FR2944104A1 - Method for detection of non-toxic indocyanine green fluorescent marker in e.g. solid medium of biological cancer tissues of patient in neurology field, involves detecting time-resolved fluorescence signal of fluorescent marker - Google Patents
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Abstract
Description
1 EXTINCTION DE L'AUTOFLUORESCENCE DES TISSUS BIOLOGIQUES EN TOMOGRAPHIE RESOLUE EN TEMPS 1 EXTINCTION OF AUTOFLUORESCENCE OF BIOLOGICAL TISSUES IN TIME-RESOLVED TOMOGRAPHY
DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR L'invention concerne le domaine de l'imagerie optique appliquée au domaine médical et notamment de l'imagerie de fluorescence in vivo et ex-vivo. TECHNICAL FIELD AND PRIOR ART The invention relates to the field of optical imaging applied to the medical field and in particular to fluorescence imaging in vivo and ex vivo.
Elle concerne principalement le domaine technique de l'imagerie optique diffuse, et de son application à l'imagerie optique diffuse de fluorescence ou à la détermination de propriétés optiques de milieux diffusants. Elle peut notamment être appliquée à des échantillons de tissus biologiques ou à des parties du corps animal ou humain dont les dimensions sont compatibles avec les profondeurs de pénétration des rayonnements optiques utilisés. Ces techniques permettent de mettre en oeuvre des systèmes de diagnostic non invasifs grâce à l'utilisation de rayonnements non-ionisants, faciles d'utilisation et peu coûteux. Pratiquement, un marqueur fluorescent ou fluorophore (substance chimique d'une molécule capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation) est injecté au sujet et se fixent sur certaines molécules spécifiques, par exemple des tumeurs cancéreuses. La zone d'intérêt est éclairée à la longueur d'onde d'excitation optimale du fluorophore et le signal fluorescent est détecté. L'imagerie 2 optique de diffusion û sans injection de marqueur fluorescent û est déjà utilisée en milieu clinique, notamment dans les domaines de la mammographie et de la neurologie. L'imagerie optique de fluorescence (avec injection de fluorophore spécifique) est quant à elle limitée à ce jour à des applications petit animal en raison du manque de marqueurs adaptés et injectables à l'humain, et du problème d'autofluorescence des tissus qui se pose pour la détection en profondeur. It mainly concerns the technical field of diffuse optical imaging, and its application to diffuse optical fluorescence imaging or the determination of optical properties of diffusing media. It can in particular be applied to biological tissue samples or to parts of the animal or human body whose dimensions are compatible with the penetration depths of the optical radiation used. These techniques make it possible to implement non-invasive diagnostic systems through the use of non-ionizing radiation, easy to use and inexpensive. In practice, a fluorescent or fluorophore marker (chemical substance of a molecule capable of emitting fluorescence light after excitation) is injected into the subject and binds to certain specific molecules, for example cancerous tumors. The area of interest is illuminated at the optimal excitation wavelength of the fluorophore and the fluorescent signal is detected. Optical diffusion imaging - without fluorescent marker injection - is already used in a clinical setting, particularly in the fields of mammography and neurology. Fluorescence optical imaging (with specific fluorophore injection) is currently limited to small animal applications because of the lack of suitable markers and injectable to humans, and the problem of autofluorescence of tissues that pose for the detection in depth.
En effet, pour appliquer cette méthode au diagnostic, par exemple de cancers, chez l'être humain, le signal spécifique à détecter est situé plus profondément sous la peau que chez le petit animal. Mais ce signal faiblit avec la profondeur, principalement à cause de l'absorption et de la diffusion des tissus, et se confronte à un signal parasite qui perturbe la détection. Ce signal parasite est appelé auto-fluorescence et désigne la fluorescence de tissus auxquels aucune substance chimique ou fluorophore spécifique n'a été injecté : il s'agit de la fluorescence naturelle du tissu, due principalement à la présence de molécules appelées fluorophores endogènes (collagène, élastine, NADH, flavines, porphyrines), qui ont elles aussi, le potentiel d'émettre de la lumière lorsqu'elles sont stimulées. L'imagerie de fluorescence in vivo est donc souvent limitée par le problème de l'autofluorescence des tissus biologiques. Indeed, to apply this method to the diagnosis, for example cancers, in humans, the specific signal to be detected is located deeper under the skin than in the small animal. But this signal weakens with depth, mainly because of the absorption and diffusion of tissues, and confronts a parasitic signal that disrupts detection. This parasitic signal is called auto-fluorescence and refers to the fluorescence of tissues to which no specific chemical or fluorophore has been injected: this is the natural fluorescence of the tissue, mainly due to the presence of molecules called endogenous fluorophores (collagen , elastin, NADH, flavines, porphyrins), which also have the potential to emit light when stimulated. In vivo fluorescence imaging is therefore often limited by the problem of autofluorescence of biological tissues.
Par conséquent, l'amélioration de contraste que l'on peut obtenir en marquant les cellules à l'aide 3 de fluorophores, dépend fortement du rapport entre la fluorescence des marqueurs et la fluorescence endogène, ou autofluorescence. Pour augmenter ce contraste, on cherche à diminuer le bruit (constitué principalement par l'autofluorescence) par rapport au signal (la fluorescence du marqueur). Pour détecter une inclusion fluorescente à une profondeur de quelques centimètres dans les tissus biologiques, on peut utiliser un dispositif tel que celui de la figure 1, qui permet de suivre la fluorescence temporellement après chaque impulsion d'excitation (c'est la tomographie résolue en temps). Un laser 8 d'excitation Saphir-titane délivre un train d'impulsion à une fréquence de 80 Mhz (durée entre les impulsions : 12.5 ns) avec une puissance moyenne de quelques centaine de milliwatts. Ce laser est accordable en longueur d'onde de par exemple entre 700 nm à 950 nm pour exciter différents types de fluorophores. De préférence, l'excitation se fait dans les longueurs d'onde du rouge ou du proche infra-rouge. Ce type d'imagerie de fluorescence est appelée imagerie de fluorescence résolue en temps. La fréquence des impulsions varie typiquement que quelques centaines de kHz à quelques centaines de MHz. Les sources utilisées peuvent être des diodes laser pulsées picosecondes, ou des lasers femtosecondes. La durée de chaque impulsion lumineuse étant généralement inférieure à 1ns, on parlera alors de sources lumineuses pulsées subnanosecondes. 4 Le laser est injecté dans une fibre optique 10 d'excitation qui va permettre de sonder l'échantillon 20. La fluorescence émise par l'inclusion fluorescente présente dans l'échantillon est collectée par une deuxième fibre optique 12 - de détection - et le signal de fluorescence filtré (la référence 16 désigne un filtre) est mesuré à l'aide d'un tube photomultiplicateur 4 raccordé à une carte 13 de comptage de photons (TCSPC) synchronisée avec une partie prélevée du laser d'excitation via une photodiode 9. Ce montage permet de mesurer le signal de fluorescence et de le suivre spatialement (temporellement). Un exemple de mesure réalisée avec ce type de dispositif est donné en figure 2. La courbe I, représente le signal de fluorescence mesuré en présence d'une inclusion fluorescente (alexa750) placée à lcm de profondeur par rapport aux fibres d'excitation et d'émission, dans un milieu simulant le tissu biologique (mêmes propriétés optiques d'absorption et de diffusion) qui est l'intralipide. La courbe II représente le même signal enregistré sans l'inclusion fluorescente. Ce signal représente la fluorescence endogène émise par le milieu environnant (l'intralipide), il s'agit de l'autofluorescence. Celle-ci est présente dans la courbe I et masque le signal que l'on souhaite mesurer et qui provient de l'inclusion fluorescente. Pour retrouver ce signal (courbe III), il faut faire la soustraction des deux signaux (courbes I et II). Therefore, the contrast enhancement that can be achieved by labeling cells with fluorophores strongly depends on the ratio of marker fluorescence to endogenous fluorescence, or autofluorescence. To increase this contrast, we try to reduce the noise (consisting mainly of autofluorescence) compared to the signal (the fluorescence of the marker). To detect a fluorescent inclusion at a depth of a few centimeters in the biological tissues, a device such as that of FIG. 1 can be used, which makes it possible to follow the fluorescence temporally after each excitation pulse (this is the tomography solved in FIG. time). A Saphir-titanium excitation laser 8 delivers a pulse train at a frequency of 80 Mhz (duration between pulses: 12.5 ns) with an average power of some hundred milliwatts. This laser is wavelength tunable for example between 700 nm to 950 nm to excite different types of fluorophores. Preferably, the excitation is done in the wavelengths of red or near infra-red. This type of fluorescence imaging is termed time-resolved fluorescence imaging. The pulse frequency typically varies from a few hundred kHz to a few hundred MHz. The sources used may be pulsed picosecond laser diodes, or femtosecond lasers. The duration of each light pulse being generally less than 1ns, we will then speak of subnanosecond pulsed light sources. The laser is injected into an excitation optical fiber which will make it possible to probe the sample. The fluorescence emitted by the fluorescent inclusion present in the sample is collected by a second optical fiber 12 of detection. filtered fluorescence signal (reference 16 designates a filter) is measured using a photomultiplier tube 4 connected to a photon counting card 13 (TCSPC) synchronized with a portion taken from the excitation laser via a photodiode 9 This assembly makes it possible to measure the fluorescence signal and to track it spatially (temporally). An example of measurement carried out with this type of device is given in FIG. 2. Curve I represents the fluorescence signal measured in the presence of a fluorescent inclusion (alexa750) placed at 1 cm deep relative to the excitation fibers and emission, in a medium simulating the biological tissue (same optical properties of absorption and diffusion) which is the intralipid. Curve II represents the same signal recorded without fluorescent inclusion. This signal represents the endogenous fluorescence emitted by the surrounding medium (the intralipid), it is autofluorescence. This is present in curve I and masks the signal which one wishes to measure and which comes from the fluorescent inclusion. To find this signal (curve III), it is necessary to subtract the two signals (curves I and II).
Dans le cas où on souhaite appliquer cette technique à l'imagerie de tissus cancéreux in vivo, la soustraction des deux signaux devient impossible, car, une fois le fluorophore injecté au patient, il est 5 impossible de l'enlever pour enregistrer l'autofluorescence, dont l'intensité est variable selon l'endroit où on se trouve dans le tissu. En outre, plus la profondeur augmente, plus le signal d'excitation diminue, par diffusion optique dans les tissus. Ceci va diminuer fortement l'excitation de l'inclusion fluorescente par rapport à l'excitation du tissu biologique qui se trouve devant. Par conséquent, la fluorescence endogène excitée dans des zones se trouvant proche de la fibre d'excitation va émettre un signal d'autofluorescence beaucoup plus fort que le signal de fluorescence émis par l'inclusion fluorescente placée à quelques centimètres de profondeur qui, elle, reçoit un faible signal d'excitation à cause de la diffusion optique de celui-ci dans les tissus. Pour diminuer l'effet de l'autofluorescence dans les tissus biologiques, d'autres techniques basées sur des analyses assez complexes sont proposées dans différentes publications. In the case where it is desired to apply this technique to cancerous tissue imaging in vivo, the subtraction of the two signals becomes impossible because, once the fluorophore has been injected into the patient, it is impossible to remove it to record autofluorescence. , the intensity of which varies according to where one is in the fabric. In addition, as the depth increases, the excitation signal decreases by optical diffusion in the tissues. This will greatly reduce the excitation of fluorescent inclusion with respect to the excitation of the biological tissue in front. Therefore, the endogenous fluorescence excited in areas close to the excitation fiber will emit a much stronger autofluorescence signal than the fluorescence signal emitted by the fluorescent inclusion placed a few centimeters deep, which itself receives a weak excitation signal because of the optical diffusion thereof into the tissues. To reduce the effect of autofluorescence in biological tissues, other techniques based on rather complex analyzes are proposed in different publications.
L'article de Steinkamp, J.A et al., "Dual- laser, differential fluorescence correction method for reducing cellular background autofluorescence". Cytometry, 1986. 7(6): p. 566-574, décrit une méthode pour diminuer l'autofluorescence dans les cellules marquées par des anticorps fluorescents. Cette technique est basée sur l'utilisation de deux lasers, 6 le premier excitant le fluorophore et l'autofluorescence, et le deuxième laser, décalé spectralement par rapport au premier, excitant uniquement l'autofluorescence. Une soustraction de ces deux signaux permet d'obtenir le signal de fluorescence, en supposant que l'autofluorescence soit comparable spectralement et quantitativement dans les deux cas. L'excitation a lieu dans le bleu (400 nm) et les mesures se font dans un cadre de détection de la fluorescence à l'échelle de la cellule (pas de mesure en profondeur). Une autre technique est décrite dans l'article de Lakowicz, J.R., et al., "Background suppression in frequency-domain fluorometry". The article by Steinkamp, J.A et al., "Dual-laser, differential fluorescence correction method for autofluorescence autofluorescence". Cytometry, 1986. 7 (6): p. 566-574 describes a method for decreasing autofluorescence in fluorescently labeled cells. This technique is based on the use of two lasers, the first exciting the fluorophore and the autofluorescence, and the second laser, shifted spectrally with respect to the first, exciting only the autofluorescence. Subtraction of these two signals makes it possible to obtain the fluorescence signal, assuming that the autofluorescence is spectrally and quantitatively comparable in both cases. The excitation takes place in blue (400 nm) and the measurements are made in a frame of fluorescence detection at the scale of the cell (no measurement in depth). Another technique is described in Lakowicz, J.R., et al., "Background suppression in frequency-domain fluorometry".
Analytical biochemistry, 2000. 277(1): p. 74û85 et dans l'article de Herman, P, et al, "Real-time background suppression during frequency domain lifetime measurements". Analytical biochemistry, 2002. 309(1) . p. 19û26. Elle est basée sur l'utilisation d'un fluorophore (MLC : metal ligand complex) d'une très longue durée de vie (entre 20ns et 10ps) dans un milieu dont la durée de vie de l'autofluorescence est courte par rapport au fluorophore (propylene glycol, plasma humain). La fluorescence, ainsi décalée temporellement, peut être détectée avec un photomultiplicateur déclenché après l'émission de l'autofluorescence (gating). Le fluorophore est mélangé avec le milieu, et l'excitation se fait dans le bleu (400 nm) qui est une région de forte absorption des tissus (tandis que l'eau n'absorbe pas beaucoup à 400nm). Dans ce document, il 7 n'y a pas de mesure en profondeur, et en outre le fluorophore étudié n'est pas injectable à l'homme. Une autre technique est décrite dans l'article de Levenson, R.M. et al., "Spectral imaging and microscopy". American Laboratory, 2000. 32(22) . p. 26-32 et dans celui de Mansfield, J.R., et al., "Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging". Journal of biomedical optics, 2005. 10(4): p. 1-7. Ces auteurs sont les seuls qui traitent le problème de l'autofluorescence en infrarouge (pour l'imagerie en profondeur). Cette technique assez complexe est basée sur l'excitation et la détection multispectrale: un spectre est réalisé en chaque pixel de l'image. Les images obtenues en trois dimensions (x, y, longueur d'onde) sont ensuite analysées minutieusement à l'aide d'algorithmes mathématiques pour corriger la contribution de l'autofluorescence. Cette technique a été industrialisée dans un appareil maestro pour l'imagerie du petit animal. Les fluorophores utilisés sont de type Qdot (non injectable à l'homme) dont la durée de vie est très grande (dizaine de ns). Enfin, l'article de Gao, M., et al., "Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography". Applied optics, 2005. 44(26) . p. 5468-5474, propose une étude sur des fantômes optiques (intralipide) en implantant des inclusions (billes en plastique remplies d'une solution fluorescente Cy5). Des algorithmes mathématiques sont employés pour la reconstruction des images des billes 8 fluorescentes. La profondeur des inclusions est d'environ 1 cm au maximum. D'une manière générale, il se pose donc le problème de trouver un nouveau procédé, permettant de réduire, dans un signal d'imagerie de fluorescence résolue en temps, la contribution de l'autofluorescence par rapport à celle des sources de fluorescence associées à des marqueurs. Un tel procédé est de préférence apte à être mis en oeuvre pour des signaux résultant d'une excitation en profondeur. En outre, un tel procédé est de préférence aisé à mettre en oeuvre, sans analyse ou traitement complexe du signal temporel. Analytical biochemistry, 2000. 277 (1): p. 74, 85 and in the article by Herman, P, et al, "Real-time background suppression during frequency domain lifetime measurements". Analytical Biochemistry, 2002. 309 (1). p. 19û26. It is based on the use of a very long-lived fluorophore (MLC: metal ligand complex) (between 20ns and 10ps) in a medium whose lifetime is short compared to the fluorophore (propylene glycol, human plasma). The fluorescence, thus temporally offset, can be detected with a photomultiplier triggered after the emission of autofluorescence (gating). The fluorophore is mixed with the medium, and the excitation is in the blue (400 nm) which is a region of high tissue absorption (while the water does not absorb much at 400 nm). In this document, there is no measurement in depth, and in addition the fluorophore studied is not injectable to humans. Another technique is described in the article by Levenson, R. M. et al., "Spectral Imaging and Microscopy". American Laboratory, 2000. 32 (22). p. 26-32 and in that of Mansfield, J.R., et al., "Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging". Journal of Biomedical Optics, 2005. 10 (4): p. 1-7. These authors are the only ones that deal with the problem of infrared autofluorescence (for deep imaging). This rather complex technique is based on excitation and multispectral detection: a spectrum is produced in each pixel of the image. Images obtained in three dimensions (x, y, wavelength) are then carefully analyzed using mathematical algorithms to correct the contribution of autofluorescence. This technique has been industrialized in a maestro device for small animal imaging. The fluorophores used are of Qdot type (not injectable to humans) whose life span is very large (about ten ns). Finally, the article by Gao, M., et al., "Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography". Applied optics, 2005. 44 (26). p. 5468-5474, proposes a study on optical ghosts (intralipid) by implanting inclusions (plastic balls filled with Cy5 fluorescent solution). Mathematical algorithms are employed for reconstructing images of fluorescent beads. The depth of the inclusions is about 1 cm maximum. In general, there is therefore the problem of finding a new method for reducing, in a time-resolved fluorescence imaging signal, the contribution of the autofluorescence compared to that of the fluorescence sources associated with markers. Such a method is preferably capable of being implemented for signals resulting from a deep excitation. In addition, such a method is preferably easy to implement, without analysis or complex processing of the time signal.
Il se pose également le problème de trouver un nouveau dispositif, permettant de mettre en oeuvre un tel procédé. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant ou environnant le marqueur, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur fluorescent dans ce milieu, b) on dirige vers ce milieu, contenant au moins un marqueur fluorescent, une pluralité de premières impulsions d'un premier faisceau d'excitation à au moins une première longueur d'onde et une pluralité de deuxièmes impulsions d'un deuxième faisceau d'excitation à au moins une deuxième longueur 9 d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, c) on détecte au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, du marqueur fluorescent. There is also the problem of finding a new device for implementing such a method. SUMMARY OF THE INVENTION The invention firstly relates to a method for locating at least one fluorescent marker in a medium that diffuses or surrounds the marker, in which: a) at least one fluorescent marker is introduced into this medium, b) a plurality of first pulses of a first excitation beam at at least a first wavelength and a plurality of second pulses of a second excitation beam at this point are directed towards this medium, containing at least one fluorescent marker. at least one second wavelength, different from at least one wavelength of the first beam, c) detecting at least one fluorescence signal, resolved in time, the fluorescent marker.
Le milieu diffusant contient des substances ou molécules endogènes, qui donnent lieu à l'émission d'un signal de fluorescence, dit autofluorescence. Les premières impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de l'autofluorescence, tandis que les deuxièmes impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de la fluorescence du marqueur fluorescent. Les premières et les deuxièmes impulsions sont temporellement alternées, une deuxième impulsion étant séparée d'une première impulsion précédente d'une durée inférieure ou égale à la durée de déclin de l'autofluorescence du milieu diffusant. Le décalage temporel est par exemple inférieur à 2 ns ou à 1 ns ou à 500 ps ou à 100 ps, mais est supérieur à 0 (>0). The diffusing medium contains endogenous substances or molecules, which give rise to the emission of a fluorescence signal, called autofluorescence. The first pulses make it possible to carry out at least one excitation of the autofluorescence, while the second pulses make it possible to carry out at least one excitation of the fluorescence of the fluorescent marker. The first and second pulses are temporally alternating, a second pulse being separated from a first preceding pulse of a duration less than or equal to the decay time of the autofluorescence of the scattering medium. The time offset is for example less than 2 ns or 1 ns or 500 ps or 100 ps, but is greater than 0 (> 0).
L'invention permet de diminuer fortement la contribution de l'autofluorescence dans un signal de fluorescence résolu en temps, et ce de manière optique, à l'aide d'une double excitation, dont l'une est décalée spectralement et temporellement par rapport à l'autre. Chaque deuxième impulsion vient après une durée inférieure à la durée de vie de l'autofluorescence, le milieu diffusant étant alors quasiment aveugle à la deuxième longueur d'onde, et va exciter le fluorophore pour produire un signal dans une région spectrale de détection correspondant aux moyens 10 de détection. On ne réalise pas une excitation multiphotonique du milieu diffusant c'est-à-dire une première excitation, avec la première impulsion, relayée ensuite par une deuxième excitation à partir de l'état excité atteint lors de la première excitation ; donc chaque deuxième impulsion va exciter le marqueur et pratiquement pas le milieu diffusant du fait de l'aveuglement précédemment décrit. Les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement, par exemple d'une valeur au moins égale à 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. On peut ainsi réaliser une excitation adaptée de l'autofluorescence lorsque celle-ci est située dans une gamme spectrale plus faible que la fluorescence du fluorophore ou du marqueur fluorescent exogène ou injecté. The invention makes it possible to strongly reduce the contribution of the autofluorescence in a fluorescence signal resolved in time, and this optically, by means of a double excitation, one of which is shifted spectrally and temporally with respect to the other. Each second pulse comes after a duration less than the lifetime of the autofluorescence, the scattering medium then being almost blind at the second wavelength, and will excite the fluorophore to produce a signal in a spectral detection region corresponding to the detection means 10. Multiphoton excitation of the scattering medium is not carried out, that is to say a first excitation, with the first pulse, then relayed by a second excitation from the excited state reached during the first excitation; therefore each second pulse will excite the marker and virtually no scattering medium due to the previously described blindness. The first and second excitation beams are spectrally offset, for example by a value at least equal to 50 nm. Each first excitation beam may have a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam. It is thus possible to achieve an appropriate excitation of the autofluorescence when it is located in a lower spectral range than the fluorescence of the fluorophore or the fluorescent marker exogenous or injected.
De préférence on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. Les premières impulsions et les deuxièmes impulsions peuvent avantageusement être envoyées vers le milieu diffusant par une même fibre optique. Ainsi un même volume du milieu examiné subit chacun des deux rayonnements. L'invention permet de réaliser un examen en profondeur, dans le milieu examiné ou diffusant. Par 30 exemple, au moins un marqueur fluorescent est situé à 11 une distance d'une interface entre le milieu diffusant et le milieu extérieur comprise entre 3 cm et 5 cm. Avantageusement, le milieu diffusant est visqueux ou solide. Preferably, each pulse of the first laser beam is saturated with an excited state of molecules of the scattering medium. The first pulses and the second pulses can advantageously be sent to the scattering medium by the same optical fiber. Thus the same volume of the examined medium undergoes each of the two radiations. The invention makes it possible to perform an examination in depth, in the examined or diffusing medium. For example, at least one fluorescent marker is located at a distance from an interface between the scattering medium and the external medium of between 3 cm and 5 cm. Advantageously, the diffusing medium is viscous or solid.
On peut réaliser en outre un filtrage d'au moins une partie du signal d'autofluorescence qui provient du milieu diffusant. Un procédé selon l'invention peut comporter en outre une étape de réalisation d'une image représentant la localisation ou la position d'au moins un marqueur fluorescent dans le milieu diffusant. L'invention concerne également un dispositif de tomographie de fluorescence résolue en temps d'un milieu diffusant, comportant : a) des moyens formant source de rayonnement pour former des premières impulsions de rayonnement, à au moins une première longueur d'onde, b) des moyens formant source de rayonnement pour former des deuxièmes impulsions de rayonnement à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant temporellement alternées, c) des moyens pour amener les premières et 25 deuxièmes impulsions de rayonnement dans un milieu diffusant, d) des moyens pour détecter au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, provenant du milieu étudié. 30 Dans un tel dispositif, les premier et deuxième faisceaux d'excitations peuvent 12 préférentiellement être décalés spectralement de telle sorte que l'excitation du fluorophore par les premières impulsions soit négligeable. Le décalage pourra être d'au moins 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter : - des moyens de filtrage d'un signal de fluorescence, - et/ou des moyens pour réaliser une image à partir de signaux de fluorescence, résolus en temps. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS 15 - La figure 1 représente un dispositif pour mettre en oeuvre un procédé selon l'art antérieur, - la figure 2 est un exemple de mesure réalisée selon l'art antérieur, - la figure 3 représente un dispositif pour 20 mettre en oeuvre l'invention, - la figure 4 représente dans le temps, des impulsions du premier laser et du deuxième laser, - la figure 5 représente le décalage spectral entre l'autofluorescence et la fluorescence 25 des fluorophores, - la figure 6 représente une courbe de saturation. 10 13 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Un exemple de dispositif pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est représenté en figure 3. In addition, a filtering of at least a part of the autofluorescence signal originating from the scattering medium can be carried out. A method according to the invention may further comprise a step of producing an image representing the location or position of at least one fluorescent marker in the scattering medium. The invention also relates to a time-resolved fluorescence tomography device of a scattering medium, comprising: a) radiation source means for forming first radiation pulses, at least a first wavelength, b) radiation source means for forming second radiation pulses at at least a second wavelength, different from at least one wavelength of the first beam, the first and second pulses being temporally alternated, c) means to bring the first and second radiation pulses into a scattering medium, d) means for detecting at least one fluorescence signal, resolved in time, from the medium under study. In such a device, the first and second excitation beams may preferentially be spectrally shifted such that the excitation of the fluorophore by the first pulses is negligible. The offset may be at least 50 nm. Each first excitation beam may have a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam. A device according to the invention may further comprise: means for filtering a fluorescence signal, and / or means for producing an image from fluorescence signals, resolved in time. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 represents a device for implementing a method according to the prior art, FIG. 2 is an example of a measurement made according to the prior art, FIG. FIG. 4 represents the pulses of the first laser and the second laser, FIG. 5 represents the spectral shift between the autofluorescence and the fluorescence of the fluorophores, FIG. saturation curve. DETAILED DESCRIPTION OF PARTICULAR EMBODIMENTS An example of a device that can be used in the context of the invention is shown in FIG.
Ce dispositif comporte une première source 8 de rayonnement en impulsions et une deuxième source 80 de rayonnement en impulsions. Chacune de ces sources est de préférence une source laser émettant dans l'infra rouge. Du point de vue temporel, la largeur de chaque impulsion (de l'une ou l'autre source) compatible avec l'invention ne doit pas dépasser quelques centaines de femtoseconde (elle est donc inférieure à 10-13s ou à 10-12s) , afin que tous les photons émis par la deuxième source déclenchent simultanément l'excitation du milieu autofluorescent et ceci avant le déclin de la fluorescence du milieu environnant (l'autofluorescence), qui est compris entre quelques centaines de picosencondes et quelques nanosecondes. Ceci permet de rendre le milieu environnant majoritairement aveugle à la deuxième impulsion : lorsque celle-ci arrive, une molécule de ce milieu est encore dans l'état électronique excité et il lui impossible de réabsorber un autre photon. La lumière émise par la première source 8, est envoyée par une fibre 10 vers la cellule 20 qui contient le milieu à analyser. La lumière émise par la deuxième source 80, rejoint également la fibre 10 et est aussi envoyée vers la cellule 20. Il peut y avoir deux fibres différentes, une pour chaque laser, mais à condition que le point d'excitation soit le même pour les deux faisceaux, ou 14 que les deux faisceaux convergent sensiblement sur une même zone, car ce point ou cette zone va émettre de l'autofluorescence et sera aveugle à la deuxième impulsion. This device comprises a first source 8 of pulsed radiation and a second source 80 of pulsed radiation. Each of these sources is preferably a laser source emitting in the infrared. From the temporal point of view, the width of each pulse (of either source) compatible with the invention must not exceed a few hundred femtosecond (it is therefore less than 10-13s or 10-12s) , so that all the photons emitted by the second source simultaneously trigger the excitation of the autofluorescent medium and this before the decline of the fluorescence of the surrounding medium (the autofluorescence), which is between a few hundreds of picosencondes and a few nanoseconds. This makes it possible to make the surrounding environment predominantly blind to the second pulse: when it arrives, a molecule of this medium is still in the excited electronic state and it is impossible for it to reabsorb another photon. The light emitted by the first source 8 is sent by a fiber 10 to the cell 20 which contains the medium to be analyzed. The light emitted by the second source 80, also joins the fiber 10 and is also sent to the cell 20. There may be two different fibers, one for each laser, but provided that the excitation point is the same for the two beams, or 14 that the two beams converge substantially on the same area, because this point or this area will emit autofluorescence and will be blind to the second pulse.
Les deux sources sont synchronisées par des moyens 17 de synchronisation. Les impulsions de la deuxième source sont décalées spectralement par rapport aux impulsions de la première source. Par exemple la première source émet à une longueur d'onde d'environ 700 nm (longueur d'onde adaptée notamment au cas de l'excitation de l'intralipide comme source d'autofluorescence, dont le temps de déclin est d'environ 500 ps), tandis que le spectre de la deuxième source est centré à une longueur d'onde d'environ 750 nm. Les impulsions de la deuxième source sont décalées temporellement par rapport aux impulsions de la première source par des moyens 81 formant ligne à retard. The two sources are synchronized by synchronization means 17. The pulses of the second source are spectrally offset from the pulses of the first source. For example, the first source emits at a wavelength of about 700 nm (wavelength adapted especially in the case of the excitation of the intralipid as a source of autofluorescence, whose decay time is about 500 ps), while the spectrum of the second source is centered at a wavelength of about 750 nm. The pulses of the second source are shifted temporally relative to the pulses of the first source by means 81 forming a delay line.
On donne plus loin des explications plus détaillées concernant ces deux types de décalage entre les deux sources 8 et 80. On injecte donc dans le milieu 20 les faisceaux de la première source et de la deuxième source, qui fonctionnent toutes deux en impulsions et de manière synchronisée. Les puissances des deux sources sont déterminées de façon à ce que la première source produise un aveuglement significatif du milieu diffusant, et que la seconde source permette l'obtention d'un signal de fluorescence exploitable. 15 Les deux sources peuvent éventuellement avoir la même puissance, si cela permet de satisfaire à cette condition. La référence 21 désigne des moyens de focalisation des faisceaux. Une fibre 12 permet de collecter le rayonnement de fluorescence issu du milieu 20. Les deux fibres 10, 12 peuvent être déplacées l'une par rapport à l'autre. Ceci présente un intérêt lorsque la technique de reconstruction de l'image met en oeuvre les algorithmes de localisation 3D, par exemple selon l'enseignement des documents US20080067420, EP1762982, ou US20070049807. Elles sont par exemple montées sur des moyens de déplacement en translation verticaux et horizontaux (suivant les axes X, Y et Z de la figure 3). Pour cela on peut mettre en oeuvre une ou des platines montées en translation pour déplacer les extrémités des fibres optiques. Dans tous les cas la translation peut être pilotée par ordinateur. La source 8 d'impulsions de rayonnement peut également être utilisée comme moyen de déclenchement de la carte TCSPC 13 : un miroir semiréfléchissant 17 et un détecteur 9 permettent de prélever une partie du signal du laser 8 et de l'utiliser comme déclencheur des moyens 13. Un filtre interférentiel 16 et/ou un filtre coloré absorbant les faibles longueurs d'onde peuvent être placés devant le détecteur 4 pour sélectionner la lumière de fluorescence d'un fluorophore disposé dans le milieu 20 et optimiser l'élimination de la lumière 16 d'excitation. Un filtre peut aussi permettre d'éliminer tout ou partie de l'autofluorescence résiduelle au moment de l'excitation du fluorophore Des moyens électroniques 24 tels qu'un ordinateur ou un micro ordinateur ou un calculateur sont programmés pour mémoriser et traiter les signaux du détecteur 4. Ces moyens comportent une unité centrale 26 programmée pour traiter des données temporelles de fluorescence obtenues par un procédé selon l'invention. Un signal de fluorescence résolu en temps, détecté lors de la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif selon l'invention, sera sensiblement similaire à celui de la courbe I de la figure 2. En particulier ces moyens 24 permettent de mettre en oeuvre un procédé de reconstitution à partir des données temporelles, par exemple tel que décrit dans le document EP 1884765 ou US 2008067420 ou EP1762982, ou US20070049807. Une image représentant le positionnement du ou des fluorophores dans le milieu 20 examiné peut ensuite être visualisée sur des moyens de visualisation 27. Les moyens 24 permettent éventuellement de commander ou de contrôler d'autres parties du dispositif expérimental, par exemple la position des fibres 10, 12. D'autres éléments peuvent être utilisés pour la détection : un photomultiplicateur, ou une photodiode à avalanche, ou une caméra rapide, ou un ensemble Caméra et HRI -High Rate Imager-. Tous ces systèmes peuvent être utilisés pour la détection, en les plaçant après les moyens de filtrage 16. 17 Le milieu étudié 20 est un milieu diffusant, par exemple un tissu biologique. Dans ce type de milieu, un rayonnement incident peut pénétrer avec une profondeur de pénétration pouvant atteindre quelques cm, par exemple 3 cm ou 5 cm. Les valeurs exactes dépendent de la puissance de la source utilisée et des propriétés optiques du milieu, notamment du coefficient d'absorption et du coefficient de diffusion réduit. More detailed explanations are given below concerning these two types of offset between the two sources 8 and 80. The beams of the first source and the second source, which both operate in pulses and therefore synchronized. The powers of the two sources are determined in such a way that the first source produces a significant blindness of the scattering medium, and that the second source makes it possible to obtain a usable fluorescence signal. The two sources may possibly have the same power, if this makes it possible to satisfy this condition. Reference 21 designates means for focusing the beams. A fiber 12 collects the fluorescence radiation from the medium 20. The two fibers 10, 12 can be displaced relative to each other. This is of interest when the image reconstruction technique uses 3D location algorithms, for example according to US20080067420, EP1762982 or US20070049807. They are for example mounted on vertical and horizontal translation displacement means (along the X, Y and Z axes of FIG. 3). For this purpose, it is possible to use one or more plates mounted in translation to move the ends of the optical fibers. In all cases the translation can be computer controlled. The source 8 of radiation pulses can also be used as means for triggering the TCSPC 13 card: a semireflecting mirror 17 and a detector 9 make it possible to take part of the signal from the laser 8 and to use it as a trigger for the means 13 An interferential filter 16 and / or a low wavelength absorbing color filter can be placed in front of the detector 4 to select the fluorescence light of a fluorophore placed in the medium 20 and optimize the elimination of the light 16. 'excitation. A filter may also make it possible to eliminate all or part of the residual autofluorescence at the time of excitation of the fluorophore. Electronic means 24 such as a computer or a microcomputer or a computer are programmed to store and process the detector signals. 4. These means comprise a central unit 26 programmed to process temporal fluorescence data obtained by a method according to the invention. A time-resolved fluorescence signal detected during the implementation of a method and a device according to the invention will be substantially similar to that of curve I of FIG. 2. In particular, these means 24 make it possible to implement a reconstitution process from time data, for example as described in EP 1884765 or US 2008067420 or EP1762982, or US20070049807. An image representing the positioning of the fluorophore (s) in the examined medium can then be visualized on viewing means 27. The means 24 optionally make it possible to control or control other parts of the experimental device, for example the position of the fibers 10. , 12. Other elements may be used for detection: a photomultiplier, or an avalanche photodiode, or a fast camera, or a camera and HRI -High Rate Imager-. All of these systems can be used for detection by placing them after the filtering means 16. The medium studied is a diffusing medium, for example a biological tissue. In this type of medium, incident radiation can penetrate with a penetration depth of up to a few cm, for example 3 cm or 5 cm. The exact values depend on the power of the source used and the optical properties of the medium, including the absorption coefficient and the reduced diffusion coefficient.
On ainsi pu atteindre une profondeur de 3.5 cm dans de la viande ex-vivo et 3 cm dans un milieu biomimétique à la prostate humaine. Autrement dit, des fluorophores situés à une distance comprise entre 0 cm (donc situés très proches de la surface définie comme l'interface entre le milieu 20 et le milieu extérieur) et 3 cm ou 5 cm à distance de cette surface vont pouvoir être détectés. Les moyens de détection 4 détectent donc un rayonnement qui provient de la zone du milieu diffusant excitée par les faisceaux des sources 8, 80. Ce rayonnement traverse le milieu diffusant en direction de la frontière entre le milieu diffusant et le milieu extérieur, puis atteint les moyens 4 de détection. Le milieu étudié peut être un milieu vivant. Il peut s'agir par exemple d'une zone du corps humain ou animal. En effet, le dispositif décrit ici est tout à fait applicable à l'imagerie in-vivo ou ex-vivo. Pour une application in vivo on peut injecter à l'homme ou à l'animal un ou des marqueurs fluorescents non-toxiques, exemple ICG (vert d'indocyanine) ou d'autres types de marqueurs 18 fluorescents connus de l'homme du métier, par exemple du document PCT/FR2007/000269. L'enveloppe corporelle de l'homme ou de l'animal peut constituer alors l'interface du milieu diffusant avec le milieu extérieur ; dans ce cas on injecte la lumière dans le milieu à travers l'épiderme (cas de l'étude de la fluorescence du sein ou des testicules) ou, lors d'une endoscopie, à travers la paroi du canal utilisé (par exemple : paroi rectale dans le cas d'une endoscopie rectale). On peut aussi utiliser une sonde échographique par contact direct. Comme déjà expliqué, il y a également excitation d'autres éléments du milieu, créant une fluorescence parasite, ou une autofluorescence. It was thus possible to reach a depth of 3.5 cm in ex-vivo meat and 3 cm in a biomimetic medium to the human prostate. In other words, fluorophores located at a distance of between 0 cm (thus located very close to the surface defined as the interface between the medium 20 and the external medium) and 3 cm or 5 cm away from this surface will be able to be detected . The detection means 4 thus detect a radiation that comes from the zone of the scattering medium excited by the beams of the sources 8, 80. This radiation passes through the scattering medium towards the boundary between the scattering medium and the external medium, then reaches the 4 means of detection. The environment studied can be a living environment. It may be for example an area of the human or animal body. Indeed, the device described here is entirely applicable to in-vivo or ex-vivo imaging. For in vivo application, one or more non-toxic fluorescent markers can be injected into humans or animals, for example ICG (indocyanine green) or other types of fluorescent markers known to those skilled in the art. for example PCT / FR2007 / 000269. The body envelope of the man or the animal can then constitute the interface of the diffusing medium with the external medium; in this case the light is injected into the medium through the epidermis (case of the study of the fluorescence of the breast or the testes) or, during an endoscopy, through the wall of the channel used (for example: wall rectal in the case of rectal endoscopy). It is also possible to use an ultrasound probe by direct contact. As already explained, there is also excitation of other elements of the medium, creating parasitic fluorescence, or autofluorescence.
De préférence le milieu 20 est visqueux ou fluide. On donne plus loin, avec la figure 6, un exemple avec une solution eau et intralipide 1%, qui a la même viscosité que l'eau. L'efficacité de la technique est d'autant plus grande que l'on atteint le régime de saturation (décrit plus loin) qui permet l'aveuglement des molécules ; ce régime est atteint plus aisément dans le cas du solide. Dans ce régime, les molécules du milieu environnent sont aveuglées, à l'état excité. Preferably the medium is viscous or fluid. FIG. 6 gives an example with a 1% solution of water and intralipate, which has the same viscosity as water. The efficiency of the technique is all the greater as one reaches the saturation regime (described below) which allows the molecules to be blinded; this regime is more easily achieved in the case of the solid. In this diet, the molecules of the surrounding medium are blinded in the excited state.
Du point de vue temporel, les impulsions d'excitation des deux sources sont distribuées comme représenté schématiquement en figure 4.Les impulsions de la première source sont désignées par I1r celles de la deuxième source 80 par I2. Chaque impulsion I2 est séparée de l'impulsion I1 précédente par une durée At, fixe, mais réglable à l'aide des moyens 81. De 19 préférence, chaque impulsion du deuxième laser est décalée temporellement de l'impulsion précédente du premier laser d'une durée At (K0), inférieure à la durée caractéristique du déclin de l'autofluorescence ; par exemple, dans le cas de l'intralipide, dont la durée de vie est d'environ 500 ps, la valeur de At sera comprise entre 0 et 500 ps (0<At<500ps)(de préférence quelques ps ou quelques dizaines de ps, par exemple entre 1 ps et 20 ps ou 50 ps ou 100 ps). From a temporal point of view, the excitation pulses of the two sources are distributed as shown diagrammatically in FIG. 4. The pulses of the first source are designated by those of the second source 80 by I2. Each pulse I2 is separated from the preceding pulse I1 by a duration At, fixed, but adjustable by means 81. Preferably, each pulse of the second laser is temporally offset from the previous pulse of the first laser. a duration At (K0), less than the characteristic duration of the decline of the autofluorescence; for example, in the case of the intralipid, whose lifetime is about 500 ps, the value of At will be between 0 and 500 ps (0 <At <500ps) (preferably a few ps or a few tens of ps, for example between 1 ps and 20 ps or 50 ps or 100 ps).
Ce décalage temporel At dépend notamment de la nature du milieu ou des tissus traversés, et en particulier de la durée de déclin de l'autofluorescence. Par exemple cette durée est d'environ 1 ns, dans de la viande (ex vivo). This time lag At depends in particular on the nature of the medium or the tissues traversed, and in particular on the duration of decline of the autofluorescence. For example this time is about 1 ns in meat (ex vivo).
Pratiquement, le décalage temporel est déterminé, selon les cas de figures, notamment en fonction de la puissance des sources et des propriétés d'autofluorescence du milieu. D'une façon générale, on cherche à ce que la seconde impulsion soit activée lorsque les molécules des tissus sont toujours aveuglées par le premier faisceau, mais aussi à ce que le signal d'auto fluorescence soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas pris en compte par le détecteur de fluorescence (et ce malgré le filtrage). Practically, the time difference is determined, depending on the case, particularly according to the power of the sources and the properties of autofluorescence of the medium. In general, it is sought that the second pulse is activated when the tissue molecules are still blinded by the first beam, but also that the auto fluorescence signal is low enough so that it is not taken into account by the fluorescence detector (despite filtering).
On cherche à ce que la première impulsion n'excite pas le fluorophore. La largeur de bande d'excitation d'un fluorophore étant relativement large, il est préférable, du point de vue spectral, que la première source soit spectralement décalée par rapport à la source d'excitation du fluorophore. Le décalage spectral entre les deux faisceaux est par exemple de 50 20 nm ou plus (la valeur de 50 nm est une valeur moyenne de la largeur spectrale de la fluorescence) dans la limite de possibilité de filtrage. Plus précisément, la longueur d'onde du deuxième faisceau laser est de préférence supérieure à celle du premier faisceau laser, afin de pouvoir filtrer (avec un filtre passe-haut) la fluorescence de l'inclusion, comme expliqué ci-dessous en liaison avec la figure 5. It is sought that the first pulse does not excite the fluorophore. Since the excitation bandwidth of a fluorophore is relatively wide, it is preferable from the spectral point of view that the first source is spectrally offset from the excitation source of the fluorophore. The spectral shift between the two beams is for example 50 nm or more (the value of 50 nm is an average value of the spectral width of the fluorescence) within the filterability limit. More precisely, the wavelength of the second laser beam is preferably greater than that of the first laser beam, in order to be able to filter (with a high-pass filter) the fluorescence of the inclusion, as explained below in connection with Figure 5.
Mais l'inverse est également possible : on peut utiliser une longueur d'onde du deuxième faisceau laser inférieure à celle du premier faisceau laser. Le filtrage (pour séparer la fluorescence que l'on cherche à observer de l'autofluorescence et de la lumière du premier faisceau laser) est alors réalisé : à l'aide d'un filtre passe-bande commercial (généralement de largeur spectrale de l'ordre de quelques dizaines de nm, par exemple comprise entre 10 nm et 50 nm). En figure 5 on a représenté un exemple de spectre d'autofluorescence (cas de l'intralipide, courbe A) et le spectre de la fluorescence du fluorophore (courbe F). Ce schéma permet d'illustrer le décalage spectral qui permet de dissocier la fluorescence de l'autofluorescence. La ligne T en trait interrompu représente la transmission spectrale du filtre utilisé pour la détection. On a donc intérêt à réaliser ici une excitation avec le premier laser 8 (impulsions I1 de la figure 4, déjà commentée ci dessus) à longueur d'onde plus courte que l'excitation réalisée avec le deuxième laser 80 (impulsions I2 de la figure 4). Le laser 8 21 permet d'exciter l'autofluorescence, et le laser 80 la fluorescence. Lorsque l'excitation à l'aide du laser 80 est réalisée, les molécules autofluorescentes sont déjà saturées par le laser 8, et elles ne peuvent plus réabsorber l'énergie du laser 80 car ce dernier intervient avant le déclin de l'autofluorescence. Dans les conditions de décalage spectral, et temporel indiquées ci-dessus, chaque molécule qui peut donner lieu à une émission d'autofluorescence et qui a absorbé un photon du premier faisceau laser est excitée à un certain niveau, qui présente une certaine durée de vie 'auto (environ 500 ps dans le cas de l'intralipide). Si le deuxième faisceau laser arrive dans le milieu suffisamment tôt, au moins avant ' to, elle est encore dans son état excité et n'a pas encore donné lieu à une émission d'autofluorescence. Elle n'est donc pas disponible pour être excitée par un photon du deuxième faisceau laser lorsque ce dernier arrive. But the opposite is also possible: one can use a wavelength of the second lower laser beam than that of the first laser beam. The filtering (to separate the fluorescence that we want to observe from the autofluorescence and the light of the first laser beam) is then achieved: using a commercial bandpass filter (generally of spectral width of the laser beam). order of a few tens of nm, for example between 10 nm and 50 nm). FIG. 5 shows an example of the autofluorescence spectrum (case of the intralipid, curve A) and the fluorescence spectrum of the fluorophore (curve F). This diagram illustrates the spectral shift that dissociates fluorescence from autofluorescence. The line T in broken line represents the spectral transmission of the filter used for the detection. It is therefore advantageous to carry out here an excitation with the first laser 8 (pulses I1 of FIG. 4, already commented on above) with a shorter wavelength than the excitation performed with the second laser 80 (pulses I2 of FIG. 4). The laser 8 21 makes it possible to excite the autofluorescence, and the laser 80 fluoresces. When the excitation using the laser 80 is performed, the autofluorescent molecules are already saturated by the laser 8, and they can not reabsorb the energy of the laser 80 because it occurs before the decline of the autofluorescence. In the spectral and temporal shift conditions indicated above, each molecule which can give rise to an autofluorescence emission and which has absorbed a photon of the first laser beam is excited at a certain level, which has a certain lifetime auto (about 500 ps in the case of intralipid). If the second laser beam arrives in the medium sufficiently early, at least before it, it is still in its excited state and has not yet given rise to an autofluorescence emission. It is not available to be excited by a photon of the second laser beam when the latter arrives.
Autrement dit, les molécules déjà excitées ne pourront être actives sous l'influence de photons du deuxième faisceau laser (dans l'exemple déjà choisi : à 750 nm) qu'après la fin du processus d'autofluorescence, c'est-à-dire après le début de la deuxième impulsion laser. Par contre, les photons du deuxième laser vont pouvoir être absorbés par les molécules de marqueur fluorescent et donner lieu à une émission de fluorescence (décalée spectralement et temporellement) que l'on souhaite observer et ces photons ne seront pas (ou peu) absorbés par les molécules qui contribuent 22 usuellement à l'autofluorescence. Le milieu environnant devient ainsi aveugle à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore. Il y a néanmoins une émission d'autofluorescence, car les molécules excitées par le premier faisceau finissent par donner lieu à une telle émission. Mais cette autofluorescence résiduelle peut être filtrée spectralement. Dans le cas de l'intralipide, l'autofluorescence résiduelle est située aux environs de 630 nm et est filtrée spectralement par exemple par filtre de type Chroma Z66OLP. Ainsi, seule la fluorescence du fluorophore est détectable, l'autofluorescence ayant alors été considérablement réduite. In other words, the already excited molecules can not be active under the influence of photons of the second laser beam (in the example already chosen: at 750 nm) after the end of the autofluorescence process, that is to say say after the start of the second laser pulse. On the other hand, the photons of the second laser will be able to be absorbed by the fluorescent marker molecules and give rise to a fluorescence emission (spectrally and temporally shifted) that one wishes to observe and these photons will not be (or little) absorbed by molecules that usually contribute to autofluorescence. The surrounding medium thus becomes blind to the excitation wavelength of the fluorophore. There is nevertheless an emission of autofluorescence, because the molecules excited by the first beam end up giving rise to such an emission. But this residual autofluorescence can be spectrally filtered. In the case of the intralipid, the residual autofluorescence is located at around 630 nm and is spectrally filtered, for example by Chroma Z66OLP type filter. Thus, only the fluorescence of the fluorophore is detectable, the autofluorescence having then been considerably reduced.
Si la densité d'énergie incidente et la durée d'irradiation du premier laser, éventuellement la fréquence des impulsions, sont suffisantes, il peut même se produire un phénomène qui est la saturation de l'état excité concerné des molécules du milieu environnant. Ce processus n'est pas en lui-même nécessairement destructif pour ces molécules, mais les effets de photoblanchiment et de photo-dégradation sont d'autant plus importants que l'intensité incidente est élevée (ce qui est voulu dans cette technique). Les tissus, qui sont des tissus vivants, peuvent alors être endommagés, mais l'endommagement reste plus faible que dans le cas d'une biopsie, où il y a prélèvement de quelques centimètres de tissus. Un exemple de ce phénomène de saturation est traduit par la courbe de la figure 6, mesurée dans l'intralipide. La valeur du seuil de puissance moyenne 23 avant saturation est d'environ 100 mW (flux de photons incident de 1020 photons/cm2/s).5 If the incident energy density and the irradiation duration of the first laser, possibly the frequency of the pulses, are sufficient, there may even occur a phenomenon which is the saturation of the excited state concerned of the molecules of the surrounding medium. This process is not in itself necessarily destructive for these molecules, but the effects of photobleaching and photo-degradation are all the more important that the incident intensity is high (which is desired in this technique). The tissues, which are living tissues, can then be damaged, but the damage remains lower than in the case of a biopsy, where a few centimeters of tissue is removed. An example of this saturation phenomenon is the curve of FIG. 6, measured in the intralipid. The value of the average power threshold 23 before saturation is about 100 mW (incident photon flux of 1020 photons / cm 2 / s).
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