JP2011088869A - Method for recovering leukocyte protein and recovery apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液細胞を含む試料液から、白血球に含まれるタンパク質を回収する方法、並びにこれに用いる装置に関する。 The present invention relates to a method for recovering proteins contained in leukocytes from a sample solution containing blood cells, and an apparatus used therefor.
ポストゲノム時代になって、ＤＮＡマイクロアレイ技術の進歩により、白血球を中心とした血液細胞における遺伝子発現の変動に関する膨大なデータが蓄積されている。それは血液細胞のタンパク質の分布にも大きな影響を与えており、そのデータの解析は新たな血液診断法の構築において重要な手段となることは間違いない。しかるに現在、各種疾患の治療や診断等に応用されているサンプルは、ほとんど全てが血清成分であり、そこでは分泌型のタンパク質やその酵素触媒によって産生されて血清として放出されている物質を測定している。その理由は、臨床現場で簡便迅速に白血球を中心とした血液細胞に含まれる全タンパク質を分離・抽出する技術が欠如していることにある。 In the post-genomic era, with the advancement of DNA microarray technology, a vast amount of data relating to changes in gene expression in blood cells centering on leukocytes has been accumulated. It has a great influence on the distribution of proteins in blood cells, and the analysis of the data is undoubtedly an important tool in the construction of new blood diagnostic methods. However, almost all samples currently applied to the treatment and diagnosis of various diseases are serum components, where substances produced by secreted proteins and their enzyme catalysts and released as serum are measured. ing. The reason is that there is a lack of a technique for separating and extracting all proteins contained in blood cells, mainly white blood cells, in a clinical setting.
血液試料からの白血球分画技術として従来行われてきたものには、繊維への粘着力を利用する方法、凝固剤を用いて特定血球のみを凝固させて除外する方法、遠心分離で分画する方法などがある。たとえば繊維に単球や顆粒球を付着させれば、リン酸緩衝生理食塩水などにより付着した血球を回収できる。凝集剤や遠心分離により得た白血球分画をナイロンやガラス繊維を詰めたカラムに入れて３７℃に保温し３０分位放置する方法でも白血球が回収できる。あるいは血液にヒドロキシエチルスターチやデキストランなどの赤血球凝集剤を加えて一定時間放置後に上清に残った白血球を採取する方法や、血液を遠心分離して白血球に富む分画(バッフィーコート)を採取する方法、比重１.０７７の液体に血液を重層後、遠心分離を行ない白血球層を回収する密度勾配遠心分離方法なども有用である。繊維に粘着する性質を持つ単球や顆粒球を付着させ、リン酸緩衝生理食塩水などにより洗浄して回収することもできる。 Conventional techniques for fractionating leukocytes from blood samples include methods that utilize adhesion to fibers, methods that exclude coagulants by coagulating specific blood cells, and fractionation by centrifugation. There are methods. For example, if monocytes or granulocytes are attached to the fibers, the blood cells attached with phosphate buffered saline can be collected. Leukocytes can also be collected by a method in which a leukocyte fraction obtained by an aggregating agent or centrifugation is placed in a column packed with nylon or glass fiber and kept at 37 ° C. and left for about 30 minutes. Alternatively, add leukocyte agglutinating agents such as hydroxyethyl starch and dextran to blood and collect leukocytes remaining in the supernatant after standing for a certain period of time, or centrifuge the blood to collect leukocyte-rich fraction (buffy coat) A method, such as a density gradient centrifugation method in which blood is layered on a liquid having a specific gravity of 1.077 and then centrifuged to collect a leukocyte layer, is also useful. Monocytes and granulocytes having the property of adhering to fibers can be adhered and recovered by washing with phosphate buffered saline.
しかし上記の従来法では、大がかりな装置や特殊な技術を必要としたり、多大な時間と手間がかかったりする問題があった。例えば、赤血球凝集剤を用いる方法では洗浄や不純物除去の操作が厄介で手間がかかる。遠心分離法は高価な遠心分離器の設置が必要となるうえ、非常に煩雑な数回の遠心分離操作を必要とするため熟練者でも多大の労力と時間を要するなど、臨床現場では実行困難である。また一般には白血球の繊維への粘着能が弱いので採集される白血球の分布に偏りが生ずるという致命的な欠陥も見逃せない。このため、血液試料から白血球を分画するための、より簡便な方法及び装置が求められている。 However, the above-described conventional methods have problems such as requiring a large-scale apparatus and special technology, and taking a lot of time and labor. For example, in the method using a hemagglutinating agent, operations for washing and impurity removal are troublesome and time-consuming. Centrifugation requires the installation of an expensive centrifuge and requires a very complex number of centrifuge operations, which requires a lot of labor and time even for a skilled person. is there. Further, since the adhesion of leukocytes to fibers is generally weak, a fatal defect that the distribution of collected leukocytes is biased cannot be overlooked. For this reason, there is a need for a simpler method and apparatus for fractionating leukocytes from a blood sample.
本発明の技術的課題は上記の問題点を一挙に解消し、血液細胞を含む試料の中から、特殊な技術を要せずに白血球のタンパク質を簡便に且つ効率よく短時間で回収できる白血球タンパク質の回収方法、並びにこれに用いる回収装置を提供することにある。 The technical problem of the present invention is to solve the above-mentioned problems all at once, and from a sample containing blood cells, leukocyte protein capable of easily and efficiently recovering leukocyte protein in a short time without requiring a special technique. It is in providing the recovery method of this, and the recovery apparatus used for this.
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、血球を含む試料液を、いわゆる白血球除去フィルターに吸着または通過させ、これを洗浄したのち、タンパク質溶解液を通過させることで白血球タンパク質を簡便に効率よく回収できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成されたものであり、例えば、本発明の実施の形態を示す図１から図９に基づいて説明すると、次のように構成したものである。 The present inventor conducted research to solve the above-mentioned problems, and adsorbed or passed a sample solution containing blood cells to a so-called leukocyte removal filter, washed it, and then passed the protein lysate to obtain leukocyte protein. It was found that it can be easily and efficiently recovered. The present invention has been completed based on this finding. For example, the present invention is configured as follows when described with reference to FIGS. 1 to 9 showing an embodiment of the present invention.
即ち本発明１は白血球タンパク質の回収方法に関し、血球を含む試料液を、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)に吸着若しくは通過させる捕捉工程(S1)と、白血球を捕捉したフィルター(９)に洗浄液を通過させる洗浄工程(S2)と、上記の洗浄したフィルター(９)にタンパク質溶解液を通過させてこのフィルター(９)に捕捉されている白血球のタンパク質をこの溶解液中に溶出させる溶出工程(S3)とを含むことを特徴とする。 That is, the present invention 1 relates to a method for recovering leukocyte protein, a capture step (S1) in which a sample solution containing blood cells is adsorbed or passed through a filter (9) that allows red blood cells to pass but leukocytes to be captured, and a filter that captures leukocytes ( 9) A washing step (S2) in which a washing solution is passed, and a protein lysate is passed through the washed filter (9), and leukocyte proteins captured by the filter (9) are eluted in the lysate. And an elution step (S3).
また、本発明２は白血球タンパク質の回収装置に関し、血球を含む試料液から白血球タンパク質を回収するための回収装置であって、試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通している連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、上記の入口(２)と圧力調整手段(４)との間に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、上記の連通路(３)が遮断される状態に配置してあり、上記の入口(２)は、試料液供給手段(13)と洗浄液供給手段(14)と溶解液供給手段(15)とに、選択的に切換え接続可能であることを特徴とする。 The present invention 2 also relates to a leukocyte protein collecting device, which is a collecting device for collecting leukocyte protein from a sample solution containing blood cells, and is connected to the inlet (2) for receiving the sample solution and the inlet (2). And a pressure adjusting means (4) for adjusting the pressure in the communicating path (3). Between the inlet (2) and the pressure adjusting means (4), red blood cells are provided. A filter (9) that allows white blood cells to pass through is disposed in a state where the communication path (3) is blocked, and the inlet (2) is connected to the sample liquid supply means (13) and the cleaning liquid supply. The means (14) and the solution supply means (15) can be selectively switched and connected.
上記のフィルターは、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するものであればよく、特定の寸法や形成材料などに限定されないが、孔径が６〜９μｍの孔を有すると、赤血球は円滑に通過するが白血球は捕捉されるので好ましく、孔径が７〜８μｍであるとさらに好ましい。これらのフィルターは、市販されているものを用いてもよく、具体的にはリューコトラップ(Leukotrap；PALL Co.Ltd.社製、商品名)などを挙げることができる。 The filter is not limited to a specific size or forming material as long as it allows red blood cells to pass through but captures white blood cells. However, if the filter has pores with a diameter of 6 to 9 μm, the red blood cells pass smoothly. Leukocytes are preferable because they are captured, and it is more preferable that the pore diameter is 7 to 8 μm. Commercially available filters may be used, and specific examples include Leukotrap (trade name, manufactured by PALL Co. Ltd.).
上記のフィルターは１枚のみ配置したものであってもよいが、複数枚を積層してあると白血球を効率よく捕捉できて好ましい。但し、積層枚数が増えると血液を通過させる際に高い圧力を必要とするので、その通過圧力で赤血球が破壊されることのないように２０枚程度以下が好ましく、さらに好ましくは１０枚以下に設定され、３〜５枚に設定すると一層好ましい。これらのフィルターは、１枚または複数枚を一対のフィルター保持部材間に挟持するなど、カセット状に構成すると、液体の通過に対しそのフィルターを特定の装着位置を保持でき、白血球を効率よく捕捉できて好ましい。 Although only one filter may be arranged, it is preferable to stack a plurality of filters because leukocytes can be efficiently captured. However, as the number of stacked layers increases, a high pressure is required to allow blood to pass. Therefore, it is preferably about 20 or less, more preferably 10 or less so that red blood cells are not destroyed by the passing pressure. It is more preferable to set 3 to 5 sheets. When these filters are configured in a cassette shape, such as by sandwiching one or more sheets between a pair of filter holding members, the filter can hold a specific mounting position against the passage of liquid, and leukocytes can be captured efficiently. It is preferable.
上記のフィルターは、特定の大きさに限定されないが、例えば直径５〜２０ｍｍ程度のものを用いると、必要とされる試料液が少量で済むうえ、回収装置を簡略に構成できて好ましい。また回収装置を小形化して、例えば１〜数滴の血液を用いる場合などは、このフィルターの面積をさらに小さくすることができるが、小さくし過ぎると白血球を短時間に充分捕捉できなくなる虞があるため、直径が１ｍｍに相当する０.７５ｍｍ２以上の面積を有すると好ましい。 The filter is not limited to a specific size, but it is preferable to use a filter having a diameter of about 5 to 20 mm, for example, because a small amount of sample solution is required and the recovery device can be configured simply. Further, when the collection device is downsized and, for example, one to several drops of blood are used, the area of the filter can be further reduced. However, if the collection device is too small, leukocytes may not be sufficiently captured in a short time. Therefore, it is preferable that the diameter has an area of 0.75 mm 2 or more corresponding to 1 mm.
上記の捕捉工程と洗浄工程では、０.１ＭＰａ以下の圧力で上記のフィルターに上記の試料液や洗浄液を通過させると、試料液中の赤血球が破壊されることなくこのフィルターを通過できるので好ましい。具体的には、上記の回収装置において、上記の圧力調整手段により上記のフィルターの入口側とその反対側との間に上記の所定の、例えば０.１ＭＰａ以下の差圧を生じさせると、その差圧で上記のフィルターに試料液や洗浄液を通過させることができる。 In the capturing step and the washing step, it is preferable to pass the sample solution and the washing solution through the filter at a pressure of 0.1 MPa or less because the red blood cells in the sample solution can pass through the filter without being destroyed. Specifically, in the above-described recovery device, when the above-described pressure adjusting means causes the above-described predetermined differential pressure of, for example, 0.1 MPa or less between the inlet side of the filter and the opposite side thereof, The sample liquid and the cleaning liquid can be passed through the filter with a differential pressure.
上記の捕捉工程(S1)は、上記の試料液を上記のフィルターに１または複数回にわたって往復通過させると、例えば４mLなど、少量の試料液中の白血球を簡単な操作で上記のフィルターに効率よく捕捉できて好ましい。即ち、上記のフィルターに捕捉された白血球は、このフィルターに逆方向の流れを生じても容易に離脱しないと推定される。 In the capturing step (S1), when the sample solution is passed through the filter one or more times, the leukocytes in a small amount of the sample solution such as 4 mL can be efficiently applied to the filter with a simple operation. It is preferable because it can be captured. That is, it is presumed that leukocytes captured by the filter do not easily escape even if a reverse flow occurs in the filter.
一方、上記の洗浄工程(S2)では、上記の洗浄液により、上記のフィルターや回収装置の連通路などに付着している赤血球が除去されるが、この洗浄液を過剰に流通させると、フィルターに捕捉されている白血球も除去される虞がある。このため、上記の洗浄液は、上記のフィルターに３往復以下にわたって往復通過させるのが好ましい。 On the other hand, in the above washing step (S2), red blood cells adhering to the communication path of the filter and the recovery device are removed by the washing liquid, but if this washing liquid is circulated excessively, it is captured by the filter. There is a risk that leukocytes that have been removed are also removed. For this reason, it is preferable that the cleaning liquid is reciprocated through the filter for 3 reciprocations or less.
上記の試料液や洗浄液を上記のフィルターに往復通過させる具体的構造としては、特定の構造に限定されないが、上記の連通路に液体を貯留できる貯留室を形成し、この貯留室と上記の入口との間に上記のフィルターを配置することで構成することができる。この場合、上記の入口は、さらに廃液部とタンパク質回収容器とに選択的に切換え接続可能であると、洗浄後の排液をこの廃液部へ排出でき、また、白血球タンパク質を溶出させたタンパク質溶解液を上記のタンパク質回収容器へ回収することができ、好ましい。 The specific structure for reciprocating the sample liquid and the cleaning liquid through the filter is not limited to a specific structure, but a storage chamber capable of storing the liquid is formed in the communication path, and the storage chamber and the inlet are formed. The above filter can be arranged between the two. In this case, if the above inlet can be selectively switched and connected to the waste liquid part and the protein recovery container, the washed waste liquid can be discharged to the waste liquid part, and the leukocyte protein eluted protein dissolution The liquid can be recovered in the protein recovery container, which is preferable.
上記の圧力調整手段は、連通路内の圧力を加圧若しくは減圧できるものであればよく、特定の構造のものに限定されない。例えばこの圧力調整手段を、上記の連通路または上記の貯留室内で保密状に進退摺動可能なピストン体から構成すると、この圧力調整手段を簡単に構成できて好ましい。この場合、汎用のシリンジの先端にフィルターを備えた容器の一端を連結するとともに、その容器の他端に試料液供給手段等を接続し、シリンジのピストンを押し引きすることで、試料液を吸引・排出して、容器の内のフィルターに試料液等を往復通過させることができる。しかし、シリンジの先端に形成された針装着部で上記の入口を構成し、このシリンジの筒体内に上記の貯留室を形成するとともに、この貯留室の先端側に上記のフィルターを配置し、貯留室の後端側に上記のピストン体を配置すると、汎用のシリンジの筒体内にフィルターを配置するだけで、上記の回収装置をきわめて簡単に構成できて好ましい。 The pressure adjusting means is not limited to a specific structure as long as it can increase or decrease the pressure in the communication path. For example, it is preferable that the pressure adjusting means is constituted by a piston body that can slide back and forth in a tightly confined manner in the communication passage or the storage chamber. In this case, one end of a container equipped with a filter is connected to the tip of a general-purpose syringe, and a sample liquid supply means is connected to the other end of the container, and the sample liquid is aspirated by pushing and pulling the piston of the syringe. -The sample liquid can be reciprocated through the filter in the container by discharging. However, the inlet is formed by the needle mounting portion formed at the tip of the syringe, the storage chamber is formed in the cylinder of the syringe, and the filter is disposed on the tip side of the storage chamber, It is preferable to dispose the piston body on the rear end side of the chamber because the recovery device can be configured very simply by simply disposing a filter in the cylinder of a general-purpose syringe.
さらに上記のピストン体は、手動により進退可能に構成してもよく、この場合は回収装置を簡略に構成でき、安価に実施できて好ましい。しかし本発明では、上記の圧力調整手段を駆動手段に連動連結し、この駆動手段の駆動により上記の連通路内の圧力を制御するように構成してもよい。この場合は白血球タンパク質の回収を自動化でき、作業者の負担を軽減できるうえ、一定の操作により白血球タンパク質の回収精度を高めることができて好ましい。 Further, the above-described piston body may be configured to be able to advance and retreat manually. In this case, the recovery device can be configured simply and can be implemented at low cost. However, in the present invention, the pressure adjusting means may be linked to the driving means, and the pressure in the communication path may be controlled by driving the driving means. In this case, the collection of leukocyte proteins can be automated, the burden on the operator can be reduced, and the collection accuracy of leukocyte proteins can be increased by certain operations, which is preferable.
一方、上記の試料液を収容した試料液容器や、洗浄液容器、溶出液容器、廃液容器、タンパク質回収容器等を一体化し、手動や電動で各容器を移動操作できる小形機器として組み立てれば、これらの各容器と上記の回収装置の入口とを切換え可能に接続することで、同時並行で数多く（たとえば１００〜１０００件）の試料液を、簡単な操作で短時間に処理することができる。 On the other hand, if a sample liquid container containing the above sample liquid, a washing liquid container, an elution liquid container, a waste liquid container, a protein recovery container, etc. are integrated and assembled as a small device that can move and operate each container manually or electrically, these By connecting each container and the inlet of the above-described recovery device in a switchable manner, a large number (for example, 100 to 1000 samples) of sample liquids can be processed in a short time with a simple operation.
さらには１ｍｍ四方のフィルターを使うなどして全システムを超小形化して、一滴(約０.０５ｍＬ)の血液を試料として調製することも可能である。例えば、上記の入口と連通路をラブオンナチップ(Lab On a Chip)に形成するとともに、このラブオンナチップに上記の圧力調整手段を設けると、回収装置を小形にできるうえ、きわめて簡単な操作で素早く回収して、例えば白血球に含まれるウィルス等を簡単に検出でき、好ましい。 It is also possible to prepare a single drop (about 0.05 mL) of blood as a sample by miniaturizing the entire system by using a 1 mm square filter. For example, when the inlet and the communication passage are formed in a Lab On a Chip and the pressure adjusting means is provided on the Lab On a Chip, the recovery device can be downsized and the operation can be performed with a very simple operation. It is preferable because it can be quickly collected and, for example, viruses contained in white blood cells can be easily detected.
なお、上記のタンパク質溶解液は特定の成分に限定されず、例えば、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤の有効量を含む溶液などが用いられる。 In addition, said protein solution is not limited to a specific component, For example, the solution etc. which contain the effective amount of at least 1 sort (s) of nonionic surfactant are used.
本発明方法及び装置によれば、市販されている汎用などの白血球除去フィルターを用いた簡略な装置により、きわめて簡単な操作で、しかも例えば１０分程度等の短時間に、試料液中の白血球を赤血球や血球以外の夾雑物質(夾雑タンパク質など)から実質的に分離して、この捕捉した白血球のタンパク質を溶出させ回収することができる。これにより、例えばインフルエンザに罹病した患者の血液から、すばやくインフルエンザウイルスを検出できるなど、血液検査を迅速に行うことができる。 According to the method and apparatus of the present invention, leukocytes in a sample solution can be removed in a very simple operation, for example, in a short time such as about 10 minutes, by a simple apparatus using a commercially available general-purpose leukocyte removal filter. The captured leukocyte proteins can be eluted and recovered by substantially separating from contaminants (such as contaminant proteins) other than erythrocytes and blood cells. Thereby, for example, an influenza virus can be quickly detected from the blood of a patient suffering from influenza, and a blood test can be performed quickly.
以下、本発明を詳細に説明する。
図１と図２は本発明の第１実施形態を示し、図１は白血球タンパク質の回収装置の断面図であり、図２は白血球タンパク質の回収方法の操作手順を示す概略構成図である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1 and 2 show a first embodiment of the present invention, FIG. 1 is a sectional view of a leukocyte protein recovery apparatus, and FIG. 2 is a schematic configuration diagram showing an operation procedure of a leukocyte protein recovery method.
図１に示すように、この回収装置(１)は、血球を含む試料液から白血球のタンパク質を回収するための装置であり、試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通する連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、この連通路(３)に貯留室(５)が形成してある。この回収装置(１)は汎用のシリンジを利用して構成してあり、このシリンジの先端部に形成された針装着部(６)に上記の入口(２)が開口され、このシリンジの筒体(７)内に上記の貯留室(５)が形成され、この貯留室(５)内で保密状に且つ進退摺動可能に配置された、上記の圧力調整手段を構成するピストン体(４)が配置してある。 As shown in FIG. 1, the recovery device (1) is a device for recovering leukocyte proteins from a sample liquid containing blood cells, and communicates with an inlet (2) for receiving the sample liquid and the inlet (2). And a pressure adjusting means (4) for adjusting the pressure in the communication path (3). A storage chamber (5) is formed in the communication path (3). The recovery device (1) is configured by using a general-purpose syringe. The inlet (2) is opened in the needle mounting portion (6) formed at the tip of the syringe, and the cylindrical body of the syringe. (7) The above-mentioned storage chamber (5) is formed in the piston body (4) constituting the pressure adjusting means, which is arranged in the storage chamber (5) in a tightly-contained manner and slidable forward and backward. Is arranged.
上記の入口(２)とピストン体(４)との間には、上記の貯留室(５)の先端側にフィルターカセット(８)が、上記の連通路(３)を遮断する状態に配置してある。このフィルターカセット(８)は、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、一対のフィルター保持部材(10)間に挟持してある。このフィルター(９)は、生化学用フィルターとして公知のフィルター材料を含むものを用いることができる。このような材料としては、例えばニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエステルなどが挙げられるが、これらの材料に限定されるものではない。またこのフィルター(９)は、市販のいわゆる白血球除去フィルターを用いることができ、例えば、具体的にはリューコトラップ(Leukotrap；PALL Co.Ltd.社製、商品名)などを挙げることができる。 Between the inlet (2) and the piston body (4), a filter cassette (8) is arranged at the front end side of the storage chamber (5) so as to block the communication path (3). It is. In this filter cassette (8), a filter (9) that allows red blood cells to pass through but captures white blood cells is sandwiched between a pair of filter holding members (10). As this filter (9), a filter containing a known filter material as a biochemical filter can be used. Examples of such materials include nitrocellulose, polycarbonate, and polyester, but are not limited to these materials. As this filter (9), a commercially available so-called leukocyte removal filter can be used. Specific examples include Leukotrap (trade name, manufactured by Leukotrap; manufactured by PALL Co. Ltd.).
上記のフィルター(９)は、例えば直径約１ｃｍなど、上記の貯留室(５)の内径に対応した大きさに形成されており、好ましくは約６〜９μｍの孔径を有し、より好ましくは、約７〜８μｍの孔径を有する。これらの孔径の範囲であれば、目的とする白血球を効率よく捕捉できるうえ、赤血球を捕捉することがなく、また適度な吸引力でスムースに試料液を通過させることができる。なお上記の孔径は、必要に応じて血小板を捕捉できる大きさに設定してもよく、或いは血小板を通過させる大きさに設定してもよい。 The filter (9) is formed in a size corresponding to the inner diameter of the storage chamber (5), for example, about 1 cm in diameter, and preferably has a pore diameter of about 6 to 9 μm, more preferably It has a pore size of about 7-8 μm. Within these pore sizes, the target leukocytes can be efficiently captured, the red blood cells are not captured, and the sample solution can be passed smoothly with an appropriate suction force. The above-mentioned pore diameter may be set to a size that can capture platelets as needed, or may be set to a size that allows platelets to pass through.
上記のフィルター(９)は１枚のみで用いてもよく、或いは例えば２０枚程度以下の複数枚を重ねて用いてもよい。この場合、１０枚以下で用いるのが好ましく、３〜５枚程度を重ねたものがさらに好ましい。これらの枚数の範囲であれば、十分に白血球を捕捉できるとともに、適度な吸引力でスムースに試料液を通過させることができる。
なお、複数枚のフィルター(９)を重ねて用いる場合、各フィルター(９)は実質的に間隙を有さず互いに密着させてもよく、或いはそれらの間に約０．１〜０．５ｍｍの間隙を形成したものであってもよいが、間隙がない方が好ましい。
The filter (9) may be used alone, or a plurality of, for example, about 20 or less may be used in a stacked manner. In this case, it is preferable to use 10 sheets or less, and it is more preferable to stack 3 to 5 sheets. Within the range of these numbers, the white blood cells can be sufficiently captured, and the sample solution can be passed smoothly with an appropriate suction force.
When a plurality of filters (9) are used in an overlapping manner, each filter (9) may have substantially no gap and may be in close contact with each other, or about 0.1 to 0.5 mm between them. Although a gap may be formed, it is preferable that there is no gap.
上記のピストン体(４)は、後方にプランジャー(11)が接続してあり、作業者はこのプランジャー(11)を手動で操作することにより、上記のピストン体(４)を貯留室(５)内で保密状に、フィルター(９)に対し進退摺動させることができる。なお、本発明ではこのプランジャー(11)を駆動装置に連動して、ピストン体(４)を機械的に進退させることも可能である。 A plunger (11) is connected to the rear side of the piston body (4), and the operator manually operates the plunger (11), so that the piston body (4) is stored in the storage chamber ( 5) It can be moved back and forth with respect to the filter (9) in a tightly-contained manner. In the present invention, it is also possible to mechanically advance and retract the piston body (4) by interlocking the plunger (11) with the drive device.
次に、図１と図２に基づいて、上記の回収装置を用いる白血球タンパク質の回収方法について説明する。
図１と図２に示すように、上記の入口(２)は、注射針(12)を介し、試料液収容容器(13)と洗浄液収容容器(14)と溶解液収容容器(15)とに選択的に切換え接続可能であり、さらに廃液容器(16)とタンパク質回収容器(17)とに選択的にも切換え接続可能である。
Next, based on FIG. 1 and FIG. 2, a method for recovering leukocyte protein using the above-described recovery device will be described.
As shown in FIGS. 1 and 2, the inlet (2) is connected to the sample liquid storage container (13), the cleaning liquid storage container (14), and the dissolution liquid storage container (15) via the injection needle (12). It can be selectively switched and connected, and can also be selectively switched to the waste liquid container (16) and the protein recovery container (17).
（Ｉ）白血球の捕捉工程
最初に、図２(Ａ)に示す捕捉工程(S1)で、血球を含む試料液が収容された試料液収容容器(13)に、注射針(12)を介して上記の回収装置(１)の入口(２)を接続する。そして上記のプランジャー(11)でピストン体(４)を後退させることにより、貯留室(５)内を減圧して試料液を吸入したのち、ピストン体(４)を前進させることにより、貯留室(５)内を加圧して貯留室(５)内の試料液を試料液収容容器(13)内に排出する。この捕捉工程(S1)の操作により、上記の試料液は上記のフィルター(９)を往復通過し、試料液中の赤血球はこのフィルターを通過するが、白血球はこのフィルター(９)に捕捉される。このとき、試料液は上記の入口(２)を介して貯留室(５)内に出入りするので、この貯留室(５)に他の出口等を設ける必要がなく、回収装置(１)を簡略に構成できるうえ、ピストン体(４)を進退させるという、きわめて簡単な操作で白血球をフィルター(９)に捕捉することができる。
(I) Leukocyte capture step First, in the capture step (S1) shown in FIG. 2 (A), the sample solution containing container (13) containing the blood cells is inserted into the sample solution storage container (13) via the injection needle (12). Connect the inlet (2) of the recovery device (1). Then, the piston body (4) is moved backward by the plunger (11), the inside of the storage chamber (5) is depressurized and the sample liquid is sucked, and then the piston body (4) is advanced to move the storage chamber. (5) The inside is pressurized and the sample liquid in the storage chamber (5) is discharged into the sample liquid container (13). By the operation of the capturing step (S1), the sample liquid passes through the filter (9), and red blood cells in the sample liquid pass through the filter, but white blood cells are captured by the filter (9). . At this time, since the sample solution enters and exits into the storage chamber (5) through the inlet (2), there is no need to provide another outlet or the like in the storage chamber (5), and the recovery device (1) is simplified. In addition, leukocytes can be captured by the filter (9) by a very simple operation of moving the piston body (4) forward and backward.
上記の血球を含む試料としては、血液、骨髄液、尿などが挙げられる。１度にこの捕捉工程(S1)に供することができる試料液量は特に制限されないが、少量でも充分な白血球を捕捉できるので、例えば１〜１０mL程度とすればよい。また、ナノサイズの装置を用いる場合は、１〜数滴程度（１滴は２〜１０μl程度）とすることもできる。 Examples of the sample containing blood cells include blood, bone marrow fluid, and urine. The amount of the sample solution that can be used for this capturing step (S1) at a time is not particularly limited, but a sufficient amount of leukocytes can be captured even in a small amount, and may be, for example, about 1 to 10 mL. Moreover, when using a nanosize apparatus, it is also possible to use about 1 to several drops (one drop is about 2 to 10 μl).
上記の回収装置(１)は試料液を吸入し排出するため、この試料液の往動と復動の際に、それぞれ白血球がフィルター(９)に捕捉されるので、少量の試料液から効率よく白血球を捕捉することができる。しかし、本発明においては、試料液は往動や復動のみであってもよく、さらには往復動において、その直前又は直後に１回の「往動」又は「復動」が加わってもよい。 Since the collection device (1) sucks and discharges the sample solution, white blood cells are captured by the filter (9) during the forward and backward movement of the sample solution. Leukocytes can be captured. However, in the present invention, the sample solution may be only forward or backward movement, and further, in the reciprocation, one “forward movement” or “reverse movement” may be added immediately before or after that. .
上記の試料液は、フィルター(９)に１往復以上通過させるのが好ましく、２往復以上通過させるのがより好ましい。即ち、上記の貯留室(５)内から注射針(12)を介して試料液収容容器(13)に排出された試料液は、再度、ピストン体(４)の進退移動で貯留室(５)内に吸入されたのち、試料液収容容器(13)に排出される。このピストン体(４)の往復動は、多い方が白血球の捕捉という本発明の目的を達成し易いデータがある(図７のFCN1参照。)ものの、余りに通過回数が多いと試料が泡立ち、扱い難くなるため、通常、上限は５往復程度とされる。 The sample solution is preferably passed through the filter (9) one or more times, more preferably two or more times. That is, the sample liquid discharged from the storage chamber (5) to the sample liquid storage container (13) via the injection needle (12) is again moved forward and backward by the piston body (4). After being inhaled, it is discharged into the sample liquid storage container (13). There is data that the piston body (4) reciprocates more easily achieves the object of the present invention, ie, capture of white blood cells (see FCN1 in FIG. 7). Usually, the upper limit is about 5 round trips.
上記のピストン体(４)の進退移動により、上記の貯留室(５)内の圧力が調整されて、上記の試料液がフィルター(９)を通過する際の速度や圧力は、特定の値に限定されないが、フィルター(９)が損傷しない程度であるとともに、フィルター(９)を通過する赤血球が破壊されない程度に設定される。例えば、上記のフィルターカセット(８)を挟んで、上記の貯留室(５)と入口側連通路(３)との間に、０.１ＭＰａ以下での所定の差圧が生じるように設定される。これにより、過剰な圧力による赤血球の破壊が防止され、しかも、試料液がフィルター(９)を円滑に通過できる。
以上の操作により、赤血球やその他の夾雑物の捕捉を抑えて、フィルター(９)に白血球が効率よく捕捉される。
The pressure in the storage chamber (5) is adjusted by the forward and backward movement of the piston body (4), and the speed and pressure when the sample liquid passes through the filter (9) are set to specific values. Although not limited, it is set to such an extent that the filter (9) is not damaged and the red blood cells passing through the filter (9) are not destroyed. For example, a predetermined differential pressure of 0.1 MPa or less is generated between the storage chamber (5) and the inlet side communication passage (3) with the filter cassette (8) interposed therebetween. . Thereby, destruction of red blood cells due to excessive pressure is prevented, and the sample solution can smoothly pass through the filter (9).
By the above operation, capture of red blood cells and other contaminants is suppressed, and white blood cells are efficiently captured by the filter (9).
（II）洗浄工程
次いで、図２(Ｂ)に示す洗浄工程(S2)で、上記のピストン体(４)をプランジャー(11)で操作することにより、洗浄液収容容器(14)から注射針(12)を介して洗浄液を貯留室(５)内へ吸引したのち、貯留室(５)内の洗浄液を廃液容器(16)内に排出する。この洗浄工程(S2)の操作により、上記の白血球を捕捉したフィルター(９)に洗浄液が往復通過し、この結果、フィルター(９)をはじめフィルター保持部材(10)、貯留室(５)の内面、ピストン体(４)の前面などに付着した赤血球や、血球以外の夾雑物質が洗浄されて除去される。この洗浄工程(S2)に用いる洗浄液としては、緩衝液、生理食塩水、緩衝液−生理食塩水などが挙げられる。具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。中でも生理食塩水が好ましい。緩衝液はｐＨ７〜８程度に調整したものを用いればよいがｐＨ７.５がより好ましい。
(II) Cleaning Step Next, in the cleaning step (S2) shown in FIG. 2 (B), by operating the piston body (4) with the plunger (11), the cleaning needle (14) is removed from the cleaning liquid container (14). After the cleaning liquid is sucked into the storage chamber (5) through 12), the cleaning liquid in the storage chamber (5) is discharged into the waste liquid container (16). By the operation of this washing step (S2), the washing solution reciprocates through the filter (9) that has captured the white blood cells. Then, erythrocytes adhering to the front surface of the piston body (4) and contaminants other than blood cells are washed and removed. Examples of the washing solution used in this washing step (S2) include a buffer solution, physiological saline, and buffer-physiological saline. Specific examples include phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, tartaric acid buffer, Tris buffer, phosphate buffered saline, and the like. Of these, physiological saline is preferable. A buffer adjusted to about pH 7 to 8 may be used, but pH 7.5 is more preferable.
上記のフィルター(９)に対する洗浄液の通過は特定の回数に限定されないが、３往復以下が好ましく、２往復に設定するのがより好ましい。上記範囲であれば、目的とする白血球をフィルター(９)に捕捉した状態で、赤血球などを効果的にフィルター(９)から除去できる。これに対し３往復よりも回数を増やすと、目的とする白血球もフィルター(９)から離脱して除去される虞が生じる。実際、４往復ではフィルター(９)等から赤血球の大半が除かれるものの、白血球タンパク質も大半が失われていた(図５Ｂ，３ｂ＊参照)。
以上の操作により、上記のフィルター(９)に試料中の白血球が選択的にかつ効率よく捕捉されたまま、しかもこのフィルター(９)から赤血球が効率よく除去される。
The passage of the cleaning liquid to the filter (9) is not limited to a specific number of times, but is preferably 3 reciprocations or less, and more preferably set to 2 reciprocations. If it is the said range, a red blood cell etc. can be effectively removed from a filter (9) in the state which capture | acquired the target white blood cell by the filter (9). On the other hand, when the number of times is increased more than 3 times, there is a possibility that the target white blood cells may be detached from the filter (9) and removed. In fact, in 4 round trips, most of the red blood cells were removed from the filter (9) and the like, but most of the white blood cells were lost (see FIGS. 5B and 3b *).
By the above operation, red blood cells are efficiently removed from the filter (9) while the white blood cells in the sample are selectively and efficiently captured by the filter (9).
（III）白血球タンパク質の溶出工程
次いで、図２(Ｃ)に示す溶出工程(S3)で、注射針(12)を介して上記の回収装置(１)の入口(２)を溶解液収容容器(15)に接続する。そして、上記のピストン体(４)をプランジャー(11)で操作することにより、この溶解液収容容器(15)からタンパク質溶解液を貯留室(５)内に吸入したのち、この貯留室(５)内の溶解液をタンパク質回収容器(17)内へ排出する。この溶出工程(S3)の操作により、上記のフィルター(９)にタンパク質溶解液が１往復通過し、このフィルター(９)に捕捉されている白血球の細胞膜が溶解されて、そのタンパク質が溶解液中に溶け出し、タンパク質回収容器(17)内に効率よく回収される。そしてこのタンパク質回収容器(17)は次工程で凍結され、或いは検査工程で上記の回収された白血球タンパク質が検査される。
(III) Leukocyte protein elution step Next, in the elution step (S3) shown in FIG. 2 (C), the inlet (2) of the recovery device (1) is placed through the injection needle (12) into the lysate container ( Connect to 15). Then, by operating the piston body (4) with the plunger (11), the protein solution is sucked into the storage chamber (5) from the solution storage container (15), and then the storage chamber (5 The solution in) is discharged into the protein recovery container (17). By the operation of this elution step (S3), the protein solution passes through the filter (9) once, and the leukocyte cell membrane captured by the filter (9) is dissolved, and the protein is dissolved in the solution. And is efficiently recovered in the protein recovery container (17). And this protein collection | recovery container (17) is frozen at the next process, or said collect | recovered leukocyte protein is test | inspected at a test process.
なお、上記のフィルター(９)に捕捉された白血球のタンパク質は、タンパク質溶解液をこのフィルター(９)に再度往復通過させてさらに多くの白血球タンパク質を回収することも考えられる。しかしこの場合はタンパク質回収容器(17)内に回収される液量が不必要に増えるので、上記の溶出工程(S3)では、タンパク質溶解液を上記のフィルター(９)に１往復のみ通過させるのが好ましい。 It is also conceivable that the leukocyte protein captured by the filter (9) can be recovered by passing the protein solution again and again through the filter (9). However, in this case, since the amount of the liquid recovered in the protein recovery container (17) increases unnecessarily, in the elution step (S3), the protein solution is passed through the filter (9) only once. Is preferred.
上記のタンパク質溶解液は、水溶性タンパク質のみでなく細胞膜や疎水性タンパク質までも溶解させることができる成分を有効量含んでいることが重要である。これらを溶解させることができる成分としては、例えば、界面活性剤が挙げられる。中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤は、Triton X、Pluronic、Tweenなどの商品名で市販されている。界面活性剤のタンパク質溶解液中の濃度は約０.１〜２ｗ/ｖ％が好ましく、約０.５〜１ｗ/ｖ％がより好ましい。 It is important that the protein solution contains an effective amount of components that can dissolve not only water-soluble proteins but also cell membranes and hydrophobic proteins. Examples of the component that can dissolve these include surfactants. Among these, nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, and alkyl monoglyceryl ether are preferable. Nonionic surfactants are commercially available under trade names such as Triton X, Pluronic, and Tween. The concentration of the surfactant in the protein solution is preferably about 0.1 to 2 w / v%, more preferably about 0.5 to 1 w / v%.
上記のタンパク質溶解液は中性に調整したものを用いればよいが、ｐＨ７.５がより好ましい。また、タンパク質分解阻害剤やタンパク質分解阻害タンパク質を含むことが好ましい。また、塩(ＮａＣｌ)やキレート剤(ＥＤＴＡ)を含むことも好ましい。これらを考慮して、例えばTNETと名付けた以下の組成を持つタンパク質溶解液が特に好ましいものとして挙げられる。ここにTNETは以下の組成を持つ： 10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 1% TritonX-100, 1mM EDTA(pH8.0), 0.1mg/mL PMSF, 1mM Aprotinin, 0.001mg/mL Leupeptin, 0.001mg/mL pepstatin A, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 10mM β-glycerophosphate。 The above protein solution may be adjusted to neutral, more preferably pH 7.5. Moreover, it is preferable that a protein degradation inhibitor and a protein degradation inhibition protein are included. It is also preferable to contain a salt (NaCl) or a chelating agent (EDTA). In consideration of these, a protein solution having the following composition, for example, named TNET is particularly preferable. Here TNET has the following composition: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% TritonX-100, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 mg / mL PMSF, 1 mM Aprotinin, 0.001 mg / mL Leupeptin, 0.001 mg / mL pepstatin A, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 , 10 mM β-glycerophosphate.
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
最初に、各実施例で行った実験方法と操作について説明する。
(1)細胞培養
MONO-MAC-6をRPMI1640培地へ20%FBS、2mM L-glutamine、1mM sodium pyruvate、10μg/mL human insulin、Penicillin-Streptomycinを添加した培地で37℃、5% CO2インキュベーターで培養した。実験には、10cm dishでLog phaseまで培養したものを使用した。
First, experimental methods and operations performed in each example will be described.
(1) Cell culture
MONO-MAC-6 was cultured in RPMI1640 medium in a medium supplemented with 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 10 μg / mL human insulin, and penicillin-streptomycin in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. In the experiment, a 10 cm dish cultured until the log phase was used.
(2)MONO-MAC-6細胞の解析
ヒト単球系培養細胞であるMONO-MAC-6細胞懸濁液(全量は１０mL：約１x１０７個の細胞数)を、上記のフィルター(１,３,５,７,１０枚)を備えた回収装置(１)でそれぞれ２回ずつ吸引・排出を繰り返し、２回目の排出液を別個に１５mLコニカルチューブ(合計６本)へ移した。なお、上記のフィルターを備えない回収装置(フィルター：０枚)を同様に操作して比較例とした。それぞれのコニカルチューブ内を別個にピペッティングにより混ぜたのち、１５mLコニカルチューブ２本（合計１２本）へ分注した。一方、他の比較例としての未処理群(NT)については、細胞懸濁液(全量は１０mL)をピペッティングにより混ぜた後、１５mLコニカルチューブ２本へ５mLずつ分注した。各群、２本のうち１本は、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、上清を除き、PBS５mLを加え、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、PBSを除いた。次いで、タンパク質溶解液(TNET)を５０μL加え、ピペッティングにより混ぜた後、２×Sample buffer を５０μL加えた。
(2) Analysis of MONO-MAC-6 cells A suspension of MONO-MAC-6 cells (total volume is 10 mL: about 1 × 10 7 cells), which are human monocyte cultured cells, is filtered with the above filter (1, 3 , 5, 7, and 10), the aspirator was repeatedly aspirated and discharged twice each time, and the second discharged liquid was separately transferred to a 15 mL conical tube (total of 6 tubes). In addition, the collection apparatus (filter: 0 sheets) not equipped with said filter was operated similarly, and it was set as the comparative example. Each conical tube was mixed by pipetting separately, and then dispensed into two 15 mL conical tubes (12 in total). On the other hand, for the untreated group (NT) as another comparative example, the cell suspension (total amount: 10 mL) was mixed by pipetting and then dispensed in 5 mL portions into two 15 mL conical tubes. One of the two in each group was centrifuged at 1000 rpm × 5 min, 25 ° C., the supernatant was removed, 5 mL of PBS was added, and after centrifugation at 1000 rpm × 5 min, 25 ° C., PBS was removed. Next, 50 μL of a protein solution (TNET) was added and mixed by pipetting, and then 50 μL of 2 × Sample buffer was added.
ここに、上記のTNETは以下の組成を持つ： 10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 1% TritonX-100, 1mM EDTA(pH8.0), 0.1mg/mL PMSF, 1mM Aprotinin, 0.001mg/mL Leupeptin, 0.001mg/mL pepstatin A, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 10mM β-glycerophosphate。これらを７分間 煮沸し、−３０℃で保存した。この一部をウエスタン解析に使用した。他の１本については、1000rpm×５min,２５℃で遠心後、上清を除き、CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit(BECTON DICKINSON)に添付されてあるプロトコールに従い、PI (Propidium iodide)染色を行った。FACS (fluorescence activated cell sorting)による解析を行う前に、ナイロンメッシュ(３００μm)で濾過し、このうち１０μLをBuffer Solution ９０μLと混ぜたものを各群４本ずつ用意し、細胞数カウントを４回行って平均値を算出した。また、DNAヒストグラム解析により、細胞のDNA量のピークを確認した。 Here, the above TNET has the following composition: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% TritonX-100, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 mg / mL PMSF, 1 mM Aprotinin, 0.001 mg / mL Leupeptin, 0.001 mg / mL pepstatin A, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 , 10 mM β-glycerophosphate. These were boiled for 7 minutes and stored at -30 ° C. Part of this was used for Western analysis. The other one was centrifuged at 1000 rpm × 5 min at 25 ° C., the supernatant was removed, and PI (Propidium iodide) staining was performed according to the protocol attached to the CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit (BECTON DICKINSON). Before analysis by FACS (fluorescence activated cell sorting), filter with a nylon mesh (300 μm), prepare 10 μL of this mixed with 90 μL of Buffer Solution for each group, and count the number of cells 4 times. The average value was calculated. Moreover, the peak of the DNA amount of the cell was confirmed by DNA histogram analysis.
(3)ウエスタンブロッティング
フィルターに捕捉されなかったMONO-MAC-6細胞からTNETによって溶出したタンパク質を１０μL使用して、１０%SDS-polyacrylamide gelで電気泳動を行い、Immobilon-P Transfer membrane(Millipore)へ転写した。０.０５% Tween-20が入ったTBS(TBST)へSkim milkが５%になるよう溶かしたバッファー(５%Skim milk/TBST)へメンブレンを４℃、一晩浸し、ブロッキングを行った。１次抗体は、室温で３時間反応させ、反応終了後、TBSTで３回洗浄した。２次抗体は室温で１時間３０分反応させた後、TBSTで３回洗浄した。次いで、各メンブレンをWESTERN LIGHTNING Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Science, Inc.)へ浸し、FUJI MEDICAL X-RAY FILM(富士フィルム株式会社)へ感光した。
(3) Using 10 μL of the protein eluted by TNET from MONO-MAC-6 cells not captured by the Western blotting filter, electrophoresis was performed with 10% SDS-polyacrylamide gel and transferred to Immobilon-P Transfer membrane (Millipore) Transcribed. Blocking was performed by immersing the membrane in a buffer (5% skim milk / TBST) containing 5% skim milk in TBS (TBST) containing 0.05% Tween-20 at 4 ° C. overnight. The primary antibody was reacted at room temperature for 3 hours, and washed 3 times with TBST after the reaction was completed. The secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour 30 minutes and then washed 3 times with TBST. Each membrane was then immersed in WESTERN LIGHTNING Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Science, Inc.) and exposed to FUJI MEDICAL X-RAY FILM (Fuji Film Co., Ltd.).
使用した１次抗体は、５%Skim milk/TBSTで５００倍希釈したanti-GAPDH mouse IgG(final 13μg/mL, Clone#6C5, Fitzgerald)、Can Get Signal Solution 1(TOYOBO)で５００倍希釈したanti-α-Erk1/2ポリクローナル抗体(1:500,Cell Signaling TECHNOLOGY)、５%Skim milk/TBSTで２５０倍希釈したanti-α-FCN1ポリクローナル抗体(final 0.76μg/mL,ATLAS Antibodies)である。２次抗体は、５%Skim milk/TBSTで５００倍希釈したHRP-mouse IgG Fc(Cappel)、Can Get Signal Solution 2(TOYOBO)で１０００倍希釈したHRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc(final 0.6μg/mL,cappel)、あるいは、５% Skim milk/TBSTで1000倍希釈したHRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc (final 0.6μg/mL,cappel)を使用した。 The primary antibodies used were anti-GAPDH mouse IgG (final 13 μg / mL, Clone # 6C5, Fitzgerald) diluted 500-fold with 5% skim milk / TBST, and anti-GAPDH mouse IgG diluted 500-fold with Can Get Signal Solution 1 (TOYOBO). -α-Erk1 / 2 polyclonal antibody (1: 500, Cell Signaling TECHNOLOGY), anti-α-FCN1 polyclonal antibody (final 0.76 μg / mL, ATLAS Antibodies) diluted 250-fold with 5% skim milk / TBST. Secondary antibodies were HRP-mouse IgG Fc (Cappel) diluted 500-fold with 5% skim milk / TBST, HRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc (1000-fold diluted with Can Get Signal Solution 2 (TOYOBO)). final 0.6 μg / mL, cappel) or HRP-conjugated goat affinity purified antibody to rabbit IgG Fc (final 0.6 μg / mL, cappel) diluted 1000-fold with 5% skim milk / TBST.
(4)血球分布
真空採血管を用い、２mLずつ合計１６本採血した。各群(未処理群(NT)、フィルター０枚、１枚、３枚、５枚、７枚、１０枚)に４mL(２mL×２本)の血液を使用した。まず未処理群(NT)については、血液４mLを転倒混和により混ぜた後、エッペンチューブ３本へ分注し、全自動血球カウンター(コールター Model S-Plus)により血球分布データを３回とって平均値を算出した。また、血液４mLをフィルター(１,３,５,７,１０枚)が入った上記の回収装置およびフィルターを備えない回収装置(フィルター：０枚)でそれぞれ吸引し、１５mLコニカルチューブへ移し、転倒混和により混ぜた後、エッペンチューブ３本へ分注して、血液分布データを各群３回とった。また、吸引・排出を繰り返すことでフィルターへより多くの細胞を捕捉させることができるかどうかを調べるために、フィルター５枚を装着した上記の回収装置で、血液４mLの吸引・排出を５回繰り返したものについても、同様に血球分布データをとった。
(4) Blood cell distribution Using a vacuum blood collection tube, a total of 16 blood samples were collected 2 mL each. 4 mL (2 mL × 2) of blood was used for each group (untreated group (NT), 0 filters, 1, 3, 5, 7, 10). First, for the untreated group (NT), 4 mL of blood was mixed by inversion, then dispensed into 3 Eppendorf tubes, and the blood cell distribution data was averaged 3 times using a fully automatic blood cell counter (Coulter Model S-Plus). The value was calculated. In addition, 4 mL of blood was aspirated with the above-mentioned recovery device with filters (1, 3, 5, 7, 10) and a recovery device without filters (filter: 0), transferred to a 15 mL conical tube, and overturned After mixing by mixing, it was dispensed into 3 Eppendorf tubes, and blood distribution data was taken 3 times for each group. In addition, in order to examine whether more cells can be captured by the filter by repeating suction and discharge, the suction and discharge of 4 mL of blood is repeated five times with the above-described collection device equipped with five filters. Similarly, blood cell distribution data were taken for the samples.
(5)フィルターに捕捉された全血液細胞の溶出
フィルターをPBS５mLの吸引・排出を２回繰り返すことで洗浄し、０.５mLのTNETで全タンパク質を溶出した。タンパク質が溶出された溶解液はエッペンチューブ２本へ分注し、一方へは１００% glycerolを最終濃度20%になるように加え、４℃にて回転混濁させて混ぜ、−８０℃で保存した。もう一方へは４×Sample Bufferを加え、７分間煮沸し、−３０℃で保存した。このうち一部、たとえば１０μL(全量の1/35〜1/27)を、ウエスタン解析に使用した。
(5) Elution of whole blood cells trapped on the filter The filter was washed by repeating suction and discharge of 5 mL of PBS twice, and total protein was eluted with 0.5 mL of TNET. Dissolve the protein-eluted solution into two Eppendorf tubes, add 100% glycerol to one end to a final concentration of 20%, rotate and mix at 4 ° C, and store at -80 ° C. . To the other side, 4 × Sample Buffer was added, boiled for 7 minutes, and stored at −30 ° C. A part of this, for example, 10 μL (1/35 to 1/27 of the total amount) was used for Western analysis.
ヒト培養単球を用いて２回吸引・排出した場合
マクロファージ由来のヒト培養単球(monocyte)を１０cmシャーレで培養して、同じ数量(１０cmシャーレ１枚分：およそ100万個の細胞)の細胞を準備し、フィルター数を１，３，５，７或いは１０枚を備えたそれぞれの回収装置(１)で吸引したのち排出して、１５mLコニカルチューブに集めてFACS解析とウエスタン解析をした。またフィルターを備えていない回収装置(フィルター：０枚)でも同様に操作してFACS解析とウエスタン解析をした。
When sucked and discharged twice using human cultured monocytes Cultured human monocytes derived from macrophages in a 10 cm dish and the same number of cells (one 10 cm dish: approximately 1 million cells) The sample was aspirated with each collection device (1) equipped with 1, 3, 5, 7 or 10 filters, and was collected and collected in a 15 mL conical tube for FACS analysis and Western analysis. Further, FACS analysis and Western analysis were carried out in the same manner with a collecting apparatus (filter: 0) not equipped with a filter.
FACS解析により、フィルターに捕捉されなかった細胞のDNAヒストグラム解析を行い、各群のDNA量(細胞数)のパターンを比較したところ、図３(Ａ)に示すように、フィルターを通過させない比較例(NT,0枚)に比べて、フィルターを通過させた場合は、フィルターに捕捉されなかった細胞数が少なくなっていた。しかもフィルター数が１〜１０枚と増えるにつれてフィルターに捕捉されなかった細胞数が漸減していた。図３(Ａ)中の右上に示したFACSパターン(５枚フィルター使用の場合)は、使用した細胞が健常に増殖していたことを示している。 A DNA histogram analysis of cells not captured by the filter by FACS analysis, and comparing the DNA amount (cell number) patterns of each group, as shown in FIG. Compared with (NT, 0 sheets), the number of cells that were not captured by the filter was smaller when it was passed through the filter. Moreover, the number of cells that were not captured by the filter gradually decreased as the number of filters increased from 1 to 10. The FACS pattern shown in the upper right of FIG. 3 (A) (in the case of using five filters) shows that the used cells were healthy.
また、GAPDH(どの細胞でも発現している解糖系酵素), 及びErk1/2(増殖細胞に発現しているシグナル伝達因子)に対する抗体を用いてウエスタン解析したところ、図３(Ｂ)と図３(Ｃ)に示すようにFACS解析の結果と合致した傾向に従い、フィルター数が１〜１０枚と増えるにつれてバンドの強度(これら抗原タンパク質を反映する)が漸減していた。 Further, Western analysis using antibodies against GAPDH (a glycolytic enzyme expressed in any cell) and Erk1 / 2 (a signal transduction factor expressed in proliferating cells) revealed that FIG. 3 (B) and FIG. As shown in FIG. 3 (C), the band intensity (reflecting these antigenic proteins) gradually decreased as the number of filters increased from 1 to 10 in accordance with the tendency consistent with the FACS analysis results.
一方、フィルターに捕捉された細胞は０.５mlのタンパク質溶解液(TNET)を吸引して溶出し、その一部をウエスタン解析した。その結果、図３(Ｃ)に示すように、フィルター数が１枚や３枚では捕捉されるタンパク質の量は少ないが、５枚以上では上記のいずれの抗原に対しても大差なく十分な量が捕捉されていた。フィルター数が７枚や１０枚の場合は分厚くて細胞吸引・排出が滑らかでないこと、３枚では捕捉されないタンパク質もある可能性を考慮すると、これらの結果はフィルター数５枚が適量であることを示唆すると判断した。 On the other hand, the cells captured by the filter were eluted by aspirating 0.5 ml of protein lysate (TNET), and a part of the cells was subjected to Western analysis. As a result, as shown in FIG. 3 (C), the amount of captured protein is small when the number of filters is 1 or 3; Had been captured. If the number of filters is 7 or 10, it is thick and the cell aspiration / discharge is not smooth. Considering the possibility of some proteins not being captured by 3 sheets, these results indicate that the number of filters is 5 Judged to suggest.
ヒト培養単球を用いて１〜５回吸引・排出した場合
次に上記の回収装置(１)に備えたフィルター数を５枚に固定して、吸引・排出回数による捕捉量の変動を調べた。FACS解析の結果、図４(Ａ)に示すように、フィルターに捕捉されなかった細胞数は吸引・排出の往復回数が１〜５回と増すにつれて漸減していた。
When the human culture monocytes were aspirated and discharged 1 to 5 times, the number of filters provided in the recovery device (1) was fixed to 5 and the fluctuation of the capture amount due to the number of aspiration and discharge was examined. . As a result of the FACS analysis, as shown in FIG. 4 (A), the number of cells not captured by the filter gradually decreased as the number of suction / discharge round trips increased from 1 to 5.
一方、ウエスタン解析の結果は、たとえばGAPDHについて、図４(Ｂ)に示すように捕捉されなかった分画では回数が増すにつれて漸減していたが、逆に捕捉された分画では、図４(Ｃ)に示すように回数が増すにつれて漸増していた。Erk1/2についても、同様の結果が得られた。手間を惜しまなければフィルターを通過させる回数は多い方が良いことが示唆されるが、回数が増えるにつれて泡がでてタンパク質が変性するなど、何かと不便な現象を生じるので、手作業では５回くらいが限度であると考えられる。ただし、これらの操作を機械化した場合には、回数を増やせるかどうかの検討をする価値があることを示唆している。 On the other hand, the results of Western analysis, for example, for GAPDH, gradually decreased with the increase in the number of fractions that were not captured as shown in FIG. 4 (B). As shown in C), it gradually increased as the number of times increased. Similar results were obtained for Erk1 / 2. If you do not spare time, it is suggested that the number of times of passing through the filter is better, but as the number of times increases, bubbles will appear and proteins will be denatured. Is considered the limit. However, when these operations are mechanized, it is suggested that it is worth considering whether the number of times can be increased.
ヒトの血液を用いた場合(血球数カウント)
次にヒトの血液を用いて、フィルター枚数を変えて１回ずつ吸引・排出した場合について調べた。まず、フィルターに捕捉されなかった血球細胞数を、その場で自動血球カウンターにより測定したところ、図５に示すように、WBC(白血球数)、LY#(リンパ球数）、MO#(単球数)、NE#(好中球数)、PLT(血小板数)が、いずれもフィルターの枚数が増えるにつれて漸減していた。すなわちこれらの血液細胞は、上記の回収装置(１)によって捕捉されたことを示唆している。これに対しRBC(赤血球数)については変化がなく、期待通り上記の回収装置(１)は赤血球を素通りさせるという優れた機能を持つことが示唆された。なお、これらの測定値において、標準誤差(SE)は極めて低かった。その他の微量な血液細胞は数値が小さいので信頼のおける測定値は得られなかった。
When using human blood (count of blood cells)
Next, human blood was used to examine the case where the number of filters was changed and sucked and discharged one by one. First, the number of blood cells that were not captured by the filter was measured on the spot using an automatic blood cell counter. As shown in FIG. 5, WBC (white blood cell count), LY # (lymphocyte count), MO # (monocyte) Number), NE # (neutrophil count), and PLT (platelet count) all decreased gradually as the number of filters increased. That is, it is suggested that these blood cells were captured by the recovery device (1). On the other hand, there was no change in RBC (red blood cell count), and it was suggested that the recovery device (1) had an excellent function of passing red blood cells as expected. In these measured values, the standard error (SE) was extremely low. Other small amounts of blood cells were small in value, so reliable measurements could not be obtained.
興味深いことに、フィルター数を５枚装着した回収装置(１)を用いてフィルター通過回数を１往復から５往復に増加させると、フィルター数が１０枚の場合と同等な値が得られた(図５の各グラフの右端の棒グラフ、5x5*参照。)。
そこで次に、フィルター数を５枚に固定して、吸引・排出回数による捕捉量の変動を調べたところ、図６に示すように、３往復まではいくつかの細胞で漸減していたが、それ以上は大差がなかった。図６においても標準誤差(SE)は極めて低かった。一方、４往復以上フィルターを通過させると、血液の場合には引っかかりが生じて吸引・排出動作が重くなり、ピストン体(４)の操作性が低下する。これらの結果から、４往復以上フィルターを通過させることは現実的ではないと判断した。
Interestingly, when the number of filter passes was increased from 1 round trip to 5 round trips using the collection device (1) with 5 filters, the same value as when the number of filters was 10 was obtained (Fig. (See the 5x5 * bar chart at the right end of each graph.)
Then, next, when the number of filters was fixed to 5 and the fluctuation of the amount of capture due to the number of aspirations / discharges was examined, as shown in FIG. There was not much difference beyond that. Also in FIG. 6, the standard error (SE) was extremely low. On the other hand, if it passes through the filter more than 4 times, in the case of blood, it will be caught, the suction / discharge operation will become heavy, and the operability of the piston body (4) will deteriorate. From these results, it was determined that it was not practical to pass the filter more than 4 times.
ヒトの血液を用いた場合(ウエスタン解析)
次に、上記の結果をウエスタン解析で確認した。まず、図７(Ａ)に示すように、GAPDHについてはフィルター枚数が０枚の比較例にあっても、他と同等な強度のバンドが観察された。これは血液中に大量に存在する赤血球内のGAPDHが、回収装置(１)のフィルター保持部材(10)や貯留室(５)の内面等に残存していたためと考えられる。なぜなら、赤血球以外のヒト血液細胞の一部に存在する補体制御に関わるFCN1は、期待通りフィルター数３枚以上で初めて検出されているからである。
Using human blood (Western analysis)
Next, the above results were confirmed by Western analysis. First, as shown in FIG. 7A, for GAPDH, a band having the same intensity as the others was observed even in the comparative example in which the number of filters was zero. This is presumably because GAPDH in red blood cells present in a large amount in blood remained on the filter holding member (10) of the collection device (1), the inner surface of the storage chamber (5), and the like. This is because FCN1 related to complement control existing in a part of human blood cells other than erythrocytes is detected for the first time with three or more filters as expected.
興味深いことにFCN1は、フィルター数が１０枚のとき大量に捕捉されていたが、フィルター数が５枚でも５往復通過させれば、同等な捕捉が実現できていた。そこで、フィルター数を５枚に固定して、フィルター(９)を通過数による捕捉量の変動を調べたところ、図７(Ｂ)に示すように、やはり３回まではバンド強度が漸増していたが、それ以上は大差なかった。 Interestingly, FCN1 was captured in large quantities when the number of filters was 10. However, even if the number of filters was 5, the same capture could be achieved. Therefore, when the number of filters was fixed to 5 and the fluctuation of the amount of capture due to the number of passes through the filter (9) was examined, the band intensity gradually increased up to 3 times as shown in FIG. 7 (B). However, there was not much difference beyond that.
ところで、最初に設定したPBSによる２回の洗浄では赤血球がいくらか残存して排出液が赤い。そこで、排液の赤みがほとんど消えるまで洗浄回数を増加させ、洗浄液を４往復通過させてウエスタン解析したところ、GAPDHのみでなくFCN1も大量に消失した。やはり２回の洗浄が最適であろうと考えられる。 By the way, in the first washing with PBS twice, some red blood cells remain and the effluent is red. Therefore, the number of washings was increased until the redness of the drainage almost disappeared, and the Western analysis was performed by passing the washings through four reciprocations. As a result, not only GAPDH but also a large amount of FCN1 disappeared. Again, it is thought that two washes would be optimal.
上記の回収装置による捕捉効率を調べるため、通常のフィコールクッションを用いて遠心操作で赤血球を除去して白血球成分を調製する従来の方法と比較した。その結果、従来法では主として赤血球由来のGAPDHは検出できなかった。これは従来法での赤血球の混入は極めて低いことを示す。しかしFCN1量に関しては本発明装置による方法が高い捕捉効率を有していた。実際、従来法での２μＬは血液０.１６ｍＬに相当するが、それより２倍程度強いFCN1バンド強度を示す本発明装置による捕捉されたサンプルは、血液０.０８ｍＬに相当するのである。すなわち本発明装置と方法を用いれば、従来法の４倍量の抽出液が調整できることを意味する。この結果は、その迅速さと簡便さを考慮すると、本発明の回収方法と回収装置が極めて優れた技術であることを示す。 In order to examine the capture efficiency of the above-described collection device, the comparison was made with a conventional method of preparing leukocyte components by removing red blood cells by centrifugation using a normal Ficoll cushion. As a result, GAPDH derived mainly from erythrocytes could not be detected by the conventional method. This indicates that contamination of red blood cells by the conventional method is extremely low. However, with respect to the amount of FCN1, the method according to the present invention had a high capture efficiency. In fact, 2 μL in the conventional method corresponds to 0.16 mL of blood, but a sample captured by the device of the present invention showing FCN1 band intensity about twice as strong as that corresponds to 0.08 mL of blood. That is, if the apparatus and method of the present invention are used, it means that a four-fold amount of extract can be prepared compared to the conventional method. This result shows that the recovery method and the recovery apparatus of the present invention are extremely excellent technologies in consideration of the speed and simplicity.
上記の第１実施形態では、上記のピストン体(４)を手作業で進退移動させた。しかし本発明では、このピストン体(４)を機械的に自動制御することも可能である。
即ち、図８に示す第２実施形態では、シリンジを用いた回収装置(１)のピストン体(４)に、駆動装置(18)がプランジャー(11)を介して連動連結してあり、この駆動装置(18)によりピストン体(４)が、貯留室(５)内に装着されたフィルター(９)に対し、機械的に進退移動される。
In the first embodiment, the piston body (4) is moved forward and backward manually. However, in the present invention, this piston body (4) can be mechanically automatically controlled.
That is, in the second embodiment shown in FIG. 8, the drive device (18) is interlocked and connected to the piston body (4) of the recovery device (1) using a syringe via the plunger (11). The piston (4) is mechanically moved forward and backward by the drive device (18) with respect to the filter (9) mounted in the storage chamber (5).
一方、上記の回収装置(１)の入口(２)に対面させて、容器収容部(19)が設けてある。この容器収容部(19)には、試料液収容容器(13)と、試料液廃棄容器(20)と、洗浄液収容容器(14)と、洗浄液廃棄容器(16)と、溶解液収容容器(15)と、タンパク質回収容器(17)が配置されている。各容器は、この容器収容部(19)内で例えばロータリー状に配置され、互いに移動することで、上記の回収装置(１)の入口(２)に対し、選択的に対面させることができる。 On the other hand, a container accommodating portion (19) is provided facing the inlet (2) of the recovery device (1). The container storage section (19) includes a sample liquid storage container (13), a sample liquid disposal container (20), a cleaning liquid storage container (14), a cleaning liquid disposal container (16), and a solution storage container (15 ) And a protein recovery container (17). Each container is disposed, for example, in a rotary shape in the container housing portion (19), and can move selectively to face the inlet (2) of the recovery device (1).
上記の回収装置(１)は、例えばこの回収装置全体を進退させることにより、上記の容器収容部(19)に対し相対的に接近・後退させることが可能である。なお本発明では、容器収容部(19)を進退させることにより、この容器収容部(19)を上記の回収装置(１)に対し相対的に接近・後退させてもよい。上記の白血球タンパク質回収装置(１)の他の構成については、上記の第１実施形態と同様に構成され、同様に作用するので説明を省略する。 The collection device (1) can be moved closer to and away from the container housing portion (19) by, for example, moving the entire collection device forward and backward. In the present invention, the container housing part (19) may be moved closer to or backward from the collection device (1) by moving the container housing part (19) forward and backward. The other configuration of the leukocyte protein recovery device (1) is configured in the same manner as in the first embodiment and operates in the same manner, and thus the description thereof is omitted.
次に、上記の回収装置(１)により白血球タンパク質を回収する手順について、図８に基づき説明する。
最初に、容器収容部(19)に収容された試料液収容容器(13)を、上記の回収装置(１)の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させて、注射針(12)をこの試料液収容容器(13)に刺通させ、入口(２)を試料液収容容器(13)に連通させる。そして上記の駆動装置(18)によりピストン体(４)を後退させ、試料液収容容器(13)内の試料液を、回収装置(１)の貯留室(５)内に吸入し、次いで、ピストン体(４)を前進させて、この貯留室(５)内の試料液を試料液収容容器(13)に排出する。この往復動作を所定回数、例えば２〜５往復繰り返したのち、最後の排出の前に回収装置(１)を後退させ、試料液廃棄容器(20)を上記の入口(２)に対面させる。そして回収装置(１)を前進させて注射針(12)を試料液廃棄容器(20)に刺通したのち、ピストン体(４)を前進させて、貯留室(５)内の試料液を試料液廃棄容器(20)に排出する。この試料液の往復動により、試料液に含まれる白血球が上記のフィルター(９)に捕捉される。なお、上記の試料液収容容器(13)は空になっており、後ほど廃棄される。
Next, a procedure for recovering leukocyte protein by the recovery device (1) will be described with reference to FIG.
First, the sample solution storage container (13) stored in the container storage section (19) is made to face the inlet (2) of the recovery device (1), the recovery device (1) is advanced, and the injection needle (12) is pierced into the sample liquid storage container (13), and the inlet (2) is communicated with the sample liquid storage container (13). Then, the piston body (4) is moved backward by the driving device (18), the sample liquid in the sample liquid storage container (13) is sucked into the storage chamber (5) of the recovery apparatus (1), and then the piston The body (4) is advanced, and the sample liquid in the storage chamber (5) is discharged into the sample liquid storage container (13). After repeating this reciprocating operation a predetermined number of times, for example, 2 to 5 reciprocating times, the recovery device (1) is retracted before the final discharge, and the sample liquid disposal container (20) is made to face the inlet (2). Then, after the collection device (1) is advanced and the injection needle (12) is pierced through the sample liquid disposal container (20), the piston body (4) is advanced and the sample liquid in the storage chamber (5) is sampled. Discharge into the liquid waste container (20). By the reciprocating motion of the sample solution, white blood cells contained in the sample solution are captured by the filter (9). The sample solution storage container (13) is empty and will be discarded later.
次に、上記の回収装置(１)を後退させたのち、洗浄液収容容器(14)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させる。これにより上記の入口(２)が注射針(12)を介して洗浄液収容容器(14)に連通するので、ピストン体(４)を後退させて洗浄液を貯留室(５)内に吸入する。次いで、回収装置(１)を後退させて、洗浄液廃棄容器(16)を上記の入口(２)に対面させたのち、回収装置(１)を前進させて注射針(12)を介して入口(２)を洗浄液廃棄容器(16)に連通させる。そして、ピストン体(４)を前進させて、貯留室(５)内の洗浄液をこの洗浄液廃棄容器(16)内に排出する。この洗浄液の吸入と排出は、例えば２回繰り返すが、この吸入と排出の際に洗浄液がフィルター(９)を通過し、フィルター(９)に付着している赤血球などが除去させる。 Next, after the recovery device (1) is retracted, the cleaning liquid container (14) faces the inlet (2) and the recovery device (1) is advanced. As a result, the inlet (2) communicates with the cleaning liquid container (14) via the injection needle (12), so that the piston body (4) is retracted and the cleaning liquid is sucked into the storage chamber (5). Next, the recovery device (1) is moved backward, the cleaning liquid disposal container (16) is made to face the inlet (2), and then the recovery device (1) is advanced to the inlet (12) through the injection needle (12). 2) is communicated with the cleaning liquid disposal container (16). Then, the piston body (4) is advanced to discharge the cleaning liquid in the storage chamber (5) into the cleaning liquid waste container (16). The suction and discharge of the cleaning liquid is repeated twice, for example, but the cleaning liquid passes through the filter (9) at the time of the suction and discharge and the red blood cells and the like adhering to the filter (9) are removed.
次に、上記の回収装置(１)を後退させたのち、溶解液収容容器(15)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させる。上記の入口(２)が、注射針(12)を介して溶解液収容容器(15)に連通するので、ピストン体(４)を後退させ、タンパク質溶解液をフィルター(９)に通過させて貯留室(５)内に吸入する。これにより、フィルター(９)に捕捉されている白血球の細胞膜が溶解し、そのタンパク質が溶解液中に溶出する。次いで、回収装置(１)を後退させたのち、タンパク質回収容器(17)を上記の入口(２)に対面させ、回収装置(１)を前進させてこの入口(２)をタンパク質回収容器(17)に連通させる。そして、ピストン体(４)を前進させて、上記のタンパク質が溶出した溶解液を、タンパク質回収容器(17)内に送り出す。その後、上記の回収装置(１)を後退したのち、上記のタンパク質回収容器(17)を容器収容部(19)から取り出し、次工程で冷凍保存し、或いは検査工程で白血球タンパク質を検査する。 Next, after the recovery device (1) is retracted, the solution storage container (15) faces the inlet (2), and the recovery device (1) is advanced. Since the inlet (2) communicates with the solution storage container (15) via the injection needle (12), the piston body (4) is retracted and the protein solution is passed through the filter (9) and stored. Inhale into chamber (5). Thereby, the cell membrane of leukocytes captured by the filter (9) is dissolved, and the protein is eluted in the lysate. Next, after the recovery device (1) is retracted, the protein recovery container (17) is made to face the inlet (2), the recovery device (1) is advanced, and the inlet (2) is moved to the protein recovery container (17). ). Then, the piston body (4) is advanced, and the solution from which the protein is eluted is sent out into the protein recovery container (17). After that, after the recovery device (1) is retracted, the protein recovery container (17) is taken out from the container housing part (19) and stored frozen in the next process, or the leukocyte protein is tested in the test process.
図９は本発明の第３実施形態を示す、白血球タンパク質の回収装置の概略構成図である。
この第３実施形態では、回収装置(１)がラブオンナチップ(Lab On a Chip)に形成されており、その表面に入口(２)が開口され、この入口(２)を横断する状態に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)が配置してある。上記の入口(２)は、ラブオンナチップ(21)内に形成された図示しない連通路に連通されており、このラブオンナチップ(21)に設けた圧力調整手段(４)により、この連通路内の圧力を減圧できるように構成してある。
FIG. 9 is a schematic configuration diagram of a leukocyte protein recovery apparatus according to the third embodiment of the present invention.
In the third embodiment, the recovery device (1) is formed on a Lab On a Chip, and an inlet (2) is opened on the surface thereof, and the inlet (2) is crossed. A filter (9) for passing red blood cells but capturing white blood cells is arranged. The inlet (2) communicates with a communication passage (not shown) formed in the lab-onner tip (21), and this communication passage is provided by pressure adjusting means (4) provided on the lab-onner tip (21). The internal pressure can be reduced.
上記の回収装置(１)を用いて血液等の試料液を検査する場合、上記の入口(２)から上記のフィルター(９)上に１滴若しくは数滴の試料液を滴下する。これにより試料液はフィルター(９)に吸着される。次いでこのフィルター(９)に洗浄液を滴下し、上記の圧力調整手段(４)を操作してこの洗浄液を吸引する。その後、上記のフィルター(９)にタンパク質溶解液を滴下して、フィルター(９)に捕捉されている白血球タンパク質をこの溶解液に溶出させ、上記の圧力調整手段(４)を操作してこの溶出液を吸入したのち、このラブオンチップ(21)上でタンパク質等を分析する。 When the sample liquid such as blood is examined using the recovery device (1), one or several drops of the sample liquid are dropped on the filter (9) from the inlet (2). As a result, the sample liquid is adsorbed to the filter (9). Next, a cleaning liquid is dropped on the filter (9), and the cleaning liquid is sucked by operating the pressure adjusting means (4). Thereafter, a protein lysate is dropped onto the filter (9) to elute leukocyte proteins captured by the filter (9) into the lysate, and the pressure adjusting means (4) is operated to perform the elution. After inhaling the liquid, proteins and the like are analyzed on the lab-on-chip (21).
上記のフィルター(９)は、１滴または数滴の試料液から白血球を捕捉できればよく、例えば直径１mm程度の広さがあれば十分であり、従って回収装置全体をきわめて小形に形成することができる。 The filter (9) only needs to be able to capture leukocytes from one or several drops of sample liquid. For example, the filter (9) is sufficient if it has a width of about 1 mm in diameter. Therefore, the entire collection device can be formed extremely small. .
上記の実施形態で説明白血球タンパク質の回収方法やこれに用いる回収装置は、本発明の技術的思想を具体化するために例示したものであり、各装置の形状や寸法、材質、構造、操作手順などをこの実施形態のものに限定するものではなく、本発明の特許請求の範囲内において種々の変更を加え得るものである。 The method for recovering leukocyte protein and the recovery device used therefor described in the above embodiment are exemplified for embodying the technical idea of the present invention, and the shape, dimensions, material, structure, and operation procedure of each device. Are not limited to those of this embodiment, and various modifications can be made within the scope of the claims of the present invention.
例えば、上記の第１実施形態や第２実施形態では、シリンジを利用して回収装置を構成したので、安価に実施できるが、本発明ではより適切な専用装置を製作するなどして他の形状に形成したものであってもよい。また上記の実施形態では、圧力調整手段をピストン体で構成したので、簡単な構成で連通路内の圧力を容易に調整できるが、本発明では、例えばエアーポンプなど、他の圧力調整手段を用いることも可能である。この場合、上記の駆動手段として、ポンプを駆動するモータなどが適用される。また上記の第１実施形態や第２実施形態では、注射針を介して上記の入口を試料液供給手段等に連通させたので、簡単な構成で容易に切換え接続できたが、本発明ではチューブや配管など、他の構成により切換え可能に連通させてもよい。さらに、本発明で使用する上記のフィルターの種類や枚数などは、上記の実施形態のものに限定されないことは言うまでもない。 For example, in the first embodiment and the second embodiment described above, since the collection device is configured using a syringe, it can be implemented at a low cost. However, in the present invention, other shapes such as a more appropriate dedicated device are manufactured. It may be formed. In the above embodiment, since the pressure adjusting means is constituted by a piston body, the pressure in the communication path can be easily adjusted with a simple configuration. However, in the present invention, other pressure adjusting means such as an air pump is used. It is also possible. In this case, a motor for driving a pump or the like is applied as the driving means. In the first embodiment and the second embodiment, the inlet is communicated with the sample solution supply means via the injection needle, so that the switching connection can be easily made with a simple configuration. It is also possible to communicate in a switchable manner by other configurations such as pipes and pipes. Furthermore, it goes without saying that the type and number of the filters used in the present invention are not limited to those of the above embodiment.
本発明方法及び装置は、臨床検査や実験室において、血球を含む試料から白血球を分離するのに好適に使用できる。 The method and apparatus of the present invention can be suitably used to separate leukocytes from a sample containing blood cells in clinical examinations and laboratories.
１…白血球タンパク質の回収装置
２…入口
３…連通路
４…圧力調整手段(ピストン体)
５…貯留室
６…針装着部
７…筒体
９…フィルター
10…フィルター保持部材
13…試料液供給手段(試料液収容容器)
14…洗浄液供給手段(洗浄液収容容器)
15…溶解液供給手段(溶解液収容容器)
16…廃液部(廃液容器、洗浄液廃棄容器)
17…タンパク質回収容器
18…駆動手段(駆動装置)
21…ラブオンナチップ(Lab On a Chip)
S1…捕捉工程
S2…洗浄工程
S3…溶出工程
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Leukocyte protein collection apparatus 2 ... Inlet 3 ... Communication path 4 ... Pressure adjustment means (piston body)
5 ... Reservoir 6 ... Needle mounting part 7 ... Tube 9 ... Filter
10… Filter holding member
13 ... Sample solution supply means (sample solution container)
14 ... Cleaning liquid supply means (cleaning liquid container)
15 ... Solution supply means (solution storage container)
16… Waste liquid part (waste liquid container, cleaning liquid waste container)
17 ... Protein recovery container
18 ... Drive means (drive device)
21 ... Lab On a Chip
S1 ... Capture process
S2 ... Cleaning process
S3 ... Elution process
Claims (14)
試料液を受け入れる入口(２)と、この入口(２)に連通している連通路(３)と、この連通路(３)内の圧力を調整する圧力調整手段(４)とを備え、
上記の入口(２)と圧力調整手段(４)との間に、赤血球は通過させるが白血球は捕捉するフィルター(９)を、上記の連通路(３)が遮断される状態に配置してあり、
上記の入口(２)は、試料液供給手段(13)と洗浄液供給手段(14)と溶解液供給手段(15)とに、選択的に切換え接続可能であることを特徴とする、白血球タンパク質の回収装置。 A collection device for collecting leukocyte proteins from a sample solution containing blood cells,
An inlet (2) for receiving the sample liquid, a communication path (3) communicating with the inlet (2), and a pressure adjusting means (4) for adjusting the pressure in the communication path (3);
Between the inlet (2) and the pressure adjusting means (4), a filter (9) that allows red blood cells to pass but captures white blood cells is arranged in a state where the communication path (3) is blocked. ,
The inlet (2) can be selectively switched and connected to the sample solution supply means (13), the washing solution supply means (14), and the lysis solution supply means (15). Recovery device.
Priority Applications (1)
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2020203510A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ | Apparatus for driving combination of microcircuit and syringe |
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2009
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