JP2006330685A

JP2006330685A - 多光子励起走査型レーザ顕微鏡

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Publication number: JP2006330685A
Application number: JP2006046768A
Authority: JP
Inventors: Hiroichi Kubo; 博一久保
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2026-02-23
Also published as: JP4869734B2; US20060237666A1; US7329880B2

Abstract

【課題】複数波長の超短パルスレーザ光を標本に照射して、複数波長の多光子蛍光を観察することができる、小型で、しかも、コストの低い多光子励起走査型レーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】単一波長の超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源５と、該レーザ光源５からの超短パルスレーザ光Ｌ１を入射させ、超短パルスレーザ光Ｌ１のスペクトルを拡散させる光ファイバ８と、該光ファイバ８から出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光Ｌ２を走査するレーザ走査部１２と、走査された超短パルスレーザ光Ｌ２を標本Ａに集光させる対物光学系１５と、標本Ａにおける超短パルスレーザ光Ｌ２の集光位置から発せられた多光子蛍光Ｆを検出する光検出器１８と、超短パルスレーザ光に対する群速度分散を補償する分散補償光学系３１とを備える多光子励起走査型レーザ顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

この発明は、多光子励起走査型レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、生体等の標本にその表面から超短パルスレーザ光を照射して、標本の表面下の比較的深い位置から発せられる多光子蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型測定装置において、波長の異なる複数の超短パルスレーザ光を照射して、異なる多光子蛍光を観察する場合には、レーザ光源として、複数の波長の超短パルスレーザ光を出射可能なものを採用、または、単一波長の超短パルスレーザ光源を複数台使用する必要があった。

一方、共焦点走査型蛍光顕微鏡において、フェムト秒オーダーの超短パルスレーザ光を、フォトニックバンドギャップ材のような微細構造光学要素に入射させることによってスペクトル拡散させ、広い波長帯域を有するレーザ光を出射させるとともに、音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）やプリズム、あるいはグレーティングを用いて波長範囲を選択する装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
特開２００２−２４３６４１号公報特開２００２−０９８８９６号公報

しかしながら、特許文献１の多光子励起型測定装置においては、複数波長の超短パルスレーザ光を出射可能なレーザ光源が大型のものとなり、装置全体が大型化するとともに、コストが高くなるという問題がある。
また、特許文献２は、共焦点走査型蛍光顕微鏡に関する技術が開示されているのみであり、これを多光子励起型蛍光顕微鏡に適用することについては何ら開示されていない。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、複数波長の超短パルスレーザ光を標本に照射して、複数波長の多光子蛍光を観察することができる、小型で、しかも、コストの低い多光子励起走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、単一波長の超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を入射させ、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、該光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光を走査するレーザ走査部と、該レーザ走査部により走査された超短パルスレーザ光を標本に集光させる対物光学系と、標本における超短パルスレーザ光の集光位置から発せられた多光子蛍光を検出する光検出器と、群速度分散を補償する分散補償光学系とを備える多光子励起走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられた単一波長の超短パルスレーザ光が、光ファイバ内に入射されると、該光ファイバ内を伝播する間にスペクトル拡散され、広い波長帯域を有する超短パルスレーザ光として出射される。光ファイバから出射された超短パルスレーザ光は、レーザ走査部によって走査され対物光学系によって標本に集光される。また、分散補償光学系の作動により、顕微鏡全体の分散によるパルス幅の太りが補正される。これにより、標本における集光位置においては、効率的な多光子励起効果により多光子蛍光が発生するので、これを光検出器により検出することで、標本の深さ方向の所定の位置における内部状態を多光子蛍光画像として観察することが可能となる。

この場合において、光ファイバから発せられた広い波長帯域の超短パルスレーザ光を波長選択することなく標本に入射させることで、複数の蛍光物質を同時に励起して、異なる波長の複数の多光子蛍光を同時に発生させることができる。また、広い波長帯域の超短パルスレーザ光から所定の波長帯域の超短パルスレーザ光を切り出すことにより、所望の波長の多光子蛍光を発生させることもできる。

上記発明においては、前記光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光の波長を選択する波長選択光学系を備えることが好ましい。
このように構成することで、波長選択光学系の作動により、所定の波長の超短パルスレーザ光を標本に照射することができる。特に波長選択光学系による波長選択を可変にしておくことにより、標本内の蛍光物質に合わせて、適切な波長の超短パルスレーザ光を標本に入射させることが可能となる。

また、上記発明においては、前記波長選択光学系により波長選択された超短パルスレーザ光の中心波長を検出する波形検出部と、前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記分散補償光学系の分散補償量を調節する調節装置とを備えることが好ましい。
このように構成することで、波長選択光学系により波長選択された結果得られた超短パルスレーザ光の中心波長に応じて、調節装置の作動により、分散補償光学系の分散補償量が調節され、波長毎に異なる顕微鏡全体の分散によるパルス幅の太りが補正され、標本において効率的に多光子励起効果を発生させることができる。

また、本発明は、単一波長の超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を入射させ、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、前記光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光から所定波長の超短パルスレーザ光を選択的に分離する波長選択光学系と、該波長選択光学系により所定波長の超短パルスレーザ光が分離された残りの超短パルスレーザ光を走査するレーザ走査部と、該レーザ走査部により走査された残りの超短パルスレーザ光に、前記所定波長の超短パルスレーザ光を合波させる合波部材と、該合波部材により合波された超短パルスレーザ光を標本に集光させる対物光学系と、標本における超短パルスレーザ光の集光位置から発せられた多光子蛍光を検出する光検出器とを備える多光子励起走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられた単一波長の超短パルスレーザ光が、光ファイバ内に入射されると、該光ファイバ内を伝播する間にスペクトル拡散され、広い波長帯域を有する超短パルスレーザ光として出射される。スペクトル拡散された超短パルスレーザ光は、波長選択光学系を通過させられることにより、所定波長の超短パルスレーザ光が選択的に分離される。該所定波長の超短パルスレーザ光が分離された残りの超短パルスレーザ光はレーザ走査部により走査され、対物光学系によって標本に集光される。これにより、標本における集光位置においては、多光子励起効果により多光子蛍光が発生するので、これを光検出器により検出することで、標本の深さ方向の所定の位置における内部状態を多光子蛍光画像として観察することが可能となる。

また、波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光は、合波部材により、走査後の残りの超短パルスレーザ光に合波されるので、標本の特定位置に照射される。これにより、標本の特定位置に所定波長の超短パルスレーザ光による多光子励起刺激を与えながら、標本の状態を多光子蛍光画像として観察することができる。

上記発明においては、前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光の中心波長を検出する波形検出部と、前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記波長選択光学系により分離する超短パルスレーザ光の波長を調節する波長調節装置とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、波形検出部により検出された中心波長に基づいて、波長調節装置が分離する超短パルスレーザ光の波長を調節するので、精度よく選択された所定波長の超短パルスレーザ光を用いて高い精度の多光子励起刺激を行うことができる。

また、上記発明においては、前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光に対する群速度分散を補償する分散補償光学系と、前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記分散補償光学系の分散補償量を調節する分散補償量調節装置とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光に対する顕微鏡全体の群速度分散が、波形検出部により検出された中心波長に基づいて分散補償光学系により補償される。これにより、波長毎に異なる顕微鏡全体の分散によるパルス幅の太りが補正され、精度の高い多光子励起刺激を行うことができる。

また、上記発明においては、前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光を走査する第２のレーザ走査部を備えることとしてもよい。
また、前記レーザ光源と、前記光ファイバとの間に、該光ファイバに入射する前記超短パルスレーザ光の尖頭出力を調整する尖頭出力調整光学系を備えることとしてもよい。

本発明によれば、複数波長の超短パルスレーザ光を標本に照射して、複数波長の多光子蛍光を観察することができる多光子励起走査型レーザ顕微鏡を、小型で、しかも、低いコストで提供することができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、照明装置２と、顕微鏡本体３と、画像表示装置４とを備えている。

本実施形態に係る照明装置２は、図１に示されるように、フェムト秒オーダーの超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源５と、該レーザ光源５から発せられた超短パルスレーザ光Ｌ１の光軸の位置および角度を調節するアライメント調整光学系６と、アライメント調整された超短パルスレーザ光Ｌ１を集光させるカップリング光学系７と、該カップリング光学系７による集光位置に一端を配置したフォトニックバンドギャップ材からなる光ファイバ８と、光ファイバ８から出射される超短パルスレーザ光Ｌ２を略平行光に変換するコリメート光学系９と、略平行光にされたレーザ光Ｌ２の光束径およびビームダイバージェンスを調節するビーム整形光学系１０とを備えている。また、ビーム整形光学系１０の前段には、超短パルスレーザ光Ｌ２の群速度分散を補償する分散補償光学系３１が備えられている。
レーザ光源５は、例えば、波長８００ｎｍの超短パルスレーザ光Ｌ１を出射するようになっている。

前記アライメント調整光学系６は、例えば、光軸に対して垂直な２軸の傾き角を調節できる２枚の反射ミラーおよびビーム位置検出光学系により構成されている、これにより、アライメント調整光学系６は、レーザ光源５から出射された超短パルスレーザ光Ｌ１の光束の中心位置を光ファイバ８の入射光軸に一致させるように調節できる。

前記光ファイバ８は、例えば、フォトニッククリスタルファイバあるいはテーパファイバにより構成されている。これにより、光ファイバ８は、一端から入射される波長８００ｎｍの超短パルスレーザ光Ｌ１を伝播させる間にスペクトル拡散させて、略３００〜１６００ｎｍの波長帯域を有する白色の超短パルスレーザ光Ｌ２を他端から出射させるようになっている。

前記ビーム整形光学系１０は、例えば、両凸レンズと平凹レンズとを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。これにより、顕微鏡本体に入射される超短パルスレーザ光Ｌ２が、後述する対物レンズ１５の入射瞳位置において、その瞳径と略同等の光束径を有するように、その光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。

前記顕微鏡本体３は、筐体１１内に、照明装置２から出射されてきた略平行光からなる白色の超短パルスレーザ光Ｌ２を２次元的に走査するスキャナ１２と、走査された超短パルスレーザ光Ｌ２を集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ１３と、中間像を結像した超短パルスレーザ光を集光する結像レンズ１４と、結像レンズ１４から発せられた超短パルスレーザ光Ｌ２を集光して標本Ａに再結像させる対物レンズ１５と、標本Ａにおいて発生し、対物レンズ１５により集められた多光子蛍光Ｆを超短パルスレーザ光Ｌ２から分岐するダイクロイックミラー１６と、分岐された多光子蛍光の波長を選択する波長選択素子（波長選択光学系）５０と、集光レンズ１７と、多光子蛍光Ｆを撮像する光検出器１８とを備えている。

スキャナ１２は、例えば、互いに直交する２本の軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー（図示略）を近接配置してなる、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
前記光検出器１８は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）であり、複数、例えば２つ設けられている。波長選択光学系５０は、例えば、ダイクロイックミラー、グレーティングおよびスリット、あるいはこれらの組合せにより構成されている。例えば、標本を異なる蛍光色素で染め、そして、異なる波長域で蛍光を生じさせている場合には、これらを波長選択素子５０で分離して、異なる蛍光色素からの異なる波長の蛍光を独立して検出することができる。
前記画像表示装置４は、光検出器１８により検出された標本Ａからの多光子蛍光Ｆに基づいて構成された多光子蛍光画像を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１の作用について、以下に説明する。
レーザ光源５から出射された超短パルスレーザ光Ｌ１は、アライメント調整光学系６によってその光軸位置および角度を調節された後に、カップリング光学系７により集光されて光ファイバ８に入射させられる。

光ファイバ８に入射された超短パルスレーザ光Ｌ１は、フォトニックバンドギャップ材からなる光ファイバ８の非線形効果によってスペクトル拡散させられて、波長３００〜１６００ｎｍの広い波長帯域を有する白色の超短パルスレーザ光Ｌ２として光ファイバ８の他端から出射される。そして、出射された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２は、コリメート光学系９によって略平行光にされた後にビーム整形光学系１０によって、その光束径およびビームダイバージェンスを調節された状態で、顕微鏡本体３に向けて出射される。

そして、顕微鏡本体３に入射された超短パルスレーザ光Ｌ２は、スキャナ１２により２次元的に走査されつつ、瞳投影レンズ１３，結像レンズ１４、蛍光の波長域をカットするダイクロイックミラー１６および対物レンズ１５を介して標本Ａの所定の深さ位置に集光され、その位置において多光子励起効果を発生させる。
また、超短パルスレーザ光Ｌ２は、アライメント調整光学系６によりその光軸位置および角度を調節され、かつ、ビーム整形光学系１０によりその光束径およびビームダイバージェンスを調節されているので、標本Ａの所定の深さ位置に高い精度で集光される。したがって、明るくかつ空間分解能の高い多光子蛍光画像を取得することができる。

さらに、超短パルスレーザ光Ｌ２は、分散補償光学系３１の作動により、系全体の群速度分散が補償される。これにより、パルス幅の太りが補正され、標本Ａにおける集光位置において、効率的な多光子励起効果を発生させることができる。

本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１によれば、白色の超短パルスレーザ光Ｌ２を標本Ａに集光するので、標本Ａに複数の蛍光物質を含有させておけば、白色の超短パルスレーザ光Ｌ２に含まれる複数の波長帯域の超短パルスレーザ光によって、複数の波長の多光子蛍光Ｆを同時に発生させることができる。
そして、本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１によれば、このような効果を単一の波長（８００ｎｍ）の超短パルスレーザ光Ｌ１のみを出射可能な小型のレーザ光源５により達成できる。したがって、大型かつ高価な波長可変のレーザ光源を使用する必要がなく、多光子励起走査型レーザ顕微鏡１の小型化およびコストの低減を図ることができるという効果がある。

なお、本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１においては、光ファイバ８から出射された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２をそのままビーム整形光学系１０によりビーム整形して顕微鏡本体３に入射させることとしたが、これに代えて、図２に示されるように、顕微鏡本体３に入射させる超短パルスレーザ光Ｌ２の波長域を制限するカラーフィルタあるいはバンドパスフィルタ１９を配置してもよい。このように構成することで、不要光を含まない超短パルスレーザ光Ｌ２を顕微鏡本体３に入射させることができ、ノイズを低減して分解能の高い多光子蛍光画像を取得することが可能となる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０は、コリメート光学系９とビーム整形光学系１０との間に、コリメート光学系９から出射された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２の波長域とスペクトルの幅とを調節する波長選択光学系２１と、超短パルスレーザ光Ｌ２の強度を調節する強度調整光学系２２とを備えている。

波長選択光学系２１としては、例えば、音響光学素子（ＡＯＴＦ，ＡＯＭ，ＡＯＢＳ）、電気光学素子（ＥＯＭ）、フィルタ（カラーフィルタ、バンドパスフィルタ、バイパスフィルタ）、グレーティングとスリット、プリズムとスリット、エタロンとスリットまたは軸上収差の大きい色消しレンズとピンホールが挙げられる。
強度調整光学系２２としては、音響光学素子（ＡＯＴＦ，ＡＯＭ，ＡＯＢＳ）、電気光学素子（ＥＯＭ）、偏光板、可変ＮＤフィルタ、可変絞り等が挙げられる。

また、ビーム整形光学系１０と顕微鏡本体３との間にビーム整形光学系１０を通過した超短パルスレーザ光Ｌ２の一部を分岐するビームサンプラー２３と、分岐された超短パルスレーザ光Ｌ２の中心波長およびスペクトル波形を検出する分光器２４と、検出された超短パルスレーザ光Ｌ２の中心波長およびスペクトル波形の幅、強度に基づいて前記波長選択光学系２１および強度調整光学系２２を制御する制御装置２５とを備えている。

本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０によれば、制御装置２５において、標本Ａに照射する超短パルスレーザ光Ｌ３の中心波長、スペクトル幅および強度を設定することにより、波長選択光学系２１の作動により白色の超短パルスレーザ光Ｌ２から切り出す超短パルスレーザ光Ｌ３の中心波長およびスペクトル幅が設定され、また、強度調整光学系２２の作動により、切り出された超短パルスレーザ光Ｌ３の強度が設定される。

また、本実施形態によれば、ビーム整形光学系１０から出射された超短パルスレーザ光Ｌ３が分光器により分光され、得られた中心波長およびスペクトル波形が制御装置２５に送られる。したがって、制御装置２５は、ビーム整形光学系１０からの超短パルスレーザ光Ｌ３の中心波長およびスペクトル波形の幅、強度を、波長選択光学系２１および強度調整光学系２２にフィードバックして、所望の中心波長、スペクトル幅および強度を有する超短パルスレーザ光Ｌ３を顕微鏡本体３に入力させることができる。

なお、本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０においては、コリメート光学系９とビーム整形光学系１０との間に波長選択光学系２１および強度調整光学系２２を設け、光ファイバ８を通過してスペクトル拡散された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２の中心波長、スペクトル幅および強度を調節することとしたが、これに代えて、図４に示されるように、光ファイバ８への入射前に出力調節光学系２６を設け、光ファイバ８へ入射する超短パルスレーザ光Ｌ１の尖頭出力を調節することで、超短パルスレーザ光Ｌ２の中心波長、スペクトル幅および強度を調整をすることとしてもよい。

これは、光ファイバ８において発生する非線形効果の強さが超短パルスレーザ光の尖頭出力（ピーク強度）に応じて変化することを利用するものである。尖頭出力の調整には超短パルスレーザ光の強度（エネルギ）を減少させる方法と、強度（エネルギ）を変えずにパルス幅を変化させる方法がある。強度（エネルギ）を低下させるには、前述の強度調整光学系と同じもの（例えば、音響光学素子、可変ＮＤフィルタ等）を使用できる。

エネルギを保持してパルス幅を変化させるには、出力調節光学系２６として、例えば、プリズム対、グレーティング対または分散素子２７からなるパルス幅調整光学系を配置して、超短パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅を制御することで、超短パルスレーザ光Ｌ２の中心波長、スペクトル幅および強度を調整する。分散素子２７としては、例えば、図５に示されるように、一対の三角プリズム２８と台形プリズム２９とを並べて配置し、台形プリズム２９を光軸に交差する方向に移動させる方式のものが挙げられる。

次に、本発明の第３の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡３０について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡３０は、波長選択光学系２１の後段に、波長選択光学系２１によって切り出された所定の中心波長およびスペクトル幅を有する超短パルスレーザ光Ｌ３に対する群速度分散を補償する分散補償光学系３１を備えている。
分散補償光学系３１は、プリズム対またはグレーティング対からなり、プリズム間隔あるいはグレーティング間隔を調節することで、分散補償量を調節することができるようになっている。

本実施形態においては、制御装置２５が分散補償光学系３１にも接続され、ビーム整形光学系１０から出射された超短パルスレーザ光Ｌ３の中心波長を元に、予め図示しない記憶装置内に記録された顕微鏡全体の分散を補償するための波長毎のプリズム間隔あるいはグレーティング間隔になるように、分散補償光学系３１を調節するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡３０によれば、分散補償光学系３１の作動により、波長毎の群速度分散を補償して、標本Ａに到達する時点の超短パルスレーザ光Ｌ３のパルス波形を最適にすることができるようになっている。また、波長選択光学系２１により選択される超短パルスレーザ光Ｌ３の波長が変更されても、分光器により検出した超短パルスレーザ光Ｌ３の中心波長に基づいて、制御装置が分散補償光学系３１を制御するので、超短パルスレーザ光Ｌ３のパルス波形が標本Ａへの到達時にも最適になっており、標本Ａにおいて多光子励起効果を効率的に発生させ、多光子励起画像の分解能を向上することができる。

次に、本発明の第４の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡４０について、図７および図８を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡２０と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡４０は、コリメート光学系９から出射された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２から所定波長の超短パルスレーザ光Ｌ４と残りの超短パルスレーザ光Ｌ３とに分離する波長選択光学系２１′と、分離された所定波長の超短パルスレーザ光Ｌ４の位置を調節する第２のスキャナ（第２のレーザ走査部）４１と、該第２のスキャナ４１により位置調節された超短パルスレーザ光Ｌ４を集光する瞳投影レンズ４２と、該瞳投影レンズ４２により集光された超短パルスレーザ光Ｌ４を、スキャナ１２により走査された残りの超短パルスレーザ光Ｌ３に合波させるダイクロイックミラー（合波部材）４３とを備えている。

本実施形態においては、分光器２４は、所定波長の超短パルスレーザ光Ｌ４を切り出されることにより、図８に示されるようなスペクトル波形を有する超短パルスレーザ光Ｌ３に基づいて、超短パルスレーザ光Ｌ４の中心波長を検出するようになっている。また、制御装置２５は、検出された超短パルスレーザ光Ｌ４の中心波長に基づいて前記波長選択光学系２１および超短パルスレーザ光Ｌ４の光路に配置された分散補償光学系３１を制御するようになっている。図中、符号４４はミラーである。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡４０によれば、光ファイバ８を通過させられることにより、略３００〜１６００ｎｍの波長帯域を有するようにスペクトル拡散された白色の超短パルスレーザ光Ｌ２が、波長選択光学系２１′を通過させられることにより、所定波長の超短パルスレーザ光Ｌ４と残りの超短パルスレーザ光Ｌ３とに分離される。

分離された２つの超短パルスレーザ光Ｌ３，Ｌ４は、それぞれ分散補償光学系３１を通過させられることにより群速度分散が補償され、ビーム整形光学系１０を通過させられることにより、それらの光束径およびビームダイバージェンスが調節される。
ビームサンプラー２３により分岐された超短パルスレーザ光Ｌ３は、図8に示されるように、切り出された超短パルスレーザ光Ｌ４部分の欠落したスペクトル波形を有しているので、分光器２４において超短パルスレーザ光Ｌ４の中心波長を容易に求めることができる。

そして、求められた超短パルスレーザ光Ｌ４の中心波長に基づいて、波長選択光学系２１の切り出す波長がフィードバック調節される一方、分散補償光学系３１による超短パルスレーザ光Ｌ４の分散補償量が波長に合わせて調節される。
したがって、超短パルスレーザ光Ｌ４は、波長選択光学系２１′により、所望の中心波長を有するように精度よく切り出され、分散補償光学系３１により波長に合わせた分散補償量で適正に群速度分散を補償され、ビーム整形光学系１０により光束径およびビームダイバージェンスを調節された状態で顕微鏡本体３に入射される。
そして、このようにして理想的に調節された超短パルスレーザ光Ｌ４は、第２のスキャナ４１により２次元的に走査され、あるいは、２次元的な位置を設定される。その後、瞳投影レンズ４２、ダイクロイックミラー４３、結像レンズ１４および対物レンズ１５を介して標本Ａに照射される。

一方、波長選択光学系２１により超短パルスレーザ光Ｌ４を切り出された残りの超短パルスレーザ光Ｌ３は、分散補償光学系３１により波長に合わせた分散補償量で適正に群速度分散を補償され、ビーム整形光学系１０により光束径およびビームダイバージェンスを調節された状態で顕微鏡本体３に入射される。そして、顕微鏡本体３内においては、超短パルスレーザ光Ｌ３は、スキャナ１２により２次元的に走査され、瞳投影レンズ、結像レンズおよび対物レンズを透過して標本Ａに照射される。

標本Ａに照射される超短パルスレーザ光Ｌ３は、超短パルスレーザ光Ｌ４の波長が欠落したスペクトル波形を有しているが、複数の波長帯域の超短パルスレーザ光が含まれているので、複数の波長の多光子蛍光Ｆを同時に発生させることができる。
また、標本Ａに照射される超短パルスレーザ光Ｌ４は、極めて精度よく限定された波長を有し、かつ、厳密に分散補償されているので、精度の高い多光子励起刺激を標本Ａに付与することができる。

このように、本実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡４０によれば、単一の光源で多光子励起刺激と、複数波長による多光子蛍光観察を行うことができ、製品コストを低減することができる。また、多光子励起刺激と複数波長による多光子蛍光観察を同時タイミングで行うことができる。したがって、標本Ａにおいて瞬時に発生する現象を逃すことなく観察できるという利点がある。

なお、本実施形態においては、第２のスキャナ４１により超短パルスレーザ光Ｌ４の標本Ａへの照射位置を設定することとしたが、これに代えて、第２のスキャナ４１により超短パルスレーザ光Ｌ４を走査させることで、標本Ａの所望の範囲に多光子励起刺激を与え
ることとしてもよい。

また、分散補償光学系３１により、超短パルスレーザ光Ｌ４のパルス幅を太らせることにより、波長選択光学系２１′により選択された中心波長に応じた１光子励起刺激を行うことができる。

本発明の第１の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。図１の多光子励起走査型レーザ顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。本発明の第２の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。図３の多光子励起走査型レーザ顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。図３の多光子励起走査型レーザ顕微鏡の第２の変形例に用いる分散素子の一例を示す模式図である。本発明の第３の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。本発明の第４の実施形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡を示す全体構成図である。図７の多光子励起走査型レーザ顕微鏡の波長選択光学系により所定波長の超短パルスレーザ光を分離した残りの超短パルスレーザ光のスペクトル波形を示す図である。

符号の説明

Ａ標本
Ｆ多光子蛍光
Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４超短パルスレーザ光
１，２０，３０，４０多光子励起走査型レーザ顕微鏡
５レーザ光源
８光ファイバ
１２スキャナ（レーザ走査部）
１５対物レンズ（対物光学系）
１８光検出器
１９，２１，２１′ 波長選択光学系
２４分光器（波形検出部）
２５制御装置（調節装置：波長調節部：分散補償量調節装置）
２６出力調節光学系（尖頭出力調整光学系）
３１分散補償光学系
４１第２のスキャナ（第２のレーザ走査部）
４３ダイクロイックミラー（合波部材）

Claims

単一波長の超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を入射させ、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、
該光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光を走査するレーザ走査部と、
該レーザ走査部により走査された超短パルスレーザ光を標本に集光させる対物光学系と、
標本における超短パルスレーザ光の集光位置から発せられた多光子蛍光を検出する光検出器と、
前記超短パルスレーザ光に対する群速度分散を補償する分散補償光学系とを備える多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光の波長を選択する波長選択光学系を備える請求項１に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記波長選択光学系により波長選択された超短パルスレーザ光の中心波長を検出する波形検出部と、
前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記分散補償光学系の分散補償量を調節する調節装置とを備える請求項２に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
単一波長の超短パルスレーザ光を出射するレーザ光源と、
該レーザ光源からの超短パルスレーザ光を入射させ、超短パルスレーザ光のスペクトルを拡散させる光ファイバと、
前記光ファイバから出射されたスペクトル拡散された超短パルスレーザ光から所定波長の超短パルスレーザ光を選択的に分離する波長選択光学系と、
該波長選択光学系により所定波長の超短パルスレーザ光が分離された残りの超短パルスレーザ光を走査するレーザ走査部と、
該レーザ走査部により走査された残りの超短パルスレーザ光に、前記所定波長の超短パルスレーザ光を合波させる合波部材と、
該合波部材により合波された超短パルスレーザ光を標本に集光させる対物光学系と、
標本における超短パルスレーザ光の集光位置から発せられた多光子蛍光を検出する光検出器とを備える多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光の中心波長を検出する波形検出部と、
前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記波長選択光学系により分離する超短パルスレーザ光の波長を調節する波長調節装置とを備える請求項４に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光に対する群速度分散を補償する分散補償光学系と、
前記波形検出部により検出された中心波長に基づいて、前記分散補償光学系の分散補償量を調節する分散補償量調節装置とを備える請求項５に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記波長選択光学系により分離された所定波長の超短パルスレーザ光を走査する第２のレーザ走査部を備える請求項４に記載の多孔子励起走査型レーザ顕微鏡。
前記レーザ光源と、前記光ファイバとの間に、該光ファイバに入射する前記超短パルスレーザ光の尖頭出力を調整する尖頭出力調整光学系を備える請求項１または請求項４に記載の多光子励起走査型レーザ顕微鏡。