ES2592216T3

ES2592216T3 - Anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 y PD-L2 humanos y sus usos

Info

Publication number: ES2592216T3
Application number: ES09816950.1T
Authority: ES
Inventors: Gordon J. Freeman; Rafi Ahmed; Timothy D. Jones; Francis J. Carr; James P. Gregson
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Emory University
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Emory University
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2016-11-28
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: EP3530672A1; MX2011003195A; KR101924874B1; EP2342226A2; IL249829A0; EP2342226A4; EP3133086B1; IL265397B; CN102264762A; CN102264762B; AU2019246763A1; US20160137731A1; JP2012503984A; PL2342226T3; AU2009296392B2; US10370448B2; CN108484767A; HUE030807T2; US10011656B2; CA2998281C

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 34-38; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 39- 42, en donde el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a una proteína PD-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está humanizado o es compuesto.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 y PD-L2 humanos y sus usos Antecedentes de la invencion

Para que los linfocitos T respondan a polipeptidos exogenos, deben proporcionarse al menos dos senales a traves de celulas presentadoras de antigeno (APC) a linfocitos T inactivos (Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D. L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701-3709). La primera senal, que confiere especificidad a la respuesta inmunitaria, se transduce mediante el receptor de linfocitos T (TCR) despues del reconocimiento del peptido antigenico exogeno presentado en el contexto del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). La segunda senal, denominada coestimulacion, induce a los linfocitos T a proliferar y a hacerse funcionales (Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233). La coestimulacion no es especifica de antigeno, ni limitada al MHC, y se proporciona por moleculas de superficie celular distintas expresadas por las APC (Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 88:6575-6579; Young, J. W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 89:271-275; van- Seventer, G. A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M. I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R. J. et al. (1992) Nature 357:80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med 175:437-445).

Las proteinas B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) son moleculas coestimuladoras criticas (Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909). B7-2 desempena una funcion predominante durante las respuestas inmunitarias primarias, mientras que B7-1, que esta regulada positivamente despues durante una respuesta inmunitaria, puede ser importante para prolongar las respuestas de los linfocitos T primarios o coestimular respuestas de linfocitos T secundarios (Bluestone (1995) Immunity 2:555).

CD28 es un ligando para B7-1 y B7-2 que se expresa de manera constitutiva en linfocitos T inactivos y aumenta en la expresion despues de la activacion de linfocitos T. El ligamiento de CD28 junto con una senal TCR produce la transduccion de una senal coestimuladora que induce a los linfocitos T a proliferar y segregar IL-2 (Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88:6575-6579; June, C. H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609). Un segundo ligando B7-1 y B7-2, CTLA4 (CD152), es homologo a CD28, pero no se expresa en linfocitos T inactivos. La expresion de CTLA4 se produce despues de la activacion de linfocitos T (Brunet, J. F. et al. (1987) Nature 328:267270). El ligamiento de CTLA4 da como resultado la transduccion de una senal inhibidora que impide la proliferacion de linfocitos T y la secrecion de citocinas. Por tanto, CTLA4 es un regulador negativo critico de respuestas de linfocitos T (Waterhouse et al. (1995) Science 270:985) (Allison y Krummel (1995) Science 270:932). El tercer miembro de la familia CD28 descubierto es ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216). El ligamiento de ICOS con su ligando (ICOS-L) produce altos niveles de expresion de citocinas, pero expansion limitada de linfocitos T (Riley J. L. et al. (2001) J. Immunol. 166:4943-48; Aicher A. et al. (2000) J. Immunol. 164:4689-96; Mages H. W. et al. (2000) Eur. J Immunol. 30:1040-7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol. 10:333-6; Ling V. et al. (2000) J. Immunol. 164:1653-7; Yoshinaga S. K. et al. (1999) Nature 402:827-32). Si los linfocitos T se estimulan a traves del receptor de linfocitos T en ausencia de una senal coestimuladora, se vuelves insensibles, anergicos o mueren.

La importancia de la ruta coestimuladora B7:CD28/CTLA4/ICOS se ha demostrado in vitro y en diversos sistemas de modelos in vivo. El bloqueo de esta ruta coestimuladora produce el desarrollo de tolerancia especifica de antigeno en sistemas murinos y humanos (Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607 609; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257:789 792; Turka, L. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102 11105; Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6586 6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753 1763). Inversamente, la expresion de B7 por celulas tumorales murinas B7 negativas induce la inmunidad especifica mediada por linfocitos T acompanada por rechazo de tumor y proteccion prolongada a exposicion tumoral (Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093 1102; Townsend, S. E. y Allison, J. P. (1993) Science 259:368 370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5687 5690.). Por lo tanto, la manipulacion de las rutas coestimuladoras ofrece un gran potencial para estimular o suprimir las respuestas inmunitarias en seres humanos.

El descubrimiento de mas miembros de las familias B7-1 y CD28 ha revelado rutas adicionales que proporcionan senales secundarias coestimuladoras e inhibidoras a linfocitos T. Una de las rutas mas novedosas esta representada por el receptor de muerte programada 1 (PD-1; tambien denominado CD279) y sus ligandos, PD-L1 (B7-H1; CD274) y PD-l2 (B7-DC; CD273). PD-1 es un miembro de la familia CD28/CtLa4 que se expresa en linfocitos T activados, pero no en reposo (Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8:773). El ligamiento de PD-1 mediante sus ligandos media una senal inhibidora que da como resultado la production reducida de citocinas, y la supervivencia reducida de linfocitos T (Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141; Nishimura et al. (2001) Science 291:319; Chemnitz et al. (2004) J. Immunol. 173:945).

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PD-L1 es un miembro de la familia B7 que se expresa en muchos tipos de celulas, incluyendo APC y linfocitos T activados (Yamazaki et al. (2002) J. Immunol. 169:5538). PD-L1 se use tanto a PD-1I como a B7-1. La union tanto de B7-1 por PD-L1 expresada en linfocitos T y la union de PD-L1 expresada en linfocitos T por B7-1 da como resultado la inhibicion de linfocitos T (Butte et al. (2007) Immunity 27:111). Tambien hay pruebas de que, al igual que otros miembros de la familia B7, PD-L1 tambien puede proporcionar senales coestimuladoras a linfocitos T (Subudhi et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:694; Tamura et al. (2001) Blood 97:1809). El documento WO 2008/083174 muestra un metodo de reactivacion de linfocitos T agotados y para tratar infecciones y tumores con un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 murino bloqueante.

PD-L2 es un miembro de la familia B7 expresado en diversas APC, incluyendo celulas dendriticas, macrofagos y mastocitos derivados de medula osea (Zhong et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:2405). PD-L2 expresado en APC puede inhibir tanto la activacion de los linfocitos T a traves del ligamiento de PD-1 como coestimular la activacion de los linfocitos T, a traves de un mecanismo independiente de PD-1 (Shin et al. (2005) J. Exp. Med. 201:1531). Ademas, el ligamiento de PD-L2 expresado en celulas dendriticas produce una expresion y una supervivencia de citocinas en celulas dendriticas potenciada (Radhakrishnan et al. (2003) J. Immunol. 37:1827; Nguyen et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1393). La estructura y expresion de PD-1, PD-L1 y PD-L2, asi como caracteristicas de senalizacion y funciones de estas moleculas en el contexto de regulation de la activacion y tolerancia de linfocitos T (por ejemplo, efectos terapeuticos) se revisa con mas detalles en Kier et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:677. La manipulation de esta y otras rutas coestimuladoras ofrece un gran potencial para estimular o suprimir las respuestas inmunitarias en seres humanos y existe una necesidad de composiciones y metodos que sean utiles para efectuar dichas manipulaciones.

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa en la generation y el aislamiento de nuevos compuestos, anticuerpos monoclonales humanos como se define en las reivindicaciones, que se unen especificamente a PD-L1 humano

asi como la caracterizacion de dichos nuevos anticuerpos y la demostracion de su valor terapeutico en el

tratamiento de diversas afecciones mediadas por PD-L1.

Las tecnicas habituales usadas para humanizar anticuerpos murinos frecuentemente producen anticuerpos humanizados que tienen afinidades de union antigenica reducidas en comparacion con los anticuerpos murinos originales (Almagro y Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13:1619-1633; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Hwang et al. (2005) Methods 36: 35-42). Sorprendentemente, se ha observado que los anticuerpos humanos compuestos de la presente invencion se unen a PD-L1 con afinidades muy proximas a las de los anticuerpos murinos. Adicionalmente, las tecnicas de humanization convencionales producen anticuerpos humanizados que conservan alguna secuencia murina. Como resultado, dichos anticuerpos pueden conservar inmunogenicidad cuando se administran a seres humanos. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado CAMPATH® suscita inmunogenicidad en aproximadamente el 50 % de los pacientes. Los anticuerpos humanos compuestos de la presente invencion, por otro lado, proceden completamente de secuencias de origen humano. Por lo tanto, posiblemente son menos significativamente inmunogenicos y mas terapeuticamente eficaces y utiles cuando se administran a pacientes humanos en lugar de anticuerpos anti-PD-L1 humanos. Por consiguiente, los anticuerpos humanos compuestos de la presente invencion, proporcionan un medio mejorado para el tratamiento y la prevention de trastornos mediados por PD-L1, atribuible en parte a su unica especificidad, afinidad, estructura, actividad funcional y el hecho de que proceden de secuencias de anticuerpos humanos. La presente invencion tambien se basa en el descubrimiento de nuevas aplicaciones terapeuticas para estos anticuerpos, incluyendo su uso en el tratamiento de infecciones y canceres administrando los anticuerpos humanos compuestos descritos en el presente documento.

En el presente documento se describe un anticuerpo aislado, o un fragmento de union a antigeno del mismo, que se une a una proteina PD-1, una proteina PD-L1 o una proteina PD-L2 (tal como la proteina PD-1, PD-L1 o PD-L2 humana), en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union a antigeno del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto, humano o humano, y que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-24.

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-1 (tal como una proteina PD-1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2), en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto, humano o humano y que comprende una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende las SEQ ID NO: 7-9 (secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 7, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 8, y secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 9) y/o una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 10-12 (secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 10, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 11 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 12).

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-L1 (tal como una proteina PD-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4), en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto,

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humano o humano, y que comprende una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende las SEQ ID NO: 13-15 (secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 13, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 14, y secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 15), y/o una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 16-18 (secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 16, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 17 y secuencia CdR3 de SEQ ID NO: 18).

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-L2 (tal como una proteina PD-L2 que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6), en que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto, humano o humano, y que comprende una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende las SEQ ID NO: 19-21 (secuencia CDr1 de SEQ ID NO: 19, secuencia CDR2 de SEQ ID nO: 20 y secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 21), y/o una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 22-24 (secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 22, secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 23 y secuencia CdR3 de SEQ ID NO: 24).

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-1, una proteina PD-L1 o una proteina PD-L2 (tal como una proteina PD-1, PD-L1 o PD-L2 humana) en la que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto y/o humano, y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en sEq ID NO: 25-29, 34-38 o 43-47 o una secuencia que tiene una homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o mas identica a la SEQ ID NO: 25-29, 34-38 o 43-47, y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30-33, 39-42 o 48-51, o una secuencia que tiene una homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o mas con la SEQ ID NO: 30-33, 39-42 o 48-51.

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, en la que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto o humano, y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 25-29, o una secuencia con una identidad u homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o mas con SEQ ID NO: 25-29, y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30-33, o una secuencia con una identidad u homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %,

99.5 %, 99,9 % o mas con la SEQ ID NO: 30-33. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 27 o 28, y una secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32 o 33. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo descrito en el presente documento comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 28, y una secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32.

La invencion proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento antigenico del mismo, que se une a una proteina PD-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, esta humanizado o compuesto y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34-38, y una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEq ID NO: 39-42. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 o 37, y una secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 39, 40 o 42. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35, y una secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.

Tambien se desvela un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-L2 que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union antigenica del mismo, es quimerico, humanizado, compuesto o humano y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43-47, una secuencia con una identidad u homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o mas con SEQ ID NO: 43-47, y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo con que consiste en SEQ ID NO: 4851, o una secuencia con una identidad u homologia de al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %,

99.5 %, 99,9 % o mas con la SEQ ID NO: 48-51. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 44 o 46, y una secuencia se region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 49, 50 o 51. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union antigenica del mismo comprende una secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 46, y una secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51.

Otra realizacion de la invencion es un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-L1, en el que el anticuerpo aislado inhibe la union del anticuerpo 29E2A3 biotinilado con Fc-PD- L1 en un ensayo ELISA de competicion, en el que el anticuerpo 29E2A3 comprende una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 78, y una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID nO: 79.

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Otra realizacion de la invencion es un anticuerpo aislado, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se une a una proteina PD-L1 en la que el anticuerpo aislado inhibe la senal mediada por PD-L1.

En particular, una realizacion de la invencion es un acido nucleico aislado como se define en las reivindicaciones. Otra realizacion es un vector, una celula hospedadora o un animal como se define en las reivindicaciones.

Tambien se desvela un acido nucleico que se hibrida, en condiciones rigurosas, con el complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25-51, o una secuencia con una homologia de al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas con la SEQ ID nO: 25-51.

Por tanto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado como se define en las reivindicaciones que codifica una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos union antigenica de los mismos de la invencion. En algunas realizaciones, el acido nucleico esta un vector, tal como un vector de expresion. La invencion tambien proporciona una celula hospedadora que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican la cadena pesada y ligera de los anticuerpos o fragmentos de union antigenica descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la celula hospedadora produce los anticuerpos o fragmentos de union antigenica. La invencion tambien proporciona metodos de produccion del anticuerpo o fragmento de union antigenica descrito en el presente documento que comprenden cultivar una celula que produzca el anticuerpo o fragmento de union antigenica y recuperar el anticuerpo o fragmento de union antigenica del cultivo celular.

Adicionalmente la invencion incluye una composicion farmaceutica como se define en las reivindicaciones que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de union antigenica del mismo, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

La invencion incluye un metodo de reactivacion de un linfocito T exhausto, que comprende poner en contacto una poblacion de linfocitos T en el que algunas celulas expresan PD-L1 usando un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de union antigenica del mismo bien in vitro o ex vivo.

La invencion incluye adicionalmente un anticuerpo, o un fragmento de union antigenica del mismo, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion persistente, incluyendo una infeccion virica, una infeccion bacteriana, una infeccion helmintica o una infeccion protozoaria administrando al sujeto una composicion que comprenda una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado descrito en el presente documento, o un fragmento de union antigenica del mismo.

La invencion incluye adicionalmente un anticuerpo, o un fragmento de union antigenica del mismo, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto que padece cancer administrando al sujeto una composicion que comprenda una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado descrito en el presente documento, o un fragmento de union antigenica del mismo, incluyendo en el que el anticuerpo aislado induce citotoxicidad mediada por anticuerpo o esta modificado para inducir citotoxicidad mediada por anticuerpo o conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste en una toxina o un agente formador de imagenes. El anticuerpo o el fragmento de union antigenica que se une a PD-L1 se administra al sujeto que tiene un cancer que sobreexpresa PD-L1.

Tambien se desvela un metodo de tratamiento del sujeto que padece asma, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprenda una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado que se una a una proteina PD-L2 descrita en el presente documento, o un fragmento de union antigenica del mismo.

Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria o rechazo de trasplante, administrando al sujeto una composicion que comprenda una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado descrito en el presente documento, o un fragmento de union antigenica del mismo, que se una a una proteina PD- L1.

Especificamente, como se define en las reivindicaciones, la invencion proporciona un anticuerpo, un fragmento de union antigenica o un polipeptido de la invencion para su uso en metodos de tratamiento de dichos trastornos. La invencion tambien incluye el uso de un anticuerpo, un fragmento de union antigenica o un polipeptido descritos en el presente documento para la fabricacion de un medicamente, tal como un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades descritas en el presente documento en un sujeto.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra un diagrama esquematico de vectores de expresion usados para la clonacion de las secuencias de inmunoglobulina humana ensambladas de la presente invencion.

Las figuras 2A-2E muestran secuencias de region variable de cadena pesada humana, compuestas, (figura 2A, VH1; figura 2B, VH2; figura 2C, VH3; y figura 2D, VH4; figura 2E, VH5) disenadas para corresponder a las del

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anticuerpo anti-PD-1 humano de raton, EH12.2H7.

Las figuras 3A-3D muestran de secuencias de region variable de cadena ligera humana, compuestas (figura 3A, Vk1; figura 3B, Vk2; figura 3C, Vk3; figura 3D, Vk4) disenadas para corresponder a la del anticuerpo anti-PD-1 humano de raton, EH12.2H7.

Las figuras 4A-4E muestran secuencias de region variable de cadena pesada humana, compuestas (figura 4A, VH1; figura 4B, VH2; figura 4C, VH3; figura 4D, VH4; figura 4E, VH5) disenadas para corresponder a la del anticuerpo anti-PD-LI humano de raton, 29E.2A3.

Las figuras 5A-5D muestran secuencias de region variable de cadena ligera humana, compuestas (figura 5A, Vk1; figura 5B, Vk2; figura 5C, Vk3; figura 5D, Vk4) disenadas para corresponder a la del anticuerpo anti-PD-LI humano de raton, 29E.2A3.

Las figuras 6A-6E muestran secuencias de region variable de cadena pesada humana, compuestas (figura 6A, VH1; figura 6B, VH2; figura 6C, VH3; figura 6D, VH4; figura 6E, VH5) disenadas para corresponder a la del anticuerpo anti-PD-L2 humano de raton, 24F.10C12.

Las figuras 7A-7D muestran secuencias de la region variable de cadena ligera humana, compuestas (figura 7A, Vk1; figura 7B, Vk2; figura 7C, Vk3; figura 7D, Vk4) disenadas para corresponder a la del anticuerpo anti-PD-L2 humano de raton, 24F.10C12.

Las figuras 8A-8C muestran resultados SDS-PAGE de 1 |jg de anticuerpos humanos, compuestos, correspondientes a los anticuerpos antihumano de raton, EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12, respectivamente.

La figura 9A-9C muestra resultados de competicion ELISA de anticuerpos humanos correspondientes a y con respecto a los anticuerpos antihumano de raton, EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12, respectivamente. En la figura 9A, la union de los anticuerpos purificados con PD-1 humano se ensayaron mediante ELISA de competicion. Diversas concentraciones de cada anticuerpo (0,06 jg/ml a 8 jg/ml) se mezclaron con una concentracion fija de EH12.2H7 biotinilado (40 ng/ml) y se unieron con una placa maxisorb immulon revestida con PD-1. Tambien se detecto la union mediante estreptavidina-HRP y sustrato OPD. La absorbancia a 490 nm se midio en un lector de placa y esto se represento graficamente frente a la concentracion del anticuerpo de ensayo. En la figura 9B, la union de los anticuerpos purificados con PD-L1 humano se ensayo mediante ELISA de competicion. Diferentes concentraciones de cada anticuerpo (0,02 mg/ml a 8 mg/ml) se mezclaron con una concentracion fija de 29E.2A3 biotinilado (40 ng/ml) y se unieron a una placa maxisorb immulon revestida con PD-L1. La union se detecto con estreptavidina-HRP y sustrato OPD. La absorbancia a 490 nm se midio en un lector de placa y esto se represento graficamente frente a la concentracion del anticuerpo de ensayo. En la figura 9C, la union de los anticuerpos purificados contra PD-L2 humano se ensayo mediante ELISA de competicion. Diversas concentraciones de cada anticuerpo (0,02 mg/ml a 8 mg/ml) se mezclaron con una concentracion fija de 24F.10C12 biotinilado (40 ng/ml) y se unieron con una placa maxisorb immulon revestida con PD-L2. La union se detecto mediante estreptavidina-HRP y sustrato OPD. La absorbancia a 490 nm se midio en un lector de placa y esto se represento graficamente frente a la concentracion del anticuerpo de ensayo.

Las figuras 10A-10C muestran datos de union de CI50 resultantes de analisis de competicion ELISA de los anticuerpos humanos, compuestos, formados de acuerdo con diferentes combinaciones de cadenas pesada y ligera humanas, compuestas, disenadas para corresponder a las de los anticuerpos anti-humano de raton, EH12.2H7 (figura 10A), 29E.2A3 (figura 1 0b) y 24F.10C12 (figura 10C), respectivamente. El ensayo se realizo como se describe en la figura 3. La CI50 de cada combinacion de cadena pesada y ligera se normalizo frente a la CI50 del anticuerpo de raton. SD = Sin datos.

La figura 11 muestra las secuencias de aminoacido de PD-1, PD-L1 y PD-L2.

La figura 12 muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones CDR de algunos de los anticuerpos humanos, compuestos, descritos en el presente documento.

La figura 13 muestra las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de algunos de los anticuerpos humanos, compuestos, descritos en el presente documento.

Las figuras 14A y 14B muestran el efecto de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado y un anticuerpo anti-PD-L1 humanizado sobre la capacidad proliferativa de linfocitos T CD8 especificos de Gag del SIV in vitro. Cada simbolo representa un macaco individual. Los numeros entre parentesis representan un factor de aumento en la proliferacion en presencia de un Ab bloqueante en comparacion con un Ab no bloqueante.

La figura 15 muestra que el bloqueo de PD-L1 reestablece la proliferacion conducida por el antigeno de linfocitos T CD8 intrahepaticos (datos representativos del animal 1564).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona nuevos compuestos terapeuticos basados en anticuerpos para el tratamiento y diagnostico de diversos trastornos mediados por PD-L1, (por ejemplo, tratamiento de enfermedades infecciosas persistentes y canceres).

Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, en primer lugar, se definen determinados terminos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.

Como se usa en el presente documento, los terminos "PD-1", "PD-L1" y "PD-L2" incluyen cualquiera de las variantes o isoformas que expresan de manera natural las celulas, y/o sus fragmentos que tienen al menos una actividad biologica del polipeptido, de longitud completa, salvo que expresamente se defina de otra manera. Ademas, la expresion "ligando de PD-1" incluye cualquiera o ambas PD-L1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027) y PD-

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L2 (Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261) y cualquiera de las variantes o isoformas que expresan de manera natural las celulas, y/o sus fragmentos que tienen al menos una actividad biologica de los polipeptidos de longitud completa. Por ejemplo, las secuencias de PD-1, PD-L1 y PD-L2 de diferentes especies, incluyendo seres humanos, son muy conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Honjo et al., Patente de Estados Unidos. n.° 5.629.204, que desvela secuencias PD-1 de ser humano y de raton; Wood et al., Patente de Estados Unidos n.° 7.105.328, que desvela secuencias PD-1 humanas; Chen et al., Patente de Estados Unidos n.° 6.803.192, que desvela secuencias PD-L1de ser humano y raton; Wood et al., Patente de Estado Unidos n.° 7.105.328, que desvela secuencias PD-L1 humanas; Freeman et al., Patente de Estados Unidos Pub. 20020164600, que desvela secuencias PD-L2 humanas y de raton).

Como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo” incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de union antigenica (es decir, "parte de union antigenica") o cadena sencilla del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glucoproteina que comprende al menos dos cadenas pesadas (H, heavy) y dos cadenas ligeras (L, light) interconectadas por enlaces disulfuro, o una parte de union antigenica del mismo. Cada cadena pesada comprende una region variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una region variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR, framework regions). Cada Vh y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, fR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de union que interacciona con un antigeno. “Los anticuerpos inactivadores” se refieren a anticuerpos que no inducen el sistema del complemento.

La expresion “regiones hipervariables”, "HVR" o "HV”, cuando se usan en el presente documento se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (H1, H2, H3), y tres en la VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se piensa que H3 en particular desempena una funcion exclusiva confiriendo especificidad refinada a los anticuerpos. Vease, por ejemplo, Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). De hecho, los anticuerpos de camelidos de origen natural que constan solamente de una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Vease, por ejemplo, Hamers- Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Diversas delineaciones de regiones hipervariables estan en uso y se incluyen en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las mas habitualmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Por otro lado, Chothia se refiere a la localizacion de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El extremo del bucle CDR- H1 de Chothia cuando se numera usando la convencion de numeracion de Kabat varia entre H32 y H34 (vease mas adelante) dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeracion de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si no estan presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo esta presente 35A, el bucle termina en 33; y se estan presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan en el programa informatico de modelacion de anticuerpos AbM Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de “contacto” se basan en un analisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuacion.

Nucleo: Kabat AbM Chothia Contacto

L1: L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36

L2: L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55

L3: L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 H30-H35B (numeracion de

H1: H31-H35B H26-H35B H26-H32, 33 o 34 Kabat)

H1: H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 Chothia) (numeracion de

H2: H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58

H3: H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101

Las regiones hipervariables pueden comprender “regiones hipervariables extendidas” siguientes: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35B (H1), 50-65, 47-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH. Estas regiones hipervariables extendidas son normalmente combinaciones de las definiciones de Kabat y

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Chothia, que puede opcionalmente incluir tambien restos identificados usando la definicion de Contacto. Los restos del dominio variable se enumeran de acuerdo Kabat et al., citado anteriormente para cada una de estas definiciones.

Los restos de la region “marco conservada” o “FR” son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos HVR como se define en el presente documento.

La expresion "numeration de restos de dominio variable como en Kabat” o “numeration de position de aminoacidos como en Kabat", y variaciones de las mismas, se refiere al sistema de numeracion usado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera del conjunto de los anticuerpos en Kabat et al., citado anteriormente. Usando este sistema de numeracion, la secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos aminoacidos o aminoacidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o insertion en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo inserto de aminoacido (resto 52a de acuerdo con Kabat) despues del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) despues del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeracion de restos Kabat puede determinarse para un anticuerpo determinado por alineamiento en regiones de homologia de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “convencional”.

La expresion "region Fc" del presente documento se usa para definir una region C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los limites de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la region Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente se define para abarcar desde un resto de aminoacido en la posicion Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la misma. La lisina C terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeracion EU) de la region Fc puede retirarse, por ejemplo, durante la production o purification del anticuerpo, o mediante modification recombinante de ingenieria genetica del acido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composition de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los restos K447 retirados, poblaciones de anticuerpos sin restos K447 retirados, y poblaciones de anticuerpos que tengan una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447. Las regiones Fc de secuencia nativa adecuadas para su uso en los anticuerpos de la invention incluyen IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 humanas.

“El receptor Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Ademas, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII incluyendo variantes alelicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores, los receptores FcyRII incluyen FcyRNA (un "receptor activador”) y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoacidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplasmaticos de los mismos. El receptor activador FcyRNA contiene un motivo de activation de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmatico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibition de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmatico (vease M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR que incluyen los que van a identificarse en el futuro estan englobados por el termino "FcR" en este documento.

El termino "CDR", se refiere a una region determinante de complementariedad (CDR) de las cuales tres constituyen el caracter de union de una region variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el caracter de union de una region variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDR contribuyen a la actividad funcional de una molecula de anticuerpo y estan separadas por secuencias de aminoacidos que comprenden regiones armazon o marco conservadas. Los limites CDR de las definiciones exactas y las longitudes se someten a diferentes sistemas de clasificacion y numeracion. Por lo tanto, las CDR pueden referirse a las de Kabat, Chothia y Contacto o a cualquier otra definicion limite, incluyendo el sistema de numeracion descrito en el presente documento. A pesar de diferentes limites, cada uno de estos sistemas tiene algun grado de solapamiento en lo que constituyen las denominadas “regiones hipervariables”, dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden por lo tanto diferir en cuanto a longitud y areas limite con respecto a la region marco conservada adyacente. Vease, por ejemplo, Kabat, Chothia y/o MacCallum et al., (Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; y MacCallum et al., J. Mol. Biol., 1996, 262: 732).

Como se usa en el presente documento, la expresion “parte de union antigenica” de un anticuerpo (o simplemente “parte antigenica”), se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o PD- L2). Se ha observado que la funcion de union antigenica de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union incluidos dentro de la expresion “parte de union antigenica” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vh, Vl, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento de Fv que consta de los dominios Vh y Vl de un solo brazo del anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), que consta de un dominio Vii; (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR)

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aislada o (vii) una combination de dos o mas CDR aisladas que opcionalmente pueden unirse mediante un enlazador sintetico. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vh y Vl, estan codificados por genes distintos, estos pueden unirse, usando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que los permite constituirse como una cadena de proteinas sencilla en la que las regiones Vh y Vl se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenaria (scFv); vease por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242:423 426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:5879 5883). Dichos anticuerpos monocatenarios tambien pretenden incluirse dentro de la expresion “parte de union antigenica” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica y los fragmentos se exploran con respecto a su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogenicos, alogenicos o singenicos; o formas modificadas de los mismos (por ejemplo, humanizados, quimericos, etc.). Los anticuerpos tambien pueden ser completamente humanos. Preferentemente, los anticuerpos de la invention se unen especifica o sustancialmente a polipeptidos PD-1, PD-L1 o PD-L2. La expresion “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que presenta una sola especificidad y afinidad de union para un epitopo particular. Por consiguiente, la expresion “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una sola especificidad de union y que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la iinea germinal humana o de inmunoglobulina que no sean de la linea germinal. En una realization los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionado a una celula inmortalizada.

Como se usa en el presente documento, la expresion “anticuerpo aislado” pretende referirse a un anticuerpo que carece sustancialmente de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a PD-1, PD-L1 o PD-L2 carece sustancialmente de anticuerpos que no se unen a PD-1, PD-L1 o PD-L2, respectivamente). Un anticuerpo aislado que se une especificamente a un epitopo de of PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras proteinas PD-1, PD- L1 y/o PD-L2, respectivamente, de diferentes especies. Sin embargo, el anticuerpo se une siempre preferentemente a PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 humano. Ademas, el anticuerpo aislado carece normalmente de manera sustancial de otro material celular y/o compuestos quimicos. En el presente documento se desvela una combinacion de anticuerpos monoclonales “aislados” que tienen diferentes especificidades por PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 combinados en una composition bien definida.

Como se usa en el presente documento, la expresion “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que consiste en la CDR de anticuerpos derivados de mamiferos que no son humanos, y la region FR y la region constante de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado es util como un componente eficaz en un agente terapeutico de acuerdo con la presente invencion dado que la antigenicidad del anticuerpo humanizado en el cuerpo humano esta reducida.

Como se usa en el presente documento, la expresion “anticuerpo compuesto” se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables que comprenden secuencias de inmunoglobulina de linea germinal o de linea no germinal de dos o mas regiones variables no relacionadas. Adicionalmente, la expresion “anticuerpo humano, compuesto” se refiere a un anticuerpo que tiene regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana de linea germinal o de linea no germinal y regiones variables que comprenden secuencias humanas de linea germinal o de linea no germinal de dos o mas regiones variables humanas no relacionadas. Un anticuerpo humano, compuesto, es util como un componente eficaz en un agente terapeutico de acuerdo con la presente invencion dado que la antigenicidad del anticuerpo humano, compuesto, en el organismo esta reducida.

Como se usa en el presente documento, la expresion “anticuerpo humano recombinante” incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medio recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, de un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de los mismos (descrito adicionalmente en la section I, mas adelante), (b) anticuerpos aislados de una celula hospedadora trasformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana, recombinante y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana de otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal y no germinal humana. Sin embargo, en determinadas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagenesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgenico para secuencias Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y por tanto las secuencias de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y estan relacionadas con secuencias de la linea germinal humana Vh y Vl, pueden no existir en la naturaleza en el repertorio de la linea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en el presente documento la expresion “anticuerpo heterologo” se define en relation al organismo no humano transgenico que produce dicho anticuerpo. Ese termino se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia

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de aminoacidos o a una secuencia de acido nucleico que corresponde a la encontrada en un organismo que no consiste en el animal no humano transgenico y generalmente de una especie distinta a la del animal no humano transgenico.

Como se usa en el presente documento, el termino “Kd” pretende referirse a la constante de disociacion del equilibrio de una interaccion anticuerpo-antigeno particular.

Como se usa en el presente documento, la expresion “union especifica” se refiere a un anticuerpo que se une a un antigeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menor de 10-7 M, tal como aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso mas baja cuando se determina mediante tecnologia de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando PD-1, PD-L1 o PD-L2 recombinante humano como el analito y el anticuerpo como el ligando, y se une al antigeno predeterminado con una afinidad que es al menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o 10,0 veces o mayor que su afinidad por la union con un antigeno no especifico (por ejemplo, BSA, caseina) distinto al antigeno predeterminado o a un antigeno estrechamente relacionado. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antigeno” y “un anticuerpo especifico para un antigeno” se usan indistintamente en el presente documento con la expresion “un anticuerpo que une especificamente a un antigeno”.

Como se usa en el presente documento, el termino “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que esta codificada por los genes de la region constante de cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, la expresion “patron de glucosilacion” se define como el patron de unidades de hidrato de carbono que estan unidas de manera covalente a una proteina, mas especificamente a una proteina de inmunoglobulina. Un patron de glucosilacion de un anticuerpo heterologo puede caracterizarse por ser sustancialmente similar a patrones de glucosilacion que se producen en la naturaleza en anticuerpos producidos por la especie del animal transgenico no humano, cuando un experto habitual en la tecnica reconoceria que el patron de glucosilacion del anticuerpo heterologo es mas similar a dicho patron de glucosilacion en la especie del animal transgenico no humano en lugar de las especies de las que proceden los genes CH del gen transgenico.

Como se usa en el presente documento, la expresion “origen natural” como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptidica o polinucleotidica que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Como se usa en el presente documento, el termino “reordenado” se refiere a una configuracion de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en la que un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformacion que codifica esencialmente un dominio Vh y Vl completo, respectivamente. Un locus de gen de inmunoglobulina reordenado puede identificarse por comparacion con el ADN de la linea germinal; un locus reordenado tendra al menos un elemento de homologia heptamerico/nonamerico recombinado.

Como se usa en el presente documento, la expresion “no reordenado” o “configuracion de linea germinal” en referencia a un segmento V se refiere a la configuracion en la que el segmento V no esta recombinado de tal manera que este inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

Como se usa en el presente documento, la expresion “molecula de acido nucleico” pretende incluir moleculas de ADN y moleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede ser mono o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.

Como se usa en el presente documento, la expresion “molecula de acido nucleico aislada” en referencia a acidos nucleicos que codifican anticuerpos o partes de anticuerpos (por ejemplo, Vh, Vl, CDR3) que se unen a PD-1, PD-L1 o PD-L2, pretende referirse a una molecula de acido nucleico en la que las secuencias nucleotidicas que codifican el anticuerpo o parte del anticuerpo carecen de otras secuencias nucleotidicas que codifican anticuerpos o partes de anticuerpos que se unen a antigenos distintos de PD-1, PD-L1 o PD-L2, respectivamente, con otras secuencias que pueden flanquear de manera natural el acido nucleico en el ADN genomico humano. Las figuras 2-7 corresponden a secuencias de nucleotidos y aminoacidos que comprenden las regiones variables de cadena pesada (Vh) y cadena ligera (Vl) de los anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 o PD-L2 humanos desvelados en el presente documento, respectivamente.

En el presente documento tambien se desvelan “modificaciones de secuencia conservativas” de las secuencias expuestas en las figuras (por ejemplo, figuras 2-7), incluyendo modificaciones de secuencias de nucleotidos y de aminoacidos que no afectan o alteran significativamente las caracteristicas de union del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleotidos o que contiene la secuencia de aminoacidos. Dichas modificaciones de secuencia conservativa incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleotidos y aminoacidos. Pueden introducirse modificaciones en la secuencia expuesta en las figuras (por ejemplo, figuras 2-7) mediante tecnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagenesis dirigida al sitio, y mutagenesis mediada por PCR. Las

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sustituciones de aminoacidos conservativas incluyen unas en las que el resto de aminoacido se reemplaza con un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. En la tecnica se han definido familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por tanto, un resto de aminoacido no esencial predicho en un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-LI o anti-PD-L2 humano se remplaza preferentemente con otro resto de aminoacido de la misma familia de cadena lateral.

Como alternativa, en otra realizacion, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de una secuencia que codifica un anticuerpo anti-PD-1, PD-L1 o PD-L2 humano, tal como mediante mutagenesis de saturacion, y los anticuerpos anti-PD-1, anti-PD-LI o anti-PD-L2 humanos modificados resultantes pueden explorarse con respecto a la actividad de union.

Por consiguiente, los anticuerpos codificados por las secuencias de nucleotidos de region variable de cadena pesada y ligera desvelados en el presente documento y/o que contienen las secuencias de aminoacidos de region variable de cadena pesada y ligera desvelados en el presente documento (por ejemplo, figuras 2-7) incluyen anticuerpos sustancialmente similares codificados por o que contienen secuencias similares que se han modificado de una manera conservativa. Un analisis adicional de como pueden generarse dichos anticuerpos sustancialmente similares basandose en las secuencias (es decir, regiones variables de cadena pesada y ligera) desveladas en el presente documento (por ejemplo, figuras 2-7) se proporcionan mas adelante.

Adicionalmente, hay una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoacidos de una proteina particular y las secuencias de nucleotidos que pueden codificar la proteina, como se define en el codigo genetico (vease mas adelante). Del mismo modo, hay una correspondencia conocida y definitiva entre la secuencia de nucleotidos de un acido nucleico particular y la secuencia de aminoacidos codificada por ese acido nucleico, como se define mediante el codigo genetico.

C6DIGO GENETICO

Alanina (Ala, A): GCA, GCC, GCG , GCT

Arginina (Arg, R): AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT

Asparagina (Asn, N): AAC, AAT

Acido Aspartico (Asp, D): GAC, GAT

Cisteina (Cys, C): TGC, TGT

Acido Glutamico (Glu, E) GAA, GAG

Glutamina (Gln, Q): CAA, CAG

Glicina (Gly, G): GGA, GGC, GGG i, GGT

Histidina (His, H): CAC, CAT

Isoleucina (Ile, I): ATA, ATC, ATT

Leucina (Leu, L): CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG

Lisina (Lys, K): AAA, AAG

Metionina (Met, M): ATG

Fenilalanina (Phe, F): TTC, TTT

Prolina (Pro, P): CCA, CCC, CCG, CCT

Serina (Ser, S): AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT

Treonina (Thr, T): ACA, ACC, ACG, ACT

Triptofano (Trp, W): TGG

Tirosina (Tyr, Y): TAC, TAT

Valina (Val, V): GTA, GTC, GTG, GTT

Senal de termination

(finalization): TAA, TAG, TGA

Una caracteristica importante y bien conocida del codigo genetico es su redundancia, mediante la cual, para la mayoria de los aminoacidos usados para elaborar proteinas, puede emplearse mas de un triplete de nucleotidos codificante (ilustrado anteriormente). Por lo tanto, diversas secuencias diferentes de nucleotidos pueden codificar una secuencia de aminoacidos determinada. Dichas secuencias de nucleotidos se consideran funcionalmente equivalentes ya que dan como resultado la produccion de la misma secuencia de aminoacidos en todos los organismos (aunque determinados organismos pueden traducir algunas secuencias de un modo mas eficaz que lo hacen otros). Adicionalmente, de un modo ocasional, una variante metilada de una purina o pirimidina puede

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encontrarse en una secuencia de nucleotidos determinada. Dichas methadones no afectan a la relacion codificante entre el codon trinucleotidico y el aminoacido correspondiente.

Para los acidos nucleicos, la expresion “homolog^a sustancial” indica que dos acidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean optimamente y se comparan son identicos, con inserciones o deleciones de nucleotidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80 % de los nucleotidos, normalmente al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, o mas de los nucleotidos, y mas preferentemente al menos aproximadamente 97 %, 98 %, 99 % o mas de los nucleotidos. Como alternativa, existe homologia sustancial cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridacion selectiva con el complemento de la cadena.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad =n.° de posiciones identicas/total de n.° de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que requieren introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes mas adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse usando el programa GAP del paquete del programa informatico GCG (disponible en internet en la pagina web de la compania GCG), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos o de aminoacidos tambien puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11 17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalizacion de longitud de hueco de 12 y una penalizacion de hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informatico GCG (disponible en internet en la pagina web de la compania GCG), usando bien un matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

Las secuencias de acido nucleico y de proteinas de la presente invencion pueden usarse adicionalmente como una “secuencia a investigar” para realizar una busqueda frente a bases de datos publicas para identificar por ejemplo secuencias relacionadas. Dichas busquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10. Pueden realizarse busquedas de nucleotidos BLAST con el programa NBLAST, puntuacion =100, longitud de palabra =12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las secuencias de acido nucleico de la invencion. Las busquedas de proteina BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion =50, longitud de palabra =3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de proteina de la invencion. Para obtener alineamientos con hueco con fines comparativos, puede utilizarse el BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) (disponibles en internet en el sitio web NCBI).

Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular o en una forma pura parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta “aislado” o “se hace sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes como, por ejemplo, otros acidos nucleicos o proteinas celulares, mediante tecnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, banda CsCl, cromatografia en columna, electroforesis con gel de agarosa y otros bien conocidos en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).

Las composiciones de acido nucleico de la presente invencion, aunque a menudo en una secuencia nativa (excepto para los sitios de restriccion modificados y similares), de cualquier ADNc, genomico o mezclas de los mismos pueden mutarse de acuerdo con tecnicas convencionales para proporcionar secuencias genicas. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones, pueden afectar a la secuencia de aminoacidos si se desea. En particular, las secuencias de ADN sustancialmente homologas a o que derivan de las constantes V, D, J, nativas, y otras de dichas secuencias descritas en el presente documento se contemplan (en las que “derivado” indica que una secuencia es identica o modificada de otra secuencia).

Un acido nucleico esta “unido operativamente” cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si este afecta a la transcripcion de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripcion, unido operativamente significa que las secuencias de ADN que estan unidas son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteina, contiguas y en fase de lectura. Para secuencias de conmutacion, unidas operativamente indica que las secuencias pueden ser capaces de efectuar la recombinacion de conmutacion.

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Como se usa en el presente documento, el termino “vector” pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico con el cual se ha ligado. Un tipo de vector es un “plasmido” que se refiere a un bucle de ADN monocatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector virico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma virico. Determinados vectores son capaces de realizar aplicacion autonoma en una celula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mamifero episomicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamifero no episomicos) pueden integrarse en el genoma de una celula hospedadora despues de la introduccion en la celula hospedadora, y por lo tanto replicarse con el genoma hospedador. Adicionalmente, determinados vectores pueden dirigir la expresion de genes con los que estan unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresion recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresion”). En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, “plasmido” y “vector” pueden usarse indistintamente como plasmido en la forma de vector mas habitualmente usada. Sin embrago, la invencion pretende incluir dichas formas distintas de vectores de expresion, tales como vectores viricos (por ejemplo, retrovirus con defectos replicacion, adenovirus y virus adenoasociados) que realizan funciones equivalentes.

Como se usa en el presente documento, la expresion “celula hospedadora recombinante” (o simplemente “celula hospedadora”), pretende referirse a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Debe entenderse que dichos terminos se incluyen para hacer referencia no solamente a la celula sujeto particular sino a la descendencia de dicha celula. Dado que determinadas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias en el entorno, dicha descendencia puede, de hecho, no ser beneficiosa para la celula parental, pero aun quedaria dentro de la expresion “celula hospedadora” como se usa en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion pueden usarse para tratar un sujeto con una enfermedad inflamatoria, tal como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide. La expresion “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamiferos y no mamiferos tales como primates no humanos, cabra, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en el presente documento, el termino “modular” incluye regulacion positiva y negativa, por ejemplo, potenciando o inhibiendo una respuesta.

Como se usa en el presente documento, la expresion “inhibir” incluye la disminucion, limitacion o bloqueo de, por ejemplo, una accion, funcion o interaccion particular.

Como se usa en el presente documento, la expresion “celula inmunitaria” se refiere a celulas que desempenan una funcion en la respuesta inmunitaria. Las celulas inmunitarias son de origen hematopoyetico e incluyen linfocitos, tales como linfocitos B y T; celulas citoliticas naturales; celulas mieloideas, tales como monocitos, macrofagos, eosinofilos, mastocitos, basofilos y granulocitos.

Como se usa en el presente documento, la expresion “linfocito T” incluye linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. La expresion linfocito T tambien incluye linfocitos T de tipo T auxiliar 1, linfocitos T de tipo T auxiliar 2, linfocitos T de tipo T auxiliar 17 y linfocitos T inhibidores. La expresion “celula presentadora de antigeno” incluye celulas presentadoras de antigeno profesional (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, celulas dendriticas, celulas de Langerhans) asi como otras celulas presentadoras de antigeno (por ejemplo, queratinocitos, celulas endoteliales, astrocitos, fibroblastos, oligodendrocitos).

Como se usa en el presente documento, la expresion “respuesta inmunitaria” incluye respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos B y/o mediadas por linfocitos T que estan influenciadas por la modulacion de la coestimulacion de linfocitos T. Las respuestas inmunitarias a modo de ejemplo incluyen respuestas de linfocitos T, por ejemplo, produccion de citocinas y citotoxicidad celular. Ademas, la expresion respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que estan indirectamente afectadas por la activacion de linfocitos T, por ejemplo, produccion de anticuerpos (respuestas humorales) y activacion de celulas sensibles a citocinas, por ejemplo, macrofagos.

Como se usa en el presente documento, el termino “coestimular”, como se usa con referencia a celulas inmunitarias activadas incluye la capacidad de un polipeptido coestimulador proporcione una segunda senal mediada por un receptor no activador (una “senal coestimuladora”) que induce la proliferation y/o funcion efectora. Por ejemplo, una senal coestimuladora puede dar como resultado la secretion de citocinas, por ejemplo, en un linfocito T que ha recibido una senal mediada por receptores de linfocitos T. Las celulas inmunitarias que han recibido una senal mediada por receptores de celulas, por ejemplo, mediante un receptor de activacion se denominan en el presente documento “celulas inmunitarias activadas”.

Como se usa en el presente documento, la expresion “senal inhibidora” se refiere a una senal transmitida mediante un receptor inhibidor (por ejemplo, CTLA4 o PD-1) para un polipeptido en una celula inmunitaria. Dicha senal

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antagoniza una senal mediante un receptor de activacion (por ejemplo, mediante un polipeptido TCR o CD3) y puede dar como resultado, por ejemplo, la inhibicion de una segunda generacion de mensajeros; una inhibicion de proliferacion; una inhibicion de la funcion efectora en la celula inmunitaria, por ejemplo, fagocitosis reducida, produccion reducida de anticuerpos, citotoxicidad celular reducida, la disminucion de la celula inmunitaria para producir mediadores (tales como citocinas (por ejemplo, IL-2) y/o mediadores de respuestas alergicas); o el desarrollo de anergia.

Como se usa en el presente documento, la expresion “insensible" incluye reactividad de celulas inmunitarias a estimulacion, por ejemplo, mediante un receptor de activacion o una citocina. La insensibilidad puede producirse, por ejemplo, debido a exposicion a inmunosupresores o exposition a altas dosis de antigeno. Como se usa en el presente documento, el termino “anergia" o “tolerancia" incluye refractividad a activacion de la estimulacion mediada por receptor. Dicha refractividad es generalmente especifica de antigeno y persiste despues que haya cesado la exposicion al antigeno tolerizante. Por ejemplo, la anergia en linfocitos T (en oposicion a insensibilidad) se caracteriza por ausencia de produccion de citocinas, por ejemplo, IL-2. La anergia de linfocitos T se produce cuando los linfocitos T se exponen a un antigeno y reciben una primera senal (una senal mediada por CD-3 o receptor de linfocitos T) en ausencia de una segunda senal (una senal coestimuladora). En estas condiciones, la reexposicion de las celulas al mismo antigeno (incluso si se produce reexposicion en presencia de un polipeptido coestimulador) da como resultado la imposibilidad de producir citocinas y por tanto imposibilidad de proliferar. Sin embargo, los linfocitos T anergicos pueden proliferar si se cultivan con citocinas (por ejemplo, IL-2). Por ejemplo, la anergia de linfocitos T tambien puede observarse mediante la ausencia de produccion de IL-2 por linfocitos T medidos por ELISA o mediante ensayo de proliferacion usando una linea celular indicadora. Como alternativa, puede usarse una construction genica indicadora. Por ejemplo, los linfocitos T alergicos no pueden iniciar la transcription del gen IL-2 inducido o por un promotor heterologo bajo el control del potenciador del gen IL-2 en 5' o por un multimero de la secuencia API que podria encontrarse dentro del potenciador (Kang et al. (1992) Science 257:1134).

Como se usa en el presente documento, el termino “actividad" cuando se usa con respecto a un polipeptido, por ejemplo, polipeptido PD-1, PD-L1 o PD-L2, incluye actividades que son inherentes en la estructura de la proteina. Por ejemplo, con respecto al ligando PD-1, el termino “actividad" incluye la capacidad de modular la coestimulacion de las celulas inmunitarias (por ejemplo, modulando una senal coestimuladora en una celula inmunitaria activada) o modular la inhibicion modulando una senal inhibidora en una celula inmunitaria (por ejemplo, conectando un receptor natural en una celula inmunitaria). Los expertos en la tecnica reconoceran que cuando un polipeptido ligando de PD- 1 se une a un receptor coestimulador, puede generarse una senal coestimuladora en la celula inmunitaria. Cuando un polipeptido ligando PD-1 se une a un receptor inhibidor, se genera una senal inhibidora en la celula inmunitaria. Ademas, cuando un ligando PD-1 se une a un polipeptido B7-1, puede generarse una senal inhibidora (Butte et al. (2007) Immunity 27:111).

Con respecto a PD-1, el termino “actividad" incluye la capacidad de un polipeptido PD-1 para modular una senal inhibidora en una celula inmunitaria, por ejemplo, acoplando un ligando PD-1 natural en una celula presentadora de antigenos. PD-1 transmite una senal inhibidora a una celula inmunitaria de una manera similar a CTLA4. La modulation de una senal inhibidora en una celula inmunitaria da como resultado la modulation de la proliferacion de, y/o secretion de citocinas por, una celula inmunitaria. Por tanto, la expresion “actividad PD-1" incluye la capacidad de un polipeptido PD-1 para unirse a su ligando (o ligandos) natural, a la capacidad de modular las senales coestimuladoras o inhibidoras de las celulas inmunitarias y la capacidad de modular la respuesta inmunitaria.

Como se usa en el presente documento, el termino “interaction", cuando se refiere al contacto fisico (por ejemplo, union) de las moleculas entre si. Generalmente, dicha interaccion da como resultado una actividad (que produce un efecto biologico) de una o ambas de dichas moleculas. La actividad puede ser una actividad directa de una o ambas de las moleculas (por ejemplo, senal de transduction).

Como alternativa, puede impedirse la union de una o ambas moleculas en la interaccion a un ligando y por tanto mantenerse inactivas con respecto a la actividad de union a ligando (por ejemplo, uniendose a su ligando y desencadenando o inhibiendo la coestimulacion). La inhibicion de dicha interaccion da como resultado la alteration de la actividad de una o mas moleculas implicadas en la interaccion. Potenciar dicha interaccion es prolongar o aumentar la probabilidad de dicho contacto fisico y prolongar o aumentar la probabilidad de dicha actividad.

Como se usa en el presente documento las formas singulares “un", “uno/una" y “el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario.

Se entiende que aspectos y realizaciones de la invention descritos en el presente documento incluyen “que consisten" y/o “que esencialmente consisten en" aspectos y realizaciones.

Diversos aspectos de la invencion se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones.

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I. Moleculas de acido nucleico aisladas

Un aspecto de la invencion se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas que codifican polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) o partes biologicamente activas de los mismos, asi como fragmentos de acido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridacion para identificar moleculas de acido nucleico que codifican estos polipeptidos y fragmentos para su uso como cebadores de PCR para la amplificacion o mutacion de las moleculas de acido nucleico. Como se usa en el presente documento, la expresion “molecula de acido nucleico" pretende incluir moleculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genomico) y moleculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y analogos del ADN o ARN generados usando analogos nucleotidicos. La molecula de acido nucleico puede ser mono o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.

La expresion “molecula de acido nucleico aislada” incluye moleculas de acido nucleico que estan separadas de otras moleculas de acido nucleico que estan presentes en la fuente natural del acido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genomico, el termino “aislado” incluye moleculas de acido nucleico que estan separadas del cromosoma con el que esta naturalmente asociado el ADN genomico. Preferentemente, una molecula de acido nucleico “aislada” carece de secuencias que flanquean naturalmente el acido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' de la molecula de acido nucleico) en el ADN genomico del organismo del cual procede el acido nucleico. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico “aislada”, tal como una molecula de ADNc, puede carecer sustancialmente de cualquier material celular, o medio de cultivo, cuando se produce por tecnicas recombinantes, o carece sustancialmente de precursores quimicos o de otros productos quimicos cuando se sintetiza quimicamente.

Una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5), o una parte de la misma, puede aislarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales y la informacion de secuencias proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico que incluye toda o una parte de secuencias mostradas en las Figuras 4-5 pueden aislarse por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotidicos sinteticos disenados en funcion de las secuencias mostradas en las Figuras 45.

Una molecula de acido nucleico de la invencion puede amplificarse usando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genomico, como un molde y cebadores oligonucieotidicos apropiados de acuerdo con tecnicas de amplificacion por PCR convencionales. La molecula de acido nucleico asi amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante analisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleotidos correspondientes a secuencias de acido nucleico de la invencion pueden prepararse por tecnicas de sintesis convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatico.

En otra realizacion, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion comprende una molecula de acido nucleico que es un complemento de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5), o una parte de la misma. Una molecula de acido nucleico que es complementaria a una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, la de las Figuras 4-5), o una parte de la misma, es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleotidos mostrada en las Figuras 4-5, de tal manera que puede hibridarse con la secuencia de nucleotidos respectiva mostrada en las Figuras 4-5, formando de este modo un duplex estable.

En el presente documento se desvela una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identica a toda la longitud de la secuencia de nucleotidos mostrada en las Figuras 27, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleotidos.

Adicionalmente, la molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender solo una parte de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5), o una parte de la misma, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de un polipeptido de la invencion, por ejemplo, las de las Figuras 4-5. La sonda/cebador comprende normalmente oligonucleotidos purificados sustancialmente. El oligonucleotido comprende normalmente una region de secuencia de nucleotidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12 o 15, preferentemente aproximadamente 20 o 25, mas preferentemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 75 nucleotidos consecutivos de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5); de una secuencia antisentido de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5); o de un mutante de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5).

Las sondas basadas en una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 45) pueden usarse para detectar transcritos o secuencias genomicas que codifican los mismos polipeptidos u homologos. En una realizacion descrita en el presente documento, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico.

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Un fragmento de acido nucleico que codifica una “parte biologicamente activa de un polipeptido de la invencion” puede prepararse aislando una parte de la secuencia de nucleotidos de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, la de las Figuras 4-5) que codifica un polipeptido que tiene una actividad biologica de un polipeptido de la invencion (por ejemplo, la capacidad de unirse a su diana antigenica), expresando la parte codificada del polipeptido de la invencion (por ejemplo, por expresion recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada del polipeptido de la invencion.

La invencion incluye adicionalmente moleculas de acido nucleico que se diferencian de la secuencia (o secuencias) de nucleotidos mostrada en las Figuras 4-5 debido a la degeneracion del codigo genetico, y por tanto codifican los mismos polipeptidos que los codificados por la secuencia de nucleotidos respectiva mostrada en las Figuras 4-5. En otra realizacion, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion tiene una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5).

Las moleculas de acido nucleico correspondientes a homologos de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5) pueden aislarse en funcion de su homologia con los acidos nucleicos desvelados en el presente documento usando los ADNc desvelados en el presente documento, o una parte de los mismos, como una sonda de hibridacion de acuerdo con tecnicas de hibridacion convencionales en condiciones de hibridacion rigurosas.

Por consiguiente, en otra realizacion, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion tiene al menos una longitud de 15, 20, 25, 30 o mas nucleotidos e hibrida en condiciones rigurosas con la molecula de acido nucleico que comprende una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5).

Como se usa en el presente documento, la expresion “hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir condiciones de hibridacion y lavado en las que las secuencias de nucleotidos que son significativamente identicas u homologas entre si permanecen hibridadas entre si. Preferentemente, las condiciones son tal que las secuencias al menos aproximadamente el 70 %, mas preferentemente al menos aproximadamente el 80 %, incluso mas preferentemente al menos aproximadamente el 85 % o 90 % identicas entre si permanecen hibridadas entre si. Los expertos en la tecnica conocen dichas condiciones rigurosas y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), apartados 2, 4 y 6. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), capitulos 7, 9 y 11 pueden encontrarse condiciones rigurosas adicionales. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion rigurosas incluye hibridacion en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 4x o 6x, a aproximadamente 65-70 °C (o hibridacion en SSC 4x mas formamida al 50 % a aproximadamente 42-50 °C) seguido de uno o mas lavados en SSC 1x, a aproximadamente 65-70 °C. Un ejemplo adicional no limitante de condiciones de hibridacion rigurosas incluye hibridacion en SSC 6x a 45 °C, seguido de uno o mas lavados en SSC 0,2x, SDS 0,1 % a 65 °C. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion muy rigurosas incluye hibridacion en SSC 1x, a aproximadamente 65-70 °C (o hibridacion en SSC 1x mas formamida al 50 % a aproximadamente 42-50 °C), seguido de uno o mas lavados en SSC 0,3x a aproximadamente 65-70 °C. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion de rigurosidad reducida incluye hibridacion en SSC 4x o 6x, a aproximadamente 50-60 °C (o como alternativa hibridacion en SSC 6x mas formamida al 50 % a aproximadamente 40-45 °C) seguido de uno o mas lavados en 2x, a aproximadamente 50-60 °C. Los intervalos intermedios de los valores indicados anteriormente, por ejemplo, a 65-70 °C o a 42-50 °C tambien pretenden incluirse en la presente invencion. El SSPE (1x SSPE en NaCl 0,15M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por SSC (SSC 1x es NaCl 0,15M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridacion y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos despues de finalizar la hibridacion. La temperatura de hibridacion para hibridos que se espera que sea menor de 50 pares de bases de longitud debe ser 5-10 °C menor que la temperatura de fusion (Tf) del hibrido, donde Tf se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para hibridos menores de 18 pares de bases de longitud, Tf (°C) =2(N.° de bases A + T) +4(N.° de bases G C). Para hibridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tf (°C) =81,5+16,6(logio[Na+]) +0,41(%G+C) -(600/N), donde N es el numero de bases en el hibrido; y [Na+] es la concentracion de iones de sodio en el tampon de hibridacion ([Na+] para SSC 1x=0,165M). El experto en la tecnica tambien reconocera que pueden anadirse reactivos adicionales a los tampones de hibridacion y/o lavado para disminuir la hibridacion inespecifica de las moleculas de acido nucleico con membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nailon, incluyendo, pero sin limitacion, agentes bloqueantes (por ejemplo, BSA o ADN transportador de esperma de salmon o arenque), detergentes (por ejemplo, SDS), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), Ficoll, PVP y similar. Cuando se usan membranas de nailon, en particular, un ejemplo no limitante adicional de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion en NaH2PO4 0,25-0,5M, SDS al 7 % a aproximadamente 65°C, seguido de uno o mas lavados en NaH2PO4 0,02M, SDS al 1 % a 65°C, vease, por ejemplo, Church y Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (o, como alternativa, SSC 0,2x, SDS al 1 %).

El experto en la materia apreciara tambien que pueden introducirse cambios por mutacion en una molecula de acido nucleico desvelada en el presente documento (por ejemplo, las de las Figuras 2-7), conduciendo por tanto a cambios en la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos codificados desvelados en el presente documento, sin alterar la capacidad funcional de los polipeptidos. Por ejemplo, las sustituciones de nucleotidos que conducen a sustituciones de aminoacidos en restos de aminoacidos “no esenciales” pueden realizarse en una molecula de acido nucleico desvelada en el presente documento (por ejemplo, las de las Figuras 2-7). Un resto de aminoacido “no esencial” es

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un resto que puede alterarse de una molecula de acido nucleico desvelada en la presente invention (por ejemplo, las de las Figuras 2-7) sin alterar la actividad biologica, mientras que para la actividad biologica se requiere un aminoacido “esencial”. Por ejemplo, los restos de aminoacido que estan conservados entre los polipeptidos desvelados en el presente documento, por ejemplo, los que se requieren para la union de los polipeptidos con su antigeno diana, se preve que sean particularmente poco susceptibles a la alteration.

Por consiguiente, en el presente documento tambien se desvelan moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos (por ejemplo, los de las Figuras 2-7) que contienen cambios en restos de aminoacido que no son esenciales para la actividad. Dichos polipeptidos difieren en la secuencia de aminoacidos de los de las Figuras 2-7, pero conservan actividad biologica. En una realization desvelada en el presente documento, la molecula de acido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido, donde el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos aproximadamente 71 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identica a las de las Figuras 2-7.

Una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido identico a los polipeptidos de las Figuras 2-7, puede crearse introduciendo una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de las de las Figuras 2-7, de tal manera que una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacido se introducen en el polipeptido codificado. Pueden introducirse mutaciones en las moleculas de acido nucleico desveladas en el presente documento (por ejemplo, las de las Figuras 2-7) mediante tecnicas convencionales, tales como mutagenesis dirigida a sitio y mutagenesis mediada por PCR. En una realizacion se realizan sustituciones de aminoacidos conservativas en uno o mas restos de aminoacido predichos no esenciales. Una “sustitucion de aminoacido conservativa” es una en la que el resto de aminoacido se reemplaza por un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. En la tecnica se han identificado familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por tanto, un resto de aminoacido no esencial predicho en un polipeptido desvelado en el presente documento (por ejemplo, los de las Figuras 2-7) puede reemplazarse por otro resto de aminoacido de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de una o mas moleculas de acido nucleico (por ejemplo, las de las Figuras 2-7), tal como mediante mutagenesis por saturation, y los mutantes resultantes pueden explorarse con respecto a su actividad biologica para identificar mutantes que conserven actividad. Despues de la mutagenesis de una molecula de acido nucleico (por ejemplo, las de las Figuras 2-7), el polipeptido codificado puede expresarse de manera recombinante y puede determinarse la actividad del polipeptido.

Como se describe en el presente documento, un polipeptido mutante puede ensayarse con respecto a la capacidad de unirse a y/o modular la actividad de PD-1 natural (por ejemplo, ligandos de PD-1) o un companero del ligando PD-1 (por ejemplo, PD-1 y B7-1), modular senalizacion intra o intercelular, modular activation de linfocitos T y/o modular la respuesta inmunitaria de un organismo.

En el presente documento tambien se desvelan moleculas de acido nucleico aisladas que codifican proteinas de fusion. Dichas moleculas de acido nucleico que comprenden al menos una primera secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido desvelado en el presente documento (por ejemplo, los de las Figuras 2-7) unida operativamente a una segunda secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido desvelado en el presente documento (por ejemplo, los de las Figuras 2-7) pueden prepararse mediante tecnicas de ADN recombinantes convencionales.

Las caracteristicas de expresion de una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5) en una linea celular o microrganismo pueden modificarse insertando un elemento regulador de ADN heterologo en el genoma de una linea celular estable o en microorganismos clonados de tal manera que el elemento regulador insertado esta unido operativamente con las moleculas de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5). Por ejemplo, un elemento regulador heterologo puede insertarse en una linea celular estable o microorganismo clonado, de tal manera que este unido operativamente con una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, las de las Figuras 4-5), usando tecnicas, tales como recombination homologa dirigida, que son muy conocidas por los expertos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Chappel, patente de Estados Unidos N.° 5.272.071; publication PCT N.° WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991.

II. Moleculas polipeptidicas aisladas

Un aspecto de la invencion se refiere a polipeptidos aislados de la presente invencion (incluyendo anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de los mismos descritos en el presente documento, y los de las Figuras 4-5) y partes biologicamente activas de los mismos. En una realizacion, los polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), y partes biologicamente activas de los mismos pueden aislarse de fuentes de celulas o tejidos mediante un esquema de purification apropiado usando tecnicas de purification de proteinas

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convencionales. En otra realizacion, los polipeptidos de la presente invention (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) y partes biologicamente activas de los mismos se produce mediante tecnicas de ADN recombinante. Como alternativa, los polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), y partes biologicamente activas de los mismos pueden sintetizarse quimicamente usando tecnicas de sintesis peptidica convencional.

Un polipeptido “aislado” o “purificado” o parte biologicamente activo del mismo carece sustancialmente de material celular u otras proteinas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que proceden los polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), o carece sustancialmente de precursores quimicos u otros productos quimicos cuando se sintetiza quimicamente. La frase “carece sustancialmente de material celular” incluye preparaciones de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), y partes biologicamente activas de los mismos, en los que los polipeptidos se separan de los componentes celulares de las celulas partir de las cuales se produce de manera recombinante o se aisla. En una realizacion, la frase “carece sustancialmente de material celular” incluye preparaciones de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), y partes biologicamente activas de los mismos que tienen una cantidad menor de aproximadamente 30 % (en peso seco) de proteinas que no son de la presente invencion (tambien denominados en el presente documento una “proteina contaminante”), mas preferentemente una cantidad menor de aproximadamente 20 % de proteinas que no son de la presente invencion, aun mas preferentemente una cantidad de proteinas menor de aproximadamente 10 % que no son de la presente invencion, y lo mas preferentemente una cantidad de proteinas menor de aproximadamente 5 % que no son de la presente invencion. Cuando los polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) o una parte biologicamente activa de los mismos se produce de manera recombinante, tambien es preferente que carezca sustancialmente de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, mas preferentemente menos de aproximadamente 10 % y lo mas preferentemente menos de aproximadamente 5 % del volumen de la preparation de proteina.

La expresion “carece sustancialmente de precursores quimicos o de otros productos quimicos” incluye preparaciones de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), o una parte biologicamente activa de los mismos en la que el polipeptido se separa de precursores quimicos o de otros productos quimicos que estan implicados en la sintesis del polipeptido. En una realizacion, la frase “carece sustancialmente de precursores quimicos o de otros productos quimicos” incluye preparaciones de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) o parte biologicamente activa de los mismos que tienen una cantidad menor de aproximadamente 30 % (en peso seco) de precursores quimicos o de proteinas que no son de la presente invencion, mas preferentemente una cantidad menor de aproximadamente 20 % de precursores quimicos o de proteinas no de la presente invencion, incluso mas preferentemente una cantidad menor de aproximadamente 10 % de precursores quimicos o de proteinas que no son de la presente invencion, y lo mas preferentemente una cantidad menor de aproximadamente 5 % de precursores quimicos o de proteinas que no son de la presente invencion.

Como se usa en el presente documento, una “parte biologicamente activa” de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), incluyen polipeptidos que participan en una interaction entre una molecula PD-L1 y una molecula no PD-L1, por ejemplo, un ligando natural de ligandos PD-1, por ejemplo, PD-1 o B7-1, respectivamente. Las partes biologicamente activas de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) incluyen peptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas a o procedentes de la secuencia de aminoacidos de uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), que incluyen menos aminoacidos en comparacion con uno o mas polipeptidos de longitud completa respectivos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5), y exhiben al menos una actividad del respectivo polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5). En una realizacion, partes biologicamente activas comprenden un dominio o motivo con la capacidad de unirse especificamente a PD-1 o a un ligando de PD-L1 de acuerdo con el antigeno, respectivamente, con el cual este se suscito o se diseno para unirse. Las partes biologicamente activas de uno o mas polipeptidos de la invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) pueden usarse como dianas para el desarrollo de agentes que modulan una actividad mediada por PD-1 o PD-L1, por ejemplo, activation o supresion de celulas inmunitarias.

En una realizacion, uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) tiene una secuencia de aminoacidos mostrada en las Figuras 4-5. En el presente documento tambien se describe que el polipeptido es sustancialmente identico a uno o mas polipeptidos mostrados en las Figuras 2-7 y conserva la actividad funcional del uno o mas polipeptidos respectivos mostrados en las Figuras 2-7, pero se diferencia en la secuencia de aminoacidos debido a la mutagenesis, como se describe con detalle en el subapartado 1 anterior. Por consiguiente, en el presente documento tambien se describe un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 71 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % o mas identica a uno o mas polipeptidos mostrados en las Figuras 2-7.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias se alinean con fines de comparacion optimos (por ejemplo, puede introducirse huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacido o acido nucleico para el alineamiento optimo pueden no considerarse secuencias que no son identicas para fines comparativos). Como se describe en el

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presente documento, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos tiene una longitud de al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, mas preferentemente al menos 50 %, incluso mas preferentemente al menos 60 % e incluso mas preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de la longitud de la secuencia de referencia. Despues, los restos de aminoacidos o nucleotidos en posiciones de aminoacidos o nucleotidos correspondientes se comparan. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (como se usa en el presente documento, una “identidad” de aminoacido o acido nucleico es equivalente a una “homologia” de aminoacido o acido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que se necesita introducir para el alineamiento optimo de las dos secuencias.

La divulgacion tambien proporciona proteinas quimericas o de fusion. Como se usa en el presente documento, una “proteina quimerica” o “proteina de fusion” comprende uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) unidos operativamente a un polipeptido que no es de la presente invencion. Un “polipeptido (polipeptidos) de la presente invencion” se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un polipeptido mostrado en las Figuras 4-5, mientras que un “polipeptido que no es de la presente invencion” se refiere a un polipeptido que no tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un polipeptido que no es sustancialmente homologo a un polipeptido mostrado en las Figuras 4-5, por ejemplo, un polipeptido que es diferente de un polipeptido mostrado en las Figuras 4-5 y que procede del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteina de fusion, la expresion “unido operativamente” pretende indicar que el polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion y que el polipeptido (o los polipeptidos) no descritos en la presente invencion se fusionan en fase entre si. El polipeptido o polipeptidos que no son de la presente invencion pueden fusionarse con el extremo N o extremo C del polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion y corresponde a una fraccion que altera la solubilidad, afinidad de union, estabilidad o valencia del polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion.

Por ejemplo, en una realizacion, la proteina de fusion es una proteina de fusion GST con un polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion. Dichas proteinas de fusion pueden facilitar la purification de los polipeptidos recombinantes de la invencion. En otra realizacion, la proteina de fusion contiene una secuencia de senal heterologa en su extremo N. En determinadas celulas hospedadoras (por ejemplo, celulas hospedadoras de mamifero), la expresion y/o secretion del polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion puede aumentarse a traves del uso de una secuencia senal heterologa.

Un polipeptido (o polipeptidos) quimerico o de fusion de la presente divulgacion (por ejemplo, los de las Figuras 2-7) pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptidicas se ligan entre si en fase de acuerdo con tecnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminos de extremo romo o de extremo escalonado para el ligamiento, digestion con enzimas de restriction para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos segun sea apropiado, tratamiento con fosfatasa de alcalina para impedir la union no deseable, y ligamiento enzimatico. En otra realizacion, el gen de fusion puede sintetizarse por tecnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automaticos. Como alternativa, la amplification por PCR de fragmentos genicos puede realizarse usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). Ademas, muchos vectores de expresion se encuentran disponibles en el mercado que ya codifican un resto de fusion (por ejemplo, un polipeptido GST).

Las secuencias de aminoacidos del polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5) identificados en el presente documento permitiran a los expertos en la tecnica producir polipeptidos correspondientes al polipeptido (o polipeptidos) de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5). Dichos polipeptidos pueden producirse en celulas hospedadoras procariotas o eucariotas por expresion de polinucleotidos que codifican uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, los de las Figuras 4-5). Como alternativa, dichos peptidos pueden sintetizarse por metodos quimicos. En la tecnica se conocen bien metodos para la expresion de polipeptidos heterologos en hospedadores recombinantes, sintesis quimica de polipeptidos y traduction in vitro y se describen adicionalmente en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CrC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; y Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing).

III. Anticuerpos contra PD-L1

Los anticuerpos contra PD-L1 descritos en el presente documento pueden producirse usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento o conocidos en la tecnica. Los anticuerpos monoclonales (por ejemplo,

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anticuerpos humanos) de la invencion pueden producirse usando diversas tecnicas conocidas, tales como la tecnica de hibridacion de celulas somaticas convencional descritas por Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridacion de celulas somaticas, en principio, tambien pueden emplearse otras tecnicas para la produccion de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformacion vmca u oncogenica de linfocitos B, tecnica de presentacion en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.

Un metodo para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de la invencion es el sistema murino. La produccion de hibridomas en el raton es muy conocida en la tecnica, incluyendo protocolos y tecnicas de inmunizacion para el aislamiento y la fusion de esplenocitos.

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse como se ha descrito anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunogen polipeptidico. La titulacion del anticuerpo polipeptidico en el sujeto inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo por tecnicas convencionales, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando un polipeptido inmovilizado. Si se desea, el anticuerpo dirigido contra el antigeno puede aislarse del mamifero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente por tecnicas muy conocidas, tales como cromatografia con proteina A para obtener la faccion de IgG. En un momento apropiado despues de la inmunizacion, por ejemplo, cuando los titulos de anticuerpo son mas elevados, las celulas productoras de anticuerpo pueden obtenerse del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales por tecnicas convencionales, tales como la tecnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497 (vease tambien Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la tecnica de hibridoma de linfocitos B humano mas reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la tecnica de EBV-hibridoma (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies y Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o tecnicas de trioma. La tecnologia para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal es muy conocida (vease en lineas generales Kenneth, R. H. en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36). En resumen, una linea celular inmortal (normalmente un mieloma) se fusiona con linfocitos (normalmente esplenocitos) de un mamifero inmunizado con un inmunogen como se describe anteriormente, y el sobrenadante del cultivo de las celulas de hibridoma resultantes se exploran para identificar un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal que se une al antigeno polipeptidico, preferentemente de un modo especifico.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y lineas celulares inmortalizadas puede aplicarse para el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 (vease, por ejemplo, Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) citado anteriormente; Lerner (1981) citado anteriormente; Kenneth (1980) citado anteriormente). Ademas, el experto habitual apreciara que hay muchas variaciones de estos metodos que tambien serian utiles. Normalmente, la linea celular inmortal (por ejemplo, una linea celular de mieloma) procede de la misma especie de mamifero que la de los linfocitos. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas murinos fusionando linfocitos de un raton inmunizado con una preparacion inmunogenica de la presente invencion con una linea celular de raton inmortalizada. Las lineas celulares inmortalizadas preferidas son lineas celulares de mieloma de raton que son sensibles a medios de cultivo que contienen hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT"). Como un companero de fusion puede usarse cualquiera de diversas lineas de celulas de mieloma de acuerdo con tecnicas convencionales, por ejemplo, las lineas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas lineas de mieloma se encuentran disponibles en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Md. Normalmente, las celulas de mieloma de raton sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de raton usando polietilenglicol (“PEG"). Las celulas de hibridoma resultantes de la fusion se seleccionan despues usando medio hAt, que destruye las celulas de mieloma no fusionadas y fusionadas de una manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren despues de varios dias porque no se transforman). Las celulas de hibridoma productoras de un anticuerpo monoclonal de la invencion se detectan explorando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para anticuerpos que se unen a un polipeptido determinado, por ejemplo, usando un ensayo ELISA convencional.

Como una alternativa a la preparacion de hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal especifico para uno de los polipeptidos descritos anteriormente explorando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una fagoteca de anticuerpos) con el polipeptido apropiado para aislar de este modo los miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen al polipeptido. En el comercio se dispone de kits para generar y explorar bibliotecas de presentacion en fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N.° de catalogo 27-9400-01; y el kit de presentacion en fagos SurfZAP™ de Stratagene, N.° de catalogo 240612). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de metodos y reactivos particularmente adecuados para su uso en la generacion y exploracion de una biblioteca de presentacion en fagos, por ejemplo, Ladner et al. Patente de Estados Unidos 5.223.409; Kang et al. Publicacion internacional N.° WO 92/18619; Dower et al. Publicacion internacional N.° WO 91/17271; Winter et al Publicacion internacional N.° WO 92/20791; Markland et al. Publicacion internacional N.° WO 92/15679; Breitlina et al. Publicacion internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicacion internacional N.° WO 92/01047; Garrard et al. Publicacion internacional N.° WO 92/09690; Ladner et al. Publicacion internacional N.° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibody. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896;

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Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

Adicionalmente, pueden generarse anticuerpos PD-L1 recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales compuestos y humanizados, que pueden preparase usando tecnicas de ADN recombinante convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales compuestos y humanizados pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinantes conocidas en la tecnica, por ejemplo, usando metodos descritos en Robinson et al. Publicacion de patente internacional WO 87/002671; Akira et al. Solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M. Solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al. Solicitud pCt WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Ademas, pueden prepararse anticuerpos humanizados de acuerdo con protocolos convencionales tales como los desvelados en la patente de Estados Unidos 5.565.332. En otra realizacion, pueden producirse cadenas de anticuerpo o miembros de pares de union especificos por recombination entre vectores que comprenden acido nucleico que codifican una fusion de una cadena polipeptidica de un miembro de par de union especifico y un componente de un empaquetado de presentacion generica replicable y vectores que contienen moleculas de acido nucleico que codifican una segunda cadena polipeptidica de un solo miembro de par de union usando tecnicas conocidas en la materia, por ejemplo, como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.565.332, 5.871.907 o 5.733.743. En la tecnica tambien se conoce el uso de anticuerpos intracelulares que inhiben la funcion de las proteinas en una celula (vease, por ejemplo, Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:15421551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 92:3137-3141; publicacion PCT n.° WO 94/02610 por Marasco et al.; y publicacion PCT n.° WO 95/03832 por Duan et al.).

En otra realizacion, pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-L1 usando ratones transgenicos o transcromosomicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de raton. En una realizacion, ratones transgenicos, denominados en el presente documento “ratones HuMAb" que contienen un miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera k y pesada (|j y y) humana no ordenada, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena |j y k endogenos (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresion reducida de IgM de raton o k, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos se someten a modification de clase y mutation somatica para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), citado anteriormente; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546). La preparation de ratones HuMAb se describe en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 90:3720 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851. Vease ademas, las Patentes de Estados Unidos n.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay, y GenPharm internacional; Patente de Estado Unidos n.° 5.545.807 de Surani et al.; publicacion internacional n.° WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645, publicado el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicado el 19 de Marzo de 1992.

En otra realizacion, un anticuerpo para su uso en la invention es un anticuerpo biespecifico. Un anticuerpo biespecifico tiene sitios de union para dos antigenos diferentes dentro de un solo polipeptido de anticuerpo. La union antigenica puede ser simultanea o secuencial. Triomas e hibridos son dos ejemplos de lineas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecificos. Los ejemplos de anticuerpos biespecificos producidos por un hibridoma hibrido o un trioma se desvelan en la Patente de Estados Unidos n.° 4.474.893. Se han construido anticuerpos biespecificos por medios quimicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, y Perez et al. (1985) Nature 316:354) y tecnologia de

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hibridoma (Staerz y Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 83:1453, y Staerz y Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Tambien se describen anticuerpos biespedficos en la patente de Estado Unidos n.° 5.959.084. En la patente de Estado unidos 5.798.229 se describen fragmentos de anticuerpos biespedficos. Tambien pueden. generarse agentes biespedficos preparando heterohibridomas fusionando hibridomas u otras celulas preparando diferentes anticuerpos, seguido por identificacion de clones que producen y co-ensamblan ambos anticuerpos. Tambien pueden generarse por conjugacion qmmica o genetica de cadenas de inmunoglobulina completa o partes de las mismas tales como secuencias Fab y Fv. El componente anticuerpo puede unirse a PD-L1.

Otro aspecto de la invencion se refiere a anticuerpos polipeptidicos anti- PD-L1 que pueden obtenerse mediante un proceso que comprende inmunizar a un animal con un polipeptido PD-L1 inmunogenico, respectivamente, o con una parte inmunogenica; y despues aislar del animal anticuerpos que se unen espedficamente al polipeptido.

En otro aspecto mas de la invencion, pueden usarse secuencias de anticuerpos parciales o conocidas para generar y/o expresar nuevos anticuerpos. Los anticuerpos interaccionan con antigenos diana predominantemente a traves de restos de aminoacido que estan localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razon, las secuencias de aminoacido en las CDR son mas diversas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoria de las interacciones entre anticuerpo-antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos espedficos de origen natural construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias CDR del anticuerpo espedfico de origen natural injertado en secuencias marco conservadas a partir de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323 327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522 525; y Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. Estados Unidos 86:10029 10033). Dichas secuencias marco conservadas pueden obtenerse en bases de datos de ADN publicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de linea germinal o no germinal. Estas secuencias de linea germinal diferiran de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluyen genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante union V(D)J durante la maduracion de linfocitos B. Las secuencias de genes de linea germinal tambien diferiran de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad en individuos homogeneamente a traves de la region variable. Por ejemplo, las mutaciones somaticas son relativamente poco frecuentes en la parte amino-terminal de la region marco conservada. Por ejemplo, las mutaciones somaticas son relativamente poco frecuentes en la parte amino-terminal de la region 1 marco conservada y en la parte carboxilo terminal de la region marco conservada 4. Ademas, muchas mutaciones somaticas no modifican significativamente las propiedades de union del anticuerpo. Por esta razon, no es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de union similares a las del anticuerpo original (vease el documento WO 99/045962 publicado el 16 de septiembre de 1999). La secuencia de cadena ligera y pesada parcial que abarca las regiones CDR es normalmente suficiente para esta finalidad. La secuencia parcial se usa para determinar que variable de linea germinal y/o linea no germinal y union de segmentos genicos contribuye a los genes variables de anticuerpo recombinado. La secuencia de linea germinal y/o linea no germinal se usa despues para llenar partes que faltan de las regiones variables. Las secuencias lider de cadena pesada y ligera se escinden durante la maduracion de las proteinas y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para anadir secuencias que faltan, pueden combinarse secuencias de ADNc clonadas con oligonucleotidos sinteticos por ligamiento o amplificacion por PCR. Como alternativa, toda la region variable puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleotidos cortos, solapantes, y combinarse mediante amplificacion PCR para crear un clon de region variable completamente sintetico. Este proceso tiene determinadas ventajas tales como eliminacion o inclusion o sitios de restriccion particulares, u optimization de codones particulares. El proceso tambien puede usarse para explorar bibliotecas de secuencias que codifican inmunoglobulinas particulares en una especie (por ejemplo, ser humano) para disenar secuencias que codifican inmunoglobulinas afines de secuencias de anticuerpo conocidas en otras especies (por ejemplo, raton) (vease, por ejemplo, el apartado de ejemplos mas adelante).

Las secuencias de nucleotidos de transcritos de cadena pesada y ligera de un hibridoma se usan para disenar un conjunto solapante de oligonucleotidos sinteticos para crear secuencias V sinteticas con identicas capacidades codificantes de aminoacidos como las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sinteticas pueden diferenciarse de las secuencias naturales de tres maneras: cadenas de bases de nucleotidos repetidas se interrumpen para facilitar la sintesis de oligonucleotidos y amplificacion PCR; se incorporan sitios optimos de inicio de la traduction de acuerdo con las normas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870); y se disenan geneticamente sitios HindIII aguas arriba de los sitios de inicio de la traduccion.

Para las regiones variables tanto de cadena ligera como pesada, las secuencias de la cadena codificante optimizada, y no codificante correspondiente, se degradan en 30-50 nucleotidos aproximadamente el punto central del oligonucleotido no codificante. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleotidos pueden ensamblarse en conjuntos bicatenarios solapantes que abarcan los segmentos de 150-400 nucleotidos. Los conjuntos se usan despues como moldes para producir productos de amplificacion PCR de 150-400 nucleotidos. Normalmente, un conjunto de oligonucleotidos de region variable sencilla se degradara en dos conjuntos que se amplifican por separado para generar dos productos PCR solapantes. Estos productos de solapamiento se combinan despues por amplificacion PCR para formar toda la region variable. Tambien puede ser deseable incluir un fragmento solapante de la region constante de cadena pesada ligera o la amplificacion PCR para generar fragmentos que pueden

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clonarse facilmente en las construcciones de vectores de expresion.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada reconstruida se combinan despues con secuencias promotoras clonadas, secuencias Kder, secuencias de inicio de la traduccion, secuencias lider, region constante, 3' no traducida, poliadenilacion, y terminacion de la transcripcion para formar construcciones de vectores de expresion. Las construcciones de expresion de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse individualmente en celulas hospedadoras que despues se fusionan para formar una celula hospedadora que expresa ambas cadenas.

Para este uso en la tecnica se conocen plasmidos e incluyen los plasmidos proporcionados en el apartado de ejemplos mas adelante. Los anticuerpos quimericos y completamente humanos desvelados en el presente documento tambien incluyen anticuerpos IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM e IgD. Pueden construirse plasmidos similares para la expresion de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresion de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Por tanto, en otro aspecto de la invencion, las caracteristicas estructurales de anticuerpos conocidos, no humanos o humanos (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-LI anti humano de raton, tal como el anticuerpo 29E.2A3) se usan para crear anticuerpos anti-PD-LI humanos estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invencion, tal como la union con PD-L1. Otra propiedad funcional incluye la inhibition de la union de 29E.2A3 con PD-L1 en un ensayo ELISA de competition. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-LI humanos estructuralmente relacionados tienen una afinidad de union mas baja con el antigeno en comparacion con el anticuerpo 29E.2A3 como se miden mediante el valor CI50 como se describe en el ejemplo 2 (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo de referencia murino no es mayor de ninguno de 3,0, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 o 1,1 veces del anticuerpo estructuralmente relacionado). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PD-L1 humanos estructuralmente relacionados tienen una afinidad mayor por el antigeno en comparacion con el anticuerpo 29E.2A3 medido por el valor CI50 como se describe en el ejemplo 2 (de tal manera que la afinidad del anticuerpo estructuralmente relacionada es al menos de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2,0 veces del anticuerpo de referencia). Ademas, una o mas CDR o regiones variables de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) pueden combinarse de manera recombinante con regiones marco conservadas humanas conocidas y las CDR crear anticuerpos anti PD-L1 humanos modificados de manera recombinante, adicionales de la invencion.

Dado que es muy conocido en la tecnica que los dominios CDR3 de cadena ligera y pesada de anticuerpo desempenan una funcion particularmente importante en la especificidad de union/afinidad de un anticuerpo por un antigeno, los anticuerpos recombinantes de la invencion preparados como se expone anteriormente comprenden preferentemente las CDR3 de cadena ligera y pesada de las regiones variables de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5). Los anticuerpos pueden comprender adicionalmente las CDR2 de regiones variables de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5). Los anticuerpos pueden comprender adicionalmente las CDR1 de las regiones variables de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5). Los anticuerpos pueden comprender adicionalmente cualquiera de las combinaciones de las CDR.

Las regiones CDR1, 2 y/o 3 de los anticuerpos modificados geneticamente descritos anteriormente pueden comprender la secuencia (o secuencias) de aminoacidos exacta como aquellas de las regiones variables de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) desveladas en el presente documento.

Ademas de simplemente la union de PD-L1, anticuerpos codificados geneticamente tales como los descritos anteriormente pueden seleccionarse con respecto a su retention de otras propiedades funcionales de anticuerpos de la invencion, tales como:

(1) union a PD-L1 humano;

(2) inhibicion de la union de 29E.2A3 con PD-L1;

(3) union con PD-L1 humano e inhibicion de la capacidad en que PD-L1 unido se una a ligandos PD-L1 (Por

ejemplo, PD-1 y/o B7-1);

Las secuencias de aminoacido de region variable de cadena pesada y ligera para los anticuerpos EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 se muestran a continuation.

Region variable de cadena pesada de EH12.2H7

QVQLQQSGAELAKPGASVQMSCKASGYSFTSSWIHWVKQRPGQGLEWIGYIYPSTGFT EYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWRDSSGYHAMDYWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO:76)

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Region variable de cadena liqera de EH12.2H7

DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKFGSNLES GIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:77)

Region variable de cadena oesada de 29E.2A3

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKFGQGLEWIGYVNPFNDG TKYNEMFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARQAWGYFWGQGTLVTVS A (SEQ ID NO:78)

Region variable de cadena liouera de 29E.2A3

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRATESVEYYGTSLVQWYQQKPGQPPKLLIYAASSVDS GVPARFSGSGSGTDFSLTIHPVEEDDIAMYFCQQSRRVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:79)

Region variable de cadena pesada de 24F.10C12

QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTGYTMHWVKQRPGQGLEWIGY1NPRSGY I'EYNQKFKDK'I'I LI ADKSSS'I AYMQLSSL'I SEDSAVYYCARPWFAYWGQG 1'LV'I VSA (SFQ ID NO:80)

Region variable de cadena lioera de 24F.10C12

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:81)

La actividad de los anticuerpos en la inhibition de la union de PD-L1 con su ligando (o ligandos) puede determinarse ensayando la capacidad del anticuerpo para bloquear la union entre PD-L1 y su ligando. Puede usarse un ensayo ELISA de competition en presencia de un ligando marcado y el anticuerpo. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo anti-PD-LI podria bloquear la interaction entre PD-1 y PD-L1, se realiza un experimento de union competitiva. Las celulas que expresan PD-L1 se preincuban con el anticuerpo anti-PD-LI seguido por la adicion de la proteina de fusion PD-1-Ig biotinilada. Si el anticuerpo anti-PD-LI bloquea la union de PD-1-Ig de una manera dependiente de la dosis y con una alta avidez, se considera que el anticuerpo anti-PD-LI es eficaz en la inhibicion de la interaccion entre pD-1 y PD-L1.

IV. Vectores de expresion recombinantes y celulas hospedadoras

Otro aspecto de la invention se refiere a vectores, preferentemente, a vectores de expresion, que contienen una, dos o mas moleculas de acido nucleico que codifican uno o mas polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) (o una parte de las mismas). Como se usan en el presente documento, el termino “vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un “plasmido”, que se refiere un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector virico, en el que puede ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma virico. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autonoma en una celula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replication bacteriano y vectores de mamifero episomicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamifero no episomicos) estan integrados en el genoma de una celula hospedadora despues de la introduction en la celula hospedadora, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedador. Ademas, determinados vectores son capaces de dirigir la expresion de genes con los que estan unidos operativamente. En el presente documento dichos vectores reciben el nombre de “vectores de expresion”. En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ARN recombinantes estan frecuentemente en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, “plasmido” y vector” pueden usarse indistintamente ya que el plasmido es la forma mas habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invencion pretende incluir otras formas de este tipo de vectores de expresion, tales como vectores viricos (por ejemplo,

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retrovirus con replicacion defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que realizan funciones equivalentes.

Los vectores de expresion recombinante de la invencion comprenden un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleo en una celula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresion recombinantes incluyen una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas en funcion de las celulas hospedadoras que se usan para la expresion, que esta unido operativamente a la secuencia de acido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresion recombinante, “unido operativamente” pretende significar que la secuencia de nucleotidos de interes esta unida a una o mas secuencias reguladoras de una manera que permita la expresion de la secuencia de nucleotidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula hospedadora cuando el vector se introduce en la celula hospedadora). La expresion “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresion (por ejemplo; senales de poliadenilacion). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas hospedadoras y aquellas que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en determinadas celulas hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras especificas de tejido). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion de la proteina deseada y similar. Los vectores de expresion de la invencion pueden introducirse en celulas hospedadoras para asi producir proteinas o peptidos, incluyendo proteinas o peptidos de fusion, codificados por los acidos nucleicos como se describe en el presente documento.

Los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden disenarse para la expresion de polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) en celulas procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los polipeptidos pueden expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (usando vectores de expresion baculovirus), celulas de levadura o celulas de mamifero. Se analizan celulas hospedadoras adecuadas adicionalmente en Goeddel (1990) citada anteriormente. Como alternativa, el vector de expresion recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa de T7.

La expresion de polipeptidos en procariotas se realiza mas frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de proteinas de fusion o no fusion. Los vectores de fusion anaden diversos aminoacidos a un polipeptido codificado en su interior, normalmente en el extremo amino del polipeptido recombinante. Dichos vectores de fusion normalmente realizan tres propositos: 1) aumentar la expresion del polipeptido recombinante; 2) aumentar la solubilidad de polipeptido recombinante; y 3) ayudar a la purificacion del polipeptido recombinante actuando como un ligando en purificacion de afinidad. A menudo, en los vectores de expresion de fusion, se introduce un sitio de escision proteolitico en la union de la fraccion de fusion y el polipeptido recombinante para permitir la separacion del polipeptido recombinante de la fraccion de fusion posterior a la purificacion de la proteina de fusion. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresion de fusion tipicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation S-transferasa (GST), la proteina de union maltosa E o la proteina A, respectivamente, al polipeptido recombinante diana.

Como ejemplos de vectores de expresion de E. coli de no fusion inducible adecuados se incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y pET 1 Id (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89). La expresion del gen diana del vector pTrc se basa en la trascripcion de la ARN polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusion trp-lac hibrido. La expresion del gen diana del vector pET 11 se basa en la transcription de un promotor de fusion gn10-lac de T7 mediado por una ARN polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se proporciona mediante celulas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago residente que aloja un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresion de polipeptidos recombinantes en E. coli es expresar el polipeptido en bacterias hospedadoras con capacidad defectuosa para escindir proteoliticamente el polipeptido recombinante (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185:119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de acido nucleico del acido nucleico a insertar en un vector de expresion de la manera que los codones individuales de cada aminoacido se utilizan preferencialmente en E. coli (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteration de acidos de secuencias de acido nucleico de la invencion puede realizarse mediante tecnicas de sintesis de ADN convencionales.

En otra realization, el vector de expresion es un vector de expresion de levadura. Los ejemplos de vectores de expresion en levaduras S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Como alternativa, los polipeptidos de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) pueden expresarse en celulas de insecto usando vectores de expresion de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresion

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de polipeptidos en celulas de insecto cultivadas (por ejemplo, celulas Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En otra realizacion mas, un acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) se expresa en celulas de mamifero usando un vector de expresion de mamifero. Los ejemplos de vectores de expresion de mamifero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usan en celulas de mamifero, las funciones del control del vector de expresion a menudo se proporcionan mediante elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores habitualmente usados proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de simio 40. Para otros sistemas de expresion adecuados para celulas tanto procariotas como eucariotas vease los capitulos 16 y 18 de Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

En otra realizacion, el vector de expresion de un mamifero recombinante puede dirigir la expresion del acido nucleico preferentemente en un tipo de celulas particular (por ejemplo, para expresar el acido nucleico se usan elementos reguladores especificos de tejido). En la tecnica se conocen elementos reguladores especificos de tejido. Como ejemplos no limitantes de promotores especificos de tejido adecuados se incluyen el promotor de albumina (especifico de higado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores especificos linfoideos (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), promotores particulares de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore (1989) EMbO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores especificos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:5473-5477), promotores especificos de pancreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores especificos de glandula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; Patente de Estados Unidos n.° 4.873.316 y publication de solicitud europea n.° 264.166). Tambien se incluyen promotores regulados por evolution, por ejemplo, por promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor alfa fetoproteinico (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Otro aspecto de la invencion se refiere a celulas hospedadoras en las que se introduce una molecula de acido nucleico de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) en un vector de expresion recombinante o una molecula de acido nucleico que contiene secuencias que permiten recombinar homologamente en un sitio especifico del genoma de la celula hospedadora. Las expresiones “celula hospedadora” y “celula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Se entiende que dichas expresiones se refieren no solo a la celula del sujeto particular sino a la descendencia o posible descendencia de dicha celula. Porque ciertas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a mutation o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, identica a la celula parental, pero aun asi quedar incluida dentro del alcance de la expresion como se usa en el presente documento.

Una figura hospedadora puede ser cualquier celula procariota o eucariotica. Por ejemplo, un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) puede expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto, celulas de levadura o de mamifero (tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) o COS). Los expertos en la tecnica conocen otras celulas hospedadoras que son adecuadas.

El ADN vectorial puede introducirse en celulas procariotas o eucariotas mediante tecnicas convencionales de transformation o transfection. Como se usa en el presente documento, los terminos “transformation” y “transfection” pretenden referirse a diversas tecnicas reconocidas en la materia para introducir acido nucleico exogeno (por ejemplo, ADN) en una celula hospedadora, incluyendo co-precipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada con DEAE-dextrano, lipofeccion o electroporation. En Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y en otros manuales de laboratorio pueden encontrarse metodos adecuados para la trasformacion o transfeccion de celulas hospedadoras.

Para la transfeccion estable de celulas de mamifero, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transfeccion que se utilice, unicamente una pequena fraction de celulas puede integrar el ADN exogeno en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente un gen que codifica un marcador de selection (por ejemplo, la resistencia a antibioticos) se introduce en las celulas hospedadoras junto con el gen de interes. Marcadores de seleccion preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El acido nucleico que codifica un marcador de seleccion puede introducirse en una celula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un polipeptido PD-L1 o puede introducirse en un vector distinto. Las celulas se transfectan de manera estable con el acido nucleico introducido pueden identificarse por la seleccion de farmacos (por ejemplo, celulas que tienen incorporado el gen marcador de seleccion sobreviviran, mientras que las otras moriran).

Una celula hospedadora de la invencion, tal como una celula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar), un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5). Por consiguiente, la invencion proporciona adicionalmente metodos para producir un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) usando las celulas hospedadoras de la presente invencion. En una realizacion, el metodo

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comprende cultivar la celula hospedadora de la invencion (en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante que codifica a un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5)) en un medio adecuado de tal manera que se produce un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5). En otra realizacion, el metodo comprende adicionalmente aislar un polipeptido de la presente invencion (por ejemplo, figuras 4-5) del medio o de la celula hospedadora.

Las celulas hospedadoras de la invencion tambien pueden usarse para producir animales transgenicos no humanos, como se describe mas adelante.

V. Produccion de animales no humanos transgenicos y transcromosomicos que generan anticuerpos PD-L1 humanos, compuestos

En otro aspecto adicional, la invencion proporciona animales no humanos transgenicos y transcromosomicos, tales como ratones transgenicos o transcromosomicos, que pueden expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unen especificamente a PD-L1. En una realizacion particular con la invencion proporciona un raton transgenico o transcromosomico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana, de tal manera que el raton produce anticuerpos anti-PD-LI humanos cuando se inmunizan con antigeno PD-L1 y/o celulas que expresen PD-L1. El transgen de cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosomico del raton como ocurre en el caso de los ratones transgenicos, por ejemplo, HuMAb, de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica. Como alternativa, el transgen de cadena pesada humana puede mantenerse extracromosomicamente, como es el caso de los ratones transcromosomicos (por ejemplo, KM) como se describe en el documento WO 02/43478. Dichos ratones transgenicos y transcromosomicos pueden producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) mediante recombination V-D-J y cambio de isotipo. El cambio de isotipo puede producirse mediante, por ejemplo, cambio clasico o no clasico de isotipo.

El diseno de un animal no humano transgenico o transcromosomico que responde a estimulacion antigenica exogena con un repertorio de anticuerpos heterologos, requiere que los transgenes de inmunoglobulina heterologos contenidos en el animal transgenico funcionen correctamente a lo largo de la ruta del desarrollo de linfocitos B. Esto incluye, por ejemplo, el cambio de isotipo del transgen de cadena pesada heterologa. Por consiguiente, se construyen transgenes para producir el cambio de isotipos y uno o mas de los siguientes anticuerpos: (1) alto nivel y expresion especifica del tipo de celula, (2) reordenacion genica funcional, (3) activation de y respuesta a exclusion alelica, (4) expresion de un repertorio primario suficiente, (5) transduction de senal, (6) hipermutacion somatica y (7) domination del locus del anticuerpo de transgen durante la respuesta inmunitaria.

No es preciso que se cumplan todos los criterios anteriores. Por ejemplo, en aquellas realizaciones en las que los loci de inmunoglobulina endogena del animal transgenico se alteran funcionalmente, el transgen no requiere activar la exclusion alelica. Ademas, en aquellas realizaciones en las que el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera funcionalmente reordenado, el segundo criterio de reordenacion genica funcional es innecesario, al menos para que ese transgen que ya esta reordenado. Para el fondo de inmunologia molecular, vease, 2a edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.

En determinadas realizaciones, los animales no humanos transgenico o transcromosomico usados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion contienen transgenes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina heterologos reordenados, no reordenados o una combination de reordenados y no reordenados en la linea germinal del animal transgenico. Cada uno de los transgenes de cadena pesada comprende al menos un gen CH. Ademas, el transgen de cadena pesada puede contener secuencias de cambio de isotipo funcional, que pueden soportar el cambio de isotipo de un transgen heterologo que codifica multiples genes CH en los linfocitos B del animal transgenico. Dichas secuencias de cambio pueden ser aquellas que se producen de manera natural en el locus de inmunoglobulina de la linea germinal de la especie que sirve como fuente para los genes CH transgenicos, o secuencias de cambio tales que pueden proceder de aquellas que se producen en la especies que va a recibir la construction transgenica (el animal transgenico). Por ejemplo, una construction transgenica humana que se usa para producir un raton transgenico puede producir una frecuencia mas alta de eventos de cambio de isotipo si este incorpora secuencias de cambio similares a las que se producen de manera natural en el locus de cadena pesada de raton, ya que supuestamente las secuencias de cambio de raton estan optimizadas para actuar con los sistemas de la enzima recombinasa de cambio de raton, mientras que las secuencias de cambio humanas no. Las secuencias de cambio pueden aislarse y clonarse mediante metodos de donation convencionales o pueden sintetizarse de nuevo a partir de oligonucleotidos sinteticos solapantes disenados en funcion de la information de secuencia publicada relacionada con las secuencias de la region de cambio de inmunoglobulina (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305 7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631 642 (1989)). Para cada uno de los animales transgenicos anteriores, se han descubierto transgenes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada heterologos funcionalmente reordenados en una fraction significativa de los linfocitos B en el animal transgenico (al menos un 10 por ciento).

Los transgenes usados para generar los animales transgenicos de la invencion incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica al menos un segmento genico variable, un segmento genico de diversidad, un segmento genico de union y al menos un segmento genico de region constante. El transgen de

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cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN que codifica al menos un segmento genico variable, un segmento genico de union y al menos un segmento genico de region constante. Los segmentos genicos que codifican los segmentos genicos de cadena ligera y pesada son heterologos para el animal no humano transgenico en el que proceden de, o corresponden con, ADN que codifica los segmentos genicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de una especie que no consiste en el animal no humano transgenico. En un aspecto de la invention, el transgen se construye de tal manera que los segmentos genicos individuales estan no reordenados, es decir, no reordenados para codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Dichos transgenes no reordenados soportan la recombination de los segmentos genicos V, D y J (reordenacion funcional) y soportan preferentemente la incorporation de todo o de parte de un segmento genico de region D en la cadena pesada de inmunoglobulina reordenada resultante en el animal no humano transgenico cuando se expone al antigeno PD-1, PD-L1 o PD-L2.

En una realization alternativa, los transgenes comprenden un “mini-locus" no reordenado. Dichos transgenes normalmente comprenden una parte sustancial de los segmentos C, D y J, asi como un subconjunto de los segmentos genicos V. En dichas construcciones transgenicas, las diversas secuencias reguladoras, por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones de cambio de clase, secuencias donantes de corte y empalme y aceptoras de corte y empalme para el procesado de ARN, senales de recombinacion y similares, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterologo. Dichas secuencias reguladoras pueden incorporarse en el transgen del mismo o de una especie relacionada de animal no humano usado en la invencion. Por ejemplo, los segmentos genicos de inmunoglobulina pueden combinarse en un transgen con una secuencia potenciadora de inmunoglobulina de roedor para su uso en un raton transgenico. Como alternativa, pueden incorporarse secuencias reguladoras sinteticas en el transgen, en el que dichas secuencias reguladoras sinteticas no son homologas a una secuencia de ADN funcional que se sabe que se produce de manera natural en los genomas de los mamiferos. Se disenaron secuencias reguladoras sinteticas de acuerdo con normas consenso tales como, por ejemplo, las que se especifican las secuencias permisibles de un sitio aceptor de corte y empalme o un motivo promotor/potenciador. Por ejemplo, un minilocus comprende una parte del locus de inmunoglobulina genomico que tiene al menos una deletion interna (es decir, no en un extremo de la parte) de una parte de ADN no esencial (por ejemplo, secuencia intermedia, intron o parte de la misma) en comparacion con el locus Ig de la linea germinal de origen natural.

Los ratones transgenicos y transcromosomicos empleados en la presente invencion pueden exhibir production de inmunoglobulina con un repertorio significativo, y de manera ideal sustancialmente similar al de un raton natural. Por lo tanto, por ejemplo, en realizaciones en las que se han inactivado genes Ig endogenos, los niveles de inmunoglobulina total pueden variar de aproximadamente 0,1 a 10 mg/ml de suero, o de aproximadamente 0,5 a 5 mg/ml, o al menos aproximadamente 1,0 mg/ml. Cuando un transgen capaz de suscitar un cambio a IgG de IgM se ha introducido en el raton transgenico, la proportion de raton adulto de IgG en suero a IgM puede ser de aproximadamente 10:1. La proporcion de IgG con IgM sera mucho menor en el raton inmaduro. En general, mas de aproximadamente 10 %, preferentemente de 40 a 80 % de los linfocitos de bazo y ganglios linfaticos pueden expresar exclusivamente la proteina IgG.

El repertorio sera idealmente aproximado al mostrado en un raton natural, habitualmente al menos aproximadamente 10 % tan alto, o 25 a 50 % o mas. Generalmente, al menos aproximadamente un millar de diferentes inmunoglobulinas (de manera ideal IgG), por ejemplo, preferentemente de 104 a 106 o mas, se producira, dependiendo principalmente del numero de diferentes regiones V, J y D introducidas en el genoma de raton. Estas inmunoglobulinas normalmente reconocen aproximadamente la mitad o mas de proteinas altamente antigenicas, por ejemplo, la proteina A de Staphylococcus. Normalmente las inmunoglobulinas exhibiran una afinidad (Kd) para antigenos preseleccionados de menos de 10-7 M, tal como menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso mas baja.

En algunas realizaciones, puede ser preferible generar ratones con repertorios predeterminados para limitar la selection de genes V representado en respuesta de anticuerpo contra un tipo antigenico predeterminado. Un transgen de cadena presada que tiene un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes Vh humanos que se usan preferentemente en respuestas de anticuerpo contra el tipo de antigeno predeterminado en seres humanos. Como alternativa, algunos genes Vh pueden excluirse de un repertorio definido por diversas razones (por ejemplo, tener una baja probabilidad de codificar regiones V de alta afinidad para el antigeno predeterminado; tener una baja propension a experimentar mutaciones somaticas y una agudizacion de la afinidad; o son inmunogenicos en determinados seres humanos). Por tanto, antes de la reordenacion de un transgen que contenga diversos segmentos de gen de cadena pesada o ligera, dichos segmentos genicos pueden identificarse facilmente, por ejemplo, por hibridacion o secuenciacion de ADN, como de especies de organismos distintos a los del animal transgenico.

Los ratones transgenicos y transcromosomicos como se describe anteriormente pueden inmunizarse, por ejemplo, con una preparation purificada o enriquecida de PD-L1 y/o celulas que expresan PD-L1. Como alternativa, los ratones transgenicos pueden inmunizarse con ADN que codifica PD-L1 humano. Los ratones produciran despues linfocitos B que experimentaran cambio de clase mediante recombinacion de cambio intratransgenico (cis-switching) y expresan inmunoglobulinas reactivas con PD-L1. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos humanos (tambien denominados “anticuerpos de secuencia humana”), en los que los polipeptidos de cadena pesada y ligera se codifican por secuencias transgenicas humanas, que pueden incluir secuencias derivadas de mutacion somatica y

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uniones recombinatorias de region V, asi como secuencias codificadas de la lmea germinal; estos anticuerpos humanos pueden referenciarse por ser sustancialmente identicos a una secuencia polipeptidica codificada por un segmento genico Vl o Vh y un segmento Jl o Dh y Jh humano, incluso aunque otras secuencias no de la linea germinal pueden estar presentes como resultado de mutacion somatica y uniones de recombination V-J y V-D-J diferenciados. Las regiones variables de cada cadena de anticuerpo estan normalmente al menos un 80 por ciento codificada por segmentos genicos V, J, y, en el caso de las cadenas pesadas, D, de linea germinal humana; frecuentemente al menos un 85 por ciento de las regiones variables estan codificadas por secuencias de la linea germinal humana presentes en el transgen; frecuentemente 90 o 95 por ciento o mas de las secuencias de region variable estan codificadas por secuencias de la linea germinal humana en el transgen. Sin embargo, dado que se introducen secuencias no iinea germinal por mutacion somatica y union VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia humana frecuentemente tendran algunas secuencias de region variables (y menos frecuentemente secuencias de region constante) que no estan codificadas por segmentos genicos V, D o J como se encuentra en el transgen o transgenes humanos en la linea germinal de los ratones. Normalmente, dichas secuencias no linea germinal (o posiciones de nucleotidos individuales) se agruparan en o cerca de las CDR, o en regiones en las que se sabe que las mutaciones somaticas se agrupan.

Los anticuerpos humanos que se unen al antigeno predeterminado puede dar como resultado el cambio de isotipo, de tal manera que se producen anticuerpos humanos que comprenden una cadena y de secuencia humana (tal como y1, Y2a, y2B o y3) y una cadena ligera de secuencia humana (tal como kappa). Dichos anticuerpos humanos de cambio de isotipo a menudo contienen una o mas mutaciones somaticas normalmente en la region variable y a menudo en o dentro de aproximadamente 10 restos de CDR como resultado de la maduracion por afinidad y selection de linfocitos B por antigeno, particularmente posterior a exposition antigenica secundaria (o posterior). Estos anticuerpos humanos altamente afines pueden tener afinidades de union (Kd) de menos de 10-7 M, tal como menos de 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-10 M o incluso menores.

Otro aspecto de la invention incluye linfocitos B procedentes de ratones transgenicos o transcromosomicos como se describe en el presente documento. Los linfocitos B pueden usarse para generar hibridomas que expresen anticuerpos monoclonales humanos que se unen con alta afinidad (por ejemplo, menor de 10-7 M) a PD-L1 humano.

El desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra PD-L1 puede facilitarse mediante un metodo para expandir el repertorio de secuencias genicas de region variable humana en un raton transgenico que tiene un genoma que comprende un transgen de inmunoglobulina humano integrado, comprendiendo dicho metodo introducir en el genoma un transgen genico V que comprende segmentos genicos de region V que no estan presentes en dicho transgen de inmunoglobulina humana integrada. A menudo, el transgen de region V es un cromosoma artificial de levadura que comprende una parte de un segmento genico humano Vh o Vl (Vk) como puede producirse de manera natural en un genoma humano o puede cortarse y empalmarse conjuntamente por separado mediante metodos recombinantes, que pueden incluir segmentos genicos V desordenados u omitidos. A menudo al menos cinco o mas segmentos genicos V funcionales estan contenidos en el YAC. En esta variation, es posible elaborar un raton transgenico producido por el metodo de expansion de repertorios V, en el que el raton expresa una cadena de inmunoglobulina que comprende una secuencia de region variable codificada por un segmento genico de region V presente en el transgen de region V y una region C codificada en el transgen Ig humano. Mediante el metodo de expansion de repertorios V, pueden generarse ratones transgenicos que tienen al menos 5 genes V distintos; asi como ratones que contienen al menos aproximadamente 24 genes V o mas. Algunos segmentos genicos V pueden ser no funcionales (por ejemplo, pseudogenes y similares); esos segmentos pueden retenerse o pueden delecionarse selectivamente por metodos recombinantes disponibles para el experto habitual en la tecnica si se desea.

Una vez que la linea germinal de raton se ha modificado por ingenieria genetica para que contenga un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V ampliado, sustancialmente no presente en el transgen Ig humano que contiene los segmentos genicos J y C, el rasgo puede propagarse y reproducirse en otros fondos geneticos, incluyendo fondos en los que el YAC que tiene un repertorio de segmento V ampliado se reproduce en una linea germinal de raton que tiene un transgen Ig humano diferente. YAC funcionales multiples que tienen un repertorio de segmentos V ampliado pueden reproducirse en una linea germinal para funcionar con un transgen Ig humano (o transgenes Ig humanos multiples). Aunque en el presente documento se denominan transgenes YAC, dichos transgenes cuando se integran en el genoma pueden carecer sustancialmente de secuencias de levadura, tales como secuencias necesarias para la replication autonoma en levaduras; dichas secuencias pueden retirarse opcionalmente por modification genetica (por ejemplo, digestion con enzimas de restriction y electroforesis en gel de campo de impulso u otro metodo adecuado) despues de la replicacion en levaduras que ya no es necesaria (es decir, antes de la introduction en una celula ES de raton o procigoto de raton). Los metodos de propagation del rasgo de la expresion de inmunoglobulina de la secuencia humana incluyen la reproduction de un raton transgenico que tiene uno o mas transgenes de Ig humanos y opcionalmente tambien tiene un YAC funcional que tiene un repertorio de segmentos V ampliado. Ambos segmentos genicos Vh y Vl pueden estar presentes en el YAC. El raton transgenico puede reproducirse en cualquier fondo deseado por el especialista, incluyendo fondos que llevan otros transgenes humanos, incluyendo transgenes Ig humanos y/o transgenes que codifican otras proteinas de linfocitos humanos. La invencion tambien proporciona una inmunoglobulina de secuencia humana de alta afinidad producida por un raton transgenico que tiene un transgen YAC con repertorio de region V ampliado. Aunque lo anterior

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describe una realizacion preferida del animal transgenico de la invention, se contemplan otras realizaciones que se han clasificado en cuatro categorias:

(1) animales transgenicos que contienen un transgen de inmunoglobulina ligera reordenado y pesada no

reordenado;

(2) animales transgenicos que contienen un transgen de inmunoglobulina ligera no reordenado y pesada no

reordenado;

(3) animal transgenico que contiene un transgen de inmunoglobulina ligera no reordenado y pesada reordenado;

y

(4) animales transgenicos que contienen transgenes de inmunoglobulina ligera reordenados y pesada

reordenados.

VI. Conjugados de anticuerpos/Inmunotoxinas

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a anticuerpos PD-L1 humanos conjugados con una fraction terapeutica, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o un radioisotopo. Cuando se conjugan con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se denominan “inmunotoxinas”. Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial a (por ejemplo, destruya) celulas. Como ejemplos se incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitation, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguaina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invencion puede conjugarse con un radioisotopo, por ejemplo, yodo radiactivo, para generar radiofarmaceuticos citotoxicos para el tratamiento de un trastorno relacionado, tal como un cancer.

Los anticuerpos PD-L1 humanos conjugados pueden usarse desde el punto de vista del diagnostico o pronostico para monitorizar niveles de polipeptidos en tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clinico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un regimen de tratamiento determinado. La detection puede facilitarse por acoplamiento (es decir, union fisica) del anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

Los conjugados de anticuerpos de la invencion pueden usarse para modificar una respuesta biologica determinada. No debe considerarse que la fraccion terapeutica esta limitada a agentes terapeuticos quimicos clasicos. Por ejemplo, la fraccion farmacologica puede ser una proteina o un polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Dichas proteinas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina difterica; una proteina tal como factor de necrosis tumoral o interferon-gamma; o modificadores de respuestas biologicas tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonia de granulocitos (“G-CSF”) u otras citocinas o factores de crecimiento.

Se conocen bien tecnicas para conjugar dichas fracciones terapeuticas con anticuerpos, vease, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review1’, en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119 58 (1982).

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VII. Composiciones farmaceuticas

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene uno o una combination de los anticuerpos monoclonales, o una o mas partes de union a antigeno de los mismos (tales como fragmentos de union a antigeno), de la presente invencion, formulados junto con un transportador farmaceuticamente aceptable. En una realization, las composiciones incluyen una combinacion de multiples anticuerpos humanos aislados (por ejemplo, dos o mas) de la invencion. Preferentemente, cada uno de los anticuerpos de la composicion se une a un epitopo distinto previamente seleccionado de PD-L1.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden administrarse en terapia de combinacion, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir una composicion de la presente invencion con al menos uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como agentes anti-inflamatorios, DMARD (farmacos anti-reumaticos modificadores de enfermedad), agentes inmunosupresores, agentes quimioterapeuticos y agentes de psoriasis. Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden administrarse junto con radioterapia. La co-administration con otros anticuerpos, tales como anticuerpos especificos de CD4 y anticuerpos especificos de IL-2, tambien se incluye en la invencion.

Como se usa en el presente documento, “transportador farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion y similares que son fisiologicamente compatibles. Preferentemente, el vehiculo es adecuado para la administration intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molecula biespecifica y multiespecifica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la action de acidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Una “sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biologica deseada del compuesto parental y no confiere ninguno de los efectos toxicos no deseados (vease, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1 19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adicion de acidos y sales de adicion de bases. Las sales de adicion de acidos incluyen las procedentes de acidos inorganicos no toxicos, tales como acido clorhidrico, nitrico, fosforico, sulfurico, bromhidrico, yodhidrico, fosforosos y similares, asi como acidos organicos no toxicos tales como acidos alifaticos mono- y dicarboxilicos, acidos alcanoicos fenil sustituidos, acidos hidroxi alcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de bases incluyen las procedentes de metales alcalinoterreas, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenziletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares.

Una composicion de la presente invencion puede administrarse mediante diversos metodos conocidos en la tecnica. Como apreciara el experto en la tecnica, la via y/o modo de administracion variara dependiendo de los resultados que se deseen. Los compuestos activos pueden prepararse con transportadores que protegeran el compuesto contra la liberation rapida, tal como una formulation de liberation controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polimeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen vinil acetato, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los expertos en la tecnica conocen en general muchos metodos para la preparation de dichas formulaciones o estos estan patentados. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Para administrar un compuesto de la invencion mediante determinadas vias de administracion, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrarlo con, un material que impide su inactivation. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un transportador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y tampones acuosos. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua asi como liposomas convencionales (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

Los transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmaceuticamente activas se conoce en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien pueden incorporarse en las composiciones compuestos complementarios activos.

Las composiciones terapeuticas normalmente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabrication y almacenamiento. La composicion puede formularse como una solution, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada con una alta concentration de farmaco. El transportador puede ser un disolvente o un medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido y similar), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido

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en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por microfiltracion. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes necesarios de los indicados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacio y criodesecado (liofilizacion) que produce un polvo del principio activo mas cualquier principio deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion de la misma.

Los regimenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o aumentarse segun se indique por las exigencias de la situacion terapeutica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la invencion pueden administrarse una o dos veces a la semana mediante inyeccion subcutanea o una o dos veces al mes mediante inyeccion subcutanea. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificacion para facilitar administracion y uniformidad de la dosificacion. Como se usa en el presente documento, forma unitaria de dosificacion se refiere a unidades separadas fisicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el transportador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas unitarias de dosificacion de la invencion se dictaminan mediante y directamente dependen de (a) las caracteristicas exclusivas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones intrinsecas en la tecnica de la formation de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

En una realization, un agente de la invencion es un anticuerpo. Como se define en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz de anticuerpo (es decir, una dosificacion eficaz) varia de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/kg, de 4 a 7 mg/kg, o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El experto en la tecnica apreciara que determinados factores pueden ejercer influencia en la dosificacion necesaria para tratar de un modo eficaz a un sujeto, incluyendo pero sin limitation, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Adicionalmente, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. Tambien se apreciara que la dosificacion eficaz de anticuerpo usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo del ciclo de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificacion pueden resultar de los resultados de ensayos diagnosticos.

Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metalicos, tales como acido citrico, acido etilendiamina tetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares

Para las composiciones terapeuticas, las formulaciones de la presente invencion incluyen las que son adecuadas para administracion oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material transportador para producir una sola forma de dosificacion variara dependiendo del sujeto que vaya a tratarse y del modo de administracion particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material transportador para producir una sola forma de dosificacion generalmente sera esa cantidad de la composicion que produzca un efecto terapeutico. Generalmente, del cien por cien, esta cantidad variara de aproximadamente 0,001 por ciento a aproximadamente noventa por ciento de principio activo, como alternativa de aproximadamente 0,005 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, o como alternativa de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente 30 por ciento.

Las formulaciones de la presente invencion que son adecuadas para administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones pulverizadoras que contienen dichos transportadores como se conoce en la tecnica que son apropiados. Las formas de dosificacion para administracion topica o transdermica de las composiciones de la presente invencion incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un transportador farmaceuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampon o

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propulsor que se requiera.

Las expresiones “administracion parenteral" y “administrada por via parenteral" como se una en el presente documento significan modos de administracion distintos a la administracion enteral y topica, normalmente por inyeccion e incluye, sin limitacion, administracion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intarespinal, epidural e inyeccion intraesternal e infusion.

Los ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse por ejemplo mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersiones, y usando tensioactivos.

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersion. La prevencion de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilizacion, citados anteriormente, como por la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenol sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Adicionalmente, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede llevarse a cabo mediante la inclusion de agentes que retrasan la absorcion tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Cuando los compuestos de la presente invencion se administran como compuestos farmaceuticos a seres humanos y animales, estos pueden administrarse en solitario o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, de 0,001 a 90 % (por ejemplo, de 0,005 a 70 %, tal como de 0,01 a 30 %) de principio activo en combinacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Independientemente de la via de administracion seleccionada, los compuestos de la presente invencion que pueden usarse en forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se formulan en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante metodos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica.

Los niveles de dosificacion reales de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden modificarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particular, sin ser toxico para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de diversos factores farmacocineticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas o del ester, sal o amida de los mismos, la via de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion del compuesto particular que vaya a emplearse, la duracion del tratamiento, otros factores, compuestos y/o materiales usados en combinacion con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general del paciente e historial medico previo del paciente que vaya a tratarse y factores similares bien conocidos por la tecnica medica. Un medico o veterinario que tenga una habilidad habitual en la tecnica puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica necesaria. Por ejemplo, el medico o el veterinario puede comenzar con dosis de los compuestos de la invencion empleados en las composiciones farmaceuticas a niveles inferiores que los necesarios para conseguir el efecto terapeutico deseado y gradualmente aumentar la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composicion de la invencion sera aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz mas baja para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis eficaz generalmente dependera de factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administracion sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea, preferentemente administrada proximal al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composicion terapeutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del dia, opcionalmente, en formas de dosificacion unitaria. Cuando esto es posible para un compuesto de la presente invencion administrarse en solitario, es preferible administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion).

Las composiciones terapeuticas pueden administrarse con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion, una composicion terapeutica de la invencion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermico sin aguja, tales como los dispositivos desvelados en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes bien conocidos y modulos utiles en la presente invencion incluyen: Patente de Estados Unidos n.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusion implantable para dispensar la medicacion a una velocidad controlada; la Patente de Estados Unidos n.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapeutico para administrar medicamentos a traves de la piel; la Patente de Estados Unidos n.° 4.448.233, que desvela una bomba de infusion de medicacion para el suministro de medicacion a una velocidad de infusion exacta; la Patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusion implantable de flujo variable para la administracion de farmaco continua; la Patente de Estados Unidos n.° 4.439.196, que desvela un sistema de suministro de farmaco osmotico que tiene

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compartimentos multicamara; y la Patente de Estados Unidos n.° 4.475.196, que desvela un sistema de suministro de farmaco osmotico. Muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro y modulos son conocidos por los expertos en la tecnica.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invention pueden formularse para garantizar la distribution apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para garantizar que los compuestos terapeuticos de la invencion atraviesan la BBB (si se desea), estos pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para metodos de fabrication de liposomas, vease, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos n.° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o mas fracciones que se transportan selectivamente en celulas u organos especificos, potenciando por tanto la administration del farmaco dirigido (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Fracciones de direccionamiento a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.416.016 de Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteina A tensioactiva (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies de las cuales puede comprender las formulaciones de las invenciones, asi como componentes de las moleculas de la invencion; p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); vease tambien K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273. En una realization de la invencion, los compuestos terapeuticos de la invencion se formulan en liposomas; en otra realizacion, los liposomas incluyen una fraction de direccionamiento. En otra realizacion mas, los compuestos terapeuticos en los liposomas de administran mediante inyeccion en embolada a un sitio proximo al tumor o infection. Las composiciones deben ser fluidas hasta el punto de que sean facilmente inyectables. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y deben preservarse contra la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

La composition debe ser esteril y fluida hasta el grado en el que la composition puede administrarse por jeringa. Ademas de agua, el transportador puede ser una solution salina tamponada isotonica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido y similar), y mezclas adecuadas de las mismas. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de la particula necesaria en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Cuando el compuesto activo se protege adecuadamente, como se describe anteriormente, el compuesto puede administrarse por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un transportador comestible asimilable.

VIII. Uso y metodos de la invencion

Los anticuerpos descritos en el presente documento (incluyendo derivados y conjugados de los anticuerpos) y composiciones que contienen los anticuerpos pueden usarse en diversas aplicaciones de diagnostico y terapeuticas in vitro e in vivo (por ejemplo, modulando positiva o negativamente la respuesta inmunitaria). Por ejemplo, la union del ligando PD-1 a PD-1 o B7-1 transmite una senal inhibidora. Por tanto, la modulation de la interaction entre PD-1 y un ligando de PD-1, o entre un ligando de PD-1 y un polipeptido B7, da como resultado la modulacion de la respuesta inmunitaria. Los ligandos PD-1 tambien coestimulan linfocitos T. Por tanto, en una realizacion, los anticuerpos que bloquean la interaccion entre un ligando PD-1 y PD-1 o B7 pueden impedir la senalizacion inhibidora. En una realizacion, los anticuerpos que bloquean la senal coestimuladora del ligando PD-1 bloquean una senal coestimuladora contra una celula inmunitaria. Adicionalmente, el ligamiento de PD-L2 puede inducir secretion de citocinas y la supervivencia de celulas dendriticas. Por tanto, los anticuerpos que bloquean el ligamiento de PD- L2 pueden inhibir la supervivencia de las celulas dendriticas y reducir la expresion de citocinas por las celulas dendriticas, y a traves de estos mecanismos inhibir una respuesta inmunitaria. En particular, los anticuerpos descritos en el presente documento son utiles para aplicaciones de diagnostico, pronostico, prevention y terapeutica relacionados con afecciones particulares mediadas por PD-1 y PD-L1, como se analiza, por ejemplo, en Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26: 677; Sharpe et al., (2007) Nat. Immunol. 8: 239; Freeman et al. (2007) J. Exp. Med. 10: 2223.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de la presente invencion pueden ser utiles para aplicaciones de diagnostico, pronostico, prevencion y terapeuticas con respecto a enfermedades neurodegenerativas (geriopsicosis, enfermedad de Alzheimer, sindrome de Down, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-jakob, neuropatia diabetica, sindrome parkinsoniano, enfermedad de Huntington, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrofica, neuropatia diabetica y enfermedad Creutzfeldt Creutzfeldt-Jakob).

Los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de la presente invencion pueden ser utiles para aplicaciones de diagnostico, pronostico, prevencion y terapeuticas (tales como el tratamiento y retraso de la aparicion o progresion de las enfermedades) para enfermedades que aceleran la reaction inmunitaria, por ejemplo, asma, enfermedades autoinmunitarias (nefritis glomerular, artritis, enfermedad de tipo cardiomiopatia dilatada, colitis ulcerosa, sindrome

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de Sjogren, enfermedad de Crohn, eritematosis sistemica, artritis reumatoide cronica, esclerosis multiple, psoriasis, dermatitis alergica por contacto, polimiositis, paquidermia, periarteritis nodosa, fiebre reumatica, vitiligo vulgar, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia grave, sindrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, sindrome de Goodpasture, enfermedad de esterilidad, hepatitis activa cronica, penfigo, purpura trombocitopenica autoinmunitaria y anemia hemolitica autoinmunitaria, hepatitis cronica activa, enfermedad de Addison, sindrome anti-fosfolipidico, alergia atopica, gastritis atopica autoinmunitaria, aclorhidra autoinmunitaria, enfermedad celiaca, sindrome de Cushing, dermatomiositis, lupus discoide, eritematosis, sindrome de Goodpasture, tiroiditis de Hashimoto, atrofia adrenal idiopatica, trombocitopenia idiopatica, diabetes insulinodependiente, sindrome de Lambert-Eaton, hepatitis lupoide, algunos casos de linfopenia, enfermedad de tejido conectivo mixta, penfigoide, penfigo vulgaris, anemia perniciosa, uveitis facogenica, poliarteritis nodosa, autosindromes poliglandulares, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, sindrome de Raynaud, policondritis recidivante, sindrome de Schmidt, esclerodermia limitada (o sindrome de crest), oftalmia simpatica, lupus eritematoso sistemico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tirotoxicosis, resistencia a insulina de tipo b, colitis ulcerosa y granulomatosis de Wegener).

En una realizacion, los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de la presente invention son utiles para aplicaciones de diagnostico, pronostico, prevention y terapeuticas (tales como tratamiento y retraso de la aparicion o progresion de las enfermedades) para terapia y/o prevencion de enfermedad infecciosa persistente (por ejemplo, enfermedades por infecciones viricas incluyendo HPV, HBV, Virus de la hepatitis C (HCV), retrovirus tales como virus de la inmunodeficiencia humana (HlV-1 y HIV-2), virus del herpes tal como virus de Epstein Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), HSV-1 y HSV-2 y virus de la gripe. Otros antigenos asociados con patogenos que pueden utilizarse como se describe en el presente documento son antigenos de diversos parasitos, incluyen malaria, preferentemente peptido de malaria basada en repeticiones de NANP. Ademas, se incluyen enfermedades bacterianas, fungicas y otros patogenos tales como Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma y Vibriocholerae. Especies a modo de ejemplo incluyen Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Grupo B Streptococcus sp., Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus. Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; u hongos, tales como, por ejemplo, Paracoccidioides brasiliensis; u otros patogenos, por ejemplo, Plasmodium falciparum. Tambien se incluyen patogenos prioritarios del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). Estos incluyen, agentes de Categoria A, tales como variola major (viruela), Bacillus anthracis (antrax), Yersinia pestis (peste), toxina de Clostridium botulinum (botulismo), Francisella tularensis (tularaemia), filovirus (fiebre hemorragica del Ebola, fiebre hemorragica de Marburg), arenavirus (Lassa (fiebre de Lassa), Junin (fiebre hemorragica argentina) y virus relacionados); agentes de Categoria B, tales como Coxiella burnetti (fiebre Q), especies de Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), alfavirus (encefalomielitis venezolana, encefalomielitis equina oriental y occidental), toxina de ricina de Ricinus communis (semillas de ricino), toxina epsilon de Clostridium perfringens; enterotoxina B de Staphylococcus B, especies de Salmonella, Shigella dysenteriae, cepa de Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum; agentes de Categoria C, tales como virus nipah, hantavirus, virus de la fibra hemorragica transmitida por garrapatas, virus de encefalitis transmitidos por garrapatas, fiebre amarilla y tuberculosis resistente a farmacos multiples; helmintos, tales como Schistosoma y Taenia; y protozoos, tales como Leishmania (por ejemplo, L. mexicana) y Plasmodium.

En otra realizacion, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de la presente invencion son utiles para aplicaciones de diagnostico, pronostico, prevencion y terapeuticas para rechazo de injerto de organos, enfermedad de injerto frente a hospedador (GVHD), enfermedades alergicas y enfermedades causadas por atenuacion de la reaction inmunitaria, en la que participa PD-1, PD-L1 y/o PD-L2, por ejemplo, cancer y enfermedades infecciosas.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento se administran a un sujeto de acuerdo con metodos conocidos tales como vias de administration intravenosa (por ejemplo, como una embolada o mediante infusion continua durante un periodo de tiempo), subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, intra-articular, intrasinovial, intratecal o inhalation).

Un sujeto se trata si se obtienen uno o mas resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados deseablemente clinicos. Para los fines de la presente invencion, los resultados clinicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitation, uno o mas de los siguientes: disminucion de uno o mas sintomas resultantes de la enfermedad, aumento de la calidad de vida de las personas que padecen la enfermedad, disminucion de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retraso de la progresion de la enfermedad y/o prolongation de la supervivencia de los individuos.

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1. Metodos de exploracion

Un aspecto de la presente divulgacion se refiere a metodos de uso de anticuerpos de la presente divulgacion para modular una respuesta inmunitaria modulando la coestimulacion (tal como anticuerpos que modulan la funcion de PD-1, PD-L1 o PD-L2). Dichos metodos utilizan ensayos de exploracion, incluyendo ensayos basados en celulas y no basados en celulas. En una realizacion los ensayos proporcionan un metodo para identificar anticuerpos que maduran la interaccion de un PD-L1 y PD-1. En otra realizacion, los ensayos proporcionan un metodo para identificar anticuerpos que modulan la interaccion entre un ligando de PD-1 y un polipeptido B7.

En una realizacion, la divulgacion se refiere a ensayos para explorar candidatos o anticuerpos de ensayo que se unen a, o modulan la actividad de PD-1, PD-L1 o PD-L2, por ejemplo, modulan la capacidad del polipeptido para interaccionar con (por ejemplo, unirse a) su companero de union afin. En una realizacion, un metodo para identificar un anticuerpo para modular una respuesta inmunitaria conlleva determinar la capacidad del anticuerpo para modular, por ejemplo, potenciar o inhibir, la interaccion entre PD-1 y un ligando de PD-1, y adicionalmente determinar la capacidad del anticuerpo para modular la interaccion entre un ligando PD-1 y un polipeptido B7. En una realizacion, un anticuerpo que modula la interaccion entre el ligando PD-1 y PD-1 (por ejemplo, sin modular la interaccion entre ligando de PD-1 y el polipeptido B7 se selecciona). En otra realizacion, un anticuerpo que modula la interaccion entre un ligando de PD-1 y un polipeptido B7 (por ejemplo, sin modular la interaccion entre el ligando de PD-1 y PD- 1) se selecciona.

En otra realizacion, un metodo para identificar un anticuerpo para disminuir una respuesta inmunitaria conlleva determinar la capacidad de un anticuerpo candidato para potenciar la interaccion entre un ligando PD-1 y un polipeptido B7 y seleccionar un anticuerpo que inhiba la interaccion entre el ligando PD-1 y el polipeptido B7. En otra realizacion, un metodo para identificar un anticuerpo para disminuir una respuesta inmunitaria conlleva determinar la capacidad del anticuerpo candidato para potenciar la interaccion entre un ligando PD-1 y PD-1 y seleccionar un anticuerpo que potencie la interaccion entre el ligando PD-1 y PD-1.

En otra realizacion, un ensayo basado en celula, que comprende poner en contacto una celula que exprese PD-1, PD-L1 o PD-L2, con un anticuerpo de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la union de PD-1 o el ligando PD-1 diana con su companero de union. La determinacion de la capacidad de PD-1, ligando de PD-1 o polipeptido B7 para unirse a, o interaccionar con, su companero de union puede realizarse, por ejemplo, midiendo la union directa o midiendo un parametro de activacion celular inmunitaria.

Por ejemplo, en un ensayo de union directa, PD-1 o la proteina ligando PD-1 (o sus respectivos polipeptidos diana) pueden acoplarse con un radioisotopo o marcador enzimatico de tal manera que la union de ligando PD-1 a PD-1 o al polipeptido B7 puede determinarse detectando la proteina marcada en un complejo. Por ejemplo, PD-1 o PD-L1 puede marcarse con 125I, 35S, 14C o 3H, directa o indirectamente, y el radioisotopo detectarse mediante recuento directo de radioemision o por recuento de centelleo. Como alternativa, PD-1 o el ligando de PD-1 puede marcarse enzimaticamente por ejemplo con peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimatico puede detectarse por determinacion de la conversion de un sustrato apropiado al producto.

Tambien se encuentra dentro del alcance de esta divulgacion determinar la capacidad de un compuesto para modular la interaccion entre PD-1 y un ligando PD-1 o entre un ligando PD-1 y un polipeptido B7 sin el marcaje de ninguno de los compuestos que interaccionan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiometro para detectar la interaccion de PD-1 y un ligando PD-1 o entre un ligando PD-1 y un polipeptido B7, con su polipeptido diana, sin marcar ninguno de PD-1, el ligando de PD-1, polipeptido B7, o el polipeptido diana (McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912). Como se usa en el presente documento, un “microfisiometro" (por ejemplo, Citosensor) es un instrumento analitico que mide la velocidad a la cual una celula acidifica su entorno usando un sensor potenciometrico dirigido por luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificacion pueden usarse como un indicador de la interaccion entre un compuesto y un receptor.

En otra realizacion, la determinacion de la capacidad del anticuerpo para antagonizar la interaccion entre un conjunto determinado de polipeptidos puede realizarse determinando la actividad de uno mas miembros del conjunto de polipeptidos. Por ejemplo, la actividad de PD-1 o un ligando de PD-1 puede determinarse detectando la induccion de un segundo mensajero celular (por ejemplo, actividad tirosina quinasa), detectando la actividad catalitica/enzimatica de un sustrato apropiado, detectando la induccion de un gen indicador (que comprende un elemento regulador sensible a diana unido operativamente a un acido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, cloranfenicol acetil transferasa), o detectando una respuesta celular regulada por PD-1 o el ligando de PD-1. La determinacion de la capacidad del anticuerpo para unirse a o interaccionar con dicho polipeptido puede realizarse, por ejemplo, midiendo la capacidad de un compuesto para modular la coestimulacion o inhibicion celular inmunitaria en un ensayo de proliferacion, o por interferencia con la capacidad de dicho polipeptido para unirse a anticuerpos que reconocen una parte de los mismos.

Los anticuerpos que bloquean o inhiben la interaccion de un ligando PD-1 con un receptor coestimulador, asi como anticuerpos que promueven una senal inhibidora mediada por ligando de PD-1 pueden identificarse por su

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capacidad para inhibir la proliferacion celular inmunitaria y/o funcion efectora, o inducir anergia cuando se anade a un ensayo in vitro. Por ejemplo, las celulas pueden cultivarse en presencia de un agente que estimula la transduccion de senal mediante un receptor de activacion. Pueden emplearse diversas lecturas reconocidas de activacion celular para medir la proliferacion celular o funcion efectora (por ejemplo, produccion de anticuerpos, produccion de citocinas, fagocitosis) en presencia del agente activador. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para bloquear esta activacion puede determinarse facilmente midiendo la capacidad del anticuerpo para afectar a una disminucion en la proliferacion o funcion efectora que se mide usando tecnicas conocidas en la materia.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invention pueden ensayarse por la capacidad de inhibir o potenciar la coestimulacion en un ensayo en linfocitos T, como se describe en Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027 y Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261. Los linfocitos T CD4+ pueden aislarse de PBMc humanas y estimularse con anticuerpo anti-CD3 de activacion. La proliferacion de linfocitos T puede medirse mediante incorporation de timidina 3H. Puede realizarse un ensayo con o sin coestimulacion de CD28 en el ensayo. Pueden realizarse ensayos similares con celulas con linfocitos T Jurkat y blastos PHA de PBMC.

En otra realization adicional, un ensayo de la presente divulgation es un ensayo acelular en el que PD-1 o un ligando de PD-1 o una parte biologicamente activa de los mismos se pone en contacto con un anticuerpo de ensayo, y se determina la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse al polipeptido, o parte biologicamente activa del mismo. La union del anticuerpo en ensayo con el polipeptido PD-1 o ligando de PD-1 puede determinarse directa o indirectamente como se ha descrito anteriormente. En otra realizacion mas, el ensayo incluye poner en contacto el polipeptido, o parte biologicamente activa del mismo, con su companero de union para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un anticuerpo de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con el polipeptido en la mezcla de ensayo, en el que la determination de la capacidad del anticuerpo de ensayo para interaccionar con el polipeptido comprende determinar la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse preferentemente al polipeptido o parte biologicamente activa del mismo, en comparacion con el companero de union.

Por ejemplo, un ligando PD-1 y un polipeptido PD-1 puede usarse para formar una mezcla de ensayo y la capacidad de un anticuerpo de ensayo para bloquear esta interaction puede ensayarse determinando la capacidad de PD-1 para unirse al ligando PD-1 y determinar la capacidad del ligando PD-1 para unirse al polipeptido PD-1, mediante uno de los metodos descritos anteriormente para determinar la union. La determinacion de la capacidad de un polipeptido PD-1 para unirse a un ligando PD-1 y determinar la capacidad de un ligando PD-1 para unirse a un polipeptido B7 tambien puede realizarse usando una tecnologia tal como analisis de interaccion biomolecular en tiempo real (BIA) (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Como se usa en el presente documento, “BIA" es una tecnologia para estudiar interacciones bioespecificas en tiempo real, sin marcar ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Pueden usarse cambios en el fenomeno optico de resonancia del plasmon superficial (SPR) como una indication de reacciones en tiempo real entre polipeptidos biologicos. PD-1, el ligando de PD-1 y polipeptido B7 pueden movilizarse en una microplaca BIAcore y los anticuerpos pueden ensayarse para union a PD-1, el ligando de PD-1 y polipeptido B7. Un ejemplo del uso de la tecnologia BIA lo describen Fitz et al. (1997) Oncogene 15:613.

Los ensayos acelulares de la presente divulgacion se dirigen al uso de formas de proteinas solubles y/o unidas a membrana (por ejemplo, un ligando PD-1 o proteinas PD-1 o partes biologicamente activas de las mismas, o companeros de union a los cuales se une un ligando PD-1 o PD-1). En el caso de ensayos acelulares en los que se usa una proteina que forma una union a membrana (por ejemplo, un receptor de PD-1 ligando PD-1 de superficie celular) puede ser deseable utilizar un agente solubilizante de tal manera que la forma unida a membrana de la proteina se mantenga en solution. Los ejemplos de dichos agentes solubilizantes incluyen detergentes no ionicos tales como n-octilglucosido, n-dodecilglucosido, n-dodecilmaltosido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N- metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, Isotridecipoil (eter de etilenglicol)n, 3-[(3-

colamidopropil)dimetilamino]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dietilamino]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO), o N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato.

En una o mas realizaciones de los metodos de ensayo descritos anteriormente, puede ser deseable inmovilizar bien PD-1, un ligando de PD-1 y un polipeptido B7, o un polipeptido diana apropiado para facilitar la separation de las formas que forman complejo de las que no forman complejo de una o ambas proteinas, asi como acomodar la automatization del ensayo. La union de un anticuerpo de ensayo o un ligando de PD-1 puede realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactantes. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de micotitulacion, tubos de ensayo y tubos de microcentrifuga. En una realizacion, puede proporcionarse una proteina de fusion que anada un dominio que permita que una o ambas de las proteinas se unan a una matriz. Por ejemplo, proteinas de fusion glutation-S-transferasa/PD-1, ligando de PD-1 o polipeptido B7 o proteinas de fusion glutation-S- transferasa/diana, pueden absorberse sobre perlas de glutation sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulacion derivatizadas con glutation que despues se combinan con el compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formation del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiologicas para sal y pH). Despues de la incubation, las perlas o pocillos de la placa de micotitulacion se lavan para retirar cualquier componente no unido, la matriz inmovilizada en el caso de perlas, determinado el complejo bien directa o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos pueden disociarse

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de la matriz, y el nivel de union o actividad de PD-1, ligando de PD-1 o polipeptido B7 determinarse usando tecnicas convencionales.

En una realizacion alternativa, la determinacion de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de PD-1 o ligando de PD-1 puede realizarse determinando la capacidad del anticuerpo de ensayo para modular la actividad de un polipeptido que actua aguas abajo de PD-1 o ligando de PD-1, por ejemplo, un polipeptido que interacciona con el ligando PD-1, o un polipeptido que funciona aguas abajo de PD-1, por ejemplo, interaccionando con el dominio citoplasmatico de PD-1. Por ejemplo, pueden determinarse niveles de segundos mensajeros, la actividad del polipeptido que interacciona sobre una diana apropiada puede determinarse, o la union del compuesto que interacciona con una diana apropiada puede determinarse como se ha descrito anteriormente.

La presente divulgacion tambien se refiere a nuevos anticuerpos identificados mediante los ensayos de exploracion descritos anteriormente. Por consiguiente, esta dentro del ambito de la presente invention usar adicionalmente un anticuerpo identificado como se describe en el presente documento en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un anticuerpo identificado como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho anticuerpo. Como alternativa, un anticuerpo identificado como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar el mecanismo de action de dicho anticuerpo. Adicionalmente, la presente invencion se refiere a usos de nuevos anticuerpos identificados por los ensayos de exploracion descritos anteriormente para tratamientos como se describe en el presente documento.

2. Metodos profilacticos

Los anticuerpos de la presente invencion y la divulgacion pueden usarse para prevenir en un sujeto, una enfermedad o afeccion asociada con una respuesta inmunitaria no deseada, o no deseable. Los sujetos que estan en riesgo de una enfermedad que podrian beneficiarse del tratamiento con los anticuerpos o metodos que se reivindican pueden identificarse, por ejemplo, mediante cualquiera o una combination de ensayos de diagnostico o pronostico conocidos en la tecnica. La administration de un anticuerpo profilactico puede producirse antes de la manifestation de los sintomas asociados con una respuesta inmunitaria no deseada o no deseable. El anticuerpo apropiado usado para el tratamiento puede determinarse basandose en indicaciones clinicas y puede identificarse usando, por ejemplo, ensayos de exploracion descritos en el presente documento.

3. Metodos terapeuticos

Los anticuerpos de la presente invencion y divulgacion pueden usarse en metodos terapeuticos de modulation de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, modulando la interaction entre PD-1 y un ligando de PD-1 y/o un ligando de PD-1 y un polipeptido B7. Por ejemplo, la modulacion de la interaccion entre PD-1 y un ligando de PD-1, o entre un ligando de PD-1 y un polipeptido B7, da como resultado la modulacion de la respuesta inmunitaria. Por tanto, en una realizacion, los anticuerpos que bloquean la interaccion entre PD-1 y el ligando PD-1 pueden impedir la senalizacion inhibidora. Los ligandos de PD-1 tambien pueden potenciar senales coestimuladoras en linfocitos T. Por tanto, en otra realizacion, los anticuerpos que impiden que el ligando PD-L1 proporcione una senal coestimuladora que puede inhibir la coestimulacion de linfocitos T.

Estos anticuerpos moduladores pueden administrase in vitro (por ejemplo, poniendo en contacto la celula con un anticuerpo) o, como alternativa, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tales, los anticuerpos de la presente invencion y divulgacion pueden usarse en metodos de tratamiento de un individuo que padece una enfermedad o trastorno que podria beneficiarse de la modulacion de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, modulando la interaccion entre un ligando de PD-1 y PD-1 o un polipeptido B7. La invencion proporciona anticuerpos y fragmentos de los mismos para su uso en metodos de tratamiento, como se define en las reivindicaciones.

4. Regulation negativa de respuestas inmunitarias

Existen numerosas realizaciones de la invencion como se define en las reivindicaciones de regulacion positiva de la funcion inhibidora o regulacion negativa de la funcion coestimuladora de un ligando de PD-1 para regular negativamente por tanto respuestas inmunitarias.

La regulacion negativa puede ser en forma de inhibition o bloqueo de una respuesta inmunitaria ya en progreso o puede implicar la prevention de la induction de una respuesta inmunitaria. Las funciones de las celulas inmunitarias activadas pueden inhibirse regulando negativamente las respuestas celulares inmunitarias, o induciendo anergia especifica en celulas inmunitarias, o ambas cosas.

Por ejemplo, la respuesta inmunitaria puede modularse negativamente usando: anticuerpos anti-PD-L1 que bloquean la coestimulacion mediante PD-L1 (por ejemplo, aunque no afecte o aumente la interaccion entre PD-L1 y PD-1) o que promueva la union de PD-L1 con PD-1 (por ejemplo, aunque no afecte o aunque inhiba la coestimulacion por PD-L1).

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En una realizacion de la invencion, se induce tolerancia contra antigenos espedficos coadministrando un antigeno con un anticuerpo que bloquea la coestimulacion de PD-L1. Por ejemplo, la tolerancia puede inducirse en protemas espedficas. En una realizacion, pueden inhibirse las respuestas inmunitarias contra alergenos, o contra proteinas exogenas en la que no es deseable una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, los pacientes que reciben factor VIII frecuentemente generan anticuerpos contra este factor de coagulacion. La coadministracion de un anticuerpo que bloquea una senal coestimuladora mediada por PD-L1 en combination con el factor VIII recombinante (o mediante ligado fisicamente al Factor VIII, por ejemplo, por reticulation) pueda dar como resultado la modulation negativa.

En una realizacion, dos agentes distintos que modulan negativamente respuestas inmunitarias pueden combinarse como una sola composition o administrarse individualmente (de manera simultanea o secuencial) para regular negativamente mas eficazmente las respuestas inmunitarias mediadas por celulas inmunitarias en un sujeto. Adicionalmente, una cantidad terapeuticamente activa de uno o mas de los anticuerpos del sujeto, pueden usarse junto con otros reactivos de modulacion negativa para ejercer influencia en respuestas inmunitarias. Los ejemplos de otros reactivos inmunomoduladores incluyen, pero sin limitation, anticuerpos que bloquean una senal coestimuladora, (por ejemplo, contra CD28 o ICOS), anticuerpos que actuan como agonistas de CTLA4, y/o anticuerpos contra otros marcadores de celulas inmunitarias (por ejemplo, contra CD40, contra el ligando de CD40, o contra citocinas), proteinas de fusion (por ejemplo, CTLA4-Fc), y farmacos inmunosupresores, (por ejemplo, rapamicina, ciclosporina A o FK506).

La regulation negativa o prevention de una coestimulacion del ligando PD-1, o la promotion de una interaction entre un ligando de PD-1 y PD-1 es util para regular negativamente la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en situaciones de trasplante de tejido, piel u organo en enfermedad de injerto frente a hospedador (GVHD), o en enfermedades inflamatorias tales como lupus eritematoso sistemico, y esclerosis multiple. Por ejemplo, el bloqueo de la funcion de las celulas inmunitarias da como resultado destruction tisular reducida en trasplante tisular. Normalmente, en los trasplantes tisulares, el rechazo del trasplante se inicia a traves de su reconocimiento como extrano por las celulas inmunitarias, seguido de una interaccion inmunitaria que destruye el trasplante. La administracion de un anticuerpo que inhibe la coestimulacion del ligando PD-1 solo o junto con otro agente modulador negativo, antes de o en el momento del trasplante puede promover la generation de una senal inhibidora. Ademas, la inhibition de senales coestimuladoras del ligando de PD-1 o la promocion de un ligando de PD-1 o senales inhibidoras de PD-1 tambien pueden ser suficientes para anergizar las celulas inmunitarias, induciendo de este modo tolerancia en un sujeto. La induction de tolerancia prolongada bloqueando una senal coestimuladora mediada por ligando PD-1 puede impedir la necesidad de realizar una administration repetida de estos reactivos bloqueantes.

Para conseguir inmunosupresion o tolerancia suficiente en un sujeto, tambien puede ser deseable bloquear la funcion coestimuladora de otros polipeptidos. Por ejemplo, puede ser deseable bloquear la funcion de B7-1, B7-2 o B7-1 y B7-2 administrando una forma soluble de una combinacion de peptidos que tienen actividad sobre cada uno de estos antigenos, bloqueando anticuerpos contra estos antigenos o bloqueando pequenas moleculas (individualmente o juntos en una sola composicion) antes de o en el momento del trasplante. Como alternativa, puede ser deseable promover la actividad inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1 e inhibir una actividad coestimuladora de B7-1 y/o B7-2. Otros agentes moduladores negativos que pueden usarse junto con los metodos de modulacion negativos de la invencion incluyen, por ejemplo, agentes que transmiten una senal inhibidora mediante CTLA4, formas solubles de CTLA4, anticuerpos que activan una senal inhibidora mediante CTLA4, anticuerpos de bloqueo contra otros marcadores de celulas inmunitarias o formas solubles de otros pares de ligando receptor (por ejemplo, agentes que alteran la interaccion entre CD40 y ligando de CD40 (por ejemplo, anticuerpos antiligando CD40)), anticuerpos contra citocinas o farmacos inmunosupresores.

La modulacion negativa de las respuestas inmunitarias tambien es util en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Muchos trastornos autoinmunitarios son el resultado de una activation inapropiada de celulas inmunitarias que son reactivas contra el propio tejido y que promueven la production de citocinas y autoanticuerpos implicados en la patologia de las enfermedades. La prevencion de la activacion de las celulas inmunitarias autorreactivas puede reducir o eliminar sintomas de enfermedades. La administracion de reactivos que bloquean la coestimulacion de celulas inmunitarias alterando interacciones entre ligando de PD-1 y polipeptidos B7, o promoviendo la interaccion entre ligando de PD-1 y PD-1, sin modular o, aunque se module negativamente la interaccion entre el ligando PD-1 y un polipeptido de B7, son utiles para inhibir la activacion de celulas inmunitarias y prevenir la activacion de autoanticuerpos o citocinas que pueden estar implicadas en procesos de enfermedad. Adicionalmente, agentes que promueven una funcion inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1 pueden inducir tolerancia especifica de antigenos de celulas inmunitarias autorreactivas, lo que podria conducir a alivio prolongado de la enfermedad. La eficacia de reactivos en la prevencion o alivio de trastornos autoinmunitarios puede determinarse usando diversos modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunitarias humanas. Como ejemplos se incluyen encefalitis autoinmunitaria experimental murina, lupus eritematoso sistemico en ratones MRLI/pr/lpr o ratones hibridos NZB, artritis inducida por colageno autoinmunitario murino, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB y miastenia grave experimental murina (vease, por ejemplo, Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, tercera edition 1993, capitulo 30).

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La inhibition de la activation de las celulas inmunitarias es terapeuticamente util en el tratamiento de reacciones alergicas y alergia, por ejemplo, inhibiendo la production de IgE. Un anticuerpo que promueve un ligando PD-1 o la funcion inhibidora de PD-1 puede administrarse a un sujeto alergico para inhibir las respuestas alergicas mediadas por celulas inmunitarias en el sujeto. La inhibicion de la coestimulacion del ligando PD-1 de celulas inmunitarias o la estimulacion de un ligando de PD-1 o la ruta inhibidora de PD-1 puede venir acompanada por la exposition al alergeno junto con polipeptidos apropiados del MHC. Las reacciones alergicas pueden ser sistemicas o locales en naturaleza, dependiendo de la via de entrada del alergeno y del patron de deposition de IgE en mastocitos o basofilos. Por tanto, la inhibicion de respuestas alergicas mediadas por celulas inmunitarias local o sistemicamente por administracion de una forma inhibidora de un agente que inhibe la interaccion de un ligando de PD-1 con un receptor coestimulador, o un anticuerpo que promueve una funcion inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1.

La inhibicion de la activacion de celulas inmunitarias a traves del bloqueo de la coestimulacion del ligando PD-1, o a traves de la promotion de la interaction entre un ligando PD-1 y PD-1, tambien puede ser terapeuticamente importante en infecciones viricas de celulas inmunitarias. Por ejemplo, en el sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la replication viral se estimula mediante activacion de celulas inmunitarias. La modulation de estas interacciones puede dar como resultado la inhibicion de la replicacion virica y por tanto mejorar el transcurso del SIDA. La modulacion de estas interacciones tambien puede ser util en la promocion del mantenimiento del embarazo. El ligando de PD-1 normalmente se expresa a altos niveles en trofoblastos de placenta, la capa de celulas que forma la interfaz entre la madre y el feto y que puede desempenar una funcion en la prevencion de rechazo materno del feto. Las mujeres en riesgos de aborto espontaneo (por ejemplo, aquellas que ya han experimentado previamente un aborto o que tienen dificultad para concebir) debido al rechazo inmunologico del embrion o fetos pueden tratarse con agentes que modulan estas interacciones.

La regulation negativa de una respuesta inmunitaria por modulacion de la coestimulacion de un ligando PD-1 o por la modulacion del ligando PD-1/union PD-1 tambien puede ser util en el tratamiento de ataque autoinmunitario de tejidos autologos. Por ejemplo, el ligando PD-1 normalmente se expresa a altos niveles en el corazon y puede protegerlo de ataque autoinmunitario. Esto se pone de manifiesto por el hecho de que los ratones knockout Balb/c PD-1 presentan ataque autoinmunitario masivo en el corazon con trombosis. Por tanto, las afecciones que estan ocasionadas o agravadas por ataque autoinmunitario (por ejemplo, en este ejemplo, cardiopatia, infarto de miocardio o aterosclerosis) pueden mejorarse o aumentarse por modulacion de estas interacciones. Esta por lo tanto dentro del ambito de la invention modular afecciones agravadas por ataque autoinmunitario, tales como trastornos autoinmunitarios (asi como afecciones tales como cardiopatia, infarto del miocardio y aterosclerosis).

5. Regulacion positiva de respuestas inmunitarias

Tambien es terapeuticamente util es el bloqueo de la interaccion de un ligando de PD-1 con PD-1 o B7-1 como un medio para regular positivamente una respuesta inmunitaria. La regulacion positiva de las respuestas inmunitarias puede ser en forma de potenciacion de una respuesta inmunitaria existente o desencadenamiento de una respuesta inmunitaria inicial. Por ejemplo, la potenciacion de una respuesta inmunitaria usando las composiciones y metodos objeto es util en caso de infecciones con microbios (por ejemplo, bacterias, virus o parasitos). En una realization, se usa un anticuerpo que bloquea la interaccion de PD-L1 con PD-1 para potenciar la respuesta inmunitaria. Dicho anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo no activador que bloquea la union de PD-L1 con PD-1) es terapeuticamente util en situaciones en las que seria beneficiosa la regulacion positiva de respuestas mediadas por celulas y anticuerpos. Como trastornos a modo de ejemplo se incluyen trastornos cutaneos viricos, tales como herpes o culebrillas, en cuyo caso dicho agente puede administrarse por via topica a la piel. Ademas, las enfermedades viricas sistemicas tales como gripe, resfriado comun y encefalitis podrian aliviarse por la administration sistemica de dichos agentes.

Como alternativa, las respuestas inmunitarias pueden potenciarse en un paciente infectado a traves de una estrategia ex vivo, por ejemplo, sustrayendo celulas inmunitarias del paciente, poniendo en contacto las celulas inmunitarias in vitro con un anticuerpo que bloquea la interaccion de un ligando PD-1 con PD-1 y reintroduciendo las celulas inmunitarias estimuladas in vitro al paciente.

En determinados casos, seria deseable administrar adicionalmente otros agentes que regulen positivamente las respuestas inmunitarias, por ejemplo, formas de otros miembros de la familia B7 que transducen senales mediante receptores coestimuladores, para aumentar adicionalmente la respuesta inmunitaria.

Un anticuerpo que bloquea la interaccion de un ligando PD-1 con PD-1 o B7-1 puede usarse profilacticamente en vacunas contra diversos polipeptidos (por ejemplo, polipeptidos procedentes de patogenos). La inmunidad contra un patogeno (por ejemplo, un virus) puede inducirse vacunando con una proteina virica junto con un anticuerpo que bloquea la interaccion de un ligando PD-1 con PD-1 o B7-1 en un adyuvante apropiado.

En otra realizacion, la regulacion positiva o potenciacion de una funcion de una respuesta inmunitaria, como se describe en el presente documento, es util en la induction de inmunidad tumoral.

En otra realizacion, la respuesta inmunitaria puede estimularse por los metodos descritos en el presente documento,

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de tal manera que se supera la tolerancia preexistente. Por ejemplo, las respuestas inmunitarias contra antigenos contra los cuales un sujeto no puede crear una respuesta inmunitaria significativa, por ejemplo, contra un antigeno autologo, tal como antigenos especificos de tumor pueden inducirse administrando un anticuerpo que bloquee la interaction de un ligando de PD-1 con PD-1. En una realization, un antigeno autologo, tal como un antigeno especifico de tumor, puede coadministrarse. En otra realizacion, puede estimularse una respuesta inmunitaria contra un antigeno (por ejemplo, un antigeno autologo) para tratar un trastorno neurologico. En otra realizacion, los agentes objeto pueden usarse como adyuvantes para reforzar respuestas contra antigenos exogenos en el proceso de inmunizacion activa.

En una realizacion, se obtienen celulas inmunitarias de un sujeto y se cultivan ex vivo en presencia de un anticuerpo como se describe en el presente documento, para ampliar la poblacion de celulas inmunitarias y/o potenciar la activation de celulas inmunitarias. En una realizacion adicional las celulas inmunitarias se administran despues a un sujeto. Las celulas inmunitarias pueden estimularse in vitro, por ejemplo, proporcionando a las celulas inmunitarias una senal de activacion primaria y una senal coestimuladora, como se sabe en la tecnica. Para coestimular la proliferation de las celulas inmunitarias pueden usarse diversos agentes. En una realizacion las celulas inmunitarias se cultivan ex vivo de acuerdo con el metodo descrito en la Publication PCT n.° WO 94/29436. El polipeptido coestimulador puede ser soluble, estar unido a una membrana celular, o unido a una superficie solida, tal como una perla.

Otras realizaciones de la presente invention se describen en los siguientes Ejemplos. La presente invention se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los ejemplos descritos a continuation describen la generation de anticuerpos monoclonales adecuados para propositos terapeuticos que se dirigen a PD-1 humano, PD-L1 y PD-L2. Los anticuerpos compuestos humanos anti- PD-1, PD-L1 y PD-L2 humanos se generaron a partir de anticuerpos de raton anti EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 humanos, respectivamente. Los segmentos de la secuencia de la region V humana se adquirieron de las bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos no relacionadas (linea germinal y linea no germinal). Cada segmento de secuencia seleccionado (asi como las uniones entre segmentos) se sometio a ensayo con respecto a la posibilidad de unirse al MHC de clase II usando algoritmos de prediction de union. Todo los variantes de secuencia de anticuerpos humanos compuestos finales se disenaron para impedir epitopos de linfocitos T. Las regiones de la region V de anticuerpo humano compuestas se generaron usando oligonucleotidos sinteticos que codifican combinaciones de segmentos de secuencia humana. Despues estos se clonaron en vectores que contenian regiones constantes humanas, y se produjeron anticuerpos y ensayaron con respecto a la union a antigenos diana por ELISA de competencia. Los anticuerpos anti PD-1 y anti PD-L2 desvelados en los ejemplos estan fuera del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones, pero se conservan para information de fondo.

Ejemplo 1: Diseno de secuencias de region variable de anticuerpo humano, compuestas

Modelos estructurales de las regiones EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 V de raton se produjeron usando Swiss Pdb y se analizaron para identificar aminoacidos importantes “de restriction” en las regiones V de raton que podrian ser esenciales para las propiedades de union de los anticuerpos. Unicamente los restos contenidos en las CDR se consideraron que eran importantes, incluyendo los restos de la CDR definidos en las definiciones de Kabat y Chothia.

A partir de los analisis anteriores, se considero que las formas humanas compuestas de EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 podrian crearse sin una amplia latitud de secuencias fuera de las cDr pero con un menu estrecho de posibles restos alternativos dentro de las secuencias CDR. Analisis preliminares indicaron que los segmentos de secuencia correspondientes de diversos anticuerpos humanos podrian combinarse para crear CDR similares o identicas a las de las secuencias de raton. Para las regiones fuera de y que flanquean las CDR, se identifico una amplia selection de segmentos de secuencia humana como posibles componentes de las nuevas regiones variables de anticuerpo humano compuesto.

Basandose en los analisis anteriores, se selecciono un gran conjunto preliminar de segmentos de secuencia que podrian usarse para crear variantes de anticuerpo humano compuesto EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 y se analizaron mediante algoritmos de prediccion de union de MHC de clase II y busqueda con BLAST a traves de una base de datos patentada de secuencia de anticuerpos conocida relacionada con epitopos de linfocitos T. Segmentos de secuencia en los que se identificaron posibles peptidos de union al MHC de clase II o se puntuaron aciertos significativos contra la base de datos de epitopos de linfocitos T conocidos se descartaron. Esto produjo un conjunto reducido de segmentos, y las combinaciones de estos se analizaron de nuevo, como se ha indicado anteriormente, para garantizar que las uniones entre los segmentos no contenian posibles epitopos de linfocitos T. Despues los segmentos seleccionados se combinaron para producir secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera para la sintesis. Para los tres anticuerpos, se construyeron cinco cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras con las secuencias detalladas a continuacion:

Antigeno Secuencias VH Compuestas Secuencias VK Compuestas

PD-1 Figura 2 (A-E) Figura 3 (A-D)

PD-L1 Figura 4 (A-E) Figura 5 (A-D)

PD-L2 Figura 6 (A-E) Figura 7 (A-D)

Los segmentos de secuencia usados para producir estas secuencias de anticuerpos humanos compuestas, se detallan en las Tablas 1,2 y 3 para anticuerpos contra PD-1, PD-L1 y PD-L2, respectivamente.

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Tabla 1. Derivacion de segmentos de secuencia humana que comprenden los anticuerpos humanos, _________________________________compuestos anti-PD-1__________________________________

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Tabla 2. Derivacion de los segmentos de secuencia humana que comprenden los anticuerpos humanos _________________________________compuestos anti-PD-L1__________________________________

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AAV39747: AWGY (SEQ ID NO: 119)

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n.° de Registro Genbank: Secuencia Vk4 (e)

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Tabla 3. Derivacion de segmentos de secuencia humana que comprenden los anticuerpos humanos anti-PD- _______________________________________L2 compuestos_______________________________________

n.° de Registro Genbank: Secuencia VH2 (a)

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n.° de Registro Genbank: Secuencia VH4 (b)

ABF83419: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGY (SEQ ID NO: 147)

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Ejemplo 2: generacion y ensayo de loa anticuerpos humanos, compuestos

Los genes de la region VH y VK del anticuerpo humano compuestos de variante 1 inicial, se sintetizaron para EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 usando una serie de oligonucleotidos solapantes que se hibridaron, se ligaron y se amplificaron por PCR para producir regiones V sinteticas de longitud completa (Figura 2A, Figura 3A, Figura 4A, Figura 5A, Figura 6A y Figura 7A). Para cada anticuerpo humano compuesto, se construyeron variantes de secuencia posteriores usando oligonucleotidos solapantes largos y PCR usando la variante 1 inicial como molde. Despues las variantes ensambladas se clonaron directamente en vectores de expresion (Figura 1) y sus secuencias se verificaron.

Todas las combinaciones de las cadenas pesada y ligera quimericas y compuestas (es decir un total de 20 emparejamientos para cada anticuerpo) se transfectaron de manera estable en celulas NS0 por electroporacion y se seleccionaron en medios (DMEM alto contenido de glucosa con L-glutamina y Na piruvato, IgG FCS ultra bajo 5 %, pen/estrep - todos ellos de Invitrogen) que contenian metotrexato 200 nM. Se ensayaron diversas colonias resistentes a farmacos para cada construccion para los niveles de expresion y las lineas de mejor expresion se seleccionaron y congelaron con nitrogeno liquido.

Los sobrenadantes de las lineas que mejor se expresaron de cada combinacion se cuantificaron usando una captura Fc, ELISA de deteccion de cadena ligera Kappa en comparacion con un patron IgG1/kappa. Despues los sobrenadantes cuantificados se ensayaron en un ELISA de competencia para la union con su antigeno diana. Noventa y seis pocillos de placas Maxisorb™ (Nunc) se recubrieron durante una noche a 4 °C con 50 |jl/pocillo de Fc-PD-1, Fc-PD-L1 o Fc-PD-L2 humano 1 jg/ml (R & D Systems) en tampon carbonato pH 9,6. Se generaron titulaciones por duplicado del anticuerpo de referencia de raton y muestras de anticuerpo humano compuesto (en el intervalo de 0,0078 jg/ml a 8 jg/ml) y se mezclaron con una concentracion constante (40 ng/ml) de anticuerpo de referencia de raton biotinilado en PBS pH 7,4/BSA al 2 %. Se anadieron las titulaciones, 100 jl/pocillo, a placas de ensayo lavadas (4x con PBS pH 7,4/Tween 20 al 0,05 %) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente, y se anadieron 100 jl/pocillo de una dilucion 1/1000 de HRP estreptavidina (Sigma) en PBS pH 7,4/BSA al 2 % y se incubo durante 1 hora mas a temperatura ambiente. Despues de un lavado adicional, el anticuerpo de referencia biotinilado unido se detecto con sustrato OPD 100 jl/pocillo. Se midio la absorbancia a 490 nm y las curvas de union de los anticuerpos de ensayo se compararon con el patron de referencia de raton. La absorbancia se represento graficamente frente a la concentracion de muestra y las lineas rectas se ajustaron a traves de cada uno de los conjuntos de datos. Las ecuaciones de las lineas se usaron para calcular la concentracion necesaria para inhibir la union de biotina-EH12.2H7 con PD-1, la union de biotina-29E.2A3 con PD-L1 y la union de biotina-24F.10C12 con PD-L2 humano al 50 % (CI50).

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Los anticuerpos con el mayor valor CI50 se seleccionaron y las lmeas celulares de todas estas variantes de anticuerpos EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 se aumentaron de volumen a 100 ml y crecieron hasta la saturacion. Los anticuerpos se purificaron de cada cultivo mediante cromatografia de afinidad con proteina A. En resumen, el pH de los sobrenadantes se ajusto con un volumen de 0,1 de PBS 10 x pH 7,4 y se pasaron sobre columnas de proteina A de 1 ml Mab Select Sure (GE Healthcare). Las columnas se lavaron con 10 volumenes de PBS pH 7,4 antes de la elucion con tampon citrato 50 mM pH 3,0. Se recogieron fracciones de 1 ml e inmediatamente se neutralizaron con 0,1 ml de Tris-HCl 1 M pH 9,0. Las fracciones que contenian proteina (segun la absorbancia a 280 nm) se agruparon, el tampon se cambio en PBS pH 7,4 y los anticuerpos purificados se conservaron a + 4 °C. Las figuras 8A-C muestran un gel SDS-PAGE de 1 |jg de cada anticuerpo, tenido con azul de coomassie. Las concentraciones de los anticuerpos se calcularon mediante absorcion UV basandose en los coeficientes de extincion molar calculados de tal manera que Eo,i % a 280 nm = 1,61 para EH12.2H7, E0.1 % a 280 nm = 1,46 para 29E.2A3 y E0.1 % a 280 nm = 1,57 para 24F.10C12.

Los anticuerpos purificados se ensayaron con respecto a la union a Fc-PD-1, Fc-PD-L1 o PD-Fc-L2 humano mediante ensayo de competicion ELlSA como se ha descrito anteriormente. Las titulaciones de los anticuerpos de ensayo se realizaron a partir de 0,0625 jg/ml a 8,0 jg/ml por duplicado. Se midio la absorbancia a 490 nm y esta se represento graficamente frente a la concentracion del anticuerpo de ensayo (Figuras 9A-C, 10A-C).

La Tabla 4 resume los resultados de las combinaciones de las secuencias variantes VH y VK del compuesto para los anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 y PD-L2. Para EH12.2H7 todos los anticuerpos humanizados tenian un valor CI50 que se mejora en comparacion con la referencia de raton, particularmente VH4/VK3 que tenia un aumento de dos veces en cuanto a la union. En el caso de 29E.2A3, las variantes VH2/VK1 y VH2/VK4 tenian equivalente union con respecto a la referencia de raton mientras que las variantes VH2/VK2 y VH4/VK2 tenian una union reducida al 1,75 y 1,36 veces respectivamente. Para 24F.10C12, todas las variantes seleccionadas tenian una union similar, aunque ligeramente reducida, en comparacion con la referencia del raton (1,13 veces).

Tabla 4: Valores CI50 para variantes de secuencia del anticuerpo humano, compuesto PD-1, PD-L1 y PD-L2

Anticuerpo EH12.2H7 CI50 jg/ml: Anticuerpo 29E.2A3 CI50 jg/ml Anticuerpo 24F.10C12 CI50 jg/ml

raton: 1,23 raton 0,28 raton 0,52

VH3/VK3: 0,93 VH2/VK1 0,27 VH2/VK2 0,58

VH3/VK4: 0,74 VH2/VK2 0,49 VH2/VK3 0,59

VH4/VK3: 0,57 VH4/VK2 0,38 VH4/VK2 0,60

VH4/VK4: 0,91 VH2/VK4 0,29 VH4/VK4 0,58

Como resultado de estos experimentos, los anticuerpos humanos compuestos especificos para PD-1, PD-L1 y PD- L2 humanos se habian construido a partir de segmentos de secuencias de aminoacidos procedentes de regiones variables de anticuerpo humano no relacionadas. Todas las CDR y regiones marco conservadas en las variantes de anticuerpo humano compuestas comprendian mas de un segmento de secuencia humana no relacionado (obtenido de la base de datos de secuencias humanas) y todos los anticuerpos humanos compuestos se disenaron especificamente para impedir epitopos de linfocitos T. Cuatro candidatos principales se seleccionaron inicialmente para la union a PD-1, PD-L1 o PD-L2 humano y, despues de analisis posterior, se demostro que tenian union con un factor de dos sobre el anticuerpo murino.

Ejemplo 5: Estimulacion potenciada de la activacion de linfocitos T por inhibicion de la interaccion entre PD-1: ligando PD

La ruta de senalizacion de PD-1 inhibe senales coestimuladoras moderadas de TCR/CD28, reduciendose la produccion de citocina primero sin una disminucion en la proliferacion de linfocitos T. A medida que las senales coestimuladoras de TCR/CD28 se debilitan, la ruta PD-1 domina, con una gran reduccion en la produccion de citocinas acompanada por una reduccion en la proliferacion. Por consiguiente, para confirmar que la inhibicion de la ruta de PD-1 mediante la inhibicion de la interaccion con PD-L1 o PD-L2 usando los anticuerpos humanos compuestos de la invencion potencia la activacion de linfocitos T, se realizan reacciones mixtas de linfocitos (MLR).

Se aislan celulas dendriticas mieloides inmaduras cultivando monocitos de sangre periferica humana en IL-4 y GM- CSF. La exposicion de celulas dendriticas inmaduras a un coctel inflamatorio de IL-1 p, TNF-a, IL-6 y PGE2 suscita el desarrollo de celulas dendriticas maduras que funcionan como APC. Sin embargo, la adicion de IL-10 a las citocinas inflamatorias dadas durante la fase de maduracion produce APC que funcionan solo 1/6 a 1/3 tambien.

Se realizaron ensayos de activacion de linfocitos T (MLR), usando celulas dendriticas tratadas con IL-10 como APC, en presencia de los anticuerpos humanos, compuestos contra PD-1, PD-L1 y/o PD-L2, o anticuerpos control. La adicion de mAb anti-PD-1, anti-PD- L1 y/o PD-L2 a cultivos de celulas dendriticas tratadas con IL-1 0 mas linfocitos T alogenicos se predice que produce un aumento en la proliferacion de linfocitos T y expresion de citocinas, en comparacion con cultivos tratados con IgG control. Una combinacion de anticuerpos anti-PD-1 con anticuerpos anti-

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PD-L1, anticuerpos anti-PD-L2, tambien puede producir un aumento en la estimulacion mayor que el observado con cualquiera de los anticuerpos solos.

Ejemplo 6: Inhibicion de la ruta de PD-1 en ratones cronicamente infectados

Ratones infectados con diversas cepas del virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMV) se usaron para estudiar el efecto de infeccion virica cronica sobre la funcion de linfocitos T CD8. La cepa Armstrong de LCMV causa una infeccion aguda que se elimina al cabo de 8 dias, dejando atras una poblacion de larga vida de linfocitos T CD8 de memoria en reposo, muy funcionales. Por otro lado, la cepa Cl-13 de LCMV, establece una infeccion persistente en el hospedador, caracterizada por una viremia de hasta tres meses.

Para confirmar que el bloqueo de la senalizacion de PD-1 restablece la funcion de linfocitos T y potencia el control virico durante infeccion LCMV cronica, la senalizacion de PD-1 se interrumpe durante infeccion LCMV cronica usando anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invention. Los anticuerpos se administran cada tres dias a ratones infectados con Cl-13 de LCMV del dia 23 al dia 37 post-infection. Se esperaba que el dia 37 hubiera varios aumentos mas de linfocitos T CD8 especificos de LCMV en ratones tratados con respecto a los controles no tratados. Tambien se esperaba que la induction de la proliferation fuese especifica contra linfocitos T CD8 dado y el numero de linfocitos T CD4 en el bazo probablemente sera el mismo en ambos ratones tratados y no tratados.

Ademas de un aumento en la proliferacion de linfocitos T CD8, se esperaba que la inhibicion de la senalizacion de PD-1 tambien produjese una production aumentada de citocinas antiviricas en linfocitos T CD8 especificos de virus. La produccion de IFN-gamma y TNF-alfa por linfocitos T CD8 seria posiblemente de varias veces mas en ratones tratados en comparacion con los no tratados. La elimination virica tambien debe acelerarse, y titulos virales reducidos deben observarse en pulmon y rinon el dia 37 post-infeccion en ratones tratados, aunque probablemente los ratones no tratados presentasen niveles significativos de virus en todos estos tejidos.

Los linfocitos T CD4 desempenan una funcion principal en la generation y mantenimiento de respuestas de linfocitos T CD8. En este sentido, los linfocitos T CD8 sensibilizados en ausencia de linfocitos T CD4 no pueden crear respuestas inmunitarias normales, y por tanto a menudo reciben el nombre de “linfocitos T indefensos”. Adicionalmente, la infeccion cronica de LCMV-Cl-13 es mas grave en ausencia de linfocitos T CD4. Por consiguiente, los linfocitos T indefensos, generados durante infeccion LCMV-Cl-13, presentan una disfuncion funcional incluso mas profunda que los linfocitos T generados en presencia de linfocitos TCD4.

Los linfocitos T CD4 se agotan en el momento de infeccion LCMV-Cl-13 y los ratones se tratan con anticuerpos anti- PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 humanos compuestos de la presente invencion desde el dia 46 al dia 60 post-infeccion. Se espera que despues de un tratamiento, los ratones tratados tengan varias veces mas linfocitos T CD8 especificos de LCMV en su bazo que los ratones de control no tratados. Este aumento en los linfocitos T CD8 especificos de virus en los ratones tratados posiblemente produzca un aumento en la proliferacion, detectado por incorporation de BrdU. El analisis de BrdU se realiza introduciendo BrdU 1 mg/ml en el agua potable durante el tratamiento y la tincion se realiza de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, Calif.).

Para confirmar que la inhibicion de las senales PD-1 aumenta la actividad litica de linfocitos T CD8 especificos de virus, agotados indefensos, la actividad litica ex vivo de linfocitos T CD8 especificos de virus se detecta despues del tratamiento usando un ensayo de liberation de 51Cr (Wherry et al., 2003. J. Virol. 77:4911-27). Se espera que los titulos virales se reduzcan varias veces en el bazo, higado, pulmon y suero despues de dos semanas de tratamiento con respecto a los ratones no tratados.

Ejemplo 7: Administration de una vacuna con un inhibidor de senalizacion de PD-1.

Una estrategia para reforzar las respuestas de linfocitos T durante una infeccion persistente es la vacunacion terapeutica. La logica de esta estrategia es que los antigenos endogenos pueden no estar presentes en una manera optima o inmunogenica durante la infeccion virica cronica y que el suministro de antigenos en forma de una vacuna puede proporcionar un estimulo mas eficaz para los linfocitos T y B especificos de virus. Usando el modelo de LCMV cronico, a los ratones se les administro un virus vaccinia recombinante que expresaba el epitopo GP33 de LCMV como una vacuna terapeutica (VVGP33), que produce una potenciacion modesta de respuestas de linfocitos T CD8 en algunos ratones cronicamente infectados. Esta vacunacion terapeutica se combina con los anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y anticuerpos y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invencion. Se espera que las respuestas de linfocitos T especificas de LCMV se refuercen a un mayor nivel en comparacion con cualquier tratamiento en solitario y que el efecto del tratamiento combinado sea probablemente mucho mas que aditivo.

Ejemplo 8: Chimpances como modelo de inmunoterapia de infeccion HCV persistente.

Los chimpances proporcionan un modelo de persistencia HCV en seres humanos. Los defectos en la inmunidad de linfocitos T que conducen a persistencia de virus prolongada incluyendo tanto un deficit en linfocitos T auxiliares CD4

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espedficos de HCV como actividad de linfocitos T efectores CD8 defectuosos o alterados. Los chimpances persistentemente infectados se tratan con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos, compuestos, de la invencion. Se determino la eficacia del bloqueo de las rutas inhibidoras, combinada con la vacunacion usando protemas HCV recombinantes estructurales y no estructurales, y si dichas estrategias pueden potenciar la frecuencia y longevidad de linfocitos T de memoria espedficos de virus. El defecto en la inmunidad de linfocitos T es exclusivamente espedfico de HCV en seres humanos y chimpances persistentemente infectados. La actividad antiviral puede despues restablecerse suministrando a los chimpances anticuerpos monoclonales humanizados que bloquean la senalizacion a traves de estas moleculas.

Los chimpances persistentemente infectados se trataron con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-LI y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos, compuestos de la invencion. Despues del tratamiento con los anticuerpos, se determinaron las respuestas inmunitarias humoral y celular, asi como la carga de ARN del ACV. Se recogieron muestras las semanas 1, 2, 3, 5 y 8, y despues a intervalos mensuales. Las muestras incluyen: 1) suero para analisis de transaminasas, autoanticuerpos, anticuerpos neutralizantes contra HCV, y respuestas de citocina, 2) plasma para carga viral y evolucion del genoma, 3) PBMC para medidas in vitro de inmunidad, expresion y funcion del receptor coestimulador/inhibidor, 4) higado reciente (no fijado) para aislamiento de linfocitos intrahepaticos y ARN, y 5) higado fijado (incluido en formalina/parafina) para analisis histologicos e inmunohistoquimicos. Tambien se recogeran ganglios linfaticos regionales en 2 o 3 momentos para evaluar la expresion de moleculas co-inhibidoras y variantes de corte y empalme mediante tecnicas de immunohistoquimica y molecular.

Para determinar si una vacunacion con antigenos HCV potencia el efecto terapeutico de los anticuerpos, los chimpances se trataron de la siguiente manera: 1) inmunizacion intramuscular con glucoproteinas de envoltura recombinante E1 y E2 (en adyuvante MF59) y otras proteinas (nucleo mas NS 3, 4, y 5 formuladas con ISCOMS) las semanas 0, 4 y 24; 2) inmunizacion intramuscular con la vacuna usada en, aunque co-administrada con los anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos, compuestos de los anticuerpos de la invencion. Las respuestas de linfocitos B y T espedficas de HCV se monitorizaron a intervalos mensuales despues de la inmunizacion durante un periodo de un ano.

Los marcadores examinados en linfocitos T totales y positivos al tetramero HCV en este analisis incluian marcadores de diferenciacion (por ejemplo, CD45RA/RO, CD62L, CCR7 y CD27), activacion (por ejemplo, CD25, CD69, CD38 y HLA-DR), supervivencia/proliferacion (por ejemplo, bcl-2 y Ki67), potencial citotoxico (por ejemplo, granzimas y perforina) y receptores de citocina (CD122 y CD127). Existe una interesante correlacion entre niveles pre-terapia de la quimiocina IP-10 y respuesta contra PEG IFN-gamma/rivabirina. Se midieron los niveles de IP-10 para investigar una posible correlacion entre rutas reguladoras negativas o respuestas de linfocitos T espedficas de HCV y niveles de IP-10. La expresion en receptores y ligandos en PBMC se realizo mediante citometria de flujo.

Ejemplo 9: Potenciacion de inmunidad especifica de SIV in vivo mediante bloqueo de PD-1

El potencial de restablecimiento inmunitario del bloqueo de PD-1 durante la infeccion por virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV) cronica se ensayo en macacos. Se estudiaron catorce macacos rhesus de la India (Macaca mulatta) infectados con SIV. Se usaron ocho macacos para la fase temprana cronica y se infectaron por via intravenosa con una dosis infecciosa de cultivo tisular al 50 % de 200 (DICT50) de SIV251. Se usaron seis macacos para la fase cronica tardia, tres se infectaron con SIV 251 por via intrarrectal y tres se infectaron con SIV239 por via intravenosa. Todos los macacos, excepto RDb11, fueron negativos para los alelos Mamu B08 y Mamu B17. RDb11 fue positivo para el alelo Mamu B17.

Tratamiento con anticuerpos in vivo: los macacos se infusionaron con el anticuerpo anti PD-1 humano de raton parcialmente humanizado (clon EH12-1540) (Dorfman et al., Am. J. Surg. Pathol. 30:802-810, 2006) o un anticuerpo de control (SYNAGIS). El anticuerpo anti PD-1 tiene un dominio de cadena pesada variable de raton ligado a IgG 1 humana (mutado para reducir la union del FcR y complemento) y un dominio de cadena variable de raton ligado a k humana. El clon EH12 se une a PD-1 de macaco y bloquea interacciones entre PD-1 y sus ligandos in vitro. SYNAGIS es un anticuerpo monoclonal de raton humanizado (IgG1K) espedfico contra la proteina F del virus respiratorio sincitial. Se administraron anticuerpos por via intravenosa a 3 mg kg-1 de peso corporal los dias 0, 3, 7 y 10.

Respuestas inmunitarias: se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica de sangre y linfocitos de biopsias de funcion rectal como se ha descrito anteriormente (Velu et al., J. Virol. 81:5819-5828, 2007). La tincion de tetrameros, production de citocina intracelular y mediciones de anticuerpo de union a la Env anti-SIV se realizaron como se ha descrito anteriormente (Amara et al, Science 292:69-74, 2001; Kannanganat et al., J. Virol. 81:84688476, 2007; Lai et al., Virology 369:153-167, 2007).

El bloqueo de PD-1 se realizo durante la fase temprana (10 semanas) asi como la tardia (aproximadamente 90 semanas) de infeccion SIV cronica. Nueve macacos (cinco durante la fase temprana y cuatro durante la fase tardia) recibieron el anticuerpo anti-PD-1 y cinco macacos (tres durante la fase temprana y dos durante la fase tardia) recibieron un anticuerpo de control isotipo (SYNAGIS, espedfico contra el virus respiratorio sincitial (RSV)).

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El bloqueo de PD-1 durante infeccion SIV cronica produjo una expansion rapida de linfocitos T CD8 espedficos de SIV en la sangre de todos los macacos. Las respuestas de linfocitos T CD8 contra dos epitopos inmunodominantes, Gag CM9 (Allen et al., J. Immunol. 160:6062-6071, 1998) y Tat SL8/TL8 (Allen et al., Nature 407:386-390, 2000), se estudiaron usando complejos tetramericos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I en siete de los macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 y tres de los macacos tratados con anticuerpo de control que expresaban la molecula de histocompatibilidad Mamu A*01. La mayoria de los linfocitos T CD8 espedficos de tetramero Gag-CM9 (>98 %) expresaron PD-1 antes del bloqueo. Despues del bloqueo de PD-1, los linfocitos T CD8 espedficos de tetramero Gag-CM9 se expandieron rapidamente y alcanzaron un pico al cabo de 7-21 dias. En la respuesta pico, estos niveles fueron de aproximadamente 2,5 a 11 veces mayores que sus niveles respectivos el dia 0 (P = 0,007) y permanecieron elevados hasta los dias 28-45. Se observaron resultados similares con bloqueo durante las fases temprana, asi como tardia de infeccion por SIV cronica. Tambien se observo un aumento de 3-4 veces en la frecuencia de linfocitos T CD8 positivos a interferon (IFN)-y espedficos de Gag el dia 14 despues del bloqueo en dos animales negativos a Mamu A*01 (RTd11 y RDb11), demostrando que el bloqueo de PD-1 puede potenciar la frecuencia de linfocitos T CD8 espedficos de virus que estan restringidos por alelos no Mamu A*01. La expansion de linfocitos T CD8 espedficos de SIV no se observo en macacos tratados con anticuerpo de control.

El bloqueo de PD-1 tambien se asocio con un aumento significativo en la frecuencia de linfocitos T CD8 espedficos de virus que se sometieron a division celular activa in vivo con calidad funcional mejorada. Coherente con la rapida expansion de linfocitos T CD8 espedficos de SIV, la frecuencia de los linfocitos CD8 espedficos de tetramero Gag- CM9 que coexpresaban Ki67 (marcador para celulas proliferativas) tambien aumento tan pronto como el dia 7 despues del bloqueo (P= 0,01). De manera similar, se observo un aumento en las frecuencias de linfocitos T CD8 espedficos de tetramero Gag-CM9 que coexpresan perforina y granzima B (potencial citolitico; P= 0,001 y P= 0,03, respectivamente), CD28 (potencial de coestimulacion; P= 0,001), CD127 (potencial proliferativo; P = 0,0003) y CCR7 (potencial buscador de ganglios linfaticos; 0,001). Se observo un aumento transitorio de 1,5 a 2 veces en la frecuencia de linfocitos T CD8 negativos a tetramero y positivos a Ki67 despues del bloqueo. Esto podia deberse a la expansion de linfocitos T CD8 espedficos contra otros epitopos en Gag, asi como contra otras proteinas de SIV y otras infecciones viricas cronicas en estos animales. No se observo potenciacion significativa para estos marcadores en los tres macacos tratados con anticuerpo de control.

No se observo expansion para los linfocitos T CD8 espedficos de Tat-TL8 despues del bloqueo. Esto podia deberse al escape viral del reconocimiento por linfocitos T CD8 espedficos de Tat-TL8, ya que se sabe que el bloqueo de PD-1 produce expansion de linfocitos T solo cuando reciben simultaneamente senales a traves del receptor de linfocitos T. Para ensayar esta posibilidad, los genomas virales presentes en el plasma justo antes del inicio del bloqueo de los tres macacos positivos a Mamu A*01 que se infectaron con SIV 251 y recibieron el anticuerpo bloqueante durante la fase de infeccion temprana se secuenciaron. De hecho, se encontraron mutaciones en el genoma viral correspondiente a la region del epitopo Tat TL8. Todas estas mutaciones se habia observado o predicho que redudan la union del peptido Tat SL8/TL8 a la molecula MHC Mamu A*01 y producen un escape del reconocimiento por los linfocitos T CD8 espedficos de Tat-SL8/TL8. Estos resultados sugieren que el bloqueo in vivo de PD-1 puede no dar como resultado la expansion de linfocitos T que son espedficos para mutantes de escape de epitopos virales.

El bloqueo de PD-1 tambien da como resultado la expansion de linfocitos T CD8 espedficos de Gag-CM9 en el tejido mucoso colorrectal (intestino), un sitio preferencial de replicacion del SIV/HIV. No se observo expansion en dos de los siete macacos, aunque la expansion fue obvia para uno de ellos en sangre. A diferencia de la sangre, el intestino aumento mucho mas tarde el dia 42 y vario de 2 a 3 veces en comparacion con sus niveles en el dia 0 respectivo (P= 0,003). Similar a la sangre, las celulas espedficas de tetramero Gag-CM9 que coexpresaban Ki67 (P = 0,01), perforina (P = 0,03), granzima B (P = 0,01) y CD28 (P = 0,01) tambien aumentaron en el intestino despues del bloqueo.

Lo que es mas importante, el bloqueo de PD-1 tambien potencio la calidad funcional de los linfocitos T CD8 antivirales y dio como resultado la generacion de celulas polifuncionales capaces de producir conjuntamente las citocinas IFN-y, factor de necrosis tumoral (TNF)-a e interleucina (IL-2). El dia del inicio del bloqueo de PD-1 durante la fase cronica tardia de infeccion, la frecuencia de celulas positivas a IFN-y espedficas de Gag tambien fue baja y no consiguieron coexpresar TNF-a e IL-2. Sin embargo, despues del bloqueo, la frecuencia de celulas positivas a IFN-y aumento en los cuatro macacos tratados con anticuerpo PD-1 (P= 0,03) y adquirieron la capacidad de coexpresar TNF-a e IL-2. La expansion de celulas positivas a IFN-y aumento a los 14-21 dias y los niveles maximos fueron de 2-10 veces mayores que los niveles de dia 0 respectivos. El dia 21, aproximadamente el 16 % de las celulas espedficas de Gag totales coexpresaron las 3 citocinas, y aproximadamente el 30 % coexpreso IFN-y y TNF-a. Esto difiere de <1 % de las celulas espedficas de Gag totales que coexpresan las tres citocinas (P= 0,01) y aproximadamente 14 % que coexpresan IFN-y y TNF-a el dia 0 (P= 0,04). Tambien se observaron resultados similares despues del bloqueo durante la fase de infeccion cronica temprana.

Para ensayar la funcion de PD-1 en la regulacion de la funcion de linfocitos B durante infecciones por el virus de la inmunodeficiencia cronica, se caracterizaron las respuestas de linfocitos B despues del bloqueo de PD-1 en macacos infectados por SIV. Analisis de expresion de PD-1 en subconjuntos de linfocitos B diferentes antes del bloqueo con PD-1 revelaron expresion preferencial de PD-1 por linfocitos B de memoria (CD20+CD27+CD21-) en

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comparacion con linfocitos B sin tratar (CD20+CD27-CD21+; P < 0,001). El bloqueo in vivo de PD-1 produjo un aumento de 2 a 8 veces en el titulo de anticuerpos de union espedficos a SIV el dia 28 despues del bloqueo (P < 0,001). Para entender esto adicionalmente, se realizaron experimentos contra la proliferacion de linfocitos B de memoria en macacos infectados por SIV que se trataron simultaneamente con anticuerpo anti-PD-1 y terapia antirretroviral y ser observo un aumento significativo en la memoria Ki67+ (proliferacion), pero no linfocitos B sin tratar tan pronto como el dia 3. Estos resultados demuestran que la ruta PD-1-PDL podria tener una funcion en la regulacion de la alteracion de linfocitos B durante infeccion del SIV cronica.

Los ensayos de neutralizacion revelaron un aumento de dos veces en titulos contra el SIV 251 adaptado al laboratorio facilmente neutralizable y ningun aumento en los titulos contra el SIV 251 o SIV 239 de tipo silvestre dificil de neutralizar. En dos de los nueve animales tratados con anticuerpo anti-PD-1, solo una expansion minima (<2 veces) de anticuerpo especifico de SIV despues del bloqueo. Notablemente, la frecuencia de linfocitos B de memoria totales en estos dos animales fue inferior (-40 % de linfocitos B totales) en comparacion con los siete animales restantes (60-90 % de linfocitos B totales) antes del bloqueo, indicando que el nivel de linfocitos B de memoria espedficos de SIV antes del bloqueo puede determinar el nivel de expansion de anticuerpos espedficos de SIV despues del bloqueo.

El bloqueo de PD-1 produce reducciones significativas en viremia en plasma (P= 0,03) y tambien prolonga la supervivencia de los macacos infectados por SW (P= 0,001). En dos de los cinco macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 durante la fase cronica temprana, la carga viral disminuyo el dia 10 y persistio a o por debajo de este nivel hasta el dia 90. En un macaco la carga viral disminuyo transitoriamente y en los otros dos macacos aumento transitoriamente y volvio a niveles previos al bloqueo. A diferencia de la fase cronica temprana, los cuatro macacos tratados con el anticuerpo anti-PD-1 durante la fase cronica tardia mostraron un aumento transitorio en la viremia el dia 7, pero rapidamente redujo la carga del virus el dia 21 a niveles que estaban por debajo de sus niveles respectivos el dia 0. Sin embargo, los niveles de ARN virales volvieron a niveles previos al bloqueo el dia 43. Como se esperaba, no se observaron reducciones significativas en las cargas virales del plasma en ninguno de los 5 macacos tratados con el anticuerpo de control. A los 21-28 dias despues del bloqueo, los niveles de ARN virales en los animales tratados con anticuerpo anti-PD-1 eran de 2-10 veces menores que sus niveles el dia 0 respectivos (P= 0,03). El dia 150 despues del bloqueo, 4 de los 5 macacos en el grupo de control murieron debido a sintomas relacionados con SIDA (por ejemplo, perdida de apetito, diarrea, perdida de peso), mientras que los 9 animales en el grupo tratado con anticuerpo anti-PD-1 sobrevivieron (P= 0,001).

El aumento inicial observado en los niveles de viremia en plasma en todos los animales tratados en fase tardia y algunos de la fase temprana podia deberse a un aumento en la frecuencia de linfocitos T CD4 activados. Para determinar esto, se midio el porcentaje de linfocitos T CD4 totales positivos a Ki67, asi como la frecuencia de linfocitos T CD4 productores de IFN-y espedficos de Gag del SIV (dianas preferenciales para la replicacion del virus) despues del bloqueo. Estos analisis revelaron un aumento transitorio en el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos a Ki67 los dias 7-14 despues del bloqueo (P= 0,002) y este aumento fue mayor en animales tratados durante la fase tardia que en la fase de infeccion temprana (P= 0,015). De manera similar tambien se observo un aumento en la frecuencia de linfocitos T CD4 espedficos de Gag, pero solo en los animales tratados durante la fase de infeccion tardia. No se observaron aumentos significativos para estos linfocitos T CD4 activados en los macacos tratados con anticuerpo control. Estos resultados sugieren que los linfocitos T CD4 activados podrian haber contribuido al aumento inicial observado en los niveles de viremia en plasma despues del bloqueo.

Despues del inicio del bloqueo de PD-1, el punto de referencia de la carga viral en plasma y linfocitos T CD4 totales en sangre e intestino era similar entre los grupos tratados con anticuerpo de control y tratados con anticuerpo anti- PD-1. Sin embargo, las frecuencias de celulas CM9+ Gag y celulas CM9+ Gag que coexpresaban perforina, granzima B o CD28 no eran similares entre los dos grupos de tratamiento antes del bloqueo in vivo. Esto aumenta la posibilidad de que estas diferencias puedan haber contribuido a la expansion de celulas CM9+ Gag despues del bloqueo de PD-1. Para estudiar la influencia de la frecuencia de celulas CM9+ Gag antes del bloqueo sobre su expansion despues del bloqueo, el grupo tratado con anticuerpos anti-PD-1 se dividio en dos subgrupos en funcion de la frecuencia de celulas CM9+ Gag antes del inicio del bloqueo de tal manera que un grupo tenia niveles similares y el otro grupo tenia niveles mas altos de celulas CM9+ Gag en comparacion con el grupo tratado con anticuerpo de control. Estos subgrupos se analizaron despues con respecto a la expansion de celulas CM9+ Gag despues del bloqueo. La expansion de celulas CM9+ Gag fue evidente en ambos subgrupos de animales despues del bloqueo de PD-1, independientemente de si tenian niveles bajos o altos antes del bloqueo. Tambien se observaron resultados similares con analisis del subgrupo basandose en la frecuencia de celulas CM9+ Gag que coexpresaban moleculas asociadas con una mejor funcion de linfocitos T tales como perforina, granzima B, CCR7, CD127 o CD28. Sin embargo, se observo una tendencia hacia una mejor expansion de linfocitos CM9+ CD28+ Gag en animales con niveles mas altos de celulas CM9+ CD28+ Gag antes del bloqueo, lo que sugeria que la expresion de CD28 puede servir como un biomarcador para predecir el resultado del bloqueo de PD-1 in vivo.

Los experimentos descritos anteriormente demuestran que el bloqueo de PD-1 usando un anticuerpo contra PD-1 produce una rapida expansion de linfocitos T CD8 espedficos de virus con calidad funcional mejorada. Esta inmunidad de linfocitos T potenciada se observo en la sangre y tambien en el intestino, un deposito principal de infeccion SIV. El bloqueo de PD-1 tambien produjo la proliferacion de linfocitos B de memoria y aumentos en el

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anticuerpo espedfico de envoltura SIV. Estas respuestas inmunitarias mejoradas se asociaron con reducciones significativas en la carga viral plasmatica y tambien prolongaron la supervivencia de macacos infectados por SIV. El bloqueo fue eficaz durante la fase temprana (semana 10) asi como la fase tardia (aproximadamente semana 90) de infeccion cronica incluso en condiciones de linfopenia grave. Estos resultados demuestran potenciacion de las respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales durante una infeccion por el virus de la inmunodeficiencia patogenico bloqueando una sola ruta inhibidora e identifican una nueva estrategia terapeutica para el control de infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana.

Ejemplo 10: proliferation potenciada de linfocitos T CD8 especificos de SIV despues del bloqueo in vitro de la ruta PD-1: PDL por un anticuerpo PD-1 humanizado y un anticuerpo PD-L1 humanizado.

El efecto de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado procedente de EH-12.2H7 y un anticuerpo anti-PD-L1 humanizado procedente de 29E.2A3 sobre la capacidad proliferativa de linfocitos T CD8 especificos de Gag del SIV se ensayo in vitro. El anticuerpo anti-PD-1 humanizado tiene la secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 28, y la secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32. El anticuerpo anti-PD-L1 humanizado tiene la secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 y la secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42. La region constante de cadena pesada de los anticuerpos humanizados es de IgG4 humana con mutation de Ser 228 a Pro (de CPSCP a CPPCP) de tal manera que el anticuerpo forma dimeros, y la region constante de cadena ligera es la region constante de cadena ligera kappa humana. La numeration de aminoacidos para Ser 228 es de acuerdo con el sistema de numeracion EU. Vease Aalberse et al., Immunology 105:9-19, 2002. Las PBMC obtenidas de macacos infectados por SIV (entre 3 meses a 1,5 anos despues de infeccion) se tineron con ester de carboxifluorescein diacetato succinimidilo (CFSE) y se estimularon con un conjunto de peptidos Gag SIV o medio de cultivo durante 6 dias en presencia o en ausencia de un anticuerpo bloqueante. Al final de la estimulacion, las celulas se tineron para CD3 y CD8 de superficie y Ki-67 intracelular. Despues las celulas se adquirieron en un Calibur FACS y se analizaron usando un programa informatico FlowJo. Los linfocitos se identificaron basandose en la dispersion, despues se analizaron linfocitos T CD8 (CD3+, CD8+) para la cotincion por Ki-67 y CFSE. Las celulas con niveles bajos de CFSE, Ki-67+, se identificaron como celulas proliferativas.

Como se muestra en la Figura 14A, el bloqueo in vitro de la ruta ligando PD-1: PD-1 usando los Ab anti-PD-1 produce un aumento significativo en la proliferacion de respuestas de linfocitos T CD8 especificas de SIV. El bloqueo in vitro usando el Ab anti-PD-L1 produce un aumento moderado en la proliferacion de respuestas de linfocitos T CD8 especificos de SIV (Figura 14B).

Ejemplo 11: Restauracion de proliferacion de linfocitos T especificos de HCV mediante celulas mononucleares intrahepaticas de un chimpance persistentemente infectado.

Se aislaron linfocitos intrahepaticos marcados con CFSE (2x106) del chimpance 1564 que se habia infectado cronicamente con la cepa H77 de genotipo 1a del HCV durante mas de 10 anos. Los linfocitos intrahepaticos se co- cultivaron durante 6 dias con 4x106 PBMC con CD8 agotado, autologas irradiadas que no se manipularon o se impulsaron con peptidos solapantes que abarcan toda la poliproteina del HCV (cepa H77 de genotipo 1a). Las celulas se cultivaron en medio RPMI complementado con L-glutamina y FCS al 10 %, con y sin un anticuerpo bloqueante anti-PD-L1 (10 |jg/ml, anadido el dia 0 y dia 2). El anticuerpo anti-PD-L1 humanizado tiene la secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 y la secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42. La region constante de cadena pesada de los anticuerpos humanizados es de IgG4 humana con mutacion de Ser 2228 a Pro (de CPSCP a CPPCP) de manera que el anticuerpo forma dimeros y la region constante de cadena ligera es la region constante de cadena ligera kappa humana. La numeracion de aminoacidos para Ser 228 es de acuerdo con el sistema de enumeration EU. Vease Aalberse et al., Immunology 105:9-19, 2002. El dia 6, las celulas se tineron con CD8-PerCP, tetramero A0701/P7(758)-PE, PD-1-Alexa 647, CD4-Alexa 700, CD14-Alexa 700, CD16-Alexa 700, CD19-Alexa 700 y colorante azul Live/Dead. Las muestras se adquirieron en un clitometro de flujo BD LSR II y los datos se analizaron usando un el programa informatico FlowJo.

Como se muestra en la Figura 15, el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-L1 reestablecio la proliferacion de linfocitos T especificos de IICV mediante celulas mononucleares intrahepaticas de un chimpance persistentemente infectado.

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REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) una secuencia de region variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 34-38; y

b) una secuencia de region variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3942,

en donde el anticuerpo aislado, o un fragmento de union a antigeno del mismo, se une a una proteina PD-L1 que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo aislado, o el fragmento de union a antigeno del mismo, esta humanizado o es compuesto.
2. El anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo aislado comprende:

a) una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende las SEQ ID NO: 35 o 37; y

b) una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NO: 39, 40 o 42.
3. El anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno del mismo inhiben la union del anticuerpo 29E2A3 a Fc-PD- L1, en donde el anticuerpo 29E2A3 comprende una secuencia de region variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 78, y una secuencia de region variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 79.
4. El anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno del mismo inhiben una senal mediada por PD-L1.
5. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Un vector que comprende el acido nucleico aislado de la reivindicacion 5.
7. Una celula hospedadora que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8. La celula hospedadora de la reivindicacion 7 que produce el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno codificado por el acido nucleico.
9. Un animal no humano transgenico que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
10. Una composicion farmaceutica, que comprende el anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
11. Un metodo de reactivacion de linfocitos T agotados, que comprende:

poner en contacto una poblacion de celulas en la que al menos algunas celulas expresan PD-L1, con una cantidad eficaz de una composicion que comprende un anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la etapa de la puesta en contacto se realiza in vitro o ex vivo.
12. Un anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso en:

(1) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion persistente; o

(2) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion viral, en donde la infeccion viral se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes, virus de la inmunodeficiencia humana, virus linfotropico T humano, virus de la coriomeningitis linfocitica, virus respiratorio sincitial y/o rinovirus; o

(3) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion bacteriana, en donde la infeccion bacteriana se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en Helicobacter, Mycobacterium, Porphyromonas y Chlamydia; o

(4) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion helmintica, en donde el helminto se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en Schistosoma y Taenia; o

(5) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece una infeccion protozoaria, en donde la infeccion protozoaria se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en Leishmania mexicana y Plasmodium; o

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(6) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece cancer, en donde el cancer se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en un tumor solido, un cancer hematologico, cancer de vejiga, cancer de cerebro, cancer de mama, cancer de colon, cancer gastrico, glioma, cancer de cabeza, leucemia, cancer de higado, cancer de pulmon, linfoma, mieloma, cancer de cuello, cancer de ovario, melanoma, cancer pancreatico, cancer renal, cancer salival, cancer de estomago, cancer del epitelio timico y cancer tiroideo; o

(7) un metodo de tratamiento de un sujeto que padece un cancer que sobreexpresa PD-L1.
13. El anticuerpo para su uso de la reivindicacion 12, parte (7), que induce citotoxicidad mediada por anticuerpos.
14. El anticuerpo para su uso de la reivindicacion 13, que esta modificado para aumentar la citotoxicidad inducida por anticuerpo.
15. El anticuerpo para su uso de la reivindicacion 14, que esta conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste en una toxina y un agente formador de imagenes.
16. Un metodo de produccion del anticuerpo o del fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende cultivar una celula que produce el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno y recuperar del cultivo celular el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno.