JP2008518603A - 幹細胞由来の血小板 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本出願は、2004年11月1日に出願された米国特許仮出願第60/623,922号及び2005年9月7日に出願された第60/714,578号の優先権を請求するものである。
今後決定。
幹細胞は、多くの他の分化細胞型への分化が可能である細胞として定義される。胚性幹細胞は、成熟した体の分化細胞型の全てではない大半へ分化することが可能である胚由来の幹細胞である。幹細胞は、多能性と称され、これはこれらの細胞の多くの細胞型へ分化する能力を説明している。学会(research community)にとって関心が高い多能性幹細胞の型は、時にはhES又はヒトES細胞と略されるヒト胚性幹細胞であり、これはヒト胚給源に由来する胚性幹細胞である。ヒト胚性幹細胞は、培養物において無限の増殖が可能であり、加えて他の細胞型へ分化すること、従って少なくとも原理上は、衰えた又は欠損されたヒト組織の代替のための細胞及び組織を供給することが可能であるので、これらの細胞には、大きい科学及び研究上の関心がある。培養物中のヒト胚性幹細胞の存在は、科学的研究及びヒトの健康を補助するための様々な治療プロトコールにおける使用のために、無限の量の遺伝的に安定したヒトの細胞及び組織の可能性をもたらす。将来は、治療目的で人体へ移植又は輸注することができる分化した細胞又は組織を開発するために、ヒト胚性幹細胞は、増殖され、及び特定の系譜へ分化するように指示されることが思い描かれている。
本発明は、ヒト血小板の生成法としてまとめられており、これは、ヒト胚性幹細胞の造血系(hematopoietic lineage)への分化に有利な(favor)条件下での、これらの細胞を培養する工程;造血系の細胞を巨核球へ培養する工程;巨核球を培養し、血小板を生成する工程;並びに、血小板を回収する工程を含む。
In vitroにおいて生成された血小板は、ヒト血流において遭遇する因子と結合しないことは、本発明の特徴である。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の明細書から明らかになるであろう。
本願明細書において企図されるものは、ヒト胚性幹細胞から始まるin vitro培養及び分化のプロセスによる血小板生成である。ヒト胚性幹細胞(hES細胞)は、in vitro培養物中に巨核球を生成するように誘導され、これらの巨核球は、生物学的に機能するヒト血小板を生成するように培養される。このプロセスは、3種の主要工程プロセスにより実行されると考えることができる。第一の主要工程は、ヒトES細胞の造血細胞への有向の分化であり、この分化プロセスは順にいくつかの方法で行うことができる。hES細胞の造血系への分化のふたつの方法は、本願明細書において詳細に説明されている。造血分化プロセスに関するひとつの技術において、既知の技術を用い、ヒト胚性幹細胞(ES細胞)は培養され、胚様体(EB)を形成する。胚様体は培養され、様々な分化細胞型の分化が始まり、その後胚様体は、巨核球前駆体の培地選択中において、細胞浮遊液へ脱凝集される。本発明者らは、経時的cDNAマイクロアレイ分析の助けにより、最高の造血能を有する最終的な造血細胞を収集するのに最も適切な時間を確定した。既に造血細胞の作出に関して十分明らかにされている別の技術は、ヒトES細胞のストロマ細胞(stromal cell)への曝露を必要とし、この曝露は、ES細胞の造血系の細胞への優先的な分化を引き起こす。これらのいずれかのプロセスの結果は、ある程度の純度で、主にES細胞由来の造血細胞である、細胞培養物である。本発明者らは、単に異なる種のフィーダー細胞の夾雑がないという理由だけでなく、限定された血清非含有培地で行うことができるという理由でも、胚様体法を特に好んでいる。このプロセスの第二の主要部分は、これらの造血細胞は次に、特に巨核球の形成を促進(encourage)しかつこれらの細胞の成熟を促進する増殖因子を含有する選択的巨核球形成培地に曝される。最後にこれらの成熟巨核球は、血小板形成培地に曝され、in vitroにおける血小板生成を促進する。これらの全てのプロセスにおいて、動物又はヒトの血清及び血漿は、回避することができる。
胚様体由来の造血前駆体
胚様体(EB)形成は、マウス及びヒトの両方のES細胞の造血系分化を研究するために使用される方法である。しかしマウスES細胞とは異なり、単独細胞の浮遊液中においてヒトES細胞で、胚様体を効率的に形成することは失敗している。代わりに、ヒトES細胞からの胚様体を形成するために、マウス胚性線維芽細胞(MEF)上で培養されたヒトES細胞の無傷のコロニーを、0.5mg/mlジスパーゼにより5分間消化し、小型の細胞クラスターを形成した。次にこれらの細胞クラスターは、血清-含有幹細胞培養培地(20%FCS)において更に凝集させた。容易に識別可能な細胞塊である胚様体は、細胞塊への参加に失敗しアポトーシスを受けた単独細胞の50%により培養の6日後形成され始めた。培養の12日後の胚様体は、卵黄嚢の初期胚構造に類似していた。胚様体の切片を採取し、その後この切片をCD34抗体で引き続き免疫-標識すると、卵黄嚢の組織学的特徴が明らかになった。細胞がCD34陽性であることにより明らかになるように、非-接着性造血前駆細胞は、小血管(small vessel)の管腔及び内皮層に存在することが認められた。その後胚様体を、37℃でのトリプシン消化(0.05%トリプシン/0.53mM EDTA)により処理した。約105個の胚様体-由来の細胞を含む初代造血前駆細胞を、メチルセルロース培養物(Stem Cells Inc. カナダ)中に播種し、10〜12日間培養した。赤血球及び巨核球コロニー形成単位(CFU)がその後、それらの本来の赤色又はモノクローナル抗-CD41もしくはCD61抗体による免疫標識により検出された。マクロファージ及び顆粒球コロニーを生じることができる最終的な造血前駆細胞は、12日目に形成された。この活性は、第一次(primary)及び最終的な造血の最初の波を示している。本発明者らは現在、動物及びヒトの両血清を含まない血清非含有胚様体培養システムを確立している。
胚様体形成及び培養の12日後、単独細胞の浮遊培養物を、得られた細胞培養物の37℃での30分間のコラーゲナーゼ(1mg/ml)及び5分間のトリプシン消化(0.05%トリプシン/0.53mM EDTA)により作出した。CD34+細胞は造血と干渉し得るので、CD34+を他のEB細胞から分離した。CD34+細胞を、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、及び幹細胞因子(SCF)の存在下、ポリ-HEME表面上で培養し、これらの全ての因子は、巨核球の分化及び増殖を特異的に促進するように選択した。106個の出発ES細胞につき106個のCD41+巨核球の収量が得られた(n=6)。興味深いことに、コラーゲン-ベースの半固形マトリックスに播種した場合は、これらの巨核球は、ビーズ-様構造を示すプロ血小板を伴う極めて長い突起を形成した。成人造血幹細胞又はマウスES細胞を使用し巨核球の生成を試みる場合には、このような長い構造はこれまで報告されていない。小さいCD41陽性細胞断片は、放出された血小板として同定されたが、これらは、巨核球近傍に存在することが検出された。本発明者らは、フローサイトメトリーにより、これらの巨核球は、CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱い)及びCD62Pについて陽性であるが、CD34、CD117、及びHLA-DRについて陰性であることを発見した。この表現型プロファイルは、正常なヒト成熟巨核球と一致する。
OP9ストロマ細胞株は、マウス造血を支援するために使用されている、新生仔頭蓋冠op/op欠損マウスから確立された細胞株である。このop/opマウスは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)遺伝子のコード領域に変異を有する。OP9システムを使用するヒトES細胞の造血系への分化の結果は、胚様体形成によるヒトES細胞の分化法に類似しているが、このストロマ細胞法は通常より多くの成熟前駆細胞のより高収量をもたらす。簡単に述べると、ヒトES細胞を、集密なOP9ストロマ細胞上に播種し、その後20%ウシ胎仔血清(FBS)を補充したα-MEM培地で培養した。分化は、6-ウェルプレート上105個ES細胞/ウェル、又は10cm2培養皿中8x105個細胞で開始した。6日間培養後、細胞上のCD34+細胞表面マーカーの出現により示されたように、ES細胞は造血前駆体に分化した。巨核球への分化のために、これらの細胞を6日目にトリプシン(0.05%トリプシン/0.53mnM EDTA、37℃/5%CO2)で5分間処理し、並びに10ng/ml TPOを含有する同じ培養培地において、新鮮な集密なOP9細胞上で継代した。更に8日間培養した後、巨核球は、目視検査により認められるようになり始めた。CD41免疫-染色により確認されるように、培養物の上清中の細胞の約30%は巨核球であった。これらの巨核球は多核であるが、胚様体-由来の巨核球において認められたような著しく長い突起を有さなかった。これらの巨核球は、成体巨核球に極めて類似している最終的な巨核球であると考えられた。興味深いことに、培養時に、血小板形成の徴候は存在せず、このことはマウスシステムとは極めて異なった。恐らく、OP9細胞は、巨核球の分化及び増殖を促進及び支援することはできるが、血小板形成を支援することはできないであろう。このことは、例え巨核球の分化及び増殖の機序の一部が類似していたとしても、マウス及びヒトの血小板形成の機序が異なることの、別の証拠である。
前述の方法のいずれかに由来した巨核球前駆体は、成体レシピエントマウスにおける増殖の、更には生着(engraft)の能力を明らかにしている。このプロセスの次工程として、本発明者らは、未熟な巨核球を更に増殖し、同時に巨核球成熟を停止するために、bFGFを使用した。各巨核球は2000個の血小板を形成することができると概算すると、106個ヒトES細胞(1個の6-ウェルプレート)は、106個の巨核球を生成し、引き続き約2x109個の血小板を生成し、これは血小板の約1/20単位を示している(>5.5x1010個血小板/単位)。従ってこの概算された効率で、ヒト血小板1単位を生成するためには、ヒトES細胞の20 T75フラスコ(flasks)が必要であろう。これは、この収量で経済的に魅力的であることもあるが、すでに明らかに独りの技術者が支援することができる範囲である。
胚様体システムは、これらの細胞の大半は卵黄嚢細胞であるという事実のために、造血幹細胞を作製する望ましい効率よりも低い効率を有する。しかし胚様体システムはマウスタンパク質の夾雑を有さないので、このシステムは、OP9共培養システムよりも優れている。本発明者らのデータから、本発明者らは、造血系分化は、ストロマ細胞との共培養システムとは対称的に、EBシステムにおいてより最良に実現されると考えている。より最終的な造血細胞を入手しより効率的プロセスを作製するために、本発明者らは、EB培養を延長することを計画している。本発明者らは、微小環境が血島分化を支援し続けることを期待して、EBをより小さい断片へ機械的に解離又は断片化し、培養を継続することを試みた。本発明者らの予備的知見は、解離されたEBは、生存することができ、この解離後に成長し続けることを示唆している。このことは、EBシステムにおける更なる分化を推進する最初の試みであろう。例え最終的な血島が形成されなかったとしても、血島数の著しい増加が実現され得る。EB培養物へのVEGF及びSCFのような増殖因子の添加も試験されるであろう。
本発明者らは、コラーゲンマトリックス、OP9及びポリHEMEを含む複数のシステムにおける血小板形成を既に認めているが、本発明者らは、そのプロセスを最適化することができるように、血小板放出の機序をより良く理解することを欲している。血小板形成を実現するために、本発明者らは、TPO、ヒト血漿、ヒト低温沈殿物及び一酸化窒素の存在下で、103〜104個の成熟巨核球を培養する。これらの血小板は、抗-CD41抗体で標識し、フローサイトメトリーで計数する。これらの血小板の形状は、電子顕微鏡を含む顕微鏡で観察する。真の血小板は、突起又は他の血小板との付着(attachment)を伴わない円盤状であるはずである。比較的大きいか又は連結した血小板は、プロ血小板形成のみを支援する、最適でない条件を示唆している。フィブリノーゲン及びフィブロネクチンのような細胞外マトリックスは、巨核球分化及び成熟を促進することが示されている。本発明者らは、巨核球の増殖及び分化に対するそれらの作用を決定するために、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンでコートされたプレートを使用し、巨核球を培養する。
血小板は、トロンビン、ADP、及びコラーゲンに反応して凝集する。In vitro生成された血小板の異なる刺激に反応する凝集能を、血小板凝集計(Chrono-log Corporation, www.chronolog.com)により測定する。血小板は、上清から収集し、計測する。106個/mlの血小板を、PBSで洗浄し、ヒト血漿中に再浮遊する。様々な濃度のトロンビン、ADP及びコラーゲンを添加し、凝集速度論を、未変性のヒト血小板と比較する。本発明者らは、生成された「血小板」を試験し、成熟巨核球は、α顆粒放出の間接的マーカーであるCD62Pの表面発現により、0.5U/mlトロンビンにより活性化することができる。本発明者らは、以下の方法による血小板機能の試験の過程にある:
Claims (9)
- ヒト血小板の製造法であって、
(a)ヒト胚性幹細胞を、該細胞の造血系への分化に有利な条件下で培養する工程;
(b)造血系の細胞を巨核球へと培養する工程;
(c)巨核球を培養し、血小板を作出する工程;及び
(d)巨核球から血小板を回収する工程;
を含む製造法。 - 工程(a)が、胚様体の形成を促進し、その後胚様体から造血細胞を選択的に回収することにより実行される、請求項1記載の方法。
- 工程(a)が、ヒト胚性幹細胞とストロマ細胞との共培養により実行される、請求項1記載の方法。
- 工程(b)が、工程(a)からの細胞を、トロンボポエチン、インターロイキン3、インターロイキン6、インターロイキン11及び幹細胞因子を含有する培地で培養することにより実行される、請求項1記載の方法。
- 巨核球が、CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱い)及びCD62Pについては陽性であるが、CD34、CD117、及びHLA-DRについては陰性である、請求項1記載の方法。
- 請求項1記載の方法により作出された、ヒト血小板。
- 血小板が、免疫グロブリン分子を含まない、請求項8記載のヒト血小板。
- in vitro培養物中で生成されたヒト血小板であって、凝固を開始するための生物学的活性があり、かつ、血液抗原、白血球及び血清構成成分を実質的に含まない、血小板。
- ヒト血小板アリコートであって、機能性ヒト血小板を含有し、該機能性ヒト血小板には免疫グロブリンが付着されない、アリコート。
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