる。 The regions amplified by these PCRs are as follows: PCDHB16 gene is GenBank Accession No. NG_000017 152547-152659 or 152544-152660, PCDHA1 gene is GenBank Accession No. NG_000016 53686-53806 or 53681-53807, and HLP gene is GenBank Accession No. U37055 6845-6940 or 6840-6945, DKFZp451I27 gene is GenBank Accession No. AC026779 90988-91084 or 90987-91094, CYP26C1 gene is GenBank Accession No. AL358613 11646-11759 or 11643-11752 (see FIG. 1) □) In addition, the said primer was designed in consideration that the unmethylated cytosine (C) is converted into thymine (uracil) (T / U) by sodium bisulfite. Furthermore, the PCDHB16 gene amplification primer also amplifies PCDHB2-15, 17 and 18 genes simultaneously, and cytosine of these genes can be analyzed simultaneously. The PCDHA1 gene amplification primer also amplifies PCDHA2-18 genes simultaneously, and cytosine of these genes can be analyzed simultaneously.
上記のメチル化特異的ＰＣＲを行った後、増幅産物を含むＰＣＲの反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物をエチジウムブロマイドにより染色して検出した。その結果、予後不良群において、PCDHB16遺伝子、PCDHA1遺伝子、HLP遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、及びCYP26C1遺伝子が高メチル化されていることがわかった（図２）。 After carrying out the above methylation-specific PCR, the PCR reaction solution containing the amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplification product was stained with ethidium bromide and detected. As a result, it was found that the PCDHB16 gene, PCDHA1 gene, HLP gene, DKFZp451I127 gene, and CYP26C1 gene were hypermethylated in the poor prognosis group (FIG. 2).
＜定量MS-PCRによる組織サンプルの解析＞
臨床ステージの異なる非再発性の神経芽細胞腫の102種類の組織サンプルについて、PCDHB16遺伝子（PCDHB2〜15,17,18も含む）、PCDHA1遺伝子（PCDHA2〜18も含む）、HLP遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、及びCYP26C1遺伝子のメチル化頻度を調べるために、それぞれ定量MS-PCRを行った。まず上記各組織サンプルから、染色体DNAを単離し、該DNAの亜硫酸水素ナトリウム処理を行った。
<Analysis of tissue samples by quantitative MS-PCR>
PCDHB16 gene (including PCDHB2-15,17,18), PCDHA1 gene (including PCDHA2-18), HLP gene, DKFZp451I127 gene, for 102 tissue samples of non-recurrent neuroblastoma of different clinical stages In order to examine the methylation frequency of the CYP26C1 gene, quantitative MS-PCR was performed. First, chromosomal DNA was isolated from each of the above tissue samples, and the DNA was treated with sodium bisulfite.
定量MS-PCRの鋳型には、被験サンプルとして、上記亜硫酸水素ナトリウム処理されたDNAを１０、１０２，１０３，１０４，１０５，１０６分子用いた。一方、標準サンプルとしては、あらかじめ表１のメチル化プライマー又は非メチル化プライマーで増幅して得たDNAをpGEM-T Easy Vector（Promega社）に組み込んだものを、それぞれ、メチル化用コントロール又は非メチル化用コントロールとして、１０、１０２，１０３，１０４，１０５，１０６分子用いた。プライマーは表１に記載したものを用いた。定量MS-PCRは、iCycle
r Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories）によって行い、SYBR Green PCR Core Reagents（PE Biosystems）を用いて検出した。被験サンプル中のメチル化CGIを含むDNA及び非メチル化CGIを含むDNAの分子数は、メチル化プライマー又は非メチル化プライマーによって得られた増幅産物の量を、それぞれメチル化用コントロール又は非メチル化用コントロールを鋳型にして得られた増幅産物の量と比較することにより算出した。メチル化DNAの増幅量／（メチル化DNAの増幅量＋非メチル化DNAの増幅量）の値を各遺伝子のメチル化頻度とした。
As a template for quantitative MS-PCR, 10, 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , and 10 6 molecules of the above-mentioned sodium bisulfite-treated DNA were used as test samples. On the other hand, as a standard sample, a DNA obtained by previously amplifying with a methylated primer or an unmethylated primer shown in Table 1 and incorporated into pGEM-T Easy Vector (Promega) was used as a control for methylation or non-respectively. As a control for methylation, 10, 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 and 10 6 molecules were used. The primers listed in Table 1 were used. Quantitative MS-PCR is iCycle
r Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories) was used and detected using SYBR Green PCR Core Reagents (PE Biosystems). The number of molecules of DNA containing methylated CGI and DNA containing unmethylated CGI in the test sample is determined based on the amount of amplification product obtained by the methylated primer or unmethylated primer. It was calculated by comparing with the amount of amplification product obtained using the control for the template as a template. The value of methylated DNA amplification amount / (methylated DNA amplification amount + unmethylated DNA amplification amount) was defined as the methylation frequency of each gene.
このメチル化頻度と神経芽細胞腫の臨床ステージとの相関を、図３にプロットした。その結果、上記5種類の遺伝子のメチル化頻度は神経芽細胞腫の臨床ステージと強い相関を示した。その中でも、PCDHB16遺伝子（P=1.2X10-16）及びCYP26C1遺伝子（P=2.9X10-15）が特に強い高い相関を示した。 The correlation between this methylation frequency and the clinical stage of neuroblastoma is plotted in FIG. As a result, the methylation frequency of the above five genes showed a strong correlation with the clinical stage of neuroblastoma. Among them, the PCDHB16 gene (P = 1.2 × 10 −16 ) and the CYP26C1 gene (P = 2.9 × 10 −15 ) showed a particularly strong high correlation.
上記102例のうちの生存情報が得られる94例について、PCDHB16遺伝子（PCDHB2〜15,17,18のメチル化頻度も同時に識別する）、PCDHA1遺伝子（PCDHA2〜18のメチル化頻度も同時に識別する）、HLP遺伝子、DKFZp451I127遺伝子、及びCYP26C1遺伝子の5種類の遺伝子のCGIのメチル化頻度と神経芽細胞腫患者の生存率との関係を調べた。すなわち、各遺伝子について、一定の境界値に基いて高メチル化群と低メチル化群に分け、医学の分野で広く使われているKaplan-Meier分析により、高メチル化群、低メチル化群それぞれについて、罹患期間と生存率の関係をプロットした。Kaplan-Meier分析はAabal Software（GigaWiz, Inc）を用いて行った。なお、高メチル化群と低メチル化群の境界値は、PCDHB16遺伝子が60%、PCDHA1遺伝子が90％、HLP遺伝子が30％、DKFZp451I127遺伝子が20％、CYP26C1遺伝子が30%と定めた。また、上記5種類の遺伝子のデータとともに、Sarteletらの文献（J Pathol, vol. 198, p83-91, 2002）又はNakagawaraらの文献（N Engl J Med, vol. 328, p847-854, 1993）に従って測定したN-mycの増幅レベル及びTrkAの発現レベルをプロットした。 Of the above 102 cases, survival information is obtained from 94 cases, PCDHB16 gene (PCDHB2-15,17,18 methylation frequency is also identified simultaneously), PCDHA1 gene (PCDHA2-18 methylation frequency is also identified simultaneously) The relationship between the frequency of CGI methylation of five genes, HLP gene, DKFZp451I127 gene, and CYP26C1 gene and the survival rate of neuroblastoma patients was investigated. In other words, each gene is divided into a hypermethylated group and a hypomethylated group based on a certain boundary value, and each of the hypermethylated group and the hypomethylated group is analyzed by Kaplan-Meier analysis widely used in the medical field. The relationship between disease duration and survival was plotted. Kaplan-Meier analysis was performed using Aabal Software (GigaWiz, Inc). The boundary values between the hypermethylated group and the hypomethylated group were determined to be 60% for the PCDHB16 gene, 90% for the PCDHA1 gene, 30% for the HLP gene, 20% for the DKFZp451I127 gene, and 30% for the CYP26C1 gene. In addition to the above five types of gene data, Sartelet et al. (J Pathol, vol. 198, p83-91, 2002) or Nakagawara et al. (N Engl J Med, vol. 328, p847-854, 1993) N-myc amplification level and TrkA expression level measured according to the above were plotted.
結果を図４に示す。上記5種類の遺伝子のいずれにおいても、高メチル化群と低メチル化群とでは、生存カーブが大きく異なることがわかった。特にPCDHB16遺伝子の高メチル化の危険率はN-mycのそれとほぼ同等であり、PCDHB16遺伝子のメチル化頻度測定により神経芽細胞腫を正確に予測できることがわかった。 The results are shown in FIG. In any of the above five genes, it was found that the survival curves differ greatly between the hypermethylated group and the hypomethylated group. In particular, the risk of hypermethylation of the PCDHB16 gene was almost the same as that of N-myc, and it was found that neuroblastoma can be accurately predicted by measuring the methylation frequency of the PCDHB16 gene.
本発明の方法により、神経芽細胞腫の予後を正確に予測することができる。判定結果に基いて治療方針を決定することができ、不必要な放射線治療や化学療法を避けることができる。 According to the method of the present invention, the prognosis of neuroblastoma can be accurately predicted. The treatment policy can be determined based on the determination result, and unnecessary radiotherapy and chemotherapy can be avoided.
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