JP2828642B2 - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents
ヌクレオシド誘導体Info
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- JP2828642B2 JP2828642B2 JP63505657A JP50565788A JP2828642B2 JP 2828642 B2 JP2828642 B2 JP 2828642B2 JP 63505657 A JP63505657 A JP 63505657A JP 50565788 A JP50565788 A JP 50565788A JP 2828642 B2 JP2828642 B2 JP 2828642B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- formula
- nucleoside derivative
- group
- polynucleotide
- fluorophore
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヌクレオシド誘導体、その合成方法、および
そのようなヌクレオシド誘導体を利用したポリヌクレオ
チドの合成および配列決定方法に関するものである。
そのようなヌクレオシド誘導体を利用したポリヌクレオ
チドの合成および配列決定方法に関するものである。
[註:本明細書に引用した参考文献は本明細書末尾にま
とめて収録した] 同定可能なマーカーで標識したDNA、合成オリゴヌク
レオチドおよびRNAは分子生物学で広い応用の途があ
る。
とめて収録した] 同定可能なマーカーで標識したDNA、合成オリゴヌク
レオチドおよびRNAは分子生物学で広い応用の途があ
る。
32Pおよび35Sのような放射性標識がほぼ独占的に分子
生物学的手段に使用されてきた。しかし放射性標識はそ
の半減期が比較的短く(例えば32Pの半減期は14日)、
またはその崩壊の間に放射される電離放射線はタンパク
質、脂質、核酸のような細胞構成要素を損傷しかねず、
それによって細胞死を招き、あるいは細胞を悪性状態へ
転換することがあるので不都合である。
生物学的手段に使用されてきた。しかし放射性標識はそ
の半減期が比較的短く(例えば32Pの半減期は14日)、
またはその崩壊の間に放射される電離放射線はタンパク
質、脂質、核酸のような細胞構成要素を損傷しかねず、
それによって細胞死を招き、あるいは細胞を悪性状態へ
転換することがあるので不都合である。
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをけい光団、
コロイド質化合物および酵素のような非放射性マーカー
で標識することが提案された。
コロイド質化合物および酵素のような非放射性マーカー
で標識することが提案された。
提案された一方法(1)として、5′末端に反応性アミ
ノ基を含んだオリゴヌクレオチドが作成された。ついで
けい光団またはその他の非放射性マーカーをそのアミノ
基に結合させ、検出可能なマーカーを挿入したオリゴヌ
クレオチドが作成された。そのような方法では5′末端
を介してオリゴヌクレオチド鎖へただ1個の検出可能な
マーカーしか導入できない不都合がある。
ノ基を含んだオリゴヌクレオチドが作成された。ついで
けい光団またはその他の非放射性マーカーをそのアミノ
基に結合させ、検出可能なマーカーを挿入したオリゴヌ
クレオチドが作成された。そのような方法では5′末端
を介してオリゴヌクレオチド鎖へただ1個の検出可能な
マーカーしか導入できない不都合がある。
また別の提案(2)〜(5)ではC−5置換基の遠位
末端にアミノ基を有するC−5置換デオキシウリジン化
合物が作成された。そのような化合物は検出可能なマー
カーで標識し、これをオリゴヌクレオチド鎖へ挿入する
ことができるのでオリゴヌクレオチドを多数の部位で標
識することが可能である。これらの化合物の製造は難し
く、しかも極めて毒性のある水銀誘導体を使用する反応
を含んでいる。
末端にアミノ基を有するC−5置換デオキシウリジン化
合物が作成された。そのような化合物は検出可能なマー
カーで標識し、これをオリゴヌクレオチド鎖へ挿入する
ことができるのでオリゴヌクレオチドを多数の部位で標
識することが可能である。これらの化合物の製造は難し
く、しかも極めて毒性のある水銀誘導体を使用する反応
を含んでいる。
したがって非同位体標識をしたポリヌクレオシドの製
造に使用でき、しかも簡単で安全に作成し得るヌクレオ
シド誘導体の必要性が存在する。
造に使用でき、しかも簡単で安全に作成し得るヌクレオ
シド誘導体の必要性が存在する。
本発明は、式(I): [式中、YはHまたはOH、または保護基を有するヒドロ
キシ基、XはH、ホスホネート基、または式: (ここで、R1およびR2は同一または異なってもよく、分
枝しまたは分枝していないアルキルおよび置換アルキル
から選ばれ、Qはリン酸保護基である) で示されるホスホルアミダイト基、 ZはH、ホスフェートまたはトリホスフェート基、また
はヒドロキシ保護基、 X′は分枝しまたは分枝していないC1〜15アルキル基、 Rはアミノ保護基またはけい光団またはその他の非放射
性の検出可能なマーカー、またはY′NHA基(ここで、
Y′は分枝しまたは分枝していないアルキル(C1〜40)
カルボニル基、Aはアミノ保護基またはけい光団または
その他の非放射性の検出可能なマーカー)である] で示されるヌクレオシド誘導体を提供する。
キシ基、XはH、ホスホネート基、または式: (ここで、R1およびR2は同一または異なってもよく、分
枝しまたは分枝していないアルキルおよび置換アルキル
から選ばれ、Qはリン酸保護基である) で示されるホスホルアミダイト基、 ZはH、ホスフェートまたはトリホスフェート基、また
はヒドロキシ保護基、 X′は分枝しまたは分枝していないC1〜15アルキル基、 Rはアミノ保護基またはけい光団またはその他の非放射
性の検出可能なマーカー、またはY′NHA基(ここで、
Y′は分枝しまたは分枝していないアルキル(C1〜40)
カルボニル基、Aはアミノ保護基またはけい光団または
その他の非放射性の検出可能なマーカー)である] で示されるヌクレオシド誘導体を提供する。
以下、議論を進める便宜上、本明細書で使用するC−
5置換ヌクレオシドの番号表示方法を第1図に示す(こ
こに示した化合物は本発明の好ましい化合物の一つを図
示したものである)。
5置換ヌクレオシドの番号表示方法を第1図に示す(こ
こに示した化合物は本発明の好ましい化合物の一つを図
示したものである)。
本発明では非放射性標識と結合し、またはこれと結合
可能な第1級脂肪族アミノ基を有するC−5置換ウリジ
ンまたはデオキシウリジンを、アミノアルキンと5−ヨ
ードウリジンまたは5−ヨードデオキシウリジン誘導体
との間にC−C結合を作成するパラジウム触媒反応を用
い、緩和な条件下に容易に作成できることが判明した。
可能な第1級脂肪族アミノ基を有するC−5置換ウリジ
ンまたはデオキシウリジンを、アミノアルキンと5−ヨ
ードウリジンまたは5−ヨードデオキシウリジン誘導体
との間にC−C結合を作成するパラジウム触媒反応を用
い、緩和な条件下に容易に作成できることが判明した。
R1およびR2はそれぞれ1〜30個の炭素原子を含み得
る。好ましくはR1およびR2はいずれもイソプロピル基で
ある。R1および/またはR2が置換アルキルである場合、
置換基が化合物の所望の特性を妨げず、またはその他有
害な効果を示さない限り、置換基の性質は重要ではな
い。例えば置換基はフェニル、ベンジルおよびアシル基
から選ぶことができる。
る。好ましくはR1およびR2はいずれもイソプロピル基で
ある。R1および/またはR2が置換アルキルである場合、
置換基が化合物の所望の特性を妨げず、またはその他有
害な効果を示さない限り、置換基の性質は重要ではな
い。例えば置換基はフェニル、ベンジルおよびアシル基
から選ぶことができる。
Qはメチル、フェニル、置換フェニル、ベンジルまた
はシアノエチル基のような任意のリン酸保護基である。
例えばフェニルであればこれをハロゲン、ヒドロキシま
たはニトロ基で置換し得る。
はシアノエチル基のような任意のリン酸保護基である。
例えばフェニルであればこれをハロゲン、ヒドロキシま
たはニトロ基で置換し得る。
グリーン(6)によって報告されたような任意のヒドロ
キシ保護基が使用できる。例えばヒドロキシ保護基とし
ては、置換または未置換のアルカノイル(例えばホルミ
ル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリ
ル、バレリル、ブロモアセチル、ジクロロアセチル、ト
リフルオロアセチル)、置換または未置換のアロイル
(例えばベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ニトロ
ベンゾイル、ブロモベンゾイル、サリチロイル)、アリ
ールアルキル(例えばベンジル)、メチル、メトキシ、
メチルチオメチル、2−メトキシエトキシメチル、ビス
(2−クロロエトキシ)メチル、テトラヒドロピラニ
ル、テトラヒドロチオピラニル、4−メトキシテトラヒ
ドロピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニ
ル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニ
ル、1−エトキシエチル、1−メチル−1−メトキシエ
チル、2−(フェニルセレニル)エチル、t−ブチル、
アリル、ベンジル、o−ニトロベンジル、トリフェニル
メチル、α−ナフチル−ジフェニルメチル、p−メトキ
シフェニルジフェニルメチル、9−(9−フェニル−10
−オキソ)アントリル[トリチロン]、ジメトキシトリ
チルまたはピキシル、トリメチルシリル、イソプロピル
ジメチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチ
ルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリイソプ
ロピルシリルのようなアシルから選ぶことができる。
キシ保護基が使用できる。例えばヒドロキシ保護基とし
ては、置換または未置換のアルカノイル(例えばホルミ
ル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリ
ル、バレリル、ブロモアセチル、ジクロロアセチル、ト
リフルオロアセチル)、置換または未置換のアロイル
(例えばベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ニトロ
ベンゾイル、ブロモベンゾイル、サリチロイル)、アリ
ールアルキル(例えばベンジル)、メチル、メトキシ、
メチルチオメチル、2−メトキシエトキシメチル、ビス
(2−クロロエトキシ)メチル、テトラヒドロピラニ
ル、テトラヒドロチオピラニル、4−メトキシテトラヒ
ドロピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニ
ル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニ
ル、1−エトキシエチル、1−メチル−1−メトキシエ
チル、2−(フェニルセレニル)エチル、t−ブチル、
アリル、ベンジル、o−ニトロベンジル、トリフェニル
メチル、α−ナフチル−ジフェニルメチル、p−メトキ
シフェニルジフェニルメチル、9−(9−フェニル−10
−オキソ)アントリル[トリチロン]、ジメトキシトリ
チルまたはピキシル、トリメチルシリル、イソプロピル
ジメチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチ
ルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリイソプ
ロピルシリルのようなアシルから選ぶことができる。
グリーン(6)によって報告されたような任意のアミノ
保護基が使用できる。例えばアミノ保護基としては、例
えばアシル、特に有機アシル、例えば置換または未置換
の脂肪族炭化水素−オキシカルボニル、例えばアルコキ
シカルボニル(例えばメトキシカルボニル、エトキシカ
ルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニ
ル、t−ブトキシカルボニル、5−ペントキシカルボニ
ル)、 ハロゲン化アルコキシカルボニル(例えばクロロメトキ
シカルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、トリク
ロロエトキシカルボニル)、 アルカン−またはアレン−スルホニルアルコキシカルボ
ニル(例えば2−(メシル)エトキシカルボニル、2−
(p−トルエンスルオニル)エトキシカルボニル)、 アルキルチオ−またはアリールチオアルコキシカルボニ
ル(例えば2−(エチルチオ)エトキシカルボニル、2
−(p−トリルチオ)エトキシカルボニル)、ハロゲン
化(低級)アルカノイルのような置換または未置換のア
ルカノイル(例えばホルミル、トリフルオロアセチ
ル)、 単環または縮合環脂環式オキシカルボニル(例えばシク
ロヘキシルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアルケニルオキシカルボニル(例え
ばアリルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアルキニルオキシカルボニル(例え
ば1,1−ジメチルプロパルギルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアリールオキシカルボニル(例えば
フェノキシカルボニル、p−メチルフェノキシカルボニ
ル)、 置換または未置換のアラルキルオキシカルボニル(例え
ばベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキ
シカルボニル、p−フェニルアゾベンジルオキシカルボ
ニル、p−(p−メトキシフェニルアゾ)ベンジルオキ
シカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、
p−ブロモベンジルオキシカルボニル、α−ナフチルメ
トキシカルボニル、p−ビフェニルイソプロポキシカル
ボニル、フルオレニルメトキシカルボニル)、 置換または未置換のアレンスルホニル(例えばベンゼン
スルホニル、p−トルエンスルホニル)、 置換または未置換のジアルキルホスホリル(例えばジメ
チルホスホリル)、 置換または未置換のジアラルキルホスホリル(例えばO,
O−ジベンジルホスホリル)、 置換または未置換のアリールオキシアルカノイル(例え
ばフェノキシアセチル、p−クロロフェノキシアセチ
ル、2−ニトロフェノキシアセチル、2−メチル−2−
(2−ニトロフェノキシ)プロピオニル)、フェニル、
トリルのような置換または未置換のアリール、ベンジ
ル、ジフェニルメチル、トリチルまたはニトロベンジル
のような置換または未置換のアラルキル から選ぶことができる。
保護基が使用できる。例えばアミノ保護基としては、例
えばアシル、特に有機アシル、例えば置換または未置換
の脂肪族炭化水素−オキシカルボニル、例えばアルコキ
シカルボニル(例えばメトキシカルボニル、エトキシカ
ルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニ
ル、t−ブトキシカルボニル、5−ペントキシカルボニ
ル)、 ハロゲン化アルコキシカルボニル(例えばクロロメトキ
シカルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、トリク
ロロエトキシカルボニル)、 アルカン−またはアレン−スルホニルアルコキシカルボ
ニル(例えば2−(メシル)エトキシカルボニル、2−
(p−トルエンスルオニル)エトキシカルボニル)、 アルキルチオ−またはアリールチオアルコキシカルボニ
ル(例えば2−(エチルチオ)エトキシカルボニル、2
−(p−トリルチオ)エトキシカルボニル)、ハロゲン
化(低級)アルカノイルのような置換または未置換のア
ルカノイル(例えばホルミル、トリフルオロアセチ
ル)、 単環または縮合環脂環式オキシカルボニル(例えばシク
ロヘキシルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアルケニルオキシカルボニル(例え
ばアリルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアルキニルオキシカルボニル(例え
ば1,1−ジメチルプロパルギルオキシカルボニル)、 置換または未置換のアリールオキシカルボニル(例えば
フェノキシカルボニル、p−メチルフェノキシカルボニ
ル)、 置換または未置換のアラルキルオキシカルボニル(例え
ばベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキ
シカルボニル、p−フェニルアゾベンジルオキシカルボ
ニル、p−(p−メトキシフェニルアゾ)ベンジルオキ
シカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、
p−ブロモベンジルオキシカルボニル、α−ナフチルメ
トキシカルボニル、p−ビフェニルイソプロポキシカル
ボニル、フルオレニルメトキシカルボニル)、 置換または未置換のアレンスルホニル(例えばベンゼン
スルホニル、p−トルエンスルホニル)、 置換または未置換のジアルキルホスホリル(例えばジメ
チルホスホリル)、 置換または未置換のジアラルキルホスホリル(例えばO,
O−ジベンジルホスホリル)、 置換または未置換のアリールオキシアルカノイル(例え
ばフェノキシアセチル、p−クロロフェノキシアセチ
ル、2−ニトロフェノキシアセチル、2−メチル−2−
(2−ニトロフェノキシ)プロピオニル)、フェニル、
トリルのような置換または未置換のアリール、ベンジ
ル、ジフェニルメチル、トリチルまたはニトロベンジル
のような置換または未置換のアラルキル から選ぶことができる。
「けい光団」の語は、それ自身がけい光を発し得る部
分、またはけい光を他の部分へ付与し得る部分をいう。
また本明細書で用いるように、「けい光団」の語はけい
光を抑制する1またはそれ以上の基を含み、ただし一度
それらの基が除かれるとけい光体となり得るけい光団前
駆体をも表わす(例えばジイソブチリル−6−カルボキ
シフルオレセインはけい光を発しない。アンモニア処理
によってジイソブチリル基を除くとけい光体6−カルボ
キシフルオレセインが生成する)。けい光団またはけい
光団前駆体を例示すれば、フルオレセイン−5−イソチ
オシアネート−アシル(例えばジイソブチリル、アセチ
ルまたはジピバロイル)−5−および/または6−カル
ボキシフルオレセインペンタフルオロフェニルエステ
ル、6−(ジアリール−5−および/または6−カルボ
ニル−フルオレセイン)−アミノヘキサン酸ペンタフル
オロフェニルエステル[テキサス・レッド(Texas Re
d)、モレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッ
ド(Molecular Probes,Inc.)の商標]、テトラメチル
ローダミン−5(および6)−イソチオシアネート(以
下、ローダミンという)、エオシン−5−イソチオシア
ネート、エリスロシン−5−イソチオシアネート、4−
クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ
ール、4−フルオロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−
1,3−ジアゾール、3−(7−ニトロベンズ−2−オキ
サ−1,3−ジアゾール−4−イル)メチルアミノプロピ
オニトリル、6−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,
3−ジアゾール−4−イル)アミノヘキサン酸、スクシ
ンイミジル−12−(N−メチル−N−(7−ニトロベン
ズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)−アミ
ノドデカノエート、7−ジエチルアミノ−3−(4′−
イソチオシアネートフェニル)−4−メチルクマリン
[CP]、7−ヒドロキシクマリン−4−酢酸、7−ジメ
チルアミノクマリン−4−酢酸、スクシンイミジル−7
−ジメチルアミノクマリン−4−アセテート、7−メト
キシクマリン−4−酢酸、4−アセトアミド−4′−イ
ソチオシアネートスチルベン−2,2′−ジスルホン酸[S
ITS]、9−クロロアクリジン、スクシンイミジル−3
−(9−カルバゾール)−プロピオネート、スクシンイ
ミジル−1−ピレンブチレート、スクシンイミジル−1
−ピレンノナノエート、p−ニトロフェニル−1−ピレ
ンブチレート、9−アントラセンプロピオン酸、スクシ
ンイミジルアントラセン−9−プロピオネート、2−ア
ントラセンスルホニルクロリド等が挙げられる。
分、またはけい光を他の部分へ付与し得る部分をいう。
また本明細書で用いるように、「けい光団」の語はけい
光を抑制する1またはそれ以上の基を含み、ただし一度
それらの基が除かれるとけい光体となり得るけい光団前
駆体をも表わす(例えばジイソブチリル−6−カルボキ
シフルオレセインはけい光を発しない。アンモニア処理
によってジイソブチリル基を除くとけい光体6−カルボ
キシフルオレセインが生成する)。けい光団またはけい
光団前駆体を例示すれば、フルオレセイン−5−イソチ
オシアネート−アシル(例えばジイソブチリル、アセチ
ルまたはジピバロイル)−5−および/または6−カル
ボキシフルオレセインペンタフルオロフェニルエステ
ル、6−(ジアリール−5−および/または6−カルボ
ニル−フルオレセイン)−アミノヘキサン酸ペンタフル
オロフェニルエステル[テキサス・レッド(Texas Re
d)、モレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッ
ド(Molecular Probes,Inc.)の商標]、テトラメチル
ローダミン−5(および6)−イソチオシアネート(以
下、ローダミンという)、エオシン−5−イソチオシア
ネート、エリスロシン−5−イソチオシアネート、4−
クロロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾ
ール、4−フルオロ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−
1,3−ジアゾール、3−(7−ニトロベンズ−2−オキ
サ−1,3−ジアゾール−4−イル)メチルアミノプロピ
オニトリル、6−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,
3−ジアゾール−4−イル)アミノヘキサン酸、スクシ
ンイミジル−12−(N−メチル−N−(7−ニトロベン
ズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)−アミ
ノドデカノエート、7−ジエチルアミノ−3−(4′−
イソチオシアネートフェニル)−4−メチルクマリン
[CP]、7−ヒドロキシクマリン−4−酢酸、7−ジメ
チルアミノクマリン−4−酢酸、スクシンイミジル−7
−ジメチルアミノクマリン−4−アセテート、7−メト
キシクマリン−4−酢酸、4−アセトアミド−4′−イ
ソチオシアネートスチルベン−2,2′−ジスルホン酸[S
ITS]、9−クロロアクリジン、スクシンイミジル−3
−(9−カルバゾール)−プロピオネート、スクシンイ
ミジル−1−ピレンブチレート、スクシンイミジル−1
−ピレンノナノエート、p−ニトロフェニル−1−ピレ
ンブチレート、9−アントラセンプロピオン酸、スクシ
ンイミジルアントラセン−9−プロピオネート、2−ア
ントラセンスルホニルクロリド等が挙げられる。
けい光団またはけい光団源物質は、好ましくは (i)商業的に使用される高圧水銀ランプの強い輝線の
一本と一致する励起極大、 (ii)スペクトル可視部における発光極大 の分光学的特性を有する。
一本と一致する励起極大、 (ii)スペクトル可視部における発光極大 の分光学的特性を有する。
非放射性の検出可能なマーカーは、顕微鏡下で検出で
きる電子集密物質のようなその物理的な特性によって直
接検出し得るもの、または検出可能なマーカーと適当な
基質との反応により、色のような検出可能な信号を発し
得るような化学的または生物化学的な特性によって間接
的に検出し得るものからなる。直接検出し得る非放射性
の検出可能なマーカーを例示すれば、コロイド金および
コロイド銀およびフェリチンのようなコロイド質化合物
が挙げられる。間接的に検出し得る非放射性の検出可能
なマーカーを例示すれば、ビオチン、アビジンおよびβ
−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼのような酵素等が挙げられ
る。
きる電子集密物質のようなその物理的な特性によって直
接検出し得るもの、または検出可能なマーカーと適当な
基質との反応により、色のような検出可能な信号を発し
得るような化学的または生物化学的な特性によって間接
的に検出し得るものからなる。直接検出し得る非放射性
の検出可能なマーカーを例示すれば、コロイド金および
コロイド銀およびフェリチンのようなコロイド質化合物
が挙げられる。間接的に検出し得る非放射性の検出可能
なマーカーを例示すれば、ビオチン、アビジンおよびβ
−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼのような酵素等が挙げられ
る。
X′は好ましくはCH2、 Rは好ましくはCO(CH2)1〜15Aであり、一層好ま
しくはCO−(CH2)5Aである。
しくはCO−(CH2)5Aである。
特に好ましい式(I)の化合物は、下表 (ここで、基Aは前記と同意義、DMTrはジメトキシトリ
チルを表わし、Dはヒドロキシ保護基である) で示される置換基を有する。
チルを表わし、Dはヒドロキシ保護基である) で示される置換基を有する。
式(I)の化合物は、式: (式中、X,YおよびZは前記請求項1と同意義である) で示される5−ヨードウリジンまたは5−ヨードデオキ
シウリジンを式H−C≡CX′NR(式中、X′およびRは
前記と同意義)を有するアミノアルキンとパラジウム触
媒の存在で反応することにより製造することができる。
シウリジンを式H−C≡CX′NR(式中、X′およびRは
前記と同意義)を有するアミノアルキンとパラジウム触
媒の存在で反応することにより製造することができる。
より詳細には、式(I)の化合物は (A)式(1): (式中、BおよびB′は同一または異なってもよいヒド
ロキシ保護基、Yは前記と同意義である) の化合物を(Ph3P)2PdCl2およびCuIの存在で、H−C≡
C−X′NR(ここで、X′およびRは前記と同意義であ
る)と室温で反応させて式(2): の化合物を作成し、 (B)式(2)の化合物から保護基BおよびB′を除去
して、 式(3): を作成する段階を経て製造し得る。
ロキシ保護基、Yは前記と同意義である) の化合物を(Ph3P)2PdCl2およびCuIの存在で、H−C≡
C−X′NR(ここで、X′およびRは前記と同意義であ
る)と室温で反応させて式(2): の化合物を作成し、 (B)式(2)の化合物から保護基BおよびB′を除去
して、 式(3): を作成する段階を経て製造し得る。
式(3)の化合物はさらに反応によって本発明の他の
化合物へ変換し得る。
化合物へ変換し得る。
(C)化合物(3)を式B″A′(ここで、B″はトリ
チル基の任意の誘導体のような保護基、A′は脱離基で
ある)の化合物と反応させて式(4): を作成し、 (D)化合物(4)を式XR′(ここで、R′は脱離基、
Xは前記と同意義である)の化合物と反応させ、式
(5) を作成し、 (E)化合物(5)を、保護基B″が酸または塩基のど
ちらに不安定であるかによって、例えば酸または塩基の
いずれかと反応させてB″基を除き、ついでトリエチル
ホスフェートの存在でPOCl3と反応させて式(6) を作成し、 (F)化合物(6)を最初カルボニルジイミダゾール、
ついでトリス(テトラ−ブチルアンモニウム)ピロホス
フェートまたはトリブチルアンモニウム−ピロホスフェ
ートと反応させて式(7) を作成することができる。
チル基の任意の誘導体のような保護基、A′は脱離基で
ある)の化合物と反応させて式(4): を作成し、 (D)化合物(4)を式XR′(ここで、R′は脱離基、
Xは前記と同意義である)の化合物と反応させ、式
(5) を作成し、 (E)化合物(5)を、保護基B″が酸または塩基のど
ちらに不安定であるかによって、例えば酸または塩基の
いずれかと反応させてB″基を除き、ついでトリエチル
ホスフェートの存在でPOCl3と反応させて式(6) を作成し、 (F)化合物(6)を最初カルボニルジイミダゾール、
ついでトリス(テトラ−ブチルアンモニウム)ピロホス
フェートまたはトリブチルアンモニウム−ピロホスフェ
ートと反応させて式(7) を作成することができる。
本発明の好ましい化合物の一つに属する化合物(7)
は、その5′トリホスフェート基の存在によりイオン交
換クロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーまたは
セルロースクロマトグラフィーによって精製することが
できる。
は、その5′トリホスフェート基の存在によりイオン交
換クロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーまたは
セルロースクロマトグラフィーによって精製することが
できる。
任意の通常の脱離基R′を上記の反応(D)に使用し
得る。そのような基を例示すれば、Cl、Br、I、p−ニ
トロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシお
よびジイソプロピルアミノが挙げられる。B″はBおよ
びB′と同一または異なってもよい。当技術で自体公知
の標準的な手技を用いてB″を選択的に5′ヒドロキシ
へ導入できる。
得る。そのような基を例示すれば、Cl、Br、I、p−ニ
トロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシお
よびジイソプロピルアミノが挙げられる。B″はBおよ
びB′と同一または異なってもよい。当技術で自体公知
の標準的な手技を用いてB″を選択的に5′ヒドロキシ
へ導入できる。
式(2)の化合物のC−5置換基(ここで、RはBOC
のようなアミノ保護基)の鎖長は酸処理によってR基を
除き、ついで(1,8−ジアザシクロ[4.4.0]ウンデカ−
7−エン)DBUの存在で下記の式: [式中、Rはアミノ保護基、nは1〜50、Eはp−ニト
ロフェニルオキシまたはペンタフルオロフェニルオキシ
のような(当技術で自体公知の)好適な脱離基である] の型の活性エステルと反応することにより を作成することによって伸長することができる。
のようなアミノ保護基)の鎖長は酸処理によってR基を
除き、ついで(1,8−ジアザシクロ[4.4.0]ウンデカ−
7−エン)DBUの存在で下記の式: [式中、Rはアミノ保護基、nは1〜50、Eはp−ニト
ロフェニルオキシまたはペンタフルオロフェニルオキシ
のような(当技術で自体公知の)好適な脱離基である] の型の活性エステルと反応することにより を作成することによって伸長することができる。
この処理を所望の回数だけ実施し、炭素5置換基の鎖
長を伸ばすことができる。
長を伸ばすことができる。
当業者ならば容易に理解し得るように、式(I)の化
合物(ここで、RまたはAはBOCのようなアミノ保護
基)から、好適な条件下に保護基を除き、けい光団また
はその他の非放射性マーカーと遊離アミノ基とを反応さ
せると、それによってけい光団またはその他の非放射性
マーカーで標識したヌクレオシド誘導体を製造し得る。
合物(ここで、RまたはAはBOCのようなアミノ保護
基)から、好適な条件下に保護基を除き、けい光団また
はその他の非放射性マーカーと遊離アミノ基とを反応さ
せると、それによってけい光団またはその他の非放射性
マーカーで標識したヌクレオシド誘導体を製造し得る。
式(I)の化合物を用いてポリヌクレオチドを製造す
ることができる。
ることができる。
本発明はまた、式(III) (式中、X′、YおよびRは前記と同意義である) で示される1またはそれ以上のヌクレオチド単位を含ん
でいるポリヌクレオチドを提供する。
でいるポリヌクレオチドを提供する。
ヌクレオチド単位(III)はポリヌクレオチド鎖に挿
入された式(I)の化合物を表わす。
入された式(I)の化合物を表わす。
式(I)の化合物は標準的な方法を用いてcDNA、合成
オリゴヌクレオチドおよびRNAへ挿入できる
(7)、(8)〜(12)。
オリゴヌクレオチドおよびRNAへ挿入できる
(7)、(8)〜(12)。
本発明はまた、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド群を伸長しつつあるヌクレオチド鎖へ逐次結合し、そ
の際、ヌクレオチドの少なくとも一つが既述した式
(I)のヌクレオシド誘導体であることからなるポリヌ
クレオチドの合成方法を提供する。
ド群を伸長しつつあるヌクレオチド鎖へ逐次結合し、そ
の際、ヌクレオチドの少なくとも一つが既述した式
(I)のヌクレオシド誘導体であることからなるポリヌ
クレオチドの合成方法を提供する。
より詳細には、1またはそれ以上の式(III)のヌク
レオチド誘導体を含んだポリヌクレオチドは (a)第1のポリヌクレオチド、 (b)第1のポリヌクレオチドの一部とハイブリダイズ
する第2のポリヌクレオチド、 (c)1またはそれ以上のヌクレオチドトリホスフェー
ト、 (d)DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ を反応させることにより製造することができ、この場
合、該第2のポリヌクレオチドの3′末端からポリヌク
レオチドが合成され、該ヌクレオチドトリホスフェート
の少なくとも一つが式(I)のヌクレオシド誘導体(Z
はトリホスフェート、Xは水素)であることを特徴とす
る方法によって製造できる。
レオチド誘導体を含んだポリヌクレオチドは (a)第1のポリヌクレオチド、 (b)第1のポリヌクレオチドの一部とハイブリダイズ
する第2のポリヌクレオチド、 (c)1またはそれ以上のヌクレオチドトリホスフェー
ト、 (d)DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ を反応させることにより製造することができ、この場
合、該第2のポリヌクレオチドの3′末端からポリヌク
レオチドが合成され、該ヌクレオチドトリホスフェート
の少なくとも一つが式(I)のヌクレオシド誘導体(Z
はトリホスフェート、Xは水素)であることを特徴とす
る方法によって製造できる。
本発明はまたもう一つの態様として、ヌクレオチドの
少なくとも一つが式(I)のヌクレオシド誘導体[ここ
で、Xはホスフェートまたは式: (式中、R1、R2およびQは前記と同意義である) で示される基から選ばれる] であるヌクレオチドを、互いにそれぞれの5′および
3′末端で逐次結合することによる、1またはそれ以上
の該ヌクレオシド誘導体を含んだポリヌクレオチドの製
造を提供する。
少なくとも一つが式(I)のヌクレオシド誘導体[ここ
で、Xはホスフェートまたは式: (式中、R1、R2およびQは前記と同意義である) で示される基から選ばれる] であるヌクレオチドを、互いにそれぞれの5′および
3′末端で逐次結合することによる、1またはそれ以上
の該ヌクレオシド誘導体を含んだポリヌクレオチドの製
造を提供する。
式(I)の化合物は標準的なホスホトリエステル化学
を用いて合成オリゴヌクレオチドへ挿入できる(19)。
を用いて合成オリゴヌクレオチドへ挿入できる(19)。
RNAへ挿入する場合には、式(1)の化合物は5′ト
リホスフェート基および3′および2′位にヒドロキシ
ル基を有する。
リホスフェート基および3′および2′位にヒドロキシ
ル基を有する。
多重部位で標識したポリヌクレオチドは本発明の一態
様によって製造できる。多重標識の効果は、単一位置で
標識したポリヌクレオチドによって生じた信号よりも読
み取った信号が増強されるので有利である。
様によって製造できる。多重標識の効果は、単一位置で
標識したポリヌクレオチドによって生じた信号よりも読
み取った信号が増強されるので有利である。
ポリヌクレオチドへ挿入する前に式(I)のヌクレオ
シド誘導体がけい光団または非放射性の検出可能なマー
カーを含んでいない場合は、作成したポリヌクレオチド
へ、その後に検出可能な標識を挿入してもよい。例えば
C−5置換基の脂肪族アミノ基をマスキングしている保
護基を除き、このようにして生成したアミノ基を、フル
オレセイン−5−イソチオシアネートのようなけい光団
と反応させることによって実施し得る。
シド誘導体がけい光団または非放射性の検出可能なマー
カーを含んでいない場合は、作成したポリヌクレオチド
へ、その後に検出可能な標識を挿入してもよい。例えば
C−5置換基の脂肪族アミノ基をマスキングしている保
護基を除き、このようにして生成したアミノ基を、フル
オレセイン−5−イソチオシアネートのようなけい光団
と反応させることによって実施し得る。
けい光を有しないけい光団類似体(けい光団前駆体)
を含んでいるヌクレオシドをポリヌクレオチドの製造に
使用できる。けい光団前駆体を使用すると、ポリヌクレ
オチド製造に必要な化学操作の間にけい光団が脱色を起
こす可能性が避けられる。好適な条件下に(例えばアン
モニア処理)けい光を抑えているけい光団前駆体のそれ
らの基を除き、けい光団前駆体をけい光体の形へ変換す
ることができる。フルオレセインのけい光を発しない類
似体を含んだ式(I)のヌクレオシド誘導体を製造する
ための反応式を例示的に第2図に示す。第2図で生じた
化合物Bは下記の式を有する。
を含んでいるヌクレオシドをポリヌクレオチドの製造に
使用できる。けい光団前駆体を使用すると、ポリヌクレ
オチド製造に必要な化学操作の間にけい光団が脱色を起
こす可能性が避けられる。好適な条件下に(例えばアン
モニア処理)けい光を抑えているけい光団前駆体のそれ
らの基を除き、けい光団前駆体をけい光体の形へ変換す
ることができる。フルオレセインのけい光を発しない類
似体を含んだ式(I)のヌクレオシド誘導体を製造する
ための反応式を例示的に第2図に示す。第2図で生じた
化合物Bは下記の式を有する。
化合物Bはアンモニア処理によるイソブチリル基の除
去によってけい光を発し得る。
去によってけい光を発し得る。
化合物Bはオリゴヌクレオチド合成(5′、3′を保
護したホスホアミダイトの形で)またはcDNA(5′トリ
ホスフェートの形で)に使用し得る。化合物Bのウリジ
ン類似体はT4ポリメラーゼ(11)またはSP6ポリメラーゼ
(12)によるRNA合成に使用し得る。
護したホスホアミダイトの形で)またはcDNA(5′トリ
ホスフェートの形で)に使用し得る。化合物Bのウリジ
ン類似体はT4ポリメラーゼ(11)またはSP6ポリメラーゼ
(12)によるRNA合成に使用し得る。
本発明の化合物は通常同位元素で標識したプローブを
利用する分子生物学的技術に有用である。そのような技
術はドットブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼ
ーション組織化学、ノーザンブロットおよびプラークハ
イブリダイゼーションのようなDNAおよびRNAハイブリダ
イゼーション等である。
利用する分子生物学的技術に有用である。そのような技
術はドットブロット、サザンブロット、ハイブリダイゼ
ーション組織化学、ノーザンブロットおよびプラークハ
イブリダイゼーションのようなDNAおよびRNAハイブリダ
イゼーション等である。
式(I)のヌクレオシド誘導体またはそのようなヌク
レオシド誘導体を挿入したポリデオキシヌクレオチドは
DNA配列決定反応に使用し得る。
レオシド誘導体を挿入したポリデオキシヌクレオチドは
DNA配列決定反応に使用し得る。
本発明のもう一つの態様は、 (a)(i)ポリデオキシヌクレオチド、 (ii)ポリデオキシヌクレオチド(i)の一部とハイ
ブリダイズし得るポリデオキシヌクレオチドプライマ
ー、 (iii)dATP、dGTP、dCTP、dTTP、 (iv)ddATP、 (v)DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼのクレ
ノー断片、 からなる第1の反応混合物を用意し、 (b)ddATPをddGTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第2の反応混合物を用意し、 (c)ddATPをddCTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第3の反応混合物を用意し、 (d)ddATPをddTTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第4の反応混合物を用意し、 (e)上記の反応混合物を別々にインキュベートして、
それぞれのポリデオキシヌクレオチドプライマーをその
3′末端から伸長させ、種々の鎖長のポリデオキシヌク
レオチド群を作成し、この場合、伸長しつつある鎖ヘジ
デオキシヌクレオチドが挿入されることによって新たに
合成される各ポリデオキシヌクレオチドにおけるヌクレ
オチド数が決定され、 (f)ゲルマトリックスを通過させることにより反応混
合物(a)〜(d)を分画する、 各工程からなり、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
(ii)が1またはそれ以上の上記の式(III)のヌクレ
オチド単位(ここで、RおよびAはけい光団またはその
他の非放射性の検出可能なマーカーである)を含有する
ポリデオキシヌクレオチドであり、そして/または上記
の各反応混合物が式(I)のヌクレオシド誘導体(ここ
で、Zはトリホスフェート、Xは水素、RまたはAはけ
い光団またはその他の検出可能なマーカーである)を含
有しており、それによってけい光団またはその他の非放
射性の検出可能なマーカーが新たに合成した各ポリデオ
キシヌクレオチドへ挿入されること、および新たに合成
されたポリデオキシヌクレオチドに含まれたけい光団ま
たはその他の非放射性の検出可能なマーカーの検出によ
って、ゲルマトリックスで分離された新たに合成された
ポリデオキシヌクレオチドの相対的な位置を確認し、こ
のようにして第1のポリヌクレオチドのDNA配列を明ら
かにすることを特徴とするDNAの配列決定方法を提供す
るものである。
ブリダイズし得るポリデオキシヌクレオチドプライマ
ー、 (iii)dATP、dGTP、dCTP、dTTP、 (iv)ddATP、 (v)DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼのクレ
ノー断片、 からなる第1の反応混合物を用意し、 (b)ddATPをddGTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第2の反応混合物を用意し、 (c)ddATPをddCTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第3の反応混合物を用意し、 (d)ddATPをddTTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第4の反応混合物を用意し、 (e)上記の反応混合物を別々にインキュベートして、
それぞれのポリデオキシヌクレオチドプライマーをその
3′末端から伸長させ、種々の鎖長のポリデオキシヌク
レオチド群を作成し、この場合、伸長しつつある鎖ヘジ
デオキシヌクレオチドが挿入されることによって新たに
合成される各ポリデオキシヌクレオチドにおけるヌクレ
オチド数が決定され、 (f)ゲルマトリックスを通過させることにより反応混
合物(a)〜(d)を分画する、 各工程からなり、ポリデオキシヌクレオチドプライマー
(ii)が1またはそれ以上の上記の式(III)のヌクレ
オチド単位(ここで、RおよびAはけい光団またはその
他の非放射性の検出可能なマーカーである)を含有する
ポリデオキシヌクレオチドであり、そして/または上記
の各反応混合物が式(I)のヌクレオシド誘導体(ここ
で、Zはトリホスフェート、Xは水素、RまたはAはけ
い光団またはその他の検出可能なマーカーである)を含
有しており、それによってけい光団またはその他の非放
射性の検出可能なマーカーが新たに合成した各ポリデオ
キシヌクレオチドへ挿入されること、および新たに合成
されたポリデオキシヌクレオチドに含まれたけい光団ま
たはその他の非放射性の検出可能なマーカーの検出によ
って、ゲルマトリックスで分離された新たに合成された
ポリデオキシヌクレオチドの相対的な位置を確認し、こ
のようにして第1のポリヌクレオチドのDNA配列を明ら
かにすることを特徴とするDNAの配列決定方法を提供す
るものである。
上記の段階(e)の新たに合成されたポリヌクレオチ
ドは、例えばレーザー光のような光源の照射によって誘
発されたけい光により検出できる。
ドは、例えばレーザー光のような光源の照射によって誘
発されたけい光により検出できる。
上記の各反応混合物(a)〜(d)はそれぞれ異なっ
た発光極大を有する異なったけい光団または異なった非
放射性の検出可能なマーカーを含むことができる。即ち
上記の各反応混合物(a)〜(d)においてオリゴヌク
レオチドプライマー(ii)および/または式(I)のヌ
クレオシド誘導体は区別し得る発光極大を有するRまた
はA基を含んでいる。
た発光極大を有する異なったけい光団または異なった非
放射性の検出可能なマーカーを含むことができる。即ち
上記の各反応混合物(a)〜(d)においてオリゴヌク
レオチドプライマー(ii)および/または式(I)のヌ
クレオシド誘導体は区別し得る発光極大を有するRまた
はA基を含んでいる。
本発明の幾つかの態様を単に例示するため、添付図面
を引用して説明する。
を引用して説明する。
第1図は本明細書に用いたC−5置換ヌクレオシドの
番号表示方法、第2図は修飾された非けい光のフルオレ
セイン部分を挿入した本発明のヌクレオシド誘導体の製
造、第3図は保護アミノアルキンヌクレオシド2の製
造、第4図は短いC−5鎖のヌクレオシドホスホアミダ
イト7の製造、第5図は長いC−5鎖のヌクレオシドホ
スホアミダイト11の製造、第6図は短いC−5鎖にけい
光で標識したカリクレイン・オリズヌクレオチドとマウ
ス唾液腺mRNAとのドットブロットハイブリダイゼーショ
ン検定を示す。プローブを32P末端標識し、以下に説明
するようにハイブリッドを形成する。Aは標準プローブ
を高度ストリンジェンシー条件下で4時間露光、Bは単
一標識プローブを中程度ストリンジェンシー条件下で4
時間露光、Cは標準プローブを高度ストリンジェンシー
条件下で16時間露光、Dは多重標識プローブを低ストリ
ンジェンシー条件下で16時間露光、Eは多重標識プロー
ブを最低ストリンジェンシー条件下で16時間露光したも
のである。
番号表示方法、第2図は修飾された非けい光のフルオレ
セイン部分を挿入した本発明のヌクレオシド誘導体の製
造、第3図は保護アミノアルキンヌクレオシド2の製
造、第4図は短いC−5鎖のヌクレオシドホスホアミダ
イト7の製造、第5図は長いC−5鎖のヌクレオシドホ
スホアミダイト11の製造、第6図は短いC−5鎖にけい
光で標識したカリクレイン・オリズヌクレオチドとマウ
ス唾液腺mRNAとのドットブロットハイブリダイゼーショ
ン検定を示す。プローブを32P末端標識し、以下に説明
するようにハイブリッドを形成する。Aは標準プローブ
を高度ストリンジェンシー条件下で4時間露光、Bは単
一標識プローブを中程度ストリンジェンシー条件下で4
時間露光、Cは標準プローブを高度ストリンジェンシー
条件下で16時間露光、Dは多重標識プローブを低ストリ
ンジェンシー条件下で16時間露光、Eは多重標識プロー
ブを最低ストリンジェンシー条件下で16時間露光したも
のである。
第7図は長いC−5鎖にけい光で標識したカリクレイ
ンプローブで実施したドットブロットハイブリダイゼー
ション検定を示す。プローブは32P末端標識し、高度ス
トリンジェンシー条件下でハイブリッド形成した。オー
トラジオグラフの露光時間は4時間であった。Aは標準
プローブ、Bは単一標識プローブ、Cは多重標識プロー
ブである。
ンプローブで実施したドットブロットハイブリダイゼー
ション検定を示す。プローブは32P末端標識し、高度ス
トリンジェンシー条件下でハイブリッド形成した。オー
トラジオグラフの露光時間は4時間であった。Aは標準
プローブ、Bは単一標識プローブ、Cは多重標識プロー
ブである。
第8図は32P末端標識、単一けい光標識をしたカリク
レインプローブと3つの異なったRNA種とのブロットハ
イブリダイゼーション検定を示す。ハイブリダイゼーシ
ョンは中程度ストリンジェンシー条件下で実施し、オー
トラジオグラフの露光時間は16時間であった。Aは短い
C−5鎖のプローブ、Bは長いC−5鎖のプローブであ
る。
レインプローブと3つの異なったRNA種とのブロットハ
イブリダイゼーション検定を示す。ハイブリダイゼーシ
ョンは中程度ストリンジェンシー条件下で実施し、オー
トラジオグラフの露光時間は16時間であった。Aは短い
C−5鎖のプローブ、Bは長いC−5鎖のプローブであ
る。
材料および方法 5−ヨードデオキシウリジンおよびフルオレセインイ
ソチオシアネート(FITC)はシグマ・ケミカル・カンパ
ニー(Sigma Chemical Company)から入手した。1H NMR
スペクトルはJEOLFX90Qの90MHz、JEOL FX100の100MHz、
またはBRUKER300の300MHzのいずれかで測定した。13C N
MRスペクトルはJEOL FX90Qの22.5MHz、JEOL FX100の25M
HzまたはBRUKER300の75MHzのいずれかで操作して測定し
た。多重度が観察された場合、JEOL FQ90QまたはFX100
では単一周波数オフレゾナンス(SFOR)法により、また
BRUKER300ではDEPTパルス系列を用いることによって多
重度を測定した。NMR分析に用いたヌクレオシド番号表
示方法は親ヌクレオシドを例にとって第1図に示す。31
P NMRスペクトルはBRUKER300で121MHzで操作し、外部標
準として用いた85%H3PO4から低磁場側を測定した。低
磁場の値が正である。微量分析はオーストレーリアン・
マイクロアナリティカル・サービス(Australian Micro
analytical Service)(メルボルン)で測定した。ピリ
ジンは水酸化カリウムで蒸留し、5Aモレキュラーシーブ
で貯蔵した。アセトニトリルおよびメタノールは3Aモレ
キュラーシーブで乾燥した。トリエチルアミンは水素化
カルシウムで蒸留し、アルゴンを封入して貯蔵した。ホ
スホアミダイト合成で使用するジクロロメタンは、5Aモ
レキュラーシーブで乾燥した。テトラゾールは0.05mmHg
で110℃で昇華した。ジイソプロピルアミンは水素化カ
ルシウムで蒸留し、3Aモレキュラーシーブで貯蔵した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)はメルク・アナリティ
カル・シリカゲル・プレート[メルク(Merck)No.573
5]で下記の溶媒系:S1、CH2Cl2/MeOH(90:10、v/v)、S
2、CH2Cl2/MeOH(98:2、v/v)またはS3、CH2Cl2/EtOAc/
Et3N(45:45:10、v/v)を使用して実施した。融点は電
熱式融点測定装置で開放毛細管を用いて測定した。
ソチオシアネート(FITC)はシグマ・ケミカル・カンパ
ニー(Sigma Chemical Company)から入手した。1H NMR
スペクトルはJEOLFX90Qの90MHz、JEOL FX100の100MHz、
またはBRUKER300の300MHzのいずれかで測定した。13C N
MRスペクトルはJEOL FX90Qの22.5MHz、JEOL FX100の25M
HzまたはBRUKER300の75MHzのいずれかで操作して測定し
た。多重度が観察された場合、JEOL FQ90QまたはFX100
では単一周波数オフレゾナンス(SFOR)法により、また
BRUKER300ではDEPTパルス系列を用いることによって多
重度を測定した。NMR分析に用いたヌクレオシド番号表
示方法は親ヌクレオシドを例にとって第1図に示す。31
P NMRスペクトルはBRUKER300で121MHzで操作し、外部標
準として用いた85%H3PO4から低磁場側を測定した。低
磁場の値が正である。微量分析はオーストレーリアン・
マイクロアナリティカル・サービス(Australian Micro
analytical Service)(メルボルン)で測定した。ピリ
ジンは水酸化カリウムで蒸留し、5Aモレキュラーシーブ
で貯蔵した。アセトニトリルおよびメタノールは3Aモレ
キュラーシーブで乾燥した。トリエチルアミンは水素化
カルシウムで蒸留し、アルゴンを封入して貯蔵した。ホ
スホアミダイト合成で使用するジクロロメタンは、5Aモ
レキュラーシーブで乾燥した。テトラゾールは0.05mmHg
で110℃で昇華した。ジイソプロピルアミンは水素化カ
ルシウムで蒸留し、3Aモレキュラーシーブで貯蔵した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)はメルク・アナリティ
カル・シリカゲル・プレート[メルク(Merck)No.573
5]で下記の溶媒系:S1、CH2Cl2/MeOH(90:10、v/v)、S
2、CH2Cl2/MeOH(98:2、v/v)またはS3、CH2Cl2/EtOAc/
Et3N(45:45:10、v/v)を使用して実施した。融点は電
熱式融点測定装置で開放毛細管を用いて測定した。
実施例1 ヌクレオシド類似体の合成 3′,5′−ジ−O−p−トルオイル−5−ヨードデオキ
シウリジン(1) デオキシウリジンの代わりに5−ヨードデオキシウリ
ジンを使用し、ロビンスらの方法(18)の改良法により、
表題の化合物を製造した。収率92%。mp205〜206℃(文
献値(14)、195〜196℃)。13C NMR(CDCl3、25MHz)、
δ21.7(CH3)、38.7(C−2′)、64.1(C−
5′)、69.0(C−5)、74.9(C−3′)、83.4(C
−1′)、85.8(C−4′)、126.1、126.4(トルオイ
ル、C−1)、129.3、129.5、129.8(トルオイル、C
−2、C−3、C−5、C−6)、143.6(C−6)、1
44.6(トルオイル、C−4)、149.2(C−2)、159.7
(C−4)、166.0(トルオイル、C−O)。
シウリジン(1) デオキシウリジンの代わりに5−ヨードデオキシウリ
ジンを使用し、ロビンスらの方法(18)の改良法により、
表題の化合物を製造した。収率92%。mp205〜206℃(文
献値(14)、195〜196℃)。13C NMR(CDCl3、25MHz)、
δ21.7(CH3)、38.7(C−2′)、64.1(C−
5′)、69.0(C−5)、74.9(C−3′)、83.4(C
−1′)、85.8(C−4′)、126.1、126.4(トルオイ
ル、C−1)、129.3、129.5、129.8(トルオイル、C
−2、C−3、C−5、C−6)、143.6(C−6)、1
44.6(トルオイル、C−4)、149.2(C−2)、159.7
(C−4)、166.0(トルオイル、C−O)。
3−第3級ブチルオキシカルボニルアミドプロピン CH2Cl2200mlへ3−アミノプロピン2.75g(50ミリモ
ル)を添加し、ついでジ−第3級ブチルピロカーボネー
ト10.92g(50ミリモル)を添加した。3時間攪拌した
後、反応混合物を蒸発してシロップ状とし、−20℃に保
って結晶化させた。生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄
し、乾燥して5.34gを得た(69%)。mp42〜44℃(文献
値(13)、mp43℃)。
ル)を添加し、ついでジ−第3級ブチルピロカーボネー
ト10.92g(50ミリモル)を添加した。3時間攪拌した
後、反応混合物を蒸発してシロップ状とし、−20℃に保
って結晶化させた。生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄
し、乾燥して5.34gを得た(69%)。mp42〜44℃(文献
値(13)、mp43℃)。
1H NMR(CDCl3、90MHz):δ1.46(9H、s、CH3)、
2.21(1H、t、J=2.6Hz、C=CH)、3.91(2H、dd、
J=2.6Hzおよび3.5Hz、CH2)、4.68(1H、巾広いs、N
H)。13C NMR(CDCl3、22.5MHz)、δ28.4(CH3)、30.
6(CH2)、71.2(C−1)、80.1(C(CH3)3)、80.2
(C−2)、155.3(C=O)。
2.21(1H、t、J=2.6Hz、C=CH)、3.91(2H、dd、
J=2.6Hzおよび3.5Hz、CH2)、4.68(1H、巾広いs、N
H)。13C NMR(CDCl3、22.5MHz)、δ28.4(CH3)、30.
6(CH2)、71.2(C−1)、80.1(C(CH3)3)、80.2
(C−2)、155.3(C=O)。
5−(3−第3級ブチルオキシカルボニルアミドプロパ
−1−インイル)−3′,5′−ジ−O−p−トルオイル
デオキシウリジン(2) 脱酸素化した酢酸エチル500mlへ3′,5′−ジ−O−
p−トルオイル−5−ヨードデオキシウリジン(1)の
5.90g(10ミリモル)を添加し、これにN−BOC−3−ア
ミノプロピン3.10g(20ミリモル)、(Ph3P)2PdCl2150m
g、CuI150mgおよびトリエチルアミン6.7ml(50ミリモ
ル)を添加した。得られた懸濁液を室温で攪拌し、反応
をTLC(S2)で追跡した。
−1−インイル)−3′,5′−ジ−O−p−トルオイル
デオキシウリジン(2) 脱酸素化した酢酸エチル500mlへ3′,5′−ジ−O−
p−トルオイル−5−ヨードデオキシウリジン(1)の
5.90g(10ミリモル)を添加し、これにN−BOC−3−ア
ミノプロピン3.10g(20ミリモル)、(Ph3P)2PdCl2150m
g、CuI150mgおよびトリエチルアミン6.7ml(50ミリモ
ル)を添加した。得られた懸濁液を室温で攪拌し、反応
をTLC(S2)で追跡した。
90時間後、出発物質が消失した。ついでさらに酢酸エ
チル200mlを追加し、得られた反応溶液を5%EDTA二ナ
トリウム/H2O(2×300ml)、H2O(300ml)および食塩
水(300ml)で洗浄した。ついでこれを乾燥し(Na2S
O4)、溶媒を蒸発し、残留物を溶媒(S3)15mlに再溶解
して、これと同じ溶媒を使用したフラッシュクロマトグ
ラフィーにより精製した。収量5.08g(84%)。試料をC
HCl3/MeOH(1:5)から再結晶して(2)を得た。mp169.5
〜170.5℃。
チル200mlを追加し、得られた反応溶液を5%EDTA二ナ
トリウム/H2O(2×300ml)、H2O(300ml)および食塩
水(300ml)で洗浄した。ついでこれを乾燥し(Na2S
O4)、溶媒を蒸発し、残留物を溶媒(S3)15mlに再溶解
して、これと同じ溶媒を使用したフラッシュクロマトグ
ラフィーにより精製した。収量5.08g(84%)。試料をC
HCl3/MeOH(1:5)から再結晶して(2)を得た。mp169.5
〜170.5℃。
UV(MeOH)λmax:290nm(肩)、283、237nm(ε11800、
12400、39800)。λmin:263nm(ε5900)。1H NMR(CDC
l3、90MHz):δ1.44(9H、s、C(CH3)3)、2.42(6H、
s、トルオイル、CH3)、2.7(2H、m、H2′)、3.97
(3H、d、J=5.1Hz、Hg)、4.6−4.7(4H、m、
H4′、H5′およびBOC NH)、5.6(1H、m、H3′)、6.4
(1H、m、H1′)、7.26(4H、d、J=8.1Hz、トルオ
イル、H3およびH6)、9.16(1H、m、H3′)、6.4(1
H、m、H1′)、7.26(4H、d、J=8.1Hz、トルオイ
ル、H3およびH6)、9.16(1H、s、複素環NH)。13C NM
R(CDCl3、22.5MHz)、δ21.7(q、トルオイル、C
H3)、28.4(q、C(CH3)3)、31.4(t、C−9)、3
8.6(t、C−2′)、64.1(t、C−5′)、73.8
(s、C−8)、74.9(d、C−3′)、80.0(s、C
(CH3)3)、83.4(d、C−1′)、86.1(d、C−
4′)、90.3(s、C−7)、100.2(s、C−5)、1
26.4および126.6(2s、トルオイル、C−1)、129.3−
129.9(4s、トルオイル、C−2、C−3、C−5およ
びC−6)、141.9(d、C−6)、144.5(s、トルオ
イル、C−4)、149.2(s、C−2)、155.3(s、BO
C、C=O)、161.7(s、C−4)、166.04および166.
15(2s、トルオイル、C=O)。
12400、39800)。λmin:263nm(ε5900)。1H NMR(CDC
l3、90MHz):δ1.44(9H、s、C(CH3)3)、2.42(6H、
s、トルオイル、CH3)、2.7(2H、m、H2′)、3.97
(3H、d、J=5.1Hz、Hg)、4.6−4.7(4H、m、
H4′、H5′およびBOC NH)、5.6(1H、m、H3′)、6.4
(1H、m、H1′)、7.26(4H、d、J=8.1Hz、トルオ
イル、H3およびH6)、9.16(1H、m、H3′)、6.4(1
H、m、H1′)、7.26(4H、d、J=8.1Hz、トルオイ
ル、H3およびH6)、9.16(1H、s、複素環NH)。13C NM
R(CDCl3、22.5MHz)、δ21.7(q、トルオイル、C
H3)、28.4(q、C(CH3)3)、31.4(t、C−9)、3
8.6(t、C−2′)、64.1(t、C−5′)、73.8
(s、C−8)、74.9(d、C−3′)、80.0(s、C
(CH3)3)、83.4(d、C−1′)、86.1(d、C−
4′)、90.3(s、C−7)、100.2(s、C−5)、1
26.4および126.6(2s、トルオイル、C−1)、129.3−
129.9(4s、トルオイル、C−2、C−3、C−5およ
びC−6)、141.9(d、C−6)、144.5(s、トルオ
イル、C−4)、149.2(s、C−2)、155.3(s、BO
C、C=O)、161.7(s、C−4)、166.04および166.
15(2s、トルオイル、C=O)。
元素分析(C33H35O9N3): 計算分析値:C64.17;H5.71;N6.80 実測値:C63.94;H5.52;N6.55 5−(3−第3級ブチルオキシカルボニルアミドプロパ
−1−インイル)−5′−O−ジメトキシトリチルデオ
キシウリジン(5) 乾燥K2CO3304mg(2.2ミリモル)の乾燥メタノール5ml
懸濁液を攪拌しながら、(2)の617mg(1ミリモル)を
これに添加した。1.5時間後に反応混合物を濾過し、濾
液をダウエックス(Dowex)50−X8(H+)で中和し、樹
脂を濾去し、濾液を蒸発乾固して(4)を得た。生成物
を乾燥ピリジン5mlと共に蒸発して(3×5ml)完全に乾
燥し、乾燥ピリジン5mlに再度溶解した。4,4′−ジメト
キシトリチルクロリド406mg(1.2ミリモル)を添加して
混合物を室温で4時間攪拌したのち、反応の完結をTLC
(S1)により判定した。MeOH2mlを加えて溶液をさらに1
0分間攪拌し、蒸発し、ジクロロメタン30mlに溶解し
て、10%NaHCO3/H2O(30ml)、食塩水(30ml)で洗浄
し、乾燥した(Na2SO4)。溶媒を再び蒸発して生成物を
CH2Cl25mlに溶解し、フラッシュクロマトグラフィーに
よって精製し、最初2%MeOH/CH2Cl2300ml、ついで10%
MeOH、CH2Cl2で溶出した。生成物を含有する画分をプー
ルして蒸発乾固し、(5)の468mg(2に対して68%)を
得た。
−1−インイル)−5′−O−ジメトキシトリチルデオ
キシウリジン(5) 乾燥K2CO3304mg(2.2ミリモル)の乾燥メタノール5ml
懸濁液を攪拌しながら、(2)の617mg(1ミリモル)を
これに添加した。1.5時間後に反応混合物を濾過し、濾
液をダウエックス(Dowex)50−X8(H+)で中和し、樹
脂を濾去し、濾液を蒸発乾固して(4)を得た。生成物
を乾燥ピリジン5mlと共に蒸発して(3×5ml)完全に乾
燥し、乾燥ピリジン5mlに再度溶解した。4,4′−ジメト
キシトリチルクロリド406mg(1.2ミリモル)を添加して
混合物を室温で4時間攪拌したのち、反応の完結をTLC
(S1)により判定した。MeOH2mlを加えて溶液をさらに1
0分間攪拌し、蒸発し、ジクロロメタン30mlに溶解し
て、10%NaHCO3/H2O(30ml)、食塩水(30ml)で洗浄
し、乾燥した(Na2SO4)。溶媒を再び蒸発して生成物を
CH2Cl25mlに溶解し、フラッシュクロマトグラフィーに
よって精製し、最初2%MeOH/CH2Cl2300ml、ついで10%
MeOH、CH2Cl2で溶出した。生成物を含有する画分をプー
ルして蒸発乾固し、(5)の468mg(2に対して68%)を
得た。
UV(MeOH)λmax:294nm(肩)、283、231nm(ε6100、6
800、21500)、λmin:257nm(2500)。1H NMR(CDCl3、
100MHz):δ1.39(9H、s、BOC、CH3)、2.4(2H、
m、H2′)、3.38(2H、m、H5′)、3.78(8H、s、OC
H3プラスH9)、4.1(1H、m、H4′)、4.6(3H、m、
H3′+BOC NH)、6.32(1H、t、H1′)、6.80、6.89
(4H、J=9.0Hz、PhOCH3のメタ位CH)、7.2−7.5(9
H、m、PhOCH3のオルト位のCHおよびPhの7.29、7.34
(J=9.0Hz)の2重線を含んでいる)、8.11(1H、
s、H6)。
800、21500)、λmin:257nm(2500)。1H NMR(CDCl3、
100MHz):δ1.39(9H、s、BOC、CH3)、2.4(2H、
m、H2′)、3.38(2H、m、H5′)、3.78(8H、s、OC
H3プラスH9)、4.1(1H、m、H4′)、4.6(3H、m、
H3′+BOC NH)、6.32(1H、t、H1′)、6.80、6.89
(4H、J=9.0Hz、PhOCH3のメタ位CH)、7.2−7.5(9
H、m、PhOCH3のオルト位のCHおよびPhの7.29、7.34
(J=9.0Hz)の2重線を含んでいる)、8.11(1H、
s、H6)。
元素分析(C38H41O9N3): 計算分析値:C66.75;H6.04;N6.15 実測値:C66.89;H5.82;N6.00 またヌクレオシド(4)は脱保護反応後、炭酸カリウ
ムを濾過し、粗製反応混合物のフラッシュクロマトグラ
フィーにより(溶出液20%MeOH/CH2Cl2)精製し、(4)
を得た。1H NMR(d6−DMSO、100MHz):δ1.39(9H、
s、CH3)、2.1(2H、m、H2′)、3.35(6H、s、試料
中に存在する2分子のメタノール)、3.6(2H、m、
H5′)、3.8(1H、m、H4′)、3.93(2H、d、J=5.9
Hz、H9)、4.2(1H、m、H3′)、5.10(1H、t、J=5
Hz、5′−OH)、2.25(1H、d、J=4Hz、3′−O
H)、6.11(1H、t、J=6.6Hz、H1′)、8.14(1H、
s、複素環NH)。UV(MeOH)λmax:290、231nm(ε1290
0、18200)、λmin:254nm(ε4200)。260nmではε=58
00M-1。
ムを濾過し、粗製反応混合物のフラッシュクロマトグラ
フィーにより(溶出液20%MeOH/CH2Cl2)精製し、(4)
を得た。1H NMR(d6−DMSO、100MHz):δ1.39(9H、
s、CH3)、2.1(2H、m、H2′)、3.35(6H、s、試料
中に存在する2分子のメタノール)、3.6(2H、m、
H5′)、3.8(1H、m、H4′)、3.93(2H、d、J=5.9
Hz、H9)、4.2(1H、m、H3′)、5.10(1H、t、J=5
Hz、5′−OH)、2.25(1H、d、J=4Hz、3′−O
H)、6.11(1H、t、J=6.6Hz、H1′)、8.14(1H、
s、複素環NH)。UV(MeOH)λmax:290、231nm(ε1290
0、18200)、λmin:254nm(ε4200)。260nmではε=58
00M-1。
5−(3−第3級ブチルオキシカルボニルアミドプロパ
ー−1−インイル)−5′−O−ジメトキシトリチル−
3′−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニ
ル−デオキシウリジン(7) アルゴン気流中、(5)の243mg(0.5ミリモル)を乾
燥CH2−Cl25mlに溶解した溶液を25ml丸底フラスコへ加
えた。これにテトラゾール17.5mg(0.25ミリモル)およ
び乾燥ジイソプロピルアミン25μl(0.25ミリモル)を
添加した。テトラゾールが溶解するまで溶液を攪拌し
た。ついでビス(ジイソプロピルアミノ)メトキシホス
フィン(17)(6)の300μl(1.1ミリモル)を添加した
後、反応をTLC(S3)で追跡した。5時間後、反応混合
物を10%NaHCO3/H2O(2×25ml)および食塩水(2×2
5ml)で洗浄し、乾燥した(Na2SO4)。溶媒を蒸発し
て、(7)を392mg得た(粗収率93%)。この物質の31P
NMRスペクトルは150.19および150.45ppmの2重線からな
る主ピークと4.23および10.41ppmに低いピークを示し
た。これらの副生物は結合反応を妨害しない。
ー−1−インイル)−5′−O−ジメトキシトリチル−
3′−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニ
ル−デオキシウリジン(7) アルゴン気流中、(5)の243mg(0.5ミリモル)を乾
燥CH2−Cl25mlに溶解した溶液を25ml丸底フラスコへ加
えた。これにテトラゾール17.5mg(0.25ミリモル)およ
び乾燥ジイソプロピルアミン25μl(0.25ミリモル)を
添加した。テトラゾールが溶解するまで溶液を攪拌し
た。ついでビス(ジイソプロピルアミノ)メトキシホス
フィン(17)(6)の300μl(1.1ミリモル)を添加した
後、反応をTLC(S3)で追跡した。5時間後、反応混合
物を10%NaHCO3/H2O(2×25ml)および食塩水(2×2
5ml)で洗浄し、乾燥した(Na2SO4)。溶媒を蒸発し
て、(7)を392mg得た(粗収率93%)。この物質の31P
NMRスペクトルは150.19および150.45ppmの2重線からな
る主ピークと4.23および10.41ppmに低いピークを示し
た。これらの副生物は結合反応を妨害しない。
この物質の少量をフラッシュ・クロマトグラフィー
(S3)により精製した。1H NMR(CD3CN、100MHz):δ
1.13(12H、2d、J=6.5Hz、CH(CH3 )2)、1.38(9H、
s、BOC CH3)、2.4(2H、m、H2′)、3.2−3.5(5H、
2dを含んだm(J=13.3Hz、PCH3)およびH5′)、3.5
(2H、m、CH(CH3)2)、3.7−3.8(8H、3.77に1本の強
い1重線を含んだm(トリチル、OCH3)およびH9)、4.
1(1H、m、H4′)、4.6(1H、m、H3′)、6.1(1H、d
t、H1′)、6.8−7.5(13H、m、トリチル、CH)、7.90
および7.91(1H、2s、H6)。
(S3)により精製した。1H NMR(CD3CN、100MHz):δ
1.13(12H、2d、J=6.5Hz、CH(CH3 )2)、1.38(9H、
s、BOC CH3)、2.4(2H、m、H2′)、3.2−3.5(5H、
2dを含んだm(J=13.3Hz、PCH3)およびH5′)、3.5
(2H、m、CH(CH3)2)、3.7−3.8(8H、3.77に1本の強
い1重線を含んだm(トリチル、OCH3)およびH9)、4.
1(1H、m、H4′)、4.6(1H、m、H3′)、6.1(1H、d
t、H1′)、6.8−7.5(13H、m、トリチル、CH)、7.90
および7.91(1H、2s、H6)。
5−(3−アミノプロパ−1−インイル)−3′,5′−
ジ−O−p−トルオイルデオキシウリジン・トリフルオ
ロ酢酸塩(8) 95%CF3CO2H/H2O(TFA/H2O)20mlへ(2)の3.09g
(5ミリモル)を添加した。10分間攪拌した後、溶媒を
蒸発乾固した。ついで酢酸エチル10mlを加えて再び蒸発
し、生成物を結晶化させ、これを濾取し、乾燥して
(8)を2.56g(81%)得た。
ジ−O−p−トルオイルデオキシウリジン・トリフルオ
ロ酢酸塩(8) 95%CF3CO2H/H2O(TFA/H2O)20mlへ(2)の3.09g
(5ミリモル)を添加した。10分間攪拌した後、溶媒を
蒸発乾固した。ついで酢酸エチル10mlを加えて再び蒸発
し、生成物を結晶化させ、これを濾取し、乾燥して
(8)を2.56g(81%)得た。
mp120℃(分解)。UV(MeOH)λmax:290nm(肩)、28
2、236nm(ε11900、12400、41200)。λmin:263nm(ε
9000)。1H NMR(90MHz、d6−DMSO):δ2.39(6H、
s、CH3)、2.5−2.6(m、溶媒プラスH2′)、3.7
(m、溶媒中のH2O不純物プラスH9)、4.6(3H、m、
H4′およびH5′)、5.6(1H、m、H3′)、6.24(1H、
t、H1′)、7.34(4H、2d、J=8.1Hz、トルオイル、H
2およびH6)、7.90(4H、2d、J=8.1Hz、トルオイル、
H3およびH5)、8.07(1H、s、H6)、8.3(3H、bs、NH3
+)、11.80(1H、s、複素環NH)。13C NMR(75MHz、d6
−DMSO)、δ21.2(CH3)、29.0(C−9)、36.4(C
−2′)、64.2(C−5′)、74.4(C−3′)、78.5
(C−8)、81.5(C−1′)、85.2(C−7)、85.7
(C−4′)、97.6(C−5)、126.4(トルオイル、
C−1)、129.3、129.5(トルオイル、C−2、C−
3、C−5およびC−6)、143.9(C−6)、144.8
(トルオイル、C−4)、149.3(C−2)、161.3(C
−4)、165.2(カルボキシル)、165.6(トルオイル、
C=0)。
2、236nm(ε11900、12400、41200)。λmin:263nm(ε
9000)。1H NMR(90MHz、d6−DMSO):δ2.39(6H、
s、CH3)、2.5−2.6(m、溶媒プラスH2′)、3.7
(m、溶媒中のH2O不純物プラスH9)、4.6(3H、m、
H4′およびH5′)、5.6(1H、m、H3′)、6.24(1H、
t、H1′)、7.34(4H、2d、J=8.1Hz、トルオイル、H
2およびH6)、7.90(4H、2d、J=8.1Hz、トルオイル、
H3およびH5)、8.07(1H、s、H6)、8.3(3H、bs、NH3
+)、11.80(1H、s、複素環NH)。13C NMR(75MHz、d6
−DMSO)、δ21.2(CH3)、29.0(C−9)、36.4(C
−2′)、64.2(C−5′)、74.4(C−3′)、78.5
(C−8)、81.5(C−1′)、85.2(C−7)、85.7
(C−4′)、97.6(C−5)、126.4(トルオイル、
C−1)、129.3、129.5(トルオイル、C−2、C−
3、C−5およびC−6)、143.9(C−6)、144.8
(トルオイル、C−4)、149.3(C−2)、161.3(C
−4)、165.2(カルボキシル)、165.6(トルオイル、
C=0)。
元素分析(C30H28O9N3F3): 計算分析値:C57.05;H4.47;N6.65;F9.02 実測値:C57.12;H4.75;N6.42;F9.1 6−第3級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサン酸 6−アミノヘキサン酸13.12g(100ミリモル)のジオ
キサン400ml溶液へ0℃で1M NaOH100mlおよびジ−第3
級ブチルピロカーボネート24.01g(110ミリモル)を添
加した。得られた懸濁液を室温で3日間攪拌すると、そ
の後、ニンヒドリン反応は陰性となった。ついで減圧で
容量を100mlに減らし、混合物を0℃に冷却し、酢酸エ
チルを液面に加えて、1M KHSO4でpH2〜3の酸性とし
た。生成物を酢酸エチルで抽出し(3×150ml)、有機
層をH2Oで洗浄し(2×300ml)、乾燥し(Na2SO4)、蒸
発して粘稠なシロップ状にした。これを酢酸エチル/ヘ
キサンから再結晶して20.40gを得た(88%)。mp39〜41
℃(文献値(14)、mp39.5℃)。
キサン400ml溶液へ0℃で1M NaOH100mlおよびジ−第3
級ブチルピロカーボネート24.01g(110ミリモル)を添
加した。得られた懸濁液を室温で3日間攪拌すると、そ
の後、ニンヒドリン反応は陰性となった。ついで減圧で
容量を100mlに減らし、混合物を0℃に冷却し、酢酸エ
チルを液面に加えて、1M KHSO4でpH2〜3の酸性とし
た。生成物を酢酸エチルで抽出し(3×150ml)、有機
層をH2Oで洗浄し(2×300ml)、乾燥し(Na2SO4)、蒸
発して粘稠なシロップ状にした。これを酢酸エチル/ヘ
キサンから再結晶して20.40gを得た(88%)。mp39〜41
℃(文献値(14)、mp39.5℃)。
p−ニトロフェニル6−第3級ブチルオキシカルボニル
−アミドヘキサノエート(9) 6−第3級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサン酸
2.31g(10ミリモル)およびp−ニトロフェノール1.62g
(12ミリモル)のEtOAc30ml溶液へ0℃でジシクロヘキ
シルカルボジイミド2.06g(10ミリモル)を滴下した。
この溶液を0℃で0.5時間、ついで室温で3.5時間攪拌
し、ジシクロヘキシル尿素を濾去し、蒸発乾固し、生成
物を1%酢酸を含有する95%EtOHから再結晶して(9)
を3.35g得た(95%)。mp119〜120℃(文献値(14)、mp1
16.5℃)。
−アミドヘキサノエート(9) 6−第3級ブチルオキシカルボニルアミドヘキサン酸
2.31g(10ミリモル)およびp−ニトロフェノール1.62g
(12ミリモル)のEtOAc30ml溶液へ0℃でジシクロヘキ
シルカルボジイミド2.06g(10ミリモル)を滴下した。
この溶液を0℃で0.5時間、ついで室温で3.5時間攪拌
し、ジシクロヘキシル尿素を濾去し、蒸発乾固し、生成
物を1%酢酸を含有する95%EtOHから再結晶して(9)
を3.35g得た(95%)。mp119〜120℃(文献値(14)、mp1
16.5℃)。
5−[N−(6−第3級ブチルオキシカルボニルアミド
ヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−3′,5′−ジ−O−p−トルオイルデオキシウ
リジン(10) (8)の1.89g(3ミリモル)を乾燥DMF30mlに溶解し
た溶液へDBU443μl(3ミリモル)および(9)の1.16g
(3.3ミリモル)を添加した。1時間攪拌した後、混合
物を真空下に蒸発し、残留物をCH2Cl250mlおよび酢酸エ
チル400mlに再溶解し、H2O(2×300ml)、食塩水(300
ml)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発乾固した。固体
をメタノールから再結晶し、(10)を1.76g得た(80
%)。mp192〜194℃。UV(MeOH)λmax:290nm(肩)、2
82、237nm(ε13800、14400、43000)。λmin:262nm
(ε10300)。1H NMR(CDCl3、100MHz):δ1.4−1.9
(15H、1.43(BOC CH3)およびH3″、H4″およびH5″に
sを伴ったm)、2.16(2H、5、J=7.5Hz、H2″)、
2.42(6H、s、トルオイル、CH3)、2.75(2H、m、
H2′)、3.1(2H、m、H6″)、4.04(2H、d、J=5.0
Hz、H9、4.5−4.8(4H、m、H4′、H5′およびBOC N
H)、5.6(1H、m、H3′)、6.31(1H、dd、H1′)、7.
27(4H、d、J=8.2Hz、トルオイル、H3およびH5)、
7.84(1H、s、H6)、7.91および7.93(4H、2d、J=8.
2Hz、トルオイル、H1およびH6)、9.0(1H、巾広いs、
複素環NH)。13C NMR(CDCl3、75MHz)、δ21.7(トル
オイル、CH3)、25.2(C−4″)、26.4(C−
3″)、28.4(BOC CH3)、29.7(C−5″)、30.0
(C−9)、36.1(C−2″)、38.6(C−2′)、4
0.4(C−6″)、64.2(C−5′)、74.0(C−
8)、74.8(C−3′)、79.8(C(CH3)3)、83.4(C
−1′)、86.0(C−4′)、89.9(C−7)、100.0
(C−5)、126.2、126.4(トルオイル、C−1)、12
9.3、129.5、129.6および129.8( トルオイル、CH)、
142.1(C−6)、144.8(トルオイル、C−4)、149.
1(C−2)、156.1(BOC C=O)、161.9(C−4)、
166.0、166.2(トルオイル、C=O)、172.3(C−
1″)。
ヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−3′,5′−ジ−O−p−トルオイルデオキシウ
リジン(10) (8)の1.89g(3ミリモル)を乾燥DMF30mlに溶解し
た溶液へDBU443μl(3ミリモル)および(9)の1.16g
(3.3ミリモル)を添加した。1時間攪拌した後、混合
物を真空下に蒸発し、残留物をCH2Cl250mlおよび酢酸エ
チル400mlに再溶解し、H2O(2×300ml)、食塩水(300
ml)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発乾固した。固体
をメタノールから再結晶し、(10)を1.76g得た(80
%)。mp192〜194℃。UV(MeOH)λmax:290nm(肩)、2
82、237nm(ε13800、14400、43000)。λmin:262nm
(ε10300)。1H NMR(CDCl3、100MHz):δ1.4−1.9
(15H、1.43(BOC CH3)およびH3″、H4″およびH5″に
sを伴ったm)、2.16(2H、5、J=7.5Hz、H2″)、
2.42(6H、s、トルオイル、CH3)、2.75(2H、m、
H2′)、3.1(2H、m、H6″)、4.04(2H、d、J=5.0
Hz、H9、4.5−4.8(4H、m、H4′、H5′およびBOC N
H)、5.6(1H、m、H3′)、6.31(1H、dd、H1′)、7.
27(4H、d、J=8.2Hz、トルオイル、H3およびH5)、
7.84(1H、s、H6)、7.91および7.93(4H、2d、J=8.
2Hz、トルオイル、H1およびH6)、9.0(1H、巾広いs、
複素環NH)。13C NMR(CDCl3、75MHz)、δ21.7(トル
オイル、CH3)、25.2(C−4″)、26.4(C−
3″)、28.4(BOC CH3)、29.7(C−5″)、30.0
(C−9)、36.1(C−2″)、38.6(C−2′)、4
0.4(C−6″)、64.2(C−5′)、74.0(C−
8)、74.8(C−3′)、79.8(C(CH3)3)、83.4(C
−1′)、86.0(C−4′)、89.9(C−7)、100.0
(C−5)、126.2、126.4(トルオイル、C−1)、12
9.3、129.5、129.6および129.8( トルオイル、CH)、
142.1(C−6)、144.8(トルオイル、C−4)、149.
1(C−2)、156.1(BOC C=O)、161.9(C−4)、
166.0、166.2(トルオイル、C=O)、172.3(C−
1″)。
元素分析(C39H46O10N4): 計算分析値:C64.10;H6.34;N7.67 実測値:C64.34;H6.32;N7.51 5−[N−(6−第3級ブチルオキシカルボニルアミ
ドヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−5′−O−ジメトキシトリチルデオキシウリジ
ン(12) (2)から(5)を製造したのに用いたのと同一の方法
を用いて(10)から表題の化合物を製造した。収量1.20
g(10に対して75%)。UV(MeOH)λmax:293nm(肩)、
283、233nm(ε8500、9000、24500)。λmin:257nm(ε
2900)。この化合物の1H NMRスペクトルは(5)のデオ
キシリボース部分から起こった共鳴スペクトルと複素環
塩基部分から起こった共鳴スペクトルから構成される。
13C NMR(CDCl3、75MHz)、δ25.1(C−4″)、26.4
(C−3″)、28.4(C(CH3)3)、29.7(C−5″)、3
0.0(C−9)、35.9(C−2″)、40.4(C−
6″)、41.7(C−2′)、55.3(OCH3)、63.6(C−
5′)、72.2(C−3′)、74.1(C−8)、79.2(C
(CH3)3)、86.0(C−4′)、86.8(C−1′)、87.0
(トリチル中心のC)、89.7(C−7)、99.5(C−
5)、113.4(メトキシフェニル、C−3およびC−
5)、127.0、127.9および128.1(フェニル、CH)、13
0.0(メトキシフェニル、C−2およびC−6)、135.6
(メトキシフェニル、C−1)、143.1(C−6)、14
4.6(フェニル、C−1)、149.4(C−2)、156.0(B
OCC=O)、158.6(メトキシフェニル(C−4)、162.
5(C−4)、172.7(C−1″)。
ドヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−5′−O−ジメトキシトリチルデオキシウリジ
ン(12) (2)から(5)を製造したのに用いたのと同一の方法
を用いて(10)から表題の化合物を製造した。収量1.20
g(10に対して75%)。UV(MeOH)λmax:293nm(肩)、
283、233nm(ε8500、9000、24500)。λmin:257nm(ε
2900)。この化合物の1H NMRスペクトルは(5)のデオ
キシリボース部分から起こった共鳴スペクトルと複素環
塩基部分から起こった共鳴スペクトルから構成される。
13C NMR(CDCl3、75MHz)、δ25.1(C−4″)、26.4
(C−3″)、28.4(C(CH3)3)、29.7(C−5″)、3
0.0(C−9)、35.9(C−2″)、40.4(C−
6″)、41.7(C−2′)、55.3(OCH3)、63.6(C−
5′)、72.2(C−3′)、74.1(C−8)、79.2(C
(CH3)3)、86.0(C−4′)、86.8(C−1′)、87.0
(トリチル中心のC)、89.7(C−7)、99.5(C−
5)、113.4(メトキシフェニル、C−3およびC−
5)、127.0、127.9および128.1(フェニル、CH)、13
0.0(メトキシフェニル、C−2およびC−6)、135.6
(メトキシフェニル、C−1)、143.1(C−6)、14
4.6(フェニル、C−1)、149.4(C−2)、156.0(B
OCC=O)、158.6(メトキシフェニル(C−4)、162.
5(C−4)、172.7(C−1″)。
元素分析(C44H52O10N4): 計算分析値:C66.32;H6.58;N7.02 実測値:C65.94;H6.52;N7.70 5−[N−(6−第3級ブチルオキシカルボニルアミド
ヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−5′−O−ジメトキシトリチル−3′−N,N−
ジ−イソプロピルアミノメトキシホスフィニルデオキシ
ウリジン(11) (11)の製造は反応を4時間続けること、および洗浄
の前にさらにCH2Cl230mlを反応混合物へ追加すること以
外は(7)の場合と類似している。洗浄し、乾燥した溶
液を真空下に蒸発乾固し、(11)を903mg得た(粗収率9
4%)。この物質の31P NMRは7.35、13.06および18.25pp
mに低いピークを伴った149.86ppmの主ピークを示した。
ヘキサノイル)−3−アミノ−プロパ−1−インイ
ル)]−5′−O−ジメトキシトリチル−3′−N,N−
ジ−イソプロピルアミノメトキシホスフィニルデオキシ
ウリジン(11) (11)の製造は反応を4時間続けること、および洗浄
の前にさらにCH2Cl230mlを反応混合物へ追加すること以
外は(7)の場合と類似している。洗浄し、乾燥した溶
液を真空下に蒸発乾固し、(11)を903mg得た(粗収率9
4%)。この物質の31P NMRは7.35、13.06および18.25pp
mに低いピークを伴った149.86ppmの主ピークを示した。
実施例2 ホスホアミダイト(7)および(11)のオリ
ゴヌクレオチドの5′−ヒドロキシルへのカップリング 修飾したヌクレオシドホスホアミダイトを、完全に保
護し固体支持体へ結合したオリゴヌクレオチドの5′−
末端へ追加するのに用いた方法は標準的なものであった
(20)。完全に保護し樹脂へ結合したオリゴヌクレオチド
はアプライド・バイオシステムズ380A・DNAシンセサイ
ザー(Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer)を
用いて1マイクロモルの規模で合成した。ついで固体支
持体を手動反応セルへ移した。このセルは直径1cm、長
さ3cmのミニアチュアクロマトグラフィーカラムと類似
しており、B14クイックフィット先端および底部にテフ
ロン製3方活栓を備えた中間気孔性焼成ガラス円盤を有
する。脱トリチル化反応(3%ジクロロ酢酸/CH2Cl2)
のあと、樹脂を乾燥CH3CNで完全に洗浄し、アルゴン大
気中に放置した。ついでホスホアミダイト10マイクロモ
ルおよびテトラゾール40マイクロモルを添加し、さらに
乾燥CH3CN1mlを追加した。セルを15分間振とうし、排液
し、亜リン酸トリエステルを0.1Mヨー素溶液で通常の方
法により酸化した。反応の程度を定量するため少量の試
料でトリチル検定を実施した。ホスフェートのメチル保
護基を除去したのち(チオフェノキシドイオン、2時
間)、樹脂を90%TFA/エタンジチオールで5分間処理
し、排液し、CH3CN、合計20mlの20%Et3N/CH2Cl2で完
全に洗浄し、ついでCH3CNで再度洗浄して、乾燥した。
ついで35%NH3水溶液(4ml)でオリゴヌクレオチドを支
持体から取り外し、得られた溶液を一夜55℃に保ち、塩
基性保護基を除去した。生成物は蒸発乾固することによ
って得られ、H2O(3ml)に再溶解した。
ゴヌクレオチドの5′−ヒドロキシルへのカップリング 修飾したヌクレオシドホスホアミダイトを、完全に保
護し固体支持体へ結合したオリゴヌクレオチドの5′−
末端へ追加するのに用いた方法は標準的なものであった
(20)。完全に保護し樹脂へ結合したオリゴヌクレオチド
はアプライド・バイオシステムズ380A・DNAシンセサイ
ザー(Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer)を
用いて1マイクロモルの規模で合成した。ついで固体支
持体を手動反応セルへ移した。このセルは直径1cm、長
さ3cmのミニアチュアクロマトグラフィーカラムと類似
しており、B14クイックフィット先端および底部にテフ
ロン製3方活栓を備えた中間気孔性焼成ガラス円盤を有
する。脱トリチル化反応(3%ジクロロ酢酸/CH2Cl2)
のあと、樹脂を乾燥CH3CNで完全に洗浄し、アルゴン大
気中に放置した。ついでホスホアミダイト10マイクロモ
ルおよびテトラゾール40マイクロモルを添加し、さらに
乾燥CH3CN1mlを追加した。セルを15分間振とうし、排液
し、亜リン酸トリエステルを0.1Mヨー素溶液で通常の方
法により酸化した。反応の程度を定量するため少量の試
料でトリチル検定を実施した。ホスフェートのメチル保
護基を除去したのち(チオフェノキシドイオン、2時
間)、樹脂を90%TFA/エタンジチオールで5分間処理
し、排液し、CH3CN、合計20mlの20%Et3N/CH2Cl2で完
全に洗浄し、ついでCH3CNで再度洗浄して、乾燥した。
ついで35%NH3水溶液(4ml)でオリゴヌクレオチドを支
持体から取り外し、得られた溶液を一夜55℃に保ち、塩
基性保護基を除去した。生成物は蒸発乾固することによ
って得られ、H2O(3ml)に再溶解した。
オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳
動により精製した。生成物は、誘導されなかったオリゴ
ヌクレオチドよりも〜1−2ヌクレオチド遅れて移動す
る最も動きが遅い主バンドである。原則的にはオリゴヌ
クレオチド溶液の〜150μlを、厚さ1.5mm、長さ20cmの
10%ポリアクリルアミドゲル(1cm×1cmウエル1つ当り
25μl+5μlホルムアミド)で精製した。バンドはけ
い光TLCシリカゲル薄板をバックグラウンドとして使用
するUVシャドウイングにより可視化した。生成物のバン
ドを切り取り、H2Oで溶出し、透析し、凍結乾燥し、H2O
150μlに再溶解した。
動により精製した。生成物は、誘導されなかったオリゴ
ヌクレオチドよりも〜1−2ヌクレオチド遅れて移動す
る最も動きが遅い主バンドである。原則的にはオリゴヌ
クレオチド溶液の〜150μlを、厚さ1.5mm、長さ20cmの
10%ポリアクリルアミドゲル(1cm×1cmウエル1つ当り
25μl+5μlホルムアミド)で精製した。バンドはけ
い光TLCシリカゲル薄板をバックグラウンドとして使用
するUVシャドウイングにより可視化した。生成物のバン
ドを切り取り、H2Oで溶出し、透析し、凍結乾燥し、H2O
150μlに再溶解した。
実施例3 内部修飾したヌクレオチドを含有するオリゴ
ヌクレオチドの製造 1またはその他の修飾したヌクレオシドでチミジン残
基を置き換えたオリゴヌクレオチドをアプライド・バイ
オシステムズ・DNAシンセサイザーで製造するため、ヌ
クレオチドホスホアミダイト(7)および(11)を使用
した。ホスホアミダイトは、乾燥アセトニトリル中、0.
1M((7)の場合)または0.15M((11)の場合)のいず
れかとした。合成は0.2マイクロモルの規模で実施し
た。反復カップリングの収率は99〜100%であった。連
鎖組立てのあと固体支持体を手動反応セルへ移し、つい
で脱保護して、5′を単一修飾したヌクレオシドを含有
するオリゴヌクレオチドの例として固体支持体から取り
外した。目的の生成物はH2O2mlに再溶解した。
ヌクレオチドの製造 1またはその他の修飾したヌクレオシドでチミジン残
基を置き換えたオリゴヌクレオチドをアプライド・バイ
オシステムズ・DNAシンセサイザーで製造するため、ヌ
クレオチドホスホアミダイト(7)および(11)を使用
した。ホスホアミダイトは、乾燥アセトニトリル中、0.
1M((7)の場合)または0.15M((11)の場合)のいず
れかとした。合成は0.2マイクロモルの規模で実施し
た。反復カップリングの収率は99〜100%であった。連
鎖組立てのあと固体支持体を手動反応セルへ移し、つい
で脱保護して、5′を単一修飾したヌクレオシドを含有
するオリゴヌクレオチドの例として固体支持体から取り
外した。目的の生成物はH2O2mlに再溶解した。
実施例4 アミノオリゴヌクレオチドへの色素結合 5′末端で修飾した1個のヌクレオシドを含有する精
製オリゴヌクレオチドへFITCをコンジュゲート結合する
ため、以下の方法を用いた。FITC2mg(5マイクロモ
ル)のDMF20μl溶液へ0.1M K2HPO4(pH9.0)の180μl
を添加、混合し、ついでアミノオリゴヌクレオチド溶液
100μl(〜30ナノモル)を添加した。混合物を一夜暗
所に保ち、ついで0.1M酢酸アンモニウム(pH9.0)を飽
和したセファデックス(Sephadex)G−25(中間)の10
μlカラムへこれを適用した。画分を0.5mlずつ採取
し、溶出液中に出てくるけい光物質(UVランプ照射によ
り検出)を採取した。これを凍結乾燥し、0.1M酢酸アン
モニウム(pH9.0緩衝液)200μlに再溶解して、別の類
似のセファデックスG−25カラムへもう一度適用した。
前記と同様に、けい光画分を採取して、これをプール
し、260nmおよび495nmの吸収を読み取った。この比率か
ら修飾したKPIBおよびHCAL(これらのオリゴヌクレオチ
ドはヌクレオチド配列の結果の項を参照)のそれぞれ3.
2×105M-1および4.4×10M-1ではε260を用い、フルオレ
セイン7×104M-1ではε495を用いてオリゴヌクレオチ
ド1分子に対するフルオレセイン残基数を測定した。つ
いで生成物を凍結乾燥し、H2Oから2回凍結乾燥した。
製オリゴヌクレオチドへFITCをコンジュゲート結合する
ため、以下の方法を用いた。FITC2mg(5マイクロモ
ル)のDMF20μl溶液へ0.1M K2HPO4(pH9.0)の180μl
を添加、混合し、ついでアミノオリゴヌクレオチド溶液
100μl(〜30ナノモル)を添加した。混合物を一夜暗
所に保ち、ついで0.1M酢酸アンモニウム(pH9.0)を飽
和したセファデックス(Sephadex)G−25(中間)の10
μlカラムへこれを適用した。画分を0.5mlずつ採取
し、溶出液中に出てくるけい光物質(UVランプ照射によ
り検出)を採取した。これを凍結乾燥し、0.1M酢酸アン
モニウム(pH9.0緩衝液)200μlに再溶解して、別の類
似のセファデックスG−25カラムへもう一度適用した。
前記と同様に、けい光画分を採取して、これをプール
し、260nmおよび495nmの吸収を読み取った。この比率か
ら修飾したKPIBおよびHCAL(これらのオリゴヌクレオチ
ドはヌクレオチド配列の結果の項を参照)のそれぞれ3.
2×105M-1および4.4×10M-1ではε260を用い、フルオレ
セイン7×104M-1ではε495を用いてオリゴヌクレオチ
ド1分子に対するフルオレセイン残基数を測定した。つ
いで生成物を凍結乾燥し、H2Oから2回凍結乾燥した。
多重内部アミノ基を持ったオリゴヌクレオチドへFITC
をコンジュゲート結合するためはるかに大過剰のFITCを
使用した。FITC26mg(63マイクロモル)のDMF100μl溶
液へ1.0MK2HPO4(pH9.0)100μlを添加し、混合し、つ
いでアミノオリゴヌクレオチド100μl(〜10ナノモ
ル)を添加した。これを一夜暗所に放置して反応させ
た。前記の例と同様にこれを精製し、修飾したKPIBおよ
びHCALのそれぞれ3.2×105M-1および4.4×105M-1ではε
260を用い、フルオレセインの2×104M-1ではε260を用
いてフルオレセインの260nmの吸収を考慮してフルオレ
セイン負荷量を測定した。
をコンジュゲート結合するためはるかに大過剰のFITCを
使用した。FITC26mg(63マイクロモル)のDMF100μl溶
液へ1.0MK2HPO4(pH9.0)100μlを添加し、混合し、つ
いでアミノオリゴヌクレオチド100μl(〜10ナノモ
ル)を添加した。これを一夜暗所に放置して反応させ
た。前記の例と同様にこれを精製し、修飾したKPIBおよ
びHCALのそれぞれ3.2×105M-1および4.4×105M-1ではε
260を用い、フルオレセインの2×104M-1ではε260を用
いてフルオレセインの260nmの吸収を考慮してフルオレ
セイン負荷量を測定した。
実施例5 FITC標識をしたオリゴヌクレオチドによるハ
イブリダイゼーション 先に報告のように(15)マウス唾液腺由来のポリアデニ
ル化したRNAでRNAドットブロットを作成した。1μgの
初期値から出発したRNAの量は連続した各ドット上、3
の倍数で減少した。ニトロセルロースフィルターを、5
×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50m
Mリン酸ナトリウム(pH6.5)、0.02%ウシ血清アルブミ
ン、フラクションV、0.02%フィコール(Ficol)、0.0
2%ポリビニルピロリドン、30μg/mlの変性した子ウシ
胸腺DNA、50%ホルムアミドからなる溶液で42℃で4時
間プレハイブリッド化した。ハイブリダイゼーションは
下記のように4つの異なった条件の組合わせで実施し
た。高度ストリンジェンシー条件下、40℃で24時間ハイ
ブリダイゼーションし、2×SSCで室温で洗浄する。中
程度ストリンジェンシー条件下、上記と同様の条件でハ
イブリダイゼーションを室温で行なう。低ストリンジェ
ンシー条件下、上記と同様の条件であるが、ハイブリダ
イゼーション混合物は50%ホルムアミドの代わりに10%
ホルムアミドを含有する。最低ストリンジェンシー条件
下、4℃でプレハイブリッド化し、ホルムアミドの存在
なしで4℃で5日間ハイブリッド形成し、2×SSCで室
温で洗浄する。
イブリダイゼーション 先に報告のように(15)マウス唾液腺由来のポリアデニ
ル化したRNAでRNAドットブロットを作成した。1μgの
初期値から出発したRNAの量は連続した各ドット上、3
の倍数で減少した。ニトロセルロースフィルターを、5
×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50m
Mリン酸ナトリウム(pH6.5)、0.02%ウシ血清アルブミ
ン、フラクションV、0.02%フィコール(Ficol)、0.0
2%ポリビニルピロリドン、30μg/mlの変性した子ウシ
胸腺DNA、50%ホルムアミドからなる溶液で42℃で4時
間プレハイブリッド化した。ハイブリダイゼーションは
下記のように4つの異なった条件の組合わせで実施し
た。高度ストリンジェンシー条件下、40℃で24時間ハイ
ブリダイゼーションし、2×SSCで室温で洗浄する。中
程度ストリンジェンシー条件下、上記と同様の条件でハ
イブリダイゼーションを室温で行なう。低ストリンジェ
ンシー条件下、上記と同様の条件であるが、ハイブリダ
イゼーション混合物は50%ホルムアミドの代わりに10%
ホルムアミドを含有する。最低ストリンジェンシー条件
下、4℃でプレハイブリッド化し、ホルムアミドの存在
なしで4℃で5日間ハイブリッド形成し、2×SSCで室
温で洗浄する。
結果 C−5置換ヌクレオチドの製造 置換デオキシウリジンの製造に用いた方法を第2図に
示す。商業的に入手可能な5−ヨードデオキシウリジン
から作成した3′,5′−ジ−O−p−トルオイル−5−
ヨードデオキシウリジン(1)をビス(トリフェニルホ
スフィン)パラジウムクロリドおよびヨー素化第一銅の
触媒量の存在でN−BOC−3−アミノプロピンと縮合さ
せた。ロビンズおよびバールはアルキルまたはエステル
置換基を有するアルキンを使用して末端アルキンと5−
ヨードウラシルまたは5−ヨードデオキシウリジンとの
カップリングを報告している(18)。この反応はトリエチ
ルアミンを溶媒として50℃で行なわれた。発明者らは生
成物(2)の収量を最大とし、主な副生物であるけい光
ヌクレオシド(ロビンズおよびバールの報告から類推し
て恐らく(3)の構造を有する)の生成を最小とするた
め種々の条件を試みた。その結果、最も良好な(2)の
収量を与える条件は溶媒として酢酸エチルを使用し、ト
リエチルアミンを(1)に対して5倍モル過剰に使用
し、反応を室温で行なうことであることが判明した。こ
れによって84%の収率が得られた。生成物の構造を1H N
MRおよび13C NMRスペクトル分析によって確認した。こ
の生成物は基本的な化合物であり、この化合物から多数
の他の誘導体を得ることができる。
示す。商業的に入手可能な5−ヨードデオキシウリジン
から作成した3′,5′−ジ−O−p−トルオイル−5−
ヨードデオキシウリジン(1)をビス(トリフェニルホ
スフィン)パラジウムクロリドおよびヨー素化第一銅の
触媒量の存在でN−BOC−3−アミノプロピンと縮合さ
せた。ロビンズおよびバールはアルキルまたはエステル
置換基を有するアルキンを使用して末端アルキンと5−
ヨードウラシルまたは5−ヨードデオキシウリジンとの
カップリングを報告している(18)。この反応はトリエチ
ルアミンを溶媒として50℃で行なわれた。発明者らは生
成物(2)の収量を最大とし、主な副生物であるけい光
ヌクレオシド(ロビンズおよびバールの報告から類推し
て恐らく(3)の構造を有する)の生成を最小とするた
め種々の条件を試みた。その結果、最も良好な(2)の
収量を与える条件は溶媒として酢酸エチルを使用し、ト
リエチルアミンを(1)に対して5倍モル過剰に使用
し、反応を室温で行なうことであることが判明した。こ
れによって84%の収率が得られた。生成物の構造を1H N
MRおよび13C NMRスペクトル分析によって確認した。こ
の生成物は基本的な化合物であり、この化合物から多数
の他の誘導体を得ることができる。
ホスホアミダイト(7)は第3図に示したような3段
階の手順を経て(3)から製造した。炭酸カリウム/メ
タノールを使用して(2)の3′,5′エステル保護基を
除去し、得られた生成物(4)をピリジン中でジメトキ
シトリチルクロリドで処理して(5)を得た。また(4)
のUVスペクトルはヌクレオシド構造の証拠を提供する。
複素環塩基の吸収極大はチミジンの265nmから(4)の化
合物では、強度の増加を伴って290nmへシフトした。吸
収極大のこのシフトはこのけい光団を含んで合成された
すべての誘導体で認められる。
階の手順を経て(3)から製造した。炭酸カリウム/メ
タノールを使用して(2)の3′,5′エステル保護基を
除去し、得られた生成物(4)をピリジン中でジメトキ
シトリチルクロリドで処理して(5)を得た。また(4)
のUVスペクトルはヌクレオシド構造の証拠を提供する。
複素環塩基の吸収極大はチミジンの265nmから(4)の化
合物では、強度の増加を伴って290nmへシフトした。吸
収極大のこのシフトはこのけい光団を含んで合成された
すべての誘導体で認められる。
5′をトリチル化したヌクレオシド(5)を触媒条件
下に2倍過剰のビス(ジアルキルアミノ)ホスフィン
(6)で処理するとホスホアミダイト(7)が得られた。
このホスホアミダイトの製造方法は、カルザーズら(10)
によって報告されたホスホアミダイトのイン・サイチュ
製造と類似している。
下に2倍過剰のビス(ジアルキルアミノ)ホスフィン
(6)で処理するとホスホアミダイト(7)が得られた。
このホスホアミダイトの製造方法は、カルザーズら(10)
によって報告されたホスホアミダイトのイン・サイチュ
製造と類似している。
実施例6 長いリンカー鎖をC−5に有するヌクレオ
シドの製造 後述するであろう様に、オリゴヌクレオチドに内部の
第1級脂肪族アミノ基を導入するのに(7)を使用する
ことができるが、複素環塩基と標識の結合部位(末端ア
ミノ基)との間のリンカー鎖の鎖長が短いとオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーション特性に影響するであ
ろうということは初めから推測された。けい光部分は大
きい平面分子であることが多いので、このけい光部分が
結合する場合、特にそうなることが予想される。したが
ってC−5にさらに長いリンカー鎖を導入する作戦が展
開された。その概略を第4図に示す。基本化合物(2)
のアミノ基を95%TFA/H2Oで脱保護し、(8)を高収量で
得た。ついで1当量の1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウ
ンデカ−7−エン(DBU)の存在下で、この化合物をp
−ニトロフェニルエステル(9)と反応させ、付加物(1
0)を高収量で得た。(2)で報告した方法と類似の方法
でこの生成物をホスホアミダイト(11)へ変換した。
シドの製造 後述するであろう様に、オリゴヌクレオチドに内部の
第1級脂肪族アミノ基を導入するのに(7)を使用する
ことができるが、複素環塩基と標識の結合部位(末端ア
ミノ基)との間のリンカー鎖の鎖長が短いとオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーション特性に影響するであ
ろうということは初めから推測された。けい光部分は大
きい平面分子であることが多いので、このけい光部分が
結合する場合、特にそうなることが予想される。したが
ってC−5にさらに長いリンカー鎖を導入する作戦が展
開された。その概略を第4図に示す。基本化合物(2)
のアミノ基を95%TFA/H2Oで脱保護し、(8)を高収量で
得た。ついで1当量の1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウ
ンデカ−7−エン(DBU)の存在下で、この化合物をp
−ニトロフェニルエステル(9)と反応させ、付加物(1
0)を高収量で得た。(2)で報告した方法と類似の方法
でこの生成物をホスホアミダイト(11)へ変換した。
実施例7 修飾したヌクレオシドのオリゴヌクレオチド
5′−末端への挿入 前もって組立てたオリゴヌクレオチドの5′−末端へ
まず手動操作によりホスホアミダイト(7)および(1
1)をカップリングすることによって試験した。そこで
自動化したアプライド・バイオシステムズ380A・DNAシ
ンセサイザーで30量体GGGCTTCACAACATCTGTGATGTCAGCAGG
を組立て、樹脂上に残したまま完全に保護した。この配
列はすべてのカリクレインに共通したカリクレインmRNA
の領域(15)と相補的であり、KPIBと呼ばれる。樹脂を手
動反応セルへ移した。最後のヌクレオシドを脱トリチル
化した後、テトラゾールの存在下で(7)または(11)
のいずれかをカップリングした。トリチル試験による検
定で、カップリングは本質的に定量的であった。チオフ
ェノキシドイオンでリン酸保護基を除去した後、BOC保
護基を除去するため樹脂を90%TFA:10%エタンジチオー
ルで5分間処理した。エタンジチオールの存在はオリゴ
ヌクレオチドを分解から保護する。トリエチルアミンを
使用して新たに作成したアミノ基および第2のホスフェ
ートを中和し、ついでオリゴヌクレオチドを標準的な方
法で処理して樹脂から取り外し、塩基保護基を除去し
た。修飾されたオリゴヌクレオチドが通常のKPIBより1
〜2ヌクレオチド遅れて移動することを利用して、オリ
ゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って精製した。
5′−末端への挿入 前もって組立てたオリゴヌクレオチドの5′−末端へ
まず手動操作によりホスホアミダイト(7)および(1
1)をカップリングすることによって試験した。そこで
自動化したアプライド・バイオシステムズ380A・DNAシ
ンセサイザーで30量体GGGCTTCACAACATCTGTGATGTCAGCAGG
を組立て、樹脂上に残したまま完全に保護した。この配
列はすべてのカリクレインに共通したカリクレインmRNA
の領域(15)と相補的であり、KPIBと呼ばれる。樹脂を手
動反応セルへ移した。最後のヌクレオシドを脱トリチル
化した後、テトラゾールの存在下で(7)または(11)
のいずれかをカップリングした。トリチル試験による検
定で、カップリングは本質的に定量的であった。チオフ
ェノキシドイオンでリン酸保護基を除去した後、BOC保
護基を除去するため樹脂を90%TFA:10%エタンジチオー
ルで5分間処理した。エタンジチオールの存在はオリゴ
ヌクレオチドを分解から保護する。トリエチルアミンを
使用して新たに作成したアミノ基および第2のホスフェ
ートを中和し、ついでオリゴヌクレオチドを標準的な方
法で処理して樹脂から取り外し、塩基保護基を除去し
た。修飾されたオリゴヌクレオチドが通常のKPIBより1
〜2ヌクレオチド遅れて移動することを利用して、オリ
ゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って精製した。
修飾したヌクレオシドのオリゴヌクレオチドへの内部挿
入 ホスホアミダイト(7)および(11)が正常に結合す
ることを確認したので、これら2つの修飾したヌクレオ
シドを内部的に挿入したオリゴヌクレオチドの合成に着
手した。合成はアプライド・バイオシステムズ・DNAシ
ンセサイザーで自動的に実施した。上記の各ホスホアミ
ダイトを使用してそれぞれ2つの異なったオリゴヌクレ
オチドを合成した。一つはKPIBで、もう一つは40量体AG
GTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGGAACGTGTGA(HCAL)であ
る。HCALはヒトカルシトニンのmRNAの一部と相補的であ
り、組織切片中のこのmRNAを検出するのに使用される
(16)。その配列を上記の配列のように合成した。ただし
すべてのチミジン残基を修飾したヌクレオシドの1つで
置き換えて合成した。反復カップリングの収率は99〜10
0%の水準であった。連鎖を組立てた後、オリゴヌクレ
オチドをチオフェノキシド・イオン、90%TFA/エタンジ
チオールで順次処理し、濃厚アンモニア溶液で固体支持
体から取り外し、50℃で15時間処理して塩基保護基を除
去した。この生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析を試みたが、標準的なUVシャドウイングの方
法では何らの物質もゲル上に認められなかった。ゲル媒
質のpHによって荷電されたアミノ基の存在がオリゴヌク
レオチドの電気泳動特性を変化するようである。したが
ってさらに精製することなくこれを次の段階に使用し
た。然し反復カップリングの収量は高いから、短い方の
配列は少量だけ生成物中に存在していることが予想され
た。
入 ホスホアミダイト(7)および(11)が正常に結合す
ることを確認したので、これら2つの修飾したヌクレオ
シドを内部的に挿入したオリゴヌクレオチドの合成に着
手した。合成はアプライド・バイオシステムズ・DNAシ
ンセサイザーで自動的に実施した。上記の各ホスホアミ
ダイトを使用してそれぞれ2つの異なったオリゴヌクレ
オチドを合成した。一つはKPIBで、もう一つは40量体AG
GTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGGAACGTGTGA(HCAL)であ
る。HCALはヒトカルシトニンのmRNAの一部と相補的であ
り、組織切片中のこのmRNAを検出するのに使用される
(16)。その配列を上記の配列のように合成した。ただし
すべてのチミジン残基を修飾したヌクレオシドの1つで
置き換えて合成した。反復カップリングの収率は99〜10
0%の水準であった。連鎖を組立てた後、オリゴヌクレ
オチドをチオフェノキシド・イオン、90%TFA/エタンジ
チオールで順次処理し、濃厚アンモニア溶液で固体支持
体から取り外し、50℃で15時間処理して塩基保護基を除
去した。この生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析を試みたが、標準的なUVシャドウイングの方
法では何らの物質もゲル上に認められなかった。ゲル媒
質のpHによって荷電されたアミノ基の存在がオリゴヌク
レオチドの電気泳動特性を変化するようである。したが
ってさらに精製することなくこれを次の段階に使用し
た。然し反復カップリングの収量は高いから、短い方の
配列は少量だけ生成物中に存在していることが予想され
た。
実施例8 けい光団のアミノオリゴヌクレオチドへのカ
ップリング アミン反応性のけい光団をアミノオリゴヌクレオチド
へ結合するために用いた方法は、タンパク質でリシン残
基のε−アミノ基へそのような分子を結合するのに広く
用いられている方法(17)と基本的に同一である。この方
法は脂肪族アミノ基の有効部分がプロトン化されないよ
うpH9でアミノオリゴヌクレオチドを反応性けい光団と
反応させることからなる。スミスらは5′−アミノチミ
ジンを含んだオリゴヌクレオチドへけい光団をカップリ
ングするのに同様の方法を用いた(1)。過剰の未反応色
素をオリゴヌクレオチドから分離するため標識反応混合
物をセファデックスG−25カラムへ2回通した。ついで
260nmおよび495nmにおける生成物の吸収を測定すること
によって標識の程度を測定した。(7)に由来するヌク
レオチド(短いC−5鎖)を5′−末端に含んでいるオ
リゴヌクレオチドの場合、150倍モル過剰のFITCを使用
した一回だけの反応によりカリクレインオリゴヌクレオ
チド分子の20%およびカルシトニンオリゴヌクレオチド
分子の3分の1が標識された。この標識物質の5′−末
端を[λ−32P]ATPでさらに標識し、電気泳動を行なっ
た。その結果、期待した位置に単一の放射性バンドが現
れた(データは添付していない)。
ップリング アミン反応性のけい光団をアミノオリゴヌクレオチド
へ結合するために用いた方法は、タンパク質でリシン残
基のε−アミノ基へそのような分子を結合するのに広く
用いられている方法(17)と基本的に同一である。この方
法は脂肪族アミノ基の有効部分がプロトン化されないよ
うpH9でアミノオリゴヌクレオチドを反応性けい光団と
反応させることからなる。スミスらは5′−アミノチミ
ジンを含んだオリゴヌクレオチドへけい光団をカップリ
ングするのに同様の方法を用いた(1)。過剰の未反応色
素をオリゴヌクレオチドから分離するため標識反応混合
物をセファデックスG−25カラムへ2回通した。ついで
260nmおよび495nmにおける生成物の吸収を測定すること
によって標識の程度を測定した。(7)に由来するヌク
レオチド(短いC−5鎖)を5′−末端に含んでいるオ
リゴヌクレオチドの場合、150倍モル過剰のFITCを使用
した一回だけの反応によりカリクレインオリゴヌクレオ
チド分子の20%およびカルシトニンオリゴヌクレオチド
分子の3分の1が標識された。この標識物質の5′−末
端を[λ−32P]ATPでさらに標識し、電気泳動を行なっ
た。その結果、期待した位置に単一の放射性バンドが現
れた(データは添付していない)。
また複数の内部第1級脂肪族アミノ基を含み、したが
って多重標識挿入可能部位を含んでいるオリゴヌクレオ
チドでFITCカップリング反応を行なった。最初に短いC
−5鎖を有するオリゴヌクレオチドを標識した。カリク
レインプローブは7ケ所の標識挿入可能部位を含んでい
るが、前記と同一の標識反応を用いるとオリゴヌクレオ
チド1分子当りただ1つのフルオレセインが含まれ、カ
ルシトニンプローブでは9ケ所の可能性部位を含んでい
るが1.5分子の標識が含まれた。極めて大過剰のFITC(9
00倍)を使用する方法に変えると、挿入水準はKPIBで4.
1、HCALでは7.2に増加した。多数のけい光団がオリゴヌ
クレオチド分子へ結合したとき有効となるので、260nm
におけるフルオレセインの吸収を考慮してこれらの数字
を計算した。反応の反復は標識の程度に何ら有意な効果
を示さない。試験反応で通常のKPIBを大過剰のFITCとの
標識反応にかけると110個のヌクレオチドで1個のバッ
クグラウンドレベルの標識が得られることが判明した。
これを対応するアミノオリゴヌクレオチドにおける110
個のヌクレオチド当り15と比較した。
って多重標識挿入可能部位を含んでいるオリゴヌクレオ
チドでFITCカップリング反応を行なった。最初に短いC
−5鎖を有するオリゴヌクレオチドを標識した。カリク
レインプローブは7ケ所の標識挿入可能部位を含んでい
るが、前記と同一の標識反応を用いるとオリゴヌクレオ
チド1分子当りただ1つのフルオレセインが含まれ、カ
ルシトニンプローブでは9ケ所の可能性部位を含んでい
るが1.5分子の標識が含まれた。極めて大過剰のFITC(9
00倍)を使用する方法に変えると、挿入水準はKPIBで4.
1、HCALでは7.2に増加した。多数のけい光団がオリゴヌ
クレオチド分子へ結合したとき有効となるので、260nm
におけるフルオレセインの吸収を考慮してこれらの数字
を計算した。反応の反復は標識の程度に何ら有意な効果
を示さない。試験反応で通常のKPIBを大過剰のFITCとの
標識反応にかけると110個のヌクレオチドで1個のバッ
クグラウンドレベルの標識が得られることが判明した。
これを対応するアミノオリゴヌクレオチドにおける110
個のヌクレオチド当り15と比較した。
(11)に由来するヌクレオチドを5′−末端に含んだ
カリクレインオリゴヌクレオチドを900倍過剰のFITCで
標識すると、一回だけの反応で完全な標識挿入が達成さ
れた。またこのけい光体生成物を5′−末端で放射能標
識すると、ゲル電気泳動により期待した位置に単一のバ
ンドが得られた(データは添付していない)。
カリクレインオリゴヌクレオチドを900倍過剰のFITCで
標識すると、一回だけの反応で完全な標識挿入が達成さ
れた。またこのけい光体生成物を5′−末端で放射能標
識すると、ゲル電気泳動により期待した位置に単一のバ
ンドが得られた(データは添付していない)。
長いC−5鎖を有する多重内部ヌクレオチド置換を含
んだオリゴヌクレオチドを上記のようにFITCカップリン
グ反応にかけると(大過剰のFITC)、標識挿入のレベル
はKPIBでは2.7、HCALでは5.2であった。またこれらの多
重標識プローブの5′−末端を[λ−32P]ATPで標識し
た。反応からの生成混合物をセファデックスG−25で精
製すると放射性の高分子量のピークが得られた。然しゲ
ル電気泳動では何らの放射性バンドも認められなかっ
た。
んだオリゴヌクレオチドを上記のようにFITCカップリン
グ反応にかけると(大過剰のFITC)、標識挿入のレベル
はKPIBでは2.7、HCALでは5.2であった。またこれらの多
重標識プローブの5′−末端を[λ−32P]ATPで標識し
た。反応からの生成混合物をセファデックスG−25で精
製すると放射性の高分子量のピークが得られた。然しゲ
ル電気泳動では何らの放射性バンドも認められなかっ
た。
実施例9 標識したオリゴヌクレオチドによるハイブリ
ダイゼーション カリクレインメッセージに富んだマウス唾液腺ポリ
(A)+mRNAへの、カリクレインオリゴヌクレオチドのハイ
ブリッド形成能を試験した(15)。ニトロセルロースフィ
ルターにポリ(A)+mRNAを1ドット当り1μgから低濃度
へ種々の濃度でドットした。ついで標準的な方法でけい
光体オリゴヌクレオチドを5′−末端で32P標識し、こ
れを使用してニトロセルロースフィルターをプローブし
た。短いリンカー鎖を含んだけい光体オリゴヌクレオチ
ドを使用して高度ストリンジェンシー条件下でニトロセ
ルロースフィルターをプローブすると、何ら信号を認め
られなかった。然し中程度ストリンジェンシー条件を用
いると、5′に単一標識したプローブでは、通常の修飾
しなかったプローブで得られたのと同等の強度の信号が
得られ(第5図)、一方、多重標識プローブでは感知し
得る信号はこの条件でも得られなかった。低ストリンジ
ェンシー条件および最低ストリンジェンシー条件下で多
重標識プローブとハイブリッド形成させると、信号は標
準プローブより、それぞれ10倍および3倍少なかった。
ダイゼーション カリクレインメッセージに富んだマウス唾液腺ポリ
(A)+mRNAへの、カリクレインオリゴヌクレオチドのハイ
ブリッド形成能を試験した(15)。ニトロセルロースフィ
ルターにポリ(A)+mRNAを1ドット当り1μgから低濃度
へ種々の濃度でドットした。ついで標準的な方法でけい
光体オリゴヌクレオチドを5′−末端で32P標識し、こ
れを使用してニトロセルロースフィルターをプローブし
た。短いリンカー鎖を含んだけい光体オリゴヌクレオチ
ドを使用して高度ストリンジェンシー条件下でニトロセ
ルロースフィルターをプローブすると、何ら信号を認め
られなかった。然し中程度ストリンジェンシー条件を用
いると、5′に単一標識したプローブでは、通常の修飾
しなかったプローブで得られたのと同等の強度の信号が
得られ(第5図)、一方、多重標識プローブでは感知し
得る信号はこの条件でも得られなかった。低ストリンジ
ェンシー条件および最低ストリンジェンシー条件下で多
重標識プローブとハイブリッド形成させると、信号は標
準プローブより、それぞれ10倍および3倍少なかった。
これらの結果から、ハイブリダイゼーション信号を起
こすのは混入している少量の標準プローブではなく、け
い光で標識したプローブそのものであることが判明し
た。そうでなければ信号は一層ストリンジェンシーの高
いハイブリダイゼーション条件でも現れるはずである。
こすのは混入している少量の標準プローブではなく、け
い光で標識したプローブそのものであることが判明し
た。そうでなければ信号は一層ストリンジェンシーの高
いハイブリダイゼーション条件でも現れるはずである。
C−5鎖を含んだけい光体オリゴヌクレオチドをハイ
ブリッド形成すると、単一標識プローブは標準プローブ
と同様に高度ストリンジェンシー条件下でもハイブリッ
ド形成した(第6図)。多重標識プローブはこれと同一
条件下でほぼ3倍弱い信号を与えた。
ブリッド形成すると、単一標識プローブは標準プローブ
と同様に高度ストリンジェンシー条件下でもハイブリッ
ド形成した(第6図)。多重標識プローブはこれと同一
条件下でほぼ3倍弱い信号を与えた。
またけい光で標識したオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション特異性を検査した。第7図は2種類の単
一標識をした(短鎖および長鎖)カリクレインオリゴヌ
クレオチドを中程度ストリンジェンシー条件下で肝臓mR
NAおよびtRNAとハイブリダイゼーションした成績を、唾
液腺mRNAのハイブリダイゼーションと比較した結果を示
す。カリクレインでないRNAを含んだ核酸の場合は可視
信号が認められず、ハイブリダイゼーションがカリクレ
インmRNAを含んでいる種に特異的であることを示してい
る。
ダイゼーション特異性を検査した。第7図は2種類の単
一標識をした(短鎖および長鎖)カリクレインオリゴヌ
クレオチドを中程度ストリンジェンシー条件下で肝臓mR
NAおよびtRNAとハイブリダイゼーションした成績を、唾
液腺mRNAのハイブリダイゼーションと比較した結果を示
す。カリクレインでないRNAを含んだ核酸の場合は可視
信号が認められず、ハイブリダイゼーションがカリクレ
インmRNAを含んでいる種に特異的であることを示してい
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−152364(JP,A)
Claims (21)
- 【請求項1】式(I) [式中、YはHまたはOH、または保護されたヒドロキシ
基、XはH、ホスホネート基、または式 (ここで、R1およびR2は同一または異なってもよく、分
枝しまたは分枝していないアルキルおよび置換アルキル
から選ばれ、Qはリン酸保護基である) で示されるホスホルアミダイト基、 ZはH、ホスフェートまたはトリホスフェート基、また
はヒドロキシ保護基、X′は分枝しまたは分枝していな
いC1〜15アルキレン基、 RはCO(CH2)nNHA基(ここで、Aは酸に不安定なアミノ
保護基またはけい光団またはその他の非放射性の検出可
能なマーカー、nは1〜15を表わす)である] で示されるヌクレオシド誘導体。 - 【請求項2】R1およびR2がいずれもイソプロピル基であ
る請求項1記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項3】X′がメチレンである請求項1または2に
記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項4】nが5である請求項3に記載のヌクレオシ
ド誘導体。 - 【請求項5】YがHまたはOH、または保護されたヒドロ
キシ基、 Zがジメトキシトリチル、 X′がCH2、 RがCO(CH2)5NHA(ここで、Aは請求項1と同意義) である請求項1記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項6】YがH、OH、または保護されたヒドロキシ
基、 XがH、 Zがトリホスフェート、 X′がCH2、 RがCO(CH2)5NHA(ここで、Aは請求項1と同意義) である請求項1に記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項7】Qがメチル、フェニル、置換フェニル、ベ
ンジル、およびシアノエチル基から選ばれた請求項1〜
6のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項8】非放射性の検出可能なマーカーがビオチ
ン、アビジン、コロイド金またはコロイド銀、およびフ
ェリチンから選ばれたものである請求項1〜7のいずれ
かに記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項9】非放射性の検出可能なマーカーが酵素であ
る請求項1〜7のいずれかに記載のヌクレオシド誘導
体。 - 【請求項10】酵素がβ−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、ペルオキシダーゼ、またはアルカリ性ホスファター
ゼである請求項9に記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項11】けい光団がフルオレセインである請求項
1〜7のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項12】けい光団が、けい光を抑制する1または
それ以上の基を含んでいるが、これらの基を除くとけい
光を発することが可能なけい光団前駆体である請求項1
〜7のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。 - 【請求項13】下記の式: を有する請求項12に記載のヌクレオシド誘導体。
- 【請求項14】式(II): [式中、X、YおよびZは請求項1と同意義である] で示される5−ヨードウリジンまたは5−ヨードデオキ
シウリジンを式: H−C≡CX′NR[式中、X′およびRは請求項1と同意
義である]で示されるアミノアルキンと、パラジウム触
媒の存在下で反応させることからなる請求項1に記載の
式(I)のヌクレオシド誘導体の製造方法。 - 【請求項15】式(III) [式中、X′、YおよびRは請求項1と同意義である] で示される1またはそれ以上のヌクレオチド単位を含ん
でなるポリヌクレオチド。 - 【請求項16】個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド
群を成長しつつあるヌクレオチド鎖へ逐次結合させるこ
とからなる請求項15に記載のポリヌクレオチドの製造法
であって、該ヌクレオチドの少なくとも1つが請求項1
に記載のヌクレオシド誘導体であることを特徴とする方
法。 - 【請求項17】(a)第1のポリヌクレオチド、 (b)第1のポリヌクレオチドの一部とハイブリダイズ
する第2のポリヌクレオチド、 (c)1またはそれ以上のヌクレオチドトリホスフェー
ト、 (d)DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ を反応させることからなる請求項16に記載の製造法であ
り、該第2のポリヌクレオチドの3′末端からポリヌク
レオチドが合成され、該ヌクレオチドトリホスフェート
の少なくとも一つが請求項1記載の式(I)のヌクレオ
シド誘導体(Zはトリホスフェート、Xは水素)である
ことを特徴とする方法。 - 【請求項18】ヌクレオチドを互いにそれぞれの5′お
よび3′を介して逐次結合することからなる請求項16に
記載の方法であって、該ヌクレオチドの少なくとも1つ
が請求項1に記載の式(I)[式中、Xはホスホネー
ト、または式: (ここで、R1、R2およびQは請求項1と同意義である) で示される基から選ばれる] のヌクレオシド誘導体であることを特徴とする方法。 - 【請求項19】(a)(i)ポリデオキシヌクレオチ
ド、 (ii)ポリデオキシヌクレオチド(i)の一部とハイブ
リダイズし得るポリデオキシヌクレオチドプライマー、 (iii)dATP、dGTP、dCTP、dTTP、 (iv)ddATP、 (v)DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼのクレノ
ー断片、 からなる第1の反応混合物を用意し、 (b)ddATPをddGTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第2の反応混合物を用意し、 (c)ddATPをddCTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第3の反応混合物を用意し、 (d)ddATPをddTTPに置き代えた以外は第1の反応混合
物と同一である第4の反応混合物を用意し、 (e)上記の反応混合物を別々にインキュベートして、
それぞれのポリデオキシヌクレオチドプライマーをその
3′末端から伸長させ、種々の鎖長のポリデオキシヌク
レオチド群を作成し、この場合、伸長しつつある鎖ヘジ
デオキシヌクレオチドが挿入されることによって新たに
合成される各ポリデオキシヌクレオチドにおけるヌクレ
オチド数が決定され、 (f)ゲルマトリックスを通過させることにより反応混
合物(a)〜(d)を分画する、各工程からなるDNAの
配列決定法であって、 ポリデオキシヌクレオチドプライマー(ii)が1または
それ以上の請求項15に記載のポリデオキシヌクレオチド
であり、そして/または上記の各反応混合物が請求項1
に記載の式(I)のヌクレオシド誘導体(ここで、Zは
トリホスフェート、XはHであり、R、X′およびYは
請求項1と同意義である)を含有しており、それによっ
てけい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカ
ーが新たに合成される各ポリデオキシヌクレオチドへ挿
入されることを特徴とし、さらに、 新たに合成されたポリデオキシヌクレオチドに含まれた
けい光団またはその他の非放射性の検出可能なマーカー
の検出によって、ゲルマトリックスで分離した新たに合
成されたポリデオキシヌクレオチドの相対的な位置を確
認し、このようにして第1のポリヌクレオチドのDNA配
列を明らかにすることを特徴とする、DNAの配列決定方
法。 - 【請求項20】新たに合成したポリヌクレオチド鎖が光
源からの照射によって誘発されたけい光により検出され
る少なくとも1個のけい光団を含んでいる請求項19に記
載の方法。 - 【請求項21】反応混合物(a)〜(d)がそれぞれ、
異なった発光極大を有する異なったけい光団または異な
った非放射性の検出可能なマーカーを有している請求項
19または20に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2666 | 1987-06-24 | ||
AUPI266687 | 1987-06-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02504144A JPH02504144A (ja) | 1990-11-29 |
JP2828642B2 true JP2828642B2 (ja) | 1998-11-25 |
Family
ID=3772261
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP63505657A Expired - Lifetime JP2828642B2 (ja) | 1987-06-24 | 1988-06-24 | ヌクレオシド誘導体 |
Country Status (9)
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US (1) | US5552540A (ja) |
EP (1) | EP0366685B1 (ja) |
JP (1) | JP2828642B2 (ja) |
AT (1) | ATE113059T1 (ja) |
AU (1) | AU598946B2 (ja) |
CA (1) | CA1340032C (ja) |
DE (1) | DE3851889T2 (ja) |
NZ (1) | NZ225176A (ja) |
WO (1) | WO1988010264A1 (ja) |
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