JP3955379B2

JP3955379B2 - Adsorbent for removing hepatitis C virus, adsorber and adsorption method

Info

Publication number: JP3955379B2
Application number: JP07320098A
Authority: JP
Inventors: 英司荻野; 道雄野村; 司旭孝; 周一金子; 明人酒井
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2018-03-05
Also published as: JPH10323387A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液、血漿等の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去することにより、Ｃ型肝炎の治療を促進させるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材、この吸着材を用いた吸着装置、及び、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８９年、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡウイルスゲノムのクローン化が発表され（Ｑ．Ｌ．Ｃｈｏｏら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９（１９８９））、これを基に組換え体を用いたＣ型肝炎ウイルスの抗体の測定が可能となった。その結果、従来非Ａ非Ｂ型肝炎とされていた肝炎の殆どがＣ型肝炎であることが判明すると共に、現在本邦にはＣ型肝炎ウイルスのキャリアーが約２００万人、その内１４０万人が慢性肝炎、３０万人が肝硬変の罹病者であると推定されるようになってきた。（飯野四郎：消化器診療プラクティス２．Ｃ型肝炎，１１−１７（１９９３））。
【０００３】
また、厚生省の人口動態統計によれば、１９９２年の原発性肝癌による死亡者数は年間２．７万人と報告されている（平成４年人口動態統計．厚生省大臣官房統計情報部編，上巻，（１９９３））が、この約７割はＣ型肝炎ウイルス感染が原因となる肝細胞癌であり、慢性肝炎から肝硬変をへて発生するものと考えられてきている（Ｓ．Ｋａｎｅｋｏら；Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３７，１０８（１９９４）），松下栄紀ら；日本臨床５３，７２７（１９９５増刊））。従って、Ｃ型肝炎は肝硬変、肝細胞癌へと進む難治性の疾患と言える。
【０００４】
Ｃ型肝炎の治療は、従来安静療法、食事療法及び肝庇護剤や漢方薬を中心とした薬物療法が主なものであったが、これらの治療法では肝炎ウイルスを排除できないため、治癒例は極めて少なく、肝壊死の軽減による慢性肝疾患の進展抑制に主眼が置かれていた。従って、長期化に伴い最終的には前述のごとく、肝硬変や肝細胞癌へと不幸な転帰を迎える症例が多い。
【０００５】
一方、最近、インターフェロンの大量生産が可能となり、しかもこれらの蛋白質がＣ型肝炎ウイルスと近縁のＲＮＡ型ウイルスにもｉｎｖｉｔｒｏで抗ウイルス活性を示したのみならず（二宮康行ら；基礎と臨床，１９，２３１（１９８５））、ＲＮＡ型ウイルス感染マウスにおいても感染防御効果を示したことから（Ｍ．Ｋｒａｍｅｒら；Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ．，３，４２５（１９８３））、臨床でのＣ型肝炎に対する効果が期待された。
【０００６】
実際に、組換え型インターフェロン−αによる非Ａ非Ｂ型肝炎疾患への治療で血清トランスアミナーゼ値が正常化することが見い出され（Ｊ．Ｈ．Ｈｏｏｆｎａｇｅｌら；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５，１５７５（１９８６））、又Ｃ型肝炎患者への投与で、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが血中から持続的に陰性化する症例も認められたことから（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａら；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３，１０４０（１９９１）、萩原秀紀ら；日消誌，８８，１４２０（１９９１））、現在では広く臨床使用されるようになってきた。即ち、Ｃ型肝炎治療は従来の対症療法から原因療法へ大きく進歩したと言える。
【０００７】
しかしながら、本邦でこれまで数年間に実施した約２０万人のＣ型慢性活動性肝炎患者でのインターフェロン療法の治療成績では、ウイルスを排除し、治癒できたのは全体の約３０％程度であり、残り約７０％の患者では肝炎ウイルスが生き残り、無効又は再発の症例となっている（矢野右人；日本臨床，５３，９８６（１９９５増刊））。
【０００８】
この治療効果の可否には、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型、血液中のウイルス量、肝病変の進展度が重要な因子となっているが、中でも血液中のウイルス量が最も重要な因子となっている。例えば、患者の血液１ｍＬ中のウイルス量が１００万コピー未満の場合にはインターフェロンの投与で約８０％の患者の体内ウイルスが完全に排除でき、治癒したのに対し、１００万コピー以上の場合には９％程度の治癒例にしかならなかった（今関文夫ら；日本臨床，５３，１０１７（１９９５））。
【０００９】
また、上記ウイルス量に加えて、本発明者らは、血液中でのウイルス粒子の存在様式もインターフェロン治療効果に対して重要な因子となっていることを見い出した。即ち、Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、血液中ではその浮遊密度により、感染性の高い、軽い粒子と感染性の低い、重い粒子とに分類されることが報告されているが、この密度の異なるウイルス粒子と病態、インターフェロン治療との関係に注目し研究した結果、軽いウイルス粒子と重いウイルス粒子の患者血液中での存在比が１０対１の患者の場合、インターフェロン治療で７５％の患者に治癒例が認められるのに対し、１対１０の患者では１３％にしか治癒例は認められなかった。
【００１０】
更に軽いウイルス粒子は血液中のリポ蛋白と結合しており、重いウイルス粒子は免疫グロブリンと結合した免疫複合体型の粒子として存在していることも明らかとなった。（酒井明人ら；日消誌，９２（臨床増刊号），１４８８（１９９５））。
【００１１】
従って、現在のインターフェロン療法は、血液中のウイルス量が少ないほど、また免疫グロブリンと結合した免疫複合体型ウイルス量が少ないほど治療効果は高いが、血液中のウイルス量が高いほど、更には免疫複合体型ウイルス量が多いほど治癒効果は極めて低下するという問題点が明らかとなった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる問題に鑑み、インターフェロンの治療効果をより高めるために、患者血液中のＣ型肝炎ウイルス、特に免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを、効率良く選択的に吸着除去でき、かつ安全性に優れたＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を提供し、更に、この吸着材を用いた吸着装置及びＣ型肝炎ウイルスの吸着除去方法を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成せんとして、各種化合物を水不溶性担体に結合させ、患者血液と接触させることにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対しては高い吸着活性を有するが、アルブミン等の蛋白質に対しては吸着活性を有しない化合物を取得すべく、鋭意研究を進めてきた。その結果、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物、特に、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物を固定化した吸着材が、著しく優れたＣ型肝炎ウイルス吸着能を持つという事実を見い出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を水不溶性担体に固定化してなるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材である。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化してなる。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物としては、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着活性を有する化合物であれば特に限定されないが、より好ましくは、上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物である。
【００１５】
免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物として、より好ましいものは、Ｃ型肝炎ウイルスを吸着除去するにあたり、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスを優先的、かつ効率的に吸着除去できる化合物である。
【００１６】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、免疫グロブリン結合蛋白である。
上記免疫グロブリン結合蛋白として、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体等を挙げることができる。
【００１７】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体である。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、より好ましくは、上記免疫グロブリン結合蛋白及び／又は抗免疫グロブリン抗体の一部であり、かつ、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に対する結合部位を含有する蛋白断片若しくはペプチド、又は、それらの誘導体である。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、多孔質である。
【００１８】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍが好ましい。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、実質的に非多孔質であることである。また、上記水不溶性担体は、親水性であることが好ましい。
【００１９】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在する免疫複合体型ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
【００２０】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着装置は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が、液体の入口、出口を有する容器内に含まれており、そして上記Ｃ型肝炎ウイルス除去用吸着材の容器外への流出防止手段が備えられていることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材とＣ型肝炎ウイルスを含有する液体とを接触させる工程を含むことを特徴とするものである。
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法においては、上記Ｃ型肝炎ウイルスを含有する液体としては、例えば、血液、血漿、その他の体液等を挙げることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施形態を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
本発明に用いられるＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物とは、実質的にＣ型肝炎ウイルスを吸着する能力を有する化合物を言い、特定の化合物に限定されるものではないが、好ましくは、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質であることが好ましい。
【００２３】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質としては、例えば、免疫グロブリンＧの重鎖中のＦｃ領域に結合活性を有する、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体、又は軽鎖に結合活性を有するプロテインＬ等、一般に免疫グロブリン結合蛋白と称されている化合物（Ｌ．Ｂｊｏｒｃｋ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０，１１９４（１９８８），Ｈ．Ｇｏｍｉら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４０４６（１９９０），土居尚之：免疫臨床，２３，８９６，（１９９１））や抗免疫グロブリン抗体等を挙げることができる。
【００２４】
またこれらの化合物中の免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に実質的に結合活性を有する部分を断片化した化合物、例えば、プロテインＡの免疫グロブリン結合部位であり、５８アミノ酸からなるＡ〜Ｅドメインの各ペプチド（Ｍ．Ｕｈｌｅｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１９６５（１９８４））、プロテインＡのＢドメインペプチドを更に短くしたＦＢ２９ペプチド等（Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎら：ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪ．，６２，８７（１９９２））、プロテインＧの５５アミノ酸からなるＣ１〜Ｃ３ドメインの各ペプチド（Ｂ．Ｇｕｓｓら：ＥＭＢＯＪ．，５，１５６７（１９８６））、プロテインＨのＡドメインペプチド（Ｈ．Ｇｏｍｉら：上記文献）、プロテインＬのＢ１〜Ｂ５ドメインの各ペプチド（ビョルク，ラルスら：特表平７−５０６５７３）、補体Ｃ１ｑのＣＢＰ２ペプチド（Ｍ．Ａ．Ｂａｕｍａｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８４１４（１９９０））等、免疫グロブリン結合蛋白と称されている物質中の免疫グロブリン結合ドメインペプチド及びその誘導体等を挙げることができる。
【００２５】
またリウマチ因子又は抗免疫グロブリン抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ）₂、一本鎖Ｆｖポリペプチド等も代表例として挙げることができる。
【００２６】
本発明に用いる水不溶性担体としては特に限定されず、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機担体、更にはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合担体等を挙げることができる。
【００２７】
なかでも、親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が、６０度以下のものを意味する。
【００２８】
このような担体としては特に限定されず、例えば、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体等を挙げることができる。
【００２９】
なかでもＯＨ基が存在する担体は、吸着性能、選択性の点で優れており、更に、多孔質セルロースゲルは、以下の（１）〜（４）等の優れた点を有しており、本発明の水不溶性担体として最も好ましいものの一つである。
【００３０】
（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため、撹拌等の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合、体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まりしたりせず、更に細孔構造であるため高圧蒸気滅菌等をした場合でも変化を受けにくい。
【００３１】
（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない。
（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる。
（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高い。
【００３２】
上記水不溶性担体は、それぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
本発明に用いる水不溶性担体としては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材の使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有するもの、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００３３】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍであることが好ましい。Ｃ型肝炎ウイルスは、その直径が５０〜５５ｎｍからなる粒子であり、多孔質性の担体でウイルス粒子をより効率良く吸着するためには、細孔の孔径分布がウイルス粒子の直径よりも大きい孔径側に幅広く分布していることが好ましいが、大きすぎる場合には担体の強度が低下し、また表面積が減少する。より好ましい平均孔径は、５０〜１２５０ｎｍである。
【００３４】
一方、細孔を有しない、実質的に非多孔質の担体においてもウイルスの吸着は可能である。この場合、体液（血液、血漿、血清等）中の蛋白質等の生体にとっての有用成分が細孔内に入ることができないため、ほとんど吸着されないという利点を有しており、利用可能である。
実質的に非多孔質とは、多孔質であっても細孔直径が非常に小さい（例えば、１０ｎｍ未満）細孔を有する多孔質担体も含まれる趣旨である。
【００３５】
上記水不溶性担体の多孔構造については、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上であり、比表面積が３ｍ²／ｇ以上であることが好ましい。
【００３６】
上記水不溶性担体の形態としては特に限定されず、例えば、ビーズ状、線維状、膜状（中空糸も含む）等を挙げることができるが、体外循環時の体液の流通面より、ビーズ状が特に好ましく用いられる。上記ビーズ状の担体の平均粒径は、１０〜２５００μｍのものが使いやすいが、２５〜８００μｍのものが好ましく用いられる。
【００３７】
上記水不溶性担体の表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。
上記官能基の代表例としては特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基等を挙げることができる。
【００３８】
上記水不溶性担体は、硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着体として使用するためには、カラムに充填し、通液する際等に目詰まりを生じないことが重要であり、そのために充分な機械的強度が要求されるので、上記水不溶性担体は、硬質担体であることがより好ましい。
【００３９】
本明細書中で、硬質担体とは、例えば粒状ゲルの場合、以下の条件でゲルをガラス製円筒状カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｎｍ）に均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失（ΔＰ）と流量の関係が、０．３ｋｇ／ｃｍ²まで直線関係にあるものをいう。
【００４０】
例えば、両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒状カラム（内径９ｎｍ、カラム長１５０ｎｍ）にアガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東洋曹達工業社製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１０００μｍ）及びセルロースゲル（チッソ社製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失（ΔＰ）との関係を求めた（図１）。
【００４１】
縦軸に流速（ｃｍ／分）を、横軸に圧力損失（ｋｇ／ｃｍ²）をプロットした。図１において、○はトヨパールＨＷ−６５、△はセルロファインＧＣ−７００ｍ、黒ぬりの○はＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍを示す。
【００４２】
この結果、トヨパールトヨパールＨＷ−６５及びセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、Ｂｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかった。
【００４３】
本発明の水不溶性担体への免疫グロブリン結合蛋白又はペプチドの固定化においては、蛋白質又はペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、更に非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。
【００４４】
上記親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００４５】
上記水不溶性担体へ導入される免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物、及び、スペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用されるエポキシ反応、ニック塩基反応、カルボジイミド試薬等を用いた縮合反応、活性エステル反応、グルタルアルデヒド試薬等を用いた担体架橋反応等による固定化方法等を挙げることができる。
【００４６】
上記固定化にあたっては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が体外循環治療及び血液浄化に用いられ得る吸着材であることを考慮して、吸着材の滅菌時又は治療時に、蛋白類が水不溶性担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましく、例えば、以下のような方法等を挙げることができる。
【００４７】
（１）担体が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによってスクシンイミドオキシカルボニル基に置換して、蛋白質又はペプチドをアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）。
【００４８】
（２）担体が有するアミノ基又はカルボキシル基に、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬存在下で、蛋白質又はペプチドのカルボキシル基又はアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）。
（３）蛋白質又はペプチドをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）。
【００４９】
上記固定化にあたっては、蛋白類の脱離溶出を極力抑えるためには共有結合法により結合することが好ましい。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化した担体を、血液、血漿、血清等の体液と接触させて、体液中のＣ型肝炎ウイルスを吸着除去する方法としては、種々の方法を挙げることができ、例えば、以下の方法等を挙げることができる。
【００５１】
（１）体液を取り出してバック等に貯留し、これを吸着材に混合してＣ型肝炎ウイルスを吸着除去した後、吸着材を濾別してＣ型肝炎ウイルスが除去された体液を得る方法。
（２）体液の入口と出口とを有し、その出口に体液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法。
【００５２】
いずれの方法を用いてもよいが、（２）の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインでＣ型肝炎ウイルスを除去することが可能であり、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材はこの方法に適している。
【００５３】
Ｃ型肝炎ウイルスを吸着するＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を用いた本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置を、その概略断面図に基づき説明する。
図２中に示す容器７は、液体の流入口又は流出口１、液体の流出口又は流入口２、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材３、液体及び液体に含まれる成分は通過できるがＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は通過できない吸着材流出防止手段４及び５、並びに、カラム６を有する。
【００５４】
この容器の形状及び材質は特に限定されないが、好ましくは、例えば、容量２０〜４００ｍＬ程度、直径２〜１０ｃｍ程度の筒状容器が用いられる。
【００５５】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。
【００５６】
Ala;Ｌ−アラニン残基、Asp;Ｌ−アスパラギン酸残基、Asn;Ｌ−アスパラギン残基、Cys;Ｌ−システイン残基、Gln;Ｌ−グルタミン残基、Glu;Ｌ−グルタミン酸残基、Gly;Ｌ−グリシン残基、Ile;Ｌ−イソロイシン残基、Leu;Ｌ−ロイシン残基、Lys;Ｌ−リジン残基、Phe;Ｌ−フェニルアラニン残基、Thr;Ｌ−スレオニン残基、Trp;Ｌ−トリプトファン残基、Tyr;Ｌ−タイロシン残基、Val;Ｌ−バリン残基。
また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側に位置し、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【００５７】
実施例１
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＡ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルであるＧＣＬ−２０００ｍ（チッソ社製、球状タンパク質の排除限界分子量３００万）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００５８】
プロテインＡの固定化
プロテインＡ（シグマ社製) ４ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）０．５ｍＬに溶解し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に再調整、全量を１．０ｍＬとした（プロテインＡ溶液）。上記エポキシ活性化セルロースゲル１ｍＬにプロテイン溶液（全量）を加えて３７℃で１６時間振盪した後、充分量のＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄し、ＧＣＬ２０００ｍ−ＰｒｏｔｅｉｎＡを得た。
【００５９】
固定化量の定量
固定化反応直前と直後の反応溶液のプロテインＡ濃度をＨＰＬＣにより測定し、その反応率を算出することにより固定化量を求めた。その結果、プロテインＡ−ＧＣＬ２０００ｍの１ｍＬ当たり２．１ｍｇのプロテインＡが固定化されたことがわかった。
【００６０】
実施例２
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＧ）の固定化
実施例１のプロテインＡをプロテインＧ（ファルマシアＬＫＢ社製）に変えたほかは全く同様にプロテインＧを固定化したＧＣＬ２０００ｍ−ＰｒｏｔｅｉｎＧ（３．２ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００６１】
実施例３
多孔質担体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）へのプロテインＧの免疫グロブリンＧ結合ドメインの固定化
ペプチドの合成
Ｎ末端側にシステインを付加したプロテインＧのＣ３ドメインの５７残基よりなる配列を有するペプチドの合成を、ペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ４１７０型（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて固相合成法により以下のように行った。
【００６２】
Ｃ末端のグルタミンを結合した支持体であるＦｍｏｃ−グルタミンＮｏｖａＳｙｎＫＡ０．１ｍｍｏｌ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーに入力されている合成プログラムにより、Ｎ末端の方向に向かって順に、脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペプチド鎖を延長した。
すなわち、ピペリジンにより該アミノ酸が有するα−アミノ基の保護基である９−フロオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去を行ない、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄し、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとジイソプロピルエチルアミンで縮合反応を行ない、ＤＭＦで洗浄する操作を繰り返した。
【００６３】
アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ala 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asn(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asp(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Cys(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gln(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Glu(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gly 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ile 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Leu 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Lys(Boc ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Phe 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Thr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Trp 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Tyr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Val 、として用い、それらの使用量は基質に対して約５倍モル（０．５ｍｍｏｌ）量を、バイアル中で用いた。ここで、Trt 、OtBu、Boc 、及び、tBu は、それぞれトリチル基、tert−ブチルエステル、tert−ブチルオキシカルボニル基、及び、tert−ブチル基を表す。
【００６４】
脱保護基反応及びペプチド鎖の切断
全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得られた支持体を３Ｇ−３孔のグラスフィルター上でtert−アミルアルコール、酢酸及びジエチルエーテルを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって乾燥支持体を得た。バイアル中で、得られた支持体１ｇに、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍＬ、１，２−エタンジチオール２６０μＬ、及び、アニソール７８０μＬを加えて室温で１．５時間撹拌した。
【００６５】
その後、この混合物を３Ｇ−３孔のグラスフイルターで支持体と濾別し、この濾液を３５℃の温度下で減圧濃縮した。これに予め冷却しておいた無水ジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加えて撹拌し、次いで遠心分離し、沈殿した粗ペプチドを収集した。更に、この粗ペプチドを無水ジエチルエーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥し、目的とする粗精製ペプチドを得た。
【００６６】
ペプチドの精製
上記、粗精製ペプチドを０．１％ＴＦＡに溶解して、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、得られた濾液を高速液体クロマトグラフィーに供した。ＨＰＬＣは、ＭｏｄｅｌＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）を用い、カラムは逆相系のμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８（日本ミリポア．ウォーターズ社製）を用いた。移動相にはＡ液として０．１％ＴＦＡ水溶液を、Ｂ液として０．１％ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル／水を用い、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。
【００６７】
得られたクロマトピークの相当画分を分取した。分取を数回繰り返し、これを凍結乾燥することにより精製ペプチドを得た。得られたペプチドは、気相プロテインシークエンサー４７７型（アプライドバイオシステムズ社製）及び日立カスタムイオン交換樹脂を用いたアミノ酸分析により解析して、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のペプチドが得られていることを確認した。
【００６８】
ペプチドの固定化
上記ペプチドを、多孔質セファロース上に固定化することにより以下のようにして吸着材を製造した。セファーロースには、チオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。チオプロピルセファロース６Ｂ５０ｍｇに蒸留水５０ｍｌを加え、室温で１５分間放置して樹脂を膨潤させた。次いで、蒸留水を除去し、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液に置換した。
【００６９】
一方、上記精製ペプチド４ｍｇを、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液４００μＬに溶解し、膨潤させた上記チオプロピルセファロース６Ｂ１５０μＬを加えて、４℃で１２時間撹拌することにより、精製ペプチドを固定化した吸着材を得た。
【００７０】
更に、得られたペプチド固定化吸着材を吸引濾過し、濾液中のペプチド含量をＨＰＬＣによる絶対検量線法で定量することにより、担体上へのペプチドの固定化率を求めた。このペプチド固定化吸着材を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で充分に洗浄し、吸引濾過し、担体１ｍＬ当たり３．６ｍｇのペプチドを固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ−Ｃ３Ｐｐｔを得た。
【００７１】
実施例４
多孔質担体（Ｋａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＫ３Ｐ４７）の固定化
ＭＫ３Ｐ４７ペプチドの生産
下記の配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有するペプチドであるＭＫ３Ｐ４７ペプチドをコードするＤＮＡをｐＵＣＮＴベクター（特開平４−２１２６９２号公報）に５′側をNde I 、３′側をHind III のそれぞれ制限酵素サイトを利用して連結できるように設計して、合成した。合成したＤＮＡ配列を、配列表の配列番号３に記載した。
【００７２】
上記配列を有するＤＮＡを、制限酵素Nde I 及びHind III(宝酒造社製）消化によって開裂したｐＵＣＮＴベクターと、宝酒造社製ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２を用いて手順書に従って連結し、ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター（図３）を作製した。
【００７３】
公知の方法で、このｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターＤＮＡを、大腸菌ＨＢ１０１株（ｉｒｉｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を指標として形質転換体を選択した。
また、この形質転換体から常法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、遺伝子配列を解析することによってｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター設計通りのＤＮＡ配列を有していることを確認した。
【００７４】
次に、この形質転換体を６ＬのＬ−ブロス（５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのバクトトリプシン、５ｇ／Ｌのイーストエキストラクト）中で３７℃にて２０時間振盪培養し、菌体を遠心分離（日立ＲＰＲ９−２ローターを用い４℃で６０００ｒｐｍ、２０分間）にて回収した。
ここで得られた沈殿を３００ｍＬのＴＥ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ：ｐＨ７．５）に懸濁した上で、超音波破砕処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２５０を用いて氷中にて６分間３回）を施し、遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて上清を回収した。
【００７５】
ここで得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理を行った後、更に遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にてその上清３００ｍＬを回収した。この上清から高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＷａｔｅｒｓμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ５μ Ｃ１８３００Ａ１９．０×１５０ｍｍ）を用いて４０ｍｌのアセトニトリル溶液を流速５ｍｌ／分にて流してカラムを活性化した後、３００ｍＬのサンプルを同流速にて流し、０．１％ＴＦＡ＋６４％アセトニトリル溶液２００ｍＬにてカラムを洗浄、続いて０．１％ＴＦＡ＋４０％アセトニトリル溶液２００ｍＬにて目的のＭＫ３Ｐ４７ペプチドを溶出、分取した。
これをエバポレーターにて１００ｍＬに濃縮した上で凍結乾燥し、高純度精製標品として１．２ｇを取得した。
【００７６】
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量５００万以上の当社試作品Ｋａｃ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００７７】
ＭＫ３Ｐ４７の固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＫ３Ｐ４７の５０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＫａｃに変えたほかは全く同様にＭＫ３Ｐ４７を固定化したＫａｃ−ＭＫ３Ｐ４７（３０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００７８】
実施例５
多孔質担体（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
配列表の配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドＭＰ４７Ｃを生産した。
配列表の配列番号５に記載される配列を有するＤＮＡ（ＭＰ４７ＣをコードするＤＮＡ）をｐＵＣＮＴベクターに実施例４と同様の方法にて連結できるように設計して合成した。
【００７９】
上記配列を有するＤＮＡを実施例４と同様の方法でｐＵＣＮＴベクターに導入し、ｐＵＣＮＴＭＰ４７Ｃベクターを作製した。
更に実施例４と同様の方法で、大腸菌の形質転換体を作製、その６Ｌ培養を経て目的のペプチドの高純度精製標品１．３ｇを取得し、各種検討に使用した
【００８０】
セファクリルゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで細孔径が４００ｎｍであるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００（ファルマシアＬＫＢ社製) ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セファクリルゲルを得た。
【００８１】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの１０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをエポキシ活性化セファクリルゲルに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＳ１０００−ＭＰ４７Ｃ（７ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８２】
実施例６
実質的な非多孔質担体（Ｂａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量３万以下の試作品である非多孔質担体（Ｂａｃ）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００８３】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの３０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＢａｃに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＢａｃ−ＭＰ４７Ｃ（２０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８４】
実施例７
多孔質担体（ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）への抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）４ｇを１ｍＭのＨＣｌ水溶液少量で１５分間膨潤させ、１ｍＭのＨＣｌ水溶液で洗浄し、更にカップリングバッファー（ｐＨ８．３、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ₃）で洗浄した。
【００８５】
カップリングバッファー１ｍＬに抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体（バインディングサイト社製）をパパイン消化（ＰＩＥＣＥ社、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＦａｂＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ）したＦａｂ１ｍｇを溶解し、上記洗浄ゲルを添加して４℃で１６時間反応させた。
カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．３、０．２Ｍのグリシン、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ₃）を添加し室温で２時間反応した。
【００８６】
２種の後処理バッファー（ｐＨ４．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液）で交互に３回づつ洗浄し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−ＡｎｔｉＩｇＧＦａｂを得た。
【００８７】
実施例８
多孔質担体（トレシルトヨパール）への抗ＩｇＧ抗体の固定化
抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（バインディングサイト社製）１ｍｇをカップリングバッファー（０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの炭酸緩衝液) １ｍＬに溶解し、ＡＦ−トレシルトヨパール６５０を乾燥状態で２００ｍｇ添加して４℃で終夜反応させた。
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液）を添加し、室温で２時間反応した。
更に０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−ＡｎｔｉＩｇＧを得た。
【００８８】
実施例９
合成した吸着体のＣ型肝炎ウイルス吸着能評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００８９】
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着能測定
その後この懸濁液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、上清中のＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶＲＮＡとして測定した（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）。
【００９０】
対照実験として、吸着体の代わりに生理食塩水１００μＬをバイアル中に採取し、上記と同様な処理をした後、溶液中のＣ型肝炎ウイルス量を求めた。
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着率（％）は、以下の式により算出した。
吸着率（％）＝ [（Ｖｒ−Ｖｔ）／Ｖｒ］×１００
Ｖｒ：対照実験溶液中のウイルス濃度
Ｖｔ：吸着実験上清中のウイルス濃度
結果を表１に示した。
【００９１】
【表１】

【００９２】
実施例１０
合成した吸着体の評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００９３】
高比重／低比重ＨＣＶウイルスの測定
吸着実験で得られたＨＣＶ浮遊液及び吸着体の代わりに生理食塩水で同様な処理を行ったＨＣＶ浮遊液に抗ＬＤＬ抗体、抗ＩｇＧ抗体と混合し４℃で１６時間反応して５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、沈殿物を回収しＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶＲＮＡとして測定し（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）、抗ＬＤＬ抗体により沈殿したＨＣＶを低比重、抗ＩｇＧ抗体により沈殿したＨＣＶを高比重ＨＣＶとしてそれらのＨＣＶＲＮＡ比（Ｔ／Ｂ＝低比重ＨＣＶ／高比重ＨＣＶ）を求めた。
結果を表２に示した。
【００９４】
【表２】

【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、上記実施例から明らかなとおり、体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去する能力、及び／又は、低比重ＨＣＶウイルスに対する高比重のＨＣＶウイルスの割合を減少させる能力を有する新規な吸着材を提供することができる。また、上記吸着材を充填してなる体液処理装置を用いることによって、血液、血漿、血清等の非処理液中のＣ型肝炎ウイルスを選択的に除去することが可能である。
【００９６】
【配列表】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【図面の簡単な説明】
【図１】ガラス製円筒状カラムに各種水不溶性担体を充填したときの流量と圧力損失との関係を示す図である。縦軸は流量（ｃｍ／分）を、横軸は圧力損失（ｋｇ／ｃｍ²）を、それぞれ表す。
【図２】本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置示す概略断面図である。
【図３】ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターを示す図である。
【符号の説明】
１流出口
２流入口
３除去用吸着材
４，５吸着材流出防止手段
６カラム
７容器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an adsorbent for removing hepatitis C virus that promotes the treatment of hepatitis C by selectively adsorbing and removing hepatitis C virus present in body fluids such as blood and plasma. The present invention relates to an adsorbing apparatus and a method for adsorbing and removing hepatitis C virus.
[0002]
[Prior art]
In 1989, the cloning of the RNA virus genome of hepatitis C virus was announced (QL Choo et al .; Science, 244, 359 (1989)). Antibody measurement became possible. As a result, it became clear that most of the hepatitis conventionally considered as non-A non-B hepatitis was hepatitis C. Currently, there are about 2 million carriers of hepatitis C virus in Japan, of which 1.4 million Is estimated to be chronic hepatitis and 300,000 people suffering from cirrhosis. (Shiro Iino: Gastrointestinal Practice 2. Hepatitis C, 11-17 (1993)).
[0003]
According to the Ministry of Health and Welfare's demographic statistics, the number of deaths from primary liver cancer in 1992 was reported to be 27,000 per year (1992 Demographic Statistics. Ministry of Health and Welfare Minister's Secretariat Statistics Information Department, Volume 1). , (1993)), about 70% of these are hepatocellular carcinomas caused by hepatitis C virus infection and are thought to occur from chronic hepatitis to cirrhosis (S. Kaneko et al .; Intervirology). 37, 108 (1994)), Eiki Matsushita et al .; Japanese Clinical 53,727 (1995 extra edition)). Therefore, it can be said that hepatitis C is an intractable disease that progresses to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
[0004]
Conventional treatment of hepatitis C has mainly been rest therapy, dietary therapy, and pharmacotherapy centered on liver protectants and herbal medicines. However, there was little focus on suppressing the progression of chronic liver disease by reducing liver necrosis. Therefore, as mentioned above, as mentioned above, there are many cases that eventually have unfortunate outcomes to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
[0005]
On the other hand, recently, mass production of interferon has become possible, and these proteins have not only shown antiviral activity in vitro against RNA viruses closely related to hepatitis C virus (Yasuyuki Ninomiya et al .; , 19, 231 (1985)), since it also showed an infection-protecting effect in RNA-type virus-infected mice (M. Kramer et al .; J. Interferon Res., 3,425 (1983)), clinical hepatitis C The effect on was expected.
[0006]
Indeed, it has been found that treatment of non-A non-B hepatitis disease with recombinant interferon-α normalizes serum transaminase levels (JH Hoofnagel et al; N. Eng. J. Med., 315). , 1575 (1986)), and hepatitis C virus RNA was negatively expressed in blood continuously by administration to patients with hepatitis C (K. Chayama et al .; Hepatology, 13, 1040). (1991), Hidenori Sugawara et al .; Nissho Journal, 88, 1420 (1991)), and is now widely used clinically. That is, it can be said that hepatitis C treatment has greatly advanced from conventional symptomatic therapy to causal therapy.
[0007]
However, in the treatment results of interferon therapy in approximately 200,000 patients with chronic active hepatitis C that have been conducted in Japan for several years so far, about 30% of the patients were able to eliminate and cure the virus. In the remaining 70% of patients, the hepatitis virus survives and is invalid or relapsed (Yano right person; Japanese clinical, 53, 986 (1995 special edition)).
[0008]
Hepatitis C virus genotype, the amount of virus in the blood, and the degree of progression of liver lesions are important factors for the effectiveness of this therapeutic effect, but the amount of virus in the blood is the most important factor. Yes. For example, if the amount of virus in 1 mL of patient blood is less than 1 million copies, about 80% of the patient's virus in the patient can be completely eliminated by administration of interferon. Was only a cure of about 9% (Fumio Imazeki et al .; Japanese Clinic, 53, 1017 (1995)).
[0009]
In addition to the above viral load, the present inventors have found that the presence mode of virus particles in blood is also an important factor for the interferon therapeutic effect. That is, it is reported that hepatitis C virus particles are classified into highly infectious, light particles and low infectious, heavy particles according to their floating density in blood. As a result of paying attention to the relationship between particles, pathophysiology, and interferon treatment, when the ratio of light virus particles to heavy virus particles in the patient's blood is 10: 1, 75% of patients treated with interferon treatment However, only 13% of 1 to 10 patients had cured cases.
[0010]
It was also revealed that lighter virus particles are bound to lipoproteins in the blood, and that heavier virus particles are present as immune complex-type particles bound to immunoglobulin. (Akihito Sakai et al .; Nissho Magazine, 92 (Clinical Special Issue), 1488 (1995)).
[0011]
Therefore, the current interferon therapy has a higher therapeutic effect as the amount of virus in the blood is smaller and the amount of immune complex-type virus bound to immunoglobulin is higher, but as the amount of virus in the blood is higher, the immune complex is further increased. It became clear that there was a problem that the healing effect was greatly reduced as the amount of somatic virus increased.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such problems, the present invention is capable of efficiently and selectively adsorbing and removing hepatitis C virus, particularly immune complex hepatitis C virus in patient blood, in order to further enhance the therapeutic effect of interferon. It is an object of the present invention to provide an adsorbent for removing hepatitis C virus that is excellent in the above, and to provide an adsorber using the adsorbent and a method for adsorbing and removing hepatitis C virus.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have achieved high adsorbing activity against hepatitis C virus by binding various compounds to a water-insoluble carrier and contacting with patient blood. In order to obtain compounds that do not have adsorption activity, we have been diligently researching. As a result, hepatitis C is a highly superior adsorbent obtained by immobilizing a compound capable of adsorbing to hepatitis C virus, particularly a compound capable of binding to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex, on a water-insoluble carrier. The fact that it has the ability to adsorb viruses has been found and the present invention has been completed. That is, the present invention is an adsorbent for removing hepatitis C virus obtained by immobilizing a compound capable of adsorbing hepatitis C virus on a water-insoluble carrier.
The present invention is described in detail below.
[0014]
The adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention is formed by immobilizing a compound having an ability to adsorb hepatitis C virus on a water-insoluble carrier.
The compound capable of adsorbing to the hepatitis C virus is not particularly limited as long as it is a compound capable of adsorbing to the hepatitis C virus, but more preferably, the compound capable of adsorbing to the hepatitis C virus is an immunity. It is a compound having binding activity to globulin and / or immunoglobulin complex.
[0015]
More preferable compounds having adsorption ability to hepatitis C virus to which immunoglobulin and / or immunoglobulin complex are bound are those that bind to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex when adsorbing and removing hepatitis C virus. It is a compound that can preferentially and efficiently adsorb and remove hepatitis C virus.
[0016]
More preferably, the compound having binding activity to the immunoglobulin and / or immunoglobulin complex is an immunoglobulin binding protein.
Examples of the immunoglobulin binding protein include protein A, protein G, protein H, protein L, protein M, rheumatoid factor, complement, and the like.
[0017]
The compound having binding activity to the immunoglobulin and / or immunoglobulin complex is more preferably an anti-immunoglobulin antibody.
More preferably, the compound capable of adsorbing to the hepatitis C virus is a part of the immunoglobulin binding protein and / or anti-immunoglobulin antibody, and has a binding site for immunoglobulin and / or immunoglobulin complex. It is a protein fragment or peptide contained, or a derivative thereof.
One preferable form of the water-insoluble carrier is porous.
[0018]
The average pore size of the porous water-insoluble carrier is preferably 10 to 1500 nm.
One preferred form of the water-insoluble carrier is substantially non-porous. The water-insoluble carrier is preferably hydrophilic.
[0019]
The adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention can be used for adsorbing and removing hepatitis C virus present in blood, plasma, and other body fluids.
The adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention can be used for adsorbing and removing immune complex viruses present in blood, plasma and other body fluids.
[0020]
The hepatitis C virus adsorbing apparatus of the present invention includes the adsorbent for removing hepatitis C virus described above in a container having a liquid inlet and outlet, and for removing the hepatitis C virus. A means for preventing the adsorbent from flowing out of the container is provided.
[0021]
The method for adsorbing hepatitis C virus of the present invention comprises a step of contacting any of the adsorbents for removing hepatitis C virus described above with a liquid containing hepatitis C virus.
In the hepatitis C virus adsorption method of the present invention, examples of the liquid containing the hepatitis C virus include blood, plasma, and other body fluids.
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the following descriptions.
The compound having the ability to adsorb hepatitis C virus used in the present invention refers to a compound having an ability to substantially adsorb hepatitis C virus, and is not limited to a specific compound, A substance that specifically binds to a heavy chain portion or a light chain portion in an immunoglobulin and / or an immunoglobulin complex is preferable.
[0023]
Examples of the substance that specifically binds to the heavy chain portion or the light chain portion in the immunoglobulin and / or immunoglobulin complex include, for example, protein A having binding activity to the Fc region in the heavy chain of immunoglobulin G, Compounds generally referred to as immunoglobulin binding proteins such as protein G, protein H, protein M, rheumatoid factor, complement, or protein L having binding activity to the light chain (L. Bjorck: J. Immunol., 140, 1194 (1988), H. Gomi et al .: J. Immunol., 144, 4046 (1990), Naoyuki Doi: Immunoclinical, 23, 896, (1991)) and anti-immunoglobulin antibodies.
[0024]
Further, compounds obtained by fragmenting a portion having a binding activity substantially to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex in these compounds, for example, protein A immunoglobulin binding site, and 58 to AE domains (M. Uhlen et al .: J. Biol. Chem., 259, 1965 (1984)), FB29 peptide in which the B domain peptide of protein A is further shortened (JS Huston et al .: Biophysical J., 62). , 87 (1992)), C1-C3 domain peptides consisting of 55 amino acids of protein G (B. Guss et al .: EMBO J., 5, 1567 (1986)), A domain peptide of protein H (H. Gomi et al.). : The above literature), each peptide of the B1-B5 domain of protein L (Bjork, Lars et al .: JP 7-506573), CBP2 peptide of complement C1q (MA Baumann et al .: J. Biol. Chem., 265, 18414 (1990)), etc. Examples thereof include immunoglobulin binding domain peptides and derivatives thereof.
[0025]
Also, rheumatoid factor or anti-immunoglobulin antibody Fab, F (ab)₂Single chain Fv polypeptides and the like can also be mentioned as representative examples.
[0026]
The water-insoluble carrier used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, and crosslinked. Examples include organic carriers composed of polysaccharides such as cellulose, cross-linked agarose, and cross-linked dextran, and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by combining these.
[0027]
Among these, a hydrophilic carrier is preferable because nonspecific adsorption is relatively small and adsorption selectivity of hepatitis C virus is good. The hydrophilic carrier as used herein means one having a contact angle with water of 60 degrees or less when the compound constituting the carrier is formed into a flat plate shape.
[0028]
Such a carrier is not particularly limited. For example, polysaccharides such as cellulose, chitosan, sepharose, dextran, polyvinyl alcohol, saponified ethylene-vinyl acetate copolymer, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, poly Examples include a carrier made of methyl methacrylate, polyacrylic acid grafted polyethylene, polyacrylamide grafted polyethylene, glass, and the like.
[0029]
Among them, the carrier having an OH group is excellent in terms of adsorption performance and selectivity, and the porous cellulose gel has excellent points such as the following (1) to (4), It is one of the most preferred as the water-insoluble carrier of the present invention.
[0030]
(1) Since the mechanical strength is relatively high and tough, it is unlikely to be broken or produce fine powder by operations such as stirring, and when packed in a column, it will be consolidated even if a body fluid flows at a high flow rate. It is not clogged, and it is less susceptible to changes even when sterilized by high-pressure steam because it has a pore structure.
[0031]
(2) Since the gel is composed of cellulose, it is hydrophilic, has many hydroxyl groups that can be used for ligand binding, and has little nonspecific adsorption.
(3) Since the strength is relatively high even if the pore volume is increased, an adsorption capacity not inferior to that of a soft gel can be obtained.
(4) Safety is higher than that of synthetic polymer gels.
[0032]
The water-insoluble carriers may be used alone or in admixture of any two or more.
The water-insoluble carrier used in the present invention preferably has a large surface area in view of the intended use and method of the adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention, and has a large number of pores of an appropriate size, It is preferably porous.
[0033]
The average pore size of the porous water-insoluble carrier is preferably 10 to 1500 nm. Hepatitis C virus is a particle having a diameter of 50 to 55 nm, and in order to more efficiently adsorb virus particles with a porous carrier, the pore size distribution is larger than the diameter of the virus particles. Although it is preferably distributed widely on the side, if it is too large, the strength of the carrier is lowered and the surface area is reduced. A more preferable average pore diameter is 50 to 1250 nm.
[0034]
On the other hand, it is possible to adsorb viruses even on a substantially non-porous carrier having no pores. In this case, useful components for a living body such as proteins in body fluids (blood, plasma, serum, etc.) cannot enter the pores, and therefore have the advantage that they are hardly adsorbed and can be used.
The term “substantially non-porous” means that a porous carrier having pores having a very small pore diameter (for example, less than 10 nm) even if porous is included.
[0035]
Regarding the porous structure of the water-insoluble carrier, considering the adsorption capacity per unit volume of the adsorbent, total porosity is preferable to surface porosity, the pore volume is 20% or more, and the specific surface area is 3 m.²/ G or more is preferable.
[0036]
The form of the water-insoluble carrier is not particularly limited, and examples thereof include a bead shape, a fiber shape, a membrane shape (including a hollow fiber), and the like. Particularly preferably used. The average particle size of the bead-shaped carrier is easily 10 to 2500 μm, but preferably 25 to 800 μm.
[0037]
The presence of a functional group that can be used for the ligand immobilization reaction on the surface of the water-insoluble carrier is convenient for ligand immobilization.
Representative examples of the functional group are not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group, amino group, aldehyde group, carboxyl group, thiol group, silanol group, amide group, epoxy group, succinimide group, and acid anhydride group. Can do.
[0038]
As the water-insoluble carrier, either a hard carrier or a soft carrier can be used. However, for use as an adsorbent for extracorporeal circulation treatment, no clogging occurs when the column is packed and passed through. It is important that the water-insoluble carrier is a hard carrier because sufficient mechanical strength is required.
[0039]
In this specification, for example, in the case of a granular gel, the hard carrier is a pressure when an aqueous fluid is allowed to flow evenly in a glass cylindrical column (inner diameter 9 mm, column length 150 nm) under the following conditions. The relationship between loss (ΔP) and flow rate is 0.3 kg / cm²The one that has a straight line relationship.
[0040]
For example, an agarose gel (Biogel-A5m manufactured by Bio-Rad, particle size 50-100 mesh), vinyl polymer gel on a glass cylindrical column (inner diameter 9 nm, column length 150 nm) equipped with a filter having a pore diameter of 15 μm at both ends. (Toyopearl HW-65 manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd., particle size 50-1000 μm) and cellulose gel (Cellulofine GC-700 m manufactured by Chisso Corp., particle size 45-105 μm) were uniformly filled with water by a peristatic pump. And the relationship between the flow rate and the pressure loss (ΔP) was determined (FIG. 1).
[0041]
The vertical axis represents the flow rate (cm / min) and the horizontal axis represents the pressure loss (kg / cm).²) Was plotted. In FIG. 1, ◯ indicates Toyopearl HW-65, Δ indicates Cellulofine GC-700m, and blackening ○ indicates Biogel-A5m.
[0042]
As a result, the flow rate of Toyopearl Toyopearl HW-65 and Cellulofine GC-700m increased in proportion to the increase in pressure, whereas Biogel-A5m caused consolidation and the flow rate increased even when the pressure was increased. I found out that I would not.
[0043]
In the immobilization of the immunoglobulin-binding protein or peptide to the water-insoluble carrier of the present invention, a hydrophilic spacer is used in order to improve the adsorption efficiency by reducing the steric hindrance of the protein or peptide and to further suppress nonspecific adsorption. It is more preferable to fix via.
[0044]
As the hydrophilic spacer, for example, a polyalkylene oxide derivative in which both ends are substituted with a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like is preferably used.
[0045]
There are no particular limitations on the method of immobilizing the compound introduced into the water-insoluble carrier and / or the organic compound used as the spacer and the compound having the binding activity to the immunoglobulin and / or immunoglobulin complex. Immobilization methods such as epoxy reaction, nick base reaction, condensation reaction using carbodiimide reagent, active ester reaction, carrier cross-linking reaction using glutaraldehyde reagent etc. Can do.
[0046]
In the above immobilization, considering that the adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention is an adsorbent that can be used for extracorporeal circulation treatment and blood purification, the protein is used during sterilization or treatment of the adsorbent. It is more preferable to apply an immobilization method that does not easily desorb from a water-insoluble carrier, and examples thereof include the following methods.
[0047]
(1) A method in which a carboxyl group of a carrier is reacted with N-hydroxysuccinimide to be substituted with a succinimideoxycarbonyl group, and a protein or peptide is reacted with an amino group (active ester method).
[0048]
(2) A method in which a carboxyl group or amino group of a protein or peptide is subjected to a condensation reaction in the presence of a condensing reagent such as dicyclohexylcarbodiimide on the amino group or carboxyl group of the carrier (condensation method).
(3) A method of crosslinking a protein or peptide using a compound having two or more functional groups such as glutaraldehyde (carrier crosslinking method).
[0049]
In the above immobilization, it is preferable to bind by a covalent bond method in order to suppress desorption and elution of proteins as much as possible.
[0050]
Various methods are mentioned as methods for adsorbing and removing hepatitis C virus in body fluids by contacting a carrier on which a compound capable of adsorbing hepatitis C virus is immobilized with a body fluid such as blood, plasma, serum, etc. Examples thereof include the following methods.
[0051]
(1) A method in which body fluid is taken out and stored in a bag or the like, mixed with an adsorbent to adsorb and remove hepatitis C virus, and then the adsorbent is filtered to obtain a body fluid from which hepatitis C virus has been removed.
(2) A method in which an adsorbent is filled in a container equipped with a filter having an inlet and an outlet for body fluid, through which the body fluid passes but not adsorbent, and the body fluid is allowed to flow through the container.
[0052]
Either method can be used, but the method (2) is easy to operate, and by incorporating it in the extracorporeal circuit, it is possible to efficiently remove hepatitis C virus from the patient's body fluid online. The adsorbent for removing hepatitis C virus of the present invention is suitable for this method.
[0053]
The adsorbing device for hepatitis C virus of the present invention using an adsorbent for removing hepatitis C virus that adsorbs hepatitis C virus will be described based on a schematic sectional view thereof.
The container 7 shown in FIG. 2 can pass the liquid inlet or outlet 1, the liquid outlet or inlet 2, the adsorbent 3 for removing hepatitis C virus of the present invention, the liquid and the components contained in the liquid. However, the adsorbent for removing hepatitis C virus has adsorbent outflow prevention means 4 and 5 and a column 6 that cannot pass therethrough.
[0054]
Although the shape and material of this container are not particularly limited, for example, a cylindrical container having a capacity of about 20 to 400 mL and a diameter of about 2 to 10 cm is preferably used.
[0055]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited only to the following examples. In the present specification, various amino acid residues are described by the following abbreviations.
[0056]
Ala; L-alanine residue, Asp; L-aspartic acid residue, Asn; L-asparagine residue, Cys; L-cysteine residue, Gln; L-glutamine residue, Glu; L-glutamic acid residue, Gly L-glycine residue, Ile; L-isoleucine residue, Leu; L-leucine residue, Lys; L-lysine residue, Phe; L-phenylalanine residue, Thr; L-threonine residue, Trp; -Tryptophan residue, Tyr; L-tylosin residue, Val; L-valine residue.
In the present specification, the amino acid sequence of a peptide is described according to a conventional method such that the amino terminus (hereinafter referred to as N-terminus) is located on the left side and the carboxyl terminus (hereinafter referred to as C-terminus) is located on the right side.
[0057]
Example 1
Immobilization of IgG binding protein (protein A) on porous carrier (GCL2000m)
Epoxy activation of cellulose gel
Water was added to 90 mL of cellulose-based porous hard gel GCL-2000m (manufactured by Chisso Corporation, 3 million exclusion molecular weight of globular protein) to make the total volume 180 mL, and then 60 mL of 2M sodium hydroxide was added to 40 ° C. To this, 21 mL of epichlorohydrin was added and reacted at 40 ° C. with stirring for 1 hour. After completion of the reaction, the product was sufficiently washed with water to obtain an epoxy activated cellulose gel.
[0058]
Immobilization of protein A
4 mg of protein A (manufactured by Sigma) was dissolved in 0.5 mL of 0.05 M borate buffer (pH 10.0), 0.01N aqueous sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 10, and the total amount was adjusted to 1.0 mL. (Protein A solution). A protein solution (total amount) was added to 1 mL of the above-mentioned epoxy-activated cellulose gel, shaken at 37 ° C. for 16 hours, washed with a sufficient amount of PBS (10 mM phosphate buffer containing 150 mM sodium chloride), and GCL2000m-Protein A was added. Obtained.
[0059]
Quantification of immobilization amount
The protein A concentration in the reaction solution immediately before and after the immobilization reaction was measured by HPLC, and the immobilization amount was determined by calculating the reaction rate. As a result, it was found that 2.1 mg of protein A was immobilized per mL of protein A-GCL2000m.
[0060]
Example 2
Immobilization of IgG binding protein (protein G) on porous carrier (GCL2000m)
GCL2000m-Protein G (3.2 mg / mL) in which protein G was immobilized was obtained in the same manner except that protein A in Example 1 was changed to protein G (manufactured by Pharmacia LKB).
[0061]
Example 3
Immobilization of immunoglobulin G-binding domain of protein G on porous carrier (Sepharose 6B)
Peptide synthesis
The synthesis of a peptide having a sequence consisting of 57 residues of the C3 domain of protein G with cysteine added to the N-terminal side was carried out by solid phase synthesis using a peptide synthesizer Model 4170 (Pharmacia LKB) as follows. went.
[0062]
Using Fmoc-glutamine NovaSyn KA 0.1 mmol (manufactured by Pharmacia LKB), which is a support to which C-terminal glutamine is bound, by the synthesis program input to the peptide synthesizer, in the direction toward the N-terminal, The peptide chain was extended by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction.
That is, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc), which is a protecting group for the α-amino group of the amino acid, is removed with piperidine, washed with dimethylformamide (DMF), and 2- (1H-benzotriazole -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and diisopropylethylamine were subjected to a condensation reaction and washed with DMF.
[0063]
Amino acids are Fmoc-L-Ala, Fmoc-L-Asn (Trt), Fmoc-L-Asp (OtBu), Fmoc-L-Cys (Trt), Fmoc-L-Gln (Trt), Fmoc-L-Glu (OtBu), Fmoc-L-Gly, Fmoc-L-Ile, Fmoc-L-Leu, Fmoc-L-Lys (Boc), Fmoc-L-Phe, Fmoc-L-Thr (tBu), Fmoc-L- Trp, Fmoc-L-Tyr (tBu) and Fmoc-L-Val were used, and the amount used was about 5-fold mol (0.5 mmol) with respect to the substrate. Here, Trt, OtBu, Boc, and tBu represent a trityl group, a tert-butyl ester, a tert-butyloxycarbonyl group, and a tert-butyl group, respectively.
[0064]
Deprotection reaction and cleavage of peptide chain
After the reaction procedure for all amino acids is completed, the obtained support is washed successively with tert-amyl alcohol, acetic acid and diethyl ether on a 3G-3 pore glass filter and then dried by vacuum drying. A support was obtained. In a vial, 20 mL of trifluoroacetic acid (TFA), 260 μL of 1,2-ethanedithiol and 780 μL of anisole were added to 1 g of the obtained support and stirred at room temperature for 1.5 hours.
[0065]
Thereafter, the mixture was filtered from the support with a 3G-3 hole glass filter, and the filtrate was concentrated under reduced pressure at a temperature of 35 ° C. To this, anhydrous diethyl ether which had been cooled in advance was added and stirred until no precipitate appeared, and then centrifuged, and the precipitated crude peptide was collected. Further, the crude peptide was washed several times with anhydrous diethyl ether and then dried under reduced pressure to obtain the desired crude purified peptide.
[0066]
Peptide purification
The above crude peptide was dissolved in 0.1% TFA, filtered through a 0.2 μm membrane filter, and the obtained filtrate was subjected to high performance liquid chromatography. For HPLC, a Model LC-10A system (manufactured by Shimadzu Corporation) was used, and for the column, a reverse phase μBondsphere C18 (manufactured by Millipore Waters, Japan) was used. For mobile phase, 0.1% TFA aqueous solution was used as solution A, and 80% (V / V) acetonitrile / water containing 0.1% TFA was used as solution B, and eluted with a linear concentration gradient from solution A to solution B. did.
[0067]
The corresponding fraction of the obtained chromatopeak was collected. The fractionation was repeated several times, and this was freeze-dried to obtain a purified peptide. The obtained peptide was analyzed by amino acid analysis using a gas phase protein sequencer type 477 (manufactured by Applied Biosystems) and Hitachi custom ion exchange resin to obtain a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. It was confirmed that
[0068]
Peptide immobilization
An adsorbent was produced as follows by immobilizing the peptide on porous sepharose. As Sepharose, thiopropyl Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia LKB) was used. Distilled water (50 ml) was added to thiopropyl sepharose 6B (50 mg) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to swell the resin. The distilled water was then removed and replaced with 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) coupling buffer containing 0.5 M NaCl.
[0069]
On the other hand, 4 mg of the purified peptide was dissolved in 400 μL of 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) coupling buffer containing 0.5 M NaCl, and 150 μL of swollen thiopropyl sepharose 6B was added at 4 ° C. By stirring for 12 hours, an adsorbent on which the purified peptide was immobilized was obtained.
[0070]
Further, the obtained peptide-immobilized adsorbent was subjected to suction filtration, and the peptide content in the filtrate was quantified by an absolute calibration curve method using HPLC, thereby obtaining the peptide immobilization rate on the carrier. This peptide-immobilized adsorbent was thoroughly washed with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 150 mM NaCl, and suction filtered to obtain Sepharose 6B-C3Ppt with 3.6 mg of peptide immobilized per mL of carrier. It was.
[0071]
Example 4
Immobilization of IgG binding peptide (MK3P47) on porous carrier (Kac)
Production of MK3P47 peptide
DNA encoding the MK3P47 peptide, which is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing below, is transferred to the pUCNT vector (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-212292), 5 ′ side to Nde I, 3 ′ side to Hind III These were designed and synthesized so that they could be linked using each restriction enzyme site. The synthesized DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
[0072]
The DNA having the above sequence was cleaved by digestion with restriction enzymes Nde I and Hind III (Takara Shuzo), and DNA Ligation Kit Ver. 2 was used to produce a pUCNTMK3P47 vector (FIG. 3).
[0073]
This pUCNTMK3P47 vector DNA was introduced into Escherichia coli HB101 (manufactured by irivitrogen) by a known method, and a transformant was selected using resistance to the antibiotic ampicillin as an index.
Moreover, plasmid DNA was extracted from this transformant by a conventional method, and the gene sequence was analyzed to confirm that it had a DNA sequence as designed by the pUCNTMK3P47 vector.
[0074]
Next, this transformant was cultured by shaking in 6 L of L-broth (5 g / L NaCl, 10 g / L bactotrypsin, 5 g / L yeast extract) at 37 ° C. for 20 hours. It collect | recovered by centrifugation (6000 rpm, 20 minutes at 4 degreeC using Hitachi RPR9-2 rotor).
The precipitate obtained here was suspended in 300 mL of TE buffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA: pH 7.5), and then subjected to ultrasonic crushing (3 times for 6 minutes in ice using BRANSON 250). The supernatant was recovered by centrifugation (using Hitachi RPR16 rotor at 15000 rpm for 20 minutes at 4 ° C.).
[0075]
The supernatant obtained here was heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes, and then 300 mL of the supernatant was recovered by centrifugation (15,000 rpm, 20 minutes at 4 ° C. using Hitachi RPR16 rotor). From this supernatant, 40 ml of acetonitrile solution was flowed at a flow rate of 5 ml / min using high performance liquid chromatography (column: Waters μBONASPHERE 5 μC18 300A 19.0 × 150 mm), and then 300 mL of the sample was flowed at the same flow rate. The column was washed with 200 mL of 0.1% TFA + 64% acetonitrile solution, and the target MK3P47 peptide was eluted and fractionated with 200 mL of 0.1% TFA + 40% acetonitrile solution.
This was concentrated to 100 mL with an evaporator and then freeze-dried to obtain 1.2 g as a high purity purified sample.
[0076]
Epoxy activation of cellulose gel
Water was added to 90 mL of our prototype Kac, which is a cellulosic porous hard gel and has an exclusion limit molecular weight of 5 million or more, and the total amount was 180 mL, and then 60 mL of 2M sodium hydroxide was added to 40 ° C. To this, 21 mL of epichlorohydrin was added and reacted at 40 ° C. with stirring for 1 hour. After completion of the reaction, the product was sufficiently washed with water to obtain an epoxy activated cellulose gel.
[0077]
Immobilization of MK3P47 and determination of the amount immobilized
Kac-MK3P47 (30 mg / mL) in which MK3P47 was immobilized was obtained in the same manner except that 4 mg of protein A in Example 1 was changed to 50 mg of MK3P47 and the epoxy activated gel was changed to Kac.
[0078]
Example 5
Immobilization of IgG-binding peptide (MP47C) on porous support (Sephacryl S1000)
Peptide MP47C having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing was produced.
A DNA having the sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing (DNA encoding MP47C) was designed and synthesized so as to be ligated to the pUCNT vector in the same manner as in Example 4.
[0079]
DNA having the above sequence was introduced into the pUCNT vector in the same manner as in Example 4 to prepare a pUCNTMP47C vector.
Furthermore, a transformant of Escherichia coli was prepared in the same manner as in Example 4, and 1.3 g of a high-purity purified preparation of the target peptide was obtained through 6 L culture and used for various studies.
[0080]
Epoxy activation of Sephacryl gel.
Sephacryl S1000 (manufactured by Pharmacia LKB Co., Ltd.), which is a cellulose-based porous hard gel and has a pore size of 400 nm, was added with water to 90 mL to make the total volume 180 mL, and then 60 mL of 2M sodium hydroxide was added to 40 ° C. To this, 21 mL of epichlorohydrin was added and reacted at 40 ° C. with stirring for 1 hour. After completion of the reaction, the product was sufficiently washed with water to obtain an epoxy-activated Sephacryl gel.
[0081]
Immobilization of MP47C and quantification of the amount immobilized
S1000-MP47C (7 mg / mL) in which MP47C was immobilized was obtained in the same manner except that 4 mg of protein A in Example 1 was changed to 10 mg of MP47C and the epoxy-activated gel was changed to an epoxy-activated sephacryl gel. .
[0082]
Example 6
Immobilization of IgG binding peptide (MP47C) on substantially non-porous carrier (Bac)
Epoxy activation of cellulose gel
Water was added to 90 mL of a non-porous carrier (Bac), which is a prototype of a spherical protein gel with a spherical protein exclusion limit molecular weight of 30,000 or less, to a total volume of 180 mL, and then 60 mL of 2M sodium hydroxide was added to 40 ° C. To this, 21 mL of epichlorohydrin was added and reacted at 40 ° C. with stirring for 1 hour. After completion of the reaction, the product was sufficiently washed with water to obtain an epoxy activated cellulose gel.
[0083]
Immobilization of MP47C and quantification of the amount immobilized
Bac-MP47C (20 mg / mL) immobilizing MP47C was obtained in exactly the same manner except that 4 mg of protein A in Example 1 was changed to 30 mg of MP47C and the epoxy activated gel was changed to Bac.
[0084]
Example 7
Immobilization of a part (Fab) of an anti-IgG antibody on a porous carrier (CNBr-activated Sepharose 6B)
4 g of CNBr activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia LKB) was swollen with a small amount of 1 mM HCl aqueous solution for 15 minutes, washed with 1 mM HCl aqueous solution, and further coupled buffer (pH 8.3, 0.5 M sodium chloride, 0. 1M NaHCO_Three).
[0085]
1 mg of Fab obtained by papain digestion (PIECE, ImmunoPure Fab Preparation Kit) of anti-human IgG (Fab) antibody (binding site) was dissolved in 1 mL of coupling buffer, and the above washing gel was added and reacted at 4 ° C. for 16 hours. It was.
After washing with coupling buffer, block buffer (pH 8.3, 0.2 M glycine, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M NaHCO 3)_Three) Was added and reacted at room temperature for 2 hours.
[0086]
2 types of post-treatment buffers (pH 4.0, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer, pH 8.0, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M Tris-HCl buffer) And alternately washed three times to obtain Sepharose 4B-AntiIgG Fab.
[0087]
Example 8
Immobilization of anti-IgG antibody on porous carrier (Tresyl Toyopearl)
1 mg of anti-human IgG (Fc) antibody (manufactured by Binding Site) is dissolved in 1 mL of coupling buffer (0.5 M sodium chloride, 0.1 M carbonate buffer), and AF-Tresyl Toyopearl 650 is dried. 200 mg was added and reacted at 4 ° C. overnight.
After washing with a 0.5 M sodium chloride aqueous solution, a block buffer (pH 8.0, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer) was added and reacted at room temperature for 2 hours.
Furthermore, it wash | cleaned by 0.5M sodium chloride aqueous solution, and Toyopearl-AntiIgG was obtained.
[0088]
Example 9
Evaluation of adsorbability of synthesized adsorbents for hepatitis C virus
Adsorption experiment
100 μL of each adsorbent was collected in a vial, 100 μL of patient serum containing hepatitis C virus was added, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 2 hours.
[0089]
Adsorbability measurement of hepatitis C virus
Thereafter, this suspension was centrifuged at 5000 rpm for 1 minute, and the amount of hepatitis C virus in the supernatant was measured as HCV RNA (Nippon Roche, Amplicore HCV monitor).
[0090]
As a control experiment, 100 μL of physiological saline was collected in a vial instead of the adsorbent, treated in the same manner as described above, and the amount of hepatitis C virus in the solution was determined.
The adsorption rate (%) of hepatitis C virus was calculated by the following formula.
Adsorption rate (%) = [(Vr−Vt) / Vr] × 100
Vr: virus concentration in the control experimental solution
Vt: Virus concentration in the supernatant of the adsorption experiment
The results are shown in Table 1.
[0091]
[Table 1]

[0092]
Example 10
Evaluation of synthesized adsorbents
Adsorption experiment
100 μL of each adsorbent was collected in a vial, 100 μL of patient serum containing hepatitis C virus was added, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 2 hours.
[0093]
Measurement of high specific gravity / low specific gravity HCV virus
The HCV suspension obtained by the adsorption experiment and the HCV suspension subjected to the same treatment with physiological saline instead of the adsorbent were mixed with anti-LDL antibody and anti-IgG antibody, reacted at 4 ° C. for 16 hours and reacted at 5000 rpm. Centrifuge for 15 minutes, collect the precipitate, measure the amount of hepatitis C virus as HCV RNA (Nippon Roche, Amplicore HCV monitor), precipitate HCV precipitated by anti-LDL antibody with low specific gravity, anti-IgG antibody The HCV RNA ratios (T / B = low specific gravity HCV / high specific gravity HCV) were determined using the HCV thus obtained as high specific gravity HCV.
The results are shown in Table 2.
[0094]
[Table 2]

[0095]
【The invention's effect】
According to the present invention, as is apparent from the above examples, the ability to selectively adsorb and remove hepatitis C virus present in body fluids and / or the ratio of high specific gravity HCV virus to low specific gravity HCV virus is reduced. It is possible to provide a novel adsorbent having the ability to be made. Moreover, it is possible to selectively remove hepatitis C virus in non-treatment liquids such as blood, plasma and serum by using a body fluid treatment device filled with the adsorbent.
[0096]
[Sequence Listing]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between flow rate and pressure loss when various water-insoluble carriers are packed in a glass cylindrical column. The vertical axis is the flow rate (cm / min), and the horizontal axis is the pressure loss (kg / cm).²) Respectively.
FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an apparatus for adsorbing hepatitis C virus according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing the pUCNTMK3P47 vector.
[Explanation of symbols]
1 outlet
2 Inlet
3 Adsorbent for removal
4,5 Adsorbent outflow prevention means
6 columns
7 containers

Claims

A compound having a binding activity to an immunoglobulin and / or immunoglobulin complex is characterized by being immobilized on a water-insoluble carrier, in the adsorbent for selectively adsorbing and removing immune complex type C hepatitis virus There,
The compound having binding activity to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex is at least one of protein A, protein G, protein H, protein L, protein M, rheumatoid factor, complement
Adsorbent .

An adsorbent for selectively adsorbing and removing immune complex type hepatitis C virus, comprising a compound having binding activity to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex, immobilized on a water-insoluble carrier. There,
The compound having binding activity to immunoglobulin and / or immunoglobulin complex is a part of at least one of protein A, protein G, protein H, protein L, protein M, rheumatoid factor, complement, And a protein fragment, peptide or derivative thereof containing a binding site for immunoglobulin and / or immunoglobulin complex
Adsorbent .

The adsorbent according to claim 1 or 2 , wherein the water-insoluble carrier is a porous carrier.

The adsorbent according to claim 3 , wherein the porous carrier has an average pore diameter of 10 to 1500 nm.

The adsorbent according to claim 1 or 2 , wherein the water-insoluble carrier is substantially non-porous.

Water-insoluble carrier, adsorbent according to any one of claims 1 to 5 which is hydrophilic.

The adsorbent according to any one of claims 1 to 6 , which is used for selectively adsorbing and removing immune complex type hepatitis C virus present in blood, plasma or other body fluids.

The adsorbent according to any one of claims 1 to 7 is contained in a container having a liquid inlet and outlet, and means for preventing the adsorbent from flowing out of the container is provided. An adsorption device for selectively adsorbing and removing immune complex type hepatitis C virus.