ES2660459T3 - Moléculas de ácido nucleico artificiales - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico artificial que comprende a. al menos un marco de lectura abierto (ORF); b. al menos un elemento de región 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina, donde la variante de la 3'UTR de un gen de albúmina es al menos un 80% idéntica a la variante de la 3'UTR de un gen de albúmina de origen natural de la cual se deriva y c. un tallo-bucle de histona.

Description

Moléculas de ácido nucleico artificiales

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden un marco de lectura abierto, un elemento 3’UTR tal como se define en las reivindicaciones y un tallo-bucle de histona. La invención se refiere además a un vector que comprende un elemento 3’UTR y un tallo-bucle de histona, a una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico artificial y a un kit que comprende una molécula de ácido nucleico artificial, un vector y/o una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico artificial, preferentemente para su uso en el campo de la terapia génica y/o la vacunación genética.

La terapia génica y la vacunación genética son parte de los métodos más prometedores y de rápido desarrollo de la medicina moderna. Pueden proporcionar opciones altamente específicas e individuales para la terapia de una gran variedad de enfermedades. Particularmente, enfermedades genéticas heredadas, pero también enfermedades autoinmunes, enfermedades cancerosas o relacionadas con tumores, así como enfermedades inflamatorias pueden ser el objetivo de tales procedimientos de tratamiento. También, se prevé evitar el inicio (precoz) de tales enfermedades mediante estas soluciones.

El concepto fundamental de la terapia génica es la apropiada modulación de una expresión génica deteriorada asociada a condiciones patológicas de enfermedad específicas. La expresión génica patológicamente alterada puede dar como resultado una carencia o sobreproducción de productos génicos esenciales, por ejemplo factores de señalización como hormonas, factores de mantenimiento, enzimas metabólicas, proteínas estructurales o similares. La expresión génica alterada puede deberse no solo a la regulación o transcripción y/o traducción defectuosa, sino también a mutaciones dentro de un ORF que codifica una proteína particular. Las mutaciones patológicas pueden estar provocadas, por ejemplo, por una aberración cromosómica o por más mutaciones específicas, como mutaciones puntuales o de desplazamiento de marco, todas ellas resultando en una funcionalidad limitada y, potencialmente, pérdida total de función del producto génico. Sin embargo, también aparecer una regulación defectuosa de la transcripción o traducción cuando las mutaciones afectan a genes que codifican las proteínas implicadas en la maquinaria de transcripción o de traducción celular. Tales mutaciones pueden conducir a una sub-o sobre-regulación patológica de los genes que, como tales, son funcionales. Genes que codifican los productos génicos que ejercen tales funciones reguladoras, pueden ser, por ejemplo, factores de transcripción, receptores de señal, proteínas mensajeras y similares. Sin embargo, la pérdida de función de estos genes que codifican proteínas reguladoras bajo ciertas circunstancias puede revertirse por la introducción artificial de otros factores que actúan adicionalmente aguas abajo del producto génico deteriorado. Tales defectos génicos también se pueden compensar con la terapia génica mediante la sustitución del gen afectado en sí mismo.

La vacunación genética permite provocar una respuesta inmunitaria deseada a determinados antígenos, tales como componentes característicos de las superficies bacterianas, partículas virales, antígenos tumorales o similares. En general, la vacunación es uno de los logros fundamentales de la medicina moderna. Sin embargo, las vacunas efectivas sólo están actualmente disponibles para una pequeña variedad de enfermedades. Por consiguiente, las infecciones que no se pueden prevenir por la vacunación aún afectan a millones de personas cada año.

Normalmente, las vacunas se pueden subdividir en vacunas de “primera”, “segunda” y “tercera” generación. Las vacunas de “Primera generación” son típicamente vacunas de organismos enteros. Se basan tanto en patógenos vivos y atenuados como exterminados, por ejemplo virus, bacterias y similares. La desventaja principal de las vacunas vivas y atenuadas es el riesgo de reversión a las variantes que ponen en peligro la vida. Así, aunque están atenuados, tales patógenos aún pueden conllevar intrínsecamente riesgos no predecibles. Los patógenos exterminados pueden no ser tan eficaces como se desea para generar una respuesta inmunitaria específica. A fin de minimizar estos riesgos, se desarrollaron vacunas de “segunda generación”. Éstas son típicamente vacunas de subunidad, que consisten en antígenos definidos o componentes de proteína recombinante derivados de patógenos.

Las vacunas genéticas, es decir, vacunas para la vacunación genética, generalmente se consideran vacunas de “tercera generación”. Se componen típicamente de moléculas de ácido nucleico genéticamente diseñadas que permiten la expresión de fragmentos de péptido o proteína (antígeno) característicos de un patógeno o de un antígeno tumoral in vivo. Las vacunas genéticas se expresan con la administración a un paciente y captación por las células competentes. La expresión de los ácidos nucleicos administrados da como resultado la producción de proteínas codificadas. En caso de que estas proteínas sean reconocidas como extrañas por el sistema inmunitario del paciente, se desencadena una respuesta inmunitaria.

Como se puede observar de lo anterior, ambos métodos, la terapia génica y la vacunación genética, se basan

esencialmente en la administración de moléculas de ácido nucleico a un paciente y en la transcripción y/o traducción subsecuente de la información genética codificada. Alternativamente, la vacunación genética o la terapia génica también pueden comprender métodos que incluyen el aislamiento de células corporales específicas de un paciente a tratar, la transfección in vitro subsecuente de tales células y la re-administración de las células tratadas al paciente.

Como moléculas de ácido nucleico para la administración en el contexto de la terapia génica o la vacunación genética se puede emplear ADN y ARN. Es conocido que el ADN es relativamente estable y fácil de manejar. Sin embargo, el uso de ADN conlleva el riesgo de inserción indeseada de fragmentos de ADN administrados en el genoma del paciente, dando como resultado una potencial pérdida de función de los genes deteriorados. Como riesgo adicional, surge una generación indeseada de anticuerpos anti-ADN. Otra desventaja es el nivel de expresión limitado del péptido o proteína codificada que se logra con la administración de ADN y su transcripción/traducción. Entre otras razones, el nivel de expresión del ADN administrado será dependiente de la presencia de factores de transcripción específicos que regulan la transcripción de ADN. En ausencia de tales factores, la transcripción de ADN no producirá cantidades satisfactorias de ARN. Como resultado, se limita el nivel de péptido o proteína traducida obtenida.

Al utilizar ARN en lugar de ADN para la terapia o la vacunación genética, el riesgo de integración y generación genómica indeseada de anticuerpos anti-ADN se minimiza o evita. Sin embargo, el ARN se considera una especie molecular más bien inestable que se puede degradar fácilmente por ARNasas ubicuas.

In vivo, la degradación de ARN contribuye a la regulación del tiempo de vida media del ARN. Ese efecto se consideró y probó para afinar la regulación de la expresión génica eucariótica (Friedel y col., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 112). Por consiguiente, cada ARNm de origen natural tiene una vida media individual dependiendo del gen del cual se derive el ARNm. Contribuye a la regulación del nivel de expresión de este gen. Los ARN inestables son importantes para llevar a cabo la expresión génica transitoria en distintos puntos en el tiempo. Sin embargo, los ARN de larga vida se pueden asociar con la acumulación de distintas proteínas o expresión continua de genes. In vivo, la vida media de los ARNm también es dependiente de factores ambientales, como tratamiento hormonal, como se ha observado, por ejemplo, para el factor de crecimiento similar a insulina I, actina y ARNm de albúmina (Johnson y col., Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, páginas 5287-5291, 1991).

Para la terapia génica y la vacunación genética, se desea un ARN usualmente estable. Esto es, por una parte, debido al hecho de que el producto codificado por la secuencia de ARN se acumulará in vivo. Por otra parte, el ARN tiene que mantener su integridad estructural y funcional cuando se prepara para una forma de dosificación adecuada, durante su almacenamiento y cuando se administra. Así, se ha dedicado una atención considerable a proporcionar moléculas de ARN estables para la terapia génica o la vacunación genética a fin de evitar que se vean afectadas por la degradación o la descomposición temprana.

Se ha informado que el contenido de G/C de las moléculas de ácido nucleico puede influir en su estabilidad. Así, los ácidos nucleicos que comprenden una mayor cantidad de residuos de guanina (G) y/o citosina (C) pueden ser funcionalmente más estables que los ácidos nucleicos que contienen una gran cantidad de adenina

(A) y timina (T) o nucleótidos uracilo (U). En este contexto, la WO02/098443 proporciona una composición farmacéutica que contiene un ARNm que se estabiliza por modificaciones de secuencia en la región traducida. Tal modificación de secuencia tiene ventajas en la degeneración del código genético. Por consiguiente, los codones que contienen una combinación menos favorable de nucleótidos (menos favorable en términos de estabilidad de ARN) se puede sustituir por codones alternativos sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada. Este método de estabilización de ARN está limitado por las provisiones de la secuencia de nucleótidos específica de cada molécula de ARN individual, no permitiéndose dejar el espacio deseado de la secuencia de aminoácidos. Igualmente, este procedimiento está restringido a las regiones de codificación del ARN.

Como una opción alternativa para la estabilización del ARN, se ha descubierto que las moléculas de ARN eucarióticas de origen natural contienen elementos de estabilización característicos. Por ejemplo, pueden comprender las llamadas regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5’ (5’UTR) y/o en su extremo 3’ (3’UTR), así como otras características estructurales, como una estructura de cap 5’ o una cola 3’-poli(A). Ambas, 5’UTR y 3’UTR se transcriben típicamente del ADN genómico y, así, son un elemento del ARN prematuro. Los aspectos estructurales característicos del ARNm maduro, tal como la cap 5’ y la cola 3’-poli(A) (también llamada cola poli(A) o secuencia poli(A)) normalmente se agregan al ARNm transcrito (prematuro) durante el procesamiento del ARNm.

Una cola 3'-poli(A) es típicamente un tramo de secuencia monótono de nucleótidos de adenina unidos al extremo 3' del ARNm transcripto. Puede comprender hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenina. Se descubrió que la longitud de esta cola 3'-poli(A) es un elemento potencialmente crítico para la estabilidad del ARNm individual.

También, se demuestra que la 3’UTR de un ARNm de α-globina puede ser un factor importante para la estabilidad bien conocida del ARNm de α-globina (Rodgers y col., Regulated α-globina mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3’-to-5’ exosome-dependent decapping, RNA, 8, páginas 1526-1537, 2002). La 3’UTR de un ARNm de α-globina está implicada obviamente en la formación de un complejo de ribonucleoproteína específico, el α-complejo, cuya presencia se relaciona con estabilidad del ARNm in vitro (Wang y col., An mRNA stability complex functions with poli(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, Vol 19, No. 7, Julio de 1999, páginas 4552-4560).

Independientemente de los factores que afectan a la estabilidad del ARNm, la traducción eficaz de las moléculas de ácido nucleico administradas por las células o tejido objetivo es crucial para cualquier procedimiento que utiliza moléculas de ácido nucleico para la terapia génica o la vacunación genética. Junto con la regulación de la estabilidad, también la traducción de la mayoría de los ARNm se regula por las características estructurales similares a UTR, cap 5’ y cola 3’-poli(A). En este contexto, se ha informado que la longitud de la cola poli(A) puede desempeñar una función importante también en la eficiencia de la traducción. La estabilización de elementos 3’, sin embargo, también puede tener un efecto de atenuación de la traducción.

Es el objeto de la invención proporcionar moléculas de ácido nucleico que pueden ser adecuadas para su aplicación en la terapia génica y/o la vacunación genética. Particularmente, es objeto de la invención proporcionar una especie de ARNm que está estabilizada contra la degradación o deterioro predeterminado sin mostrar una pérdida funcional significativa de la eficiencia de traducción. Otro objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico que codifican tal especie de ARNm superior que puede ser apta para su uso en la terapia génica y/o la vacunación genética. Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para su uso en la terapia génica y/o la vacunación genética. En resumen, es objeto de la presente invención proporcionar especies de ácido nucleico mejoradas que superen las desventajas planteadas en el estado anterior de la técnica mediante un procedimiento rentable y sencillo.

El objetivo que subyace aquí se resuelve por el contenido de las reivindicaciones.

Por razones de claridad y legibilidad, se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier característica técnica mencionada en estas definiciones se puede leer en todas y cada una de las realizaciones de la invención. Las definiciones y explicaciones adicionales se pueden proporcionar específicamente en el contexto de estas realizaciones.

Respuesta inmunitaria adaptiva: La respuesta inmunitaria adaptiva se entiende típicamente como una respuesta específica de antígeno del sistema inmunitario. La especificidad de antígeno permite generar respuestas que se adaptan a patógenos específicos o células infectadas por patógenos. Normalmente, la capacidad de desarrollar estas respuestas adaptadas es mantenida en el cuerpo por “células de memoria”. Si un patógeno infecta el cuerpo más de una vez, se usan estas células de memoria específicas para eliminarlo rápidamente. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmunitaria adaptiva es la activación de células T específicas de antígeno primitivo o diferentes células inmunitarias capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno por células presentadoras de antígeno. Esto ocurre en los tejidos linfoides y órganos a través de los cuales las células T naive pasan constantemente. Los tres tipos de células que pueden servir como células presentadoras de antígeno son células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estas células tiene una función distinta provocando respuestas inmunitarias. Las células dendríticas pueden tomar antígenos por fagocitosis y macropinocitosis y pueden volverse a estimular por contacto con, por ejemplo, un antígeno exterior para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian en células dendríticas maduras. Los macrófagos ingieren antígenos de partículas como bacterias y se inducen por agentes infecciosos u otros estímulos apropiados para expresar las moléculas MHC. La capacidad única de las células B de enlazar e interiorizar antígenos de proteína solubles por medio de sus receptores también puede ser importante para inducir las células T. Las moléculas MHC son típicamente responsables de la presentación de un antígeno a células T. A este respecto, presentar el antígeno en moléculas MHC lleva a la activación de las células T que inducen su proliferación y diferenciación en células T efectoras armadas. La función más importante de las células T efectoras es la eliminación de células infectadas por células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos por células Th1 que juntos conforman la inmunidad mediada por célula, y la activación de células B por ambas células Th2 y Th1 para producir diferentes clases de anticuerpo, conduciendo así a la respuesta inmunitaria humoral. Las células T reconocen un antígeno por sus receptores de células T que no reconocen y enlazan el antígeno directamente, pero en su lugar reconocen fragmentos peptídicos cortos, por ejemplo de

antígenos de proteína derivados de patógeno, por ejemplo los llamados epítopos, que se enlazan a moléculas MHC en las superficies de otras células.

Sistema inmunitario adaptativo: El sistema inmunitario adaptativo se dedica esencialmente a eliminar o impedir el crecimiento patogénico. Típicamente regula la respuesta inmunitaria adaptiva dotando al sistema inmunitario vertebrado de la capacidad para reconocer y recordar patógenos específicos (para generar inmunidad) y para desarrollar ataques más fuertes cada vez que se encuentra el patógeno. El sistema es altamente adaptable debido a la hipermutación somática (un proceso de mutaciones somáticas aceleradas) la y recombinación V(D)J (una recombinación genética irreversible de segmentos de gen de receptor de antígeno). Este mecanismo permite a un número pequeño de genes generar un gran número de diferentes receptores de antígeno, que luego se expresan únicamente en cada linfocito individual. Debido a que el reordenamiento del gen lleva a un cambio irreversible del ADN de cada célula, toda de la progenie (descendencia) de tal célula heredará entonces genes que codifican la misma especificidad de receptor, que incluye células B de Memoria y células T de Memoria, claves para la inmunidad específica longeva.

Adyuvante/componente adyuvante: Un adyuvante o un componente adyuvante en el sentido más amplio es típicamente un agente farmacológico y/o inmunológico que puede modificar, por ejemplo mejorar, el efecto de otros agentes, tal como un fármaco o vacuna. Esto debe interpretarse en un sentido amplio y se refiere a un espectro amplio de sustancias. Típicamente, estas sustancias son capaces de incrementar la inmunogenicidad de antígenos. Por ejemplo, los adyuvantes se pueden ser reconocidos por los sistemas inmunitarios innatos y, por ejemplo, pueden provocar una respuesta inmunitaria innata. Los “adyuvantes” típicamente no provocan una respuesta inmunitaria adaptiva. A este respecto, los “adyuvantes” no califican como antígenos. Su modo de acción es distinto de los efectos desencadenados por antígenos que resultan en una respuesta inmunitaria adaptiva.

Antígeno: En el contexto de la presente invención el “antígeno” se refiere típicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunitario, preferiblemente por el sistema inmunitario adaptativo, y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo por la formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptiva. Típicamente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo y que se puede presentar por la MHC a células T.

Molécula artificial de ácido nucleico: Una molécula artificial de ácido nucleico se puede entender típicamente como una molécula de ácido nucleico, por ejemplo un ADN o un ARN, que no es de origen natural. En otras palabras, una molécula artificial de ácido nucleico se puede entender como una molécula de ácido nucleico no natural. Tal molécula de ácido nucleico puede ser no natural debido a su secuencia individual (que no se presenta naturalmente) y/o debido a otras modificaciones, por ejemplo modificaciones estructurales de nucleótidos que no se presentan naturalmente. Una molécula artificial de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, una molécula de ARN o una molécula híbrida que comprende porciones de ADN y ARN. Típicamente, las moléculas artificiales de ácido nucleico se pueden diseñar y/o generar por métodos de ingeniería genética en correspondencia con una secuencia artificial deseada de nucleótidos (secuencia heteróloga). En este contexto una secuencia artificial es usualmente una secuencia que no puede presentarse naturalmente, es decir difiere de la secuencia de tipo natural en al menos un nucleótido. El término “tipo natural” se puede entender como una secuencia presente en la naturaleza. Además, el término “moléculas de ácido nucleico artificial” no se restringe a “una molécula individual” sino, típicamente, se entiende que comprende un conjunto de moléculas idénticas. Por consiguiente, se puede referir a una pluralidad de moléculas idénticas contenidas en una alícuota.

ARN bicistrónico, ARN multicistrónico: Un ARN bicistrónico o multicistrónico es típicamente un ARN, preferentetemente un ARNm, que puede tener típicamente dos (bicistrónico) o más (multicistrónico) marcos de lectura abiertos (ORF). Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de codones que es traducible en un péptido o proteína.

Portador/portador polimérico: Un portador en el contexto de la invención puede ser típicamente un compuesto que facilita el transporte y/o la formación de un complejo con otro compuesto (carga). Un portador polimérico es típicamente un portador que se forma en un polímero. Un portador se puede asociar a su carga por interacción covalente o no covalente. Un portador puede transportar ácidos nucleicos, por ejemplo ARN o ADN, a las células diana. El portador puede -para algunas realizaciones – ser un componente catiónico.

Componente catiónico: El término “componente catiónico” se refiere típicamente a una molécula cargada que está cargada positivamente (catión) a un pH típico de 1 a 9, de manera preferente un pH de o inferior a 9 (por ejemplo de 5 a 9), de o por debajo de 8 (por ejemplo de 5 a 8), de o por debajo de 7 (por ejemplo de 5 a 7), de manera preferente a pH fisiológico, por ejemplo de 7,3 a 7,4. Por consiguiente, un componente catiónico puede

ser cualquier compuesto o polímero cargado positivamente, de manera preferente un péptido o proteína catiónico cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas, en particular bajo condiciones fisiológicas in vivo. Un “péptido o proteína catiónica” puede contener al menos un aminoácido cargado positivamente o más de un aminoácido cargado positivamente, por ejemplo seleccionado de Arg, His, Lys u Orn. Así, los componentes “policatiónicos”, que tienen más de una carga positiva bajo las condiciones dadas, también están dentro del alcance.

Cap 5’: Cap 5’ es una entidad, típicamente una entidad de nucleótidos modificada, que generalmente “cap” el extremo 5’ de un ARNm maduro. Un cap 5’ se puede formar típicamente por un nucleótido modificado, en particular por un derivado de un nucleótido de guanina. De manera preferente, cap 5’ se une al extremo 5’ mediante un enlace 5’-5’-trifosfato. Un cap 5’ puede estar metilado, por ejemplo m7GpppN, donde N es el nucleótido 5’ terminal del ácido nucleico que lleva el cap 5’, típicamente el extremo 5’ de un ARN. Ejemplos adicionales de estructuras cap 5’ incluyen glicerilo, residuo no básico de desoxi invertido (porción), nucleótido 4’,5’-metileno, nucleótido de 1-(beta-D-eritrofuranosilo), nucleótido 4’-tio, nucleótido carbocíclico, nucleótido de 1,5-anidrohexitol, L-nucleótidos, alfa-nucleótido, nucleótido base modificado, nucleótido treopentofuranosilo, nucleótido 3’,4’-seco acíclico, nucleótido 3,4-dihidroxibutil-acíclico, nucleótido 3,5-dihidroxipentil-acíclico, porción de nucleótido 3’-3’-invertido, porción abásica 3’-3’-invertida, porción de nucleótido 3’,2’-invertido, porción abásica 3’,2’-invertida, fosfato de 1,4-butanodiol, 3’-fosforamidato, hexilfoshato, fosfato de aminohexilo, 3’-fosfato, 3’-fosforotioato, fosforoditioato, o porción de metilfosfonato puente o no puente.

Inmunidad celular/respuesta inmunitaria celular: La inmunidad celular se relaciona típicamente con la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de diversas citoquinas en respuesta a un antígeno. En términos más generales, la inmunidad celular no se basa en anticuerpos, sino en la activación de células del sistema inmunitario. Típicamente, una respuesta inmunitaria celular se puede caracterizar por ejemplo activando linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que son capaces de inducir la apoptosis celular, por ejemplo en células inmunitarias específicas como células dendríticas u otras células, que detectan epítopos de antígenos extraños en su superficie. Tales células se pueden infectar por virus o con bacterias intracelulares o con células de cáncer que detectan antígenos tumorales. Las características adicionales pueden ser la activación de macrófagos y células asesinas naturales, permitiéndoles destruir patógenos y la estimulación de células para secretar una variedad de citoquinas que influyen en la función de otras células implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas e innatas.

ADN: ADN es la abreviatura usual para ácido desoxirribonucleico. Es una molécula de ácido nucleico, es decir un polímero consistente en nucleótidos. Estos nucleótidos son normalmente monómeros de desoxiadenosin-monofosfato, desoxitimidin-monofosfato, desoxiguanosin-monofosfato y desoxicitidinmonofosfato que son a su vez están compuestos por una porción de azúcar (desoxirribosa), una porción base y una porción fosfato, y se polimerizan en un esqueleto principal característico. El esqueleto de principal está formado típicamente por uniones fosfodiéster entre la porción de azúcar del nucleótido, es decir la desoxirribosa, de una primera porción fosfato de un segundo monómero adyacente. El orden específico de los monómeros, es decir el orden de las bases ligadas a la cadena principal azúcar/fosfato, se denomina secuencia de ADN. El ADN puede ser mono-o bi-catenario. En la forma de doble hebra, los nucleótidos de la primera hebra se hibridan típicamente con los nucleótidos de la segunda hebra, por ejemplo por un apareamiento de bases A/T y G/C.

Epítopo: Los epítopos (también llamados ’determinantes de antígeno‘) pueden distinguirse en epítopos de células T y epítopos de células B. Los epítopos de células T o partes de las proteínas en el contexto de la presente invención pueden comprender fragmentos que, preferiblemente, tienen una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 20 o aún más aminoácidos, por ejemplo fragmentos tal como se procesan y presentan por moléculas de clase I MHC, preferiblemente con una longitud de alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9, o 10, (o aún 11, o 12 aminoácidos), o fragmentos tales como se procesan y presentan por moléculas de clase II MHC, preferiblemente de una longitud de alrededor de 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o aún más aminoácidos, donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos son típicamente reconocidos por células T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de péptido y una molécula MHC, así, los fragmentos típicamente no son reconocidos en su forma nativa. Los epítopos de células B son típicamente fragmentos ubicados en la superficie externa de proteínas (nativas) o antígenos de péptido como se define aquí, preferiblemente de 5 a 15 aminoácidos, más preferiblemente de 5 a 12 aminoácidos, aún más preferiblemente de 6 a 9 aminoácidos, que pueden ser reconocidos por anticuerpos, esto es en su forma nativa.

Tales epítopos de proteínas o péptidos además se pueden seleccionar de cualquiera de las variantes aquí mencionadas de tales proteínas o péptidos. En este contexto, los determinantes antigénicos pueden ser epítopos conformacionales y discontinuos que se componen de segmentos de las proteínas o péptidos tal como se definen aquí que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como se

definen aquí, pero se reúnen en la estructura tridimensional, o epítopos continuos o lineales que se componen de una única cadena de polipéptidos.

Fragmento de una secuencia: Un fragmento de una secuencia es típicamente una parte más corta de una secuencia de longitud completa de, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos. En consecuencia, un fragmento de una secuencia típicamente consiste en una secuencia que es idéntica al tramo

o tramos correspondientes dentro de la secuencia de longitud completa. Un fragmento preferente de una secuencia en el contexto de la presente invención consiste en un tramo continuo de entidades, como nucleótidos o aminoácidos, que corresponden a un tramo continuo de entidades en la molécula de la que se deriva el fragmento, lo que representa al menos el 80% de la molécula total (esto es longitud completa) de la cual se deriva el fragmento.

Modificado en G/C: Un ácido nucleico modificado en G/C puede ser típicamente un ácido nucleico, preferentemente una molécula artificial de ácido nucleico como se define aquí, basada en una secuencia de tipo natural modificada, que comprende un número preferentemente incrementado de nucleótidos guanosina y/o citosina en comparación con la secuencia de tipo natural. Tal número incrementado se puede generar por sustitución de codones que contienen nucleótidos de adenosina o timidina por codones que contienen nucleótidos de guanosina o citosina. Si el contenido de G/C enriquecido aparece en una región de codificación de ADN o ARN, hace uso de la degeneración del código genético. Por consiguiente, las sustituciones del codón preferentemente no alteran los residuos de aminoácidos codificados, sino incrementan exclusivamente el contenido de G/C de la molécula de ácido nucleico.

Terapia Génica: La terapia génica se puede entender como un tratamiento de elementos corporales o aislados del cuerpo de un paciente, por ejemplo tejidos/células aisladas, con ácidos nucleicos que codifican un péptido

o proteína. Típicamente puede comprender al menos una de las ecaps de a) administrar un ácido nucleico, de manera preferente una molécula artificial de ácido nucleico como se define aquí, directamente al paciente – por cualquier vía de administración – o in vitro a células/tejidos aislados del paciente, lo cual tiene como resultado la transfección de las células del paciente ya sea in vivo/ex vivo o in vitro; b) la transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) la re-administración de las células transfectadas aisladas al paciente si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al mismo.

Vacunación genética: La vacunación genética típicamente se puede entender como la vacunación por administración de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno o un inmunógeno o fragmentos de los mismos. La molécula de ácido nucleico se puede administrar a un cuerpo del sujeto o a células aisladas de un sujeto. Tras la transfección de ciertas células del cuerpo o tras la transfección de las células aisladas, el antígeno o inmunógeno puede ser expresado por aquellas células y posteriormente ser presentado al sistema inmunitario, provocando una respuesta inmunitaria adaptiva, esto es específica de antígeno. En consecuencia, la vacunación genética típicamente comprende al menos una de las etapas de a) administrar un ácido nucleico, preferiblemente un ARN (aislado) como se define aquí, a un sujeto, preferiblemente un paciente, o a células aisladas de un sujeto, preferiblemente de un paciente, que usualmente resulta en la transfección de las células del sujeto ya sea in vivo o in vitro; b) transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) re-administración de células aisladas transfectadas al sujeto, preferiblemente al paciente, si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.

Secuencia heteróloga: Típicamente se entiende que dos secuencias son “heterólogas” cuando no se derivan del mismo gen, es decir, aunque las secuencias heterólogas se pueden derivar del mismo organismo, no se presentan naturalmente (en la naturaleza) en la misma molécula de ácido nucleico, tal como en el mismo ARNm.

Inmunidad humoral/respuesta inmunitaria humoral: La inmunidad humoral se refiere típicamente a la producción de anticuerpos y opcionalmente a procesos accesorios que acompañan q la producción de anticuerpos. Una respuesta inmunitaria humoral se puede caracterizar típicamente, por ejemplo, por la activación de Th2, la producción de citoquinas, formación central germinal y cambio de isotipo, maduración por afinidad y generación de células de memoria. La inmunidad humoral también se puede referir típicamente a funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la naturalización de patógenos y toxinas, activación de complemento clásica y la promoción de opsonina de fagocitosis y eliminación de patógenos.

Inmunógeno: En el contexto de la presente invención, un inmunógeno se puede entender típicamente como un compuesto capaz de estimular una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un inmunógeno es un péptido, polipéptido o proteína. En una realización particularmente preferente, un inmunógeno en el sentido de la presente invención es el producto de la traducción de una molécula de ácido nucleico proporcionada, preferentemente una molécula artificial de ácido nucleico como se define aquí. Típicamente un inmunógeno induce al menos una respuesta inmunitaria adaptativa.

Composición inmunoestimuladora: En el contexto de la invención, una composición inmunoestimuladora se puede entender típicamente como una composición que contiene al menos un componente capaz de inducir una respuesta inmunitaria o del cual se deriva un componente que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Tal respuesta inmunitaria puede ser preferentemente una respuesta inmunitaria innata o una combinación de una respuesta inmunitaria adaptativa e innata. De manera preferente, una composición inmunoestimuladora en el contexto de la invención contiene al menos una molécula artificial de ácido nucleico, en especial un ARN, por ejemplo una molécula de ARNm. El componente inmunoestimulador, tal como el ARNm, se puede complejar con un portador adecuado. Así, la composición inmunoestimuladora puede comprender un complejo ARNm/portador. Adicionalmente, la composición inmunoestimuladora puede comprender un adyuvante y/o un vehículo adecuado para el componente inmunoestimulador, tal como el ARNm.

Respuesta inmunitaria: Una respuesta inmunitaria puede ser típicamente una reacción específica del sistema inmunitario adaptativo a un antígeno particular (llamada así respuesta inmunitaria específica o adaptativa) o una reacción no específica del sistema inmunitario innato (llamada entonces respuesta inmunitaria no específica o innata), o una combinación de las mismas.

Sistema inmunitario: El sistema inmunitario puede proteger a los organismos de infecciones. Si un patógeno tiene éxito traspasando una barrera física de un organismo y entra en éste, el sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, pero no específica. Si los patógenos evaden esta respuesta innata, los vertebrados tienen una segunda capa de protección, el sistema inmunitario adaptativo. Aquí, el sistema inmunitario adapta su respuesta durante una infección para mejorar su reconocimiento del patógeno. Esta respuesta mejorada se mantiene así después de que el patógeno se ha eliminado en forma de una memoria inmunológica y permite al sistema inmunitario adaptativo desarrollar ataques más rápidos y fuertes cada vez que se encuentra este patógeno. De acuerdo con esto, el sistema inmunitario comprende el sistema inmunitario innato y el adaptativo. Cada una de estas dos partes típicamente contiene los denominados componentes humorales y celulares.

ARN inmunoestimulante: Un ARN inmunoestimulador (isARN) en el contexto de la invención típicamente puede ser un ARN que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata. Éste usualmente no tiene un marco de lectura abierto y, por tanto, no proporciona un péptido-antígeno o inmunógeno, pero provoca una respuesta inmunitaria innata, por ejemplo por enlace a una clase específica de receptor tipo Toll (TLR) u otros receptores adecuados. Sin embargo, por supuesto también los ARNm que tienen un marco de lectura abierto y que codifican para un péptido/proteína puede inducir una respuesta inmunitaria innata y, por tanto, pueden ser ARN inmunoestimuladores.

Sistema inmunitario innato: El sistema inmunitario innato, también conocido como sistema inmunitario no específico (o inespecífico), típicamente comprende células y mecanismos que defienden al huésped de la infección por otros organismos de manera no específica. Esto significa que las células del sistema innato pueden reconocer y responder a patógenos de forma genérica, pero, a diferencia del sistema inmunitario adaptativo, no confiere inmunidad de larga duración o de protección al huésped. El sistema inmunitario innato puede ser, por ejemplo, activado por ligandos de receptores tipo Toll (TLRs) u otras sustancias auxiliares, como lipopolisacáridos, TNF-alfa, ligando CD40, o citoquinas, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimiocinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento y hGH, un ligando de receptor tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, un ligando de receptor tipo Toll de murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando de un receptor tipo NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-I, un ácido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (isARN), un CpG-ADN, un agente antibacteriano o un agente anti-viral. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender una o más de tales sustancias. Típicamente, una respuesta del sistema inmunitario innato incluye células inmunitarias de reclutamiento a sitios de infección mediante la producción de factores químicos, incluyendo mediadores químicos especializados denominados citoquinas; activación de la cascada del complemento; identificación y eliminación de sustancias extrañas presentes en órganos, tejidos, sangre y linfa por glóbulos blancos especializados; activación del sistema inmunitario adaptativo; y/o actuando como barrera física y química a agentes infecciosos.

Sitio de clonación: Un sitio de clonación se entiende típicamente como un segmento de una molécula de ácido nucleico adecuada para la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un marco de lectura abierto. La inserción se puede llevar a cabo por cualquier método biológico molecular conocido por el experto en la técnica, por ejemplo por restricción y ligación. Un sitio de clonación comprende típicamente uno o más sitios de reconocimiento de enzimas de

restricción (sitios de restricción). Estos sitios de una o más restricciones pueden ser reconocidos por las enzimas de restricción que escinden el ADN en estos sitios. Un sitio de clonación que comprende más de un sitio de restricción también puede denominarse sitio de clonación múltiple (MCS) o poliligador.

Molécula de ácido nucleico: Una molécula de ácidos nucleico es una molécula que comprende, preferentemente que consiste en, componentes de ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico se refiere preferentemente a moléculas de ADN o ARN. Se utiliza preferentemente como sinónimo del término “polinucleótido”. De manera preferente, una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o que consiste en monómeros de nucleótidos que se unen covalentemente entre sí por enlaces fosfodiéster a un esqueleto azúcar/fosfato. El término “molécula de ácido nucleico” también abarca moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ADN o ARN modificadas con base o modificadas con azúcar o modificadas en su esqueleto.

Marco de lectura abierto: Un marco de lectura abierto (ORF) en el contexto de la invención típicamente puede ser una secuencia de diversos tripletes de nucleótidos que se pueden traducir en un péptido o proteína. Un marco de lectura abierto preferiblemente contiene un codón de inicio, esto es una combinación de tres nucleótidos subsiguientes que codifican usualmente para el aminoácido metionina (ATG o AUG), en su extremo 5’-y una región posterior que usualmente tiene una longitud múltiplo de 3 nucleótidos. Un ORF preferiblemente está terminado por un codón de parada (por ejemplo, TAA, TAG, TGA). Típicamente, éste es únicamente codón de parada del marco de lectura abierto. Por tanto, un marco de lectura abierto en el contexto de la presente invención es preferiblemente una secuencia de nucleótidos que consiste en un número de nucleótidos que se pueden dividir entre tres, que inician con un codón de inicio (por ejemplo ATG o AUG) y que preferiblemente terminan con un codón de parada (por ejemplo, TAA, TGA, o TAG o UAA, UAG, UGA, respectivamente). El marco de lectura abierto se puede aislar o se puede incorporar en una secuencia de ácido nucleico más larga, por ejemplo en un vector o un ARNm. Un marco de lectura abierto también se puede denominar “región de codificación de proteína” o “región de codificación”.

Péptido: Un péptido o polipéptido es típicamente un polímero de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Contiene típicamente menos de 50 unidades monoméricas. No obstante, el término péptido no excluye moléculas que tienen más de 50 unidades monoméricas. Los péptidos largos también se denominan polipéptidos, que tienen típicamente entre 50 y 600 unidades monoméricas.

Cantidad farmacéuticamente efectiva: Una cantidad farmacéuticamente efectiva en el contexto de la invención se entiende típicamente como una cantidad que es suficiente para inducir un efecto farmacéutico, tal como una respuesta inmunitaria, que altera un nivel patológico de un péptido o proteína expresado, o sustituye un producto carente de gen, por ejemplo, en el caso de una situación patológica.

Proteína: Una proteína comprende típicamente uno o más péptidos o polipéptidos. Una proteína típicamente está plegada en una forma tridimensional, que puede ser necesaria para que la proteína ejerza su función biológica.

Secuencia Poli(A): Una secuencia poli(A), también llamada cola poli(A) o cola 3’-poli(A), se entiende típicamente como una secuencia de nucleótidos adenina, por ejemplo de hasta 400 nucleótidos de adenina, por ejemplo de aproximadamente 20 a aproximadamente 400, de manera preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, aun de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, de manera mucho más preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenina. La secuencia poli(A) se sitúa típicamente en el extremo 3’ de un ARNm. En el contexto de la presente invención, una secuencia poli(A) se puede situar dentro de un ARNm o de cualquier otra molécula de ácido nucleico, por ejemplo un vector, por ejemplo un vector que sirve como plantilla para la generación de un ARN, preferentemente un ARNm, por ejemplo por transcripción del vector.

Poliadenilación: La poliadenilación se entiende típicamente como la adición de una secuencia poli(A) a una secuencia de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN, por ejemplo un ARNm prematuro. La poliadenilación se puede inducir por una llamada señal de poliadenilación. Esta señal se sitúa preferentemente dentro de un tramo de nucleótidos en el extremo 3’ de una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN, que se poliadenila. Una señal de poliadenilación comprende típicamente un hexámero que consiste en adenina y nucleótidos uracilo/timina, preferentemente la secuencia de hexámero AAUAAA. Otras secuencias, de manera preferente secuencias de hexámero, también son concebibles. La poliadenilación aparece típicamente durante el procesamiento de un pre-ARNm (también llamado ARNm prematuro). Típicamente, la maduración del ARN (de pre-ARNm a ARNm maduro) comprende la ecap de poliadenilación.

es una secuencia de nucleótidos reconocida por la enzima de restricción. Un sitio de restricción es típicamente una secuencia de nucleótidos, preferentemente palindrómicos corta, por ejemplo una secuencia que comprende de 4 a 8 nucleótidos. Preferentemente, un sitio de restricción es reconocido por una enzima de restricción. La enzima de restricción escinde típicamente una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio de restricción en este sitio. En una secuencia de nucleótidos de doble hebra, tal como una secuencia de ADN de doble hebra, la enzima de restricción corta típicamente ambas hebras de la secuencia de nucleótidos.

ARN, ARNm: ARN es la abreviatura usual para el ácido ribonucleico. Es una molécula de ácido nucleico, es decir un polímero que consiste en nucleótidos. Estos nucleótidos son usualmente monómeros de adenosinamonofosfato, uridina-monofosfato, guanosina-monofosfato y citidina-monofosfato que se unen entre sí a lo largo de un esqueleto principal. El esqueleto principal está formado por la unión fosfodiéster entre el azúcar, es decir ribosa, de una primera porción de fosfato y de un segundo monómero adyacente. La sucesión específica de monómeros se denomina secuencia de ARN. Usualmente el ARN puede ser obtenible por la transcripción de una secuencia de ADN, por ejemplo dentro de una célula. En las células eucarióticas, la transcripción se lleva a cabo típicamente dentro del núcleo de la mitocondria. In vivo, la transcripción del ADN da por resultado normalmente el llamado ARN prematuro, que tiene que ser procesado en el llamado ARN mensajero, usualmente abreviado como ARNm. El procesamiento del ARN prematuro, por ejemplo en organismos eucarióticos, comprende una variedad de diferentes modificaciones pos-transcripcionales, como empalme, cap 5’, poliadenilación, exportación del núcleo o la mitocondria y similares. La suma de estos procesos también se denomina maduración del ARN. El ARN mensajero maduro proporciona usualmente la secuencia de nucleótidos que se puede traducir en una secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína particular. Típicamente, un ARNm maduro comprende un cap 5’, 5’UTR, un marco de lectura abierto, una 3’UTR y una secuencia poli(A). Además del ARN mensajero, existen varios tipos de ARN no codificantes que pueden estar implicados en la regulación de la transcripción y/o traducción.

Secuencia de una molécula de ácido nucleico: La secuencia de una molécula de ácido nucleico se entiende típicamente como el orden particular e individual, es decir la sucesión de sus nucleótidos. La secuencia de una proteína o péptido se entiende típicamente como el orden, es decir la sucesión de sus aminoácidos.

Identidad de secuencia: Dos o más secuencias son idénticas si tienen la misma longitud y orden de nucleótidos

o aminoácidos. El porcentaje de identidad típicamente describe el grado en que dos secuencias son idénticas, esto es típicamente describe el porcentaje de nucleótidos que corresponden en su posición de secuencia con nucleótidos idénticos de una secuencia de referencia. Para determinar el grado de identidad, las secuencias a comparar se consideran de la misma longitud, esto es la longitud de la secuencia más larga de las secuencias a comparar. Esto significa que una primera secuencia que consiste en 8 nucleótidos es un 80% idéntica a una segunda secuencia que consiste en 10 nucleótidos que comprende la primera secuencia. En otras palabras, en el contexto de la presente invención, la identidad de secuencia preferiblemente se refiere al porcentaje de nucleótidos de una secuencia que tiene la misma posición en dos o más secuencias de la misma longitud. Los espacios son usualmente considerados como posiciones no idénticas, independientemente de su posición actual en una alineación.

Molécula de ácido nucleico estabilizada: Una molécula de ácido nucleico estabilizada es una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN o ARN, que se modifica de forma que es más estable a la desintegración o degradación, por ejemplo por factores ambientales o digestión enzimática, tal como por degradación con exo o endonucleasas, que la molécula de ácido nucleico sin la modificación. De manera preferente, una molécula de ácido nucleico estabilizado en el contexto de la presente invención se estabiliza en una célula, tal como una célula procariótica o eucariótica, de manera preferente en una célula de mamífero, tal como una célula humana. El efecto de estabilización también se puede ejercer fuera de las células, por ejemplo con una solución tampón, etc., por ejemplo en un proceso de fabricación para una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico estabilizada.

Transfección: El término ’transfección’ se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tal como moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en células, preferiblemente en células eucariotas. En el contexto de la presente invención, el término ’transfección’ abarca cualquier método conocido por el experto para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, preferiblemente en células eucariotas, tal como en células de mamífero. Tales métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo basado en lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación de fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección basada en virus o transfección basada en polímeros catiónicos, tal como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. De manera preferente, la introducción no es viral.

Vacuna: Una vacuna se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno, preferiblemente un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno se puede derivar de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno se puede derivar de un

patógeno, tal como de bacterias o partículas virales, etc., o de un tumor o tejido canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptiva.

Vector: El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico, de manera preferente a una molécula artificial de ácido nucleico. Un vector en el contexto de la presente invención es adecuado para incorporar o alojar una secuencia de ácido nucleico deseada, tal como una secuencia de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto. Tales vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, de una molécula de ARNm. Así, el vector puede comprender una secuencia que corresponde, por ejemplo, a una secuencia de ARNm deseada o a una parte de la misma, tal como una secuencia que corresponde al marco de lectura abierto y la 3’UTR de un ARNm. Se puede emplear un vector de expresión para la producción de productos de expresión tales como ARN, por ejemplo ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender secuencias necesarias para la transcripción de un tramo de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora, por ejemplo una secuencia promotora de ARN. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que se puede utilizar para incorporar secuencias de ácidos nucleicos en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plásmido o bacteriófago. Un vector de transferencia puede ser un vector adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico en células u organismos, por ejemplo vectores virales. Un vector en el contexto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Preferentemente, un vector es una molécula de ADN. De manera preferente un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. De manera preferente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector de plásmido.

Vehículo: Un vehículo se entiende típicamente como un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo. Por ejemplo, puede ser un líquido fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo.

Región 3’ no traducida (3’UTR): Una 3’UTR es típicamente la parte de un ARNm entre la región de codificación de la proteína (es decir el marco de lectura abierto) y la secuencia poli(A) del ARNm. Una 3’UTR del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoácidos. La secuencia 3’UTR es codificada generalmente por el gen que se transcribe en el ARNm respectivo durante el proceso de expresión génica. La secuencia genómica primero se transcribe en el ARNm pre-maduro, que comprende intrones opcionales. El ARNm premaduro luego se procesa adicionalmente en ARNm maduro en un proceso de maduración. Este proceso de maduración comprende las ecaps de cap 5’, empalme del ARNm pre-maduro para escindir intrones opcionales y modificaciones del extremo 3’, tal como poliadenilación del extremo 3’ del ARNm pre-maduro y escisiones de endo o exonucleasa opcionales, etc. En el contexto de la presente invención, una 3’UTR corresponde a la secuencia de un ARNm maduro que se sitúa 3’ al codón de parada de la región que codifica la proteína, preferentemente inmediatamente 3’ al codón de parada de la región que codifica a la proteína, y que se extiende al lado 5’ de la secuencia poli(A), de manera preferente al nucleótido inmediatamente 5’ de la secuencia poli(A). El término “corresponde a” significa que la secuencia 3’UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm, utilizada para definir la secuencia 3’UTR, o una secuencia de ADN que corresponde a tal secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, el término 3’UTR de un gen”, tal como “3’UTR de un gen de albumina”, es la secuencia que corresponde a la 3’UTR del ARNm maduro derivado de este gen, es decir el ARNm obtenido por transcripción del gel y la maduración de la ARNm pre-maduro. El término “3’UTR de un gen” abarca la secuencia de ADN y la secuencia de ARN de la 3’UTR.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial que comprende

a.

al menos un marco de lectura abierto (ORF); y

b.

al menos un elemento de región 3’-no traducida (elemento 3’UTR) que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, donde la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina es idéntica al menos en un 80% a la 3’UTR de la variante de la cual se deriva; y

c.

un tallo-bucle de histona.

El término “elemento 3’UTR” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3’UTR o de una variante de una 3’UTR. Preferentemente un “elemento 3’-UTR” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que representa una 3’UTR de una secuencia de ácido nucleico artificial, tal como un ARNm artificial, o que codifica una 3’UTR de una molécula de ácido nucleico artificial. Por consiguiente, en el sentido de la presente invención, de manera preferente, un elemento

3’UTR puede ser la 3’UTR de un ARNm, de manera preferente de un ARNm artificial, o puede ser la plantilla de transcripción para una 3’UTR de un ARNm. Así, un elemento 3’UTR preferentemente es una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la 3’UTR de un ARNm, de manera preferente a la 3’UTR de un ARNm artificial, tal como un ARNm obtenido por transcripción de un constructo vector genéticamente diseñado. Preferentemente, un elemento 3’UTR en el sentido de la presente invención funciona como una 3’UTR o codifica una secuencia de nucleótidos que cumple con la función de una 3’UTR.

Preferentemente, el al menos un marco de lectura abierto y el al menos un elemento 3’UTR son heterólogos. El término “heterólogo” en este contexto significa que el marco de lectura abierto y el elemento 3’UTR no son ocurren naturalmente (en la naturaleza) en esta combinación. De manera preferente, el elemento 3’UTR se deriva de un gen diferente que el marco de lectura abierto. Por ejemplo, el ORF se puede derivar de un gen diferente que el elemento 3’UTR, por ejemplo que codifica una proteína diferente o la misma proteína pero de una especie diferente, etc. De manera preferente, el marco de lectura abierto no codifica para albúmina humana, en especial el marco de lectura abierto no codifica para albúmina. Se prefiere que el marco de lectura abierto no codifique para una proteína reporter, por ejemplo seleccionada del grupo consistente en proteínas globina (particularmente beta-globina), proteína luciferasa, proteínas GFP o variantes de las mismas, por ejemplo variantes que tienen al menos un 70% identidad de secuencia con una proteína globina, una proteína luciferasa o una proteína GFP. Particularmente, se prefiere, en una realización específica, que el marco de lectura abierto no codifique para beta-globina o, más específicamente, para beta-globina de conejo o variantes de la misma, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se deriva de la 3’UTR de albúmina de rata o variantes de la misma. Además, en una realización específica, la molécula de ácido nucleico artificial de la invención no codifica para una secuencia señal (y por tanto no contiene un segmento que codifica tal secuencia señal), que también es sinónimo de señal de localización o señal diana. Tal secuencia señal se proporciona típicamente en el extremo 5’ de la secuencia de aminoácidos codificada. Particularmente, el ácido nucleico artificial de la invención no codifica para una proteína que (artificial o naturalmente) contiene una “secuencia de aminoácidos señal”, en particular no una secuencia señal que dirige la proteína codificada a los polisomas ligados a la membrana del retículo endoplásmico y/o transubica la proteína de interés codificada por el ácido nucleico inventivo a través de la membrana del retículo endoplásmico. En particular, la proteína codificada de la molécula de ácido nucleico inventiva no contiene una secuencia señal de albúmina, más específicamente no la secuencia señal de albúmina de rata. Típicamente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico artificial inventiva no contiene una proteína láctea o una secuencia señal de hormona de crecimiento, en particular si la región de codificación codifica para la globina, más específicamente beta-globina, aún más específicamente beta-globina de conejo. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico artificial de la invención no contiene una secuencia 5’-UTR de globina, en particular no una secuencia 5’-UTR de beta-globina o, más particularmente, no una secuencia 5’-UTR de globina de conejo, en particular si la región de codificación codifica una secuencia de globina, más específicamente beta-globina o variantes de la misma. Si la molécula de ácido nucleico artificial contiene una secuencia 5’-UTR, tal secuencia 5’-UTR se puede seleccionar de forma que no sea una secuencia 5’-UTR de un gen de albúmina, en particular no del gen de albúmina de rata. En caso de que la molécula de ácido nucleico artificial de la invención contenga más de una 3’-UTR, las otras 3’-UTR preferentemente no se seleccionan del grupo consistente en 3’-UTR de globina y 3’-UTR c-myc. En otra realización, la 3’UTR del ácido nucleico inventivo no corresponde a la 3’-UTR de albúmina de rata, en particular si la región de codificación codifica una globina, más específicamente una beta-globina.

Además, se prefiere particularmente que el marco de lectura abierto no codifique para el factor IX humano o variantes del mismo, por ejemplo variantes que tienen al menos 70% de identidad de secuencia con el factor IX humano. La molécula de ácido nucleico no contiene un promotor de albúmina, en particular un promotor de albúmina con una mutación puntual, más específicamente con una mutación puntual G52A, en particular si la región de codificación de la molécula de ácido nucleico inventiva codifica el factor IX humano o variantes del mismo como se describe anteriormente.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico artificial de la invención no corresponde a un elemento transposón, por ejemplo un plásmido transposón, o no contiene un transposón (en particular no un transposón Tn5 o no contiene elementos mosaico TN5), en particular si la región de codificación codifica para un gen de resistencia, en particular un gen de resistencia a la neomicina. La molécula de ácido nucleico de la invención no puede interactuar funcionalmente con una transposasa, en particular no con una transposasa Tn5, bajo tales circunstancias. Hablando funcionalmente, la molécula de ácido nucleico inventiva no formará típicamente un complejo entre el ácido nucleico (ya que el ácido nucleico artificial inventivo no contiene un transposón) y una transposasa específica para cualquier transposón. La región de codificación (ORF) de la molécula de ácido nucleico de la invención no codifica un ARNsi, en particular si la molécula de ácido nucleico de la invención interactúa funcionalmente con una transposasa.

En este contexto se prefiere particularmente en una realización específica que el marco de lectura abierto no contenga un intrón, particularmente en caso de que el marco de lectura abierto codifique para el factor IX humano o variantes del mismo. Además, se prefiere en este contexto que, en una realización específica, el

marco de lectura abierto no codifique para el factor IX humano o variantes del mismo, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se derive de la 3’UTR de albúmina humana o variantes de la misma.

La molécula de ácido nucleico artificial inventiva no es – como una realización específica de la invención -un casete de expresión. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico inventiva no contiene un promotor 3’ o un extremo 3’ promotor. En términos de esa realización, la molécula de ácido nucleico inventiva tampoco es un “casete de secreción”, ya que no contiene una secuencia señal y, preferentemente, no contiene un promotor 3’. En particular, la molécula de ácido nucleico inventiva se compone de una única molécula de ácido nucleico que comprende el ORF y la región 3’UTR y opcionalmente una región 5’UTR. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico inventiva no corresponde a un casete de secreción que se compone de más de uno de los elementos genéticos separados, en particular no corresponde a un primer elemento genético que representa la región aguas arriba de la región de codificación (ORF) y un segundo elemento genético separado que representa la región aguas abajo del ORF, que se proporciona independientemente, por ejemplo como partes de un kit.

Preferentemente, el al menos un elemento 3’UTR se une funcionalmente al ORF. Esto significa preferentemente que el elemento 3’UTR se asocia con el ORF de manera que puede ejercer una función, tal como una función de estabilización de la expresión del ORF o una función de estabilización en la molécula de ácido nucleico artificial. De manera preferente, el ORF y el elemento 3’UTR se asocian en la dirección 5’3’. Así, de manera preferente, la molécula de ácido nucleico artificial comprende la estructura 5’-ORFligante(opcional)-elemento 3’UTR-3’, donde el ligante puede estar presente o ausente. Por ejemplo, el ligante puede ser uno o más nucleótidos, tal como un tramo de 1-50 o 1-20 nucleótidos, por ejemplo, que comprende

o que consiste en uno o más sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (sitios de restricción).

Preferentemente, el al menos un elemento 3’UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, de manera preferente de la 3’UTR de un gen de albúmina de mamífero, tal como la 3’UTR del gen de albúmina de ratón, el gen de albúmina de Olive baboon o el gen de albúmina humano o de una variante de los mismos, donde la variante de la 3’UTR es idéntica al menos en un 80% a la 3’UTR natural de la cual se deriva. En especial, el al menos un elemento 3’UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivada de la 3’UTR de un gen de albúmina de primate, particularmente de un gen de albúmina humano, de un gen de albúmina de Olive baboon o de una variante del mismo, aún de manera más preferible de la 3’UTR del gen de albúmina humano de acuerdo con el número de Acceso al GenBank NM_000477.5 o de una variante de los mismos, donde la variante de la 3’UTR es idéntica al menos en un 80% a la 3’UTR natural de la cual se deriva. En una realización preferida, el elemento 3’UTR no se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina de Xenopus. Preferentemente, el elemento 3’UTR no comprende un elemento B limitador de poli(A) (PLEB) de una 3’UTR de un gen de albúmina de Xenopus. De manera preferente, el elemento 3’UTR no consiste en un PLEB de una 3’UTR de un gen de albúmina de Xenopus.

El término “una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un […] gen de albúmina” preferentemente se refiere a una secuencia de nucleótidos que se basa en la secuencia 3’UTR de un gen de albúmina o en un fragmento o parte de la misma. Este término incluye secuencias que se corresponden con la secuencia 3’UTR completa, es decir la secuencia 3’UTR de longitud completa de un gen de albúmina, y secuencias que se corresponden con un fragmento de la secuencia 3’UTR de un gen de albúmina. Preferentemente, un fragmento de una 3’UTR de un gen de albúmina consiste en un tramo continuo de nucleótidos que se corresponde con un tramo continuo de nucleótidos de la 3’UTR de longitud completa de un gen de albúmina, que representa al menos el 80%, y de manera mucho más preferente al menos el 90%, de la 3’UTR de longitud completa de un gen de albúmina. Tal fragmento, en el sentido de la presente invención, preferentemente es un fragmento funcional como se describe aquí. El término “3’UTR de un gen de albúmina” preferentemente se refiere a la 3’UTR de un gen de albúmina de origen natural.

Los términos “variante de la 3’UTR de un gen de albúmina” y “variante de la misma” en el contexto de una 3’UTR de un gen de albúmina se refieren a una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de origen natural, de manera preferente a una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de vertebrado, en especial a una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de mamífero, tal como la 3’UTR de un gen de albúmina de ratón, de manera aún más preferente una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de primate, en particular de un gen de albúmina humana o de un gen de albúmina de Olive baboon como se describe anteriormente, donde la variante de la 3’UTR es idéntica al menos en un 80% a la 3’UTR natural de la cual se deriva. Tal variante puede ser una 3’UTR modificada de un gen de albúmina. Por ejemplo, una 3’UTR variante puede presentar una o más deleciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos en comparación con la 3’UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. La variante de una 3’UTR de un gen de albúmina es al menos un 80%, de manera aún más preferible al menos un 90%, de manera mucho más preferible al menos un 95% idéntica a la 3’UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. Preferentemente, la variante es una

variante funcional como se describe aquí.

El término “una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina” preferentemente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se basa en una variante de la secuencia 3’UTR de un gen de albúmina o un fragmento o parte del mismo como se describe anteriormente. El término incluye secuencias que se corresponden con la secuencia completa de la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, es decir la secuencia 3’UTR variante de longitud completa de un gen de albúmina, y con secuencias que se corresponden con un fragmento de la secuencia 3’UTR variante de un gen de albúmina. De manera preferente, un fragmento de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina consiste en un tramo continuo de nucleótidos que se corresponde con un tramo continuo de nucleótidos de la variante de longitud completa de la 3’UTR de un gen de albúmina, que representa al menos un 80%, y de manera mucho más preferible al menos un 90%, de la variante de longitud completa de la 3’UTR de un gen de albúmina. Tal fragmento de una variante, en el sentido de la presente invención, preferentemente es un fragmento funcional de una variante como se describe aquí.

Los términos “variante funcional”, “fragmento funcional” y “fragmento funcional de una variante” (también denominado “fragmento variante funcional”) en el contexto de la presente invención significan que el fragmento de la 3’UTR, la variante de la 3’UTR, el fragmento de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina satisface al menos una función, de manera preferente más de una función de la 3’UTR de origen natural de un gen de albúmina de la cual la variante, el fragmento o el fragmento de la variante se deriva. Tal función puede ser, por ejemplo, estabilizar ARNm y/o estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de un ARNm y/o incrementar la expresión de proteínas o la producción de proteínas total de un ARNm, preferentemente de una célula de mamífero, tal como una célula humana. Es particularmente preferente que la variante, el fragmento y el fragmento variante en el contexto de la presente invención cumpla la función de estabilizar un ARNm, preferentemente de una célula de mamífero, tal como una célula humana, comparado con un ARNm que comprende una 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR, y/o la función de estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de un ARNm, de manera preferente de una célula de mamífero, tal como una célula humana, en comparación con un ARNm que comprende una 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR, y/o la función de incrementar la producción de proteínas de un ARNm, de manera preferente de una célula de mamífero, tal como una célula humana, en comparación con un ARNm que comprende una 3’UTR de referencia

o que carece de una 3’UTR. Una 3’UTR de referencia puede ser, por ejemplo, una 3’UTR de origen natural en combinación con el ORF. Además, una variante funcional, un fragmento funcional o un fragmento variante funcional de una 3’UTR de un gen de albúmina preferentemente no tienen el efecto de disminuir esencialmente la eficiencia de la traducción del ARNm que comprende tal variante, fragmento o fragmento variante de una 3’UTR en comparación con la 3’UTR de tipo natural de la cual la variante, el fragmento o el fragmento variante se deriva. Una función particularmente preferente de un “fragmento funcional”, una “variante funcional” o un “fragmento funcional de una variante” de la 3’UTR de un gen de albúmina en el contexto de la presente invención es la estabilización y/o la prolongación de la producción de proteínas por la expresión de un ARNm que lleva el fragmento funcional, la variante funcional o el fragmento funcional de una variante como se describe anteriormente.

De manera preferente, la eficiencia de la una o más funciones ejercidas por la variante funcional, el fragmento funcional o el fragmento variante funcional, tal como la eficiencia de estabilización de la producción de proteínas y/o ARNm es al menos un 40%, de manera más preferible al menos 50%, de manera más preferible al menos 60%, aún de manera más preferible al menos 70%, aún de manera más preferible al menos 80%, de manera mucho más preferible al menos un 90% de la eficiencia de estabilización de la producción de ARNm y/o proteínas y/o de la eficiencia de incremento de la producción de proteínas de la 3’UTR de origen natural de un gen de albúmina de la cual la variante, el fragmento o el fragmento variante se deriva.

En el contexto de la presente invención, un fragmento de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina preferentemente tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente de al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente de al menos aproximadamente 100 nucleótidos, aún de manera más preferente de al menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente de al menos aproximadamente 150 nucleótidos. De manera preferente, tal fragmento de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina es un fragmento funcional como se describe anteriormente.

De manera preferente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en un “fragmento funcional”, una “variante funcional” o un “fragmento funcional de una variante” de la 3’UTR de un gen de albúmina.

Preferentemente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la estabilidad de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo incrementa

la estabilidad de un ARNm de acuerdo con la presente invención en comparación con un ARNm respectivo (ARNm de referencia) que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, en combinación con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la estabilidad de la producción de proteínas a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invención en comparación con un ARNm que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, en combinación con el ORF. Preferentemente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención prolonga la producción de proteínas a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invención en comparación con un ARNm respectivo que carece de una 3’UTR o que comprende de una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, en combinación con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la expresión de proteínas y/o la producción total de proteínas a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo un ARNm de acuerdo con la presente invención en comparación con un ARNm respectivo que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, en combinación con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no influye negativamente en la eficiencia de traducción de un ARNm en comparación con la eficiencia de traducción de un ARNm respectivo que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, en combinación con el ORF. El término “ARNm respectivo” en este contexto significa que – aparte de las diferentes 3’UTR – el ARNm de referencia es comparable, preferentemente idéntico, al ARNm que comprende el elemento 3’UTR inventivo.

El término “estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas” de una molécula de ácido nucleico artificial, tal como un ARNm artificial, preferentemente significa que la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, se estabiliza y/o se prolonga en comparación con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, por ejemplo que comprende una 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR, preferentemente en un sistema de expresión mamífero, tal como en células HeLa o HDF. Así, la proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, es observable durante un período de tiempo más prolongado que lo previsto para una proteína producida de una molécula de ácido nucleico de referencia. En otras palabras, la cantidad de proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, medida en el tiempo rebaja el valor de umbral a un punto de tiempo posterior que la cantidad de la proteína producida a partir de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, medida a lo largo del tiempo. Tal valor umbral puede ser, por ejemplo, la cantidad de proteínas medidas en la fase inicial de la expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección de la molécula de ácido nucleico (Figura 17).

Por ejemplo, la producción de proteínas a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, en una cantidad que es al menos la cantidad observada en la fase inicial de expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección de la molécula de ácido nucleico, se prolonga durnante al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera más preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, en un sistema de expresión mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa o HDF. Así, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención preferentemente permite la producción de proteínas prolongada en una cantidad que es al menos la cantidad observada en la fase inicial de la expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de expresión, tal como post-transfección, durante al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera más preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia.

En realizaciones preferidas, la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se prolonga en al menos 1,5 veces, de manera preferente al menos 2 veces, de manera más preferente al menos 2,5 veces en comparación con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia.

Este efecto de prolongar la producción de proteínas se puede determinar (i) midiendo la cantidad de proteínas, por ejemplo obtenidas por la expresión de un ORF que codifica una proteína reporter, tal como luciferasa, preferentemente en un sistema de expresión mamífero, tal como en células HeLa o HDF, con el tiempo, (ii) determinando el punto del tiempo en el cual la cantidad de proteínas está por debajo de la cantidad de proteínas observadas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresión, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-transfección de la molécula de ácido nucleico artificial, y (iii) comparando el punto de tiempo al cual la

cantidad de proteínas está por debajo de la cantidad de proteínas observada en 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas postinicio de la expresión en dicho momento del tiempo para una molécula de ácido nucleico que carece de una 3’UTR o que comprende de una 3’UTR de referencia (Figura 17).

Preferentemente, este efecto de estabilización y/o prolongación de la producción de proteínas se logra a la vez que la cantidad total de proteínas producidas a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo en un lapso de tiempo de 48 o 72 horas, es al menos la cantidad de proteínas producidas a partir de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR o que comprende de una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial. Así, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que permite una producción de proteínas prolongada y/o estabilizada en un sistema de expresión mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo células HeLa o HDF, como se específica anteriormente, siendo la cantidad total de proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo en un lapso de tiempo de 48

o 72 horas, al menos la cantidad total de la proteína producida, por en el lapso de tiempo, de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR o que comprende de una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial.

De esta manera, “expresión de proteína estabilizada” significa preferentemente que hay una producción de proteínas más uniforme a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención durante un período de tiempo predeterminado, tal como durante 24 horas, de manera más preferente durante 48 horas, aún de manera más preferente durante 72 horas, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico de referencia, por ejemplo un ARNm que comprende una 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR. Por consiguiente, el nivel de producción de proteínas, por ejemplo en un sistema mamífero, a partir de la molécula de ácido nucleico artificial que comprende un elemento 3’UTR de acuerdo con la presente invención, por ejemplo un ARNm de acuerdo con la presente invención, preferentemente no disminuye el grado observado para una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia como se describe anteriormente. Por ejemplo, la cantidad de proteína (codificada por el ORF) observada 6 horas después del inicio de expresión, por ejemplo 6 horas post-transfección de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, en una célula, tal como una célula de mamífero, puede ser comparable con la cantidad de proteína observada 48 horas después del inicio de la expresión, por ejemplo 48 horas posttransfección. Así, preferentemente la relación entre la cantidad de proteína codificada por el ORF, tal como una proteína reporter, por ejemplo luciferasa, observada 48 horas post-inicio de la expresión, por ejemplo 48 horas post-transfección, y la cantidad de proteína observada 6 horas después del inicio de la expresión, por ejemplo 6 horas post-transfección, es de al menos aproximadamente 0,4, de manera más preferente al menos aproximadamente 0,5, de manera más preferente al menos aproximadamente 0,6, aún de manera más preferente al menos aproximadamente 0,7. Preferentemente, la relación está entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 3, de manera más preferente entre aproximadamente 0,7 y 2 para una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Para una molécula de ácido nucleico de referencia respectiva, por ejemplo un ARNm que comprende una 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR, la relación puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3.

Así, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que comprende un ORF y un elemento 3’UTR y un tallo-bucle de histona como se describe anteriormente, donde la relación entre la cantidad de proteína (reporter), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 48 horas después del inicio de la expresión y la cantidad de proteína (reporter) observada 6 horas después del inicio de la expresión, de manera preferente en el sistema de expresión mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo células HeLa, preferentemente es superior a aproximadamente 0,4, de manera más preferente superior a aproximadamente 0,5, de manera más preferente superior a aproximadamente 0,6, aún de manera más preferente superior a aproximadamente 0,7, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 3, de manera más preferente entre aproximadamente 0,7 y 2, donde preferentemente la cantidad total de proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo, en un lapso de tiempo de 48 horas, es al menos la cantidad total de la proteína producida, por ejemplo en el lapso de tiempo, de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR

o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial. En una realización preferida, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que comprende un ORF y un elemento 3’UTR y un tallo-bucle de histona como se describe anteriormente, donde la relación entre la cantidad de proteína (reporter), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 72 horas después del inicio de la expresión y la cantidad de proteína (reporter) observada 6 horas después del inicio de la expresión, preferentemente en un sistema de expresión mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo células HeLa, preferentemente está por encima de aproximadamente 0,4, de manera más preferente por encima de aproximadamente 0,5, de manera más preferente por encima de aproximadamente 0,6, aún de manera más preferente por encima de aproximadamente 0,7, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y 1,5, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 1,15, de

manera más preferente entre aproximadamente 0,7 y 1,0, donde preferentemente la cantidad total de proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo en un lapso de tiempo de 72 horas, es al menos la cantidad total de la proteína producida, por ejemplo en el lapso de tiempo, a partir de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural, con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial.

“Expresión de proteína incrementada” en el contexto de la presente invención significa preferentemente una expresión de proteínas incrementada en un punto de tiempo después del inicio de la expresión en comparación con una molécula de referencia. Así, el nivel de proteínas observado en un cierto punto de tiempo después del inicio de la expresión, por ejemplo después de la transfección, de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo después de la transfección de un ARNm de acuerdo con la presente invención, por ejemplo 48 o 72 horas post-transfección, preferentemente es más alto que el nivel de proteína observada en el mismo punto de tiempo después del inicio de la expresión, por ejemplo después de la transfección, de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia que comprende un 3’UTR de referencia o que carece de una 3’UTR.

“Producción de proteína total incrementada” a partir de una molécula de ácido nucleico artificial se refiere a una producción de proteínas incrementada durante un lapso de tiempo en el cual la proteína se produce a partir de una molécula de ácido nucleico artificial, de manera preferente un sistema de expresión de mamífero, tal como células de mamífero, por ejemplo células HeLa o HDF. Así, “producción de proteínas total” se refiere preferentemente al área bajo la curva (AUC) que representa la producción de proteínas con el tiempo.

Dicho incremento de la estabilidad de la molécula de ácido nucleico artificial, dicho incremento de la estabilidad de la producción de proteínas y dicha prolongación de la producción de proteínas y/o dicho incremento de la expresión de proteínas y/o de producción de proteínas se determina preferentemente en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia respectiva que carece de una 3’UTR, por ejemplo un ARNm que carece de una 3’UTR, o de una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural con el ORF como se describe anteriormente.

El efecto y eficiencia de la estabilización de la producción de ARNm y/o de proteínas y/o el efecto y eficiencia de incremento de producción de proteínas de las variantes, fragmentos y/o fragmentos variantes de la 3’UTR de un gen de albúmina, así como el efecto y la eficiencia de estabilización de la producción de ARNm y/o el efecto y la eficiencia de incremento de producción de proteínas del al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se puede determinar por cualquier método adecuado para este propósito conocido por el experto. Por ejemplo, se pueden generar moléculas de ARNm artificial que comprenden una secuencia de codificación para una proteína reporter, tal como luciferasa, y no 3’UTR, una 3’UTR derivada de un gen de origen natural, una 3’UTR derivada de un gen de referencia (es decir, una 3’UTR de referencia, tal como una 3’UTR de origen natural con el ORF), como una 3’UTR una variante una 3’UTR de un gen de albúmina, como 3’UTR un fragmento de un gen de albúmina de origen natural, o como 3’UTR un fragmento de una variante de una 3’UTR de un gen de albúmina. Tales ARNm se pueden generar, por ejemplo, por transcripción in vitro de vectores respectivos, tales como vectores plásmidos, por ejemplo que comprenden un promotor T7 y una secuencia que codifica las secuencias de ARNm respectivas. Las moléculas de ARNm generadas se pueden transfectar en células por cualquier método de transfección adecuado para transfectar ARNm, por ejemplo se pueden electroporar en células de mamífero, como células HELA, y las muestras se pueden analizar en ciertos puntos del tiempo después de la transfección, por ejemplo 6, 24, 48 y 72 horas post-transfección. Las muestras se pueden analizar en cuanto a cantidades de ARNm y/o cantidades de proteínas por métodos bien conocidos por el experto. Por ejemplo, las cantidades de ARNm reporter presentes en las células en los puntos de tiempo de muestra se pueden determinar por métodos de PCR cuantitativa. Las cantidades de proteína reporter codificada por los ARNm respectivos se puede determinar, por ejemplo, por ensayos ELISA o ensayos reporter, tales como ensayos de luciferasa, dependiendo de la proteína reporter utilizada. El efecto de estabilizar la expresión de proteínas y/o prolongar la expresión de proteínas se puede analizar, por ejemplo, determinando la relación entre el nivel de proteínas observado 48 horas post-transfección y el nivel de proteínas observado 6 horas post-transfección. Mientras más cercano sea el valor a uno, más estable es la expresión de proteínas que está en este período de tiempo. Tales mediciones por supuesto también se pueden llevar a cabo a 72 horas o más y se puede conocer la relación entre el nivel de proteína observado 72 horas post-transfección y el nivel de proteína observado 6 horas post-transfección para determinar la estabilidad de la expresión de proteínas.

Preferentemente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99%, de manera mucho más preferente de 100% con la secuencia de ácido

nucleico de una 3’UTR de un gen de albúmina, tal como la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35 como se muestran a continuación, donde las variantes de las secuencias (por ejemplo al menos 40% idéntica) son variantes preferentemente funcionales como se describe anteriormente:

El al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención

10 puede comprender o consistir en un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99%, de manera mucho más preferente de 100% con la secuencia de ácido nucleico de la 3’UTR de un gen de

albúmina, tal como la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35, donde el fragmento es preferentemente un fragmento funcional o un fragmento variante funcional como se describe anteriormente. Tal fragmento preferentemente tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente al menos aproximadamente 150 nucleótidos.

Por ejemplo, tal fragmento puede tener una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 1830, tal como

o la secuencia de ARN correspondiente, o una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99% idéntica a las secuencias de ácido nucleico o la secuencia de ARN correspondiente. Así, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir en un fragmento de ácido nucleico como se determina anteriormente. Obviamente, los nucleótidos de timidina comprendidos en los fragmentos de acuerdo con las SEQ ID No. 18-30 se pueden reemplazar de nucleótidos de uridina.

Preferentemente, dichas variantes, fragmentos o fragmentos de variantes son variantes funcionales, fragmentos funcionales o fragmentos variantes funcionales como se describe anteriormente, que tienen al menos una función de la secuencia de ácido nucleico acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35, tal como la estabilización de la molécula de ácido nucleico acuerdo con la invención, estabilizar y/o prolongar la expresión de proteínas a partir de la molécula de ácido nucleico acuerdo con la invención y/o incrementar la producción de proteínas, preferentemente con una eficiencia de al menos 40%, de manera más preferente de al menos 50%, de manera más preferente de al menos 60%, de manera aún más preferente de al menos 70%, de manera aún más preferente de al menos 80%, de manera mucho más preferente de al menos 90% en la estabilización de la eficiencia y/o la producción de proteínas incrementa la eficiencia mostrada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35.

De manera preferente, el al menos un elemento 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente al menos aproximadamente 150 nucleótidos. Por ejemplo, el elemento 3’UTR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos, de manera preferente de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 nucleótidos, de manera más preferente de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos.

Además, la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención puede comprender más de un elemento 3’UTR como se describe anteriormente. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede comprender uno, dos, tres, cuatro o más elementos 3’UTR, pudiendo ser los elementos 3’UTR individuales iguales o diferentes. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención puede comprender dos elementos 3’UTR esencialmente idénticos como se describe anteriormente, por ejemplo dos elementos 3’UTR que comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de

albúmina, tal como una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, 2, 32, 33, 34 o 35, variantes funcionales de las mismos, fragmentos funcionales de las mismos o fragmentos variantes funcionales de los mismas como se describe anteriormente.

Sorprendentemente, los inventores han encontrado que una molécula de ácido nucleico artificial que comprende una 3’UTR como se describe anteriormente puede representar o puede proporcionar una molécula de ARNm que permite la producción de proteínas prolongada y/o estabilizada. Así, una 3’UTR como se describe aquí puede mejorar la estabilidad de la expresión de proteínas de una molécula de ARNm y/o mejorar la eficiencia de traducción.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede ser un ARN, tal como un ARNm, un ADN, tal como un vector de ADN, o puede ser una molécula de ARN o ADN modificada. Se puede proporcionar como una molécula de doble hebra que tiene una hebra sentido y otra anti-sentido, por ejemplo como una molécula de ADN que tiene una hebra sentido y una hebra anti-sentido.

El ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede comprender además opcionalmente una 5’UTR y/o una cap 5’. La cap 5’ y/o la 5’UTR opcionales se sitúan preferentemente 5’ al ORF dentro de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende además una secuencia poli(A) y/o una señal de poliadenilación. De manera preferente, la secuencia poli(A) opcional se sitúa 3’ al al menos un elemento 3’UTR, preferentemente se une al extremo 3’ del elemento 3’UTR. La unión puede ser directa o indirecta, por ejemplo a través de un tramo de 2, 4, 6, 8, 10, 20, etc. nucleótidos, tal como a través de un ligante de 1-50, de manera preferente de 1-20 nucleótidos, por ejemplo que comprende

o consiste en uno o más sitios de restricción.

En una realización, la señal de poliadenilación opcional se sitúa dentro del elemento 3’UTR. De manera preferente, la señal de poliadenilación comprende la secuencia consenso NN(U/T)ANA, con N = A o U, de manera preferente AA(U/T)AAA o A(U/T)(U/T)AAA. Tal secuencia consenso puede ser reconocida por la mayoría de los sistemas celulares animales y bacterianos, por ejemplo por los factores de poliadenilación, tal como el factor de especificidad de escisión/poliadenilación (CPSF) que coopera con CstF, PAP, PAB2, CFI y/o CFII. Preferentemente, la señal de poliadenilación, en especial la secuencia consenso NNUANA, se sitúa a menos de aproximadamente 50 nucleótidos, de manera más preferente a menos de aproximadamente 30 bases, de manera mucho más preferente a menos de aproximadamente 25 bases, por ejemplo a 21 bases, aguas arriba del extremo 3’ del elemento 3’UTR.

La transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una molécula de ADN artificial, que comprende una señal de poliadenilación con el elemento 3’UTR dará por resultado un ARN prematuro que contiene la señal de poliadenilación en su elemento 3’UTR. Por ejemplo, la transcripción de una molécula de ADN que comprende un elemento 3’UTR de acuerdo con la SEQ ID No. 1

dará como resultado un ARN que tiene un elemento 3’UTR de acuerdo con la secuencia

Utilizando un sistema de transcripción apropiado entonces conducirá a la unión de una secuencia poli(A) al ARN prematuro. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial inventiva puede ser una molécula de ADN40 que comprende un elemento 3’UTR como se describe en lo anterior y una señal de poliadenilación que puede dar como resultado la poliadenilación de un RNA en la transcripción de esta molécula de ADN. Por consiguiente,

un ARN resultante puede comprender una combinación del elemento 3’UTR inventivo seguido por una secuencia poli(A).

Sistemas de transcripción potenciales son sistemas de transcripción in vitro o sistemas de transcripción celulares, etc. Por consiguiente, la transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la invención, por ejemplo transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3’UTR y una señal de poliadenilación, puede dar como resultado una molécula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3’UTR y una secuencia poli(A).

Así, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3’UTR como se describe anteriormente y una secuencia poli(A).

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente. Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 2 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente.

En una realización adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 32 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente. Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 33 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente.

Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 34 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente. Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que es una molécula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 35 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente.

Así, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que puede ser una plantilla para una molécula de ARN, de manera preferente para una molécula de ARNm, que se estabiliza y optimiza con respecto a la eficiencia de traducción. En otras palabras, la molécula de ácido nucleico artificial puede ser un ADN o ARN que puede emplearse para la producción de un ARNm. El ARNm obtenido puede a su vez traducirse para la producción de un péptido o proteína deseados codificados por el marco de lectura abierto. Si la molécula de ácido nucleico artificial es un ADN, puede emplearse, por ejemplo, como una forma de almacenamiento de doble hebra para la producción in vitro o in vivo continuada y respectiva del ARNm.

En una realización, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende además una secuencia poli(A). La longitud de la secuencia poli(A) puede variar. Por ejemplo, la secuencia poli(A) puede tener una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos de adenina hasta aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleótidos de adenina, tal como aproximadamente 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de adenina.

Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que corresponde a las secuencias de ADN

La transcripción de tales secuencias puede dar como resultado moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden las secuencias

o

Tales moléculas de ARN artificial, es decir moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden una secuencia de acuerdo con las SEQ ID No. 4, 37 o 39, también pueden obtenerse in vitro por métodos habituales de síntesis química sin ser transcriptos necesariamente de un progenitor de ADN.

En una realización particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención es una molécula de ARN, de manera preferente una molécula de ARNm que comprende en la dirección 5’ a 3’ un marco de lectura abierto, un elemento 3’UTR como se describe anteriormente y una secuencia poli(A).

En una realización preferida, el marco de lectura abierto no codifica para albúmina, en particular no para albúmina humana, albúmina de ratón o la albúmina de Olive baboon, con la condición de que el elemento 3’UTR sea idéntico a la 3’UTR de la albúmina humana, albúmina de ratón o albúmina de Olive baboon, respectivamente. En algunas realizaciones adicionales, puede ser preferente que el marco de lectura abierto no codifique la albúmina humana de acuerdo con el número de Aceso de GenBank NM_000477.5, con la condición de que el elemento 3’UTR sea idéntico a la 3’UTR de la albúmina humana. En algunas realizaciones adicionales, puede ser preferente que el marco de lectura abierto no codifique para albúmina o variantes de la misma donde el elemento 3’UTR sea una secuencia que es idéntica a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35. Además, en algunas realizaciones, es preferente que el marco de lectura abierto no codifique para el factor IX humano o una proteína reporter, por ejemplo seleccionada del grupo consistente en proteínas globina, (particularmente beta-globina), proteínas luciferasa, proteínas GFP o variantes de las mismas, por ejemplo variantes que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con una proteína globina, una proteína luciferasa o una proteína GFP. Adicionalmente, en realizaciones específicas, es preferente que el marco de lectura abierto no contenga un intrón, particularmente en caso de que el marco de lectura abierto codifique para el factor IX humano.

En una realización, la invención proporciona una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteína diferente a la albúmina; un elemento 3’UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos 99%, de manera aún más preferente un 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID No. 1, 32 o 34; y una señal de poliadenilación y/o una secuencia poli(A). Además, la invención proporciona una molécula de ADN artificial según las reivindicaciones que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica cualquier péptido o proteína diferente a la albúmina; un elemento 3’UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos 99%, de manera aún más preferente un 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID No. 3, 36 o 38.

Además, la invención proporciona una molécula de ARN artificial, preferentemente una molécula de ARNm artificial o una molécula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteína diferente a la albúmina; un elemento 3’UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente al menos 99%; de manera aún más preferente un 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID No. 2, 33 o 35; y una señal de poliadenilación y/o una secuencia poli(A). Además, la invención proporciona una molécula de ARN artificial, preferentemente una molécula de ARNm artificial o una molécula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica para un péptido o proteína diferente a la albúmina; un elemento 3’UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos 99%, de manera aún más preferente un 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID No. 4, 37 o 39.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial, preferentemente un ARNm artificial, que se puede caracterizar por una estabilidad mejorada y una expresión prolongada del péptido o proteína codificada. Sin limitarse a ninguna teoría, la estabilidad mejorada de la expresión de proteínas y así de la expresión de proteínas prolongada puede ser resultado de la menor degradación de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como una molécula de ARNm artificial de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, el elemento 3’UTR inventivo puede prevenir al ácido nucleico artificial de la degradación y el deterioro.

En algunas realizaciones, se prefiere que el elemento 3’UTR no consista en un tallo-bucle de histona, preferentemente no comprenda un tallo-bucle de histona. En una realización, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no comprende un tallo-bucle de histona. Sin embargo, en algunas

realizaciones, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender un tallo-bucle de histona además de la secuencia de ácido nucleico derivada de la 3’UTR de un gen de albúmina. Tal molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, puede comprender en la dirección 5’ a 3’ un ORF, un elemento 3’UTR inventivo, preferentemente comprendiendo una señal de poliadenilación, un tallo-bucle de histona opcional y una secuencia poli(A) opcional. También puede comprender en la dirección 5’ a 3’ un ORF, un elemento 3’UTR inventivo, por ejemplo que comprende una señal de poliadenilación, una secuencia poli(A) y un tallo-bucle de histona opcional.

En el contexto de la presente invención, tal tallo-bucle de histona se deriva típicamente de un gen de histona y comprende un apareamiento de bases intramolecular de secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, formando así un tallo-bucle. Un tallo-bucle puede producirse en un ADN monohebra o, más comúnmente, en un ARN. La estructura también es conocida como tallo-bucle de horquilla u horquilla y consiste normalmente en un tallo y un bucle (terminal) dentro de una secuencia consecutiva, estando formado el tallo por dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas separadas por una secuencia corta, como una especie de espaciador, que construye el bucle de la estructura tallo-bucle. Las dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas se pueden definir, por ejemplo, como elementos de tallo-bucle tallo 1 y tallo 2. El tallo-bucle se forma cuando las dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, por ejemplo los elementos de tallo-bucle tallo 1 y tallo 2, forman pares de bases entre sí, conduciendo a una secuencia de ácido nucleico de doble hebra que comprende un bucle no apareado en su extremo terminal formado por una secuencia corta situada entre los elementos de tallo-bucle tallo 1 y tallo 2 en la secuencia consecutiva. Así, el bucle no pareado representa típicamente una región del ácido nucleico que no es capaz de apareamiento de bases con cualquiera de estos elementos tallo-bucle. La estructura en forma de pala resultante es un bloque de construcción clave de muchas estructuras secundarias de ARN. Así, la formación de una estructura tallo-bucle depende de la estabilidad de las regiones de tallo y bucle resultantes, siendo el primer requisito típicamente la presencia de una secuencia que se puede replegar sobre sí misma para formar una doble hebra pareada. La estabilidad de los elementos de tallo-bucle pareados es determinada por la longitud, el número de no coincidencias o protuberancias que contienen (un número pequeño de no coincidencias es típicamente tolerable, especialmente en una doble hebra larga) y la composición base de la región pareada. En el contexto de la presente invención, la longitud de bucle óptima es 3-10 bases, de manera más preferente 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6 o de manera aún más preferente de 4 a 5 bases, y de manera mucho más preferente 4 bases.

Un ejemplo de una secuencia de tallo-bucle de histona es la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 31 ((CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA) o la secuencia de ARN correspondiente.

De esta manera, en algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende (a.) al menos un marco de lectura abierto; (b.) al menos un elemento 3’UTR como se describe aquí, y (d.) al menos un tallo-bucle de histona que puede, por ejemplo, comprender o consistir en una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 75%, de manera preferente de al menos aproximadamente 80%, de manera preferente al menos aproximadamente 85%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95% con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 31 o la secuencia de ARN correspondiente, donde preferentemente las posiciones 6, 13 y 20 de la secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 75%, de manera preferente de al menos aproximadamente 80%, de manera preferente al menos aproximadamente 85%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95% con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 31 o el ARN correspondiente están conservados, es decir son idénticas a los nucleótidos en las posiciones 6, 13 y 20 de la SEQ ID NO. 31.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico artificial comprende elementos adicionales, tales como una cap 5’, una secuencia poli(C) y/o un motivo IRES. Una cap 5’ se puede agregar post-transcripcionalmente al extremo 5’ de un ARN. Además, la molécula de ácido nucleico artificial inventiva, particularmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm o codifica un ARNm, puede modificarse con una secuencia de al menos 10 citidinas, de manera preferente al menos 20 citidinas, de manera más preferente al menos 30 citidinas (la llamada “secuencia poli(C)”). Particularmente, la molécula de ácido nucleico inventiva puede contener, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARN(m) o codifica un ARNm, una secuencia poli(C) de típicamente aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citidina, de manera preferente aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citidina, de manera más preferente aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de citidina o de manera aún más preferente aproximadamente 20 a 50 o aún de 20 a 30 nucleótidos de citidina. Así, preferentemente la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende, en especial en la dirección 5’ a 3’, un ORF, al menos un elemento 3’UTR como se describe anteriormente, una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación y una secuencia poli(C).

Una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o motivo IRES puede separar varios marcos de lectura abiertos, por ejemplo si la molécula de ácido nucleico artificial codifica dos o más péptidos o proteínas, una secuencia IRES puede ser particularmente útil si el ARNm es un ARN a bi-o multi-cistrónico.

Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender elementos 5’ adicionales, preferentemente una 5’UTR, un promotor, o una 5’UTR y una secuencia que contiene un promotor. El promotor puede conducir y/o regular la transcripción de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo una molécula de ADN de acuerdo con la presente invención. Adicionalmente, la 5’UTR puede interactuar con el elemento 3’UTR inventivo y así puede favorecer el efecto de estabilización del elemento 3’UTR inventivo. Tales elementos pueden favorecer además la estabilidad y eficiencia de traducción. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico artificiales, preferentemente moléculas de ARNm, que comprenden en la dirección 5’ a 3’ al menos una de las siguientes estructuras:

cap 5’ – 5’UTR – ORF – elemento 3’UTR– tallo-bucle de histona – secuencia poli(A) cap 5’ – 5’UTR – ORF – elemento 3’UTR– secuencia poli(A) – tallo-bucle de histona cap 5’ -5’UTR – ORF – IRES – ORF – elemento 3’-UTR -tallo-bucle de histona -secuencia poli(A) cap 5’ -5’UTR – ORF – IRES – ORF – elemento 3’-UTR -tallo-bucle de histona -secuencia poli(A) – secuencia poli(C) cap 5’ – 5’UTR – ORF – IRES – ORF – elemento 3’UTR– secuencia poli(A) – tallo-bucle de histona cap 5’ – 5’UTR – ORF – IRES – ORF – elemento 3’UTR– secuencia poli(A) – secuencia poli(C)– tallo-bucle de histona cap 5’ – 5’UTR – ORF – elemento 3’UTR– secuencia poli(A) – secuencia poli(C) (no reivindicada) cap 5’ – 5’UTR – ORF – elemento 3’UTR – secuencia poli(A) – secuencia poli(C)– tallo-bucle de histona

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, en especial el marco de lectura abierto, está al menos parcialmente modificado con G/C. así, la molécula de ácido nucleico artificial inventiva se puede estabilizar termodinámicamente modificando el contenido de G (guanosina)/C (citidina) de la molécula. El contenido G/C del marco de lectura abierto de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se puede incrementar comparado con el contenido G/C del marco de lectura abierto de una secuencia de tipo natural correspondiente, preferentemente empleando la degeneración del código genético. Así, la secuencia de aminoácidos codificada de la molécula de ácido nucleico preferentemente no está modificada por la modificación G/C en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada de la secuencia de tipo natural particular. Los codones de una secuencia de codificación o una molécula de ácido nucleico entera, por ejemplo un ARNm, por tanto, pueden variar en comparación con la secuencia de codificación de tipo natural de forma que incluyan una mayor cantidad de nucleótidos G/C mientras la secuencia de aminoácidos traducidas se mantenga. Con respecto al hecho de que varios codones codifican uno y el mismo aminoácido (la llamada degeneración del código genético), se pueden determinar los codones más favorables para la estabilidad (el llamado uso de codón alternativo).

Dependiendo del aminoácido que es codificado por la región de codificación de la molécula de ácido nucleico inventiva como se define aquí, existen varias posibilidades de modificación de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo del marco de lectura abierto, comparado con su región de codificación de tipo natural. En el caso de los aminoácidos que son codificados por codones que contienen exclusivamente nucleótidos G o C, no es necesaria modificación del codón. Así, los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren modificación, puesto que no hay A o U/T.

Por el contrario, los codones que contienen nucleótidos A y/o U/T se pueden modificar sustituyéndolos por otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero no contienen A y/o U/T. Por ejemplo:

los codones para Pro se pueden modificar de CC(U/T) o CCA a CCC o CCG; los codones para Arg se pueden modificar de CG(U/T) o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG; los codones para Ala se pueden modificar de GC(U/T) o GCA a GCC o GCG; los codones para Gly se pueden modificar de GG(U/T) o GGA a GGC o GGG.

En otros casos, aunque los nucleótidos A o (U/T) no se pueden eliminar de los codones, es posible, sin embargo, disminuir el contenido de A y (U/T) utilizando codones con un contenido más bajo de nucleótidos A y/o (U/T). Ejemplos de éstos son: los codones para Phe se pueden modificar de (U/T)(U/T)(U/T) a (U/T) (U/T)C; los codones para Leu se pueden modificar de (U/T) (U/T)A, (U/T) (U/T)G, C(U/T) (U/T) o C(U/T)A a C(U/T)C o C(U/T)G; los codones para Ser se pueden modificar de (U/T)C(U/T) o (U/T)CA o AG(U/T) a (U/T)CC, (U/T)CG o AGC; el codón para Tyr se puede modificar de (U/T)A(U/T) a (U/T)AC;

el codón para Cys se puede modificar de (U/T)G(U/T) a (U/T)GC; el codón para His se puede modificar de CA(U/T) a CAC; el codón para Gln se puede modificar de CAA a CAG; los codones para Ile se pueden modificar de A(U/T)(U/T) o A(U/T)A a A(U/T)C; los codones para Thr se pueden modificar de AC(U/T) o ACA a ACC o ACG; el codón para Asn se puede modificar de AA(U/T) a AAC; el codón para Lys se puede modificar de AAA a AAG; los codones para Val se pueden modificar de G(U/T)(U/T) o G(U/T)A a G(U/T)C o G(U/T)G; el codón Asp se puede modificar de GA(U/T) a GAC; el codón para Glu se puede modificar de GAA a GAG; el codón de parada (U/T)AA se puede modificar a (U/T)AG o (U/T)GA.

En el caso de los codones para Met (A(U/T)G) y Trp ((U/T)GG), por otra parte, no existe posibilidad de modificación de secuencia sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada.

Las sustituciones enumeradas anteriormente se pueden utilizar ya sea individualmente o en todas las combinaciones posibles para incrementar el contenido G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva como se define aquí, comparada con su marco de lectura abierto de tipo natural particular (es decir la secuencia original). Así, por ejemplo, todos los codones para Thr que aparecen en la secuencia de tipo natural se pueden modificar a ACC (o ACG).

Preferentemente, el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva como se define aquí está incrementado en al menos un 7%, de manera más preferente al menos 15%, particularmente de manera preferente al menos 20%, comparado con el contenido G/C de la región de codificación de tipo natural. De acuerdo con una realización específica, al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de manera más preferente al menos 70%, de manera aún más preferente al menos 80% y de manera mucho más preferente al menos 90%, 95% o aún 100% de los codones sustituibles en el marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o fragmento, variante o derivado del mismo se sustituyen, incrementado así el contenido de G/C del marco de lectura abierto.

En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva como se define aquí al máximo (es decir 100% de los codones sustituibles), comparado con el marco de lectura abierto de tipo natural, sin alterar la secuencia de aminoácidos codificados.

Además, el marco de lectura abierto preferentemente está al menos parcialmente optimizado por codón. La optimización por codón se basa en el descubrimiento de que la eficiencia de traducción puede determinarse por una frecuencia diferente en la ocurrencia de ARN de transferencia (ARNt) en las células. Así, si los llamados “codones raros” están presentes en la región de codificación de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva como se define aquí en un grado incrementado, la traducción a la secuencia de ácido nucleico modificada correspondiente es menos eficiente que en el caso donde los codones que codifican los ARNt relativamente “frecuentes” están presentes.

Así, el marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva preferentemente está modificado en comparación con la región de codificación de tipo natural correspondiente de forma que al menos un codón de la secuencia de tipo natural que codifica un ARNt que es relativamente raro en la célula se intercambia por un codón que codifica un ARNt que es comparablemente frecuente en la célula y lleva el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Con esta modificación, el marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventivo como se define aquí se modifica de forma que los codones por los cuales los ARNt que aparecen frecuentemente están disponibles pueden reemplazar los codones que corresponden a los ARNt raros. En otras palabras, de acuerdo con la invención, con tal modificación todos los codones del marco de lectura abierto de tipo natural que codifica un ARNt se puede intercambiar por un codón que codifica un ARNt que es más frecuente en la célula y que lleva el mismo aminoácido que el ARNt raro. Los ARNt que aparecen relativamente de manera frecuente en la célula y aquellos que, por el contrario, aparecen de forma relativamente rara son conocidos por el experto en la materia; véase, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Por consiguiente, preferentemente el marco de lectura abierto se optimiza por codón, de manera preferente con respecto al sistema done se va a expresar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, de manera preferente con respecto al sistema en el cual la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se va a traducir. Preferentemente, el uso de codón del marco de lectura abierto se optimiza por codón de acuerdo con el uso de codón de mamífero, de manera más preferente de acuerdo con el uso de codón humano. De manera preferente, el marco de lectura abierto se optimiza con codón y se modifica el contenido de G/C.

Para mejorar adicionalmente la resistencia a la degradación, por ejemplo la resistencia a una degradación in vivo por una exo-o endonucleasa, y/o para mejorar adicionalmente la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender además modificaciones, tales como modificaciones de cadena principal, modificaciones de azúcar y/o modificaciones base, por ejemplo modificaciones de lípidos o similares. Preferentemente, la transcripción y/o la traducción de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no se deteriora significativamente por dichas modificaciones.

Análogos/modificaciones de nucleótidos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención se pueden seleccionar, por ejemplo, de 2-amino-6-cloropurinribosido-5'-trifosfato, 2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2-tiocitidina-5'-trifosfato, 2-tiouridina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5aminoaliluridina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato, 5-bromouridina-5'-trifosfato, 5-yodocitidina-5'trifosfato, 5-yodouridina-5'-trifosfato, 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 6-azacitidina-5'trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, 6-cloropurinribosido-5'-trifosfato, 7-deazaadenosina-5'-trifosfato, 7deazaguanosina-5'-trifosfato, 8-azaadenosina-5'-trifosfato, 8-azidoadenosina-5'-trifosfato, bencimidazolribosido-5'-trifosfato, N1-metiladenosina-5'-trifosfato, N1-metilguanosina-5'-trifosfato, N6-metiladenosina-5'trifosfato, O6-metilguanosina-5'-trifosfato, pseudouridina-5'-trifosfato, o puromicina-5'-trifosfato, xantosina-5'trifosfato. Son particularmente preferentes nucleótidos para modificaciones de bases seleccionados del grupo de nucleótidos modificados base que consiste en 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosina-5'-trifosfato, 5bromocitidina-5'-trifosfato y pseudouridina-5'-trifosfato.

Además, las moléculas de ácido nucleico artificiales modificadas por lípidos pueden comprender típicamente al menos un ligante que se une covalentemente a la molécula de ácido nucleico artificial y al menos un lípido que se une covalentemente a este ligante. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico artificial modificada con lípidos puede comprender al menos una molécula de ácido nucleico artificial como se define aquí y al menos un lípido, de manera preferente al menos un lípido bifuncional, que se une covalentemente, en especial sin ligante, con aquella molécula de ácido nucleico artificial. De acuerdo con una tercera alternativa, una molécula de ácido nucleico artificial modificada por lípido puede comprender una molécula de ácido nucleico artificial como se define aquí, al menos un ligante que se une covalentemente a la molécula de ácido nucleico artificial, al menos un lípido que se une covalentemente a este ligante y además al menos un lípido, preferentemente bifuncional, que se une covalentemente, preferentemente sin ligante, a la molécula de ácido nucleico artificial.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende

a.

un marco de lectura abierto (ORF) y/o un sitio de clonación para la inserción de un marco de lectura abierto

o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto; y

b.

al menos un elemento de región 3’-no traducida (elemento 3’UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina que es al menos un 80% idéntico a la variante 3’UTR natural de la cual se deriva y

c.

un tallo-bucle de histona.

El al menos un elemento 3’UTR y el ORF se describen aquí anteriormente para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención. El sitio de clonación puede ser cualquier secuencia adecuada para introducir un marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto, tal como uno o más sitios de restricción. Así, el vector que comprende un sitio de clonación preferentemente es adecuado para insertar un marco de lectura abierto en el vector, de manera preferente para insertar un marco de lectura abierto 5’ al elemento 3’UTR. Preferentemente, el sitio de clonación o el ORF se sitúa 5’ al elemento 3’UTR, de manera preferente en proximidad cercana al extremo 5’ del elemento 3’UTR. Por ejemplo, el sitio de clonación o el ORF se pueden unir directamente al extremo 5’ del elemento 3’UTR o se pueden unir a través de un tramo de nucleótidos, tal como un tramo de 2, 4, 6, 8, 10, 20, etc., nucleótidos como se describe anteriormente para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, el vector de acuerdo con la presente invención es adecuado para producir la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, de manera preferente para producir un ARNm artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, insertando opcionalmente el marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto en el vector y transcribiendo el vector. Así, preferentemente el vector comprende elementos necesarios para la transcripción, tal como un promotor, por ejemplo un promotor de ARN polimerasa. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripción utilizando sistemas de transcripción eucarióticos, procarióticos, virales o en fago, tales como células eucarióticas, células procarióticas o sistemas de transcripción in vitro eucarióticos, procarióticos, virales o en fago. De esta manera, por ejemplo, el vector puede comprender una secuencia promotora que es reconocida por una polimerasa, tal como por una ARN-polimerasa, por ejemplo una ARN-polimerasa eucariótica, procariótica, viral o en fago. En una realización preferida, el vector comprende un promotor de ARN-polimerasa

en un fago tal como SP6 o T7, preferentemente un promotor T7. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripción in vitro utilizando un sistema de transcripción in vitro basado en fago, tal como una ARpolimerasa T7 basada en el sistema de transcripción in vitro.

El vector puede comprender además una secuencia poli(A) y/o una señal de poliadenilación como se describe anteriormente para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

El vector puede ser un vector de ARN o un vector de ADN. De manera preferente, el vector es un vector de ADN. El vector puede ser cualquier vector conocido por el experto, tal como un vector viral o plásmido. De manera preferente, el vector es un vector plásmido, de manera preferente un vector plásmido de ADN.

En una realización preferente, el vector de acuerdo con la presente invención comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

De manera preferente, un vector de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34 o SEQ ID NO. 38, o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente de al menos aproximadamente 90%, aún de manera más preferente de al menos aproximadamente 95%; aún de manera más preferente de al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34 o SEQ ID NO. 38, o un fragmento de las mismas, preferentemente un fragmento funcional de las mismas..

De manera preferente, un vector de ARN de acuerdo con la presente invención comprende una secuencua según las SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37 o SEQ ID No. 39 o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37 o SEQ ID No. 39

o un fragmento de la misma, preferentemente un fragmento funcional de las mismas.

De manera preferente, el vector es una molécula circular. De manera preferente, el vector es una molécula de doble hebra, tal como una molécula de ADN de doble hebra. Tal molécula de ADN preferente de doble hebra circular se puede utilizar convenientemente como una forma de almacenamiento para la molécula de ácido nucleico artificial inventiva. Además, se puede utilizar para la transfección de células, por ejemplo células cultivadas. También se puede utilizar para la transcripción in vitro con el fin de obtener una molécula de ARN artificial de acuerdo con la invención.

Preferentemente, el vector, en especial el vector circular, es linealizable, por ejemplo por digestión con enzimas de restricción. En una realización preferida, el vector comprende un sitio de escisión, tal como un sitio de restricción, de manera preferente un sitio de escisión único, situado inmediatamente 3’ al elemento 3’UTR o – si está presente – inmediatamente 3’ a la secuencia poli(A) o señal de poliadenilación, o – si está presente – situado 3’ a la secuencia poli(C), o – si está presente – situado 3’ al tallo-bucle de histona. Así, preferentemente, el producto obtenido al linealizar el vector termina en el extremo 3’ con el extremo 3’ del elemento 3’UTR o – si está presente – con el extremo 3’ de la secuencia poli(A) o señal de poliadenilación, o -si está presente – con el extremo 3’ de la secuencia poli(C). En la realización, donde el vector de acuerdo con la presente invención comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, un sitio de restricción, preferentemente un único sitio de restricción, se sitúa de manera preferente inmediatamente 3’ al extremo 3’ de la molécula de ácido nucleico artificial.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o el vector según la presente invención. La célula puede ser cualquier célula, tal como una célula bacteriana, de insecto, célula vegetal, célula de vertebrado, por ejemplo una célula de mamífero. Tal célula puede emplearse, por ejemplo, para la replicación del vector de la presente invención, por ejemplo una célula bacteriana. Adicionalmente, la célula se puede utilizar para transcribir la molécula de ácido nucleico artificial o el vector según la presente invención y/o traducir el marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la célula se puede utilizar para producir proteínas recombinantes.

Las células de acuerdo con la presente invención se obtienen, por ejemplo, por métodos de transferencia de ácido nucleico estándar, como métodos de transfección estándar. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención se pueden transferir a la célula por electroporación, lipofección, por ejemplo en base a lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación de fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección viral virus, o basados en polímeros catiónicos, tales como

DEAE-dextrano o polietilenimina, etc.

Preferentemente, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula humana, de un animal doméstico, un animal de laboratorio, tal como una célula de ratón o rata. De manera preferente, la célula es una célula humana. La célula puede ser una célula de una línea celular establecida, tal como una célula CHO, BHK, 293T, COS-7, HELA, HEK etc., o puede ser una célula primaria, por ejemplo una célula HDF, preferentemente una célula aislada de un organismo. En una realización preferente, la célula es una célula aislada de un sujeto mamífero, de manera preferente de un sujeto humano. Por ejemplo, la célula puede ser una célula inmunitaria, tal como una célula dendrítica, una célula cancerosa o tumoral, o cualquier otra célula somática, etc., preferentemente de un sujeto mamífero, en especial de un sujeto humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención

o la célula de acuerdo con la presente invención. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede utilizar, por ejemplo, como vacuna, por ejemplo para la vacunación genética. Así, el ORF puede, por ejemplo, codificar un antígeno cuando se administra a un paciente para la vacunación. De esta manera, en una realización preferente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una vacuna. Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede utilizar, por ejemplo, para la terapia génica.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende además uno o más excipientes, vehículos, cargas y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En el contexto de la presente invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye típicamente una base líquida o no líquida para la composición farmacéutica inventiva. En una realización, la composición farmacéutica se proporciona en forma líquida. En este contexto, preferentemente el vehículo se basa en agua, tal como agua libre de pirógenos, solución salina isotónica o soluciones tampón (acuosas), por ejemplo soluciones tampón fosfato, citrato, etc. La solución tampón puede ser hipertónica, isotónica o hipotónica en relación al medio de referencia específico, es decir la solución tampón puede tener un contenido de sales más alto, idéntico o más bajo en relación al medio de referencia específico, donde preferentemente se emplean concentraciones de las sales mencionadas que no conducen al daño de las células del mamífero por ósmosis u otros efectos de la concentración. Medios de referencia son, por ejemplo, líquidos que se emplean en métodos “in vivo”, tales como líquidos sanguíneos, linfoides, citosólicos u otros líquidos corporales, por ejemplo, líquidos que se pueden utilizar como medios de referencia en métodos “in vitro”, tales como soluciones tampón habituales o líquidos. Tales soluciones tampón

o líquidos comunes son conocidos del experto. La solución de lactato de Ringer es particularmente preferente como base líquida.

Se pueden utilizar una o más cargas o sólidas o líquidas o diluyentes o compuestos encapsulantes adecuados para la administración a un paciente así como para la composición farmacéutica inventiva. El término “compatible” como se utiliza aquí significa preferentemente que estos componentes de la composición farmacéutica inventiva son capaces de mezclarse con el ácido nucleico inventivo, el vector o las células como se definen aquí de manera que no aparece una interacción que reduce la efectividad farmacéutica de la composición farmacéutica inventiva bajo las condiciones de uso típicas.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender opcionalmente además uno o más componentes farmacéuticamente activos adicionales. Un componente farmacéuticamente activo en este contexto es un compuesto que tiene un efecto terapéutico para sanar, mejorar o prevenir una indicación o enfermedad particular. Tales compuestos incluyen, sin limitación, péptidos o proteínas, ácidos nucleicos, compuestos orgánicos o inorgánicos de bajo peso molecular (terapéuticamente activos) (peso molecular inferior a 5.000, de manera preferente inferior a 1.000), azucares, antígenos o anticuerpos, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica anterior, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares, componentes de pared celular (por ejemplo polisacáridos), patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ejemplo químicamente o por irradiación) (virus, bacterias, etc.).

Además, la composición farmacéutica inventiva puede comprender un portador para la molécula de ácido nucleico artificial o el vector. Tal portador puede ser adecuado para facilitar la disolución en líquidos fisiológicos adeptables, para el transporte y la captación celular activa de la molécula de ácido nucleico artificial farmacéutica o el vector. Por consiguiente, tal portador puede ser un componente que puede ser adecuado para el almacenamiento y la administración de una molécula de ácido nucleico artificial o un vector de acuerdo con la invención. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, portadores o compuestos catiónicos o policatiónicos que pueden servir como agentes de transfección o formación de complejos.

Agentes de transfección o formación de complejos particularmente preferentes en este contexto son compuestos catiónicos o policatiónicos, incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros

péptidos o proteínas catiónicas, como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, poli-péptidos básicos, péptidos de penetración de células (CPPs), incluyendo péptidos de unión a VIH, VIH-1 Tat (VIH), péptidos derivados de Tat, Penetratina, péptidos derivados o análogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, MPG-péptido(s), Pep-1, L-oligómeros, péptido(s) de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, Lactoferrina, Transportano, Buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, o histonas.

Adicionalmente, tales compuestos catiónicos o policatiónicos o portadores pueden ser péptidos o proteínas catiónicas o policatiónicas, que preferentemente comprenden o están modificados adicionalmente para comprender al menos una parte –SH. De manera preferente, un portador catiónico o policatiónico se selecciona de péptidos catiónicos que tienen la siguiente fórmula suma (I):

{(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}; fórmula (I) donde I + m + n + o + x = 3-100, e I, m, n u o independientemente entre sí es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100 con la condición de que el contenido total de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos el 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto Arg, Lis, His u Orn; y x es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, con la condición de que el contenido total de Xaa no exceda el 90 % de todos los aminoácidos del oligopéptido. Cualquiera de los aminoácidos Arg, Lis, His, Orn y Xaa se puede situar en cualquier lugar del péptido. En este contexto los péptidos o proteínas catiónicas en un intervalo de 730 aminoácidos son particularmente preferidos.

Adicionalmente, el péptido o proteína catiónica o policatiónica, cuando se define de acuerdo con la formula {(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (I)) como se muestra anteriormente, y que comprende o está modificado adicionalmente para comprender al menos una parte –SH, puede seleccionarse, sin restringirse a, de la fórmula (Ia):

{(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa’)x (Cys)y} subfórmula (Ia) donde (Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o; y x son como se definen aquí, Xaa’ es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto Arg, Lis, His, Orn o Cys e y es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 y 81-90, con la condición de que el contenido total de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos un 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido. Adicionalmente, el péptido catiónico o policatiónico se puede seleccionar de la fórmula (Ib):

Cys1 {(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} Cys2 subfórmula (Ib) donde la fórmula empírica {(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (fórmula (III)) es como se define aquí y forma un núcleo de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula (semi empírica) (III) y donde Cys1 y Cys2 son Cisteínas próximas a, o terminales a (Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x.

Compuestos catiónicos o policatiónicos preferidos adicionales que se pueden utilizar como agentes de transfección o formación de complejos pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de 1-(2,3-sioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropildimetilhidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-( trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-(2,3-dioctadecil-oxipropil)(2hidroxietil)dimetilamonio, CLIP6: rac-2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etiltrimetilamonio, CLIP9: rac2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisuccinil-oxi)etil-trimetilamonio, oligofectamina, o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo poliaminoácidos modificados, tales como polímeros -aminoácido o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, tales como PVP, bromuro de (poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas tales como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE), tal como polímeros de 1,4butanodiol, diacrilato-co-5-amino-1-pentanol, modificados en el extremo diamina, etc., dendrímeros, tales como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polímeros basados en cadena principal de azúcar, tales como polímeros basados en ciclodextrina, polímeros basados en dextrano, quitosano, etc., polímeros basados en cadena principal de silano, tales como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros en bloque que consisten en una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo seleccionados de un polímero catiónico

como se menciona anteriormente) y uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo polietilenglicol); etc.

En este contexto, se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o el vector inventivo forme un complejo al menos parcialmente con un compuesto catiónico o policatiónico, preferentemente proteínas o péptidos catiónicos. Parcialmente significa que solo una parte de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o del vector inventivo forme un complejo con un compuesto catiónico o policatiónico y que el resto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o del vector inventivo esté en forma no complejada (libre). De manera preferente, la relación ácido nucleico complejado:ácido nucleico libre se selecciona de un intervalo de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 1:10 (p/p), de manera más preferente de un intervalo de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:8 (p/p), aún de manera más preferente de un intervalo de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:5 (p/p) o 1:3 (p/p), y de manera mucho más preferente la relación ácido nucleico complejado:ácido nucleico libre se selecciona de una relación de aproximadamente 1:1 (p/p).

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender opcionalmente además uno o más adyuvantes, por ejemplo adyuvantes para estimular el sistema inmunitario innato o para mejorar la captación celular de la molécula de ácido nucleico artificial o del vector. En este contexto, un adyuvante se puede entender como cualquier compuesto adecuado para iniciar o incrementar una respuesta inmunitaria del sistema inmunitario innato, es decir una respuesta inmunitaria no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica inventiva preferentemente induce una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante contenido opcionalmente en la misma. De manera preferente, tal adyuvante puede ser un adyuvante que apoye la inducción de una respuesta inmunitaria innata en un mamífero. Tal adyuvante puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico inmunoestimulador, es decir un ácido nucleico que se puede unir a un receptor similar a Toll o el similar, de manera preferente un ARN inmunoestimulador.

Tales adyuvantes, preferentemente tales ácidos nucleicos inmunoestimuladores, pueden inducir una respuesta inmunitaria innata, es decir no específica, que puede apoyar una respuesta específica, adaptativa, inmune al péptido o proteína, es decir al antígeno, codificado por la molécula de ácido nucleico artificial de la composición farmacéutica, preferentemente la vacuna.

La composición farmacéutica inventiva también puede comprender adicionalmente cualquier compuesto adicional conocido por ser inmunoestimulador debido a su afinidad de unión (como ligandos) a los receptores similares a Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, o debido a su afinidad de ligación (como ligandos) a los receptores similares a Toll murinos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13.

Otros aditivos adicionales que se pueden incluir en la composición farmacéutica inventiva son, por ejemplo, emulsificantes, por ejemplo Tween®; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes, portadores farmacéuticos; agentes formadores de pastillas; estabilizantes, antioxidantes; conservantes, etc.

Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende una “cantidad segura y efectiva” de los componentes de la composición farmacéutica, particularmente de la secuencia de ácido nucleico inventiva, del vector y/o de las células como se definen aquí. Como se utiliza aquí, una “cantidad segura y efectiva” significa una cantidad suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno como se define aquí. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y efectiva” preferentemente evita efectos secundarios serios y permite una relación sensible entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites está típicamente dentro del alcance del juicio médico sensible.

En otro aspecto, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso como medicamento, por ejemplo como vacuna (en la vacunación genética) o en la terapia génica.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para cualquier aplicación medica que hace uso de la acción terapéutica o efecto de los péptidos, polipéptidos o proteínas, o donde es necesaria la suplementación de un péptido o proteína particular. Así, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos sensibles al tratamiento por la acción terapéutica o

efecto de los péptidos, polipéptidos o proteínas sensibles al tratamiento mediante suplementación de un péptido, polipéptido o proteína particular. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de enfermedades genéticas, enfermedades autoinmunes, enfermedades cancerosas o relacionadas con tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades crónicas o similares, por ejemplo, por vacunación genética o terapia génica.

En particular, tales tratamientos terapéuticos que se benefician de una presencia estable, prolongada y/o incrementada de péptidos terapéuticos, polipéptidos o proteínas en un sujeto a tratar son especialmente adecuados como aplicación medica en el contexto de la presente invención, ya que el elemento 3’UTR proporciona una expresión de proteínas incrementada del ORF de la molécula de ácido nucleico inventiva. Así, una aplicación médica particularmente adecuada para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es la vacunación, por ejemplo contra infecciones o tumores. De esta manera, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para la vacunación de un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, en especial un sujeto humano. Los tratamientos de vacunación preferentes son la vacunación contra enfermedades infecciosas, como infecciones bacterianas, protozoarias o virales, y la vacunación anti-tumoral. Tales tratamientos de vacunación pueden ser profilácticos o terapéuticos.

El ORF se puede seleccionar dependiendo de la enfermedad a tratar o prevenir. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una proteína que tiene que ser suministrada a un paciente que sufre de carencia total o al menos pérdida parcial de la función de una proteína, tal como un paciente que sufre de una enfermedad genética. Adicionalmente, el marco de lectura abierto se puede elegir de un ORF que codifica un péptido o proteína que influye beneficiosamente en una enfermedad o en la condición de un sujeto. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar un péptido o proteína que afecta la regulación por decremento de una sobreproducción patológica de un péptido o proteína natural o por la eliminación de células que expresan patológicamente una proteína o péptido. Tal carencia, pérdida de función o sobreproducción pueden aparecer, por ejemplo, en el contexto de tumores y neoplasias, enfermedades autoinmunes, alergias, infecciones, enfermedades crónicas o similares. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar para un antígeno o inmunógeno, por ejemplo un epítopo de un patógeno o para un antígeno tumoral. Así, en realizaciones preferentes, la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención comprende un ORF que codifica la secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste en un antígeno o inmunógeno, por ejemplo un epítopo de un patógeno o un antígeno asociado a tumor, un elemento 3’UTR como se describe anteriormente y componentes adicionales opcionales, como una secuencia poli(A), etc.

En el contexto de la aplicación médica, en particular en el contexto de la vacunación, es preferente que la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención sea ARN, en especial ARNm, ya que el ADN conlleva el riesgo de inducir una respuesta inmunitaria anti-ADN y tiende a insertarse en el ADN genómico. Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo si se utiliza un vehículo de suministro viral, tal como un vehículo adenoviral, para la administración de la molécula de ácido nucleico artificial o del vector de acuerdo con la presente invención, por ejemplo en el contexto de los tratamientos terapéuticos génicos, puede ser deseable que la molécula de ácido nucleico artificial o el vector sea una molécula de ADN.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se pueden administrar vía oral, parenteral, por rociado en inhalación, vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término parenteral como se utiliza aquí incluye subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial, e inyección sublingual o técnicas de infusión.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administran parenteralmente, por ejemplo, por inyección parenteral, en especial por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial, inyección sublingual o por técnicas de infusión. Es particularmente preferente la inyección intradérmica e intramuscular. Las formas inyectables estériles de la composición

farmacéutica inventiva puede ser una suspensión acuosa u oleosa. Estas suspensiones se pueden formular según técnicas conocidas en la técnica utilizando agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se pueden administrar oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se pueden administrar tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por la aplicación tópica, por ejemplo incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede formular en una pomada adecuada suspendidos o disueltos en uno o más vehículos.

En una realización, el uso como un medicamento comprende la etapa de transfectar células de mamífero, preferentemente in vitro de células de mamífero, en especial transfectar in vitro células aisladas de un sujeto a tratar por el medicamento. Si el uso comprende la transfección in vitro de células aisladas, el uso como medicamento puede comprender además la (re)administración de las células transfectadas al paciente. El uso de las moléculas de ácido nucleico artificiales inventivas o del vector como un medicamento puede comprender además la etapa de seleccionar las células aisladas exitosamente transfectadas. Así, puede ser beneficioso si el vector comprende además un marcador de selección. También, el uso como medicamento puede comprender la transfección in vitro de células aisladas y la purificación de un producto de expresión, es decir la proteína o péptido codificado a partir de estas células. Este péptido o proteína purificada se puede administrar subsecuentemente a un sujeto que lo necesite.

Se proporciona aquí un método (no reivindicado) para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno como se describe anteriormente, que comprende administrar la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención a un sujeto que lo necesite.

Adicionalmente, se proporciona aquí un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno que comprende la transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o con el vector de acuerdo con la presente invención. La transfección se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. En una realización preferida, la transfección de una célula se lleva a cabo in vitro y la célula transfectada se administra a un sujeto que lo necesite, preferentemente a un paciente humano. De manera preferente, la célula a transfectar in vitro es una célula aislada del sujeto, de manera preferente del paciente humano. Así, un método de tratamiento (no reivindicado) comprende las etapas de aislar una célula de un sujeto, preferentemente de un paciente humano, transfectar la célula aislada con la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o el vector de acuerdo con la presente invención, y administrar la célula transfectada al sujeto, preferentemente al paciente humano.

El método para tratar o prevenir un trastorno de acuerdo con la presente invención es preferentemente un método de vacunación y/o un método de terapia génica como se describe anteriormente.

Como se describe en lo anterior, el elemento 3’UTR inventivo es capaz de estabilizar una molécula de ARNm y/o de estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de una molécula de ARNm. De esta manera, también se describe aquí un método para estabilizar una molécula de ARN, preferentemente una molécula de ARNm, que comprende la etapa de asociar la molécula de ARN, en especial de ARNm, o un vector que codifica la molécula de ARN, a un elemento 3’UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, de manera preferente con el elemento 3’UTR como se describe anteriormente.

Además, se proporciona aquí un método para implementar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico o de un vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico artificial o de un vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, comprendiendo el método la etapa de asociar la molécula de ácido nucleico o el vector, preferentemente la molécula ARNm, a un elemento 3’UTR que comprende o consiste en

una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, de manera preferente con el elemento 3’UTR como se describe anteriormente.

El término “que asocia la molécula de ácido nucleico artificial o el vector a un elemento 3’UTR” en el contexto de la presente invención preferentemente significa asociar funcionalmente o combinar funcionalmente la molécula de ácido nucleico artificial o el vector al elemento 3’UTR. Esto significa que la molécula de ácido nucleico artificial o el vector y el elemento 3’UTR, de manera preferente el elemento 3’UTR como se describe anteriormente, se asocian o acoplan de forma que la función del elemento 3’UTR, por ejemplo se ejerce la función de estabilización de la producción de ARN y/o proteínas. Típicamente, esto significa que el elemento 3’UTR se integra en la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, preferentemente la molécula ARNm, 3’ a un marco de lectura abierto, de manera preferente inmediatamente 3’ a un marco de lectura abierto, de manera preferente entre el marco de lectura abierto y una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación. Preferentemente, el elemento 3’UTR se integra en la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, como 3’UTR, es decir de forma que el elemento 3’UTR es la 3’UTR de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, es decir, tal que se extiende desde el lado 3’ del marco de lectura abierto al lado 5’ de una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación, opcionalmente unido a través un ligante corto, tal como una secuencia que comprende o consiste en uno o más sitios de restricción. De esta manera, preferentemente el término “que asocia la molécula de ácido nucleico artificial o el vector con un elemento 3’UTR” significa asociar funcionalmente el elemento 3’UTR con un marco de lectura abierto situado dentro de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente dentro de la molécula de ARNm. La 3’UTR y el ORF son como se describen en lo anterior para la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención, por ejemplo preferentemente el ORF y la 3’UTR son heterólogos, por ejemplo derivados de genes diferentes, como se describe anteriormente.

Además, también se describe aquí el uso de un elemento 3’UTR, preferentemente del elemento 3’UTR como se describe anteriormente, para incrementar la estabilidad de una molécula de ARN, preferentemente de ARNm, donde el elemento 3’UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina.

Además, también se describe aquí el uso de un elemento 3’UTR, preferentemente el elemento 3’UTR como se describe anteriormente, para incrementar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico o un vector, de manera preferente una molécula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la producción de proteína de una molécula de ácido nucleico artificial o una molécula vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, donde el elemento 3’UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina como se describe anteriormente.

Los usos de acuerdo aquí descritos comprenden preferentemente asociar la molécula de ácido nucleico, el vector o el ARN al elemento 3’UTR como se describe anteriormente.

Los compuestos e ingredientes de la composición farmacéutica inventiva también se pueden fabricar y tratar separadamente entre sí. De esta manera, la invención se refiere adicionalmente a un kit o kit de partes que comprende una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con la invención, una célula de acuerdo con la invención y/o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. De manera preferente, tal kit o kit de partes pueden comprender además instrucciones de uso, células para la transfección, un adyuvante, un medio para la administración de la composición farmacéutica, un portador farmacéuticamente aceptable y/o una solución farmacéuticamente aceptable para la disolución o dilución de la molécula de ácido nucleico artificial, el vector, las células o la composición farmacéutica.

Las siguientes Figuras, Secuencias u Ejemplos se proponen para ilustrar la invención. No deben entenderse como limitativas de su alcance.

Fig. 1: muestra el efecto de la 3’UTR α-globina humana, de la 3’UTR de albúmina humana y de la 3’UTR β-glucuronidasa humana en la expresión de luciferasa por parte del ARNm artificial. Aquí, el ARNm que comprende la 3’UTR de albúmina humana es un ARNm de acuerdo con la presente invención. Comprende un marco de lectura abierto que codifica la Luciferasa de Photinus pyralis, seguido en la dirección 5’ a 3’ por un elemento 3’UTR acuerdo con SEQ ID No. 2 y por una secuencia poli(A) que tiene una longitud de 64 adeninas. Se puede observar una expresión de proteína notablemente prolongada del ARNm artificial que contiene la 3’UTR de albúmina humana que corresponde a SEQ ID No. 2. Se examinó el efecto de la 3’-UTR de α-globina humana, de la 3’-UTR de albúmina humana

o de la 3’-UTR de β-glucuronidasa humana en la expresión de luciferasa del ARNm en comparación con la expresión de Luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR. Así, se electroporaron diferentes ARNm en células HeLa. Los niveles de Luciferasa se midieron 6, 24, y 48 horas después

de la transfección. El nivel de luciferasa del ARNm carece de una 3’-UTR cae desde 6 horas a 48 horas, permaneciendo el 10% de la señal a las 6 horas hasta 48 horas. La 3’-UTR de α-globina estabiliza la expresión de luciferasa del ARNm moderadamente. Sorprendentemente, sin embargo la 3’-UTR de albúmina humana inventiva extiende notablemente adicionalmente la expresión de

5 Luciferasa del ARNm. En contraste, la 3’-UTR del ARNm de β-glucuronidasa estable no prolonga la expresión de Luciferasa al grado observado para la 3’-UTR de albúmina, confirmando que la 3’-UTR de albúmina es particularmente eficiente en prolongar la expresión de proteínas de ARNm. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para transfecciones por triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.1.

10 Fig. 2: muestra el efecto de la 3’-UTR de albúmina humana en la expresión de luciferasa a partir de ARNm en comparación con la expresión de luciferasa del ARNm que contiene la 3’-UTR de α-globina humana o la 3’-UTR de cada uno de varios ARNm estables diferentes. Así, los diferentes ARNm se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24 y 48 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR cae desde las 6 horas

15 a 48 horas, manteniendo un 14% de la señal a las 6 horas en 48 horas. La 3’-UTR de α-globina estabiliza la expresión de luciferasa del mRNA moderadamente. Sorprendentemente sin embargo, la 3’-UTR de albúmina humana inventiva prolonga notablemente además la expresión de luciferasa del ARNm. Comparadas con la 3’-UTR de albúmina, las 3’-UTR de diferentes ARNm estables afectan a la expresión de luciferasa del ARNm de manera mucho menos favorable: las 3’-UTR atp5o

20 y atp5l estabilizan la expresión de luciferasa mucho menos que la 3’-UTR de albúmina. Además, las 3’-UTR atp5o y atp5l reducen sustancialmente los niveles de luciferasa comparados con la 3’-UTR de albúmina. La 3’-UTR del ARNm de ndufa1 estable estabiliza la expresión de luciferasa notablemente. Sin embargo, la 3’-UTR ndufa1 también reduce esencialmente los niveles de luciferasa. La 3’-UTR de albúmina es única para prolongar la expresión de proteína a la vez que

25 mantiene la expresión de proteína total. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) de transfecciones por triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo

5.2. Fig. 3: muestra el efecto de mutaciones puntuales para eliminar ya sea un sitio de restricción HindIII y/o XbaI y/o una señal de terminación T7 de la 3’-UTR de albúmina humana en la expresión de luciferasa

30 del ARNm que contiene la 3’-UTR albúmina humana. Así, diferentes ARNm se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal de la RrLuc co-transfectada. La 3’-UTR de α-globina estabiliza la expresión de luciferasa del ARNm solo muy moderadamente. En contraste, todas las variantes de la 3’-UTR de albúmina prolongaron

35 notablemente la expresión de luciferasa del ARNm. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para transfecciones por triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4.

Fig. 4: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – A64 que carece de una 3’-UTR. Fig. 5: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana 40 se insertó entre el ORF y poli(A). La secuencia se tomó de Dugaiczyk y col. 1982; Proc Natl Acad Sci U S A. Jan;79(1):71-5.

Fig. 6: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 2 – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 eliminada por una mutación puntual individual, se insertó entre el ORF y poli(A).

45 Fig. 7: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 3 – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 eliminada por una mutación puntual individual, se insertó entre el ORF y poli(A).

Fig. 8: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 4 – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 eliminada por una mutación puntual individual, se insertó 50 entre el ORF y poli(A).

Fig. 9: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 5 – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 eliminada por dos mutaciones puntuales consecutivas, se insertó entre el ORF y poli(A).

Fig. 10: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 6 – A64. La 3’-UTR de la albúmina 55 humana, con los sitios de restricción HindIII y XbaI eliminados por dos mutaciones puntuales individuales, se insertó entre el ORF y poli(A).

Fig. 11: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 7 – A64. La 3’-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 así como los sitios de restricción HindIII y XbaI eliminados por tres mutaciones puntuales individuales, se insertó entre el ORF y poli(A).

60 Fig. 12: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – ag – A64. La porción de ligación a α-complejo, central de la 3’-UTR de la α-globina humana se insertó entre el ORF y poli(A). Fig. 13: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – gusb – A64. La 3’-UTR de la β-glucuronidasa humana se insertó entre el ORF y poli(A). Fig. 14: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – atp5o – A64. La 3’-UTR de la subunidad O de ATP

5

Fig. 15: Fig. 16: Fig. 17: sintasa humana se insertó entre ORF y poli(A). muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – ndufa1 – A64. La 3’-UTR de la subunidad 1 subcompleja α de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 humana se insertó entre el ORF y poli(A). muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – atp5l – A64. La 3’-UTR de la subunidad g de ATP sintasa humana se insertó entre el ORF y poli(A). ilustra el efecto de estabilización de producción de proteínas y/o la prolongación de producción de proteínas del elemento 3’UTR de acuerdo con la presente invención. Las curvas representan la cantidad de proteína producida de las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo en células de

10 15

mamífero, medida en el tiempo. La línea continua representa la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo un ARNm artificial, la línea discontinua representa la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia, por ejemplo que carece de una 3’UTR o que comprende una 3’UTR de referencia tal como una 3’UTR de origen natural con el ORF que codifica la proteína reporter. La línea negrilla horizontal continua representa un valor de umbral. Este puede ser, por ejemplo, la cantidad de proteína medida 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresión, tal como posttransfección de la molécula de ácido nucleico. Se puede observar que la cantidad de proteína producida de una molécula de ácido nucleico de referencia reduce el valor umbral aproximadamente

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Fig. 18: 32 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección, mientras que la cantidad de proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención reduce el valor umbral aproximadamente 68 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección. La cantidad total de proteína producida iguala el área bajo la curva (AUC). Preferentemente, la cantidad total de proteína producida a partir de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención es al menos la cantidad total de la proteína producida por una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3’UTR. muestra el efecto de diferentes 3’-UTR de albúmina de primate en la expresión de luciferasa de un

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ARNm artificial, comparada con la expresión de luciferasa de un ARNm que carece de una 3’-UTR. Aquí, el ARNm que comprende la 3’UTR de albúmina humana (albúmina) y el ARNm que comprende la 3’UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) son ARNm de acuerdo con la presente invención. Comprenden un marco de lectura abierto que codifica la Luciferasa de Photinus pyralis, seguido en la dirección 5’ a 3’ por un elemento 3’UTR de acuerdo con SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 33 y por una secuencia poli(A) con una longitud de 64 adeninas. Se observa una expresión de proteína notablemente prolongada de los ARNm artificiales que contienen las 3’UTR de albúmina que corresponden a SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 33. Se examinó el efecto de la 3’-UTR de albúmina

35 40

humana y la 3’UTR de albúmina de Olive baboon en la expresión de luciferasa del ARNm comparado con la expresión de Luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR. Para examinar la expresión de luciferasa, los diferentes ARNm se electroporaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF). Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3’-UTR desciende de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas se mantiene en 72 horas. Otra vez, la 3’-UTR de albúmina humana inventiva prolonga notablemente la expresión de luciferasa de ARNm. La 3’-UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa del ARNm al mismo nivel que la secuencia de 3’UTR

45 50

Fig. 19: de albúmina humana. Las 3’-UTR de albúmina de primate son así particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteína del ARNm. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) de transfecciones por triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4, tabla 7. muestra el efecto de diferentes 3’-UTR de albúmina de primate en la expresión de luciferasa del ARNm, comparado con la expresión de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR, utilizando un método de transfección diferente. Así, diferentes ARNm se lipofectaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF). Los niveles de Luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3’-UTR desciende de 6 horas a 48

55

Fig. 20: horas a 82% de la señal de 6 horas. Nuevamente, la 3’-UTR de albúmina humana prolonga notablemente la expresión de luciferasa del ARNm, la señal de 48 horas es más alta que la señal de 6 horas. La 3’-UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa de ARNm en un grado similar a la secuencia de 3’UTR de albúmina humana. Las 3’-UTR de albúmina de primate son así particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) en transfecciones por triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4, tabla 9. muestra el efecto de diferentes 3’-UTR de albúmina de primate en la expresión de luciferasa del

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ARNm en células de ratón, comparada con la expresión de luciferasa de ARNm que carece de una 3’-UTR. Así, diferentes ARNm se lipofectaron en células L-929, una línea celular de fibroblasto murino. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3’-UTR desciende de 6 horas a 48 horas, 23% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. Aún en las células de murino la 3’-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa de ARNm. La 3’-UTR de albúmina de

Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa del ARNm similarmente. Las 3’-UTR de albúmina de primate son así particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteína del ARNm en los tipos celulares de mamífero. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) de transfecciones por triplicado. La RLU se resume en los Ejemplo 5.5, tabla 11.

Fig. 21: muestra el efecto de diferentes 3’-UTR de albúmina de mamífero en la expresión de luciferasa del ARNm, comparado con la expresión de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR. Así, diferentes ARNm se transfectaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR desciende de 6 horas a 48 horas, 49% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. Nuevamente, la 3’-UTR de albúmina humana y la 3’-UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolongó notablemente la expresión de luciferasa del ARNm, la señal de 48 horas que es más alta que la señal de 6 horas. De manera importante, también la 3’-UTR de albúmina de ratón (albúmina 9) prolonga la expresión de luciferasa de ARNm similarmente. Las 3’-UTR de albúmina de mamífero son así particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteína de ARNm. Los datos se muestran como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) en transfecciones por triplicado. La RLU se resume en los Ejemplo 5.6, tabla 13.

Fig. 22: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 8 – A64. La 3’-UTR de albúmina de Olive baboon se insertó entre el ORF y poli(A). La secuencia se tomó de la Secuencia de Referencia NCBI XM_003898783.1.

Fig. 23: muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) – albúmina 9 – A64. La 3’-UTR de albúmina de ratón se insertó entre el ORF y poli(A). La secuencia se tomó de la Secuencia de Referencia NCBI NM_009654.3.

Ejemplos

1. Preparación de plantillas de ADN

Se construyó un vector para la transcripción in vitro que contenía un promotor T7 seguido por una secuencia enriquecida en GC que codifica la luciferasa de Photinus pyralis (PpLuc(GC)) y una secuencia A64 poli(A). La secuencia poli(A) fue seguida inmediatamente por un sitio de restricción utilizada para la linealización del vector antes de la transcripción in vitro a fin de obtener un ARNm que termina en una secuencia poli(A) A64. El ARNm así obtenido de este vector por la transcripción in vitro se denomina “PpLuc(GC) – A64N64”. Este vector se modificó para incluir las secuencias no traducidas 3’ del marco de lectura abierto (3’UTR). Los vectores comprenden las siguientes secuencias de codificación de ARNm (Figuras 4 a 16 y Figuras 22 a 23): SEQ ID NO. 5 (Figura 4): PpLuc(GC) – A64 SEQ ID NO. 6 (Figura 5): PpLuc(GC) – albúmina – A64 SEQ ID NO. 7 (Figura 6): PpLuc(GC) – albúmina 2 – A64 SEQ ID NO. 8 (Figura 7): PpLuc(GC) – albúmina 3 – A64 SEQ ID NO. 9 (Figura 8): PpLuc(GC) – albúmina 4 – A64 SEQ ID NO. 10 (Figura 9): PpLuc(GC) – albúmina 5 – A64 SEQ ID NO. 11 (Figura 10): PpLuc(GC) – albúmina 6 – A64 SEQ ID NO. 12 (Figura 11): PpLuc(GC) – albúmina 7 – A64 SEQ ID NO. 13 (Figura 12): PpLuc(GC) – ag – A64 SEQ ID NO. 14 (Figura 13): PpLuc(GC) – gusb – A64 SEQ ID NO. 15 (Figura 14): PpLuc(GC) – atp5o – A64 SEQ ID NO. 16 (Figura 15): PpLuc(GC) – ndufa1 – A64 SEQ ID NO. 17 (Figura 16): PpLuc(GC) – atp5l – A64 SEQ ID NO. 40 (Figura 22): PpLuc(GC) – albúmina 8 – A64 SEQ ID NO. 41 (Figura 23): PpLuc(GC) – albúmina 9 – A64

Los ARNm utilizados en los ejemplos se obtienen por transcripción in vitro de los vectores.

2. Transcripción in vitro

La plantilla de ADN de acuerdo con el Ejemplo 1 se linealizó y se transcribió in vitro utilizando la T7-Polimerasa. La plantilla de ADN luego se digirió por el tratamiento de ADNasa. Los transcriptos de ARNm contenían una la estructura cap 5' obtenida agregando un exceso de N7-Metil-Guanosin-5'-Trifosfato-5'-Guanosina a la reacción de transcripción. El ARNm así obtenido se purificó y se resuspendió en agua.

3. Transfección de células

3.1 Electroporación del ARNm

Las células se tripsinaron y se lavaron en opti-MEM. 5x104 o 1x105 células en 200 μl de opti-MEM se electroporaron cada una con 0,3 o 1 μg de ARNm que codifica PpLuc. Como control, un ARNm que no codifica para PpLuc se electroporó separadamente. En algunos experimentos, el ARNm que codifica la luciferasa de Renilla reniformis (RrLuc) se electroporó junto con el ARNm de PpLuc para controlar la eficiencia de transfección (0,1 µg de ARNm de RrLuc). Las células electroporadas se sembraron en placas de 24 pocillos en 1 ml de medio. 6, 24, o 48 horas después de la transfección (o 72 horas en algunos experimentos), el medio se aspiró y las células se lisaron en 200 µl de solución tamón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,5 (HCl), EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, DTT 2 mM, PMSF 1 mM o alternativamente en solución tampón de lisis pasiva, Promega). Los lisados se almacenaron a -20ºC hasta que se midió la actividad de la luciferasa.

3.2 Lipofección del ARNm

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos tres días antes de la transfección (2.500 o 5.000 células por pocillo). Inmediatamente antes de la lipofección, las células se lavaron en opti-MEM. Las células se lipofectaron con 25 ng de ARNm que codifica PpLuc por pocillo complejado con Lipofectamine2000. El ARNm que codifica la luciferasa de Renilla reniformis (RrLuc) se cotransfectó junto con el ARNm de PpLuc para controlar la eficiencia de transfección (2,5 ng de ARNm de RrLuc por pocillo). 6, 24, 48, o 72 horas después de la transfección, el medio se aspiró y las células se lisaron en 100 µl de solución tampón de lisis (Passive Lysis Buffer, Promega). Los lisados se almacenaron a -80ºC hasta que se midió la actividad de la luciferasa.

4. Medida de la luciferasa

La actividad de la luciferasa se midió como unidades de luz relativas (RLU) en un lector de placas BioTek SynergyHT. La actividad de PpLuc se midió en 15 segundos de tiempo de medida utilizando 50 µl de lisado y 200 µl de solución tampón de luciferina (75 µM de luciferina, Glicilglicina 25 mM, pH 7,8 (NaOH), MgSO4 15 mM, ATP 2 mM). La actividad de RrLuc se midió en 15 segundos de tiempo de medición utilizando 50 µl de lisado 200 µl de solución tampón de coelenterazina (40 µM de coelenterazinan EDTA 2,2 mM, KH2PO4/K2HPO4 220 mM, pH 5,0, NaCl 1,3 mM, 0,44 g/1 BSA). Alternativamente, la actividad de luciferasa se midió como unidades de luz relativas (RLU) en el lector de placas Hidex Chameleon. La actividad de PpLuc se midió a 2 segundos del tiempo de medición utilizando 20 µl de lisado y 100 µl de solución tampón de luciferina (Beetle-Juice, PJK GmbH). La actividad de RrLuc se midió a 2 segundos de tiempo de medición utilizando 20 µl de lisado y 100 µl de solución tampón de coelenterazina (Renilla-Juice, PJK GmbH).

5. Resultados

5.1 3’-UTR de albúmina prolonga la expresión de proteínas del ARNm notablemente más que la 3’-UTR de α-globina bien conocida

Para investigar el efecto de las regiones 3’-no traducidas en la expresión de proteínas del ARNm, se sintetizaron ARNm con diferentes 3’-UTR de acuerdo con los Ejemplos 1-2: el ARNm contenía ya sea la porción de unión a α-complejo, central de la 3’-UTR de la α-globina (PpLuc(GC)-ag-A64 humana de acuerdo con SEQ ID No. 13), puesto que la 3’-UTR α-globina se ha reportado para estabilizar el ARNm independientemente de la secuencia de región de codificación (Rodgers, N.D., Wang, Z. & Kiledjian, M., 2002. Regulated alpha-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3’-to-5’ exosome-dependent decapping. RNA, 8(12), S.1526 -1537). Alternativamente, el ARNm contenía la 3’-UTR de albúmina humana (PpLuc(GC)-albúmina-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 6). El ARNm de albúmina humana se ha reportado que es estable (Johnson, T.R. y col., 1991. Newly synthesized RNA: simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albúmina in growth hormone-stimulated hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(12), S.5287-5291). Finalmente, el ARNm que contiene la 3’-UTR de β-glucuronidasa (PpLuc(GC)-gusb-A64 humana de acuerdo con SEQ ID No. 14) se utilizó. Este ARNm de β-glucuronidasa humana también se ha reportado que es estable (Watson, G. & Paigen, K., 1987. Genetic variations in kinetic constants that describe beta-glucuronidase mRNA induction in androgen-treated mice. Molecular and Cellular Biology, 7(3), S.1085 -1090.). Para comparación, el ARNm que carece de una 3’-UTR también se utilizó (PpLuc(GC)-A64 acuerdo con SEQ ID No. 5). Los ARNm que codifican la luciferasa se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección (ver la siguiente Tabla 1 y la Figura 1).

Tabla 1:

ARNm

RLU a 6 horas RLU a 24 horas RLU a 48 horas

PpLuc(GC)-A64

299993 162445 29168

PpLuc(GC)-ag-A64

571131 574896 120029

PpLuc(GC)-albúmina-A64

364580 476567 277317

PpLuc(GC)-gusb-A64

357513 431134 134463

El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, el 10% de la señal de 6 horas se mantiene a las 48 horas. La 3’-UTR de α-globina estabilizó la expresión de luciferasa de ARNm solamente de manera moderada. Sorprendentemente, sin embargo, la 3’-UTR de albúmina humana prolongó notablemente de manera adicional la expresión de luciferasa del ARNm. En contraste, la 3’-UTR de la βglucuronidasa no prolongó la expresión de luciferasa al grado observado para la 3’-UTR de albúmina. Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa en 48 horas y 6 horas, las figuras más altas indican la estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2:

ARNm

RLU a las 48 horas / RLU a 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,10

PpLuc(GC)-ag-A64

0,21

PpLuc(GC)-albúmina-A64

0,76

PpLuc(GC)-gusb-A64

0,38

10 La 3’-UTR de albúmina estabilizó la expresión de proteínas mucho más que la 3’-UTR de α-globina bien conocida y más que la 3’-UTR del ARNm de β-glucuronidasa estable. Este resultado demuestra que la 3’-UTR de albúmina es particularmente eficiente para prolongar la expresión de proteínas a partir del ARNm.

5.2 La 3’-UTR de albúmina es única en prolongar la expresión de proteínas a la vez que mantiene la expresión de proteínas total

15 La extensión de la expresión de proteínas por la 3’-UTR de albúmina podría manifestar un efecto genérico de las 3’-UTR de ARNm estables (aunque el efecto muy limitado de la 3’-UTR de α-globina observado en el Ejemplo 5.1 no apoya este argumento). Así, se sintetizaron ARNm que contenían la 3’-UTR de los ARNm estables (Friedel, C.C. et el., 2009. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Research, 37(17), S.e115.) atp5o o ndufa1 o atp5l (subunidad O de ATP sintasa

20 humana, subunidad 1 de subcomplejo α de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] o subunidad g ATP sintasa humana, respectivamente). Los ARNm que codifican luciferasa se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección (ver la siguiente Tabla 3 y la Figura 2).

Tabla 3:

ARNm

RLU a 6 horas RLU a 24 horas RLU a 48 horas

PpLuc(GC)-A64

529804 725602 72348

PpLuc(GC)-ag-A64

1065036 1790023 263484

PpLuc(GC)-albúmina-A64

548821 1261832 523000

PpLuc(GC)-atp5o-A64

239418 402629 79566

PpLuc(GC)-ndufa1-A64

116139 277149 133723

PpLuc(GC)-atp5l-A64

58610 56553 9728

El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, el 14% de la señal

25 de 6 horas permanece a las 48 horas. La 3’-UTR de α-globina estabilizó la expresión de luciferasa del ARNm moderadamente. Sorprendentemente sin embargo, loa 3’-UTR de albúmina humana prolongó notablemente además la expresión de luciferasa del ARNm. Comparada con la 3’-UTR de albúmina, las 3’-UTR de varios ARNm estables diferentes afectaron la expresión de luciferasa del ARNm de forma mucho menos favorable: las 3’-UTR atp5o y atp5l estabilizaron la expresión de luciferasa mucho menos que la 3’-UTR de albúmina.

30 Además se redujeron sustancialmente los niveles de luciferasa de las atp5o y atp5l en comparación con la 3’

UTR de albúmina. La 3’-UTR del ARNm ndufa1 estable no estabilizó la expresión de luciferasa notablemente. Sin embargo, la 3’-UTR ndufa1 también redujo los niveles de luciferasa sustancialmente. Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa a las 48 horas y las 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo la expresión de proteínas, se resume en la Tabla 4.

Tabla 4:

ARNm

RLU a 48 horas / RLU a 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,14

PpLuc(GC)-ag-A64

0,25

PpLuc(GC)-albúmina-A64

0,95

PpLuc(GC)-atp5o-A64

0,33

PpLuc(GC)-ndufa1-A64

1,15

PpLuc(GC)-atp5l-A64

0,17

La 3’-UTR de albúmina fue única prolongando la expresión de proteínas a la vez que mantenía la expresión de proteínas total. La 3’-UTR de albúmina produjo una expresión de proteínas sustancialmente más alta en el último punto de tiempo comparada con la 3’-UTR de la α-globina bien conocida y 3’-UTR de varios ARNm

10 estables diferentes. Este resultado demuestra que la 3’-UTR de albúmina es particularmente adecuada para prolongar la expresión de proteínas a partir del ARNm.

5.3 Diferentes variantes de la 3’-UTR de albúmina prolongaron la expresión de proteínas del ARNm

La 3’-UTR de albúmina humana contiene un sitio de restricción HindIII, un sitio de restricción XbaI, un sitio de restricción y una señal de terminación T7. Así, se sintetizó ARNm conteniendo variantes de la 3’-UTR de

15 albúmina humana con los sitios de restricción HindIII y/o XbaI y/o la señal de terminación T7 eliminada por mutación(es) puntual(es) (PpLuc(GC)-albúmina 2-7 de acuerdo con SEQ ID Nos. 17-12). Los ARNm que codifican luciferasa se electroporaron en las células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección para la señal de RrLuc co-transfectada (ver la siguiente Tabla 5 y la Figura 3).

20 Tabla 5:

ARNm

RLU 6 horas RLU 24 horas RLU 48 horas RLU 72 horas

PpLuc(GC)-A64

382909 576557 122118 20962

PpLuc(GC)-ag-A64

281262 536346 118000 20356

PpLuc(GC)-albúmina-A64

199494 499804 282475 134271

PpLuc(GC)-albúmina 2-A64

258516 655711 351888 186869

PpLuc(GC)-albúmina 3-A64

219365 547307 292511 124330

PpLuc(GC)-albúmina 4-A64

236873 576151 298229 139260

PpLuc(GC)-albúmina 5-A64

223815 576899 289954 131145

PpLuc(GC)-albúmina 6-A64

180412 455039 240086 99802

PpLuc(GC)-albúmina 7-A64

174371 417171 216048 68887

Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa a las 72 horas y las 6 horas, las figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó con el tiempo la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6:

ARNm

RLU 72 horas / RLU 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,05

PpLuc(GC)-ag-A64

0,07

PpLuc(GC)-albúmina-A64

0,67

PpLuc(GC)-albúmina 2-A64

0,72

PpLuc(GC)-albúmina 3-A64

0,57

PpLuc(GC)-albúmina 4-A64

0,59

PpLuc(GC)-albúmina 5-A64

0,59

PpLuc(GC)-albúmina 6-A64

0,55

PpLuc(GC)-albúmina 7-A64

0,40

El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas se mantiene a las 72 horas. La 3’-UTR de α-globina estabilizó la expresión de luciferasa de ARNm solo muy moderadamente. En contraste, todas las variantes de la 3’-UTR de albúmina prolongaron

5 notablemente la expresión de luciferasa de ARNm.

5.4 La 3’-UTR de albúminas de primate prolongaron la expresión de proteínas de ARNm

La prolongación de la expresión de proteínas por la 3’-UTR de albúmina podría ser específica de especie. Comparando las 3’-UTR de albúmina de diferentes primates, la 3’-UTR de albúmina de Olive baboon fue la última homóloga a la 3’-UTR de albúmina humana (chimpancé común: 99% de identidad, Pygmy chimpanzee: 10 99% de identidad, orangután de Sumatra: 99% de identidad, Olive baboon: 96% de identidad). Así, el mRNA el sintetizó conteniendo la 3’-UTR del gen de albúmina de Olive baboon (PpLuc(GC)-albúmina 8-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 40). Los ARNm que codifican luciferasa se electroporaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF). Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal del RrLuc co-transfectado (ver

15 siguiente Tabla 7 y Figura 18).

Tabla 7:

ARNm

RLU 6 horas RLU 24 horas RLU 48 horas RLU 72 horas

PpLuc(GC)-A64

130469 72629 26267 6637

PpLuc(GC)-albúmina-A64

70661 74152 38209 17648

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

71463 123361 51361 18373

Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa a las 72 horas y 6 horas, las figuras más altas que indican estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 8.

20 Tabla 8:

ARNm

RLU 72 horas / RLU 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,05

PpLuc(GC)-albúmina-A64

0,25

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

0,26

El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas se mantienen a las 72 horas. La 3’-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa del mRNA. La 3’-UTR de albúmina de Olive baboon prolongó la expresión de luciferasa del ARNm al mismo nivel que la secuencia humana. Este resultado demuestra que las 3’-UTR de albúmina de primate 25 son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm. La prolongación de la

expresión de proteínas tanto de la 3’-UTR de albúmina humana como de Olive baboon también se observó cuando los ARNm se lipofectaron antes de electroporarse. Los ARNm que codifican luciferasa se lipofectaron en HDF. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal de PpLuc se corrigió para la presencia de transfección por la señal de RrLuc co-transfectado (ver la siguiente Tabla 9 y la Figura 19).

Tabla 9:

ARNm

RLU 6 horas RLU 24 horas RLU 48 horas RLU 72 horas

PpLuc(GC)-A64

3285 7946 2725 1266

PpLuc(GC)-albúmina-A64

3743 9525 5466 3381

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

3259 7367 4044 1892

Se calcularon las relaciones entre el nivel de luciferasa a las 48 horas y las 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 10.

10 Tabla 10:

ARNm

RLU 48 horas / RLU 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,82

PpLuc(GC)-albúmina-A64

1,46

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

1,24

En la lipofección antes que la electroporación, nuevamente tanto la 3’-UTR de albúmina humana como la 3’-UTR de albúmina de Olive baboon prolongó la expresión de luciferasa del ARNm notablemente. Este resultado confirma que las 3’-UTR de albúmina de primate son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteína del ARNm.

15 5.5 Las 3’-UTR de albúmina de primate prolongaron la expresión de proteínas del ARNm en células de ratón

La prolongación de la expresión de proteínas por la 3’-UTR de albúmina podría ser específica de especie. Así, se probó si la 3’-UTR de albúmina humana y la 3’-UTR de albúmina de Olive baboon prolongaban la expresión de luciferasa del ARNm en células de ratón. Los ARNm que codifican luciferasa se lipofectaron en células L

20 929, una línea celular de fibroblasto murino. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal del RrLuc co-transfectado (ver la siguiente Tabla 11 y la Figura 20).

Tabla 11:

ARNm

RLU 6 horas RLU 24 horas RLU 48 horas RLU 72 horas

PpLuc(GC)-A64

177805 128658 40414 12593

PpLuc(GC)-albúmina-A64

160478 244279 101177 22605

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

151076 178839 68786 16969

Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa a las 48 horas y las 6 horas, figuras más altas que indican la 25 estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 12.

Tabla 12:

ARNm

RLU 48 horas / RLU 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,23

PpLuc(GC)-albúmina-A64

0,63

El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 23% de la señal de 6 horas se mantenía a las 48 horas. La 3’-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa del ARNm en la línea celular de ratón. La 3’-UTR de albúmina de Olive baboon también prolongó la expresión de luciferasa del ARNm en la línea celular de ratón. Este resultado demuestra que las 3’-UTR de

5 albúmina de primate son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas de ARNm de tipos celulares de mamífero.

5.6 Las 3’-UTR de albúmina de mamífero prolongaron la expresión de proteínas a partir de ARNm

La prolongación de la expresión de proteínas por la 3’-UTR de albúmina podría ser específica de especie. Comparando las 3’-UTR de albúmina de diferentes mamíferos, la 3’-UTR de albúmina de ratón era menos 10 homóloga a la 3’-UTR de albúmina humana (Caballo: 86% de identidad, perro doméstico: 84% de identidad, ganado vacuno: 74% de identidad, Rata: 73% de identidad, Ratón: 72% de identidad). Así, se sintetizó ARNm conteniendo la 3’-UTR del gen de albúmina de ratón (PpLuc(GC)-albúmina 9-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 41). Los ARNm que codifican luciferasa se lipofectaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de

15 transfección por la señal del RrLuc co-transfectado (ver siguiente Tabla 13 y Figura 21).

Tabla 13:

ARNm

RLU 6 horas RLU 24 horas RLU 48 horas RLU 72 horas

PpLuc(GC)-A64

46533 200168 22702 3001

PpLuc(GC)-albúmina-A64

42931 224315 109190 25314

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

39783 205950 82918 17447

PpLuc(GC)-albúmina 9-A64

42500 210365 60893 8380

Se calculó la relación entre el nivel de luciferasa a las 48 horas y las 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas. Estos datos, indicando que cualquiera de las 3’-UTR estabilizó en el tiempo la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 14.

20 Tabla 14:

ARNm

RLU 48 horas / RLU 6 horas

PpLuc(GC)-A64

0,49

PpLuc(GC)-albúmina-A64

2,54

PpLuc(GC)-albúmina 8-A64

2,08

PpLuc(GC)-albúmina 9-A64

1,43

El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3’-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 49% de la señal de 6 horas se mantiene a las 48 horas. La 3’-UTR de albúmina humana y la 3’-UTR de albúmina de Olive baboon prolongaron notablemente la expresión de luciferasa del ARNm. De manera importante, la 3’-UTR de albúmina de ratón prolongó similarmente la expresión de luciferasa del ARNm en la línea de células HeLa

25 humanas. Este resultado demuestra que las 3’-UTR de albúmina de mamífero son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm.

Secuencias:

Claims (30)

1. Reivindicaciones

   1. Molécula de ácido nucleico artificial que comprende

   a.

   al menos un marco de lectura abierto (ORF);

   b.

   al menos un elemento de región 3’-no traducida (elemento 3’UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, donde la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina es al menos un 80% idéntica a la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de origen natural de la cual se deriva y

   c.

   un tallo-bucle de histona.

2. 2.

   Molécula de ácido nucleico artificial según la reivindicación 1, caracterizada porque el marco de lectura abierto no codifica para beta-globina, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se derive de la 3’UTR del gen de albúmina de rata, y donde el marco de lectura abierto no codifica para el factor humano IX, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se derive de la 3’UTR del gen de albúmina humana.

3. 3.

   Molécula de ácido nucleico artificial según la reivindicación 1 o 2, donde el al menos un elemento 3’UTR comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, preferentemente de la 3’UTR de un gen de albúmina de mamífero, por ejemplo del gen de albúmina de ratón o de una variante del mismo, de manera más preferente de la 3’UTR de un gen de albúmina de primate, particularmente del gen de albúmina humana o del gen de albúmina de Olive baboon, o de una variante del mismo, de manera aún más preferente de la 3’UTR del gen de albúmina humana de acuerdo con el número de Acceso al GenBank NM_000477.5 o de una variante del mismo, siendo la variante al menos un 80% idéntica a la variante de la 3’UTR de origen natural de la cual se deriva la variante.

4. 4.

   Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el al menos un elemento 3’UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35, o donde el al menos un elemento 3’UTR comprende o consiste en un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera más preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No.

5. 35.

6. 5.

   Molécula de ácido nucleico artificial según la reivindicación 4, donde el fragmento tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente de al menos aproximadamente 150 nucleótidos.

7. 6.

   Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el al menos un elemento 3’UTR tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente al menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente al menos aproximadamente 150 nucleótidos.

8. 7.

   Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende

   d. una secuencia poli(A) y/o una señal de poliadenilación.

9. 8.

   Molécula de ácido nucleico artificial según la reivindicación 7, donde la señal de poliadenilación se sitúa dentro del elemento 3’UTR.

10. 9.

    Molécula de ácido nucleico artificial según la reivindicación 7 o 8, donde la señal de poliadenilación comprende la secuencia consenso NN(U/T)ANA, con N = A o U, de manera preferente AA(U/T)AAA o A(U/T)(U/T)AAA.

11. 10.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde la señal de

    poliadenilación, preferentemente la secuencia consenso NNUANA, se sitúa a menos de aproximadamente 50 nucleótidos aguas arriba del extremo 3’ de la 3’UTR.

12. 11.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, donde la secuencia poli(A) tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleótidos de adenina, de manera aún más preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nucleótidos de adenina.

13. 12.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el marco de lectura abierto no codifica para albúmina, preferentemente no para la albúmina humana.

14. 13.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que además comprende una estructura cap 5’, una secuencia poli(C), y/o un motivo IRES.

15. 14.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el ácido nucleico comprende un elemento 5’ adicional, preferentemente una 5’UTR, un promotor o una 5’UTR y una secuencia que contiene un promotor.

16. 15.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde la molécula de ácido nucleico artificial, preferentemente el marco de lectura abierto, está al menos parcialmente modificado con G/C, preferentemente donde el contenido de G/C del marco de lectura abierto está incrementado en comparación con el marco de lectura abierto de tipo natural.

17. 16.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde el marco de lectura abierto comprende una región optimizada con codón, preferentemente donde el marco de lectura abierto está optimizado por codón.

18. 17.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que es un ARN, preferentemente una molécula de ARNm.

19. 18.

    Vector que comprende

    a.

    al menos un marco de lectura abierto y/o un sitio de clonación;

    b.

    al menos un elemento de región 3’-no traducida (elemento 3’UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3’UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3’UTR de un gen de albúmina, donde la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina es al menos un 80% idéntica a la variante de la 3’UTR de un gen de albúmina de origen natural de la cual se deriva y

    c.

    un tallo-bucle de histona.

20. 19.

    Vector según la reivindicación 18, donde el marco de lectura abierto no codifica para beta-globina, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se derive de la 3’UTR del gen de albúmina de rata, y donde el marco de lectura abierto no codifica para el factor humano IX, en particular en caso de que el elemento 3’UTR se derive de la 3’UTR del gen de albúmina humana.

21. 20.

    Vector según las reivindicaciones 18 o 19, que es un vector de ADN.

22. 21.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-20, que es un vector plásmido o un vector viral, preferentemente un vector plásmido.

23. 22.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, que comprende una molécula de ácido nucleico acuerdo artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

24. 23.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-22, que es una molécula circular.

25. 24.

    Vector según la reivindicación 23, donde la secuencia poli(A) o el elemento 3’UTR de la hebra de codificación está seguido en la dirección 5’3’ por un sitio de restricción para la linealización de la molécula del vector circular.

26. 25.

    Célula que comprende la molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-24., preferentemente una célula de mamífero.

27. 26.

    Composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-24 o la célula según la reivindicación 25.

28. 27. Composición farmacéutica según la reivindicación 26, que además comprende uno o más diluyentes 5 y/o excipientes y/o uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

29. 28.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, vector según cualquiera de las reivindicaciones 18-24, célula según la reivindicación 25 o composición farmacéutica según la reivindicación 26 o 27, para su uso como un medicamento.

30. 29.

    Molécula de ácido nucleico artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, vector según

    10 cualquiera de las reivindicaciones 18-24, célula según la reivindicación 25 o composición farmacéutica según la reivindicación 26 o 27, para su uso como una vacuna o para su uso en la terapia génica.

    PpLuc de ARNm con diferentes 3’UTR (HeLa)

    Media, SD

    Fig. 1

    PpLuc de ARNm con diferentes 3’UTR (HeLa)

    Media, SD

    Fig. 2

    PpLuc de ARNm con diferentes variantes de 3’UTR de albúmina (HeLa)

    Media, SD

    Fig. 3

    PpLuc (CG)-A64 sin una 3’UTR PpLuc (CG)-albúmina -A64 PpLuc (CG)-albúmina2-A64 PpLuc (CG)-albúmina3-A64 PpLuc (CG)-albúmina4-A64 PpLuc (CG)-albúmina5-A64 PpLuc (CG)-albúmina6-A64 PpLuc (CG)-albúmina7-A64 PpLuc (CG)-ag -A64 PpLuc (CG)-gusb -A64 PpLuc (CG)-atp50 -A64 PpLuc (CG)-ndufa1 -A64 PpLuc (CG)-atp51 -A64

    PpLuc de ARNm con 3’UTR de albúmina de diferentes especies (HDF)

    Media, SD

    PpLuc de ARNm con 3’UTR de albúmina de diferentes especies (HDF)

    Media, SD

    PpLuc de ARNm con 3’UTR de albúmina de diferentes especies (L-929)

    Media, SD

    PpLuc de ARNm con 3’UTR de albúmina de diferentes especies (HeLa)

    Media, SD