JP2017500865A - レプチンmRNAの組成物および製剤 - Google Patents
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Abstract
改変された合成メッセンジャーRNAおよび送達剤を含む製剤。改変された合成メッセンジャーRNAは、レプチンタンパク質をコードし、複製せず、翻訳が直ちに可能である。製剤は、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象に送達することができる。
Description
本発明は、概して、ポリヌクレオチドの生体影響(bio-affecting)組成物または体侵食(body eating)組成物に関し、特に、対象にヒトレプチンタンパク質をコードする改変された合成非複製メッセンジャーRNA(mRNA)を投与することによる、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象の処置に関する。
レプチンは、白色脂肪組織によって生成され、個体の循環系の中に分泌されるホルモンである。循環レプチンは個体の脳に入り、そこでそれはレプチン受容体に結合し、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化させることによって食欲(満腹感)、エネルギー代謝および神経内分泌機能を調節する。
先天性レプチン欠乏症は、レプチン遺伝子での突然変異によって引き起こされる。先天性レプチン欠乏症をもつ個体は貪欲に食べ、病的肥満になり、性腺機能低下症および糖尿病を含む肥満の結果を患う。全身性リポジストロフィー(脂肪組織のほとんど完全な不在)を引き起こすレプチン突然変異または単一遺伝子突然変異をもつ個体も、不十分なレプチンレベルを有する。リポジストロフィーおよび低いレプチンレベルをもつこれらの個体は痩せているが、過食、重度の脂質異常および糖尿病を起こす。
組換えレプチンタンパク質による処置は、これらの影響を逆戻りさせる。Licinio J et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(13):4531-6は、レプチンタンパク質療法の後にレプチン欠乏肥満成人での体重減少を示した。患者を皮下メトレレプチン(組換えレプチンタンパク質)で18カ月間処置し、それは、身体活動の増加、2型糖尿病および性腺機能低下症の解消、ならびに肥満度指数の低減をもたらした。全身性リポジストロフィーを有する患者で、Ebihara K et al. (2007) J. Clin. Endocrinol. Metab. 92 532-541は、1日2回の注射によるメトレレプチンによる40カ月間の処置が、1週間以内に開始して空腹時グルコースおよびトリグリセリドレベルを改善したことを示した。レプチン補充療法は、インスリン抵抗性を低減し、インスリン分泌を増強した。メトレレプチン療法は、糖尿病とリポジストロフィーの両方の合併症に有益であった。Chan JL et al. (2011) Endocr. Pract. 17(6):922-932は、メトレレプチン療法がリポジストロフィー患者の代謝異常を正常化することを示した。特に、Chan et al. (2011)は、3年の処置期間にわたってメトレレプチン療法がヘモグロビンA1cおよびトリグリセリドレベルを低減したことを示した。
しかし、レプチンタンパク質は生成するのが困難であり、半減期が短く、1日に1〜2回の皮下(SC)投薬を必要とする。したがって、当技術分野では、レプチン投薬レジメンを1日2回から数日おきに1回に、またはさらにはより低い頻度に低減させることによって、患者標準治療を改善する必要性がある。
本発明は、対象においてレプチン欠乏症を治すのに有用である製剤を提供する。製剤は、有利には、in vivoで最小限の免疫賦活化およびレプチンタンパク質の制御された発現で、数日おきに1回対象に投与することができる。
製剤の1つの構成要素は、改変された合成レプチンメッセンジャーRNA(mRNA)である。mRNAの改変は、改善されたmRNA安定性および減少した免疫原性をもたらす。改変された合成レプチンmRNAの合成は、in vitro転写を含むいくつかの方法のいずれかによるものであってもよい。一実施形態では、レプチンmRNAは、レプチンmRNAのin vitro転写の間のプソイドウリジン(Ψ)によるレプチンmRNA中のウリジンの置換によって、その合成の間に改変される。具体的な実施形態では、レプチンmRNA中のウリジンの全てがプソイドウリジンで置換される。
一実施形態では、改変された合成レプチンは、天然に見出されるコード配列を有する。代わりの実施形態では、改変された合成レプチンは、コドン最適化されたコード配列を有する。一実施形態では、改変された合成レプチンは、天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であるタンパク質をコードするコード配列を有する。
製剤の別の構成要素は、送達剤である。一実施形態では、送達剤は脂質ナノ粒子である。一実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、(i)封入およびエンドソームエスケープのためのカチオン性脂質、(ii)安定化のための中性脂質、(iii)同じく安定化のためのヘルパー脂質、および(iv)凝集を阻止するステルス脂質を含む。より具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性リピドA、カチオン性リピドB、カチオン性リピドCまたはカチオン性リピドDであってもよく;ヘルパー脂質はコレステロールであり;ステルス脂質は、ポリエチレングリコール(PEG)脂質(「リピド化PEG」)である。別の実施形態では、改善された脂質ナノ粒子は、個体の細胞でのレプチンタンパク質の改善された発現および個体の循環でのレプチンの増加を提供するための送達剤として用いられる。別の実施形態では、ヘルパー脂質は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)である。さらに別の実施形態では、ステルス脂質はS024(本明細書でさらに記載される)である。別の実施形態では、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は3:1から8:1の間である。
本発明は、レプチン欠乏症を有する対象に改変された合成レプチンmRNA製剤を投与する方法も提供する。対象は、先天性および後天性の全身性リポジストロフィー(非常に低いレプチンレベルがある)、後天性HIVリポジストロフィー(低いレプチンレベルがある)、視床下部無月経または肥満(特に、レプチンレベルが低下した者)などの状態を有してもよい。器官または脂肪組織でレプチンタンパク質の外因性発現を誘導するために、改変された合成レプチンmRNA製剤を対象にin vivoで、または器官もしくは組織にex vivoで投与することができる。したがって、mRNAは染色体挿入リスクをもたらすかもしれないDNAコピーを生み出すために哺乳動物細胞で逆転写することができないので、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、最小限のがんのリスクで遺伝子療法に類似の目的のために用いることができる。
一実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤は、個体に静脈内投与される。別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤は、皮下投与される。さらに別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤は、先ず静脈内投与され、次に皮下投与される。改変された合成レプチンmRNA製剤は、反復投薬で投与することができる。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、対象の体重1kgにつき少なくとも0.2mgのレプチンmRNAの投薬量で送達される。別の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、対象の体重1kgにつき少なくとも0.6mgのレプチンmRNAの投薬量で送達される。
本発明は、いくつかの利点を有する。利点の1つは、1日1〜2回の皮下投与であるレプチンタンパク質の投与に必要とされる投与より低い頻度で製剤を個体に投与することができることである。一実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤の投与は、3日おきに1回であってもよい。別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤の投与は、1週に1回であってもよい。一実施形態では、改変された合成レプチンmRNAは、個体への免疫原性レベルが低い脂質ナノ粒子複合体にパッケージされる。別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNAは、有利には、生分解性である送達剤にパッケージされる。
利点の1つは、対象への製剤の投与が、in vivoでレプチンの薬学的に活性なレベルをもたらすのに十分な改変された合成レプチンmRNAを送達することである。本明細書に記載されるように、本発明の改変された合成レプチンmRNAのEC50濃度値は、食物摂取の抑制のために血漿中で1.4ng/mL(85pM)と決定された。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、レプチン欠損ob/obマウスで体重を減少させるためのヒトレプチンタンパク質濃度のEC50の2倍の値である、少なくとも2.8ng/mLのレプチンタンパク質の血漿中濃度を投与がもたらすように対象に投与される。別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤の送達は、1.4ng/mLレプチンタンパク質の血漿中濃度をもたらす。さらに別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤の送達は、185ng/mLの血漿中濃度をもたらす。別の実施形態では、改変された合成レプチンmRNA製剤の送達は、1300ng/mLのレプチンタンパク質の血漿中濃度をもたらす。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、投与前の対象のベースラインレプチンタンパク質濃度を少なくとも10ng/mL上回る血漿レプチンタンパク質濃度のために十分な量で対象に投与される。
本発明は、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤が投与される対象にいくつかの測定可能な利益を提供する。本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤の送達は、食物摂取および体重における用量依存的減少を誘導する。本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤の送達は、肥満および糖尿病を改善する。一実施形態では、投与は、グルコースの血漿中濃度の少なくとも30%の低下をもたらす。一実施形態では、本発明のレプチンmRNAの投与は、トリグリセリドの血漿中濃度の少なくとも40%の低下をもたらす。
痩せた対象への本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与は、循環中で、肥満対象への本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与より低いレベルのレプチンタンパク質をもたらす。これらの結果は、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤が肥満対象の処置のために利点を有することを示す。
序論
本明細書において、改変された合成レプチンmRNAの生成のための組成物および方法が開示される。本発明の組成物および方法は、レプチンタンパク質の発現のために外因性DNAまたはウイルスベクターをベースとした方法を含まず、したがってゲノムの恒久的な改変を引き起こさず、予想外の変異原性作用の可能性もない。本発明の組成物、製剤および方法は、in vitroで合成されたRNAの細胞への直接導入に基づき、それは、in vitroまたはin vivoで翻訳されたときに所望のレプチンタンパク質を提供する。
本明細書において、改変された合成レプチンmRNAの生成のための組成物および方法が開示される。本発明の組成物および方法は、レプチンタンパク質の発現のために外因性DNAまたはウイルスベクターをベースとした方法を含まず、したがってゲノムの恒久的な改変を引き起こさず、予想外の変異原性作用の可能性もない。本発明の組成物、製剤および方法は、in vitroで合成されたRNAの細胞への直接導入に基づき、それは、in vitroまたはin vivoで翻訳されたときに所望のレプチンタンパク質を提供する。
本発明の合成レプチンmRNAを改変する目的の1つは、免疫原性を低減することである。より高等の真核細胞は、外来の「非自己」RNAに対する細胞性防御手段を有する。これらの防御手段は細胞性タンパク質合成の広域的阻害を引き起こし、細胞毒性をもたらす。細胞性防御手段はin vitroで合成されたRNAを通常は外来であると認識し、この細胞性先天性免疫応答を誘導する。本明細書に記載される方法では、応答を回避または低減する様式で改変される合成RNAを用いることによって、細胞性先天性免疫応答の効果は軽減される。先天性免疫応答の回避または低減は、外因的に導入されたRNAからの持続性の発現を可能にする。一態様では、持続性の発現は、本発明の改変された合成レプチンmRNAの反復導入によって達成される。
Karikoらへの米国特許第8,278,036号は、ウリジンがプソイドウリジン(Ψ)で置き換えられたmRNA分子、それを合成する方法および治療的タンパク質のin vivo送達のための方法を開示する。この特許は、開示の方法によって作製することができる多くのmRNAを開示する。Kariko K et al. (2007) Current Opinion in Drug Discovery and Development 10(5): 523-532;Kariko K et al. (2008) Molecular Therapy 16(11), 1833-1840およびAnderson BR et al. (2010) Nucleic Acids Res. 38(17): 5884-5892も参照されたい。
本発明は、新規脂質ナノ粒子複合体にパッケージされたレプチンmRNAのin vivo効力データならびに静脈内および皮下送達の後のレプチンタンパク質発現に関するin vivo試験データを提供する。
定義
「同時転写で加えられた」は、RNA分子の転写の間の、本発明の改変された合成レプチンmRNAへの特徴、例えば5’ジグアノシンキャップまたは他の改変ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの付加を意味する(すなわち、改変RNAは5’キャップの付加の前に完全には転写されない)。
「同時転写で加えられた」は、RNA分子の転写の間の、本発明の改変された合成レプチンmRNAへの特徴、例えば5’ジグアノシンキャップまたは他の改変ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの付加を意味する(すなわち、改変RNAは5’キャップの付加の前に完全には転写されない)。
「生分解性」は、材料が対象の体内で分解し、その化学的同一性を失うことを意味する。生分解性脂質は、ほとんどの脂質と比較して、in vivoで速やかに消去される脂質である。生分解性脂質部分は、in vivo投与後の組織曝露のピークを過ぎてから速やかに消滅する。消去は、肝臓半減時間として薬物動態学的に測定することができる。国際特許出願番号WO2011/153493を参照されたい。生分解性ポリマーは、それらを除去するための2回目の手術を回避するために、または薬物を徐々に放出するために医療器具で用いられるタイプのポリマーであってもよい。
「コード領域(CDS)」または「コード配列」は、タンパク質などのポリペプチドをコードする、メッセンジャーRNA(mRNA)の部分である。コード領域は、一般的にAUGコドンで開始し、1つまたは複数のストップコドンで終わる。いくつかの例示的なコドン領域が本明細書に記載される。他のコード領域を決定する方法も、本明細書に記載される。真核生物のメッセンジャーRNAは、コード領域中の情報のポリペプチドへの翻訳のために有用であるがそれら自身はコード領域でない、他の部分を含む。メッセンジャーRNAのこのような他の部分は、本明細書にさらに記載される。本明細書で用いるように、用語「オープンリーディングフレーム(ORF)」も、コード領域またはコード配列を記載するために用いられる。
細胞を「接触させる」とは、細胞を本発明の改変された合成レプチンmRNAまたはその製剤とin vivoまたはin vitroで接触させることを意味する。そのような細胞がin vivoである場合は、細胞を本発明の改変された合成レプチンmRNAと接触させることは、化合物がin vivoで細胞と接触するように、製剤中の本発明の改変された合成レプチンmRNAを適当な投与経路によって対象に投与することを含む。
「保存された」ヌクレオチドまたはアミノ酸は、比較される2つ以上の配列の同じ位置に変更なしに出現する、それぞれポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の残基である。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関係している配列の間で保存されているものである。それらがお互いと100%同一であるならば、2つ以上の配列は「完全に保存されている」。一部の実施形態では、それらがお互いと少なくとも90%同一であるならば、2つ以上の配列は「高度に保存されている」。一部の実施形態では、それらがお互いと同一であるならば、2つ以上の塩基は「保存されている」。配列の保存は、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用することができるか、またはその部分、領域もしくは特徴に適用することができる。
「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する行為または様式を意味する。「送達剤」は、細胞への核酸分子のin vivo送達を少なくとも一部促進する任意の物質である。
「欠失」は、DNAのある部位を欠くまたは欠失する突然変異である。
「検出可能な標識」は、X線撮影法、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などを含む当技術分野で公知の方法によって容易に検出される、別の実体(RNAまたはタンパク質など)に付着しているか、組み込まれるかまたはそれと関連する、1つまたは複数のマーカー、シグナルまたは部分を意味する。検出可能な標識には、放射性同位体、蛍光体、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドットなどが含まれる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるRNAまたはタンパク質の任意の位置に置かれてもよい。
「投薬レジメン」は、処置、予防または待期的医療の投与スケジュールまたは医師が決定したレジメンである。
「外因性」核酸は、それが通常は見出されないかまたはそれがより低い量で見出される細胞または生物体などの生体系に、ヒト介入を含むプロセスによって導入された核酸(例えば、本発明の改変された合成レプチンmRNA)である。その物質を継承する直属の前駆体細胞または子孫細胞にそれが導入されるならば、因子(例えば、本発明の改変された合成レプチンmRNA)は外因性である。対照的に、「内因性」は、生体系または細胞にとって天然である因子または発現生成物である(例えば、遺伝子の内因性発現)。
「発現」は、RNAおよびタンパク質の生成、ならびに適宜、転写、翻訳、折畳み、修飾およびプロセシングを含むタンパク質の分泌に関与する細胞過程である。核酸配列の「発現」は、以下の事象の1つまたは複数を指す:(i)DNA配列からのRNA鋳型の生成(例えば、転写による);(ii)RNA転写産物のプロセシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成または3’末端プロセシングによる);(iii)ポリペプチドまたはタンパク質へのRNAの翻訳;および(iv)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。「発現生成物」または「遺伝子生成物」には、遺伝子から転写されるRNAおよび遺伝子から転写されるmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドが含まれる。
「フレームシフト」は、DNA配列の3で均等に分割できないいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失によって引き起こされる突然変異である。コドンによる遺伝子質発現のトリプレット性のために、挿入または欠失はリーディングフレーム(コドンの組分け)を変えることができ、元のものと完全に異なる翻訳をもたらす。これは、機能の喪失をもたらすトランケーションされたタンパク質をしばしば生み出す。
「相同性」は、核酸分子(例えばDNA分子またはRNA分子)の間またはポリペプチド分子の間の全体的関連性を意味する。用語「相同的」は、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)の間の比較を必然的に指す。
「同一性」は、ポリマー分子の間、例えばオリゴヌクレオチド分子(例えば、DNA分子またはRNA分子)の間またはポリペプチド分子の間の全体的関連性を意味する。例えば2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために2つの配列を並べることによって実行することができる(例えば、最適なアラインメントのために第1および第2の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非同一配列は比較目的のために無視することができる)。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが次に比較される。第1の配列中の位置が第2の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合は、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)によって記載されるものなどの方法を用いて、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを判定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Clustal 2.0多重配列アラインメントプログラムを用いて判定することができる。Larkin MA et al. (2007) "Clustal @ and Clustal X version 2.0." Bioinformatics 23(21): 2947-2948。
「先天性免疫応答」または「インターフェロン応答」は、外来生物体、例えばウイルスまたは細菌、またはそのような生物体の生成物、例えば対象細胞で生成されるRNAに特徴的な改変を欠くRNAによる感染の認識に応答して細胞によって開始される、細胞防御応答を意味する。先天性免疫応答は、外因性核酸を検出する細胞の死を誘導することによって、ウイルスおよび細菌感染から保護する。「先天性免疫応答」または「インターフェロン応答」の記載は、Karikoらへの米国特許第8,278,036号によって提供される。
「単離細胞」は、それが本来見出される生物体から取り出された細胞またはそのような細胞の後代である。任意選択で、細胞は、in vitroで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。任意選択で、細胞は後に第2の生物体に導入されるか、またはそれが単離された生物体(またはそれが由来する細胞または細胞の集団)に再導入される。
「挿入」は、DNAのある場所に余分の塩基対が挿入される突然変異である。
「レプチン」は、対象における、食欲および飢え、代謝ならびに行動を含む、エネルギーの摂取および消費の調節に関与する約16kDaのタンパク質である。本明細書で用いるように、用語「レプチン」は、in vivo機能またはin vitro機能、例えばヒトレプチン受容体(LEPR、CD295)への機能的結合によって測定される通り、レプチンタンパク質として機能することができる任意のタンパク質を含む。用語「ヒトレプチン」には、タンパク質受託番号NP_000221の配列(配列番号3)を有する天然のヒトレプチン(LEP)、およびヒトレプチンタンパク質として機能するヒトレプチンの任意の変異体が含まれる。ヒト以外の哺乳動物のレプチンポリペプチドは、ヒトレプチンと67%以上の同一性を一般に有する。Doyon C et al. (2001) "Molecular Evolution of Leptin." Gen. and Comp. Endocrinol. 124:188-198;Denver RJ et al. (2011) "Evolution of Leptin Structure and Function." Neuroendocrinol. 94:21-38。用語「レプチン」には、ヒトレプチンの合成類似体であるメトレレプチンも含まれ、その使用はLicinio et al. (2004)、Ebihara K et al. (2007)およびChan et al. (2011)によって記載される。用語「レプチン」には、ヒトレプチンの機能的特性を有する、任意の硬骨魚または両生類のレプチンオルソログも含まれる。例えば、アフリカツメガエル(Xenopus)のレプチンは、細胞上で発現されるヒトレプチン受容体を活性化する。Hen G et al. (2008) "Monitoring leptin activity using the chicken leptin receptor." J. Endocrinol. 197:325-333。
「改変された」は、本発明の分子の変化した状態または構造を意味する。「改変された」mRNAは、標準のグアニン(G)、アデニン(A)、シチジン(C)およびウリジン(U)ヌクレオシドに対して改変形を含むリボヌクレオシドを含有する。非標準ヌクレオシドは、天然に存在するもの、または天然に存在しないものであってもよい。RNAは、当業者に公知である方法によって、化学的、構造的および機能的を含む多くの形で改変することができる。そのようなRNA改変は、例えば、哺乳動物細胞mRNAに転写後に通常導入される改変を含むことができる。さらに、Karikoらへの米国特許第8,278,036号、およびSchrumへの米国特許出願公開第2013/0102034号、deFougerollesらへの米国特許出願公開第2013/0115272号およびdeFougerollesらへの米国特許出願公開第2013/0123481号に記載されるように、mRNA分子は、天然および非天然のヌクレオシドまたはヌクレオチドの転写の間に導入によって改変することができる。本発明の改変された合成レプチンmRNAに関するときの改変されたは、野生型ヒトレプチンコード配列と異なる任意の変更を意味することもできる。
「患者」は、処置を求めるかもしくはその必要性がある対象、処置を要求する対象、処置を受けている対象、処置を受けようとする対象、または特定の疾患もしくは状態のために訓練された専門家によって治療中の対象である。
語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なしでヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適し、理にかなった利益/リスク比と釣り合っている、化合物、材料、組成物または剤形を指す。
「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形に変換することによって親化合物が改変される、本発明の化合物の誘導体である。薬学的に許容される塩の例には、限定されずに、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば無毒の無機または有機の酸から形成される親化合物の従来の無毒の塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基の形を、水または有機溶媒中、または2つの混合液中の適当な塩基または酸の化学量と反応させることによって調製することができる。適する塩のリストは、Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Press and Journal of Pharmaceutical Science (1977) 66, 2、に見出される。
「プライマー」は、短い核酸配列である。一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応で用いられるかなり短い長さ(例えば、8〜30ヌクレオチド)のオリゴヌクレオチドである。PCRプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、標的配列からの配列情報を用いて、当業者が容易に開発、生成することができる。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
「プローブ」(オリゴヌクレオチドプローブ)は、サイズが約50〜100ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、さらに数千ヌクレオチドの長さまで一般的に変動する核酸分子である。したがって、プローブは、整数増分で50から数千ヌクレオチドの範囲内の任意の長さを含む、本明細書に記載されるアッセイで用いるための任意の適する長さであってもよい。そのような分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的核酸配列とハイブリダイズさせることによって、試料中の特異的核酸配列を特定するために一般的に用いられる。ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知である。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
「低減された細胞傷害性」は、例えば同じ配列を有するがRNAへの改変を欠くRNA分子との接触と比較して、本発明の改変された合成レプチンmRNAと繰り返し接触させた細胞培養中の細胞の50%未満の死を意味する。低減された細胞傷害性は、例えばTUNELアッセイを用いてアポトーシスを測定することによって評価することができる。「低減された細胞傷害性」を判定するための他の有用な測定手段には、例えば、フローサイトメトリーおよびビーズをベースとした生存率の測定、細胞増殖または細胞性(例えば顕微鏡で測定して、血球計で定量化する)が含まれる。
「反復投与」は、対象への複数回(例えば、2回以上または少なくとも2回)の投与である。一部の実施形態では、投与頻度は、所与の時間の間に24〜48時間以上おきに起こる。頻度は、各投与の間の間隔が異なるように異なってもよい(例えば、第1の間隔36時間、第2の間隔48時間、第3の間隔72時間など)。
生物学および化学の当業者に公知であるように、「リボ核酸(RNA)ポリヌクレオチド」はリボヌクレオチドのポリマーである。RNA分子の各ヌクレオチドはリボース糖を含有し、炭素は1’から5’まで番号付けされる。塩基が、1’位に結合する。一般に、塩基は、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)またはウラシル(U)であるが、多くの改変形が当業者に公知である。例えば、本明細書に記載されるように、プソイドウリジンヌクレオチドがウリジンヌクレオチドに代えて置換されるように、RNAは1つまたは複数のプソイドウラシル(Ψ)塩基を含有することができる。本明細書に記載される通り、多くの他のRNA改変が当業者に公知である。RNAの種類の1つは、DNAからリボソームに遺伝情報を伝達する働きを本来する「メッセンジャーRNA(mRNA)」であり、それらは、転写として知られるプロセスによって遺伝子発現のタンパク質生成物のアミノ酸配列を規定する。生物学の当業者に公知であるように、構造的および情報的に、メッセンジャーRNAはコード領域中のタンパク質の情報をコードする。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressを参照されたい。
「試料」は、その組織、細胞または構成部分(例えば、体液)のサブセットである。試料は、全生物体またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその画分または部分、例えば、限定されずに、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部、呼吸、腸および尿生殖器の管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、から調製されるホモジネート、溶解物または抽出物をさらに含むことができる。試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地をさらに指す。「試験試料」または「患者試料」は、限定されずに、単離細胞の試料、組織試料または体液試料を含む、本発明の方法によって評価されるべき細胞または細胞から分泌された生成物を含有する任意のタイプの試料を意味する。「組織試料」は、単離細胞の試料に類似しているが、任意選択で細胞を保持する細胞骨格構造と一緒の、いくつかの細胞型を一般的に含む体の器官または組織の部位である。「細胞試料」は「組織試料」の一タイプであるが、用語「組織試料」は、細胞試料より複雑な構造を指すために用いられることの方が多いかもしれない。組織試料は、例えば切断、スライシングまたはパンチによることを含む、生検によって得ることができる。「体液試料」は、組織試料と同様に、評価される細胞を含有し、特定の体液から試料を採取するのに適する任意の方法によって得られる流体である。試料採取に適する体液には、中でも、血液、血漿および血清が含まれる。
「選択的に結合する」は、1つの化合物の別のものとの(例えば、本発明の製剤の細胞との)特異的結合を意味し、そこで、任意の標準のアッセイによって測定される結合レベルは、そのアッセイのバックグラウンド対照より統計学的に有意に高い。
「対象」は、本明細書で用いるように、実験、診断、予防または治療目的であれ、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤を投与することができる任意の生物体である。一般的な対象には、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類およびヒトなどの哺乳動物が含まれる。
「置換」は、1つの塩基を別のものと交換する突然変異である(すなわち、AからGへの交換などの単一の「化学的文字」の変化)。そのような置換は、(i)異なるアミノ酸をコードして生成されるタンパク質に小さい変化を引き起こすものにコドンを変更すること;(ii)同じアミノ酸をコードして生成されるタンパク質に変化を引き起こさないものにコドンを変更すること(「サイレント突然変異」);または(iii)アミノ酸コードコドンを単一の「終止」コドンに変更して不完全タンパク質を生じさせることができるかもしれない。
疾患、障害または状態を「患っている」個体は、疾患、障害または状態を診断されているか、またはその1つまたは複数の症状を示す。
疾患、障害または状態に「感受性である」個体は、その疾患、障害または状態を診断されていないか、またはその症状を示さないが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。一部の実施形態では、疾患、障害または状態(例えば、肥満)に感受性である個体は、以下の1つまたは複数で特徴付けることができる:(i)疾患、障害または状態の発症と関連する遺伝子突然変異;(ii)疾患、障害または状態の発症と関連する遺伝子多型;(iii)疾患、障害または状態と関連するタンパク質または核酸の発現または活性の増加または減少;(iv)疾患、障害または状態の発症と関連する習慣またはライフスタイル;(v)疾患、障害または状態の家族歴;および(vi)疾患、障害または状態の発症と関連する微生物への曝露またはそれによる感染。一部の実施形態では、疾患、障害または状態に感受性である個体は、その疾患、障害または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害または状態に感受性である個体は、その疾患、障害または状態を発症しない。
「合成」は、ヒトの介入によって生成、調製または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的であるかまたは酵素的であってもよい。
「ターゲティング部分」は、特定の組織、細胞型、受容体、感染因子または他の対象領域に向かうか、優先的に関連するかまたは結合する薬剤である。mRNA送達組成物へのターゲティング部分の付加は、所望の細胞型または位置へのmRNAの送達を増大させる。細胞におけるターゲティング部分の付加または発現は、動物または対象の中の所望の位置へのその細胞の限局化を強化する。
「治療有効量」または「有効量」は、送達される薬剤(例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など)の、疾患、障害または状態を患っているかまたはそれに感受性の対象に投与したときに、疾患、障害または状態を処置するか、その症状を改善するか、診断するか、予防するか、その発症を遅らせるのに十分である量、あるいは、研究者、獣医、医師または他の臨床医が望む、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を導き出す量である。
「処置すること」は、特定の疾患、障害または状態の1つまたは複数の症状または特徴を部分的または完全に緩和、寛解、改善、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻止すること、その重症度を低減することまたはその発生頻度を低減することである。例えば、「処置すること」は、レプチン欠乏症またはリポジストロフィーを後退させるかまたは緩和する手段を指すことができる。「処置」は、例えば、レプチン欠乏症またはリポジストロフィーを処置する行為を意味する。処置は、疾患の徴候を示さない対象に、または疾患の初期徴候だけを示す対象に、疾患と関連する病状を発症するリスクを低下させる目的で投与されてもよい。
レプチン欠乏症
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、レプチン欠乏症の対象への投与のために有用である。原則的に、レプチン欠乏症(低い循環レプチンレベル)につながるいかなる状態も、本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与によって処置することができる。レプチン欠乏症を有する対象には、以下の状態を有する者が含まれてもよい:(i)レプチン遺伝子の突然変異による先天性レプチン欠乏症、(ii)先天性および後天性全身性リポジストロフィー;(iii)患者は低いレプチンレベルを有する後天性HIVリポジストロフィー;(iv)運動誘導形または非競技形(食事誘導性)であれ、視床下部無月経;(v)10%の体重減少の後の重量維持(すなわち、代謝適応)。これらの状態のいずれかを有する対象は、低い循環レプチンレベルの状態にあり、代謝疾患(糖尿病、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症および過食)、月経周期および重量維持を正常化するために本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与が有益である。Kelesidis T et al. (2010) Annals of Internal Medicine 152(2):93-101およびDardeno TA et al. (2010) Frontiers in Neuroendocrinology 31:377-393を参照されたい。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、レプチン欠乏症の対象への投与のために有用である。原則的に、レプチン欠乏症(低い循環レプチンレベル)につながるいかなる状態も、本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与によって処置することができる。レプチン欠乏症を有する対象には、以下の状態を有する者が含まれてもよい:(i)レプチン遺伝子の突然変異による先天性レプチン欠乏症、(ii)先天性および後天性全身性リポジストロフィー;(iii)患者は低いレプチンレベルを有する後天性HIVリポジストロフィー;(iv)運動誘導形または非競技形(食事誘導性)であれ、視床下部無月経;(v)10%の体重減少の後の重量維持(すなわち、代謝適応)。これらの状態のいずれかを有する対象は、低い循環レプチンレベルの状態にあり、代謝疾患(糖尿病、インスリン抵抗性、高トリグリセリド血症および過食)、月経周期および重量維持を正常化するために本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与が有益である。Kelesidis T et al. (2010) Annals of Internal Medicine 152(2):93-101およびDardeno TA et al. (2010) Frontiers in Neuroendocrinology 31:377-393を参照されたい。
先天性レプチン欠乏症は、レプチン遺伝子の突然変異によって引き起こされる。先天性レプチン欠乏症をもつ対象は貪欲に食べ、病的肥満になり、性腺機能低下症および糖尿病を含む肥満の結果を患う。
リポジストロフィー症候群は遺伝性または後天性のいずれであってもよく、脂肪組織の全身性または部分的な喪失および結果としての循環中の不十分なレプチンレベルを伴う。リポジストロフィー症候群患者は、体の脂肪組織の縮退または再分布(低脂肪症)または両方を有する。リポジストロフィー症候群患者は、インスリン抵抗性、糖尿病、高トリグリセリド血症および過食などの、病的肥満としばしば関連した重度の代謝表現型を示す。重度のリポジストロフィーを有する患者は、心筋症、急性すい炎、肝硬変、失明および腎移植が必要な末期糖尿病性腎疾患を発症する素因も有する。
後天性HIVリポジストロフィーは、HIV感染対象の15〜35%を侵す。後天性HIVリポジストロフィーを有する患者は、インスリン抵抗性、高脂血症および中心肥満を含む、メタボリックシンドロームを示す。
視床下部無月経は、対象の視床下部−下垂体−性腺軸の調節不全からもたらされる月経周期の停止である。視床下部無月経は、ストレス、運動または体重減少によって誘導されることがある。
肥満の患者は、一般にレプチン抵抗性である。中等度体重減少により、レプチン感受性は部分的に回復される。したがって、本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与は、患者が体重を維持することを可能にする。
改変された合成レプチンmRNA
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、レプチンポリペプチドをコードし、少なくとも1つの改変されたヌクレオシドを含み、少なくとも以下の特徴を有する:(i)それはin vitroで生成され、細胞から単離されていない;(ii)それは、細胞(例えば、ヒト細胞)においてin vivoまたはex vivoで翻訳可能である;および(iii)それは、同じ配列の改変されていないRNAと比較して、それが導入されるか接触する対象において有意に低減された先天性免疫応答またはインターフェロン応答を引き起こす。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、レプチンポリペプチドをコードし、少なくとも1つの改変されたヌクレオシドを含み、少なくとも以下の特徴を有する:(i)それはin vitroで生成され、細胞から単離されていない;(ii)それは、細胞(例えば、ヒト細胞)においてin vivoまたはex vivoで翻訳可能である;および(iii)それは、同じ配列の改変されていないRNAと比較して、それが導入されるか接触する対象において有意に低減された先天性免疫応答またはインターフェロン応答を引き起こす。
in vivo機能(例えば、食欲、エネルギー代謝または神経内分泌機能を調節することによる)またはin vitro機能(例えば、ヒトレプチン受容体(LEPR、CD295)に機能的に結合することによる)または両方によって測定される通り、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、天然のヒトレプチンタンパク質(配列番号3)に機能的に同等であるレプチンポリペプチドをコードすることができる。天然のヒトタンパク質への相同性によって判定される通り、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、天然のヒトレプチンタンパク質に構造的に類似しているレプチンポリペプチドをコードすることができる。本発明の改変された合成レプチンmRNAは、天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であり、かつ構造的に類似しているレプチンポリペプチドをコードすることができる。具体例では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、配列番号17〜20から選択されるコード配列を含有する。実施例31を参照されたい。これらの4つのヒトレプチンオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、互いと78%〜91%同一である。したがって、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、配列番号17〜20から選択されるコード配列と少なくとも78%同一である機能的コード領域を含有することができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAのコード領域は、天然のヒトレプチンコード配列を含む任意の天然のレプチンコード配列のコドン最適化によって構築することができる。コドン最適化は、市販サービス、例えばGeneArt(登録商標)、(Life Technologies Corporation、Grand Island、NY USAから入手できる)、GENEWHIZ(GENEWHIZ,Inc.、Cambridge MA USAから入手できる)およびGenScript(GenScript,Inc.、Piscataway NJ USAから入手できる)によって実行することができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、翻訳を開始、増進する、脱アデニル化およびRNA鎖分解に拮抗する、かつ炎症性応答の誘導を阻止する複数のエレメントを含有することができる。
改変された合成レプチンmRNAは、5’末端において、mRNAがin vitroでRNAポリメラーゼによって転写された後に酵素的に合成されるmRNAキャップで開始することができる。mRNAキャップは、外来としてのmRNAの認識を回避しつつ翻訳開始を促進し、5’エキソヌクレアーゼによって媒介される分解からmRNAを保護する。5’キャップは、5’−5’三リン酸結合を用いてRNA分子の5’末端に連結されている、改変されたグアニンヌクレオチドを含むことができる。5’キャップは、5’キャップ類似体、例えば5’ジグアノシンキャップ、メチレンビス(ホスホネート)部分を有する四リン酸キャップ類似体(例えば、Rydzik AM et al. (2009) Org. Biomol. Chem. 7(22):4763-76を参照)、ホスホロチオエート改変を有するジヌクレオチドキャップ類似体(例えば、Kowalska J et al. (2008) RNA 14(6):1119-1131を参照)、非架橋酸素の代わりに硫黄置換を有するキャップ類似体(例えば、Grudzien-Nogalska E et al. (2007) RNA 13(10): 1745-1755を参照)、N7−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体(例えば、Grudzien E et al. (2004) RNA 10(9):1479-1487を参照)、またはアンチリバースキャップ類似体(例えば、Jemielity J et al., (2003) RNA 9(9): 1108-1122およびStepinski J et al. (2001) RNA 7(10):1486-1495を参照されたい)であってもよい。そのような一実施形態では、5’キャップ類似体は5’ジグアノシンキャップである。実施例2に示すNew England Biolabs(Beverly MA USA)によるキャップ形成の方法も参照されたい。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、5’三リン酸を含まない。
次は、最小限の二次構造を有し、かつリボソーム補充を増強するかまたはキャップからコザック配列および開始コドンまでのリボソーム走査の効率を向上させることによってキャップ依存性翻訳効率を増進する、真核生物またはウイルス起源の合成5’非翻訳領域(UTR)であってもよい。
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、コザック配列を含む。「コザック配列」は、コンセンサス(gcc)gccRccAUGG(配列番号1)を有する真核生物のmRNA上の配列を指し、そこで、Rは、別の「G」が続く開始コドン(AUG)の上流のプリン(アデニンまたはグアニン)の3つの塩基である。コザックコンセンサス配列はリボソームによって認識されて、ポリペプチドの翻訳を開始する。一般的に、開始は、転写産物の5’末端に近位の翻訳機構が遭遇する最初のAUGコドンにおいて起こる。AUGコドンの近くのコザック配列の存在は、正しいポリペプチドの翻訳が起こるように、翻訳の開始部位としてのそのコドンを強化する。一部のそのような実施形態では、コザック配列は、1つまたは複数の改変されたヌクレオシドを含む。
天然のヒトレプチンタンパク質に機能的に同等であるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームが、この後に続く。例示的なオープンリーディングフレームが本明細書に開示されるが、機能的レプチンタンパク質を生成する他のオープンリーディングフレームを用いてもよい。
オープンリーディングフレームの後に、真核生物またはウイルス起源の合成3’非翻訳領域(3’UTR)配列が続いてもよい。3’UTRは、細胞中で高い安定性を有することが公知であるmRNAから選択することができる。例えば、合成3’UTR配列は、Johannes Gutenberg−Universitat Mainzへの国際特許出願番号WO2007/036366に記載される、マウスα−グロビン3’UTRまたはマウスβ−グロビン3’UTRであってもよい。この3’UTRの後に、細胞中で一緒にmRNAの分解に拮抗してその翻訳を増強するポリアデノシンテールをコードする別の合成3’UTR配列が続いてもよい。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる急速な分解を阻止し、RNAへの細胞の先天性免疫またはインターフェロン応答を回避または低減するための改変を含むことができる。改変には、例えば、(i)末端改変、例えば、5’末端改変(リン酸化脱リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など)、3’末端改変(コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆結合など)、(ii)塩基改変、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対を形成する塩基、またはコンジュゲート塩基による置き換え、(iii)糖改変(例えば、2’位または4’位での)または糖の置き換え、ならびに(iv)ホスホジエステル結合の改変または置き換えを含む、ヌクレオシド間の結合の改変、を含めることができる。これらの改変の多くは、siRNA分子を改変するために用いられている。一部の塩基改変は、投与されたmRNAへの免疫応答の低減のために有用である。Kariko K et al. (2005) Immunity 23: 165-175を参照されたい。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、任意の利用可能な技術、例えばin vitro転写による酵素的合成、より長い前駆体の酵素的または化学的切断などによって調製することができる。RNAの合成方法は当技術分野で公知である。例えば、組換えT7RNAポリメラーゼを用いた、プラスミド鋳型からの長いRNAのin vitro転写のための初期参考文献、例えば、Chapman KA and Wells RD (1982) "Bacteriophage T7 late promoters; construction and in vitro transcription properties of deletion mutants." Nucleic Acids Research 10(20): 6331-6340およびSchenborn ET and Mierendorf RC (1985) "A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure." Nucleic Acids Research 13(17): 6223-6236を参照されたい。転写方法は、本明細書において実施例2でさらに記載される。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、レプチンDNA鋳型のin vitro転写によって生成することができる。鋳型生成のための方法は、標準の分子クローニング技術を用いる当業者に周知である。mRNAは、mRNAの翻訳および安定性を増強して、炎症性応答の誘導を回避する効果を有する改変(例えば、プソイドウリジンによるウリジンの置換)を含むリボヌクレオチドによってin vitroで合成される。転写された改変合成レプチンmRNAは、転写後に、例えばキャップまたは他の官能基を加えることによってさらに改変することができる。
転写のために、改変されたヌクレオチドは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼ酵素が基質として認識することができる。一般に、RNAポリメラーゼ酵素は、一定範囲のヌクレオシド塩基の改変を許容することができる。RNAポリメラーゼによる転写を可能にする、リボースおよびリン酸改変ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体が当技術分野で公知である。改変されたヌクレオシドを受容するポリメラーゼは、当業者に公知である。Karikoらへの米国特許第8,278,036号を参照されたい。例えば、RNAポリメラーゼは、ファージRNAポリメラーゼであってもよい。RNAポリメラーゼによって受け入れられる改変ヌクレオチドには、プソイドウリジン(Ψ)、5−メチルウリジン(m5U)、2−チオウリジン(s2U)、6−メチルアデニン(m6A)が含まれ、5−メチルシチジン(m5C)はファージRNAポリメラーゼを用いる転写に適合するが、N1−メチルグアノシン、N1−メチルアデノシン、N7−メチルグアノシン、2’−O−メチルウリジンおよび2’−O−メチルシチジンはそうでないことが知られている。
本発明の改変された合成レプチンmRNAを生成するために、改変されたポリメラーゼを用いることができる。2’−O−メチル改変リボヌクレオチド5’−三リン酸を効率的に組み込む、改変された(突然変異体、R425C)T7RNAポリメラーゼが、Ibach J et al. (2013) "Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2'-O-methyl-modified mRNA." J. Biotechnology 167:287-295によって近年記載された。
本発明の改変された合成レプチンmRNAの転写または他の合成は、当技術分野で公知の任意の適する方法によって監視することができる。例えば、生成物形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴スペクトル法(例えば、1Hまたは13C)赤外分光分析、吸光分光分析(例えば、紫外可視)、もしくは質量分析によって、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)もしくは薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって監視することができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、真核細胞の翻訳機構によって翻訳することができる。プソイドウリジン(Ψ)以外のヌクレオシド改変は、翻訳に干渉することができる。当業者は、invitro翻訳アッセイ(例えば、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイ、リポーター活性アッセイまたは翻訳されたタンパク質中の放射性標識の測定)を用い、SDS−PAGE、ウエスタンブロット、ELISAまたは免疫化学アッセイなどを用いて生成されたポリペプチドの量を検出して、翻訳および翻訳効率を受けるその能力について、本発明の改変された合成レプチンmRNAを試験することができる。候補改変を有する本発明の改変された合成レプチンmRNAの翻訳が同じままであるかまたは増加するならば、本明細書に記載される組成物および方法での候補改変の使用が企図されるように、候補改変を含む本発明の改変された合成レプチンmRNAの翻訳は、候補改変を欠くRNAの翻訳と比較される。
製剤
改変された合成レプチンmRNAは、いくつかの有利な特徴を有する送達剤で製剤化される。送達剤は、改変された合成レプチンmRNAを分解から保護する。送達剤は、改変された合成レプチンmRNAを意図された組織または細胞型に送達することを助けることもでき、そのことは対象の循環系でレプチンタンパク質の翻訳の増加およびレプチンタンパク質のレベルの増加をもたらす。
改変された合成レプチンmRNAは、いくつかの有利な特徴を有する送達剤で製剤化される。送達剤は、改変された合成レプチンmRNAを分解から保護する。送達剤は、改変された合成レプチンmRNAを意図された組織または細胞型に送達することを助けることもでき、そのことは対象の循環系でレプチンタンパク質の翻訳の増加およびレプチンタンパク質のレベルの増加をもたらす。
mRNAは単独で細胞の細胞質に効率的に送達されず、リボヌクレアーゼによる分解に対して脆弱である。mRNAは負に強く荷電し、親水性であるが、それは細胞外空間またはエンドサイトーシス小胞から細胞の細胞質へのmRNAの侵入の可能性を非常に低くする。したがって、治療目的のための細胞へのmRNAのin vivo送達は製剤の使用を必要とし、そこで、製剤中の送達剤はリボヌクレアーゼからmRNAを保護し、かつ細胞の細胞質へのmRNAの送達を促進する。
改変された合成レプチンmRNA製剤は、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、エマルジョン、リポソーム、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、アニオン性脂質、荷電脂質または浸透エンハンサーなどの送達剤を含むことができる。正に荷電したカチオン性送達系は、本発明の改変された合成レプチンmRNA(負荷電したポリヌクレオチド)の結合を促進し、負荷電した細胞膜で相互作用を増強して効率的な細胞取り込みも可能にする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーは、改変された合成RNAに結合することができるか、または小胞もしくはミセルを形成するように誘導することができる。例えば、改変されたRNAが入っているKim SH et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい。カチオン性改変RNA複合体を作製して用いるための方法は、当業者の能力の範囲内である(例えば、Sorensen DR et al. (2003) J. Mol. Biol. 327:761-766;Verma UN et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300;Arnold AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい)。核酸送達のための脂質およびポリマー担体を評価する方法の指針は、Nguyen J and Szoka FC (2012) Accounts of Chemical Research 45(7): 1153-1162によって提供される。
トランスフェクションまたはリポフェクションのための送達剤。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、トランスフェクションまたはリポフェクションによって細胞または組織に導入することができる。トランスフェクションまたはリポフェクションのための適する送達剤には、例えば、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、リポフェクチン、リポフェクタミン、DIMRIE C(商標)、Superfect(商標)およびEffectin(商標)(Qiagen(商標))、Unifectin(商標)、Maxifectin(商標)、DOTMA、DOGS(商標)(トランスフェクタム;ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DDAB(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、DHDEAB(N,N−ジ−n−ヘキサデシル−N,N−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)、HDEAB(N−n−ヘキサデシル−N,N−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド)、ポリブレン、ポリ(エチレンイミン)(PEI)などが含まれる。例えば、Banerjee et al. (1999) Med. Chem. 42:4292-99;Godbey et al. (1999) Gene Ther. 6:1380-88;Kichler et al. (1998) Gene Ther. 5:855-60;Birchaa et al. (1999) J. Pharm. 183:195-207を参照されたい。
細胞透過エンハンサー。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、1つまたは複数の透過エンハンサー、界面活性剤またはキレーターと共に製剤化される。適する界面活性剤には、脂肪酸ならびにまたはそのエステルおよび塩、胆汁酸およびその塩が含まれる。適する胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸(CDCA)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(UDCA)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−24,25−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが含まれる。適する脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1−モノカプリン酸、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩(例えば、ナトリウム)が含まれる。一部の実施形態では、透過エンハンサーの組合せ、例えば胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩が用いられる。1つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびUDCAのナトリウム塩である。他の透過エンハンサーには、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテルが含まれる。
リポソーム。核酸を含有するいくつかのリポソームが、当技術分野で公知である。Thierryらへの国際特許出願番号WO96/40062は、高分子量核酸をリポソームに封入する方法を開示する。Tagawaらへの米国特許第5,264,221号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容はRNA分子を含むことができると主張する。Rahmanらへの米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記載する。Loveらへの国際特許出願番号WO97/04787は、RNAi分子を含むリポソームを開示する。核酸を含むリポソーム製剤を調製する方法は、例えば、米国特許第6,011,020号;第6,074,667号;第6,110,490号;第6,147,204号;第6、271、206号;第6,312,956号;第6,465,188号;第6,506,564号;第6,750,016号;および第7,112,337号に見出すこともできる。本発明の改変された合成レプチンmRNAの細胞への送達を提供するために、これらのアプローチの各々を用いることができる。
ポリマー。国際特許出願番号WO2013/090186A1に示すように、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、天然または合成のポリマーを用いて製剤化することができる。送達のために用いることができるポリマーの例には、MIRUS(登録商標)Bio(Madison WI USA)およびRoche Madison(Madison WI USA)からのDynamic POLYCONJUGATE(商標)製剤、PHASERX(商標)ポリマー製剤、例えばSMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PhaseRx、Seattle WA USA)、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego CA USA)からのVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena CA USA)からのシクロデキストリン、デンドリマーおよび乳酸−グリコール酸コポリマー(PLGA)、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation、Pasadena CA WA)およびPHASERX(商標)(Seattle WA USA)などのpH応答性ブロックコポリマーが含まれる。米国特許第6,835,393号、第7,374,778号、第7,737,108号、第7,718,193号および第8,003,129号を参照されたい。欧州特許EP1044021B1も参照されたい。
乳酸−グリコリドコポリマー(PLGA)製剤の例には、PLGA注射用デポ、例えばELIGARD(登録商標)が含まれる。
これらのポリマーアプローチの多くは、細胞質へのオリゴヌクレオチドのin vivo送達において有効性を実証した。これらのアプローチは、deFougerolles (2008) Hum Gene Ther. 19: 125-132によってレビューされている。核酸、特に小さい干渉RNA(siRNA)のin vivo送達を与えた2つのポリマーアプローチは、動的ポリコンジュゲートおよびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチの第1のものは、動的ポリコンジュゲートを用い、siRNAを効果的に送達することがマウスでin vivoで示されている。Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887。このアプローチは、その特徴が、ジスルフィド結合によって核酸に共有結合することができる膜活性ポリマーを含み、PEG(電荷マスキングのため)とN−アセチルガラクトサミン(肝細胞ターゲティングのためのターゲティング部分)基の両方がpH感受性結合によって連結する、多成分ポリマー系である。Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887。
別のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子の使用を含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現ユーイング肉腫腫瘍細胞で、EWS−FLI1遺伝子生成物の標的サイレンシングを実証した。Hu-Lieskovan et al. (2005) Cancer Res. 65: 8984-8982を参照されたい。これらのナノ粒子で製剤化されたsiRNAは、ヒト以外の霊長類で耐容性が良好であった。Heidel et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:5715-21を参照されたい。ポリマー製剤は、異なるリガンド、例えば葉酸塩、トランスフェリンおよびN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)の発現を通して選択的ターゲティングが可能である。Benoit et al. (2011) Biomacromolecules 12:2708-2714;Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 12982-12887;Davis (2009) Mol. Pharm. 6: 659-668;Davis (2010) Nature 464: 1067- 1070を参照されたい。
送達剤は、少なくとも1つのポリマー、例えば、ポリエテン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l−リシン)(PLL)、PLLに移植されたPEG、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分枝状ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、改変ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ[a−(4−アミノブチル)−Lグリコール酸)(PAGA)、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、L−ラクチド−L−リシンコポリマー、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはその組合せを含むことができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、科学文献、特許および公開された特許出願で提供される指針を用いて、製剤技術の当業者がポリマーで製剤化することができる。例えば、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許第6,177,274号に記載の通りPLLで移植されたPEGのポリマー化合物で製剤化し、in vivo送達のために用いることができる。別の例として、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許出願公開第2009/0042829号および第2009/0042825号に記載の通り、カチオン性ポリマーを有する溶液もしくは媒体に、乾燥した医薬組成物中に、または乾燥させることが可能な溶液に懸濁させることができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許出願公開第2012/0004293号および米国特許第8,236,330号によって記載される通り、PLGA−PEGブロックコポリマーで製剤化することもできる。本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許第8,246,968号に記載される通り、PEGとPLAまたはPEGとPLGAのジブロックコポリマーで製剤化することができる。本明細書に記載されるポリマーは、脂質末端PEGにコンジュゲートすることができる。例えば、PLGAは、PLGA−DSPE−PEGを形成する脂質末端PEGにコンジュゲートすることができる。PEGコンジュゲートは、国際特許出願番号WO2008/103276に記載される。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許出願公開第2010/0260817号に記載される通り、植込み型のまたは注射可能な器具に含まれるポリアミン誘導体送達剤で製剤化することができる。本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許出願公開第2010/0260817号に記載されるポリアミン誘導体で製剤化することができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリシアノアクリレートおよびその組合せで製剤化することができる。本発明の改変された合成レプチンmRNAの製剤は、少なくとも1つのアミン含有ポリマー、例えばポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマーまたはその組合せを含むことができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、国際特許出願番号WO2011/15862、WO2012/082574およびWO2012/068187に記載される少なくとも1つのポリマーで製剤化することができる。さらに、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、ポリ(アルキレンイミン)、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマーまたは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、PAGA、生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマーまたはその組合せを含む送達剤で製剤化することができる。生分解性カチオン性リポポリマーは、米国特許第6,696,038号または米国特許出願公開第2003/0073619号および第2004/0142474号に記載される方法によって作製することができる。ポリ(アルキレンイミン)は、米国特許出願公開第2010/0004315号に記載される方法を用いて作製することができる。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマーまたは生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、米国特許第6,517,869号または第6,267,987号に記載される方法を用いて作製することができる。線状生分解性コポリマーは、例えば米国特許第6,652,886号に記載される通り、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。PAGAポリマーは、米国特許第6,217,912号に記載される方法を用いて作製することができる。PAGAポリマーを共重合させて、ポリマーと、例えば、限定されずに、ポリ−L−リシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチドおよびラクチド−グリコリドコポリマーとコポリマーまたはブロックコポリマーを形成することができる。生分解性架橋カチオン性多ブロックコポリマーは、米国特許第8,057,821号または米国特許出願公開第2012/009145号に記載される方法によって作製することができる。例えば、分枝状ポリエチレンイミンと比較して異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを用いて、多ブロックコポリマーを合成することができる。さらに、米国特許出願公開第2010/0004315号または米国特許第6,267,987号もしくは第6,217,912号に記載される方法によって、組成物または医薬組成物を作製することができる。
米国特許出願公開第2010/0004313号は、製剤がヌクレオチド配列およびポロキサマーをどのように含むことができるかについて記載する。したがって、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、遺伝子送達組成物でポロキサマーと一緒に用いることができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、ポリカチオン性側鎖を含有することができる少なくとも1つの分解可能なポリエステルで製剤化することができる。分解可能なポリエステルには、限定されずに、ポリ(セリンエステル)、L−ラクチド−L−リシンコポリマー、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)およびその組合せが含まれる。別の実施形態では、分解可能なポリエステルは、ペグ化されたポリマーを形成するPEGコンジュゲーションを含むことができる。
カチオン性脂質ナノ粒子。一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、ナノ粒子に封入することができる。ナノ粒子パッケージングの方法は当技術分野で周知であり、例えば、Bose S et al. (2004) J. Virol. 78:8146;Dong Y et al. (2005) Biomaterials 26:6068;Lobenberg R et al. (1998) J Drug Target 5:171;Sakuma SR et al. (1999) Int. J. Pharm. 177:161;Virovic L et al. (2005) Expert Opin. Drug Deliv. 2:707およびZimmermann E et al, (2001) Eur. J. Pharm. Biopharm. 52:203に記載される。
核酸の細胞送達のためのカチオン性脂質の使用は、いくつかの利点を有する。カチオン性脂質を用いるアニオン性化合物の封入は、静電的相互作用のために本質的に定量的である。カチオン性脂質は、細胞膜輸送を開始する負荷電した細胞膜と相互作用することができる。Akhtar et al. (1992) Trends Cell Biol. 2, 139;Xu et al. (1996) Biochemistry 35, 5616。さらに、カチオン性脂質の分子形状、立体配置および特性は、エンドソームコンパートメントからサイトゾルへの送達効率の増大をもたらすことができる。Semple SC et al. (2010) Nature Biotechnol. 28(2):172-176。カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子は、小さい抑制性RNA(siRNA)を十分に封入し、動物の細胞に効率的にsiRNAを送達することが示された。Jayaraman M et al (2012) Angew. Chemie Int. Ed. 51:1-6。
一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAを脂質ナノ粒子に封入するための組成物は、(i)封入およびエンドソームエスケープのためのカチオン性脂質、(ii)安定化のための中性脂質、(iii)ヘルパー脂質、および(iv)凝集を阻止するステルス脂質を含む。
「カチオン性脂質」は、正に荷電した脂質である。核酸送達のためのカチオン性リポソームまたはカチオン性リポプレックスを作製するためのカチオン性脂質の使用のレビューについては、Gallas A et al. (2013) Chem. Soc. Rev. 42:7983-7997;Falsini et al. (2013) J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q;および本明細書で提供される他の参考文献を参照されたい。具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性リピドA、カチオン性リピドB、カチオン性リピドCおよびカチオン性リピドDから選択することができ、その各々は本明細書で記載される。
「中性脂質」は、非常に低い極性の溶媒だけで可溶性である任意の脂質のための運用上の用語である。本発明の送達剤での使用に適する中性脂質には、様々な中性、非荷電または双性イオン性の脂質、例えば以下のものが含まれる:5−ヘプタデシルベンゼン−1,3−ジオール(レソルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ3ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1ミリストイル2パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1パルミトイル2ミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、1−パルミトイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2−ジアラキドイル−snグリセロール−3−ホスホコリン(DBPC)、1−ステアロイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2−ジエイコセノイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびその組合せ。一実施形態では、中性リン脂質は、DSPCおよびDMPEからなる群から選択される。
「ヘルパー脂質」は、トランスフェクション(例えば生物学的に活性な薬剤を含むナノ粒子のトランスフェクション)を増強する脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強する機構は、例えば、粒子安定性を増強するかまたは膜融合誘導を増強することを含むことができる。ヘルパー脂質には、ステロイドおよびアルキルレソルシノールが含まれる。本発明の送達剤での使用に適するヘルパー脂質には、コレステロール、5−ヘプタデシルレソルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートが含まれる。
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がin vivoに、例えば血液中に存在することができる時間の長さを増加させる脂質である。本発明の送達剤での使用に適するステルス脂質には、限定されずに、脂質部分に連結した親水性の頭基を有するステルス脂質が含まれる。そのようなステルス脂質の例には、国際特許出願番号WO2011/076807に記載される化合物が含まれる。本発明の送達剤での使用に適する他のステルス脂質、およびそのようなステルス脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al. (2008) Pharmaceutical Research 25(1): 55 71 and Hoekstra et al. (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1660: 41-52に見出すことができる。適するステルス脂質は、ポリ(エチレンオキシド)ならびにポリ(オキサゾリン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(グリセロール)、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリアミノ酸およびポリ[N(2ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]に基づくポリマーを含む、ポリ(エチレングリコール)(PEG)に類似の分子の中から選択することができる。追加の適するPEG脂質は、国際特許出願番号2006/007712に開示される。PEG脂質には、約C4から約C40の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ポリエチレングリコールジアシルグリセロールまたはポリエチレングリコールジアシルグリカミド(PEGDAG)コンジュゲートが含まれる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、1つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含むことができる。本明細書に記載される例のいずれでも、PEGコンジュゲートは、PEGジラウリルグリセロール、PEGジミリスチルグリセロール(PEG−DMG)(NOF、Tokyo、Japanからのカタログ番号GM020)、PEGジパルミトイルグリセロール、PEGジステリルグリセロール、PEGジラウリルグリカミド、PEGジミリスチルグリカミド、PEGジパルミトイルグリカミドおよびPEGジステリルグリカミド、PEGコレステロール(1[8’(コレスタ5エン3[ベータ]オキシ)カルボキシアミド3’,6’ジオキサオクタニル]カルバモイル[オメガ]メチルポリ(エチレングリコール)、PEG DMB(3,4ジテトラデコキシルベンジル−[オメガ]−メチルポリ(エチレングリコール)エーテル)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロール−3−ホスホエタノールアミンN[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000](Avanti Polar Lipids、Alabaster AL USAからのカタログ番号880150P)から選択することができる。
一実施形態では、ステルス脂質は化合物S024であり、それは国際特許出願番号WO2011/076807に記載される。化合物S024の化学構造は、以下の通りである:
S024の化学名は、ノナコサン−15−イル2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,70,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135−ヘキサテトラコンタオキサテトラコンタヘクタン−140−イルカルバメートであり、n=45である。
一実施形態では、送達剤は、ヘルパー脂質としてコレステロールを、ステルス脂質として中性脂質およびPEG脂質を含む。より具体的な実施形態では、送達剤は、カチオン性リピドA、カチオン性リピドB、カチオン性リピドCまたはカチオン性リピドDから選択される30〜60%のカチオン性脂質、5〜10%のヘルパー脂質、30〜60%の中性脂質および1〜5%のPEG脂質を含む。さらにより具体的な実施形態では、送達剤は、カチオン性リピドA、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCから選択される30〜60%のカチオン性脂質、5〜10%のヘルパー脂質、48%のコレステロールおよび2%のPEG脂質を含む。
一実施形態では、送達剤のpHは、改変された合成レプチンmRNAの封入または製剤化の時点で4〜6である。より具体的な実施形態では、送達剤のpHは、封入または製剤化の時点で5〜6である。さらにより具体的な実施形態では、送達剤のpHは、封入または製剤化の時点で5.6〜6.0である。カチオン性リピドCによる脂質ナノ粒子の製剤化のための、必要とは限らないが提案されたpHはpH5.6である。カチオン性リピドBによる脂質ナノ粒子の製剤化のための、必要とは限らないが提案されたpHはpH6.0である。
選択されるカチオン性脂質によって、mRNA封入パーセントは、異なるpH値でこの範囲内でより高くてもまたはより低くてもよい。特定のカチオン性脂質製剤のための最適な封入pHは、この範囲内で経験的に決定することができる。送達剤中の4つの脂質構成成分のモル比およびカチオン性脂質アミン対mRNAホスフェート(N:P)モル比は一般に有用な指針であるが、3:1のN:P比から8:1のN:P比まで変更することができる。N:P比の変動は、mRNA封入効率、粒子分析性およびin vivoのmRNA送達性能に影響を及ぼすことができる。in vivoのmRNA送達要件のための理想的な脂質製剤は、経験的に決定することができる。
本発明の送達剤は、これらの各種の脂質の間の脂質モル比を調整することによって、当業者がさらに最適化することができる。一実施形態では、さらなる最適化は、所望の粒径、N:P比、製剤方法の1つまたは複数を調整して得られる。
本明細書に、特に実施例34および実施例35に記載される改善されたプロセスでは、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、カチオン性脂質および急速混合を用いてカチオン性脂質ナノ粒子に製剤化される。封入は効率的であり、製剤化された粒子は生細胞への封入mRNAのin vitroおよびin vivoでの送達に適合することができる。表2は、実施例34および実施例35に記載される2つの改善プロセスによる、脂質ナノ粒子へのレプチンmRNA封入の分析結果を示す。
医薬組成物。本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、公知であるかまたは今後薬学分野で開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、有効成分を賦形剤および任意選択で1つまたは複数の他の副成分と関連させるステップと、次に、任意選択で生成物を所望の単一用量または複数用量単位に成形またはパッケージするステップを含む。
本明細書で提供される医薬組成物の記載は主にヒトへの投与に適する医薬組成物を対象とするが、そのような組成物があらゆる種類の動物への投与に一般に適することは当業者が理解する。
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量としてまたは複数の単一単位用量として調製、パッケージまたは販売することができる。「単位用量」は、有効成分の所定量を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、対象に投与されるだろう有効成分の投薬量に一般に等しい。
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含有することができ、それらには、所望の特定の剤形に適するものとして、あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などが含まれる。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Pressは、医薬組成物の製剤化で用いられる様々な賦形剤およびそれらの調製のための公知の技術を開示する。
一部の実施形態では、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認される。一部の実施形態では、賦形剤は医薬用グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方(USP)、欧州薬局方(EP)、英国薬局方または国際薬局方の規格を満たす。
医薬品の製剤化または製造での一般的な考慮事項は、例えばRemington's The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition (20012) Allen LV et al. eds., Pharmaceutical Pressに見出すことができる。
本明細書に記載される医薬組成物は、以下の特性の1つまたは複数によって特徴付けることができる:
生物学的利用能。本明細書に記載される送達剤で組成物に製剤化されるとき、mRNA分子は、本明細書に記載される送達剤のない組成物と比較して増大した生物学的利用能を示すことができる。用語「生物学的利用能」は、哺乳動物に投与されるmRNA分子の所与の量の全身の利用度を指す。生物学的利用能は、哺乳動物への化合物の投与の後に、未変形化合物の曲線下面積(AUC)または最大血清中もしくは血漿中濃度(Cmax)を測定することによって評価することができる。AUCは、横軸(X軸)に沿った時間に対して縦軸(Y軸)に沿って化合物の血清中または血漿中濃度をプロットした曲線の下の面積の判定である。一般に、特定の化合物のためのAUCは、当業者に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるG. S. Banker (1996) Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc.に記載されているような方法を用いて計算することができる。
Cmax値は、哺乳動物への化合物の投与の後に哺乳動物の血清または血漿で達成される、化合物の最高濃度である。特定の化合物のCmax値は、当業者に公知である方法を用いて測定することができる。本明細書で用いる語句「生物学的利用能を増加させる」または「薬物動態を改善する」は、哺乳動物においてAUC、CmaxまたはCminで測定される第1のmRNA分子の全身利用度が、本明細書に記載される送達剤と同時投与されるときに、そのような同時投与がないときより大きいことを意味する。
治療ウィンドウ。本明細書に記載される組成物に製剤化されるとき、mRNA分子は、本明細書に記載される送達剤を欠く投与されたmRNA分子組成物の治療ウィンドウと比較して、投与されたmRNA分子組成物の治療ウィンドウの増加を示すことができる。本明細書で用いるように、「治療ウィンドウ」は、治療効果を導き出す確率の高い、血漿中濃度の範囲または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を指す。一実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤の投与のための治療ウィンドウは、ベースラインより10ng/mL上の増加した血漿レプチンタンパク質であり、ベースラインは、改変された合成レプチンmRNA製剤の投与前の対象の血漿レプチンであるかまたは同等の試験患者の血漿レプチンタンパク質であってもよい。
分布容積。本明細書に記載される組成物に製剤化されるとき、本発明の改変された合成mRNAは、改善された分布容積(Vdist)を示すことができる。Vdistは、体内の薬物量を血液または血漿中の薬物濃度に関連させる。用語「分布容積」は、血液または血漿におけるのと同じ濃度で体内の全薬物量を含有するために必要とされる流体容積を指す:Vdistは、体内の薬物量/血液または血漿中の薬物濃度に等しい。例えば、10mgの用量および10mg/Lの血漿中濃度の場合、分布容積は1リットルであるだろう。分布容積は、薬物が脈管外組織に存在する程度を反映する。大きな分布容積は、血漿タンパク結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床場面では、定常状態濃度を達成する負荷用量を決定するために、Vdistを用いることができる。実施例で示す薬物動態学的研究に基づくと、Vdistは非常に低く、化合物が循環を離れるとき、化合物は循環に再入しないことを意味する。
投薬量
本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤の投薬量および投与は、処置すべき状態および所与の場合にとられる治療アプローチによって異なる。投薬量は、改変された合成レプチンmRNA製剤が治療量で投与されるかまたは予防量で投与されるかによって異なってもよい。
本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤の投薬量および投与は、処置すべき状態および所与の場合にとられる治療アプローチによって異なる。投薬量は、改変された合成レプチンmRNA製剤が治療量で投与されるかまたは予防量で投与されるかによって異なってもよい。
投薬量は、とられるアプローチ、送達様式および処置すべき疾患によっても変化する。一実施形態では、投薬量は1kg体重につき0.2mg(mg/kg、mpk)の範囲のリボ核酸ポリヌクレオチドであってもよい。別の実施形態では、投薬量は1kg体重につき0.6mg(mg/kg、mpk)の範囲のリボ核酸ポリヌクレオチドであってもよい。実施例20および実施例23を参照されたい。他の実施形態では、投薬量は最高2mg/kgまたは4mg/kgであってもよい。
本発明の少なくとも1つの改変された合成レプチンmRNAを含有する治療組成物は、単位用量で従来通りに投与することができる。治療組成物に関して用いるとき、用語「単位用量」は、対象のための単一投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる生理的に許容される希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共同して所望の治療効果を生むように計算された活性物質の所定量を含有する。
組成物は、投薬製剤に適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与される。投与する量およびタイミングは、処置対象、有効成分を利用する対象の系の能力および所望の治療効果の程度に依存する。
投与
本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、局所または全身処置が所望かどうか、および処置領域によって様々な経路によって対象に送達または投与することができる。例示的な経路には、静脈内および皮下送達経路がある。
本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、局所または全身処置が所望かどうか、および処置領域によって様々な経路によって対象に送達または投与することができる。例示的な経路には、静脈内および皮下送達経路がある。
本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与は、対象によって、または別の人、例えば介護者によって提供されてもよい。介護者は、ヒトへの医療の提供に関与する任意の実体、例えば病院、ホスピス、診療室、外来診療所;医療従事者、例えば医師、看護士もしくは他の開業医;または配偶者、親もしくは保護者であってよい。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、改変された合成レプチンmRNAによってコードされるレプチンポリペプチドの翻訳および発現が細胞で起こるように、改変された合成レプチンmRNAの細胞内送達を達成する任意の様式によって、in vivoまたはex vivoで細胞に導入することができる。細胞による本発明の改変された合成レプチンmRNAの吸収または取り込みは、補助なしの拡散性もしくは活性細胞性プロセスによって、または本明細書で下に記載されるかもしくは当技術分野で公知である補助的薬剤もしくは器具によって起こすことができる。
本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤または本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤を含む医薬組成物は、1つまたは複数の他の治療、予防、診断または画像化の薬剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」という語句は、薬剤を同時に投与しなければならないか、送達のために一緒に製剤化しなければならないことを意味しないが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、1つまたは複数の他の所望の治療または医療手順と同時に、その前または後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でまたは時間スケジュールで投与される。一部の実施形態では、本発明は、医薬、予防、診断または画像化の組成物を、それらの生物学的利用能を改善するか、それらの代謝を低減もしくは改変するか、それらの排出を抑制するか、または体内でそれらの分布を改変することができる薬剤と組み合わせて送達することを含む。
対象、器官、組織または細胞への投与のための当技術分野で公知の器具および方法は、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤と一緒の使用が企図される。これらには、例えば内腔またはカテーテルを採用する、針、ハイブリッド器具を有する方法および器具が例えば含まれる。
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション(例えば、Wong and Neumann (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87を参照されたい)、微粒子銃(すなわち、粒子衝撃)、細胞融合などによって標的細胞に導入される。
一部の実施形態では、本発明の改変された合成レプチンmRNA製剤は、単一用量または2つ以上の用量で投与される。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望ならば、非植込み型送達器具、例えば針、シリンジ、ペン器具、または植込み型送達器具、例えばポンプ、半恒久的なステント(例えば、静脈内、腹腔内、嚢内または包内)もしくはレザバーを推奨できる。一部のそのような実施形態では、送達器具は、本発明の改変された合成レプチンmRNAを含む医薬組成物の単位用量を小出しする機構を含むことができる。他の実施形態では、器具は、本発明の改変された合成レプチンmRNAを含む医薬組成物を、例えば拡散によって連続的に放出する。一部の実施形態では、器具は、対象の中でパラメータを監視するセンサーを含むことができる。例えば、器具は、例えば、および任意選択でエレクトロニクスと関連付けられたポンプを含むことができる。例示的な器具には、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官または器官構成要素(例えば、人工心臓、心臓弁など)および縫合が含まれる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、本発明の改変された合成レプチンmRNAを含有する流体の少量を局部組織に直接的に注入する手段を提供する、植え込まれた留置カテーテルを用いることにより送達することもできる。これらのカテーテルの近位端は、対象の体に外科的に固定された植え込まれたアクセスポートに、または、例えば対象の胴に位置する植え込まれた薬ポンプに接続することができる。
あるいは、植込み型送達器具、例えば植込み型ポンプを採用することができる。本発明の改変された合成レプチンmRNAを含む組成物用としての送達器具の例には、MinneapolisMN、USAのMedtronic,Inc.によるモデル8506治験器具が含まれ、それは、体の皮下にまたは頭蓋の上に植え込むことができ、治療剤を送達することができるアクセスポートを提供する。あるいは、本発明の改変された合成レプチンmRNAは、米国特許第5,735,814号、第5,814,014号および第6,042,579号に記載されるものなどの、種々の器具によって送達することができる。本明細書に記載される教示を用いて、本発明の改変された合成レプチンmRNAの送達のために、これらおよび他の器具および系が適する可能性があることを当業者は認める。
一部のそのような実施形態では、送達系は、カテーテルの近位端に接続されたポンプを体の外に植え込むこと、およびポンプを作動させて本発明の改変された合成mRNAの所定投薬量をカテーテルの排出部を通して送達することをさらに含む。さらなる実施形態は、体の外のポンプへの本発明の改変された合成レプチンmRNAの供給を周期的に更新することを含む。
固体組織へ治療剤を送達する方法が、Bahamiらによって米国特許出願公開第2011/0230839号に記載されている。各針に沿って固体組織の任意の位置で実質的に等しい量の流体を送達する器具に、列状の針が組み込まれる。
生体組織全体に生物物質を送達する器具が、Kodguleらによって米国特許出願公開第2011/0172610号に記載されている。ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質および他の薬学的に活性な成分またはそれらの組合せを送達する器具に、1つまたは複数の金属で作製され、約200ミクロンから約350ミクロンの外径および少なくとも100ミクロンの長さを有する多穴極微針が組み込まれる。
組織へ治療剤を送達する送達プローブが、Gundayらによって米国特許出願公開第2011/0270184号に記載されている。針を通してカプセルから薬剤を排出するために、取り付けられたカプセルを活性化位置と不活性化位置の間で移動させる器具に、複数の針が組み込まれる。
多注入医療装置が、Assafによって米国特許出願公開第2011/0218497号に記載されている。針の1つまたは複数に接続されたチャンバー、および各注入の後に医療流体をチャンバーに連続的に補充する手段を有する器具に、複数の針が組み込まれる。
鉄の治療有効量の経皮送達のための方法が、Berensonによって米国特許出願公開第2010/0130910号に記載されている。イオン導入パッチ上のイオン性鉄の経皮送達を増強するために、角質層に複数のマイクロチャネルを形成するために、複数の針を用いることができる。
生体組織全体に生物物質を送達する方法が、Kodguleらによって米国特許出願公開第2011/0196308号に記載されている。タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質および他の薬学的に活性な成分またはそれらの組合せを送達する器具に、治療有効成分を含有する複数の生分解性極微針が組み込まれる。
組織細胞へ遺伝子、酵素および生物学的薬剤を送達する方法が、Desaiによって米国特許出願公開第2003/0073908号に記載されている。体に挿入され、針を通して医薬流体を送達する器具に、複数の針が組み込まれる。
極微針経皮運搬器具が、Angelらによって米国特許第7,364,568号に記載されている。異なる方向から表面に挿入される針を通して体表面に物質を運搬する器具に、複数の針が組み込まれる。
皮下注入用器具が、Daltonらによって米国特許第7,150,726号に記載されている。針を通して皮下組織に流体を送達する器具に、複数の針が組み込まれる。
マイクロカニューレを通したワクチンおよび遺伝子治療剤の皮内送達のための器具および方法が、Miksztaらによって米国特許第7,473,247号に記載されている。対象の皮膚に0.025mmから2mmの間の深さまでワクチンを送達する器具に、少なくとも1つの穴の極微針が組み込まれる。
皮膚を通して物質を引き抜くかまたは送達する器具が、Downらによって米国特許第6,607,513号に記載されている。器具に組み込まれる複数の皮膚透過メンバーは、約100ミクロンから約2000ミクロンの長さを有し、約30〜50ゲージである。
極微針とヒト皮膚の間の相互作用を改善することによる、組織全体への薬物および生物学的分子の運搬の増強のための方法が、Prausnitzらによって米国特許第6,743,211号に記載されている。極微針が適用される、より強固でより変形しにくい表面を提供することができる器具に、複数の極微針が組み込まれる。
多針ホルダーおよび皮下の多チャネル注入ポートが、Brownによって米国特許第4,695,273号に記載されている。針ホルダー上の複数の針は、注入ポートの隔壁を通して挿入され、注入ポート内の隔離されたチャンバーに通じる。
二重の皮下注射器が、Hornによって米国特許第3,552,394号に記載されている。器具に組み込まれる2つの針は間隔が68mm未満であり、異なる型および長さであってもよく、このように異なる深度への注入を可能にする。
全身吸収および改善された薬物動態のための皮膚の少なくとも2つのコンパートメントへの物質の投与のための方法および器具が、Pettisらによって国際特許出願番号WO2003/094995に記載されている。皮内および皮下組織コンパートメントに同時に送達する器具に、約300μmから約5mmの間の長さを有する複数の針が組み込まれる。
針およびローラーを有する薬物送達器具が、Zimmermanらによって国際特許出願番号WO2012/006259に記載されている。ローラーが回転する間に針を通してレザバー中の内容物を送達する器具に、ローラーに配置される多穴針が組み込まれる。
多成分療法を投与するための方法が、Nayakによって米国特許第7,699,803号に記載されている。組織の中に治療物質が送達される深度を制御するための深度スロットを含むことができる器具に、複数の注入カニューレを組み込むことができる。
柔軟な生体障壁に流体を送達するための器具および方法が、Yeshurunらによって米国特許第7,998,119号および第8,007,466号にそれぞれ記載されている。器具の上の極微針は柔軟な生体障壁を貫通して伸展し、流体は中空極微針の孔を通して注入される。
所望の場合は、哺乳動物または対象を薬剤(例えば、ホーミング因子)で前処置することができる。例えば、ホーミング因子は、組織への細胞ターゲティングを増強するために投与することができ、細胞が所望の組織を標的にすることを助長する部位に置くことができる。組織へのホーミング因子の直接注入は、リガンド標的細胞の全身送達の前に実行することができる。
効能の評価
本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与の奏効は、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態などの状態を含む、処置する状態の1つまたは複数の症状またはマーカーを監視することによって、通常の熟練臨床医が評価することができる。効能の評価は、状態の1つまたは複数の徴候の任意の統計的に有意な改善を含む。適切な場合には、所与の状態のための臨床的に容認されたグレードまたは評価系を適用することができ、尺度またはグレードの改善は有効な処置の指標となる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与の奏効は、先天性レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態などの状態を含む、処置する状態の1つまたは複数の症状またはマーカーを監視することによって、通常の熟練臨床医が評価することができる。効能の評価は、状態の1つまたは複数の徴候の任意の統計的に有意な改善を含む。適切な場合には、所与の状態のための臨床的に容認されたグレードまたは評価系を適用することができ、尺度またはグレードの改善は有効な処置の指標となる。
本発明の改変された合成レプチンmRNAの投与の効能を評価するための指針は、他のレプチン療法の投与からの結果が提供することができる。
Licinio Jら(2004)は、メトレレプチンによる皮下処置の後に、レプチン欠乏肥満成人でいくつかの治療指数の改善を報告した。Licinio Jら(2004)は、身体活動の増加、2型糖尿病および性腺機能低下症の解消、ならびに肥満度指数の低減を報告した。患者の平均肥満度指数は、6カ月間の処置の後に約36.5kg/m2に低下した。患者の平均肥満度指数は、12カ月間の処置の後に約28.9kg/m2に低下した。患者の平均肥満度指数は、18カ月間の処置の後に約26.9kg/m2に低下した。さらに、患者の1日の平均カロリー摂取は、2週間の処置の後に49%減少した。患者の血清中レプチンレベルは、6カ月間の処置の後に約12.67ng/mLに増加した。患者の血漿中黄体形成ホルモン(LH)レベルは、6カ月間の処置の後に約2.75ミリ単位/mLに増加した。18カ月の処置クール中、トリグリセリドレベルは少なくとも49%低下した。
Ebihara K.ら(2007)は、全身性リポジストロフィーを有する患者を、1日2回のメトレレプチンにより、メトレレプチンで皮下処置した。全身性リポジストロフィーを有する患者は、1週間の処置期間内に空腹時血漿グルコースおよび血清トリグリセリドの有意な改善を示した。全身性または部分的リポジストロフィーを有する患者では、4カ月間のメトレレプチン処置は、空腹時グルコースを184±91mg/dLから146±14mg/dLに、ヘモグロビンA1cを8.5%±2.1%から7.3%±0.3%に、トリグリセリドを479±80mg/dLから254±40mg/dLに有意に改善した。Ebiharaら(2007)は、1週間の処置期間内に空腹時グルコースレベルが約172から約120mg/dLに低減し、トリグリセリドレベルが約700から約260mg/dLに低減したことも示した。
Chan JLら(2011)は、3年のメトレレプチン処置期間中のいくつかの治療指数の低を報告した。ヘモグロビンA1cの血漿中レベル(当初、約8.5%に上昇していた)は、約2.1%低下した。ヘモグロビンA1c(HbA1c)は糖化されたヘモグロビンであり、総ヘモグロビンの百分率で表され、より高い百分率は循環中の経時的なより高いグルコースレベルを反映する。トリグリセリドの血漿中レベル(当初、約479mg/dLに上昇していた)は、約35.4%低下した。3年間のメトレレプチン処置の後、空腹時グルコースレベルは約184mg/dLから約124mg/dLになり、ヘモグロビンA1cレベルは約8.5%から約6.0%になり、トリグリセリドは約743mg/dLから約164mg/dLになった。Chanら(2011)は、リポジストロフィーのためのレプチン補充療法の後の、レプチン、グルコース、トリグリセリドおよびグリコシル化ヘモグロビンの試験結果方法を記載する、Oral EA et al. (2002) N. Engl. J. Med. 346(8):570-8を参照した。Oralら(2002)および他によって記載された試験法は、血液、血漿または血清の関連する試験のための指針を提供する。
本発明のレプチンmRNA製剤の投与のための指針は、Licinioら(2004)、Ebiharaら(2007)、Chanら(2011)およびOralら(2002)によって提供される結果が提供することができる。本発明のレプチンmRNAの投与は少なくともメトレレプチンの投与と同じくらい効果的にレプチンタンパク質を送達するので、7日間のレプチン処置の後と同等の、血漿中グルコースレベルまたはトリグリセリドレベルの低減がある。7日間メトレレプチンを皮下投与する患者の投与はグルコースおよびトリグリセリドレベルの低減をもたらしたので、本発明のレプチンmRNA製剤の投与は、血漿中グルコースレベルの少なくとも30%の低下および血漿中トリグリセリドレベルの少なくとも40%の低下をもたらす。
血漿中グルコースレベルおよび血漿中トリグリセリドレベルの低減のための追加の指針は、実施例37および実施例38に見出される。
全ての特許、遺伝子識別番号によって特定されるオリゴヌクレオチド配列、および本明細書で特定される他の刊行物は、記載および開示のために参照により明示的に組み込まれる。これには、本発明に関連して用いることができる特許および刊行物に記載される方法論が含まれる。これらの文書の内容に関する日付または表示に関する全ての表明は、入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認も構成しない。引用元と本明細書の開示の間の矛盾する表明の場合には、本明細書の開示中の表明が支配するものとする。
「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」などの冠詞は、それとは反対に指示されないか、さもなければ文脈から明白でない限り、1つまたは複数を意味することができる。本明細書および特許請求の範囲で用いるように、文脈が明らかに別に指示しない限り単数形は複数形を含み、その逆も真である。操作例以外では、または特記されている場合以外は、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解すべきである。
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、文脈が明らかに他を指示しない限り、範囲で表される値は、本発明の異なる実施形態において、その範囲の下限の単位の10分の1まで、明記される範囲内の任意の特異の値またはサブレンジをとることができる。
以下の実施例は、本発明およびその様々な使用の具体的な実施形態を例示する。それらは説明目的のためにだけ示されており、本発明を限定するものととるべきでない。
レプチンDNAのin vivo薬物動態および効能試験
この実施例の目的は、レプチンをコードするポリヌクレオチド構築物からの発現がヒトレプチンタンパク質を送達することができることを確認することであった。ヒトレプチンDNAからのレプチンタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、流体力学的遺伝子送達方法(HDI)を開発し、採用した。裸のDNAで誘導されたレプチンタンパク質の発現の送達を、ob/obマウスにおいてin vivo効能で追跡した。以下の材料を用いた:
この実施例の目的は、レプチンをコードするポリヌクレオチド構築物からの発現がヒトレプチンタンパク質を送達することができることを確認することであった。ヒトレプチンDNAからのレプチンタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、流体力学的遺伝子送達方法(HDI)を開発し、採用した。裸のDNAで誘導されたレプチンタンパク質の発現の送達を、ob/obマウスにおいてin vivo効能で追跡した。以下の材料を用いた:
HDIの前に、マウス体重および食物重量を記録した。マウスをそれらの体重によってグループ分けした。
マウスを加熱灯から約12インチ離し、加熱灯の下でそれらを約2分の間暖めることによって、マウスを注射のために準備した。
流体力学的な注入手順については、マウスを拘束装置に置き、それらの尾を70%アルコールで洗浄した。ベベルすり合せにより3mlシリンジに接続された27ゲージのバタフライ針を尾静脈に挿入し、血液が確実にシリンジに抜かれるようにシリンジプランジャーを後方に引いた。DNA構築物の所望の容量(体重の7%、3.2mlでふたをした)を手動により短時間(5〜10秒)で注入した。次に針を抜き取り、注射部位にガーゼで圧を加えることによって止血した。
注射後のケアのために、完全な回復(約15分)のためにマウスを観察下、加熱パッドの上に置き、その後それらのハウジング部屋に戻した。その後、最初の48時間に1日2回、マウスを監視した。
独居房内の8〜9週齢の雄のob/obマウスをin vivo試験のために用いた。表1に記載されるヒトレプチンDNA構築物を、平均群体重につき30μg、3μg、0.3μgおよび0.03μgの用量で注射用食塩水に希釈した。
0日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。体重に従って、マウスに対して上のDNA用量で尾静脈に注射し、それは注射用食塩水に次に希釈した。最終投与量はマウス体重の7%であり、3.0mlのキャップであった。マウスに投薬した。次に、体重、健康状態および食物摂取(FI)を1、2、4、7、14および21日目にそれぞれ記録した。さらに、レプチンタンパク質の発現レベルを評価するために、4および7日目に15μlの血漿を収集した。
レプチンDNAの流体力学的注入の後、レプチン欠損ob/obマウスにおいて、この実施例の手順により投与されたヒトレプチンは体重を減少させ(表4)、食物摂取(表5)を低減した。体脂肪分析は、体重減少が完全に体脂肪の減少によることを確認した。
ヒトレプチンタンパク質ELISAアッセイ。マウス血漿中のヒトレプチンを、ELISAによって測定した。R&D systems duosetから購入した抗体(Cat#DY398E、捕捉抗体についてはpart#840279、検出抗体についてはpart#840280)をPBSで再構成し、再びPBSを用いて滴定した。white Nunc(登録商標)Maxisorp384ウェルプレート(Cat#460372)の上に、捕捉抗体を30μl/ウェルで4μg/mLでコーティングした。室温で終夜のインキュベーションの後、捕捉抗体を吸引し、プレートを90μL/ウェルのKPLミルクブロッカー(Cat#50−82−00)により室温で2時間ブロックした。インキュベーションが完了したならば、プレートを吸引し、600rpmで振盪させながら37℃で2時間、組換え標準および試料を30μL/ウェルでプレートに加えた。カゼイン試料希釈剤を用いて試料/標準希釈溶液を作製した。Teknovaプレート洗浄溶液(Cat#P1192)を用いて、100μl/ウェルによる洗浄/吸引が3回続いた。次に、カゼイン検出抗体希釈剤を用いて検出抗体を12.5ng/mLに希釈し、室温で2時間、30μl/ウェルで加えた。このインキュベーションの後、プレートを再び洗浄し、HRP希釈緩衝液中の1:1250希釈のポリ−ストレプトアビジン−HRP(Cat#21140)の溶液を各ウェルに加え(30μL/ウェル)、室温で30分間インキュベートした。最終洗浄/吸引はHRP溶液を除去し、化学発光基質を30μL/ウェル(Cat#1859678および1859679)で加えた。SpectramaxM5プレートリーダーを用いて50ミリ秒の集積時間でプレートを速やかに読み取った。ELISAのダイナミックレンジは、100〜2,000pg/mlのヒトレプチンである。アッセイは、マウス、ラットおよびカニクイザルから血漿に適用できる。血漿中ヒトレプチンレベルを、表6に示す。
薬物動態学的(PK)および薬力学的(PD)分析は、食物摂取の抑制について1.4ng/mL(85pM)のレプチンEC50を確立した。
改変された合成レプチンmRNAのin vitro転写およびキャップ形成
この実施例の改変された合成レプチンmRNAは、in vitro転写(IVT)によって生成し、塩化リチウム(LiCl)精製によって精製し、その後New England Biolabs(Beverly MA USA)からの市販キットを用いてキャップを形成した。
この実施例の改変された合成レプチンmRNAは、in vitro転写(IVT)によって生成し、塩化リチウム(LiCl)精製によって精製し、その後New England Biolabs(Beverly MA USA)からの市販キットを用いてキャップを形成した。
材料および試薬は、表7に示す。
表8に掲載したように転写反応を組み立て、無RNアーゼチューブ、チップおよび操作の使用に注意を払った。
改変された合成レプチンmRNAを作製するためのこの実施例での手順は、以下の通りである:
1.温度を監視しながら、30℃で2時間超材料をインキュベートする。0.04U/μLのDNアーゼを加えることによってDNA鋳型を消化し、次に37℃で30分の間インキュベートする。
2.2.81Mの最終濃度までLiClを加え、よく混合し、−20℃で1時間超インキュベートする。およそ20,000×g(最高速度)の最高速度で、混合物を4℃で15分の間遠心分離する。上清を除去し、1mLの70%エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように10分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び1分未満上記の通り遠心分離する。
3.残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。
ペレットの溶解を観察し、ペレットの溶解を助けるためにピペットで吸引排出を繰り返し、37℃でインキュベートする。濃度を測定し、約1μg/μLに調整する。
4.10%容量の3M酢酸ナトリウムpH5.5を加え、よく混合する。1容量の室温イソプロパノールを加え、よく混合する。−20℃で終夜インキュベートする。およそ20,000×g(最高速度)の最高速度で、混合物を4℃で15分の間遠心分離する。上清を除去し、1mLの70%エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように10分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び1分未満上記の通り遠心分離する。
5.残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。ペレットの溶解を注意深く観察し、ペレットが溶解するのを助けるためにピペットによる吸引排出を繰り返し、37℃でインキュベートする。濃度を測定し、約4μg/μLに調整する。
1.温度を監視しながら、30℃で2時間超材料をインキュベートする。0.04U/μLのDNアーゼを加えることによってDNA鋳型を消化し、次に37℃で30分の間インキュベートする。
2.2.81Mの最終濃度までLiClを加え、よく混合し、−20℃で1時間超インキュベートする。およそ20,000×g(最高速度)の最高速度で、混合物を4℃で15分の間遠心分離する。上清を除去し、1mLの70%エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように10分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び1分未満上記の通り遠心分離する。
3.残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。
ペレットの溶解を観察し、ペレットの溶解を助けるためにピペットで吸引排出を繰り返し、37℃でインキュベートする。濃度を測定し、約1μg/μLに調整する。
4.10%容量の3M酢酸ナトリウムpH5.5を加え、よく混合する。1容量の室温イソプロパノールを加え、よく混合する。−20℃で終夜インキュベートする。およそ20,000×g(最高速度)の最高速度で、混合物を4℃で15分の間遠心分離する。上清を除去し、1mLの70%エタノールでペレットを洗浄する。直前に記載のように10分の間遠心分離し、次に上清を取り出し、再び1分未満上記の通り遠心分離する。
5.残留するエタノールを除去し、無ヌクレアーゼ水にペレットを再懸濁する。ペレットの溶解を注意深く観察し、ペレットが溶解するのを助けるためにピペットによる吸引排出を繰り返し、37℃でインキュベートする。濃度を測定し、約4μg/μLに調整する。
改変された合成レプチンmRNAは、その後キャップ形成まで−80℃で保存することができ、解凍後に濃度を再び測定する。
キャップ形成については、用いた手順は、New England BioLabsのそれであった。合成レプチンmRNAおよび水の混合液を65℃で10分の間熱変性させ、次に冷たいブロックに移して5分の間クエンチする。使用直前にS−アデノシルメチオニン(SAM)(32mM)の保存溶液を水で4mMに1:8に希釈し、次に残りの反応成分を表9に指定の順序で加える。
次に、混合液を37℃で1時間インキュベートする。試料を上記の通りLiCl沈殿によって精製し、次に−80℃で保存する。
改変された合成レプチンmRNAのFPLC精製
本発明の改変された合成mRNAは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)カラム(Semi−Prep RNASep21×100mmカラム(Transgenomic Inc.カタログ番号RPC−99−2110))で精製した。カラムは、温度を50℃に設定したカラムヒーター(Timberline Instruments(カタログ番号TL−105))に入れ、5カラム容量の62%のウェーブ最適化緩衝液A(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0)(TransgenomicInc.カタログ番号553401)および38%のウェーブ最適化緩衝液B(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0、25%アセトニトリル)(TransgenomicInc.カタログ番号553402)によって前平衡化させた。1カラム容量は、35mLに等しい。
本発明の改変された合成mRNAは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)カラム(Semi−Prep RNASep21×100mmカラム(Transgenomic Inc.カタログ番号RPC−99−2110))で精製した。カラムは、温度を50℃に設定したカラムヒーター(Timberline Instruments(カタログ番号TL−105))に入れ、5カラム容量の62%のウェーブ最適化緩衝液A(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0)(TransgenomicInc.カタログ番号553401)および38%のウェーブ最適化緩衝液B(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0、25%アセトニトリル)(TransgenomicInc.カタログ番号553402)によって前平衡化させた。1カラム容量は、35mLに等しい。
各改変された合成mRNA溶液の1.5mLを、2mLの試料ループに注入した。次に、表10に記載した勾配に従ってFPLC操作を開始した。流量は、5mL/分にセットした。
画分をプールし、イソプロパノールおよび酢酸ナトリウム沈殿によって改変された合成mRNAを単離した。第1のmRNAピークに関連する画分(注入後約23分に溶出する)をプールした。
4750rpmで15分の間、Amicon Ultra−15遠心分離フィルターユニット、30K(Milliporeカタログ番号UFC903024)で試料を22℃で濃縮し、濃縮液を水で希釈することによって緩衝液を水に交換し、混合液を遠心機に2回通した。
濃縮したmRNA試料をエッペンドルフチューブに移し、mRNAを1/10容量3M酢酸ナトリウム、pH5.5(Ambion#AM9740)および2×容量2−プロポノールおよび1/100容量GlycoBlue(Ambionカタログ番号AM9515)で沈殿させ、終夜−20℃に保った。
混合液を4℃で15分の間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを1mLの70%冷エタノール(Sigmaカタログ番号459844)で洗浄した。混合液を3分の間遠心分離し、上清を除去した。
ペレットを無ヌクレアーゼ水(Life Technologiesカタログ番号10977−015)に再懸濁させた。37℃でおよそ5〜10分間のピペット操作およびインキュベーションで、ペレットが溶解するのを助けた。濃度を測定し、約1.5mg/mLに調整した。その後、キャップ形成までmRNAを−80℃で保存し、解凍後に濃度を再び測定した。
HPLCによるmRNA精製
本発明の改変された合成mRNAは、高速液体クロマトグラフィーで精製した。SIL−10APオートサンプラー、LC−8A液体クロマトグラフ、SPD−20A UV/可視光検出器およびFRC−10A画分コレクターへの分離を同期させるために、Shimadzu SCL−10A VPシステムコントローラを用いた。hLeptin mRNAのクロマトグラフ分離のために、Phenomenex Luna C18(2)30×100mm 5μ 100Å反転相HPLCカラムを用いた。カラムを、Timberline InstrumentsのT105デュアルカラムおよび移動相加熱ユニットに入れた。試薬は、表11に掲載する。
本発明の改変された合成mRNAは、高速液体クロマトグラフィーで精製した。SIL−10APオートサンプラー、LC−8A液体クロマトグラフ、SPD−20A UV/可視光検出器およびFRC−10A画分コレクターへの分離を同期させるために、Shimadzu SCL−10A VPシステムコントローラを用いた。hLeptin mRNAのクロマトグラフ分離のために、Phenomenex Luna C18(2)30×100mm 5μ 100Å反転相HPLCカラムを用いた。カラムを、Timberline InstrumentsのT105デュアルカラムおよび移動相加熱ユニットに入れた。試薬は、表11に掲載する。
0.1M TEAAおよび4.5%アセトニトリル中の4mg/mLの濃度の100mgのmRNAを、5mlループを用いて6〜8回の注入によってカラムに詰めた。移動相Aは水に0.1MのTEAAであり、移動相Bは90:10のアセトニトリル:水に0.1MのTEAAであった。流量は完全勾配のために10ml/分の一定に保ち、HPLCカラムおよび移動相は常に65℃に維持した。HPLC操作のための時間プログラムを、表12に示す。260nm波長の読取が20mVに到達したならば、ヒトレプチンmRNAを12ml画分に収集した。HPLCピークのテールエンドが20mV未満になるまで、試料収集を続けた。
下流の任意の試験および適用の前に、HPLC画分を水に緩衝液交換した。緩衝液交換は、3つのPellicon3 88cm2カセットを有するMillipore Cogent μScale TFFで実施した。個々のLC画分または合同画分をユニットの試料チャンバーに注ぎ、少なくとも100×交換して発熱物質およびRNアーゼを含まない水にした。ヒトレプチンmRNAの最終濃度が確実に少なくとも1mg/mLであるように、水中の試料の最終容量を最適化した。キャップ形成まで水中のヒトレプチンmRNA試料を−80℃で保存し、in vivo実験のために必要なときには解凍後に濃度を再び測定した。
送達ビヒクルへの改変された合成レプチンmRNAのパッケージング
この実施例で用いた材料は、以下の通りだった:
この実施例で用いた材料は、以下の通りだった:
カチオン性脂質アミン基対mRNAリン酸基(N:P)モル比が4:1で本発明の改変された合成mRNAを脂質ナノ粒子にパッケージし、透析し、濃縮した。一例として、>0.4mg/mLmRNAの濃度の約2mgのパッケージされた改変された合成mRNAをもたらしたプロトコールについて、量を示す。
無RNアーゼ試薬、チューブ、チップおよび操作を用いて、表14に記載の通り脂質ナノ粒子混合物試薬を計量し、バイアル中に混合した。
処理の容易さのために、必要量の1.1×比に相当するエタノール(8.8mL)を脂質に加えた。混合液を短時間超音波処理して、37℃で5分の間静かに撹拌した。その後、使用の準備ができるまで、混合液をかき混ぜずに37℃でインキュベートした。
Amicon Ultra−15遠心分離装置にmRNA溶液を詰め、4℃で4,000rpmで15分の間遠心分離することによって、改変された合成mRNAを水からpH6.0緩衝液に交換した。濃縮したmRNAをpH6.0クエン酸緩衝液に再懸濁し、mRNA濃度を測定した。
pH6.0のクエン酸緩衝液に0.5mg/mLの最終改変合成mRNA濃度を水洗シンチレーションバイアルに調製し(8mLに4mgのmRNA)、mRNA溶液の最終濃度を測定した。使用の準備ができるまで、mRNA希釈溶液を37℃でインキュベートした。
以下の各8mLで、3つの10mlシリンジを調製した:(a)脂質混合物;(b)mRNA溶液;(c)クエン酸緩衝液。シリンジ(a)および(b)は、T字型接合部のLeurフィッティングに取り付けた。簡潔には、0.5mm内径のP727 T−混合機が、P652アダプタ(IDEX、Oak Harbor WA USA)に取り付けられた。シリンジ(a)および(b)は、P658 Luerフィッティング(IDEX)に取り付けた。シリンジ(a)および(b)は、PTFE0.8mm内径チュービング(#3200068、Dolomite、Royston、UK)によって、P938xナットおよびフェルール(IDEX)でT−混合機に接続した。シリンジ(C)は、P938xナットおよびフェルールによって最終単一チュービングに接続されたLuerフィッティングに取り付けた。チュービングの末端は、撹拌棒入りの前水洗ビーカーの上に一緒に固定し、静かに撹拌した。
シリンジポンプ設定は、適当なシリンジ製造業者およびサイズにセットし、容量(8mL)および1.0mL/分の流量を入れた。ポンプを開始し、生じた材料は撹拌棒入りの無RNアーゼ50mLプラスチックビーカーに収集した。mRNAを含有する脂質ナノ粒子の懸濁液を、1バッグにつき2〜3mLで透析チュービングに移し、4℃で終夜、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に透析した。
分割した材料を、1つの15mL円錐形チューブにプールした。接線流濾過(TFF)を用いて、脂質ナノ粒子(LNP)懸濁液を濃縮した。新鮮な500Kの分子量カットオフカプセルをMinimateシステムに接続するために新鮮なチュービングを用いて、150rpmの流速で500mLの無RNA水で水洗することによってTFFシステムを準備した。
脂質ナノ粒子/改変された合成mRNA懸濁液をTFFユニットレザバーに詰め、75mL/分の流量で2〜3mlの最終容量に濃縮した。
改変された合成mRNAの封入パーセントは、Life Technologies(Grand Island NY USA)からのQuant−iT Ribogreen RNAアッセイキットを用いて判定した。脂質ナノ粒子/改変された合成mRNA懸濁液は、緩衝液(粒子外のmRNA)および緩衝液プラス洗浄剤(全mRNA)での蛍光測定によって分析した。提供されたリボソームRNAからの1000ng/mL保存液を調製し、保存液は表15に示すTEおよびTE+0.75%Triton X−100の比に従ってRibogreenアッセイのための標準曲線を作成するために用いた。アッセイのために、TE緩衝液またはTEプラスTritonで試料を調製し、蛍光試薬を各々に加える。計算される差は、粒子中のmRNAである。
読取りが標準曲線内(400〜600倍)にあるように、試料はTE緩衝液およびTE緩衝液+0.75%Triton X−100で適当な希釈で調製した。96ウェルプレートの各ウェルに100μLの標準/試料を加えた。Ribogreen試薬をTE緩衝液で1:200に希釈し、100μLを各ウェルに加えた。
試料蛍光は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、480nmの励起、520nmの放射で測定した。蛍光対RNA濃度の標準曲線を作成するために、各RNA試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を差し引いた。各試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を差し引き、標準曲線からの試料のRNA濃度を判定した。試料の封入パーセントは、試料プラスTritonと試料だけの間の濃度の差を、試料プラスTritonの濃度によって割り算することによって判定した。脂質ナノ粒子/改変された合成懸濁液の6倍希釈溶液を作製し、Zetasizer Nano ZS機器(Malvern Instruments,Ltd、Worcestershire、UK)を用いて直径および多分散指数を判定した。
カチオン性リピドAにパッケージしたレプチンmRNA;in vivo薬物動態試験
本発明の改変された合成レプチンmRNAの静脈内および皮下送達に続いて、レプチンタンパク質発現を誘導した。レプチンタンパク質の発現(実施例1に記載されるELISAによって測定された)は、レプチン欠損ob/obマウスでin vivo効能につながった。
本発明の改変された合成レプチンmRNAの静脈内および皮下送達に続いて、レプチンタンパク質発現を誘導した。レプチンタンパク質の発現(実施例1に記載されるELISAによって測定された)は、レプチン欠損ob/obマウスでin vivo効能につながった。
マウスへのカチオン性リピドA中の改変された合成mRNAの投与のために用いた材料は、表16に詳述する。
改変された合成レプチンmRNAのマウス静脈内尾静脈注射
尾静脈注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを加熱灯から約12インチ離し、加熱灯の下でそれらを約2分の間暖めることによって、マウスを準備した。
尾静脈注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを加熱灯から約12インチ離し、加熱灯の下でそれらを約2分の間暖めることによって、マウスを準備した。
尾静脈注射手順については、マウスを拘束装置に置き、それらの尾を70%アルコールで洗浄した。ベベルすり合せにより1mlシリンジ(Becton Dickinson、カタログ番号309659)に接続した27ゲージの針(Becton Dickinson、カタログ番号305109)を尾静脈に挿入し、血液が確実にシリンジに抜かれるようにシリンジプランジャーを後方に引いた。改変された合成レプチンmRNAの所望の容量を中程度の圧および速度により、手で注射した。次に針を抜き取り、注射部位をガーゼで圧迫することによって止血した。
in vivo試験のために、独居房の8〜9週齢の雄C57BL/6マウスを用いた。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、FPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)をカチオン性リピドAにパッケージし(N:Pモル比=8:1)、次に、平均群体重につき10μgの用量で注射用食塩水に希釈した。
0日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。マウスに投薬し、食物摂取(FI)を1〜7日目の各日と9、11および16日目に記録した。
実施例1のELISAプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドA中のレプチンmRNAの静脈内投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表17および図5に詳述する。
この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンmRNAの静脈内送達は、19ng/mLの血漿中レプチンレベルをもたらし、そのレベルは、実施例1で判定されたように、レプチン欠損ob/obマウスにおける食物摂取の抑制のための1.4ng/mLのEC50の10倍以上高い。
改変された合成レプチンmRNAのマウス皮下注射
皮下注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを手動で拘束し、作業台に置いた。それらの襟首をつまんで下の筋肉から持ち上げ、その空間に1mLシリンジと接続した25ゲージ針を挿入した。流体が決してシリンジ内に引き抜かれないようにシリンジプランジャーを後方に引き、次にレプチンmRNAの所望の容量を中程度の圧および速度により手で注射した。針を次に抜き取り、マウスはそれらのケージに戻した。
皮下注射の前に、マウス体重を記録し、食物を計量し、体重によってマウスをグループ分けした。マウスを手動で拘束し、作業台に置いた。それらの襟首をつまんで下の筋肉から持ち上げ、その空間に1mLシリンジと接続した25ゲージ針を挿入した。流体が決してシリンジ内に引き抜かれないようにシリンジプランジャーを後方に引き、次にレプチンmRNAの所望の容量を中程度の圧および速度により手で注射した。針を次に抜き取り、マウスはそれらのケージに戻した。
in vivo試験のために、8〜9週齢の雄C57BL/6マウスを用いた。カチオン性リピドAにパッケージした、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている(N:Pモル比=8:1)、FPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)を、平均群体重につき10μgの用量で注射用食塩水に希釈した。
0日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。午前9時にマウスに投薬し、0日目の午前9時に血液をとった。1日目および2日目にも午前9時にそれぞれ血液をとり、レプチンタンパク質レベルについて評価した。体重および食物摂取も記録した。
実施例1のELISAプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドA中のレプチンmRNAの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表18および図5に詳述する。
この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンmRNAの皮下送達は、1.4ng/mLの血漿中レプチンタンパク質レベルをもたらし、これは、実施例1で判定されたように、レプチン欠損ob/obマウスにおける食物摂取の抑制のためのEC50に同等である。
カチオン性リピドAでパッケージされ、レプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの特異的効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているFPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達され、レプチンmRNAはカチオン性リピドAにパッケージされて静脈内投与された。
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの特異的効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているFPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達され、レプチンmRNAはカチオン性リピドAにパッケージされて静脈内投与された。
用いたマウスは、Jackson Labsからの9週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、HPLC精製され、カチオン性リピドAにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)または対照の改変された合成マウスエリスロポイエチンmRNA(配列番号12)を与えた。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
3匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(B群)。3匹のマウスに、改変された合成マウスエリスロポイエチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(C群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4、5、6、7および8日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
図2Aおよび図2Bは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
カチオン性リピドAでパッケージされ、レプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているFPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、mRNAはカチオン性リピドAにパッケージされて静脈内投与された。
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されているFPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、mRNAはカチオン性リピドAにパッケージされて静脈内投与された。
用いたマウスは、Jackson Labsからの9週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、HPLC精製され、カチオン性リピドAにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)または対照の改変された合成マウスエリスロポイエチンmRNA(配列番号12)を与えた。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
3匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(B群)。3匹のマウスに、改変された合成マウスエリスロポイエチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(C群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬後6時間)に、次に1、2および4日目の午前9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、ヒトレプチンまたはマウスエリスロポイエチンレベルを測定した。
図2Cは、実施例1のプロトコールによって測定された、この試験の血漿中ヒトレプチンレベルの結果を表す。図2Cの裏づけとなる研究については、mEPO mRNAを投与された(6時間後に54,582pg/mL)マウスでmEPOタンパク質の発現が高く、mEPO mRNAの送達を確認した。
カチオン性リピドBにパッケージされてレプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達され、レプチンmRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて静脈内投与された。
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすヒトレプチンの効果を実証することであった。ヒトレプチンは、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達され、レプチンmRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて静脈内投与された。
用いた動物は、Jackson Labsからの12週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらは、HPLC精製され、カチオン性リピドBにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与された。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.02mpkの用量で投与した(B群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(C群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(D群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4、5、6および7日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
図3Aおよび図3Bは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
カチオン性リピドBでパッケージされてレプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、レプチンmRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて静脈内投与された。
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルでヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであって、レプチンmRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて静脈内投与された。
用いた動物は、Jackson Labsからの16週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらは、HPLC精製され、カチオン性リピドBにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与された。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(B群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬後6時間)に、次に1、2、3、4、5、6および7日目の午前9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例1のELISAプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。
図3Cは、この試験の血漿中ヒトレプチンタンパク質の結果を表す。
カチオン性リピドCでパッケージされてレプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の効果を実証することであった。ヒトレプチンは、カチオン性リピドCにパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達された。
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の効果を実証することであった。ヒトレプチンは、カチオン性リピドCにパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の投与によって送達された。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらは、HPLC精製され、カチオン性リピドCにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与された。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.02mpkの用量で投与した(B群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(C群)。5匹の動物に、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(D群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4、5、6および7日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
図4Aおよび図4Bは、この試験の体重および食物摂取の結果を表す。
カチオン性リピドCでパッケージされてレプチン欠損ob/obマウスに投与されたレプチンmRNAの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)が、カチオン性リピドCにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに静脈内投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)が、カチオン性リピドCにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに静脈内投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらは、HPLC精製され、4:1のN:Pモル比でカチオン性リピドCにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、本発明の改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与された。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
3匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.02mpkの用量で投与した(B群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(C群)。3匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(D群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬後6時間)に、次に1、2、3、4、5、6および7日目の午前9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例1のELISAプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。
図4Cは、この試験の血漿中ヒトレプチンタンパク質の結果を表す。
カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCでパッケージされてレプチン欠損ob/obマウスに投与されたマウスエリスロポイエチンmRNAの薬物動態
この実施例の目的は、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCでパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたマウスエリスロポイエチンmRNA(配列番号12)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取への効果がないことを実証することであった。
この実施例の目的は、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCでパッケージされて静脈内投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたマウスエリスロポイエチンmRNA(配列番号12)の投与後に、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取への効果がないことを実証することであった。
用いた動物は、Jackson Labsからの8週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらは、HPLC精製され、4:1のN:Pモル比でカチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、改変された合成マウスエリスロポイエチン(mEPO)mRNA(配列番号12)を投与された。マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドB中の改変された合成mEPO mRNAを0.02mpkの用量で投与した(B群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドC中の改変された合成mEPO mRNAを0.2mpkの用量で投与した(C群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4および7日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
図3Dおよび図4Dは、この試験の結果を表す。図3Dの裏づけとなる研究については、mEPO mRNAを投与された(6時間後に892,633pg/mL)マウスでmEPOタンパク質の発現が高く、mEPO mRNAの送達を確認した。図4Dの裏づけとなる研究については、mEPO mRNAを投与された(6時間後に158,865pg/mL)マウスでmEPOタンパク質の発現が高く、mEPO mRNAの送達を確認した。
C57BL/6マウスにおけるカチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAの毒性および耐容性試験
この実施例は、カチオン性リピドCでパッケージされて静脈内(4mpk)および皮下(2mpk)投与された、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)がどのようにマウスで一般に安全だったかを記載する。
この実施例は、カチオン性リピドCでパッケージされて静脈内(4mpk)および皮下(2mpk)投与された、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)がどのようにマウスで一般に安全だったかを記載する。
雄C57BL/6マウス(3匹の動物/群)は、リン酸緩衝食塩水(PBS)を皮下もしくは静脈内のいずれかで投与されて対照の役目をしたか、または、カチオン性脂質としてカチオン性リピドCで脂質ナノ粒子に製剤化された改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投薬された。表19は、試験計画を概説する。表20は、製剤特性を概説する。試験の静脈内アームのマウスは、およそ10mL/kgの投薬量を投与した。皮下に投薬したマウスは、投薬前に剃った。試験の終了時(投薬のおよそ24および72時間後)、適当な試験セグメントに割り当てられた全てのマウスを検死にかけ、それらの最終体重を記録し、臨床化学のために血液試料を収集した。
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Cobas(登録商標)6000アナライザー(Roche Diagnostics)を用いて、以下のパラメータを判定した:アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST);総ビリルビン;アラニントランスアミナーゼ(ALT);総タンパク;アルカリ性ホスファターゼ;アルブミン;尿素;グロブリン;クレアチニン;クレアチンキナーゼ(CK);グルコース;アルブミン/グロブリン比。
臨床化学的変化が投薬の72時間後に起こり、それを表21に概説する。
カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を静脈内に投薬されたマウスは、対応する顕微鏡的変化なしでタンパク価が減少した。さらに、静脈内投薬されたマウスにおけるBUNの低下は、減少した食物摂取を示唆した。
これらの変化は、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)の皮下投与による最小限の炎症を反映していた(アルブミンの減少、グロブリンの増加およびアルブミングロブリン比の低下を伴う総タンパクの減少)。これらの変化は、顕微鏡的好中球性脾臓浸潤物および皮膚の血清細胞性痂皮に対応した。
検死時に、脾臓、肝臓および腎臓重を記録し、全ての動物からのこれらの組織を肺と一緒に10%中性緩衝ホルマリンで固定し、通常通り処理して顕微鏡評価に適する染色組織切片を生成した。
改変された合成レプチンmRNA関連の器官重量の変化は検出されなかった。改変された合成レプチンmRNA関連の肉眼的変化は観察されなかった。カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を皮下に投薬されたマウスの中で、試験品関連の皮膚変化は投薬から72時間後に1匹の動物だけに明らかに存在した(皮下および皮膚の炎症性細胞浸潤)。脾臓での顕微鏡観察(増加した赤色脾髄の細胞性または好中球性浸潤物または両方)は、任意の皮膚刺激に反応性および二次性であると考えられた。
カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)で静脈内投薬されたマウスは、肝臓での異常な血管内細胞、赤脾髄での細胞性の増加、ならびに肺脈管障害および血栓症を呈した(1/3の動物)。
カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を静脈内に投薬された1匹のマウスは、投薬から72時間後に肺脈管障害を呈した。
カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA;in vivo予備的前臨床安全性試験
この実施例の目的は、カチオン性リピドCにパッケージされ、マウスに製剤の静脈内(IV)注射によって送達された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)の投与からのタンパク質の発現を判定することであった。ELISAアッセイによって測定された通り、改変された合成レプチンmRNAの送達は、レプチンタンパク質の発現を誘導した。毒性および耐容性も分析した。
この実施例の目的は、カチオン性リピドCにパッケージされ、マウスに製剤の静脈内(IV)注射によって送達された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)の投与からのタンパク質の発現を判定することであった。ELISAアッセイによって測定された通り、改変された合成レプチンmRNAの送達は、レプチンタンパク質の発現を誘導した。毒性および耐容性も分析した。
マウスは、上で実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
in vivo試験を、独居房の8〜9週齢雄ob/obマウスで実施した。それらに、カチオン性リピドCにパッケージされ、この実施例のために4mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、HPLCで精製された改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)(N:Pモル比=4:1)を投与した。食塩水対照を用いた。
3匹のマウスは、食塩水対照を投与した。3匹のマウスの1つの群は、カチオン性リピドCにパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、4mpkの用量で各々投与する。0日目に、マウスを計量し、それらの体重によって群に選別し、それらのグループ分けに基づいて次に投薬した。食物重量を記録した。
1日目に(投薬の24時間後)、全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。
心臓穿刺により血液を収集する:ALT/AST/ALP/ビリルビン(総および活性)のための血清(150〜250μl);ELISAのための血漿(15μl)。
肝臓、脾臓および腎臓を収集した。全組織重量を記録した。
試験でレプチンタンパク質の用量比例曝露が観察された。カチオン性リピドCにパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、ob/obマウスでの0.2mpk用量より20倍高い4mpkの用量で、痩せたC57BL/6マウスに投薬した。循環中の185ng/mLのレプチンタンパク質レベルが観察された。
カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNA;反復用量によるin vivo薬物動態および効能試験
カチオン性リピドCにパッケージされた改変された合成レプチンmRNAのタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)をマウスに送達するために、実施例7のプロトコールによる反復静脈内(IV)注射を用いた。改変された合成レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ob/obマウスでのin vivo効能が続いた。
カチオン性リピドCにパッケージされた改変された合成レプチンmRNAのタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)をマウスに送達するために、実施例7のプロトコールによる反復静脈内(IV)注射を用いた。改変された合成レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ob/obマウスでのin vivo効能が続いた。
マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
in vivo試験を、独居房の12週齢雄ob/obマウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドCでパッケージされ、この試験のために0.2mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、HPLCで精製された改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与した。食塩水対照を用いた。
薬物動態。5匹のマウスの1つの群に食塩水対照を投与し、5匹のマウスの1つの群には、カチオン性リピドCでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)を0.2mpk(10μg)の用量で投与した。反復血液試料採取の行為自体のストレスがマウスの体重減少を引き起こすので、レプチンタンパク質発現の動態を測定するためのおよびレプチンmRNAの効能を測定するための別々の群のマウスが必要である。群あたりの平均体重が同じであるように、5日間の各日にマウスを計量し、選別した。食物を、同様に計量した。
0日目に、午前9時(午前)にマウスに投薬し、午後3時(午後)にレプチン分析のために尾ニックによって放血させた(15μlの血漿)。3、7、10、14、14および17日目に、午前9時にマウスに投薬した。1、2、4、8、11、15および18日目に、午前9時にマウスを計量し、レプチン分析のために尾ニックによって放血させた(15μlの血漿)。実施例1のELISAプロトコールに従って、血漿中のヒトレプチンタンパク質レベルを測定する。この実施例で測定されたレプチンタンパク質レベルは、表22にある。第1の投薬の後のレプチンタンパク質レベルを6、24および48時間の時点に分析し、以降のタンパク質レベルは最後の投薬から24時間後であった。
薬力学。6匹の動物に、食塩水対照を投与した。6匹のマウスの1つの群の各々に、カチオン性リピドCでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)を0.2mpk(10μg)の用量で投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、動物を計量し、選別した。
1日目に、午前9時(午前)にマウスに投薬した。1、2、4、8、9、11〜13、15、16、18〜20、22および23日目に、体重および食物摂取だけを記録した。3、7、10、14、17および21日目に、体重および食物摂取を朝一番に記録し、午前9時にマウスに投薬した。
カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの反復処置は、持続した体重減少およびレプチンタンパク質発現をもたらした。カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、3週間にわたって1週あたり2回投薬し(矢印によって表される合計6回の投薬)、各投薬の後、表23に詳述される通り、体重減少およびレプチンタンパク質レベルの維持が観察された。
カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA;in vivo安定性試験
カチオン性リピドCにパッケージされた(N:Pモル比=4:1)、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の安定性を判定するために、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを様々な時点でマウスに送達するために、静脈内(IV)注射を用いた。レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、発現レベルを全ての時点で比較した。
カチオン性リピドCにパッケージされた(N:Pモル比=4:1)、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の安定性を判定するために、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを様々な時点でマウスに送達するために、静脈内(IV)注射を用いた。レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、発現レベルを全ての時点で比較した。
マウスは、実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
in vivo試験は、独居房の10週齢雄C57BL/6マウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドCにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、この試験のために0.4mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、HPLCで精製された改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与する。食塩水対照を用いた。
4匹のマウスに、食塩水対照を投与した。4匹のマウスの1つの群に、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、0.4mpk(10μg)の用量で各々投与した。
群あたりの平均体重が同じであるように、1日目と1、2、4および8週目に動物を計量し、選別した。午前9時にマウスに投薬し、次に計量し、レプチンレベルのために24時間時に放血させた(3つのアリコート)。
静脈内送達の後に、実施例1のELISAプロトコールによってレプチンタンパク質発現を測定することによって、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)の安定性を判定する。初期製剤日から1、7、14、28および56日後に、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを用いてマウスに投薬し、各投薬の24時間後にレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを調製してから56日後に、投与後のレプチンタンパク質レベルは約60%低下した。
カニクイザルにおけるカチオン性リピドCでパッケージされたレプチンmRNAの薬物動態および薬力学
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドCでパックされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の、0.6mg/kgの用量での静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態(PK)および薬力学(PD)を検討することであった。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドCでパックされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の、0.6mg/kgの用量での静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態(PK)および薬力学(PD)を検討することであった。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
表24は、この実施例のための試験計画を概説する。表25は、製剤特性を概説する。表26で概説される通りに、血液試料を収集した。伏在静脈または大腿静脈で血液試料を収集してシリンジに入れた。血液化学のために全血を分析した。血清化学のために血清を収集し、レプチンELISAおよびリピド代謝のために血漿を収集した。
3匹のサルに、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、0.6mpkの用量で静脈内に投薬した。129ng/mLのピークのレプチン発現が、医薬品処置の4時間後に観察された。これにより、げっ歯動物からカニクイザルへのレプチン発現の翻訳が確認された。
実施例の条件下で、カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAは、雄カニクイザルに0.6mg/kgの用量で静脈内投与され、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカインIL−1RAの増加もあった。これらの変化の全ては初期の時点で最も目立ち、24時間(サイトカインの場合)または72時間(臨床病理)後までにはほとんど正常だった。
下記のように、カチオン性リピドCでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)の0.6mg/kgでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示し、肝臓および筋肉の傷害を示唆する炎症性変化、大部分は最小限の変化をもたらした。
血液学のための血液試料は、EDTA抗凝固剤の中に収集した。ADVIA2120(登録商標)アナライザーを用いて以下のパラメータを判定した:赤血球数、白血球数、ヘモグロビン、好中球数、ヘマトクリット、リンパ球数、平均血球体積、単球数、平均赤血球ヘモグロビン量、好酸球数、平均赤血球ヘモグロビン濃度、好塩基球数、網状赤血球数、大きな未染色細胞数および血小板数。
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Cobas6000アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した:アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST);総ビリルビン;アラニントランスアミナーゼ(ALT);総タンパク;アルカリ性ホスファターゼ;アルブミン;尿素;グロブリン;クレアチニン;クレアチンキナーゼ(CK);グルコース;アルブミン/グロブリン比;ナトリウム;リン;カリウム;コレステロール;塩化物;トリグリセリド;カルシウム;およびマグネシウム。
表27に掲載した分析物の判定のために、Invitrogen Cytokine Monkey Magnetic 28−Plex Panel(キットカタログ番号:LPC0003M、Invitrogen Corporation、Carlsbad CA)を用いた。定量下限未満の値は、1:2の希釈比に基づいて定量下限(LLOQ)としてデータ表に入れた。一部の場合には、その計算のために異なる希釈が用いられたので、LLOQは異なった。Bioplex 200(Bio−Rad Laboratories,Inc.、Hercules、CA)を分析のために用い(ソフトウェアバージョン:Bio−Plex Manager(商標)5.0セキュリティ版、ビルド531)、データ処理を促進するためにMicrosoft Excel(登録商標)2010が用いられ、生データに含まれた。
結果。有意な血液学的変化は起こらなかった。表28で、臨床化学的変化を概説する。カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの0.6mg/kgの用量での静脈内投与は、両時点で臨床化学的変化を引き起こし、投薬から24時間後の最小限の肝細胞変化(AST、ALTの増加、アルブミンの低下)および潜在的な筋肉変化(ASTおよびCKの増加)を反映していた。アルブミンの減少(下で詳述する炎症誘発性サイトカインの増加に加えて)によって、かすかな炎症性変化が示された。主に投薬後24時間のトリグリセリドの減少は、脂質代謝への影響、食物摂取の減少を反映していたかもしれず、または生物学的変動によるかもしれない。
投薬前の値と比較したときに、カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAによる0.6mg/kg ivの用量での投薬の後に、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子濃度の上昇が記された。分析物の投薬前の値が定量下限(LLOQ)未満であったならば、LLOQを用いて変化倍率を計算した。血清中分析物レベルがULOQより上にあったとき、定量上限(ULOQ)を用いて増加倍率を計算した(動物#3の6時間後のMCP−1)。
投薬後2時間という早い時期に全3匹の動物で試験品関連の変化のいくつかが記され、これらの変化のほとんどは投薬後24時間までに投薬前レベルに復帰した。1匹の動物だけで上昇した少数の分析物もあった。これらの後者の変化と処置との関係は除外することができないが、その理由は、それらが投薬前の値を上回っていたからであり、および他のサイトカインが同じサルで増加していたからである。
両端を含めて投薬の2時間後から投薬の6時間後まで、血清IL1RAレベルの上昇は全3匹のサルで起こり、投薬の24時間後までにレベルは正常に戻った;最大上昇量は、少なくとも1時点の1匹の動物でおよそ12倍であった。同時並行的に、血清中のIL6レベルは投薬の2時間後から投薬の6時間後まで全ての動物で上昇し(少なくとも1時点の1匹のサルで100倍以上)、24時間後までに投薬前の値に回帰した。血清中のMCP−1レベルは、投薬の6時間後の最高100倍以上の上昇を含めて投薬の2時間後に上昇し、投薬の24時間後におよそ2倍の上昇であったが、投薬の72時間後に投薬前の値に回帰した。I−TAC(CXCL11ケモカイン)の血清中レベルは、投薬の4時間後に全3匹の動物で上昇し、6時間後には上昇したままであった(1匹の動物で最高78倍)。24時間後までに、I−TACレベルは最高8倍上昇し、投薬の72時間後までに投薬前レベルに回帰した。さらに、動物#2以外の動物#1および#3で、血清中VEGFレベルのおよそ3倍の上昇が起こった。これらの上昇は、投薬の2、4または6時間後に見られた。表29では、最も一貫した上昇を示した4つの分析物の経時変化を概説する。
表29は、投薬前の値と比較したカチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変合成レプチンmRNAの雄カニクイザルへの投与と関連した血清中サイトカインおよびケモカインレベルで顕著な変化が観察されたことを示す。
実施例の条件下で、雄カニクイザルに0.6mg/kgで静脈内投与された、カチオン性リピドC構築物でパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAは、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、ILー1RAの増加もあった。これらの変化の全ては初期の時点で最も目立ち、24時間(サイトカインの場合)または72時間(臨床病理)後までにはほとんど正常だった。
レプチンは、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの増加を通してそれ自体免疫調節効果を有する(末梢血単核細胞でTNFα、IL−6およびIFNγならびにIL−1RAをin vitroで刺激する。Juge-Aubry CE and Meier CA (2002) Mol. Cell Endocrinol. 194(1-2): 1-7を参照されたい)。
結論として、カニクイザルへのカチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの静脈内単回投与は、72時間後に解消した炎症性変化、大部分は肝臓および筋肉の傷害を示唆した最小限の変化をもたらした。この実施例の結果に基づいて、0.6mg/kgの用量は、カニクイザルで良好な耐容性を示した。
カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNA;in vivo予備的前臨床安全性試験
この実施例のin vivo試験は、独居房の8〜9週齢雄C57BL/6マウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドBにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、この試験用に7mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与した。食塩水対照を用いた。
この実施例のin vivo試験は、独居房の8〜9週齢雄C57BL/6マウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドBにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、この試験用に7mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製された改変合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与した。食塩水対照を用いた。
0日目に、マウスは、実施例7に記載の通りに尾静脈内注射を受けた。
表30に詳述されるように、3匹のマウスに食塩水対照を投与し(A群)、3匹のマウスの1つの群に、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを7mpkの用量で各々投与する(B群)。A群およびB群のマウスは、1日目に屠殺した。3匹のマウスに食塩水対照を投与し(C群)、3匹のマウスの1つの群に、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを7mpkの用量で各々投与する(D群)。C群およびD群のマウスは、3日目に屠殺した。表31は、製剤特性を概説する。
0日目に、マウスを計量し、それらの体重によって群に選別し、それらのグループ分けに基づいて次に投薬した。食物重量を記録した。
1日目に、A群およびB群の全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。3日目に、C群およびD群の全てのマウスを屠殺し、体重および食物重量を記録し、マウスの行動および活動を目視で観察する。
心臓穿刺により血液を収集した:ALT/AST/ALP/ビリルビン(総および活性)(150〜250μL)のために血清;レプチンタンパク質測定(15μL)およびカチオン性リピド測定(20μL)のために血漿。
肝臓、脾臓および腎臓を収集する:全組織重量を記録した。
耐容性試験でレプチンタンパク質の用量比例曝露が観察された。カチオン性リピドBにパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を、7mpkの用量で痩せたC57BL/6マウスに投薬した。実施例1のELISAアッセイプロトコールにより測定したときに1300ng/mLのレプチンタンパク質レベルが循環中で観察されたが、それはC57BL/6マウスで0.6mpk用量で観察されたレベルより17倍高い。
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Cobas 6000アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した:アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST);総ビリルビン;アラニントランスアミナーゼ(ALT);総タンパク;アルカリ性ホスファターゼ;アルブミン;尿素;グロブリン;クレアチニン;クレアチンキナーゼ(CK);グルコース;アルブミン/グロブリン比。
検死時に、脾臓、肝臓および腎臓重を記録し、全ての動物からのこれらの組織を肺と一緒に10%中性緩衝ホルマリンで固定し、通常通り処理して顕微鏡評価に適する組織切片にした。
表32で、臨床化学的変化を概説する。
両時点で変化は最小限の炎症を反映した(アルブミンの減少、グロブリンの増加およびアルブミングロブリン比の低下を伴う総タンパクの減少)。これらの変化は、顕微鏡により好中球の脾臓浸潤、肝血管系における異常な血管内細胞、または肺脈管障害および血栓症に対応した。さらに、BUNの低下は食物摂取の減少を示唆した。
器官重量を、表33に示す。改変された合成レプチンmRNA関連の増加は投薬のおよそ72時間後に脾臓重量で発生し、最小限であり(3匹のマウスで正味8%の差)、赤色脾髄および好塩基球の顕微鏡的に増加した細胞性に対応した。
投薬したマウスにおいて投薬の24時間後に、改変された合成レプチンmRNA関連の脾臓および肝臓の変化が存在したが、投薬の72時間後には、肝臓および脾臓での変化に加えて肺にも形態学的変化が存在した。投薬の24時間後の改変された合成レプチンmRNA関連の脾臓変化には、白色および赤色脾髄の細胞細片/単細胞壊死、赤色脾髄、好中球浸潤物および好塩基球の細胞性の減少が含まれた。脾臓の好塩基球は、初期の骨髄巨核球に対応した可能性が高い。これらの変化は、臨床病理学で観察された炎症性プロファイルと一致した。
肝臓では、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAを投薬された動物において異常な血管内細胞が存在し、炎症性応答をさらに示した。
投薬の72時間後、異常な血管内細胞が肝臓になお存在した。細胞性細片および赤色脾髄または好塩基球の細胞性の増加(全て骨髄外造血を示す)で特徴付けられる脾臓の変化もあった。
72時間後の肺では、中間のおよび小さい径の血管系に脈管障害および血栓が存在した。
さらに、検査した両時点で、全動物において赤色脾髄は若干膨張し、薄くなった(しかし、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAで処置した動物で余計そうであった)。
実施例の条件下で、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAは、24時間後に炎症性臨床病理学プロファイルと一貫した脾臓変化、細胞性細片/単細胞壊死、好中球浸潤物および好塩基球(初期の骨髄巨核球)ならびに肝臓での異常な血管内細胞をもたらした。これらの変化に加えて、それは、72時間後までに肺脈管障害ももたらした。
カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNA;反復投与によるin vivo薬物動態および効能試験
カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)のタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、改変された合成レプチンmRNAをマウスに送達するために反復静脈内(IV)注射を用いた。レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ob/obマウスでのin vivo効能が続いた。
カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)のタンパク質発現およびin vivo効能を判定するために、改変された合成レプチンmRNAをマウスに送達するために反復静脈内(IV)注射を用いた。レプチンmRNAの送達はレプチンタンパク質の発現を誘導し、その後ob/obマウスでのin vivo効能が続いた。
マウスは、上の実施例7に記載の通りに尾注射を受けた。
この実施例のin vivo試験は、独居房の16週齢雄ob/obマウスで実施した。マウスに、カチオン性リピドBにパッケージされ、この試験のために0.2mpkの用量で注射用食塩水に希釈された、HPLCで精製された改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)(N:Pモル比=4:1)を投与した。食塩水対照を用いた。
薬物動態。5匹の動物に、食塩水対照を投与した。5匹のマウスの1つの群に、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を0.2mpk(10μg)の用量で各々投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、5日間の各日に動物を計量し、選別した。食物を、同様に計量する。
0日目に、午前9時にマウスに投薬し、午後3時にレプチンのために尾ニックによって放血させた(15μlの血漿)。1、2、4、8、11、15および18日目に、午前9時に動物を計量し、レプチンのために尾ニックによって放血させる(15μlの血漿)。体重および食物摂取を記録する。3、7、10、14および17日目に、午前9時にマウスに投薬し、体重および食物摂取を記録する。9および21日目に、体重および食物摂取だけを記録した。
最初の投与の後に6、24および48時間の時点でレプチンタンパク質レベルを測定した。以降の投与の24時間後に、レプチンタンパク質レベルを測定した。表34の結果は、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの反復処置は、類似したレベルのレプチンタンパク質発現をもたらすことを実証する。
薬力学。6匹の動物に、食塩水対照を投与した。6匹のマウスの1つの群に、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を0.2mpk(10μg)の用量で各々投与した。群あたりの平均体重が同じであるように、マウスを計量し、選別した。
0、3および7日目に、午前9時にマウスに投薬し、体重および食物摂取を記録した。1、2、5、6および8〜21日目に、体重および食物摂取だけを記録した。
カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの反復処置は、持続した体重減少およびレプチンタンパク質発現をもたらす。ob/obマウスを、1、3および7日目に3回、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)で処置した。各投与の後、マウスは有意な量の体重減少を続けた。
レプチンタンパク質発現は、25ng/mLのままであった。最初の投与の後のレプチンタンパク質レベルは6、24および48時間の時点、以降のタンパク質レベルは最後の投与から24時間後である。
カニクイザルにおけるカチオン性リピドBでパッケージされたレプチンmRNAの薬物動態および薬力学
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドBでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、0.6mg/kgのHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態および薬力学(PD)を検討することである。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
この実施例の目的は、サルにおいて、カチオン性リピドBでパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、0.6mg/kgのHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の静脈内投与の後の、レプチンの薬物動態および薬力学(PD)を検討することである。血漿中のレプチンタンパク質レベル、血液化学および血漿または血清中の脂質レベルを全て調査した。
伏在静脈または大腿静脈で血液試料を収集してシリンジに入れた。表36は、試験計画を概説する。表37は、製剤特性を概説する。表38で概説される通りに、血液試料を収集した。表38に掲載される時点に基づいて、全血、血漿および血清を収集した。全血は、血液化学のために分析した。血清化学のために血清を収集し、レプチンELISAおよびリピド代謝のために血漿を収集した。3匹のサルに、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNAを静脈内に0.6mpkで投薬した。医薬品処置の6時間後に、95mg/mLのピークのレプチンタンパク質発現が観察されたが、レプチンタンパク質レベルは実施例1に記載のELISAアッセイによって測定した。これにより、げっ歯動物からカニクイザルへのレプチン発現の翻訳が確認された。実施例の条件下で、雄カニクイザルに0.6mg/kgで静脈内投与された、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)は、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、IL−1RAの増加もあった。サイトカイン変化の全ては、投薬の6時間後に最も著しく、24時間後にほとんど正常であった。臨床病理学変化は投薬の24時間後に顕著であったが、一部の変化は試験中ずっと持続した。
下記のように、カチオン性リピドBでパッケージされた改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)の0.6mg/kgでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示した。
血液学のための血液試料は、EDTA抗凝固剤の中に収集した。ADVIA2120(登録商標)アナライザーを用いて以下のパラメータを判定した:赤血球数、白血球数、ヘモグロビン、好中球数、ヘマトクリット、リンパ球数、平均血球体積、単球数、平均赤血球ヘモグロビン量、好酸球数、平均赤血球ヘモグロビン濃度、好塩基球数、網状赤血球数、大きな未染色細胞数および血小板数。
凝固試験のための血液試料は、凝血薬としてクエン酸三ナトリウムを含有するチューブに収集した。Stago STA−R機器を用いて以下のパラメータを判定した:プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間。
血液試料を心臓穿刺によって収集し、プレーンチューブに保存した。Cobas 6000アナライザーを用いて、以下のパラメータを判定した:アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST);総ビリルビン;アラニントランスアミナーゼ(ALT);総タンパク;アルカリ性ホスファターゼ;アルブミン;尿素;グロブリン;クレアチニン;クレアチンキナーゼ(CK);グルコース;アルブミン/グロブリン比;ナトリウム;リン;カリウム;コレステロール;塩化物;トリグリセリド;カルシウム;およびマグネシウム。
実施例20の表25に掲載した分析物の判定のために、Invitrogen Cytokine Monkey Magnetic 28−Plex Panel(キットカタログ番号:LPC0003M、Invitrogen Corporation、Carlsbad CA USA)を用いた。Bioplex 200(Bio−Rad Laboratories,Inc.、Hercules CA USA)を分析のために用い(ソフトウェアバージョン:Bio−Plex Manager(商標)5.0セキュリティ版、ビルド531)、データ処理を促進するためにMicrosoft Excel(登録商標)2010が用いられ、生データに含まれた。定量下限未満の値は、1:2の希釈比に基づいてLLOQとしてデータ表に入れた。
有意な血液学的変化は起こらなかった。表39で、臨床化学的変化を概説する。カチオン性リピドCでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの0.6mg/kgでの静脈内投与は、両時点で臨床化学的変化を引き起こし、投薬から24時間後の最小限の肝細胞変化(アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)、アラニントランスアミナーゼ(ALT)の増加、アルブミンの低下)および潜在的な筋肉変化(ASTおよびCKの増加)を反映していた。アルブミンの減少(下で詳述する炎症誘発性サイトカインの増加に加えて)によって、かすかな炎症性変化が示された。主に投薬後24時間のトリグリセリドの減少は、脂質代謝への影響、食物摂取の減少を反映していたかもしれず、または生物学的変動によるかもしれない。
投薬前の値と比較したときに、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAによる0.6mg/kgの用量での静脈内投薬の後に、サイトカインおよびケモカインの上昇が記された。分析物の投薬前の値がLLOQ未満であったならば、LLOQを用いて変化倍率を計算した。
大部分は投薬の6時間後に全3匹のサルで改変された合成レプチンmRNA関連の変化のいくつかが記され、これらの変化のほとんどは投薬の24時間後までに投薬前のレベルに復帰した。1匹のサルだけで上昇した少数の分析物もあった。これらの後者の変化と処置との関係は除外することができないが、その理由は、それらが投薬前の値を上回っていたからであり、および他のサイトカインが同じサルで増加していたからである。
投薬の6時間後に、血清中のIL1RAレベルの上昇が全3匹のサルで起こり、投薬の24時間後までにレベルは正常に戻った(上昇はおよそ2倍からおよそ11倍まで変動した)。血清中のIL6レベルは3匹のサルのうちの2匹で投薬の3時間後におよそ5倍上昇し、投薬6時間後に全てのサルでおよそ4倍から8倍までさらに上昇したが、24時間後までに投薬前の値に戻った。血清中のMCP−1レベルは3匹のサルのうちの2匹で投薬の1時間後におよそ1倍上昇し、レベルは投薬の3時間後に全ての動物で1倍から4倍上昇したが、投薬の6時間後にMCP−1レベルは3匹のサルのうちの2匹で14倍から30倍、1匹のサルでは4倍上昇し、上昇は投薬の24時間後に全てのサルで1倍から3倍のままであった。I−TACの血清中レベルは投薬の6時間後に全3匹の動物で4倍から37倍上昇し、投薬の24時間後にも上昇したままであった。表40は、最も一貫した上昇を示した4つの分析物の経時変化を概説する。
表40は、投薬前の値と比較したカチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変合成レプチンmRNAの雄カニクイザルへの投与と関連した血清中サイトカインおよびケモカインレベルの変化を示す。
実施例の条件下で、雄カニクイザルに0.6mg/kgで静脈内投与された、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAは、臨床病理パラメータならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加に基づくと炎症性変化をもたらした。追加の臨床病理学的変化は、肝臓および筋肉の変化を示唆した。抗炎症サイトカイン、IL−1RAの増加もあった。サイトカイン変化の全ては、投薬の6時間後に最も著しく、24時間後までにほとんど正常であった。臨床病理学的変化は投薬の24時間後に顕著であったが、一部の変化は試験中ずっと持続した。
レプチンは、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの増加を通してそれ自体免疫調節効果を有する(末梢血単核細胞でTNFα、IL−6およびIFNγならびにIL−1RAをin vitroで刺激する。Juge-Aubry CE and Meier CA (2002) Mol. Cell Endocrinol. 194(1-2): 1-7を参照されたい)。
結論として、カチオン性リピドBでパッケージされた本発明の改変された合成レプチンmRNAの0.6mg/kgでのカニクイザルへの静脈内単回投与は、良好な耐容性を示し、肝臓および筋肉の傷害を示唆する炎症性変化、大部分は最小限の変化をもたらした。
ob/obマウスへの皮下投与後のカチオン性リピドBにパッケージされたヒトレプチンmRNAの薬力学
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の特異的効果を実証することであった。レプチンタンパク質は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)によって送達され、mRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて皮下投与された。
この実施例の目的は、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼすレプチンタンパク質の特異的効果を実証することであった。レプチンタンパク質は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)によって送達され、mRNAはカチオン性リピドBにパッケージされて皮下投与された。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。マウスは、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)、または、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、翻訳不能になるように突然変異させられた、HPLCで精製された対照ヒトレプチンmRNA(配列番号16)を投与した。mRNAを、カチオン性リピドC(N:Pモル比=4:1)にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈した。実施例8に記載されるように、マウスに皮下注射した。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(B群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(C群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを2mpkの用量で投与した(D群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを6mpkの用量で投与した(E群)。5匹のマウスに、改変された合成翻訳不能レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(F群)。5匹のマウスに、改変された合成翻訳不能レプチンmRNAを2mpkの用量で投与した(G群)。5匹のマウスに、改変された合成レプチンmRNAを6mpkの用量で投与した(H群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4、5、6、7、10、14および24日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
表41は体重を表し、表42はこの実施例の食物摂取の結果を表す。レプチンmRNAの最低用量(0.2mg/kg)は、体重および食物摂取に関して効果的だった。体重および食物摂取に及ぼすレプチンmRNAの効果は、最高のkgあたり6mg用量まで用量依存的に増加した。kgにつき2mgの用量で、対照の翻訳不能レプチンmRNAにはマイナー効果しかなかった。翻訳不能なレプチンmRNAの効果は最も高いkgにつき6mg用量でより大きかったが、この効果は翻訳可能なレプチンmRNAの最も低い用量で見られたものよりなお低かった。これらの結果は、レプチン欠損マウスに皮下投与されたレプチンmRNAが食物摂取および体重を強力に低減し、この影響はヒトレプチンタンパク質の特異的発現に主によることを実証する。
ob/obマウスへの皮下投与後のカチオン性リピドCにパッケージされたヒトレプチンmRNAの薬力学
この実施例の目的は、カチオン性リピドCにパッケージされて皮下投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼす特異的効果を実証することであった。
この実施例の目的は、カチオン性リピドCにパッケージされて皮下投与された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)の、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルの体重および食物摂取に及ぼす特異的効果を実証することであった。
Jackson Labsからの8週齢雄レプチン欠損ob/obマウスを、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)、または、HPLCで精製された翻訳不能ヒトレプチンmRNA(配列番号21)を投与した。実施例35の製剤化プロセスに従って、mRNAをカチオン性リピドC(N:Pモル比=4:1)にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈した。実施例8に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。5匹のマウスの各群に、リン酸緩衝食塩水または1キログラムにつき0.6ミリグラム(mpk)の、カチオン性リピドCで製剤化した、レプチンmRNAもしくは翻訳不能レプチンmRNAを投与した。試験の初めに、それらの食物も計量した。1、2、3、4、5、6、7、10および15日目の午前9時00分に全てのマウスを計量し、それらの食物を計量した。
カチオン性リピドC中のレプチンmRNAの皮下投与の後の体重変化は、表43に詳述する。食物摂取は、表44に詳述する。カチオン性リピドCによる結果は、レプチンタンパク質発現をもたらすことができる0.6mpkレプチンmRNAの皮下投与は、ob/obマウスで体重および食物摂取を減少させることを実証する。対照的に、翻訳不能レプチンmRNAの0.6mpkの投与は、体重および食物摂取に最小限の影響しか及ぼさない。
レプチン欠損ob/obマウスへの皮下投与の後のカチオン性リピドCでパッケージされたレプチンmRNAの薬物動態
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)が、カチオン性リピドCにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
この実施例の目的は、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)が、カチオン性リピドCにパッケージされて遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与された後に、ヒトレプチンタンパク質の発現レベルを実証することであった。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、カチオン性リピドCにパッケージされ(N:Pモル比=4:1)、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)、または、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、翻訳不能になるように突然変異させられた、HPLCで精製された対照ヒトレプチンmRNA(配列番号21)を投与した。実施例8に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
4匹の動物に、PBSを投与した(A群)。4匹の動物に、改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(B群)。4匹の動物に、改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(C群)。4匹の動物に、改変された合成レプチンmRNAを2mpkの用量で投与した(D群)。4匹の動物に、改変された合成レプチンmRNAを6mpkの用量で投与した(E群)。4匹の動物に、改変された合成翻訳不能レプチンmRNAを6mpkの用量で投与した(F群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬6時間後)に、次に1および2日目の午前9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、ヒトレプチンまたはマウスエリスロポイエチンレベルを測定した。
表43は、実施例1のプロトコールによって測定された、この試験の血漿中ヒトレプチンレベルの結果を表す。
カチオン性リピドAの合成
中間体A1の調製:(6Z,9Z)−18−ブロモオクタデカ−6,9−ジエン。
中間体A1の調製:(6Z,9Z)−18−ブロモオクタデカ−6,9−ジエン。
撹拌棒を備えた500mL丸底フラスコ内で、リノレイルメシレート(50g、145mmol)をジエチルエーテル(200mL)に溶解した。臭化マグネシウムジエチルエーテル化合物(101g、392mmol)をゆっくり加えた。反応物は、室温で終夜撹拌した。分液漏斗中で、ブラインおよびエーテルを混合液に加えた。次に有機物をブラインで洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、圧の下で濃縮して粗生成混合物を得た。次に100%ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、45gの生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.26 - 5.46 (m, 4 H) 3.42 (t, J=6.90 Hz, 2 H) 2.78 (t, J=6.65 Hz, 2 H) 2.06 (q, J=6.78 Hz, 4 H) 1.86 (dt, J=14.43, 7.09 Hz, 2 H) 1.21 - 1.49 (m, 16 H) 0.82 - 0.95 (m, 3 H) ppm.
中間体A2の調製:(13Z,16Z)−1−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン−4−オール。
撹拌棒を備えた500mLの三つ口丸底フラスコ内で、Mg旋削(0.443g、18.22mmol)を計量し、ヒートガンで加熱しながら5分の間真空下に保った。5〜10分間、フラスコを真空下に放置した。次にフラスコをN2で充填し、セプタムで密封した。反応容器中にTHF(75mL)を速やかに注ぎ、続いてI2(0.039g、0.152mmol)および中間体A1(5g、15.18mmol)を注ぎ、還流凝縮器をフラスコに取り付けた。システム全体をN2で3回交換し、混合液を2時間加熱還流(90℃)した。次に、N2の下で透明な混合液を室温まで冷却させた。
第2の250mL丸底フラスコ内で、4−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ブタナール(2.76g、13.66mmol)をTHF(30mL)に溶解し、氷水浴で冷却させた。次に調製したリノレイルグリニャール試薬をシリンジによって10分間にわたってアルデヒドに滴下添加し、周囲温度で30分の間反応物を撹拌した。反応フラスコを氷浴で再び冷却させた。飽和NH4Cl(水性)溶液をゆっくり加えてpHを7に調整し、反応物を撹拌し、1時間かけて室温まで温めた。分液漏斗中で、ブラインおよび酢酸エチルを混合液に加えた。有機物を収集してブラインで洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成混合物を得た。次にヘプタン中の0〜20%酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、4.91gの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.26 - 5.46 (m, 4 H) 3.51 - 3.80 (m, 3 H) 2.71 - 2.84 (m, 2 H) 1.99 - 2.13 (m, 4 H) 1.56 - 1.75 (m, 4 H) 1.21 - 1.52 (m, 20 H) 0.82 - 0.98 (m, 12 H) 0.01 - 0.14 (m, 6 H) ppm.
中間体A3の調製:(13Z,16Z)−1−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン−4−イル(3−(ジメチルアミノ)プロピル)カーボネート。
撹拌棒を備えた500mL丸底フラスコ内で、4−ニトロフェニルクロロホルメート(3.49g、17.31mmol)をDCM(100mL)に溶解した。Py(1.4mL、17.31mmol)およびDMAP(397mg、3.25mmol)を加え、続いて中間体A2(4.9g、10.82mmol)を加え、混合液を終夜室温で撹拌した。3−ジメチルアミノ−1−プロパノール(6.7g、64.9mmol)を次に加え、混合液を次に密封チューブに移し、50℃で終夜加熱した。DCMを加えて、反応混合液を希釈した。飽和NaHCO3(水溶液)(50mL×4)を用いて、反応物を洗浄した。有機相をMgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。ヘプタン中の0〜60%酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、残渣を精製した。単離した材料をBond Elute NH2カラム(Agilent)に通して、4gの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.27 - 5.47 (m, 4 H) 4.62 - 4.79 (m, 1 H) 4.19 (t, J=6.40 Hz, 2 H) 3.61 (d, J=3.01 Hz, 2 H) 2.72 - 2.83 (m, 2 H) 2.42 - 2.59 (m, 2 H) 2.31 (br. s., 6 H) 2.05 (d, J=6.78 Hz, 4 H) 1.83 - 2.00 (m, 2 H) 1.47 - 1.74 (m, 6 H) 1.17 - 1.43 (m, 18 H) 0.80 - 0.97 (m, 12 H) -0.05 - 0.10 (m, 6 H) ppm.
中間体A4の調製:3−(ジメチルアミノ)プロピル((13Z,16Z)−1−ヒドロキシドコサ−13,16−ジエン−4−イル)カーボネート。
プラスチックチューブ内で、中間体A3(2g、3.44mmol)を20mLのTHFに溶解し、氷浴で冷却した。HF−Py(1.51mL、86mmol)を滴下添加した。次に混合液を周囲温度まで温め、1時間撹拌した。反応混合液を分液漏斗に移し、DCMで希釈した。反応混合液がバブリングを停止するまで、飽和NaHCO3(水溶液)をゆっくり加え、酢酸エチルで水性相を3回分離、抽出した。有機相を合わせ、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物質を、さらなる精製なしで用いた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.28 - 5.47 (m, 4 H) 4.67 - 4.80 (m, 1 H) 4.13 - 4.28 (m, 2 H) 3.66 (t, J=5.77 Hz, 2 H) 2.78 (t, J=6.53 Hz, 2 H) 2.44 - 2.65 (m, 2 H) 2.26 - 2.44 (m, 6 H) 2.01 - 2.14 (m, 4 H) 1.88 - 2.01 (m, 2 H) 1.50 - 1.80 (m, 6 H) 1.19 - 1.44 (m, 18 H) 0.80 - 0.97 (m, 3 H) ppm.
中間体A5の調製:(13Z,16Z)−4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエン酸。
アセトン(20mL)中の中間体A4(1.5g、3.21mmol)の溶液にジョーンズ試薬(1.6mL、3.2mmol、H2O中の2M溶液)を滴下添加により加え、反応混合液が5分間を超えてオレンジ色のままであるまで、氷水浴で冷却させた。それを次に30分間撹拌し、その後冷却浴を除去し、さらなる45分の間撹拌を継続した。iPrOH(1mL)を加え、混合液を濾過した。pHが6に調整されるまで、アセトンおよび5MのNaOH水溶液を加えた。混合液を、DCM中の5%MeOHで4回抽出した。合わせたDCM抽出物を減圧下で乾燥、濃縮し、288mgの生成物を得、それをさらなる精製なしで用いた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.25 - 5.48 (m, 4 H) 4.84 (dt, J=7.72, 3.80 Hz, 1 H) 4.38 (ddd, J=10.85, 6.84, 3.39 Hz, 1 H) 3.98 (ddd, J=11.04, 8.28, 3.01 Hz, 1 H) 2.99 - 3.10 (m, 1 H) 2.78 (t, J=6.53 Hz, 2 H) 2.62 - 2.74 (m, 2 H) 2.47 - 2.59 (m, 6 H) 2.24 - 2.42 (m, 2 H) 2.18 (br. s., 1 H) 1.89 - 2.11 (m, 6 H) 1.58 - 1.78 (m, 2 H) 1.47 - 1.58 (m, 1 H) 1.19 - 1.42 (m, 18 H) 0.89 (t, J=6.65 Hz, 3 H) ppm.
リピドAの合成:2−(((13Z,16Z)−4−(((3−(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ドコサ−13,16−ジエノイル)オキシ)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート。
丸底フラスコ内で、中間体A5(280mg、0.581mmol)、DMAP(28.4mg、0.233mmol)、EDC.HCl(223mg、1.163mmol)および2−ヒドロキシプロパン−1,3−ジイルジオクタノエート(300mg、0.872mmol)を、ジクロロメタン(5mL)にとった。DIPEA(0.2mL、1.163mmol)を滴下添加し、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間後に、反応物を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘプタン中の0%〜50%酢酸エチル)によって、残渣を精製した。画分を収集し、溶媒を減圧下で除去して、188mgの生成物を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=5.45 - 5.21 (m, 5H), 4.73 (d, J=4.3 Hz, 1H), 4.30 (dd, J=4.3, 11.8 Hz, 2H), 4.23 - 4.07 (m, 4H), 2.77 (t, J=6.3 Hz, 2H), 2.49 - 2.36 (m, 4H), 2.36 - 2.21 (m, 9H), 2.12 - 1.80 (m, 7H), 1.70 - 1.48 (m, 6H), 1.40 - 1.20 (m, 36H), 0.94 - 0.81 (m, 9H) ppm.
液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS m/z)=808.5(M+1)。
カチオン性リピドBの合成
中間体1aの調製:5−(ベンジルオキシ)ペンチルメタンスルホネート。
中間体1aの調製:5−(ベンジルオキシ)ペンチルメタンスルホネート。
磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、N2下の0℃において、DCM(75mL)中の5−ベンジルオキシ−1−ペンタノール(10.08g、51.9mmol)の溶液に、Et3N(10.79mL、78mmol)をシリンジで一度に加えた。次に、内部温度が15℃を超えないような速度で、MsCl(4.85mL、62.3mmol)を4回に分けてシリンジで滴下添加した。反応物を1時間撹拌し続けさせ、その後それをH2O(200mL)およびDCM(150mL)で希釈した。有機層を分離し、水性層をDCM(225mL)で洗浄した。合わせた有機層をブライン(200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して標記化合物を未精製のオレンジ色の油状物(14.46g、99%)として得た。
質量分析(「MS」)(m+1)=272.9。
中間体1bの調製:ジエチル2−(5−(ベンジルオキシ)ペンチル)マロネート。
N2雰囲気下の無水DMF(100mL)中のマロン酸ジエチルの冷たい0℃の溶液(7.5g、46.8mmol)に、60%NaH(2.23g、56.2mmol)を10分間にわたって少しずつ加えた。気体の発生が観察された。混合液を0℃で30分間撹拌し、次に、無水DMF(41mL)中の中間体1a(14.46g、51.5mmol)を10分間にわたって滴下添加し、続いてヨウ化テトラブチルアンモニウム(1.73g、4.68mmol)を加えた。次に、混合液を100℃で1.5時間加熱した。混合液を室温で冷却させ、終夜放置した。混合液を次に飽和NH4Cl(50mL)でクエンチし、H2O(100mL)で希釈した。混合液を、EtOAc(2×200mL)で抽出した。合わせた有機層をH2O(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過し、真空中で濃縮した。0〜30%EtOAc/ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製し、化合物を油状物(11.7g、74%)として得た。
(MS)(m+1)=336.6。
中間体1cの調製:2−(5−(ベンジルオキシ)ペンチル)プロパン−1,3−ジオール。
N2下の無水THF(20mL)中の中間体1bの冷たい0℃溶液(5.5g、16.35mmol)に、THF(24.52mL、49.0mmol)中の2.0MのLiAlH4を15分間にわたって滴下添加した。混合液を室温に温め、終夜撹拌した。混合液を0℃に冷却させ、THF(16.35mL、32.7mmol)中の2.0MのLiAlH4で再び処理し、室温に温め、週末の間撹拌した。反応物を0℃に冷却させ、10分間にわたるEtOAc(9.30mL)の滴下でクエンチした。次に、H2O(3.10mL)の滴下、15%NaOH溶液(3.10mL)の滴下、次に追加のH2O(9.30)の滴下で混合液を処理した。混合液を室温で30分の間撹拌した。セライトのパッドを通して、混合液を濾過した。セライトをEtOAcで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、標記化合物を半ワックス固体(1.52g、37%)として得た。
MS(m+1)=253.0。
中間体1dの調製:2−(5−(ベンジルオキシ)ペンチル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート。
磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、N2下の0℃において、DCM(20ml)中の中間体1c(1.51g、5.98mmol)の溶液に、ピリジン(1.21mL、14.96mmol)をシリンジで約30秒間にわたって滴下添加した。次に、塩化オクタノイル(2.145mL、12.57mmol)を数分間にわたってシリンジで滴下添加し、反応物を室温に温め、終夜撹拌した。混合液を飽和NH4Cl(100mL)およびCH2Cl2(100mL)で希釈した。有機物を分離した。水性相をCH2Cl2(100mL)で抽出した。合わせた有機物をMgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。0〜10%EtOAc/ヘプタンで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、標記化合物を無色油状物(2.88g、95%)として得た。
MS(m+1)=505.6。
中間体1eの調製:2−(5−ヒドロキシペンチル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート。
室温のMeOH(25ml)中の中間体1dの溶液(2.5g、4.95mmol)に、10%Pd/C、wet degussa型(264mg)を加えた。混合液を、H2バルーンの下で終夜撹拌した。粗反応混合液をセライトのパッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮して標記化合物を無色油状物(2.0g、97%)として得た。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ4.11 - 3.96 (m, 4H), 3.59 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.04 - 1.91 (m, 1H), 1.66 - 1.48 (m, 7H), 1.41 - 1.34 (m, 6H), 1.34 - 1.20 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ4.11 - 3.96 (m, 4H), 3.59 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.04 - 1.91 (m, 1H), 1.66 - 1.48 (m, 7H), 1.41 - 1.34 (m, 6H), 1.34 - 1.20 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
中間体1fの調製:7−(オクタノイルオキシ)−6−((オクタノイルオキシ)メチル)ヘプタン酸。
室温において、磁気撹拌棒を入れたバイアル中で、MeCN:H2O(46.84mL、1:1の比)中の中間体1e(2.0g、4.82mmol)に、TEMPO(0.151g、0.965mmol)を一度に加えた。次に、二酢酸ヨードベンゼン(3.42g、10.61mmol)を一度に加え、反応物を室温で終夜撹拌し続けさせ、その後、15%水性チオ硫酸ナトリウム(50mL)で反応をクエンチした。反応物をH2Oで希釈し、EtOAc(3×100mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して薄黄色油状物を得た。油状物をトルエン(15mL)に溶解し、減圧下で濃縮して(×6)薄黄色油状物を得、それをDCMに溶解し、減圧下で濃縮して(×3)標記化合物(さらに、残留トルエンまたはヨードベンゼンのいずれかに相当するかもしれないマイナーな芳香族不純物)を薄黄色油状物(2.0g、97%)として得た。
MS(m−1)=427.2。
中間体1gの調製:3−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)プロパナール。
撹拌棒を備えた1L丸底フラスコ内で、tertブチルジメチルシリルオキシプロパノール(20g、105mmol)をDCM(500mL)に溶解した。Et3N(43.9mL、315mmol)を加えた。撹拌棒を備えた第2の500mLフラスコ内で、SO3.Py(25.08g、158mmol)をDMSO(100mL、1409mmol)に溶解した。生じた溶液を、0℃(氷水浴中の)のアルコール溶液に滴下添加した。週末にわたって、室温に温まる間、反応物を撹拌した。分液漏斗中で、水およびDCMを混合液に加えた。次に有機物を水で洗浄し、DCMで抽出し、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮(冷)して粗生成混合物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(330gカラム、100%DCM)による精製により、標記化合物(17.7g、89%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 9.81 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.61 (td, J = 6.0, 2.3 Hz, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 9.81 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 3.99 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.61 (td, J = 6.0, 2.3 Hz, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
中間体1hの調製:1−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンタデカン−3−オール。
500mL丸底フラスコ内で、中間体1g(17.7g、94mmol)をTHF(100mL)に溶解し、氷水浴で0℃に冷却した。ジエチルエーテル中に1Mのドデシル臭化マグネシウム(132mL、132mmol)をピペットで10分間にわたってアルデヒドに滴下添加し、氷浴を除去し、室温で30分の間反応物を撹拌した。反応フラスコを氷浴で再び0℃に冷却した。飽和NH4Cl溶液をゆっくり加えて(600mL)pHを約7に調整し、混合液を1L分液漏斗に注いだ。次に有機物を飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄し、EtOAcで抽出し、MgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成混合物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(330gカラム、2カラム体積のために100%ヘプタン、1カラム体積のために0%〜2%EtOAc/ヘプタン、3カラム体積のために2%EtOAc/ヘプタン、1カラム体積のために2%〜5%EtOAc/ヘプタン、次に10カラム体積のために5%EtOAc/ヘプタン)による精製により、標記化合物(24.9g、74%)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.97 - 3.87 (m, 1H), 3.87 - 3.77 (m, 2H), 1.69 - 1.60 (m, 2H), 1.57 - 1.36 (m, 3H), 1.36 - 1.19 (br, 19H), 0.93 - 0.84 (m, 12H), 0.09 (s, 6H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.97 - 3.87 (m, 1H), 3.87 - 3.77 (m, 2H), 1.69 - 1.60 (m, 2H), 1.57 - 1.36 (m, 3H), 1.36 - 1.19 (br, 19H), 0.93 - 0.84 (m, 12H), 0.09 (s, 6H).
中間体1iの調製:1−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンタデカン−3−イル(4−ニトロフェニル)カーボネート。
室温において、磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、DCM(28mL)中の中間体1h(2.9660g、8.27mmol)の溶液に、4−ニトロフェニルカルボノクロリデート(2.084g、9.92mmol)を一度に加えた。反応物にセプタムを取り付けてN2の下に置き、その後、ピリジン(1.003mL、12.40mmol)を数分間にわたってシリンジで滴下添加した。反応物を、室温で終夜撹拌させた。24時間の反応時間の後、反応物をH2O(100mL)およびDCM(125mL)で希釈した。有機層を分離し、水性層をDCM(125mL)で洗浄した。合わせた有機層をブライン(100mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオフホワイトの残渣を得た。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(80gカラム、液体投入、0〜2.5%EtOAc:ヘプタン)で精製して、3.144g(73%)の標記化合物(さらに、マイナーな未確認不純物のピーク)を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ8.29 - 8.24 (m, 2H), 7.41 - 7.35 (m, 2H), 5.03 - 4.95 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 6.6, 5.7 Hz, 2H), 1.95 - 1.80 (m, 2H), 1.80 - 1.63 (m, 2H), 1.45 - 1.19 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 12H), 0.06 (s, 6H).
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ8.29 - 8.24 (m, 2H), 7.41 - 7.35 (m, 2H), 5.03 - 4.95 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 6.6, 5.7 Hz, 2H), 1.95 - 1.80 (m, 2H), 1.80 - 1.63 (m, 2H), 1.45 - 1.19 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 12H), 0.06 (s, 6H).
中間体1jの調製:1−((tert−ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンタデカン−3−イル(3−(ジエチルアミノ)プロピル)カーボネート。
N2の下で、磁気撹拌棒を入れた丸底フラスコ内で、DCM(40mL)中の中間体1i(2.9153g、5.57mmol)に、3−(ジエチルアミノ)プロパン−1−オール(3.48mL、22.26mmol)を数分間にわたってシリンジで滴下添加した。次に、ピリジン(2.251mL、27.8mmol)を約30秒間にわたってシリンジで滴下添加し、続いてDMAP(0.136g、1.113mmol)を一度に加えた。反応物を、室温で終夜撹拌し続けさせた。22時間の反応時間の後、反応物をH2O(200mL)およびDCM(200mL)で希釈した。有機層を分離し、水性層をDCM(200mL)で洗浄した。合わせた有機層をブライン(100mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して黄色−オレンジ色の粗油状物を得、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(120gカラム、液体投入(DCM中)、0〜8%MeOH:DCM)によって精製して黄色の油状物を得た。黄色の油状物はbond elut NH2カラム(10g)を通して、DCMで溶出した。濾液を減圧下で濃縮して、薄黄色の油状物を得た。bond elut手順を再び繰り返して、標記化合物を無色油状物(2.0887g、73%)として得た。
MS(m+1)=516.4。
中間体1kの調製:3−(ジエチルアミノ)プロピル(1−ヒドロキシペンタデカン−3−イル)カーボネート。
室温のMeOH(50mL)中の中間体1jの溶液(2.2g、4.26mmol)に、CAN(5.14g、9.38mmol)を一度に加えた。混合液を室温で撹拌し、その後TLC(70%EtOAc/ヘプタン、KMnO4染色)が続いた。出発材料の消費が観察された後、混合液をCH2Cl2(100mL)で希釈し、飽和NaHCO3(2×100mL)で洗浄した。水性層をCH2Cl2(100mL)で抽出した。合わせた有機物をNa2SO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して標記化合物(多少のマイナーな不純物と一緒に)を油状物として得た。
MS(m+1)=402.2。
最終化合物、カチオン性リピドBの調製:2−(10−ドデシル−3−エチル−8,14−ジオキソ−7,9,13−トリオキサ−3−アザオクタデカン−18−イル)プロパン−1,3−ジイルジオクタノエート。
丸底フラスコ内で、中間体1f(1.99g、4.66mmol)、DMAP(0.207g、1.693mmol)、DIPEA(1.48mL、8.47mmol)および中間体1k(1.7g、13.07mmol)を、ジクロロメタン(20mL)にとった。EDC.HCl(1.62g、8.47mmol)を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間の後、反応物を減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2に0%〜5%のMeOH)によって、残渣を精製した。画分を収集し、溶媒を減圧下で除去して、黄色の油状物(3.8g)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0〜75%EtOAc/ヘプタン)によって油状物を精製し、標記化合物をオフホワイトの油状物(2.6g、71.8%)として得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ= 4.80 (t, J=6.1 Hz, 1H), 4.25 - 3.96 (m, 8H), 2.62 (br. s., 4H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 6H), 2.05 - 1.85 (m, 5H), 1.71 - 1.53 (m, 8H), 1.43 - 1.21 (m, 42H), 1.21 - 0.98 (m, 6H), 0.96 - 0.79 (m, 9H). 13C NMR (101MHz, CDCl3) δ= 174.15 (s, 2C), 173.71, 155.20, 75.90, 66.41, 64.14 (s, 2C), 60.85, 49.32, 47.10 (s, 2C), 37.46, 34.56 (s, 3C), 34.52, 34.29, 33.28, 32.22, 31.97 (s, 2C), 29.95 (s, 2C), 29.88, 29.80, 29.76, 29.66, 29.41 (s, 2C), 29.23 (s, 2C), 28.20, 26.64, 25.36, 25.25 (s, 4C), 23.00, 22.90 (s, 2C), 14.44, 14.38 (s, 2C), 11.37 (s, 2C).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ= 4.80 (t, J=6.1 Hz, 1H), 4.25 - 3.96 (m, 8H), 2.62 (br. s., 4H), 2.30 (t, J=7.5 Hz, 6H), 2.05 - 1.85 (m, 5H), 1.71 - 1.53 (m, 8H), 1.43 - 1.21 (m, 42H), 1.21 - 0.98 (m, 6H), 0.96 - 0.79 (m, 9H). 13C NMR (101MHz, CDCl3) δ= 174.15 (s, 2C), 173.71, 155.20, 75.90, 66.41, 64.14 (s, 2C), 60.85, 49.32, 47.10 (s, 2C), 37.46, 34.56 (s, 3C), 34.52, 34.29, 33.28, 32.22, 31.97 (s, 2C), 29.95 (s, 2C), 29.88, 29.80, 29.76, 29.66, 29.41 (s, 2C), 29.23 (s, 2C), 28.20, 26.64, 25.36, 25.25 (s, 4C), 23.00, 22.90 (s, 2C), 14.44, 14.38 (s, 2C), 11.37 (s, 2C).
カチオン性リピドCの合成
中間体1aの調製:(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート)
中間体1aの調製:(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート)
丸底フラスコ内で、リノール酸(95.0g、339mmol)、DMAP(4.14g、33.90mmol)、DIPEA(74.1mL、424mmol)および2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール(18.0g、170mmol)を、ジクロロメタン(435ml)にとった。EDC(81.0g、424mmol)を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間後に、乾燥投入のためにシリカゲル粉末により反応物を減圧下で濃縮し、溶離剤として酢酸エチル/ヘプタン(0%〜40%)を用いてシリカゲル(Biotage)で残渣を精製し、47g(44%収率)の所望の生成物を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.19-5.50 (m, 8H), 4.19 (tt, J = 11.83, 5.87 Hz, 4H), 3.51-3.69 (m, 2H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.53 Hz, 4H), 2.20 (五重線, J = 5.83 Hz, 2H), 2.06 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.49-1.72 (m, 5H), 1.20-1.46 (m, 26H), 0.79-0.98 (m, 6H) ppm.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.19-5.50 (m, 8H), 4.19 (tt, J = 11.83, 5.87 Hz, 4H), 3.51-3.69 (m, 2H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.53 Hz, 4H), 2.20 (五重線, J = 5.83 Hz, 2H), 2.06 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.49-1.72 (m, 5H), 1.20-1.46 (m, 26H), 0.79-0.98 (m, 6H) ppm.
最終化合物、カチオン性リピドCの調製:(9Z,9’Z,12Z,12’Z)−2−(((1,3−ジメチルピロリジン−3−カルボニル)オキシ)メチル)プロパン−1,3−ジイルビス(オクタデカ−9,12−ジエノエート)。
丸底フラスコ内で、中間体1a(15.0g、23.77mmol)、DMAP(0.581g、4.75mmol)、DIPEA(8.30mL、47.5mmol)および1,3−ジメチルピロリジン−3−カルボン酸(5.11g、35.7mmol)を、ジクロロメタン(78mL)にとった。EDC(9.11mg、47.5mmol)を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間後に、乾燥投入のために乾燥シリカゲルにより反応物を減圧下で濃縮し、溶離剤として酢酸エチル/ヘプタン(0%〜80%)を用いてシリカゲル(Biotage)で残渣を精製し、15g(82%収率)の所望の生成物を無色油状物として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.26-5.47 (m, 8H), 4.08-4.21 (m, 6H), 2.97 (d, J = 9.29 Hz, 1H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.56-2.69 (m, 2H), 2.24-2.49 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.54-1.76 (m, 5H), 1.22-1.42 (m, 31H), 0.89 (t, J = 6.78 Hz, 6H) ppm.MS(m+1)=756.7。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.26-5.47 (m, 8H), 4.08-4.21 (m, 6H), 2.97 (d, J = 9.29 Hz, 1H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 4H), 2.56-2.69 (m, 2H), 2.24-2.49 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.78 Hz, 8H), 1.54-1.76 (m, 5H), 1.22-1.42 (m, 31H), 0.89 (t, J = 6.78 Hz, 6H) ppm.MS(m+1)=756.7。
カチオン性リピドDの合成
中間体13aの調製:4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタンニトリル。
中間体13aの調製:4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタンニトリル。
4,4−ジエトキシブタンニトリル(15g、95mmol)とオクタノール(37.3g、286mmol)の混合液に、ピリジニウムp−トルエンスルホネート(1.2g、4.77mmol)を加え、混合液を105℃に加熱した。72時間後に、反応混合液を冷却し、溶離剤として酢酸エチル/ヘプタンを用いてシリカゲルで精製して、9.34gの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.56 (t, J = 5.40 Hz, 1H), 3.61 (dt, J = 9.16, 6.59 Hz, 2H), 3.44 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.28 Hz, 2H), 1.95 (td, J = 7.34, 5.40 Hz, 2H), 1.50-1.66 (m, 4H), 1.17-1.44 (m, 20H), 0.80-0.95 (m, 6H) ppm.
中間体13bの調製:4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタン酸
高圧反応容器内で、中間体13a(9.34g、28.7mmol)を30mLのEtOHに溶解する。KOH(4.83g)を30mLの水に溶解し、KOH溶液をEtOH溶液に加えた。チューブを密封して、終夜110℃に加熱した。混合液を冷却し、EtOAcで希釈した。1N HClを加えてpH5に調整し、水性相をEtOAcで2回抽出した。合わせた有機抽出物をMgSO4で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して10.9gの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.46 (t, J = 5.52 Hz, 1H), 3.46-3.59 (m, 2H), 3.08-3.46 (m, 3H), 2.18 (t, J = 7.28 Hz, 2H), 1.72-1.89 (m, 2H), 1.46-1.63 (m, 4H), 1.28 (d, J = 3.76 Hz, 20H), 0.79-0.96 (m, 6H) ppm.
中間体13cの調製:(9Z,12Z)−3−ヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート。
丸底フラスコ内で、リノール酸(23.78g、85mmol)、DMAP(2.072g、16.96mmol)、DIPEA(22.22mL、127mmol)および2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール(9g、85mmol)を、ジクロロメタン(200mL)にとった。EDC(24.39g、127mmol)を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間の後、反応物を減圧下で濃縮し、酢酸エチル/ヘプタンを溶離剤とするシリカゲルで濃縮液を精製して、12.4gの予想生成物を得る。9.5gの中間体1aも単離された。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 4.27 (d, J = 6.27 Hz, 2H), 3.77 (qd, J = 11.25, 5.14 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 6.40 Hz, 2H), 2.23-2.48 (m, 4H), 1.90-2.15 (m, 6H), 1.53-1.76 (m, 3H), 1.15-1.45 (m, 14H), 0.77-0.98 (m, 3H) ppm.
中間体13dの調製:(9Z,12Z)−3−((4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)−2−(ヒドロキシメチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート
丸底フラスコ内で、中間体13c(10.9g、31.6mmol)、DMAP(773mg、6.33mmol)、DIPEA(11.05mL、63.3mmol)および中間体13b(13.99g、38mmol)を、ジクロロメタン(100mL)にとった。EDC(12.13g、63.3mmol)を一度に加え、反応物を周囲温度で撹拌した。24時間の後、反応物を減圧下で濃縮した。0〜20%EtOAc/ヘプタンを溶離剤とするシリカゲルで濃縮液を精製して、11.2gの予想生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 5.27-5.45 (m, 4H), 4.50 (t, J = 5.52 Hz, 1H), 4.08-4.25 (m, 4H), 3.50-3.69 (m, 4H), 3.41 (dt, J = 9.22, 6.68 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.53 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.53 Hz, 2H), 2.33 (t, J = 7.53 Hz, 2H), 2.13-2.29 (m, 2H), 2.00-2.13 (m, 4H), 1.88-2.00 (m, 2H), 1.49-1.69 (m, 7H), 1.20-1.44 (m, 32H), 0.83-0.95 (m, 9H) ppm.
最終化合物、カチオン性リピドDの調製:(9Z,12Z)−3−((4,4−ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)−2−(((((1−エチルピペリジン−3−イル)メトキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ−9,12−ジエノエート。
異なるレプチンmRNA配列からのレプチンタンパク質の発現
この実施例の目的は、レプチンタンパク質発現の効率に及ぼすレプチンmRNAヌクレオチド配列の影響を実証することであった。
この実施例の目的は、レプチンタンパク質発現の効率に及ぼすレプチンmRNAヌクレオチド配列の影響を実証することであった。
実施例で用いたレプチンmRNA構築物の各々は、異なるヒトレプチンコード領域配列を含有した。配列番号4、配列番号6および配列番号8のヒトレプチンmRNAは、コドン最適化配列(それぞれ、配列番号17、配列番号18および配列番号19)を含有した。配列番号10のヒトレプチンmRNAは、天然のヒトコード配列(配列番号20)を含有する。これらの4つのヒトレプチンコドン配列のヌクレオチド配列は相同配列であり、互いと78%〜91%同一である。
レプチンmRNAは、実施例2のように転写された。5%CO2の加湿雰囲気の37℃のインキュベーター内で、10%ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地でHepG2/C3a細胞を増殖させた。1.5マイクログラムのレプチンmRNAをLipofectamine 2000(Life Technologies)と複合体化させ、製造業者のプロトコールに従ってHepG2/C3a細胞にトランスフェクトさせた。
細胞を24時間インキュベートし、ならし培地を除去した。細胞をリン酸緩衝食塩水で一度洗浄し、10%ウシ胎児血清を含む新鮮なダルベッコの改変イーグル培地を細胞に加えた。細胞をさらに24時間インキュベートし、ならし培地をその後除去した。
ならし培地中のレプチンタンパク質レベルを、実施例1に記載の通りに測定した。表46に結果を示す。配列番号4のレプチンmRNAは、レプチンタンパク質の最高の発現を裏づけた。
カチオン性リピドCにパッケージされたレプチンmRNA;皮下送達された異なる製剤のin vivo薬物動態試験
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドCにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンmRNA(配列番号4)の皮下送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドCにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンmRNA(配列番号4)の皮下送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。
実施例2に記載の通りにレプチンmRNAを合成し、実施例5の通りにカチオン性リピドナノ粒子に封入したが、ただし、カチオン性リピドCと、中性脂質(DSPC)、コレステロールおよびリピド化PEGとの比が表47の通り異なっていた。
9週齢雄C57BI/6マウス(群につきn=4)に、実施例8のように脂質ナノ粒子中のレプチンmRNAを皮下投与した。0日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。午前9時にマウスに投薬し、6時間後に採血した。体重および食物摂取も記録した。
実施例1のプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。異なる製剤化条件下のカチオン性リピドC中のレプチンmRNAの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルを、表47に詳述する。
したがって、より高い血漿中ヒトレプチンタンパク質レベルから証明される通り、この実施例の手順による痩せたマウスへのヒトレプチンmRNAの皮下送達は、皮下投与の後にmRNA送達の効力を増強することができる。
カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCにパッケージされたレプチンmRNA、静脈内反復送達のin vivo薬物動態試験
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドCにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンmRNA(配列番号4)の静脈内送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。実施例2に記載の通りにレプチンmRNAを合成し、実施例5の通りにカチオン性脂質ナノ粒子に封入した。
異なる脂質製剤を用いてカチオン性リピドCにパッケージされた、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、ヒトレプチンmRNA(配列番号4)の静脈内送達後に、レプチンタンパク質の発現が誘導された。実施例2に記載の通りにレプチンmRNAを合成し、実施例5の通りにカチオン性脂質ナノ粒子に封入した。
15週齢雌129Svマウス(群につきn=4)に、実施例8のように脂質ナノ粒子中のレプチンmRNAを静脈内投与した。0日目に、動物を計量し、平均体重によって選別した。表48に示す日の午前9時にマウスに投薬し、6時間後に採血した。体重も記録した。
実施例1のプロトコールに従って、ヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドC中のレプチンmRNAの各静脈内投与の後のレプチンタンパク質レベルを、表48に詳述する。
この実施例の手順による129SvマウスへのヒトレプチンmRNAの反復静脈内送達は、mRNA送達の6時間後にほとんど再現性レベルの血漿中レプチンタンパク質をもたらす。カチオン性リピドBの場合、反復投与マウス群がそれらの17日目の投与を受けたのと同時の、マウスのさらなる群へのレプチンmRNAの単一の2mg/kg用量の投与は、252,622pg/mLの血漿中レプチンタンパク質レベルをもたらした。これは、カチオン性リピドB中のレプチンmRNAの反復投与の後の血漿中レプチンタンパク質レベルの変動が、単一投与の正常な変動の範囲内であることを示す。試験期間中にマウス群の間に体重の一貫した差はなく、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドC中のレプチンmRNAの反復投与が一般に耐容性であったことを示す。
改善プロセスA
改善プロセスAによる脂質ナノ粒子へのmRNAの封入。以下の改善は、0.3mgのmRNAの封入操作のための、最高0.4mg/mLの濃度での、0.75ml容量の脂質および0.75ml容量のmRNAを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか40μgのmRNAまで規模を縮小することができる。撹拌プレートの上で撹拌棒入りの回収容器内でクエン酸緩衝液と混合することによって、50%エタノール中の初期mRNA脂質ナノ粒子を直ちに希釈する。
改善プロセスAによる脂質ナノ粒子へのmRNAの封入。以下の改善は、0.3mgのmRNAの封入操作のための、最高0.4mg/mLの濃度での、0.75ml容量の脂質および0.75ml容量のmRNAを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか40μgのmRNAまで規模を縮小することができる。撹拌プレートの上で撹拌棒入りの回収容器内でクエン酸緩衝液と混合することによって、50%エタノール中の初期mRNA脂質ナノ粒子を直ちに希釈する。
任意選択で、装置および使い捨て式備品は、RNアーゼ活性がないことを製造業者が証明してもよく、またはRNaseZap試薬の使用によってRNアーゼフリーにされてもよい。
本発明の改変された合成レプチンmRNAは、pH6.0であってもよいが、所望によりpH5.6まで多少下げてもよいクエン酸緩衝液で調製される。
エタノールでの脂質混合液の調製。以下は、4:1のカチオン性脂質アミン対mRNAリン酸塩(N:P)のモル比で封入されたmRNAの一例である。脂質(カチオン性脂質、DSPC、コレステロールおよびリピド化PEG)を別々に計量し、エタノール中の10mg/mL保存溶液(5mg/mLの濃度で調製されるポリエチレングリコール(PEG)を除いて)として調製する。これらの保存溶液は、脂質混合液を調製するために用いる。モル比は、それぞれ40:10:48:2である。例えば、エタノール中の1.5mL容量の脂質のための全ての構成成分の量および最終濃度が表50にある。1.5mL容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の2倍に相当する。混合液をシンチレーションバイアルで調製し、使用時まで37℃に維持する。
クエン酸緩衝液でのmRNAの調製。クエン酸緩衝液のpHがpH6.0であることを先ず確認する。そうでないならば、進行する前にpHを調整する。
封入のための水中の十分なmRNAを−80℃保存から解凍し、Amicon Ultra−15遠心濃縮器の使用によって水からクエン酸緩衝液pH6.0に交換する。10〜12mgのmRNAを各濃縮器に投入することができ、それは4℃で4,000rpmで8分の間遠心分離される。クエン酸緩衝液pH6.0の添加によって、容量を増加させる。所望の緩衝条件を達成するために、クエン酸緩衝液pH6.0による≧10容量の交換が推奨される。UV分光計で260nmの光学濃度によって、mRNAの濃度を測定する。水洗したシンチレーションバイアル内で、mRNAの最終濃度を0.825mLのクエン酸緩衝液で0.4mg/mLに調整し、使用時まで室温に保つ。0.825mL容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の1.1倍に相当する。
脂質ナノ粒子へのmRNAの封入。投入および排出ラインを有するT字型接合部を、図6に示すように準備する。滅菌1mLシリンジに、等量(0.75mL)のエタノール中の脂質(シリンジ(a))、クエン酸緩衝液中のmRNA(シリンジ(b))およびクエン酸緩衝液だけ(シリンジ(c))を詰める。脂質およびmRNAをそれぞれ含有するシリンジ(a)および(b)のLuerフィッティングからつながるチュービングをT字型接合部に取り付け、クエン酸緩衝液だけを含有するシリンジ(c)のLuerフィッティングからつながるチュービングを、活性撹拌プレートの上の撹拌棒入りの回収容器の上のT字型接合部を出るチュービングと対にする。シリンジをシリンジポンプの上に設置する。シリンジポンプを、適当なシリンジ(例えば、Becton Dickinson、Plastipak、1mL)および1分につき1mLの流量にセットする。
こうして脂質ナノ粒子に封入されたmRNAを、透析チュービング(例えば、スネークスキン10kDa分子量カットオフ、Thermo Scientific)に直ちに移す。4℃で終夜、RNアーゼおよび発熱物質フリーの1×リン酸緩衝食塩水に対して材料を透析する。mRNA脂質ナノ粒子を取り出し、滅菌チューブに入れ、分析まで4℃で保存する。
改善プロセスAに関する追加の情報については、実施例5を参照されたい。
改善プロセスB
改善プロセスBによる脂質ナノ粒子へのmRNA封入。以下の改善は、最高0.5mg/mLの濃度の、または30mgのmRNAの封入操作のための、60ml容量の脂質および60ml容量のmRNAを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか2mgのmRNAまで規模を縮小することができる。
改善プロセスBによる脂質ナノ粒子へのmRNA封入。以下の改善は、最高0.5mg/mLの濃度の、または30mgのmRNAの封入操作のための、60ml容量の脂質および60ml容量のmRNAを用いた封入プロセスのための方法である。このプロセスは、わずか2mgのmRNAまで規模を縮小することができる。
改善プロセスAと対照的に、改善プロセスBにおいては、容器への回収の前に第2のT字型接合部でクエン酸緩衝液と混合することによって、50%エタノール中の初期mRNA脂質ナノ粒子を直ちに希釈する。生じたmRNA脂質ナノ粒子懸濁液は、次に別のT字型接合部を通してクエン酸緩衝液と混合することによってもう一度希釈する。プロセスBは、mRNA脂質ナノ粒子の濃縮のための接線流濾過法(TFF)および透析の代わりのTFFユニットでの緩衝液交換の使用も含む。任意選択で、TFFカートリッジ(例えば、Vivaflow 50)を先ず発熱物質フリーにしてもよい。
エタノールでの脂質混合物の調製。以下は、4:1のカチオン性脂質アミン対mRNAリン酸塩(N:P)のモル比で封入されたmRNAの例である。脂質(カチオン性脂質、DSPC、コレステロールおよびリピド化PEG)を、エタノールに溶解する。モル比は、それぞれ40:10:48:2である。表51は、エタノール中の63ml容量の脂質のための全ての構成成分の量および最終濃度を示す。63mL容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の1.05倍に相当する。混合液を計量し、滅菌ポリエチレンテレフタレートグリコール改変(PETG)125mLボトルに入れ、エタノールを加える。混合液を短時間超音波処理し、次に5分の間静かにかき混ぜ、次に使用時まで37℃に維持する。
クエン酸緩衝液でのmRNAの調製。クエン酸緩衝液のpHがpH6.0であることを先ず確認する。そうでないならば、進行する前にpHを調整する。封入のための水中の十分なmRNAを−80℃保存から解凍し、Amicon Ultra−15遠心濃縮器の使用によって水からクエン酸緩衝液pH6.0に交換する。10〜12mgのmRNAを各濃縮器に投入することができ、それは4℃で4,000rpmで5分の間遠心分離される。クエン酸緩衝液pH6.0の添加によって、容量を増加させる。所望の緩衝条件を達成するために、クエン酸緩衝液pH6.0による≧10容量の交換が推奨される。UV分光計で260nmの光学濃度によって、mRNAの濃度を測定する。滅菌125mL PETGボトル内で、mRNAの最終濃度を63mLのクエン酸緩衝液で0.5mg/mLに調整し、使用時まで室温に保つ。63mL容量は、目標容量がシリンジへの投入のために利用可能であることを確実にするのに必要な容量の1.05倍に相当する。
脂質ナノ粒子へのmRNAの封入。投入および排出ラインを有するT字型接合部を、図7Aに示すように準備する。滅菌60mLシリンジに、等量(60ml)のエタノール中の脂質(シリンジ(a))、クエン酸緩衝液中のmRNA(シリンジ(b))およびクエン酸緩衝液だけ(シリンジ(c))を詰める。脂質およびmRNAをそれぞれ含有するシリンジ(a)および(b)のLuerフィッティングからつながるチュービングをT字型接合部に取り付け、シリンジポンプAに設置する。図7Bを参照されたい。mRNA脂質ナノ粒子のインライン希釈を可能にするために、クエン酸緩衝液だけを含有するシリンジ(c)のLuerフィッティングからつながるチュービングを、第2のT字型接合部に取り付け、シリンジ(c)をシリンジポンプBに設置する。第2のT字型接合部からの排出ラインを、希釈されたmRNA脂質ナノ粒子の回収のための滅菌250mL PETGボトルの上に配置する。全てのフィッティングは、シリンジとタイトである。シリンジポンプを、適当なシリンジ製造業者およびサイズ(BD、Plastipak、60ml)ならびに1分につき40mlまでの流量にセットする。両方のポンプを同時に開始し、およそ0.5秒後に材料回収を開始する。およそ160〜170mlのmRNA脂質ナノ粒子を回収することができる。
135mLのmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を吸引するために、140mLシリンジを用いることができる。残りの35〜45mLを60mLシリンジに移す。同量のクエン酸緩衝液で、140mLおよび60mLシリンジを準備する。mRNA脂質ナノ粒子懸濁液の別の希釈のために、図7Cに示す通りに別のT字型接合部をセットする。この希釈ステップは、ただ1つのシリンジポンプの上の両方のシリンジで実行する。140mLシリンジ(1つは脂質ナノ粒子を含有し、他はクエン酸緩衝液を含有する)を先に実行し、2番目に60mLシリンジを実行する。全てのフィッティングは、シリンジとタイトである。最初の実行のために、シリンジポンプの上で設定を正しいサイズおよび製造業者(140mL、Sherwood−monoject)に変更する。流量は、1分につき25mlに設定する。希釈したmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を、滅菌500ml PETGボトルに回収する。第2の実行のために、シリンジポンプの上で設定を正しいサイズおよび製造業者(60ml、BD Plastipak)に変更する。流量は、1分につき25mlに設定する。希釈したmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を、同じ滅菌500mL PETGボトルに回収する。最終容量は、およそ370〜380mLである。
接線流濾過によるmRNA脂質ナノ粒子の透析および濃縮。封入操作での15mgのmRNAのために、Vivaflow 50カートリッジを用いることができる。30mgのmRNAの封入操作のために、2つのVivaflow 50カートリッジを直列に取り付けることができる。任意選択で、再生セルロースカートリッジを先ず発熱物質フリーにすることができる。任意選択で、この手順は、封入前日に開始することができる。
Minimate TFFシステムを用いて、2つのVivaflow 50カートリッジを直列にセットし、チュービングを取り付ける。500mLの発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水をレザバーに詰め、20psiの圧でカートリッジに流す。100mLの0.1M NaOH/1.0M NaClをレザバーに詰め、50mLをカートリッジに流す。残りの50mLは、カートリッジ内に終夜静置する。翌朝、残りの50mLを20psiでカートリッジに流す。さらなる発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水をレザバーに詰め、50mLをカートリッジに流す。この水洗をさらに2回繰り返す。それが検出可能な量未満であることを確実にするために、最後の水洗のアリコートをエンドトキシンについて試験する。
Minimate TFFレザバーにmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を詰める。20〜25psiの全体圧を維持しながら、混合液を濃縮する。濾液は1分につきおよそ4mlで溶出を開始するかもしれないが、その後遅くなるかもしれない。レザバー中の液位が40mlの目盛にくるまで濃縮する。濃縮したmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を、300mlの発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの1×PBSに対して限外濾過する。20〜25psiの圧を保つ。限外濾過の後、レザバーの10ml目盛線直下まで材料の濃縮を再開する。レザバーから、mRNA脂質ナノ粒子懸濁液を回収する。さらなる5mlの1×PBSでTFFシステムを水洗して、希釈されたmRNA脂質ナノ粒子懸濁液を含有するこの洗浄液を回収することが可能であるが、この洗浄液は濃縮したmRNA脂質ナノ粒子懸濁液から別個に回収することができる。分析まで4℃で材料を保存する。TFFシステムを発熱物質フリー、ヌクレアーゼフリーの水で、続いて70%エタノール/水で洗浄する。
痩せたC57BI/6、食事誘発性肥満(DIO)またはレプチン欠損ob/obマウスへのカチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCの中のレプチンmRNAの皮下投薬の後のレプチンタンパク質発現の薬物動態
レプチンmRNAの皮下送達の後に発現されるレプチンタンパク質の量に皮下脂肪の量が影響するかどうか判定するために、3匹の異なるマウスモデルを評価した。
レプチンmRNAの皮下送達の後に発現されるレプチンタンパク質の量に皮下脂肪の量が影響するかどうか判定するために、3匹の異なるマウスモデルを評価した。
Jackson Labsからの8週齢雄の痩せたC57BI/6マウス、Taconicからの13週齢雄の食事誘発性肥満(DIO)マウスおよびJackson Labsからの16週齢雄のレプチン欠損ob/obマウスを、通常の明周期(6:00〜18:00)により1ケージ4匹で収容した。それらに、ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、本発明のHPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)を投与した。実施例35の製剤化プロセスに従って、mRNAをカチオン性リピドBまたはカチオン性リピドC(N:Pモル比=4:1)にパッケージした。製剤は、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈した。実施例8に記載されるように、マウスは皮下に注射した。
4匹のマウスの各群に、1キログラムにつき0.2、0.6または2.0ミリグラム(mpk)のカチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCで製剤化したレプチンmRNAを午前9時に投与し、6時間後の午後3時に採血した。レプチンタンパク質レベルの評価のために、投与の24、48、72および96時間後(4日間の各翌日の午前9時)にも採血した。
実施例1のELISAプロトコールに従って、血漿中のヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。カチオン性リピドB中のレプチンmRNAの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表52に詳述する。カチオン性リピドC中のレプチンmRNAの皮下投与の後のレプチンタンパク質レベルは、表53に詳述する。
両方のカチオン性脂質製剤による結果は、痩せたC57Bl/6マウスモデルと比較して、やや肥満のDIOマウスモデルでより高いレプチンタンパク質レベルを実証する。レプチンタンパク質レベルは、やや肥満のDIOマウスモデルと比較して、重度肥満のob/obマウスモデルでさらにより高かった。したがって、皮下脂肪のより大きな量は、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCの中のレプチンmRNAの皮下投与の後のより大きなレプチンタンパク質発現と相関する。
レプチン欠損ob/obマウスに投与されたカチオン性リピドBおよびカチオン性リピドCでパッケージされたレプチンmRNAの反復SC処置の薬物動態
この実施例の目的は、レプチンmRNAの反復(毎週の)処置が各連続投与の後に一貫した(安定した)レプチンレベルをもたらすこと、およびin vivo効能が全投薬期間を通して維持されることを実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)をカチオン性リピドBおよびCにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
この実施例の目的は、レプチンmRNAの反復(毎週の)処置が各連続投与の後に一貫した(安定した)レプチンレベルをもたらすこと、およびin vivo効能が全投薬期間を通して維持されることを実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)をカチオン性リピドBおよびCにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、HPLC精製され、4:1のN:Pモル比でカチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈された、本発明の改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与した。通常の様式でマウスを拘束した。実施例8に示すように、レプチンmRNAを皮下投与した。
5匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドCにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(B群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドCにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(C群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドCにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(D群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドBにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(E群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドBにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(F群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドBにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(G群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドBにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.02mpkの用量で投与した(H群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるように体重によって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬の6時間後)に、次に1、7、10、15、21、22、28および31日目の午前9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。血漿を単離し、実施例1のELISAプロトコールに従ってヒトレプチンタンパク質レベルを測定した。Polymer Technology Systems,Inc.、Indianapolis IN USAによって製造されたCardioChek(登録商標)PA(カタログ番号730)およびトリグリセリド(TG)試験ストリップ(参照番号1716)を用いて、トリグリセリドを測定した。マウス尾静脈によって新たに収集されたEDTA−血液の15μLをメーターにかけ、約2分以内にTG値を記録した。Abbott Laboratories,Inc.、Abbott Park IL USAによって製造されたAlphaTRAk(登録商標)メーター(カタログ番号321250401)およびグルコース試験ストリップ(参照32109−46−50)を用いて、マウスグルコースレベルを測定した。約20秒以内にこのメーターからグルコースを読み取るのに、尾静脈からの全血の1滴だけが必要である。
下の表は、ウリジンがプソイドウリジンで置換され、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCのいずれかを含有する脂質ナノ粒子で製剤化された、本発明のHPLC精製ヒトレプチンmRNA(配列番号4)による毎週の(4回投与)処置からの、体重、グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルを示す。
レプチン欠損ob/obマウスに投与されたカチオン性リピドDでパッケージされたレプチンmRNAの皮下処置の後のグルコースおよびトリグリセリドデータ
この実施例の目的は、単一の皮下処置の後のグルコースおよびトリグリセリド(TG)の動態(減少率およびベースラインへの戻り)に及ぼす、レプチンmRNAの効果を実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)をカチオン性リピドDにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
この実施例の目的は、単一の皮下処置の後のグルコースおよびトリグリセリド(TG)の動態(減少率およびベースラインへの戻り)に及ぼす、レプチンmRNAの効果を実証することであった。ウリジンがプソイドウリジンで置換されている、HPLCで精製されたヒトレプチンmRNA(配列番号4)をカチオン性リピドDにパッケージし、遺伝的レプチン欠乏症のマウスモデルに皮下投与した。
図1に、カチオン性リピドDの構造を示す。
用いた動物は、Jackson Labsからの10週齢雄ob/obマウスであった。動物は、通常の明周期(6:00〜18:00)の独居房に入れた。それらに、実施例8に示すようにHPLC精製され、4:1のN:Pモル比でカチオン性リピドDにパッケージされ、注射用リン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈され、皮下注射された、本発明の改変された合成レプチンmRNA(配列番号4)を投与した。
4匹のマウスに、PBSを投与した(A群)。4匹のマウスに、カチオン性リピドDにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.6mpkの用量で投与した(B群)。4匹のマウスに、カチオン性リピドDにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.2mpkの用量で投与した(C群)。5匹のマウスに、カチオン性リピドDにパッケージした改変された合成レプチンmRNAを0.06mpkの用量で投与した(D群)。
0日目に、マウスを計量し、群あたりの平均体重が同じであるようにそれらの摂取グルコースおよびグリセリドレベルによって群に選別し、次に、それらのグループ分けに基づいて午前9時00分に投薬した。試験の以降の全ての日の午前9時00分にも、全てのマウスを計量した。
0日目の午後3時00分(投薬の6時間後)に、次に1、2、3、5、6、7および14日目の午後9時00分に、各群のマウスを尾ニックによって放血させた。実施例37に記載のように、CardioChek(登録商標)PA(カタログ番号730)およびトリグリセリド試験ストリップ(参照番号1716)を用いて、トリグリセリドを測定した。同じく実施例37に記載のように、AlphaTRAk(登録商標)メーター(カタログ番号321250401)およびグルコース試験ストリップ(参照32109−46−50)を用いて、マウスグルコースレベルを測定した。
カニクイザルにおけるカチオン性リピドBおよびカチオン性リピドCにパッケージされたレプチンmRNAの静脈内投与の投与後のカニクイザルの毒性結果
実施例20に記載のように、カニクイザルは、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCのいずれかを含有する脂質ナノ粒子にパッケージされたレプチンmRNAの静脈内投与を受けた。投薬の24時間後または投薬の72時間後のいずれかに、サルの脳を毒性結果について検査した。
実施例20に記載のように、カニクイザルは、カチオン性リピドBまたはカチオン性リピドCのいずれかを含有する脂質ナノ粒子にパッケージされたレプチンmRNAの静脈内投与を受けた。投薬の24時間後または投薬の72時間後のいずれかに、サルの脳を毒性結果について検査した。
静脈内投与の24時間後の一部のサルの脾臓の組織学的分析は、それらの動脈周囲リンパ鞘の細胞性の増加を示し、対照動物での成熟したリンパ集団と比較してリンパ組織球集団へのシフトがあった。
より高い用量(例えば、カチオン性リピドB製剤では1.5mpkまたはカチオン性リピドC製剤では1.25mpk)の脂質ナノ粒子のいずれかの静脈内投与から72時間後の一部のサルの組織学的分析は、脳出血の病変および散乱した病巣を示した。病変は大部分はサルの脳白質に限定され、周囲神経網への混合型ないし支配的好中球性炎症細胞浸潤と関連した。散乱病巣出血は、白質に限定された。
24時間後、動物の大脳皮質の灰白質および白質の両方でグリア細胞賦活化が観察された。グリア細胞賦活化は、GFAP発現の増加(星状神経膠細胞の賦活化を示す)およびIba1発現の増加(小グリア細胞の賦活化を示す)によって、免疫組織化学的に測定された。星状神経膠細胞賦活化は、投薬の24時間後から観察された。星状神経膠細胞賦活化は、組織病理学的病変を示す動物で投薬の72時間後により顕著であることが観察された。
他のマーカーも試験した。免疫組織化学的に測定されたKi67は、24および72時間の時点で全ての高用量動物で増加した。IL−1βはin situハイブリダイゼーションによっておよび免疫組織化学的に全ての高用量動物で観察され、脳病変を起こしたサルで最も増加した。IL−1βのmRNAおよびタンパク質の発現は24時間後に観察され、72時間後に増加する;24時間後に、灰白質および白質の星状神経膠細胞にmRNAの発現が存在するようである。72時間後に、炎症性細胞浸潤および内皮細胞連続性の喪失と一緒に血管周囲GFA陽性星状神経膠細胞の減少が起こるのが観察された。切断されたカスパーゼ3の存在は、投薬の72時間後の一部の罹患動物の白質内のアポトーシスを実証する。ヒトレプチンRNAのin situハイブリダイゼーション結果は、全ての用量で24時間後までの灰白質および白質のグリア細胞および内皮の中のレプチンmRNAの存在を実証する。72時間後に、罹患動物の出血領域において内皮およびグリア細胞で広範な限局化が観察された。正常な白質の内皮細胞は低レベルのLDLRを発現し(組織化学的に測定された)、それは、脂質ナノ粒子の投与の後に再分布し、観察した罹患動物で上方制御された。C5b−9(MAC)の免疫組織化学結果は、72時間後に高投薬量静脈内投与を受けた動物の内皮への補体沈着を実証した。この補体沈着は罹患動物でより顕著であることが観察され、神経網で広範囲にわたったレプチンシグナル(in situハイブリダイゼーションによって検出された)に先行した。
本発明の範囲は、上の記載に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に示される通りである。
Claims (36)
- (a)リボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドであって、
(i)レプチンタンパク質をコードし、
(ii)プソイドウリジンヌクレオチドを含む
リボ核酸ポリヌクレオチド;および
(b)送達剤
を含む製剤。 - コードされる前記レプチンタンパク質がヒトレプチンタンパク質である、請求項1に記載の製剤。
- 前記リボ核酸ポリヌクレオチドがウリジンヌクレオチドを含まない、請求項1〜2のいずれかに記載の製剤。
- 前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号17〜20からなる群から選択される配列と少なくとも78%の配列同一性を有するコード領域を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- 前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号17〜20からなる群から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有するコード領域を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- 前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号17〜20からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- 前記リボ核酸ポリヌクレオチドが、配列番号4、配列番号6、配列番号8および配列番号10からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- 脂質ナノ粒子(LNP)である、請求項1〜7のいずれかに記載の製剤。
- 前記送達剤が、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質およびステルス脂質を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の製剤。
- カチオン性脂質対リボ核酸ポリヌクレオチドのモル比が3:1から8:1の間である、請求項9に記載の製剤。
- 前記カチオン性脂質が、カチオン性リピドA、カチオン性リピドB、カチオン性リピドCおよびカチオン性リピドDからなる群から選択される、請求項9〜10のいずれかに記載の製剤。
- 前記中性脂質が1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)である、請求項9〜11のいずれかに記載の製剤。
- 前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項9〜12のいずれかに記載の製剤。
- 前記ステルス脂質がポリエチレングリコール(PEG)脂質である、請求項9〜13のいずれかに記載の製剤。
- 前記ステルス脂質がS024である、請求項9〜14のいずれかに記載の製剤。
- 前記送達剤が、カチオン性脂質、コレステロール、中性脂質およびポリエチレングリコール(PEG)脂質を含む、請求項1〜15のいずれかに記載の製剤。
- 医薬として使用するための、請求項1〜16のいずれかに記載の製剤。
- レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態の処置で使用するための、請求項1〜17のいずれかに記載の製剤。
- 対象においてレプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を処置する方法であって、
(a)レプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態を有する対象を選択するステップと;
(b)前記対象に請求項1に記載の製剤を投与するステップと
を含み、前記製剤の前記投与は、前記対象のレプチン欠乏症、リポジストロフィーまたは循環レプチンレベルが低い他の状態の症状を緩和する、方法。 - 前記製剤が反復用量で投与される、請求項19に記載の方法。
- 前記製剤が静脈内投与される、請求項19〜20のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が皮下投与される、請求項19〜20のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が静脈内投与され、その後皮下投与される、請求項19〜20のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が前記対象の体重1kgにつき少なくとも0.2mgのリボ核酸ポリヌクレオチドの投薬量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が前記対象の体重1kgにつき少なくとも0.6mgのリボ核酸ポリヌクレオチドの投薬量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも1.4ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも2.8ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が、前記製剤の前記投与の前の前記対象の血漿中レプチンタンパク質濃度より少なくとも10ng/mL超の血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも19ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも25ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも185ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記製剤が少なくとも1300ng/mLの血漿中レプチンタンパク質濃度をもたらすのに十分な量で投与される、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記投与がグルコースの血漿中濃度の少なくとも30%の低下をもたらす、請求項19〜32のいずれかに記載の方法。
- 前記投与がトリグリセリドの血漿中濃度の少なくとも40%の低下をもたらす、請求項19〜33のいずれかに記載の方法。
- 前記投与が安定した体重をもたらす、請求項19〜34のいずれかに記載の方法。
- 前記投与が持続した体重減少をもたらす、請求項19〜34のいずれかに記載の方法。
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