JP2005269902A - Method for immobilizing cell on solid-phase surface - Google Patents

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Hiroshi Takiguchi
宏志 瀧口
Hitoshi Fukushima
均 福島
Takashi Masuda
貴史 増田
Teruyuki Nagamune
輝行 長棟
Masashige Shinkai
政重 新海
Kengo Yamawaki
健吾 山脇
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for immobilizing a compound having an affinity for a cell membrane in a desired pattern on the solid-phase surface. <P>SOLUTION: The method for immobilization is to immobilize the cell 20 in the desired pattern on the solid-phase surface 10 by using a first compound 14 having an affinity for the cell. There is provided the method comprising at least an immobilizing step of immobilizing a second compound 12 having a binding site binding to the first compound 14 and more readily immobilizable on the solid-phase surface 10 than the first compound 14 on the solid-phase surface 10 according to the pattern. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、固相表面に、所望の微細なパターンに従って、細胞を固定化する方法に関する。より詳しくは、細胞に親和性を有する物質を前記パターンに従って固定化し、該物質に細胞を固定化することによって、細胞を前記パターンに固定化する方法に関する。   The present invention relates to a method for immobilizing cells on a solid phase surface according to a desired fine pattern. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing cells in the pattern by immobilizing a substance having affinity for cells according to the pattern and immobilizing the cells on the substance.

近年、固相表面に細胞を迅速かつ正確に固定化するCell Immobilization技術が注目されている。生きたまま固定化された細胞は固相表面上での培養が可能であり、バイオセンサや再生医療分野での利用が期待されている。   In recent years, attention has been focused on Cell Immobilization technology for rapidly and accurately immobilizing cells on a solid surface. Cells that are fixed alive can be cultured on a solid phase surface, and are expected to be used in biosensor and regenerative medicine fields.

特に、再生医療分野での利用を目的として、細胞を固相表面上で増殖させ、生体組織の代替物を得ようとする場合は、細胞を傷つけずに固定化するだけでなく、固相表面の特定の位置に固定化することが重要である。組織、臓器の重要な特徴は、必要な細胞が適当な個所に配置され機能を発揮している点にあり、特定の位置に配置された個性をもった細胞を、それぞれ増殖させて組織として組み立てることは、複雑な組織構造を持った生体組織の構築につながる。   In particular, for the purpose of use in the field of regenerative medicine, when cells are grown on a solid surface to obtain a substitute for living tissue, not only immobilization without damaging the cells but also solid phase surface It is important to fix at a specific position. An important feature of tissues and organs is that necessary cells are placed at appropriate locations and perform their functions, and cells with individuality placed at specific positions are each proliferated and assembled into tissues. This leads to the construction of a living tissue having a complex tissue structure.

一方、基板上に細胞を規則正しく固定した細胞アレイも開発されつつあり、特定の遺伝子を用いてこの細胞を形質転換することによる発現解析や、薬物の毒性や安全性評価等に用いることができると考えられている。基板上で発現解析や薬物のスクリーニング等ができれば、サンプルが少量ですみ、反応時間を短縮でき、分析コストを低減することができるというメリットがある。   On the other hand, a cell array in which cells are regularly fixed on a substrate is being developed, and it can be used for expression analysis by transforming this cell with a specific gene, evaluation of drug toxicity and safety, etc. It is considered. If expression analysis, drug screening, etc. can be performed on a substrate, there is an advantage that a small amount of sample is required, reaction time can be shortened, and analysis cost can be reduced.

細胞を固相表面の所定位置に固定化する手段として、細胞の接着等に関与した細胞培養制御用物質を含む液体を、微小液滴吐出手段によって基体表面に吐出することにより、該細胞培養制御用物質を所望のパターンで固定化した後、この細胞培養制御用物質が固定化された領域が培養液と接触している状態において細胞を培養して、該細胞を基体表面の所望の位置に固定化する方法について報告がある（例えば、特許文献１を参照）。
特開２００２−３５５０２６ 特開２００３−１１６５２９ As a means for immobilizing cells at a predetermined position on the surface of the solid phase, a liquid containing a cell culture control substance involved in cell adhesion or the like is discharged onto the substrate surface by means of a microdroplet discharge means, thereby controlling the cell culture. After immobilizing the material for use in a desired pattern, the cells are cultured in a state where the region where the cell culture control substance is immobilized is in contact with the culture solution, and the cells are brought to a desired position on the substrate surface. There is a report on a method of immobilization (see, for example, Patent Document 1).
JP 2002-355026 A JP 2003-116529 A

ある化合物を含む溶液を固相表面に供給することによって、該化合物を所望のパターンで固相表面に固定化する場合、まず該溶液をこのパターンに従って固相表面に配置しなければならない。しかし、細胞培養制御用物質などの細胞に親和性を有する化合物は、リン脂質からなる細胞膜に親和性を有しなくてはならないため、疎水性の高い炭化水素鎖をもち、一方で固体表面への反応を担う官能基を分子末端の反対側に持つことが多く、これらを溶解できる表面張力の高い溶媒は収縮する傾向が強い。一般的に、水などの極性が高く表面張力が大きな有機溶剤は、表面自由エネルギーを最小限にとどめるように張力がはたらき、相対的に表面自由エネルギーの低い固体表面上の溶媒の液滴は、蒸発に伴い球状の形状を保ちながら収縮する。かかる場合、例えば、微小液滴吐出手段によって固相表面にライン状に溶液を供給すると、乾燥するまでに液体の収縮により短く切れてしまうなど形状に乱れが生じる。その結果、溶質である化合物もきれいなパターンで固定化できず、これに細胞を固定化しても、所望のパターンとならない。   When the compound is immobilized on the solid phase surface in a desired pattern by supplying a solution containing the compound to the solid phase surface, the solution must first be placed on the solid surface according to this pattern. However, compounds that have an affinity for cells, such as cell culture control substances, must have an affinity for cell membranes made of phospholipids, and thus have a highly hydrophobic hydrocarbon chain, while at the same time becoming a solid surface. In many cases, a functional group responsible for this reaction is provided on the opposite side of the molecular end, and a solvent having a high surface tension capable of dissolving these has a strong tendency to shrink. In general, organic solvents with high polarity and high surface tension, such as water, are tensioned to minimize surface free energy, and droplets of solvent on solid surfaces with relatively low surface free energy It shrinks while maintaining a spherical shape as it evaporates. In such a case, for example, when the solution is supplied in a line shape to the solid phase surface by the fine droplet discharge means, the shape is disturbed, such as being cut short due to contraction of the liquid before drying. As a result, a compound that is a solute cannot be immobilized in a clean pattern, and even if cells are immobilized thereon, a desired pattern is not obtained.

そこで、本発明は、細胞膜に親和性を有する化合物を所望のパターンで固相表面に固定化する方法を提供することを目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for immobilizing a compound having affinity for a cell membrane on a solid phase surface in a desired pattern.

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、細胞を固相表面に所望のパターンで固定化する際、該細胞の細胞膜に親和性を有する化合物を固定化するのに先立って、該化合物と結合しうる分子結合部位を有し、かつきれいなパターンで固相表面に固定化しやすい化合物を、上記パターンに従って予め固相表面に固定化しておくことにより、上記細胞に親和性を有する化合物および細胞を上記パターンに従って好適に固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have immobilized a compound having affinity for the cell membrane of the cell when the cell is immobilized in a desired pattern on the surface of the solid phase. First, a compound that has a molecular binding site capable of binding to the compound and is easily immobilized on the solid phase surface in a clean pattern is previously immobilized on the solid phase surface according to the pattern, so that it has affinity for the cells. The present inventors have found that compounds and cells having the above can be suitably immobilized according to the above pattern, and have completed the present invention.

即ち、本発明は、［１］細胞膜に親和性を有する第一の化合物を用いて、固相表面に所望のパターンで細胞を固定化する固定化方法であって、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より前記固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、前記パターンに従って前記固相表面に固定化する固定化工程を少なくとも含む、方法；[２]前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に自己組織化単分子膜を形成しうる基板結合部位を有する化合物である、上記[１]に記載の方法；[３]前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物である、上記[１]記載の方法；[４]前記分子結合部位がアミノ基である、上記[１]から[３]のいずれか１項に記載の方法；[５]前記固定化工程が、前記第二の化合物を含む液滴を、前記固相表面に前記パターンに従って吐出することによって行われる、上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法[６]前記固定化工程が、前記第二の化合物を前記固相表面全体に固定化する工程と、前記パターンを残して、前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[７]前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程が、前記第二の化合物に放射エネルギー線を照射することによって行われる、上記[６]に記載の固定化方法；[８]前記固定化工程の後、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する、上記[１]から[７]のいずれか１項に記載の固定化方法；[９]前記固定化工程が、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、前記パターンに従って、前記第二の化合物を固定化する工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[１０]前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、細胞付着防止化合物を含む液滴を、前記パターンを除く領域に吐出することによって行われる上記[９]に記載の固定化方法；[１１]前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、前記固相表面全体に細胞付着防止膜を形成する工程と、前記パターンに従って、前記細胞付着防止化合物を除去する工程と、を含む、上記[９]に記載の固定化方法；[１２]前記細胞付着防止膜を除去する工程が、前記細胞付着防止膜に放射エネルギー線を照射することによって行われる、上記[１１]に記載の固定化方法；[１３]前記細胞付着防止膜が、ポリエチレングリコール、糖、ポリエステル、ポリイソシアネートをふくむ、上記［８］から［１２］のいずれか１項に記載の固定化方法；[１４]前記固定化工程が、前記結合部位に保護基が結合された前記第二の化合物を、前記固相表面全体に固定化する工程と、前記パターンに従って、前記保護基を脱離させる工程と、を含む上記[１]から[４]のいずれか１項に記載の固定化方法；[１５]前記保護基を脱離させる工程が、前記パターンに従って、前記第二の化合物に脱保護誘発化合物を含む液滴を吐出することによって行われる、上記[１４]に記載の固定化方法；[１６]前記保護基を脱離させる工程が、前記パターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、前記第二の化合物を除去する工程と、前記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含む上記[１４]に記載の固定化方法；[１７]前記放射エネルギー線が、電磁波、電子線、またはイオンビームである、上記［７］、［１２］および［１６］のいずれか１項に記載の固定化方法、および；[１８]上記[１]から[１７]のいずれか１項に記載の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイ、に関する。   That is, the present invention provides [1] an immobilization method for immobilizing cells in a desired pattern on a solid phase surface using a first compound having affinity for a cell membrane, which binds to the first compound A method comprising at least an immobilization step of immobilizing a second compound having a molecular binding site capable of being immobilized on the solid phase surface more easily than the first compound on the solid phase surface according to the pattern; [2] The above-mentioned second compound is a compound having a molecular binding site capable of binding to the first compound and a substrate binding site capable of forming a self-assembled monolayer on the surface of the solid phase substrate. [3] The method according to 1]; [3] a molecular binding site where the second compound can bind to the first compound, and a polymer site capable of forming an insoluble thin film by physical adsorption on the surface of the solid phase substrate. [4] The method according to the above [1], which is a compound having The method according to any one of [1] to [3] above, wherein the child binding site is an amino group; [5] In the immobilization step, a droplet containing the second compound is added to the solid phase. [6] The immobilization method according to any one of [1] to [4], wherein the immobilization step is performed by discharging the second compound onto the solid surface. The immobilization according to any one of [1] to [4], comprising a step of immobilizing the whole and a step of inactivating a molecular binding site of the second compound leaving the pattern. [7] The immobilization method according to [6] above, wherein the step of inactivating the molecular binding site of the second compound is performed by irradiating the second compound with radiant energy rays. [8] After the immobilization step, a cell adhesion prevention film is formed in a region excluding the pattern, [1] [7] The immobilization method according to any one of [7]; [9] The immobilization step includes a step of forming a cell adhesion preventing film in a region excluding the pattern, and the second compound according to the pattern. And [10] the immobilization method according to any one of [1] to [4] above; and [10] the step of forming a cell adhesion preventing film in a region excluding the pattern, The immobilization method according to the above [9], which is performed by discharging a droplet containing an inhibitory compound to a region excluding the pattern; [11] a step of forming a cell adhesion preventing film in the region excluding the pattern; [12] The immobilization method according to the above [9], comprising a step of forming a cell adhesion preventing film on the entire solid surface, and a step of removing the cell adhesion preventing compound according to the pattern; The step of removing the anti-adhesion film comprises the cell attachment [8] The immobilization method according to [11], which is performed by irradiating the stop film with radiant energy rays; [13] The cell adhesion prevention film includes polyethylene glycol, sugar, polyester, and polyisocyanate. [14] The immobilization method according to any one of [12]; [14] In the immobilization step, the second compound having a protective group bound to the binding site is immobilized on the entire solid surface. The immobilization method according to any one of the above [1] to [4], comprising: a step of removing the protecting group according to the pattern; and [15] removing the protecting group. The immobilizing method according to [14] above, wherein the step of causing is performed by discharging a droplet containing a deprotection-inducing compound on the second compound according to the pattern; [16] The protecting group is removed The step of making the pattern [14] including a step of irradiating a region to be removed with radiant energy rays to remove the second compound and a step of reacting a deprotection-inducing compound with the second compound left in the pattern. [17] The immobilization method according to any one of [7], [12] and [16] above, wherein the radiant energy beam is an electromagnetic wave, an electron beam or an ion beam. And [18] relates to a cell array in which cells are immobilized using the immobilization method according to any one of [1] to [17] above.

本発明によれば、まず、固相表面に固定化しやすい第二の化合物を固定化するので、細胞を固定化しようとするパターンどおりに、正確な膜パターンを形成することができる。これにより、第二の化合物上に第一の化合物を、さらに第一の化合物上に細胞を、所望のパターン通りに正確に固定化することができる。   According to the present invention, since the second compound that is easily immobilized on the solid phase surface is first immobilized, an accurate membrane pattern can be formed in accordance with the pattern for immobilizing cells. Thereby, a 1st compound can be fix | immobilized correctly according to a desired pattern on a 1st compound on a 2nd compound, and also on a 1st compound.

本発明に係る「固定化方法」は、細胞に親和性を有する第一の化合物に結合しうる結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、上記パターンに従って固相表面に固定化する固定化工程を含むことを特徴とする
本発明において「固相表面に固定化しやすい」とは、固相表面に、所望のパターンに従って容易に固定化できることを意味する。従って、第二の化合物としては、例えば、第一の化合物よりも固相表面に対して反応する速度が早く、緻密な薄膜を形成するような分子構造をもった化合物を用いることができる。 The “immobilization method” according to the present invention includes a second compound that has a binding site capable of binding to a first compound having affinity for cells and that is easier to immobilize on a solid phase surface than the first compound. In the present invention, “easy to immobilize on the solid phase surface” means that it can be easily immobilized on the solid phase surface according to a desired pattern. Means. Therefore, as the second compound, for example, a compound having a molecular structure that forms a dense thin film can be used, which has a faster reaction speed with respect to the solid phase surface than the first compound.

このような化合物の一例として、固相基板表面に自己組織化単分子膜（Self Assembled Monolayer; ＳＡＭ）を形成しうる基板結合部位を有する化合物が挙げられる。第二の化合物に自己組織化単分子膜を形成するための基板結合部位があれば、固相表面に該溶液を配置した場合に、第二の化合物は速やかに固相表面に緻密な薄膜を形成する。その結果、溶液の収縮によって液滴の位置が移動したり、ライン状のパターンに配置した液滴が途中で途切れたりしても、その前に固相基板表面に前記第一の化合物が反応するための第一の化合物に結合しうる結合部位のパターンを形成することができる。 An example of such a compound, self-assembled monolayer to a solid substrate surface; include compounds having the (S elf A ssembled M onolayer SAM ) capable of forming the substrate binding site. If the second compound has a substrate binding site for forming a self-assembled monolayer, the second compound quickly forms a dense thin film on the solid surface when the solution is placed on the solid surface. Form. As a result, even if the position of the droplet moves due to the contraction of the solution or the droplet arranged in the line pattern is interrupted, the first compound reacts with the surface of the solid phase substrate before that. A pattern of binding sites capable of binding to the first compound for forming the first compound.

ＳＡＭを形成しうる基板結合部位としては、固相基板が金属である場合には、チオール基（−ＳＨ）、ジスルフィド基（−ＳＳ−）、スルフィド基（−Ｓ−）等が挙げられる。これらの基板結合部位は、例えば金蒸着された固相表面とＡｕ−Ｓ結合してＳＡＭを形成する。   Examples of the substrate binding site capable of forming SAM include a thiol group (—SH), a disulfide group (—SS—), a sulfide group (—S—), etc., when the solid phase substrate is a metal. These substrate binding sites form, for example, a SAM by Au—S bonding with a gold-deposited solid phase surface.

一方、固相基板がガラスやポリマー樹脂、半導体、金属酸化物などである場合は、ＳＡＭを形成しうる基板結合部位を含む第二の化合物として、シラン系やチタネート系のカップリング剤が挙げられる。シラン系のカップリング剤は、一般にＹnＳｉＸ(4-n)［ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基等を表し；Ｘはアルコキシル基またはハロゲンを表し；ｎは１〜３の整数を表す］で表される。シランカップリング剤の場合、Ｘ部分が加水分解によりシラノールを形成し、固相表面の水酸基と結合する。 On the other hand, when the solid phase substrate is glass, polymer resin, semiconductor, metal oxide, or the like, a silane-based or titanate-based coupling agent can be cited as the second compound including a substrate binding site capable of forming SAM. . Silane coupling agents are generally Y n SiX (4-n) [wherein Y represents an alkyl group, a fluoroalkyl group, a vinyl group, an amino group, a phenyl group, an epoxy group, or the like; X represents an alkoxyl group or Represents a halogen; n represents an integer of 1 to 3]. In the case of a silane coupling agent, the X moiety forms silanol by hydrolysis and binds to a hydroxyl group on the solid surface.

ここで、本発明に用いられる「固相表面」の材料は、上記のほか、他の金属（例えば、銀、銅、アルミニウム、白金、酸化アルミニウム、ＳｒＴｉＯ3、ＬａＡｌＯ3、ＮｄＧａＯ3、ＺｒＯ2）、シリコン（例えば、酸化ケイ素）、ポリマー樹脂（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート）、等からも選ぶことができる。尚、これらの材料の固相表面を用いる場合も、それぞれ適切な官能基を有する第二の化合物を用いることによって、好適にＳＡＭを形成することが可能である。また、固相表面は平面であることが好ましく、基板状、テープ状、フィルム状等の形状の固相が用いられる。 Here, in addition to the above, the material of the “solid surface” used in the present invention is other metal (for example, silver, copper, aluminum, platinum, aluminum oxide, SrTiO 3 , LaAlO 3 , NdGaO 3 , ZrO 2 ). , Silicon (for example, silicon oxide), polymer resin (for example, polyethylene terephthalate, polycarbonate), and the like. In addition, also when using the solid-phase surface of these materials, it is possible to form SAM suitably by using the 2nd compound which has an appropriate functional group, respectively. The solid phase surface is preferably a flat surface, and a solid phase having a substrate shape, a tape shape, a film shape or the like is used.

また、本発明に係る方法では、「固相表面に固定化しやすい」第二の化合物として、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物を用いることができる。高分子の溶液は高分子の重合度、溶液の濃度調整、吸着の温度等を制御することで、高分子薄膜の吸着速度や析出時の形状を変えることが可能であり、高濃度の溶液を用いて高分子の薄膜を形成することができる。従って、第二の化合物が、固相表面に物理吸着しうる高分子部位を有していれば、固相表面に該溶液を配置した場合に、乾燥に伴う溶液の収縮によって液滴の位置が移動したり、ライン状のパターンに配置した液滴が途中で途切れたりすることなく、固相基板表面に第二の化合物の堆積膜を形成することができる。   Further, in the method according to the present invention, as the second compound “easy to be immobilized on the solid phase surface”, a compound having a polymer portion that can be physically adsorbed on the solid substrate surface to form an insoluble thin film is used. it can. By controlling the degree of polymerization of the polymer, adjusting the concentration of the solution, the temperature of adsorption, etc., the polymer solution can change the adsorption speed of the polymer thin film and the shape during deposition. It can be used to form a polymer thin film. Therefore, if the second compound has a polymer site that can be physically adsorbed on the solid phase surface, the position of the droplets is reduced by the contraction of the solution accompanying drying when the solution is disposed on the solid phase surface. The deposited film of the second compound can be formed on the surface of the solid phase substrate without moving or dropping the droplets arranged in a line pattern in the middle.

本発明に用いられる、第二の化合物が高分子部位を有する場合、第二の化合物は固相表面に対して化学的な結合をせず、物理吸着により固相表面上に吸着して薄膜を形成する。分子量が大きいために、溶液中に溶け込むことなく基板表面に残留するため、この第二の化合物をパターン状に配置しておけば第一の化合物を介して、細胞が固定化することができる。   When the second compound used in the present invention has a polymer moiety, the second compound does not chemically bond to the solid surface, and is adsorbed on the solid surface by physical adsorption to form a thin film. Form. Since the molecular weight is large, it does not dissolve in the solution and remains on the substrate surface. Therefore, if this second compound is arranged in a pattern, cells can be immobilized via the first compound.

高分子の構造に特に限定はないが、細胞の吸着過程において水溶液中で第二の化合物が溶出しないことが必要である。第二の化合物を薄膜にする工程では水を主成分とする緩衝溶液またはその緩衝溶液の中に有機溶剤を含むものを用いることができる。特に、ポリペプチドや蛋白質はそれ自体がアミノ基を大量に表面に有しているため第一の化合物を固定化するためにアミノ基を導入するなどの特別な処理を必要としない。蛋白質の中でも、アルブミンは凝固しやすい蛋白質でありながら、中性から弱アルカリ性において可溶な蛋白質であり、熱やアルコールなどで容易に変性して凝固するため、本発明に用いられる第二の化合物として適している。   The structure of the polymer is not particularly limited, but it is necessary that the second compound does not elute in the aqueous solution during the cell adsorption process. In the step of forming the second compound into a thin film, a buffer solution containing water as a main component or a solution containing an organic solvent in the buffer solution can be used. In particular, since polypeptides and proteins themselves have a large amount of amino groups on their surfaces, they do not require any special treatment such as introducing amino groups to immobilize the first compound. Among proteins, albumin is a protein that is easily coagulated, but is a protein that is soluble in neutral to weak alkalinity, and is easily denatured and coagulated with heat, alcohol, etc., so the second compound used in the present invention Suitable as

ここで、本発明で用いられる「第一の化合物」は、細胞に親和性を有する限り特に限定されず、生体由来であるか合成されたものであるかを問わない。例えば、細胞外マトリックスの構成成分である蛋白質（例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等）や、細胞表面に露出した官能基を特異的に認識して結合する化合物、抗体、サイトカイン、また、細胞膜に挿入されるように結合する化合物等が挙げられる。   Here, the “first compound” used in the present invention is not particularly limited as long as it has affinity for cells, regardless of whether it is derived from a living body or synthesized. For example, proteins that are components of extracellular matrix (eg, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, laminin, etc.), compounds that specifically recognize and bind to functional groups exposed on the cell surface, antibodies, cytokines, And compounds that bind to be inserted into the cell membrane.

中でも、細胞膜に挿入されるように結合する脂肪族炭化水素基を備えたＢＡＭ（Biocompatible Anchor for Membrane）（例えば、特許文献２を参照）は、非共有結合によって細胞を傷つけることなく効率的に固定化できて好ましい。 Among them, BAM with an aliphatic hydrocarbon group attached to be inserted into the cell membrane (B iocompatible A nchor for M embrane ) ( e.g., see Patent Document 2), the efficiency without damaging the cells by non-covalent bonds It is preferable because it can be fixed.

本発明に係る「第二の化合物」は、上記「第一の化合物に結合しうる結合部位」を有する。このような化合物として、例えば、第一の化合物に含まれる官能基と共有結合する、アミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等の官能基を、結合部位として備えた化合物が挙げられる。特に、第一の化合物として上記ＢＡＭを用いる場合には、結合部位としてアミノ基を備えた第二の化合物が好ましい。また、第一の化合物が蛋白質等の生体分子である場合は、該生体分子に生物学的親和性を有する、抗体、抗原、その他の蛋白質を「第二の化合物」として用いることも可能である。   The “second compound” according to the present invention has the above “binding site capable of binding to the first compound”. As such a compound, for example, a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a disulfide group, an epoxy group, a carbodiimide group, or a maleimide group that is covalently bonded to the functional group included in the first compound is provided as a binding site. Compounds. In particular, when BAM is used as the first compound, the second compound having an amino group as the binding site is preferable. When the first compound is a biomolecule such as a protein, an antibody, antigen, or other protein having biological affinity for the biomolecule can be used as the “second compound”. .

なお、第一の化合物に適当な結合部位がない場合は、予めアミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等の官能基を第一の化合物に導入しておいたり、アビジン、ビオチンといった生物学的親和性を有する分子を結合させておいてもよい。この場合、第二の化合物として、上記官能基に親和性を有する官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基等）を有する化合物や、上記分子に親和性を有する分子（例えば、ビオチン、アビジン等）を結合させた化合物を用いれば、第一の化合物を好適に固定することができ、かかる構成も本発明に含まれる。   If the first compound does not have a suitable binding site, a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a disulfide group, an epoxy group, a carbodiimide group, or a maleimide group has been introduced into the first compound in advance. A molecule having biological affinity such as avidin or biotin may be bound. In this case, as the second compound, a compound having an affinity for the functional group (for example, an amino group, a carboxyl group, a disulfide group, an epoxy group, a carbodiimide group, a maleimide group, etc.) or an affinity for the molecule If a compound to which a molecule having a property (for example, biotin, avidin, etc.) is bound, the first compound can be suitably immobilized, and such a configuration is also included in the present invention.

本発明に係る固定化工程は、第二の化合物を含む液滴を、固相表面に吐出することによって行われることが好ましい。液滴を吐出する方法としては、例えば、少量の液滴を精度よく供給することが可能なインクジェット法を用いることができる。インクジェット法には、溶液を吐出する方法として、ピエゾ素子を用いたピエゾジェット法、サーマル素子を用いたサーマルジェット法、振動板と電極間の静電力を利用した静電アクチュエータ法があり、いずれの方法を用いてもよい。温度に敏感な生体試料が含まれる場合には、吐出された液滴に高温がかからないピエゾジェット法または静電アクチュエータ法を用いることができる。   The immobilization step according to the present invention is preferably performed by discharging a droplet containing the second compound onto the solid surface. As a method for ejecting droplets, for example, an inkjet method capable of supplying a small amount of droplets with high accuracy can be used. Ink jet methods include piezo jet methods using piezo elements, thermal jet methods using thermal elements, and electrostatic actuator methods that use electrostatic force between the diaphragm and the electrodes. A method may be used. When a temperature-sensitive biological sample is included, a piezo jet method or an electrostatic actuator method in which a high temperature is not applied to discharged droplets can be used.

第二の化合物を含む液滴は、細胞を固定化するパターンに従って吐出する。インクジェット装置を用いる場合は、固相を載置したステージを動かすことにより、任意のパターンに液滴を吐出することができる。細胞を固定化するパターンは、細胞の種類、大きさを考慮し、培養量等に応じて任意に決定することができる。   The droplet containing the second compound is ejected according to a pattern for immobilizing cells. In the case of using an inkjet apparatus, droplets can be ejected in an arbitrary pattern by moving a stage on which a solid phase is placed. The pattern for immobilizing cells can be arbitrarily determined according to the culture amount and the like in consideration of the type and size of the cells.

第二の化合物は、第一の化合物と異なり、細胞への親和性が必要とされないので、第一の化合物よりも高い自由度で選択することができる。従って、第一の化合物が、液滴の吐出に適さない溶媒にしか溶解しない場合にも、第二の化合物として、吐出に適した溶媒に溶解できる化合物を選択し、これを固相表面に吐出して供給できる。第二の化合物がきれいにパターニングされていれば、第二の化合物が吸着した固相表面を第一の化合物の溶液に充分な時間浸漬することによって細胞への親和性を有した第一の化合物のパターンが固相表面に形成できる。   Unlike the first compound, the second compound does not require affinity for cells, and thus can be selected with a higher degree of freedom than the first compound. Therefore, even when the first compound dissolves only in a solvent that is not suitable for droplet ejection, a compound that can be dissolved in a solvent suitable for ejection is selected as the second compound, and this is ejected onto the solid surface. Can be supplied. If the second compound is neatly patterned, the first compound having an affinity for cells can be obtained by immersing the solid phase surface on which the second compound is adsorbed in a solution of the first compound for a sufficient time. A pattern can be formed on the solid surface.

また、本発明に係る固定化工程は、まず、第二の化合物を固相表面全体に固定化し、続いて細胞を固定化するパターンのみを残して、第二の化合物の結合部位を不活性化することによって行われることも好ましい。例えば、まず固相表面に第二の化合物によるＳＡＭを形成し、上記パターン以外の部分に開口が設けられたマスクを用いて放射エネルギー線を照射することにより、ＳＡＭを構成する分子の原子間結合の一部を切断して不活性化することができる。放射エネルギー線としては紫外線が好ましく、マスクを用いて照射することにより、微細なパターンを正確に残すことができる。この結果、第二の化合物上に、第一の化合物を所望のパターン通りに精度よく固定化することができる。   In addition, the immobilization step according to the present invention first inactivates the binding site of the second compound, leaving only the pattern for immobilizing the second compound on the entire solid surface and subsequently immobilizing the cells. It is also preferable that this is performed. For example, first, an SAM made of a second compound is formed on the surface of a solid phase, and irradiation with radiant energy rays is performed using a mask in which openings are provided in portions other than the above pattern, whereby the interatomic bonds of the molecules constituting the SAM. A part of can be cut and inactivated. Ultraviolet rays are preferable as the radiant energy ray, and a fine pattern can be accurately left by irradiation using a mask. As a result, the first compound can be accurately immobilized on the second compound in a desired pattern.

なお、本発明に係る固定化方法では、上述した固定化工程後、固相表面において第二の化合物が固定化された領域以外の領域に細胞付着防止膜を形成しておくことが好ましい。細胞付着防止膜は、細胞に親和性を有しない、細胞付着防止化合物を含む。細胞付着防止化合物は、特に限定されないが、例えば、水酸基など、親水性の高い官能基を含む化合物を用いることができ、このような化合物としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。   In the immobilization method according to the present invention, it is preferable to form a cell adhesion preventing film in a region other than the region where the second compound is immobilized on the solid phase surface after the above-described immobilization step. The cell adhesion-preventing membrane contains a cell adhesion-preventing compound that has no affinity for cells. The cell adhesion preventing compound is not particularly limited, and for example, a compound containing a highly hydrophilic functional group such as a hydroxyl group can be used. Examples of such a compound include polyethylene glycol (PEG).

ＰＥＧの末端に、固相表面でＳＡＭを形成しうる官能基（例えば、固相表面に金薄膜が形成されている場合、チオール基）を結合させておくことによって、ＰＥＧが表面に並んだＳＡＭを形成することができ、これを細胞付着防止膜とすることができる。ＳＡＭは、第二の化合物を固定化した後、チオール基を結合させたＰＥＧ（以下「ＰＥＧ−チオール」という）を含む溶液に、固相表面を接触させることによって形成することができる。また、固相表面における第二の化合物が固定化されていない領域に、ＰＥＧ−チオールを含む液滴を吐出することによっても、ＳＡＭを形成することが可能である。   By attaching a functional group capable of forming a SAM on the solid surface (for example, a thiol group when a gold thin film is formed on the solid surface) to the end of the PEG, the SAM in which the PEG is arranged on the surface This can be used as a cell adhesion preventing film. The SAM can be formed by immobilizing the second compound and then bringing the solid surface into contact with a solution containing PEG to which a thiol group is bound (hereinafter referred to as “PEG-thiol”). Alternatively, the SAM can be formed by discharging a droplet containing PEG-thiol to a region where the second compound is not immobilized on the solid surface.

細胞付着防止膜を形成しておくことにより、細胞が固定化したいパターン以外の領域にはみ出して固定化されるのを防ぐことができるので、より精度よく細胞を固定化することが可能と成る。また、その後固相表面上で、細胞を培養し増殖させた場合にも細胞が付着する領域を制御可能となる。   By forming the cell adhesion preventing film, it is possible to prevent the cells from sticking out of the region other than the pattern to be immobilized, and thus the cells can be immobilized with higher accuracy. Further, when the cells are cultured and grown on the solid phase surface, the area to which the cells adhere can be controlled.

本発明に係る固定化方法では、第二の化合物の固定化と、細胞付着防止膜の形成とは、いずれを先に行ってもよいが、正確なパターニングが容易に行える方を先に行うことが好ましい。以下、細胞付着防止膜を先に形成する場合について説明する。   In the immobilization method according to the present invention, either the immobilization of the second compound or the formation of the cell adhesion-preventing film may be performed first, but one that can easily perform accurate patterning is performed first. Is preferred. Hereinafter, a case where the cell adhesion preventing film is formed first will be described.

細胞付着防止膜の材料は上述の通りであり、説明を省略する。かかる細胞付着防止膜の形成方法は特に限定されないが、例えば、細胞付着防止化合物を含む液滴を、細胞を固定化するパターンを除く領域に吐出する方法によって行うことができる。また、細胞付着防止膜を、まず固相表面全体に形成し、その後、細胞を固定化するパターン状に、細胞付着防止膜を除去することによって行うこともできる。   The material of the cell adhesion preventing film is as described above, and the description is omitted. The method for forming such a cell adhesion preventing film is not particularly limited. For example, the cell adhesion preventing film can be formed by discharging a droplet containing a cell adhesion preventing compound to a region excluding a pattern for immobilizing cells. Alternatively, the cell adhesion preventing film can be formed first on the entire solid surface, and then the cell adhesion preventing film is removed in a pattern for immobilizing cells.

後者の方法の場合、例えば、上述の方法によって細胞付着防止膜を固相表面全体に形成し、細胞を固定化するパターン状に開口を設けたマスクを用いて、放射エネルギー線、好ましくは紫外線を照射することによって、細胞付着防止化合物の原子間結合を切断し、細胞付着防止膜を除去することが可能である。   In the case of the latter method, for example, a cell adhesion prevention film is formed on the entire solid surface by the above-described method, and a radiant energy ray, preferably ultraviolet rays, is used, using a mask provided with an opening in a pattern for immobilizing cells. By irradiating, it is possible to break the interatomic bond of the cell adhesion preventing compound and remove the cell adhesion preventing film.

上記方法によって細胞付着防止膜のパターンを形成した後、第二の化合物を、固相表面に固定化する。第二の化合物を含む液滴を、細胞を固定化するパターンに従って固相表面に吐出してもよいし、第二の化合物を含む溶液に、細胞付着防止膜をパターンにそって形成した固相表面を接触させてもよい。   After the cell adhesion preventing film pattern is formed by the above method, the second compound is immobilized on the solid phase surface. A droplet containing the second compound may be discharged onto the surface of the solid phase according to a pattern for immobilizing cells, or a solid phase in which a cell adhesion preventing film is formed along the pattern in a solution containing the second compound. The surface may be contacted.

さらに、本発明に係る固定化工程は、第一の化合物との結合部位に保護基が結合された第二の化合物を固定化する工程と、細胞を固定化するパターンに従って、この保護基を脱離させる工程と、を含むものであってもよい。保護基が反応性の官能基を保護することによって、より多様な溶媒に化合物を溶解させることが可能となり、きれいにパターニングすることができる。また、第一の化合物を反応させる直前に脱保護誘発剤によって反応性の高い官能基を固相表面にもたせることで、第一の化合物との反応をすばやく、しかも再現性良く行うことが可能となる。その結果、きれいな形状で第一の化合物のパターンを形成することが出来る。   Furthermore, the immobilization step according to the present invention comprises removing the protective group according to the step of immobilizing the second compound having a protective group bound to the binding site with the first compound and the pattern of immobilizing cells. And a step of separating them. When the protective group protects the reactive functional group, the compound can be dissolved in a wider variety of solvents, and the patterning can be performed cleanly. In addition, the reaction with the first compound can be carried out quickly and with good reproducibility by applying a highly reactive functional group to the solid phase surface by the deprotection inducer immediately before reacting the first compound. Become. As a result, the pattern of the first compound can be formed in a clean shape.

保護基としては、例えば、第一の化合物との結合部位がアミノ基の場合には、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が好適である。Ｆｍｏｃを用いて保護する場合、まず上述の方法で、Ｆｍｏｃ付きの第二の化合物を固相表面全体に固定化した後、細胞を固定化するパターン通りに脱保護を行う。Ｆｍｏｃの場合、脱保護は、脱保護誘発剤として、エタノールアミン等の塩基性溶液を接触させることによって行うことができるので、例えば塩基性溶液の液滴を、細胞を固定化するパターンに従って吐出すればよい。   As the protective group, for example, when the binding site with the first compound is an amino group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) is preferable. When protecting with Fmoc, first, the second compound with Fmoc is immobilized on the entire solid surface by the method described above, and then deprotected according to a pattern for immobilizing cells. In the case of Fmoc, deprotection can be performed by contacting a basic solution such as ethanolamine as a deprotection inducing agent. Therefore, for example, a droplet of the basic solution is ejected according to a pattern for immobilizing cells. That's fine.

なお、保護基は、それ自体、固相表面で細胞付着防止膜の機能を果たすものが好ましく、これにより、脱保護しない領域をそのまま細胞付着防止膜とすることができる。   The protective group itself preferably functions as a cell adhesion preventing film on the surface of the solid phase, so that a region that is not deprotected can be used as it is as a cell adhesion preventing film.

また、上記保護基を脱離させる工程は、細胞を固定化するパターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、保護基を有する第二の化合物を除去する工程と、除去した領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、上記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含んでもよい。   The step of removing the protecting group includes irradiating a region excluding the pattern for immobilizing cells with radiant energy rays to remove the second compound having the protecting group, and attaching the cell to the removed region. You may include the process of forming a prevention film, and the process of making a deprotection induction compound react with the 2nd compound left in the said pattern shape.

本発明に係る固定化方法では、上述した固定化工程後に、前記第一の化合物を含む液滴を第二の化合物のパターンに従って吐出することにより、第一の化合物を所望のパターン通りに固定化することができる。この場合、第一の化合物を含む液滴は、美しい細線状に吐出する必要がないので、比較的多い量の液滴を吐出でき、該液滴が乾燥するまでの時間を延ばすことができる。これにより第一の化合物と第二の化合物との反応時間をより長く確保することが可能となり、第一の化合物が好適に固定化される。   In the immobilization method according to the present invention, after the above-described immobilization step, the first compound is immobilized in a desired pattern by discharging droplets containing the first compound according to the pattern of the second compound. can do. In this case, since the droplet containing the first compound does not need to be ejected into a beautiful fine line, a relatively large amount of the droplet can be ejected, and the time until the droplet is dried can be extended. This makes it possible to secure a longer reaction time between the first compound and the second compound, and the first compound is suitably immobilized.

また、第一の化合物の固定化は、前記第一の化合物を含む溶液に、固相表面を接触させることによっても行うことができる。すでに第二の化合物が固相表面に固定化されているので、この固相表面を、第一の化合物を含む溶液に浸漬させることによって、容易に第一の化合物を固定化することができる。かかる方法によれば第一の化合物の供給方法が簡便であり、また第一の化合物と第二の化合物とが液相で反応できる時間を長く確保することができるという利点もある。   The first compound can also be immobilized by bringing the solid phase surface into contact with the solution containing the first compound. Since the second compound has already been immobilized on the solid phase surface, the first compound can be easily immobilized by immersing the solid phase surface in a solution containing the first compound. According to such a method, there is an advantage that the method for supplying the first compound is simple and it is possible to ensure a long time during which the first compound and the second compound can react in the liquid phase.

第一の化合物を固定化した後、例えば、細胞を含む溶液に固相表面を接触させることによって、細胞を固定化することができる。細胞を含む溶液に固相表面を浸漬させてもよく、細胞を含む溶液を固相表面に塗布しても良い。余分な細胞は、第一の化合物に結合しないので、洗浄除去することができる。   After immobilizing the first compound, the cells can be immobilized, for example, by bringing the solid phase surface into contact with a solution containing the cells. The solid surface may be immersed in a solution containing cells, or a solution containing cells may be applied to the solid surface. Excess cells do not bind to the first compound and can be washed away.

また、本発明は、上述の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイを提供する。かかる細胞アレイは、所望の微細なパターンに沿って生きたまま細胞が固定化され、このまま培養し、細胞を増殖させることができる。このような細胞アレイは、例えば、細胞を培養して生体組織の代替物を得る目的で用いることもできるし、また発現解析用バイオセンサとしても利用可能であり有用である。   The present invention also provides a cell array in which cells are immobilized using the above-described immobilization method. In such a cell array, the cells are immobilized while alive along a desired fine pattern, and the cells can be cultured and grown as they are. Such a cell array can be used, for example, for the purpose of culturing cells to obtain a substitute for living tissue, and can also be used as a biosensor for expression analysis.

以下に示す本発明の実施例は、例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。   The following examples of the present invention are illustrative, and the present invention is not limited to the following specific examples. Those skilled in the art can make various modifications to the embodiments shown below to fully implement the present invention, and such modifications are included in the scope of the claims of the present application.

第二の化合物としてウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）を、第一の化合物としてＢＡＭのうち下記式（１） The second bovine serum albumin as the compound (B ovine S erum A lbumin: BSA) and the following formula of the BAM as the first compound (1)

Figure 2005269902
で表される化合物Ｅ２９０を用いて、本発明に係る固定化方法に従って細胞を固相表面に固定化した。ＢＳＡは表面にアミノ基を有し、Ｅ２９０のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基と反応して、Ｅ２９０を固相表面に固定化することができる。
Figure 2005269902
 In accordance with the immobilization method according to the present invention, cells were immobilized on the solid surface using the compound E290 represented by BSA has an amino group on its surface and can react with the N-hydroxysuccinimide group of E290 to immobilize E290 on the solid surface.

図１に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。固相表面としてガラス基板１０を用い、このガラス基板表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を１０分間照射して、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより基板１０表面の液体に対する濡れ性が高まり、ＢＳＡのパターンがきれいに作製できるようになる。ガラス基板の水に対する接触角は１０度以下となった。 FIG. 1 is a process chart for explaining the cell immobilization method in this example. The glass substrate 10 was used as the solid surface, and the glass substrate surface was irradiated with 254 nm UV light (10 mW / cm 2 ) for 10 minutes to perform ozone cleaning of the substrate surface. As a result, the wettability of the surface of the substrate 10 with respect to the liquid is increased, and the BSA pattern can be produced neatly. The contact angle of the glass substrate with respect to water was 10 degrees or less.

次に、図１（Ａ）に示すように、インクジェット式吐出装置を用いて、ＢＳＡ溶液１２（１％リン酸バッファ溶媒）を基板１０表面に、ライン＆ピッチパターン（等間隔にラインが並んだパターン）に吐出した。ラインの幅は50μｍ、ピッチは50μｍとした。   Next, as shown in FIG. 1 (A), the BSA solution 12 (1% phosphate buffer solvent) is arranged on the surface of the substrate 10 by using an ink jet discharge device, and lines are arranged at equal intervals. Pattern). The line width was 50 μm and the pitch was 50 μm.

ＢＳＡ溶液が乾燥した後、同図（Ｂ）に示すように、ＢＳＡのパターンに従って、ＢＡＭ溶液１４をインクジェット式吐出装置を用いて吐出し、ＢＳＡとＢＡＭを反応させた。ＢＡＭ溶液は、溶媒にＤＭＳＯを用いて、ＢＡＭ５４ｍＭとし、トリエチルアミンを少量添加した。ＢＡＭは、ＢＳＡのパターンが全てカバーされるように、十分な量吐出した。   After the BSA solution was dried, as shown in FIG. 5B, the BAM solution 14 was discharged using an ink jet type discharge device in accordance with the BSA pattern, and BSA and BAM were reacted. The BAM solution was made into BAM 54 mM using DMSO as a solvent, and a small amount of triethylamine was added. A sufficient amount of BAM was discharged so that the entire BSA pattern was covered.

ＢＡＭ溶液の乾燥後、同図（Ｃ）に示すように、ＢＡＭパターン上に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。   After drying the BAM solution, as shown in FIG. 5C, the cells were fixed in a line by contacting the solution in which the cells 20 were dispersed on the BAM pattern.

ＢＡＭとＢＳＡの反応はＳＡＭの形成よりもゆっくりと進行する。ＢＡＭ溶液の溶媒であるＤＭＳＯは、表面張力が高く、接触角のヒステリシスも小さいので、反応が終わらないうちに液体が移動しやすく液滴が収縮してしまうため、ライン状のパターンを描くのが難しい。一方、ＢＳＡ溶液は、高分子の溶液であるため濃度調節することによりパターンの形状や膜の厚みを制御することができ、１％の高濃度ＢＳＡ溶液を吐出することで、
途中で途切れないきれいなパターンを描くことができる。従って、ＢＡＭもきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。 The reaction between BAM and BSA proceeds more slowly than SAM formation. DMSO, the solvent of BAM solution, has a high surface tension and a small contact angle hysteresis. Therefore, the liquid tends to move before the reaction is completed, and the liquid droplet contracts. difficult. On the other hand, since the BSA solution is a polymer solution, it is possible to control the pattern shape and the film thickness by adjusting the concentration, and by discharging a 1% high concentration BSA solution,
It is possible to draw a clean pattern that is uninterrupted along the way. Accordingly, BAM is also immobilized in a clean pattern, and as a result, cells can also be immobilized in a desired pattern.

図２に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。   FIG. 2 shows a process chart for explaining the cell immobilization method in this example.

本実施例では、まず、図２（Ａ）に示すように、金を蒸着されたガラス基板１０上に、細胞付着防止膜として、ＰＥＧチオール［ＨＳ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2ＣＨ2）7−ＯＨ］膜１８を形成した。ＰＥＧチオールは、１ｍＭのエタノール溶液とし、基板１０表面における細胞を固定するパターンを除く領域に、インクジェット法により吐出した。これにより、ＰＥＧチオールのチオール基と金とが反応して、ＳＡＭが形成された。本実施例で用いた溶媒はエタノールであるため非常に揮発性が高いが、チオール化合物の金に対する反応性が非常に高いため、短時間でもＰＥＧチオールのパターンが形成できた。 In this example, first, as shown in FIG. 2A, a PEG thiol [HS—CH 2 — (OCH 2 CH 2 ) 7 — as a cell adhesion preventing film is formed on a glass substrate 10 on which gold is deposited. OH] film 18 was formed. PEG thiol was made into a 1 mM ethanol solution, and was ejected to the region excluding the pattern for fixing cells on the surface of the substrate 10 by an ink jet method. Thereby, the thiol group of PEG thiol and gold reacted to form SAM. Since the solvent used in this example is ethanol, it is very volatile. However, since the reactivity of the thiol compound to gold is very high, a PEG thiol pattern could be formed even in a short time.

次に、図２（Ｂ）に示すように、ＰＥＧチオールを吐出しなかった領域に、第二の化合物として、アミノＰＥＧ−チオール［ＨＳ−Ｃ2Ｈ4−ＣＯＮＨ−Ｃ2Ｈ4−（ＯＣＨ2ＣＨ2）7−ＮＨ2］１２を固定化した。アミノＰＥＧ−チオールは、１ｍＭのエタノール溶液として、インクジェット法により基板１０表面に吐出した。 Next, as shown in FIG. 2 (B), the area not eject PEG thiols, as the second compound, amino PEG- thiol [HS-C 2 H 4 -CONH -C 2 H 4 - (OCH 2 CH 2) 7 -NH 2] 12 was immobilized. Amino PEG-thiol was discharged onto the surface of the substrate 10 by an inkjet method as a 1 mM ethanol solution.

乾燥後、図２（Ｃ）に示すように、アミノＰＥＧ−チオールのパターン１２に従って、ＢＡＭ溶液１４をインクジェット式吐出装置を用いて吐出し、アミノ基とＢＡＭを反応させた。ＢＡＭ溶液は、溶媒にＤＭＳＯを用いて、５４ｍＭとし、トリエチルアミンを少量添加した。ＢＡＭは、ＢＳＡのパターンが全てカバーされるように、十分な量吐出した。   After drying, as shown in FIG. 2C, according to the amino PEG-thiol pattern 12, the BAM solution 14 was ejected using an ink jet ejection device to react the amino group with BAM. The BAM solution was made 54 mM using DMSO as a solvent, and a small amount of triethylamine was added. A sufficient amount of BAM was discharged so that the entire BSA pattern was covered.

ＢＡＭ溶液の乾燥後、図２（Ｄ）に示すように、ＢＡＭパターン１４に、細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。   After the BAM solution was dried, as shown in FIG. 2D, the cells were fixed in a line by bringing the BAM pattern 14 into contact with the solution in which the cells 20 were dispersed.

このような方法によれば、ＰＥＧ−チオールおよびアミノＰＥＧ−チオールは、金基板にすばやく反応してＳＡＭを形成するため、途中で途切れないきれいなパターンを描くことができる。従って、ＢＳＡパターン上に固定化されるＢＡＭも、よりきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。   According to such a method, since PEG-thiol and amino PEG-thiol react quickly with a gold substrate to form SAM, it is possible to draw a clean pattern that is not interrupted. Therefore, the BAM immobilized on the BSA pattern is also immobilized in a cleaner pattern, and as a result, the cells can also be immobilized in a desired pattern.

また、高い親水性を示す付着保護膜を形成しておくことによって、細胞がこの領域に付着しなくなるので、より正確に細胞を固定化することができる。   In addition, by forming an adhesion protective film exhibiting high hydrophilicity, the cells do not adhere to this region, so that the cells can be more accurately immobilized.

図３に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。   FIG. 3 is a process chart for explaining the cell immobilization method in this example.

本実施例では、まず、ガラス基板１０表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を大気中で１０分間照射し、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより、ガラス表面の有機物が除去されて清浄な表面が得られた。このとき、基板表面は極めて親水的で、水の接触角は５度以下であった。 In this example, first, the surface of the glass substrate 10 was irradiated with 254 nm UV light (10 mW / cm 2 ) in the atmosphere for 10 minutes to perform ozone cleaning of the substrate surface. Thereby, the organic substance on the glass surface was removed, and a clean surface was obtained. At this time, the substrate surface was extremely hydrophilic and the contact angle of water was 5 degrees or less.

次に、基板１０を、１２０℃で、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）の蒸気に２時間接触させ、図３（Ａ）に示すように緻密なアミノ基の表面膜３０を気相法によって得た。   Next, the substrate 10 is brought into contact with vapor of aminopropyltriethoxysilane (APTS) at 120 ° C. for 2 hours to obtain a dense amino group surface film 30 by a vapor phase method as shown in FIG. It was.

続いて、同図（Ｂ）に示すように、表面膜３０に対して、マスク３２を通して図中の矢印の方向に１７２ｎｍのエキシマＵＶを１５分間照射し、基板表面のアミノ基を部分的に分解して不活性化した領域３４を得た。エキシマＵＶの照射は、アミノ基が酸化しないよう、Ｎ2雰囲気中で行った。 Subsequently, as shown in FIG. 5B, the surface film 30 is irradiated with excimer UV of 172 nm in the direction of the arrow in the drawing for 15 minutes through the mask 32, and the amino group on the substrate surface is partially decomposed. Thus, an inactivated region 34 was obtained. Excimer UV irradiation was performed in an N 2 atmosphere so that the amino group was not oxidized.

図３（Ｃ）に示すように、こうして得られた基板１０を、ＢＡＭのＤＭＳＯ溶液（５４ｍＭ）に５〜１０分浸漬することによって、アミノ基が活性な領域にのみＢＡＭ１４が固定化される。   As shown in FIG. 3C, by immersing the substrate 10 thus obtained in a BAM DMSO solution (54 mM) for 5 to 10 minutes, the BAM 14 is immobilized only in the region where the amino group is active.

ＢＡＭ溶液の乾燥後、図３（Ｄ）に示すように、ＢＡＭパターン１４に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。   After drying the BAM solution, as shown in FIG. 3D, the cells were fixed in a line by bringing the BAM pattern 14 into contact with a solution in which the cells 20 were dispersed.

このような方法によれば、マスクを使用して放射エネルギー線を照射することにより、アミノ基を有する膜を正確にパターニングすることができる。従って、アミノ基のパターン上に固定化されるＢＡＭも、よりきれいなパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。   According to such a method, the film | membrane which has an amino group can be patterned correctly by irradiating a radiant energy ray using a mask. Therefore, BAM immobilized on the amino group pattern is also immobilized in a cleaner pattern, and as a result, cells can also be immobilized in a desired pattern.

図４に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。   FIG. 4 is a process chart for explaining the cell immobilization method in this example.

本実施例では、まず、金蒸着されたガラス基板１０表面に２５４ｎｍのＵＶ光（１０ｍＷ／ｃｍ2）を大気中で１０分間照射し、基板表面のオゾン洗浄を行った。これにより、ガラス表面の有機物が除去されて清浄な表面が得られた。 In this example, first, the surface of the glass substrate 10 on which gold was deposited was irradiated with 254 nm UV light (10 mW / cm 2 ) in the atmosphere for 10 minutes to clean the substrate surface with ozone. Thereby, the organic substance on the glass surface was removed, and a clean surface was obtained.

次に、図４（Ａ）に示すように、基板１０を、ＰＥＧチオールの１ｍＭエタノール溶液に１〜２４時間浸漬することによって、ＰＥＧチオールによる細胞付着防止膜４２を形成した。   Next, as shown in FIG. 4A, the substrate 10 was immersed in a 1 mM ethanol solution of PEG thiol for 1 to 24 hours to form a cell adhesion prevention film 42 by PEG thiol.

続いて、同図（Ｂ）に示すように、Ｎ2雰囲気中で、付着防止膜４２に対して、マスク４４を用いて１７２ｎｍのエキシマＵＶを１５分間照射する。照射された領域ではＡｕ−Ｓ結合が切れてＰＥＧチオールが基板からはずれ、再び金表面が露出したので、図４（Ｃ）に示すように、基板１０をアミノＰＥＧチオールの１ｍＭエタノール溶液に３０分間浸漬し、露出した金表面にＳＡＭ４６を形成した。 Subsequently, as shown in FIG. 5B, excimer UV of 172 nm is irradiated for 15 minutes to the adhesion preventing film 42 using a mask 44 in an N 2 atmosphere. In the irradiated region, the Au—S bond was broken and PEG thiol was detached from the substrate, and the gold surface was exposed again. Therefore, as shown in FIG. 4C, the substrate 10 was immersed in a 1 mM ethanol solution of amino PEG thiol for 30 minutes. Immersion and SAM46 was formed on the exposed gold surface.

一旦基板を乾燥させた後、図４（Ｄ）に示すように、この基板をＢＡＭのＤＭＳＯ溶液に浸漬することにより、アミノＰＥＧチオールにより形成されたＳＡＭ４６上に、ＢＡＭ１４が固定化される。   Once the substrate is dried, as shown in FIG. 4D, the substrate is immersed in a DMSO solution of BAM, so that the BAM 14 is immobilized on the SAM 46 formed by amino PEG thiol.

ＢＡＭ溶液の乾燥後、図４（Ｅ）に示すように、ＢＡＭパターン状に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。   After drying the BAM solution, as shown in FIG. 4 (E), the cells were fixed in a line by contacting with a solution in which the cells 20 were dispersed in a BAM pattern.

このような方法によれば、マスクを使用して放射エネルギー線を照射することにより、付着防止膜、ひいてはアミノ基を有する膜を正確にパターニングすることができる。従って、アミノ基のパターン上に固定化されるＢＡＭも、より美しいパターンで固定化されるので、その結果、細胞も所望のパターンに固定化することができる。   According to such a method, it is possible to accurately pattern an adhesion preventing film, and thus a film having an amino group, by irradiating a radiant energy ray using a mask. Therefore, BAM immobilized on the amino group pattern is also immobilized in a more beautiful pattern, and as a result, cells can also be immobilized in a desired pattern.

基板を、ＢＡＭ溶液に浸漬させるので、ＢＡＭとアミノ基とを、液相で十分に反応させることができる。   Since the substrate is immersed in the BAM solution, BAM and amino groups can be sufficiently reacted in the liquid phase.

図５に本実施例における細胞固定化方法を説明する工程図を示す。   FIG. 5 is a process diagram for explaining the cell immobilization method in this example.

図５（Ａ）に示すように、金蒸着した基板１０を、N-Fmoc-Aminoundecanethiolの０．１ｍＭエタノール溶液に浸漬し、N-Fmoc-Aminoundecanethiolの薄膜５２を形成した。   As shown in FIG. 5A, the gold-deposited substrate 10 was immersed in a 0.1 mM ethanol solution of N-Fmoc-Aminoundecanethiol to form a thin film 52 of N-Fmoc-Aminoundecanethiol.

続いて、同図（Ｂ）に示すように、インクジェット法によって、脱保護誘発溶液Tris(2-aminoethyl)amine1Ｍ/ dimethylformamide溶液）５４を、基板に対してライン状（50μｍ）に供給し、同図（Ｃ）に示すように、脱保護され、活性なアミノ基が露出した領域５６を得た。dimethylformamideは蒸気圧が高いために液滴が乾燥しやすく、５０μｍ程度の液滴であれば１分程度で乾燥してしまう。脱保護には５分程度の接触時間が必要であるため、１分置きに重ね打ちすることで活性なアミノ基表面を得た。   Subsequently, as shown in FIG. 5B, the deprotection induction solution Tris (2-aminoethyl) amine 1M / dimethylformamide solution) 54 is supplied in a line shape (50 μm) to the substrate by the ink jet method. As shown in (C), a region 56 that was deprotected and exposed an active amino group was obtained. Since dimethylformamide has a high vapor pressure, the droplets are easy to dry, and a droplet of about 50 μm will dry in about 1 minute. Since contact time of about 5 minutes is required for deprotection, an active amino group surface was obtained by overstrike every other minute.

次に、基板１０をＢＡＭのＤＭＳＯ溶液に浸漬することにより、図５（Ｄ）に示すように、ＢＡＭ１４が固定化された。   Next, by immersing the substrate 10 in a DMSO solution of BAM, as shown in FIG. 5D, the BAM 14 was fixed.

ＢＡＭ溶液の乾燥後、図５（Ｅ）に示すように、ＢＡＭパターン状に細胞２０を分散させた溶液を接触させることにより、細胞がライン状に固定化された。   After drying the BAM solution, as shown in FIG. 5 (E), the cells were fixed in a line by contacting with a solution in which the cells 20 were dispersed in a BAM pattern.

このような方法によれば、塩基性溶液は、ＢＡＭ溶液よりもインクジェット法によってきれいなパターンを描くことができる溶媒を用いているので、ＢＡＭ溶液を直接基板に吐出するよりも、より美しいパターンでＢＡＭを固定化できる。   According to such a method, since the basic solution uses a solvent that can draw a clean pattern by the inkjet method than the BAM solution, the BAM has a more beautiful pattern than the BAM solution directly discharged onto the substrate. Can be fixed.

また、基板をＢＡＭ溶液に浸漬させるので、ＢＡＭとアミノ基とが液相で反応する時間を十分に確保することができる。   In addition, since the substrate is immersed in the BAM solution, it is possible to ensure a sufficient time for BAM and amino groups to react in the liquid phase.

本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示すThe process drawing explaining an example of the cell fixing method which concerns on this invention is shown. 本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示すThe process drawing explaining an example of the cell fixing method which concerns on this invention is shown. 本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示すThe process drawing explaining an example of the cell fixing method which concerns on this invention is shown. 本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示すThe process drawing explaining an example of the cell fixing method which concerns on this invention is shown. 本発明に係る細胞固定化方法の一例を説明する工程図を示すThe process drawing explaining an example of the cell fixing method which concerns on this invention is shown.

符号の説明Explanation of symbols

１０…基板、１２、３０、４６、５６…第二の化合物、１４…第一の化合物、１８、４２…細胞付着防止膜、２０…細胞、５４…脱保護誘発液 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Board | substrate, 12, 30, 46, 56 ... 2nd compound, 14 ... 1st compound, 18, 42 ... Cell adhesion prevention film, 20 ... Cell, 54 ... Deprotection induction liquid

Claims (18)

細胞に親和性を有する第一の化合物を用いて、固相表面に所望のパターンで細胞を固定化する固定化方法であって、
前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位を有し、かつ前記第一の化合物より前記固相表面に固定化しやすい第二の化合物を、前記パターンに従って前記固相表面に固定化する固定化工程を少なくとも含む、方法。 An immobilization method of immobilizing cells in a desired pattern on a solid surface using a first compound having affinity for cells,
Immobilization of immobilizing a second compound having a molecular binding site capable of binding to the first compound and more easily immobilized on the solid phase surface than the first compound on the solid phase surface according to the pattern A method comprising at least a step. 前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に自己組織化単分子膜を形成しうる基板結合部位を有する化合物である、請求項１に記載の方法。   2. The compound according to claim 1, wherein the second compound is a compound having a molecular binding site capable of binding to the first compound and a substrate binding site capable of forming a self-assembled monolayer on the surface of the solid phase substrate. the method of. 前記第二の化合物が、前記第一の化合物に結合しうる分子結合部位と、固相基板表面に物理吸着して不溶性の薄膜を形成しうる高分子部位を有する化合物である、請求項１に記載の方法。   2. The compound according to claim 1, wherein the second compound is a compound having a molecular binding site capable of binding to the first compound and a polymer site capable of being physically adsorbed on the surface of the solid phase substrate to form an insoluble thin film. The method described. 前記分子結合部位がアミノ基である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the molecular binding site is an amino group. 前記固定化工程が、前記第二の化合物を含む液滴を、前記固相表面に前記パターンに従って吐出することによって行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。   The immobilization method according to any one of claims 1 to 4, wherein the immobilization step is performed by discharging a droplet containing the second compound onto the solid phase surface according to the pattern. 前記固定化工程が、
前記第二の化合物を前記固相表面全体に固定化する工程と、
前記パターンを残して、前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。 The immobilization step includes
Immobilizing the second compound on the entire solid surface; and
The immobilization method according to any one of claims 1 to 4, comprising a step of leaving the pattern and inactivating a molecular binding site of the second compound. 前記第二の化合物の分子結合部位を不活性化する工程が、前記第二の化合物に放射エネルギー線を照射することによって行われる、請求項６に記載の固定化方法。   The immobilization method according to claim 6, wherein the step of inactivating the molecular binding site of the second compound is performed by irradiating the second compound with radiant energy rays. 前記固定化工程の後、前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する、請求項１から７のいずれか１項に記載の固定化方法。   The immobilization method according to any one of claims 1 to 7, wherein a cell adhesion prevention film is formed in a region excluding the pattern after the immobilization step. 前記固定化工程が、
前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程と、
前記パターンに従って、前記第二の化合物を固定化する工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。 The immobilization step includes
Forming a cell adhesion preventing film in a region excluding the pattern;
The immobilization method according to any one of claims 1 to 4, comprising a step of immobilizing the second compound according to the pattern. 前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、
細胞付着防止化合物を含む液滴を、前記パターンを除く領域に吐出することによって行われる請求項９に記載の固定化方法。 Forming a cell adhesion preventing film in the region excluding the pattern,
The immobilization method according to claim 9, wherein the immobilization method is performed by discharging a droplet containing a cell adhesion preventing compound to an area excluding the pattern. 前記パターンを除く領域に細胞付着防止膜を形成する工程が、
前記固相表面全体に細胞付着防止膜を形成する工程と、
前記パターンに従って、前記細胞付着防止化合物を除去する工程と、を含む、請求項９に記載の固定化方法。 Forming a cell adhesion preventing film in the region excluding the pattern,
Forming a cell adhesion preventing film on the entire solid surface;
Removing the cell adhesion preventing compound according to the pattern. 前記細胞付着防止膜を除去する工程が、前記細胞付着防止膜に放射エネルギー線を照射することによって行われる、請求項１１に記載の固定化方法。   The immobilization method according to claim 11, wherein the step of removing the cell adhesion preventing film is performed by irradiating the cell adhesion preventing film with radiant energy rays. 前記細胞付着防止膜が、ポリエチレングリコール、糖、ポリエステル、ポリイソシアネートをふくむ、請求項８から１２のいずれか１項に記載の固定化方法。   The immobilization method according to any one of claims 8 to 12, wherein the cell adhesion preventing film includes polyethylene glycol, sugar, polyester, and polyisocyanate. 前記固定化工程が、
前記結合部位に保護基が結合された前記第二の化合物を、前記固相表面全体に固定化する工程と、
前記パターンに従って、前記保護基を脱離させる工程と、を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の固定化方法。 The immobilization step includes
Immobilizing the second compound having a protecting group bound to the binding site over the entire solid surface;
The immobilization method according to any one of claims 1 to 4, further comprising a step of removing the protecting group according to the pattern. 前記保護基を脱離させる工程が、
前記パターンに従って、前記第二の化合物に脱保護誘発化合物を含む液滴を吐出することによって行われる、請求項１４に記載の固定化方法。 Removing the protecting group comprises:
The immobilization method according to claim 14, wherein the immobilization method is performed by discharging a droplet containing a deprotection-inducing compound on the second compound according to the pattern. 前記保護基を脱離させる工程が、
前記パターンを除く領域に放射エネルギー線を照射して、前記第二の化合物を除去する工程と、
前記パターン状に残された第二の化合物に脱保護誘発化合物を反応させる工程と、を含む請求項１４に記載の固定化方法。 Removing the protecting group comprises:
Irradiating a region excluding the pattern with radiant energy rays to remove the second compound;
And a step of reacting the second compound left in the pattern with a deprotection-inducing compound. 前記放射エネルギー線が、紫外線などの電磁波、電子線、イオンビームである、請求項７、１２および１６のいずれか１項に記載の固定化方法。   The immobilization method according to claim 7, wherein the radiant energy rays are electromagnetic waves such as ultraviolet rays, electron beams, or ion beams. 請求項１から１７のいずれか１項に記載の固定化方法を用いて細胞が固定化された、細胞アレイ。   The cell array by which the cell was fix | immobilized using the fixing method of any one of Claim 1 to 17.
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