【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液、尿などの生体試料、食品工業における原料や製品、さらには果汁などの試料に含まれる基質（特定成分）を、高精度で迅速かつ容易に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料および食品中の特定成分（基質）を、試料の希釈および撹拌などを行うことなく簡易に定量しうるバイオセンサが提案されている。その一例として、特許文献１には、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法によって電極系を形成し、この電極系上に酸化還元酵素および電子伝達体（電子受容体）を含有する反応層を形成したバイオセンサが開示されている。
【０００３】
このバイオセンサは、以下のようにして試料中の基質濃度を定量する。まず、試料液をバイオセンサの反応層上に滴下することにより、反応層が溶解し、試料液中の基質と反応層の酸化還元酵素との間で酵素反応が進行する。この酵素反応に伴い、電子伝達体が還元される。一定時間後、センサの電極に電圧を印加して、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を定量することができる。
【０００４】
しかし、このような構成のバイオセンサの反応層は、水溶性の成分を含む溶液を滴下し、乾燥することによって作製され、薄膜として作製することが困難であった。また、反応層を乾燥させる際に、表面と内部の乾燥状態を均一にすることが困難であり、表面の乾燥状態によってセンサとしての性能が変わるという欠点があった。そのため、反応層中に存在する酵素量は、定量する試料に含まれる基質量と比較して過剰であった。また、反応層に含まれる試薬の量が多いため、試薬層の溶解に時間がかかるという欠点があった。
【０００５】
一方、特許文献２には、試料液供給路の内面上に少なくとも電子伝達体を含む第一の反応層を形成し、試料液供給路の内面上に形成された前記第一の反応層に直接接触しない位置関係をもって形成されたバイオセンサが開示されている。しかし、これらの第一の反応層と第二の反応層に含まれる物質の溶解性の差が大きい場合、双方の反応層の溶解時間が異なることによるセンサの反応性の低下が起こるという欠点があった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平３−２０２７６４号公報
【特許文献２】
特開２００１−２０８７１６号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上の従来技術の内容に鑑み、本発明は、少量の試料液によっても酵素を含む反応層が速やかに溶解し、酵素反応を有効に利用することができ、応答特性の良好なバイオセンサを提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような反応層を容易に形成することのできるバイオセンサを提供することをも目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は、電気絶縁性の基板、前記基板上に形成された作用極と対極とを有する電極系、および前記電極系を含む試料液供給路を具備し、さらに、前記試料液供給路内に形成された電子伝達体を含む第一の反応層、および前記試料液供給路内に前記第一の反応層と分離して形成された酵素と微粒子とを含む第二の反応層を具備することを特徴とするバイオセンサを提供する。
【０００９】
前記微粒子の平均直径が０．１μｍ以上１μｍ未満であるのが好ましい。
また、前記微粒子を構成する材料としては、高分子化合物、セラミック、ガラス、ダイヤモンドおよびカーボンなどが挙げられる。
【００１０】
前記第二の反応層には、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素、およびコレステロールエステラーゼを含ませることができる。
【００１１】
また、前記第二の反応層には、グルコースオキシダーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼよりなる群から選択される少なくとも１種の酵素を含ませることができる。
また、前記第一の反応層および／または前記第二の反応層が界面活性剤を含むのが好ましい。
また、前記第二の反応層に含まれる前記微粒子の量が、第二の反応層の５〜９９体積％であるのが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明に係るバイオセンサは、電気絶縁性の基板、前記基板上に形成された作用極と対極とを有する電極系、および前記電極系を含む試料液供給路を具備し、さらに、前記試料液供給路内に形成された電子伝達体を含む第一の反応層、および前記試料液供給路内に前記第一の反応層と分離して形成された酵素と微粒子とを含む第二の反応層を具備することを特徴とする。
【００１３】
本発明に係るバイオセンサは、試料液供給路内に形成された電子伝達体を含む第一の反応層、および試料液供給路内に前記第一の反応層と分離して形成された酵素と微粒子とを含む第二の反応層を有する点に最大の特徴を有する。
【００１４】
第一の反応層は、少なくとも電子伝達体を含む水溶液を試料液供給路の内面に塗布して乾燥して形成する方法をとるのが良い。
電子伝達体としては、例えばフェリシアン化物塩、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体などが挙げられる。電子伝達体としては、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００１５】
つぎに、第二の反応層は、第二の反応層を形成するための液、好ましくは酵素を含む水溶液に前記微粒子を分散し、試料液供給路の内面上における前記第一の反応層と直接接しない位置に、得られる液を塗布、乾燥して形成する方法をとるのが良い。
ここで用いる微粒子の平均直径は、０．１μｍ以上１μｍ未満であることが好ましい。ここに用いる微粒子としては、高分子化合物、シリカ、アルミナ、酸化チタンなどのセラミック、ガラス、ダイヤモンド、およびカーボンなどが挙げられる。
【００１６】
この場合、微粒子の平均粒径が１μｍを超えると、第二の反応層を形成するための液における微粒子の分散性に劣り、常に攪拌をすることが必要となり、製造工程が複雑となる。
また、微粒子の分散状態が不均一な液を用いて第二の反応層を形成すると、得られる第二の反応層が不均一となり、第二の反応層全体が速やかには溶解せず、センサの応答特性が低下する。
【００１７】
また、微粒子の平均粒径が０．１μｍより小さいと、得られる第二の反応層における微粒子間の間隙が狭くなり、酵素の表面積を増加する効果が得られない。
平均直径０．１μｍ以上１μｍ未満の微粒子を用いることにより、微粒子が第二の反応層を形成する酵素層内に微細な空隙を形成し、これによってセンサに供給される試料液が第二の反応層内に酵素を溶解しながら速やかに浸透する。その結果、第二の反応層は速やかに試料液に溶解し、酵素反応が迅速に進行する。そのため応答特性にばらつきを生じることなく、高精度の測定が可能となる。
【００１８】
第二の反応層に含む微粒子の量は、微粒子表面に薄く酵素層が形成されるように、第二の反応層の体積比で５〜９９％が適当であり、試料液に容易に溶解する多孔性の第二の反応層が形成される。なかでも、微粒子の表面積を酵素分子が一層になって覆うことが、溶解性にとって好ましいという理由から、５〜３０％であるのが好ましい。
多孔性の第二の反応層が形成されることにより、試料液として血液を用いた場合、血液中の赤血球などの粒子成分を濾過する効果が期待される。これにより、センサ応答における赤血球の影響を低減させる効果がある。
【００１９】
本発明において用いられる酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、ムタロターゼ、インベルダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼなどが挙げられる。これらの酵素のうち１種または２種以上を混合して用いることもできる。
【００２０】
ここで、第一の反応層に電子伝達体を含め第二の反応層に酵素を含めることにより、電子伝達体と酵素とを混合させないで反応層を形成する理由について説明する。電子伝達体と酵素とを同じ層に存在させると、保存中に酵素の活性を損ねることがあるので、酵素とは分離して反応層を形成した方が好ましい。
【００２１】
特に、コレステロールセンサの場合、酵素としてコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの少なくとも一方と、コレステロールエステルを遊離型コレステロールに変化させるコレステロールエステラーゼ、ならびに界面活性剤を用いる。この場合、界面活性剤の作用により、さらにセンサの劣化が進みやすいため、上述のように分離した構成が有効なのである。
【００２２】
電子伝達体を溶解して第一の反応層を形成するため水溶液を調製するための溶媒としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、フタル酸緩衝液、酢酸緩衝液、塩化ナトリウム水溶液、およびコハク酸緩衝液などが挙げられ、これらのうちの１種、または２種以上の混合溶液であることが好ましい。
本発明のバイオセンサの第一の反応層には、上記電子伝達体の他に、親水性高分子を含有させてもよい。第一の反応層中に親水性高分子を添加することにより、試料液供給路内面からの第一の反応層の剥離を防ぐことができる。さらに、第一の反応層表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。
【００２３】
酵素を溶解して第二の反応層形成液を調製するための溶媒としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、フタル酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、および塩化ナトリウム水溶液などの各種水溶液、ならびにメタノール、エタノール、トルエン、およびアセトンなどの有機溶媒などが挙げられ、これらのうちの１種、または２種以上の混合溶液であることが好ましい。前記第二の反応層形成用液に加える微粒子の含量は、体積濃度にして５〜２０体積％の範囲であることが好ましい。
本発明のバイオセンサの第二の反応層には、上記酵素の他に、親水性高分子を含有させてもよい。第二の反応層中に親水性高分子を添加することにより、試料液供給路の内面からの反応層の剥離を防ぐことができる。さらに、第二の反応層表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。また、電極系上を親水性高分子で被覆しても良く、上記と同様の効果が得られる。
【００２４】
このような親水性高分子としては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、ならびにアクリル酸またはその誘導体の重合体などが挙げられる。特に、カルボキシメチルセルロースが好ましい。
【００２５】
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照電極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方が、より正確な測定が可能である。
ここで、本発明に係るバイオセンサの構成の一実施の形態について図面を参照しながら説明する。図１は、本発明に係るバイオセンサの反応層を取り除いた分解斜視図である。
【００２６】
図１において、１はポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性の基板を示す。この基板１上にスクリーン印刷により銀ペーストを印刷してリード２および３が形成されている。基板１上には、さらに、同様の印刷法により、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストからなる作用極４と対極５を含む電極系、および電気絶縁性ペーストからなる電気絶縁層６が形成されている。電気絶縁層６は作用極４および対極５の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的に覆っている。上記リードおよび電極の材料としては、銀やカーボン以外にも、白金、金、およびパラジウムなどが用いられる。
【００２７】
このバイオセンサは、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板１、カバー９、および基板１とカバー９の間に挟まれるスペーサ８から組み立てられる。これらが図１の中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着され、バイオセンサが構成される。
スペーサ８には、試料液供給路を形成するスリット１０が形成され、カバー９には空気孔１１が形成されている。基板１とカバー９とスペーサ８を図１に示したように接着すると、基板１とカバー９の間に試料液供給路となる空間部が形成される。この空間部は、スリット１０の解放端部が試料液供給口となり、終端部は空気孔１１となる。ここでカバー９とスペーサ８の組み合わせでカバー部材を構成しているが、スペーサ８のスリット１０に相当する溝を設けた１つの部材で構成することもできる。
【００２８】
図１のようにして電極系を形成した絶縁性の基板１上またはカバー側のスリット内に、少なくとも電子伝達体を含む第一の反応層７ａと、少なくとも酵素と微粒子物質を含む第二の反応層７ｂを形成した状態が図２に示されている。第一の反応層７ａおよび第二の反応層７ｂは、共に必ずしも電極系上に形成する必要はなく、試料液供給路内に露出する部分に形成されていれば良く、試料液が第一の反応層７ａおよび第二の反応層７ｂを溶解して電極系上に達する構成であればよい。
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００２９】
《実施例１》
本実施例においては、図１に示す構造を有するコレステロールセンサを作製した。
図１の基板１の電極系上に、フェリシアン化カリウムを含む水溶液を滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて第一の反応層７ａを形成した（図２を参照）。作製した第一の反応層７ａには、１平方センチメートルあたり１ｍｇのフェリシアン化カリウムが含まれた。
【００３０】
つぎに、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、微粒子としてポリエチレン製の平均直径０．５μｍのポリマー粒子、および界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む液を調製し、スペーサ８およびカバー９の試料液供給路側の部分に滴下し、５０℃の温風乾燥機で１０分間乾燥させ、第二の反応層７ｂを形成した。
この第二の反応層７ｂに含まれる酵素の量は、反応層１平方センチメートルあたりコレステロールオキシダーゼ０．１０ｍｇ、コレステロールエステラーゼ０．０５ｍｇであった。微粒子および界面活性剤は、反応層１平方センチメートルあたりそれぞれ０．４ｍｇ及び１．０ｍｇ含まれていた。
【００３１】
この基板１とスペーサ８とカバー９を組み合わせてセンサを組み立て、コレステロールセンサとしての特性評価を行った。
コレステロールを含む試料液が試料液供給路に供給されると、第一の反応層７ａおよび第二の反応層７ｂが溶解した。そして、試料液に含まれるコレステロールは、コレステロールオキシダーゼによって酸化され、これと同時に反応層中の電子伝達体が還元された。
【００３２】
続いて、試料液を供給して一定時間経過後に対極５に対して作用極４に＋０．５Ｖの電圧を印加して電子伝達体の還元体を酸化した。そして、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。
この電流値は、生成した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の基質濃度に比例し、この電流値を測定することにより、試料液のコレステロール濃度を求めることができた。
【００３３】
０ｍｇ／ｄｌ、１５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ、および４５０ｍｇ／ｄｌのコレステロール濃度の試料を用意し、測定時間を３分とした場合のそれぞれに対するセンサの応答電流値を測定した結果、応答電流値とコレステロール濃度との間には一定の相関性があり、良好な直線性を示した。また、測定時間１分においてもコレステロール濃度に対し良好な直線性を示した。図３は、コレステロール濃度（ｍｇ／ｄｌ）とセンサ応答（μＡ）との関係を示し、比較例１の特性も示している。
【００３４】
《実施例２》
実施例１と同様に、基板１の電極系上にフェリシアン化カリウムを含む第一の反応層７ａを形成した。つぎに、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、微粒子としてポリエチレン製の平均直径８μｍのポリマー粒子、および界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む液を調製した。この液を図１のスペーサ８およびカバー９の試料液供給路側に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて、第二の反応層７ｂを形成した。この第二の反応層７ｂにおいては、１平方センチメートルあたりコレステロールオキシダーゼが０．１ｍｇ、コレステロールエステラーゼが０．０５ｍｇ、微粒子が０．５〜１．５ｍｇ、界面活性剤が１．０ｍｇ含まれていた。
【００３５】
つぎに、実施例１と同様の方法でセンサの応答電流値を測定した。その結果、測定時間１分および３分ともに良好な応答直線性が得られたが、実施例１ほど良好ではなかった。その理由は、第二の反応層を形成する液内で微粒子が均一に分散しにくく、得られる第二の反応層中に含まれる微粒子の量が一定せず、したがってセンサ応答特性を評価した際、応答値のばらつきが多く発生したためである。
【００３６】
《比較例１》
実施例１と同様に、基板１の電極系上にフェリシアン化カリウムを含む第一の反応層７ａを形成した。つぎに、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、および界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む液を調製した。この液を図１のスペーサ８およびカバー９の試料液供給路側に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて、第二の反応層７ｂを形成した。この第二の反応層７ｂには、１平方センチメートルあたりコレステロールオキシダーゼが０．５ｍｇ、コレステロールエステラーゼが０．２５ｍｇ、界面活性剤が１．０ｍｇ含まれていた。
【００３７】
つぎに、実施例１と同様の方法でセンサの応答電流値を測定した。その結果、測定時間１分および３分ともに良好な応答直線性を示さなかった。その理由は、乾燥した第二の反応層に微粒子が含まれていないことから、第二の反応層の試料液による溶解が遅く、基質の反応が不十分になる場合があり、したがってセンサ応答特性を評価した際応答値のばらつきが多く発生したためである。
【００３８】
《実施例３》
実施例１と同じ方法でコレステロールセンサを作製した。
測定する試料として、血液を用意し、コレステロール濃度が１５０ｍｇ／ｄｌ、２４０ｍｇ／ｄｌ、および３３０ｍｇ／ｄｌの血液を調製した。
つぎに、実施例１と同様の方法でセンサの応答電流値を測定した。その結果、図４に示したように、測定時間１分および３分のいずれにおいても、良好な応答直線性が得られた。
【００３９】
《比較例２》
比較例１と同じ方法で微粒子を含まない第二の反応層を有するコレステロールセンサを作製した。
測定する試料として、血液を用意し、コレステロール濃度が１５０ｍｇ／ｄｌ、２４０ｍｇ／ｄｌ、および３３０ｍｇ／ｄｌの血液を調製した。
つぎに、実施例１と同様の方法でセンサの応答電流値を測定した。その結果、測定時間１分および３分のいずれにおいてもコレステロール濃度に依存したセンサ応答値が得られなかった。
【００４０】
《実施例４》
本実施例においては図１に示す構造を有するグルコースセンサを作製した。
図１の基板１の電極系上に、フェリシアン化カリウムを含む水溶液を滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて第一の反応層７ａを形成した。作製した第一の反応層７ａには、１平方センチメートルあたり１ｍｇのフェリシアン化カリウムが含まれた。
【００４１】
一方、図１のスペーサ８およびカバー９の試料液供給路側に、微粒子としてシリカ製の平均直径０．５μｍの微粒子、およびグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）を含む液を滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて第二の反応層７ｂを形成した。作製した第二の反応層７ｂに含まれる微粒子の量は１平方センチメートルあたり１ｍｇ、ＧＯＤの量は０．０２５ｍｇであった。
【００４２】
つぎに、この基板とスペーサとカバーを組み合わせてセンサを組み立て、グルコースセンサとしての特性評価を行った。
グルコースを含む試料液が試料液供給路に供給されると、第一の反応層７ａ及び第二の反応層７ｂが溶解した。そして、試料液に含まれるグルコースは、ＧＯＤによって酸化され、これと同時に反応層中の電子伝達体が還元された。続いて、試料液を供給して一定時間経過後に対極５に対して作用極４に＋０．５Ｖの電圧を印加して電子伝達体の還元体を酸化した。そして、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、生成した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の基質濃度に比例し、この電流値を測定することにより、試料液のグルコース濃度を求めることができた。
【００４３】
０ｍｇ／ｄｌ、１８０ｍｇ／ｄｌ、３６０ｍｇ／ｄｌ、および５４０ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度の試料を用意し、測定時間を３０秒とした場合のそれぞれに対するセンサの応答電流値を測定した結果、応答電流値とグルコース濃度との間には一定の相関性があり、良好な直線性を示した。また、測定時間を１０秒とした場合にも、応答電流値とグルコース濃度の関係は良好な直線性を示した。図５は測定時間を１０秒としたときの応答特性を比較例３の特性とともに示している。
【００４４】
《比較例３》
フェリシアン化カリウムとＧＯＤを含む水溶液を基板１の電極系上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させ、反応層を形成した。この反応層に含まれるフェリシアン化カリウムの量は１平方センチメートルあたり１ｍｇであり、ＧＯＤの量は、０．０５ｍｇであった。
実施例４と同様の方法でグルコース標準液に対するセンサ応答電流値を測定した結果、測定時間を３０秒とした場合には応答電流値とグルコース濃度との関係は良好な直線性を示した。しかし、測定時間を１０秒とした場合には、図５に示すように、応答電流値とグルコース濃度との関係は、高濃度域において直線性を示さなかった。
【００４５】
《実施例５》
実施例４と同じ方法でグルコースセンサを作製した。
測定する試料として、ヘマトクリット値の異なる血液を用意した。ヘマトクリット値は、それぞれ３０％、４５％、および５５％であった。グルコース濃度は、９０ｍｇ／ｄｌと３６０ｍｇ／ｄｌの２種類を用意した。
つぎに、実施例４３と同様の方法で、センサの応答電流値を測定した。その結果、図６に示したように測定時間３０秒および１０秒いずれにおいてもヘマトクリット値に依存しないセンサ応答を示した。
【００４６】
《比較例４》
比較例３と同じ方法で微粒子を含まない第二の反応層を有するグルコースセンサを作製した。
実施例４と同様の試料を用いてセンサの応答電流値を測定した結果、グルコース濃度３６０ｍｇ／ｄｌの試料を用いた場合に、測定時間３０秒、１０秒ともに、ヘマトクリット値の上昇に依存して応答値が低下した。グルコース濃度９０ｍｇ／ｄｌの試料を用いた場合には、ヘマトクリット値に依存した応答低下は見られなかった。
【００４７】
第二の反応層に微粒子を混合しない場合、基質の高濃度域で応答直線性が失われたことは、第二の反応層が密な構造となって乾燥するため、センサに試料液が供給された際にその表面のみが溶解して反応が起こっているものと考えられる。
一方、微粒子を混合して作製した第二の反応層は、微粒子を混合しない第二の反応層と比較して、酵素や電子伝達体が微粒子表面で薄い膜状に乾燥した構造となる。また、微粒子の間隙を通って試料液が非常にすばやく第二の反応層に進入し、酵素を含む試薬の溶解がスムーズになり、速やかに酵素反応が進行する。その結果、センサの測定時間の短縮が可能となる。
【００４８】
この場合、第二の反応層に含まれる微粒子が、平均直径０．１μｍ未満であると微粒子を含む第二の反応層の構造が非常に微細となるため、微粒子間に間隙が形成されず、試料液への溶解がスムーズに進行しない。また、微粒子が平均直径１μｍ以上であると、第二の反応層形成用液中の微粒子が沈殿したり上部で塊を生じたりして、製造工程が複雑になる。
【００４９】
以上のことから、微粒子の大きさは、平均直径０．１μｍ以上１μｍ未満の範囲であることが有効である。また、このような微粒子を含む第二の反応層が形成されることで、血液のような血球や蛋白質などの多くの成分を含む試料を用いた場合にも、センサの応答性が非常に良好になる。
【００５０】
以上の実施例では、グルコースセンサおよびコレステロールセンサについて説明したが、その他の酵素を用いたグルコースセンサまたはコレステロールセンサ、および乳酸センサ、果糖センサ、しょ糖センサ、アルコールセンサ、アスコルビン酸センサなどの各センサにも本発明を適用できることは言うまでもない。
【００５１】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、血液、尿などの生体試料、食品工業における原料や製品などの試料中に含まれる基質を、高精度で迅速かつ容易に定量しうるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図２】同バイオセンサの縦断面略図である。
【図３】実施例１、実施例２および比較例１のセンサ応答の比較を示すグラフである。
【図４】実施例３および比較例２のセンサ応答の比較を示すグラフである。
【図５】実施例４および比較例３のセンサ応答の比較を示すグラフである。
【図６】実施例５および比較例４のセンサ応答の比較を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 電気絶縁性の基板
２、３ リード
４ 作用極
５ 対極
６ 電気絶縁層
７ａ 第一の反応層
７ｂ 第二の反応層
８ スペーサ
９ カバー
１０ スリット
１１ 空気孔[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biosensor for quickly and easily quantifying a substrate (specific component) contained in a biological sample such as blood or urine, a raw material or product in the food industry, and a sample such as fruit juice.
[0002]
[Prior art]
There has been proposed a biosensor capable of easily quantifying a specific component (substrate) in a biological sample or food without diluting or stirring the sample. As an example, Patent Document 1 discloses that an electrode system is formed on an insulating substrate by a method such as screen printing, and a reaction layer containing an oxidoreductase and an electron carrier (electron acceptor) is formed on the electrode system. A formed biosensor is disclosed.
[0003]
This biosensor quantifies the substrate concentration in a sample as follows. First, the sample solution is dropped on the reaction layer of the biosensor to dissolve the reaction layer, and the enzyme reaction proceeds between the substrate in the sample solution and the oxidoreductase of the reaction layer. With this enzymatic reaction, the electron carrier is reduced. After a certain period of time, a voltage is applied to the electrode of the sensor to electrochemically oxidize the reduced electron carrier, and the substrate concentration in the sample solution can be determined from the oxidation current value obtained at this time.
[0004]
However, the reaction layer of the biosensor having such a configuration is manufactured by dropping a solution containing a water-soluble component and drying the solution, and it has been difficult to manufacture the reaction layer as a thin film. Further, when the reaction layer is dried, it is difficult to make the surface and inside dry uniformly, and there is a drawback that the performance as a sensor changes depending on the surface dry state. Therefore, the amount of the enzyme present in the reaction layer was excessive compared to the base mass contained in the sample to be quantified. In addition, since the amount of the reagent contained in the reaction layer is large, there is a disadvantage that it takes time to dissolve the reagent layer.
[0005]
On the other hand, in Patent Document 2, a first reaction layer including at least an electron carrier is formed on an inner surface of a sample liquid supply path, and the first reaction layer is formed directly on the inner surface of the sample liquid supply path. A biosensor formed with a non-contact positional relationship is disclosed. However, when the difference between the solubility of the substances contained in the first reaction layer and the second reaction layer is large, there is a drawback that the reactivity of the sensor is reduced due to the different dissolution time of both reaction layers. there were.
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-3-202768
[Patent Document 2]
JP 2001-208716 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the contents of the prior art described above, the present invention provides a biosensor with good response characteristics, in which a reaction layer containing an enzyme can be rapidly dissolved even with a small amount of a sample solution, and an enzyme reaction can be effectively used. The purpose is to do. Further, another object of the present invention is to provide a biosensor capable of easily forming such a reaction layer.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention includes an electrically insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode formed on the substrate, and a sample liquid supply path including the electrode system, A first reaction layer including an electron carrier formed in the sample liquid supply path, and a second reaction layer including an enzyme and fine particles formed separately from the first reaction layer in the sample liquid supply path. And a biosensor comprising the reaction layer of (1).
[0009]
The average diameter of the fine particles is preferably 0.1 μm or more and less than 1 μm.
Examples of the material constituting the fine particles include a polymer compound, ceramic, glass, diamond, and carbon.
[0010]
The second reaction layer may contain at least one enzyme selected from the group consisting of cholesterol oxidase and cholesterol dehydrogenase, and cholesterol esterase.
[0011]
Further, the second reaction layer can contain at least one enzyme selected from the group consisting of glucose oxidase and glucose dehydrogenase.
Further, it is preferable that the first reaction layer and / or the second reaction layer contain a surfactant.
Further, it is preferable that the amount of the fine particles contained in the second reaction layer is 5 to 99% by volume of the second reaction layer.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The biosensor according to the present invention includes an electrically insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode formed on the substrate, and a sample liquid supply path including the electrode system. A first reaction layer including an electron carrier formed in a supply path, and a second reaction layer including an enzyme and fine particles formed separately from the first reaction layer in the sample liquid supply path It is characterized by having.
[0013]
The biosensor according to the present invention includes a first reaction layer including an electron carrier formed in the sample liquid supply path, and an enzyme formed separately from the first reaction layer in the sample liquid supply path. It has the greatest feature in having a second reaction layer containing fine particles.
[0014]
The first reaction layer is preferably formed by applying an aqueous solution containing at least an electron carrier on the inner surface of the sample liquid supply path and drying it.
Examples of the electron carrier include ferricyanide salts, p-benzoquinone and derivatives thereof, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and derivatives thereof. One or more of these can be used as the electron carrier.
[0015]
Next, the second reaction layer, a liquid for forming a second reaction layer, preferably disperse the fine particles in an aqueous solution containing an enzyme, and the first reaction layer on the inner surface of the sample liquid supply path It is preferable to adopt a method of applying and drying the obtained liquid at a position not directly in contact with the liquid.
The average diameter of the fine particles used here is preferably 0.1 μm or more and less than 1 μm. Examples of the fine particles used herein include polymer compounds, ceramics such as silica, alumina, and titanium oxide, glass, diamond, and carbon.
[0016]
In this case, if the average particle diameter of the fine particles exceeds 1 μm, the dispersibility of the fine particles in the liquid for forming the second reaction layer is poor, and it is necessary to constantly stir, which complicates the manufacturing process.
Further, when the second reaction layer is formed using a liquid in which the dispersion state of the fine particles is non-uniform, the resulting second reaction layer becomes non-uniform, and the entire second reaction layer does not dissolve promptly, and the sensor The response characteristics of
[0017]
On the other hand, if the average particle size of the fine particles is smaller than 0.1 μm, the gap between the fine particles in the obtained second reaction layer becomes narrow, and the effect of increasing the surface area of the enzyme cannot be obtained.
By using the fine particles having an average diameter of 0.1 μm or more and less than 1 μm, the fine particles form fine voids in the enzyme layer forming the second reaction layer, whereby the sample liquid supplied to the sensor can be used in the second reaction layer. Immediately penetrates while dissolving the enzyme in the layer. As a result, the second reaction layer is rapidly dissolved in the sample solution, and the enzyme reaction proceeds rapidly. Therefore, high-accuracy measurement can be performed without causing variation in response characteristics.
[0018]
The amount of the fine particles contained in the second reaction layer is suitably from 5 to 99% by volume of the second reaction layer so that an enzyme layer is formed thinly on the surface of the fine particles, and is easily dissolved in the sample solution. A porous second reaction layer is formed. Above all, it is preferable to be 5 to 30% because it is preferable for the solubility that the enzyme molecules cover the surface area of the fine particles as a single layer.
When blood is used as the sample liquid by forming the porous second reaction layer, an effect of filtering particle components such as red blood cells in blood is expected. This has the effect of reducing the effect of red blood cells on sensor response.
[0019]
Examples of the enzymes used in the present invention include cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, cholesterol esterase, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, fructose oxidase, mutarotase, invertase, ascorbate oxidase, and alcohol oxidase. One or more of these enzymes may be used in combination.
[0020]
Here, the reason for forming the reaction layer without mixing the electron carrier and the enzyme by including the electron carrier in the first reaction layer and the enzyme in the second reaction layer will be described. If the electron carrier and the enzyme are present in the same layer, the activity of the enzyme may be impaired during storage. Therefore, it is preferable to form a reaction layer separately from the enzyme.
[0021]
In particular, in the case of a cholesterol sensor, at least one of cholesterol oxidase and cholesterol dehydrogenase, cholesterol esterase that converts cholesterol ester to free cholesterol, and a surfactant are used. In this case, the sensor is liable to further deteriorate due to the action of the surfactant, and thus the separated configuration as described above is effective.
[0022]
Examples of a solvent for preparing an aqueous solution for dissolving the electron carrier to form a first reaction layer include water, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, phthalate buffer, acetate buffer, and sodium chloride. Examples thereof include an aqueous solution and a succinate buffer, and one or a mixture of two or more of them is preferable.
The first reaction layer of the biosensor of the present invention may contain a hydrophilic polymer in addition to the electron carrier. By adding a hydrophilic polymer to the first reaction layer, it is possible to prevent the first reaction layer from peeling off from the inner surface of the sample liquid supply path. Furthermore, it also has the effect of preventing cracks on the surface of the first reaction layer, which is effective in increasing the reliability of the biosensor.
[0023]
Solvents for dissolving the enzyme to prepare the second reaction layer forming solution include, for example, water, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, phthalate buffer, acetate buffer, succinate buffer, and chloride. Examples thereof include various aqueous solutions such as a sodium aqueous solution, and organic solvents such as methanol, ethanol, toluene, and acetone. One or a mixture of two or more of them is preferable. The content of the fine particles to be added to the second reaction layer forming liquid is preferably in the range of 5 to 20% by volume in volume concentration.
The second reaction layer of the biosensor of the present invention may contain a hydrophilic polymer in addition to the above enzyme. By adding a hydrophilic polymer to the second reaction layer, separation of the reaction layer from the inner surface of the sample liquid supply path can be prevented. Furthermore, it also has the effect of preventing cracks on the surface of the second reaction layer, which is effective in increasing the reliability of the biosensor. Further, the electrode system may be coated with a hydrophilic polymer, and the same effects as above can be obtained.
[0024]
Such hydrophilic polymers include, for example, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, carboxymethylethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol, polyamino acids such as polylysine, polystyrenesulfonic acid, gelatin And a derivative thereof, and a polymer of acrylic acid or a derivative thereof. Particularly, carboxymethyl cellulose is preferable.
[0025]
As a method for measuring the oxidation current, there are a two-electrode method using only a measurement electrode and a counter electrode, and a three-electrode method including a reference electrode. The three-electrode method enables more accurate measurement.
Here, an embodiment of the configuration of the biosensor according to the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to the present invention from which a reaction layer has been removed.
[0026]
In FIG. 1, reference numeral 1 denotes an electrically insulating substrate made of polyethylene terephthalate. On the substrate 1, leads 2 and 3 are formed by printing a silver paste by screen printing. An electrode system including a working electrode 4 and a counter electrode 5 made of a conductive carbon paste containing a resin binder and an electric insulating layer 6 made of an electric insulating paste are further formed on the substrate 1 by the same printing method. I have. The electrical insulating layer 6 keeps the area of the exposed portion of the working electrode 4 and the counter electrode 5 constant and partially covers the lead. As the material of the lead and the electrode, platinum, gold, palladium and the like are used in addition to silver and carbon.
[0027]
This biosensor is assembled from an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, a cover 9, and a spacer 8 sandwiched between the substrate 1 and the cover 9. These are adhered in a positional relationship as indicated by a dashed line in FIG. 1 to constitute a biosensor.
A slit 10 is formed in the spacer 8 to form a sample liquid supply path, and an air hole 11 is formed in the cover 9. When the substrate 1, the cover 9, and the spacer 8 are bonded as shown in FIG. 1, a space serving as a sample liquid supply path is formed between the substrate 1 and the cover 9. In this space, the open end of the slit 10 is a sample liquid supply port, and the end is an air hole 11. Here, the cover member is constituted by the combination of the cover 9 and the spacer 8, but may be constituted by one member provided with a groove corresponding to the slit 10 of the spacer 8.
[0028]
As shown in FIG. 1, a first reaction layer 7a containing at least an electron carrier and a second reaction containing at least an enzyme and a fine particle substance are provided on the insulating substrate 1 or the slit on the cover side on which the electrode system is formed. FIG. 2 shows a state in which the layer 7b is formed. Both the first reaction layer 7a and the second reaction layer 7b do not necessarily need to be formed on the electrode system, but may be formed on portions exposed in the sample liquid supply path. Any structure may be used as long as the reaction layer 7a and the second reaction layer 7b are dissolved to reach the electrode system.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0029]
<< Example 1 >>
In this example, a cholesterol sensor having the structure shown in FIG. 1 was manufactured.
An aqueous solution containing potassium ferricyanide was dropped on the electrode system of the substrate 1 in FIG. 1 and dried in a hot air drier at 50 ° C. for 10 minutes to form a first reaction layer 7a (see FIG. 2). The produced first reaction layer 7a contained 1 mg of potassium ferricyanide per square centimeter.
[0030]
Next, a liquid containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, polymer particles made of polyethylene having an average diameter of 0.5 μm as fine particles, and a surfactant Triton X-100 was prepared. , And dried for 10 minutes with a warm air dryer at 50 ° C. to form a second reaction layer 7b.
The amounts of the enzymes contained in the second reaction layer 7b were 0.10 mg of cholesterol oxidase and 0.05 mg of cholesterol esterase per square centimeter of the reaction layer. The fine particles and the surfactant were contained at 0.4 mg and 1.0 mg per square centimeter of the reaction layer, respectively.
[0031]
A sensor was assembled by combining the substrate 1, the spacer 8, and the cover 9, and the characteristics of the sensor as a cholesterol sensor were evaluated.
When the sample liquid containing cholesterol was supplied to the sample liquid supply path, the first reaction layer 7a and the second reaction layer 7b dissolved. Cholesterol contained in the sample solution was oxidized by cholesterol oxidase, and at the same time, the electron carriers in the reaction layer were reduced.
[0032]
Subsequently, a voltage of +0.5 V was applied to the working electrode 4 with respect to the counter electrode 5 after a lapse of a predetermined time after the supply of the sample liquid, so that the reduced form of the electron carrier was oxidized. After 5 seconds, the value of the current flowing between the working electrode and the counter electrode was measured.
This current value is proportional to the concentration of the generated electron carrier, that is, the substrate concentration in the sample solution. By measuring this current value, the cholesterol concentration in the sample solution could be obtained.
[0033]
Samples with cholesterol concentrations of 0 mg / dl, 150 mg / dl, 300 mg / dl, and 450 mg / dl were prepared, and the response current value of the sensor was measured for each of three minutes when the measurement time was 3 minutes. There was a certain correlation between the cholesterol level and good linearity. In addition, good linearity with respect to the cholesterol concentration was shown even at a measurement time of 1 minute. FIG. 3 shows the relationship between the cholesterol concentration (mg / dl) and the sensor response (μA), and also shows the characteristics of Comparative Example 1.
[0034]
<< Example 2 >>
As in Example 1, a first reaction layer 7a containing potassium ferricyanide was formed on the electrode system of the substrate 1. Next, a liquid containing cholesterol oxidase, cholesterol esterase, polymer particles of polyethylene having an average diameter of 8 μm as fine particles, and a surfactant Triton X-100 was prepared. This liquid was dropped on the sample liquid supply path side of the spacer 8 and the cover 9 in FIG. 1 and dried in a hot air drier at 50 ° C. for 10 minutes to form a second reaction layer 7b. The second reaction layer 7b contained 0.1 mg of cholesterol oxidase, 0.05 mg of cholesterol esterase, 0.5 to 1.5 mg of microparticles, and 1.0 mg of surfactant per square centimeter.
[0035]
Next, the response current value of the sensor was measured in the same manner as in Example 1. As a result, good response linearity was obtained for both the measurement times of 1 minute and 3 minutes, but not as good as in Example 1. The reason is that it is difficult to uniformly disperse the fine particles in the liquid forming the second reaction layer, and the amount of the fine particles contained in the obtained second reaction layer is not constant. This is because a large variation in response values has occurred.
[0036]
<< Comparative Example 1 >>
As in Example 1, a first reaction layer 7a containing potassium ferricyanide was formed on the electrode system of the substrate 1. Next, a liquid containing cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and a surfactant Triton X-100 was prepared. This liquid was dropped on the sample liquid supply path side of the spacer 8 and the cover 9 in FIG. 1 and dried in a hot air drier at 50 ° C. for 10 minutes to form a second reaction layer 7b. The second reaction layer 7b contained 0.5 mg of cholesterol oxidase, 0.25 mg of cholesterol esterase, and 1.0 mg of surfactant per square centimeter.
[0037]
Next, the response current value of the sensor was measured in the same manner as in Example 1. As a result, good response linearity was not shown for both the measurement times of 1 minute and 3 minutes. The reason is that since the dried second reaction layer does not contain fine particles, dissolution of the second reaction layer by the sample solution is slow, and the reaction of the substrate may be insufficient. This is because a large variation in response values occurred when the evaluation was made.
[0038]
<< Example 3 >>
A cholesterol sensor was produced in the same manner as in Example 1.
Blood was prepared as a sample to be measured, and cholesterol concentrations of 150 mg / dl, 240 mg / dl, and 330 mg / dl were prepared.
Next, the response current value of the sensor was measured in the same manner as in Example 1. As a result, as shown in FIG. 4, good response linearity was obtained at all of the measurement times of 1 minute and 3 minutes.
[0039]
<< Comparative Example 2 >>
A cholesterol sensor having a second reaction layer containing no fine particles was produced in the same manner as in Comparative Example 1.
Blood was prepared as a sample to be measured, and cholesterol concentrations of 150 mg / dl, 240 mg / dl, and 330 mg / dl were prepared.
Next, the response current value of the sensor was measured in the same manner as in Example 1. As a result, no sensor response value depending on the cholesterol concentration was obtained at any of the measurement times of 1 minute and 3 minutes.
[0040]
<< Example 4 >>
In this example, a glucose sensor having the structure shown in FIG. 1 was manufactured.
An aqueous solution containing potassium ferricyanide was dropped on the electrode system of the substrate 1 in FIG. 1 and dried in a hot-air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to form a first reaction layer 7a. The produced first reaction layer 7a contained 1 mg of potassium ferricyanide per square centimeter.
[0041]
On the other hand, a liquid containing silica fine particles having an average diameter of 0.5 μm and glucose oxidase (EC 1.1.3.4; hereinafter abbreviated as GOD) as fine particles is provided on the sample liquid supply path side of the spacer 8 and the cover 9 in FIG. Was dried in a warm air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to form a second reaction layer 7b. The amount of fine particles contained in the produced second reaction layer 7b was 1 mg per square centimeter, and the amount of GOD was 0.025 mg.
[0042]
Next, a sensor was assembled by combining the substrate, the spacer, and the cover, and the characteristics as a glucose sensor were evaluated.
When the sample liquid containing glucose was supplied to the sample liquid supply path, the first reaction layer 7a and the second reaction layer 7b dissolved. Then, glucose contained in the sample solution was oxidized by GOD, and at the same time, the electron carriers in the reaction layer were reduced. Subsequently, a voltage of +0.5 V was applied to the working electrode 4 with respect to the counter electrode 5 after a lapse of a predetermined time from the supply of the sample liquid, to oxidize the reduced form of the electron carrier. After 5 seconds, the value of the current flowing between the working electrode and the counter electrode was measured. This current value was proportional to the concentration of the generated electron carrier, that is, the substrate concentration in the sample solution, and by measuring this current value, the glucose concentration in the sample solution could be obtained.
[0043]
Samples with glucose concentrations of 0 mg / dl, 180 mg / dl, 360 mg / dl, and 540 mg / dl were prepared, and the response current value of the sensor was measured for each measurement when the measurement time was 30 seconds. There was a certain correlation with the glucose concentration, indicating good linearity. Also, when the measurement time was set to 10 seconds, the relationship between the response current value and the glucose concentration showed good linearity. FIG. 5 shows the response characteristics when the measurement time is set to 10 seconds, together with the characteristics of Comparative Example 3.
[0044]
<< Comparative Example 3 >>
An aqueous solution containing potassium ferricyanide and GOD was dropped on the electrode system of the substrate 1 and dried in a hot air drier at 50 ° C. for 10 minutes to form a reaction layer. The amount of potassium ferricyanide contained in this reaction layer was 1 mg per square centimeter, and the amount of GOD was 0.05 mg.
As a result of measuring the sensor response current value for the glucose standard solution in the same manner as in Example 4, when the measurement time was set to 30 seconds, the relationship between the response current value and the glucose concentration showed good linearity. However, when the measurement time was 10 seconds, as shown in FIG. 5, the relationship between the response current value and the glucose concentration did not show linearity in the high concentration range.
[0045]
<< Example 5 >>
A glucose sensor was manufactured in the same manner as in Example 4.
Blood samples having different hematocrit values were prepared as samples to be measured. Hematocrit values were 30%, 45%, and 55%, respectively. Two types of glucose concentrations, 90 mg / dl and 360 mg / dl, were prepared.
Next, the response current value of the sensor was measured in the same manner as in Example 43. As a result, as shown in FIG. 6, the sensor response was independent of the hematocrit value at both the measurement times of 30 seconds and 10 seconds.
[0046]
<< Comparative Example 4 >>
A glucose sensor having a second reaction layer containing no fine particles was produced in the same manner as in Comparative Example 3.
The response current value of the sensor was measured using the same sample as in Example 4. As a result, when a sample with a glucose concentration of 360 mg / dl was used, the measurement time was 30 seconds and 10 seconds, depending on the increase in the hematocrit value. Response value has dropped. When a sample having a glucose concentration of 90 mg / dl was used, no response decrease depending on the hematocrit value was observed.
[0047]
When fine particles are not mixed in the second reaction layer, the loss of response linearity in the high concentration region of the substrate means that the second reaction layer has a dense structure and dries. It is considered that only the surface was dissolved when the reaction was performed, and the reaction was occurring.
On the other hand, the second reaction layer formed by mixing the fine particles has a structure in which the enzyme and the electron carrier are dried in a thin film on the surface of the fine particles, as compared with the second reaction layer in which the fine particles are not mixed. Further, the sample liquid enters the second reaction layer very quickly through the gap between the fine particles, so that the dissolution of the reagent containing the enzyme becomes smooth, and the enzyme reaction proceeds promptly. As a result, the measurement time of the sensor can be reduced.
[0048]
In this case, the fine particles contained in the second reaction layer, if the average diameter is less than 0.1 μm, since the structure of the second reaction layer containing fine particles is very fine, no gap is formed between the fine particles, Dissolution in the sample solution does not proceed smoothly. If the average diameter of the fine particles is 1 μm or more, the fine particles in the liquid for forming the second reaction layer precipitate or form lumps at the top, which complicates the manufacturing process.
[0049]
From the above, it is effective that the size of the fine particles is in the range of 0.1 μm or more and less than 1 μm in average diameter. In addition, since the second reaction layer containing such fine particles is formed, the response of the sensor is very good even when a sample containing many components such as blood cells and proteins such as blood is used. become.
[0050]
In the above embodiments, the glucose sensor and the cholesterol sensor have been described. It goes without saying that the present invention can be applied.
[0051]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, there is provided a biosensor capable of quickly and easily quantifying a substrate contained in a biological sample such as blood or urine or a sample such as a raw material or a product in the food industry with high accuracy. be able to.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to an embodiment of the present invention, from which a reaction layer is removed.
FIG. 2 is a schematic longitudinal sectional view of the biosensor.
FIG. 3 is a graph showing a comparison between sensor responses of Example 1, Example 2, and Comparative Example 1.
FIG. 4 is a graph showing a comparison between sensor responses of Example 3 and Comparative Example 2.
FIG. 5 is a graph showing a comparison between sensor responses of Example 4 and Comparative Example 3.
FIG. 6 is a graph showing a comparison between sensor responses of Example 5 and Comparative Example 4.
[Explanation of symbols]
1 Electrically insulating substrate
2-3 leads
4 Working electrode
5 Counter electrode
6 Electrical insulation layer
7a First reaction layer
7b Second reaction layer
8 Spacer
9 Cover
10 slits
11 air holes
