JP2015506373A - 成長分化因子15(gdf−15)ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
GDF15ポリペプチド、GDF15を含む構築物、およびその突然変異体を提供する。種々の実施形態において、GDF15ポリペプチド、GDF15を含む構築物、およびその突然変異体は、代謝性障害の治療または緩和における使用に有用であり得る。種々の実施形態において、代謝性疾患または障害は、2型糖尿病、肥満、脂質異常症、高グルコースレベル、高インスリンレベル、および糖尿病性腎症である。
Description
配列表
本出願は、EFS−Webを通じてASCII形式で提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2013年1月28日に作成された当該ASCIIコピーは、A1682WOP.txtという名称であり、サイズは253,155バイトである。
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発明の分野
本開示は、GDF15ポリペプチド、GDF15を含むポリペプチド、ならびにその生成および使用に関する。
本開示は、GDF15ポリペプチド、GDF15を含むポリペプチド、ならびにその生成および使用に関する。
成長分化因子15(GDF15)は、TGFβスーパーファミリーの分岐メンバーである。これは、マクロファージ阻害性サイトカイン1(MIC1)(Bootcov MR,1997,Proc Natl Acad Sci 94:11514−9.)、胎盤骨形成因子(PLAB)(Hromas R 1997,Biochim Biophys Acta.1354:40−4)、胎盤形質転換成長因子β(PTGFB)(Lawton LN 1997,Gene.203:17−26)、前立腺由来因子(PDF)(Paralkar VM 1998,J Biol Chem.273:13760−7)、および非ステロイド性抗炎症薬活性化遺伝子(NAG−1)(Baek SJ 2001,J Biol Chem.276:33384−92)とも称される。
ヒトGDF15遺伝子は、染色体19p13.2〜13.1上に位置し、ラットGDF15遺伝子は、染色体16上に位置し、マウスGDF15遺伝子は、染色体8上に位置する。GDF15オープンリーディングフレームは、2つのエクソンに及ぶ(Bottner M 1999,Gene.237:105−11およびNCBI)。成熟GDF15ペプチドは、他のファミリーメンバーと低い相同性を共有する(Katoh M 2006,Int J Mol Med.17:951−5.)。
GDF15は、二塩基性切断部位で切断されて、カルボキシ末端成熟ペプチドを放出する、大きな前駆体タンパク質として合成される。マウスおよびラットGDF15プレプロペプチドはいずれも、303個のアミノ酸を含有する。ヒト全長前駆体は、308個のアミノ酸を含有する。齧歯類成熟ペプチドは、RGRR(配列番号1)切断部位でのプロセシング後に、115個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟ペプチドは、RGRRRAR(配列番号2)切断部位でのプロセシング後に、112個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟GDF15ペプチドは、ラットおよびマウス成熟GDF15ペプチドと66.1%および68.1%の配列類似性を共有する(Bottner M 1999,Gene.237:105−11、Bauskin AR 2000,EMBO J.19:2212−20、NCBI)。成熟GDF15ペプチドにはグリコシル化部位が存在しない。
成熟GDF15ペプチドは、TGFβスーパーファミリーのメンバーに一般的である、システインノットモチーフ(3つの鎖内ジスルフィド結合を有する)および単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要な7個の保存システイン残基を含有する。成熟GDF15ペプチドは、さらに、第4の鎖内ジスルフィド結合を形成する2つの追加のシステイン残基を含有する。生物学的に活性なGDF15は、1つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合された成熟ペプチドの25KDのホモ二量体である。
GDF15の血液循環レベルは、複数の病理学的および生理学的状態、最も顕著には妊娠(Moore AG 2000.J Clin Endocrinol Metab 85:4781−4788)、βサラセミア(Tanno T 2007,Nat Med 13:1096−101)(Zimmermann MB,2008 Am J Clin Nutr 88:1026−31)、および先天性赤血球異形成貧血(Tamary H 2008,Blood.112:5241−4)において上昇することが報告されている。GDF15はまた、文献報告において、複数の生物学的活性に関連付けられている。GDF15ノックアウトおよびトランスジェニックマウスの研究は、GDF15が、虚血/再灌流誘発性または過負荷誘発性の心臓損傷に対して保護効果があり(Kempf T,2006,Circ Res.98:351−60)(Xu J,2006,Circ Res.98:342−50)、加齢関連の運動ニューロンおよび感覚ニューロンの消失に対して保護効果があり(Strelau J,2009,J Neurosci.29 :13640−8)、腎臓の代謝性アシドーシスに対して軽度に保護効果がある可能性があり、癌患者の悪液質をもたらす可能性がある(Johnen H 2007 Nat Med.11:1333−40)ことを示唆した。また、多数のグループが細胞のアポトーシスおよび増殖におけるGDF15の役割を研究し、異なる細胞培養および異種移植モデルを用いて議論の余地のある結果を報告している。トランスジェニックマウスにおける研究は、GDF15が、腸および肺における発癌性物質またはApc突然変異に誘発される新生物形成に対して保護効果があることを示した(Baek SJ 2006,Gastroenterology.131:1553−60、Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2:450−8)。
Bootcov MR,1997,Proc Natl Acad Sci 94:11514−9
Hromas R 1997,Biochim Biophys Acta.1354:40−4
Lawton LN 1997,Gene.203:17−26
Paralkar VM 1998,J Biol Chem.273:13760−7
Baek SJ 2001,J Biol Chem.276:33384−92
Bottner M 1999,Gene.237:105−11
Katoh M 2006,Int J Mol Med.17:951−5
Bauskin AR 2000,EMBO J.19:2212−20
Moore AG 2000.J Clin Endocrinol Metab 85:4781−4788
Tanno T 2007,Nat Med 13:1096−101
Zimmermann MB,2008 Am J Clin Nutr 88:1026−31
Tamary H 2008,Blood.112:5241−4
Kempf T,2006,Circ Res.98:351−60
Xu J,2006,Circ Res.98:342−50
Strelau J,2009,J Neurosci.29 :13640−8
Johnen H 2007 Nat Med.11:1333−40
Baek SJ 2006,Gastroenterology.131:1553−60
Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2:450−8
GDF15ポリペプチドおよび1つ以上のFc配列を含む構築物を、本明細書に提供する。一実施形態において、構築物は、2つ以上のFc配列を含む。さらなる実施形態において、Fc配列のうちの1つ以上は、独立して、配列番号18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109、および111からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態において、Fc配列のうちの2つ以上は、結合される。なおもさらなる実施形態において、GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する。さらに別の実施形態において、GDF15ポリペプチドおよびFc配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、構築物は、配列番号44、50、57、61、65、69、74、79、84、95、および104からなる群から選択される配列を含む。なおもさらなる実施形態において、構築物は、配列番号18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109、および110からなる群から選択される配列をさらに含む。別の実施形態において、本明細書に記載される構築物を含む二量体を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、(a)配列番号18を含む配列および配列番号44を含む配列、(b)配列番号86を含む配列および配列番号50を含む配列、(c)配列番号18を含む配列および配列番号57を含む配列、(d)配列番号86を含む配列および配列番号61を含む配列、(e)配列番号86を含む配列および配列番号65を含む配列、(f)配列番号86を含む配列および配列番号69を含む配列、(g)配列番号86を含む配列および配列番号74を含む配列、(h)配列番号86を含む配列および配列番号79を含む配列、(i)配列番号86を含む配列および配列番号84を含む配列、(j)配列番号91を含む配列および配列番号95を含む配列、または(k)配列番号100を含む配列および配列番号104を含む配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
さらに、GDF15ポリペプチドおよび2つ以上のFc配列を含む構築物であって、1つ以上のFc配列は、独立して、配列番号23、110、114、および115からなる群から選択される配列を含む、構築物を、本明細書に提供する。一実施形態において、2つ以上のFc配列は、結合される。さらなる実施形態において、GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する。さらに別の実施形態において、GDF15ポリペプチドおよびFc配列は、リンカーによって接合される。なおもさらなる実施形態において、構築物は、配列番号113を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される構築物を含む二量体を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、配列番号110を含む配列および配列番号113を含む配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
GDF15ポリペプチドおよび2つ以上のFc配列を含む構築物であって、Fc配列が、配列番号28および配列番号30を含む、構築物もまた、本明細書に提供する。一実施形態において、2つのFc配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、リンカーは、配列番号87、88、および131からなる群から選択される配列を含む。なおも別の実施形態において、第1のFc配列のC末端は、第2のFc配列のN末端に接合される。さらに別の実施形態において、GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する。なおもさらなる実施形態において、GDF15ポリペプチドおよびFc配列は、リンカーによって接合される。別の実施形態において、リンカーは、配列番号31を含む。なおもさらなる実施形態において、本明細書に記載される構築物の二量体を含む構築物を提供する。具体的な実施形態において、構築物は、配列番号33、123、および128からなる群から選択される配列を含み、同様に、その構築物を含む二量体を含む。
本開示は、GDF15ポリペプチドおよびGDF15ポリペプチドを含む構築物を提供する。さらに、本開示の分子の生成、ならびに、例えば、2型糖尿病、高グルコースレベル、高インスリンレベル、脂質異常症、または肥満等、代謝性障害の治療におけるその使用を提供する。
実施例を含む本明細書において使用される組み換えポリペプチドおよび核酸の方法は、概して、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,Green Publishers Inc.およびWiley and Sons 1994)に記載されており、これらはいずれも、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
I. 一般定義
慣例に従って、本明細書に使用される際、「1つの(a)」および「1つの(an)」は、別途具体的に示されない限り、「1つ以上の」を意味する。
慣例に従って、本明細書に使用される際、「1つの(a)」および「1つの(an)」は、別途具体的に示されない限り、「1つ以上の」を意味する。
本明細書に使用される際、「アミノ酸」および「残基」という用語は互換可能であり、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、天然および合成の両方のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、および天然のアミノ酸に化学的に類似する非天然のアミノ酸を指す。
「天然のアミノ酸」および「天然にコードされるアミノ酸」という用語は、互換可能に使用され、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに合成後に修飾される遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびO−ホスホセリンを指す。
「アミノ酸類似体」は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホキシドである。このような類似体は、修飾R基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物である。例としては、アミド、β−、γ−、δ−イミノ酸(例えば、ピペリジン−4−カルボン酸)等のメタクリロイルまたはアクリロイル誘導体が挙げられる。
「非天然のアミノ酸」および「非天然にコードされるアミノ酸」という用語は、互換可能に使用され、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖に組み込まれない化合物を指す。「非天然のアミノ酸」にはまた、天然にコードされるアミノ酸(20種類の一般のアミノ酸を含むがこれらに限定されない)の修飾(例えば、翻訳後修飾)によって生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長するポリペプチドに天然に組み込まれないアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド配列に挿入され得るか、またはポリペプチド配列中の野生型残基と置換され得る、非天然のアミノ酸の非限定的な例の列挙としては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環式アミノ酸、および誘導体化された側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、(L型またはD型、括弧内に略す)シトルリン(Cit)、ホモシトルリン(hCit)、Nα−メチルシトルリン(NMeCit)、Nα−メチルホモシトルリン(Nα−MeHoCit)、オルニチン(Orn)、Nα−メチルオルニチン(Nα−MeOrnまたはNMeOrn)、サルコシン(Sar)、ホモリジン(hLysまたはhK)、ホモアルギニン(hArgまたはhR)、ホモグルタミン(hQ)、Nα−メチルアルギニン(NMeR)、Nα−メチルロイシン(Nα−MeLまたはNMeL)、N−メチルホモリジン(NMeHoK)、Nα−メチルグルタミン(NMeQ)、ノルロイシン(Nle)、ノルバリン(Nva)、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン(Tic)、オクタヒドロインドール−2−カルボン酸(Oic)、3−(1−ナフチル)アラニン(1−Nal)、3−(2−ナフチル)アラニン(2−Nal)、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン(Tic)、2−インダニルグリシン(IgI)、パラ−インドフェニルアラニン(pI−Phe)、パラ−アミノフェニルアラニン(4AmPまたは4−アミノ−Phe)、4−グアニジノフェニルアラニン(Guf)、グリシルリジン(「K(Nε−グリシル)」または「K(グリシル)」または「K(gly)」と略す)、ニトロフェニルアラニン(ニトロphe)、アミノフェニルアラニン(アミノpheまたはアミノ−Phe)、ベンジルフェニルアラニン(ベンジルphe)、γ−カルボキシグルタミン酸(γ−カルボキシglu)、ヒドロキシプロリン(ヒドロキシpro)、p−カルボキシ−フェニルアラニン(Cpa)、α−アミノアジピン酸(Aad)、Nα−メチルバリン(NMeVal)、N−α−メチルロイシン(NMeLeu)、Nα−メチルノルロイシン(NMeNle)、シクロペンチルグリシン(Cpg)、シクロヘキシルグリシン(Chg)、アセチルアルギニン(アセチルarg)、α,β−ジアミノプロピオン酸(Dpr)、α,γ−ジアミノ酪酸(Dab)、ジアミノプロピオン酸(Dap)、シクロヘキシルアラニン(Cha)、4−メチル−フェニルアラニン(MePhe)、β,β−ジフェニル−アラニン(BiPhA)、アミノ酪酸(Abu)、4−フェニル−フェニルアラニン(またはビフェニルアラニン;4Bip)、α−アミノ−イソ酪酸(Aib)、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、N−エチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、N−メチルグリシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルバリン、4−ヒドロキシプロリン(Hyp)、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−N,N,N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、4−アミノ−O−フタル酸(4APA)、N−アセチルグルコサミニル−L−セリン、N−アセチルグルコサミニル−L−スレオニン、O−ホスホチロシン、および他の類似のアミノ酸、ならびに具体的に列挙されたもののいずれかの誘導体化形態が挙げられる。
また、「非天然のアミノ酸」という定義には、構造
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、カルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸残基は、アジド基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アルキン基を含む。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造
「置換された」という用語は、分子上の水素原子または基が、置換基と称される基または原子と置き換えられることを意味する。典型的な置換基には、ハロゲン、C1−8アルキル、ヒドロキシ、C1−8アルコキシ、−NRxRx、ニトロ、シアノ、ハロもしくはペルハロC1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、−SRx、−S(=O)2Rx、−C(=O)ORx、−C(=O)Rxが挙げられ、式中、各Rxは、独立して、水素またはC1−C8アルキルである。置換基が−NRxRxである場合、Rx基は、窒素原子と一緒に接合されて環を形成し得ることに留意されたい。
「アルキル」という用語は、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルキル基の代表的な例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、sec−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。典型的なアルキル基は、1〜8個の炭素原子を有するアルキル基であり、この基は一般にC1−8アルキルとして表される。
「アルコキシ」という用語は、酸素原子に結合したアルキル基を意味する。アルコキシ基の代表的な例には、メトキシ、エトキシ、tert−ブトキシ、プロポキシ、およびイソブトキシが挙げられる。一般的なアルコキシ基は、C1−8アルコキシである。
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、フッ素、臭素、またはヨウ素を意味する。
「アルケニル」という用語は、1つ以上の炭素−炭素二重結合を有する分岐鎖または直鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基の代表的な例には、エテニル、プロペニル、アリル、ブテニル、および4−メチルブテニルが挙げられる。一般的なアルケニル基は、C2−8アルケニルである。
「アルキニル」という用語は、1つ以上の炭素−炭素三重結合を有する分岐鎖または直鎖の炭化水素を意味する。アルキニル基の代表的な例には、エチニル、プロピニル(プロパルギル)、およびブチニルが挙げられる。一般的なアルキニル基は、C2−8アルキニルである。
「シクロアルキル」という用語は、環式非芳香族炭化水素を意味する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが挙げられる。シクロアルキル基は、1つ以上の二重結合を含有し得る。二重結合を含有するシクロアルキル基の例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、およびシクロブタジエニルが挙げられる。一般的なシクロアルキル基は、C3−8シクロアルキル基である。
「ペルフルオロアルキル」という用語は、水素原子の全てが、フッ素原子で置き換えられているアルキル基を意味する。一般的なペルフルオロアルキル基は、C1−8ペルフルオロアルキルである。一般的なペルフルオロアルキル基の例は、_CF3である。
「アシル」という用語は、ヒドロキシ基(−OH)の除去により有機酸から誘導される基を意味する。例えば、アシル基CH3C(=O)_は、CH3C(=O)OHからヒドロキシ基を除去することにより形成される。
「アリール」という用語は、環式芳香族炭化水素を意味する。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが挙げられる。一般的なアリール基は、6〜13員環である。
本明細書に使用される「ヘテロ原子」という用語は、酸素、窒素、または硫黄原子を意味する。
「ヘテロアリール」という用語は、アリール基の1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられている、環式芳香族炭化水素を意味する。ヘテロアリール基は、1つを上回るヘテロ原子を含有し、このヘテロ原子は、同じかまたは異なり得る。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピラジニル、ピロリル、インドリル、トリアゾリル、ピリダジニル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリル、キノリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、イソチアゾリル、およびベンゾ[b]チエニルが挙げられる。一般的なヘテロアリール基は、1〜4個のヘテロ原子を含有する5〜13員環である。1〜3個のヘテロ原子を含有する5および6員環であるヘテロアリール基が、特に一般的である。
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素原子のうちの1つ以上がヘテロ原子と置き換えられている、シクロアルキル基を意味する。ヘテロシクロアルキル基が、1つを上回るヘテロ原子を含有する場合、このヘテロ原子は、同じかまたは異なってもよい。ヘテロシクロアルキル基の例には、テトラヒドロフリル、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、およびピロリジニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基が、1つ以上の二重結合を有するが芳香族ではないこともまた、可能である。二重結合を含有するヘテロシクロアルキル基の例には、ジヒドロフランが挙げられる。一般的なヘテロシクロアルキル基は、1〜4個のヘテロ原子を含有する3〜10員環である。1〜2個のヘテロ原子を含有する5および6員環であるヘテロシクロアルキル基が、特に一般的である。
環式環基、すなわち、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、1つを上回る環を含み得ることにも留意されたい。例えば、ナフチル基は、縮合二環式環系である。本発明は、架橋原子を有する環基またはスピロ配置を有する環基を含むこともまた意図される。
1または2個のヘテロ原子を任意に有する、5〜6員芳香環の代表的な例は、フェニル、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリジアジニル、ピリミジニル、およびピラジニルである。
1〜3個のヘテロ原子を任意に有する、部分飽和、完全飽和、または完全不飽和の5〜8員環の代表的な例は、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびフェニルである。さらなる例となる5員環は、フリル、チエニル、ピロリル、2−ピロリニル、3−ピロリニル、ピロリジニル、1,3−ジオキソラニル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、2H−イミダゾリル、2−イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、2−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、1,2−ジチオリル、1,3−ジチオリル、3H−1,2−オキサチオリル、1,2,3−オキサジザオリル(oxadizaolyl)、1,2,4−オキサジアゾリル、1,2,5−オキサジアゾリル、1,3,4オキサジアゾリル、1,2,3−トリアゾリル、1,2,4−トリザオリル(trizaolyl)、1,3,4−チアジアゾリル、3H−1,2,3−ジオキサゾリル、1,2,4−ジオキサゾリル、1,3,2−ジオキサゾリル、1,3,4−ジオキサゾリル、5H−1,2,5−オキサチアゾリル、および1,3−オキサチオリルである。
さらなる例となる6員環は、2H−ピラニル、4H−ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、1,2−ジオキシニル、1,3−ジオキシニル、1,4−ジオキサニル、モルホリニル、1,4−ジチアニル、チオモルホリニル、ピンダジニル(pyndazinyl)、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、1,3,5−トリアジニル、1,2,4−トリアジニル、1,2,3−トリアジニル、1,3,5−トリチアニル、4H−1,2−オキサジニル、2H−1,3−オキサジニル、6H−1,3−オキサジニル、6H−1,2−オキサジニル、1,4−オキサジニル、2H−1,2−オキサジニル、4H−1,4−オキサジニル、1,2,5−オキサチアジニル、1,4−オキサジニル、o−イソオキサジニル、p−イソオキサジニル、1,2,5−オキサチアジニル、1,2,6−(3オキサチアジニル、および1,4,2−オキサジアジニルである。
さらなる例となる7員環は、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、および1,2,4−トリアゼピニルである。
さらなる例となる8員環は、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルである。
1〜4個のヘテロ原子を任意に有する、2個の縮合部分飽和、完全飽和、または完全不飽和の5および/または6員環を含有する例となる二環式環は、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、シクロペンタ(b)ピリジニル、ピラノ(3,4−b)ピロリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾ(b)チエニル、ベンゾ(c)チエニル、1H−インダゾリル、インドキサジニル、ベンゾオキサゾリル、アントラニリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、1,8−ナフチリジニル、プテリジニル、インデニル、イソインデニル、ナフチル、テトラリニル、デカリニル、2H−1−ベンゾピラニル、ピリド(3,4−b)ピリジニル、ピリド(3,2−b)ピリジニル、ピリド(4,3−b)−ピリジニル、2H−1,3−ベンゾオキサジニル、2H−1,4−ベンゾオキサジニル、1H−2,3−ベンゾオキサジニル、4H−3,1−ベンゾオキサジニル、2H−1,2−ベンゾオキサジニル、および4H−1,4−ベンゾオキサジニルである。
環式環基が、1つを上回る方式で別の基に結合してもよい。具体的な結合配設が指定されない場合、全ての可能性のある配設が意図される。例えば、「ピリジル」という用語には、2−、3−、または4−ピリジルが含まれ、「チエニル」という用語には、2−または3−チエニルが含まれる。
「単離核酸分子」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、または全核酸を供給源細胞から単離する際に核酸が天然に見出される他の物質の、少なくとも約50パーセントから分離されている、5’から3’末端の方向に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマー(例えば、本明細書に提供されるGDF15核酸配列)またはその類似体を指す。好ましくは、単離核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、あるいはポリペプチド生成におけるその使用またはその治療、診断、予防、もしくは研究のための使用を妨げるであろう、その核酸の天然環境に見られる他の分子を、実質的に含まない。
「単離ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、または供給源細胞から単離する際にポリペプチドが天然に見出される他の物質の、少なくとも約50パーセントから分離されている、ポリペプチド(例えば、本明細書に提供されるGDF15ポリペプチド配列)を指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチド、またはその治療、診断、予防、もしくは研究のための使用を妨げるであろう、その天然環境に見られる他の混入物質を、実質的に含まない。
「コードする」という用語は、1つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始または終止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列によって提供される異なるリーディングフレームのうちのいずれか1つにおいてコードされ得る。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一な」およびパーセント「同一性」という用語は、同じである2つ以上の配列または部分配列を指す。「パーセント同一性」とは、比較される分子のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一な残基のパーセントを意味し、比較される分子のうちの最も小さいものの寸法に基づいて計算される。これらの計算については、アライメント中のギャップ(存在する場合)は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって対処することができる。アライメントされる核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),(1988)New York:Oxford University Press、Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press、von Heinje,G.,(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press、Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press、およびCarillo et al.,(1988)SIAM J.Applied Math.48:1073に記載されるものが含まれる。
パーセント同一性を計算する際、比較する配列は、配列間に最大の一致が得られる方式でアライメントされる。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、GAPを含む、GCGプログラムパッケージである(Devereux et al.,(1984)Nucl.Acid Res.12:387;Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。コンピュータアルゴリズムGAPを使用して、パーセント配列同一性を決定する2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアライメントする。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致(アルゴリズムによって判定される「一致範囲」)についてアライメントされる。ギャップ開始ペナルティ(平均対角成分の3倍として計算され、「平均対角成分」とは、使用される比較行列の対角成分の平均であり、「対角成分」とは、特定の比較行列によって、それぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数である)およびギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開始ペナルティの1/10)、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62等の比較行列を、アルゴリズムと併せて使用する。ある特定の実施形態において、標準的な比較行列(PAM 250比較行列についてはDayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345−352、BLOSUM 62比較行列についてはHenikoff et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915−10919を参照されたい)もまた、アルゴリズムにより使用される。
GAPプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨パラメータは、次のものである。
アルゴリズム:Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.48:443−453
比較行列:Henikoff et al.,1992(上記)からのBLOSUM 62
ギャップペナルティ:12(末端ギャップはペナルティなし)
ギャップ長ペナルティ:4
類似性の閾値:0
アルゴリズム:Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.48:443−453
比較行列:Henikoff et al.,1992(上記)からのBLOSUM 62
ギャップペナルティ:12(末端ギャップはペナルティなし)
ギャップ長ペナルティ:4
類似性の閾値:0
2つのアミノ酸配列をアライメントするためのある特定のアライメントスキームは、2つの配列の短い領域のみの一致をもたらす場合があり、この短いアライメントした領域は、2つの全長配列の間に重大な関係がない場合であっても、非常に高い配列同意性を有し得る。したがって、選択されるアライメント方法(例えば、GAPプログラム)は、標的ポリペプチドの少なくとも50個の連続したアミノ酸に及ぶアライメントを得ることが望ましい場合には、調整することができる。
「GDF15ポリペプチド」および「GDF15タンパク質」という用語は、互換可能に使用され、ヒトまたはマウスといった哺乳動物に発現される、天然の野生型ポリペプチドを意味する。本開示の目的で、「GDF15ポリペプチド」という用語は、308個のアミノ酸残基からなり、配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされる、任意の全長GDF15ポリペプチド、例えば、配列番号4;279個のアミノ酸残基からなり、配列番号7のヌクレオチド配列によってコードされ、全長GDF15ポリペプチドのアミノ末端で29個のアミノ酸残基(すなわち、シグナルペプチドを構築する)が除去されている、ポリペプチドの活性およびプロドメインを含む任意の形態、例えば、配列番号8;ならびに、112個のアミノ酸残基からなり、配列番号11のヌクレオチド配列によってコードされ、シグナル配列およびプロドメインが除去されている、プロドメインおよびシグナル配列が除去されている、活性ドメインを含むポリペプチドの任意の形態、例えば、配列番号12を指して互換可能に使用され得る。GDF15ポリペプチドは、組み換えによって導入されるか、または細菌発現プロセスの結果として導入され得る、アミノ末端メチオニンを含み得るが、必ずしも含む必要はない。
「GDF15突然変異体ポリペプチド」という用語は、天然のGDF15ポリペプチド配列(例えば、配列番号4、8、または12)が修飾されているGDF15ポリペプチドを包含する。このような修飾には、非天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣体との置換を含む、1つ以上のアミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されない。
一態様において、「GDF15突然変異体ポリペプチド」という用語は、通常は天然のGDF15ポリペプチドの所定の位置に見られる少なくとも1つの残基が、欠失しているか、または通常は天然のGDF15配列におけるその位置に見られない残基によって置き換えられている、GDF15ポリペプチド配列(例えば、配列番号4、8、または12)を指す。いくつかの場合において、通常は天然のGDF15ポリペプチドの所定の位置に見られる単一の残基を、通常はその位置に見られない1つを上回る残基と置き換えることが望ましく、さらに他の場合においては、天然のGDF15ポリペプチド配列を維持し、そのタンパク質の所定の位置に1つ以上の残基を挿入することが望ましい可能性があり、なおも他の場合においては、所定の残基を完全に欠失させることが望ましい可能性があり、これらの構築物のすべては、「GDF15突然変異体ポリペプチド」という用語に包含される。
種々の実施形態において、GDF15突然変異体ポリペプチドは、天然のGDF15ポリペプチド(例えば、配列番号4、8、または12)に少なくとも約85%同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、GDF15ポリペプチドは、天然のGDF15ポリペプチドアミノ酸配列(例えば、配列番号4、8、または12)に少なくとも約90パーセント、または約95、96、97、98、もしくは99パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。このようなGDF15突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力、またはグルコース耐性、エネルギー消費、またはインスリン感受性を改善する能力といった、野生型GDF15突然変異体ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有するが、必ずしも有する必要はない。本発明はまた、このようなGDF15突然変異体ポリペプチド配列をコードする核酸分子を包含する。
本明細書に記載のように、GDF15突然変異体ポリペプチドは、シグナル配列(配列番号4の残基1〜29)を含んでもよく、または、シグナル配列が除去されていてもよい(配列番号8をもたらす)。他の実施形態において、GDF15突然変異体ポリペプチドは、シグナル配列が除去されていてもよく、さらに、残基196で切断され、プロドメインの主要配列(配列番号4の残基30〜196)を活性ドメインの主要配列から分離してもよい。GDF15突然変異体ポリペプチド天然の生物学的に活性な形態は、プロセシングされた成熟ペプチド(配列番号12;配列番号4の残基197〜308)を含むホモ二量体である。GDF15ポリペプチドおよびGDF15突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物は、主としてヒトGDF15に関して開示されているが、本発明は、それに限定されず、GDF15ポリペプチドおよびGDF15突然変異体ポリペプチドが他の種(例えば、カニクイザル、マウス、およびラット)に由来する、GDF15ポリペプチドおよびGDF15突然変異体ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む構築物にも及ぶ。いくつかの事例において、対象における代謝性障害を治療または緩和するために使用できるGDF15ポリペプチドまたはGDF15突然変異体ポリペプチドは、対象と同じ種に由来するGDF15突然変異体ポリペプチドの成熟形態である。
GDF15突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、生物学的に活性である。様々な個別の実施形態において、GDF15ポリペプチドまたはGDF15突然変異体ポリペプチドは、シグナルペプチドが全長GDF15突然変異体ポリペプチド配列のN末端から除去されており、プロドメインが活性ドメインから切断されている(が、除去されていなくてもよい)成熟GDF15タンパク質またはGDF15突然変異体ポリペプチドの天然の形態のものと同等、それよりも高い、またはそれよりも低い、生物学的活性を有する。生物学的活性の例には、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力、またはグルコース耐性、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力、尿中グルコースおよびタンパク質分泌を低下させる能力が挙げられる。
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、本明細書に使用される際、治療される疾患または障害の症状の軽減または緩和を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって求められる、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医薬的応答を誘起する、GDF15またはGDF15突然変異体ポリペプチドの量、すなわち、観察可能なレベルの1つ以上の所望される生物学的または医学的応答、例えば、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下、体重の減少、またはグルコース耐性、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の改善を支持する、GDF15またはGDF15突然変異体ポリペプチドの量を意味する。
II. GDF15ポリペプチドおよびGDF15を含む構築物(その突然変異体形態を含む)、ならびにポリヌクレオチド
様々なGDF15ポリペプチドおよびGDF15ポリペプチドを含む構築物を、本明細書に提供する。これらの分子のうちのいくつかを、本明細書で以下に提示される実施例に記載のように、種々のアッセイにおいて研究した。本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよびGDF15ポリペプチドを含む構築物には、以下に記載のものが含まれる。
様々なGDF15ポリペプチドおよびGDF15ポリペプチドを含む構築物を、本明細書に提供する。これらの分子のうちのいくつかを、本明細書で以下に提示される実施例に記載のように、種々のアッセイにおいて研究した。本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよびGDF15ポリペプチドを含む構築物には、以下に記載のものが含まれる。
II.A. 天然の成熟GDF15およびその変異体
II.A.1 天然の成熟GDF15
GDF15の生物学的に活性な形態は、ホモ二量体を含み、本開示において「天然の成熟GDF15二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号12を含む2つの成熟GDF15単量体を含む、ホモ二量体を指すことに留意されたい。ホモ二量体化して天然の成熟GDF15二量体を形成する単量体は、核酸配列
II.A.1 天然の成熟GDF15
GDF15の生物学的に活性な形態は、ホモ二量体を含み、本開示において「天然の成熟GDF15二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号12を含む2つの成熟GDF15単量体を含む、ホモ二量体を指すことに留意されたい。ホモ二量体化して天然の成熟GDF15二量体を形成する単量体は、核酸配列
したがって、「天然の成熟GDF15二量体」は、配列番号12を含む2つの共有結合される単量体を含む。
いくつかの実施形態において、リーダーまたはシグナル配列を使用して、ポリペプチドの分泌を指示することができる。シグナル配列は、ポリペプチドコード領域の5’末端内、またはそこに直接位置付けられ得る。多数のシグナル配列、例えば、VH21シグナル配列(VH21シグナル配列の考察についてはEP2330197号を参照されたい)が特定されており、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して天然の成熟GDF15二量体を形成する単量体は、核酸配列(VH21シグナル配列を下線で示す):
II.A.2 成熟GDF15(H6D)変異体
GDF15(H6D)変異体は、C→G多型による天然のヒトGDF15変異体であり、全長ペプチド(配列番号4)における残基202、成熟ペプチド(配列番号12)における残基6に、HisからAspへの変化をもたらす。
GDF15(H6D)変異体は、C→G多型による天然のヒトGDF15変異体であり、全長ペプチド(配列番号4)における残基202、成熟ペプチド(配列番号12)における残基6に、HisからAspへの変化をもたらす。
本開示において「成熟GDF15(H6D)二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号38を含む2つの成熟GDF15(H6D)単量体を含む、ホモ二量体を指す。ホモ二量体化して成熟GDF15(H6D)二量体を形成する単量体は、核酸配列:
したがって、「成熟GDF15(H6D)二量体」は、配列番号38を含む2つの共有結合される単量体を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して成熟GDF15(H6D)二量体を形成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
II.A.3 成熟GDF15(N3Q)変異体
GDF15(N3Q)変異体は、N脱アミド化の可能性を回避するために成熟ペプチド(配列番号12)の残基3におけるAsnがGlnで置き換えられたヒトGDF15突然変異体である。
GDF15(N3Q)変異体は、N脱アミド化の可能性を回避するために成熟ペプチド(配列番号12)の残基3におけるAsnがGlnで置き換えられたヒトGDF15突然変異体である。
本開示において「成熟GDF15(N3Q)二量体」と示される構築物は、それぞれが配列番号42を含む2つの成熟GDF15(N3Q)単量体を含む、ホモ二量体を指す。ホモ二量体化して成熟GDF15(N3Q)二量体を形成する単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ホモ二量体化して天然の成熟GDF15二量体を形成する単量体は、核酸配列(下線で示される、切断されたVH21シグナル配列を含む):
したがって、「成熟GDF15(N3Q)二量体」は、配列番号42を含む共有結合される2つの単量体を含む。
II.B. 荷電対(delHinge)構築物
本開示において、「荷電対(delHinge)」または「荷電対(delHinge)Fc」と示される構築物は、(i)ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「負の電荷を有する」Fc配列、および(ii)ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「正の電荷を有する」Fc配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため(すなわち、Fc配列における電荷対の性質を示すため)であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
本開示において、「荷電対(delHinge)」または「荷電対(delHinge)Fc」と示される構築物は、(i)ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「負の電荷を有する」Fc配列、および(ii)ヒンジ領域を欠き、荷電対突然変異を含む、「正の電荷を有する」Fc配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため(すなわち、Fc配列における電荷対の性質を示すため)であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
アスパラギン酸(aspartatic acid)からリジンへの突然変異(E356K)およびグルタミン酸からリジンへの突然変異(D399K)の、ヒンジ領域を欠く非修飾Fc配列への導入は、ヒンジ領域を欠く正の電荷を有するFc配列(本明細書に「DhCpmFc(+)」と称される)をもたらす。リジンからアスパラギン酸への2つの突然変異(K392D、K409D)の、ヒンジ領域を欠く非修飾Fc配列への導入は、ヒンジ領域を欠く負の電荷を有するFc配列(本明細書に「DhCpmFc(−)」と称される)をもたらす。場合によっては、C末端リジン(K477)もまた、負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列、正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列、またはその両方において欠失していてもよい。例えば、配列番号18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109、および111(DhCpmFc配列)を参照されたい。
一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、DhCpmFc(+)配列とDhCpmFc(−)配列との間のFcヘテロ二量体の形成を促進し、DhCpmFc(+)配列間またはDhCpmFc(−)配列間のFcホモ二量体の形成を低減または阻止する。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体は、(i)直接またはリンカーを介してDhCpmFc(−)のC末端に連結された成熟GDF15配列、および(ii)DhCpmFc(+)を含む。他の実施形態において、ヘテロ二量体は、(i)直接またはリンカーを介してDhCpmFc(+)のC末端に連結された成熟GDF15配列、および(ii)DhCpmFc(−)を含む。いずれの場合においても、2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された2つのヘテロ二量体を含む四量体の図による描写については、図1を参照されたく、ここで、各ヘテロ二量体は、本開示において「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物である(すなわち、各ヘテロ二量体が、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟GDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含む)。
II.B.1 DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)
本開示において「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む構築物を指す。負の電荷を有するDhCpmFc(−)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む構築物を指す。負の電荷を有するDhCpmFc(−)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物は、
(a)配列:
(a)配列:
GDF15ポリペプチドは、配列:
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体)は、配列番号18を含む2つの単量体および配列番号44を含む2つの単量体を含む。
II.B.2 DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列:
(a)配列:
GDF15ポリペプチドは、配列番号20を含むリンカーを介して、GDF15ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体とともに四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号50を含む2つの単量体を含む。
II.B.3.DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(+)
本開示において「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(+)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。負の電荷を有するDhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D)鎖は、正の電荷を有するDhCpmFc(+)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(H6D)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(+)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してDhCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。負の電荷を有するDhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D)鎖は、正の電荷を有するDhCpmFc(+)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(H6D)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(+)四量体は、
(a)配列番号18を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号19を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号38を含む、成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号18を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号19を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号38を含む、成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15(H6D)ポリペプチドは、配列番号20を含むリンカーを介して、GDF15(H6D)ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって負の電荷を有するFc配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号46の核酸配列によってコードされ、配列番号18のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号17の核酸配列によってコードされ、配列番号45のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(+)構築物の二量体)は、配列番号18を含む2つの単量体および配列番号57を含む2つの単量体を含む。
II.B.4.DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)のリンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドを含む単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D)鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(H6D)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)のリンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドを含む単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D)鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(H6D)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号38を含む、成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号38を含む、成熟ヒトGDF15(H6D)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15(H6D)ポリペプチドは、配列番号20を含むリンカーを介して、GDF15(H6D)ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号61を含む2つの単量体を含む。
II.B.5.DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)のリンカーを介してDhCpmFc(+)”)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(N3Q)ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q)鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(N3Q)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)のリンカーを介してDhCpmFc(+)”)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15(N3Q)ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q)鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15(N3Q)配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号42を含む、成熟ヒトGDF15(N3Q)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号42を含む、成熟ヒトGDF15(N3Q)ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15(N3Q)ポリペプチドは、配列番号20を含むリンカーを介して、GDF15(N3Q)ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号65を含む2つの単量体を含む。
II.B.6. DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)DhCpmFc(+)配列のC末端に連結された1つの成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)DhCpmFc(+)配列のC末端に連結された1つの成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15ポリペプチドは、GDF15ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号19を含む2つの単量体および配列番号69を含む2つの単量体を含む。
II.B.7.DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−G4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−G4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15ポリペプチドは、
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(切断されるシグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号74を含む2つの単量体を含む。
II.B.8.DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)2(配列番号75)のリンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4S)2(配列番号75)のリンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15ポリペプチドは、配列
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号79を含む2つの単量体を含む。
II.B.9.DhCpmFc(+)−(G4Q)2−GDF15:DhCpmFc(−)
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4Q)4(配列番号80)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「DhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15:DhCpmFc(−)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)(G4Q)4(配列番号80)リンカーを介してDhCpmFc(+)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)DhCpmFc(−)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。正の電荷を有するDhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15:DhCpmFc(−)四量体は、
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
(a)配列番号85を含む、組み換えの正の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、
(b)配列番号86を含む、組み換えの負の電荷を有するFc配列の2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)、および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖(各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15ポリペプチドは、配列
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号53の核酸配列によってコードされ、配列番号86のアミノ酸配列を含む。
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、配列番号51の核酸配列によってコードされ、配列番号52のアミノ酸配列を含む。
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15:DhCpmFc(−)構築物の二量体)は、配列番号86を含む2つの単量体および配列番号84を含む2つの単量体を含む。
II.B.10.DhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)
本開示において「DhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介してヒンジ領域を欠く正の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(+)(L351C)」と称される)のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、およびヒンジ領域を欠く1つの負の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(−)(L351C)」と称される)を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。
本開示において「DhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介してヒンジ領域を欠く正の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(+)(L351C)」と称される)のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、およびヒンジ領域を欠く1つの負の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(−)(L351C)」と称される)を含むヘテロ二量体を含む、構築物である。
上で論じたように、ヒンジ領域を欠く非修飾Fc配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異(E356K)およびグルタミン酸からリジンへの突然変異(D399K)の導入は、正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列をもたらす。2つのリジンからアスパラギン酸への突然変異(K392D、K409D)の導入は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列をもたらす。C末端リジン(K477)はまた、場合によって、負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列、正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列、またはその両方において、欠失していてもよい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、DhCpmFc(+)配列とDhCpmFc(−)配列との間のFcヘテロ二量体の形成を促進し、DhCpmFc(+)配列間またはDhCpmFc(−)配列間のFcホモ二量体の形成を低減または阻止する。
正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列におけるロイシンからシステインへの突然変異(L351C)(本明細書に「DhCpmFc(+)(L351C)」と称される)および負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列におけるロイシンからシステインへの突然変異(L351C)(本明細書に「DhCpmFc(−)(L351C)」と称される)の導入は、DhCpmFc(+)(L351C)配列とDhCpmFc(−)(L351C)配列との間のFcヘテロ二量体の形成を、それらの間のジスルフィド結合(または「システインクランプ」)の形成によって、さらに強化する。正の電荷を有するDhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)(L351C)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)四量体は、
(a)
(a)
および
(c)配列番号12を含む、天然の成熟ヒトGDF15ポリペプチドの2つの鎖各ヘテロ二量体に1つ)を含む。
GDF15ポリペプチドは、配列番号70を含むリンカーを介して、GDF15ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc(L351C)配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)(L351C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)構築物の二量体は、配列番号91を含む2つの単量体および配列番号95を含む2つの単量体を含む。
II.B.11. DhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)
本開示において「DhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介して、ヒンジ領域を欠く正の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(+)(S354C)」と称される)のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、およびヒンジ領域を欠く1つの負の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(−)(Y349C)」と称される)を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。
本開示において「DhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)」と示される荷電対(delHinge)構築物は、(i)G4(配列番号70)リンカーを介して、ヒンジ領域を欠く正の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(+)(S354C)」と称される)のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、およびヒンジ領域を欠く1つの負の電荷を有するFc単量体(本明細書に「DhCpmFc(−)(Y349C)」と称される)を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。
本明細書に記載のように、ヒンジ領域を欠く非修飾Fc配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異(E356K)およびグルタミン酸からリジンへの突然変異(D399K)の導入は、正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列をもたらす。2つのリジンからアスパラギン酸への突然変異(K392D、K409D)の導入は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列をもたらす。C末端リジン(K477)はまた、場合によって、負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列、正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列、またはその両方において、欠失していてもよい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、静電力を通じてリジン残基と結合し、DhCpmFc(+)配列とDhCpmFc(−)配列との間のFcヘテロ二量体の形成を促進し、DhCpmFc(+)配列間またはDhCpmFc(−)配列間のFcホモ二量体の形成を低減または阻止する。
正の電荷を有するDhCpmFc(+)配列におけるロイシンからシステインへの突然変異(S354C)(本明細書に「DhCpmFc(+)(S354C)」と称される)および負の電荷を有するDhCpmFc(−)配列におけるロイシンからシステインへの突然変異(Y349C)(本明細書に「DhCpmFc(−)(L351C)」と称される)の導入は、2つのDhCpmFc(+)(S354C)配列とDhCpmFc(−)(Y349C)配列との間のFcヘテロ二量体の形成を、それらの間のジスルフィド結合(または「システインクランプ」)の形成によって、さらに強化する。正の電荷を有するDhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15鎖は、負の電荷を有するDhCpmFc(−)(Y349C)鎖と結合する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、DhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)四量体は、
(a)配列:
(a)配列:
GDF15ポリペプチドは、配列番号70を含むリンカーを介して、GDF15ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって正の電荷を有するFc(S354C)配列に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(DhCpmFc(+)(S354C)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)構築物の二量体)は、配列番号100を含む2つの単量体および配列番号104を含む2つの単量体を含む。
II.C. 荷電対構築物
本開示において「荷電対」または「荷電対Fc」と示される構築物は、電荷対突然変異を含む「負の電荷を有する」Fc配列、および(ii)荷電対突然変異を含む、正の電荷を有するFc配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため(すなわち、Fc配列における電荷対突然変異の性質を示すため)であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
本開示において「荷電対」または「荷電対Fc」と示される構築物は、電荷対突然変異を含む「負の電荷を有する」Fc配列、および(ii)荷電対突然変異を含む、正の電荷を有するFc配列を含む、構築物を指す。「正の電荷を有する」および「負の電荷を有する」という用語の使用は、参照の容易さのため(すなわち、Fc配列における電荷対突然変異の性質を示すため)であり、全体の配列または構築物が、正または負の電荷を有する必要があることを示すものではないことに留意されたい。
非修飾Fc配列におけるアスパラギン酸からリジンへの突然変異(E356K)およびグルタミン酸からリジンへの突然変異(D399K)の導入は、正の電荷を有するFc配列(本明細書に「CpmFc(+)」と称される)をもたらす。非修飾Fc配列への2つのリジンからアスパラギン酸への突然変異(K392D、K409D)の導入は、負の電荷を有するFc配列(本明細書に「CpmFc(−)」と称される)をもたらす。C末端リジン(K477)はまた、場合によって、負の電荷を有するCpmFc(−)配列、正の電荷を有するCpmFc(+)配列、またはその両方において、欠失していてもよい。例えば、配列番号23、110、114、および115(CpmFc配列)を参照されたい。一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基は、リジン残基と結合し、CpmFc(+)配列とCpmFc(−)配列都の間のFcヘテロ二量体の形成を促進し、CpmFc(+)配列間およびCpmFc(−)配列間のFcホモ二量体の形成を低減または阻止する。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体は、(i)直接またはリンカーを介してCpmFc(−)のC末端に連結された成熟GDF15配列、および(ii)CpmFc(+)を含む。他の実施形態において、ヘテロ二量体は、(i)直接またはリンカーを介してCpmFc(+)のC末端に連結された成熟GDF15配列、および(ii)CpmFc(−)を含む。いずれの場合においても、2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された2つのヘテロ二量体を含む四量体の図による描写については、図1を参照されたく、そこでは、各ヘテロ二量体は、本開示において「CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15CpmFc(−)」と示される荷電対構築物である(すなわち、各ヘテロ二量体が、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してCpmFc(−)配列のCの末端に連結された成熟GDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)CpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含む)。
CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)
本開示において「CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)」と示される荷電対構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)CpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。ヒンジ領域は存在するが、負の電荷を有するCpmFc(−)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
本開示において「CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)」と示される荷電対構築物は、(i)(G4S)4(配列番号20)リンカーを介してCpmFc(−)配列のC末端に連結された成熟ヒトGDF15ポリペプチドを含む第1の単量体、および(ii)CpmFc(+)配列を含む第2の単量体を含むヘテロ二量体を含む、構築物を指す。ヒンジ領域は存在するが、負の電荷を有するCpmFc(−)−(G4S)4−hGDF15鎖は、負の電荷を有するCpmFc(−)鎖と結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、ヘテロ二量体が2つのヒトGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、四量体を形成する。
より具体的には、特定の実施形態において、CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)構築物は、
(a)配列(ヒンジ領域を括弧で示す):
(a)配列(ヒンジ領域を括弧で示す):
GDF15ポリペプチドは、配列番号20を含むリンカーを介して、GDF15ポリペプチドのN末端で、ペプチド結合によって負の電荷を有するFc単量体に融合される。
その最終形態において、ヘテロ二量体(別のこのようなヘテロ二量体と四量体を形成する)を構成する第1の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態において、ヘテロ二量体を構成する第1の単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
ヘテロ二量体を構成する第2の単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態において、ヘテロ二量体を構成する単量体は、核酸配列(シグナル配列を下線で示す):
第1および第2の単量体が結合して、ヘテロ二量体を形成する。2つのこのようなヘテロ二量体が結合して、最終的な四量体を形成する。したがって、結果として得られる四量体(CpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)構築物の二量体)は、配列番号110を含む2つの単量体および配列番号113を含む2つの単量体を含む。
II.D. ヘミFc構築物
本開示において「ヘミ」または「ヘミFc」と示される構築物は、第1のFc配列(例えば、配列番号28または30)のN末端を第2のFc配列(例えば、配列番号28または30)のC末端に接続するリンカーによって、タンデムに接合された2つのFc配列を含む構築物を指す。いくつかの実施形態において、単量体は、GDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する第1のリンカーによって第1のFc配列に連結された成熟GDF15配列を含み、第1のFc配列は、第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続する第2のリンカーによって第2のFc配列に連結される。第1および第2のFc配列はまた、Fcヒンジ領域によって結合される。2つのこのような単量体が結合して、単量体が2つのGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。ヘミ構築物「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」の図による描写については、図1を参照されたい(すなわち、それぞれが、GS(G4S)4リンカーによって第1のFc配列のC末端に連結され、そのN末端が(G4S)8リンカーを介して第2のFc配列のC末端に連結された成熟GDF15ポリペプチドを含む、2つの単量体であり、この2つの成熟GDF15配列が鎖間ジスルフィド結合を介して連結される)。
本開示において「ヘミ」または「ヘミFc」と示される構築物は、第1のFc配列(例えば、配列番号28または30)のN末端を第2のFc配列(例えば、配列番号28または30)のC末端に接続するリンカーによって、タンデムに接合された2つのFc配列を含む構築物を指す。いくつかの実施形態において、単量体は、GDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する第1のリンカーによって第1のFc配列に連結された成熟GDF15配列を含み、第1のFc配列は、第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続する第2のリンカーによって第2のFc配列に連結される。第1および第2のFc配列はまた、Fcヒンジ領域によって結合される。2つのこのような単量体が結合して、単量体が2つのGDF15配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。ヘミ構築物「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」の図による描写については、図1を参照されたい(すなわち、それぞれが、GS(G4S)4リンカーによって第1のFc配列のC末端に連結され、そのN末端が(G4S)8リンカーを介して第2のFc配列のC末端に連結された成熟GDF15ポリペプチドを含む、2つの単量体であり、この2つの成熟GDF15配列が鎖間ジスルフィド結合を介して連結される)。
II.D.1 Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15
本開示において「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に連結された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続するアミノ酸配列:
本開示において「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に連結された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続するアミノ酸配列:
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミ構築物Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、配列(ヒンジ領域を括弧内に示す):
その最終形態において、単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸(シグナル配列を下線で示す):
2つのこのような単量体が結合して、2つのhGDF15ポリペプチドが、2つの天然の(すなわち、組み換えでない)システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミFc二量体構築物Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、配列番号33を含む2つの単量体を含む。
II.D.2 Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15
本開示において「Fc(G4S)3−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する、配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に接続された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続する、アミノ酸配列:
本開示において「Fc(G4S)3−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する、配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に接続された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続する、アミノ酸配列:
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミFc構築物Fc(G4S)3−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、リンカー:
その最終形態において、単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸(シグナル配列を下線で示す):
2つのこのような単量体が結合して、2つのhGDF15ポリペプチドが、2つの天然の(すなわち、組み換えでない)システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミFc二量体構築物Fc−(G4S)3−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、配列番号123を含む2つの単量体を含む。
II.D.3 Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15
本開示において「Fc−(G4S)5−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に連結された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続するアミノ酸配列:
本開示において「Fc−(G4S)5−Fc−GS(G4S)4−GDF15」と示されるヘミFc構築物は、ヒトGDF15配列のN末端を第1のFc配列のC末端に接続する配列番号31を含む第1のリンカーを介して第1のFc配列に連結された成熟ヒトGDF15配列、および第1のFc配列のN末端を第2のFc配列のC末端に接続するアミノ酸配列:
より具体的には、特定の実施形態において、ヘミFc構築物Fc−(G4S)5−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、リンカー:
その最終形態において、単量体は、核酸配列:
VH21シグナル配列を用いる実施形態では、その最終形態にいて、単量体は、核酸(シグナル配列を下線で示す):
2つのこのような単量体が結合して、2つのhGDF15ポリペプチドが、2つの天然の(すなわち、組み換えでない)システイン残基間のジスルフィド結合を介して連結された、二量体を形成する。したがって、特定のヘミFc二量体構築物Fc−(G4S)5−Fc−GS(G4S)4−GDF15は、配列番号128を含む2つの単量体を含む。
III. GDF15ポリペプチドおよびGDF15を含む構築物(その突然変異体形態を含む)
本明細書に開示されるように、標準的な分子生物学の方法を使用して、本開示に記載されるGDF15ポリペプチド(ヒトGDF15の全長および成熟形態を含む)およびGDF15を含む構築物を組み換えおよび/または生成して、本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態を形成することができる。種々の実施例において、配列番号4、8、または12の全てまたは一部を含み得る、本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態をコードする核酸配列は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムDNA、またはcDNAから単離および/または増幅することができる。プライマーは、標準的な(RT)−PCR増幅技術に従って、本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列に基づいて設計され得る。増幅したGDF15突然変異体ポリペプチド核酸を、次いで、好適なベクターにクローニングし、DNA配列分析によって特徴付けることができる。
本明細書に開示されるように、標準的な分子生物学の方法を使用して、本開示に記載されるGDF15ポリペプチド(ヒトGDF15の全長および成熟形態を含む)およびGDF15を含む構築物を組み換えおよび/または生成して、本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態を形成することができる。種々の実施例において、配列番号4、8、または12の全てまたは一部を含み得る、本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態をコードする核酸配列は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムDNA、またはcDNAから単離および/または増幅することができる。プライマーは、標準的な(RT)−PCR増幅技術に従って、本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列に基づいて設計され得る。増幅したGDF15突然変異体ポリペプチド核酸を、次いで、好適なベクターにクローニングし、DNA配列分析によって特徴付けることができる。
本明細書に提供されるGDF15ポリペプチドおよび構築物の突然変異体形態の全てまたは一部の単離または増幅の際にプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化DNA合成装置を使用して設計および生成することができるか、またはより長いDNA配列から単離することができる。
III.A. GDF15ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列
インビボにおいて、GDF15は、シグナル配列、プロドメイン、および活性ドメインを含む、連続的なアミノ酸配列として発現する。
インビボにおいて、GDF15は、シグナル配列、プロドメイン、および活性ドメインを含む、連続的なアミノ酸配列として発現する。
全長ヒトGDF15の308個のアミノ酸配列は、
全長マウスGDF15の303個のアミノ酸配列は、
29残基のシグナル配列の切断後のヒトGDF15のアミノ酸配列は、
32残基のシグナル配列の切断後のマウスGDF15のアミノ酸配列は、
各単量体中に1つの鎖間ジスルフィド結合および4つの鎖内ジスルフィド結合を形成する9個のシステインを含むホモ二量体を構成する、ヒトGDF15の組み換え活性形態のアミノ酸配列(任意のN末端メチオニン残基を括弧内に示す)は、
各単量体中に1つの鎖間ジスルフィド結合および4つの鎖内ジスルフィド結合を形成する9個のシステインを含むホモ二量体を構成する、マウスGDF15の組み換え活性形態のアミノ酸配列は、
本明細書に記載される際、「GDF15ポリペプチド」という用語は、配列番号4、8、および12のヒトアミノ酸配列を含む、GDFポリペプチドを指す。「GDF15突然変異体ポリペプチド」という用語は、しかしながら、1つ以上のアミノ酸が天然のGDFポリペプチド配列、例えば、配列番号4、8、および12のアミノ酸配列とは異なり、結果としてその配列が配列番号4、8、および12と少なくとも85%同一となる、アミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。GDF15ポリペプチドは、天然もしくは非天然のアミノ酸を使用して、保存的もしくは非保存的のいずれかである1つ以上のアミノ酸置換を、GDF15ポリペプチドの特定の位置に導入することによって、または特定の残基もしくは一連の残基を欠失させることによって、生成することができる。
「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷への影響がほとんどないかまたは全くないように、天然のアミノ酸残基(すなわち、野生型GDF15ポリペプチド配列の所定の位置に見られる残基)を、非天然の残基(すなわち、野生型GDF15ポリペプチド配列の所定の位置には見られない残基)と置換することを含み得る。保存的アミノ酸置換はまた、典型的には生体系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然のアミノ酸残基(本明細書に定義される)を包含する。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転または逆位形態が含まれる。
天然の残基は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる:
(1) 疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr
(3) 酸性:Asp、Glu
(4) 塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg
(5) 鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、および
(6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1) 疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2) 中性親水性:Cys、Ser、Thr
(3) 酸性:Asp、Glu
(4) 塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg
(5) 鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、および
(6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。
さらなる群のアミノ酸もまた、例えば、Creighton(1984)PROTEINS:STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES(2d Ed.1993),W.H.Freeman and Companyに記載される原理を使用して、形成することができる。いくつかの事例において、このような特性のうちの2つ以上に基づいて、置換をさらに特徴付けることが有用であり得る(例えば、Thr残基等の「極性の小さい」残基との置換は、適切な文脈において、高度に保存的な置換を表し得る)。
保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を伴い得る。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーと別のクラスからのメンバー都の交換を伴い得る。
既知の上述の分類のものに類似する生理化学特性を有する、合成、希少、または修飾のアミノ酸残基を、配列内の特定のアミノ酸残基の「保存的」置換として用いることができる。例えば、D−Arg残基は、典型的なL−Arg残基の置換として機能し得る。特定の置換は、上述のクラスのうちの2つ以上に関して記載され得る場合もあり得る(例えば、小さな疎水性残基による置換は、1つのアミノ酸を、上述のクラスの両方に見られる残基(複数可)、または両方の定義を満たす残基に類似する生理化学特性を有することが当該技術分野で既知である他の合成、希少、もしくは修飾残基と置換することを意味する)。
配列番号3、7、11、および15に変性するもの、ならびに配列番号4、8、および12のポリペプチド変異体をコードするものを含む、本明細書に提供されるGDF15突然変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、本開示の他の態様を形成する。
III.B. GDF15ポリペプチドおよびGDF15を含む構築物(その突然変異体形態を含む)を発現するのに有用なベクター
本明細書に記載されるGDF15ポリペプチドおよびGDF15を含む構築物をコードする核酸配列を発現させるため、適切なコード配列、例えば、配列番号3、7、11、15、17、21、24、26、および32を、好適なベクターにクローニングすることができ、好適な宿主に導入した後に、この配列を、標準的なクローニングおよび発現技術に従って、発現させて、コードされたポリペプチドを生成することができ、これらは、当該技術分野で既知である(例えば、Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989に記載される)。本発明はまた、本発明による核酸配列を含む、このようなベクターにも関する。
本明細書に記載されるGDF15ポリペプチドおよびGDF15を含む構築物をコードする核酸配列を発現させるため、適切なコード配列、例えば、配列番号3、7、11、15、17、21、24、26、および32を、好適なベクターにクローニングすることができ、好適な宿主に導入した後に、この配列を、標準的なクローニングおよび発現技術に従って、発現させて、コードされたポリペプチドを生成することができ、これらは、当該技術分野で既知である(例えば、Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989に記載される)。本発明はまた、本発明による核酸配列を含む、このようなベクターにも関する。
「ベクター」とは、(a)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する、(b)そこからのポリペプチドの生成を促進する、(c)標的細胞へのそれのトランスフェクション/形質転換を促進する、(d)核酸配列の複製を促進する、(e)核酸の安定性を促進する、(f)核酸および/もしくは形質転換/トランスフェクトした細胞の検出を促進する、ならびに/または(g)別様に有益な生物学的および/もしくは生理化学的機能をポリペプチドをコードする核酸配列に与える、送達ビヒクルを指す。ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸のベクター(発現制御要素の好適なセットを含む核酸配列)を含む、任意の好適なベクターであり得る。このようなベクターの例には、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸(RNAまたはDNA)ベクターが挙げられる。
組み換え発現ベクターは、原核生物(例えば、大腸菌)または真核生物(例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞)におけるGDF15突然変異体ポリペプチドの発現のために設計され得る。代表的な宿主細胞には、大腸菌株TOP10F′、TOP10、DH10B、DH5a、HB101、W3110、BL21(DE3)、およびBL21(DE3)pLysS、BLUESCRIPT(Stratagene)、哺乳動物細胞系CHO、CHO−K1、HEK293、293−EBNA pINベクター(Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.264:5503−5509(1989)、pETベクター(Novagen,Madison Wis.)を含む、クローニングおよび発現に典型的に使用される宿主が含まれる。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼ、ならびにインビトロ翻訳系を使用して、インビトロで転写および翻訳してもよい。好ましくは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するクローニング部位の上流にプロモーターを含有する。スイッチのオンおよびオフが可能なプロモーターの例には、lacプロモーター、T7プロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、およびtrpプロモーターが挙げられる。
このように、目的のポリペプチドまたは構築物の発現を促進する、GDF15ポリペプチドまたはGDF15ポリペプチドを含む構築物(その突然変異体形態を含む)をコードする核酸配列を含むベクターを、本明細書に提供する。種々の実施形態において、ベクターは、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の発現を制御する、操作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進要素を含むか、またはそれと結合し得る。このような要素の例には、強力な発現プロモーター(例えば、ヒトCMV IEプロモーター/エンハンサー、RSVプロモーター、SV40プロモーター、SL3−3プロモーター、MMTVプロモーター、もしくはHIV LTRプロモーター、EF1αプロモーター、CAGプロモーター)、有効なポリ(A)末端配列、大腸菌におけるプラスミド生成物の複製起源、選択可能マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および/または簡便なクローニング部位(例えば、ポリリンカー)が挙げられる。ベクター−はまた、CMV IE等の構成的プロモーターとは逆の誘導的プロモーターを含み得る。一態様において、肝臓または膵臓組織等の代謝関連組織において配列の発現を促進する、組織特異的プロモーターに操作可能に連結される、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態をコードする配列を含む核酸を、提供する。
III.C. 宿主細胞
本開示の別の態様において、本明細書に開示される核酸およびベクターを含む宿主細胞を提供する。種々の実施形態において、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノムに統合されるが、他の実施形態においては、ベクターまたは核酸は、染色体外にある。
本開示の別の態様において、本明細書に開示される核酸およびベクターを含む宿主細胞を提供する。種々の実施形態において、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノムに統合されるが、他の実施形態においては、ベクターまたは核酸は、染色体外にある。
このような核酸、ベクター、またはそれらのいずれかもしくは両方の組み合わせを含む、酵母、細菌(例えば、大腸菌)、および哺乳動物細胞(例えば、不死化哺乳動物細胞)等の組み換え細胞を提供する。種々の実施形態において、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはそれに由来する突然変異体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素等、非統合核酸を含む細胞を、提供する。
本明細書に提供されるGDF15突然変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを、形質転換またはトランスフェクションによって、宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを用いて細胞を形質転換する方法は、周知である。
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはそれに由来する突然変異体をコードする核酸を、ウイルスベクターを介して宿主細胞または宿主動物に位置付ける、および/またはそこに送達することができる。任意の好適なウイルスベクターを、この役割で使用することができる。ウイルスベクターは、所望の宿主細胞において本発明の核酸の送達、複製、および/または発現を促進する、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを単独でか、または1つ以上のウイルスタンパク質と組み合わせて含み得る。ウイルスベクターは、ウイルス核酸およびGDF15突然変異体ポリペプチドコード核酸を含む、ウイルスゲノム、ウイルスタンパク質/核酸抱合体、ウイルス様粒子(VLP)、インタクトウイルス粒子のうちの全てまたは一部を含む、ポリヌクレオチドであり得る。ウイルス粒子ウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子または修飾ウイルス粒子を含み得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターアンプリコン等、複製および/または発現に別のベクターまたは野生型ベクターの存在を必要とするベクターであってもよい(例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存性ウイルスであってもよい)。典型的に、このようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子、またはトランス遺伝子の能力を増加させるか、もしくはそのタンパク質および/もしくは核酸のトランスフェクションおよび/もしくは発現を補助するように核酸含量が改変されたウイルス粒子からなる(このようなベクターの例には、ヘルペスウイルス/AAVアンプリコンが含まれる)。典型的に、ウイルスベクターは、通常ヒトに感染するウイルスに類似である、および/またはそれに由来する。この態様において好適なウイルスベクター粒子には、例えば、アデノウイルスベクター粒子(アデノウイルス科またはそのウイルスに由来する全てのウイルスを含む)、アデノ随伴ウイルスベクター粒子(AAVベクター粒子)、または他のパルボウイルスおよびパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターが挙げられる。
III.D. GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の単離
本明細書に記載のように発現されるGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を発現するように組み換えられている細胞、例えば、天然のGDF15を自然には発現しない細胞から、単離することができる。
本明細書に記載のように発現されるGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を発現するように組み換えられている細胞、例えば、天然のGDF15を自然には発現しない細胞から、単離することができる。
GDF15突然変異体ポリペプチドを単離するために利用することができるタンパク質精製方法、ならびに関連する材料および試薬は、当該技術分野で既知である。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を精製する例となる方法を、本明細書において以下の実施例に提供する。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体を単離するのに有用であり得るさらなる精製方法は、Bootcov MR,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11514−9,Fairlie WD,2000,Gene 254:67−76等の文献に見出す事ができる。
IV. GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物を提供する。このようなポリペプチドの薬学的組成物は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効量を、投与形態との適合性で選択される薬学的または生理学的に許容される配合剤(formulation agent)との混合で含み得る。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の、ヒトまたは非ヒト対象の体内への送達の達成または強化に好適な1つ以上の配合剤を指す。これらの用語には、生理学的に適合される、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの1つ以上、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの場合において、等張剤、例として、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを薬学的組成物中に含むことが好ましい。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態ポリペプチドの保存可能期間または有効性を強化する、湿潤剤または少量の補助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液といった、薬学的に許容される物質もまた、担体として機能し得るか、またはその構成成分を形成し得る。許容される薬学的に許容される担体は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物を提供する。このようなポリペプチドの薬学的組成物は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効量を、投与形態との適合性で選択される薬学的または生理学的に許容される配合剤(formulation agent)との混合で含み得る。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の、ヒトまたは非ヒト対象の体内への送達の達成または強化に好適な1つ以上の配合剤を指す。これらの用語には、生理学的に適合される、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの1つ以上、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの場合において、等張剤、例として、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを薬学的組成物中に含むことが好ましい。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態ポリペプチドの保存可能期間または有効性を強化する、湿潤剤または少量の補助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液といった、薬学的に許容される物質もまた、担体として機能し得るか、またはその構成成分を形成し得る。許容される薬学的に許容される担体は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭い、滅菌性、分解もしくは放出の速度、吸収、または浸透性の改変、維持、または保存のために配合剤(複数可)を含有してもよい。好適な配合剤には、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等)、抗菌剤、抗酸化剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等)、緩衝液(ホウ酸、重炭酸、Tris−HCl、クエン酸、リン酸、または他の有機酸等)、増量剤(マンニトールまたはグリシン等)、キレート化剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等)、錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等)、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、またはデキストリン等)、タンパク質(遊離血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等)、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー(ポリビニルピロリドン等)、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン(ナトリウム等)、保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素等)、溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等)、糖アルコール(マンニトールまたはソルビトール等)、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20もしくはポリソルベート80、Triton、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサパル等)、安定性強化剤(スクロースまたはソルビトール等)、張性強化剤(アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、またはマンニトールソルビトール)、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および/または薬学的アジュバントが含まれるが、これらに限定されない(例えば、REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,19th edition,(1995)、Berge et al.,J.Pharm.Sci.,6661),1−19(1977)を参照されたい。さらなる関連する原理、方法、および薬剤は、例えば、Lieberman et al.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS−DISPERSE SYSTEMS(2nd ed.,vol. 3,1998)、Ansel et al.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS(7th ed.2000)、Martindale,THE EXTRA PHARMACOPEIA(31st edition)、Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES(16th−20th and subsequent editions)、The Pharmacological Basis Of Therapeutics,Goodman and Gilman,Eds.(9th ed.−−1996)、Wilson and Gisvolds’TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY,Delgado and Remers,Eds.(10th ed.,1998)に記載されている。薬学的に許容される組成物を製剤化する原理はまた、例えば、Aulton,PHARMACEUTICS:THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN,Churchill Livingstone(New York)(1988),EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS,CSHP(1998)に記載されており、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる)。
最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与の経路、送達形式、および所望される投薬量に応じて、当業者によって決定される(例えば、Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES(上記)を参照されたい)。このような組成物は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水溶性または非水溶性の性質のいずれであっても良い。例えば、注射に好適なビヒクルまたは担体は、場合によっては非経口投与用組成物に一般的な他の材料を補充した、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝食塩水または遊離血清アルブミンと混合した食塩水は、さらなる例となるビヒクルである。他の例となる薬学的組成物は、約pH7.0〜8.5のトリス緩衝液、または約pH4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これらは、ソルビトールまたは好適な代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む組成物は、所望される程度の純度を有する選択された組成物を、最適な配合剤と混合することによって、保管用に凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で調製することができる(Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES(上記))。さらに、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
ポリペプチド薬学的組成物を、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入、または経口等、消化管を通じた送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技能の範囲内である。
配合成分は、投与の部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液を使用して、生理的pHまたはわずかに低いpH、典型的には約5〜約8のpH範囲内に、組成物を維持する。
非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療組成物は、所望されるGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を薬学的に許容されるビヒクル中に含む、発熱物質不含の非経口で許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が、適正に保存された滅菌の等張水溶液として製剤化される、滅菌蒸留水である。さらに別の調製物には、所望される分子と、後にデポー注射を介して送達することができる、生成物の制御または持続放出を提供する注射可能なマイクロスフェア、生体浸食性粒子、ポリマー化合物(ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸等)、ビーズ、またはリポソームといった薬剤との配合物が含まれ得る。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは、血液循環の持続期間を促進する効果を有し得る。所望される分子の導入のための他の好適な手段には、埋め込み可能な薬物送達デバイスが含まれる。
一実施形態において、薬学的組成物は、吸入用に製剤化することができる。例えば、GDF15突然変異体ポリペプチドは、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。GDF15ポリペプチド吸入溶液はまた、エアロゾル送達のために噴射剤とともに製剤化することができる。さらに別の実施形態において、溶液は、噴霧されてもよい。肺内投与は、化学修飾されたタンパク質の肺内送達について記載した国際公開第WO94/20069号に、さらに記載されている。
ある特定の製剤は経口投与可能であることもまた、企図される。本発明の一実施形態において、この様式で投与されるGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態は、錠剤およびカプセル等の固形剤形を形成する際に通例的に使用される担体を用いて、または用いずに、製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大となり全身循環前の分解が最小となる消化管内の地点で、製剤の活性部分を放出するように設計され得る。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の吸収を促進するために、さらなる薬剤が含まれてもよい。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた、用いることができる。
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクル中に溶解することによって、溶液を、単位用量形態に調製することができる。好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、もしくは重炭酸塩、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤;またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア等の結合剤;またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルク等の滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。
持続または制御送達製剤中にGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む製剤を含む、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含むさらなる薬学的組成物が、当業者には明らかであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性マイクロ粒子、または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を製剤化するための技術もまた、当業者に既知である(例えば、薬学的組成物の送達のための多孔質ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載した国際公開第WO93/15722号、ならびにマイクロスフェア/マイクロ粒子の調製および使用について考察したWischke&Schwendeman,2008,Int.J.Pharm.364:298−327およびFreiberg&Zhu,2004,Int.J.Pharm.282:1−18を参照されたい)。本明細書に記載のように、ヒドロゲルは、持続または制御送達製剤の例である。
持続放出調製物のさらなる例には、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号および欧州特許第0 058 481号)、L−グルタミン酸およびγエチル−L−グルタミン酸のコポリマー(Sidman et al.,1983,Biopolymers 22:547−56)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langer et al.,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167−277およびLanger,1982,Chem.Tech.12:98−105)、エチレン酢酸ビニル(Langer et al.上記)、またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第0 133 988号)が挙げられる。持続放出組成物にはまた、リポソームが含まれ得、これは、当該技術分野で既知の複数の方法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Epstein et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688−92、ならびに欧州特許第0 036 676号、同第0 088 046号、および同第0 143 949号を参照されたい。
インビボ投与で使用されるであろうGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物は、典型的に、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結および再構成の前または後に行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注バッグまたはバイアルに入れられる。
薬学的組成物が製剤化されると、それを、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保管することができる。このよう製剤は、すぐに使用可能な形態または投与前に再構成が必要な形態(例えば、凍結乾燥)のいずれかで保管され得る。
特定の実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生成するためのキットを対象とする。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性配合物を有する第2の容器の両方を含み得る。単一または複数チャンバの事前充填されたシリンジ(例えば、液体シリンジまたは分散シリンジ(lyosyringe))を含有するキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。
治療的に用いられるであろうGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存することになる。当業者であれば、治療に適切な投薬量レベルが、したがって、送達される分子、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が使用される適応症、投与の経路、ならびに患者の寸法(体重、体表面、もしくは器官寸法)および状態(年齢および一般的な健康)に部分的に応じて多様であろうことを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果が得られるように、投薬量を滴定し、投与経路を修正することができる。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約0.1μg/kg〜最大で約100mg/kgまたはそれ以上の範囲に及び得る。他の実施形態において、投薬量は、0.1μg/kg〜約100mg/kg、または1μg/kg〜最大で約100mg/kg、または5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、または最大で約10mg/kgの範囲に及び得る。
投薬の頻度は、使用される製剤中のGDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の薬物動態パラメータに依存する。典型的に、臨床医は、所望される効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。組成物は、したがって、単回用量として、経時的な2回以上の用量として(同じ量の所望される分子を含んでもよく、もしくは含まなくてもよい)、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介した連続的注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、当業者が日常的に行う業務の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確定することができる。
薬学的組成物の投与経路は、例えば、経口;静脈内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射を通じて;持続放出系(注射もまた可能である)による;または埋め込みデバイスによる、既知の方法に従う。所望される場合、組成物は、ボーラス注射によって、もしくは注入によって連続的に、または埋め込みデバイスによって、投与されてもよい。
代替または追加として、組成物は、所望される分子が吸収または封入されている膜、スポンジ、または他の適切な材料の埋め込みを介して局所的に投与されてもよい。埋め込みデバイスを使用する場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官に埋め込むことができ、所望される分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または連続的投与を介して行われ得る。
薬物濃度を長期にわたって所望される治療有効レベルに維持することができるように、薬物、例えば、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を所定の速度で送達するために、種々の異なるアプローチが用いられ得る。一実施例において、ゼラチン(例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチン、もしくは別の源からのゼラチン)または天然もしくは合成して生成されたポリマー等のポリマーを含むヒドロゲルを用いることができる。5、10、15、または20%等、任意の割合のポリマー(例えば、ゼラチン)を、ヒドロゲルにおいて用いることができる。適切な濃度の選択は、所望される治療プロファイルおよび治療分子の薬物動態プロファイルといった種々の要因に依存し得る。
ヒドロゲルに組み込むことができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール(「PEG」)、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド、コ−ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ(ビニルピロリジノン)、ポリ(アミノ酸)、デキストラン、ヘパリン、多糖類、ポリエーテル等が含まれる。
ヒドロゲル製剤を生成する際に考慮され得る別の要因は、ヒドロゲルの架橋度と架橋剤である。一実施形態において、架橋は、メタクリル無水物が関与するメタクリル化反応を介して達成することができる。いくつかの状況においては高度の架橋が望ましいが、他の状況においては、低度の架橋が好ましい。いくつかの場合において、高度の架橋は、より長い持続放出をもたらす。高度の架橋は、より堅固なヒドロゲルおよびより長い薬物送達期間をもたらし得る。
任意の比率のポリマーおよび架橋剤(例えば、メタクリル無水物)を用いて、所望される特性を有するヒドロゲルを生成することができる。例えば、ポリマーと架橋剤との比率は、例として、8:1、16:1、24:1、または32:1であり得る。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンであり、架橋剤がメタクリル酸塩である場合、8:1、16:1、24:1、または32:1の比率のメタクリル酸無水物:ゼラチンが用いられ得る。
V.GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療的使用
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して、代謝性状態または障害を治療、診断、または緩和することができる。一実施形態において、治療される代謝性障害は、糖尿病、例えば、2型糖尿病である。別の実施形態において、代謝性状態もしくは障害は、肥満である。他の実施形態において、代謝性状態または障害は、脂質異常症、高グルコースレベル、高インスリンレベル、または糖尿病性腎症である。例えば、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して治療または緩和することができる代謝性状態または障害には、ヒト対象が、125mg/dLまたはそれ以上、例えば、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、または200mg/dLを上回る絶食時血中グルコースレベルを有する状態が含まれる。血中グルコースレベルは、摂食または絶食状態、またはランダムに判定することができる。代謝性状態または障害は、対象が代謝性状態を発症する危険性にある状態もまた含まれる。ヒト対象については、このような状態には、100mg/dLの絶食時血中グルコースレベルが含まれる。GDF15突然変異体ポリペプチドを含む薬学的組成物を使用して治療することができる状態はまた、American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care−2011,American Diabetes Association,Diabetes Care Vol.34,No.Supplement 1,S11−S61,2010に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して、代謝性状態または障害を治療、診断、または緩和することができる。一実施形態において、治療される代謝性障害は、糖尿病、例えば、2型糖尿病である。別の実施形態において、代謝性状態もしくは障害は、肥満である。他の実施形態において、代謝性状態または障害は、脂質異常症、高グルコースレベル、高インスリンレベル、または糖尿病性腎症である。例えば、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を使用して治療または緩和することができる代謝性状態または障害には、ヒト対象が、125mg/dLまたはそれ以上、例えば、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、または200mg/dLを上回る絶食時血中グルコースレベルを有する状態が含まれる。血中グルコースレベルは、摂食または絶食状態、またはランダムに判定することができる。代謝性状態または障害は、対象が代謝性状態を発症する危険性にある状態もまた含まれる。ヒト対象については、このような状態には、100mg/dLの絶食時血中グルコースレベルが含まれる。GDF15突然変異体ポリペプチドを含む薬学的組成物を使用して治療することができる状態はまた、American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care−2011,American Diabetes Association,Diabetes Care Vol.34,No.Supplement 1,S11−S61,2010に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
適用において、2型糖尿病、高グルコースレベル、高インスリンレベル、脂質異常症、肥満、または糖尿病性腎症等の代謝性障害または状態は、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量を、それを必要とする患者に投与することによって治療することができる。投与は、静脈内注射、腹腔内(IP)注射、皮下注射、筋肉内注射によって、または錠剤の形態もしくは液体形態において経口によって等、本明細書に記載されるように行うことができる。いくつかの状況において、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量または好ましい用量は、臨床医によって決定され得る。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効用量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、免疫状態、ならびにレシピエントの健康に依存する。「治療有効用量」という用語は、本明細書に使用される際、治療される疾患または障害の症状の軽減または緩和を含む、研究者、医師、または他の臨床医によって求められる、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘起する、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の量、すなわち、観察可能なレベルの1つ以上の所望される生物学的または医学的応答、例えば、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールレベルの低下、体重の減少、またはグルコース耐性、エネルギー消費、もしくはインスリン感受性の改善を支持する、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の量を意味する。
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効容量はまた、所望される結果によって多様であり得ることに留意されたい。したがって、例えば、低い血中グルコースレベルが示されている状況では、GDF15突然変異体ポリペプチドの用量は、それに応じて、比較的低い血中グルコースレベルが所望される場合の用量よりも、高くなる。対照的に、高い血中グルコースレベルが示されている状況では、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の用量は、比較的高い血中グルコースレベルが所望される場合の用量よりも、低くなる。
種々の実施形態において、対象は、100mg/dLまたはそれ以上の血中グルコースレベルを有するヒトであり、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態で治療することができる。
一実施形態において、本開示の方法は、まず、対象におけるグルコース、インスリン、コレステロール、脂質等、1つ以上の代謝関連化合物のベースラインレベルを測定することを含む。次いで、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物を、対象に投与する。所望される期間の後に、対象における1つ以上の代謝関連化合物(例えば、血中グルコース、インスリン、コレステロール、脂質)のレベルを、再度測定する。次いで、対象における代謝関連化合物における相対変化を判定するために、2つのレベルを比較する。この比較の結果に応じて、GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物のさらなる用量を、1つ以上の代謝関連化合物の所望されるレベルを達成するために投与してもよい。
GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物は、別の化合物と同時投与してもよいことに留意されたい。GDF15突然変異体ポリペプチドと同時投与される化合物が何であるか、および特性は、治療または緩和される状態の性質に依存する。GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態を含む薬学的組成物と組み合わせて投与することができる化合物の非限定的な例の列挙としては、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン(pioglitizone)、レパグリニド、ナテグリチニド(nateglitinide)、メトホルミン、エクセナチド、シタグリプチン(stiagliptin)、プラムリンチド、グリピジド、グリメピリドアカルボース(glimeprirideacarbose)、およびミグリトールが挙げられる。
VI. キット
本開示の方法を実施するためのキットもまた提供する。そのようなキットは、本明細書に提供されるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含むベクターおよび細胞、ならびにこのような核酸含有化合物を含む薬学的組成物を含む、本明細書に記載されるもの等の薬学的組成物を含み得、これらは滅菌容器中に提供され得る。場合によっては、提供される薬学的組成物を代謝性障害の治療に用いる方法についての説明もまた、含まれ得るか、または患者もしくは医療従事者に利用可能であり得る。
本開示の方法を実施するためのキットもまた提供する。そのようなキットは、本明細書に提供されるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸、このような核酸を含むベクターおよび細胞、ならびにこのような核酸含有化合物を含む薬学的組成物を含む、本明細書に記載されるもの等の薬学的組成物を含み得、これらは滅菌容器中に提供され得る。場合によっては、提供される薬学的組成物を代謝性障害の治療に用いる方法についての説明もまた、含まれ得るか、または患者もしくは医療従事者に利用可能であり得る。
一態様において、キットは、(a)GDF15ポリペプチド、GDF15ポリペプチドを含む構築物、またはその突然変異体形態の治療有効量を含む薬学的組成物、および(b)薬学的組成物のための1つ以上の容器を含む。このようなキットはまた、その使用のための説明を含み得、この説明は、治療されている正確な代謝性障害に合わせて作成することができる。説明には、キットに提供される材料の使用および性質が記載され得る。ある特定の実施形態において、キットは、高グルコースレベル、高インスリンレベル、肥満、2型糖尿病、脂質異常症、または糖尿病性腎症等、代謝性障害を治療するために投与を実行するための患者に対する説明を含む。
説明は、紙またはプラスチック等の基材に印刷されてもよく、添付文書としてキット内に、キットまたはその構成要素の容器のラベル(例えば、パッケージ関連)に存在してもよい。他の実施形態において、説明は、好適なコンピュータ可読媒体、例えば、CD−ROM、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明はキット内に存在しないが、インターネットを介して等、遠隔源から説明を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明を確認することができる、および/または説明をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。
しばしば、キットの構成要素の一部または全てを、好適なパッケージ中に入れて、滅菌性を維持することが望ましい。キットの構成要素を、キット格納要素にパッケージ化して、単一の取り扱いが容易なユニットを形成することができ、ここで、例えば、箱または類似の構造であるキット格納要素は、例えば、キットの構成要素の一部または全ての滅菌性をさらに保つための気密容器であり得るが、そうでなくてもよい。
行った実験および得られた結果を含む、以下の実施例は、例示のみの目的で提供され、本発明を制限すると見なされるものではない。
[実施例1]
天然のGDF15ポリペプチドの調製
CHO−S安定細胞系の成長およびトランスフェクションを、トランスフェクション培地(CD−CHO、4×L−グルタミン、1×HT、1×P/S/G)を含有する6ウェルプレートを使用して実行した。トランスフェクションの前日に、培養細胞を、5e5生存細胞(vc)/mlの濃度に分割した。トランスフェクション複合体の形成を、4μgの線状DNA/500 Optimem、10μlのLF−LTX/500μlのOptimem、および20分間のインキュベーション期間を用いて行った。次いで、細胞を、1e6vc/ウェルでの遠心分離によって調製し、DPBS中で洗浄し、1mlのOptimem中に再懸濁させた。続いて、1mlのトランスフェクション複合体を、6ウェルプレート中の1e6の細胞に添加し、振盪させながら6時間インキュベートした後、2mlのMIX−6培地(抗生物質不含)を添加した。6μg/mlのピューロマイシンを有するMIX−6培地を使用して、2日目に選択を開始し、細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁することによって、培地の置き換えを2〜3日毎に10〜12日間行った。
天然のGDF15ポリペプチドの調製
CHO−S安定細胞系の成長およびトランスフェクションを、トランスフェクション培地(CD−CHO、4×L−グルタミン、1×HT、1×P/S/G)を含有する6ウェルプレートを使用して実行した。トランスフェクションの前日に、培養細胞を、5e5生存細胞(vc)/mlの濃度に分割した。トランスフェクション複合体の形成を、4μgの線状DNA/500 Optimem、10μlのLF−LTX/500μlのOptimem、および20分間のインキュベーション期間を用いて行った。次いで、細胞を、1e6vc/ウェルでの遠心分離によって調製し、DPBS中で洗浄し、1mlのOptimem中に再懸濁させた。続いて、1mlのトランスフェクション複合体を、6ウェルプレート中の1e6の細胞に添加し、振盪させながら6時間インキュベートした後、2mlのMIX−6培地(抗生物質不含)を添加した。6μg/mlのピューロマイシンを有するMIX−6培地を使用して、2日目に選択を開始し、細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁することによって、培地の置き換えを2〜3日毎に10〜12日間行った。
親和性タグとともに構築したGDF15発現ベクターによって形質転換した細胞を600nmで9の光学密度まで成長させ、次いで、6時間後に遠心分離によって63の光学密度で誘導し、採取した。凍結細胞ペーストを解凍し、スラリーが均質になるまで低剪断力のホモジナイザーを用いて15%(重量/体積)で緩衝液中に再懸濁した。細胞を、次いで、高剪断力のホモジナイゼーションに供して破壊し、生成物を含有する封入体を放出させた。結果として得られたホモジネートを、次いで、5,000×gにおいて5Cで1時間遠心分離して、封入体をペレットとして採取し、細胞質の混入物質は廃棄上清中に残した。冷水および低剪断力のホモジナイザーを使用してペレットを元のホモジネート体積まで均質に再懸濁することによって、残留細胞質を封入体から洗い流した後、前述のように遠心分離した。結果として得られたペレット、すなわち洗浄した封入体(WIBS)を、次いで、−80Cで凍結させた。
WIBSおよび塩酸グアニジン(GnHCl)の十分な量を、pH8.5で還元−可溶化に使用して、おおよそ25mg/mlの還元生成物および6MのGnHCl最終濃度を得た。可溶化物を、次いで、アルカリ性pHでレドックス試薬、カオトロープ、および共溶媒を含有するリフォールディング緩衝液中に、撹拌しながら25倍に急速希釈した。リフォールディング溶液を、ゆっくりと撹拌させ、6Cで72時間または溶液がエルマン試薬に対して陰性となるまで、空気酸化させた。次いで、5Cのリフォールディング溶液を、深層濾過によって浄化させて、10倍の限外濾過濃度にし、続いて50mMのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液に透析濾過し、pH8.5の低カオトロープ濃度にした。続く残余液を25Cに温め、次いで、pHを酸性範囲に低下させて混入物質を沈殿させた。沈殿物を、25Cで30分間、5,000×gでの遠心分離によって除去し、結果として得られた上清を、0.45μmの濾過によってさらに浄化させた。次いで、濾液(AP)をpH8.5および低塩濃度に調整して、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)を含む精製の第1のステップを可能にした。
タンパク質フォールディングおよびAPに続いて、GDF15を、2ステップのクロマトグラフィートレインを用いて精製した。調整したAPを、pH 8.5で低塩濃度を有する緩衝カオトロープで平衡させたIMACカラムに適用した。次いで、カラムを、ベースラインの紫外線(UV)レベルが得られるまで、平衡緩衝液で洗浄した。生成物および混入物質を、ディスプレーサー濃度を段階的に増加させる事によって溶出し、溶出物を回収し、続いてクマシー染色SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)によってアッセイして、どの溶出画分が、予測されたGDF15の分子量で移動するポリペプチドを含有したかを特定した。IMACが完了した後、プールした生成物含有画分を、25CでpH7.2および5mM EDTAに調整する。生成物を、25Cで数時間、低濃度の酵素を添加して親和性タグを切断することによって、成熟長GDF15に変換させた。切断反応混合物を、酢酸および有機溶媒の添加によって有機改質剤および酸性pHで調整した。これにより、25Cで行われる逆相カラムからの生成物の線形勾配溶出からなる最終クロマトグラフィーステップが可能となった。クロマトグラフィーからの溶出物を、画分として回収し、次いで、SDS−PAGEによって分析して、均質な生成物のプールに適切な画分を決定した。結果として得られたプールに、弱酸性緩衝液への透析濾過による緩衝液交換を行い、限外濾過によって濃縮し、滅菌濾過し、最終的に5Cまたは凍結させて保管した。
[実施例2]
Fc融合GDF15タンパク質による過食ob/obマウスにおける食物摂取の抑制
GDF15は過食ob/obマウスにおける食物摂取を低減させるため、食物摂取量アッセイを使用して、異なる形態のGDF15類似体の有効性を評価した。マウスにおけるヒトGDF15ポリペプチドの半減期がおおよそ3時間であることが観察されたため、Fc融合の戦略を用いてタンパク質の半減期を延長させた。異なるFc融合GDF15ポリペプチドを生成し、Fc融合GDF15および野生型GDF15ポリペプチドを過食レプチン欠損ob/obマウスに導入し、特定のFc融合GDF15ポリペプチドがこれらの動物において食物摂取を抑制する能力を測定することによって、インビボでのGDF15活性について分析した。試験するFc融合GDF15ポリペプチドを、0日目の午後4〜5時の間に、7〜8週齢のob/obマウス(Jackson Laboratory)に皮下注射した。注射後に、動物を、食物が事前に測定されているケージに移し、食物摂取量を翌日の午前9〜10時の間に測定した。
Fc融合GDF15タンパク質による過食ob/obマウスにおける食物摂取の抑制
GDF15は過食ob/obマウスにおける食物摂取を低減させるため、食物摂取量アッセイを使用して、異なる形態のGDF15類似体の有効性を評価した。マウスにおけるヒトGDF15ポリペプチドの半減期がおおよそ3時間であることが観察されたため、Fc融合の戦略を用いてタンパク質の半減期を延長させた。異なるFc融合GDF15ポリペプチドを生成し、Fc融合GDF15および野生型GDF15ポリペプチドを過食レプチン欠損ob/obマウスに導入し、特定のFc融合GDF15ポリペプチドがこれらの動物において食物摂取を抑制する能力を測定することによって、インビボでのGDF15活性について分析した。試験するFc融合GDF15ポリペプチドを、0日目の午後4〜5時の間に、7〜8週齢のob/obマウス(Jackson Laboratory)に皮下注射した。注射後に、動物を、食物が事前に測定されているケージに移し、食物摂取量を翌日の午前9〜10時の間に測定した。
野生型GDF15および各Fc融合GDF15ポリペプチドについての代表的な実験の結果を、図3〜21に提供し、これらは、荷電対(delHinge)構築物:DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(H6D):DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−(G4S)4−GDF15(N3Q):DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−G4−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−(G4S)2−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−(G4Q)4−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)−(1K)−GDF15:DhCpmFc(−)、DhCpmFc(+)(L351C)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)(L351C)、およびDhCpmFc(+)(S354C)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)の二量体;荷電対構築物DhCpmFc(+)(S354C)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(−)(Y349C)の二量体;ヘミFc構築物Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15、Fc−(G4S)3−Fc−GS(G4S)4−GDF15、および Fc−(G4S)5−Fc−GS(G4S)4−GDF15の二量体;天然の成熟hGDF15のホモ二量体;ならびに成熟hGDF15(H6D)変異体のホモ二量体の食物摂取量アッセイにおける用量応答曲線を示す。
これらの実験は、荷電対(delHinge)、荷電対、およびヘミFc構築物の二量体が、天然の成熟hGDF15のホモ二量体のものよりも優れた効力で、ob/obマウスにおいて食物摂取量の減少を呈したことを示した。食物摂取量の測定値は、ポリペプチドの単回注射の17時間後に取得され、より強い効力および有効性は、Fc融合ポリペプチドのより長い半減期の結果であり得る。
[実施例3]
Fc融合GDF15構築物による脂質耐性の改善
荷電対(delHinge)およびヘミFc構築物の二量体を、これらの構築物ならびに天然の成熟hGDF15ホモ二量体を肥満B6D2F1マウス(肥満は、60%高脂肪食をマウスに与える事によって誘発した)に導入し、それぞれの特定のポリペプチドまたは構築物がこれらの動物において経口脂質耐性を改善する能力を測定することによって、インビボでのGDF15の活性について分析した。
Fc融合GDF15構築物による脂質耐性の改善
荷電対(delHinge)およびヘミFc構築物の二量体を、これらの構築物ならびに天然の成熟hGDF15ホモ二量体を肥満B6D2F1マウス(肥満は、60%高脂肪食をマウスに与える事によって誘発した)に導入し、それぞれの特定のポリペプチドまたは構築物がこれらの動物において経口脂質耐性を改善する能力を測定することによって、インビボでのGDF15の活性について分析した。
雄のB6D2F1マウスに、5週齢で60%高脂肪食(Research Diets D12492i)を6〜10週間与え、研究の2〜4日前に、体重および3時間絶食時血清トリグリセリドレベルによって分類割り当てした。試験日に、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体(節II.B.1を参照されたい)、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体(節II.D.1を参照されたい)、および天然の成熟hGDF15のホモ二量体を、3時間絶食させたマウスに静脈内注射した。天然の成熟hGDF15またはまたは成熟hGDF15(H6D)変異体の用量応答試験においては、タンパク質を皮下注射した。タンパク質注射の3時間後に、20%Intralipidを、20ml/kgで経口投与した。さらに90分後に、血液試料を、尾出血により採取し、血清トリグリセリドレベルを測定した。
天然の成熟hGDF15のホモ二量体、成熟hGDF15(H6D)変異体のホモ二量体、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体、およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体を含む代表的な実験の結果を、図22〜25に示す。図23〜25において、天然の成熟hGDF15のホモ二量体、成熟hGDF15(H6D)の変異体、およびDhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体は、用量依存性様式で、脂質耐性を改善した。図22において、天然の成熟hGDF15のホモ二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体が、1mg/kgの静脈内投与で同じアッセイにおいて有効であることを示す。
[実施例4]
DIOマウスにおけるhGDF15およびhGDF15を含む構築物の長期的有効性
GDF15は、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールのレベルを低下させる、体重を減少させる、またはグルコース耐性およびインスリン感受性を改善する。hGDF15および種々のFc融合GDF15構築物がこれらのパラメータを改善する能力を評価するために、長期試験を行った。
DIOマウスにおけるhGDF15およびhGDF15を含む構築物の長期的有効性
GDF15は、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、もしくはコレステロールのレベルを低下させる、体重を減少させる、またはグルコース耐性およびインスリン感受性を改善する。hGDF15および種々のFc融合GDF15構築物がこれらのパラメータを改善する能力を評価するために、長期試験を行った。
実施例4.1 試験の設計
2つの別個の試験を行って、異なるFc融合GDF15ポリペプチドの長期的有効性を評価した。第1の試験(試験#1)は、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体(節II.B.1を参照されたい)およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体(節II.D.1を参照されたい)を含んだ。この試験において、荷電対(delHinge)構築物の二量体およびヘミFc構築物の二量体を、60Kcal%の高脂肪食(Research Diets)を与えた4週齢の雄のC57Bl/6マウス(HAR)に、16週間、長期的に皮下投与した。動物を、6週間、個室収容条件に順化させた。あらゆる試験化合物の投与の前に、週1回の処置および生理食塩水の皮下注射を、3週間行った。マウスを、1回目のタンパク質注射の2日前に、週間食物摂取量、ならびに体重、4時間絶食時血中グルコースレベル、4時間絶食時血清インスリンレベル、トリグリセリド、およびコレステロールレベルに基づいて12匹ずつ7つの群および6匹の1つの群に分割した。荷電対(delhinge)構築物の二量体では1.29、0.129、0.0129mg/kg、またはヘミFc構築物の二量体では1.35、0.135、0.0135mg/kgに相当する、10、1、0.1nmol/kgの3つの異なる用量レベルを選択した。週1回の投与の投薬レジメンを、マウスPKデータに基づいて選択した。12匹の動物の1つの群に、対照としてビヒクル緩衝液を週1回皮下注射した。6匹の動物の1つの群に、ビヒクル緩衝液を皮下注射し、陽性対照として、10mg/kgの経口1日用量を目標とする0.014%のロシグリタゾンを含有する食餌を与えた。研究は、5週間行い、最終投与は28日目に行った。結果を、図26〜38に示す。
2つの別個の試験を行って、異なるFc融合GDF15ポリペプチドの長期的有効性を評価した。第1の試験(試験#1)は、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体(節II.B.1を参照されたい)およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体(節II.D.1を参照されたい)を含んだ。この試験において、荷電対(delHinge)構築物の二量体およびヘミFc構築物の二量体を、60Kcal%の高脂肪食(Research Diets)を与えた4週齢の雄のC57Bl/6マウス(HAR)に、16週間、長期的に皮下投与した。動物を、6週間、個室収容条件に順化させた。あらゆる試験化合物の投与の前に、週1回の処置および生理食塩水の皮下注射を、3週間行った。マウスを、1回目のタンパク質注射の2日前に、週間食物摂取量、ならびに体重、4時間絶食時血中グルコースレベル、4時間絶食時血清インスリンレベル、トリグリセリド、およびコレステロールレベルに基づいて12匹ずつ7つの群および6匹の1つの群に分割した。荷電対(delhinge)構築物の二量体では1.29、0.129、0.0129mg/kg、またはヘミFc構築物の二量体では1.35、0.135、0.0135mg/kgに相当する、10、1、0.1nmol/kgの3つの異なる用量レベルを選択した。週1回の投与の投薬レジメンを、マウスPKデータに基づいて選択した。12匹の動物の1つの群に、対照としてビヒクル緩衝液を週1回皮下注射した。6匹の動物の1つの群に、ビヒクル緩衝液を皮下注射し、陽性対照として、10mg/kgの経口1日用量を目標とする0.014%のロシグリタゾンを含有する食餌を与えた。研究は、5週間行い、最終投与は28日目に行った。結果を、図26〜38に示す。
第2の試験(試験#2)は、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体(節II.B.1を参照されたい)およびCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:CpmFc(+)構築物の二量体(節II.Cを参照されたい)を含んだ。この試験において、荷電対(delHinge)構築物の二量体および荷電対構築物の二量体を、60Kcal%の高脂肪食(Research Diets)を与えた4週齢の雄のC57Bl/6マウス(HAR)に、15週間、長期的に皮下した。動物を、5週間、個室収容条件に順化させた。あらゆる試験化合物の投与の前に、週1回の処置および生理食塩水の皮下注射を、3週間行った。マウスを、1回目のタンパク質注射の4日前に、週間食物摂取量、ならびに体重、4時間絶食時血中グルコースレベル、4時間絶食時血清インスリン、トリグリセリド、およびコレステロールレベルに基づいて、12匹ずつの群に分割した。荷電対構築物の二量体では1.25、0.125、0.0125mg/kgに相当する、10、1、0.1nmol/kgの3つの異なる用量を選択した。荷電対(delHinge)構築物の二量体では1.29および0.129mg/kgに相当する、10および1nmol/kgの2つの異なる用量レベルを選択した。週1回の投与の投薬レジメンを、マウスPKデータに基づいて選択した。12匹の動物の1つの群に、対照としてビヒクル緩衝液を週1回皮下注射した。6匹の動物の1つの群に、ビヒクル緩衝液を皮下注射し、陽性対照として、10mg/kgの経口1日用量を目標とする0.014%のロシグリタゾンを含有する食餌を与えた。研究は、5週間行い、最終投与は28日目に行った。結果を、図39〜54に示す。
体重および食物摂取量を、試験を通じて週1回測定した。1回目のタンパク質注射を行った2週間後に、4時間絶食させた動物において、経口グルコース耐性試験(OGTT)を1回行った。1回目のタンパク質注射を行った5週間後に、16時間絶食させた動物において、経口グルコース耐性試験(OGTT)を1回行った。血液試料を、1回目のタンパク質注射の2週間後および4週間後に4時間絶食させた動物、1回目のタンパク質注射の3週間後に自由に給餌させた動物、および1回目のタンパク質注射の5週間後に16時間絶食させた動物から、採取した。血清試料を使用して、インスリン、トリグリセリド、およびコレステロールレベル、ならびに試験化合物のレベルを測定した。
実施例4.2 体重に対する試験化合物の効果
体重を、試験の間、試験化合物の投与の前後両方に調べた。ビヒクル動物のベースラインからの体重は、時間とともに増加したが、10または1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物の体重は、図30および43に示されるように、5週間の処置期間の間に減少し、化合物の断薬期間中に回復し始めた。1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物における体重の変化は、統計学的有意性には達しなかった。
体重を、試験の間、試験化合物の投与の前後両方に調べた。ビヒクル動物のベースラインからの体重は、時間とともに増加したが、10または1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物の体重は、図30および43に示されるように、5週間の処置期間の間に減少し、化合物の断薬期間中に回復し始めた。1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物における体重の変化は、統計学的有意性には達しなかった。
実施例4.3. 食物摂取量に対する試験化合物の効果
食物摂取量を、週1回測定した。平均の1日食物摂取量は、週間食物摂取量を7で除すことによって計算した。図31および44に示されるように、10nmol/kgにおいて、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体は食物摂取量を低下させ、ほとんどの週間測定値において統計学的有意性を有した。1nmol/kgの用量での効果は、有意性が低かったが、傾向は明らかであった。1nmol/kgの3つの構築物のそれぞれ(すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体)で処置した動物における食物摂取量は、ビヒクル緩衝液で処置した動物における食物摂取量と比較して低かった。
食物摂取量を、週1回測定した。平均の1日食物摂取量は、週間食物摂取量を7で除すことによって計算した。図31および44に示されるように、10nmol/kgにおいて、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体は食物摂取量を低下させ、ほとんどの週間測定値において統計学的有意性を有した。1nmol/kgの用量での効果は、有意性が低かったが、傾向は明らかであった。1nmol/kgの3つの構築物のそれぞれ(すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体)で処置した動物における食物摂取量は、ビヒクル緩衝液で処置した動物における食物摂取量と比較して低かった。
実施例4.4 グルコースおよびOGTTに対する試験化合物の効果
OGTT(OGTT1およびOGTT2)を、処置を開始した後に行った。OGTT1は、1回目のタンパク質注射の14日後に、午前6時から4時間絶食させた動物において行った。経口グルコースチャレンジの前の4時間絶食時グルコースレベルを、タンパク質注射の2日前または4日前に測定したベースラインの4時間絶食時グルコースレベルと比較した(図32および45)。OGTT1のグルコースプロファイルを、図26、27、39、および40に示す。10および1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対Fc−hGDF15構築物の二量体、またはヘミFc構築物の二量体で処置した動物は、OGTTの前および最中のグルコースレベル、ならびにOGTT中のAUCによって示されるように、ビヒクル処置動物と比較して、改善されたグルコースレベルおよび経口グルコース耐性を示した。0.1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物は、改善されたグルコース耐性を示したが、これらの動物におけるグルコースレベルの改善は、それほど有意ではなかった。1回目のタンパク質注射の2週間後、0.1nmol/kgのヘミFc構築物の二量体で処置した動物における改善されたグルコース耐性は、これらの動物が、ビヒクル処置動物と類似の体重および食物摂取量を有することから、体重または食物摂取量の変化からは独立してグルコース耐性の改善を示す。
OGTT(OGTT1およびOGTT2)を、処置を開始した後に行った。OGTT1は、1回目のタンパク質注射の14日後に、午前6時から4時間絶食させた動物において行った。経口グルコースチャレンジの前の4時間絶食時グルコースレベルを、タンパク質注射の2日前または4日前に測定したベースラインの4時間絶食時グルコースレベルと比較した(図32および45)。OGTT1のグルコースプロファイルを、図26、27、39、および40に示す。10および1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対Fc−hGDF15構築物の二量体、またはヘミFc構築物の二量体で処置した動物は、OGTTの前および最中のグルコースレベル、ならびにOGTT中のAUCによって示されるように、ビヒクル処置動物と比較して、改善されたグルコースレベルおよび経口グルコース耐性を示した。0.1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体で処置した動物は、改善されたグルコース耐性を示したが、これらの動物におけるグルコースレベルの改善は、それほど有意ではなかった。1回目のタンパク質注射の2週間後、0.1nmol/kgのヘミFc構築物の二量体で処置した動物における改善されたグルコース耐性は、これらの動物が、ビヒクル処置動物と類似の体重および食物摂取量を有することから、体重または食物摂取量の変化からは独立してグルコース耐性の改善を示す。
OGTT2を、1回目のタンパク質注射の35日後、すなわち最終タンパク質注射の7日後に、経口グルコースチャレンジの前日の午後5時から16時間絶食させた動物に行った。OGTT2のグルコースプロファイルを、図28、29、41、および42に示す。10、1、または0.1nmol/kgの3つの構築物のそれぞれ(すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体)での5週間の処置は、OGTT中のグルコースレベルおよびグルコース曲線のAUCによって示されるように、経口グルコース耐性を有意に改善した。
実施例4.5. インスリンに対する試験化合物の効果
インスリンレベルを、4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物、21日目に自由に給餌させた動物、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。観察されたインスリンレベルを、図33、34、および46〜48に示す。
インスリンレベルを、4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物、21日目に自由に給餌させた動物、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。観察されたインスリンレベルを、図33、34、および46〜48に示す。
4時間絶食させたビヒクル処置動物におけるインスリンレベルは、これらの動物においてインスリン耐性がさらに進行するにつれて、経時的に増加した。10または1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、またはヘミFc構築物の二量体での処置は、インスリンレベルを、処置を始める前の動物の開始点よりも低下させ、高脂肪食に誘発されるインスリン耐性の逆転を示した。0.1nmol/kgの投薬量は、経時的なインスリンレベルの増加を阻止した。.
全ての3つのFc融合GDF15構築物はまた、35日目に一晩絶食させた動物において、類似の用量依存性改善をインスリンレベルに示した。試験#2で収集されたデータは、荷電対(delHinge)構築物の二量体および荷電対構築物の二量体が、自由に給餌させた動物においてインスリンレベルを低下させることを示した。
実施例4.6 トリグリセリドレベルに対する試験化合物の効果
トリグリセリドレベルを、−4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物、21日目に自由に給餌させた動物、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
トリグリセリドレベルを、−4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物、21日目に自由に給餌させた動物、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
4時間または16時間絶食させた動物におけるトリグリセリドレベルに対する荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体の効果は、図35、36、49、および51に示されるように、強力ではないが統計学的に有意であった。10nmol/kgにおいて、荷電対(delHinge)Fc構築物の二量体は、一貫して、28日目および35日目の血清トリグリセリドレベルを低下させた。試験#2から収集したデータは、自由に給餌させた動物において、10および1nmol/kgの荷電対(delHinge)構築物の二量体および荷電対構築物の二量体のいずれの効果も、図50に示されるように、統計学的に有意であったことを示した。GDF15が経口脂質耐性を改善することは、前述の節において示されている。自由に給餌させた動物において血清トリグリセリドレベルを低下させることにおけるより強力な有効性の観察は、食後の脂質プロファイルの改善を示し得、また、経口/食事脂質耐性の改善から結果としてもたらされた可能性がある。
実施例4.7 コレステロールレベルに対する試験化合物の効果
総コレステロールレベルを、−4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物から、21日目に自由に給餌させた動物から、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
総コレステロールレベルを、−4日目、14日目、および28日目に4時間絶食させた動物から、21日目に自由に給餌させた動物から、ならびに35日目に16時間絶食させた動物から採取した血液試料において測定した。マウスは、暗サイクル中に食物の大半を消費する。午前6時から4時間絶食させるプロトコルを同じ群内の縦断的比較に使用して、明サイクル中の食物の摂取によって誘発される変動を排除した。
全ての3つの構築物(すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、ヘミFc構築物の二量体)は、図37、38、および52〜54に示されるように、総コレステロールレベルを用量依存的に低下させ、この効果は、動物の給餌状態によって影響を受けた。
実施例4からの結論
全ての3つの構築物、すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体は、体重、血中グルコースレベルおよびグルコース耐性、血清インスリンレベル、血清コレステロールレベル、血清トリグリセリドレベル、ならびに経口脂質耐性を含む、種々の代謝パラメータの改善に有効性を示した。ポリペプチドは1週間に1回注射し、有効性は用量依存性であり、10nom/kgの投薬量が、最も強い有効性を示した。
全ての3つの構築物、すなわち、荷電対(delHinge)構築物の二量体、荷電対構築物の二量体、およびヘミFc構築物の二量体は、体重、血中グルコースレベルおよびグルコース耐性、血清インスリンレベル、血清コレステロールレベル、血清トリグリセリドレベル、ならびに経口脂質耐性を含む、種々の代謝パラメータの改善に有効性を示した。ポリペプチドは1週間に1回注射し、有効性は用量依存性であり、10nom/kgの投薬量が、最も強い有効性を示した。
[実施例5]
肥満カニクイザルにおけるhGDF15およびhGDF15を含む構築物の長期的有効性
荷電対(delHinge)構築物「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)」およびヘミFc構築物「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」を、これらの構築物ならびにビヒクル(A4.5Su)を肥満カニクイザルに導入することによって、インビボでのGDF1515活性について分析した。
肥満カニクイザルにおけるhGDF15およびhGDF15を含む構築物の長期的有効性
荷電対(delHinge)構築物「DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)」およびヘミFc構築物「Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15」を、これらの構築物ならびにビヒクル(A4.5Su)を肥満カニクイザルに導入することによって、インビボでのGDF1515活性について分析した。
実施例5.1 試験の設計
この試験は、カニクイザルにおいて行った。サルは、年齢が11〜14歳であった。体重は、7〜10kgの範囲に及び、BMIは、38〜58kg/m2の範囲に及んだ。40匹のサルを、化合物投与を開始する前に6週間順化させた。順化期間中、サルに、椅子への拘束、皮下注射(PBS、0.1ml/kg)、強制給餌(水、10ml/kg)、非OGTTおよびOGTT試料のための採血を含む、手順に慣れるように、1週間に4回6週間訓練を行った。6週間の訓練中、ベースラインOGTTおよび血漿代謝パラメータを測定した。40匹中30匹のサルを選択し、類似するベースラインレベルの体重、OGTT AUC応答、ならびに血漿グルコース、インスリン、およびトリグリセリドレベルを達成するように、3つの処置群に無作為割り当てした。
この試験は、カニクイザルにおいて行った。サルは、年齢が11〜14歳であった。体重は、7〜10kgの範囲に及び、BMIは、38〜58kg/m2の範囲に及んだ。40匹のサルを、化合物投与を開始する前に6週間順化させた。順化期間中、サルに、椅子への拘束、皮下注射(PBS、0.1ml/kg)、強制給餌(水、10ml/kg)、非OGTTおよびOGTT試料のための採血を含む、手順に慣れるように、1週間に4回6週間訓練を行った。6週間の訓練中、ベースラインOGTTおよび血漿代謝パラメータを測定した。40匹中30匹のサルを選択し、類似するベースラインレベルの体重、OGTT AUC応答、ならびに血漿グルコース、インスリン、およびトリグリセリドレベルを達成するように、3つの処置群に無作為割り当てした。
試験は、盲検方式で行った。ビヒクル(n=10)、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体(n=10)、およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体(n=10)を、化合物A、B、およびCとしてラベル付けし、1週間に1回、皮下注射によって投与した。化合物は、1.5mg/kg/週で与えた。6週間の化合物処置の後、動物を、化合物の断薬および処置からの回復について、さらに5週間観察した。食物摂取量、体重、臨床化学、およびOGTTを、試験を通じて監視した。食物摂取量は、毎食測定した。体重は、週1回測定した。血液試料を、週1回、各注射の6日後に採取して、グルコース、トリグリセリドを測定した。OGTTは、処置開始後13日目、34日目、および55日目に行った。処置を開始する日を0日目として指定し、詳細な試験の設計を、図55に示す。
この実施例に示される結果は、6週間の処置の終了時、および断薬期間中に収集されたデータである。
実施例5.2 化合物の暴露
化合物(DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体)の暴露測定を、一晩絶食後およびその翌日に非絶食マウスにおいて採取した試料に行った。これらの測定は、処置および断薬期間の間、毎週行った。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体は、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体よりも高い暴露を示した。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体群の10匹中2匹の動物が、抗体を示したが、10匹中5匹の動物は、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体群に特定された。抗体を有する疑いのある動物における薬力学的応答の消失は、薬物暴露の消失と相関する。各化合物の暴露レベルを、図56に示す。
化合物(DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体)の暴露測定を、一晩絶食後およびその翌日に非絶食マウスにおいて採取した試料に行った。これらの測定は、処置および断薬期間の間、毎週行った。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体は、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体よりも高い暴露を示した。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体群の10匹中2匹の動物が、抗体を示したが、10匹中5匹の動物は、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体群に特定された。抗体を有する疑いのある動物における薬力学的応答の消失は、薬物暴露の消失と相関する。各化合物の暴露レベルを、図56に示す。
実施例5.3 経口グルコース耐性試験(OGTT)に対する試験化合物の効果
OGTTは、処置開始の前および後に行った。図57〜64は、OGTTの前および後のOGTT曲線下面積(AUC)を示す。順化OGTTを処置開始の前に行い、投与後のOGTTを2週目および5週目に行い、断薬OGTTを8週目(最終投与の3週間後)に行った。グルコースおよびインスリン(AUC)を、グルコース(図57〜60)およびインスリン(図61〜64)について測定した。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体は、2週目にOGTTグルコースAUCを有意に改善し、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体は、5週目に改善した。OGTTグルコースAUCは、8週目(断薬期間中にもFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15)構築物の二量体により依然として改善されたOGTTインスリンAUCは、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体では2週目および5週目、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体では2週目のみに有意に改善された。
OGTTは、処置開始の前および後に行った。図57〜64は、OGTTの前および後のOGTT曲線下面積(AUC)を示す。順化OGTTを処置開始の前に行い、投与後のOGTTを2週目および5週目に行い、断薬OGTTを8週目(最終投与の3週間後)に行った。グルコースおよびインスリン(AUC)を、グルコース(図57〜60)およびインスリン(図61〜64)について測定した。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体は、2週目にOGTTグルコースAUCを有意に改善し、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体は、5週目に改善した。OGTTグルコースAUCは、8週目(断薬期間中にもFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15)構築物の二量体により依然として改善されたOGTTインスリンAUCは、Fc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体では2週目および5週目、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体では2週目のみに有意に改善された。
実施例5.4 絶食時インスリンレベルに対する試験化合物の効果
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週1回、各注射の6日後に行った。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体のいずれも、絶食時血中インスリンレベルを低減させた。この効果は、断薬期間中には見られなかった。図68は、研究期間中の絶食時インスリンレベルを示す。
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週1回、各注射の6日後に行った。DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体のいずれも、絶食時血中インスリンレベルを低減させた。この効果は、断薬期間中には見られなかった。図68は、研究期間中の絶食時インスリンレベルを示す。
実施例5.5 食物摂取量に対する試験化合物の効果
動物は、1日2回給餌させ、食物摂取量を毎食記録した。給餌時間は、午前8:00〜午前9:00(±30分間)、次いで午後4:00〜午後5:00(±30分間)であった。リンゴ(150g)を、毎日午後1:30〜2:30(±30分間)に、各動物に与えた。
動物は、1日2回給餌させ、食物摂取量を毎食記録した。給餌時間は、午前8:00〜午前9:00(±30分間)、次いで午後4:00〜午後5:00(±30分間)であった。リンゴ(150g)を、毎日午後1:30〜2:30(±30分間)に、各動物に与えた。
ビヒクルと比較して、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体のいずれも、サルにおいて食物摂取量を低減させた(図66)。しかしながら、約30日間の処置の後、効果は減少し、食物摂取量はベースラインまたは対照レベル付近に戻った。
実施例5.6 トリグリセリド(trigylceride)レベルに対する試験化合物の効果
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週1回、各注射の6日後に行った。トリグリセリドレベルは、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物において、処置期間を通して有意に低減された。この効果は、断薬期間中に減少した。図67は、試験期間中の絶食時血漿トリグリセリドレベルを示す。
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。採血は、週1回、各注射の6日後に行った。トリグリセリドレベルは、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物において、処置期間を通して有意に低減された。この効果は、断薬期間中に減少した。図67は、試験期間中の絶食時血漿トリグリセリドレベルを示す。
実施例5.7 体重に対する試験化合物の効果
体重を、試験を通じて週1回監視した。6週間の処置期間にわたって、ビヒクルで処置した動物の体重は、一定して留まったか、またはわずかに増加したが、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物の体重は、図65に示されるように徐々に減少した。
体重を、試験を通じて週1回監視した。6週間の処置期間にわたって、ビヒクルで処置した動物の体重は、一定して留まったか、またはわずかに増加したが、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物の体重は、図65に示されるように徐々に減少した。
実施例5からの結論
雄の肥満カニクイザルに行った研究では、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15
:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物は、代謝パラメータの改善を示した。体重は減少した。食物摂取量の短期間の減少が観察され、この効果は、試験の中間で減少し、ベースラインまたは対照レベルに回復した。絶食時トリグリセリドレベルもまた、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体の両方の化合物によって低減された。OGTTグルコースおよびインスリンAUCは、改善された。
雄の肥満カニクイザルに行った研究では、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15
:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体で処置した動物は、代謝パラメータの改善を示した。体重は減少した。食物摂取量の短期間の減少が観察され、この効果は、試験の中間で減少し、ベースラインまたは対照レベルに回復した。絶食時トリグリセリドレベルもまた、DhCpmFc(−)−(G4S)4−GDF15:DhCpmFc(+)構築物の二量体およびFc−(G4S)8−Fc−GS(G4S)4−GDF15構築物の二量体の両方の化合物によって低減された。OGTTグルコースおよびインスリンAUCは、改善された。
本発明は、種々の実施形態に関して記載されたが、変形および修正が当業者に想起されることを理解されたい。したがって、添付の特許請求の範囲が、全てのこのような同等の変化形を含み、それらは特許請求される本発明の範囲内に含まれることが意図される。さらに、本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のみであり、記載される主題を制限するものと見なされるものではない。
本出願に引用される全ての参考文献は、あらゆる目的で参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
Claims (29)
- GDF15ポリペプチドおよび1つ以上のFc配列を含む、構築物。
- 2つ以上のFc配列を含む、請求項1に記載の構築物。
- Fc配列のうちの1つ以上が、独立して、配列番号18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109、および111からなる群から選択される配列を含む、請求項2に記載の構築物。
- Fc配列のうちの2つ以上が、結合される、請求項3に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項4に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドおよびFc配列が、リンカーによって接合される、請求項5に記載の構築物。
- 配列番号44、50、57、61、65、69、74、79、84、95、および104からなる群から選択される配列を含む、請求項6に記載の構築物。
- 配列番号18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109、および110からなる群から選択される配列をさらに含む、請求項7に記載の構築物。
- 請求項8に記載の構築物を含む、二量体。
- (a) 配列番号18を含む配列および配列番号44を含む配列、
(b) 配列番号86を含む配列および配列番号50を含む配列、
(c) 配列番号18を含む配列および配列番号57を含む配列、
(d) 配列番号86を含む配列および配列番号61を含む配列、
(e) 配列番号86を含む配列および配列番号65を含む配列、
(f) 配列番号86を含む配列および配列番号69を含む配列、
(g) 配列番号86を含む配列および配列番号74を含む配列、
(h) 配列番号86を含む配列および配列番号79を含む配列、
(i) 配列番号86を含む配列および配列番号84を含む配列、
(j) 配列番号91を含む配列および配列番号95を含む配列、または
(k) 配列番号100を含む配列および配列番号104を含む配列、
からなる群から選択される構築物を含む、請求項1に記載の構築物。 - 請求項10に記載の構築物を含む二量体を含む、構築物。
- 1つ以上のFc配列が、独立して、配列番号23、110、114、および115からなる群から選択される配列を含む、請求項2に記載の構築物。
- 2つ以上のFc配列が、結合される、請求項12に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項13に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドおよびFc配列が、リンカーによって接合される、請求項14に記載の構築物。
- 配列番号113を含む、請求項15に記載の構築物。
- 請求項16に記載の構築物を含む、二量体。
- 配列番号110を含む配列および配列番号113を含む配列を含む、請求項12に記載の構築物。
- 請求項18に記載の構築物を含む、二量体。
- Fc配列のうちの1つ以上が、独立して、配列番号28および30からなる群から選択される配列を含む、請求項2に記載の構築物。
- Fc配列のうちの2つ以上が、リンカーによって接合される、請求項20に記載の構築物。
- リンカーが、配列番号87、88、および131からなる群から選択される配列を含む、請求項21に記載の構築物。
- 第1のFc配列のC末端が、第2のFc配列のN末端に接合される、請求項22に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドとFc配列のうちの1つ以上とが、連続した配列を形成する、請求項23に記載の構築物。
- GDF15ポリペプチドおよびFc配列が、リンカーによって接合される、請求項24に記載の構築物。
- リンカーが、配列番号31を含む、請求項25に記載の構築物。
- 請求項26に記載の構築物を含む、二量体。
- 配列番号33、123、および128からなる群から選択される配列を含む、請求項20に記載の構築物。
- 請求項28に記載の構築物を含む、二量体。
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