JP2003509012A - 細胞培養物中でのサイトカインの産生を増強するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞中のサイトカイン調節因子のレベルを改変することによって、哺乳動物の細胞培養物中でのサイトカインの産生を増強するための方法に関し、それによって増強されたレベルのサイトカインの産生を生じる。本発明はさらに、増強されたサイトカイン調節因子の発現および増強されたサイトカインの発現を示す細胞株に関する。より詳細には、上記方法は、培養された哺乳動物細胞株中のサイトカイン調節因子の過剰発現を生じるために有効な様式で、この細胞株を改変する工程が包含され、上記サイトカイン調節因子は、ＰＫＲであり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ＰＫＲの過剰発現による、細胞培養物中のサイトカインの産生を増
強するための方法に関する。

【０００２】 （参考文献）

【０００３】

【表１】 （発明の背景） ｄｓ−ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）は、Ｐ１／ｅＩＦ２キナー
ゼ、ＤＡＩ，またはｄｓＲＮＡ活性化インヒビターについてのｄｓＩと呼ばれ、
そしてｐ６８（ヒト）およびｐ６５（マウス）キナーゼは、セリン／スレオニン
キナーゼであり、これらの酵素活性は、ｄｓＲＮＡまたは内部ｄｓＲＮＡ構造お
よび結果として自己リン酸化を示す一本鎖ＲＮＡに結合することを必要とする。
（ＧａｌａｂｒｕおよびＨｏｖａｎｅｓｓｉａｎ、１９８７；Ｍｅｕｒｓら、１
９９０）。ウサギの網状赤血球、種々のマウスの組織、およびヒトの末梢血単核
細胞中の類似の酵素が、記載されている（Ｆａｒｒｅｌら、１９９７；Ｌｅｖｉ
ｎら、１９７８；Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ、１９８８；Ｋｒｕｓｔら、１９８２
；Ｂｕｆｆｅｔ−Ｊａｎｖｒｅｓｓｅら、１９８６）。

【０００４】 ＰＫＲは、翻訳、転写、およびシグナル伝達経路の調節において、他の物質に
加えて、タンパク質合成開始因子ｅＩＦ２、およびＩ−κＢ（ＮＦ−κＢのイン
ヒビター；Ｋｕｍａｒ Ａら、１９９４）をリン酸化するその能力を通じて、種
々の重要な役割を果たすことが示されている。

【０００５】 最も特徴付けられているＰＫＲのインビボでの基質は、真核生物の開始因子−
２（ｅＩＦ−２α）のαサブユニットである。これは、一旦リン酸化されると、
最終的には細胞性およびウイルス性のタンパク質合成の阻害を導く（Ｈｅｒｓｈ
ｅｙ、１９９１）。ＰＫＲは、二本鎖のＲＮＡによって活性化された場合、イン
ビトロで開始因子ｅＩＦ−２αをリン酸化することが実証されている（Ｃｈｏｎ
ｇら、１９９２）。

【０００６】 ＰＫＲに寄与する活性として、以下における役割が挙げられる：（１）ＩＦＮ
−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルスおよび抗増殖活性を媒介すること、（２）生
理学的なストレスに対する感染していない細胞の応答、ならびに（３）細胞増殖
の調節（Ｃｌｅｍｅｎｓ ＭＪおよびＥｌｉａ Ａ、１９９７；Ｚａｍａｎｉａ
ｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ Ｍら、１９９９）。

【０００７】 ＰＫＲが腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスのインデューサーとして機能し
得ることもまた、示唆されている（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ ＭＪおよびＢｏｍ
ｍｅｒ ＵＡ、１９９９；Ｙｅｕｎｇ，Ｌａｕら、１９９６；Ｋｏｒｏｍｉｌａ
ｓら、１９９２）。最近の結果は、ＰＫＲの活性な形態の発現が、おそらくＦａ
ｓレセプターの上方制御を通じてアポトーシスを誘発することを示している（Ｄ
ｏｎｚｅ Ｏ，ら、１９９９）。

【０００８】 さらに、インターフェロンを産生し得る細胞株が、ＰＫＲをコードする発現ベ
クターでトランスフェクトされた場合には、ＰＫＲの過剰発現がインターフェロ
ンの増大した産生を誘導することが示されている（ＷＯ９７／０８３２４）。タ
ンパク質のインターフェロンファミリーは、サイトカインの原型であり、そして
病原体および癌組織に対する免疫防御において重要な役割を果たすことが示され
ている。

【０００９】 サイトカインは、生物学的活性の範囲を示し、そして広範囲の標的細胞に対し
て作用する調節分子である（例えば、Ｂａｌｋｗｉｌｌ ＦＲおよびＢｕｒｋｅ
Ｆ、１９８９；Ｗｏｎｇ ＧおよびＣｌａｒｋ Ｓ、１９８８；ならびにＣｌ
ａｒｋ ＳおよびＫａｍｅｎ Ｒ、１９８７を参照のこと）。

【００１０】 一般的には、サイトカインは、昆虫、細菌、および哺乳動物宿主細胞中での組
換えタンパク質の発現によって、現在産生される。

【００１１】 サイトカインは、哺乳動物細胞株から天然のサイトカインを精製するか、また
は昆虫、微生物、もしくは哺乳動物細胞中でのサイトカインの組換えによる産生
のいずれかによって、種々の治療適用のために産生される。天然のサイトカイン
は、それらが所定のサイトカインのネイティブな形態の全レパートリーを含み、
そして適切な構造を有する点で好ましいが、これらは、産生するためには高価で
ありそして時間がかかることが公知である。

【００１２】 組換えによって産生されたサイトカインは、作成することはあまり高価ではな
いが、供給源に依存して外来の抗原を含み得、それによってそれらが投与される
被験体により免疫応答を生じ得るか、または天然の形態からの構造のバリエーシ
ョン（例えば、グリコシル化パターン）に起因して活性が低くなり得る。

【００１３】 従って、産生することがあまり高価ではない、天然のサイトカインの産生を増
強するための方法が有利である。

【００１４】 本方法は、サイトカインタンパク質のグリコシル化およびネイティブな折り畳
みを可能にしない微生物システム、または一般的には、非常に低レベルで組換え
タンパク質を産生するヒトの細胞におけるサイトカインの発現を利用する。

【００１５】 本発明は、特定の遺伝子の発現を操作することによって、サイトカインの産生
が培養された哺乳動物細胞中で増強されるという驚くべき発見に関する。

【００１６】 （発明の要旨） 本発明は、サイトカイン調節タンパク質の発現が正常なレベルを上回るように
増大され、それによってサイトカインの産生の増大を生じる細胞株を提供するこ
とによって、哺乳動物細胞培養物中でのサイトカインの増強された産生のための
方法を提供する。

【００１７】 １つの局面においては、本発明は、サイトカイン調節因子の過剰発現を生じる
様式で改変されており、そしてサイトカインの産生をもたらすように処理されて
いる、哺乳動物細胞株を培養すること、それに引き続き培養されて処理された細
胞株によって産生されるサイトカインの回収により、サイトカインを産生するた
めの方法を提供する。

【００１８】 １つの好ましい実施態様においては、サイトカイン調節因子はＰＫＲである。

【００１９】 １つのアプローチにおいては、哺乳動物細胞株が、サイトカイン調節因子をコ
ードするＤＮＡセグメントに対して作動可能に連結された、宿主細胞中で機能す
るプロモーターフラグメントを有する発現ベクターでトランスフェクトされる。
その結果、サイトカイン調節因子は、細胞株中で過剰発現される。

【００２０】 細胞株は、サイトカインの産生をもたらすために感作することおよび誘導する
ことによって（例えば、ホルボールエステル（例えば、酢酸ミリスチン酸ホルボ
ール（ＰＭＡ））で感作することによって、およびポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）
のようなｄｓＲＮＡで誘導することによって）処理され得る。感作は、周知の現
象であり、これにより、サイトカインまたは他の化合物での細胞の予備処理は、
同じサイトカインおよび／またはさらなるサイトカインの増強された産生、それ
に続く刺激を生じる。

【００２１】 その発現が本発明の方法を使用して増大させられ得る例示的なサイトカインと
して、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インターロイキン（ＩＬ−
１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４〜８）、腫瘍壊死
因子αおよびβ（ＴＮＦ−β）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、
Ｇ−ＣＳＦ；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ；および
ＩＬ−３）、血管形成因子（線維芽細胞増殖因子、ＦＧＦ；血管内皮増殖因子、
ＶＥＧＦ；および血小板由来増殖因子１および２（ＰＤＧＦ−１および−２）、
ならびに抗血管形成因子（アンギオスタチンおよびエンドスタチン）。

【００２２】 サイトカインは、誘導性のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモー
ターもしくはテトラサイクリン（ＴＲＥ）プロモーター）、または構成性のプロ
モーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下で発現され得る。

【００２３】 本発明はさらに、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）の正常を上回る発
現、およびサイトカイン（例えば、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インター
ロイキン８（ＩＬ−８）、または腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β））の正常を上回
る発現によって特徴付けられる、細胞株組成物を提供する。

【００２４】 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が、添付の図
面および実施例と組合せて読まれる場合に、より完全に明らかとなる。

【００２５】 （発明の詳細な説明） （１．定義） 用語「ベクター」は、新規の核酸を融合（ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ）し得、そし
て適切な宿主中でそれらの新規の配列を増殖し得るヌクレオチドをいう。ベクタ
ーとして、組換えプラスミドおよびウイルスが挙げられるが、これらに限定され
ない。本発明のベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルス）は、キャ
リア（例えば、タンパク質に対して複合体化されたプラスミド、脂質に基づく核
酸導入システムと複合体化されたプラスミド、または他の非ウイルスキャリアシ
ステム）であり得る。

【００２６】 発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、
２つの複製システムを有し得、従って、２つの生物体（例えば、発現のための哺
乳動物細胞または昆虫細胞、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物
宿主）中で維持されることを可能にする。

【００２７】 発現およびクローニングベクターの両方が、１つ以上の選択された宿主細胞中
でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種
々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。さらに、組込み発現ベク
ターについては、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに対して相同である少なく
とも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接している２つの相
同な配列を含む。組込みベクターは、ベクター中への封入のための適切な相同配
列を選択することによって、宿主細胞中の特異的な遺伝子座に対して指向され得
る。組込みベクターの構築は、当該分野で周知である。

【００２８】 発現およびクローニングベクターは、代表的には、選択マーカー遺伝子を含む
。選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリ
ン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性
を付与するか、（ｂ）栄養要求性の欠損を相補するか、または（ｃ）複合培地か
ら入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする（例えば、Ｂ
ａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。

【００２９】 ベクター中では、核酸コード配列は、別の核酸配列と機能的な関係にそれを配
置することによって、「作動可能に連結」されなければならない。例えば、プレ
配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ
タンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに対して作動可能
に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を
与える場合には、コード配列に対して作動可能に連結される；あるいは、リボソ
ーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合には、コード配列
に対して作動可能に連結される。一般的には、「作動可能に連結された」ＤＮＡ
配列は、連続的であり、そして分泌リーダーの場合においては、連続的でありそ
してリーディング相内である。しかし、エンハンサーは、連続である必要はない
。連結は、便利な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在
しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣
例に従って使用される。

【００３０】 用語「制御配列」は、特定の宿主生物体中の作動可能に連結されたコード配列
の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列として、例えば、
プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙
げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエ
ンハンサーを利用することが公知である。

【００３１】 プロモーター配列は、構成性のプロモーターまたは誘導性のプロモーターのい
ずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在しているプロモーターまたは
ハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。ハイブリッドプロモーターは
、１つ以上のプロモーターのエレメントの組合せであり、これは一般的には当該
分野で公知であり、そして本発明の実施において有用である。

【００３２】 本明細書中で使用される場合は、用語「サイトカイン調節因子の発現」は、サ
イトカイン調節因子遺伝子の転写および翻訳をいう。この産物は、前駆体ＲＮＡ
、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、およびそ
れらの誘導体（マウスまたはサルの酵素ような他のヒト以外の種に由来するサイ
トカイン調節因子を含む）である。本明細書中で使用される場合は、用語「ＰＫ
Ｒの発現」は、ＰＫＲ遺伝子の転写および翻訳をいう。その産物として、前駆体
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、お
よびそれらの誘導体（マウスまたはサルの酵素ような他のヒト以外の種に由来す
るＰＫＲを含む）。

【００３３】 本明細書中で使用される場合は、用語「ＰＫＲの生物学的活性」および「生物
学的に活性なＰＫＲ」は、ＰＫＲ、またはＰＫＲの任意のフラグメント、誘導体
、もしくはアナログに関連する任意の生体活性（例えば、酵素活性、特に、自己
リン酸化活性、真核生物の翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２）のリン酸化活性、もし
くはキナーゼ活性を含む）をいい、それによってサイトカインのようなタンパク
質の増強された転写を生じる。続いて、所定のサイトカイン調節因子の生物学的
活性が、当業者によって、代表的にその因子に帰される任意の生物学的活性をい
う。

【００３４】 本明細書中で使用される場合は、用語「正常なレベルのＰＫＲ活性」および「
正常なレベルのＰＫＲの発現」によって示される、用語「サイトカイン調節因子
の活性の正常なレベル」、「サイトカイン調節因子の発現の正常なレベル」は、
サイトカイン調節因子のレベル（例えば、特定の型（例えば、特定の細胞株）の
刺激されていないかまたは感染されていない細胞中に存在するとして決定される
、ＰＫＲ活性または発現）をいう。このような「正常な」サイトカイン調節因子
の活性または発現が、サイトカイン調節因子の活性または発現の範囲として報告
され、これは一般的には、サイトカイン調節因子をコードするベクターでトラン
スフェクトされていない、刺激されていない（誘導されていないかまたは感作さ
れていない）そして感染されていない所定の細胞型について観察され、そして培
養条件にいくらか依存して変化し得ることが明らかである。

【００３５】 例えば、Ｕ９３７細胞株は、正常な範囲のＰＫＲ活性を有し得る。これは、Ｕ
９３７、Ｔ９８Ｇ、またはＮａｍａｌｗａ細胞株についてのＰＫＲ活性の正常な
範囲とは異なるＰＫＲ活性の正常な範囲を有し得る。所定のサイトカイン調節因
子（例えば、ＰＫＲ）の過剰発現は、ＰＫＲをコードするベクターでトランスフ
ェクトされていない、刺激されていない（誘導されていないか前処理されていな
いか、または感作されていない）そして感染されていない、所定の型の細胞につ
いて一般的に観察されるＰＫＲの発現の正常な範囲を上回る発現レベルを意味す
ることになる。

【００３６】 同様に、本明細書中で使用される場合は、用語「正常なレベルのサイトカイン
活性」および「正常なレベルのサイトカインの発現」は、正常に産生するかまた
は所定のサイトカインを産生し得るかのいずれかであるトランスフェクトされて
いない細胞株のような、所定のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）を過剰
発現しない特定の型の細胞中に存在するとして決定される、サイトカインの活性
または発現のレベルをいう。このような「正常な」サイトカインの活性または発
現は、サイトカイン調節因子を過剰発現せず、そして培養条件にいくらか依存し
て変化し得る所定の型の細胞について一般的に観察されるサイトカインの活性ま
たは発現の範囲として報告されることが理解される。

【００３７】 例えば、ＰＫＲを過剰発現しない所定の細胞株は、ＰＫＲでのトランスフェク
ションおよびその過剰発現後の同じ細胞株についてのサイトカイン活性の範囲と
は異なる、サイトカイン活性の正常な範囲を有し得る。

【００３８】 （ＩＩ．発明の方法） 本発明は、哺乳動物細胞培養物中でのサイトカインの産生のレベルが、インビ
ボでサイトカインの発現を通常は調節する特定のタンパク質の発現または活性の
制御によって増大させられ得るという発見に基づく。

【００３９】 これらの因子として、サイトカイン特異的調節因子（例えば、インターフェロ
ン調節因子（ＩＲＦ−１、ＩＲＦ−３、およびＩＲＦ−７）、サイトカインレセ
プター、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、活性化因子タンパク質−１（ＡＰ−１）、
核因子ＩＬ−ｂ（ＮＦ−ＩＬ−６）、プロテインキナーゼＣ、ｐ３８ ＭＡＰＫ
、ＳＴＡＴ／Ｊａｋキナーゼシステム因子）、そして特にＰＫＲが挙げられる。

【００４０】 これらの調節因子の任意のものの発現または活性を増強することによって、１
つ以上のサイトカインをコードする遺伝子の正常な発現レベルよりも高いレベル
を生じる。このように増強されたサイトカインの発現は、サイトカインのより十
分でありそしてコストの低い産生を生じる。

【００４１】 ＰＫＲは、サイトカインの発現を調節し得るタンパク質の例として本明細書中
で使用される。しかし、他のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＭＡ、プロテイ
ンキナーゼＣ（ＰＫＣ）インデューサー、インターフェロン−γ、インターフェ
ロン−α、インターフェロン−β、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、および
ＰＤＧＦ）がＰＫＲの代わりに使用され得ることが理解される。

【００４２】 哺乳動物細胞中のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）の発現／活性を増
大させることによって、サイトカインの産生が増大させられ得る。従って、哺乳
動物細胞培養物（これは、より高い構成的なレベルのサイトカイン調節因子を発
現するか、またはここでサイトカイン調節因子の発現がより高いレベルに誘導さ
れ得る）が、サイトカインの産生のために有用である。

【００４３】 この方法は、サイトカインの発現を調節し得るタンパク質（サイトカイン調節
因子）（例えば、ＰＫＲを含むがこれに限定されない）を過剰発現する細胞の、
サイトカインの供給源としての（代表的には微生物ではないインデューサーが使
用されることを除いて、サイトカイン調節因子を過剰発現するために特定の方法
は必要とされない）使用をあてにする。しかし、いくつかの場合においては、ウ
イルスの誘導が（例えば、酪酸ナトリウム処理とともに）使用される。

【００４４】 特に、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）サイトカイン調節因子を過
剰発現するために十分な条件下で、サイトカイン調節因子またはそのアナログも
しくはホモログを過剰発現し得る哺乳動物細胞を培養する工程、および（ｂ）適
切である場合には、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するために細胞培養物を処
理する工程。

【００４５】 所定のサイトカインを産生するために使用される細胞は、サイトカイン調節因
子（例えば、任意の哺乳動物供給源に由来するＰＫＲ、例えば、ウサギの赤血球
、種々のマウス組織、またはヒトの末梢血単核細胞中に通常見出されるＰＫＲ）
を過剰発現し得る。好ましくは、マウスのｐ６５キナーゼ（Ｆｅｎｇ，Ｇ．Ｓ．
ら、１９９２）、そして最も好ましくは、ヒトｐ６８キナーゼ（Ｍｅｕｒｓ，Ｅ
．ら、１９９０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＮＭ ００２７５９）が、対応する
マウスまたはヒトの細胞培養物中でそれぞれ過剰発現される。

【００４６】 いくつか場合においては、過剰発現されるサイトカイン調節因子は、天然のサ
イトカイン調節因子のアナログ（例えば、天然のものではないプロテインキナー
ゼのようなＰＫＲアナログ（これは、サイトカインの転写のｄｓＲＮＡ活性化を
媒介し得る（通常は、天然のＰＫＲタンパク質をコードする遺伝子の改変によっ
て得られる））である。

【００４７】 サイトカイン調節因子を過剰発現し得る哺乳動物細胞は、当該分野で周知であ
る任意の多数の方法によって得ることができるか、または商業的な供給源から入
手することができる。

【００４８】 サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞を得るための例示的な方法として、
サイトカイン調節因子をより高いレベルで発現する細胞についての選択、プロモ
ーターの制御下でサイトカイン調節因子をコードする発現ベクターでのトランス
フェクション、および正常なレベルを上回るサイトカイン調節因子の発現の増大
を生じる他の方法が挙げられる。

【００４９】 さらなるアプローチとして、ＰＫＲを阻害する因子であるｐ５８（これは通常
は、ＰＫＲ活性を阻害する）の不活化またはそのレベルの低下が挙げられる。ｐ
５８の変異、改変、または遺伝子標的化除去によって、増強されたＰＫＲ活性を
生じる（Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．ら、１９９４）。

【００５０】 別の例として、ＰＫＲの発現を増強し得る、ＰＫＲの天然の、合成の、または
組換えの活性化因子（例えば、ＰＫＲ活性化因子タンパク質ＰＡＣＴ（Ｐａｔｅ
ｌ，Ｒ．Ｃ．およびＳｅｎ，Ｇ．Ｃ．，１９９８））が挙げられる。

【００５１】 本発明は、ヒトの細胞の形質転換に適切なベクター（例えば、哺乳動物細胞株
中のタンパク質の発現に有効な調節エレメントに対して作動可能に連結されたサ
イトカインの発現を調節するために有効なタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含有している、組換え発現ベクター）を提供する。好ましいコード配列と
して、ｐ６８（ヒト）キナーゼまたはｐ６５（マウス）キナーゼのコード配列が
挙げられる。関連する局面においては、本発明は、このベクターを含有している
哺乳動物宿主細胞を包含する。

【００５２】 １つの好ましいアプローチにおいては、ベクターは、イントロンおよび制御エ
レメント（例えば、適切な宿主、および／またはコード配列が異種遺伝子である
ベクターもしくは宿主の環境において、コード配列の発現に有効である、プロモ
ーターおよびターミネーターエレメントまたは５’および／もしくは３’非翻訳
領域）のような非コード配列と組合せて、融合タンパク質またはシグナルペプチ
ドのコード配列のようなさらなるコード配列とともにサイトカインの発現を調節
するために有効なタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド配列を含む。「異
種ＤＮＡ」および「異種遺伝子」は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部
に対して内因性ではないヌクレオチドを意味する。一般的には、このようなヌク
レオチドは、細胞に対して、トランスフェクション、相同組換え、マイクロイン
ジェクション、エレクトロポレーションなどによって付加されている。発現ベク
ターはまた、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位、および転写のターミネー
ターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。さ
らに、発現ベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現
型形質を提供するための、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。

【００５３】 多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして商
業的に入手可能である。ヒトの細胞での使用に適切なクローニングおよび発現ベ
クターがまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡ
ｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として明らかに援用されてい
る）に記載されている。例示的なプロモーターとして、構成性のプロモーターお
よび誘導性のプロモーターが挙げられ、それらの例として、ＣＭＶプロモーター
、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、
ｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）を含有しているプロモーター、およびメタロ
チオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎｅｉｎ）プロモーターが挙げられる。

【００５４】 サイトカインの発現を調節するために有効なタンパク質のコード配列を含有し
ている異種核酸配列は、ポリペプチドの発現のための種々の発現ベクターの任意
の１つに含まれ得る。任意のベクターが、導入される哺乳動物細胞中でそれが複
製可能でありそして存続可能である限りは、使用され得る。適切なＤＮＡ配列が
、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般的には、ＤＮＡ配列が、
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）中に標準的な手順によっ
て挿入される。このような手順および関連するサブクローニング手順は、当業者
の知見の範囲内であると考えられる。

【００５５】 上記のような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、または制御配
列を含有しているベクターが、細胞がタンパク質を発現することを可能にするよ
うに、そしてそれによってサイトカインの産生を増強するために、哺乳動物細胞
株を形質転換するために使用され得る。

【００５６】 ベクターの宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウムでのトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎによって媒介されるトランスフェクション、リポ
フェクタミン、またはリポフェクションによって媒介されるトランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションによって達成され得る（Ｄａｖｉｓ．Ｌ．、
Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。組換えサイトカインの
長期間の高収量での産生については、安定な発現が好ましい。続いて、安定な形
質転換体を作製するために有効な任意の方法が、本発明の実施において使用され
得る。

【００５７】 本発明はまた、本発明の発現ベクターで形質導入されているか、形質転換され
ているか、またはトランスフェクトされている宿主細胞を提供する。培養条件（
例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主について以前に使用
されたものであり、そして当業者に明らかである。

【００５８】 サイトカイン調節因子の発現に適切なクローン細胞株の例として、Ｎａｍａｌ
ｗａ、Ｕ９３７、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８細胞、Ｆｌｏｗ １０００
細胞、Ｆｌｏｗ ４０００細胞、ＦＳ−４およびＦＳ−７細胞、ＭＧ−６３細胞
、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、およびＴ９８Ｇ細胞が挙げられ
るが、これらに限定されない。サイトカイン調節因子の発現のために適切な初代
細胞型の例として、単球／マクロファージ系統の細胞、リンパ球系統の細胞（Ｔ
細胞およびＢ細胞を含む）、肥満細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト
、骨芽細胞に由来する細胞、メラニン細胞、内皮細胞、血小板、種々の他の免疫
系の細胞、肺の上皮細胞、膵臓の実質（ｐａｒｅｎｃｈｍａｌ）細胞、グリア細
胞、およびこのような細胞型に由来する腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定
されない。

【００５９】 好ましくは、サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞培養物は、サイトカイ
ンの誘導に利用可能な因子のレベルを調節するためのサイトカイン調節因子の過
剰発現が誘導可能である。

【００６０】 サイトカイン調節因子の過剰発現によって、サイトカイン調節因子の活性の正
常なレベルよりも高いことが意味される。サイトカイン調節因子の「正常な」活
性または発現は、サイトカイン調節因子をコードするベクターでトランスフェク
トされていない、刺激されていない（誘導も感作もされていない）、そして感染
していない、所定の型の細胞について一般的に観察される、サイトカイン調節因
子のある範囲の活性または発現として報告されている。サイトカイン調節因子の
正常な活性の範囲が、特定の因子、細胞型に依存して変化し、そして所定の細胞
型については、培養条件に依存していくらか変化し得ることが、理解される。

【００６１】 正常よりも高いレベルは、好ましくは、使用される特定の培養条件下で、所定
のサイトカイン調節因子についての正常なレベルの、少なくとも１５０％、より
好ましくは少なくとも２００％または３００％、最も好ましくは少なくとも５０
０％を意味する。サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞培養物は、サイトカ
イン調節因子の過剰発現について構成性であり得るか、またはサイトカイン調節
因子の過剰発現について誘導性であり得る。

【００６２】 １つの好ましい実施態様においては、サイトカイン調節因子はＰＫＲであり、
そしてＰＫＲを過剰発現する細胞培養物は、サイトカインの誘導に利用可能なＰ
ＫＲのレベルを調節するために、ＰＫＲの過剰発現について誘導性である。かな
り多数の公知の細胞型が、ＰＫＲを過剰発現する細胞株を作製するために、特に
上記に提供される特定の例を用いて、有用である。

【００６３】 所定のサイトカイン調節因子の活性は、当該分野で公知の方法によって決定さ
れ得る。例示として、ＰＫＲの発現についてのアッセイとしては、自己リン酸化
アッセイ、ｅＩＦ２αのリン酸化についてのアッセイ、タンパク質のレベルにつ
いてのウェスタンブロット分析、およびノーザンブロット分析、ならびにＰＫＲ
ｍＲＮＡについての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げ
られる。

【００６４】 一般的には、さらなる工程が、哺乳動物細胞によるサイトカインの発現を増強
するために行われる。このような工程として、以下の工程の１つ以上が挙げられ
る：（１）サイトカイン調節因子の発現を増強するために有効な条件下でトラン
スフェクトされた細胞を培養する工程、（２）ポリペプチド、化学薬品、または
核酸を含むがこれらに限定されない試薬を用いて、サイトカイン調節因子を発現
する細胞を感作する工程、および（３）サイトカインの産生を誘導するために、
サイトカイン調節因子を発現する細胞を処理する工程（誘導）。

【００６５】 感作は、感作剤（例えば、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、および他
のホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、インターフェロン−α、イン
ターフェロン−γ、インターフェロン−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧ
Ｆ、ＴＧＦ、ＥＧＦ、酪酸ナトリウム、キナーゼ活性化因子、または転写活性化
因子）で処理することを含み得る。

【００６６】 処理は、細胞培養物に対して微生物（すなわち、ウイルス）または微生物では
ないインデューサーを添加することを含み得る。一般的には、インデューサーは
、微生物ではないインデューサー（例えば、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）、またはポ
リｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ））である。

【００６７】 一般的には、Ｕ９３７細胞が、ＦＧＦおよびｓＴＮＦ−Ｒの産生に好ましい；
Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＩＬ−３およびＴＮＦ−βの産生に好ましい；線維芽細胞
が、ＦＧＦおよびアンギオスタチンの産生に好ましい；Ｕ９３７細胞が、ＩＬ−
６およびそのホモログの産生に好ましい；ＪｕｒｋａｔおよびＨＵＴを含むＣＤ
−４を発現する細胞が、ＴＮＦ−βの産生に好ましい；そしてＪａｒｋａｔおよ
びＮａｍａｌｗａを含むＴ細胞およびＢ細胞が、ＩＬ−８およびそのホモログの
産生に好ましい。

【００６８】 一旦、所定のサイトカインの上昇した発現が達成されると、それによって産生
されたサイトカインが、細胞培養物から精製される。このような精製に適切な例
示的な手順として、以下が挙げられる：抗体−アフィニティーカラムクロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シ
リカまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）でのクロマトグラフィー；ク
ロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；および例え
ば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過。タンパク質精製の種々の
方法が使用され得、そしてこのような方法は当該分野で公知であり、そして例え
ば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８
２、１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：Ｐ
ＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２に記載されている。選択される精製工程（単
数または複数）は、例えば、使用される産生プロセスの性質、および産生される
特定のサイトカインの性質に依存する。

【００６９】 本発明の１つの好ましい局面においては、培養条件、感作、および処理の組合
せによって、有意に増強されたサイトカインの産生（例えば、少なくとも２．５
倍の増大、そして好ましくは、１０倍以上の増大）を生じる。いくつかの場合に
おいては、本発明の方法は、１００から１０００倍またはそれ以上である、サイ
トカインの産生における増大を生じる。

【００７０】 細胞培養でのサイトカインの産生に代表的に付随する問題点（例えば、組換え
ではない哺乳動物系による低い収量、不適切なグリコシル化、または微生物系に
おいて産生されるタンパク質の誤った折り畳み）は、本発明の方法において排除
される。本発明の方法は、治療用のタンパク質の開発に有用であることが証明さ
れるはずである。

【００７１】 （ＩＩＩ．サイトカイン） サイトカインは、それらの同族レセプターに結合することによって、それらの
生物学的活性が引き出され、続いて、シグナル伝達によって種々の生化学的プロ
セスの刺激を導く。いくつかの場合においては、このようなレセプターの発現は
、特異的なシグナルによって調節される。例えば、サイトカインは、ポジティブ
なまたはネガティブなフィードバックループに関与し得、そしてそれによって同
じまたは異なるサイトカインのレセプターの発現を調節し得る。このようなレセ
プターは、サイトカインを産生する同じ型の細胞または異なる型の細胞であり得
る。

【００７２】 サイトカインは、免疫応答および炎症性の応答を媒介しそして調節するように
作用する。一般的には、サイトカインの産生は一時的であり、そして産生は、短
い転写期間の間に行われ、そしてこれもまた短く存続しそして転写後の制御機構
に供される、ｍＲＮＡ転写物の産生を生じる。最近の研究は、一般的なシグナル
伝達経路である、「Ｊａｋ／ＳＴＡＴ」経路が、種々のサイトカインによって使
用されることを示した（Ａｂｂａｓ，ＡＫら、１９９７）。

【００７３】 サイトカインの細胞性の供給源が、複数の多岐にわたる型の細胞による産生が
可能であるそれぞれの個々のサイトカインの特徴を区別することが理解される。
さらに、所定のサイトカインは、（１）１より多くの型の細胞に対して作用し得
、（２）同じ細胞に対して１より多くの影響を有し得、（３）別のサイトカイン
と共有される活性を有し得、そして（４）他のサイトカインの合成または効果に
、その効果を拮抗または相乗作用することによって影響を与え得る。

【００７４】 組換えの可溶性の腫瘍壊死因子レセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）は、ＴＮＦを中和
し、そして抗炎症特性を有することが観察されている。

【００７５】 ｓＴＮＦ−Ｒは現在、組換えタンパク質として産生されている。

【００７６】 ｓＴＮＦ−Ｒの産生のための標的細胞として、単球／マクロファージ系統の細
胞が挙げられる。

【００７７】 ｓＴＮＦ−Ｒの臨床的な有用性として、慢性関節リウマチおよび敗血症に対す
る適用、ならびに種々の研究用の適用が挙げられる。

【００７８】 インターロイキン−２（ＩＬ−２）または「Ｔ細胞増殖因子」は、Ｔ細胞の増
殖および機能を促進することが公知である。Ｔヘルパーリンパ球が、特定の有子
分裂促進因子での刺激、または抗原提示細胞の表面上での抗原／ＭＨＣ複合体と
Ｔ細胞レセプター複合体との相互作用によって活性化されている場合、ＩＬ−２
およびＩＬ−２レセプターが誘導され、それによって抗原特異的Ｔ細胞のクロー
ン性拡大を生じる（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ＫＡ、１９８８；Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ
、１９９４を参照のこと）。

【００７９】 ＩＬ−２は、現在、種々の細胞型中の組換えＩＬ−２タンパク質の発現によっ
て産生されている。

【００８０】 ＩＬ−２の産生のための標的細胞として、Ｔ細胞が挙げられる。

【００８１】 ＩＬ−２の臨床的な有用性として、抗ガン適用および抗ＨＩＶ適用、ならびに
種々の研究的な使用が挙げられる。

【００８２】 インターロイキン−３（ＩＬ−３）は、多数の型の造血細胞（顆粒球、マクロ
ファージ、好酸球、肥満細胞、巨核球、および赤血球を含む）の形成における刺
激因子と推定されている。

【００８３】 ＩＬ−３は、骨髄（ＢＭ）幹細胞に対して多数の造血効果を有することが観察
されており、これは、Ｇ−ＣＳＦよりも多面発現性である。

【００８４】 ＩＬ−３は現在、組換えＤＮＡ技術を使用して産生されている。

【００８５】 ＩＬ−３の産生のための標的細胞として、Ｔ細胞および肥満細胞が挙げられる
。

【００８６】 ＩＬ−３の臨床的な有用性として、以下に対する適用が挙げられる：（１）エ
キソビボでのＴ細胞および幹細胞の拡大、（２）インビボでのＢＭ移植後、（３
）骨髄の不全（化学療法）、（４）血液の疾患、ならびに（５）汎血球減少症、
さらに種々の研究的な使用。

【００８７】 インターロイキン−４（ＩＬ−４）もまた、Ｂ細胞刺激因子（すなわち、ＢＳ
Ｆ−１）として公知であり、これは、以下を含む多数の生物学的影響を有するこ
とが観察されている：（１）Ｔ細胞、肥満細胞、顆粒球、巨核球、および赤血球
の同時刺激、（２）休止Ｂ細胞上でのクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の発
現の誘導、（３）刺激されたＢ細胞によるＩｇＥおよびＩｇＧ１アイソタイプの
増強された分泌、ならびに（４）抗炎症特性。

【００８８】 ＩＬ−４は、２型のヘルパーＴ細胞（ＴＨ２）応答に対する影響および抗増殖
特性を有することが観察されている。

【００８９】 ＩＬ−４は現在、組換えタンパク質としての発現によって産生されている。

【００９０】 ＩＬ−４の産生のための標的細胞として、Ｔ細胞および肥満細胞が挙げられる
。

【００９１】 ＩＬ−４の臨床的な有用性として、エキソビボでの幹細胞の拡大、抗ガンスト
ラテジー、および固形腫瘍の処置に対する適用、さらに種々の研究的な使用が挙
げられる。

【００９２】 インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、アレルギー性の応答の抑制および抗酸
球の抑制に対して影響を有することが提案されている。

【００９３】 ＩＬ−５は現在、組換えタンパク質としての発現によって産生されている。

【００９４】 ＩＬ−５の産生のための標的細胞として、Ｔ細胞および肥満細胞が挙げられる
。

【００９５】 ＩＬ−５の臨床的な有用性として、喘息の処置における適用、さらに種々の研
究的な使用が挙げられる。

【００９６】 インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、種々の細胞型によって産生される多機
能性のサイトカインであり、そして免疫系の細胞、肝細胞、腎臓細胞、造血幹細
胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔａｍｉｎａｌ ｃｅｌｌ）、ケラチノサ
イト、およびニューロンを含む種々の細胞型に対して、分化因子および成長因子
として作用する。

【００９７】 ＩＬ−６は、炎症において役割を果たすこと、および抗増殖特性を有すること
観察されている。

【００９８】 ＩＬ−６は現在、組換えタンパク質としての発現によって産生されている。

【００９９】 ＩＬ−６の産生のための標的細胞として、線維芽細胞、Ｔ細胞、および単球／
マクロファージ系統の細胞が挙げられる。

【０１００】 ＩＬ−６の臨床的な有用性として、乳ガンおよび白血病の処置に対する適用が
挙げられ、そしてＩＬ−６の抗炎症特性は、種々の感染性の疾患および血小板新
生の障害の処置、さらに種々の研究的な使用に有用であり得る。

【０１０１】 「リンホポエチン−１」として以前に公知のインターロイキン−７（ＩＬ−７
）は、長期間の骨髄培養物から誘導されるプレ−Ｂ細胞（Ｂ２２０＋細胞）の増
殖を刺激するその能力によって最初に定義された（Ｗｈｉｔｌｏｃｋら、１９８
４）。ＩＬ−７は、骨髄中でのＢ細胞およびＴ細胞の前駆体の増殖を刺激し、そ
して以下において役割を果たすことが観察されている：（１）皮膚でのサイトカ
インの合成、（２）増大した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性、および（
３）増大したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性。

【０１０２】 ＩＬ−７は、現在は、組換えタンパク質としての発現によって産生されている
。

【０１０３】 ＩＬ−７の産生のための標的細胞として、骨髄細胞およびケラチノサイトが挙
げられる。

【０１０４】 ＩＬ−７の臨床的な有用性として、黒色腫の処置に対する適用、さらに種々の
研究用途に対する適用が挙げられる。

【０１０５】 インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、化学走化性のサイトカインであり、ヒ
トの好中球の脱顆粒化を生じ得、そしてケラチノサイト、上皮細胞、滑膜細胞（
ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）、肝細胞、単球、および好中球によって産生される。
ＩＬ−８の生物学的な影響は、７回膜貫通ドメイン、Ｇタンパク質共役型レセプ
ターを通じて媒介されるとして記載されている。

【０１０６】 ＩＬ−８は、ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーであり、そして化学走化
特性および血管形成特性を有することが観察されている。

【０１０７】 ＩＬ−８は、現在は、組換えタンパク質としての発現によって産生されている
。

【０１０８】 ＩＬ−８の産生のための標的細胞として、線維芽細胞、Ｔ細胞、および単球／
マクロファージ系統の細胞が挙げられる。

【０１０９】 臨床研究は完了していないが、ＩＬ−８の推定される有用性として、細菌およ
びウイルスの感染の処置のための適用、ガン治療における適用、および血管の増
殖を促進することにおける適用、さらに種々の研究用途に対する適用が挙げられ
る。

【０１１０】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β；リンホト
キシン）は、それぞれ主にマクロファージおよびリンパ球によって産生される。
ＴＮＦ−αは、多数の生物学的機能（移植された腫瘍の出血性の壊死、細胞傷害
性を含む）、内毒素のショックおよび炎症、免疫調節、増殖、および抗ウイルス
応答における重要な役割を有する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは、生物学的活
性の同様のスペクトルを共有する。ＴＮＦ−βは、新生物細胞株に対して抗細胞
性の活性を示すが、初代細胞培養物および正常な細胞株に対しては示さない。こ
のことは、それが強力な抗腫瘍活性を有することを示唆している。ＴＮＦ−βも
また、リンパ系の器官の発達において重要な役割を果たす。ＴＮＦ−αおよびＴ
ＮＦ−βは、それらの同様の活性と矛盾しない同じ細胞表面レセプターに結合す
る。

【０１１１】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの臨床的な有用性として、抗ガン適用、特に、他
の化学療法薬または遺伝子治療と組合せた適用が、挙げられる。比較的低用量の
ＴＮＦが投与され得るような組合せ治療が、重要であり得る（１９９９年１１月
２日に発行された米国特許第５，９７６，８００号）。この薬剤は、黒色腫、骨
肉種、乳ガン、およびリンパ腫を含む、散在性の腫瘍を有する患者の処置に有用
であり得る。

【０１１２】 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、好中球前駆体の増殖および分化を
刺激し、そして顆粒球の維持および酸化的バースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕ
ｒｓｔ）において役割を果たすことが、観察されている。

【０１１３】 Ｇ−ＣＳＦは、現在は、細菌および哺乳動物宿主細胞中での組換えタンパク質
としての発現によって産生されている。

【０１１４】 Ｇ−ＣＳＦの産生のための標的細胞として、線維芽細胞、内皮細胞、および単
球／マクロファージ系統の細胞が挙げられる。

【０１１５】 Ｇ−ＣＳＦの臨床的な有用性として、化学療法後の汎血球減少症の処置、骨髄
移植後の処置に対する適用、および種々の研究用途に対する適用が挙げられる。

【０１１６】 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、それらの始原
細胞からの顆粒球およびマクロファージのコロニーの産生を刺激し、そして多能
性の始原細胞の増殖および分化を促進することが観察されている。さらに、ＧＭ
−ＣＳＦは、顆粒球およびマクロファージの機能においてエフェクターの役割を
果たすようである。

【０１１７】 ＧＭ−ＣＳＦは、現在は、細菌および哺乳動物宿主細胞中での組換えタンパク
質の発現によって産生されている。

【０１１８】 ＧＭ−ＣＳＦの産生のための標的細胞として、線維芽細胞、内皮細胞、および
Ｔ細胞が挙げられる。

【０１１９】 ＧＭ−ＣＳＦの臨床的な有用性として、化学療法後の汎血球減少症の処置、骨
髄移植後の処置に対する広範な適用、および種々の研究用途に対する適用が挙げ
られる。

【０１２０】 線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（酸性の形態および塩基性の形態の両方）は、
血管形成および内皮細胞の増殖において役割を果たすことが観察されている。培
養物中で組換えＦＧＦ−５を用いる研究は、それが培養された運動ニューロンの
生存性を促進し得ることを示し、このことは、ＦＧＦ−５が運動ニューロンの神
経栄養性因子であることを示している。

【０１２１】 ＦＧＦは、組換えタンパク質としての発現によって現在は産生されている。

【０１２２】 ＦＧＦの産生のための標的細胞として、血小板、内皮細胞、およびマクロファ
ージ系統の細胞が挙げられる。

【０１２３】 ＦＧＦの有用性として、虚血性心臓疾患、うっ血性心不全、および炎症応答を
含む種々の状態の処置に対する適用、ならびに種々の研究用途に対する適用が挙
げられる。

【０１２４】 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、多数の生理学的影響（血管形成、窒素酸化
物によって媒介される血管拡張、増大した血管の浸透性、ならびに増大した内皮
細胞の増殖および運動性を含む）を有する血管形成性の増殖因子である。ＶＥＧ
Ｆの発現は、虚血によって有意にアップレギュレートされることが観察されてい
る。

【０１２５】 ＶＥＧＦは、現在は、微生物および哺乳動物宿主細胞中で組換えタンパク質の
発現によって産生されている。

【０１２６】 ＶＥＧＦの産生のための標的細胞として、種々の免疫細胞が挙げられる。

【０１２７】 ＶＥＧＦの有用性として、うっ血性の心不全の処置に対する適用、さらに種々
の研究用途に対する適用が挙げられる。

【０１２８】 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２）は、増殖因子として
作用し、そして血管形成において役割を果たすことが観察されている。精製され
たヒトの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、間葉由来の培養された平滑筋細胞
、線維芽細胞、およびグリア細胞についてのマイトジェンであり、そして単球お
よび好中球の化学接着因子として作用することが示されている。

【０１２９】 インビボでは、ＰＤＧＦは、血小板のα顆粒中および内皮細胞中に見出され、
そして創傷治癒特性を有することが示されている。

【０１３０】 ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２は、現在は、組換えタンパク質としての発現
によって産生されている。

【０１３１】 ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２の産生のための標的細胞として、血小板、内
皮細胞、および単球／マクロファージ系統の細胞が挙げられる。

【０１３２】 ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２の有用性として、虚血性心疾患の処置に対す
る適用、および種々の研究用途に対する適用が挙げられる。

【０１３３】 アンギオスタチンおよびアンドスタチンは、内皮細胞の増殖の阻害において役
割を果たすことが観察されている。アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、
腫瘍を保有している動物中の血管形成のインヒビターとして作用することが観察
されている（Ｌａｎｎｕｔｔｉ ＢＪら、１９９７；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳら
、１９９７）。

【０１３４】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンの産生のための標的細胞として、種々
の免疫系の細胞が挙げられる。

【０１３５】 アンギオスタチンおよびエンドスタチンの有用性として、ガンの処置における
適用、および種々の研究用途における適用が挙げられる。

【０１３６】 （さらなるサイトカイン） その発現が本発明の方法を使用して増大され得る他の例示的なサイトカインと
して、上記のサイトカインのさらなるファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−６
ファミリーのメンバーであるオンコスタチンＭ；ＩＬ−１１、白血病阻害因子（
ＬＩＦ）；毛様体好中球因子およびカルジオトロピン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈ
ｉｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記のサイトカイン
についての同族のレセプター（例えば、ＴＮＦ可溶性レセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ
）、Ｆａｓ可溶性レセプター（ｓＦａｓ）、およびＩＬ−６ファミリーレセプタ
ー、可溶性の糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０））の発現が、増大させられ得る
。その発現が本発明の方法を使用して増大させられ得るさらなる例示的なサイト
カインとして、その遺伝子がＰＫＲによって活性化される転写因子によって調節
されるサイトカイン（ＮＦ−κＢ、ＩＲＦ−１、３、および７、ならびにＳｔａ
ｔファミリーのメンバーを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０１３７】 （ＩＶ．ＰＫＲ） １つの例示的なアプローチにおいては、ＰＫＲは、サイトカインの産生を増強
させるために使用される因子であり、そして本発明の方法を実施することにおい
て使用される細胞は、ＰＫＲを産生し得、そして改変が存在していないＰＫＲの
ベースラインレベルを生じる。

【０１３８】 いくつかの例においては、ＰＫＲ活性は、ＰＫＲ自己リン酸化活性、あるいは
基質をリン酸化することにおけるキナーゼの活性、好ましくは、真核生物の開始
因子−２α（ｅＩＦ−２α）、または別の因子（例えば、核因子−κＢ（ＮＦ−
κＢ）を測定することによって（Ｌｉｎｋら、２６７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２３９、１９９２）、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＰＫＲ
特異的抗体でのウェスタンブロッティングのような生化学的な試験によって、直
接評価され得る。

【０１３９】 多数のアプローチが、ＰＫＲの発現を増強するために行われ得る。本発明の１
つの実施形態においては、ＰＫＲの発現は、所定のサイトカインを産生し得る哺
乳動物宿主細胞を、プロモーターに作動可能に連結されたＰＫＲをコードする配
列を含有しており、かつ哺乳動物宿主細胞によるＰＫＲの発現に必須の制御配列
を含有している発現ベクターでトランスフェクトすることによって、増強される
。

【０１４０】 ＰＫＲをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた宿主細胞は、
細胞中でのコードされるＰＫＲの発現に適切な条件下で培養され得る。当業者に
よって理解されているように、ＰＫＲをコードするポリヌクレオチドを含有して
いる発現ベクターは、組換え細胞によって産生されるＰＫＲが、使用される配列
および／もしくはベクターに依存して、分泌され得るか、膜に結合し得るか、ま
たは細胞内に含まれ得るように設計され得る。

【０１４１】 いくつかの場合においては、さらなる工程が、トランスフェクトされた宿主細
胞によるＰＫＲの発現を増強するために行われ得る。このような工程は、以下の
工程の１つ以上を包含する：（１）ＰＲＫの発現を増強するために有効な条件下
でトランスフェクトされた細胞を培養する工程、（２）ＰＫＲでトランスフェク
トされた細胞を感作する工程、および（３）さらに以下に記載されるように、サ
イトカインの産生を誘導するために、ＰＫＲでトランスフェクトされた細胞を処
理する工程。

【０１４２】 好ましい実施形態においては、培養条件、感作、および処理の組合せは、有意
に増強されたサイトカインの産生（例えば、少なくとも２．５倍の増大、そして
好ましくは、１０倍以上の増大）を生じる。いくつかの場合においては、本発明
の方法は、１００倍から１０００倍またはそれ以上であるサイトカインの産生に
おける増大を生じる。

【０１４３】 （Ｖ．サイトカインの発現の評価） サイトカイン調節因子を過剰発現する細胞株によって目的のサイトカインの発
現を評価するために、アッセイは、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで行われ得
るか、または発現される個々のサイトカインに対する特定の機能的なバイオアッ
セイの使用によって行われ得る。

【０１４４】 特定のサイトカインタンパク質についてのイムノアッセイは、当業者によって
慣用的に使用される手順を使用して行われ得る。このようなイムノアッセイは、
目的のサイトカインの発現を定性的にかつ定量的に分析するために使用され得る
。

【０１４５】 精製された形態の目的のサイトカインは、天然の供給源から得られ得るか、ま
たはトランスフェクトされた細胞中での組換えによる産生によって得ることがで
き、そしてタンパク質精製のための標準的な技術を使用して精製され得る。精製
されたタンパク質は、次いで、発現されたタンパク質について特異的なモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを産生するために使用され得る
。これは、種々のイムノアッセイにおいて使用され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｓ．，Ｎ．Ｙ．，１９
８８を参照のこと）。例示的なアッセイとして、ＥＬＩＳＡ，競合イムノアッセ
イ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、間接的な免疫蛍光アッセイな
どが挙げられる。

【０１４６】 一般的には、このような抗体は、商業的に入手可能である。サイトカイン分析
キット（これもまた、商業的に入手可能である）は、代表的には、既知のサイト
カインの発現レベルの定量的なイムノアッセイのために使用される。

【０１４７】 上記の工程の特定の例が、以下の実施例に示される。しかし、多くの改変が可
能であり、そして実施例が、例示の目的のみのために提供され、そして特に記載
されない限りは、本発明を限定しないことが、当業者に明らかである。

【０１４８】 （実施例１） （ＰＫＲを過剰発現するＮａｍａｌｗａ細胞株の調製） 全長のヒトのＰＫＲ分子をコードするｃＤＮＡ（５５１アミノ酸；Ｍｅｕｒｓ
，Ｅ．ら、１９９０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＮＭ ００２７５９号）を、真
核生物の発現ベクター中に挿入し、その結果、ＰＫＲコード配列を、ＣＭＶプロ
モーターの制御下で発現させた。このベクターは、以下を含む、ＰＫＲの転写に
適切な種々の特徴を含む：ｉ）高レベルのｍＲＮＡの発現のためのヒトＣＭＶ（
サイトメガロウイルス）の最初期遺伝子に由来するプロモーター配列；ｉｉ）Ｒ
ＮＡの安定性を増強させるための、β−グロビン遺伝子に由来するポリアデニル
化シグナルおよび転写終結配列；ｉｉｉ）アンピシリン耐性遺伝子；ならびにｉ
ｖ）Ｅ．ｃｏｌｉ中での選択および維持のためのＣｏｌＥ１複製起点。第２のベ
クターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子
およびＣｏｌＥ１起点、ならびに真核生物細胞への同時トランスフェクション後
のプラスミドの選択および同定を可能にするＧ４１８耐性マーカー（Ｎｅｏ）を
含んだ。

【０１４９】 安定なトランスフェクタントを、８００μＦ、３００Ｖの設定でＧｅｎｅ Ｐ
ｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＋１０％のＦ
ＢＳ）中で、１５μｇのＰＫＲ発現プラスミドおよび１５μｇのＮｅｏを含有し
ているベクターでの、４×１０⁶個の対数増殖しているＮａｍａｌｗａ細胞のエ
レクトロポレーションによって得た。安定なトランスフェクタントのバルクの集
団を、３〜４週間の２ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）での選択
によって得た。クローン株を続いて、限界稀釈クローニングによって得た。親細
胞およびＰＫＲでトランスフェクトしたＮａｍａｌｗａ細胞中のＰＫＲのレベル
を分析し、そして親のＮａｍａｌｗａ細胞と比較して、ＰＫＲトランスフェクタ
ントにおいては約１６倍の増大を有することを見出した。

【０１５０】 １つの代表的なＰＫＲを過剰発現する、そしてクローンのＮａｍａｌｗａ細胞
株を選択し、そして２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７と命名した。

【０１５１】 ２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７および親のＮａｍａｌｗａ細胞を、２．５×１０⁵個の細
胞／ｍｌで、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。こ
の細胞を、２０ｎＭのＰＭＡで２０時間処理（感作）し、続いて、２００μｇ／
ｍｌのポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で３日間処理（誘導）した。１つのセットの細胞
を、未処理のまま放置した（誘導していないコントロール）。処理後、培養上清
を回収し、そしてインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（
ＩＬ−８）、およびＴＮＦ−βのレベルについて、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）の供給者によって提供される手順に従ってＥＬＩＳＡによって
分析した。

【０１５２】 ＩＬ−６の種々の条件下での産生を、図１に示す。親のＮａｍａｌｗａ細胞株
および２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７細胞株のいずれもが、感作剤（ＰＭＡ）および誘導剤
［ポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）］の非存在化ではＩＬ−６を産生しなかった。ＰＭＡ
およびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で処理した親のＮａｍａｌｗａ細胞もまた、検出
可能なＩＬ−６を産生しなかった（３ｐｇ／ｍｌの最少検出可能レベルを有する
アッセイにおいて）。対照的に、ＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で処理し
た２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７は、３００ｐｇ／ｍｌより多くのＩＬ−６を産生した。こ
のことは、未処理の２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７細胞、ならびにＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ
）：ｒ（Ｃ）で処理した親のＮａｍａｌｗａ細胞を上回る、ＩＬ−６の産生にお
ける少なくとも１００倍の増大を示す。さらに、いくつかの他のＰＫＲを過剰発
現するクローン細胞株が、ＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）処理後に３００
ｐｇ／ｍｌより多くのＩＬ−６を産生した（データは示さない）。これらの結果
は、Ｎａｍａｌｗａ細胞中でのＰＫＲ遺伝子をの過剰発現、続く感作、および活
性化が、ＩＬ−６の過剰発現を生じることを示す。

【０１５３】 種々の条件下でのＩＬ−８の産生を図２に示す。ＩＬ−６について得られた結
果と一致して、親のＮａｍａｌｗａ細胞および２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７の両方ともが
、感作剤（ＰＭＡ）および誘導剤［ポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）］の非存在下ではＩ
Ｌ−８を産生しなかった。ＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で処理した親の
Ｎａｍａｌｗａ細胞もまた、検出可能なＩＬ−８を産生しなかった（３１ｐｇ／
ｍｌの最少検出可能レベルを有するアッセイにおいて）。対照的に、ＰＭＡおよ
びポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で処理した２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７は、約３００ｐｇ／ｍ
ｌのＩＬ−８を産生した。このことは、未処理の細胞、ならびにＰＭＡおよびポ
リｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で処理した親のＮａｍａｌｗａ細胞を上回る、少なくとも
１０倍の増大を示す。さらに、いくつかの他のＰＫＲを過剰発現するクローン細
胞株が、ＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）処理後に２５０〜４７０ｐｇ／ｍ
ｌの間のＩＬ−８を産生した（データは示さない）。

【０１５４】 種々の条件下でのＴＮＦ−βの産生を図３に示す。この場合においては、親の
Ｎａｍａｌｗａ細胞および２Ａ１．Ｄ１．Ｇ７の両方ともが、感作および誘導の
非存在下ではＴＮＦ−βを産生しなかった。しかし、感作および誘導の後、親の
Ｎａｍａｌｗａ細胞株は、約８００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−βを産生し、一方、２
Ａ１．Ｄ１．Ｇ７細胞株は、２０００ｐｇ／ｍｌより多くを産生した。また、Ｐ
ＫＲを過剰発現する細胞株は、ＰＭＡおよびポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）での処理の
後に、親の細胞株よりも多いサイトカインを産生した（約２．５倍の増大）。さ
らに、いくつかの他のＰＫＲを過剰発現するクローンの細胞株は、ＰＭＡおよび
ポリｒ（Ｉ）：ｒ（Ｃ）での処理の後に、２０００ｐｇ／ｍｌより多くのＴＮＦ
−βを産生した（データは示さない）。

【０１５５】 本明細書中に示す結果は、本発明が哺乳動物細胞培養物中でのサイトカインの
産生を増強するための効果的な方法を提供することを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、形質転換されていないＮａｍａｌｗａおよびＰＫＲを過剰発現するＮ
ａｍａｌｗａ細胞中でのインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生を示す。２Ａ１
．Ｄ１．Ｇ７および親のＮａｍａｌｗａ細胞を、２０ｎＭのＰＭＡを含有してい
るＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２０時間培養し、続いて２００μｇ／ｍｌのポリｒ
（Ｉ）：ｒ（Ｃ）で３日間処理した（＋）かまたは処理しないまま放置した（−
）。培養上清を回収し、そして供給者によって提供された手順に従って、ＥＬＩ
ＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＩＬ−６の産生について分析した。

【図２】 図２は、培養上清をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の供給者に
よって提供される手順に従ってＥＬＩＳＡによってＩＬ−８の産生について分析
したことをのぞいて、図１の説明に示される同じ手順の後、形質転換していない
Ｎａｍａｌｗａ細胞およびＰＫＲを過剰発現するＮａｍａｌｗａ細胞中でのイン
ターロイキン−８（ＩＬ−８）の産生を示す。

【図３】 図３は、培養上清をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の供給者に
よって提供される手順に従ってＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−βの産生について分
析したことをのぞいて、図１の説明に示される同じ手順の後、形質転換していな
いＮａｍａｌｗａ細胞およびＰＫＲを過剰発現するＮａｍａｌｗａ細胞中での腫
瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）の産生を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ブラウニング， ローラ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94513， ブレントウッド， アウトリッガー サ ークル 925 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA10 BA26 BA28 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 4B064 AG03 AG07 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA29

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物細胞培養物中でサイトカインを産生するための方法
   であって、以下： （ａ）サイトカインを産生し得る哺乳動物細胞株を培養する工程； （ｂ）該培養された哺乳動物細胞株中のサイトカイン調節因子の過剰発現を生
   じるために有効な様式で、該細胞株を改変する工程であって、ここでサイトカイ
   ンの発現を調節し得る因子の正常を上回るレベルが、該細胞株中で得られる、工
   程； （ｃ）サイトカインの産生をもたらすために、該培養されて、サイトカイン調
   節因子を過剰発現する哺乳動物細胞株を処理する工程；および （ｄ）該培養されて、処理された細胞株によって産生された該サイトカインを
   回収する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記サイトカイン調節因子がＰＫＲである、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記改変する工程が、トランスフェクトされた細胞中でサイ
   トカイン調節因子の過剰発現を生じる条件下で、プロモーターに作動可能に連結
   された該サイトカイン調節因子をコードするＤＮＡを含有している発現ベクター
   を用いて、前記培養された哺乳動物細胞株にトランスフェクトする工程を意味す
   る、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記処理工程が、感作工程を包含する、請求項１に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 前記処理工程が、誘導工程をさらに包含する、請求項４に記
   載の方法。
6. 【請求項６】 前記感作工程が、ホルボールエステルでの処理によって達成
   される、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記誘導工程が、ポリｒ（Ｉ）：ポリｒ（Ｃ）での処理によ
   って達成される、請求項５に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記サイトカインが、インターロイキン６（ＩＬ−６）、イ
   ンターロイキン８（ＩＬ−８）、および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）からなる
   群より選択される、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記プロモーターが誘導性のプロモーターである、請求項１
   に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記誘導性のプロモーターが、メタロチオネインプロモー
    ターまたはテトラサイクリン（ＴＲＥ）プロモーターである、請求項９に記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項８
    に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記サイトカインがインターロイキン６（ＩＬ−６）であ
    り、そして前記哺乳動物細胞株がＮａｍａｌｗａである、請求項８に記載の方法
    。
13. 【請求項１３】 前記サイトカインがインターロイキン８（ＩＬ−８）であ
    り、そして前記哺乳動物細胞株がＮａｍａｌｗａである、請求項８に記載の方法
    。
14. 【請求項１４】 前記サイトカインが腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）であり
    、そして前記哺乳動物細胞株がＮａｍａｌｗａである、請求項８に記載の方法。
15. 【請求項１５】 ＰＫＲの正常を上回る発現およびインターロイキン６（Ｉ
    Ｌ−６）の正常を上回る発現を特徴とする、哺乳動物細胞株組成物。
16. 【請求項１６】 ＰＫＲの正常を上回る発現およびインターロイキン８（Ｉ
    Ｌ−８）の正常を上回る発現を特徴とする、哺乳動物細胞株組成物。
17. 【請求項１７】 ＰＫＲの正常を上回る発現および腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ
    −β）の正常を上回る発現を特徴とする、哺乳動物細胞株組成物。