JP2002010784A

JP2002010784A - 細胞増殖抑制剤

Info

Publication number: JP2002010784A
Application number: JP2000196514A
Authority: JP
Inventors: Naoko Namiki; 直子並木; Naotaka Suzuki; 直貴鈴木; Noriyuki Tsunekawa; 典之恒川; Shinji Kobayashi; 慎治小林; Hiroshi Eguchi; 広志江口; Yukiya Koike; 行也小池; Yoshihiko Washimi; 芳彦鷲見
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2002-01-15
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: JP4469467B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの特定の領
域に結合し、該レセプターの細胞増殖に関する機能を阻
害する薬剤を提供する。【解決手段】ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの
構造のうち細胞増殖に関与する特定の領域に結合するポ
リペプチドまたは化合物。例えば、ＰＡＲ１型ヒトトロ
ンビンレセプターのアミノ末端側の５２番目から５６番
目のアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｒｐに結合するポリペプチドまたは化合物。これらは細
胞増殖阻害活性やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βな
どの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制する活性
を有し、各種炎症性疾患や細胞増殖性疾患の治療薬とし
て用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はトロンビンによる細
胞の増殖を抑制しうる薬剤に関する。さらに詳しくは、
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの特定の領域に結合し
て該レセプターの細胞増殖に関する機能を阻害する薬剤
に関する。本発明はまた、新規なヒトＰＡＲ１型トロン
ビンレセプター、ならびにそれをコードするＤＮＡ断片
に関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンビンは血液凝固カスケードの最終
段階に関与し、血栓止血において極めて重要な役割を果
たすセリンプロテアーゼである。一方、トロンビンは血
管内皮細胞上のトロンボモジュリンと結合すると、凝固
促進的な働きは全くなくなり、逆にプロテインＣの活性
化能が数千倍も増強される。このようにして活性化され
たプロテインＣは、第Ｖ因子や第ＶIII因子を分解して
抗凝固作用を示す。したがって、トロンビンは抗凝固因
子としての働きももっていることになる。トロンボモジ
ュリンはトロンビン受容体の一種であるが、最近トロン
ビンのシグナルを伝達するタイプの受容体（レセプタ
ー）が発見された（Vu, T. K. H. et al. :Cell, 64, 1
057-1068 (1991)）。最初にクローニングされたシグナ
ル伝達型のトロンビンレセプター（ＰＡＲ１）のｃＤＮ
Ａは４２５個のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードし
ており、７個の膜貫通領域をもつ典型的なＧ蛋白共役型
レセプターの構造を有している。

【０００３】トロンビンはＰＡＲ１型トロンビンレセプ
ターの細胞外Ｎ末端側の部位Ａｒｇ（４１）−Ｓｅｒ
（４２）を限定分解する。ＰＡＲ１型トロンビンレセプ
ターのＮ末端側が遊離すると、新たに露呈してきたＮ末
端部位がアゴニストとして働くという極めて特徴的な構
造をしている。すなわちトロンビンはリガンドとして働
くのではなく、レセプターに内在しているリガンド（Ｔ
ＲＡＰ： Thrombin Receptor Agonist Peptide）を露呈
させる役目をもっているだけである。このリガンド部位
のＣ末端側には隣接して酸性アミノ酸に富んだ部位があ
る（−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−）。この部位
はトロンビンの天然インヒビターであるヒルの唾液中の
ヒルジンに相同性が高く、ヒルジン様ドメインとよばれ
ており、トロンビンが結合する部位と考えられている
（医学のあゆみ、167, 484-487 (1993)）。

【０００４】トロンビンのシグナルにより、血小板や血
管内皮細胞のみならず、血管平滑筋細胞やマクロファー
ジなども活性化され、遊走し、増殖する。粥状硬化、Ｐ
ＴＣＡ後などにＰＡＲ１型トロンビンレセプターが過剰
発現していることからみて、このレセプターが各種血管
病変の成立に重要な役割を果たすと考えられてきた。

【０００５】抗トロンビン剤、すなわちトロンビン阻害
剤は、前述したようなトロンビンの機能を考えると、血
液凝固カスケードを阻害するばかりでなく活性化プロテ
インＣの生成も抑制することになる。すなわち血管内皮
上の凝固と抗凝固のバランスがくずれることが予想さ
れ、副作用として、例えば出血が懸念される。

【０００６】一方、トロンビンレセプター阻害剤は、そ
の作用機序からみて、血液凝固系には全く影響を及ぼさ
ずに細胞表面のレセプターを調節することで、細胞増殖
や細胞遊走などの細胞活性化のみを抑制することが期待
できる。つまり、トロンビン阻害剤と異なり、トロンビ
ンレセプター阻害剤は、出血という副作用の少ない薬剤
となりうると考えれる。さらに、対象疾患のすみわけも
可能である。例えば、トロンビン阻害剤は血栓症が対象
になるのに対し、トロンビンレセプター阻害剤は細胞増
殖性の疾患が対象となる。

【０００７】次に、トロンビンと細胞上のレセプターと
の反応が各種疾患といかに関連するかについて説明す
る。例えば、リウマチにおける滑膜細胞増殖や、動脈硬
化における血小板凝集、平滑筋細胞増殖、あるいはマク
ロファージ遊走に細胞上のトロンビンレセプターが関与
していることを示唆する報告を以下に示す。

【０００８】リウマチ患者の滑膜組織においてＰＡＲ１
型トロンビンレセプターは過剰発現している（Ann. Rhe
um. Dis., 55: 841-843 (1996)）。また、リウマチ患者
の滑液中には活性化トロンビンが多量に存在し、さらに
滑液中ではトロンビン生成量を反映するメルクマールで
あるＴＡＴ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂ
ｉｎＣｏｍｐｌｅｘ）が健常人血漿値に比べて数千倍
も高値になっていることが最近明らかにされている（J.
of Rheumatology, 23, 1505-1511 (1996); Clin. Exp.
Rheumatol., 17, 161-170 (1999)）。

【０００９】さらに、リウマチ患者由来の滑膜細胞は、
ｉｎｖｉｔｒｏで培養液中にトロンビンあるいはＴＲ
ＡＰを添加することによって、トリチウムチミジンの取
り込みが増加すること、すなわちトロンビンレセプター
の作用を介して増殖することが示唆されている（Clinic
al Immunology and Immunopathology, 76: 225-233 (19
95)）。

【００１０】また、慢性関節リウマチにおいては増殖し
た滑膜組織内に新生血管が多くみられることが特徴であ
るが、トロンビンは血管内皮細胞の管腔形成など血管新
生の過程に関与することが示唆されている（Am. J. Phy
siol., 273, c239-245, 1997）。

【００１１】さらに、慢性関節リウマチ患者の病態にお
いてマトリックスメタロプロテアーゼの発現が亢進して
いることが知られている。トロンビンは血管内皮細胞に
作用してマトリックスメタロプロテアーゼ−１および−
３の発現を亢進するが、そのうちのマトリックスメタロ
プロテアーゼ−３の発現にＰＡＲ１型トロンビンレセプ
ターが関与していることが報告されている（Atheroscle
r. Thromb. Vasc. Biol., 17, 1731-1738 (1997)）。こ
のことから、トロンビンレセプターは慢性関節リウマチ
の滑膜増生、およびそれに引き続いて起きる骨軟骨破壊
の過程に関与していると考えられる。

【００１２】これらの報告をまとめてみると、関節局所
で生成したトロンビンが滑膜組織あるいは滑膜細胞表面
上のトロンビンレセプターを介してシグナル伝達を起こ
し、滑膜細胞増殖が惹起されていると考えられる。

【００１３】リウマチの発症機序は、最近の研究から滑
膜細胞増殖が骨軟骨破壊に到るステップであることが明
らかにされている。しかしながら、現行の抗リウマチ薬
の作用をみると、痛みを和らげる抗炎症薬が主流であ
り、滑膜細胞増殖を有効に阻害調節する薬剤は未だな
い。早期リウマチ治療を考えた場合、滑膜細胞増殖阻害
剤は、対症療法のための薬剤ではなく根治薬となりう
る。

【００１４】また、粥状動脈硬化やＰＴＣＡ後の再狭窄
などの血管病変の病態進展においては新生内膜肥厚がそ
の大きな要因となっており、その新生内膜組織にはＰＡ
Ｒ１型トロンビンレセプターの過剰発現が認められるこ
とが報告されている（Journal of Clinical Investigat
ion, 90, 1614-1621 (1992)）。

【００１５】一方、トロンビンはｉｎｖｉｔｒｏで血
小板の凝集、平滑筋細胞の増殖、マクロファージの遊走
を惹起することから、病変部位においても浸潤したマク
ロファージや血小板、内膜平滑筋細胞表面上のトロンビ
ンレセプターを介するシグナル伝達に関与し、局所炎症
亢進、平滑筋細胞増殖を起こしていることが強く示唆さ
れる。

【００１６】また、上記以外にもＰＡＲ１型トロンビン
レセプターと疾患に関する報告例のひとつとして、脳神
経細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）がトロンビンあるいはＴ
ＲＡＰによってアポトーシスを起こすことが最近報告さ
れており（The Journal of Neuroscience, 17, 5316-53
26, (1997)）、トロンビンレセプターと脳神経障害との
関連性が示唆されている。また、トロンビンレセプター
はある種のヒト肺ガン細胞の転移にも関与しているとの
報告もある（Nature Med., 4, 909-914,1998）。

【００１７】ＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、その
生体内における分布や機能から考えると、上述のリウマ
チや動脈硬化、脳神経障害に限らず、各種疾患の発症あ
るいは増悪に関連していると考えられる。

【００１８】しかしながら、一部の報告ではＰＡＲ１型
トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位に対する抗体でラ
ットの血管平滑筋細胞の増殖を抑制しうることが示され
ているものの（Circ.Res. 82, 980-987 (1998)）、ヒト
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対する阻害剤で細胞
増殖を抑制したという報告は現在のところない。また、
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位による
刺激は細胞の増殖には不十分である可能性も報告されて
いる（FEBS Lett., 15, 225-228 (1993); J Surg. Re
s., 68, 139-144 (1997); Circulation 95, 1870-1876
(1997)）。さらに近年トロンビンに反応するといわれる
複数のレセプター（ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、Ｎ−ＰＡＲ）
が報告されており、それらのレセプターと細胞の増殖作
用などとの関連については明らかになっていない（Natu
re, 386, 502-506 (1997); Nature,394, 690-694 (199
8); Biochem. J., 313, 353-368 (1996)）。

【００１９】次にファージミド技術すなわちファージデ
ィスプレイライブラリーについて詳述する。ファージ表
面上に発現されたタンパク質をあたかもファージと融合
した巨大タンパク質として扱うことが可能となり、目的
の物質（例えば抗原タンパク質）に結合するファージク
ローンを効率的に選別できるようになった。いったん選
択されたファージはたとえ少数であろうとも、大腸菌で
の感染、増殖過程を経ることにより大量のファージとす
ることができる。

【００２０】また、ファージディスプレイベクターの最
大の特長は、ファージ表面に提示されたタンパク質の性
質（表現型）を指標として選択を行うことにより、その
タンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子型）を同時
に回収できることであり、したがって遺伝子レベルでの
解析を行うことが容易な点である。

【００２１】特異的結合能をもつファージクローンをラ
イブラリーから選択的に分離するためには、基本的に標
的タンパク質への結合、洗浄、そして溶出という操作を
行う。さらに、標的タンパク質に特異的に強く結合する
ファージクローンを濃縮するために、溶出操作後に得ら
れたファージを大腸菌に感染してその増殖を行い、標的
タンパク質での選択操作を繰り返す必要がある。このよ
うな結合、洗浄、溶出、増殖という過程はパンニングと
よばれており、通常この操作を５回程度繰り返すことに
より、ライブラリーより特異的結合能をもつファージを
選択的に分離することができる。

【００２２】ファージの結合対象としては、タンパク質
のみならずターゲットタンパク質を表面に発現している
細胞そのもの、炭水化物、核酸、化学薬品などがある。
また、溶出過程では、酸あるいはアルカリによる処理が
一般的に用いられている。

【００２３】ファージディスプレイは、その原理上いか
なるポリペプチドにも応用可能である。例えば抗体のＶ
ＨとＶＬ領域をペプチドリンカーでつないだ一本鎖抗体
すなわち単鎖型Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦ
ｖ；ｓｃＦｖ）断片の形で、外殻タンパク質IIIとの
融合タンパク質としてファージ表面上に提示することが
できる。

【００２４】抗原（標的タンパク質あるいは細胞など）
を免疫したマウスのＢリンパ細胞に由来するｃＤＮＡを
鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨとＶＬ遺伝子をそれぞ
れ増幅すると共にクローン化することにより、さまざま
な抗原結合部位を提示するファージミドライブラリーを
作製することができる。そのライブラリーの大きさは、
通常の分子生物学的手法によれば１０の８乗程度であ
る。この方法を用いることで特定の抗原に対して異なる
結合特性をもつ単鎖抗体を同時に多種類取得することが
可能となる。

【００２５】従来のトロンビンレセプターに対する抗体
は、アミノ末端の細胞外部分のペプチドを合成し、抗原
として動物に免疫して取得されている。例えば、ウサギ
ポリクローナル抗体の調製が報告されている（Circulat
ion., 91, 2961-2971 (1995)）。また、ラットのトロン
ビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含むペプチドＳＦＦＬ
ＲＮＰＳＥＤＴＦＥＱＦをウサギに免疫して得られたポ
リクローナル抗体は、ラットの平滑筋細胞のトロンビン
による増殖を抑制したことが報告されている（Circ. Re
s., 82, 980-987 (1998)）。

【００２６】しかしながら、本発明者らの検討では、ヒ
トＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含
むペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦを免疫して得
たウサギポリクローナル抗体によっては、ヒト血管平滑
筋細胞およびヒト関節滑膜細胞のトロンビンによる細胞
増殖を抑制することはできなかった。

【００２７】トロンビンレセプターはリガンドを分子中
に内在し、トロンビンによってアミノ末端側が切断され
て露呈したＴＲＡＰ部分が分子内の特定部分と相互作用
をすることによってシグナル伝達が起こると考えられて
いる。また、トロンビンはトロンビンレセプターを切断
した後、レセプター分子から離れて次々とレセプターを
活性化していくものと考えられる。こうしたことから、
トロンビンレセプターはトロンビンと結合した後に、さ
らにはトロンビンによって切断された後に、分子内で立
体構造変化を起こしていることが示唆されている（米国
心臓学会、１９９６年）。

【００２８】一方ファージミド技術によって得られたｓ
ｃＦｖは、１回のライブラリーの作成により多数の独立
したクローンが得られること、またその各クローンは単
一の抗原決定基に対して特異的であり、かつ同一の特異
性を有する抗体を安定的に産生できるという利点をもつ
ことから、リガンドとレセプターの機能解析、アンタゴ
ニストあるいはアゴニスト分子デザイン、構造活性相関
研究に近年利用されるようになってきた。

【００２９】ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増
殖シグナル伝達においては、ＴＲＡＰ部位以外の部位が
関与している可能性が考えられてきたが、その部位につ
いては今までの情報では特定できていない。

【００３０】しかしながら、ＰＡＲ１型トロンビンレセ
プター上に存在する未知の細胞増殖に関与する部位に対
する抗体を作成するために、ＰＡＲ１型トロンビンレセ
プターの全配列を分割した複数の部分ペプチドを作成し
て免疫し、得られたそれぞれの抗体について細胞増殖抑
制活性を検討する方法では効率が悪いといわざるを得な
い。

【００３１】そこで本発明者らは、トロンビン切断部位
およびＴＲＡＰ部位を欠損させた組み換えＰＡＲ１型ヒ
トトロンビンレセプターを細胞上に発現させ、その機能
および構造活性相関に関して鋭意研究を重ねた。その結
果、このヒトトロンビンレセプター改変体を発現した細
胞を抗原としてマウスに免疫し、構築したファージディ
スプレイライブラリーからヒトトロンビンレセプターに
対するｓｃＦｖを作製することで、トロンビンレセプタ
ーの機能を特異的に抑制する薬剤を得ることができた。

【００３２】本発明のｓｃＦｖは、慢性関節リウマチ患
者より取得した関節滑膜細胞のトロンビン惹起増殖を特
異的に抑制する活性を有する。現在まで、トロンビンレ
セプターに対する抗体を含むトロンビンレセプター阻害
剤によってトロンビンによる細胞増殖を有意に抑制した
と報告はなく、この活性は本発明の薬剤において初めて
認められたものである。

【００３３】例えば特表平６−５０８７４２号公報には
トロンビンレセプターに対する抗体を含むアンタゴニス
トの取得についての記載があるものの、トロンビンレセ
プターのアンタゴニストによる細胞増殖作用の抑制につ
いての記載はない。

【００３４】さらに、本発明に至る過程で、種々のＰＡ
Ｒ１型トロンビンレセプターと結合しうるｓｃＦｖおよ
び抗体についてトロンビンによる細胞増殖の抑制の検討
を行ったところ、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上の
特定の配列を認識するｓｃＦｖクローンのみが有意に抑
制活性を示した。すなわち、従来ＰＡＲ１型トロンビン
レセプターのトロンビンとの結合に関与する部位といわ
れていたＹＥＰＦＷ配列を認識するｓｃＦｖのうち、一
部のｓｃＦｖクローンのみが細胞増殖抑制活性を有する
ことも明らかになった。この細胞増殖抑制活性をもつｓ
ｃＦｖクローンは、該活性をもたないｓｃＦｖクローン
と比較してトロンビンによる細胞でのＣａ流入反応、血
小板凝集に対する抑制効果、およびエピトープペプチド
に対するアフィニティの強さにおいて特に強い活性を示
すことはなく、したがって従来の技術により細胞増殖抑
制活性をもつｓｃＦｖや抗体を取得することは困難と考
えられる。

【００３５】さらに、本発明者らが鋭意検討を行ったと
ころ、トロンビンによる細胞増殖を抑制する活性のある
ｓｃＦｖクローンは、その認識エピトープであるヒトＰ
ＡＲ１型トロンビンレセプターの５２番目から５６番目
のアミノ酸配列のうちの５６番目のトリプトファン残基
をアラニン残基に置き換えることで、該エピトープへの
結合性を失った。

【００３６】これに対し、同様のエピトープに結合しう
る細胞増殖抑制活性のないｓｃＦｖクローンは、ＰＡＲ
１型トロンビンレセプターエピトープの５６番目のトリ
プトファンをアラニンに置き換えてもそれへの結合性を
保持していた。つまり、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセ
プターの細胞増殖に関与する部位は、従来のトロンビン
に対するアニオン外部部位結合領域では規定されず、そ
のすぐ下流に位置するヒルジン様配列（ＥＤＥＥ）の間
に位置する５６番目のトリプトファン残基を中心にした
部位であることが示された。

【００３７】以上のことから、本発明はトロンビンによ
る細胞の増殖を抑制しうる薬剤を効率よく取得するため
の技術を含んでいる。すなわち、従来のトロンビンレセ
プター阻害剤の取得方法であるトロンビンによる細胞で
のＣａ流入反応の抑制や、血小板の凝集抑制を評価項目
とする方法では、トロンビンによる細胞の増殖を有効に
抑制しうる薬剤を取得することは困難であり、本明細書
に示されているように、ＰＡＲ１型トロンビンレセプタ
ーの細胞増殖に関連する特定の配列の情報を得たことに
よってトロンビンの細胞増殖作用を有効に阻止しうる抗
体や薬剤の取得が可能になったのである。

【００３８】本発明の薬剤の一例は、マウス抗体骨格を
もつｓｃＦｖであるが、該遺伝子配列をもとにＣＤＲグ
ラフティングなどの技術を利用することによって、ヒト
化抗体を作製することが可能である。またｓｃＦｖを改
変してＦｃ部分を付加したり、あるいは二本鎖の完全分
子型の抗体にすることも可能である。これらは血中半減
期が異なると予想され、対象疾患、投与部位、投与方法
によって抗体の剤型を変えることができる。

【００３９】また、本発明のｓｃＦｖはＰＡＲ１型トロ
ンビンレセプターの細胞増殖に重要な部位を認識するた
め、このｓｃＦｖを用いてより活性の高い抗体やＰＡＲ
１型トロンビンレセプターと結合してその活性を修飾し
うる化合物を選別、取得するためのツールとして用いる
ことが可能である。

【００４０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＰＡ
Ｒ１型トロンビンレセプターに対する多種類の抗体を取
得することによってＰＡＲ１型トロンビンレセプターの
細胞増殖への関与を検証するとともに、ＰＡＲ１型トロ
ンビンレセプター上の増殖に強く関与する部位を特定
し、その情報をもとにトロンビンによる細胞増殖を有効
に抑制しうる薬剤を取得する点にある。

【００４１】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＰＡＲ１型
ヒトトロンビンレセプターを特異的に認識するポリペプ
チドを見出し、本発明に到達した。

【００４２】すなわち本発明者らは、遺伝子工学的に各
種ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを昆虫細胞表面
に機能を有する蛋白として発現させた。本発明者らが作
製したＰＡＲ１型トロンビンレセプター改変体は次の３
種類である。（１）△１−４９ＴＲＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端の１
番目から４９番目までのアミノ酸を欠失させたレセプタ
ー：内在性リガンドであるＴＲＡＰ部分やトロンビンに
よって切断されて遊離するペプチド部分を欠失させたレ
セプター。トロンビン結合部位すなわちヒルジン様ドメ
インは有している。△１−４９ＴＲのＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を配列番号１に示す。（２）△１−８０ＴＲＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端１番
目から８０番目のアミノ酸を欠失したレセプター：ＴＲ
ＡＰ部分、遊離ペプチド、ヒルジン様ドメインを含まな
いレセプター。△１−８０ＴＲのＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列を配列番号２に示す。（３）ＦｕｌｌＴＲ天然に存在するＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプター：
各機能部位を分子内に有する。ＦｕｌｌＴＲのＤＮＡ
配列およびアミノ酸配列を配列番号３に示す。

【００４３】本発明者らは上記（１）〜（３）の各レセ
プターを発現させた昆虫細胞を抗原としてマウスに免疫
し、得られたマウス抗血清から抗体を調製し、それぞれ
の抗体のプロファイルを検討した。その結果、△１−４
９ＴＲ発現昆虫細胞を抗原として免疫し得られた抗体に
アンタゴニスト的な活性プロファイルが認められた。

【００４４】そこで本発明者らは、△１−４９ＴＲ発現
細胞を抗原として免疫したマウスの脾臓細胞よりファー
ジミドライブラリーを作製し、そのライブラリーから吸
脱着すなわちパンニング法によってヒトトロンビンレセ
プターを特異的に認識して結合するｓｃＦｖを選別、取
得した。

【００４５】本発明者らは、さらに研究を進めた結果、
取得したＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを認識す
るｓｃＦｖの中に、次のような特徴を有するものがある
ことを見出した。すなわち、ヒト細胞表面上のＰＡＲ１
型トロンビンレセプターに結合し、トロンビンによるト
ロンビンレセプターを介したカルシウム流入を抑制する
活性を有すること、さらにはヒト血小板上のＰＡＲ１型
トロンビンレセプターに結合して、トロンビンによるト
ロンビンレセプターを介した血小板凝集を阻害する活性
を有すること、さらにはヒト滑膜細胞のトロンビンレセ
プターに結合して、トロンビンによるトロンビンレセプ
ターを介した滑膜細胞増殖を阻害する活性を有すること
が明らかになった。

【００４６】さらに本発明者らは、取得した抗体の結合
部位のアミノ酸配列を決定した。該エピトープの解析手
法としては、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの部
分合成ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡおよび各種トロ
ンビンレセプター発現細胞を用いるＥＬＩＳＡを行っ
た。また、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのすべ
ての細胞外領域を包含するように１つのピン当たり１５
アミノ酸の長さのペプチドを計９４種類ピン上に固相合
成したマルチピンＥＬＩＳＡを行った。

【００４７】トロンビンレセプターの内在性リガンドで
あるＴＲＡＰ部分に対するポリクローナル抗体、あるい
はトロンビン結合部位であるヒルジンライクドメインに
対するポリクローナル抗体は、それぞれの機能部位に対
して複数のエピトープで結合するため、トロンビンレセ
プターの機能に影響を与える可能性はある。しかしなが
らどのエピトープをブロックすることがアンタゴニスト
として有効かはこれまで明らかではなかった。そこで、
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ヒルジン様ドメイ
ンに包含されるＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの
アミノ末端側の５１番目から５５番目のアミノ酸が増殖
惹起を含むトロンビンレセプター機能に重要であり、そ
の部分に由来する機能を抑えることが該レセプター阻害
剤として有効であることがわかった。

【００４８】このエピトープのアミノ酸配列は、トロン
ビンレセプターの活性化および機能発現において重要な
部位であると考えられる。例えばこの部位に抗体が結合
することによってトロンビンとトロンビンレセプターの
相互作用が阻害されること、またトロンビンはレセプタ
ーに結合するが、ＴＲＡＰによるレセプターの細胞外ル
ープ部分への相互作用を阻害していることなど種々の可
能性が考えられる。

【００４９】また、このヒトＰＡＲ１型トロンビンレセ
プターのアミノ末端側の５１番目から５５番目の配列の
中でも増殖に関与する部位があることが判明した。すな
わち本発明者らは同様の部位に結合し、かつ同様のエピ
トープに対する親和性を示す複数のｓｃＦｖを取得して
いるが、トロンビンの細胞の増殖を抑制しうるのはその
一部のｓｃＦｖであった。そのトロンビンによる細胞増
殖を抑制しうるｓｃＦｖは、ＰＡＲ１型トロンビンレセ
プターのアミノ末端側から５５番目のトリプトファン残
基をアラニンに置換するとその配列に対する結合性が消
失するのに対し、トロンビンによる細胞増殖を抑制しな
いｓｃＦｖにおいては同様な置換を行ったエピトープに
対する結合性は維持されていた。すなわち、トロンビン
による細胞増殖を抑制しうるｓｃＦｖのＰＡＲ１型トロ
ンビンレセプターへの結合には該レセプターのアミノ末
端から５５番目のトリプトファン残基が重要であり、ま
た該レセプターの細胞増殖に対する作用にはこの該レセ
プターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン残基
の周辺の配列が重要な役割をもつことが示された。

【００５０】本発明者らは、前記のトロンビンレセプタ
ーおよび改変体を作製する研究過程で詳細な検討を進め
た結果、新しい事実を見出した。それは従来知られてい
るＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターをコードする遺
伝子とは２箇所異なる塩基配列があることが判明した点
である。本発明者らは、該遺伝子が細胞表面上にＰＡＲ
１型トロンビンレセプターとしての機能を有する形で発
現していることを確認した。つまりトロンビンおよびＴ
ＲＡＰ（内在性リガンド部分の合成ペプチド：Ｈ₂Ｎ−
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−ＣＯＯＨ）いずれにおいても細胞内シグナル伝達
が認められた。また、ＴＲＡＰ部分に対するウサギポリ
クローナル抗体の結合性がフローサイトメトリーによっ
て認められた。この点からも本発明者らが新たに見出し
た遺伝子配列は機能しているものであることが明らかに
なった。

【００５１】既報のＰＡＲ１型トロンビンレセプター
は、最初に巨核球細胞株Ｄａｍｉ細胞のｃＤＮＡをアフ
リカツメガエルの卵母細胞にトランスフェクトし、トロ
ンビン刺激に対する応答性からクローニングされた。こ
れに対し、本発明者らはＰＡＲ１型トロンビンレセプタ
ーをコードする遺伝子をヒト大動脈と胎盤由来の正常組
織のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。既報
のｃＤＮＡの由来がガン細胞の一種であるＤａｍｉ細胞
だとすると、遺伝子変異もしくは遺伝子多型による可能
性もある。

【００５２】また、上述のことから、本発明者らが見出
したＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、アミノ酸配列
が既報のものに比べて２箇所異なったものであることが
わかる。したがって本発明の薬剤は、新規なレセプター
を認識し、結合するものである。

【００５３】すなわち本発明は下記の発明を包含する。１）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうるポリペプチ
ドまたは化合物。２）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの構造のうち
細胞増殖に関与する特定の領域に結合するポリペプチド
または化合物。３）ペプチド配列Ｘ₁−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ₂−Ｔｒｐ−
Ｘ₃に結合する前記ポリペプチドまたは化合物。ここ
で、Ｘ₁は任意のアミノ酸またはペプチド配列であり、
Ｘ₂は任意のアミノ酸を、Ｘ₃は任意のアミノ酸またはペ
プチド配列を表す。４）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端
側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列：Ｘ₄−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｘ₅なる部分に
結合するポリペプチドまたは化合物。ここでＸ₄および
Ｘ₅は、任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。５）単鎖型Ｆｖあるいはその断片であるＰＡＲ１型トロ
ンビンレセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチ
ド。６）抗体あるいはその断片であるＰＡＲ１型トロンビン
レセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチド。７）トロンビンレセプターを介した細胞増殖に関わるシ
グナル伝達系を阻害する、ＰＡＲ１型トロンビンレセプ
ター阻害剤としての前記ポリペプチド。８）前記ポリペプチドを取得するために用いることが可
能な改変型ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの遺伝子ま
たはその断片、ならびにそれを発現する細胞。９）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうる前記ポリペ
プチドまたは化合物を取得するための方法。

【００５４】

【発明の実施の形態】本発明におけるｓｃＦｖの作製方
法について詳細に説明する。Ａ．ファージミドライブラリーの作製 △１−４９ＴＲ発現昆虫細胞をアジ化ナトリウムによっ
て死細胞化し、死菌体（シグマ社製）と混合して生理食
塩水に懸濁した。細胞の形態が生細胞と同程度であるこ
とを確認し、マウス腹腔に投与した。この免疫を２週間
間隔で５回行い、最終免疫の４日後に心臓から採血する
と同時に脾臓細胞を摘出した。

【００５５】上記抗原の細胞を調製する際、アジ化ナト
リウムを細胞と接触させることによってレセプターの細
胞内へのインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）を防ぐことができる。細胞表面に存在す
るレセプター蛋白数をインタナーナリゼーションを防い
で恒常的に維持することは、免疫感作を十分に行うため
に必要である。

【００５６】一般的には純化精製された抗原蛋白であれ
ば、免疫の際の必要量は比較的少量でよいと考えられて
いる。例えばモノクローナル抗体の例では、マウス１匹
あたり１回投与量として数μｇ〜数十μｇでよい。

【００５７】しかしながら、細胞表面上のレセプターを
抗原とする場合では細胞表面上には各種蛋白が存在す
る。レセプターに対する免疫動物の抗体価を上げるため
には、レセプターの数がこれら細胞表面上の夾雑蛋白に
比べてある程度多量に必要である。本発明者らはアジ化
ナトリウムによってレセプターの細胞内へのインタナラ
イゼーションを防ぎ、該トロンビンレセプター発現昆虫
細胞を抗原として動物に免疫することによってレセプタ
ーの構造を反映した機能部位を特異的に認識するファー
ジミド抗体を取得した。

【００５８】ファージミド抗体の作成はアマーシャムフ
ァルマシア・バイオテク社より市販されている「Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔＰｈａｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＳ
ｙｓｔｅｍ」を用いて業者添付のプロトコールにしたが
って行った。キットに含まれるｐＣＡＮＴＡＢ５ベクタ
ーについては、このベクターのＮｏｔＩ部位に塩基配列
ｇｇｃｃｇｃａｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ
ｇｇを挿入し、クローニングした遺伝子が発現される際
にＨｉｓ６配列およびＥ−ｔａｇ配列が付加されるよう
にデザインした（ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥ）。上記のト
ロンビンレセプター発現昆虫細胞を免疫したマウスの脾
臓よりｍＲＮＡを取得し、抗体ｃＤＮＡを作成した。そ
のｃＤＮＡよりキットに含まれるＰＣＲプライマーを用
いて免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の抗原結合部位
（それぞれＶＨおよびＶＬ）の遺伝子を取得した。この
ＶＬおよびＶＨ遺伝子断片をキットに含まれるリンカー
遺伝子を用いて一本のＤＮＡとして連結させ、さらにＶ
Ｈの５’側を認識し、制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を含む
プライマーおよびＶＬの３’側を認識し、制限酵素Ｎｏ
ｔＩ認識部位を含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、
このＶＨ−ＶＬ連結遺伝子を増幅して取得した。この増
幅ＤＮＡ産物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで処理
し、ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥベクターのＳｆｉＩ−Ｎｏ
ｔＩクローニング部位に挿入し、大腸菌ＴＧ１株に導入
した。この遺伝子導入大腸菌にヘルパーファージＭ１３
Ｋ０７を添加することで抗体蛋白質を発現し、かつ抗体
遺伝子を含有するファージミドライブラリーを作成し
た。

【００５９】Ｂ．パンニング上記のように作成したファージミドライブラリーは、目
的のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対するファージ
ミド抗体以外のものを多数含んでいる。たとえば、ここ
で用いた抗体遺伝子はバキュロウイルス法でトロンビン
レセプターを発現させた細胞そのものを免疫しているた
め、細胞自体の成分やウイルスの構成成分に対するファ
ージミド抗体も多種類存在することが考えられる。した
がって、パンニング法による目的のファージミド抗体の
濃縮を行った。すなわち、このファージミド抗体を天然
型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶを感染させた昆虫細胞
と反応させることで目的以外のファージミド抗体を吸着
除去を行った後、トロンビンレセプター（△１−４９Ｔ
Ｒ）を発現させた昆虫細胞と反応させ、結合したファー
ジミド抗体のみを取得することでトロンビンレセプター
と結合するファージミド抗体を濃縮した。この濃縮ファ
ージミドライブラリーを大腸菌ＨＢ２１５１に感染さ
せ、アンピシリン含有寒天培地上で生育させた各コロニ
ーを取得することで可溶型ｓｃＦｖを産生しうる大腸菌
クローン（ｓｃＦｖ産生大腸菌株）を取得した。

【００６０】Ｃ．キャラクタリゼーション標準的な方法によりｓｃＦｖ産生株の培養およびペリプ
ラズム画分取得を行い、標準的な方法により精製を行っ
た。ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの機能阻害活性を
評価するｉｎｖｉｔｒｏの方法として、ヒト巨核芽球
系細胞を用いたカルシウム流入阻害評価、ヒト血小板を
用いた凝集阻害評価、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜
細胞を用いた増殖阻害評価を実施した。また、上記評価
にてトロンビンレセプターの機能阻害活性を認めたｓｃ
Ｆｖおよび該活性を認めなかったｓｃＦｖについてＰＡ
Ｒ１型トロンビンレセプター上のエピトープを決定した
うえで、さらに詳細な認識ペプチド配列の解析を行っ
た。

【００６１】以下に、標準的なｓｃＦｖの産生、ペリプ
ラズム画分取得、および精製について述べる。ｓｃＦｖ
産生大腸菌株を２×ＹＴ培地にて終夜培養を行い、終夜
培養液と本培養液を１：１０の割合で混合した。３０
℃、１６０回転／分で１時間培養後、ＩＰＴＧ（イソプ
ロピルチオガラクトシド）を最終濃度で１ｍＭ加えて６
時間培養し、ｓｃＦｖ産生を誘導した。本発明者らの用
いたｓｃＦｖ産生システムではｓｃＦｖは大腸菌のペリ
プラズム画分に産生、集積することが知られている。こ
のため、培養液を遠心操作し、菌体沈殿物を１０倍濃度
のＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁したのち、再度遠心操作によ
り得た沈殿物を超純水に懸濁し、浸透圧ストレスを加
え、再度遠心して上清を回収してペリプラズム画分を得
た。

【００６２】本発明者らの調製したｓｃＦｖは、そのア
ミノ酸配列内にポリＨｉｓ領域を有しており、この領域
の金属イオン結合性を利用したＮｉ−ＮＴＡカラムによ
るアフィニティーカラムクロマトによる精製が可能であ
る。取得したペリプラズム画分をＮｉ−ＮＴＡアガロー
スカラムにロードし、数回洗浄の後にイミダゾールを含
むＨｅｐｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液により溶出した。さ
らに、溶出物を限外濾過膜を用いて濃縮してからＨｅｐ
ｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して透析を行い、精製ｓ
ｃＦｖを取得した。

【００６３】次に、上記工程Ａ、Ｂで取得した各ｓｃＦ
ｖ産生大腸菌株の産生するｓｃＦｖのトロンビンレセプ
ター結合性について解析した。トロンビンレセプター発
現昆虫細胞に精製ｓｃＦｖを反応させ、未反応のｓｃＦ
ｖを洗浄除去した。次にｓｃＦｖのＣ末端に反応するホ
ースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ｅ−
Ｔａｇ抗体を結合させ、ＨＲＰの発色基質である２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）による発色
法で結合性を解析した。また、野生型バキュロウイルス
ＡｃＭＮＰＶを感染させた細胞においても同様に結合性
を解析し、トロンビンレセプター発現昆虫細胞に結合し
てＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖ産
生大腸菌株を選択した。この選択した大腸菌株の産生す
るｓｃＦｖについてトロンビンレセプターの機能阻害活
性を評価した。

【００６４】以下にトロンビンレセプターの機能阻害活
性を評価する方法について述べる。ヒト巨核芽球系の株
化細胞にはトロンビンレセプターの発現が認められてお
り、またトロンビンにより細胞内カルシウム濃度が上昇
することが知られている。そこで、トロンビンにより惹
起された細胞内カルシウム濃度上昇を測定し、上記方法
により取得したｓｃＦｖに機能阻害活性があるかどうか
調べた。すなわち、ヒト巨核芽球系の株化細胞に蛍光色
素（Ｆｕｒａ２−ＡＭ）を取り込ませ、室温で３０分間
ｓｃＦｖとインキュベートした後にヒトトロンビンを添
加し、添加３０秒後の細胞内カルシウム流入量を測定
し、ｓｃＦｖのカルシウム流入阻害活性を調べた。その
結果、トロンビンによる細胞内カルシウム濃度上昇を抑
制する複数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。

【００６５】上述のように、血小板上にはトロンビンレ
セプターが発現し、トロンビンにより凝集が惹起される
ことが知られている。そこで、トロンビンで惹起した血
小板凝集に対するｓｃＦｖの効果について検討した。健
常人ヒト血液から血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液を
調製した。得られた血小板浮遊液に上記方法にて取得し
たｓｃＦｖを添加し、室温で２０分間静置した。さらに
３７℃で２分間で安定化し、ＣａＣｌ₂（最終濃度１．
５ｍＭ）を添加した。次にヒトトロンビン（最終濃度
０．１〜０．２ｕ／ｍｌ）を添加して血小板凝集を惹起
し、その濁度の変化からｓｃＦｖによる血小板凝集阻害
を評価した。その結果、血小板凝集を抑制する数種類の
ｓｃＦｖクローンを取得した。

【００６６】また、本発明者らにより慢性関節リウマチ
患者由来滑膜細胞はＬＰＳ（リポポリサッカライド）感
受性を有し、ＬＰＳにより増殖が惹起されることが判明
したため、ゲルろ過法およびカニ外殻キトサン多孔性粒
子を用いたアフィニティー吸着除去法を併用し、上記の
ように精製、取得したｓｃＦｖサンプルに含まれる大腸
菌由来のエンドトキシンを除去した。

【００６７】上述のように、滑膜細胞にはトロンビンレ
セプターが発現しており、トロンビン刺激により細胞増
殖が惹起されることが知られている。そこで、トロンビ
ンにより惹起した滑膜細胞増殖能に対して上記方法によ
りエンドトキシンを除去したｓｃＦｖに阻害活性がある
かどうか調べた。すなわち、慢性関節リウマチ患者由来
の滑膜細胞を血清飢餓状態にしてから３７℃で３０分間
ｓｃＦｖとインキュベートした後、ヒトトロンビンで増
殖を惹起した。そしてトロンビン添加２４時間から４８
時間までの間のチミジンアナログ（ＢｒｄＵ）取り込み
を測定することによってＤＮＡ合成能を測定し、ｓｃＦ
ｖの細胞増殖阻害活性を調べた。その結果、滑膜細胞増
殖を抑制する数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。

【００６８】上記の滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖク
ローンのエピトープを決定するためにエピトープマッピ
ング解析を行った。すなわち、１ペプチド当たり１５ア
ミノ酸の長さで、ヒトトロンビンレセプターのすべての
細胞外領域を包含するように、９４種類のペプチドをピ
ン上に固相合成し、上記方法で取得した滑膜細胞増殖を
阻害するｓｃＦｖの結合性を調べた。その結果、ＰＡＲ
１型ヒトトロンビンレセプターのヒルジン様ドメインに
包含されるアミノ末端側の５１番目から５５番目のアミ
ノ酸が滑膜細胞増殖阻害ｓｃＦｖのエピトープであるこ
とがわかった。同様に滑膜細胞増殖を示さなかったｓｃ
Ｆｖについても同様の解析を行ったところ、その中にＰ
ＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５
０番目から５５番目のアミノ酸を認識するｓｃＦｖクロ
ーンが見出された。

【００６９】さらにこのＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセ
プターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のアミ
ノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクローン、
およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末
端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑
膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、そのエ
ピトープを含むＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの
アミノ末端から４７番目から６７番目のアミノ酸に相当
する合成ペプチドを作成し、キーホールリムペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲート化した。これを表
面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップ上に固定化
し、それぞれの該ペプチドに対するアフィニティを計測
した。滑膜細胞増殖抑制活性を有するｓｃＦｖクローン
と増殖抑制活性を有しないｓｃＦｖクローンの間でアフ
ィニティの差は認められなかった。

【００７０】また、以下にＰＡＲ１型ヒトトロンビンレ
セプターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のア
ミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクロー
ン、およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミ
ノ末端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識し
て滑膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、エ
ピトープのアミノ酸配列の一部を置換したペプチドに対
する結合性を解析した。前記ＰＡＲ１型ヒトトロンビン
レセプターのアミノ末端から４７番目から６７番目のア
ミノ酸に相当する合成ペプチドをＫＬＨにコンジュゲー
ト化したものを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサー
チップに固定化し、この滑膜細胞増殖抑制活性を有する
ｓｃＦｖクローンとＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプタ
ーのアミノ末端から５５番目のトリプトファンをアラニ
ンに置き換えた４７番目から６７番目のアミノ酸に相当
するペプチドとを混合して解析を行ったところ、センサ
ーチップに固定化したペプチドへの結合は阻害されなか
った。しかしながら滑膜細胞増殖抑制活性をもたないｓ
ｃＦｖクローンについて同様の解析を行ったところ、セ
ンサーチップに固定化されたペプチドへの結合は強く阻
害された。このことはエピトープペプチドの５５番トリ
プトファンをアラニンに置換したことにより滑膜細胞増
殖抑制活性を有するクローンのエピトープへの結合が失
われたことを示しており、ひいてはこのＰＡＲ１型ヒト
トロンビンレセプターのアミノ末端から５５番目のトリ
プトファン周辺がトロンビンの細胞増殖活性に関与して
いることを示している。

【００７１】本発明の一態様である前記ｓｃＦｖあるい
はその断片を有効成分として含有する薬剤（ポリペプチ
ドまたは低分子化合物）は、炎症性の細胞、増殖した組
織あるいは血小板を主体とする血栓に接触させることに
より、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を抑
制し、細胞増殖阻害やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１
βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制し、
あるいは血小板凝集を阻害することにより血栓形成進展
を阻害するので、各種炎症性疾患、細胞増殖性疾患、血
栓性疾患の治療薬として利用できる。

【００７２】例えば本発明のトロンビンレセプター阻害
剤は、静脈用注射用製剤として使用することができる。
その場合、上記ｓｃＦｖあるいはその断片は広い範囲の
含有割合でよく、投与量は種々の条件によって変動す
る。またこれらは通常静脈注射用として使用されている
水性媒体中に溶解ないしは分散して使用することができ
る。また、注射剤以外にも外用剤または座薬として用い
られる。非経口投与のための注射剤としては無菌の水性
または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。非
経口投与のためのその他の組成物としてはひとつ、また
はそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外
用液剤、軟膏、塗布剤のような外用剤、直腸内投与のた
めの座薬およびペッサリー等が含まれる。

【００７３】

【実施例】実施例１：各種組換えＴＲ発現細胞の調製［ヒトトロンビンレセプターｃＤＮＡの取得］ヒト大動
脈由来ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入）１μｇか
らｃＤＮＡ合成キットＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ア
マシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてｃ
ＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡの１／１００量を用い
てプライマーＴＲ１［配列番号４］およびＴＲ４［配列
番号５］によりトロンビンレセプターのｃＤＮＡ部分を
ＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電
気泳動した結果、約１．３ｋｂ付近にトロンビンレセプ
ターのｃＤＮＡフラグメントと推定されるバンドが認め
られた。このＤＮＡフラグメントをＤＮＡ精製キット
（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲルか
ら抽出、精製した。精製したＤＮＡフラグメントをＴＡ
クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用
いて、ｐＣＲII ｐＣＲ２．１（ＴＭ）ベクターに挿入
し、数クローンについてプラスミド精製（ＱＩＡＧＥＮ
社製プラスミド抽出キット使用）を行った。これらの精
製したプラスミドを用いて日立ＤＮＡ蛍光自動シーケン
サーによりＤＮＡ配列を決定した。塩基配列決定に用い
たプライマー６種を［配列番号６−１１］で示す。その
結果、このＤＮＡフラグメントがトロンビンレセプター
をコードしていることが明らかになった。決定したヒト
大動脈由来のトロンビンレセプターの全塩基配列を［配
列番号３］に示す。同様に、本発明者らはヒト胎盤由来
のｃＤＮＡ配列も決定したが、ヒト大動脈由来のものと
一致した。この得られたヒト大動脈由来およびヒト胎盤
由来のトロンビンレセプターｃＤＮＡ配列と、ＤＮＡ
ＤａｔａＢａｓｅＪａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録さ
れているトロンビンレセプターのｃＤＮＡ配列（ａｃｃ
ｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ６２４２４）との比較を行っ
たところ、トロンビンレセプターの蛋白質をコードして
いる部分の５’末端より７１１番目の塩基がＣがＧに、
７１２番目の塩基がＧからＣに、１０９１番目の塩基が
ＣからＧに、１０９２番目の塩基がＧからＣにデータベ
ースでの表示から置き換わった形のｃＤＮＡとなってい
ることがわかった。また、ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ
中のトロンビンレセプター遺伝子についてもこの部位の
塩基配列を解析したところ、本発明者らが取得した配列
と同様の配列であることが確認された。このヒトトロン
ビンレセプターｃＤＮＡを挿入したｐＣＲIIプラスミド
をｐＣＲ−ＴＲ１４と命名した。

【００７４】［トロンビンレセプターｃＤＮＡ含有トラ
ンスファーベクターの作製］上記ｐＣＲ−ＴＲ１４を制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動を行った。そしてトロンビンレセプター
ｃＤＮＡを含む約１．３ｋｂフラグメントをＤＮＡ精製
キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いて
ゲルから抽出、精製した。一方、バキュロウイルストラ
ンスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）［Technique, Vol. 2, No. 4,pp.173-188, 1990]
を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、上記
ＤＮＡフラグメントとライゲーション反応を行った。こ
の反応液で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、いくつか
の形質転換体のコロニーからプラスミドを抽出して約
１．３ｋｂフラグメントが挿入されたプラスミドを得
た。これをｐＡｃ−ＴＲ１４と命名した。このトロンビ
ンレセプターｃＤＮＡ含有トランスファーベクターを精
製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使用）して
トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの
作製に用いた。

【００７５】［トロンビンレセプター発現用組換えバキ
ュロウイルスの作製］組換えバキュロウイルスの作製に
はファーミジェン社製のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）
キットを用いた。Ｓｆ９昆虫細胞１×１０⁶細胞を３０
ｍｍディッシュに播種し、３０分間室温にて接着させ
た。一方、０．２５μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｔ
Ｍ）ＤＮＡと２μｇのｐＡｃ−ＴＲ１４プラスミドＤＮ
Ａを混ぜ、室温に５分間静置し、その後０．５ｍｌトラ
ンスフェクション緩衝液Ｂ（２５ｍＭＨＥＰＥＳｐ
Ｈ７．１、１２５ｍＭＣａＣｌ₂、１４０ｍＭＮａ
Ｃｌ）を加えてよく混ぜた。次に播種したＳｆ９細胞の
培地を抜き取り、０．５ｍｌのトランスフェクション緩
衝液Ａ（グレース培地、１０％牛血清含有）を加えた。
ここに、トランスフェクション緩衝液ＢとＤＮＡの溶液
を少しずつ滴下していくことによりコトランスフェクシ
ョンを行った。２７℃でインキュベーションして４時間
後に新しいグレース培地（１０％牛血清含有）に取り換
えた。５日後、組換えウイルスを含む培養上清を回収
し、１０倍、１００倍、１０００倍希釈液を作成し、Ｓ
ｆ９細胞（１×１０⁶細胞／ｄｉｓｈ）に室温で１時間
感染させた。上清を抜き取り、１％ＳｅａＰｌａｑｕｅ
アガロース含有グレース培地（４２℃）を２ｍｌ滴下し
て加え、アガロースが固まるまで１０分間程度室温に放
置した。その後、２７℃で３日間培養を行った。３日目
にニュートラルレッド／ＰＢＳ（１ｇ／ｌ）を１ｍｌ／
ｄｉｓｈ加えた。４日目にウイルスプラークを観察した
ところ、１００培希釈液を感染したディッシュに６個の
プラークを確認した。数個のシングルウイルスプラーク
をアガロースごとパスツールピペットで抜き取り、グレ
ース培地と混ぜて、ウイルスを培地中に拡散させた。こ
のシングルプラーク由来のウイルス液を単層培養したＳ
ｆ９細胞（２５ｃｍ²フラスコ培養）に感染させた。こ
れを２７℃で４−５日間培養してウイルス液を回収し
た。このウイルス液を１ｍｌとって１．５ｍｌエッペン
ドルフチューブに入れ、４℃、１５０００回転／分で３
０分間遠心し、ウイルス粒子を沈殿させた。沈殿物を２
００μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ）緩衝液に懸濁し、５０μｌのＬｙｓｉｓ緩衝液
（１０％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ）を加え、６０℃で
２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿により反応液中のウイルス
ＤＮＡを回収した。回収したウイルスＤＮＡの１／５を
使用し、プライマーＢａｃＦ［配列番号１２］およびＴ
Ｒ−Ｓ２［配列番号７］によってＰＣＲ増幅を行い、Ｄ
ＮＡ中にトロンビンレセプターｃＤＮＡが含有されてい
ることを確認した。このトロンビンレセプター発現用組
換えバキュロウイルスをＡｃＴＲＦと命名した。ウイル
ス液は適宜希釈してプラークアッセイを行い、タイター
をチェックした。さらに、ウイルス液をＭＯＩ（Ｍｕｌ
ｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝
０．２５でＳｆ９細胞に感染させることで１〜５×１０
⁷程度の高濃度のウイルス液を得た。ウイルス液は４℃
および−８０℃で凍結保存した。

【００７６】［改変型トロンビンレセプターｃＤＮＡの
構築］トロンビンレセプターの構造の内在性リガンドペ
プチド部分（ＴＲＡＰ）を欠損させ、トロンビン結合部
位は保持させた形の改変トロンビンレセプター△１−４
９ＴＲ、および内在性リガンドペプチド部位およびトロ
ンビン結合部位の両方を欠損させた形の改変トロンビン
レセプター△１−８０ＴＲのｃＤＮＡを構築し、バキュ
ロウイル−昆虫細胞系での発現を行った。△１−４９Ｔ
ＲｃＤＮＡは完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐ
ＣＲ−ＴＲ１４）の遺伝子配列のうち、塩基番号７９〜
１４７の部位を、△１−８０ＴＲｃＤＮＡは完全長トロ
ンビンレセプターの塩基番号７９〜２４０の部位を遺伝
子工学的に欠損させて構築した。これらの遺伝子は、細
胞でトロンビンレセプターが発現したときに除去される
シグナルペプチド部位（アミノ酸残基番号１〜２６）
に、さらに、△１−４９ＴＲでは完全長トロンビンレセ
プターにおいてシグナルが除去されたときにアミノ末端
となる部位から３３アミノ酸残基を、△１−８０ＴＲで
は６４アミノ酸残基を欠損させた形のアミノ酸配列を付
加した形のトロンビンレセプターとなるように設計され
ている。△１−４９ＴＲと△１−８０のｃＤＮＡの塩基
配列、ならびにそれらによってコードされているアミノ
酸配列をそれぞれ配列番号１と配列番号２に記載する。

【００７７】［△１−４９ＴＲｃＤＮＡの構築］完全長
トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐＣＲ−ＴＲ１４）よ
りその塩基番号７９〜１４７の部位を欠損させて△１−
４９ｃＤＮＡを作成する手順を以下に示す。ｐＣＲ−ＴＲ１４より△１−４９ｃＤＮＡの塩基配列
１−１８５に相当する部位を含む遺伝子断片である△１
−４９−５’（１９０ｂｐ）断片を作成した。 −１ｐＣＲ−ＴＲ１４のｐＣＲIIベクター（ＩＮＶＩＴＲＯ
ＧＥＮ社）の部位に相同なプライマーＭ１３ＲＥＶ２
２プライマー［配列番号１０］、および完全長トロンビ
ンレセプターｃＤＮＡの塩基番号５９〜７８に相当する
部位と塩基番号１４８〜１５７に相当する部位に相補的
なプライマーであるＴＲ△２７−４９Ｒプライマー［配
列番号１３］を用いてＰＣＲ反応を実施した。反応液組
成はｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ２００ｎｇ／ｍｌ、Ｍ１
３ＲＥＶ２２プライマー３００ｎＭ、ＴＲ△２９−４
９プライマー３００ｎＭ、ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎｍｉｘ｛２０ｍＭｄＮＴＰｓｍｉ
ｘ｝（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ社）１０μｌ／ｍｌ、×１０Ｅｘｐａｎｄ
^TM Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔ
ｅｍ緩衝液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈａｉｍ
社）１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌＥｘｐａｎｄ
^TM Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅ
ｍｅｎｚｙｍｅｍｉｘ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈａｉｍ社）１０μｌ／ｍｌのものを用い、５０μ
ｌの反応スケールで行った。反応条件はＧｅｎｅＡｍｐ
ｓｙｓｔｅｍ^R ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９６００
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で９４℃２分間反応し
た後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分間
のサイクルを１０サイクル行い、その後に７２℃７分間
反応させる温度サイクルであった。反応後のサンプルは
４％ＮＵＳＩＥＶＥ^R ＧＴＧ^R ＡＧＡＲＯＳＥ（Ｆ
ＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社）−ＴＡＥ（４０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅｐＨ７．６、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）緩衝液ゲルを用い、１００Ｖで１時間電気泳
動し、２２４ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部分のゲルを
切り出した。切り出したゲルはＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法
でＤＮＡを抽出、精製して約２００ｎｇのＤＮＡを得
た。

【００７８】−２完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号１４８
〜３６７に相当する部分の遺伝子断片を取得するため、
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号６９〜
７８に相当する部位と塩基番号１４８〜１６９に相当す
る部位よりなるＴＲ△２７−４９Ｆプライマー［配列番
号１４］と、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩
基番号３５０〜３６７に相補的な配列よりなるＴＲＳ１
プライマー［配列番号６］を用いたＰＣＲを行った。反
応液組成は−１に示した反応組成中のＭ１３ＲＥＶ２
２プライマーおよびＴＲ△２７−４９ＲプライマーをＴ
Ｒ△２７−４９ＦプライマーとＴＲＳ１プライマーに置
き換えた他は同様に実施した。反応条件も−１と同様
に行った。得られたＰＣＲ反応物は４％ＮＵＳＵＥＶ
Ｅ^TM ＧＴＧ^TM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを
用い、１００Ｖで１時間電気泳動を行った。２２０ｂｐ
のＤＮＡ鎖長に相当する部位のゲルを切り出し、Ｈｏｔ
−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。得ら
れたＤＮＡ断片は約２４０ｎｇである。

【００７９】−３ＴＲ△２７−４９ＲプライマーとＴＲ△２７−４９Ｆプ
ライマーの間には２０ｂｐの相補的な部分が生じるよう
にデザインされているため、−１で得られた２２４ｂ
ｐのＤＮＡ断片と−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ
断片をａｓｓｅｍｂｌｙＰＣＲ法での連結を行った。
まず、−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片８０ｎ
ｇと−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片９６ｎｇ
を混合した。反応液組成はＤＮＡｐｌｙｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎｍｉｘ１０μｌ／ｍｌ、×１０Ｅｘｐ
ａｎｄ^TM Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙ
ｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌＥ
ｘｐａｎｄ^TM Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍｅｎｚｙｍｅｍｉｘ７．５μｌ／ｍ
ｌであり、４０μｌの反応スケールで実施した。反応
は、ＧｅｎｅＡｍｐ^RＰＣＲｓｙｓｔｅｍで９４℃２
分間反応後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃
１分３０秒間のサイクルを５サイクル行い、その後７２
℃で７分間反応を行う温度サイクルプログラムで行っ
た。次にその反応によって得られた反応産物４０μｌ
に、Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー１５０ｎｇ／ｍｌ、
ＴＲＳ１プライマー１５０ｎｇ／ｍｌ、ＤＮＡｐｏ
ｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｍｉｘ１０μｌ／ｍｌ、×
１０Ｅｘｐａｎｄ^TM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ
ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５
ＵＥｘｐａｎｄ^TM Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰ
ＣＲｓｙｓｔｅｍｅｎｚｙｍｅｍｉｘ６μｌ／
ｍｌになるように各試薬を加え、蒸留水で全量４００μ
ｌになるように調整し、５０μｌづつ５本の反応チュー
ブに分注してＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍ
ｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９６００で９４℃２分間反
応させた後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃
１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行い、その後９
４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間＋
各サイクルごとに２０秒間延長のサイクルを１０サイク
ル行い、最後に７２℃７分間で反応させる温度サイクル
プログラムで行った。得られたＰＣＲ反応物からエタノ
ール沈殿法でＤＮＡを回収した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩ
Ｎ−１００ＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏカラム（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ社）で精製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
社）３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ（ＮｅｗＥｎｇ
ｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）３０Ｕで切断した。制限
酵素処理を行った産物を４％ＮＵＳＩＥＶＥ^TM ＧＴ
Ｇ^TM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを用い、５０
Ｖで１時間電気泳動を行った。その１９０ｂｐのＤＮＡ
鎖長に相当する部位のゲルを切り出してＨｏｔ−Ｐｈｅ
ｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。その結果、△
１−４９−５’（１９０ｂｐ）ＤＮＡ断片に相当するＤ
ＮＡ約４００ｎｇを得た。

【００８０】完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの
塩基番号２５５〜１２７８と△１−４９ＴＲｃＤＮＡの
塩基番号１８６〜１２０９は配列が同一であるため、ｐ
ＣＲ−ＴＲ１４に含まれる完全長トロンビンレセプター
ｃＤＮＡ部分のうちの塩基番号１〜２４４の部分を切り
出して、その部分を△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号
１〜１８５を含むＤＮＡ断片である△１−４９−５’
（１９０ｂｐ）とおきかえることで△１−４９ｃＤＮＡ
の塩基番号１〜１２０９の部分を構築した。

【００８１】−１ｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ２．３μｇを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ３０Ｕで切断
し、それを０．７５％ＳＥＡＰＬＡＱＵＥ^TMＧＴＧ^TM
ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ
ｓ）−ＴＡＥ緩衝液ゲルにのせて５０Ｖで１時間電気泳
動を行った。その４．１ｋｂｐに相当するＤＮＡ断片を
含むゲルを切り出し、そこからＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法
で抽出、精製して約６４０ｎｇのＤＮＡ断片を得た。

【００８２】−２で得られた△１−４９−５’（１９０ｂｐ）断片８０
ｎｇと、−１で得られたｐＣＲ−ＴＲ１４４．１ｋ
ｂｐ断片６４ｎｇとを、ＵＮＩ−Ａｍｐｋｉｔ（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ社）のｌｉｇａｔｉｏｎ試薬（Ｔ４ｌ
ｉｇａｓｅ３７．５Ｕ／ｍｌ）を用い、２０μｌスケ
ールで４℃２０時間反応させて結合させた。得られた結
合ＤＮＡは大腸菌ＤＨ−１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯＢＲ
Ｌ社）に、ＢＲＬＣｅｌｌＰｏｒａｔｏｒ^R Ｅ．
ｃｏｌｉｐｕｌｓｅｒ^R（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）
を用いて遺伝子導入した。遺伝子を導入した大腸菌をア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に播き
込み、３７℃で一晩培養して可視的に見られるコロニー
を組換え体クローンとした。それらについて△１−４９
ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１−２０に相当するプライマー
ＴＲ１プライマーとＴＲＳ１プライマーを用いてＰＣＲ
を行い、電気泳動的に３００ｂｐの増幅産物がみられる
△１−４９ｃＴＲＤＮＡを含むベクターが導入されたク
ローンの有無を解析したところ、組換え体クローン８４
クローン中１７クローンに目的のＤＮＡが導入されてい
ることが確認された。このうちの１クローンｐＣＲ−△
１−４９ＴＲｃｌｏｎｅｅ−０１についてＤＮＡ塩
基配列解析を行った。詳細にはｐＣＲII^Rベクター部位
に対するシークェンスプライマーＭ１３ＲＥＶ２２プ
ライマー［配列番号１０］、およびＭ１３ＦＯＲ２４プ
ライマー［配列番号１１］、△１−４９ＴＲｃＤＮＡの
シークェンスプライマーＴＲ１、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２
［配列番号４、６、および７］、ＴＲＳ３［配列番号
８］、ＴＲＳ４［配列番号９］ならびに、ＡＢＩＰＲ
ＩＳＭ^TM ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏ
ｎｋｉｔｗｉｔｈＡｍｐｌｉＴａｑ^R ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＦＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒ社）を用い、業者添付のプロトコールに従った。解
析装置としてはＡＢＩ３７３ＡＤＮＡＳｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ現Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いた。その結果、ｐＣ
Ｒ−△１−４９ＴＲｃｌｏｎｅｅ−１の△１−４９
ＴＲｃＤＮＡに相当する部分のＤＮＡ塩基配列は、配列
番号１に示したＤＮＡ塩基配列と完全に一致したことか
ら、目的の△１−４９ＴＲｃＤＮＡが正しく構築されて
いることが確認された。このｐＣＲ−△１−４９ＴＲ
ｃｌｏｎｅｅ−０１を含有する大腸菌を、アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌを含むＣＩＲＣＬＥＧＲＯＷ^R培地
で３７℃で一晩培養し、その含有するプラスミドをＱＩ
ＡＧＥＮ^R ＰＬＡＳＭＩＤＭＩＤＩＫＩＴ（ＱＩＡ
ＧＥＮ社）で抽出、精製し、３４μｇのｐＣＲ−△１−
４９ＴＲｃｌｏｎｅｅ−０１プラスミドを得た。

【００８３】［△１−４９ＴＲｃＤＮＡ含有トランスフ
ァーベクターの作成］△１−４９ＴＲｃＤＮＡを含有す
るバキュロウイルストランスファーベクターの作成は、
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡのトランスファー
ベクターｐＡＣ−ＴＲ１４作成と同様の方法で行った。
方法を簡単に示すと、ｐＣＲ−△１−４９ＴＲｃｌｏ
ｎｅｅ−０１の△１−４９ＴＲｃＤＮＡ部分１．２ｋ
ｂｐを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切り出し、そ
のＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで
処理したｐＶＬ１３９３ベクター中へサブクローニング
した。得られた組換え体クローン８４クローンについて
ＢａｃＦプライマーとＴＲＳ２プライマーを用いてのＰ
ＣＲ解析を行い、２４クローンに△１−４９ＴＲｃＤＮ
Ａがクローニングされていることを確認した。このうち
の１クローン、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲｃｌｏｎｅ
ｅ０１Ｅ０１プラスミドを含有する大腸菌を培養し、精
製することで約３９０μｇのプラスミドを得た。

【００８４】［△１−４９ＴＲ改変トロンビンレセプタ
ー発現用組換えバキュロウイルスの作成］△１−４９Ｔ
ＲｃＤＮＡを含有する組換えバキュロウイルスの作成
は、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲｃｌｏｎｅｅ０１Ｅ０
１組換えトランスファーベクター２μｇを用い、完全長
トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスｐ
ＡＣ−ＴＲＦ作成と同様に行った。組換えウイルスクロ
ーンのうちＢａｃＦおよびＴＲ−Ｓ２プライマーでのＰ
ＣＲにより、△１−４９ＴＲｃＤＮＡが組み込まれてい
ることが確認されたクローンｐＡＣ−△１−４９ＴＲ−
３を△１−４９ＴＲ改変ＴＲ発現用組換えバキュロウイ
ルスとした。これをＳｆ９昆虫細胞にＭＯＩ＝０．２５
で感染させることで、３×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの高濃度
ウイルス液を取得した。

【００８５】［組換えバキュロウイルスによるトロンビ
ンレセプターの昆虫細胞における発現］上記のようにし
て得られたトロンビンレセプター発現用組換えバキュロ
ウイルスＡｃＴＲＦを、１５０ｃｍ²フラスコに播種し
た１．８×１０⁷のＳｆ９細胞にＭＯＩ＝０．６−１．
０で感染させ、４０−４８時間、２７℃で静置培養し
た。培養後、感染細胞を回収し、ウエスタンブロッティ
ングおよびカルシウム流入実験によってトロンビンレセ
プターの発現および機能を有することの確認を行った。

【００８６】［ウエスタンブロッティング］回収した感
染細胞（１５０ｃｍ²フラスコ２本分、約６×１０⁷）を
ＰＢＳで２回洗浄した。これ以後の実験はすべて４℃の
条件で行った。次に、５ｍｌのホモジェナイズ用緩衝液
（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＴＭ）（ベーリンガー社
製）含有）に懸濁し、テフロンホモジェナイザーを用い
て、２５００回転／分で３０ｓｔｒｏｋｅホモジェナイ
ズを行った。このホモジェネートを１５ｍｌの遠心管に
いれて２５００回転／分（約１０００ｇ）で１０分間遠
心し、上清を回収した。回収した上清を５００００回転
／分（約１０００００ｇ）で１時間、超遠心を行い、粗
膜画分を沈殿させた。沈殿物を１ｍｌのホモジェナイズ
用緩衝液に懸濁し、５０μｌずつ分注して−８０℃で凍
結保存した。ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（ＴＭ）（ベーリ
ンガー社製）を用いて定量した結果、タンパク濃度は１
４ｍｇ／ｍｌであった。このようにして得られた粗膜画
分につき、２５μｇ−５０μｇ／ｌａｎｅで、１０％ゲ
ルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、これをニトロセルロース膜に転写した。この膜を３
％ゼラチン／ＴＢＳで室温で１時間ブロッキングし、Ｔ
ＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄
した。その後、トロンビンレセプターの内在性リガンド
領域であるＴＲＡＰをウサギに免疫して得られた抗ＴＲ
ＡＰウサギポリクローナル抗体１０−２０μｇ／ｍｌを
含む１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液中、室温で終夜反応させ
た。翌日、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢ
Ｓで１回洗浄し、抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナルＨ
ＲＰ標識抗体（約１μｇ／ｍｌ、１％ゼラチン／ＴＢＳ
溶液）を室温１時間反応させた。次にＴＢＳ−０．０５
％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで２回洗浄し、コニカイム
ノステインＨＲＰで１０分間、室温にて発色させてバン
ドを検出した。その結果、トロンビンレセプター発現用
組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に特異的
に、約４５ｋＤおよび約８５ｋＤ付近のバンドが観察さ
れ、トロンビンレセプターが昆虫細胞膜上に発現してい
ることが確認された。

【００８７】［カルシウム流入実験］回収した感染細胞
（約３×１０⁷）をＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
（−Ｃａ）で１回洗浄した後、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ−
Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１μｇ／ｍｌＦｕｒａ２−ＡＭ
含有）に懸濁してＦｕｒａ２−ＡＭを２７℃で３０分間
負荷した。室温で８００回転／分で５分間遠心して細胞
を回収し、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）
で２回洗浄した後、２ｍｌのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ
緩衝液（−Ｃａ）に再懸濁した。この細胞懸濁液に２μ
ｌの１ＭＣａＣｌ₂を最終濃度１ｍＭになるように加
え、遮光して室温で５分間インキュベートした。このよ
うに調製したＦｕｒａ２−ＡＭ負荷感染細胞を４９０μ
ｌとってキュベットに入れ、細胞内カルシウム測定装置
（日本分光ＣＡＦ−１００型）で測定した。［励起光３
４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８
０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］（細胞内カルシウ
ム濃度を反映）が０．０２ぐらいに安定したらキュベッ
トに１０μｌの１０ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンもしくは
１．２５ｍＭＴＲＡＰを添加して刺激を与え、細胞内
カルシウム濃度を経時的に測定した。カルシウムの流入
は［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／
［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］の値
が上昇することで検出される。その結果、トロンビンレ
セプター発現用組換えバキュロウイルスを感染させた昆
虫細胞に特異的にカルシウム流入が観察された（表１参
照）。この結果から、機能を有するトロンビンレセプタ
ーが昆虫細胞に発現していることが証明された。

【００８８】

【表１】

【００８９】表中の値は［励起光３４０ｎｍによる５０
０ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００
ｎｍの蛍光強度］の変化量を表す（高い値ほど強い反応
を表す）。４回の測定の平均値±ＳＤ。

【００９０】実施例２：マウスの免疫および脾臓細胞か
らのファージミドライブラリーの作製ファージミドライブラリーの作製はリコンビナント・フ
ァージアンチボディー・システム（ファルマシア社製）
の方法に準じた。抗体遺伝子取得のための免疫は以下の
ように行った。Ｓｆ９昆虫細胞２×１０ ⁷細胞を細胞培
養フラスコに播種して３０分間静置の後、前述のｐｃ△
１−４９ＴＲ−３ウイルスをＭＯＩ＝２で感染させ、２
７℃で４０時間培養した。この感染細胞を回収してＰＢ
Ｓ（０．９％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液）で２回洗浄後、０．２Ｍアジ化ナトリウムを含
むＰＢＳ４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を室温で
３０分間放置したのち５０μＬを分取して等量の０．２
％トレパンブルー染色液と混合し、光学顕微鏡で細胞を
観察したところ、すべての細胞が青く染まったことか
ら、回収した感染細胞が１００％死細胞となったと判断
した。この死細胞化した感染昆虫細胞をＰＢＳで２回洗
浄した後、約３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。得られた死細
胞化感染昆虫細胞は約６×１０⁷細胞であった。この細
胞３ｍｌに不活化百日咳死菌（シグマ社）を３０μＬ添
加した後、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに各１ｍｌずつ腹腔内
投与した。その後２週間おきに４回、同様の方法で免疫
を行った後、最後の免疫実施から４日後にマウスを屠殺
して脾臓の摘出を行った。

【００９１】△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を免疫したマ
ウスから脾臓を摘出し、ｍＲＮＡを抽出した。これを鋳
型としてＨｏｎｇＺｈｏｕらの報告（Nucleic Acid R
eserch, 1994, vol. 22, No.5, 888-889）のＰＣＲプラ
イマーを使用して抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子をそれぞれ
別々に増幅した。得られたＤＮＡをリンカーを用いて連
結し、アガロースゲル電気泳動により約７５０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡを制限酵素Ｎｏ
ｔＩとＳｆｉＩで消化し、再びアガロースゲル電気泳動
により、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。
こうして得られたＤＮＡフラグメントを抗Ｄ１−４９Ｔ
Ｒ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名付け
た。

【００９２】アマーシャムファルマシアバイオテク社の
ｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターを制限酵素ＮｏｔＩとＳｆｉ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片
を分離、回収した。このＤＮＡ断片にヒスチジンＴａｇ
アダプター（配列番号１５）をＴＡＫＡＲＡのＬｉｇａ
ｔｉｏｎｋｉｔＶｅｒII（ＴＭ）でライゲーション
し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。この遺伝子ベクタ
ー導入大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む
ＬＢ−アガロース固形培地に播種し、クローンを取得し
た。そのうちの２０クローンについてプラスミドＤＮＡ
をＱＩＡＧＥＮ社プラスミド抽出キットによって取得
し、Ｅ−ｔａｇプライマーとＰＥａｐｐｌｉｅｄＢ
ｉｏｓｙｔｅｍｓ社ＡＢＩＰＲＩＳＭ（ＴＭ）Ｄｙ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉ
ｔおよび同社ＡＢＩＭｏｄｅｌ３７３ＡＤＮＡシー
クェンサーを用いて塩基配列を解析することで、ヒスチ
ジンＴａｇアダプターが正しい方向にクローニングされ
たベクターを選択し、これをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベク
ターと名づけた。さらにこのｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベク
ターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩで切断したベク
ターをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名
づけた。

【００９３】抗Ｄ１−４９ＴＲ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／
ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩとｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ
−ＳｆｉＩをライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社
製）を用いてライゲーション反応を行った。このライゲ
ーション溶液とコンピテントセルＴＧ１−ｔｒを用いて
形質転換を行った。

【００９４】アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍ
ｌ）を含む２×ＹＴ（トリプトン１６ｇ、イーストエ
クストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）寒天プレー
トに形質転換した液をまき、３７℃で一晩インキュベー
トした。プレート上に生じたコロニーをかきとって２×
ＹＴ培地に懸濁し、これをファージミドライブラリーと
した（ライブラリーのサイズは約１．３×１０⁸ｐｆ
ｕ）。作製したファージミドライブラリーはグリセロー
ルを最終２５％程度になるように加えてマイナス８０℃
に保存した。

【００９５】実施例３：△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を
用いるパンニング実施例２で得られたファージミドライブラリー１００μ
ｌをアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グル
コース（２％）を含む２×ＹＴ培地５０ｍｌに加え、６
００ｎｍのＯＤが０．６になるまで３７℃で培養した。
ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（５×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍ
ｌ）を５５μｌ加え、１時間感染させた。

【００９６】遠心により菌体を回収し、アンピシリン
（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（最終濃
度５０μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に懸濁し、３７
℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心後、上清を回収
し、５分の１量の２０％ポリエチレングリコール、２．
５ＭＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿回収した。
回収したファージは滅菌水に懸濁した。

【００９７】次に２％スキムミルクを含む溶液中でファ
ージとＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞を混合し、室温で３０
分間反応させた。遠心により細胞に結合したファージを
除き、上澄みを再度ＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞と混合し
た。この操作を１０回繰り返すことによりＡｃＭＮＰＶ
感染昆虫細胞に結合するファージを除去した。

【００９８】続いてそのファージ溶液と△１−４９ＴＲ
発現昆虫細胞を混合し、室温で１時間反応させた。遠心
により結合しなかったファージ（上澄み）を除き、さら
に５回の洗い操作によって非特異的な結合を排除した。
その後０．１ＭＨＣｌで細胞からファージをはがして
回収し、等量の１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。こ
うして回収したファージを大腸菌ＴＧ１−ｔｒに１時間
感染させ、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）
を含む２×ＹＴ寒天プレート上で一晩培養することによ
りコロニーを作製し、回収したものを△１−４９ＴＲ発
現昆虫細胞１回パンニングファージミドライブラリーと
した。

【００９９】ここまでのファージ調製、細胞に結合する
ファージの回収という操作を４回繰り返すことによっ
て、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合するファージミ
ドを濃縮した。各パンニングステップにおいて溶出され
てきたファージ数は１回目から順に、８×１０⁷ｐｆ
ｕ、１×１０⁸ｐｆｕ、１×１０⁹ｐｆｕ、６×１０¹⁰ｐ
ｆｕである。

【０１００】実施例４：精製ｓｃＦｖの調製［標準的なｓｃＦｖ産生株培養法およびペリプラズム画
分取得方法］（１）ｓｃＦｖ産生大腸菌株を下記前培養液３０ｍｌに
植菌して３０℃、１６０回転／分で終夜培養を行う。
（前培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン、０．５％グルコース含有）（２）終夜培養液３０ｍｌを本培養液３００ｍｌに加え
る。（本培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌ
アンピシリン、０．４Ｍショ糖含有）（３）３０℃、１６０回転／分で１時間培養後、最終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラ
クトシド）を加え、ｓｃＦｖの産生を誘導する。さら
に、３０℃、１６０回転／分で６時間培養する。（４）培養液を５００ｍｌの遠心管に移し、４℃、５５
００回転／分で２０分間遠心する。（５）沈殿物を回収し、１．８ｍｌの１０×ＨＥＰＥＳ
緩衝液（１ｍＭＡＰＭＳＦ含有、４℃）に懸濁する。（６）４０ｍｌの遠心管に移し、氷上で１５分間静置す
る。（５分おきにボルテックスで攪拌）（７）４℃、８０００回転／分で１０分間遠心する。（８）上清を回収し４℃に保存する。（９）沈殿物を１６．２ｍｌ注射用水（１ｍＭＡＰＭ
ＳＦ含有、４℃）に懸濁する。（１０）氷上で２０分間静置する。（５分おきにボルテ
ックスで攪拌）（１１）４℃、１２０００回転／分で２０分間遠心す
る。（１２）上清を回収し、（８）で保存してあった上清と
合わせて「ペリプラズム画分」とする。（１３）４℃に保存または−２０℃で凍結保存する。

【０１０１】［標準的なｓｃＦｖ精製方法］（１）ペリプラズム画分（３０ｍｌ）の約１／１０量の
３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（アガロース担体の量
として１／２０量）を測りとる。（２）室温で６００回転／分で３分間遠心する。（３）上清を捨て、１．５ｍｌの脱イオン水を加え、攪
拌する。（４）真空ポンプで吸引し、１０−２０分間脱気を行
う。（５）３０ｍｌボリュームのカラムにＮｉ−ＮＴＡアガ
ロースを装填する。（６）１時間室温で静置する。（７）１５ｍｌ緩衝液１（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、
１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ
８）でカラムを平衡化する。（８）３０ｍｌのペリプラズム画分を４℃で０．５ｍｉ
ｎ／ｍｌの滴下速度で２回アプライする。以下の操作は
すべて４℃で行う。（９）１５ｍｌ緩衝液２（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、
１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍ
ＭＡＰＭＳＦ、ｐＨ８）で洗浄する。（１０）１．５ｍｌ緩衝液３（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄ
ｅ、６５０ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾー
ル、ｐＨ８）で２回ｓｃＦｖを溶出する。（１１）ＭｉｌｌｉｃｕｐＬＧＣ（ミリポア社製）で
濃縮を行う。（１２）１０００倍量のＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝
液で透析を２回行う。（１３）精製されたｓｃＦｖを回収し、４℃または−２
０℃で凍結保存する。

【０１０２】実施例５：リコンビナントＴＲ発現昆虫細
胞結合性の評価実施例１で作製した△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞で４回
パンニングしたファージを大腸菌ＨＢ２１５１に感染さ
せ、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成さ
せた。

【０１０３】こうして得られたファージミドがトランス
フォームされた大腸菌ＨＢ２１５１株をアンピシリン
（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（最終濃度
０．５％）を含む２×ＹＴ培地中、３０℃で一晩振とう
培養した。培養液を１０μｌとり、１００μｌのアンピ
シリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む培地に懸濁
し、３０℃で１時間振とう培養した。ここで最終濃度１
ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間振とう
培養を続けた後、遠心によりペレットを回収した。これ
に１０×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を加えて菌体
を懸濁した後、４℃で１５分静置した。最後に蒸留水を
加えて１×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１２９ｍＭＮａＣｌ、８．９ｍＭＮ
ａＨＣＯ₃、２．８ｍＭＫＣｌ、０．８ｍＭＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、５．６ｍＭＤ−グルコース、０．８ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂／Ｌ）の状態に戻したものをペリプラズム画分と
して回収した。これを結合評価用のｓｃＦｖサンプルと
した。

【０１０４】△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に対する結合
性の評価は以下のように行った。まず９６ウエルマルチ
スクリーンプレート（ミリポア社製）を３％ウシ血清ア
ルブミンでコーティングしたところに、△１−４９ＴＲ
発現昆虫細胞とＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞をそれぞれ抗
原として加え、調製したｓｃＦｖを混合し、１時間室温
で反応させ、ｓｃＦｖのＣ末端側に存在するＥｔａｇ
部分を認識するＨＲＰ／抗Ｅｔａｇ抗体コンジュゲー
トで検出した。こうして５４０個のコロニーを評価して
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合し、ＡｃＭＮＰＶ感
染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖを３４個選択した。

【０１０５】実施例６：ヒト巨核芽球系細胞を用いるＣ
ａ流入阻害評価実施例４において作製したｓｃＦｖのトロンビン惹起カ
ルシウム流入阻害能を、以下に示す方法によって評価し
た。すなわち、巨核球細胞系の株化細胞をＨＥＰＥＳ−
ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に懸濁し、最終濃度１μＭのＦｕｒ
ａ２−ＡＭ（和光純薬社製）を３７℃で５０分間インキ
ュベートしたのち、ＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で
２回洗浄し、細胞密度が３．３３×１０⁶ｃｅｌｌｓ／
ｍｌになるように調製した。次にその細胞懸濁液３００
μｌに実施例４において作製したｓｃＦｖ溶液を２００
μｌ混合し、室温で３０分間インキュベートしたのち、
最終濃度が１ｍＭになるようにＣａＣｌ₂を添加し、さ
らに室温で５分間インキュベートした。そこにヒト血漿
由来トロンビン（シグマ社製）を最終濃度が０．４Ｕ／
ｍｌになるように添加し、添加３０秒後の細胞内カルシ
ウム流入量をＣＡＦ−１００（日本分光社製）を用いて
測定した。その例として、４種類のクローン（Ｎ０２
１、Ｎ０２２、Ｎ０２３、Ｎ０２５）について、ｓｃＦ
ｖ溶液のかわりにＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液とイ
ンキュベートした場合のカルシウム流入量を１００とし
たときの相対値および阻害率を算出した（表２参照）。

【０１０６】

【表２】

【０１０７】実施例７：血小板凝集阻害評価健常人より０．３８％クエン酸加血として採血し、９０
０回転／分で１５分遠心することにより血小板を豊富に
含む血漿を取得した。その血漿をセファロース２Ｂを用
いＨＥＰＡＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液にて展開することに
より血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液（＞２×１０⁸
／ｍｌ）を調製した。得られた血小板浮遊液２１０μｌ
にｓｃＦｖ溶液９０μｌを混合し、２０分間静置した。
そのうち２８５μｌをキュッベットに分取し、アグリゴ
メーターＰＡＭ８Ｃ（メバニクス株式会社）を用いて攪
拌しつつ、３７℃にて２分間で安定化した。その血小板
浮遊液の濁度を測定しつつ、７．５μｌのＣａＣｌ₂水
溶液（最終濃度１．５ｍＭ）を添加した。さらに７．５
μｌのヒトトロンビン（最終濃度０．１〜０．２Ｕ／ｍ
ｌ）を添加して血小板の凝集を惹起し、その濁度の変化
から血小板の凝集度を１１分間測定することによってｓ
ｃＦｖによる血小板凝集阻害を評価した。トロンビンで
惹起された最大凝集度を１００％としたときのｓｃＦｖ
の阻害活性の例を表３に示した。

【０１０８】

【表３】

【０１０９】実施例８：滑膜細胞増殖阻害評価実施例４に示したように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにて精製
したｓｃＦｖについて、さらにエンドトキシンの除去を
行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラム溶出物１６０ｍｌを限外濾
過膜を用いて９０ｍｌに濃縮したのち、φ０．２２μｍ
のフィルターで濾過した後、セファクリルＳ−１００を
用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ｓｃＦｖが
溶出する画分を回収した。それを再度Ｎｉ−ＮＴＡカラ
ムにロードして６０ｍｌの溶出画分を得、それを限外濾
過膜を用いて１０ｍｌに濃縮した。それを２ＬのＨＥＰ
ＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して２回透析した後、カ
ニ外殻キトサン多孔性粒子を用いたアフィニティーカラ
ムにロードし、フロースルー画分を回収し、φ０．２２
μｍのフィルターで濾過した。各精製工程におけるエン
ドトキシン量、蛋白質量を表４に示した。

【０１１０】

【表４】

【０１１１】次に、慢性関節リウマチ患者の滑膜組織か
ら外植片法により初代培養したのち数代継代した滑膜細
胞を、９６穴のマイクロタイタープレートにて１ウェル
当たり５×１０³細胞になるように播き込み、１０％の
ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ₂の条
件下で３日間培養した。上清を除去し、無血清のＤＭＥ
Ｍ培地で洗浄した後に０．１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ
培地を添加し、さらに４８時間血清飢餓条件下で培養し
た。そこにエンドトキシンを除去したｓｃＦｖを添加
し、３０分間インキュベートした後、ヒト血漿由来トロ
ンビン（シグマ社製）を最終濃度が１０Ｕ／ｍｌになる
ように添加した。添加２４時間後にチミジンのアナログ
であるＢｒｄＵを最終濃度１ｍＭになるように添加し、
添加４８時間後に蛋白固相液により細胞核内に取り込ま
れたＢｒｄＵを固相化し、酵素標識された抗ＢｒｄＵ抗
体を用いて検出した。トロンビンで惹起されたＢｒｄＵ
取り込み量を１００％としたときのｓｃＦｖの阻害活性
の例を表５に示した。

【０１１２】

【表５】

【０１１３】実施例９：ｓｃＦｖのエピトープの決定以下に示す９４種類の１５アミノ酸をＣ末端が固相側に
なるように９４本のピン上に固相合成した。該ペプチド
はすべてＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞外
領域に包含されるペプチドである。

【０１１４】ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側
の１番目から１５番目のアミノ酸配列［配列番号１
６］、同じく２番目から１６番目のアミノ酸配列［配列
番号１７］、同じく３番目から１７番目のアミノ酸配列
［配列番号１８］、同じく４番目から１８番目のアミノ
酸配列［配列番号１９］、同じく５番目から１９番目の
アミノ酸配列［配列番号２０］、同じく６番目から２０
番目のアミノ酸配列［配列番号２１］、同じく７番目か
ら２１番目のアミノ酸配列［配列番号２２］、同じく８
番目から２２番目のアミノ酸配列［配列番号２３］、同
じく９番目から２３番目のアミノ酸配列［配列番号２
４］、同じく１０番目から２４番目のアミノ酸配列［配
列番号２５］、同じく１１番目から２５番目のアミノ酸
配列［配列番号２６］、同じく１２番目から２６番目の
アミノ酸配列［配列番号２７］、同じく１３番目から２
７番目のアミノ酸配列［配列番号２８］、同じく１４番
目から２８番目のアミノ酸配列［配列番号２９］、同じ
く１５番目から２９番目のアミノ酸配列［配列番号３
０］、同じく１６番目から３０番目のアミノ酸配列［配
列番号３１］、同じく１７番目から３１番目のアミノ酸
配列［配列番号３２］、同じく１８番目から３２番目の
アミノ酸配列［配列番号３３］、同じく１９番目から３
３番目のアミノ酸配列［配列番号３４］、同じく２０番
目から３４番目のアミノ酸配列［配列番号３５］、同じ
く２１番目から３５番目のアミノ酸配列［配列番号３
６］、同じく２２番目から３６番目のアミノ酸配列［配
列番号３７］、同じく２３番目から３７番目のアミノ酸
配列［配列番号３８］、同じく２４番目から３８番目の
アミノ酸配列［配列番号３９］、同じく２５番目から３
９番目のアミノ酸配列［配列番号４０］、同じく２６番
目から４０番目のアミノ酸配列［配列番号４１］、同じ
く２７番目から４１番目のアミノ酸配列［配列番号４
２］、同じく４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配
列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸
配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目の
アミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５
８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番
目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じ
く４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４
８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配
列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸
配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目の
アミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６
４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番
目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］、同じ
く５２番目から６６番目のアミノ酸配列［配列番号５
４］、同じく５３番目から６７番目のアミノ酸配列［配
列番号５５］、同じく５４番目から６８番目のアミノ酸
配列［配列番号５６］、同じく５５番目から６９番目の
アミノ酸配列［配列番号５７］、同じく５６番目から７
０番目のアミノ酸配列［配列番号５８］、同じく５７番
目から７１番目のアミノ酸配列［配列番号５９］、同じ
く５８番目から７２番目のアミノ酸配列［配列番号６
０］、同じく５９番目から７３番目のアミノ酸配列［配
列番号６１］、同じく６０番目から７４番目のアミノ酸
配列［配列番号６２］、同じく６１番目から７５番目の
アミノ酸配列［配列番号６３］、同じく６２番目から７
６番目のアミノ酸配列［配列番号６４］、同じく６３番
目から７７番目のアミノ酸配列［配列番号６５］、同じ
く６４番目から７８番目のアミノ酸配列［配列番号６
６］、同じく６５番目から７９番目のアミノ酸配列［配
列番号６７］、同じく６６番目から８０番目のアミノ酸
配列［配列番号６８］、同じく６７番目から８１番目の
アミノ酸配列［配列番号６９］、同じく６８番目から８
２番目のアミノ酸配列［配列番号７０］、同じく６９番
目から８３番目のアミノ酸配列［配列番号７１］、同じ
く７０番目から８４番目のアミノ酸配列［配列番号７
２］、同じく７１番目から８５番目のアミノ酸配列［配
列番号７３］、同じく７２番目から８６番目のアミノ酸
配列［配列番号７４］、同じく７３番目から８７番目の
アミノ酸配列［配列番号７５］、同じく７４番目から８
８番目のアミノ酸配列［配列番号７６］、同じく７５番
目から８９番目のアミノ酸配列［配列番号７７］、同じ
く７６番目から９０番目のアミノ酸配列［配列番号７
８］、同じく７７番目から９１番目のアミノ酸配列［配
列番号７９］、同じく７８番目から９２番目のアミノ酸
配列［配列番号８０］、同じく７９番目から９３番目の
アミノ酸配列［配列番号８１］、同じく８０番目から９
４番目のアミノ酸配列［配列番号８２］、同じく８１番
目から９５番目のアミノ酸配列［配列番号８３］、同じ
く８２番目から９６番目のアミノ酸配列［配列番号８
４］、同じく８３番目から９７番目のアミノ酸配列［配
列番号８５］、同じく８４番目から９８番目のアミノ酸
配列［配列番号８６］、同じく８５番目から９９番目の
アミノ酸配列［配列番号８７］、同じく８６番目から１
００番目のアミノ酸配列［配列番号８８］、同じく８７
番目から１０１番目のアミノ酸配列［配列番号８９］、
同じく８８番目から１０２番目のアミノ酸配列［配列番
号９０］、同じく８９番目から１０３番目のアミノ酸配
列［配列番号９１］、同じく９０番目から１０４番目の
アミノ酸配列［配列番号９２］、同じく１５９番目から
１７３番目のアミノ酸配列［配列番号９３］、同じく１
６０番目から１７４番目のアミノ酸配列［配列番号９
４］、同じく２３５番目から２４９番目のアミノ酸配列
［配列番号９５］。同じく２３６番目から２５０番目の
アミノ酸配列［配列番号９６］、同じく２３７番目から
２５１番目のアミノ酸配列［配列番号９７］、同じく２
３８番目から２５２番目のアミノ酸配列［配列番号９
８］、同じく２３９番目から２５３番目のアミノ酸配列
［配列番号９９］、同じく２４０番目から２５４番目の
アミノ酸配列［配列番号１００］、同じく２４１番目か
ら２５５番目のアミノ酸配列［配列番号１０１］、同じ
く２４２番目から２５６番目のアミノ酸配列［配列番号
１０２］、同じく２４３番目から２５７番目のアミノ酸
配列［配列番号１０３］、同じく２４４番目から２５８
番目のアミノ酸配列［配列番号１０４］、同じく２４５
番目から２５９番目のアミノ酸配列［配列番号１０
５］、同じく２４６番目から２６０番目のアミノ酸配列
［配列番号１０６］、同じく２４７番目から２６１番目
のアミノ酸配列［配列番号１０７］、同じく２４８番目
から２６２番目のアミノ酸配列［配列番号１０８］、同
じく３２９番目から３４６番目のアミノ酸配列［配列番
号１０９］

【０１１５】上記９４種類のペプチドが固相化されたピ
ンをプレコートバッファー（２％ＢＳＡ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０、０．１％アジ化ナトリウム０．０１Ｍ
ＰＢＳ）に室温で６０分間浸したのちに、洗浄バッファ
ー（０．０１ＭＰＢＳ）で室温で１０分間洗浄した。
次に２０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ溶液（１％ＢＳＡ、０．
１％スキムミルク含有）に４℃で終夜反応させたのちに
洗浄バッファーで４回洗浄した。次にｓｃＦｖのｃ−ｍ
ｙｃタグを特異的に認識する抗体である９Ｅ１０にホー
スラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした
ものを１μｇ／ｍｌ（１％ＢＳＡ、０．１％スキムミ
ルク、０．０１ＭＰＢＳ含有）の濃度で室温で６０分
間反応させた後、洗浄バッファーで４回洗浄した。次に
発色剤溶液（ＡＢＴＳ）にピンを１０分間浸漬し、波長
４０５ｎｍにおける発色剤溶液の吸光度を測定した。そ
の結果、滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０
２２およびＮ０２５は、以下のアミノ酸配列に対して特
異的に結合した。すなわち、ＰＡＲ１型ヒトトロンビン
レセプターのアミノ末端側の４１番目から５５番目のア
ミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６
番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目
から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく
４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４
６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配
列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸
配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目の
アミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６
２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番
目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じ
く５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５
２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配
列番号５３］である。

【０１１６】このことから、トロンビンで惹起した滑膜
細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０２２およびＮ
０２５のエピトープは、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセ
プターのアミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ
酸配列を認識することが示された。

【０１１７】また滑膜細胞増殖を阻害しないｓｃＦｖク
ローンＮ０１８は、以下のアミノ酸配列に対して特異的
に結合した。すなわち、ヒトトロンビンレセプターのア
ミノ末端側の４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配
列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸
配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目の
アミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５
８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番
目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じ
く４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４
８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配
列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸
配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目の
アミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６
４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番
目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］であ
る。

【０１１８】このことから、トロンビンで惹起した滑膜
細胞増殖を阻害するｓｃＦｖのエピトープは、ヒトトロ
ンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５６番
目のアミノ酸配列であることが示された。

【０１１９】実施例１０：ｓｃＦｖのＫｉｎｅｔｉｃｓ
解析滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープに対
するＫｉｎｅｔｉｃｓ特異性の検証を表面プライズモン
共鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ
社）を用いて行った。

【０１２０】以下に示す２１アミノ酸を合成した（株式
会社バイオロジカ）。このペプチドはＰＡＲ１型ヒトト
ロンビンレセプターの細胞外領域に包含され、活膜細胞
増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープを含むペプチ
ドである。ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１０］ＡｓｎＰｒｏＡｓｎＡｓｐＬｙｓＴｙｒＧｌｕＰｒｏＰｈｅＴｒｐＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｕＬｙｓＡｓｎＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｅｕＴｈｒ

【０１２１】ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのア
ミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配
列番号１１０］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成
した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃ
ｔＩｍｍｕｎｏｇｅｎＥＤＣＣｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎＫｉｔＷｉｔｈＫＬＨａｎｄＢＳＡ」を
用い、まずＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミ
ノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチ
ド１ｍｇをＫｉｔのＥＤＣＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩
衝液０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、
ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さ
らにＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、Ｋ
ＬＨ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３
０分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣＣｏｎｊｕ
ｇａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止さ
せた。その後、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して
２回透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。

【０１２２】ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側
の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体
ペプチドまたリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５センサ
ーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡＣ
ＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキット」
を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なった。Ｂ
ＩＡＣＯＲＥＣｏｎｔｒｏｌＳｏｆｔｗａｒｅＶ
ｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同社市販
のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭＨＥＰＥＳ、０．
１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ボ
リソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／分で流し
た。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ／ＮＨＳ
の１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応させ、センサ
ーチップ表面上のカルボキシメチルデキストランを活性
化させた。１００μｇ／ｍｌのＫＬＨＣｏｎｊｕｇａ
ｔｅｄペプチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応
させることによりセンサーチップ上に結合させ、さらに
アミンカップリングキット中のエタノールアミンを７分
間（３５μｌ）反応させて残余の活性型ＮＨＳ基をブロ
ッキングした。

【０１２３】上記センサーチップ上に固定化されたＫＬ
Ｈをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結
合解離曲線を測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にてｓｃＦ
ｖを５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／
ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌに調製し、各ｓｃＦｖ溶液に
ついて、流速２０μｌ／分で３分間センサーチップに反
応させた。その後、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ
／分で５分間流し、センサーチップを１０ｍＭＨＣｌ
で２０μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一
連の操作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定
することによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの結合解
離曲線を得た。得られた結合解離曲線と各ｓｃＦｖの濃
度から、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒ
ｅｖｅｒ．２．１を用いて同社添付のプログラムに準
じ、各ｓｃＦｖの結合解離定数を算出した。その結果、
各ｓｃＦｖの結合解離定数（ＫＤ値）は滑膜細胞増殖阻
害活性をもつｓｃＦｖでＫＤ値：約５×１０^-7Ｍ、滑膜
細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖでＫＤ値：約１×
１０^-7Ｍであった（表６参照）。

【０１２４】

【表６】

【０１２５】実施例１１：ｓｃＦｖのエピトープのアミ
ノ酸残基特異性の比較滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープにお
けるアミノ酸残基特異性の検証を、表面プライズモン共
鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ
社）を用いて行った。

【０１２６】以下に示す５種類の２１アミノ酸を合成し
た（株式会社バイオロジカ）。４種のペプチドはヒトト
ロンビンレセプターの細胞外領域に包含されるペプチド
とそのアミノ酸残基置換ペプチドである。

【０１２７】すなわち、ヒトトロンビンレセプターのア
ミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配
列番号１１２］、同じく４７番目から６７番目のアミノ
酸残基中５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ
酸配列［配列番号１１３］、同じく４７番目から６７番
目のアミノ酸残基中５５番目のフェニルアラニンをアラ
ニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１４］、同じ
く４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５６番目のト
リプトファンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列
番号１１５］、およびコントロールの２１アミノ酸配列
［配列番号１１１］ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｈｅＰｈｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅである。

【０１２８】ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのア
ミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配
列番号１１２］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成
した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃ
ｔＩｍｍｕｎｏｇｅｎＥＤＣＣｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎＫｉｔＷｉｔｈＫＬＨａｎｄＢＳＡ」を
用い、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末
端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド１
ｍｇをＫｉｔのＥＤＣＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液
０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、ＫＬ
Ｈ溶解液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さら
にＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、ＫＬ
Ｈ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３０
分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣＣｏｎｊｕｇ
ａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止させ
た。さらにＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して２回
透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。

【０１２９】ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側
の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体
ペプチド、またリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５セン
サーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡ
ＣＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキッ
ト」を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なっ
た。ＢＩＡＣＯＲＥＣｏｎｔｒｏｌＳｏｆｔｗａｒ
ｅＶｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同
社市販のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭＨＥＰＥ
Ｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０
０５％ボリソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／
分で流した。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ
／ＮＨＳの１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応さ
せ、センサーチップ表面上のカルボキシルデキストラン
を活性化させた。１００μｇ／ｍｌのＫＬＨ複合体ペ
プチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応させるこ
とによりセンサーチップ上に結合させ、さらにアミンカ
ップリングキット中のエタノールアミンを７分間（３５
μｌ）反応させて残余のＮＨＳ基をブロッキングした。

【０１３０】上記センサーチップ上に固定化されたＫＬ
Ｈをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結
合を確認した。ｓｃＦｖをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にて５０
μｇ／ｍｌに調製し、流速１０μｌ／分で３分間反応さ
せた。その後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ／分で
５分間流し、センサーチップを１０ｍＭＨＣｌで２０
μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一連の操
作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定するこ
とによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの最大結合量を
得た。滑膜細胞増殖活性を有するｓｃＦｖで最大結合量
約３００ＲＵ、滑膜細胞増殖活性のないｓｃＦｖで最大
結合量約６００ＲＵの結合値を得た。

【０１３１】上記線センサーチップ上に固定化されたＫ
ＬＨをリファレンスに、ペプチドに対するｓｃＦｖ５種
の各ペプチドによる競合結合阻害を測定した。ＨＢＳ−
ＥＰ緩衝液にてｓｃＦｖ（終濃度５０μｇ／ｍｌ）とペ
プチド（終濃度５μｇ／ｍｌ）の混合液を調製し、ｓｃ
Ｆｖ−ペプチド混合液を流速１０μｌ／分で３分間反応
させた。

【０１３２】コントロールペプチドでは滑膜細胞増殖阻
害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともに結合を
阻害されなかった。ヒトトロンビンレセプターのアミノ
末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド
では滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓ
ｃＦｖともに結合が阻害された。

【０１３３】活膜細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖ
ではヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番
目から６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンを
アラニンに置換したアミノ酸ペプチド、および４７番目
から６７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルア
ラニンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは結合
阻害が認められず、アミノ末端側の４７番目から６７番
目のアミノ酸残基中、５６番目のトリプトファンをアラ
ニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認められ
た。

【０１３４】滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖでは
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目か
ら６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンをアラ
ニンに置換したアミノ酸ペプチドおよび４７番目から６
７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルアラニン
をアラニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認
められ、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４
７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５６番目のトリ
プトファンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは
結合阻害が認められなかった。

【０１３５】滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、も
たないｓｃＦｖともにエピトープとして重複したアミノ
酸配列を認識しているものの、そのエピトープにおける
各アミノ酸残基に対する重要度に違いがあることが確認
された。

【０１３６】トロンビン惹起滑膜細胞増殖阻害にはヒト
トロンビンレセプターのアミノ酸末端から５６番目のト
リプトファン残基がｓｃＦｖの重要な結合部位であるこ
とが確認された。

【０１３７】

【発明の効果】本発明の薬剤（ポリペプチドまたは化合
物）は、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を
抑制し、細胞増殖阻害活性やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑
制する活性を有し、各種炎症性疾患や細胞増殖性疾患の
治療薬として用いられる。

【０１３８】

【配列表】

【０１３９】 <110> 帝人株式会社 <120> 細胞増殖抑制剤 <130> P33486 <160> 115 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213> ヒト <400> 1 atg ggg ccg cgg cgg ctg ctg ctg gtg gcc gcc tgc ttc agt ctg tgc ggc ccg 54 Met Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro 1 5 10 15 ctg ttg tct gcc cgc acc cgg gcc gat aaa tat gaa cca ttt tgg gag gat gag 108 Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu 20 25 30 35 gag aaa aat gaa agt ggg tta act gaa tac aga tta gtc tcc atc aat aaa agc 162 Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser 40 45 50 agt cct ctt caa aaa caa ctt cct gca ttc atc tca gaa gat gcc tcc gga tat 216 Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr 55 60 65 70 ttg acc agc tcc tgg ctg aca ctc ttt gtc cca tct gtg tac acc gga gtg ttt 270 Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu Phe Val Pro Ser Val Tyr Thr Gly Val Phe 75 80 85 90 gta gtc agc ctc cca cta aac atc atg gcc atc gtt gtg ttc atc ctg aaa atg 324 Val Val Ser Leu Pro Leu Asn Ile Met Ala Ile Val Val Phe Ile Leu Lys Met 95 100 105 aag gtc aag aag ccg gcg gtg gtg tac atg ctg cac ctg gcc acg gca gat gtg 378 Lys Val Lys Lys Pro Ala Val Val Tyr Met Leu His Leu Ala Thr Ala Asp Val 110 115 120 125 ctg ttt gtg tct gtg ctc ccc ttt aag atc agc tat tac ttt tcc ggc agt gat 432 Leu Phe Val Ser Val Leu Pro Phe Lys Ile Ser Tyr Tyr Phe Ser Gly Ser Asp 130 135 140 tgg cag ttt ggg tct gaa ttg tgt cgc ttc gtc act gca gca ttt tac tgt aac 486 Trp Gln Phe Gly Ser Glu Leu Cys Arg Phe Val Thr Ala Ala Phe Tyr Cys Asn 145 150 155 160 atg tac gcc tct atc ttg ctc atg aca gtc ata agc att gac cgg ttt ctg gct 540 Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Met Thr Val Ile Ser Ile Asp Arg Phe Leu Ala 165 170 175 180 gtg gtg tat ccc atg cag tcc ctc tcc tgg cgt act ctg gga agg gct tcc ttc 594 Val Val Tyr Pro Met Gln Ser Leu Ser Trp Arg Thr Leu Gly Arg Ala Ser Phe 185 190 195 act tgt ctg gcc atc tgg gct ttg gcc atc gca ggg gta gtg cct ctg ctc ctc 648 Thr Cys Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ala Ile Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu 200 205 210 215 aag gag caa acc atc cag gtg ccc ggg ctc aac atc act acc tgt cat gat gtg 702 Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val 220 225 230 ctc aat gaa acc ctg ctc gaa ggc tac tat gcc tac tac ttc tca gcc ttc tct 756 Leu Asn Glu Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Phe Ser Ala Phe Ser 235 240 245 250 gct gtc ttc ttt ttt gtg ccg ctg atc att tcc acg gtc tgt tat gtg tct atc 810 Ala Val Phe Phe Phe Val Pro Leu Ile Ile Ser Thr Val Cys Tyr Val Ser Ile 255 260 265 270 att cga tgt ctt agc tct tcc gca gtt gcc aac cgc agc aag aag tcc cgg gct 864 Ile Arg Cys Leu Ser Ser Ser Ala Val Ala Asn Arg Ser Lys Lys Ser Arg Ala 275 280 285 ttg ttc ctg tca gct gct gtt ttc tgc atc ttc atc att tgc ttc gga ccc aca 918 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Val Phe Cys Ile Phe Ile Ile Cys Phe Gly Pro Thr 290 295 300 305 aac gtc ctc ctg att gcg cat tac tca ttc ctt tct cac act tcc acc aca gag 972 Asn Val Leu Leu Ile Ala His Tyr Ser Phe Leu Ser His Thr Ser Thr Thr Glu 310 315 320 gct gcc tac ttt gcc tac ctc ctc tgt gtc tgt gtc agc agc ata agc tgc tgc 1026 Ala Ala Tyr Phe Ala Tyr Leu Leu Cys Val Cys Val Ser Ser Ile Ser Cys Cys 325 330 335 340 atc gac ccc cta att tac tat tac gct tcc tct gag tgc cag agg tac gtc tac 1080 Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Cys Gln Arg Tyr Val Tyr 345 350 355 360 agt atc tta tgc tgc aaa gaa agt tcc gat ccc agc agt tat aac agc agt ggg 1134 Ser Ile Leu Cys Cys Lys Glu Ser Ser Asp Pro Ser Ser Tyr Asn Ser Ser Gly 365 370 375 cag ttg atg gca agt aaa atg gat acc tgc tct agt aac ctg aat aac agc ata 1188 Gln Leu Met Ala Ser Lys Met Asp Thr Cys Ser Ser Asn Leu Asn Asn Ser Ile 380 385 390 395 tac aaa aag ctg tta act tag 1209 Tyr Lys Lys Leu Leu Thr 400 <210> 2 <211> 1116 <212> DNA <213> ヒト <400> 2 atg ggg ccg cgg cgg ctg ctg ctg gtg gcc gcc tgc ttc agt ctg tgc ggc ccg 54 Met Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro 1 5 10 15 ctg ttg tct gcc cgc acc cgg gcc caa aaa caa ctt cct gca ttc atc tca gaa 108 Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu 20 25 30 35 gat gcc tcc gga tat ttg acc agc tcc tgg ctg aca ctc ttt gtc cca tct gtg 162 Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu Phe Val Pro Ser Val 40 45 50 tac acc gga gtg ttt gta gtc agc ctc cca cta aac atc atg gcc atc gtt gtg 216 Tyr Thr Gly Val Phe Val Val Ser Leu Pro Leu Asn Ile Met Ala Ile Val Val 55 60 65 70 ttc atc ctg aaa atg aag gtc aag aag ccg gcg gtg gtg tac atg ctg cac ctg 270 Phe Ile Leu Lys Met Lys Val Lys Lys Pro Ala Val Val Tyr Met Leu His Leu 75 80 85 90 gcc acg gca gat gtg ctg ttt gtg tct gtg ctc ccc ttt aag atc agc tat tac 324 Ala Thr Ala Asp Val Leu Phe Val Ser Val Leu Pro Phe Lys Ile Ser Tyr Tyr 95 100 105 ttt tcc ggc agt gat tgg cag ttt ggg tct gaa ttg tgt cgc ttc gtc act gca 378 Phe Ser Gly Ser Asp Trp Gln Phe Gly Ser Glu Leu Cys Arg Phe Val Thr Ala 110 115 120 125 gca ttt tac tgt aac atg tac gcc tct atc ttg ctc atg aca gtc ata agc att 432 Ala Phe Tyr Cys Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Met Thr Val Ile Ser Ile 130 135 140 gac cgg ttt ctg gct gtg gtg tat ccc atg cag tcc ctc tcc tgg cgt act ctg 486 Asp Arg Phe Leu Ala Val Val Tyr Pro Met Gln Ser Leu Ser Trp Arg Thr Leu 145 150 155 160 gga agg gct tcc ttc act tgt ctg gcc atc tgg gct ttg gcc atc gca ggg gta 540 Gly Arg Ala Ser Phe Thr Cys Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ala Ile Ala Gly Val 165 170 175 180 gtg cct ctg ctc ctc aag gag caa acc atc cag gtg ccc ggg ctc aac atc act 594 Val Pro Leu Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr 185 190 195 acc tgt cat gat gtg ctc aat gaa acc ctg ctc gaa ggc tac tat gcc tac tac 648 Thr Cys His Asp Val Leu Asn Glu Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Tyr Tyr 200 205 210 215 ttc tca gcc ttc tct gct gtc ttc ttt ttt gtg ccg ctg atc att tcc acg gtc 702 Phe Ser Ala Phe Ser Ala Val Phe Phe Phe Val Pro Leu Ile Ile Ser Thr Val 220 225 230 tgt tat gtg tct atc att cga tgt ctt agc tct tcc gca gtt gcc aac cgc agc 756 Cys Tyr Val Ser Ile Ile Arg Cys Leu Ser Ser Ser Ala Val Ala Asn Arg Ser 235 240 245 250 aag aag tcc cgg gct ttg ttc ctg tca gct gct gtt ttc tgc atc ttc atc att 810 Lys Lys Ser Arg Ala Leu Phe Leu Ser Ala Ala Val Phe Cys Ile Phe Ile Ile 255 260 265 270 tgc ttc gga ccc aca aac gtc ctc ctg att gcg cat tac tca ttc ctt tct cac 864 Cys Phe Gly Pro Thr Asn Val Leu Leu Ile Ala His Tyr Ser Phe Leu Ser His 275 280 285 act tcc acc aca gag gct gcc tac ttt gcc tac ctc ctc tgt gtc tgt gtc agc 918 Thr Ser Thr Thr Glu Ala Ala Tyr Phe Ala Tyr Leu Leu Cys Val Cys Val Ser 290 295 300 305 agc ata agc tgc tgc atc gac ccc cta att tac tat tac gct tcc tct gag tgc 972 Ser Ile Ser Cys Cys Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Cys 310 315 320 cag agg tac gtc tac agt atc tta tgc tgc aaa gaa agt tcc gat ccc agc agt 1026 Gln Arg Tyr Val Tyr Ser Ile Leu Cys Cys Lys Glu Ser Ser Asp Pro Ser Ser 325 330 335 340 tat aac agc agt ggg cag ttg atg gca agt aaa atg gat acc tgc tct agt aac 1080 Tyr Asn Ser Ser Gly Gln Leu Met Ala Ser Lys Met Asp Thr Cys Ser Ser Asn 345 350 355 360 ctg aat aac agc ata tac aaa aag ctg tta act tag 1116 Leu Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Leu Thr 365 370 <210> 3 <211> 1278 <212> DNA <213> ヒト <400> 3 atg ggg ccg cgg cgg ctg ctg ctg gtg gcc gcc tgc ttc agt ctg tgc ggc ccg 54 Met Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro 1 5 10 15 ctg ttg tct gcc cgc acc cgg gcc cgc agg cca gaa tca aaa gca aca aat gcc 108 Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala 20 25 30 35 acc tta gat ccc cgg tca ttt ctt ctc agg aac ccc aat gat aaa tat gaa cca 162 Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro 40 45 50 ttt tgg gag gat gag gag aaa aat gaa agt ggg tta act gaa tac aga tta gtc 216 Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val 55 60 65 70 tcc atc aat aaa agc agt cct ctt caa aaa caa ctt cct gca ttc atc tca gaa 270 Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu 75 80 85 90 gat gcc tcc gga tat ttg acc agc tcc tgg ctg aca ctc ttt gtc cca tct gtg 324 Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu Phe Val Pro Ser Val 95 100 105 tac acc gga gtg ttt gta gtc agc ctc cca cta aac atc atg gcc atc gtt gtg 378 Tyr Thr Gly Val Phe Val Val Ser Leu Pro Leu Asn Ile Met Ala Ile Val Val 110 115 120 125 ttc atc ctg aaa atg aag gtc aag aag ccg gcg gtg gtg tac atg ctg cac ctg 432 Phe Ile Leu Lys Met Lys Val Lys Lys Pro Ala Val Val Tyr Met Leu His Leu 130 135 140 gcc acg gca gat gtg ctg ttt gtg tct gtg ctc ccc ttt aag atc agc tat tac 486 Ala Thr Ala Asp Val Leu Phe Val Ser Val Leu Pro Phe Lys Ile Ser Tyr Tyr 145 150 155 160 ttt tcc ggc agt gat tgg cag ttt ggg tct gaa ttg tgt cgc ttc gtc act gca 540 Phe Ser Gly Ser Asp Trp Gln Phe Gly Ser Glu Leu Cys Arg Phe Val Thr Ala 165 170 175 180 gca ttt tac tgt aac atg tac gcc tct atc ttg ctc atg aca gtc ata agc att 594 Ala Phe Tyr Cys Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Met Thr Val Ile Ser Ile 185 190 195 gac cgg ttt ctg gct gtg gtg tat ccc atg cag tcc ctc tcc tgg cgt act ctg 648 Asp Arg Phe Leu Ala Val Val Tyr Pro Met Gln Ser Leu Ser Trp Arg Thr Leu 200 205 210 215 gga agg gct tcc ttc act tgt ctg gcc atc tgg gct ttg gcc atc gca ggg gta 702 Gly Arg Ala Ser Phe Thr Cys Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ala Ile Ala Gly Val 220 225 230 gtg cct ctg ctc ctc aag gag caa acc atc cag gtg ccc ggg ctc aac atc act 756 Val Pro Leu Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr 235 240 245 250 acc tgt cat gat gtg ctc aat gaa acc ctg ctc gaa ggc tac tat gcc tac tac 810 Thr Cys His Asp Val Leu Asn Glu Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Tyr Tyr 255 260 265 270 ttc tca gcc ttc tct gct gtc ttc ttt ttt gtg ccg ctg atc att tcc acg gtc 864 Phe Ser Ala Phe Ser Ala Val Phe Phe Phe Val Pro Leu Ile Ile Ser Thr Val 275 280 285 tgt tat gtg tct atc att cga tgt ctt agc tct tcc gca gtt gcc aac cgc agc 918 Cys Tyr Val Ser Ile Ile Arg Cys Leu Ser Ser Ser Ala Val Ala Asn Arg Ser 290 295 300 305 aag aag tcc cgg gct ttg ttc ctg tca gct gct gtt ttc tgc atc ttc atc att 972 Lys Lys Ser Arg Ala Leu Phe Leu Ser Ala Ala Val Phe Cys Ile Phe Ile Ile 310 315 320 tgc ttc gga ccc aca aac gtc ctc ctg att gcg cat tac tca ttc ctt tct cac 1026 Cys Phe Gly Pro Thr Asn Val Leu Leu Ile Ala His Tyr Ser Phe Leu Ser His 325 330 335 340 act tcc acc aca gag gct gcc tac ttt gcc tac ctc ctc tgt gtc tgt gtc agc 1080 Thr Ser Thr Thr Glu Ala Ala Tyr Phe Ala Tyr Leu Leu Cys Val Cys Val Ser 345 350 355 360 agc ata agc tgc tgc atc gac ccc cta att tac tat tac gct tcc tct gag tgc 1134 Ser Ile Ser Cys Cys Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Cys 365 370 375 cag agg tac gtc tac agt atc tta tgc tgc aaa gaa agt tcc gat ccc agc agt 1188 Gln Arg Tyr Val Tyr Ser Ile Leu Cys Cys Lys Glu Ser Ser Asp Pro Ser Ser 380 385 390 395 tat aac agc agt ggg cag ttg atg gca agt aaa atg gat acc tgc tct agt aac 1242 Tyr Asn Ser Ser Gly Gln Leu Met Ala Ser Lys Met Asp Thr Cys Ser Ser Asn 400 405 410 ctg aat aac agc ata tac aaa aag ctg tta act tag 1278 Leu Asn Asn Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Leu Thr 415 420 425 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aaggatccat ggggccgcgg cggctgct 28 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tgggaattcc taagttaaca gcttttt 27 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ccatgatgtt tagtggga 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 agagtacgcc aggagag 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tggcaactgc ggaagagc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 tgctgggatc ggaacttt 18 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tcacacagga aacagctatg ac 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tttactgttt tcgtaacagt tttg 24 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 catttatatc ggcccgggtg cgggcagaca 30 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cacccgggcc gataaatatg aaccattttg gg 32 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ggccgcacat catcatcacc atcacgg 27 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Met Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 17 Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Pro Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 19 Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Arg Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 21 Leu Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 22 Leu Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 23 Leu Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 24 Val Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 25 Ala Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 26 Ala Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 27 Cys Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 28 Phe Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 29 Ser Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 30 Leu Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 31 Cys Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 32 Gly Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 33 Pro Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 34 Leu Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Leu Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 36 Ser Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 37 Ala Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 38 Arg Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala Thr 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 39 Thr Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala Thr Leu 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Arg Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala Thr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 41 Ala Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala Thr Leu Asp Pro 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 42 Arg Arg Pro Glu Ser Lys Ala Thr Asn Ala Thr Leu Asp Pro Arg 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 43 Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 44 Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 45 Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 46 Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 47 Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 48 Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 49 Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 50 Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 51 Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 52 Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 53 Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 54 Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 55 Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 56 Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 57 Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 58 Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 59 Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 60 Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 61 Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 62 Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 63 Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 64 Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 65 Glu Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 66 Ser Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 67 Gly Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 68 Leu Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 69 Thr Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 70 Glu Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 71 Tyr Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 72 Arg Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 73 Leu Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 74 Val Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 75 Ser Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 76 Ile Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 77 Asn Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 78 Lys Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 79 Ser Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 80 Ser Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 81 Pro Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 82 Leu Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 83 Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 84 Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 85 Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 86 Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 87 Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 88 Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 89 Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 90 Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 91 Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 92 Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 93 Ile Ser Tyr Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Trp Gln Phe Gly Ser Glu 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 94 Ser Tyr Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Trp Gln Phe Gly Ser Glu Leu 1 5 10 15 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 95 Val Pro Leu Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu 1 5 10 15 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 96 Pro Leu Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn 1 5 10 15 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 97 Leu Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 98 Leu Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr 1 5 10 15 <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 99 Leu Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr 1 5 10 15 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 100 Lys Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 101 Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His 1 5 10 15 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 102 Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 103 Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val 1 5 10 15 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 104 Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val Leu 1 5 10 15 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 105 Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val Leu Asn 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 106 Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val Leu Asn Glu 1 5 10 15 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 107 Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val Leu Asn Glu Thr 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 108 Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp Val Leu Asn Glu Thr Leu 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 109 Thr Asn Val Leu Leu Ile Ala His Tyr Ser Phe Leu Ser His Thr 1 5 10 15 <210> 110 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 110 Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Thr 20 <210> 111 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 111 Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe 1 5 10 15 Asn Ile Phe 20 <210> 112 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 112 Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Thr 20 <210> 113 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 113 Asn Pro Asn Asp Ala Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Thr 20 <210> 114 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 114 Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Ala Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Thr 20 <210> 115 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 115 Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Ala Glu Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Thr 20

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/705 35/04 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者恒川典之東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者小林慎治東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者江口広志東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者小池行也東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (72)発明者鷲見芳彦東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 BA63 CA04 DA02 DA06 EA02 EA03 GA11 GA18 HA01 4B064 AG20 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 CE06 CE09 DA01 4C084 AA02 AA07 BA08 BA22 CA18 DC35 NA14 ZA012 ZA452 ZB152 ZC422 4H045 AA11 CA42 DA76 DA86 EA22 FA74 GA10 GA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トロンビンによる細胞増殖を抑制しうる
ポリペプチドまたは化合物。
【請求項２】ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの
構造のうち細胞増殖に関与する特定の領域に結合するポ
リペプチドまたは化合物。
【請求項３】ペプチド配列Ｘ₁−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ₂
−Ｔｒｐ−Ｘ₃に結合する請求項１または請求項２に記
載のポリペプチドまたは化合物。ここでＸ₁は任意のア
ミノ酸またはペプチド配列、Ｘ₂は任意のアミノ酸、Ｘ₃
は任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。
【請求項４】ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの
アミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列
（Ｘ₄）−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
（Ｘ₅）に結合するポリペプチドまたは化合物。ここで
Ｘ₄およびＸ₅は任意のアミノ酸またはペプチド配列を表
す。
【請求項５】単鎖型Ｆｖまたはその断片である請求項
１から請求項４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】抗体またはその断片である請求項１から
請求項４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】トロンビンレセプターを介した細胞増殖
に関わるシグナル伝達系を阻害する請求項１から請求項
６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】請求項１から請求項７のいずれかに記載
のポリペプチドを取得するために用いられる改変型ＰＡ
Ｒ１型トロンビンレセプター遺伝子またはその断片。
【請求項９】配列番号３で示される、ヒトＰＡＲ１型
トロンビンレセプター蛋白質。
【請求項１０】請求項９に記載の蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片。