ES2347566T3

ES2347566T3 - Inmunomodulador que comprende celulas enteras de bacterias tsukamurella.

Info

Publication number: ES2347566T3
Application number: ES04798504T
Authority: ES
Inventors: Graham Mcintyre; John Lawson Stanford; Cynthia Ann Stanford; Oscar Adelmo Bottasso
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2010-11-02
Anticipated expiration: 2024-11-12
Also published as: GB2422544A; US7413728B2; AR046583A1; JP2007511493A; DE602004028038D1; EP1684803B1; GB2422544B; JP4875494B2; ATE473014T1; GB0607956D0; US20070104735A1; EP1684803A2; WO2005049056A3; WO2005049056A2

Abstract

Uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género T. sukamurella en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere inmunomoduladores, en particular vacunas que modulan una respuesta inmune celular y sus usos. La presente invención se refiere al uso de inmunomoduladores en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y / o prevención de una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune, incluyendo ciertos trastornos vasculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El sistema inmune es un retículo de células y componentes celulares (moléculas) complicados que normalmente trabajan para defender el cuerpo y eliminar las infecciones provocadas por bacterias, virus, y otros cuerpos invasores extraños. Si una persona tiene una enfermedad autoinmune, el sistema inmune se ataca a sí mismo por error, dirigiendo a las células, tejidos y órganos del propio cuerpo de la persona. Una colección de células y moléculas del sistema inmune en un sitio diana se denomina inflamación.

Existen muchas enfermedades autoinmunes diferentes, y cada una de ellas puede afectar al cuerpo de diferentes maneras. Muchas de las enfermedades autoinmunes son raras. Como un grupo, sin embargo, las enfermedades autoinmunes afectan a millones de personas.

Algunas enfermedades autoinmunes se sabe que comienzan o empeoran con ciertos desencadenantes tales como infecciones virales, parásitas y bacterianas crónicas. Otras influencias menos entendidas afectan al sistema inmune y el curso de las enfermedades autoinmunes incluyen envejecimiento, estrés crónico, hormonas y embarazo.

Las enfermedades autoinmunes son a menudo crónicas, requiriendo cuidado y control a lo largo de la vida, incluso cuando la persona parece que esté bien o se siente bien. Actualmente, pocas enfermedades autoinmunes se pueden curar o hacer que vayan en remisión con tratamiento.

La mayoría de los médicos a menudo ayudan a los pacientes a tratar las consecuencias de la inflamación provocada por la enfermedad autoinmune. En algunas personas, un número limitado de medicaciones inmunosupresoras pueden dar como resultado la remisión de la enfermedad. Sin embargo, incluso si su enfermedad va en remisión, pacientes son raramente capaces de modificar su medicación. Los efectos secundarios a largo plazo de la medicación inmuno -supresora pueden ser sustanciales.

El inicio y progresión del daño vascular es un proceso complejo, multi-factorial, pero existe una evidencia creciente de que las respuestas inflamatorias juegan un papel clave. El daño vascular está implicado en el desarrollo de la aterosclerosis, y en los procesos trombóticos que conducen a síndromes isquémicos agudos tales como infarto de miocardio, apoplejía y oclusión arterial periférica.

Los mecanismos inmunes pueden ser importantes en el desarrollo y mantenimiento de aterosclerosis e hiperplasia de la miointima (MIH).

La hiperplasia de la mioíntima (MIH) se puede considerar como una respuesta de curación exagerada a daño tal como angioplastia con globo. Una cascada de episodios da como resultado: pérdida de la membrana basal, migración de células de músculo liso vascular

(VSMC) desde el medio en la íntima, la proliferación VSMC y cambio fenotípico a un tipo de célula fibroblástica más secretora y producción aumentada de matriz extracelular, que eventualmente conduce a estenosis u oclusión del vaso. Se produce después de injerto de derivación y angioplastia con globo y afecta aproximadamente al 30% de tales casos en la práctica clínica. Es la causa principal de fallo de tales procedimientos y tratamiento de los vasos / injertos con estenosis y bloqueados resultantes es problemático. Los mecanismos de células subyacentes que conducen a MIH no son bien entendidos y hasta la fecha no se ha desarrollado ninguna terapia que pueda prevenirla de manera eficaz. La pertinencia relevancia clínica de la patente actual tiene que ver con el gran número de angioplastias de arterias coronarias que se realizan anualmente en el Reino Unido y en el mundo. Aunque se están produciendo actualmente dilatadores vasculares permanentes que eluyen el fármaco los resultados es poco probable que eviten la reestenosis completamente. Cualquier terapia complementaria segura, relativamente económica, tal como la inmunoterapia propuesta en esta patente, tendría un impacto clínico importante.

Los mecanismos implicados en la inmunoterapia contra la reestenosis son complejos y no completamente aclarados. El daño endotelial provocado por la angioplastia se pueden exacerbar por la respuesta inmune del huésped a las hsp. Las hsp son proteínas producidas por células estresadas que han estado implicadas en en la patogénesis y en la patofisiología de diversos trastornos inmunológicos incluyendo aterosclerosis (Xu Q et al. Arterioscler Thromb 1992; 12: 789 -799). Es probable que estén presentes en las células endoteliales y de músculo liso en la región de una angioplastia. En efecto la hsp actúa como un autoantígeno que después puede ser atacado por el sistema inmune. Esta situación se puede inducir de manera experimental mediante la inmunización con una hsp micobacteriana de reacción cruzada (hsp65) que conduce a una lesión endotelial en conejos y ratones (Xu Q, et al. Arterioscler Thromb 1992; 12: 789 -799 y George J, et al. Circ. Res. 2000; 86: 1203 -1210). El efecto parece que sea dependiente de IL-4 secretada por los linfocitos Th2, y está probablemente mediada por anticuerpo George J, et al. Circ. Res. 2000; 86: 1203 -1210 y Schett G, et al. J. Clin. Invest. 1995; 96: 2569 -2577). La relevancia de estas observaciones para el hombre se sugiere por la capacidad del anticuerpo humano purificado por afinidad eluido de columnas de hsp65 para dañar las células endoteliales humanas estresadas in vitro. Este hallazgo sugiere que el anticuerpo reacciona de manera cruzada con la hsp60 que es la homóloga humana de hsp65, y puede ser accesible al anticuerpo cuando se expresa en las membranas de células endoteliales estresadas. Se ha sugerido que tales anticuerpos que se unen a células endoteliales estresadas pueden ser un factor en la producción dearteriopatía coronaria después de trasplante de corazón (Crisp SJ et al. J Heart Lung Transplant 1994; 81 91). Mukherjee et al (Thromb Haemost 1996; 75: 258 -60) no mostró ninguna asociación entre los niveles de anticuerpo preoperativos a hsp65 y la reestenosis coronaria, pero mostraron que esos pacientes en los que los niveles de tales anticuerpos cayeron después de la angioplastia eran menos probable que padecieran reestenosis. De hecho el papel de los anticuerpos a hsp puede ser complejo, debido a que los pacientes con enfermedad vascular no tienen solamente niveles de anticuerpos aumentados, sino también de las propias hsp (Wright BH, et al Heart Vessels 2000; 15: 18 -22). De este modo una caída evidente de los niveles de anticuerpos puede meramente reflejar un incremento en los niveles de la proteína. Además las hsp tienen efectos reguladores, y unirse a las células de músculo liso arteriales, que conducen a un aumento en la supervivencia sin un requerimiento para la internalización (Johnson AD et al. Atherosclerosis 1990; 84: 111 -119).

El documento WO 03/049752 describe composiciones que comprenden componentes preparados a partir de bacterias gram positivas para la prevención y / o el tratamiento de trastornos que comprenden una desregulación inmune tal como cáncer, enfermedades autoinmunes, alergia y tuberculosis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente que una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella administrada a un sujeto de ensayo puede inducir una modificación del sistema inmune, en particular el sistema inmune celular de ese sujeto de ensayo, que efectúa un efecto preventivo y / o terapéutico sobre enfermedades autoinmunes o trastornos autoinmunes, particularmente los que implican la inflamación de la íntima de vasos sanguíneos por ejemplo.

Una ventaja del uso de composiciones que comprenden una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella para tratar y / o prevenir de manera eficaz las enfermedades autoinmunes y trastornos autoinmunes, particularmente los que implican inflamación de la íntima de vasos sanguíneos por ejemplo, puede ser que ese tratamiento y / o prevención se efectúa mientras que produce menos efectos secundarios a largo plazo que las quimioterapias,

es decir, la medicación inmunosupresora, usada ahora de manera rutinaria.

La frase "sistema inmune celular", como se usa en el presente documento, incluye una respuesta inmune mediada por células que depende de la presencia de linfocitos T. El término "linfocitos T" incluye linfocitos T citotóxicos, células T auxiliares, células T supresoras y células T reguladoras. La modificación de una respuesta inmune mediada por células se puede usar, por ejemplo, para vencer los trastornos inmunes mediados por células que incluyen, por ejemplo enfermedades autoinmunes o trastornos.

Los términos "modular", "modificar", "modificación" y otros derivados de los mismos, como se usan en el presente documento, significan regulación por disminución, inhibición, inducción, estimulación, regulación por incremento, alteración o que de otra manera afecta a un componente o componentes del sistema inmune celular.

ASPECTOS DETALLADOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención además proporciona el uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune es del tipo donde los sujetos poseen daños en el sistema inmune de uno o más de los tejidos sujeto. De manera adecuada, la respuesta autoinmune se puede accionar mediante algo en el sujeto o algo en el ambiente del sujeto.

De manera adecuada la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser uno que sigue a la causa de inicio. Por ejemplo, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser una que está provocada por infección y / o alguna otra causa de inicio. Las causas de inicio potenciales pueden ser a modo de ejemplo, edad avanzada, infección (por ejemplo infección parásita), tratamiento con esteroides, vacunación repetida con alumbre, embarazo y / o cánceres.

La presente invención además proporciona el uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune, donde la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune implica inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede, además implicar la inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo, implicar la inflamación de la capa muscular de un vaso sanguíneo o del miocardio.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser una que está precedida o provocada por un trastorno vascular.

La enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser una o más de las siguientes: artritis, de manera particular artritis reumatoide, psoriasis, artropatía psoriática, escleroderma, tiroiditis, hiperplasia de la íntima después de transplante, rechazo de injerto y trastornos vasculares.

De manera adecuada, los trastornos vasculares de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier enfermedad o trastorno vascular que comprende un elemento autoinmune, por ejemplo uno que está provocado por una respuesta autoinmune.

De manera adecuada, trastornos vasculares de acuerdo con la presente invención pueden incluir uno o más de enfermedad y fenómeno de Raynaud, uveitis anterior, trastorno vascular obliterante, formación de ateroma (también conocido como arteriosclerosis), arteritis, hiperplasia de la mioíntima (natural o después de angioplastia), engrosamiento, inflamatorio y autoinmune de la íntima y / o capa muscular de los vasos sanguíneos, lesiones inflamatorias de los vasos sanguíneos, enfermedad cardíaca aterosclerótica, lesión de reperfusión, alteraciones de conducción cardíaca, miocarditis, infarto de miocardio.

De manera adecuada, el rechazo de acuerdo con la presente invención puede ser rechazo de injerto crónico, de manera particular en la ausencia de un inmunosupresor. De este modo, la composición de acuerdo con la presente invención se puede usar como un reemplazo del inmunosupresor convencional administrado antes de, durante y / o después de transplante. Las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden usar cuando se transplantan células, tejidos y órganos naturales o artificiales, tales como uno o más de los siguientes: córneas, médula ósea, órganos (por ejemplo, riñón, hígado), cristalinos, marcapasos, tejido cutáneo natural o artificial, células de islotes.

La presente invención además proporciona el uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno vascular.

La presente invención además proporciona el uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de artritis, de manera particular artritis reumatoide.

La presente invención además proporciona el uso de una composición de

inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de rechazo de injerto.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona el uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento

o prevención de psoriasis. El término "inmunomodulador", como se usa en el presente documento, significa una sustancia que modula un sistema inmune celular de un sujeto.

El término "célula entera", como se usa en el presente documento, significa una bacteria que está intacta, o sustancialmente intacta. En particular, el término "intacta" como se usa en el presente documento significa una bacteria que comprende todos los componentes presentes en una célula entera, de manera particular una célula entera, viable, y / o una bacteria que no se ha tratado de manera específica para eliminar uno o más componentes de ella. Por el término "sustancialmente intacta" como se usa en el presente documento significa que aunque todo el proceso de aislamiento y / o purificación usado en la obtención de la bacteria puede dar como resultado, por ejemplo, una modificación ligera para la célula y / o en la eliminación de uno o más de los componentes de la célula, el grado al que tal modificación y / o eliminación se produce es insignificante. En particular, una célula sustancialmente intacta de acuerdo con la presente invención no se ha tratado de manera específica para eliminar uno o más componentes de ella.

Aunque se ha sugerido que los componentes individuales de células bacterianas se podrían usar para inducir un efecto adyuvante, antes de la presente invención el uso de células enteras de la bacteria del género Tsukamurella de acuerdo con la presente invención no se contempló. De manera sorprendente, se ha encontrado que mediante el uso de una célula entera de una bacteria de dicho género se puede efectuar el tratamiento y / o prevención de una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune. La modulación de una respuesta inmune celular provocada por la administración de dicha célula entera de dicha bacteria puede ser de manera ventajosa de larga duración cuando se compara con la respuesta provocada por la administración de un componente individual de la bacteria.

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la presente invención comprende más de una célula entera, y más preferiblemente comprende una pluralidad de células enteras.

De manera adecuada, la composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención puede comprender un antígeno y un adyuvante, en la que dicho adyuvante comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella. Dichos antígenos pueden ser aquellos compartidos por estos géneros con otros microorganismos y las mitocondrias de eucariotas, por ejemplo células de vertebrados.

En otro aspecto, la composición de inmunomodulador puede ser una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella y de manera opcional un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, dicha composición de inmunomodulador en uso modifica una respuesta inmune celular.

En un aspecto adicional, la composición de inmunomodulador y / o a composición farmacéutica puede comprender una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, y al menos una citocina añadida, tal como interleucina 2 por ejemplo. La citocina puede ayudar a reforzar la acción moduladora inmune de la presente invención.

De manera adecuada, el antígeno o determinante antigénico puede ser un antígeno o determinante antigénico de uno o más de lo siguiente: vacuna de BCG (bacilo de Calmette y Guerin), vacuna de toxoide de difteria, vacuna de difteria/tétanos/pertussis (DTP o Triple), vacuna de pertussis, vacuna de toxoide de tétanos, vacuna de sarampión, vacuna de paperas, vacuna de rubéola, vacuna de OPV (vacuna de poliomielitis oral) y Mycobacteria vaccae, o parte de la misma (como se enseña en el documento GB0025694.1). Esta lista no es de ninguna manera limitante y antígenos adecuados de otras fuentes se pueden añadir a las composiciones de acuerdo con la presente invención de manera que las respuestas a esos antígenos también se pueden beneficiar de la regulación inducida de la respuesta que se produce de la administración de la composición de acuerdo con la presente invención. Otros antígenos adecuados pueden ser antígenos de otros virus, tumores, parásitos u otras bacterias de origen no natural presentes en la composición de modulador de acuerdo con la presente invención.

De manera adecuada, la composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica puede comprender dos o más de tales antígenos o determinantes antigénicos.

En un aspecto adicional, la composición de inmunomodulador o composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella de acuerdo con la presente invención se puede usar como una vacuna.

De manera adecuada, la vacuna puede ser una vacuna profiláctica o una vacuna terapéutica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género Tsukamurella para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune.

En un aspecto, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención

puede regular por disminución una respuesta de Th2.

En otro aspecto, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención puede regular por incremento una respuesta de Th1.

De manera adecuada, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención puede regular por disminución una respuesta de Th2 y regular por incremento una respuesta de Th1.

De manera alternativa, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención puede regular por incremento una respuesta de Th1 mientras no afecta a una respuesta de Th2.

De manera alternativa, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención puede regular por disminución una respuesta de Th2, mientras también regula por incremento una respuesta de Th1.

De manera alternativa, la célula entera de la bacteria de acuerdo con la presente invención puede regular por incremento una respuesta de Th2, mientras también regula por incremento una respuesta de Th1.

Un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica y / o composición de inmunomodulador que comprende una célula entera de una bacteria de uno o más de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides a un sujeto en el que dicha composición modula una respuesta inmune celular también se enseña en el presente documento.

De manera adecuada la cantidad eficaz de la composición farmacéutica y / o composición de inmunomodulador se puede administrar en forma de una dosis individual. De manera alternativa, la cantidad eficaz de la composición farmacéutica y / o composición de inmunomodulador se puede administrar en dosis múltiples (repetidas), por ejemplo dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, diez o más, o veinte o más dosis repetidas.

En particular, tales dosis repetidas pueden ser necesarias para el tratamiento de afecciones establecidas o crónicas, por ejemplo.

Un procedimiento para protección, que incluye inmunización, un sujeto contra una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune que comprende la administración de una composición farmacéutica y / o composición de inmunomodulador que comprende una célula entera de una bacteria de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides se enseña en el presente documento.

El término "protegido" como se usa en el presente documento significa que el sujeto es menos susceptible a la enfermedad/trastorno cuando se compara con un sujeto no tratado o administrado con las composiciones de acuerdo con la presente invención y / o que el sujeto es más capaz de contrarrestar o superar la enfermedad / trastorno cuando se compara con un sujeto no tratado o administrado con las composiciones de acuerdo con la presente invención.

Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica y / o una composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención se puede administrar a un sujeto, en la que dicha composición se administra de manera conjunta con un antígeno o determinante antigénico.

Cuando la composición se administra de manera conjunta con un antígeno o determinante antigénico de acuerdo con la presente invención el antígeno o determinante antigénico puede de manera adecuada ser un antígeno o determinante antigénico de uno o más de los siguientes: vacuna de BCG (bacilo de Calmette y Guerin), vacuna de toxoide de difteria, vacuna de difteria/tétanos/tos ferina (DTP o Triple), vacuna de tos ferina, vacuna de toxoide de tétanos, vacuna de sarampión, vacuna de paperas, vacuna de rubeola, OPV (vacuna oral de poliomielitis) y Mycobacteria vaccae, o parte de las mismas (como se enseña en el documento GB0025694.1). De manera adecuada dos o más, o tres o más, de tales antígenos o determinantes antigénicos se pueden administrar de manera conjunta con una composición farmacéutica o una composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención.

Preferiblemente, un medicamento de acuerdo con la presente invención se usa para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o un trastorno autoinmune.

En un aspecto adicional de la presente invención, la composición farmacéutica o la composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención puede comprender bacterias del género Tsukamurella. De manera adecuada, la composición puede comprender dos o más, o tres o más, bacterias de cualquiera de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides, siendo al menos una bacteria de Tsukamurella.

Preferiblemente, las bacterias para uso de acuerdo con la presente invención son del género Tsukamurella, incluyendo cualquier especie de este género tal como Tsukamurella paurometabola y Tsukamurella inchonensis por ejemplo. De manera adecuada, las especies usadas son las que se pueden desarrollar sobre medio, que es un medio antigénico bajo, preferiblemente no antigénico. A modo de ejemplo solamente, un medio adecuado no antigénico es medio de Sauton.

Preferiblemente, la bacteria de acuerdo con la presente invención se destruye antes de uso. De manera adecuada, la bacteria de acuerdo con la presente invención se puede destruir mediante tratamiento por calor de la misma, por ejemplo, tratamiento por calor en un

autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Otros tratamientos adecuados para destruir la bacteria pueden incluir radiación ultravioleta o ionizante o tratamiento con compuestos químicos tales como fenol, alcohol o formalina.

De manera adecuada, la bacteria de acuerdo con la presente invención se puede purificar y / o aislar.

De manera adecuada, la bacteria de acuerdo con la presente invención se puede suspender en agua o solución salina tamponada, de manera adecuada borato tamponado a pH

8.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, significa un animal. De manera adecuada, el sujeto puede ser por ejemplo cualquier animal, incluyendo pájaros, crustáceos (tal como camarones por ejemplo), peces y mamíferos. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, incluyendo por ejemplo ganado y seres humanos. En algunos aspectos de la presente invención, el sujeto puede de manera adecuada ser un ser humano.

Cuando la composición farmacéutica o composición de inmunomodulador se administra (para la primera vez si se va a realizar más de una administración) a ganado, preferiblemente se administra después que el ganado haya mamado la primera vez. En particular, para algunas aplicaciones puede ser importante permitir que el bebé tome y / o digiera el calostro paternal antes de la administración de la primero (cuando se hace más de una vez) o solamente la dosis de la composición farmacéutica o composición de inmunomodulador. Para evitar dudas, para algunas aplicaciones la primera administración de la composición farmacéutica o composición de inmunomodulador se debe proporcionar entre aproximadamente 1-4 días después del nacimiento, preferiblemente 1 -3 días después del nacimiento, más preferiblemente 1 -2 días después del nacimiento, preferiblemente 2 -3 días después del nacimiento. Después las administraciones se pueden proporcionar 7 días y / u 8 12 semanas después de la primera inyección.

El término "inmunomodulador" como se usa en el presente documento incluye una vacuna.

USOS TERAPÉUTICOS

Los inmunomoduladores de la presente invención se pueden usar en terapia. En particular tales compuestos pueden ser usados para modular respuestas de linfocitos T in vivo y / u otras células implicadas en una respuesta inmune in vivo.

Las composiciones de inmunomodulador/farmacéuticas capaces de modular, en particular bloquear, la proliferación de células T y / o diferenciación y / o actividad se pueden usar contra cualquier trastorno que sea susceptible a la prevención o tratamiento mediante la modulación de una respuesta inmune adaptable, es decir, una respuesta inmune celular.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención es del tipo en el que los sujetos poseen daños en el sistema inmune de uno o más de los tejidos sujeto. De manera adecuada, la respuesta autoinmune puede accionada mediante algo dentro del sujeto o algo dentro del ambiente del sujeto.

De manera adecuada la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser uno de los que sigue a una causa de inicio. Por ejemplo, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser una que está provocada por infección y / o alguna otra causa de inicio. Las causas de inicio potenciales pueden ser a modo de ejemplo, edad avanzada, infección (por ejemplo infección parásita), tratamiento con esteroides, vacunación repetida con alumbre, embarazo y /

o cánceres.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser una que implica inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención may, también implica la inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo, implican la inflamación de la capa muscular de un vaso sanguíneo o del miocardio.

De manera adecuada, la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser uno que está precedido o causado por un trastorno vascular.

La enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune de acuerdo con la presente invención puede ser uno o más de los siguientes: artritis, de manera particular artritis reumatoide, psoriasis, artropatía psoriática, escleroderma, tiroiditis, hiperplasia de la íntima después de transplante, rechazo de injerto y trastornos vasculares.

De manera adecuada, los trastornos vasculares de acuerdo con la presente invención pueden incluir enfermedad o trastorno vascular que comprende un elemento autoinmune, por ejemplo uno que está provocado por una respuesta autoinmune.

De manera adecuada, trastornos vasculares de acuerdo con la presente invención pueden incluir uno o más de enfermedad y fenómeno de Raynaud, uveitis anterior, trastorno vascular obliterante, formación de ateroma (otras veces conocido como arteriosclerosis), arteritis, hiperplasia de la mioíntima (natural o después de angioplastia), engrosamiento inflamatorio y autoinmune de la íntima y / o capa muscular de los vasos sanguíneos, lesiones inflamatorias de los vasos sanguíneos, enfermedad cardíaca aterosclerótica, lesión de

reperfusión, alteraciones de conducción cardíaca, miocarditis, infarto de miocardio.

De manera adecuada, el rechazo de injerto de acuerdo con la presente invención puede ser rechazo de injerto crónico, de manera particular en la ausencia de un inmunosupresor. De este modo, la composición de acuerdo con la presente invención se puede usar como un reemplazo del inmunosupresor convencional administrado antes de, durante y / o después de transplante. Las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden usar cuando se transplantan células, tejidos y órganos naturales o artificiales, tales como uno o más de los siguientes: córneas, médula ósea, órganos (por ejemplo, riñón, hígado), cristalinos, marcapasos, tejido cutáneo natural o artificial, células de islotes.

CÉLULAS AUXILIARES T

El término 'Th1' como se usa en el presente documento se refiere a un tipo 1 de célula auxiliar T (Th1). El término también se puede usar en el presente documento para referirse a la respuesta mediada por o mediante tal tipo de célula. Tal respuesta puede incluir uno o más de la secreción de interleucina-2 (IL-2), la secreción de Interferón-gamma (IFN-y), activación de macrófagos, activación de células T citotóxicas, o cualquier otro episodio asociado a Th1. De este modo, el término 'Th1' puede incluir célula (s) Th1 así como la (s) respuesta (s) inmune(s) que produce (n) tal (es) célula (s).

El término 'Th2' como se usa en el presente documento se refiere a un tipo 2 de célula auxiliar T (Th2). El término también se puede usar en el presente documento para referirse a la respuesta mediada por o a través de tal tipo de célula. Tal respuesta puede incluir uno o más de la secreción de Interleucina-4 (IL-4), la secreción de la interleucina IL-402 de variante de ayuste, la secreción de Interleucina-5 (IL-5), aumentan en los niveles de determinante de células 30 (CD30) en linfocitos, aumento en los niveles de Inmunoglobulina-E (lgE) en la sangre o eosinófilos en la sangre, o cualquier otro episodio asociado a Th2. De este modo, el término 'Th2' puede incluir célula (s) Th2 así como la (s) respuesta (s) inmune (s) que tal (es) célula) (s) produce (n).

Se sabe que diversas condiciones pueden dar como resultado o producirse a partir de una respuesta inmune celular no regulada o regulada de manera inapropiada, en particular en la activación y / o proliferación de Th1 y / o Th2, que si está no regulada o regulada de manera inapropiada se ha encontrado que da como resultado uno o más efectos perjudiciales en el sujeto.

Una respuesta inmune celular no regulada o regulada de manera inapropiada también se ha observado en los trastornos autoinmunes tales como por ejemplo enfermedades vasculares inflamatorias tales como arteriosclerosis, hiperplasia de la mioíntima después de angioplastia y uveitis anterior, y durante transplante/rechazo de injertos. A modo de un ejemplo adicional, Stansby et al. Eur 25 J Vasc Endovasc Surg 2002; 23: 23 -28 probaron la hipótesis de que el tratamiento con una preparación micobacteriana que modula la respuesta de anticuerpos, debe disminuir la enfermedad vascular, es decir, reestenosis en un modelo de angioplastia de rata. Se ha mostrado que la inmunomodulación con material micobacteriano adecuado para uso en ser humano, puede reducir MIH. Ya que tal modulación tiene un riesgo bajo, esto incrementa la esperanza de una modalidad terapéutica nueva importante para combatir la reestenosis.

De acuerdo con lo anterior, un objetivo de la presente invención es promover y establecer la regulación de una respuesta inmune celular, incluyendo la regulación o modulación de Th1 y / o Th2, de tal forma que supere los efectos negativos de la respuesta inmune celular no regulada o regulada de manera inapropiada.

De manera adecuada, el uso de una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención modula la respuesta de Th1 o Th2, es decir, una respuesta de Th1 o Th2 que da como resultado, por ejemplo, daño de tejido.

De manera adecuada, el uso de una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede reducir la respuesta de Th1 y reducir la respuesta de Th2.

De manera adecuada, el uso de una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede incrementar la respuesta de Th1 sin que afecte a la respuesta de Th2.

De manera adecuada, el uso de una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede incrementar la respuesta de Th1 y disminuir la respuesta de Th2.

De manera adecuada, el uso de una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede incrementar la respuesta de Th1 e incrementar la respuesta de Th2.

De manera adecuada, los expertos en la técnica pueden ensayar especies específicas de cada género de acuerdo con la presente invención para determinar su respuesta específica de Th1/Th2.

Una respuesta inmune no regulada o regulada de manera inapropiada puede jugar un papel en el establecimiento de una enfermedad debido al hecho que algunas enfermedades provocan, o son una consecuencia de, respuestas de Th1 y / o Th2 desplazadas. Acompañando estas reacciones atípicas de Th1 y Th2 son una serie de respuestas inflamatorias anormales, que pueden tomar parte en los mecanismos que subyacen a la

patología de los tejidos.

A modo de ejemplo solamente, la composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contrarrestar una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune.

VACUNAS

La preparación de vacunas que contienen una o más sustancias como un (os) ingrediente (s) activo (s), es conocida por los expertos en la técnica. Típicamente, tales vacunas se preparan en forma de inyectables, o bien como soluciones líquidas o suspensiones; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de inyección también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar, o el (los) ingrediente (s) encapsularse en liposomas. Los ingredientes activos se mezclan a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y sus combinaciones. De manera alternativa, la vacuna se puede preparar, por ejemplo, para que se ingiera de manera oral y / o sea capaz de inhalación.

Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes y agentes de tamponación de de pH.

ADMINISTRACIÓN

Típicamente, un medico determinará la dosis real de una vacuna, composición de inmunomodulador y composición farmacéutica que será la más adecuada para el sujeto individual y variará con la edad, peso y respuesta del paciente particular. Las dosificaciones inferiores son ejemplares del caso promedio. Por supuesto, pueden ser casos individuales donde merecen la pena dosificaciones mayores o inferiores

Preferiblemente, la dosis real que se usa da como resultado una toxicidad mínima para el sujeto.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante inyección directa. La composición puede ser formulada para la administración parenteral, mucosal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular, intradérmica o transdérmica.

De manera adecuada, la composición de acuerdo con la presente invención se puede administrar a una dosis de 1 nanogramo a 100 miligramos de organismos, preferiblemente 10 nanogramos a 10 miligramos de organismos, más preferiblemente 100 nanogramos a 5 miligramos de organismos, e incluso más preferiblemente 100 nanogramos a 1 miligramo de organismos. Típicamente, la composición de acuerdo con la presente invención se puede administrar a una dosis de 100 microgramos a 1 miligramo de bacterias para uso humano y animal.

Si las composiciones de la presente invención se van a administrar como inmunopotenciadores, entonces 1 nanogramo a 100 miligramos de organismos por dosis, preferiblemente 10 nanogramos a 10 miligramos de organismos por dosis, more preferiblemente 100 nanogramos a 5 miligramos organismos por dosis, e incluso más preferiblemente 100 nanogramos a 1 miligramo organismos por dosis, e incluso más preferiblemente, 100 microgramos a 1 miligramo de bacterias por dosis para uso humano y animal se pueden administrar a intervalos regulares.

Como fácilmente apreciaran los expertos en la técnica la dosificación administrada dependerá del organismo al que se administra la dosis.

El término "administrado" incluye la administración mediante los mecanismos de administración que incluyen inyección, transfección mediada por lípidos, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfifilos faciales catiónicos (CFA) y sus combinaciones, o incluso administración viral. Las vías de tales mecanismos de administración incluyen pero no se limitan a las vías mucosal, nasal, oral, parenteral, gastrointestinal, tópica, o sublingual.

El término "administrado" incluye pero no se limita a administración por vía mucosa, por ejemplo, en forma de un pulverizador o aerosol nasal para inhalación o en forma de una solución que se puede ingerir, cápsula o comprimido; una vía parental donde la administración es mediante una forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea.

El término "administrado conjuntamente" significa que el sitio y tiempo de administración de cada adyuvante (s), antígeno (s) y / o determinante (s) antigénico (s) de la presente invención son de manera que se logra la modulación necesaria del sistema inmune. De este modo, mientras que el (los) antígeno (s) y adyuvante (s) se puede (n) administrar al mismo tiempo y en el mismo sitio, por lo tanto puede ser ventajoso en la administración del (de los) antígeno (s) y / o determinante (s) antigénico (s) en un tiempo diferente y a un sitio diferente el adyuvante (s). el (los) antígeno (s) y / o determinante (s) antigénico (s) y adyuvante (s) se puede incluso administrar en el mismo vehículo de administración – y el (los) antígeno (s) y / o determinante (s) antigénico (s) y adyuvante (s) puede estar acoplado y / o no acoplado y / o genéticamente acoplado y / o no acoplado. A modo de ejemplo solamente, la composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración de uno o más antígenos o antígenos adicionales.

El antígeno, determinante antigénico, péptido u homólogo o mimético del mismo se puede administrar de manera separada o administrarse conjuntamente al sujeto huésped en forma de una única dosis o en múltiple dosis.

La composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de la invención se puede administrar mediante una serie de diferentes vías tal como inyección (que incluye inyección parenteral, subcutánea, intradérmica e intramuscular) administración intranasal, mucosal, oral, intra-vaginal, uretral u ocular.

Preferiblemente, en la presente invención, la administración es mediante inyección. Más preferiblemente la inyección es intradérmica.

Preferiblemente, en la presente invención, la administración es mediante una composición aceptable por vía oral.

Para la vacunación la composición se puede proporcionar en 0,1 a 0,2 ml de solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica tamponada, y administrar por vía parenteral, por ejemplo mediante inoculación intradérmica. La vacuna de acuerdo con la invención se inyecta preferiblemente por vía intradérmica. Ligera hinchazón y enrojecimiento algunas veces picazón también se puede encontrar en el sitio de inyección. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones se puede optimizar por los expertos en la técnica de una manera conocida.

ANTÍGENOS

Como se usa en el presente documento, un "antígeno" significa una entidad que, cuando se introduce en un huésped inmunocompetente, modifica la producción de un anticuerpo o anticuerpos específico (s) que se pueden combinar con la entidad, y / o modifica la respuesta de Th relevante, tales como Th2 y / o Th 1. The antígeno puede ser una sustancia pura, una mezcla de sustancias o material soluble o particulado (incluyendo células o fragmentos de células o célula sonicada). En este sentido, el término incluye cualquier determinante antigénico adecuado, antígeno de reacción cruzada, aloantígeno, xenoantígeno, tolerógeno, alérgeno, hapteno, e inmunógeno, o partes de los mismos, así como cualquier combinación de los mismos, y estos términos se usan indistintamente a lo largo de todo el texto.

El término "determinante antigénico o epítopo" como se usa en el presente documento se refiere a un sitio sobre un antígeno que se reconoce por un anticuerpo o receptor de células T, o es responsable de provocar la respuesta de células auxiliares T. Preferiblemente es un péptido corto derivado de o parte de un antígeno de proteína. Sin embargo el término también pretende incluir glicopéptidos y epítopes de carbohidratos. El término también incluye secuencias modificadas de aminoácidos o carbohidratos que estimula las respuestas que reconocen el organismo entero.

Una vacuna "preventiva" o "profiláctica" es una vacuna que se administra a individuos no expuestos para prevenir del desarrollo de una afección, tal como mediante estimulación de inmunidad protectora.

Una vacuna "terapéutica" es una vacuna que se administra a individuos con una afección existente para reducir o minimizar la afección o eliminar las consecuencias inmunopatológicas de la afección.

ADYUVANTES

El término 'adyuvante' como se usa en el presente documento significa una entidad capaz de aumentar o participar en la influencia de una respuesta inmune. Un adyuvante es cualquier sustancia o mezcla de sustancias que ayuda, incrementa, regula hacia abajo, modifica o diversifica la respuesta inmune a un antígeno.

La composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más adyuvantes que potencian la eficacia de la composición de inmunomodulador y / o composiciones farmacéuticas. Ejemplos de adyuvantes adicionales que pueden ser eficaces incluyen pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio y potasio (alumbre), sulfato de berilio, sílice, caolín, carbono, emulsiones agua en aceite, v aceite en agua, muramil dipéptido, endotoxina bacteriana, lípido X, Corynebacteria parvum (Propionobacteria acnes), Bordetella pertussis, Mycobacteria vaccae, polirribonucleótidos, alginato de sodio, lanolina, Iisolecitina, vitamina A, interleucinas tales como interleucina 2 e interleucina 12, saponina, liposomas, levamisol, DEAE-dextrano, copolímeros bloqueados u otros adyuvantes sintéticos. Tales adyuvantes están disponibles comercialmente de diversas fuentes, por ejemplo, Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) o Adyuvante incompleto y Adyuvante completo de Freund (Difco Laboratorios, Detroit, Michigan). Solamente el hidróxido de aluminio está aprobado para uso humano. Alguno de los otros adyuvantes, tales como M. vaccae por ejemplo, han sido aprobados para ensayos clínicos.

De manera adecuada, el adyuvante puede ser una célula entera de una bacteria de una cualquiera del género Tsukamurella.

En la técnica, se sabe que las vacunas de ADN, que son esencialmente secuencias de ADN unidas a partículas de oro y que se queman en la piel mediante una pistola de helio, son sistemas de administración eficaces de vacuna. A diferencia de las vacunas convencionales, estas vacunas de ADN no requieren un componente adyuvante adicional. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, la composición de inmunomodulador como se define en el presente documento puede de manera adecuada usarse junto con tales vacunas de ADN para aumentar o participar en la influencia de la respuesta inmune.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

Las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula entera de una bacteria de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides y de manera opcional un vehículo diluyente o excipientes (incluyendo sus combinaciones) farmacéuticamente aceptables, se enseñan también en el presente documento.

La composición farmacéutica puede comprender dos componentes -un primer componente que comprende un antígeno y un segundo componente que comprende un adyuvante del mismo. El primer y segundo componente puede ser administrado de manera secuencial, de manera simultánea o conjuntamente, e incluso mediante diferentes vías de administración.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria y típicamente comprenderán cualquiera o más de un diluyente, vehículo,

o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del vehículo, excipiente or diluyente farmacéutico se puede seleccionar con relación a la vía propuesta de administración y práctica farmacéutica convencional.

Las composiciones farmacéuticas puede comprender como -o además de -vehículo, excipiente o diluyente cualquier aglutinante (s), lubricante (s), agente (s) de suspensión, agente (s) de revestimiento, agente (s) de solubilización adecuado (s) adecuado (s).

Agentes conservantes, estabilizantes, tintes e incluso aromatizantes se pueden proporcionar en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Antioxidantes y agentes de suspensión también se pueden usar.

Pueden existir diferentes requerimientos de composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de administración. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser formulada para administrarse usando una mini bomba o mediante una vía mucosa, por ejemplo, en forma de un pulverizador o aerosol nasal para inhalación o solución que se puede ingerir, o potencialmente en la que la composiciones formula mediante una forma inyectable, para la administración, mediante, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. De manera alternativa, la formulación puede ser diseñada para que se administre mediante ambas rutas.

Preferiblemente en la presente invención la formulación está en forma inyectable. Más preferiblemente la formulación se inyecta por vía intradérmica.

Preferiblemente en la presente invención la formulación es una composición aceptable por vía oral.

Cuando el agente se va a administrar por vía oral a través de la mucosa gastrointestinal, debe ser capaz de permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.

Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante inhalación, en la forma de un supositorio o pesario, por vía tópica en la forma de una loción, solución, crema, pomada o polvo fino, mediante el uso de un parche cutáneo, por vía oral en la forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos o bien solos o en mezcla con excipientes, o en la forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes y colorantes, o se pueden inyectar por vía parenteral, por ejemplo por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intradérmica o por vía subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones puede ser usadas mejor en la forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer la solución isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual las composiciones se pueden administrar en la forma de comprimidos o pastillas que se pueden formular de una manera convencional.

COMBINACIONES FARMACÉUTICAS

El agente de la presente invención se puede administrar con una o más sustancias farmacéuticamente activas diferentes. A modo de ejemplo, la presente invención cubre los tratamientos simultáneos o de manera secuencial con una composición de inmunomodulador y / o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, y uno o más esteroides, analgésicos, antivirales, interleucinas tales como IL-2, o sustancia (s) farmacéuticamente activa

(s) diferente (s).

Se entenderá que estos regímenes incluyen la administración de las sustancias secuencialmente, simultáneamente o conjuntamente. INMUNOPOTENCIADORES

El término "inmunopotenciadores" como se usa en el presente documento significa una

o más bacterias o bien aislarse o en cultivo que cuando se administra a un sujeto beneficia la salud de ese sujeto. Preferiblemente, este beneficio se logra mediante la modificación de la respuesta inmune celular del sujeto.

De acuerdo con la presente invención, se pueden usar potenciadotes inmunes, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune.

Los inmunopotenciadores se pueden administrar por consumo en alimentos específicamente diseñados o en piensos animales. Los inmunopotenciadores también se pueden administrar por otras vías – tal como inyección directa. Preferiblemente, las bacterias se destruyen de manera que eviten las dificultades de mantenimiento de los productos vivos.

IDENTIFICACIÓN DE UNA BACTERIA QUE MODULA UNA RESPUESTA INMUNE CELULAR

Un procedimiento para identificar una o más células enteras de bacterias de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides que modulan (por ejemplo, modifican) una respuesta inmune celular que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un primer animal de ensayo con un inmuneostimulador; (b) poner en contacto un segundo animal de ensayo con un inmunoestimulador mezclado con una bacteria; (c) medir la respuesta inmune celular en cada uno de los animales de ensayo; y (d) comparar la respuesta inmune celular en cada uno de los animales de ensayo, en el que, una respuesta inmune celular menor del inmunoestimulador mezclado con una bacteria en comparación con el inmunoestimulador solo es indicativo de una modificación de la respuesta inmune celular por la bacteria, se describe en el presente documento .

Además, se enseña un procedimiento de determinación de la respuesta de Th1/Th2 de una especie de bacterias seleccionadas entre los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides, comprendiendo dicho procedimiento la utilización del ensayo en la piel con tuberculina. En ratones, el ensayo en la piel con tuberculina se lleva a cabo preferiblemente en la almohadilla de la pata. En una reacción de Th1 predominante la respuesta inmune de la almohadilla de la pata es máxima a las 24 horas y disminuyó a las 48 horas. Sin embargo, ya que la reactividad de Th2 aumenta después de 48 horas la respuesta inmune positiva de la almohadilla de la pata aumenta y puede incluso exceder la respuesta inmune de la almohadilla de la pata a las 24 horas.

El efecto de vacunación de BCG está bien documentado usando este ensayo en la piel con tuberculina. De este modo, el ensayo de prueba se puede usar para determinar si o no la introducción de una composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención

modula la respuesta inmune celular de BCG.

Como se usa en el presente documento, el término "animal de ensayo" se refiere a cualquier animal que induce una respuesta inmune celular al inmunostimulador. Preferiblemente, el (los) animal (es) de ensayo es (son) un mamífero. Más preferiblemente, el (los) animal (es) de ensayo es (son) una rata, hámster, conejo, cobaya o ratón. Más preferiblemente, el (los) animal (es) de ensayo es un ratón.

Preferiblemente, la bacteria modifica la respuesta de células T auxiliares. De manera adecuada, la bacteria puede modificar la respuesta de células T auxiliares mediante la disminución de de la respuesta de Th1 y Th2. De manera adecuada, la bacteria puede modificar la respuesta de células T auxiliares incrementando la respuesta de Th1 y disminuyendo la respuesta de Th2. De manera adecuada, la bacteria puede modificar la respuesta de células T auxiliares mediante el incremento de la respuesta de Th1 sin afectar a la respuesta de Th2.

Preferiblemente, el inmunostimulador tendrá una respuesta conocida de Th1 y Th2. Por ejemplo, con el inmunostimulador de BCG la reacción es usualmente mayor que 24 h cuando es un indicador de la respuesta de Th1; la reacción a las 48 h es usualmente menor e incluye una contribución de Th2. Se sabe que BCG predominantemente estimula una respuesta de Th1. Mediante el uso de tales inmunostimuladores puede ser posible determinar la respuesta Th1/Th2 de una bacteria de ensayo y, de este modo, puede ser posible identificar una o más bacterias que tienen una respuesta de Th1/Th2 deseada para tratar y / o prevenir una enfermedad y / o trastorno particular.

Preferiblemente, la respuesta inmune celular se mide usando el ensayo en la piel con tuberculina. La vacunación con un inmunostimulador -tal como BCG -induce una respuesta al ensayo en la piel con tuberculina (una preparación soluble de bacilos de Tuberculosis), cuando se ensaya más tarde. La reacción local se mide a diferentes intervalos, por ejemplo, 24 horas, 48 horas y 72 y horas después de la inyección de tuberculina. En resumen, un inmunostimulador (por ejemplo, BCG) se usa para que induzca una respuesta inmune positiva a la tuberculina. En el animal de ensayo, el ensayo en la piel con tuberculina se lleva a cabo preferiblemente sobre la almohadilla de la pata. En una reacción de Th1 predominante la respuesta inmune positiva de la almohadilla de la pata es usualmente máxima a las 24 horas y disminuye a las 48 horas. Sin embargo, a medida que la reactividad de Th2 aumenta entonces la respuesta inmune positiva de la almohadilla de la pata a las 48 horas y puede incluso exceder la respuesta inmune de la almohadilla de la pata a las 24 horas. De este modo, el ensayo se puede usar para determinar si o no la introducción de una composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención modula la respuesta inmune celular.

Preferiblemente, el inmunoestimulador es BCG.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un gráfico que demuestra los resultados de ensayo de media de ganancia de pesos/hembras de camada y controles durante 12 semanas de destete.

La figura 2 es un gráfico que demuestra los resultados de ensayo de media de ganancia de peso/machos de camada y controles durante 12 semanas de destete.

La figura 3 es un gráfico que demuestra que Gordonia bronchialis potencia el efecto temprano de TH1.

La figura 4 es un gráfico que demuestra que Tsukamurella inchonensis potencia la respuesta temprana de TH1 y suprime la respuesta tardía de TH2.

La figura 5 es un gráfico que demuestra que Rhodococcus coprophilus suprime tanto las respuestas de TH1 como de TH2.

La figura 6 es un gráfico que demuestra la respuesta a la tuberculina para BCG después de 1 mes comparado con los controles no vacunados.

La figura 7 es un gráfico que demuestra la modulación inmune del efecto de BCG mediante tres especies de bacterias. Las respuestas de tuberculina se miden a las 24 y 48 horas. Las especies representativas son (Na) Nocardia asteroides; (Gb) Gordonia bronchialis; y (Tp) Tsukamurella inchonensis.

La figura 8 es un gráfico que demuestra la modulación inmune de BCG/BCG+ por dos especies de bacterias. Las respuestas de tuberculina se miden a las 24, 48 y 72 horas. Las especies representativas son (Rrh) Phodococcus rhodocrous y (Dm) Dietzia maris.

La figura 9 es un gráfico que demuestra la modulación inmune del efecto de BCG mediante especies seleccionadas dentro del género Rhodococcus. Las respuestas de tuberculina se miden a las 24, 48 y 72 horas. (Rrh) Rhodococcus rhodocrous; (Rru) Rhodococcus ruber; (Rrhod) Rhodococcus rhodnii; (Rcop) Rhodococcus coprophilus; (Ropa) Rhodococcus opacus; (Reryth) Rhodococcus erythopolis.

La figura 10 es un gráfico que demuestra la dosis optima para Rhodococcus ruber usando BCG modificado con diluciones log de Rhodococcus ruberfrom 108 a 104 comparado con BCG solo.

La figura 11 muestra un gráfico de un estudio de angioplastia de rata, que muestra la ganancia media de peso en rata después de tratamiento con Gordonia bronchialis, Rhodococcus corprophilus, o Tsukamurella inchonensis, comparado con un control no tratado y un control tratado con Mycobacteria vaccae.

La figura 12 muestra los resultados para las relaciones de engrosamiento íntima/medio

en ratas después de tratamiento con Gordonia bronchialis, Rhodococcus corprophilus, o Tsukaniurella inchonensis, comparado con un control no tratado y un control tratado con Mycobacteria vaccae. GP1= Control; GP2= G.bronchialis; GP3= R. coprophilus; GP4= T.inchonensis; GP5= M. vaccae).

La invención se describirá ahora a modo de ejemplos, que significa que sirven para ayudar a los expertos en la técnica en la realización de la invención y no se pretende de ninguna manera que limiten de ninguna lanera la invención.

EJEMPLOS

PROCEDIMIENTOS Ensayo en la piel con tuberculina

El ensayo en la piel con tuberculina es un modelo de ensayo apropiado para determinar el efecto de un composición de inmunomodulador, es decir, composiciones /suspensiones bacterianas que comprenden células enteras bacterianas muertas de acuerdo con la presente invención, en una respuesta inmune celular.

La Vacunación de BCG induce una respuesta inmune positiva a la tuberculina. En ratones, el ensayo en la piel con tuberculina se lleva a cabo preferiblemente sobre la almohadilla de la pata. En una reacción de Th1 predominante la respuesta inmune de la almohadilla de la pata es máxima a las 24 horas y disminuye a las 48 horas. Sin embargo, a medida que la reactividad de Th2 aumenta entonces la respuesta inmune positiva de la almohadilla de la pata a las 48 horas aumenta e incluso excede la respuesta inmune de la almohadilla de la pata a las 24 horas.

El efecto de vacunación de BCG está bien documentado usando un ensayo en la piel con tuberculina. De este modo, el ensayo de prueba se puede usar para determinar si o no la introducción de una composición de inmunomodulador de acuerdo con la presente invención modula la respuesta inmune celular de BCG.

Preparación de una suspensión bacteriana

Las especies bacterianas de los géneros Rhodococcus, Gordonia, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y Nocardioides se pueden desarrollar en un medio sin antígeno, tal como medio de Sauton, en un fermentador durante 2 -28 días. De manera alternativa, las especies bacterianas de interés se pueden hacer crecer en una pendiente sólida. Los procedimientos alternativos estarían fácilmente disponibles por los expertos en la técnica

La masa bacteriana resultante se puede recoger y o bien usar directamente y o bien usar directamente o después de lavado para preparar una suspensión en tampón. La suspensión de células bacterianas se prepara para que contenga entre 100 nanogramos y 10 miligramos de bacilos por dosis. Las células bacterianas se vuelven a suspender en agua o solución salina. Preferiblemente, la solución salina se tampona a pH 8,0 con borato. Preferiblemente los bacilos están inactivados (muertos), de manera adecuada mediante calentamiento en un autoclave durante 15 minutos a 121°C. La suspensión bacteriana resultante comprende células enteras.

EJEMPLO 1: Modulación de una respuesta inmune celular por Rhodococcus ruber (R.r.).

Grupo 1: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se dejaron sin vacunar como un grupo de control.

Grupo 2: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (105 de bacilos) (Evans).

Grupo 3:: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (105 de bacilos) a los que se había añadido Mycobacteria vaccae inactivado por calor (M. v.) (107 de bacilos).

Todos los ratones en los Grupos 1 -3 se ensayaron en la almohadilla de la pata para determinar la respuesta inmune con tuberculina los días 10 y 30. Después cada ratón se inyectó con Mycobacteria vaccae (107 de bacilos) inactivado por calor inactivados por calor el día 40. El día 50 se repitió el ensayo con tuberculina en la almohadilla de la pata.

Grupo 4: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se dejaron sin vacunar como un grupo de control adicional. Grupo 5: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (Evans) (105 de bacilos).

Grupo 6: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (105 de bacilos) a los que se habían añadido Mycobacteria vaccae (107 de bacilos) inactivados por calor.

Grupo 7: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (105 de bacilos) a los que se habían añadido Rhodococcus ruber (107 de bacilos) inactivados por calor.

Grupo 8: ratones hembra adultos jóvenes no consanguíneos se vacunaron el día 0 en la nuca del cuello con BCG (105 de bacilos) a los que se habían añadido Rhodoccocus ruber (106 de bacilos) inactivados por calor.

Todos los ratones en los grupos 4 -7 se ensayaron en la almohadilla de la pata para determinar la respuesta inmune con tuberculina el día y 30. Después el día 40 cada grupo se dividió de manera que cada mitad del grupo no recibió ningún tratamiento y la segunda mitad

recibió una inyección de Rhodococcus ruber (107 de bacilos). El día 50 se repitió el ensayo con tuberculina sobre la almohadilla de la pata. Los resultados del Ejemplo 1 se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1: Modulación de una respuesta inmune celular por Rhodococcus ruber (R.r.)

Respuesta a tuberculina a las 24 horas: 48 horas Diferencia de 24 -48 horas

Día: Grupo 1-control

10: 6,9 ± 4,5 5,3 ± 3,7 1,6

30: 5,9 ± 4,7 5,2 ± 4,5 0,7

50 M.v.: 13,1 ± 5,6 14,0 ± 5,2 + 0,9

p < 0,01: p < 0,001

Grupo 2 -BCG

10: 16,8 ± 11,1 16,8 ± 5,5 0

30: 31,1 ± 17,8 16,9 ± 9,1 14,2 < 0,05

50 M.v.: 33,9 ± 12,3 19,2 ± 11,3 14,7 < 0,02

Grupo 3-BCG + M.v.

10: 14,6 ± 8,3 9,9 ± 2,7 4,7

30: 23,8 ± 16,1 21,7 ± 11,5 2,1 n,s

50 M.v.: 27,4 ± 10,3 15,1 ± 5,8 12,3 <0,005

Grupo 4 -control

30: 2,8 ± 3,7 2,5 ± 2,3 0,3 n,s,

50: 6,4 ± 9,4 3,6 ± 7,5 2,8 n,s,

50 R.r.: 4,2 ± 5,4 1,0 ± 1,7 3,2 n,s,

Grupo 5-BCG

30: 28,8 ± 15,4 19,1 ± 10,9 9,7 «0,1)

50: 33,8 ± 21,6 12,0 ± 7,9 21,8«0,1)

50 R.r.: 40,0 ± 22,4 12,2 ± 9,2 27,8 <0,05

Grupo 6-BCG + M.v.

30: 19,4 ± 20,5 17,7 ± 11,8 1,7 n,s,

50: 56,8 ± 53,8 29,4 ± 31,1 27,4 n,s,

50 R.r.: 50,0 ± 38,4 9,0 ± 10,4 41,0 <0,05

Grupo 7-BCG + R.r.

30: 20,6 ± 10,9 17,8 ± 10,3 2,8 n,s,

50: 24,8 ± 22,5 14,6 ± 13,2 10,2 n,s,

50 R.r.: 28,0 ± 13,2 11,0 ± 4,7 17,0 < 0,05

Grupo 8 -BCG + grupo R.r./10

30: 19,5 ± 13,9 20,9 ± 14,9 +1,4

50 R.r.: 37,2 ± 25,2 20,2 ± 5,3 17,0 n,s,

50: 26,8 ± 14,8 12,8 ± 8,0 14,0 (< 0,1)

M.v. =Mycobacteria vaccae

En el Grupo 1 de control el tratamiento con Mycobacteria vaccae indujo un incremento significativo en la respuesta a tuberculina después de tanto 24 horas (p < 0,01) como 48 horas (p < 0,001). Sin embargo, en el Grupo 4 de control, el tratamiento con Rhodococcus ruberdid

5 no induce un cambio significativo en la respuesta inmune a tuberculina después de tanto 24 horas como 48 horas. En ambos momentos los resultados de M.v. eran significativamente mayores que los resultados de R.r. (p < 0,02).

En los grupos BCG (Grupo 2 y Grupo 5), la caída en la respuesta a tuberculina entre 24 horas y 48 horas era mayor que (p = 0,06) en los ratones que reciben tratamiento con 10 Rhodococcus ruber (siendo la media 28,2 ± 15,7) que en los ratones que reciben tratamiento

con Mycobacteria vaccae (estando la media entre 14,9 ± 9,6).

En el grupo de BCG+Mycobacteria vaccae (Grupo 3 y Grupo 6), la caída en la respuesta a tuberculina entre 24 horas y 48 horas estaba otra vez entre (p < 0,05) en el grupo que recibe tratamiento con Rhodococcus ruber (siendo la media 41,0 ± 41,0) que en los

15 ratones que reciben tratamiento con Mycobacteria vaccae (siendo la media 12,7 ± 7,0). Estos datos sugieren que existe una regulación hacia abajo de la respuesta de Th2 después de tratamiento con Rhodococcus ruber, que no se observa después de tratamiento con Mycobacteria vaccae. En los grupos de BCG + R.r. (Grupos 7 y 8) el efecto de la adición de R.r. 107 (Grupo

20 7) o 106 (Grupo 8) a BCG era muy similar y después de la segunda inyección con R.r. existía una reducción sustancial en la respuesta entre 24 y 48 horas (15,5 ± 10,0). EJEMPLO 2: Modulación de una respuesta inmune celular usando Nocardia asteroides (N.a.), Gordonia bronchialis (G.b.) o Tsukamurella inchonensis (T.p.).

25 Este experimento se diseñó para comparar los efectos de ensayo de la almohadilla de la pata con Tuberculina 28 días después de la vacunación de los grupos de 6 ratones con BCG

solo o con la adición de 107 M. V., R.r., Nocardia asteroides (N.a.), Gordonia bronchialis (G.b.)

o Tsukamurella inchonensis (T.p.). Para conocer los efectos que se producían sobre la la respuesta inmune a cada uno de estos organismos añadidos, los grupos de animales se ensayaron en la otra almohadilla de la pata 28 días después que se hayan ensayado con

5 tuberculina con reactivos de ensayo de piel preparados a partir del organismo incluidos en su vacunación (Vaccin, Rubin, Asterin, Bronchialin e Inchonensin).

Los resultados se detallan en la Tabla 2. TABLA 2: Modulación de una respuesta inmune celular

10

Respuesta a tuberculina a las 24 horas: 48 horas Diferencia de 24 -48 horas

Día: 1) Grupo de control

28: 3,8 ± 4,8 3,7 ± 3,6 0,1

2) Grupo BCG

28: 38,0 ± 20,2 28,2 ± 17,0 9,8

Tuberculina 56: 65,0 ± 31,2 45,8 ± 23,6 19,2

3) Grupo BCG + M.v.

28: 20,3 ± 10,0 14,2 ± 5,7 6,1

Vaccin 56: 18,7 ± 12,1 8,0 ± 6,5 10,7

4) Grupo BCG + R.r.

28: 31,3 ± 16,0 24,2 ± 10,3 7,1

Rubin 56: 19,5 ± 7,1 12,3 ± 10,4 7,2

5) Grupo BCG + N.a.

28: 24,2 ± 20,8 20,2 ± 17,6 4,0

Asterin 56: 7,3 ± 8,3 5,3 ± 5,0 2,0

6) Grupo BCG + G.b.

28: 15,8 ± 14,4 15,7 ± 13,2 0,1

Bronchialin 56: 11,3 ± 3,4 6,2 ± 4,3 5,1

7) Grupo BCG + T.p.

28: 19,5 ± 7,4 15,8 ± 5,7 3,7

Inchonensin 56: 9,8 ± 5,0 2,3 ± 2,7 7,5

Todas las suspensiones bacterianas disminuían la respuesta a la Tuberculina el día 28 medida tanto a las 24 como a las 48 horas, en comparación con la del siguiente BCG solo (p = 0,05; p = 0,2).

Con la excepción de Tuberculina y Vaccin, ésta fue la primera vez que cualquiera de

5 estos reactivos de ensayo en la piel se habían usado. Las diferencias de sensibilidad a los nuevos reactivos a las 24 horas eran probablemente debidas a que no se habían equilibrado excepto por la estimación de proteínas. Sin embargo, todas mostraron una caída en la respuesta entre 24 y 48 horas el día 50, sugiriendo una actividad inmunorreguladora.

10 EJEMPLO 3: Reacciones de la piel locales a las inyecciones intradérmicas en cobayas adultos El lado izquierdo de 3 animales se afeitó para proporcionar inyecciones intradérmicas de 0,1 ml que contenía 108 M vaccae en el extremo anterior y 0,1 ml que contenía 109 M vaccae 5 cm al final de la cola del animal.

15 Otros 3 animales se afeitaron en en el lado derecho y se proporcionaron inyecciones intradérmicas de 0,1 ml que contenía 108 R. ruber en el extremo anterior y 0,1 ml que contenía 109 R. ruber 5 cm al final de la cola del animal.

imagen1

En 3 cobayas, las reacciones locales a inyecciones intradérmicas (la vía de inyección a usar típicamente en la práctica veterinaria y médica) de 109 R. ruber (una dosis típica para uso humano y animal) eran similares a las reacciones a la misma dosis de M vaccae en otras 3 cobayas. A las 48 horas después de la inyección, las reacciones a R. ruber eran más 25 pequeñas (p < 0,05) que a M. vaccae. No existían diferencias a los 7 días o 14 días. De este modo, R. ruber puede ser incluso más farmacéuticamente aceptable que M vaccae. No existen

reacciones locales a cualquier preparación a la dosis de 108.

EJEMPLO 4: Toxicidad después de inyección subcutánea.

No se observó evidencia de toxicidad a dosis subcutánea en 17 ratas que recibían 3 inyecciones de R. ruber cuando tenían de edad 1 día, 14 días y 28 días.

No existían diferencias a los 7 días o 14 días. Muchos ratones habían recibido inyecciones de diversas especies de bacterias de la presente invención, sin ninguna evidencia de toxicidad.

EJEMPLO 5: Determinación de bacterias que potencian respuestas de Th1 solamente

Artritis adyuvante es la artritis experimental grave inducida en animales mediante mezclas de extractos oleosos y micobacterianos (una preparación que contenía Mycobacteria butyricum es de manera particular eficaz). Se cree que requiere un fuerte adyuvante de Th1 para inducir esta respuesta. La artritis se regula por mecanismos que regulan hacia abajo Th2 (artritis requiere mecanismos tanto de Th1 como de Th2).

Experimento 1: Para determinar si R. rubercan induce Artritis Adyuvante.

Tres grupos de ratas de edad de 60 -90 días recibieron en la almohadilla de la pata trasera:

1.: Una suspensión en aceite de M. butyricum 1 mg/0,1 ml (n = 8)

2.: Una suspensión en aceite de R. ruber 1 mg (n = 8)

3.: Una emulsión en aceite y en solución salina (n = 8)

Animales del primer grupo desarrollaron artritis que implicaban los cuatro miembros, mientras en ratas proporcionó la suspensión en aceite de R.ruber, solamente estaba afectada la pata inyectada.

Experimento 2: Determinar si R. ruber puede inducir una respuesta reguladora de Th2 en ratas después de una exposición de M. butyricum en aceite:

Para ensayar esto, 15 ratas se les administró inyecciones subcutáneas, en diferentes sitios, de 107 de R.ruber en solución salina tamponada los días -42, -28 y -14 antes de la exposición con M. butyricum en emulsión en aceite. Un grupo de control de 10 ratas se trató previamente con solución salina fisiológica siguiendo el mismo programa y se expuso posteriormente.

La evaluación macroscópica de Artritis Adyuvante se realizó mediante puntuación visual de las articulaciones individuales (J Rheumatol 1992; 19:513 -5). Cada miembro se puntuó 0 -4, con el máximo alcanzando 16 puntos/rata.

-42 -28 -14 Día 0 Rro Rro Rro M. butyricum Solución salina Solución salina Solución salina

Ambos grupos no mostraron diferencias en el tiempo de aparición de lesiones artríticas (usualmente entre 9 -11 días después de la inducción), o en la gravedad de manifestaciones 5 artríticas. Los animales se sacrificaron el día 18 por rezones éticas debido a la progresión de la

enfermedad.

Conclusión

Estos experimentos claramente muestran que R. ruber tiene actividad de adyuvante 10 de Th1 pero no actividad "reguladora" de Th2. El dañó en la articulación en la Artritis Adyuvante es una acción combinada de Th1 y Th2.

EJEMPLO 6: Investigación de los efectos de Rhodococcus coprophilus NCIMB 11211, Gordonia bronchialis NC10667 y Tsukamurella inchonensis NC13040 en la 15 toxicidad, en particular velocidad de crecimiento y posterior vacunación de BCG en

ratones recién nacidos.

Un ensayo alternativo de toxicidad es que en las inyecciones subcutánea de Gordonia bronchialis, Rhodococcus coprophilus o Tsukamurella inchonensis se proporcionan el día del 20 nacimiento, e igualmente en un sitio separado, el día 21. Estos animales, y controles

inyectados con solución salina se pesaron a intervalos regulares durante 3 meses.

Procedimientos Se usan 9 ratones Balb C embarazadas de fase terminal.

25 Preparación de suspensión de bacterias muertas: Las suspensiones preparadas de cultivo de 10 días en caldo de antiespumante Sauton, se centrifugaron y se volvieron a suspender como 10 mg/ml en una solución salina tamponada de borato, se autoclavó y se almacenó a 4°C. Se diluyen 10 mg/ml, 1010 /mI 1/2 en borato proporcionando 5x109 y después diluyendo 1/10 en tampón borato proporcionando una concentración final de 107 en 20 µ para

30 uso.

Día 1

El día de nacimiento retirar los ratones recién nacidos individualmente e inyectar la

camada con 107 de suspensión muerta en la nuca y devolverlos a la madre.

Inyectar la camada de control con 20 µ litros de M15 se solución salina tamponada con borato en la nuca.

Camada 1 = 2 hembras + 3 machos (Rhodococcus coprophilus NCIMB 11211) Camada 2 = 2 hembras + 3 machos (Rhodococcus coprophilus NCIMB 11211) Camada 3 = 5 hembras + 3 machos (Gordonia bronchialis NC1 0667) Camada 4 = 3 hembras + 4 machos (Gordonia bronchialis NC1 0667) Camada 5 = 1 hembras + 1 machos (Solución salina tamponada con borato) Camada 6 = 3 hembras + 1 machos (Solución salina tamponada con borato) Camada 7 = 5 hembras + 3 machos (Tsukamurella inchonensis NC13040) Camada 8 = 5 hembras + 4 machos (Tsukamurella inchonensis NC13040) Camada 9 = 4 hembras + 5 machos (solución salina tamponada con borato)

Día 21

Destetar los ratones, sexarlos y separar las camadas en 2 grupos machos y hembras Pesar y volver a vacunar. Marcar los individuos en la cola marcando con un bolígrafo indeleble. Pesar y volver a marcar la cola durante 3 meses. La figura 1 demuestra los resultados de media de ganancia de pesos/camada de ensayo de hembras y controles en las 12 semanas de destete. La figura 2 demuestra los resultados de media de ganancia de peso/camada de ensayo de machos y controles en las 12 semanas de destete.

La ganancia en peso es la misma en todos los grupos, y solamente 2/57 animales murieron en los 3 meses. Ambos eran machos, que murieron justo después de ponerse juntos con otros machos después del destete. De este modo se puede concluir que la ganancia de peso y progreso de los animales no se afectó por las tres especies ensayadas.

EJEMPLO 7: El efecto sobre la inmunización de BCG medido mediante la respuesta de ensayo en la piel con tuberculina

Se proyectó modelo de ensayo de inmunomodulador, basado en el principio de que la vacunación con BCG induce una respuesta al ensayo en la piel con Tuberculina (una preparación soluble de bacilos de Tuberculosis), cuando se ensayaron 4 semanas más tarde. La reacción local se mide 24 horas, 48 horas y 72 horas después de inyección de Tuberculina. En el ratón, la reacción es usualmente mayor a las 24 horas cuando es un indicador de la respuesta de Th1 a los antígenos en Tuberculina. La reacción a las 48 horas es usualmente menor e incluye una contribución de Th2. La reacción a las 72 horas es a menudo un poco menor que a las 48 horas y es una respuesta de Th2. Esta reacción de Tuberculina después de BCG se puede modular mediante sensibilización anterior, de manera que los componentes Th1 y Th2 de la reacción reflejarán la naturaleza del reactivo de sensibilización.

Procedimientos

Ratones sensibilizados de acuerdo con el Ejemplo 6 cuando tenían 3 de edad se inyectaron con 106 BCG en 100 µl en la nuca en la mitad de cada ensayo y eel grupo de control.

A los 4 meses ensayo de tuberculina con reactivo T1475 1 mg/ml. Diluir 100 µ litros en 1,9 ml proporcionando una concentración final de 50 µgms/ml. Almacenar a 4ºC. La dosis es 2,5 µg en 50 µ litros proporcionada en la almohadilla de la pata trasera. La inflamación de la respuesta de tuberculina medida usando un micrómetro a las 24, 48 y 72 horas.

Resultados

La figura 3 muestra que Gordonia bronchialis potencia el efecto de TH1 a las 24 horas.

La figura 4 muestra que Tsukamurella inchonensis potencia la respuesta de TH1 a las 24 horas y suprime la respuesta de TH2 a las 72 horas

La figura 5 muestra que Rhodococcus coprophilus suprime tanto las respuestas de TH 1 como de TH2.

Conclusión

Cada una de las 3 especies indujo efectos diferentes en el ensayo de tuberculina después de la exposición a BCG:

Gordonia bronchialis indujo una respuesta potenciada de Th1, sin cambiar la respuesta de Th2. Rhodococcus rubber también tiene esta función.

Tsukamurella inchonensis potenció la respuesta de Th1 y reguló hacia abajo la respuesta de Th2.

Rhodococcus coprophilus reguló hacia abajo tanto las respuestas de Th1 como de Th2.

Proporcionado como un adyuvante cualquiera de estos reactivos modulan la respuesta inmune a un antígeno posterior.

Estos resultados muestran también claramente que la influencia de 2 inmunizaciones de sensibilización con cualquiera de las 3 especies representativas 3 de la invención persiste durante al menos 9 semanas después de la segunda inmunización.

EJEMPLO 8: Modelo de ensayo de inmunomodulador

Se proyectó modelo de ensayo de inmunomodulador, basado en el principio de que la vacunación con BCG induce una respuesta al ensayo en la piel con Tuberculina (una preparación soluble de bacilos de Tuberculosis), cuando se ensayaron 4 semanas más tarde. La reacción local se mide 24 horas, 48 horas y 72 horas después de inyección de Tuberculina. La reacción es usualmente mayor a las 24 horas cuando es un indicador de la respuesta de Th1 a los antígenos en Tuberculina. La reacción a las 48 horas es usualmente menor e incluye una contribución de Th2. La reacción a las 72 es a menudo un poco menor que a las 48 horas y es una respuesta de Th2. Esta reacción de Tuberculina después de BCG se puede modular mediante sensibilización anterior, de manera que los componentes Th1 y Th2 de la reacción reflejarán la naturaleza del reactivo de sensibilización.

El inmunoestimulador conocido, BCG se inyecta en la nuca de ratones jóvenes de 3 semanas de edad y la respuesta de tuberculina se midió 1 mes más tarde mediante inyección subcutánea de tuberculina en la almohadilla de la pata del ratón. La inflamación resultante es decir, la "respuesta a tuberculina " se mide después a las 24, 48 y 72 horas. La inflamación a las 24 horas se considera una respuesta mediada por Th1 y la inflamación a las 48 y 72 horas una respuesta mediada Th2 o tardía. BCG en el ratón sano estimula predominantemente una respuesta de Th1.

Procedimiento

(a) vial de 10 dosis de vacuna intradérmica de BCG (Evans Medical).

Reconstituir con 1 ml de agua estéril suministrada usando una jeringa y aguja dejando que se disuelva durante 5 minutos. Debe ser 1x107 /ml.

Usando una jeringa y aguja retirar toda la vacuna y transferirla a una botella de plástico bijou.

Diluir 1/10 0,15 ml en 1,35 ml de M15 solución salina tamponada con borato proporcionando 105 in 100 µ litros

La dosis es 105 en 100 µl proporcionada en la nuca del cuello.

(b) Tuberculina

T1475 1 mg/ml. Diluir 100 µl en 1,9 ml proporcionando una concentración final de 50 µgms/ml. Almacenar a 4°C. La dosis es 2,5 µg en 50 µl proporcionada por vía intradérmica en la almohadilla de la

pata trasera.

La respuesta a la tuberculina se mide a las 24, 48 y 72 horas usando un micrómetro

La figura 6 muestra la respuesta a la tuberculina de BCG después de un mes 1 comparada con los controles no vacunados.

(c) Preparación de suspensiones de ensayo

Los cultivos se desarrollan en caldo Sauton se recogen mediante centrifugación y se vuelven a suspender a una concentración de 10 mg/ml en M15 solución salina tamponada con borato y se almacenaron a 4°C.

1 0 mg/ml = 109 en 100 µl.

Diluir 1/10=108 en 100 µl.

Añadir 150 µl de 108 a 1,2 ml de M15 borato y añadir 150 µl de BCG.

La dosis es ahora 105 de BCG + 107 de organismo de ensayo en 100 µl inyectados en

la nuca del cuello.

Resultados

La figura 7 es un gráfico que demuestra la modulación inmune del efecto de BCG por tres especies de bacterias. Las respuestas de Tuberculina se miden a las 24 y 48 horas. Las especies representativas son (Na) Nocardia asteroides; (Gb) Gordonia bronchialis; y (Tp) Tsukamurella inchonensis.

La figura 8 es un gráfico que demuestra la modulación inmune de BCG/BCG+ por dos especies de bacterias. Las respuestas de Tuberculina se miden a las 24, 48 y 72 horas. Las especies representativas son (Rrh) Rhodococcus rhodocrous y (Dm) Dietzia maris.

La figura 9 es un gráfico que demuestra la modulación inmune del efecto de BCG por especies seleccionadas dentro del género Rhodococcus. Las respuestas de Tuberculina se miden a las 24, 48 and 72 horas. (Rrh) Rhodococcus rhodocrous; (Rru) Rhodococcus ruber; (Rrhod) Rhodococcus rhodnii; (Reop) Rhodococcus coprophilus; (Ropa) Rhodococcus opacus; (Reryth) Rhodococcus erythopolis.

La figura 10 es un gráfico que demuestra la dosis óptima para Rhodococcus ruber usando BCG modificado con soluciones log de Rhodococcus ruberfrom 108 a 104 comparada con BCG solo. Conclusión

Este ensayo de selección demuestra que mezclando las suspensiones de ensayo con BCG y comparando con BCG solo, 28 días después del ensayo de tuberculina, como una medida de respuesta a BCG, se ha regulado o modificado. En este modelo simple, la inmunorregulación se muestra como una depresión en el tamaño de la respuesta a tanto 24 como 48 horas. Esto se puede además investigar en experimentos a más largo plazo en los que la sensibilización con la suspensión de ensayo se lleva a cabo algunas semanas antes De la exposición con BCG y posterior ensayo de Tuberculina.

EJEMPLO 9: Para mostrar que las suspensiones de células enteras de las bacterias son más eficaces en la modulación de la inmunidad que los extractos de células, se preparan preparaciones comparativas y se ensayan en un sistema de ensayo en la piel de exposición a BCG / Tuberculina.

100 mg de Tsukamurella inchonensis se suspenden en solución salina tamponada (pH 8,0) en un tubo de centrífuga pesado previamente a una concentración de 10 mg de peso húmedo de organismos/ml. Los 10 ml completos tratados en un ultrasonicador para romper la mayoría de los organismos (70 -80%).

El sonicado se centrifuga a 15.000 rpm durante una hora en un tubo y el sobrenadante se retiró 0,2 µn como el extracto de ensayo. El tubo, con depósito, se pesa de nuevo para determinar la proporción de organismos enteros que no se han roto más los desechos de paredes celulares etc. Esto es 64mg. El volumen de extracto equivalente a 0,01 mg de T.inchonensis se estima después y esto se compara con el equivalente 0,01 mg (aproximadamente a 107) de bacilos enteros.

Grupos de 10 animales reciben inyecciones del extracto o suspensiones de células enteras de bacilos (equivalente a 0,01 mg/dosis) o placebo de solución salina tamponada en la nuca del cuello en el destete y 7 días después. Dos semanas después los animales se expusieron con BCG. 28 días más tarde. Se realiza el ensayo de Tuberculina con lecturas tomadas a las 24, 48 y 72 horas.

Resultados:

Las respuestas de tuberculina en ratones después de la Vacunación de BCG proporcionó después de la sensibilización con nada, tampón borato, células enteras de T.inchonensis o antígenos solubles (sonicado del filtrado).

La respuesta a la Tuberculina después de BCG proporcionada a animales no sensibilizados:

Nº 24 horas 48 horas 72 horas 6

9 ± 4,2 7,7 ± 3,39 3,67 ± 3,5

La respuesta a la Tuberculina después de BCG proporcionado a animales sensibilizados con tampón borato solo:

6 9 ± 5,7 6,3 ± 7,1 3,17 ± 2,93

5 La sensibilización con tampón borato no tenía ningún efecto en el ensayo de Tuberculina de BCG. La respuesta a la Tuberculina después de BCG proporcionado a animales sensibilizados con T. inchonensis inactivados por calor:

6 7,3 ± 1,03 6,17 ± 3,87 1,5 ± 2,07

10

La sensibilización con T. inchonensis enteros disminuye las respuestas de Tuberculina, notablemente a las 72 horas (sensibilidad de Th2). La respuesta a la Tuberculina después de BCG proporcionado a animales sensibilizados con preparación soluble de T. inchonensis (filtrado sonicado):

15

6 6,8 ± 6,8 11,0 ± 8,0 4,6 ± 6,8

La sensibilización con filtrado sonicado de T. inchonensis incrementa las respuestas a las 48 horas y 72 horas (sensibilidad de Th2). Esto es probablemente debido a un incremento en la producción de anticuerpos inflamatorios para compartir antígenos entre BCG y T.

20 inchonensis. Los resultados muestran que la sensibilización con sonicado da como resultado una respuesta que es diferente de la sensibilización con organismos muertos enteros. Las investigaciones preliminares sugieren que las células enteras de la bacteria son más eficaces en la modulación de la inmunidad que los extractos celulares.

25 EJEMPLO 10: Estudio de angioplastia de modelo de rata de enfermedad vascular

El modelo se basa en una reducción inducida de engrosamiento de las capas de la

íntima de la arteria carótida común de ratas observado después de angioplastia de balón. Los grupos experimentales consistían de 15 ratas macho cada una: El grupo 1 eran ratas inyectadas con 0.1 ml de de solución salina tamponada con

30 borato a pH 8 por vía subcutánea (CONTROL) El grupo 2 eran ratas inyectadas con 0,1 ml de solución salina tamponada con borato a pH 8 por vía subcutánea que contenía bacterias saprofitas ambientales Gordonia bronchialis

inactivadas por calor

El grupo 3 eran ratas inyectadas con 0,1 ml de solución salina tamponada con borato a pH 8 por vía subcutánea que contenía bacterias saprofitas ambientales Rhodococcus coprophilus inactivadas por calor

El grupo 4 eran ratas inyectadas con 0,1 ml de solución salina tamponada con borato a pH 8 por vía subcutánea que contenía bacterias saprofitas ambientales Tsukamurella inchonensis inactivadas por calor

El grupo 5 eran ratas inyectadas con 0,1 ml de solución salina tamponada con borato a pH 8 por vía subcutánea que contenía bacterias saprofitas ambientales Mycobacteria vaccae inactivadas por calor (control positivo).

Transcurso del tiempo experimental de Procedimientos:

A todos los animales se les dejaron 7 -10 días para acomodarse antes del inicio del experimento el Día 0. Se pesaron el Día 0 a intervalos semanales después de esto como una medida de bienestar.

Las ratas en todos los grupos se alimentaron con un pienso de rata estándar y se dejó libre acceso al agua a voluntad.

El día 0 las ratas se inyectaron por vía subcutánea con agente de control o activo como se ha descrito anteriormente (la dosis de organismo era 50 microgramos en 0,1 ml, es decir, 500 microgramos/ml)

El día 21 las ratas se inyectaron con una segunda dosis de agente de control / activo por vía subcutánea (la dosis de organismo era 100 microgramos en 0,1 ml, es decir, 1 mg/ml)

El día 49 se recogieron 0,75 ml se sangre de la vena de la cola de cada rata y se almacenaron de manera apropiada para permitir que el ARN se las citocinas se mida más tarde.

El día 56 todas las ratas se sometieron a trauma con globo en la arteria carótida común izquierda bajo anestesia.

El día 70 todas las ratas se pesaron y se sacrificaron mediante un procedimiento de Programa 1 y las arterias carótidas, bazo, riñón izquierdo, parte del pulmón izquierdo, parte del lóbulo medio de hígado, corazón y aorta torácica se recogieron para análisis inmunológico. También se recogió sangre para análisis adicionales.

Secciones trasversales de cada carótida izquierda se cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las capas musculares y de la íntima se midieron separadamente microscópicamente y se expresaron como áreas de la sección transversal de del vaso. Se usarán secciones adicionales para inmuno-histoquímica para determinar los tipos de células inmunes que están presentes en las citocinas que se están liberando.

Se recogieron muestras de sangre los días 49 y 70 se almacenaron de una forma adecuada para análisis posteriores de ARN de citocinas, quimiocinas y otras sustancias relacionadas con la enfermedad vascular.

Resultados

Los resultados de los pesos corporales de ratas se muestran en la Tabla más adelante y también en la figura 11. Tabla: Pesos de las ratas en g entre el día 0 y el día70 del ejemplo 10

Grupo: Día

0: 7 14 2 28 35

1: 352 368 380 392 400 417

2: 359 377 392 409 424 437

3: 350 366 381 395 406 417

4: 360 376 388 402 411 422

5: 353 370 385 395 408 417

Día: Angioplastia

42: 49 56 63 70

424: 434 437 413 428

443: 456 460 447 460

424: 433 439 422 439

428: 439 443 428 446

427: 433 438 424 443

Día: Angioplastia

1v2
1v2

P < 0,03: P < 0,01

Los animales sensibilizados con inyecciones de Gordonia bronchialis (2) muestran un incremento de peso significativo sobre el grupo placebo (1) en dos momentos

Los resultados de las mediciones del espesor de la íntima y media se muestran en la

Tabla más adelante y los resultados para las relaciones Intima/media ratios se muestran en la

figura 12.

Tabla: Los valores medios para la íntima y media en diferentes grupos del Ejemplo 10.

Íntima Media

Placebo 118233 ± 48506 125434 ± 35064 n = 31*

G bronchialis 65167 ± 25068 131833 ± 39016 n = 41

R. coprophilus 89506 ± 35109 149469 ± 7913 n = 34 T.inehonensis 66153 ± 37546 147426 ± 17494 n = 28 M.vaccae 50924 ± 27363 139523 ± 20206 n = 38

* número de secciones estudiadas

Diferencias entre los valores Placebo

G. bronchialis: p < 0,001 n. s.

R. coprophilus.: p < 0,01 p < 0,001

T. inchonensis: p < 0,001 p < 0,005

M. vaccae: P < 0,001 p < 0,05

10

Las diferencias altamente significativas se observan entre receptores de los agentes activos y el placebo. Los resultados reducidos para la íntima reflejan una reducción en la hiperplasia de la mioíntima después de la angioplastia. Esto se produce con las cuatro preparaciones bacterianas, lo más

15 notable con G. bronchialis, T. inchonensis y M. vaccae. Este efecto podría hacer una gran contribución al éxito de las angioplastias.

La pérdida de espesor de la media en el grupo placebo se mantiene en los grupos de tratamiento activos, lo más notable después de R. coprophilus y T. inchinensis. La combinación de espesor de la íntima reducido y espesor de la media mantenido, observado 20 mejor después de tratamiento con T. inchonensis, puede probar un progreso importante en la

reducción potencial de rechazo de injerto crónico.

EJEMPLO 11: Miocarditis en ratas infectadas con Trypanosomiasis

Preparación de animales

5

10

15

20

25

30

40

i) El día uno ratas macho viejas "1" se inyectaron en la nuca del cuello con 107 Gordonia bronchialis, Rhodococcus ruber, Rhodococcus coprophilus, Tsukamurella inchonensis o Mycobacteria vaccae en un volumen de 0,1 ml mediante inyección subcutánea. (Esto se llevó a cabo en dos rondas experimentales, como se muestra en la tabla más adelante).

ii) Después de 14 días, a las ratas macho "1" se les proporcionó una segunda inyección subcutánea con 107 de los mismos organismos en 0,1 ml en el lado izquierdo. iii) Los animales se expusieron con Trypanosoma cruzi viva el día 21 por vía subcutánea con 106 tripomastigotas de la cepa Tulahuen de T. cruzi. Las tripomastigotas de sangre infecciosas se mantuvieron mediante pasaje en serie en ratones CBi. iv) Formas del torrente circulatorio de T. cruzi se valorarn en condiciones convencionales, mediante observación microscópica directa de 5 µI de sangre venosa de la cola heparinizada, en los días 7 y 14 días después de la infección (pi). Los datos se expresan como número de parásitos/50 campos. v) 7 días más tarde una inyección subcutánea adicional de 107 del mismo organismo se administró en un volumen de 0,1 ml en el lado derecho.

Los animales de control solamente recibieron la provocación con T. cruzi. Otro grupo de animales se dejaron sin provocar para propósitos de comparación.

PARASITEMIAS

Día 7: Día 14

GRUPO: n Media ± DE Media (categoría) Media ± DE Media (categoría)

Control de T. cruzi: 14 2,35 ± 1,44 2 (1 -5) 1,07 ± 1,07 1 (0 -3)

M. vaccae: 17 1,17 ± 1,01 1 (0 -3) 1,29 ± 2,1 0 (0 -7)

R. ruber: 17 0,65 ± 0,78 0 (1 -2) 0,69 ± 1,01 0 (0 -3)

P<0,01 para M. vaccae y P = 0,001 para R. ruber comparado con el control de T.cruzi

Preparación de animales

El día uno ratas macho viejas "1" se inyectaron en la nuca del cuello con 107 Gordonia bronchialis, Rhodococcus coprophilus, o Tsukamurella inchonensis en un volumen de 0,1 ml mediante inyección subcutánea. (Esto se llevó a cabo en dos rondas experimentales, como se muestra en la tabla más adelante).

Después de 14 y 28 días, a las ratas macho "1" se les proporcionó una segunda y tercera inyección subcutánea con 107 de los mismos organismos en 0,1 ml en el lado izquierdo.

Los animales se provocaron con Trypanosoma cruzi viva el día 21 por vía subcutánea con 106 tripomastigotas de la cepa Tulahuen de T. cruzi. Las tripomastigotas de sangre

infecciosas se mantuvieron mediante pasaje en serie en ratones Cbi. Los animales control sólo recibieron la exposición con T. cruzi. Otro grupo de animales se dejó para propósitos de comparación.

5

Día 7: Día 14

GRUPO Control de T. cruzi G. bronchialis R. coprophilus T. inchonensis: n 6 4 5 6 Media ± DE 3,83 ± 4,36 3,25 ± 3,3 1,6 ± 0,89 3,83 ± 5,64 Media (categoría) 4,5 (1 -22) 2 (0-8) 3 (1-8) 5 (0 -20) Media ± DE 3,5 ± 2,89 0,33 ± 0,58 1,0 ± 1,73 2,0 ± 1,83 Media (categoría) 2 (0 -6) 0,5 (0 -5) 0 (0 -3) 2 (0 -18)

P = 0,032 el día 7 y P = 0.05 el día 14 para R. coprophilus comparado con el control de T. cruzi (análisis de varianza de Kruskall-Wallis).

Anticuerpos IgG en suero específicos para T. cruzi 28 días después de la infección con

T. cruzi.

Valores de densidad óptica del ensayo ELlSA

Control de T. cruzi: 0,3

G. bronchialis: 1,4

R. coprophilus: 0,5

T.inchonensis: 0,9

Células CD4+ve en el miocardio 7, 14 y 21 días después de provocación con T. cruzi.

Día 7 p.i.: Día 14 p.i. Día 21 p.i

Control de T. cruzi: 26,4 ± 4,5 25,6 ± 8,4 44,6 ± 10,5

G. bronchialis: 48,6 ± 7,5 63,4 ± 8,2 74,3 ± 10,8

R. coprophilus: 53,2 ± 9,9 50,0 ± 8,1 32,9 ± 8,6

T. inchonensis: 40,0 ± 8,5 38,6 ± 8,2 44,5 ± 9,2

El músculo cardíaco de sujetos de ensayo adicionales se analizarán 3 meses después de infección con T. cruzi para una determinación de miocarditis crónica. Investigaciones preliminares han mostrado que Mycobacteria vaccae tiene un efecto beneficioso en la reducción de miocarditis crónica y se espera de los datos anteriores que algunos organismos de ensayo tengan efectos beneficiosos en la prevención de miocarditis crónica.

EJEMPLO 12: Uso de T. inchonensis para reducir hiperplasia de la mioíntima (MIH) después de angioplastia coronaria

Enfermedad vascular aterosclerótica es la causa más común de muerte e incapacidad en el mundo. El desarrollo de aterosclerosis es un proceso complejo, con deposición de lípidos que conduce a estrechamiento de arterias y disfunción endotelial. La evidencia es el desarrollo de que las respuestas inflamatorias en los sitios de lesión vascular juegan un papel clave en la disposición a aterosclerosis (Schett G, et al J Clin. Invest. 1995, 96: 2569 -2477). La ruptura de las placas ateroscleróticas es la causa más común de oclusión arterial súbita que conduce a síndromes isquémicos agudos tales como infarto de miocardio, apoplejía y oclusión arterial periférica. Después de un episodio isquémico agudo, una serie de marcadores inflamatorios están elevados incluyendo ciertas citocinas y proteína C reactiva (CRP) (George et al Circ. Res. 2000; 86: 1203 -1210; Hansson et al Arteriosclerosis 1989; 9: 567 -578; Yokota et al J Intern Med. 1995; 238; 479 -489; Ikeda J. Mol. Cell. Cardiol. 24 de Junio de 1992 (6): 579 584; Hojo et al Heart Julio de 2000; 84 (1) 83 -7.

La expresión de proteínas de estrés, incluso en los sitios de daño de estrés completo a la íntima, conduce a una respuesta inmune local con liberación de citocinas en la media e íntima de acuerdo con el tiempo de la respuesta inmune que predomina en el individuo en el tiempo (Chan et al Eur J. Vasc. Enodvasc. Surg. nov. de 1999 18 (5): 381 -5; Mukherjee et al Thromb. Haemost 1996; 75: 258 -260; Wright Heart Vessels 2000; 15: 18 -22; Sanchez-Margalet et al Clin Chem Lab. Med agosto de 2002; 40 (8); 769 -774). Algunas citocinas conducen al engrosamiento de la íntima y un cambio de fenotipo en las células de músculo liso de la media, conjuntamente dando como resultado hiperplasis de la mioíntima (MIH). La liberación local de otras citocinas da como resultado la reparación de la íntima con una obstrucción mínima de flujo sanguíneo (Hansson et al Proc. Natl Acac. Sci. Estados Unidos 1991; 88: 10530 -10534; D'Elios et al Transplant Proc 1998; 30: 2373 -7; Feldman et al Circulation 29 de febrero de 2000; 101 (8): 908 -916; Tashiro Coron Artery Dis marzo de 2001; 12(2): 107 -13; Hojo et al Aterosclerosis mayo de 2001; 156 (1): 165 -170; Yang et al Circulation 7 de marzo de 2000; 101 (9); 1019 -26; Anguera et al Am. Heart J. nov. de 2002 144 (5): 811-817; Takase et al Can J. Cardiol. Julio de 2003; 19 (8): 902 -906; Tutar et al Circulation 30 de septiembre de 2003; 108 (13):1581 -1584 E-pub 15 de septiembre de 2003; Del Prete et al Blood 1 de julio de 1995; 86 (1): 250 -257). El propósito de nuestra propuesta es asegurar que el último mecanismo está en el sitio.

El nexo entre hiperplasia de la mioíntima (MIH) e inflamación:

Los mecanismos inmunes que conducen al desarrollo y mantenimiento de MIH dan como resultado un incremento en el estrés asociado a flujo sanguíneo restringido, el establecimiento de las estrías grasas y las placas de aterosclerosis. Incremento en los niveles de anticuerpo de IgG2 a las proteínas de estrés expresadas sobre las células de la íntima dañadas de manera mínima dan como resultado la inducción local de la cascada de complementos y destrucción de las células dañadas (Schett et al (supra); Chan et al (supra); Crisp et al J. Herat Lung Transplant 1994; 81 -91; Johnson et al Atherosclerosis 1990; 84: 111 -119). En este sitio los Linfocitos T se atraen para que inicien la producción de citocinas local (Hansson 1991 (supra); D'Elios (supra); Mickelson et al J Am Coll Cardiol. 1996 Aug; 28(2): 345-53). Una estría grasa se establece sobre la íntima dañada debajo de la cual la actividad de citocinas, beneficiosa o prejudicial, tiene lugar de manera que determina la reparación o progresión aterosclerótica. Como un resultado no específico de la inflamación local, las citocinas interleucina (IL)-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) inducen IL-6 que a su vez potencia la biosíntesis de proteínas en fase aguda (por ejemplo, fibrinógeno, CRP) por hepatocitos (Ikeda et al (supra); Hojo et al (supra); Spaziani et al Ital Heart J. octubre de 2002: 3 (10): 593 -597).

La MIH se puede considerar como una respuesta de curación exagerada a la lesión vascular después de una intervención coronaria percutánea (PCI). Una cascada de episodios, que eventualmente conduce a estenosis u oclusión del vaso, se puede producir, incluyendo:

•: pérdida de la membrana basal

•: migración de células de células de músculo liso vascular (VSMC) desde la media a la íntima.

•: Proliferación de VSMC y cambio fenotípico a un tipo de célula fibroblástica más secretora

•: Aumento de la producción de la matriz extracelular

La reestenosis clínica se produce después de intervención coronaria percutánea (PCI) angioplastia de balón y afecta aproximadamente al 30% de tales casos en la práctica clínica. Es la causa principal de fallo de tales procedimientos y tratamiento de los vasos / injertos con estenosis y bloqueados resultantes es problemático. Los mecanismos celulares subyacentes que conducen a MIH no son bien entendidas aunque estén asociados a un predominio de células T auxiliares de tipo 2 (Th2), que producen las citocinas IL-4 e IL-5, en presencia de las cuales TNF-a llega a dañar el tejido (Hernandez-Pando et al lmmunology 1994; 82: 591 -595). Hasta la fecha no se ha desarrollado ninguna terapia que pueda evitar de manera eficaz el proceso. Sin embargo el papel de una respuesta inflamatoria mediada localmente que después puede llegar a ser un fenómeno más sistémico que se acepta como una parte clave del fallo de PCI. La relevancia clínica del proyecto complete se refiere a las muy numerosas intervenciones coronarias percutáneas que se realizan anualmente en el reino Unido UK (aproximadamente 40.000) y en todo el mundo. La nueva generación de dilatadores vasculares permanentes que eluyen fármaco tienen muchos menores porcentajes de reestenosis que los dilatadores vasculares permanentes "de metal sin protección", pero es poco probable que eviten la reestenosis completamente y son caros. Una terapia segura, relativamente económica, complementaria para prevenir MIH, tal como la inmunoterapia propuesta en este protocolo, podría tener un impacto clínico importante.

Ciertas especies bacterianas poseen la capacidad, cuando están muertas, de regular la respuesta inmune a antígenos, tales como proteínas de choque térmico, presentadas con ellos. Las suspensiones de tales bacterias muertas son muy seguras de usar, y la modulación inmune deseada se puede obtener usando diversas especies. Recientes estudios en nuestro laboratorio muestra que pacientes con aterosclerosis pueden tener inmunidad de Th1 disminuida comparada con los controles de la misma edad. De este modo las respuestas inflamatorias a lesión de vasos se puede modificar alterando el patrón de respuesta mediante inmunoterapia apropiada.

Ha existido mucho interés en el papel que las citocinas Th1 y Th2 juegan en otras diversas enfermedades humanas tales como tuberculosis, asma, artritis reumatoide y un número de afecciones autoinmunes (D'Elios M, Del PG. Transplant Proc 1998; 30: 2373 -7; Shirakawa T, et al. Science 1996; 275: 77 -79; y Hernández-Pando R, Rook GAW. Inmunology 1994; 82: 591 -595). Las células Th1 producen IFN-y, interleucina-2 (1 L-2) y TNF. Las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 (Lin E, et al. Surgery 2000; 127: 117 -126). Ambos tipos de células T pueden provocar inflamación mediada por células, y ambas conducir a la formación de anticuerpos, aunque diferentes subclases de inmunoglobulina están implicadas, y la cantidad de anticuerpo que acompaña una respuesta de Th2 es usualmente mucho mayor. Cuando la regulación de respuestas de Th1 falla, se pueden producir enfermedades autoinmunes mediadas por Th1 tal como esclerosis múltiple (Genain CP, et al. Science 1996;

274: 2054 -2057). Las respuestas de Th2 sin regular pueden conducir a una variedad de patologías, incluyendo reacciones alérgicas, autoinmunidad mediada por Th-2 y también inflamación fibrótica crónica tal como la observada en fibrosis pulmonar idiomática (IPF) (Wallace W, et al. Clin. Exp. Inmunol. 1995; 101: 436 -441; y Du Bois RM. New Engl. J. Med. 1999; 341: 1302 -1304).

Tales respuestas de TH2 a los antígenos de las células de músculo liso vasculares (VSMC) y endoteliales y juegan un papel causal similar en la MIH clínica.

En algunas situaciones, tales como tuberculosis y artritis reumatoide la producción simultánea de citocinas Th1 y Th2 pueden dar como resultado daño de tejido adicional. Al menos un mecanismo para esto es el aumento de la actividad necrotizante de los tejidos de TNF-ү asociado a Th1 en la presencia de las citocinas de Th2 IL-4 e IL-5. La parte jugada por tales actividades combinadas es incierta en MIH, pero enfermedades micobacterianas tales como tuberculosis y enfermedad de ganado de Johne, en las que se produce, se sabe que predisponen a aterosclerosis (Alibasoglu M, et al. Am J Vet Res. enero de 1962;23: 49 -57).

La inflamación está ahora ligada a la progresión de enfermedad vascular aterosclerótica. La lesión vascular, que se produce de forma natural mediante la rotura de la placa espontánea, o mediante angioplastia, estimula las respuestas inflamatorias que pueden afectar de manera adversa a la curación y provocan hiperplasia de la mioíntima. Una preparación derivada de una bacteria inactivada por calor de acuerdo con la presente invención modula la respuesta inmune a lesión vascular en pacientes que experimentan intervención coronaria percutánea para enfermedad arterial coronaria sintomática. La respuesta inflamatoria medida mediante los niveles en sangre venosa de anticuerpos a las proteínas de estrés, una gama de citocinas, cortisol, deshidro epi-androsterona (DHEA) y proteína C reactiva estará modificada en los sujetos a los que se les proporciona la preparación activa. Un tamaño de muestra de 50 pacientes será suficiente para detectar diferencias de aproximadamente 20% en los niveles de estos marcadores.

La modulación inmune puede afectar a la respuesta inflamatoria: El modo de acción de T. inchonensis inactivada por calor se cree que es un regulador de la maduración de las células T en relación con los antígenos compartidos entre la preparación bacteriana y los de los tejidos humanos. De manera notable éstos incluyen las proteínas de estrés de 60 y 70kDa de origen mitocondrial conocidas por compartir algo del 60% de su homología de la longitud de la cadena de aminoácidos con las proteínas inactivadas por calor de 65 y 70kDa bacterianas. La actividad reguladora de T. inchonensis es disminuir los mecanismos de Th2 y potenciar los mecanismos de Th1, cambiando la respuesta a la expression en la intima de proteínas de estrés, y regulando el fenotipo de VSMC mediante la producción local de citocinas. Una respuesta de Th2 predominante con altas titulaciones de anticuerpos a proteínas de estrés conduce a la destrucción de células de la íntima que expresan estas proteínas mediante la cascada de complementos, con liberación local de citocinas de tipo 2 (IL-4, IL-5 e IL-13), modificando el fenotipo de VSMC para una replicación rápida. Con una respuesta de Th1, células de la íntima que expresan proteínas de estrés se piensa que se destruyen de manera individual por las células T liberando citocinas de tipo 1 (IL-2, IFN-a, y TNF-a) induciendo menos cambios fenotípicos proliferativos en las VSMC y reparación del tejido local. El primero de estos mecanismos conduciría a un daño adicional y reestenosis, mientras el segundo debe conducir a la reparación de la íntima sin estimulación de la reestenosis.

Tales cambios en la actividad de las células Th acompaña a una disminución de cortisol en plasma con un incremento de DHEA en plasma, y una regulación eficaz de la inflamación que se produce en una vuelta a los valores normales para la proteína C reactiva etc.

Aunque sin querer estar ligado a ninguna teoría, una diana autoinmune en la pares de los vasos puede ser la proteína de choque térmico (HSP) 70.

Los mecanismos mediante los que la inmunoterapia modifica la respuesta inflamatoria después de lesión vascular no están completamente entendidos, pero se cree que la combinación de actividad adyuvante específica de T. inchonensis, conjuntamente con antígenos compartidos entre los bacilos y los tejidos, dan como resultado la regulación de inmunidad de manera que reduce el daño de tejido inmunizado. La lesión endotelial provocada por angioplastia puede ser aumentada por la respuesta inmune del huésped a HSP. Estas HSP en la forma estrechamente similar de proteínas de estrés se producen mediante células estresadas que han estado implicadas en la patogénesis y la patofisiología de diversos trastornos inmunológicos incluyendo aterosclerosis (Xu et al Arterioscler. Thromb. 1992; 12: 789 -799). Es probable que estén presentes en células endoteliales y del músculo liso en la región de una angioplastia. En efecto la proteína hsp/de estrés actúa como un auto-antígeno, que después se puede dirigir por el sistema inmune de una manera apropiada. Esta situación se puede inducir experimentalmente por la inmunización con una hsp miobacteriana de reacción cruzada (hsp65) que conduce a daño endotelial en conejos y ratones. El efecto parece ser dependiente de la IL-4 secretada por los linfocitos Th2, y está probablemente mediada por anticuerpo, como se ha descrito anteriormente.

La relevancia de estas observaciones de estudios animales animal para el hombre se sugiere por la capacidad de anticuerpo humano purificado por afinidad eluido de columnas de hsp65 para dañar las células endoteliales humanas estresadas in vitro (Schett et al (supra)). Este hallazgo sugiere que el anticuerpo reacciona de manera cruzada con hsp60, que es el homólogo humano de hsp65, y puede ser accesible al anticuerpo cuando se expresa sobre las membranas de células endoteliales estresadas. Se ha sugerido que tales anticuerpos que se unen a las células endoteliales estresadas pueden ser un factor en la producción de arteriopatía coronaria después de transplante de corazón (Crisp et al (supra)). Mukherjee et al. No mostraron asociación entre los niveles preoperativos de anticuerpos con hsp65 y reestenosis coronaria, pero mostraron que esos pacientes donde los niveles de tales anticuerpos caían después de angioplastia eran menos probable para que tuvieran reestenosis

(Mukherjee et al (supra)). No determinaron la subclase de IgG a la que los anticuerpos a los que pertenecían hsp 65, y los niveles reducidos registrados se podrían haber debido a cambio a IgG4 (anticuerpo asociado a Th1). De hecho el papel de los anticuerpos para hsp puede ser complejo, debido a que los pacientes con enfermedad vascular no tenían solamente incrementado el anticuerpo, sino que también tenían elevado los niveles de las proteínas hsp/de estrés ellos mismos (Wright et al (supra)). De este modo una caída evidente de los niveles de anticuerpos puede solamente reflejar un incremento en los niveles de la proteína o de anticuerpo que se une a la proteína. Además las proteínas hsp/de estrés tienen efectos reguladores, y se unen a células de músculo liso arterial, que conduce a una supervivencia potenciada sin un requerimiento para la internalización (Johnson et al (supra)).

El pretratamiento de pacientes debido al sometimiento a la intervención coronaria percutánea con un reactivo inmunomodulador preparado a partir de Tsukamurella inchonensis inactivada por calor reducirá los procesos inflamatorios, reduciendo la producción de hiperplasia de la mioíntima local y posterior formación de ateroma y reestenosis de la arteria. Esto será reconocible por los cambios en el contenido en citocinas en la sangre periférica usando el procedimiento muy sensible de "Luminex", midiendo 22 citocinas diferentes. También será detectable mediante cambios en los niveles de ciertas proteínas de estrés y de anticuerpos para ellos, y mediante cambios en cortisol en suero, deshidroepiandrosterona (DHEA), y sus derivados.

Para estudiar el efecto de inyecciones de una preparación inactivada por calor de Tsukamurella inchonensis en (i) respuesta inflamatoria, medida por los niveles de Interferon-y, TNF-α, IL-6, IL-10, (ii) otras medidas de regulación por células T auxiliares y functción, (iii) niveles de proteínas de estrés circulantes y los anticuerpos para ellos, (iv) proteína, y (5) niveles en plasma de cortisol y deshidro epiandrosterona, observados después de angioplastia coronaria percutánea (PCI) electiva; se usará un estudio de grupo paralelo controlado doble ciego aleatorio.

Se pueden elegir para tomar parte pacientes que requieren PCI por razones clínicas. El tamaño de estudio es de 50 pacientes que se distribuirán al azar para terapia inmune con T inchonensis o un vehículo inactivo. Los pacientes recibirán inyecciones, 6 semanas y 3 semanas antes de la angioplastia y una tercera inyección 4 semanas después del procedimiento. Los marcadores de inflamación se medirán antes de la primera inyección, justo antes del procedimiento, 24 a 48 horas después del procedimiento y 6 -8 semanas después del procedimiento.

El estudio tendrá 2 fases; en los primeros 10 pacientes aleatorios que vayan a recibir producto activo o placebo se investigarán todos los parámetros mencionados. En la segunda fase, los pacientes restantes se investigarán mediante procedimientos seleccionados como los más apropiados de la primera etapa.

La primera inyección se administrará por vía intradérmica en la parte superior del brazo

o área del hombro 6 semanas antes de la angioplastia programada y una segunda inyección se administrará 3 semanas más. El procedimiento se realizará 3 -5 semanas después de la segunda inyección, y una tercera y una final inyección se administrará 4 semanas después del procedimiento. La PCI debe tener lugar tan rutinariamente como se indica y se debe hacer un seguimiento a las 6 -8 semanas que deben coincidir con la cita clínica apropiada. Muestras de sangre para marcadores inmunológicos e inflamatorios se deben tomar al comienzo del experimento (antes de la primera inyección de terapia inmune o de placebo), inmediatamente antes del procedimiento de PCI, 24 -48 horas después del procedimiento de PCI procedimiento, y 6 -8 semanas después del procedimiento de PCI.

Protocolo de muestreo de sangre: muestras de 10 -15 ml de sangre venosa se recogerán en cada una de las 4 ocasiones. Éstas serán para ensayos hematológicos e inmunológicos de rutina, para una batería de determinaciones de de citocina y quimioquina en suero, para la medición de los niveles de proteínas de estrés circulantes y los anticuerpos para ellos, para la determinación de cortisol y DHEA en plasma, para la medición de marcadores inflamatorios y enfermedad vascular y para almacenamiento de ARN para análisis de la producción de citocinas intracelulares.

Detalles de preparación de terapia inmune: Las preparaciones serán de M/15, solución salina fisiológica sin pirógenos tamponada con borato (pH 8) (placebo), o de una suspensión de organismos inactivados por calor de las especies de actinomicetos aerobios de Tsukamurella inchonensis, suspendidas a 10 mg/ml en el mismo tampón borato.

Los bacilos se desarrollaron sobre un medio líquido no antigénico, producto no animal, (aprobado por Veterinary Medicines Directorate tanto como virus animales). La incubación fue en un baño de agua en agitación a 32°C. Los bacilos se recogieron cuando se obtuvo un buen crecimiento después de 10 días de incubación.

El placebo y suspensión bacteriana se distribuyeron en viales multidosis de 2 ml estériles, en 0,5 ± 0,1 ml volúmenes para dosificación individual. Los viales se autoclavaron a 121°C durante 15 minutos en un autoclave mantenido de manera regular con indicadores de eficacia Después de enfriar los viales se marcaron y se almacenaron a 4° ± 1ºC en cajas dedicadas al estudio.

Aleatorización: Esto será mediante la producción de secuencia al azar generada por ordenador de número, 1 a 10 y 11 a 60 (que cubre los pacientes que están fuera o accidentes a los viales).

El marcado de viales puede será con el número de estudio de paciente y A, B, o C para indicar si se va a usar para la primera, segunda o tercera inyección (se unirá una etiqueta desechable, autoadhesiva a cada vial que se puede adherir a las notas del paciente frente a los datos administrados). Los viales de placebo y producto activo se marcarán u se etiquetarán

de manera similar con el fin de usar en las cajas, siguiendo un esquema de aleatorización generada por ordenador. La administración de las intervenciones serán por inyección intradérmica en la piel en los músculos deltoides alternativos, comenzando con el hombro izquierdo. El vial correcto para

5 el paciente se tomará del refrigerador. Inmediatamente antes de ponerse en una jeringa, el vial se agitará vigorosamente durante 20 segundos para suspender los bacilos particulados. Después 0,1 ml se retirarán en una jeringa de insulina "BD Microfine+ 1 ml de U-1 00 con una aguja de 0,33 mm (29G)x12.7 (fusionada) ", e inmediatamente se administrarán, teniendo cuidado de levantar una pequeña área de piel de naranja. Se debe inyectar la dosis completa

10 de 0,1 ml. Después de la inyección, el vial restante con su contenido se devolverá a una caja especial en el refrigerador para futura comprobación, si es necesario.

Tabla de procedimientos

Procedimiento/episodio: Línea base Tiempo 0 3 semanas 6 semanas + 1 -2 días 10 semanas 14 semanas

Comprobación de admisibilidad: imagen2

Consentimiento

Aleatorización

Historia y física

Intervención de ensayo

Sitio de inyección de comprobación: imagen2 imagen2 imagen2 imagen2

Muestra de sangre: imagen2

PCI

Comprobación de episodios adversos: imagen2 imagen2 imagen2 imagen2

Seguimiento final

15 Las intervenciones de estudio se realizarán en 3 ocasiones, 2 antes de angioplastia y 1 después. Las 2 primeras deben ser con 21 ± 3 días de separación a la angioplastia debe seguir la segunda inyección en 28 -52 días y la tercera inyección de tratamiento de estudio debe ser 28 ± 3 días después de angioplastia (es decir, 52 -80 días después de la segunda inyección). Resultados de estudio: El principal resultado de interés son marcadores en suero que

20 reflejan la modulación inmune y cambios en los niveles de las reacciones de fase aguda como

indicadores de inflamación. Se analizarán muestras de sangre para la determinación de una diversidad de marcadores pero las mediciones del resultado principal del estudio serán una comparación de las diferencias detectadas entre los dos grupos de tratamiento en el seguimiento de las muestras de sangre en comparación con las muestras de la línea base, y con la muestra tomada antes de PCI.

Las siguientes investigaciones se llevarán a cabo sobre los 10 pacientes en la fase 1 del estudio:

1.: Determinación por luminex de 22 citocinas diferentes.

2.: Cortisol, DHEA y metabolitos en plasma.

3.: Niveles en suero de proteínas de 60/65 kDa y 70k Da hsp/de estrés, y los anticuerpos para ellos.

4.: Niveles de proteína C reactiva.

5.: Activación de cumplimiento.

6.: Marcadores de enfermedad vascular.

7.: Hematología de rutina etc.

8.: Estudios de sistema Pax-gen para citocinas intracelulares se realizarán si los resultados de los ensayos anteriores son inadecuados. Las investigaciones a realizar en la segunda etapa y posterior del ensayo se seleccionan entre los resultados obtenidos de la fase1, como se describe más adelante.

Los resultados obtenidos para los primeros 10 pacientes se analizarán por cada uno de los investigadores para:

1.: Los que muestran diferencias entre las muestras de sangre 1 y 2 (efecto de modulación inmune).

2.: Los que muestran diferencias entre las muestras de sangre 2 y 3 (efecto de procedimiento operativo).

3.: Los que muestran diferencias entre las muestras de sangre 1 y 4 (efectos de tratamiento y procedimiento).

Los resultados después se analizarán de acuerdo con tratamiento activo o placebo de los pacientes. Las investigaciones seleccionadas que muestran diferencias entre estos 2 grupos se aplicarán a la segunda, principal fase del estudio.

Resultados secundarios: Se almacenarán alícuotas de muestras de sangre para posible análisis posterior de otros marcadores inflamatorios vasculares, tales como endotelina, factor de von Willibrand etc.

Las investigaciones preliminares sugieren que T. inchonensis reduce la hiperplasia de

la mioíntima (MIH) post angioplastia coronaria.

Claims

Reivindicaciones

1.

Uso de una composición de inmunomodulador o una composición farmacéutica que comprende una célula entera de una bacteria del género T. sukamurella en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune.
2.

Uso de acuerdo con reivindicación 1 en el que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune implica inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo.
3.

Uso de acuerdo con reivindicación 2 en el que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune además implica inflamación de la capa muscular de un vaso sanguíneo o del miocardio.
4.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune es uno que está precedido o causado por un trastorno vascular.
5.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune se selecciona entre uno o más de los siguientes: artritis, de manera particular artritis reumatoide, psoriasis, artropatía psoriática, escleroderma, tiroiditis, hiperplasia de la íntima después de trasplante, rechazo de injerto y trastornos vasculares, en el que el trastorno vascular es un trastorno vascular que comprende un elemento autoinmune.
6.

Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el trastorno vascular se selecciona entre uno o más de los siguientes: enfermedad o fenómeno de Raynaud, uveitis anterior, trastorno vascular obliterante, formación de ateroma, arteritis, hiperplasia de la mioíntima, engrosamiento inflamatorio y autoinmune de la íntima y / o capa muscular de los vasos sanguíneos, lesiones inflamatorias de los vasos sanguíneos, enfermedad cardíaca aterosclerótica, lesión de reperfusión, alteraciones de conducción cardíaca, miocarditis, infarto de miocardio.
7.

Uso de acuerdo con la reivindicación 5 en el que el rechazo de injerto es rechazo de injerto crónico.
8.

Uso de acuerdo con reivindicación 5 en el que el rechazo de injerto es rechazo de injerto crónico en ausencia de inmunosupresor.
9.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 en el que dicha bacteria se selecciona entre una o más del grupo constituido por Tsukamurella paurometabola y Tsukamurella inchonensis.
10.

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha bacteria está muerta.
11.

Una composición de inmunomodulador o composición farmacéutica que comprende una

célula entera de una bacteria del género Tsukamurella, para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune.
12.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con reivindicación 11 en la que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune implica inflamación de la íntima de un vaso sanguíneo.
13.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con reivindicación 12 en la que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune además implica inflamación de la capa muscular de un vaso sanguíneo o del miocardio.
14.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en la que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune es uno que está precedido o causado por un trastorno vascular.
15.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la que la enfermedad autoinmune o trastorno autoinmune se selecciona entre uno o más de los siguientes: artritis, de manera particular artritis reumatoide, psoriasis, artropatía psoriática, escleroderma, tiroiditis, hiperplasia de la íntima después de trasplante, rechazo de injerto y trastornos vasculares, en el que el trastorno vascular es un trastorno vascular que comprende un elemento autoinmune.
16.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el trastorno vascular se selecciona entre uno o más de los siguientes: enfermedad o fenómeno de Raynaud, uveitis anterior, trastorno vascular obliterante, formación de ateroma (también conocida como arteriosclerosis), arteritis, hiperplasia de la mioíntima (natural o después de angioplastia), engrosamiento inflamatorio y autoinmune de la íntima y / o capa muscular de los vasos sanguíneos, lesiones de los vasos sanguíneos inflamatorias, enfermedad cardíaca aterosclerótica, lesión de reperfusión, alteraciones de conducción cardíaca, miocarditis, infarto de miocardio.
17.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con reivindicación 15 en la que el rechazo de injerto es rechazo de injerto crónico.
18.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con reivindicación 15 en la que el rechazo de injerto es rechazo de injerto crónico en ausencia de inmunosupresor.
19.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 -18 en la que dicha bacteria se selecciona entre el grupo constituido por Tsukamurella paurometabola y Tsukamurella inchonensis.
20.

Una composición de inmunomodulador o farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en la que dicha bacteria está muerta.