JP2000106882A - 癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片産生酵素および当該酵素により断片化された血漿蛋白断片 - Google Patents
癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片産生酵素および当該酵素により断片化された血漿蛋白断片Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 プラスミノーゲン及びフィブロネクチンなど
の血漿蛋白を分解し、癌転移増殖巣の増殖を抑制する蛋
白断片を産する酵素、当該断片化蛋白質及び当該断片の
調製方法を供する。 【構成】 １.Ｎ末端のアミノ酸残基がＬＶＲＩＰＬＨ
ＫＦＴで始まり非還元系ＳＤＳ電気泳動で分子量約４５
ｋＤａ付近に認められる蛋白であり、プラスミノーゲン
分子種で代表される血漿蛋白を分解し癌転移増殖抑制作
用を有する血漿蛋白断片を調製することのできるカテプ
シンD前駆体と高い相同性を示すアスパラギン酸酵素。
２.当該酵素で分解し調製された癌転移増殖抑制効果を
有する血漿蛋白断片。３.上記当該酵素で血漿蛋白を分
解し、癌転移増殖抑制効果を有する蛋白断片を調製する
方法。４.当該酵素または断片化血漿蛋白を主要構成成
分とする抗癌転移増殖治療薬。 【効果】 本願発明の血漿蛋白断片化酵素または当該血
漿蛋白断片化酵素によって調製される血漿蛋白断片を主
成分とする癌転移増殖抑制剤は、肺癌、大腸癌に代表さ
れる固形癌等の臨床治療に利用され得る。
の血漿蛋白を分解し、癌転移増殖巣の増殖を抑制する蛋
白断片を産する酵素、当該断片化蛋白質及び当該断片の
調製方法を供する。 【構成】 １.Ｎ末端のアミノ酸残基がＬＶＲＩＰＬＨ
ＫＦＴで始まり非還元系ＳＤＳ電気泳動で分子量約４５
ｋＤａ付近に認められる蛋白であり、プラスミノーゲン
分子種で代表される血漿蛋白を分解し癌転移増殖抑制作
用を有する血漿蛋白断片を調製することのできるカテプ
シンD前駆体と高い相同性を示すアスパラギン酸酵素。
２.当該酵素で分解し調製された癌転移増殖抑制効果を
有する血漿蛋白断片。３.上記当該酵素で血漿蛋白を分
解し、癌転移増殖抑制効果を有する蛋白断片を調製する
方法。４.当該酵素または断片化血漿蛋白を主要構成成
分とする抗癌転移増殖治療薬。 【効果】 本願発明の血漿蛋白断片化酵素または当該血
漿蛋白断片化酵素によって調製される血漿蛋白断片を主
成分とする癌転移増殖抑制剤は、肺癌、大腸癌に代表さ
れる固形癌等の臨床治療に利用され得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、生化学的に活性な酵
素、該酵素によって産生される生物活性を有する血漿蛋
白断片、該血漿蛋白断片の調製方法及びそれらを用いた
癌治療法の一形態に関する。詳細には、プラスミノーゲ
ンあるいはフィブロネクチン分子種等の血漿蛋白質を分
解し癌転移増殖抑制作用を有する断片を産する酵素、当
該酵素を用いて得られる癌転移増殖抑制作用を有する血
漿蛋白質断片、及び当該血漿蛋白質断片の調製法に関す
る。従って本願発明は、前記酵素及び当該酵素によって
断片化される血漿蛋白質断片に生化学あるいは医学的意
義が存する分野、例えば癌の治療薬、予防薬の分野にお
いて広く利用される。
素、該酵素によって産生される生物活性を有する血漿蛋
白断片、該血漿蛋白断片の調製方法及びそれらを用いた
癌治療法の一形態に関する。詳細には、プラスミノーゲ
ンあるいはフィブロネクチン分子種等の血漿蛋白質を分
解し癌転移増殖抑制作用を有する断片を産する酵素、当
該酵素を用いて得られる癌転移増殖抑制作用を有する血
漿蛋白質断片、及び当該血漿蛋白質断片の調製法に関す
る。従って本願発明は、前記酵素及び当該酵素によって
断片化される血漿蛋白質断片に生化学あるいは医学的意
義が存する分野、例えば癌の治療薬、予防薬の分野にお
いて広く利用される。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】現在の
癌に対する外科的治療技術はめざましいものがあり、原
発巣の術的切除治療に関してはほぼ完成された域に達し
たと評価され得る。しかし、臨床上の術後の癌の再発、
転移増殖といった課題に対してはまだ解決すべき問題は
多く、特に遠隔転移増殖は癌患者を死に至らせる最大の
原因となっている。癌の転移増殖とは、原発巣から癌細
胞が離脱し血管系を経て他の部位で癌が増殖することで
ある。血管系で拡散された癌細胞が広範囲に増殖する状
況では、いかに進歩した術的治療であってもこれを完全
に取り除くことは不可能に近い。そのため、抗癌剤に代
表される化学療法がこの予防、治療に用いられている。
しかしこの場合も、化学物質に対する薬剤耐性の問題が
避けられず、有効性の発現のための投与量の増大、それ
に伴う副作用の増大と問題は大きい。多くの技術がこれ
ら諸問題の解決に費やされている一方で、癌細胞が血管
系に進入することを抑制しようとする研究も現在活発に
展開されている。癌浸潤抑制、血管新生阻害の研究がそ
れである。
癌に対する外科的治療技術はめざましいものがあり、原
発巣の術的切除治療に関してはほぼ完成された域に達し
たと評価され得る。しかし、臨床上の術後の癌の再発、
転移増殖といった課題に対してはまだ解決すべき問題は
多く、特に遠隔転移増殖は癌患者を死に至らせる最大の
原因となっている。癌の転移増殖とは、原発巣から癌細
胞が離脱し血管系を経て他の部位で癌が増殖することで
ある。血管系で拡散された癌細胞が広範囲に増殖する状
況では、いかに進歩した術的治療であってもこれを完全
に取り除くことは不可能に近い。そのため、抗癌剤に代
表される化学療法がこの予防、治療に用いられている。
しかしこの場合も、化学物質に対する薬剤耐性の問題が
避けられず、有効性の発現のための投与量の増大、それ
に伴う副作用の増大と問題は大きい。多くの技術がこれ
ら諸問題の解決に費やされている一方で、癌細胞が血管
系に進入することを抑制しようとする研究も現在活発に
展開されている。癌浸潤抑制、血管新生阻害の研究がそ
れである。
【０００３】癌細胞が血管系へ進入する経路は大きく２
つに分けられるが、そのうち一つは癌細胞が血管側へ移
行する経路、他方は血管を癌局部に導き入れる経路であ
る。前者は癌の浸潤と呼ばれており、後者は血管新生と
呼ばれる。癌浸潤とは、転移増殖能力を獲得した癌細胞
が原発巣（腫瘍）から離脱し、癌細胞と血管とを遮る間
質というバリアーを分解し、さらにその間隙に浸潤して
血管系に入りこむ現象である(Ｍｉｇｎａｔｔｉ Ｐ,ｅ
ｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖｏｌ.１０８,ｐ.
６７１−６８２,(１９８９)）。
つに分けられるが、そのうち一つは癌細胞が血管側へ移
行する経路、他方は血管を癌局部に導き入れる経路であ
る。前者は癌の浸潤と呼ばれており、後者は血管新生と
呼ばれる。癌浸潤とは、転移増殖能力を獲得した癌細胞
が原発巣（腫瘍）から離脱し、癌細胞と血管とを遮る間
質というバリアーを分解し、さらにその間隙に浸潤して
血管系に入りこむ現象である(Ｍｉｇｎａｔｔｉ Ｐ,ｅ
ｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖｏｌ.１０８,ｐ.
６７１−６８２,(１９８９)）。
【０００４】一方、血管新生とは、既存血管から新たな
血管が生じる現象であり、この血管（新生血管）を通し
て癌は血流中へ移行する。血管新生は健常状態の成人個
体では、女性の性周期あるいは創傷治癒時以外には認め
られず、主に、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ、乾せん
といった病的状態で生じる(Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ., Ａｄ
ｖ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ｖｏｌ.４３, ｐ.１７５−
２０３,(１９８５)；Ｚｅｔｔｅｒ Ｂ.Ｒ., Ｃｈｅｓ
ｔ, ｖｏｌ.９３(Ｓｕｐｐｌ.), ｐ.１５９Ｓ−１６６
Ｓ,(１９９８)；Ｐａｔｚ Ａ., Ｉｎｖｅｓｔ. Ｏｐｈ
ｔｈａｌｍｏｌ.Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ., ｖｏｌ.１９,
ｐ.１１３３−１１３８(１９８０)；Ａｍｏｒｅ Ｄ, ｅ
ｔ ａｌ., Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｐｈｙｓｉｏｌ., ｖｏｌ.
４９,ｐ.４５３−４６４,(１９８７))。癌細胞（腫瘍）
は、自らの増殖に必要な酸素や栄養分を供給するために
新しい血管を既存血管から導き入れるが、この血管（新
生血管）は癌細胞の血管系への移行をより容易なものと
している。これら血管新生は癌細胞によって刺激を受け
た血管内腔に敷き詰められた血管内皮細胞の異化による
ものであるが、これらが癌細胞に到達し新しい血管を形
成するまでには、癌の浸潤過程と同様に基底膜の消化、
血管内皮細胞の遊走、増殖、管腔形成といった多段階的
な行程を経る。癌細胞が血管系へ進入する経路を阻害し
転移増殖を抑制するという研究とは、換言すれば、以上
示したいずれかの行程を阻害することである。このうち
のどの行程に焦点を当てるかについては議論があるとこ
ろであるが、癌浸潤と血管新生に共有する間質の分解消
化という過程は最も注目されるものである。
血管が生じる現象であり、この血管（新生血管）を通し
て癌は血流中へ移行する。血管新生は健常状態の成人個
体では、女性の性周期あるいは創傷治癒時以外には認め
られず、主に、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ、乾せん
といった病的状態で生じる(Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ., Ａｄ
ｖ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., ｖｏｌ.４３, ｐ.１７５−
２０３,(１９８５)；Ｚｅｔｔｅｒ Ｂ.Ｒ., Ｃｈｅｓ
ｔ, ｖｏｌ.９３(Ｓｕｐｐｌ.), ｐ.１５９Ｓ−１６６
Ｓ,(１９９８)；Ｐａｔｚ Ａ., Ｉｎｖｅｓｔ. Ｏｐｈ
ｔｈａｌｍｏｌ.Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ., ｖｏｌ.１９,
ｐ.１１３３−１１３８(１９８０)；Ａｍｏｒｅ Ｄ, ｅ
ｔ ａｌ., Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｐｈｙｓｉｏｌ., ｖｏｌ.
４９,ｐ.４５３−４６４,(１９８７))。癌細胞（腫瘍）
は、自らの増殖に必要な酸素や栄養分を供給するために
新しい血管を既存血管から導き入れるが、この血管（新
生血管）は癌細胞の血管系への移行をより容易なものと
している。これら血管新生は癌細胞によって刺激を受け
た血管内腔に敷き詰められた血管内皮細胞の異化による
ものであるが、これらが癌細胞に到達し新しい血管を形
成するまでには、癌の浸潤過程と同様に基底膜の消化、
血管内皮細胞の遊走、増殖、管腔形成といった多段階的
な行程を経る。癌細胞が血管系へ進入する経路を阻害し
転移増殖を抑制するという研究とは、換言すれば、以上
示したいずれかの行程を阻害することである。このうち
のどの行程に焦点を当てるかについては議論があるとこ
ろであるが、癌浸潤と血管新生に共有する間質の分解消
化という過程は最も注目されるものである。
【０００５】間質の分解阻害 癌細胞と血管内皮細胞との間には、タイプＩＶコラーゲ
ンよりなる基底膜とコラーゲン類よりなる細胞外マトリ
ックスが細胞浸潤のバリアーとして存在している。その
ため、癌細胞が血流中に進入するためには、あるいは血
管内皮細胞が癌細胞に到達するためにはこのバリアーを
消化、分解しなければならない(Ｓｔｅｔｌｅｒ-Ｓｔｅ
ｖｅｎｓｏｎ Ｗ.Ｇ.,ｅｔ ａｌ.,Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｃ
ｅｌｌＢｉｏｌ.ｖｏｌ.９，ｐ.５４１−５７３,(１９
９３))。これら分解酵素がマトリックス分解酵素と呼ば
れる一群の酵素であり、コラゲナーゼ等がこれらに該当
する(Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ＪＦ．Ｊｒ．，ＦＡＳＥＢ
Ｊ.,ｖｏｌ.５,ｐ.２１４５−２１５４,(１９９１))。
一般に癌部位ではこのマトリックス分解酵素が過剰発現
しており、かつ活性化に関わるセリンプロテアーゼの過
剰発現が認められる。さらに、癌部位では、活性阻害物
質であるＴＩＭＰ(Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ)の発現低
下が認められるため、酵素と阻害剤の関係に不均衡が生
じ、癌細胞に転移増殖の環境を提供することが報告され
ている(Ｒａｋ Ｊ., ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ.,ｖｏｌ.５５,ｐ.４５７５−４５８０,(１９９
５))。そのため、この不均衡を是正するため、例えば、
癌細胞にＴＩＭＰ-Ｉ遺伝子を導入したりマトリックス
分解酵素を阻害する薬剤を投与する試みがなされてお
り、このうち例えばゼラチナーゼの阻害剤であるＢＢ-
９４が実験的な転移増殖を抑制し、かつ血管新生を抑制
することによって癌の増殖を抑制したとの良好な報告も
多くなされている(Ｄａｖｉｓ,Ｂ.,ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ.,ｖｏｌ.５３,ｐ.２０８７−２０９１,
(１９９３)；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ, Ｈ.Ｓ.，Proceeding
s of the ICS 2nd. International conference on prot
ease inhibitors, International business communicat
ions,(１９９７)）。
ンよりなる基底膜とコラーゲン類よりなる細胞外マトリ
ックスが細胞浸潤のバリアーとして存在している。その
ため、癌細胞が血流中に進入するためには、あるいは血
管内皮細胞が癌細胞に到達するためにはこのバリアーを
消化、分解しなければならない(Ｓｔｅｔｌｅｒ-Ｓｔｅ
ｖｅｎｓｏｎ Ｗ.Ｇ.,ｅｔ ａｌ.,Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｃ
ｅｌｌＢｉｏｌ.ｖｏｌ.９，ｐ.５４１−５７３,(１９
９３))。これら分解酵素がマトリックス分解酵素と呼ば
れる一群の酵素であり、コラゲナーゼ等がこれらに該当
する(Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ＪＦ．Ｊｒ．，ＦＡＳＥＢ
Ｊ.,ｖｏｌ.５,ｐ.２１４５−２１５４,(１９９１))。
一般に癌部位ではこのマトリックス分解酵素が過剰発現
しており、かつ活性化に関わるセリンプロテアーゼの過
剰発現が認められる。さらに、癌部位では、活性阻害物
質であるＴＩＭＰ(Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅａｓｅ)の発現低
下が認められるため、酵素と阻害剤の関係に不均衡が生
じ、癌細胞に転移増殖の環境を提供することが報告され
ている(Ｒａｋ Ｊ., ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ.,ｖｏｌ.５５,ｐ.４５７５−４５８０,(１９９
５))。そのため、この不均衡を是正するため、例えば、
癌細胞にＴＩＭＰ-Ｉ遺伝子を導入したりマトリックス
分解酵素を阻害する薬剤を投与する試みがなされてお
り、このうち例えばゼラチナーゼの阻害剤であるＢＢ-
９４が実験的な転移増殖を抑制し、かつ血管新生を抑制
することによって癌の増殖を抑制したとの良好な報告も
多くなされている(Ｄａｖｉｓ,Ｂ.,ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ.,ｖｏｌ.５３,ｐ.２０８７−２０９１,
(１９９３)；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ, Ｈ.Ｓ.，Proceeding
s of the ICS 2nd. International conference on prot
ease inhibitors, International business communicat
ions,(１９９７)）。
【０００６】プラスミンと癌の関係 マトリックス分解酵素は一般に酵素前駆体の形態で細胞
外に放出されており(Ｃｈｅｎ, Ｗ.Ｔ., Ｃｕｒｒ. Ｏ
ｐｉｎ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖｏｌ.４, ｐ.８０２−
８０９,(１９９２))、活性化に関わる当該酵素を阻害す
ることによって間質の分解を阻害するという試みがあ
る。マトリックス分解酵素はセリンプロテアーゼによる
限定分解によって初めて活性化される性質をもつため、
このセリンプロテアーゼを阻害することがそれに当た
る。マトリックス分解酵素を活性化するセリンプロテア
ーゼとしてはプラスミン、ウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベーター（以下、ｕ−ＰＡ）、組織型プラス
ミノーゲンアクチベータ（以下、ｔ−ＰＡ）、及びトリ
プシンなどがあり、特に血液線溶系の酵素であるプラス
ミンは癌細胞及び血管内皮細胞で活性化される共通の酵
素である点で注目される。つまり、プラスミンとはその
前駆体であるプラスミノーゲンがｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ等
のプラスミノーゲンアクチベーターによって切断を受け
活性化されたものであるが、癌細胞はｕ−ＰＡ産生能力
を、血管内皮細胞はｔ−ＰＡ産生能力を有しており、癌
状態ではともに高レベルで発現されているとの報告があ
る。
外に放出されており(Ｃｈｅｎ, Ｗ.Ｔ., Ｃｕｒｒ. Ｏ
ｐｉｎ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖｏｌ.４, ｐ.８０２−
８０９,(１９９２))、活性化に関わる当該酵素を阻害す
ることによって間質の分解を阻害するという試みがあ
る。マトリックス分解酵素はセリンプロテアーゼによる
限定分解によって初めて活性化される性質をもつため、
このセリンプロテアーゼを阻害することがそれに当た
る。マトリックス分解酵素を活性化するセリンプロテア
ーゼとしてはプラスミン、ウロキナーゼ型プラスミノー
ゲンアクチベーター（以下、ｕ−ＰＡ）、組織型プラス
ミノーゲンアクチベータ（以下、ｔ−ＰＡ）、及びトリ
プシンなどがあり、特に血液線溶系の酵素であるプラス
ミンは癌細胞及び血管内皮細胞で活性化される共通の酵
素である点で注目される。つまり、プラスミンとはその
前駆体であるプラスミノーゲンがｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ等
のプラスミノーゲンアクチベーターによって切断を受け
活性化されたものであるが、癌細胞はｕ−ＰＡ産生能力
を、血管内皮細胞はｔ−ＰＡ産生能力を有しており、癌
状態ではともに高レベルで発現されているとの報告があ
る。
【０００７】また、プラスミンには上述のマトリックス
分解酵素を活性化させる以外に、例えば血管新生に関与
する因子であるＴＧＦ−βの活性化作用や自ら細胞外の
マトリックスを分解する能力を持っている(Ｗｅｒｂ
Ｚ., ｅｔ ａｌ.,Ｎ Ｅｎｇｌ.Ｊ．Ｍｅｄ.,ｖｏｌ.２
９６,p.１０１７,(１９７７)；Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｇ., ｅ
ｔ ａｌ.,Ｊ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.,ｖｏｌ.６,p.１２７
５−１２８３,(１９９１))。さらに、プラスミンはフィ
ブリン膜で癌を取り囲みその分散を抑制しようとする宿
主側の防御機構を破る能力を有していると考えられてい
る。以上の結果を考慮すれば、プラスミンの発現は癌存
在部位においては浸潤を促す方向に傾いていると推察さ
れる。実際、プラスミンの阻害剤が実験動物の癌転移増
殖を抑制したとする知見も報告され、このことを裏付け
ている(Ｏｈｔａ Ｔ., ｅｔ ａｌ., Ｇａｎｎ ｔｏ ｒ
ｉｎｓｈｏｕ， ｖｏｌ.２３,ｐ.１６６９−１６７２,
(１９９６)；Ｏｈｋｏｓｈｉ Ｍ，Ｇａｎｎ ｔｏ ｋａ
ｇａｋｕｒｙｏｕｈｏｕ， ｖｏｌ.２２, ｐ.４１７−
４３０,(１９９５))。
分解酵素を活性化させる以外に、例えば血管新生に関与
する因子であるＴＧＦ−βの活性化作用や自ら細胞外の
マトリックスを分解する能力を持っている(Ｗｅｒｂ
Ｚ., ｅｔ ａｌ.,Ｎ Ｅｎｇｌ.Ｊ．Ｍｅｄ.,ｖｏｌ.２
９６,p.１０１７,(１９７７)；Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｇ., ｅ
ｔ ａｌ.,Ｊ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.,ｖｏｌ.６,p.１２７
５−１２８３,(１９９１))。さらに、プラスミンはフィ
ブリン膜で癌を取り囲みその分散を抑制しようとする宿
主側の防御機構を破る能力を有していると考えられてい
る。以上の結果を考慮すれば、プラスミンの発現は癌存
在部位においては浸潤を促す方向に傾いていると推察さ
れる。実際、プラスミンの阻害剤が実験動物の癌転移増
殖を抑制したとする知見も報告され、このことを裏付け
ている(Ｏｈｔａ Ｔ., ｅｔ ａｌ., Ｇａｎｎ ｔｏ ｒ
ｉｎｓｈｏｕ， ｖｏｌ.２３,ｐ.１６６９−１６７２,
(１９９６)；Ｏｈｋｏｓｈｉ Ｍ，Ｇａｎｎ ｔｏ ｋａ
ｇａｋｕｒｙｏｕｈｏｕ， ｖｏｌ.２２, ｐ.４１７−
４３０,(１９９５))。
【０００８】プラスミンの癌転移増殖抑制作用 一方、プラスミノーゲンまたはプラスミンを断片化した
物質に癌の増殖あるいは浸潤を抑制する作用があること
が報告されている。すなわち、血管新生阻害物質(アン
ジオスタチン)に関する報告がそれである(Ｏ'Ｒｅｉｌ
ｌｙ Ｍ.Ｓ., ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ.７９,ｐ.
３１５-３２８,(１９９４))。アンジオスタチンはプラ
スミノーゲンの内部断片からなる血管新生阻害物質であ
り、微量で血管新生及び癌転移増殖巣増殖を強力に阻害
する作用を有しており、さらに、驚くべきことに副作
用、薬剤耐性もなく量依存的に癌（原発巣）を退縮させ
る能力を持つ(Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ Ｍ.Ｓ., ｅｔ ａｌ.,
Ｎａｔ. Ｍｅｄ.,ｖｏｌ.２,ｐ.６８９−６９２,(１９
９６))。アンジオスタチンに関してはＯ'Ｒｅｉｌｌｙ
等の詳細な実験によって血管新生及び癌抑制の関係が示
されている。しかし、それらに対するアンジオスタチン
の作用機作、およびその産生に関しては未だ不明な点が
多い。
物質に癌の増殖あるいは浸潤を抑制する作用があること
が報告されている。すなわち、血管新生阻害物質(アン
ジオスタチン)に関する報告がそれである(Ｏ'Ｒｅｉｌ
ｌｙ Ｍ.Ｓ., ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ.７９,ｐ.
３１５-３２８,(１９９４))。アンジオスタチンはプラ
スミノーゲンの内部断片からなる血管新生阻害物質であ
り、微量で血管新生及び癌転移増殖巣増殖を強力に阻害
する作用を有しており、さらに、驚くべきことに副作
用、薬剤耐性もなく量依存的に癌（原発巣）を退縮させ
る能力を持つ(Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ Ｍ.Ｓ., ｅｔ ａｌ.,
Ｎａｔ. Ｍｅｄ.,ｖｏｌ.２,ｐ.６８９−６９２,(１９
９６))。アンジオスタチンに関してはＯ'Ｒｅｉｌｌｙ
等の詳細な実験によって血管新生及び癌抑制の関係が示
されている。しかし、それらに対するアンジオスタチン
の作用機作、およびその産生に関しては未だ不明な点が
多い。
【０００９】前述の知見は、プラスミンの産生は癌転移
増殖を導きプラスミノーゲンまたはプラスミンの断片化
はそれを抑制するという仮説を示唆するものである。癌
状態ではこれらのバランスが崩れ癌転移増殖の方向に向
いているとすれば、これを断片化方向へ転換することに
よって癌転移増殖を抑制することができる。つまり、プ
ラスミンノーゲンまたはプラスミンを切断し、かつ上述
のアンジオスタチン様分子を産生する酵素が癌の進展に
対する生体側の防御機構として備わっているはずであ
る。本願発明者は上述の仮説の真偽を証明するべく、プ
ラスミノーゲンまたはプラスミンを断片化しアンジオス
タチン様分子を産生する酵素の探索を行った。
増殖を導きプラスミノーゲンまたはプラスミンの断片化
はそれを抑制するという仮説を示唆するものである。癌
状態ではこれらのバランスが崩れ癌転移増殖の方向に向
いているとすれば、これを断片化方向へ転換することに
よって癌転移増殖を抑制することができる。つまり、プ
ラスミンノーゲンまたはプラスミンを切断し、かつ上述
のアンジオスタチン様分子を産生する酵素が癌の進展に
対する生体側の防御機構として備わっているはずであ
る。本願発明者は上述の仮説の真偽を証明するべく、プ
ラスミノーゲンまたはプラスミンを断片化しアンジオス
タチン様分子を産生する酵素の探索を行った。
【００１０】
【課題を解決するための手段、発明の構成】上述の課題
を解決する目的で鋭意検討の結果、本願発明者は、前立
腺癌細胞株であるＰＣ−３培養液中にｐＨが低い環境で
のみプラスミノーゲンを断片化する新しい酵素活性を見
出した。本酵素によって産生されるプラスミノーゲン断
片はプラスミノーゲンクリングル１〜４を含む断片であ
り、また、本酵素はプラスミンの活性中心付近を切断す
ることによりその活性を失わせることも明らかになっ
た。前記活性は癌細胞で多く発現されており、癌に対す
る特異性が示唆された。各種のクロマトグラフィーに基
づいて精製した結果、本酵素は分子量約４５ｋＤａの酵
素であり、Ｎ末端アミノ酸配列はＬＶＲＩＰＬＨＫＦＴ
から始まり、このＮ末端配列はヒトカテプシンＤ前駆体
(Human Cathepsin D Precurser)に高い相同性を示すこ
とが判明した。また、阻害剤を用いた検討によりアスパ
ラギン酸酵素に分類されることが判明した。本願発明者
等は得られた本酵素を低ｐＨで活性発現することに因
み、ＰＡＣＥ４(Plasminogen Angiostatin Converting
Enzyme of pH４)と命名した。
を解決する目的で鋭意検討の結果、本願発明者は、前立
腺癌細胞株であるＰＣ−３培養液中にｐＨが低い環境で
のみプラスミノーゲンを断片化する新しい酵素活性を見
出した。本酵素によって産生されるプラスミノーゲン断
片はプラスミノーゲンクリングル１〜４を含む断片であ
り、また、本酵素はプラスミンの活性中心付近を切断す
ることによりその活性を失わせることも明らかになっ
た。前記活性は癌細胞で多く発現されており、癌に対す
る特異性が示唆された。各種のクロマトグラフィーに基
づいて精製した結果、本酵素は分子量約４５ｋＤａの酵
素であり、Ｎ末端アミノ酸配列はＬＶＲＩＰＬＨＫＦＴ
から始まり、このＮ末端配列はヒトカテプシンＤ前駆体
(Human Cathepsin D Precurser)に高い相同性を示すこ
とが判明した。また、阻害剤を用いた検討によりアスパ
ラギン酸酵素に分類されることが判明した。本願発明者
等は得られた本酵素を低ｐＨで活性発現することに因
み、ＰＡＣＥ４(Plasminogen Angiostatin Converting
Enzyme of pH４)と命名した。
【００１１】さらに、ＰＣ−３培養上清から精製した本
酵素をプラスミノーゲンに作用させて得られたプラスミ
ノーゲン断片を、ルイス肺癌を移植したマウスモデルに
投与した結果、当該断片に癌細胞の転移増殖抑制作用が
あることが確認された。また、多くの血漿成分を本酵素
で切断し、得られる断片をその血管新生阻害作用に着目
してスクリーニングを実施した結果、前述のプラスミノ
ーゲン以外にも、細胞接着に関与する成分であるフィブ
ロネクチン、ビトロネクチンあるいはヒト肝細胞増殖因
子(ＨＧＦ)等の血漿蛋白が本酵素によって断片化され、
当該断片化血漿蛋白が強い血管新生抑制作用を示すこと
が見出された。
酵素をプラスミノーゲンに作用させて得られたプラスミ
ノーゲン断片を、ルイス肺癌を移植したマウスモデルに
投与した結果、当該断片に癌細胞の転移増殖抑制作用が
あることが確認された。また、多くの血漿成分を本酵素
で切断し、得られる断片をその血管新生阻害作用に着目
してスクリーニングを実施した結果、前述のプラスミノ
ーゲン以外にも、細胞接着に関与する成分であるフィブ
ロネクチン、ビトロネクチンあるいはヒト肝細胞増殖因
子(ＨＧＦ)等の血漿蛋白が本酵素によって断片化され、
当該断片化血漿蛋白が強い血管新生抑制作用を示すこと
が見出された。
【００１２】当該酵素活性の発見 アンジオスタチン様分子を産生し且つプラスミンの活性
を失わせる酵素を探索するための優先的方策は、先ず、
アンジオスタチンの産生酵素を見出すことである。既報
によれば、アンジオスタチンはルイス肺癌の亜種である
３ＬＬ−ＬＭを移植されたマウスの血漿、尿中に見出さ
れており、当該マウスの体内にはアンジオスタチンを産
生する酵素が存在する筈である。O'Ｒｅｉｌｌｙ等は、
悪性腫瘍摘出後希に認められる遠隔転移増殖巣の急速な
増殖に着目して３ＬＬ−ＬＭ細胞を用いたモデルを作製
し、その血漿、尿中に強力な血管新生阻害因子を見出
し、アンジオスタチンの発見に至った。癌状態では原発
巣（癌）に由来する因子が血流内を循環し遠隔転移増殖
巣の増殖を抑制しているというものである。また、アン
ジオスタチンに限って言及すれば、癌細胞はプラスミノ
ーゲンを産生しないことから癌細胞に由来する酵素が血
中のプラスミノーゲンを切断し、アンジオスタチンを産
生させている、と推察することができる。
を失わせる酵素を探索するための優先的方策は、先ず、
アンジオスタチンの産生酵素を見出すことである。既報
によれば、アンジオスタチンはルイス肺癌の亜種である
３ＬＬ−ＬＭを移植されたマウスの血漿、尿中に見出さ
れており、当該マウスの体内にはアンジオスタチンを産
生する酵素が存在する筈である。O'Ｒｅｉｌｌｙ等は、
悪性腫瘍摘出後希に認められる遠隔転移増殖巣の急速な
増殖に着目して３ＬＬ−ＬＭ細胞を用いたモデルを作製
し、その血漿、尿中に強力な血管新生阻害因子を見出
し、アンジオスタチンの発見に至った。癌状態では原発
巣（癌）に由来する因子が血流内を循環し遠隔転移増殖
巣の増殖を抑制しているというものである。また、アン
ジオスタチンに限って言及すれば、癌細胞はプラスミノ
ーゲンを産生しないことから癌細胞に由来する酵素が血
中のプラスミノーゲンを切断し、アンジオスタチンを産
生させている、と推察することができる。
【００１３】アンジオスタチンを産生する酵素について
は各研究施設から種々の候補が報告されている。Ｇａｔ
ｅｌｙ等は、近年、ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ−３細胞)の
細胞培養上清中にアンジオスタチンを断片化する活性が
あることを報告し、この活性をもたらす酵素をＰＡＣＥ
(Plasminogen Angiostatin Converting Enzyme)と命名
した(Ｇａｔｅｌｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ., ｖｏｌ.５６,ｐ.４８８７−４８９０,(１９９
６))。ＰＣ−３細胞は、癌の原発巣の摘出が逆に遠隔転
移増殖巣の増殖を促進させる特質を持つヒト型の細胞で
あり(Ｓｏｆｆ Ｇ.Ａ., ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎ
ｖｅｓｔ., ｖｏｌ.９６,ｐ.２５９３−２６００,(１９
９５))、この癌細胞が産生するヒトアンジオスタチン及
びアンジオスタチン産生酵素(ＰＡＣＥ)は注目されるも
のである。また、彼らはプラスミノーゲンとＰＣ−３培
養上清とを反応させることによって得られるプラスミノ
ーゲン断片を調製し、この断片がO'Ｒｅｉｌｌｙ等の報
告したアンジオスタチンと同等の血管新生阻害効果を有
することをｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの系で示し
た。また、癌環境に認められるマクロファージの浸潤に
着目し、マクロファージに由来する酵素（マトリックス
メタロエラスターゼ）がアンジオスタチンを産生させる
酵素であることを明らかにしたＤｏｎｇ等の報告(Ｄｏ
ｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ,ｖｏｌ.８８,ｐ.８０１
−８１０,(１９９７))、及びＭＭＰのスクリーニングの
中でその活性が認められたＢｒａｉｎ等のＭＭＰ-７、
ＭＭＰ-９に関する報告もある(Ｂｒａｉｎ Ｃ ｅｔ ａ
ｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２７２,ｐ.２８８
２３−２８８２５,(１９９７))。
は各研究施設から種々の候補が報告されている。Ｇａｔ
ｅｌｙ等は、近年、ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ−３細胞)の
細胞培養上清中にアンジオスタチンを断片化する活性が
あることを報告し、この活性をもたらす酵素をＰＡＣＥ
(Plasminogen Angiostatin Converting Enzyme)と命名
した(Ｇａｔｅｌｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ., ｖｏｌ.５６,ｐ.４８８７−４８９０,(１９９
６))。ＰＣ−３細胞は、癌の原発巣の摘出が逆に遠隔転
移増殖巣の増殖を促進させる特質を持つヒト型の細胞で
あり(Ｓｏｆｆ Ｇ.Ａ., ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎ
ｖｅｓｔ., ｖｏｌ.９６,ｐ.２５９３−２６００,(１９
９５))、この癌細胞が産生するヒトアンジオスタチン及
びアンジオスタチン産生酵素(ＰＡＣＥ)は注目されるも
のである。また、彼らはプラスミノーゲンとＰＣ−３培
養上清とを反応させることによって得られるプラスミノ
ーゲン断片を調製し、この断片がO'Ｒｅｉｌｌｙ等の報
告したアンジオスタチンと同等の血管新生阻害効果を有
することをｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの系で示し
た。また、癌環境に認められるマクロファージの浸潤に
着目し、マクロファージに由来する酵素（マトリックス
メタロエラスターゼ）がアンジオスタチンを産生させる
酵素であることを明らかにしたＤｏｎｇ等の報告(Ｄｏ
ｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ,ｖｏｌ.８８,ｐ.８０１
−８１０,(１９９７))、及びＭＭＰのスクリーニングの
中でその活性が認められたＢｒａｉｎ等のＭＭＰ-７、
ＭＭＰ-９に関する報告もある(Ｂｒａｉｎ Ｃ ｅｔ ａ
ｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２７２,ｐ.２８８
２３−２８８２５,(１９９７))。
【００１４】しかし、当時、Ｇａｔｅｌｙ等のＰＡＣＥ
はその活性のみの評価であり、その活性の本態である酵
素については単離・確認されていない状況であった。従
って、本願発明者等は当初ＰＡＣＥを単離・精製するこ
とを目的としてＧａｔｅｌｙ等の実験を追試した。確か
に、Ｇａｔｅｌｙ等の方法によって調製したＰＣ−３培
養上清をプラスミノーゲンに反応させた場合、アンジオ
スタチンに相当する５０ｋＤａに分布するプラスミノー
ゲンの断片化物がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認できた。し
かし、この切断様式は特異性に乏しく、少なくともＰＡ
ＣＥがプラスミノーゲンを特異的に切断しているとは断
言できないものであった。
はその活性のみの評価であり、その活性の本態である酵
素については単離・確認されていない状況であった。従
って、本願発明者等は当初ＰＡＣＥを単離・精製するこ
とを目的としてＧａｔｅｌｙ等の実験を追試した。確か
に、Ｇａｔｅｌｙ等の方法によって調製したＰＣ−３培
養上清をプラスミノーゲンに反応させた場合、アンジオ
スタチンに相当する５０ｋＤａに分布するプラスミノー
ゲンの断片化物がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認できた。し
かし、この切断様式は特異性に乏しく、少なくともＰＡ
ＣＥがプラスミノーゲンを特異的に切断しているとは断
言できないものであった。
【００１５】本願発明者等は独自のスクリーニング系を
構築し、所望の当該酵素の単離・精製を試みた。鋭意検
討の結果、幸いにも、ＰＣ−３培養上清中には中性域で
プラスミノーゲンを断片化する酵素の他に、低いｐＨの
条件下でプラスミノーゲンの限定部位を特異的に切断し
得る、Ｇａｔｅｌｙ等のＰＡＣＥとは全く異なる従来報
告されていない酵素活性を見出すことに成功した。この
酵素の切断様式は図１に示すように、ＰＡＣＥの非特異
的な切断とは異なり、プラスミノーゲンの限定部位を特
異的に切断するものであった。本願発明者等は以前より
癌状態における低ｐＨに着目しており、エラスターゼで
切断したある種のプラスミノーゲン断片が低ｐＨ環境部
位に集積する可能性について報告した(第５６回日本癌
学会総会抄録、ｐ.４２６、１９９７年)。また、この低
ｐＨで作用する酵素が癌状態と関係する知見を、各種癌
細胞及び正常細胞を用いた酵素活性の検討によって見出
しており、この酵素が癌状態でのみ大量に産生されるこ
とを予備的な検討によって察知していた。前述のよう
に、本願発明者のスクリーニングの目的は、「プラスミ
ンを切断し、そのプラスミン活性を消失させ得るアンジ
オスタチン様分子を産生する酵素が癌の進展に対する生
体側の防御機構として備わっている筈」との仮説を証明
することである。この低ｐＨ条件でのみ作用する酵素こ
そが前記仮説における「酵素」である可能性が高く、本
願発明者等は新たに当該酵素の単離精製を開始した。な
お、Ｇａｔｅｌｙ等は最近、前述のＰＡＣＥの本態を単
離することに成功し、これらがプラスミンと遊離のシス
テインドナーに起因する結果であることを報告した(Ｇ
ａｔｅｌｙ Ｓ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃ
ａｄ.Ｓｃｉ.,ｖｏｌ.９４,ｐ.１０６８−１０８７,(１
９９７))。
構築し、所望の当該酵素の単離・精製を試みた。鋭意検
討の結果、幸いにも、ＰＣ−３培養上清中には中性域で
プラスミノーゲンを断片化する酵素の他に、低いｐＨの
条件下でプラスミノーゲンの限定部位を特異的に切断し
得る、Ｇａｔｅｌｙ等のＰＡＣＥとは全く異なる従来報
告されていない酵素活性を見出すことに成功した。この
酵素の切断様式は図１に示すように、ＰＡＣＥの非特異
的な切断とは異なり、プラスミノーゲンの限定部位を特
異的に切断するものであった。本願発明者等は以前より
癌状態における低ｐＨに着目しており、エラスターゼで
切断したある種のプラスミノーゲン断片が低ｐＨ環境部
位に集積する可能性について報告した(第５６回日本癌
学会総会抄録、ｐ.４２６、１９９７年)。また、この低
ｐＨで作用する酵素が癌状態と関係する知見を、各種癌
細胞及び正常細胞を用いた酵素活性の検討によって見出
しており、この酵素が癌状態でのみ大量に産生されるこ
とを予備的な検討によって察知していた。前述のよう
に、本願発明者のスクリーニングの目的は、「プラスミ
ンを切断し、そのプラスミン活性を消失させ得るアンジ
オスタチン様分子を産生する酵素が癌の進展に対する生
体側の防御機構として備わっている筈」との仮説を証明
することである。この低ｐＨ条件でのみ作用する酵素こ
そが前記仮説における「酵素」である可能性が高く、本
願発明者等は新たに当該酵素の単離精製を開始した。な
お、Ｇａｔｅｌｙ等は最近、前述のＰＡＣＥの本態を単
離することに成功し、これらがプラスミンと遊離のシス
テインドナーに起因する結果であることを報告した(Ｇ
ａｔｅｌｙ Ｓ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃ
ａｄ.Ｓｃｉ.,ｖｏｌ.９４,ｐ.１０６８−１０８７,(１
９９７))。
【００１６】本願発明の酵素の探索 本願発明の酵素の最大の特徴は、プラスミノーゲン及び
フィブロネクチン等の血漿蛋白質の限定部位を特異的に
切断する能力である。本願発明者は先ず当該酵素の癌細
胞との関係を明らかにする目的で当該酵素の探索及びそ
の単離に着手した。
フィブロネクチン等の血漿蛋白質の限定部位を特異的に
切断する能力である。本願発明者は先ず当該酵素の癌細
胞との関係を明らかにする目的で当該酵素の探索及びそ
の単離に着手した。
【００１７】本願発明者等は、先ず、プラスミノーゲン
の断片化率をより高感度に検出するスクリーニング系を
構築し、当該スクリーニング系を用い各種のクロマトグ
ラフィーの組み合わせによって目的の酵素が精製できる
ことを明らかにした。本願発明のプラスミノーゲン断片
化酵素のスクリーニング系の概念図を図２に示した。本
方法はサンドイッチＥＬＩＳＡを応用したものであり、
固相化抗体としてプラスミノーゲンリジン結合部Ｉ(Pla
sminogen Lysine Binding Site I 、以下LBS I)に対す
る特異抗体を用い、標識抗体としてミニプラスミノーゲ
ン(Mini Plasminogen、以下mPlg.)に対する特異抗体を
使用することを特徴とするものである。既知量のプラス
ミノーゲンに目的の酵素が接触するとプラスミノーゲン
は断片化され標識抗体が認識する部分が消失することに
よってＥＬＩＳＡの発色値が低下する。この発色の低下
をもって酵素活性を評価する方法である。
の断片化率をより高感度に検出するスクリーニング系を
構築し、当該スクリーニング系を用い各種のクロマトグ
ラフィーの組み合わせによって目的の酵素が精製できる
ことを明らかにした。本願発明のプラスミノーゲン断片
化酵素のスクリーニング系の概念図を図２に示した。本
方法はサンドイッチＥＬＩＳＡを応用したものであり、
固相化抗体としてプラスミノーゲンリジン結合部Ｉ(Pla
sminogen Lysine Binding Site I 、以下LBS I)に対す
る特異抗体を用い、標識抗体としてミニプラスミノーゲ
ン(Mini Plasminogen、以下mPlg.)に対する特異抗体を
使用することを特徴とするものである。既知量のプラス
ミノーゲンに目的の酵素が接触するとプラスミノーゲン
は断片化され標識抗体が認識する部分が消失することに
よってＥＬＩＳＡの発色値が低下する。この発色の低下
をもって酵素活性を評価する方法である。
【００１８】本願発明の酵素の調製 目的の酵素の調製は、ＰＣ−３培養上清を出発原料とし
陽イオン交換体、ヘパリンクロマトグラフィー、陰イオ
ン交換体、ゲル濾過、ハイドロキシアパタイトからなる
一連のクロマトグラフィー操作によって達成された。最
初の陽イオン交換体による処理は、主に夾雑する一本鎖
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（sing
lechain urokinase-type plasminogen activator; scu
−ＰＡ)を除去する目的で行い、ヘパリンクロマトグラ
フィーはセリンプロテアーゼ群の除去に用いた。scu−
ＰＡはプラスミノーゲンアクチベーターの前駆体であり
プラスミンの存在によって活性化され活性型のｕ−ＰＡ
となり、ｕ−ＰＡは中性域でプラスミノーゲンを断片化
するため、所望の酵素の精製に際しては初期に除く必要
がある。本願発明の酵素は疎水クロマトグラフィーによ
り良好な分離を認める。図３に典型的な疎水クロマトグ
ラフィーのクロマトグラムを示した。白丸は吸光度を、
黒丸は酵素活性そして波線はイオン強度を示す。図のよ
うに疎水性の異なる２種類の酵素活性がＰＣ−３培養上
清中に認められる。このうち、疎水性の高い部分(クロ
マトグラムの後半)の酵素活性にプラスミノーゲンを特
異的に切断し、クリングル１〜４を含むプラスミノーゲ
ン断片を産生する酵素活性が認められた。なお、疎水性
の低い部分(クロマトグラムの前半)の酵素活性はプラス
ミノーゲンを非特異的に断片化するものであり、単離精
製した結果、カテプシンＥ(cathepsin E)と相同性が高
い蛋白であることが見出された。
陽イオン交換体、ヘパリンクロマトグラフィー、陰イオ
ン交換体、ゲル濾過、ハイドロキシアパタイトからなる
一連のクロマトグラフィー操作によって達成された。最
初の陽イオン交換体による処理は、主に夾雑する一本鎖
ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（sing
lechain urokinase-type plasminogen activator; scu
−ＰＡ)を除去する目的で行い、ヘパリンクロマトグラ
フィーはセリンプロテアーゼ群の除去に用いた。scu−
ＰＡはプラスミノーゲンアクチベーターの前駆体であり
プラスミンの存在によって活性化され活性型のｕ−ＰＡ
となり、ｕ−ＰＡは中性域でプラスミノーゲンを断片化
するため、所望の酵素の精製に際しては初期に除く必要
がある。本願発明の酵素は疎水クロマトグラフィーによ
り良好な分離を認める。図３に典型的な疎水クロマトグ
ラフィーのクロマトグラムを示した。白丸は吸光度を、
黒丸は酵素活性そして波線はイオン強度を示す。図のよ
うに疎水性の異なる２種類の酵素活性がＰＣ−３培養上
清中に認められる。このうち、疎水性の高い部分(クロ
マトグラムの後半)の酵素活性にプラスミノーゲンを特
異的に切断し、クリングル１〜４を含むプラスミノーゲ
ン断片を産生する酵素活性が認められた。なお、疎水性
の低い部分(クロマトグラムの前半)の酵素活性はプラス
ミノーゲンを非特異的に断片化するものであり、単離精
製した結果、カテプシンＥ(cathepsin E)と相同性が高
い蛋白であることが見出された。
【００１９】本願発明の酵素の分子量をゲル濾過クロマ
トグラフィーで分離検討した結果、約５０から６０ｋＤ
ａ付近で活性が回収される。本願発明の酵素のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる解析結果を図４に示した。図のように分
子量４５ｋＤａに相当する位置に活性を示すバンドが認
められた。なお、事項で記述するように本願発明の酵素
がアスパラギン酸酵素であることが判明したことから、
本願発明の酵素は最終的にペプスタチンをリガンドとし
たアフィニティークロマトグラフィーで精製した。本願
発明の酵素の調製に関しては、上述のＰＣ−３培養上清
からの調製の他、遺伝子組換え技術により当該酵素産生
細胞を構築し、これより産生される当該酵素を調製する
方法、即ち、当該酵素をコードする遺伝子を好適なベク
ター等を用いて原核細胞、真核細胞、ほ乳動物細胞また
は昆虫細胞等適当な宿主に導入し、これより調製する方
法も現実的な調製手段として充分に考慮され得る。
トグラフィーで分離検討した結果、約５０から６０ｋＤ
ａ付近で活性が回収される。本願発明の酵素のＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる解析結果を図４に示した。図のように分
子量４５ｋＤａに相当する位置に活性を示すバンドが認
められた。なお、事項で記述するように本願発明の酵素
がアスパラギン酸酵素であることが判明したことから、
本願発明の酵素は最終的にペプスタチンをリガンドとし
たアフィニティークロマトグラフィーで精製した。本願
発明の酵素の調製に関しては、上述のＰＣ−３培養上清
からの調製の他、遺伝子組換え技術により当該酵素産生
細胞を構築し、これより産生される当該酵素を調製する
方法、即ち、当該酵素をコードする遺伝子を好適なベク
ター等を用いて原核細胞、真核細胞、ほ乳動物細胞また
は昆虫細胞等適当な宿主に導入し、これより調製する方
法も現実的な調製手段として充分に考慮され得る。
【００２０】本願発明の酵素の性状 本願発明の酵素の阻害様式を図５にまとめた。各種イン
ヒビターの濃度はアプロチニン(０.３μＭ)、ベンツア
ミジン(１０ｍＭ)、エラスチナル(１００μＭ)、ペプス
タチンA(1μＭ)、ＥＤＴＡ(１０ｍＭ)である。図に示さ
れるように本酵素活性はアスパラギン酸酵素の特異的阻
害剤であるペプスタチンAによって完全に阻害された。
また、図６は反応時のｐＨを中性域、酸性域に調整した
際のプラスミノーゲンの断片化を示したものであるが、
図のように本願発明の酵素は酸性域でのみプラスミノー
ゲンを断片化する。図中矢印Ａ(→Ａ)はＧａｔｅｌｙ等
が示したＰＣ−３由来のアンジオスタチンを、矢印Ｂ
(→Ｂ)はＰＡＣＥ４によって産生されたプラスミノーゲ
ンクリングル１〜４を含む断片に相当する。図７には本
願発明の酵素によるプラスミノーゲンの切断部を示し
た。プラスミノーゲンはＡ(プラスミノーゲンクリング
ル１〜４部分)、Ｂ(ミニプラスミノーゲン部)及びＣ(ミ
ニプラスミノーゲン断片化部分)に切断され、各画分の
Ｎ末端アミノ酸を解析した結果、ＡはＦ−７４、ＢはＰ
−４５２そしてＣはＡ−７００であった。本願発明の酵
素はプラスミノーゲンのＮ末端から４５１番目のロイシ
ンと４５２番目のプロリン間(以下、４５１Ｌ−Ｐと表
記する)を切断し、かつＮ末端７３番目のロイシンと７
４番目のフェニルアラニン間(以下、７３Ｌ−Ｆと表記
する)を切断することによってプラスミノーゲンのクリ
ングル１〜４部を含む断片を遊離する。なお、生体中に
循環するプラスミノーゲンはそのＮ末端がＧｌｕで始ま
る完全型であるが、そのうち数％が一部断片化を受けて
いる。この断片化された分子種はＮ末端が７８Ｌｙｓで
始まりＬｙｓプラスミノーゲンと呼ばれる。本願発明の
酵素は完全型のプラスミノーゲンのほかにも、Ｌｙｓプ
ラスミノーゲンを良好な基質として断片化するため、遊
離されるクリングルのなかにはそのＮ末端アミノ酸残基
が７８Ｌｙｓ、８０Ｖａｌである場合もある。
ヒビターの濃度はアプロチニン(０.３μＭ)、ベンツア
ミジン(１０ｍＭ)、エラスチナル(１００μＭ)、ペプス
タチンA(1μＭ)、ＥＤＴＡ(１０ｍＭ)である。図に示さ
れるように本酵素活性はアスパラギン酸酵素の特異的阻
害剤であるペプスタチンAによって完全に阻害された。
また、図６は反応時のｐＨを中性域、酸性域に調整した
際のプラスミノーゲンの断片化を示したものであるが、
図のように本願発明の酵素は酸性域でのみプラスミノー
ゲンを断片化する。図中矢印Ａ(→Ａ)はＧａｔｅｌｙ等
が示したＰＣ−３由来のアンジオスタチンを、矢印Ｂ
(→Ｂ)はＰＡＣＥ４によって産生されたプラスミノーゲ
ンクリングル１〜４を含む断片に相当する。図７には本
願発明の酵素によるプラスミノーゲンの切断部を示し
た。プラスミノーゲンはＡ(プラスミノーゲンクリング
ル１〜４部分)、Ｂ(ミニプラスミノーゲン部)及びＣ(ミ
ニプラスミノーゲン断片化部分)に切断され、各画分の
Ｎ末端アミノ酸を解析した結果、ＡはＦ−７４、ＢはＰ
−４５２そしてＣはＡ−７００であった。本願発明の酵
素はプラスミノーゲンのＮ末端から４５１番目のロイシ
ンと４５２番目のプロリン間(以下、４５１Ｌ−Ｐと表
記する)を切断し、かつＮ末端７３番目のロイシンと７
４番目のフェニルアラニン間(以下、７３Ｌ−Ｆと表記
する)を切断することによってプラスミノーゲンのクリ
ングル１〜４部を含む断片を遊離する。なお、生体中に
循環するプラスミノーゲンはそのＮ末端がＧｌｕで始ま
る完全型であるが、そのうち数％が一部断片化を受けて
いる。この断片化された分子種はＮ末端が７８Ｌｙｓで
始まりＬｙｓプラスミノーゲンと呼ばれる。本願発明の
酵素は完全型のプラスミノーゲンのほかにも、Ｌｙｓプ
ラスミノーゲンを良好な基質として断片化するため、遊
離されるクリングルのなかにはそのＮ末端アミノ酸残基
が７８Ｌｙｓ、８０Ｖａｌである場合もある。
【００２１】さらに、本願発明の酵素はクリングル１〜
４部を含有するアンジオスタチンを産生するとともに、
プラスミンの活性中心付近(６９９番目フェニルアラニ
ン−７００番目アラニン間)を切断し、プラスミンの活
性を消失させることができる。この切断様式は癌の進展
を有効に抑制する上で極めて興味深い点である。即ち、
癌の増殖を抑制するアンジオスタチンはプラスミノーゲ
ンの断片化によって生ずると考えられるが、同時に産生
される残りのプラスミン活性中心部分(プラスミンセリ
ンプロテアーゼドメイン)が癌の進展を助長する可能性
があるからである。また、前述したように、プラスミン
活性は血管新生及び癌の浸潤を亢進するが、このクリン
グル部を除くことはその進展をさらに悪化させる可能性
がある。なぜなら、クリングル部が失われることによっ
て生体内に存在するプラスミン阻害蛋白質の作用が減弱
してしまうからである。すなわち、プラスミンの阻害蛋
白質であるアルファ２プラスミンインヒビター（以下、
α2−ＰＩ）の作用抑制がこれにあたる。血漿中のプラ
スミンは血流を巡回するα2−ＰＩによって即座に不活
化されるが、この過程において、クリングル部はプラス
ミンとα2−ＰＩとの結合において重要である。この部
分の欠落はα2−ＰＩの作用を半減させるため、阻害を
受けない活性型のプラスミン断片が拡散によって癌周辺
のマトリックスの分解酵素に作用し、癌の進展・転移増
殖を促進する可能性があるからである。 本願発明の酵
素は、プラスミノーゲンのクリングル１〜４部分を産生
するとともに、残存するプラスミン活性を消失させる点
が他に報告されているアンジオスタチン産生酵素とは異
なるところであり、本願発明の酵素が例えば生体保護の
役割を果たしているとすれば、最も有力視される酵素候
補である。図８に本願発明の酵素によるプラスミノーゲ
ンの経時的な切断と残存プラスミン活性との関係を示し
た。ＡはプラスミノーゲンをＰＡＣＥ４で断片化した際
のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｂは同被検試料のプラスミン活
性を測定したものである。図で示されるように切断とと
もにプラスミン活性が失われるのが理解される。上述の
結果は、本願発明の酵素が生体に有利に作用することを
示唆するものであり、この点に着目すれば、本願発明の
酵素が作用する基質蛋白質はプラスミノーゲンに限らな
いことが予想される。本願発明者等は、この可能性も同
様に明らかにするため、事項以下に示す血漿蛋白質につ
いても同様に断片化を実施し、本願発明の酵素でプラス
ミノーゲンと同等あるいはそれ以上の活性を有する断片
を調製することに成功した。
４部を含有するアンジオスタチンを産生するとともに、
プラスミンの活性中心付近(６９９番目フェニルアラニ
ン−７００番目アラニン間)を切断し、プラスミンの活
性を消失させることができる。この切断様式は癌の進展
を有効に抑制する上で極めて興味深い点である。即ち、
癌の増殖を抑制するアンジオスタチンはプラスミノーゲ
ンの断片化によって生ずると考えられるが、同時に産生
される残りのプラスミン活性中心部分(プラスミンセリ
ンプロテアーゼドメイン)が癌の進展を助長する可能性
があるからである。また、前述したように、プラスミン
活性は血管新生及び癌の浸潤を亢進するが、このクリン
グル部を除くことはその進展をさらに悪化させる可能性
がある。なぜなら、クリングル部が失われることによっ
て生体内に存在するプラスミン阻害蛋白質の作用が減弱
してしまうからである。すなわち、プラスミンの阻害蛋
白質であるアルファ２プラスミンインヒビター（以下、
α2−ＰＩ）の作用抑制がこれにあたる。血漿中のプラ
スミンは血流を巡回するα2−ＰＩによって即座に不活
化されるが、この過程において、クリングル部はプラス
ミンとα2−ＰＩとの結合において重要である。この部
分の欠落はα2−ＰＩの作用を半減させるため、阻害を
受けない活性型のプラスミン断片が拡散によって癌周辺
のマトリックスの分解酵素に作用し、癌の進展・転移増
殖を促進する可能性があるからである。 本願発明の酵
素は、プラスミノーゲンのクリングル１〜４部分を産生
するとともに、残存するプラスミン活性を消失させる点
が他に報告されているアンジオスタチン産生酵素とは異
なるところであり、本願発明の酵素が例えば生体保護の
役割を果たしているとすれば、最も有力視される酵素候
補である。図８に本願発明の酵素によるプラスミノーゲ
ンの経時的な切断と残存プラスミン活性との関係を示し
た。ＡはプラスミノーゲンをＰＡＣＥ４で断片化した際
のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｂは同被検試料のプラスミン活
性を測定したものである。図で示されるように切断とと
もにプラスミン活性が失われるのが理解される。上述の
結果は、本願発明の酵素が生体に有利に作用することを
示唆するものであり、この点に着目すれば、本願発明の
酵素が作用する基質蛋白質はプラスミノーゲンに限らな
いことが予想される。本願発明者等は、この可能性も同
様に明らかにするため、事項以下に示す血漿蛋白質につ
いても同様に断片化を実施し、本願発明の酵素でプラス
ミノーゲンと同等あるいはそれ以上の活性を有する断片
を調製することに成功した。
【００２２】本願発明の酵素の同定 精製された酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動
を行った後、ＧＶＤＦ膜にトランスブロットした。トラ
ンスブロット後の膜はアミドブラックで染色後、それぞ
れ４５ｋＤａに相当するバンド部分を切り出し、アミノ
酸配列分析装置でN末端からの配列を解読した。その結
果、４５ｋＤａに相当するバンドの配列はＬＶＲＩＰＬ
ＨＫＦＴであった。得られたアミノ酸配列を既存のアミ
ノ酸データバンクで照合した結果、当該酵素のＮ末端ア
ミノ酸残基はヒトカテプシンD前駆体に相同することが
判明した。また、イムノブロットの手法を用いて精製し
た酵素を抗ヒトカテプシンD抗体で反応させた結果、当
該酵素はこの抗体に反応したことから、本酵素がヒトカ
テプシンD前駆体に高い相同性を示すことが推察され
た。カテプシンDは、全アミノ酸を有するカテプシンD前
駆体の状態で産生され、リソゾーム中で他の酵素によっ
て切断を受け、活性型のカテプシンDに変換される。ヒ
ト乳癌に代表される悪性腫瘍がカテプシンD前駆体を細
胞外へ放出することは数多く報告されているが、仮に本
願発明の酵素がカテプシンＤ前駆体であったとしても、
カテプシンD前駆体が前駆体の形態でプラスミノーゲン
を切断することについては全く新しい知見であり興味あ
る点である。ＰＡＣＥ４調製の出発材料として用いたＰ
Ｃ−３細胞から調製したｍＲＮＡを基に合成したｃＤＮ
Ａを用い、カテプシンDのｃＤＮＡ配列より全長の翻訳
領域を増幅するためのセンスとアンチセンスプライマー
を合成し、ＡｍｐｌｉＴａｑ(ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ
社)を用いて増幅後、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ(Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｎｇｅｎ社)を使用し増幅したｃＤＮＡ断片
をプラスミドベクターにクローニングした。得られた遺
伝子断片の塩基配列を決定した結果、既知のカテプシン
Dの塩基配列と同一であることが確認できた。しかし、
ＰＡＣＥ４をカテプシンD前駆体と同定した場合、非活
性型である前駆体がなぜ例えばプラスミノーゲンを切断
できるのか、あるいは元来細胞内酵素であるカテプシン
がなぜ細胞外に放出されるのか、という疑問が生じる。
本願発明の酵素が真にカテプシンD前駆体と同一である
か否かという点については全アミノ酸配列、構造が明ら
かにされることが必要である。しかし、現時点において
カテプシンD前駆体、活性型カテプシンD共に本願発明の
酵素活性を有するものであり、いずれもＰＡＣＥ４の範
疇に入る。また、同様に欠失、置換または化学修飾され
たカテプシンD誘導体も、使用目的が癌転移増殖抑制作
用を有する血漿蛋白断片を調製する目的であれば、本願
発明の酵素の範疇に入るものである。
を行った後、ＧＶＤＦ膜にトランスブロットした。トラ
ンスブロット後の膜はアミドブラックで染色後、それぞ
れ４５ｋＤａに相当するバンド部分を切り出し、アミノ
酸配列分析装置でN末端からの配列を解読した。その結
果、４５ｋＤａに相当するバンドの配列はＬＶＲＩＰＬ
ＨＫＦＴであった。得られたアミノ酸配列を既存のアミ
ノ酸データバンクで照合した結果、当該酵素のＮ末端ア
ミノ酸残基はヒトカテプシンD前駆体に相同することが
判明した。また、イムノブロットの手法を用いて精製し
た酵素を抗ヒトカテプシンD抗体で反応させた結果、当
該酵素はこの抗体に反応したことから、本酵素がヒトカ
テプシンD前駆体に高い相同性を示すことが推察され
た。カテプシンDは、全アミノ酸を有するカテプシンD前
駆体の状態で産生され、リソゾーム中で他の酵素によっ
て切断を受け、活性型のカテプシンDに変換される。ヒ
ト乳癌に代表される悪性腫瘍がカテプシンD前駆体を細
胞外へ放出することは数多く報告されているが、仮に本
願発明の酵素がカテプシンＤ前駆体であったとしても、
カテプシンD前駆体が前駆体の形態でプラスミノーゲン
を切断することについては全く新しい知見であり興味あ
る点である。ＰＡＣＥ４調製の出発材料として用いたＰ
Ｃ−３細胞から調製したｍＲＮＡを基に合成したｃＤＮ
Ａを用い、カテプシンDのｃＤＮＡ配列より全長の翻訳
領域を増幅するためのセンスとアンチセンスプライマー
を合成し、ＡｍｐｌｉＴａｑ(ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ
社)を用いて増幅後、ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ(Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｎｇｅｎ社)を使用し増幅したｃＤＮＡ断片
をプラスミドベクターにクローニングした。得られた遺
伝子断片の塩基配列を決定した結果、既知のカテプシン
Dの塩基配列と同一であることが確認できた。しかし、
ＰＡＣＥ４をカテプシンD前駆体と同定した場合、非活
性型である前駆体がなぜ例えばプラスミノーゲンを切断
できるのか、あるいは元来細胞内酵素であるカテプシン
がなぜ細胞外に放出されるのか、という疑問が生じる。
本願発明の酵素が真にカテプシンD前駆体と同一である
か否かという点については全アミノ酸配列、構造が明ら
かにされることが必要である。しかし、現時点において
カテプシンD前駆体、活性型カテプシンD共に本願発明の
酵素活性を有するものであり、いずれもＰＡＣＥ４の範
疇に入る。また、同様に欠失、置換または化学修飾され
たカテプシンD誘導体も、使用目的が癌転移増殖抑制作
用を有する血漿蛋白断片を調製する目的であれば、本願
発明の酵素の範疇に入るものである。
【００２３】ＰＡＣＥ４で切断した蛋白断片の調製法 プラスミノーゲンをＰＡＣＥ４と一定割合で混合しｐＨ
４.０の条件下で反応させる。中性域の緩衝液で透析
後、反応液をリジンセファロースに吸着させてリジン結
合の有無により分離することによって、プラスミノーゲ
ンのクリングル１〜４を含む画分を調製することができ
る。本断片は炭酸アンモニウム緩衝液で透析後、凍結乾
燥する。なお、フィブロネクチンも同様に切断し、断片
混合液をヘパリンセファロースで分離することによって
所望の断片を調製することができる。
４.０の条件下で反応させる。中性域の緩衝液で透析
後、反応液をリジンセファロースに吸着させてリジン結
合の有無により分離することによって、プラスミノーゲ
ンのクリングル１〜４を含む画分を調製することができ
る。本断片は炭酸アンモニウム緩衝液で透析後、凍結乾
燥する。なお、フィブロネクチンも同様に切断し、断片
混合液をヘパリンセファロースで分離することによって
所望の断片を調製することができる。
【００２４】ＰＡＣＥ４の使用方法 １. ＰＡＣＥ４で切断した蛋白断片を転移増殖巣増殖
抑制剤として使用する方法 上述の方法で調製した蛋白
断片を生理食塩液で溶解し、これを動物試験の試料とし
た。転移増殖巣増殖抑制効果を判定する系としては、マ
ウスに転移増殖性癌を移植し、遠隔転移増殖巣の状況を
把握する系を用いた。マウスの背部皮下に肺癌細胞(Ｌ
Ｌ/２；大日本製薬）を移植し、原発巣が所定の大きさ
になるまで飼育した後、原発巣を術的に取り除き、１ｍ
ｇ/匹/日でマウス腹腔に試料を１０日間投与した。な
お、対象は凍結乾燥試料を溶解する際に用いた生理食塩
水を同量投与するものとした（転移増殖巣増殖抑制試
験）。転移増殖抑制試験の場合には原発巣除去後、さら
に一定期間飼育した後、１ｍｇ/匹/日でマウス腹腔に試
料を１０日間投与した。各試験終了後、マウスを解剖し
転移増殖抑制試験の場合は肺表面の結節数を、転移増殖
巣増殖抑制試験の場合は肺重量を測定し、対照群と比較
した(Mann Whetney U検定）。転移増殖抑制試験の結
果、対照群の転移増殖結節数が６.３±０.２ｇ(ｎ=６)
であるのに対して、プラスミノーゲン断片投与群の転移
増殖結節数は２.１±０.８ｇ(ｎ=６)であり、プラスミ
ノーゲン断片の投与により癌転移増殖を抑制しているこ
とが判明した。また、転移増殖巣増殖抑制試験では対照
群の肺重量が０.４４±０.２８ｇ(ｎ=６)であるのに対
して、プラスミノーゲン断片投与群の肺重量は０.２３
±０.０８ｇ(ｎ=６)であり、プラスミノーゲン断片投与
群が有意にＬＬ/２の肺転移増殖後の増殖を抑制するこ
とが認められた。
抑制剤として使用する方法 上述の方法で調製した蛋白
断片を生理食塩液で溶解し、これを動物試験の試料とし
た。転移増殖巣増殖抑制効果を判定する系としては、マ
ウスに転移増殖性癌を移植し、遠隔転移増殖巣の状況を
把握する系を用いた。マウスの背部皮下に肺癌細胞(Ｌ
Ｌ/２；大日本製薬）を移植し、原発巣が所定の大きさ
になるまで飼育した後、原発巣を術的に取り除き、１ｍ
ｇ/匹/日でマウス腹腔に試料を１０日間投与した。な
お、対象は凍結乾燥試料を溶解する際に用いた生理食塩
水を同量投与するものとした（転移増殖巣増殖抑制試
験）。転移増殖抑制試験の場合には原発巣除去後、さら
に一定期間飼育した後、１ｍｇ/匹/日でマウス腹腔に試
料を１０日間投与した。各試験終了後、マウスを解剖し
転移増殖抑制試験の場合は肺表面の結節数を、転移増殖
巣増殖抑制試験の場合は肺重量を測定し、対照群と比較
した(Mann Whetney U検定）。転移増殖抑制試験の結
果、対照群の転移増殖結節数が６.３±０.２ｇ(ｎ=６)
であるのに対して、プラスミノーゲン断片投与群の転移
増殖結節数は２.１±０.８ｇ(ｎ=６)であり、プラスミ
ノーゲン断片の投与により癌転移増殖を抑制しているこ
とが判明した。また、転移増殖巣増殖抑制試験では対照
群の肺重量が０.４４±０.２８ｇ(ｎ=６)であるのに対
して、プラスミノーゲン断片投与群の肺重量は０.２３
±０.０８ｇ(ｎ=６)であり、プラスミノーゲン断片投与
群が有意にＬＬ/２の肺転移増殖後の増殖を抑制するこ
とが認められた。
【００２５】以上の結果は、転移増殖の抑制と血管新生
の阻害による結果と推察され、とりわけ転移増殖の抑制
については、当該断片によるマトリックス分解酵素活性
化の阻害、プラスミンの競合阻害によるプラスミン作用
の抑制、およびレセプターを介したマトリックス分解酵
素のダウンレギュレーションなど直接的、間接的に転移
増殖を抑制した結果と考えられる。一方、血管新生の効
果については本願発明の酵素が断片化するプラスミノー
ゲン断片がＯ'Ｒｅｉｌｌｙ等の報告したアンジオスタ
チン及びプラスミノーゲンのクリングルと同等の活性を
発現した結果と考えられる。しかし、ウシ大動脈血管内
皮細胞を用いた内皮細胞の増殖抑制試験においてはその
増殖を抑制する結果は得られてはおらず、転移増殖巣の
増殖抑制の機序については、現時点では不明である。
の阻害による結果と推察され、とりわけ転移増殖の抑制
については、当該断片によるマトリックス分解酵素活性
化の阻害、プラスミンの競合阻害によるプラスミン作用
の抑制、およびレセプターを介したマトリックス分解酵
素のダウンレギュレーションなど直接的、間接的に転移
増殖を抑制した結果と考えられる。一方、血管新生の効
果については本願発明の酵素が断片化するプラスミノー
ゲン断片がＯ'Ｒｅｉｌｌｙ等の報告したアンジオスタ
チン及びプラスミノーゲンのクリングルと同等の活性を
発現した結果と考えられる。しかし、ウシ大動脈血管内
皮細胞を用いた内皮細胞の増殖抑制試験においてはその
増殖を抑制する結果は得られてはおらず、転移増殖巣の
増殖抑制の機序については、現時点では不明である。
【００２６】２. ＰＡＣＥ４を転移増殖巣増殖抑制剤
として使用する方法 調製したＰＡＣＥ４自体の転移増殖巣増殖効果を判定す
る系としては、免疫不全(Ｓｃｉｄ)マウスを用いた系を
使用した。すなわち、Ｓｃｉｄマウスの背部皮下に肺癌
細胞(３ＬＬ；東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源
センターより供与)を移植し、原発巣が所定の大きさに
なるまで飼育した。また、マウスに病態の状況を反映さ
せるため、原発巣の大きさによって、全群を原発巣重量
１２００ｍｇ以下群と１２００ｍｇ以上群とに分けた。
各群の原発巣を術的に除去した後、さらに各群を３群に
分け、ＰＡＣＥ４の高濃度投与群、低濃度投与群、対照
群とし、４０μｇ/匹/日あるいは８μｇ/匹/日でマウス
腹腔に試料を１０日間投与した。なお、対照は凍結乾燥
試料を溶解する際に用いた生理食塩水を同量投与するも
のとした。試験終了後マウスを解剖し肺重量を測定し対
照群と比較した(Mann Whetney U検定）。その結果、興
味深いことに原発巣１２００ｍｇ以上群(図中Ｂ)におい
て、本願発明の酵素による転移増殖巣増殖抑制活性が濃
度依存的に認められた(図９)。
として使用する方法 調製したＰＡＣＥ４自体の転移増殖巣増殖効果を判定す
る系としては、免疫不全(Ｓｃｉｄ)マウスを用いた系を
使用した。すなわち、Ｓｃｉｄマウスの背部皮下に肺癌
細胞(３ＬＬ；東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源
センターより供与)を移植し、原発巣が所定の大きさに
なるまで飼育した。また、マウスに病態の状況を反映さ
せるため、原発巣の大きさによって、全群を原発巣重量
１２００ｍｇ以下群と１２００ｍｇ以上群とに分けた。
各群の原発巣を術的に除去した後、さらに各群を３群に
分け、ＰＡＣＥ４の高濃度投与群、低濃度投与群、対照
群とし、４０μｇ/匹/日あるいは８μｇ/匹/日でマウス
腹腔に試料を１０日間投与した。なお、対照は凍結乾燥
試料を溶解する際に用いた生理食塩水を同量投与するも
のとした。試験終了後マウスを解剖し肺重量を測定し対
照群と比較した(Mann Whetney U検定）。その結果、興
味深いことに原発巣１２００ｍｇ以上群(図中Ｂ)におい
て、本願発明の酵素による転移増殖巣増殖抑制活性が濃
度依存的に認められた(図９)。
【００２７】上述の結果は極めて興味深い知見である。
すなわち、カテプシンD様の本願発明の酵素が生体内で
作用するということは、少なくともｐＨ５.０という低
ｐＨ環境が生体内に存在することを意味するからであ
る。このｐＨ５.０以下という環境は非生理的であり、
この酵素が生理的にどのように作用しているのかは現段
階では不明であるが、担癌環境がこの低ｐＨ環境を生み
出しているとする報告もある。Ｂｒｉｏｚｚｏ等は、本
願発明の酵素と同種類に分類されるアスパラギン酸酵素
であるカテプシンDが癌細胞から分泌され、遠隔部位で
作用し、細胞外マトリックスを分解することを示してい
る(Ｂｒｉｏｚｚｏ Ｐ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ.,ｖｏｌ.４８，ｐ.３６８８−３６９２,(１９８
８))。このことは、間質にアスパラギン酸プロテアーゼ
が作用できるｐＨ５.５以下のｐＨ域が存在することを
示すものである。特に、この低いｐＨは細胞外マトリッ
クスに近接した悪性腫瘍によって生じた微小環境で認め
られる。これらのメカニズムに関しては、膜癌蛋白から
のプロトンの遊離の増加、またはＨ−ＡＴＰａｓｅ(Ｂ
ａｒｏｎ Ｒ. ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖ
ｏｌ.１０１,p.２２１０−２２２２,(１９９５))、もし
くは癌細胞のオリゴサッカライド鎖のシアル酸含量が増
加することが原因で(ｖａｎ Ｂｅｅｋ Ｗ.Ｐ.,ｅｔ ａ
ｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,ｖｏｌ.３３,ｐ.２９１３−
２９２２,(１９７３))、細胞膜での酸性側への局在化
(Ｃａｒｒｅｌ Ａ, ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.,ｖ
ｏｌ.１４４,ｐ.５０３−５２１,(１９７６)に起因する
ものと考えられる。また、癌の酸性化は無酸素状態の結
果であることは従来から提唱されている(Ｓｐｅｃｈｌ
ｅｒ Ｓ.Ｊ., ｅｔ ａｌ.,Ａｒｃｈ.Ｉｎｔ.Ｍｅｄ.,ｖ
ｏｌ.１３８,ｐ.１６６３−１６６４,(１９７８))。カ
テプシンDも本願発明の酵素も膜結合能を有する性質か
ら細胞外へ放出される際は膜に包み込まれた状態である
ことが推察される。カテプシンD等の細胞内プロテアー
ゼは主にエンドソーム、リソゾームと呼ばれる膜胞に局
在する。両膜胞はＨ−ＡＴＰａｓｅの分布により極度に
酸性側に傾いており、細胞内外の異物を分解、再利用を
果たす役割を有している。癌細胞に何らかの条件が加わ
ることによりこの膜胞が細胞外に放出され、膜胞付近に
存在するプラスミノーゲンあるいは細胞外マトリックス
を細胞外で消化することも推察される。
すなわち、カテプシンD様の本願発明の酵素が生体内で
作用するということは、少なくともｐＨ５.０という低
ｐＨ環境が生体内に存在することを意味するからであ
る。このｐＨ５.０以下という環境は非生理的であり、
この酵素が生理的にどのように作用しているのかは現段
階では不明であるが、担癌環境がこの低ｐＨ環境を生み
出しているとする報告もある。Ｂｒｉｏｚｚｏ等は、本
願発明の酵素と同種類に分類されるアスパラギン酸酵素
であるカテプシンDが癌細胞から分泌され、遠隔部位で
作用し、細胞外マトリックスを分解することを示してい
る(Ｂｒｉｏｚｚｏ Ｐ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ.,ｖｏｌ.４８，ｐ.３６８８−３６９２,(１９８
８))。このことは、間質にアスパラギン酸プロテアーゼ
が作用できるｐＨ５.５以下のｐＨ域が存在することを
示すものである。特に、この低いｐＨは細胞外マトリッ
クスに近接した悪性腫瘍によって生じた微小環境で認め
られる。これらのメカニズムに関しては、膜癌蛋白から
のプロトンの遊離の増加、またはＨ−ＡＴＰａｓｅ(Ｂ
ａｒｏｎ Ｒ. ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ., ｖ
ｏｌ.１０１,p.２２１０−２２２２,(１９９５))、もし
くは癌細胞のオリゴサッカライド鎖のシアル酸含量が増
加することが原因で(ｖａｎ Ｂｅｅｋ Ｗ.Ｐ.,ｅｔ ａ
ｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,ｖｏｌ.３３,ｐ.２９１３−
２９２２,(１９７３))、細胞膜での酸性側への局在化
(Ｃａｒｒｅｌ Ａ, ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.,ｖ
ｏｌ.１４４,ｐ.５０３−５２１,(１９７６)に起因する
ものと考えられる。また、癌の酸性化は無酸素状態の結
果であることは従来から提唱されている(Ｓｐｅｃｈｌ
ｅｒ Ｓ.Ｊ., ｅｔ ａｌ.,Ａｒｃｈ.Ｉｎｔ.Ｍｅｄ.,ｖ
ｏｌ.１３８,ｐ.１６６３−１６６４,(１９７８))。カ
テプシンDも本願発明の酵素も膜結合能を有する性質か
ら細胞外へ放出される際は膜に包み込まれた状態である
ことが推察される。カテプシンD等の細胞内プロテアー
ゼは主にエンドソーム、リソゾームと呼ばれる膜胞に局
在する。両膜胞はＨ−ＡＴＰａｓｅの分布により極度に
酸性側に傾いており、細胞内外の異物を分解、再利用を
果たす役割を有している。癌細胞に何らかの条件が加わ
ることによりこの膜胞が細胞外に放出され、膜胞付近に
存在するプラスミノーゲンあるいは細胞外マトリックス
を細胞外で消化することも推察される。
【００２８】３. ＰＡＣＥ４によるフィブロネクチン等
血漿蛋白の分解 本願発明者は、癌状態で多く産生され細胞接着に深く関
与する血漿成分であるフィブロネクチンに注目し、これ
を本願発明の酵素で切断した。フィブロネクチンは当該
酵素によって限定的に分解され、かつその分解産物には
インタクトの状態では認められない強力なＢＣＥ血管増
殖抑制能力が認められた。当該酵素によるフィブロネク
チン分解産物をさらにヘパリンセファロース(ファルマ
シア社)で分離した画分を上述のマウスを用いたモデル
系に投与した結果(１ｍｇ/ｋｇ/ｄａｙ)、これらの断片
に転移増殖巣の増殖抑制効果が認められた。本成績は転
移増殖巣の増殖を抑制する断片はプラスミノーゲンに限
らないことを示すものであり、その仮定を証明するた
め、本願発明者は、マトリックス構成成分であるテトラ
ネクチンまたはプラスミノーゲンが有するのと同様なク
リングル部を有する血漿蛋白に本願発明の酵素を作用さ
せ、上述の血管内皮細胞の系でその血管新生阻害活性を
評価した。また、本願発明者は、血漿蛋白をアルコール
分画して得られる幾種かのフラクションを同様に本願発
明の酵素で切断した。アルコール画分から透析によって
アルコールを除いた後、さらにクエン酸リン酸緩衝液
(ｐＨ４.０)で透析し、蛋白量対酵素比を１００：１の
割合で当該酵素を混合し、３７℃で一晩反応させた。な
お、同蛋白粗液はｐＨ４.０の条件で多くの沈殿を生じ
るため、酵素反応の前には６０００ｒｐｍ(トミー社製)
で遠心処理をし、その上清を使用した。反応液はさらに
５０ｍＭＴｒｉｓ／５０ｍＭＮａＣｌ(ｐＨ７.２)の緩
衝液で一晩透析後、０.４５μｍのフィルター(Ｍｉｌｅ
ｘ ＨＡ：ミリポア社製)で濾過後、ヘパリンセファロー
ス(Ｈｉ−ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ：ファルマシア社
製)５ｍｌによって蛋白混合液を得た。現段階では活性
のみであるが、本願発明者は既に、アルコール画分のう
ちフラクションIIIまたはフラクションＩＶを切断し、
このうちヘパリン担体に結合する画分に血管内皮細胞の
増殖を抑制する活性を認めている。
血漿蛋白の分解 本願発明者は、癌状態で多く産生され細胞接着に深く関
与する血漿成分であるフィブロネクチンに注目し、これ
を本願発明の酵素で切断した。フィブロネクチンは当該
酵素によって限定的に分解され、かつその分解産物には
インタクトの状態では認められない強力なＢＣＥ血管増
殖抑制能力が認められた。当該酵素によるフィブロネク
チン分解産物をさらにヘパリンセファロース(ファルマ
シア社)で分離した画分を上述のマウスを用いたモデル
系に投与した結果(１ｍｇ/ｋｇ/ｄａｙ)、これらの断片
に転移増殖巣の増殖抑制効果が認められた。本成績は転
移増殖巣の増殖を抑制する断片はプラスミノーゲンに限
らないことを示すものであり、その仮定を証明するた
め、本願発明者は、マトリックス構成成分であるテトラ
ネクチンまたはプラスミノーゲンが有するのと同様なク
リングル部を有する血漿蛋白に本願発明の酵素を作用さ
せ、上述の血管内皮細胞の系でその血管新生阻害活性を
評価した。また、本願発明者は、血漿蛋白をアルコール
分画して得られる幾種かのフラクションを同様に本願発
明の酵素で切断した。アルコール画分から透析によって
アルコールを除いた後、さらにクエン酸リン酸緩衝液
(ｐＨ４.０)で透析し、蛋白量対酵素比を１００：１の
割合で当該酵素を混合し、３７℃で一晩反応させた。な
お、同蛋白粗液はｐＨ４.０の条件で多くの沈殿を生じ
るため、酵素反応の前には６０００ｒｐｍ(トミー社製)
で遠心処理をし、その上清を使用した。反応液はさらに
５０ｍＭＴｒｉｓ／５０ｍＭＮａＣｌ(ｐＨ７.２)の緩
衝液で一晩透析後、０.４５μｍのフィルター(Ｍｉｌｅ
ｘ ＨＡ：ミリポア社製)で濾過後、ヘパリンセファロー
ス(Ｈｉ−ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ：ファルマシア社
製)５ｍｌによって蛋白混合液を得た。現段階では活性
のみであるが、本願発明者は既に、アルコール画分のう
ちフラクションIIIまたはフラクションＩＶを切断し、
このうちヘパリン担体に結合する画分に血管内皮細胞の
増殖を抑制する活性を認めている。
【００２９】４. 癌患者血漿中のＰＡＣＥ４の測定 癌患者血漿中のＰＡＣＥ４の活性は、ＰＣ−３培養上清
中のＰＡＣＥ４活性を測定する方法に基づいて測定し
た。披検試料を測定するに当たり、各種癌細胞の培養上
清中に放出される酵素活性を上述のプラスミノーゲン分
解活性で検討した結果、ＰＡＣＥ４は正常細胞では殆ど
細胞外へ放出されることがなく、ある種の癌細胞で多量
に放出されるのが特徴であることが見出された(図１
０)。図１０中で、Ａ)はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂ)は抗プ
ラスミノーゲン抗体を用いたウエスタンブロット、Ｃ)
はＰＡＣＥ４の阻害剤と共に反応させた際のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、Ｄ)はシステイン酵素阻害剤と共に反応させた
際のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。また、ＰＬＧはプラスミ
ノーゲン(対照)、ＮＫＬＦは平滑筋細胞、ＨＵＶＥＣは
血管内皮細胞、ＰＣ−３は前立腺癌細胞、ＨｅｐＧ２は
肝癌細胞、ＣＯＬＯＮは大腸癌細胞、ＭＣＦ７は乳癌細
胞、ＬＬ/２はマウス肺癌細胞の例示を意味する。ＰＡ
ＣＥ４活性は正常細胞では認められず、前立腺癌、大腸
癌、肺癌細胞で大量に産生されていることが判明した。
また、肝癌細胞はＰＡＣＥ４とは異なるアスパラギン酸
酵素が存在していることが判明した。また、乳癌細胞に
ＰＡＣＥ４活性は認められなかった。上記の知見は、本
酵素活性の測定が癌状態を把握するうえで重要なマーカ
ーとなる可能性を強く示唆している。本願発明者等は癌
患者血漿のＰＡＣＥ４活性をＰＡＣＥ４スクリーニング
系に適応させ、その活性値を測定した。癌患者血漿中の
当該酵素活性は０.７３±０.６ｕｎｉｔ(ｎ＝３０)であ
り、健常人の０.０２±０.１ｕｎｉｔ(ｎ＝６)に比較し
て有意に高値であることが判明した。
中のＰＡＣＥ４活性を測定する方法に基づいて測定し
た。披検試料を測定するに当たり、各種癌細胞の培養上
清中に放出される酵素活性を上述のプラスミノーゲン分
解活性で検討した結果、ＰＡＣＥ４は正常細胞では殆ど
細胞外へ放出されることがなく、ある種の癌細胞で多量
に放出されるのが特徴であることが見出された(図１
０)。図１０中で、Ａ)はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂ)は抗プ
ラスミノーゲン抗体を用いたウエスタンブロット、Ｃ)
はＰＡＣＥ４の阻害剤と共に反応させた際のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、Ｄ)はシステイン酵素阻害剤と共に反応させた
際のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。また、ＰＬＧはプラスミ
ノーゲン(対照)、ＮＫＬＦは平滑筋細胞、ＨＵＶＥＣは
血管内皮細胞、ＰＣ−３は前立腺癌細胞、ＨｅｐＧ２は
肝癌細胞、ＣＯＬＯＮは大腸癌細胞、ＭＣＦ７は乳癌細
胞、ＬＬ/２はマウス肺癌細胞の例示を意味する。ＰＡ
ＣＥ４活性は正常細胞では認められず、前立腺癌、大腸
癌、肺癌細胞で大量に産生されていることが判明した。
また、肝癌細胞はＰＡＣＥ４とは異なるアスパラギン酸
酵素が存在していることが判明した。また、乳癌細胞に
ＰＡＣＥ４活性は認められなかった。上記の知見は、本
酵素活性の測定が癌状態を把握するうえで重要なマーカ
ーとなる可能性を強く示唆している。本願発明者等は癌
患者血漿のＰＡＣＥ４活性をＰＡＣＥ４スクリーニング
系に適応させ、その活性値を測定した。癌患者血漿中の
当該酵素活性は０.７３±０.６ｕｎｉｔ(ｎ＝３０)であ
り、健常人の０.０２±０.１ｕｎｉｔ(ｎ＝６)に比較し
て有意に高値であることが判明した。
【００３０】上述の方法で調製された酵素あるいは当該
酵素によって断片化された抗癌能力を有する蛋白断片
は、その活性を最大限に維持するためには、新鮮状態で
使用するか、保存する場合は４℃で保存し保存後７日以
内に使用することが望ましい。あるいは、これらをヒト
アルブミン、ゼラチン、塩、糖またはアミノ酸等の好適
な安定剤と共に凍結乾燥もしくは液状の状態で保存する
ことができるし、さらには凍結し保存することも可能で
ある。また、感染性夾雑ウイルスの不活性化を目的とし
て、凍結乾燥状態において所定の条件下、例えば６５℃
９６時間加熱処理を施すことは、薬剤の安全性の観点か
ら好ましい態様である。本願発明では、かかる有効成分
としてのＰＡＣＥ４または当該酵素によって調製される
抗癌能力を持つ蛋白断片を公知の適当な賦型剤と組み合
わせ、公知の方法で本願発明の癌転移増殖抑制剤とする
ことができる。本願発明のＰＡＣＥ４またはＰＡＣＥ４
によって調製される血漿蛋白断片を本態とする癌転移増
殖抑制剤の有効投与量は、例えば投与対象者の年齢、症
状及び重症度等により変動し、最終的には医師の意図に
より変動するものであるが、例えば一般に成人一人当た
り３０〜１５０ｍｇ程度を１〜２回に分けて投与するこ
となどが想定される。投与方法は単回大量(ボーラス)あ
るいは静脈点滴投与が最適である。また、場合により他
の抗癌剤と併用することも可能であり、本願発明によっ
て提供される癌転移増殖抑制剤中に前記の抗癌剤を併存
させることも好ましい態様の一つである。なお、本願明
細書中の実施例で使用した血液由来のプラスミノーゲン
断片に関しては、マウスでの単回静脈投与毒性試験、呼
吸器循環器系に及ぼす影響をビーグル犬を用いて実施す
る一般薬理試験及びウイルス不活性化試験等によりその
安全性が確認されている。
酵素によって断片化された抗癌能力を有する蛋白断片
は、その活性を最大限に維持するためには、新鮮状態で
使用するか、保存する場合は４℃で保存し保存後７日以
内に使用することが望ましい。あるいは、これらをヒト
アルブミン、ゼラチン、塩、糖またはアミノ酸等の好適
な安定剤と共に凍結乾燥もしくは液状の状態で保存する
ことができるし、さらには凍結し保存することも可能で
ある。また、感染性夾雑ウイルスの不活性化を目的とし
て、凍結乾燥状態において所定の条件下、例えば６５℃
９６時間加熱処理を施すことは、薬剤の安全性の観点か
ら好ましい態様である。本願発明では、かかる有効成分
としてのＰＡＣＥ４または当該酵素によって調製される
抗癌能力を持つ蛋白断片を公知の適当な賦型剤と組み合
わせ、公知の方法で本願発明の癌転移増殖抑制剤とする
ことができる。本願発明のＰＡＣＥ４またはＰＡＣＥ４
によって調製される血漿蛋白断片を本態とする癌転移増
殖抑制剤の有効投与量は、例えば投与対象者の年齢、症
状及び重症度等により変動し、最終的には医師の意図に
より変動するものであるが、例えば一般に成人一人当た
り３０〜１５０ｍｇ程度を１〜２回に分けて投与するこ
となどが想定される。投与方法は単回大量(ボーラス)あ
るいは静脈点滴投与が最適である。また、場合により他
の抗癌剤と併用することも可能であり、本願発明によっ
て提供される癌転移増殖抑制剤中に前記の抗癌剤を併存
させることも好ましい態様の一つである。なお、本願明
細書中の実施例で使用した血液由来のプラスミノーゲン
断片に関しては、マウスでの単回静脈投与毒性試験、呼
吸器循環器系に及ぼす影響をビーグル犬を用いて実施す
る一般薬理試験及びウイルス不活性化試験等によりその
安全性が確認されている。
【００３１】本願発明の効果 本願発明の血漿蛋白断片化酵素または当該血漿蛋白断片
化酵素によって調製される血漿蛋白断片を主成分とする
癌転移増殖抑制剤は、肺癌、大腸癌に代表される固形癌
等の臨床治療に利用され得る。ヒトプラスミノーゲンを
エラスターゼで処理することによって得られるヒトアン
ジオスタチンは、強力に血管内皮細胞の増殖を抑制し、
新生血管に依存する主要の増殖を有効に抑制することが
Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ等の報告で明らかにされている(Ｏ'Ｒ
ｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔ. Ｍｅｄ., ｖｏｌ.２,
ｐ.６８９−６９２,(１９９６))。血管新生阻害剤によ
る癌治療は従来の化学療法に比較して副作用が少なく、
且つ薬剤耐性を受けにくい点で大きな注目を集めてい
る。しかし、一方で血管新生阻害剤は癌が存在する間そ
の投与が続けられる必要があり、特にアンジオスタチン
のような蛋白由来物質については、その供給が大きな問
題となる。遺伝子組換え技術を用いたアンジオスタチン
の調製あるいは癌患者へのアンジオスタチン遺伝子の導
入などは、これら問題の解決手段として注目されている
が、ＰＡＣＥ４の癌患者への導入もこの問題の解決策ま
たは治療法の一つとなり得る。即ち、１.アンジオスタ
チンの原料であるプラスミノーゲンは生体内に大量に存
在するため、本願発明の酵素は少量で有効にプラスミノ
ーゲンからアンジオスタチンを調製することが可能であ
る。２.アンジオスタチンを産生させると共に、癌進展
に促進的に作用するプラスミンを不活性化させることに
より、より有効にアンジオスタチンの活性を発現させる
ことができる。３.本願発明の酵素は外分泌系(胃)を除
く中性のｐＨに保たれた生体内では作用せず、その作用
はＰＡＣＥ４がその活性を発現する低いｐＨ域を有する
癌周辺に限局されるため有効であり、かつ安全である。
また、４.本願発明の酵素はプラスミノーゲンに限ら
ず、フィブロネクチンあるいはテトラネクチンを切断し
血管新生阻害作用を有する断片を遊離させるため、５.
その相乗的作用によってより有効に血管新生に依存する
癌の転移増殖を抑制することができる。
化酵素によって調製される血漿蛋白断片を主成分とする
癌転移増殖抑制剤は、肺癌、大腸癌に代表される固形癌
等の臨床治療に利用され得る。ヒトプラスミノーゲンを
エラスターゼで処理することによって得られるヒトアン
ジオスタチンは、強力に血管内皮細胞の増殖を抑制し、
新生血管に依存する主要の増殖を有効に抑制することが
Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ等の報告で明らかにされている(Ｏ'Ｒ
ｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔ. Ｍｅｄ., ｖｏｌ.２,
ｐ.６８９−６９２,(１９９６))。血管新生阻害剤によ
る癌治療は従来の化学療法に比較して副作用が少なく、
且つ薬剤耐性を受けにくい点で大きな注目を集めてい
る。しかし、一方で血管新生阻害剤は癌が存在する間そ
の投与が続けられる必要があり、特にアンジオスタチン
のような蛋白由来物質については、その供給が大きな問
題となる。遺伝子組換え技術を用いたアンジオスタチン
の調製あるいは癌患者へのアンジオスタチン遺伝子の導
入などは、これら問題の解決手段として注目されている
が、ＰＡＣＥ４の癌患者への導入もこの問題の解決策ま
たは治療法の一つとなり得る。即ち、１.アンジオスタ
チンの原料であるプラスミノーゲンは生体内に大量に存
在するため、本願発明の酵素は少量で有効にプラスミノ
ーゲンからアンジオスタチンを調製することが可能であ
る。２.アンジオスタチンを産生させると共に、癌進展
に促進的に作用するプラスミンを不活性化させることに
より、より有効にアンジオスタチンの活性を発現させる
ことができる。３.本願発明の酵素は外分泌系(胃)を除
く中性のｐＨに保たれた生体内では作用せず、その作用
はＰＡＣＥ４がその活性を発現する低いｐＨ域を有する
癌周辺に限局されるため有効であり、かつ安全である。
また、４.本願発明の酵素はプラスミノーゲンに限ら
ず、フィブロネクチンあるいはテトラネクチンを切断し
血管新生阻害作用を有する断片を遊離させるため、５.
その相乗的作用によってより有効に血管新生に依存する
癌の転移増殖を抑制することができる。
【００３２】以下、本願発明の理解を深めるために実施
例に沿って説明するが、本願発明はこれらの実施例にな
んら限定されるものではない。
例に沿って説明するが、本願発明はこれらの実施例にな
んら限定されるものではない。
【００３３】実施例１ （酵素原液の調製）ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ−３)は九州
大学医学部、桑野仲信教授より供与された。ＰＣ−３は
１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含むＲＰＭＩ-１６４０
培地(日水製薬社製)で維持し、コンフルな状態になった
時点で、その培地をＦＣＳを含まないＲＰＭＩ-１６４
０(以下、無血清培地）に置換し、１〜２日間培養後、
その培養上清を回収し、遠心(３０００ｒｐｍ×２０分
間)、濾過(０.４５μｍ Ｍｉｌｅｘ ＨＡ:ミリポア社
製)処理したものを酵素原液とした。
大学医学部、桑野仲信教授より供与された。ＰＣ−３は
１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含むＲＰＭＩ-１６４０
培地(日水製薬社製)で維持し、コンフルな状態になった
時点で、その培地をＦＣＳを含まないＲＰＭＩ-１６４
０(以下、無血清培地）に置換し、１〜２日間培養後、
その培養上清を回収し、遠心(３０００ｒｐｍ×２０分
間)、濾過(０.４５μｍ Ｍｉｌｅｘ ＨＡ:ミリポア社
製)処理したものを酵素原液とした。
【００３４】実施例２ （酵素活性の確認）酵素原液の活性は、Ｇａｔｅｌｙ等
の方法に従い、酵素原液とプラスミノーゲンとを反応さ
せ、その反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＬＢＳ
Ｉ抗体を用いたイムノブロットでプラスミノーゲンが分
解されている度合いを確認することによって評価した。
の方法に従い、酵素原液とプラスミノーゲンとを反応さ
せ、その反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＬＢＳ
Ｉ抗体を用いたイムノブロットでプラスミノーゲンが分
解されている度合いを確認することによって評価した。
【００３５】実施例３ （培養上清のプラスミノーゲン断片化に対するｐＨの影
響）実施例１の培養上清１００μl、１ｍｇ/ｍｌのプラ
スミノーゲン溶液１００μl、及び各種ｐＨ緩衝液を
１：１：２の割合で混合し、３７℃でインキュベーショ
ンし、酵素活性を実施例２に記載の方法で確認した。結
果を図１に示した。図で明らかなようにｐＨ５.０を境
にプラスミノーゲンの断片化様式に差が認められた。矢
印(→)はＧａｔｅｌｙ等が報告したＰＡＣＥ由来のプラ
スミノーゲン断片に相当する。
響）実施例１の培養上清１００μl、１ｍｇ/ｍｌのプラ
スミノーゲン溶液１００μl、及び各種ｐＨ緩衝液を
１：１：２の割合で混合し、３７℃でインキュベーショ
ンし、酵素活性を実施例２に記載の方法で確認した。結
果を図１に示した。図で明らかなようにｐＨ５.０を境
にプラスミノーゲンの断片化様式に差が認められた。矢
印(→)はＧａｔｅｌｙ等が報告したＰＡＣＥ由来のプラ
スミノーゲン断片に相当する。
【００３６】実施例４ （ＰＡＣＥ４により生ずるプラスミノーゲン断片の同
定）実施例３に記載の検体のうちｐＨ４.０に相当する
反応液について１２.５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施
し、常法に従い、蛋白をイモビロン膜（ミリポア社製）
に転写した。これにウサギ抗ヒトプラスミノーゲンLysi
ne Binding Site I抗体、ウサギ抗ヒトプラスミノーゲ
ンミニプラスミノーゲン抗体を用いてイムノブロットを
行った結果を図１１に示した。図のように非還元型の泳
動で３本のバンドが認められ、このうち４０、４３ｋＤ
ａのバンドはウサギ抗ヒトプラスミノーゲンLysine Bin
ding Site I抗体に３５ｋＤａのバンドはウサギ抗ヒト
プラスミノーゲンミニプラスミノゲーン抗体にのみ反応
した。図中、ａはリジンセファロース結合画分、ｂはリ
ジンセファロース素通り画分である。
定）実施例３に記載の検体のうちｐＨ４.０に相当する
反応液について１２.５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施
し、常法に従い、蛋白をイモビロン膜（ミリポア社製）
に転写した。これにウサギ抗ヒトプラスミノーゲンLysi
ne Binding Site I抗体、ウサギ抗ヒトプラスミノーゲ
ンミニプラスミノーゲン抗体を用いてイムノブロットを
行った結果を図１１に示した。図のように非還元型の泳
動で３本のバンドが認められ、このうち４０、４３ｋＤ
ａのバンドはウサギ抗ヒトプラスミノーゲンLysine Bin
ding Site I抗体に３５ｋＤａのバンドはウサギ抗ヒト
プラスミノーゲンミニプラスミノゲーン抗体にのみ反応
した。図中、ａはリジンセファロース結合画分、ｂはリ
ジンセファロース素通り画分である。
【００３７】実施例５ （ｐＨ４.０条件での切断様式）実施例３の条件でプラ
スミノーゲンを断片化した検体を１２.５％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動を実施し、常法に従い、蛋白をイモビロ
ン膜(ミリポア社製)にトランスブロットした。その後、
アミドブラックで染色後、精製水で脱色し、約４０、４
３ｋＤａのバンドと３５ｋＤａ付近のバンドをそれぞれ
取り出した。各バンドについて、アミノ酸N末分析機(Bi
oApplied 社製)によってそのアミノ末端アミノ酸残基を
求めた。得られた蛋白質のＮ末端アミノ酸残基は４０、
４３ｋＤａのバンドは７９Ｌｅｕであり、３５ｋＤａに
相当する部分は４８０Ｐｒｏであった。ｐＨ４.０条件
で切断される本断片はその分子量からクリングル１〜４
を含む断片であることが推察された。本断片を以下ＰＡ
Ｎ４(PACE derived Angiostatin ｐＨ４.０)と略称す
る。
スミノーゲンを断片化した検体を１２.５％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動を実施し、常法に従い、蛋白をイモビロ
ン膜(ミリポア社製)にトランスブロットした。その後、
アミドブラックで染色後、精製水で脱色し、約４０、４
３ｋＤａのバンドと３５ｋＤａ付近のバンドをそれぞれ
取り出した。各バンドについて、アミノ酸N末分析機(Bi
oApplied 社製)によってそのアミノ末端アミノ酸残基を
求めた。得られた蛋白質のＮ末端アミノ酸残基は４０、
４３ｋＤａのバンドは７９Ｌｅｕであり、３５ｋＤａに
相当する部分は４８０Ｐｒｏであった。ｐＨ４.０条件
で切断される本断片はその分子量からクリングル１〜４
を含む断片であることが推察された。本断片を以下ＰＡ
Ｎ４(PACE derived Angiostatin ｐＨ４.０)と略称す
る。
【００３８】実施例６ （各種癌細胞のＰＡＣＥ４の産生）実施例１のＰＣ−３
の代わりにヒト繊維芽細胞、ヒト臍帯血由来血管内皮細
胞、ウシ大動脈血管内皮細胞、ヒト肝癌細胞(ＨｅｐＧ
２)、マウス肺癌細胞(ＬＬ/２)の培養上清を用い実施例
３の方法に従いプラスミノーゲンの断片化を調べた。Ｐ
Ｃ−３培養上清以外の癌細胞にも同様の断片化酵素が認
められた。
の代わりにヒト繊維芽細胞、ヒト臍帯血由来血管内皮細
胞、ウシ大動脈血管内皮細胞、ヒト肝癌細胞(ＨｅｐＧ
２)、マウス肺癌細胞(ＬＬ/２)の培養上清を用い実施例
３の方法に従いプラスミノーゲンの断片化を調べた。Ｐ
Ｃ−３培養上清以外の癌細胞にも同様の断片化酵素が認
められた。
【００３９】実施例７ （ＰＡＣＥ４のスクリーニング系）ＰＡＣＥ４のスクリ
ーニング法の概念を図２に示した。固相抗体として抗ミ
ニプラスミノーゲン抗体を用い、標識抗体としてプラス
ミノーゲンのクリングル１〜３に反応する抗体を用い、
既知量のプラスミノーゲンと試料を反応させた液をこの
測定系に加える。クリングル４からミニプラスミノーゲ
ン間で切断があった場合、その発色値はその程度に従っ
て低下する。この低下の率を評価することによって酵素
量を決定する。 1)試料の調製 ７５０μlの０.１Ｍリン酸/クエン酸緩衝液(ｐＨ３.０)
に２００μlの検体(培養上清または精製中間原料)を加
え、これに最終濃度２０μｇ/mlのプラスミノーゲンま
たはＬｙｓプラスミノーゲン５０μlを添加し、３７℃
で１時間反応させた。反応液は、２０Ｕ/mlアプロチニ
ン、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で希釈し、これをＥ
ＬＩＳＡの試料とした。
ーニング法の概念を図２に示した。固相抗体として抗ミ
ニプラスミノーゲン抗体を用い、標識抗体としてプラス
ミノーゲンのクリングル１〜３に反応する抗体を用い、
既知量のプラスミノーゲンと試料を反応させた液をこの
測定系に加える。クリングル４からミニプラスミノーゲ
ン間で切断があった場合、その発色値はその程度に従っ
て低下する。この低下の率を評価することによって酵素
量を決定する。 1)試料の調製 ７５０μlの０.１Ｍリン酸/クエン酸緩衝液(ｐＨ３.０)
に２００μlの検体(培養上清または精製中間原料)を加
え、これに最終濃度２０μｇ/mlのプラスミノーゲンま
たはＬｙｓプラスミノーゲン５０μlを添加し、３７℃
で１時間反応させた。反応液は、２０Ｕ/mlアプロチニ
ン、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液で希釈し、これをＥ
ＬＩＳＡの試料とした。
【００４０】2)ＥＬＩＳＡの操作 リン酸緩衝液からなる抗体希釈液に抗ヒトＬＢＳＩ抗体
を２０μｇ/mlになるように溶解し、これを９６ウエル
マイクロタイタープレート(IMMUNO MODULE MAXISORP F
8、ヌンク社製）に１ウエルあたり１００μlずつ添加し
４℃で一晩放置した。各ウエルより上記抗体液をマイク
ロタイタープレート洗浄機( DIATECH社製, ULTRA WASH
II)で吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後１％アルブミン
(AlbuminFraction V, Bovine、生化学工業社製)溶解液
を３００μl添加し、４℃で一晩放置した。アルブミン
溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗浄し測定用ウエ
ルとした。別に、ペルオキシダーゼ標識した抗ｍＰｌ
ｇ.抗体を０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝
液(ｐＨ７.２)で希釈した溶液(２０ｎｇＨＲＰconjugat
e/ml)を準備した。測定用ウエルに上記の方法で調製し
た試料を１ウエルあたり１００μl入れ、３７℃で１時
間放置し反応させた。各ウエル中の反応液を吸引除去
し、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ｐＨ７.
２)で４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗ｍＰ
ｌｇ.抗体溶解液を１００μl入れ、３７℃で３０分間放
置し反応させた。各ウエルの反応液を吸引除去し、０.
０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)で4回洗浄後、基質液(ＯＰＤ/Ｈ2Ｏ2)１００μlを各
ウエルに添加後２０分間室温遮光下で放置した後、２Ｎ
硫酸を各ウエルに１００μlずつ加え反応を停止した
後、プレートリーダー(WAKO Molecular Devices, THRMO
max microplate reader)で４９０ｎｍの吸光度を測定
した。
を２０μｇ/mlになるように溶解し、これを９６ウエル
マイクロタイタープレート(IMMUNO MODULE MAXISORP F
8、ヌンク社製）に１ウエルあたり１００μlずつ添加し
４℃で一晩放置した。各ウエルより上記抗体液をマイク
ロタイタープレート洗浄機( DIATECH社製, ULTRA WASH
II)で吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後１％アルブミン
(AlbuminFraction V, Bovine、生化学工業社製)溶解液
を３００μl添加し、４℃で一晩放置した。アルブミン
溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗浄し測定用ウエ
ルとした。別に、ペルオキシダーゼ標識した抗ｍＰｌ
ｇ.抗体を０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝
液(ｐＨ７.２)で希釈した溶液(２０ｎｇＨＲＰconjugat
e/ml)を準備した。測定用ウエルに上記の方法で調製し
た試料を１ウエルあたり１００μl入れ、３７℃で１時
間放置し反応させた。各ウエル中の反応液を吸引除去
し、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ｐＨ７.
２)で４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した抗ｍＰ
ｌｇ.抗体溶解液を１００μl入れ、３７℃で３０分間放
置し反応させた。各ウエルの反応液を吸引除去し、０.
０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)で4回洗浄後、基質液(ＯＰＤ/Ｈ2Ｏ2)１００μlを各
ウエルに添加後２０分間室温遮光下で放置した後、２Ｎ
硫酸を各ウエルに１００μlずつ加え反応を停止した
後、プレートリーダー(WAKO Molecular Devices, THRMO
max microplate reader)で４９０ｎｍの吸光度を測定
した。
【００４１】（ＥＬＩＳＡの結果）ＰＣ−３培養上清の
希釈系を本願発明の酵素測定系で測定した結果を図１２
に示した。図１２の上図白丸は基質にプラスミノーゲン
を用いたもの、黒丸はＬｙｓプラスミノーゲンを用いた
ものである。ＰＣ−３培養上清中のプラスミノーゲン断
片化酵素は経時的に両基質を切断した。図に示されるよ
うに、反応初期においてＬｙｓプラスミノーゲンが早期
に切断される傾向が認められたが、１０分以降Ｇｌｕプ
ラスミノーゲンとＬｙｓプラスミノーゲンの切断の差は
減少することが判明した。図１２の下図はプラスミノー
ゲンが切断されていく様子を電気泳動図を用いて示した
ものである。以上の結果はＰＡＣＥ４は一旦ミニプラス
ミノーゲン部を切断した後、クリングル部を析出するこ
とを示しており、基質としてはＧｌｕ、Ｌｙｓのどちら
のタイプのプラスミノーゲンでもその測定値は同一であ
ることを示す。本願発明者らは便宜上、本測定系の基質
をＬｙｓプラスミノーゲンに固定し、酵素活性はこのＬ
ｙｓプラスミノーゲン１０μｇを１分間に分解する酵素
量を１単位として定義した。
希釈系を本願発明の酵素測定系で測定した結果を図１２
に示した。図１２の上図白丸は基質にプラスミノーゲン
を用いたもの、黒丸はＬｙｓプラスミノーゲンを用いた
ものである。ＰＣ−３培養上清中のプラスミノーゲン断
片化酵素は経時的に両基質を切断した。図に示されるよ
うに、反応初期においてＬｙｓプラスミノーゲンが早期
に切断される傾向が認められたが、１０分以降Ｇｌｕプ
ラスミノーゲンとＬｙｓプラスミノーゲンの切断の差は
減少することが判明した。図１２の下図はプラスミノー
ゲンが切断されていく様子を電気泳動図を用いて示した
ものである。以上の結果はＰＡＣＥ４は一旦ミニプラス
ミノーゲン部を切断した後、クリングル部を析出するこ
とを示しており、基質としてはＧｌｕ、Ｌｙｓのどちら
のタイプのプラスミノーゲンでもその測定値は同一であ
ることを示す。本願発明者らは便宜上、本測定系の基質
をＬｙｓプラスミノーゲンに固定し、酵素活性はこのＬ
ｙｓプラスミノーゲン１０μｇを１分間に分解する酵素
量を１単位として定義した。
【００４２】実施例８ （プラスミノーゲン分解酵素の精製）本願発明の酵素
(ＰＡＣＥ４)は、疎水クロマトグラフィー、陰イオンク
ロマトグラフィー、ゲル濾過及びハイドロキシアパタイ
トの各種クロマトグラフィーを組み合わせることによっ
て精製した。実施例１の方法で得られた酵素原液５Lを
５０mMＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.４)で２倍に希釈後、５
０mM Ｔｒｉｓ/５０mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)緩衝液で平
衡化したＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ(φ５x１５０m
m、ファルマシア社製)に通液し、さらに同緩衝液で平衡
化したヘパリン-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ(φ２.５x１０
０mm、ファルマシア社製)に通液し、ＰＡＣＥ４の粗精
製溶液を調製した。得られた粗精製溶液に１Ｍの硫酸ア
ンモニウムを加え一晩静置した後、４℃で６,０００ｒ
ｐｍの遠心処理を行いその遠心上清を得た。遠心上清を
さらに２５μｍの孔サイズを有する濾紙(ＡＰ-２５: ア
ミコン社製)で濾過し、濾液を１Ｍの硫酸アンモニウム
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)で平衡化した
Ｐｈｅｎｙｌ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｐｅｒｆｏｒｍ
ａｎｃｅ(φ２.５x１００mm、ファルマシア社製)で処理
し、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)で濃度勾配溶出した。その後、さらに４０％エチレ
ングリコールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)
で溶出した。活性画分(５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)及び４０％エチレングリコールを含む同緩衝液にて
溶出)を集め、同画分を大過剰の１０mMＴｒｉｓ緩衝液
(ｐＨ７.４)で透析した。透析後、液を５０mMＴｒｉｓ
緩衝液(ｐＨ７.４)で平衡化したＱ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｈｉｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ(φ１.５x１００mm、ファ
ルマシア社製)で処理し、１ＭＮａＣｌを含む同緩衝液
で濃度勾配溶出した。活性画分を集め、限外濾過膜(Ｙ
Ｍ-１０: アミコン社製)で濃縮後、５０ｍＭＴｒｉｓ/
１００mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)緩衝液で平衡化したＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ-２００(φ２.５x１００ｃm、ファル
マシア社製)に通液しゲル濾過を実施した。分子量５０,
０００〜６０,０００相応付近に溶出されるピークを分
取し、さらにＱ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ(φ１.５x１００mm、ファルマシア社製)のク
ロマトグラフィーを上記の条件で実施して活性画分を調
製した。得られた活性画分は最終的に２０ｍＭリン酸緩
衝液(ｐＨ７.４)で透析した後、同緩衝液で平衡化した
ハイドロキシアパタイト(φ２.５x１００mm、バイオラ
ッド社製)に通液し、２００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
４)の濃度勾配溶出を用いて精製した。精製した蛋白質
は分子量が４２〜４５ｋＤａ(還元型)に相当するバンド
として認められた。精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図４に
示した。ＰＡＣＥ４は分子量４２〜４５ｋＤａ(還元型:
試料をメルカプトエタノールで処理したもの)の蛋白質
として認められた。
(ＰＡＣＥ４)は、疎水クロマトグラフィー、陰イオンク
ロマトグラフィー、ゲル濾過及びハイドロキシアパタイ
トの各種クロマトグラフィーを組み合わせることによっ
て精製した。実施例１の方法で得られた酵素原液５Lを
５０mMＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.４)で２倍に希釈後、５
０mM Ｔｒｉｓ/５０mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)緩衝液で平
衡化したＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ(φ５x１５０m
m、ファルマシア社製)に通液し、さらに同緩衝液で平衡
化したヘパリン-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ(φ２.５x１０
０mm、ファルマシア社製)に通液し、ＰＡＣＥ４の粗精
製溶液を調製した。得られた粗精製溶液に１Ｍの硫酸ア
ンモニウムを加え一晩静置した後、４℃で６,０００ｒ
ｐｍの遠心処理を行いその遠心上清を得た。遠心上清を
さらに２５μｍの孔サイズを有する濾紙(ＡＰ-２５: ア
ミコン社製)で濾過し、濾液を１Ｍの硫酸アンモニウム
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)で平衡化した
Ｐｈｅｎｙｌ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｐｅｒｆｏｒｍ
ａｎｃｅ(φ２.５x１００mm、ファルマシア社製)で処理
し、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)で濃度勾配溶出した。その後、さらに４０％エチレ
ングリコールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)
で溶出した。活性画分(５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
２)及び４０％エチレングリコールを含む同緩衝液にて
溶出)を集め、同画分を大過剰の１０mMＴｒｉｓ緩衝液
(ｐＨ７.４)で透析した。透析後、液を５０mMＴｒｉｓ
緩衝液(ｐＨ７.４)で平衡化したＱ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｈｉｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ(φ１.５x１００mm、ファ
ルマシア社製)で処理し、１ＭＮａＣｌを含む同緩衝液
で濃度勾配溶出した。活性画分を集め、限外濾過膜(Ｙ
Ｍ-１０: アミコン社製)で濃縮後、５０ｍＭＴｒｉｓ/
１００mM ＮａＣｌ(ｐＨ７.４)緩衝液で平衡化したＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ-２００(φ２.５x１００ｃm、ファル
マシア社製)に通液しゲル濾過を実施した。分子量５０,
０００〜６０,０００相応付近に溶出されるピークを分
取し、さらにＱ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ(φ１.５x１００mm、ファルマシア社製)のク
ロマトグラフィーを上記の条件で実施して活性画分を調
製した。得られた活性画分は最終的に２０ｍＭリン酸緩
衝液(ｐＨ７.４)で透析した後、同緩衝液で平衡化した
ハイドロキシアパタイト(φ２.５x１００mm、バイオラ
ッド社製)に通液し、２００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.
４)の濃度勾配溶出を用いて精製した。精製した蛋白質
は分子量が４２〜４５ｋＤａ(還元型)に相当するバンド
として認められた。精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図４に
示した。ＰＡＣＥ４は分子量４２〜４５ｋＤａ(還元型:
試料をメルカプトエタノールで処理したもの)の蛋白質
として認められた。
【００４３】（ＰＡＣＥ４のＮ末端アミノ酸残基の分析
および同定）ＰＣ−３培養上清より調製した本願発明の
酵素はＧＶＤＦ膜(イモビロン、ミリポア社製)にトラン
スブロットしたものをアミノ酸シーケンサー( Applied
Biosystem Model 477A protein sequencer)で分析し
た。当該酵素のＮ末端アミノ酸分析の結果はＬＶＲＩＰ
ＬＨＫＦＴでありホモロジー検索の結果、ヒトカテプシ
ンＤ前駆体(Human Cathepsin D precursor)のそれと一
致した。
および同定）ＰＣ−３培養上清より調製した本願発明の
酵素はＧＶＤＦ膜(イモビロン、ミリポア社製)にトラン
スブロットしたものをアミノ酸シーケンサー( Applied
Biosystem Model 477A protein sequencer)で分析し
た。当該酵素のＮ末端アミノ酸分析の結果はＬＶＲＩＰ
ＬＨＫＦＴでありホモロジー検索の結果、ヒトカテプシ
ンＤ前駆体(Human Cathepsin D precursor)のそれと一
致した。
【００４４】実施例９ （本願発明の酵素によるプラスミノーゲン断片の調製）
本願発明の酵素によるプラスミノーゲン断片の調製は、
Ｌｙｓプラスミノーゲンと本願酵素をインキュベーショ
ンした後、反応液をリジンアフィニティークロマトグラ
フィーで分離することによって調製した。５０mM Ｔｒ
ｉｓ/０.１５MＮａＣｌ(ｐＨ８.０)からなる緩衝液中に
Ｌｙｓプラスミノーゲンと本願酵素が１００:１の割合
になるように混合した後、３７℃で３時間反応させた。
反応液は同緩衝液で平衡化したLysine Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ 4B（φ１０x１５ｍｍ)に通液し、洗浄後、０.１M
イプシロンアミノカプロン酸を含む同緩衝液で溶出し
た。また、プラスミノーゲンを用いた場合の断片の調製
に関しては、３７℃で一晩反応させ、以下同様に操作し
た。得られた画分は０.１M炭酸アンモニウムで透析した
後凍結乾燥し、使用時まで−８０℃で保存した。
本願発明の酵素によるプラスミノーゲン断片の調製は、
Ｌｙｓプラスミノーゲンと本願酵素をインキュベーショ
ンした後、反応液をリジンアフィニティークロマトグラ
フィーで分離することによって調製した。５０mM Ｔｒ
ｉｓ/０.１５MＮａＣｌ(ｐＨ８.０)からなる緩衝液中に
Ｌｙｓプラスミノーゲンと本願酵素が１００:１の割合
になるように混合した後、３７℃で３時間反応させた。
反応液は同緩衝液で平衡化したLysine Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ 4B（φ１０x１５ｍｍ)に通液し、洗浄後、０.１M
イプシロンアミノカプロン酸を含む同緩衝液で溶出し
た。また、プラスミノーゲンを用いた場合の断片の調製
に関しては、３７℃で一晩反応させ、以下同様に操作し
た。得られた画分は０.１M炭酸アンモニウムで透析した
後凍結乾燥し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００４５】実施例１０ （本願発明の酵素によって生成したプラスミノーゲン断
片）本願発明の酵素により生成したプラスミノーゲンク
リングル１〜４を含むプラスミノーゲン断片を１２.５
％のＳＤＳポリアクリルアミドで電気泳動し、クマシー
染色した結果を図１３に示した。２-メルカプトエタノ
ールで処理した(還元型)プラスミノーゲン断片につい
て、５５ｋＤａと６３ｋＤａの分子量に相当する２本の
バンドが認められた。また、２-メルカプトエタノール
で処理していない(非還元型)プラスミノーゲン断片は還
元型の分子種に相当する４０ｋＤａと４３ｋＤａにわた
る２本のバンドが認められた。
片）本願発明の酵素により生成したプラスミノーゲンク
リングル１〜４を含むプラスミノーゲン断片を１２.５
％のＳＤＳポリアクリルアミドで電気泳動し、クマシー
染色した結果を図１３に示した。２-メルカプトエタノ
ールで処理した(還元型)プラスミノーゲン断片につい
て、５５ｋＤａと６３ｋＤａの分子量に相当する２本の
バンドが認められた。また、２-メルカプトエタノール
で処理していない(非還元型)プラスミノーゲン断片は還
元型の分子種に相当する４０ｋＤａと４３ｋＤａにわた
る２本のバンドが認められた。
【００４６】得られたプラスミノーゲン断片について、
そのＮ末端アミノ酸残基を分析した。Ｌｙｓプラスミノ
ーゲンを基質とした場合およびプラスミノーゲンを基質
とした場合のＮ末端アミノ酸残基はともに７７Ｌｙｓで
あった。
そのＮ末端アミノ酸残基を分析した。Ｌｙｓプラスミノ
ーゲンを基質とした場合およびプラスミノーゲンを基質
とした場合のＮ末端アミノ酸残基はともに７７Ｌｙｓで
あった。
【００４７】実施例１１ (免疫不全動物を用いたＰＡＣＥ４の抗癌増殖抑制作用) １. 癌細胞 ルイス肺癌細胞(ＬＬ/２)は大日本製薬より購入し、ル
イス肺癌細胞(３ＬＬ)は東北大学加齢医学研究所医用細
胞資源センターより分与を受けた。各細胞は１０％ＦＢ
Ｓを含むＲＰＭＩ-１６４０/HighGlucose培地(大日本製
薬社製)で、３７℃、５％ＣＯ2条件下で維持、培養し
た。 ２.マウス ６週齢のＣ５７Ｂ１マウスは九州動物より購入し、免疫
不全(Ｓｃｉｄ)マウスはチャールズリバー社より購入し
た。各動物とも、４〜５匹/ケージで１週間、無菌施設
で馴化し飼育した後に実験に供した。
イス肺癌細胞(３ＬＬ)は東北大学加齢医学研究所医用細
胞資源センターより分与を受けた。各細胞は１０％ＦＢ
Ｓを含むＲＰＭＩ-１６４０/HighGlucose培地(大日本製
薬社製)で、３７℃、５％ＣＯ2条件下で維持、培養し
た。 ２.マウス ６週齢のＣ５７Ｂ１マウスは九州動物より購入し、免疫
不全(Ｓｃｉｄ)マウスはチャールズリバー社より購入し
た。各動物とも、４〜５匹/ケージで１週間、無菌施設
で馴化し飼育した後に実験に供した。
【００４８】６週齢の免疫不全マウスにルイス肺癌細胞
(ＬＬ/２)を１０6cells背部皮下に移植し、１４〜１７
日間飼育して形成される背部の癌(原発巣)を術的に切除
し、その原発巣の大きさを基に２群に分類した。原発巣
１２００ｍｇ以下群(原発巣２００ｍｇ〜１２００ｍｇ)
と１２００ｍｇ以上群(原発巣１２０１ｍｇ〜２５００
ｍｇ)をそれぞれ３群に分け、本願発明酵素(ＰＡＣＥ
４)高投与群、本願発明酵素(ＰＡＣＥ４)低投与群及び
対照群とした。術後４日飼育後、各々の群に対してＰＡ
ＣＥ４を１０μｇ/匹、２μｇ/匹及び生理食塩水１００
μｌで毎日１０日間腹腔内投与を行った。その後マウス
を解剖して肺の重量を測定した。結果を図９に示した。
図中、Ａは原発巣重量１２００ｍｇ以下群へのＰＡＣＥ
４投与を、Ｂは原発巣１２００ｍｇ以上群への投与を示
す。なお、点線は正常マウスの肺重量を示す。図のよう
に１２００ｍｇ以下群においては肺重量で対照群との差
異を認めなかったが、１２００ｍｇ以上群ではＰＡＣＥ
４投与の量依存的な肺重量の抑制(転移増殖巣の増殖抑
制)作用が認められた。
(ＬＬ/２)を１０6cells背部皮下に移植し、１４〜１７
日間飼育して形成される背部の癌(原発巣)を術的に切除
し、その原発巣の大きさを基に２群に分類した。原発巣
１２００ｍｇ以下群(原発巣２００ｍｇ〜１２００ｍｇ)
と１２００ｍｇ以上群(原発巣１２０１ｍｇ〜２５００
ｍｇ)をそれぞれ３群に分け、本願発明酵素(ＰＡＣＥ
４)高投与群、本願発明酵素(ＰＡＣＥ４)低投与群及び
対照群とした。術後４日飼育後、各々の群に対してＰＡ
ＣＥ４を１０μｇ/匹、２μｇ/匹及び生理食塩水１００
μｌで毎日１０日間腹腔内投与を行った。その後マウス
を解剖して肺の重量を測定した。結果を図９に示した。
図中、Ａは原発巣重量１２００ｍｇ以下群へのＰＡＣＥ
４投与を、Ｂは原発巣１２００ｍｇ以上群への投与を示
す。なお、点線は正常マウスの肺重量を示す。図のよう
に１２００ｍｇ以下群においては肺重量で対照群との差
異を認めなかったが、１２００ｍｇ以上群ではＰＡＣＥ
４投与の量依存的な肺重量の抑制(転移増殖巣の増殖抑
制)作用が認められた。
【００４９】実施例１２ （ＰＡＣＥ４で切断したプラスミノーゲン断片の担癌動
物への投与）６週齢のＣ５７Ｂ１マウスの背部皮下にル
イス肺癌(ＬＬ/２)細胞を１０6cells移植し、１４〜１
７日間飼育し、背部の癌(原発巣)が３００〜１２００ｍ
ｇに達した時点で原発巣を術的に切除し、消毒後患部を
縫合した。さらにマウスを１４日間飼育した後、１０日
間ＰＡＣＥ４で切断したプラスミノーゲン断片を２５μ
ｇ/匹で腹腔内投与した。１１日目にマウスを解剖して
肺を摘出し、肺の重量を測定した。対照群の肺重量が
０.４４±０.２８ｇ(ｎ=６)であるのに対して、プラス
ミノーゲン断片投与群の肺重量は０.２３±０.０８ｇ
(ｎ=６)であり、プラスミノーゲン断片投与群が有意に
ＬＬ/２細胞の肺転移増殖後の増殖を抑制することが認
められた。
物への投与）６週齢のＣ５７Ｂ１マウスの背部皮下にル
イス肺癌(ＬＬ/２)細胞を１０6cells移植し、１４〜１
７日間飼育し、背部の癌(原発巣)が３００〜１２００ｍ
ｇに達した時点で原発巣を術的に切除し、消毒後患部を
縫合した。さらにマウスを１４日間飼育した後、１０日
間ＰＡＣＥ４で切断したプラスミノーゲン断片を２５μ
ｇ/匹で腹腔内投与した。１１日目にマウスを解剖して
肺を摘出し、肺の重量を測定した。対照群の肺重量が
０.４４±０.２８ｇ(ｎ=６)であるのに対して、プラス
ミノーゲン断片投与群の肺重量は０.２３±０.０８ｇ
(ｎ=６)であり、プラスミノーゲン断片投与群が有意に
ＬＬ/２細胞の肺転移増殖後の増殖を抑制することが認
められた。
【００５０】実施例１３ （血管内皮細胞増殖阻害試験）血管内皮細胞増殖抑制試
験はＧａｔｅｌｙ等の方法に従いヒト臍帯静脈血管内皮
細胞(ＨＵＶＥＣ;Human Umbilical vein endothelial
(HUV)cell、三光純薬)を用いた系で評価した。ＨＵＶＥ
Ｃは２４ウエルプレート(Nunclone, Nunc社製)に１２,
５００細胞/ウエルで播種し、キットに添付の培養液で
一晩培養した後、１,１０,５０,１００μｇ/mlの当該プ
ラスミノーゲン断片(対照としては生理食塩液)を加え、
５％ＣＯ2条件下、７２時間、３７℃で培養した。トリ
プシン/ ＥＤＴＡ溶液で細胞をウエルから剥離させ、コ
ールターカウンター(コールター社製)で細胞数を計測し
た。また、同様にＯ'Ｒｅｉｌｌｙ等の方法に従いウシ
大動脈血管内皮細胞を用いた系によっても当該プラスミ
ノーゲン断片を評価した。ウシ大動脈血管内皮細胞(Bov
ine aota endothelial(BAE) cell)は三晃純薬より購入
したものを用い、ゼラチンでコートした２４ウエルプレ
ート(岩城硝子社製)上で、１０％ウシ胎児血清(ＦＣ
Ｓ)、３ｎｇ/ｍｌ塩基性ＦＧＦ(ｂＦＧＦ)、１％グルタ
ミン、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを含む
ＤＭＥＭ基礎培地中、５％ＣＯ2の条件で維持培養を行
った。２４ウエルのゼラチンコートプレートにＢＡＥ細
胞を１２,５００細胞/ウエルで播種し、ｂＦＧＦを除い
た基礎培地で２４時間培養した後、ｂＦＧＦを除いた５
％ＦＣＳ含有基礎培地に当該プラスミノーゲン断片を１
００μｇ/ｍｌになるよう希釈した培養液に交換し、２
０分間３７℃で反応させた。ここで、陰性コントロール
として生理食塩液を、陽性コントロールとしてアンジオ
スタチン(Angiostatin、テクノクローン社製)を用い
た。反応後、５％ＦＣＳ、２ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦを含む
基礎培地を加え、３７℃で７２時間さらに培養した。ト
リプシン/ ＥＤＴＡ溶液で細胞をウエルから剥離させ、
コールターカウンター(コールター社製)で細胞数を計測
した。
験はＧａｔｅｌｙ等の方法に従いヒト臍帯静脈血管内皮
細胞(ＨＵＶＥＣ;Human Umbilical vein endothelial
(HUV)cell、三光純薬)を用いた系で評価した。ＨＵＶＥ
Ｃは２４ウエルプレート(Nunclone, Nunc社製)に１２,
５００細胞/ウエルで播種し、キットに添付の培養液で
一晩培養した後、１,１０,５０,１００μｇ/mlの当該プ
ラスミノーゲン断片(対照としては生理食塩液)を加え、
５％ＣＯ2条件下、７２時間、３７℃で培養した。トリ
プシン/ ＥＤＴＡ溶液で細胞をウエルから剥離させ、コ
ールターカウンター(コールター社製)で細胞数を計測し
た。また、同様にＯ'Ｒｅｉｌｌｙ等の方法に従いウシ
大動脈血管内皮細胞を用いた系によっても当該プラスミ
ノーゲン断片を評価した。ウシ大動脈血管内皮細胞(Bov
ine aota endothelial(BAE) cell)は三晃純薬より購入
したものを用い、ゼラチンでコートした２４ウエルプレ
ート(岩城硝子社製)上で、１０％ウシ胎児血清(ＦＣ
Ｓ)、３ｎｇ/ｍｌ塩基性ＦＧＦ(ｂＦＧＦ)、１％グルタ
ミン、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを含む
ＤＭＥＭ基礎培地中、５％ＣＯ2の条件で維持培養を行
った。２４ウエルのゼラチンコートプレートにＢＡＥ細
胞を１２,５００細胞/ウエルで播種し、ｂＦＧＦを除い
た基礎培地で２４時間培養した後、ｂＦＧＦを除いた５
％ＦＣＳ含有基礎培地に当該プラスミノーゲン断片を１
００μｇ/ｍｌになるよう希釈した培養液に交換し、２
０分間３７℃で反応させた。ここで、陰性コントロール
として生理食塩液を、陽性コントロールとしてアンジオ
スタチン(Angiostatin、テクノクローン社製)を用い
た。反応後、５％ＦＣＳ、２ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦを含む
基礎培地を加え、３７℃で７２時間さらに培養した。ト
リプシン/ ＥＤＴＡ溶液で細胞をウエルから剥離させ、
コールターカウンター(コールター社製)で細胞数を計測
した。
【００５１】（ＰＡＣＥ４によって調製されたプラスミ
ノーゲン断片の血管内皮細胞増殖抑制作用）ＰＡＣＥ４
によって調製されたプラスミノーゲン断片を０〜２０μ
ｇ/ｍｌで上述の血管内皮細胞に作用させたが、当該断
片に血管内皮細胞の増殖を抑制する作用は認められなか
った。一方、テクノクローン社より購入したアンジオス
タチンにはその増殖を抑制する作用が認められた。
ノーゲン断片の血管内皮細胞増殖抑制作用）ＰＡＣＥ４
によって調製されたプラスミノーゲン断片を０〜２０μ
ｇ/ｍｌで上述の血管内皮細胞に作用させたが、当該断
片に血管内皮細胞の増殖を抑制する作用は認められなか
った。一方、テクノクローン社より購入したアンジオス
タチンにはその増殖を抑制する作用が認められた。
【００５２】実施例１４ （ＰＡＣＥ４のE. coli.による発現(ｃＤＮＡ調製))Ｐ
ＡＣＥ４のＮ末端分析の結果は実施例８に示したよう
に、ｌｙｓｏｓｏｍｅ系の蛋白分解酵素であるカテプシ
ンＤの前駆体のアミノ酸配列と相同性が高く、カテプシ
ンＤ自体にもＰＡＣＥ４と同様の活性が認められたこと
から、ＰＡＣＥ４の活性の本態はカテプシンＤであろう
と推定された。この事実から、以下の手法によりＰＡＣ
Ｅ４のｃＤＮＡを単離した。 １. ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３中のメッセンジャーＲＮ
Ａの精製 ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ−３)約１６００万個からＩＳＯ
ＧＥＮ液(和光純薬社製)を用い、定法に従って細胞中の
全てのＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡからｏｌｉｇｏ
(ｄＴ)カラムを使用して最終的に２７μｇのｍＲＮＡを
精製した。精製したｍＲＮＡは、以下のｃＤＮＡ合成に
使用するまで１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍
量の冷エタノールを加え、−８０℃に保存した。 ２. ｃＤＮＡ合成と増幅 精製したｍＲＮＡ１μｇからＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社のＳ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用し、その手順書に従ってｏｌｉ
ｇｏ(ｄＴ)をプライマーとしてＰＡＣＥ４のｃＤＮＡを
合成した。次に、データベース上に公開されたカテプシ
ンＤ前駆体ｃＤＮＡの塩基配列より、ＰＡＣＥ４の遺伝
子全長翻訳領域を増幅するためのセンスとアンチセンス
プライマーを合成し、ＡｍｐｌｉＴａｑ(ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ社製)を用いて所望の遺伝子の増幅を行っ
た。 ３. ＰＡＣＥ４のｃＤＮＡ塩基配列の決定 ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)
を使用し、その手順書に従って増幅したｃＤＮＡ断片を
プラスミドベクターにクローニングした。得られたプラ
スミドを鋳型として、蛍光ラベルしたジデオキシヌクレ
オチドを使用した。ジデオキシターミネーター法により
塩基配列を決定した。決定した塩基配列とその配列によ
り推定されるアミノ酸配列を既知のヒトカテプシンＤ前
駆体と比較した結果、極めて相同性の高い配列であるこ
とが確認できた。
ＡＣＥ４のＮ末端分析の結果は実施例８に示したよう
に、ｌｙｓｏｓｏｍｅ系の蛋白分解酵素であるカテプシ
ンＤの前駆体のアミノ酸配列と相同性が高く、カテプシ
ンＤ自体にもＰＡＣＥ４と同様の活性が認められたこと
から、ＰＡＣＥ４の活性の本態はカテプシンＤであろう
と推定された。この事実から、以下の手法によりＰＡＣ
Ｅ４のｃＤＮＡを単離した。 １. ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３中のメッセンジャーＲＮ
Ａの精製 ヒト前立腺癌細胞(ＰＣ−３)約１６００万個からＩＳＯ
ＧＥＮ液(和光純薬社製)を用い、定法に従って細胞中の
全てのＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡからｏｌｉｇｏ
(ｄＴ)カラムを使用して最終的に２７μｇのｍＲＮＡを
精製した。精製したｍＲＮＡは、以下のｃＤＮＡ合成に
使用するまで１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍
量の冷エタノールを加え、−８０℃に保存した。 ２. ｃＤＮＡ合成と増幅 精製したｍＲＮＡ１μｇからＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社のＳ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用し、その手順書に従ってｏｌｉ
ｇｏ(ｄＴ)をプライマーとしてＰＡＣＥ４のｃＤＮＡを
合成した。次に、データベース上に公開されたカテプシ
ンＤ前駆体ｃＤＮＡの塩基配列より、ＰＡＣＥ４の遺伝
子全長翻訳領域を増幅するためのセンスとアンチセンス
プライマーを合成し、ＡｍｐｌｉＴａｑ(ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ社製)を用いて所望の遺伝子の増幅を行っ
た。 ３. ＰＡＣＥ４のｃＤＮＡ塩基配列の決定 ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)
を使用し、その手順書に従って増幅したｃＤＮＡ断片を
プラスミドベクターにクローニングした。得られたプラ
スミドを鋳型として、蛍光ラベルしたジデオキシヌクレ
オチドを使用した。ジデオキシターミネーター法により
塩基配列を決定した。決定した塩基配列とその配列によ
り推定されるアミノ酸配列を既知のヒトカテプシンＤ前
駆体と比較した結果、極めて相同性の高い配列であるこ
とが確認できた。
【００５３】実施例１５ （癌患者血漿中のＰＡＣＥ４活性） ＰＡＣＥ４の活性測定の意義 実施例６に示したように、ＰＡＣＥ４は正常細胞では殆
どその細胞外へ放出されることがなく、ある種の癌細胞
で多く放出されるのが特徴である。このことは、ＰＡＣ
Ｅ４が癌状態を把握するうえで重要なマーカーとなる可
能性を示している。前述のように、ＰＡＣＥ４はヒトカ
テプシンＤ前駆体と極めて相同性が高く、ＰＡＣＥ４に
対する抗体はヒトカテプシンＤ前駆体及びその活性型で
あるヒトカテプシンに強く反応する。そのため、一般に
ヒトカテプシンに対する抗体を用いて測定された結果は
ＰＡＣＥ４にも反映させることが可能であり、癌とＰＡ
ＣＥ４の関係を知るうえで重要な情報である。この関係
については、乳癌を対象とした報告が最も多く、一般に
乳癌状態ではヒトカテプシンＤの抗原値が高く、ヒトカ
テプシンＤ量の上昇は乳癌を悪性化するというのが一般
的な認識である。しかし、実施例６に示した結果は、癌
の遠隔転移増殖巣の増殖を阻害する癌細胞であるルイス
肺癌や前立腺癌がプラスミノーゲンを断片化するＰＡＣ
Ｅ４活性を細胞外に多く放出するのに対して、乳癌細胞
(ＭＦＣ-７)にはその活性が殆どないことを示すもので
あり、乳癌においてはその抗原値とＰＡＣＥ４活性値に
大きな差異が認められることが類推された。ＰＡＣＥ４
の活性は断片化したプラスミノーゲン量をＥＬＩＳＡで
測定するものであり、カテプシンＤで用いられるヘモグ
ロビンの切断断片の色素を吸光度あるいは蛋白量で測定
する方法に比べ約１００〜１０００倍高感度である。そ
のため、血中に微量に存在するカテプシンＤ活性は従来
の方法では測定することができない。本願発明者等は、
実施例７に示したＰＡＣＥ４スクリーニング系を癌患者
血漿のＰＡＣＥ４活性測定に適用し、その活性値を測定
した。
どその細胞外へ放出されることがなく、ある種の癌細胞
で多く放出されるのが特徴である。このことは、ＰＡＣ
Ｅ４が癌状態を把握するうえで重要なマーカーとなる可
能性を示している。前述のように、ＰＡＣＥ４はヒトカ
テプシンＤ前駆体と極めて相同性が高く、ＰＡＣＥ４に
対する抗体はヒトカテプシンＤ前駆体及びその活性型で
あるヒトカテプシンに強く反応する。そのため、一般に
ヒトカテプシンに対する抗体を用いて測定された結果は
ＰＡＣＥ４にも反映させることが可能であり、癌とＰＡ
ＣＥ４の関係を知るうえで重要な情報である。この関係
については、乳癌を対象とした報告が最も多く、一般に
乳癌状態ではヒトカテプシンＤの抗原値が高く、ヒトカ
テプシンＤ量の上昇は乳癌を悪性化するというのが一般
的な認識である。しかし、実施例６に示した結果は、癌
の遠隔転移増殖巣の増殖を阻害する癌細胞であるルイス
肺癌や前立腺癌がプラスミノーゲンを断片化するＰＡＣ
Ｅ４活性を細胞外に多く放出するのに対して、乳癌細胞
(ＭＦＣ-７)にはその活性が殆どないことを示すもので
あり、乳癌においてはその抗原値とＰＡＣＥ４活性値に
大きな差異が認められることが類推された。ＰＡＣＥ４
の活性は断片化したプラスミノーゲン量をＥＬＩＳＡで
測定するものであり、カテプシンＤで用いられるヘモグ
ロビンの切断断片の色素を吸光度あるいは蛋白量で測定
する方法に比べ約１００〜１０００倍高感度である。そ
のため、血中に微量に存在するカテプシンＤ活性は従来
の方法では測定することができない。本願発明者等は、
実施例７に示したＰＡＣＥ４スクリーニング系を癌患者
血漿のＰＡＣＥ４活性測定に適用し、その活性値を測定
した。
【００５４】（癌患者血漿中のＰＡＣＥ４活性）乳癌、
肝臓癌、肺癌の各々の癌患者血漿及び正常人血漿を対象
として実施例７の方法に従いそのＰＡＣＥ４活性を測定
した。 １) 癌患者血漿の測定 マイクロ遠沈管に癌患者血漿を１００μl、１％ＥＤＴ
Ａを含む生理食塩液１００μl及びｐＨ修正液１００μl
を加え３７℃で一晩インキュベーションした。反応液を
１５,０００ｒｐｍで３分間遠心処理し、上清を得、こ
れを測定検体とした。測定検体を実施例７に示したＰＡ
ＣＥ活性測定用ＥＬＩＳＡで測定した。また、正常人血
漿１００μl、ＰＡＣＥ４/１００μl(０〜５０unit)、
ｐＨ修正液１００μlを加え３７℃で一晩インキュベー
ションし、以下同様の操作を行い、得られる測定値で検
量線を作成した。なお、本測定では血漿中に存在する内
在性のプラスミノーゲンを基質として用いているため、
内在量のプラスミノーゲンはプラスミノーゲン定量用Ｅ
ＬＩＳＡを用いて測定し、一定量とした。
肝臓癌、肺癌の各々の癌患者血漿及び正常人血漿を対象
として実施例７の方法に従いそのＰＡＣＥ４活性を測定
した。 １) 癌患者血漿の測定 マイクロ遠沈管に癌患者血漿を１００μl、１％ＥＤＴ
Ａを含む生理食塩液１００μl及びｐＨ修正液１００μl
を加え３７℃で一晩インキュベーションした。反応液を
１５,０００ｒｐｍで３分間遠心処理し、上清を得、こ
れを測定検体とした。測定検体を実施例７に示したＰＡ
ＣＥ活性測定用ＥＬＩＳＡで測定した。また、正常人血
漿１００μl、ＰＡＣＥ４/１００μl(０〜５０unit)、
ｐＨ修正液１００μlを加え３７℃で一晩インキュベー
ションし、以下同様の操作を行い、得られる測定値で検
量線を作成した。なお、本測定では血漿中に存在する内
在性のプラスミノーゲンを基質として用いているため、
内在量のプラスミノーゲンはプラスミノーゲン定量用Ｅ
ＬＩＳＡを用いて測定し、一定量とした。
【００５５】２) 結果 癌患者血漿中の当該酵素活性は０.７３±０.６ｕｎｉｔ
(ｎ＝３０)であり、健常人の０.０２±０.１ｕｎｉｔ
(ｎ＝６)に比べ有意に高値であることが認められた。癌
の種類別の結果としては、乳癌０.６６±０.０３ｕｎｉ
ｔ(ｎ＝６)、肝臓癌０.６９±０.０３ｕｎｉｔ(ｎ＝
８)、肺癌０.７７±０.０４ｕｎｉｔ(ｎ＝１０)、その
他０.７０±０.０７ｕｎｉｔ(ｎ＝１３)であり、各癌の
間で測定値に差異は認められなかった。
(ｎ＝３０)であり、健常人の０.０２±０.１ｕｎｉｔ
(ｎ＝６)に比べ有意に高値であることが認められた。癌
の種類別の結果としては、乳癌０.６６±０.０３ｕｎｉ
ｔ(ｎ＝６)、肝臓癌０.６９±０.０３ｕｎｉｔ(ｎ＝
８)、肺癌０.７７±０.０４ｕｎｉｔ(ｎ＝１０)、その
他０.７０±０.０７ｕｎｉｔ(ｎ＝１３)であり、各癌の
間で測定値に差異は認められなかった。
【００５６】実施例１６ （ＰＡＣＥ４による他の血管新生抑制因子の産生）フィ
ブロネクチンはＲｏｕｓｌａｈｔｉ等の方法(Ｍｅｔｈ
ｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ. Ｖｏｌ.８２, ｐ.８０３−８３
１)に従い、ゼラチンをリ癌ドとしたレジンを用い精製
した。新鮮凍結血漿５００ｍｌを凍結融解して得られる
浮遊沈殿物(クリオプレシピテート)を２００ｍｌのＰＢ
Ｓで溶解し、同液をさらに４℃で一晩静置した。引き続
き同液を１０,０００ｒｐｍで遠心処理し、澄明感のあ
る沈殿物を得た。沈殿物を室温でＰＢＳで溶解後、ゼラ
チンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに通液し、充分に洗浄し
た後、４Ｍ尿素を含むＰＢＳで溶出した。得られたフィ
ブロネクチンはさらにＳｅｐａｃｒｙｌ ＨＲ５００(フ
ァルマシア社製)でゲル濾過を行った後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでその純度を確認し、使用時まで−８０℃で保存し
た。ビトロネクチン、ヒト肝臓細胞増殖因子(ＨＧＦ)は
ベクトンディッキンソン社及びカルビオケム社より購入
した。上述の蛋白質を０.１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液
とし、ｐＨを４.０に調整後、ＰＡＣＥ４と蛋白質が２
００：１になるように本願発明の酵素を加え３７℃で一
晩反応させた。反応液に０.５Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ
７.０)を加えて反応を停止させた後同液をＰＢＳに透析
して無菌濾過したものを検体とした。
ブロネクチンはＲｏｕｓｌａｈｔｉ等の方法(Ｍｅｔｈ
ｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ. Ｖｏｌ.８２, ｐ.８０３−８３
１)に従い、ゼラチンをリ癌ドとしたレジンを用い精製
した。新鮮凍結血漿５００ｍｌを凍結融解して得られる
浮遊沈殿物(クリオプレシピテート)を２００ｍｌのＰＢ
Ｓで溶解し、同液をさらに４℃で一晩静置した。引き続
き同液を１０,０００ｒｐｍで遠心処理し、澄明感のあ
る沈殿物を得た。沈殿物を室温でＰＢＳで溶解後、ゼラ
チンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに通液し、充分に洗浄し
た後、４Ｍ尿素を含むＰＢＳで溶出した。得られたフィ
ブロネクチンはさらにＳｅｐａｃｒｙｌ ＨＲ５００(フ
ァルマシア社製)でゲル濾過を行った後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでその純度を確認し、使用時まで−８０℃で保存し
た。ビトロネクチン、ヒト肝臓細胞増殖因子(ＨＧＦ)は
ベクトンディッキンソン社及びカルビオケム社より購入
した。上述の蛋白質を０.１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液
とし、ｐＨを４.０に調整後、ＰＡＣＥ４と蛋白質が２
００：１になるように本願発明の酵素を加え３７℃で一
晩反応させた。反応液に０.５Ｍのリン酸緩衝液(ｐＨ
７.０)を加えて反応を停止させた後同液をＰＢＳに透析
して無菌濾過したものを検体とした。
【００５７】実施例１７ （フィブロネクチンの断片化と血管新生阻害作用）実施
例１３の方法で、試験検体をフィブロネクチン及びフィ
ブロネクチン断片に換え、その血管内皮細胞増殖に関わ
る影響について検討した。図１４に各種条件でＰＡＣＥ
４とフィブロネクチンを接触した後の反応液の電気泳動
図を示した。図中のレーン１は未処理のフィブロネクチ
ンを、レーン２はフィブロネクチンをｐＨ４.０の条件
で１２時間反応させた反応液を、レーン３はフィブロネ
クチンとＰＡＣＥ４を混合しｐＨ４.０の条件で１２時
間反応させた反応液を泳動した結果を示す。また、フィ
ブロネクチンをＰＡＣＥ４によって断片化した産物を血
管内皮細胞に作用させた結果を図１５に示した。図のよ
うにＰＡＣＥ４で断片化していないフィブロネクチンが
全くその増殖を抑制しないのに対し、ＰＡＣＥ４で断片
化したフィブロネクチン断片は血管内皮細胞の増殖を有
意に抑制した。
例１３の方法で、試験検体をフィブロネクチン及びフィ
ブロネクチン断片に換え、その血管内皮細胞増殖に関わ
る影響について検討した。図１４に各種条件でＰＡＣＥ
４とフィブロネクチンを接触した後の反応液の電気泳動
図を示した。図中のレーン１は未処理のフィブロネクチ
ンを、レーン２はフィブロネクチンをｐＨ４.０の条件
で１２時間反応させた反応液を、レーン３はフィブロネ
クチンとＰＡＣＥ４を混合しｐＨ４.０の条件で１２時
間反応させた反応液を泳動した結果を示す。また、フィ
ブロネクチンをＰＡＣＥ４によって断片化した産物を血
管内皮細胞に作用させた結果を図１５に示した。図のよ
うにＰＡＣＥ４で断片化していないフィブロネクチンが
全くその増殖を抑制しないのに対し、ＰＡＣＥ４で断片
化したフィブロネクチン断片は血管内皮細胞の増殖を有
意に抑制した。
【００５８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物：ヒト癌細胞 配列 Leu Val Arg Ile Pro Leu His Lys Phe Thr 1 5 10
【図１】ＰＣ−３培養上清とプラスミノーゲンを各種ｐ
Ｈで反応させた際のプラスミノーゲンの断片化を示す図
である。
Ｈで反応させた際のプラスミノーゲンの断片化を示す図
である。
【図２】プラスミノーゲン断片化酵素の測定方法の概念
を示す図である。
を示す図である。
【図３】ＰＣ−３培養上清を疎水クロマトグラフィーで
処理した際の溶出パターンを示す図である。
処理した際の溶出パターンを示す図である。
【図４】精製したＰＡＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動図
である。
である。
【図５】純化したＰＡＣＥ４を各種プロテアーゼインヒ
ビターと反応させその阻害様式を検討した結果を示す図
である。
ビターと反応させその阻害様式を検討した結果を示す図
である。
【図６】精製したＰＡＣＥ４とプラスミノーゲンをｐＨ
７.０とｐＨ４.０の条件下で反応させた際の切断様式を
示す図である。
７.０とｐＨ４.０の条件下で反応させた際の切断様式を
示す図である。
【図７】プラスミノーゲン(Ｇｌｕ−１)をＰＡＣＥ４で
切断した際の経時的な切断様式を示した図である。
切断した際の経時的な切断様式を示した図である。
【図８】ＰＡＣＥ４によるプラスミン活性の消失を示す
図である。
図である。
【図９】ＰＡＣＥ４の癌細胞転移増殖巣増殖抑制作用を
示す図である。
示す図である。
【図１０】各種癌細胞からのＰＡＣＥ４の産生について
の検討結果を示す図である。ＰＡＣＥ４活性をプラスミ
ノーゲンの分解量で示した。
の検討結果を示す図である。ＰＡＣＥ４活性をプラスミ
ノーゲンの分解量で示した。
【図１１】ＰＣ−３におけるプラスミノーゲンの分解に
ついての検討結果を示す図であり、Ａ)はＰＣ−３にお
いて産生されたプラスミノーゲン断片物のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの泳動図である。Ｂ)は抗ミニプラスミノーゲン抗
体、抗ＬＢＳ-Ｉ抗体を用いたウェスタンブロットの結
果を示す図である。
ついての検討結果を示す図であり、Ａ)はＰＣ−３にお
いて産生されたプラスミノーゲン断片物のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの泳動図である。Ｂ)は抗ミニプラスミノーゲン抗
体、抗ＬＢＳ-Ｉ抗体を用いたウェスタンブロットの結
果を示す図である。
【図１２】Ｇｌｕ−プラスミノーゲンとＬｙｓ−プラス
ミノーゲンのＰＡＣＥ４による切断の速度を比較した結
果を示す図である。
ミノーゲンのＰＡＣＥ４による切断の速度を比較した結
果を示す図である。
【図１３】ＰＡＣＥ４によって産生されたプラスミノー
ゲンクリングル１〜４を含む断片の泳動図である。
ゲンクリングル１〜４を含む断片の泳動図である。
【図１４】ＰＡＣＥ４によるフィブロネクチンの切断に
関し、各種条件でＰＡＣＥ４とフィブロネクチンを接触
した後の反応液の電気泳動図を示す。
関し、各種条件でＰＡＣＥ４とフィブロネクチンを接触
した後の反応液の電気泳動図を示す。
【図１５】フィブロネクチンをＰＡＣＥ４によって断片
化した産物を血管内皮細胞に作用させた結果を示す図で
ある。
化した産物を血管内皮細胞に作用させた結果を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/46 Ｃ０７Ｋ 14/745 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/18 Ｃ１２Ｎ 9/64 37/54 (72)発明者 野崎 周英 熊本県熊本市武蔵ケ丘５丁目26−１ (72)発明者 宮本 誠二 熊本県菊池郡西合志町須屋2066−８ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 GA18 HA01 HA03 4B050 CC01 DD11 FF04E FF05E FF10E FF12E LL01 LL05 4C084 AA02 BA44 DA40 DB62 DC02 DC10 ZA332 ZA362 ZB152 ZB262 4H045 AA10 AA30 CA41 DA01 DA65 DA89 EA22 EA23 EA24 EA28 FA70 GA30 HA05
Claims (14)
- 【請求項１】 癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断
片産生酵素。 - 【請求項２】 下記の性状を有する請求項１記載の血漿
蛋白断片産生酵素。 (ａ)非還元系ＳＤＳ電気泳動で約４５ｋＤａの分子量を
示し、(ｂ)Ｎ末端のアミノ酸残基がＬＶＲＩＰＬＨＫＦ
Ｔであって、(ｃ)ｐＨ５.０以下の酸性域で血漿蛋白に
作用して癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片を産
生し、そして(ｄ)カテプシンD前駆体と高い相同性を示
すアスパラギン酸酵素である。 - 【請求項３】 前記被断片化血漿蛋白が、プラスミノー
ゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びヒト肝細
胞増殖因子(ＨＧＦ)より選択される請求項１または請求
項２記載の血漿蛋白断片産生酵素。 - 【請求項４】 プラスミノーゲンの７３Ｌ−７４Ｆ及び
／または４５１Ｌ−４５２Ｐ間の結合を切断し、プラス
ミノーゲンのクリングル１〜４を含む断片を遊離させ得
る請求項1〜請求項３のいずれかに記載の血漿蛋白断片
産生酵素。 - 【請求項５】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
血漿蛋白断片産生酵素の作用によって産生される癌転移
増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片。 - 【請求項６】 プラスミノーゲン、フィブロネクチン、
ビトロネクチン及びヒト肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)より選
択される血漿蛋白に由来するものである請求項５記載の
血漿蛋白断片。 - 【請求項７】 プラスミノーゲンのクリングル１〜４を
含む断片よりなる請求項５または請求項６に記載の血漿
蛋白断片。 - 【請求項８】 フィブロネクチンヘパリン結合部を含む
断片よりなる請求項５または請求項６に記載の血漿蛋白
断片。 - 【請求項９】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
血漿蛋白断片産生酵素を作用させることを特徴とする、
癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片の調製方法。 - 【請求項10】 ヘパリン担体を利用したレジンを用いて
癌転移増殖抑制作用を有する血漿蛋白断片を特異的に分
離する工程を含む、請求項９記載の血漿蛋白断片の調製
方法。 - 【請求項11】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
血漿蛋白断片産生酵素を主たる構成成分とする、癌(固
形癌）、糖尿病性網膜症、リウマチ等血管新生に関与す
る病態の治療及び予防用薬剤。 - 【請求項12】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
血漿蛋白断片産生酵素を主たる構成成分とする癌の治療
及び予防用薬剤。 - 【請求項13】 請求項５〜請求項８のいずれかに記載の
血漿蛋白断片を主たる構成成分とする、癌(固形癌）、
糖尿病性網膜症、リウマチ等血管新生に関与する病態の
治療及び予防用薬剤。 - 【請求項14】 請求項５〜請求項８のいずれかに記載の
血漿蛋白断片を主たる構成成分とする癌の治療及び予防
用薬剤。
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