JP2013200125A - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する際、レーザ光を前記測定対象物に照射する。前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物の発する蛍光を、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより、増幅する。増幅された前記蛍光と、前記蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光する。前記受光により得られた受光信号から、前記光の位相の時間変調の情報を用いて、前記蛍光の蛍光強度を求める。
【選択図】 図1
Description
蛍光検出装置及び蛍光検出方法を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、DNA、RNA、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素が蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を検出することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
細胞、DNA、RNA、酵素、蛋白等の測定対象物には、一般に蛍光蛋白を用いるが、蛍光蛋白の発する蛍光の蛍光強度は、レーザ光の強度に比べてかなり低い。このため、蛍光成分のみを受光素子で受光することは難しく、測定対象物によって散乱したレーザ光の散乱光が蛍光に比べて強度の高い状態で受光される場合がある。
レーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物の発する蛍光を、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより、増幅する光増幅部と、
前記光増幅部によって増幅された前記蛍光を受光する受光素子と、
前記受光素子が前記蛍光を受光する時、前記受光素子が前記蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光するように、前記参照光を発する参照光源を含む参照光源部と、
前記受光素子が出力する受光信号から、前記光の位相の時間変調の情報および前記参照光の光強度の情報を用いて前記蛍光の蛍光強度を求める処理部と、を有する。
レーザ光を測定対象物に照射するステップと、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物の発する蛍光を、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより、増幅するステップと、
増幅された前記蛍光と、前記蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光するステップと、
前記受光により得られた受光信号から、前記光の位相の時間変調の情報及び前記参照光の光強度の情報を用いて、前記蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有する。
図1は、本実施形態の蛍光検出方法を実施する蛍光検出装置の構成の一例を示す概略図である。
以下、図1を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。フローサイトメータは、フローセル中の管路内で、複数の検査対象サンプルを一列に順次流し、このとき、レーザ光の照射位置(測定場)を通過する検査対象サンプルのそれぞれを測定対象物として蛍光検出を行う。具体的に、フローサイトメータは、測定対象物12にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物12から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物12の情報を取得する。本実施形態は、フローサイトメータを用いる例であるが、フローサイトメータに限られない。例えば、測定対象物12が静止した状態でレーザ光を照射する蛍光顕微鏡に適用することもできる。
本実施形態では、測定対象物12の発する蛍光を、光増幅器内で、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより増幅し、この光増幅器によって増幅された蛍光を受光素子で受光する。このとき、蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光素子で受光するように、参照光源部は参照光を発する。受光信号には、蛍光の信号と参照光の信号を含む。しかし、フローサイトメータは、受光素子が出力する受光信号から、光の位相の時間変調の情報を用いて、蛍光信号の振幅を取り出し、蛍光の蛍光強度を求めることができる。光増幅器を用いることにより効率よくレーザ光の散乱光を除去し、さらに、参照光と蛍光と同時に受光した後、受光信号から参照光の信号を除去することにより、精度の高い蛍光強度を算出することができる。
図2は、レーザ光源部20の構成の一例を示す図である。
図2に示すように、レーザ光源部20は、レーザ光源21と、レンズ系22と、レーザドライバ23とを有している。
レーザ光源21は、強度が一定のCW(連続波)レーザ光を出射する。
レンズ系22は、レーザ光源21から出射されたレーザ光を、フローセル10中の所定の照射位置(測定場)に集束させる。
レーザドライバ23は、後述する制御部50と電気的に接続されており、制御部50から供給された信号に基づいて一定の光強度のレーザ光を出射するようにレーザ光源21を駆動する。
レーザ光を出射する光源として、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、5mW〜100mWである。
第1受光部30は、例えば、フォトダイオード等の光電変換器を備える。光電変換器は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第1受光部30の光電変換器によって変換された電気信号は処理部60へ出力され、当該電気信号は、測定対象物12がフローセル10の測定場を通過するタイミングを知らせるためのトリガ信号として用いられる。
また、第1受光部30は、例えば、前方散乱光を光電変換器に集束させるレンズ系(図示省略)と、レーザ光が光電変換器に直接入射しないようにレンズ系の測定対象物12側前面に設けられた遮蔽板(図示省略)とを有してもよい。
図3は、本実施形態の第2受光部40の構成の一例を模式的に示す図である。
図3に示すように、第2受光部40は、レンズ系41と、バンドパスフィルタ(BPF)42と、光増幅器43と、バンドパスフィルタ44と、光電子倍増管45と、ハイパスフィルタ46と、を有する。
BPF42は、光増幅器43の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させるフィルタである。なお、BPF42を透過させる蛍光の波長帯域は、蛍光色素14が発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。また、BPF42の代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。BPF42は、蛍光の光強度に比べて光強度が強いレーザ光の側方散乱光を蛍光から十分に分離できず、レーザ光の側方散乱光が光増幅器43に入射され易い。
光増幅器43は、蛍光の光信号を増幅するために設けられており制御部50と電気的に接続され、制御部50から送信されたDCバイアス信号を光の誘導放出のための信号として受ける。これにより、光増幅器43を構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、DCバイアス信号により励起される。そして、蛍光が入射すると、光増幅器43は、レーザ媒質の原子あるいは分子の蛍光と同じ波長を持つ光の誘導放出を行い、この結果、光増幅器43に入射した蛍光は増幅されることになる。すなわち、光増幅器43は、測定対象物12が発する蛍光の波長に対応した波長の光を誘導放出するように、レーザ媒質は構成されている。したがって、レーザ光の側方散乱光は増幅されない。このため、光増幅器43を出た光は、蛍光が極めて強くなった光となる。なお、光増幅器43は、本発明における光増幅部の一例である。
BPF44は、光増幅された蛍光を透過させ、レーザ光の側方散乱光を分離するフィルタである。
こうして、得られた蛍光は、受光素子の一例である光電子倍増管45により受光される。このとき、光電子倍増管45は、参照光源部32から出射した光の位相が変調角周波数ωνで時間変調した参照光を同時に受光する。この点は後述する。
蛍光は平面波であり、下記式(1)のように複素数表示で表すことができる。また、参照光も平面波であり、下記式(2)のように複素数表示で表すことができる。
AD変換ボード62は、受光信号S’をAD変換する。デジタル化された受光信号S’は、入出力ポート68を通して、メモリ66に一旦記録される。
復調部70は、受光信号S’をメモリ66から呼び出し、受光信号S’と、復調部70で別途生成したcos(ωνt)とを乗算することにより下記式(7)の信号を得る。ここで、変調角周波数ωνは、参照光の位相の時間変調に用いる角周波数であり、参照光源部32から情報として送られる既知の情報である。したがって、復調部70は、この角周波数を用いて、下記式(7)に示すように、蛍光の振幅A1と参照光の振幅A2の積の値を取り出すことができる。
したがって、参照光源32が発する参照光の光強度と、超音波振動子36の変調角周波数ωνの情報は、処理部60に送られる。これらの情報は、処理部60では、復調部70の処理及び強度算出部72の処理に用いられる。
このように、本実施形態は、光電子倍増管45に対して、参照光を蛍光と同時に受光させるのは、受光信号Sのレベルを高めSN比を向上するためである。光増幅器43の光増幅率を高めて、受光される蛍光の蛍光強度を高くすることもできるが、光増幅率を高くするには、光増幅器43内の通過する蛍光の光路を長くしなければならず、第2受光部40が大型化するため好ましくない。光電子倍増管45の感度を高めることも可能であるが、ノイズ成分も高めることになる。このような状況の下、本実施形態は、効率よくレーザ光の散乱光を除去し、精度の高い蛍光強度を算出することができる。
本実施形態では、ハイパスフィルタ46を備えるが、ハイパスフィルタ46を備えず、復調部70の処理により除去することができる。しかし、蛍光強度を精度高く算出する点で、ハイパスフィルタ46を用いることが好ましい。
図6は、本実施形態の蛍光検出方法のフローの一例を示す図である。
まず、フローサイトメータは、測定対象物12を含む複数の検査対象サンプルを、シース液とともにフローセル10中に一列に流す。このとき、制御部50からの指示により、レーザ光源部20は、測定場を通過した測定対象物12に、レーザ光源部20からレーザ光を照射する。このとき、参照光源部32は、参照光を出射する(ステップS10)。参照光は、測定対象物12の発する蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調している。
増幅された蛍光は、BPF44を透過し、光電子倍増管45にいたる。このとき、参照光源部32は参照光を出射しているので、BPF44を透過した蛍光は、参照光とともに、同時に光電子倍増管45に受光される(ステップS30)。
このように、処理部60は、参照光の位相の時間変調に用いる角周波数と参照光の振幅を用いて、蛍光信号の振幅A1を取り出し、蛍光強度を算出する(ステップS40)。
12 測定対象物
20 レーザ光源部
30 第1受光部
32 参照光源部
34 参照光源
36 超音波振動子
38 反射ミラ
40 第2受光部
41 レンズ系
42,44 バンドパスフィルタ
43 光増幅器
45 光電子倍増管
46 ハイパスフィルタ
50 制御部
60 処理部
62 AD変換ボード
64 CPU
66 メモリ
68入出力ポート
70 復調部
72 強度算出部
70 出力部
70a ディスプレイ
70b プリンタ
Claims (6)
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
レーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物の発する蛍光を、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより、増幅する光増幅部と、
前記光増幅部によって増幅された前記蛍光を受光する受光素子と、
前記受光素子が前記蛍光を受光する時、前記受光素子が前記蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光するように、前記参照光を発する参照光源を含む参照光源部と、
前記受光素子が出力する受光信号から、前記光の位相の時間変調の情報および前記参照光の光強度の情報を用いて前記蛍光の蛍光強度を求める処理部と、を有する蛍光検出装置。 - 前記光の位相は、予め定めた周波数で時間変調し、
前記受光素子が出力する前記受光信号のDC成分を除去するとともに、前記光の位相の時間変調の周波数成分を含む信号成分を抽出するフィルタを備える、請求項1に記載の蛍光検出装置。 - 前記参照光源部は、前記参照光源から前記受光素子までの前記参照光の光路長を時間変化させることにより、光の位相を時間変調する、請求項1または2に記載の蛍光検出装置。
- 前記参照光源部は、超音波振動子と前記超音波振動子に設けられた反射面ミラとを含み、前記超音波振動子の振動によって前記反射ミラの位置が変動する状態で、前記参照光源から入射した参照光を前記受光素子に向けて反射させることにより、前記光の位相を時間変調する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 管路を一列になって順次流れ、レーザ光の照射位置を通過する複数の検査対象サンプルのそれぞれを測定対象物として前記レーザ光源部がレーザ光を照射して蛍光検出を行うフローサイトメータである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
レーザ光を測定対象物に照射するステップと、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物の発する蛍光を、バイアス信号による光の誘導放出を行うことにより、増幅するステップと、
増幅された前記蛍光と、前記蛍光と同じ波長成分を有し、光の位相が時間変調した参照光を同時に受光するステップと、
前記受光により得られた受光信号から、前記光の位相の時間変調の情報および前記参照光の光強度の情報を用いて、前記蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有する蛍光検出方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103868896A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-06-18 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 光学光纤传感器自参考量化检测方法 |
JP2020516953A (ja) * | 2017-04-11 | 2020-06-11 | カリコ ライフ サイエンシーズ エルエルシー | 刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法システムおよび方法 |
JP2021179447A (ja) * | 2020-04-01 | 2021-11-18 | 浜松ホトニクス株式会社 | 光学測定装置及び光学測定方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0431745A (ja) * | 1990-05-28 | 1992-02-03 | Res Dev Corp Of Japan | ヘテロダイン検波受光系を用いた振幅像及び位相像の同時検出装置 |
JP2001004538A (ja) * | 1999-06-17 | 2001-01-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 媒質の測定装置および測定方法 |
JP2007187477A (ja) * | 2006-01-11 | 2007-07-26 | Fujitsu Ltd | 蛍光検出装置 |
JP2010099095A (ja) * | 2008-05-02 | 2010-05-06 | Olympus Corp | 光学的検査装置 |
JP2010230649A (ja) * | 2009-03-04 | 2010-10-14 | Olympus Corp | 光検出装置 |
JP2011097986A (ja) * | 2009-11-04 | 2011-05-19 | Olympus Corp | 光スペクトル検出方法 |
-
2012
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0431745A (ja) * | 1990-05-28 | 1992-02-03 | Res Dev Corp Of Japan | ヘテロダイン検波受光系を用いた振幅像及び位相像の同時検出装置 |
JP2001004538A (ja) * | 1999-06-17 | 2001-01-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 媒質の測定装置および測定方法 |
JP2007187477A (ja) * | 2006-01-11 | 2007-07-26 | Fujitsu Ltd | 蛍光検出装置 |
JP2010099095A (ja) * | 2008-05-02 | 2010-05-06 | Olympus Corp | 光学的検査装置 |
JP2010230649A (ja) * | 2009-03-04 | 2010-10-14 | Olympus Corp | 光検出装置 |
JP2011097986A (ja) * | 2009-11-04 | 2011-05-19 | Olympus Corp | 光スペクトル検出方法 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103868896A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-06-18 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 光学光纤传感器自参考量化检测方法 |
JP2020516953A (ja) * | 2017-04-11 | 2020-06-11 | カリコ ライフ サイエンシーズ エルエルシー | 刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法システムおよび方法 |
JP7066740B2 (ja) | 2017-04-11 | 2022-05-13 | カリコ ライフ サイエンシーズ エルエルシー | 刺激された放出に基づく蛍光顕微鏡法システムおよび方法 |
JP2021179447A (ja) * | 2020-04-01 | 2021-11-18 | 浜松ホトニクス株式会社 | 光学測定装置及び光学測定方法 |
JP7348933B2 (ja) | 2020-04-01 | 2023-09-21 | 浜松ホトニクス株式会社 | 光学測定装置及び光学測定方法 |
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