JP2017102265A - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】 走査型顕微鏡は、光源１０２からの照射光により試料１１２を走査する走査手段１０９と、走査手段からの照射光を試料に導く光学系１１１と、試料から射出して光学系を通過した射出光の光路と照射光の光路とを分離する分離手段１０８と、分離手段からの射出光を検出する検出手段１１６と、を有し、分離手段は、光源と光学系との間の照射光の光路上に配置されている光サーキュレータを含み、射出光は、光学系と分離手段との間は自由空間のみを伝搬する。【選択図】 図１

Description

本発明は、走査型顕微鏡に関する。

対物レンズを用いて顕微分光イメージングを行う顕微鏡には、試料を透過した透過光を検出する透過型の構成と、試料で反射した散乱光等の反射光を検出する反射型の構成との２通りの構成がある。透過型の構成は、切片化された試料の観察に適しており、透過光を計測するため感度が高い。一方、反射型の構成は、特に試料の厚みが大きい場合に用いられ、主に試料で多重散乱した後方散乱光等の反射光を射出光として計測する。特に生体試料では、後方散乱光は試料内部での多重散乱により、角度分布をもって出射されるため、検出器で受光できる光量が低下し、感度が低くなりやすい。したがって反射型の顕微鏡では、試料からの射出光をより多く取り出して、検出器に伝送することが求められる。

非特許文献１には、固体レーザとＹｂファイバレーザを同期させて試料へ同軸に集光することで誘導ラマン散乱（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）観察が可能な顕微鏡が記載されている。非特許文献１の顕微鏡は、透過型の構成と反射型の構成とを有している。非特許文献１では、試料に照明光を集光する対物レンズを通って射出された射出光を、λ／４板と偏光ビームスプリッタ（Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ Ｂｅａｍ Ｓｐｌｉｔｔｅｒ：ＰＢＳ）とを用いて照射光の光路と異なる光路へ分離し、検出器に伝送している。

Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１５３−１５９，２０１４．

多重散乱した光は偏光が解消されているため、非特許文献１に記載の顕微鏡では、ＰＢＳに入射した後方散乱光のうち、ＰＢＳで反射される偏光成分しか受光できない。

本発明はかかる課題に鑑みてなされたもので、試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一側面としての顕微鏡は、光源からの照射光により試料を走査する走査手段と、前記走査手段からの前記照射光を前記試料に導く光学系と、前記試料から射出して前記光学系を通過した射出光の光路と前記照射光の光路とを分離する分離手段と、前記分離手段からの前記射出光を検出する検出手段と、を有し、前記分離手段は、前記光源と前記光学系との間の前記照射光の光路上に配置されている光サーキュレータを含み、前記射出光は、前記光学系と前記分離手段との間は自由空間のみを伝搬することを特徴とする。

本発明の一側面としての顕微鏡によれば、試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

第１の実施形態の顕微鏡の構成を説明するための模式図。 第１の実施形態の分離手段における照射光及び射出光の光路を説明するための模式図。 第１の実施形態の穴あきミラーを配置した場合の分離手段における射出光の光路を説明するための模式図。 第１の実施形態の分離手段の別の一例における照射光及び射出光の光路を説明するための模式図。 第２の実施形態の顕微鏡の構成を説明するための模式図。 第３の実施形態の顕微鏡の構成を説明するための模式図。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、後述の各実施形態は本発明の好ましい実施形態の一例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施形態に対して種々の変形や変更が可能である。すなわち、本発明は、その要旨の範囲内で適宜変更可能である。

（第１の実施形態）
本実施形態の顕微鏡１００について、図１を参照して説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡１００の構成を説明する模式図である。顕微鏡１００は、照明光を集光したスポットを試料１１２内（試料１１２の表面を含む）で２次元または３次元に走査可能な走査型の誘導ラマン散乱（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）顕微鏡である。なお、図１の各構成部品を結ぶ太い直線は光路を、矢印付き直線は電気配線を表す。

コヒーレントラマン散乱（ＣＲＳ；Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＣＲＳ）を利用すると、生体内分子の３次元分布や体内組成を観察することが可能である。ＣＲＳの中でも特にＳＲＳを利用すると、スペクトル歪みなく、定量的な観察が可能である。このようなＳＲＳを利用した計測装置では、互いに波長が異なる２つの光パルス（２波長光パルス）を試料に同時に照射してＳＲＳを誘起する。２波長光パルスの光周波数の差が試料の分子振動数と一致すると、それら光パルスの集光点にてＳＲＳが生じる。そして、試料を透過した２波長光パルスのうち、光周波数が高い、すなわち波長が短い光パルス（ポンプ光）の強度が減少し（誘導ラマンロス）、光周波数が低い、すなわち波長が長い光パルス（ストークス光）の強度が増大する（誘導ラマンゲイン）。

この誘導ラマンロスまたは誘導ラマンゲイン（以下、ともにＳＲＳ信号という場合がある）を検出することによって、試料の分子の振動情報を反映した分子振動イメージングを行うことができる。また、２波長光パルスの光周波数を変化させることによって、光周波数に対するＳＲＳ信号の依存性（ラマンスペクトル）の検出が可能であり、試料の組織構造や組成の特定が可能である。

顕微鏡１００は、第１の光源１０１、第２の光源１０２、同期制御手段１０３、強度変調器１０４、調整手段１０５、ミラー１０６、１１０、合波部１０７、分離手段１０８、走査手段１０９、光学系１１１、及びステージ１１３を有する。さらに、顕微鏡１００は、レンズ１１４、フィルタ１１５、検出器（検出手段）１１６、はロックインアンプ１１７、及びコンピュータ１１８、を有する。

なお、以降の説明では、検出器１１６で検出する光パルス（以下、「被検出光」と呼ぶ）としてポンプ光を用いる構成について説明するが、これに限らずストークス光を検出する構成でもよい。また、以降の説明では、第１の光源１０１及び第２の光源１０２から試料１１２に照射される光束を「照射光」、試料１１２に照射された後に試料１１２から射出した光を「射出光」と呼ぶ。「射出光」は、試料１１２内で多重反射及び多重散乱して試料１１２から射出した反射光を含む。

第１の光源１０１はパルス発振レーザであり、ポンプ光を発振する。第２の光源１０２はパルス発振レーザであり、ストークス光を発振する。ポンプ光およびストークス光のそれぞれは、試料１１２に集光して照射される照射光である。第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれには、Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザ、ＯＰＯ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ）等の固体レーザやＹｂファイバレーザ等のファイバレーザを用いる。感度と波数分解能の両立の観点から、ポンプ光、ストークス光のそれぞれのパルス幅は、１ｐ以上１０ｐｓ以下程度とすることが好ましい。

第１の光源１０１または第２の光源１０２の発振波長を変更することで広範囲のラマンスペクトル計測が可能である。例えば、第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれの発振波長を１０３０ｎｍ±１５ｎｍ、７９０ｎｍとすると、脂質領域に対応する約２８００〜３１００ｃｍ−１におけるＳＲＳ計測が可能である。第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれの発振波長を変更するのでなく、広帯域光源や広帯域化手段と可変波長フィルタ等の波長選択手段を組み合わせて波長を変更してもよい。光源の繰り返し周波数は高速検出と検出器１１６の応答速度の観点から１０〜１００ＭＨｚ程度とするとよい。なお、入射するパルス光の波長に応じて検出器１１６の感度が変わるおそれがあるため、被検出光の波長は一定であることが望ましい。そのため、本実施形態の場合、被検出光であるポンプ光の波長を一定にし、ストークス光の波長を変更することが望ましい。

同期制御手段１０３は、第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれのパルス発振のタイミングを同期する。同期制御手段１０３には、パルス発振のタイミングのずれを検知して、第１の光源１０１および第２の光源１０２の少なくとも一方の共振器長を制御する。あるいは、同期制御手段１０３は、電気的に同期した発振制御信号を用いて第１の光源１０１、第２の光源１０２を制御する等の一般的な方法を用いればよい。パルスタイミングずれの測定には二光子吸収や和周波発生を誘起するフォトダイオードや非線形結晶を利用する等の手法を用いる。

強度変調器１０４は、ＳＲＳ信号をロックイン検出するために、コンピュータ１１８からの変調信号によりストークス光を強度変調する。調整手段１０５は、試料１１２にポンプ光とストークス光とが到達するタイミングが一致するように光路長を調整する光路長調整手段である。調整手段１０５には手動または自動ステージとミラーを組み合わせた素子やファイバ型のディレイライン等を用いる。

合波部１０７は、第１の光源１０１からのポンプ光と、ミラー１０６を介して伝搬してきた第２の光源１０２からのストークス光とを合波するダイクロイックミラーである。

走査手段１０９は、第１の光源１０１と光学系１１１との間のポンプ光の光路上に配置されている。走査手段１０９は、照射光の試料１１２内での集光点（スポット）の位置を変更することにより、照射光により試料１１２を走査するための構成である。具体的には、走査手段１０９は、走査手段１０９から射出する照射光の方向を変更（偏向する）して、照射光の光学系１１１に対する入射角を変更する光偏向素子を含む。光偏向素子としては、例えば、ガルバノミラーを２つ用いる。高速走査のためにレゾナントミラーやポリゴンミラーと組み合わせて用いてもよい。両光の集光点の位置が試料１１２内（試料１１２表面を含む）で２次元に変更されることで、試料１１２の形状や組成を反映した分子振動情報の２次元分布が画像（ＳＲＳ画像）として取得できる。

ミラー１１０は、合波部１０７で合波されたポンプ光およびストークス光を光学系１１１に導く。光学系１１１は、入射した照射光を試料１１２内の同一スポット（集光点）に集光するとともに、試料１１２から照射光路側へ散乱される射出光を採光して走査手段１０９に導く。本実施形態では、対物レンズを用いているが、光学系１１１は、ミラー等を含んでいてもよい。

走査手段１０９で試料１１２を走査する際に、試料１１２における光量分布を均一に近づけ、画像周辺部での光量低下を防ぐことが望ましい。そのために、例えば、走査手段１０９の光偏向素子のガルバノミラー面と光学系１１１の入射瞳面とを共役関係とするリレーレンズ対（走査光学系）を、走査手段１０９と光学系１１１との間に挿入することができる。試料１１２はステージ１１３上に設置されている。ステージ１１３は、ＸＹＺ方向に駆動することで、集光点の走査領域に試料１１２を移動させる移動手段である。

分離手段１０８は、少なくとも３つのポートを有しており、第１のポートから入射した光を第２のポートから射出し、第２のポートから入射した光を第３のポートから射出する光サーキュレータである。これを用いて、本実施形態では、合波部１０７からの光を透過し、光学系１１１を透過した試料１１２からの散乱光（射出光）の光路を、第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれから出力される照射光の光路と異なる光路へ分離（分岐）する。分離手段１０８は、照射光の一方であるポンプ光の光路のうち、合波部１０７と走査手段１０９との間に配置されている。

図２を用いて分離手段１０８の構成を説明する。図２は、分離手段１０８の構成の一例である偏光無依存型の光サーキュレータを説明するための模式図である。分離手段１０８は、第１の偏光ビームスプリッタ（Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ Ｂｅａｍ Ｓｐｌｉｔｔｅｒ：ＰＢＳ）２０１、第２のＰＢＳ２０６、ファラデーローテータ２０２、λ／２板２０３、及びミラー２０４、２０５の複数の素子を有する。第１のＰＢＳ２０１は、第２のＰＢＳ２０６よりも第１の光源１０１側に配置されている。なお、本明細書では、任意の構成又は任意の位置よりも第１の光源１０１又は第２の光源１０２側であるとは、照射光の光路上の任意の構成又は任意の位置から照射光の光路に沿って第１の光源１０１又は第２の光源１０２側であることを言う。照射光の光路に沿って、任意の構成又は任意の位置より試料１１２側、すなわち光学系１１１側にある場合は、単に「任意の構成又は任意の位置より光学系１１１側」と言う。

図２（ａ）は分離手段１０８における照射光の光路を示している。図２（ａ）は、分離手段１０８に入射する光がＰ偏光だった場合の光路を実線で示し、分離手段１０８に入射する光がＳ偏光だった場合の光路を点線で示す。

分離手段１０８に入射する光がＰ偏光である場合、分離手段１０８に入射する光は、まず第１の光源１０１側（図２における紙面左側）から入射して、第１のＰＢＳ２０１を透過する。その後ファラデーローテータ２０２で偏光面が４５度回転し、λ／２板２０３でさらに４５度回転することにより、Ｓ偏光となり第２のＰＢＳ２０６で反射され、走査手段１０９等を介して試料１１２へ導光される。

分離手段１０８に入射する光がＳ偏光である場合は、まず第１のＰＢＳ２０１で反射する。その後ファラデーローテータ２０２で偏光面が４５度回転し、λ／２板２０３でさらに４５度回転することにより、Ｐ偏光となり第２のＰＢＳ２０６を透過して、走査手段１０９等を介して試料１１２へ導光される。分離手段１０８に入射する光が楕円偏光である場合は、照射光は、Ｐ偏光、Ｓ偏光の光路に分岐されるが、第２のＰＢＳ２０６で合波される。ただし、照射光のピークパワーの低下や不要な干渉の影響を回避するために、分離手段１０８に入射する光は、Ｐ偏向又はＳ偏向となるように構成することが好ましい。

図２（ｂ）は分離手段１０８における射出光の光路を示している。試料１１２からの射出光は、試料１１２内部での多重散乱によって試料１１２に入射する偏光方向によらずにランダム偏光となる。そのため、射出光が分離手段１０８に入射すると、第２のＰＢＳ２０６で２つの光路に分岐される。分岐された光はそれぞれλ／２板２０３にて偏光が４５度回転するが、ファラデーローテータ２０２ではその非相反性によってλ／２板２０３での偏光回転を相殺する方向に偏光が回転する。そのため、第２のＰＢＳ２０６を透過した光は第１のＰＢＳ２０１を透過し、第２のＰＢＳ２０６で反射した光は第１のＰＢＳ２０１で反射され、結果的に、図２における紙面下側に射出され、照射光の光路と異なる光路に導光される。その結果、レンズ１１４およびフィルタ１１５を介して、検出器１１６へ射出光が導光される。

試料１１２からの射出光は様々な角度で出射し、分離手段１０８には最大で光学系１１１の焦点距離と実視野から決まる角度とビーム径で入射する。そのため、本実施形態では、試料１１２からの射出光が、光学系１１１から分離手段１０８に到達するまでの間に自由空間を伝搬するように構成されている。すなわち、射出光は、分離手段１０８に入射するとき、自由空間を伝搬する。このような構成にすることにより、射出光のファイバへのカップリングが不要となる。そのため、ファイバのビーム径や開口数に制約されず、ファイバとファイバコリメータとを介して光が分離手段１０８の第２のＰＢＳ２０６に入力される場合よりも、広範囲の射出光を受光できる。

また、射出光をより広範囲に受光するためには、射出光が分離手段１０８から射出されときも、ファイバを介さず、自由空間に射出されることが好ましい。そして、射出光は、分離手段１０８から検出器１１６までの間、自由空間を伝搬することが好ましい。

さらに、分離手段１０８を構成する素子を、自由空間型の素子で構成することが好ましい。ここで「自由空間型」の素子とは、光ファイバ中に光を導光しない、バルク型の光学素子であることを意味する。すなわち、分離手段内（分離手段１０８内）の第１のＰＢＳ２０１、第２のＰＢＳ２０６、ファラデーローテータ２０２、λ／２板２０３、ミラー２０４、２０５のそれぞれの素子間を伝搬する光は、自由空間を伝搬するように構成されている。このような構成にすることにより、射出光をより広範囲に受光できるようになる。

第１の光源１０１、第２の光源１０２のそれぞれからの照射光は、ファイバ及びファイバコリメータを通って分離手段１０８に入力される構成でもよい。

例えば、光学系１１１として開口数１．２、倍率６０倍、焦点距離３ｍｍ、視野数２６．５のものを用い、走査手段１０９よりも第１の光源１０１側に１００ｍｍの位置に分離手段１０８を配置した場合を考える。この場合、幾何光学的には分離手段１０８に最大で約２度の角度を持った射出光が直径約１４ｍｍのビーム径で入射する。市販のファイバコリメータの有効径が１０ｍｍ程度であることから、射出光の全てを受光することは容易でない。しかし、非特許文献１のような射出光のＳ偏光成分しか受光できないＰＢＳ方式と比較すると、顕微鏡１００は光学系１１１を透過した後方散乱光の大部分を光検出器１１６に向かう光路へ導光できるため、最大で２倍の感度が得ることができる。

また、ＳＲＳ顕微鏡では、検出する射出光と試料へ入射する照射光とが同じ波長であるため、波長フィルタを用いて射出光の光路と照射光の光路とを分けることは不可能である。このような場合でも、本実施形態のように分離手段１０８を用いることによって、検出したい射出光を照射光の光路から分離することができる。これはＳＲＳ顕微鏡に限らず共焦点顕微鏡や自発ラマン顕微鏡等、照射光の波長と検出する射出光が同じ、または近い波長を有する顕微鏡であれば、同様の効果を得ることができる。

なお、図２においてファラデーローテータ２０２、λ／２板２０３は一つの素子としているが、偏光ごとに分離されたそれぞれの光路にファラデーローテータ２０２とλ／２板２０３とを一つずつ設置してもよい。その場合、ファラデーローテータ２０２およびλ／２板２０３のそれぞれのサイズを小さくすることができる。

また、第１のＰＢＳ２０１の性能や射出光の角度によっては、分離手段１０８に入射した射出光の一部が第１の光源１０１側へ透過してしまうおそれがある。その場合、分離手段１０８よりも第１の光源１０１側へ透過してしまった射出光を検出器１１６に導くために、第１のＰＢＳ２０１よりも第１の光源１０１側に穴空きミラーを配置することもできる。図３に、穴空きミラー３０７を配置した場合の、分離手段１０８における射出光の光路を示す。

穴あきミラー３０７は、光を反射する反射部（ミラー部）と、光が透過する透過部（穴部）とを有する反射部材である。穴あきミラー３０７は、照射光が穴あきミラー３０７の穴部を透過するように配置されている。ポンプ光の光路において分離手段１０８よりも第１の光源１０１側に透過した射出光は、穴あきミラー３０７で反射され、不図示の光学系又はレンズ１１４と、フィルタ１１５とを介して検出器１１６で受光される。穴あきミラー３０７で反射された射出光は、フィルタ１１５と異なる別のフィルタを介して、検出器１１６と異なる別の検出器で検出してもよい。

分離手段１０８として、偏光分離された射出光をそれぞれ個別の位置から射出する分離手段４０８を用いることもできる。図４（ａ）に分離手段４０８における照射光の光路、図４（ｂ）に分離手段４０８における射出光の光路を示す。なお、分離手段４０８を構成する各素子は分離手段１０８と同じであり、同様の構成には同様の符号を付している。

分離手段４０８は、ミラー４０５を配置する位置と、分離手段１０８のミラー２０５とが配置されている位置とが異なる。図（４）に示したように、射出光は、第２のＰＢＳ２０６に入射して分岐される。第２のＰＢＳ２９６を透過した射出光は、λ／２板２０３およびファラデーローテータ２０２を通過し、ミラー４０５で反射して第１のＰＢＳ２０１を介さずに分離手段４０８から射出する。第２のＰＢＳ２９６で反射した射出光は、λ／２板２０３およびファラデーローテータ２０２を通過し、第１のＰＢＳ２０１を介さずに分離手段４０８から射出する。すなわち、第２のＰＢＳ２０６を透過するＳ偏光成分の射出光と第２のＰＢＳ２０６で反射されるＰ偏光成分の射出光とは、別の光路に分離して分離手段４０８から射出する。

このとき、図４（ａ）に示したように、分離手段４０８への照射光はＳ偏光とし、照射光がミラー４０５で遮光されないようにしておく。光源からの光がＳ偏光でない場合には分離手段４０８よりも第１の光源１０１側にλ／２板等の偏光制御素子を挿入し、分離手段４０８への照射光の偏光を調整する。また、分離された光をそれぞれ個別の光検出器を用意して受光する。図４の構成によれば試料１１２の射出光を偏光成分ごとに計測でき、試料１１２の偏光特性を測定することができる。

また、本実施例では分離手段１０８の配置位置は、ポンプ光の光路における走査手段１０９よりも第１の光源１０１側としているが、光学系１１１よりも第１の光源１０１側であればよい。すなわち、分離手段１０８は、第２の光源１０２と光学系１１１との間のポンプ光の光路上に配置されていればよい。

分離手段１０８は、本実施形態のように、第１の光源１０１と走査手段１０９との間の走査手段１０９に入射する被検出光の光路上に配置されていることが望ましい。これは、第１の光源１０１と走査手段１０９との間の被検出光の光路上に分離手段１０８を配置すると、第１の光源１０１及び第２の光源１０２からの照射光は略同一の光路をたどるため、照射光に対する角度依存性を無視できるためである。また、走査手段１０９の動作に伴い分離手段１０８の各素子の光に対する屈折率の変化が発生を抑制でき、集光点のずれが発生しにくくなる。さらに、走査手段１０９と光学系１１１との間にリレーレンズ系及び分離手段１０８を配置することによって発生する、リレーレンズ系を構成する光学素子と分離手段１０８との機械的干渉を抑制できるという効果も期待できる。

レンズ１１４は、分離手段１０８から射出した射出光を検出器１１６へ集光する。フィルタ１１５は、特定の波長領域の光を抽出する分光部で、具体的には、バンドパスフィルタまたはショートパスフィルタ等を用いることができる。ここでは、フィルタ１１５は、強度変調器１０４の変調周波数で誘導ラマンロスが誘起されたポンプ光のみを検出するために、ストークス光をカットする。検出器１１６は、入射した光パルス（ポンプ光）を電気信号に変換する。検出器１１６には高速シリコンフォトダイオードを用いる。本実施形態では、レンズ１１４を用いて光を検出器１１６上に集光するため、検出器１１６の受光面積を小さくできる。これによりフォトダイオードの応答速度を上げることができる。

従来技術として、光学系直下に穴空きフォトディテクタ（Ｐｈｏｔｏｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＰＤ）を配置し、光学系を介さず後方散乱光を直接受光する反射型のＳＲＳ顕微鏡がある（特許文献：ＵＳ８６８１３３１）。しかし、この方法では、大面積のＰＤが必要となるため、遮断周波数が低くなり、検出可能な周波数幅（検出帯域）が制限される恐れがある。また、ＰＤや波長フィルタ等の部材の厚さから作動距離の長い光学系しか使えず、信号強度や空間分解能の制限されることがある。このような大面積のＰＤで受光する構成と比較して、本実施形態の顕微鏡１００は、遮断周波数の低下がなく、高速な検出に適している。また、信号強度、空間分解の制限が低減されることが期待できる。

ロックインアンプ１１７は、検出器１１６からの電気信号中から、強度変調器１０４の変調周波数でＳＲＳ信号（誘導ラマンロス）をロックイン検出（同期検波）する。このため、ロックイン検出の参照信号には強度変調器１０４の変調信号を分岐した電気信号を用いる。

コンピュータ１１８は、外部変調器１０４に変調信号を送出する。変調信号の周波数は光源の強度ノイズの影響を抑えるために１ＭＨｚ以上とするとよい。

また、コンピュータ１１８は、ロックイン検出されたＳＲＳ信号を読み出す。また、コンピュータ１１８は、ＳＲＳ信号に対する信号処理を行って試料１１２に関する分子振動情報を画像化したＳＲＳ画像データ（２次元画像データ）を生成し、これらＳＲＳ画像データをディスプレイに表示する。画像化する際、走査手段１０９からの信号をデータ収録開始のトリガー信号として用いる。また、コンピュータ１１８はステージ１１３を制御して、試料１１２における観察部位を３次元的に設定することができる。

また、コンピュータ１１８は、取得した各波長のＳＲＳ画像データに対して主成分分析、独立成分分析等といったスペクトル分析手法を適用し、特徴的な成分に注目して疑似カラー化してディスプレイ上に表示してもよい。

本実施形態では、試料１１２からの射出光が、自由空間を伝搬して分離手段１０８、４０８に入力される構成としている。そして、分離手段１０８、４０８で射出光の光路と照射光の光路と分離する。そのため、本実施形態によれば、遮断周波数の低下を低減しつつ、試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる。その結果、従来よりも、高感度な計測が可能な走査型顕微鏡を実現することができる。

（第２の実施形態）
次に、図５を用いて、実施形態２について説明する。第１の実施形態では、分離手段１０８は、被検出光の光路のうち、合波部１０７と走査手段１０９との間に配置されていた。これに対し、本実施形態の顕微鏡５００は、被検出光の光路の合波部１０７よりも第１の光源１０１側、すなわち第１の光源１０１と合波部１０７との間の被検出光の光路上に配置されている分離手段５０８を有する。分離手段５０８は、配置されている位置が異なる以外は、第１の実施形態と同様の構成である。これにより、分離手段５０８の波長依存性を低減し、さらに波長フィルタを用いない構成とすることができ、より小型で安価な走査型顕微鏡を提供する。

図５は、本実施形態における顕微鏡５００の構成を説明するための模式図である。第１の実施形態と同様の構成には、同様の符号を付した。

本実施形態の顕微鏡５００は、分離手段５０８を、第１の光源１０１とダイクロイックミラー５０７との間の被検出光としてのポンプ光の光路上に配置している。これにより、試料１１２からの射出光は、光学系１１１、ミラー１０、走査手段１０９、合波部１０７を介して分離手段５０８に入射する。合波部１０７において、試料１１２からの射出光が、ストークス光とポンプ光とに分岐される。そのため、検出器５１５で検出する光のみが分離手段５０８を通過するため、フィルタ１１５を不要とすることができる。

また、分離手段５０８内の各素子の対応波長をポンプ光の波長のみに限定することができる。これにより、各素子の入射角度特性を向上させることができ、射出光をより高効率に受光できる。また、反射コーティング等の制約を緩和し、コストを抑えることができる。射出光をより高効率に取り出すためには、分離手段５０８とダイクロイックミラー５０７とを、できるだけ走査手段１０９に接近させて配置しておくことが好ましい。

本実施形態では、試料１１２でからの射出光が、自由空間を伝搬して分離手段５０８に入力される構成としている。そして、分離手段５０８で射出光の光路と照射光の光路と分離する。そのため、本実施形態によれば、遮断周波数の低下を低減しつつ、試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる。その結果、従来よりも、高感度な計測が可能な走査型顕微鏡を実現することができる。

また、分離手段５０８を、第１の光源１０１と合波部１０７との間の、第１の光源１０１からの光の光路上に配置することにより、分離手段５０８に入力される光を被検出光のみに限定できる。すなわち、分離手段５０８の透過帯域を被検出光のみに限定できる。そのため、より小型、安価でありながら高感度な計測が可能な顕微鏡を提供することができる。

（第３の実施形態）
本実施形態の顕微鏡６００について、図６を参照して説明する。図６は、顕微鏡６００の構成を説明するための模式図である。上述の各実施形態では、光源を２つ有するＳＲＳ顕微鏡について記載した。これに対し、本実施形態の顕微鏡６００は、光源を１つだけ有する。例えば、光源を１つだけ有する多光子吸収、多光子蛍光を計測する顕微鏡である。

顕微鏡６００は、光源６０１、分離手段１０８、走査手段１０９、ミラー１１０、光学系（光学系）１１１、ステージ（移動手段）１１３、レンズ１１４、検出器（検出手段）１１６、及びコンピュータ１１８を有する。

光源６０１は、例えば蛍光を励起するための励起光を出力する。その他の構成は、上述の実施形態と同様であり、上述の実施形態と同じ符番を付している。なお、各構成は、光源６０１からの光（照射光）および試料１１２からの光の波長に対応したものを、適宜選択する。

光源６０１からの照射光は、分離手段１０８を通過して走査手段１０９、ミラー１１０を介して光学系１１１に入射する。その後、照射光は、光学系１１１で試料１１２に集光される。試料１１２からの射出光の一部は、光学系１１１に入射し、再び集光される。その後、射出光は、ミラー１１０、走査手段１０９を介して分離手段１０８に入射し、照射光の光路と異なる光路に分離される。分離手段１０８から射出した射出光は、レンズ１１４で集光されて検出器１１６で検出される。コンピュータ１１８は、上述の実施形態と同様に、検出器１１６の検出結果から、試料１１２の画像を取得する。

本実施形態のように、光源を１つだけ有する顕微鏡においても、試料１１２からの射出光が、自由空間を伝搬して分離手段１０８に入力される構成としている。そして、分離手段１０８で射出光の光路と照射光の光路と分離する。そのため、本実施形態によれば、遮断周波数の低下を低減しつつ、試料からの射出光を従来よりも高効率に取り出すことができる。その結果、従来よりも、高感度な計測が可能な走査型顕微鏡を実現することができる。

以上、各実施形態で述べた構成によれば、物質の形状観察、組成特定が可能な光学装置、やこれを用いた顕微鏡等の観察装置を提供することができる。なお、以上説明した各実施形態は一例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施形態に対して種々の変形や変更が可能である。

例えば、上述の各実施形態では、分離手段１０８、５０８の配置位置は、走査手段１０９よりも第１の光源１０１側としているが、光学系１１１よりも第１の光源１０１側であればよい。すなわち、分離手段１０８は、第２の光源１０２から光学系１１１へのポンプ光の光路上に配置されていればよい。

また、上述の各実施形態では、走査手段１０９を用いて試料１１２内を２次元的に走査する構成について説明したが、１軸のガルバノミラーによる走査とその走査方向に直交する方向へのステージ１１３の駆動とを組み合わせて２次元走査を行ってもよい。さらに、ステージ１１３のみを２次元面内で駆動してもよい。

さらに、試料１１２の画像を取得する必要がなければ、走査手段１０９による集光点の走査を行わずに、試料１１２内の１点のみを観察すればよい。

第１の実施形態及び第２の実施形態では、強度変調器を用いたロックイン検出方式を説明したが、非特許文献１に記載されているように、変調器を用いずに繰り返し周波数がｎ：１（ｎは２以上）となる光源を用いてロックイン検出を行う方式を採用してもよい。

また、第１の実施形態及び第２の実施形態は、誘導ラマンロスではなく誘導ラマンゲインを検出するように適宜構成を変更してもよい。さらに、ＳＲＳ信号ではなくＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）信号を計測するように装置を構成してもよい。例えば、第１の実施形態において、フィルタ１１５をＣＡＲＳ信号の波長帯のみを透過するフィルタへ変更することでＣＡＲＳ信号を検出できる。この場合、検出器１１６には光電子増倍管を用いればよく、強度変調器１０４やロックインアンプ１１７はなくしてよい。

また、上述の各実施形態は、ＣＲＳ計測、光源が１つの多光子顕微鏡等に限定せず、光源を複数有する多光子吸収、多光子蛍光を計測する顕微鏡等にも適用できる。また、上述の各実施形態では、試料１１２からの射出光の計測を行う構成を示したが、試料１１２への光を照射するための構成をプローブ化して、顕微鏡の一形態である内視鏡を構成してもよい。

１０１ 光源
１０８ 分離手段
１１１ 光学系
１１６ 検出器（検出手段）

Claims (16)

1. 光源からの照射光により試料を走査する走査手段と、
   前記走査手段からの前記照射光を前記試料に導く光学系と、
   前記試料から射出して前記光学系を通過した射出光の光路と前記照射光の光路とを分離する分離手段と、
   前記分離手段からの前記射出光を検出する検出手段と、を有し、
   前記分離手段は、前記光源と前記光学系との間の前記照射光の光路上に配置されている光サーキュレータを含み、
   前記射出光は、前記光学系と前記分離手段との間は自由空間のみを伝搬する
   ことを特徴とする走査型顕微鏡。
2. 前記射出光は、前記分離手段と前記検出手段との間は自由空間のみを伝搬する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記分離手段は、前記分離手段内を伝搬する前記射出光は自由空間を伝搬するように構成されている
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記分離手段は、前記光源と前記走査手段との間の前記照射光の光路上に配置されている
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記光源と前記分離手段との間の前記照射光の光路上に配置されている反射部材を有し、
   前記反射部材は、前記照射光が透過する透過部と、前記光学系、前記走査手段及び前記分離手段を通過した前記射出光を反射する反射部と、を有する
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
6. 前記光源と前記分離手段との間の前記照射光の光路上に配置されている反射部材を有し、
   前記反射部材は、前記照射光を反射する反射部と、前記光学系、前記走査手段及び前記分離手段を通過した前記射出光が透過する透過部と、を有する
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
7. 前記光源を第１の光源、前記第１の光源からの前記照射光を第１の光パルスとすると、
   前記第１の光パルスの波長と異なる波長を有する第２の光パルスを出力する第２の光源と、
   前記第１の光パルスと前記第２の光パルスと、を合波する合波部と、を有し、
   前記光学系は、前記合波部で合波された前記第１の光パルス及び前記第２の光パルスを前記試料に導く
   ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
8. 前記分離手段と前記検出手段との間に配置されており、前記射出光から前記第１の光パルスの波長の光を抽出するフィルタを有し、
   前記分離手段は、前記合波部と前記光学系との間の前記第１の光パルスの光路上に配置されている
   ことを特徴とする請求項７に記載の走査型顕微鏡。
9. 前記分離手段は、前記第１の光源と前記合波部との間の前記照射光の光路上に配置されている
   ことを特徴とする請求項７又は８に記載の走査型顕微鏡。
10. 前記射出光は、前記試料でコヒーレントラマン散乱した散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項７乃至９のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
11. 前記射出光は、前記試料で誘導ラマン散乱した散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
12. 前記射出光は、前記試料で後方散乱した散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
13. 前記分離手段は、偏光無依存である
    ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
14. 前記複数の素子は、第１の偏光ビームスプリッタ、第２の偏光ビームスプリッタ、ファラデーローテータ、λ／２板、及びミラーを含む
    ことを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
15. 前記分離手段は、前記第１の偏光ビームスプリッタで分離された２つの光のそれぞれは、前記ファラデーローテータと前記λ／２板とを通過した後、前記第２の偏光ビームスプリッタに入射するように構成されている
    ことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
16. 前記走査手段は、前記光学系に入射する前記照射光を偏向する光偏向素子を含む
    ことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。

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