DE3132497A1

DE3132497A1 - Verfahren zur bildung eines polysaccharids durch mikroorganismen

Info

Publication number: DE3132497A1
Application number: DE19813132497
Authority: DE
Inventors: Stuart Gordon Sittingbourne Kent Ash; Leo Modesto Clif. Kim
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1980-08-19
Filing date: 1981-08-17
Publication date: 1982-05-27
Also published as: DE3132497C2; BE890001A; JPH0521555B2; JPS5758889A; NL8103838A; FR2488909B1; FR2488909A1; US4384044A

Description

Shell Internationale ":./;.-; ^: Q 1 1A-55 067 U.

Beschreibung Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids durch Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft die Anwendung von mikrobiologischen Zellen in einem inmobilisierten System und insbesondere die Bildung eines Polysaccharids durch immobilisierte Mikroorganismen,,

1A-55 067 ;'_- i ^ ■·■-'-

sind, vorausgesetzt, daß die Trägerteilchen eine definierte Porengröße besitzen.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Polysaocharid bildet, enthalten (supported) ist auf einem porösen, feinteiligen, inerten Träger, dessen Porengröße mehr als 0,5 Mm beträgt₍unter Bildung eines immobilisierten Zellsystems, wobei ein wäßriges Nährmedium durch das immobilisierte System geleitet wird und das Polysaccharid-haltige Medium von dem System abgezogen wird.

Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Mikroorganismen, die Polysaccharide bilden. Es kann angewandt werden auf Mikroorganismen, bei denen die Polysaccaridbildung von Wachstum und Vermehrung begleitet ist wie dem Xanthan-bildenden Organismus Xanthomonas campestris. In diesen Fällen führt das Wachstum des Organismus jedoch zur Freisetzung von Zellen aus dem Träger in das Medium, wodurch einige der erfindungsgemäßen Vorteile verloren gehen. Das Verfahren ist besonders geeignet für Mikroorganismen, die Polysaccharide in der stationären Phase des Wachstums zyklus bilden (d, h. die PoIysaccharidbildung ist nicht von Wachstum begleitet). Beispiele für derartige Mikroorganismen sind bestimmte Schleim-bildende Arten der Gattung Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes und Agrobacterium, besonders Pseudomonas spp* NCIB 11592 und 11264, Rhinzobium •meliloti, Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes. Alle diese speziellen Organismen bilden ein besonderes Polysaccharid, enthaltend Glucose und auf jeweils 7 Mol Glucose

/3

0,9 bis 1,2 Mol Galactose und 0,65 bis 1,1 Mol Pyruvat zusammen mit 0 bis 2 Mol Succinat und Acetat, dessen Eigenschaften und Anwendung für Ölgewinnungsverfahren im einzelnen in der GB-Anmeldung 8016832*beschrieben ist. In dieser Anmeldung sind auch im einzelnen die Charakteris vi des neuen Stammes NCIB 11592 der Art Pseudomonas beschrieben.

Das Trägermaterial sollte natürlich chemisch und biologisch inert sein unter den Anwendungsbedingungen und geeignete Materialien sind anorganische Oxide von Silicium, Aluminium, Zirkon, Magnesium und deren Gemische. Es hat sich gezeigt, daß die wirksame Zurückhaltung der mikrobiologischen Zellen auf (bzw. in) dem Träger abhängt von der geeigneten Wahl der Porengröße in den Trägerteilchen und wie oben angegeben sollte diese größer als 0,5 V& sein. Allgemein werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Porengröße mindestens 1 yum beträgt. Bevorzugte Porengrößen betragen 2 bis 30/um. Die Größe der Trägerteilchen ist weniger kritisch als die Porengröße, um eine günstige Arbeitsweise zu erzielen, und in der Praxis wird die Teilchengröße zum Teil durch die Arbeitsbedingungen bestimmt, unter denen das immobilisierte System angewandt werden soll, z. B. ob es in Form eines Festbettes oder als Aufschlämmung angewandt werden soll. Im allgemeinen sollte die Teilchengröße weniger als 1 mm betragen und bei Anwendung in einem Aufschlämmungsreaktor hat es sich gezeigt, daß üblicherweise die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn Teilchen mit einer Größe von 100 bis 600 um, insbesondere 150 bis 300/um angeandt werden.

Das Aufbringen der Zellen auf den Träger kann auf verschiedene Weise erfolgen, wobei sich jedoch zwei

*) (= EP-r-Anmeldung 812004794 vom 06,05,81)

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1A-55 067 ' -' -: 4 --."..- '■

Verfahren allgemein als günstig erwiesen haben. Bei einem Verfahren werden die mikrobiologischen Zellen nach bekannten Verfahren in einem Fermenter gezüchtet, sodaß man eine Paste der erforderlichen Zellen erhält, die mit den Trägerteilchen vermischt wird. Das Gemisch wird dann einem Vakuum ausgesetzt und das Vakuum aufgehoben, sodaß der Atmosphärendruck die Paste in die Poren des Trägers preßt. Die überzogenen Teilchen werden dann eine kurze Zeit (einige Stunden) gealtert und anschließend der Überschuß an Zellen abgewaschen. Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren besteht in dem Wachstum in situ, bei dem der feinteilige Träger in einem geeigneten Wachstumsmedium suspendiert wird, das dann mit dem gewünschten Organismus beimpft wird. Das beimpfte,den Träger ent--' haltene Wachstumsmedium wird dann unter entsprechenden Bedingungen inkubiert, um ein Wachstum des Organismus zu erreichen und nach einer entsprechenden Zeit werden die freien Zellen abgewaschen, wobei das zellhaltige immobilisierte System verbleibt. Bei einer Abwandlung dieses Verfahrens wird frisches Wachstumsmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, kontinuierlich während der Immobilisierung in den Reaktor geleitet, um geeignete Bedingungen für das Festsetzen der Zellen auf den Trägerteilchen zu erhalten. Wenn das Wachstum in situ durchgeführt wird, hat es sich häufig gezeigt, daß höhere und stabilere Beladungen mit Zellen erzielt werden können-durch Verwendung von hohen Nähr-

30 stoffgehalten in dem Wachstumsmedium.

Das wäßrige Nährmedium sollte ein Substrat für die Polysaccharidbildung durch den Mikroorganismus enthalten. Im Falle solcher Mikroorganismen,'die PoIysaccharid in der stationären Phase ihres Wachstumszyklus bilden, ist das Nährmedium vorzugsweise ein solches, das während es das erforderliche Substrat

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1A-55 067 ' — S --"" - .' .

zur Verfügung stellt, nicht zu Bedingungen führt, die zum Wachstum zur Vermehrung des Mikroorganismus führen. Derartige nicht-Wachstumsbedingungen können aufrechterhalten werden durch Anwendung eines Mediums, dem eine oder mehrere Komponenten mangeln, die für das Zellwachstum erforderlich sind, z. B. Sulfaj, Phospat oder vorzugsweise Stickstoff₍oder durch andere bekannte Maßnahmen. Das wäßrige Nährmedium enthält üblicherweise eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusammen mit kleineren Mengen anorganischer Ionen. Die Kohlenstoffquelle ist günstigerweise ein Kohlenhydrat und bequemerweise Glucose und wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Gew₄-96, üblicherweise 1 bis 2 % (Gew_c/Volumen) angewandt. Die Temperatur und der pH-Wert, bei denen das Polysaccharid am wirksamsten gebildet wird, variieren natürlich je nach nach dem Organismus und im Falle von Pseudomonas sp. NCIB 11592 liegt die Temperatur vorzugsweise zwischen 20 und 35°C und der pH-Wert vorzugsweise zwischen 6 und 9. Während der Bildung des Polysaccharids wird das wäßrige Nährmedium üblicherweise kontinuierlich zu dem immobilisierten System mit der gleichen Geschwindigkeit zugeführt;,wie das Polysaccharidhaltige Medium davon abgezogen wird. Das austretende Medium kann als solches verwendet oder es kann nach bekannten Verfahren behandelt werden, um das Polysaccharid daraus zu extrahieren»

Einer der Hauptvorteile, der durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens erzielt werden kann, besteht in der Leichtigkeit der Trennung des gewünschten Polysaccharids von den Zellen, da diese auf den Trägerteilchen festgehalten werden, die leicht in dem Fermentationsgefäß durch bekannte Vorrichtungen wie Filter, Siebe öder ähnliches zurückgehalten werden können. Darüberhinaus bietet das

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*) Überlaufvorrichtungen

Immobilisierungsverfahren die Möglichkeit einer längeren Lebensdauer der Zellen, d. h. einer längeren Zeit, während der sie das Polysaccharid bilden,ohne daß deutliches Wachstum auftritt. Diese Lebenszeit ist jedoch unweigerlich begrenzt und nicht in allen Fällen deutlich langer als die der freien Zellen. Wenn die Polysaccharidbildung der auf dem Träger enthaltenen Zellen jedoch unter.ein annehmbares Niveau absinkt, kann sie leicht und nahezu vollständig wieder erneuert werden durch Wiederholung der Wachstumsphase-(d. h. Einleitung eines vollständigen Wachstumsmediums, das alle notwendigen Nährstoffe enthält) für eine entsprechende Zeit, günstigerweise unter Auswaschbedingungen, durch die freie Zellen, die von dem Träger freigesetzt werden, entfernt werden. Dann kann wieder ein Nährmedium zugeführt werden, das einen Mangel an beispielsweise Stickstoff aufweist.

Eine wichtige Anwendung für die erfindungsgemäß gebildeten Polysaccharide liegt in einer verbesserten Ölgewinnung (wie im einzelnen in der GB-Anm. 8016832*angegeben) und daher umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren, bei dem das Polysaceharid-haltige Medium nach einer etwaigen erforderlichen Einstellung der Konzentration und/oder Zusatz weiterer Bestandteile in eine flüssigkeitführende, durchlässige Schicht injiziert wird. Bei dieser Anwendung ist es besonders wichtig, daß die Polysaccharidesung keine Zellkörper enthält und ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß dadurch die Bildung von zellfreien Polysaccharidlösungen erleichtert wird. Bei bekannten Verfahren ist es notwendig, die mikrobiologischen Zellen von der viskosen Polysaccharidlösung abzutrennen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die Zellen jedoch auf dem Träger immobilisiert und die entstehende

*) (= EP-Anmeldung 812004794)

Polysaccharidlösung ist daher im wesentlichen frei von derartigen Zellen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

A. Herstellung des immobilisierten Systems 10

1. Aufbringen der Mikroorganismen mit Hilfe von Vakuum

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde kontinuierlich in einem Chemap LF-7-Fermentations-Gefäß mit einem Flüssigkeitsvolumen von 4 1 gezüchtet. Die Temperatur wurde auf 28°C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung (1n NaOH + 1n KOH) auf 6,8 gehalten. Es wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min in das Fermentations-Gefäß geleitet und die Kultur mit Hilfe eines Turbinenpropellers mit 1 000 UpM bewegt. Frisches, steriles Medium wurde in zwei Strömen kontinuierlich in den Fermenter geleitet und die Kulturbrühe mit Hilfe eines Überlaufs abgezogen, um ein konstantes Arbeitsvolumen in dem Reaktor aufrechtzuerhalten, Die Fließgeschwindigkeit und die Zusammensetzung der Ströme waren:

Strom 1: Fließgeschwindigkeit 300 ml/h

Mineralsalzmedium, wie unten angegeben, enthaltend zusätzlich 20 g/l Glucose und 10 mM H PO..

/8

TA-55 067

■—* -

	55,6	0	g/l	Konzentration	-	AiMoI
Bestand teil	^,99	0	,^93	mMol
MgSO -TH 0	2,3T	χ χ	,3>Τ	²T⁰
CaCl₂.2H₂O	0,6l	χ X	ίο"³	I₁O		200 20
FeSO₁₊-TH₂O	2,1+1 1,66	X	ΙΟ"³ ΙΟ"³			20 20
ZnSO₁₊-TH₂O CuSO, .5H₂O		X	ΙΟ"³	10
CoCl₀-OH₅O		X X	ίο-³	10
		ίο"³ ΙΟ"³	10 10
-Na₀MoO. .2H₉P KI

15 Strom 2: Fließgeschwindigkext 60-120 ml/h

21,14 g/l

Eine Paste der von der oben angegebenen Kulturbrühe durch Abzentrifugieren erhaltene Zellen, die 10Og Zellen (Trockengewicht) pro Liter enthielt, wurde mit den ausgewählten Trägerteilchen vermischt. Dieses Gemisch wurde dann mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe einem Vakuum ausgesetzt und das Vakuum nach 3 bis 5 Minuten aufgehoben. Dieses Verfahren wurde 4 bis 5 Mal wiederholt und das Gemisch 2 bzw. 12 Stunden bei 4⁰C gealtert, bevor es mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen wurde, um überschüssige Zellen zu entfernen. Die Menge der festgehaltenen Zellen (cell loading) wurde entweder durch Respirationsuntersuchungen mit einer Sauerstoffelektrode oder durch

1A-55» 067 -:-t:^;--. '- "■

Messung der Proteinkonzentration mit Hilfe des Verfahrens von Lowrey et al, bestimmt und angegeben als Milligramm Trockengewicht Zellen pro Gramm Trägermaterial. Diese Versuche wurden mit verschiedenen Trägermaterialien durchgeführte Die Ergebnisse all dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

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Tabelle 1

Be	Zusammen	Poren	Teilchen	tt	Alterungs-	Gehalt an Zellen
zeichnung	setzung	größe	größe	zeit	(mg Trockengewicht/ g Träger)
		( M-m)	( μπι)
Practosil 5000	Kieselsäure	0,5	63-125	2	0,1
" 10000	Il	1,0	Il	2	V
" 25000	Il	2>5	It	2	3/3
¹¹ 25000	It	2,5	tt	12	21/26
¹¹ 5000	It	0,5	Il	12	5;33
Norton 06519	Aluminiumoxid	3-13	150-250	2	10,τ
M	It	ti	ti	12	10,66
ti	It	tt	300-600	12	11,5
ti	«1	M	> 600	12	8,0
Norton 06U82	KLeaels äure/IOuminijnoV.	tt	150-300	2	11,2
*JkI \^Λ, \J* ^iI \J K₁J ^ \/ C_-* Norton SA 6373	Aluminiumoxid	0,1	150-600	2	0
Norton SA 5559	ti	₂lu	300-600	2	0
Norton SA 5221	Aluminiumoxid	10-30	N. A.	12	10.1
Norton SA 5561+	Zirconpxid	5-80	N. A.	12	9>
Norton SA 6525	Aluminiumoxid	3,2	■H.A.	12	9,1
Norton· SA 5231	Aluminiumoxid	l-2/15-lOO	N.A.	12	UJ9
Norton SA 66O5	Aluminiumoxid	5	N.A.	12	10,8
Carborundum
SAEHSU533'	It I	0,3	N ,A.	2	0
Harshaw AL-I83-IF	It	N.A.	500	2	3;3
It	It	tt	12	8

VJl VJI

1A-55 067 jrf*.- ..

2. Aufbringen der Mikroorganismen durch Wachstum in situ

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden in einem Biotec-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 2,5 1 in Gegenwart von 5-10 % (Gew./Volumen) Aluminiumoxid (Norton 06519) mit einer Gasstromgeschwindigkeit von 400 ml/min Luft oder 200 ml/min Sauerstoff und bei einer Rührergeschwindigkeit von 200 UpM gezüchtet, wobei man eine Spannung von gelöstem Sauerstoff von mehr als 60 % Luftsättigung erhielt. Die Temperatur betrug 30°C und der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung auf 7,0 gehalten und das Wachstumsmedium enthielt das Mineralsalzmedium wie oben angegeben, enthaltend 20 g/l Glucose, 2,11 g/l (NH₄)₂S0₄, 0,680 g/1 KH₂PO₄ und 0,709 g/1 Na₂HPO₄.

Unmittelbar bevor das Wachstum dieses Ansatzes beendet war (ungefähr 20 Stunden) wurden die Reaktor-, bedingungen geändert und zwar auf eine Gasströmungsgeschwindigkeit von 600 ml/min Luft (oder 300 ml/1 Sauerstoff) und eine kontinuierliche Kultur, die das vorgegebene Medium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von mehr als 1 l/h verwertete. Bei dieser hohen Verdünnungsgeschwindigkeit wurden die bereits an dem Träger festgehaltenen Zellen zurückgehalten und wuchsen weiter in dem Träger, während die freien oder nur locker haftenden Zellen ausgewaschen wurden. Die Zellen wurden auf diese Weise gezüchtet, bis keine weitere Zunahme des Zellgehalts beobachtet wurde (48 Stunden) und .der Zellgehalt in dem Träger wurde wie unter A 1 angegeben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

/12

1A-55 067

Tabelle 2

Zeit seit Beginn der kontinuierlichen Kultur (h)

Gehalt an Zellen (mg/g)

Ansatz 1 Ansatz 2

72 g/l Träger- 260 g/l konz. Trägerkonz.

15

20

25

0 20

Uo 6o 8o

IT, h
17,2

3*5 12,0

20 20

B. Bildimg des Biopolvmers

1. Yakuumimmobilislßrung und ansatzweise Bildung des Polymers

Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592, Pseudomonas sp. NCIB 11264 und Agrobacterium radiobacter NCIB 9042 wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie oben beschrieben immobilisiert. 10 g jedes Biokatalysators wurden nach Waschen in Schüttelkolben gegeben, enthaltend 100 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, und 10 g Glucose_β Die Kolben wurden mit 200 UpM bei 30⁰C geschüttelt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Tabelle 3

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1A-55 067

Tabelle 3

Stamm

PseucLomonas sp. UCIB 11592 Pseudomonas sp. NCIB 1126H 5 Agrcfbacterium radiobacter NCIB 90k2

Gehalt an Zellen*)

(mg/g)

Polymerkonzentration nach 140 h (g/l)

9,6
.11 j O

2,0

*) mg Zellen (Trockengewicht)/g Träger

"' erliche

2.' Vakuiomimmobilisierung und kontinui Bildung des Polymers

Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie oben angegeben immobilisiert, !fen erhielt 9»7 mg Zellen (Trockengewicht)/g Träger. 180 g dieses Biokatalysators wurden in ein 4 Liter Biotec-Fermentationsgefäß gegeben, enthaltend 2,8 1 Medium, umfassend das Mineralsalzmedium wie oben beschrieben, sowie 20 g/l Glucose und 10 mM H₃PO^. Die Temperatur

wurde auf 3O⁰C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung auf 7,0 gehalten. Es wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 400 ml/min in den Reaktor geleitet und die Suspension durch einen Prop eil errühr er mit 200 UpM bewegt. Frisches Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von 225 ml/h in den Reaktor gepumpt und die PoIysaccharidlösung mit Hilfe eines Überlaufs abgezogen, wobei eine Absetzvorrichtung vorgesehen war, um ein konstantes Arbeitsvolumen sowie eine konstante Zurückhaltung des Biokatalysators in dem Reaktor zu erreichen.

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1A-55 067 -^Γ

Die Polysaccharidkonzentration in dem austretenden Strom (gemessen durch Umsetzung mit Anthron) ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle.4

Zeit Polysaccharidkonzentration - (g/l)

20 10 V2

⁶³ 11!+

139

0,13 Oj 18 0,20 0,21

3. Immobilisierung durch Wachstum in situ und kontuierliche Bildung des Polymers.

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde auf 180 g Aluminiumoxid (Norton 06519) nach dem unter A 2 angegebenen Verfahren immobilisiert. Nach der Immobilisierung wurde frisches Salzmedium (Stickstoff-frei), enthaltend zusätzlich 20 g/l Glucose und 10. mM H,PÖ,, mit einer Geschwindigkeit von 225 ml/h in den Reaktor gepumpt und die PoIysaccharidlösung entsprechend Beispiel B 2 abgezogen. Nach einem anfänglichen Verlust von Zellen stabilisierte sich der Gehalt an Zellen auf dem Träger während der Polymersynthese auf 10 mg (Trockengewicht)/g. Die Polysaccharidkonzentration in dem austretenden Strom ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle 5

/15

Tabelle 5

Zeit (K) Polysaccharidkonzentration (g/l·)

(nach
Immobilisierung)

26 U2 63 86

0,73

⁰151 0_;U5

0/5

4_Φ Wachstum in situ bei unterschiedlichen Nährstoffgehalten und kontinuierliche Bildung des Polymers

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie in Beispiel A 2 angegeben immobilisiert mit der Ausnahme, daß das Wachstumsmedium die folgenden Mineralsalzkonzentrationen enthielt:

Bestandteil Konz. mg/l

20	Na₂HP	Oj₄
	KHgPO	h.
	MgSOj^	.7HgO
	FeCl₃	.6h_?o
	CaCIg	.2HgO
25	ZnSO,	.7HgO
	CuSO,	.5HgO
	MnSOj₄	^HgO
	CoCIg	.6HgO
	^H3^B03
30	Na₂MoI	VSH₂O

3000 3000 200 33,4 16,0 0^36 0_;32 0,30 0,36 0₇20

O₇ 6o

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1A-55 067 <·-.._

zusammen mit (NH^)₂ ^S04 und Glucose in Konzentrationen von entweder 0,3 g/l und 10 g/l (i) bzw. 3,0 g/l und 20 g/l (II). Die Zeit des (loading) Wachstums betrug 90 Stunden bei I und 70 Stunden bei II. Den entstandenen immobilisierten Zellsystemen wurde dann ein Nährmedium zugeführt, das sich von dem Wachstumsmedium nur durch Weglassen des Ammoniumsulfats unterschied (diese Modifikation wird als Stickstoff-freies Medium bezeichnet). Die Polysaccharidlösung wurde abgezogen und der Produktquotient (g Polymer/g fixierte Zellen.h) und die Produktivität (angegeben in ml PoIysaccharid/g Zell-haltigen Träger.h) wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben, aus der hervorgeht, daß ein höherer Nährstoffgehalt zu wesentlichen Verbesserungen in dem Zellgehalt des Trägers und der Produktivität führte

Tabelle 6

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1A-55 007

to

Tabelle 6

Zeit (h)	Gehalt Zellen Träger	an auf dem (ngÄ)	Pro duktquoti ent	II	Produktivität	II
	I	II	• I	0,002	I	o₅io7
0	li, oU	53,2	0,007	-	0,071+	-
16, U	8_; 77	-	0,051	0;022	0₇Ui+9	0,570
17; 5	-	26jl	-	-	-	-
Ho,5		-	0,065	o,ol*5	0_;U83	0,593
53,1		13)2	-	-	-	-
65;O	5_;55	-	0,01*8	0_;o65	o_? 268	0,728
78,1		11,2	-	O_;O39		0;U6T
89,3	-	11_; 97	-	-	-	-
99; 9		-	o.oUo	0,03U	0,178	0,330
113,2	-	9j6U	-	-	-	-
126_;5		.-	0,021	-	O.O86	-
136,5	k, 11	-	0,028	0;03li	0_;113	0_;3o0
137,3	-	10 j 59	- -	-	-	-
l6lj0	3,98	-	0,015	0,029	0,059	0^251
161,6	-	8j6	-	-	-	-
183,9	5,61t	-	0;012	0.03U	0,065	0,301
185,H	-	8^96	-	-	-	-
2U2_;2	3,12	-	Oj 030	0,019	0_;092	0,17*+
2U6,3	-		-	-

/18

1A-55 067 . :- )&.-. ":

Beispiel 2

Regeneration der Polysaccharidproduktivität

Pseudomonas sp. NCIB 11592-Zellen wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) immobilisiert, entsprechend dem Verfahren des Beispiels B 4 mit dem höheren Nähr·*- stoffgehalt und einer Wachstumszeit von 76 Stunden. Diesem immobilisierte Zellsystem wurde dann mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h~ (Strömungsgeschwindigkeit des Medium geteilt durch das Volumen der Flüssigkeit in dem Reaktor) Stickstoff-freies (aber sonst gleiches) Medium zugeführt, um die Polysaccharidbüdungsphase einzuleiten, die 208 Stunden dauerte. Zu diesem Zeitpunkt war der Polysaccharid-Produktquotient auf einen niedrigen Wert gefallen und das Stickstoff-freie Medium wurde durch ein vollständiges Stickstoff-haltiges Wachstumsmedium mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,4 χ h 96 Stunden lang ersetzt, um die Polysaccharidbildungsfähigkeit der Zellen zu regenerieren. Nach dieser Regenerationsphase wurde wieder die Bildungsphase eingeleitet durch erneutes Einleiten des Stickstofffreien Mediums mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h . Der Gehalt an Zellen auf dem Träger und der Polysaccharid-Produktquotient wurden während dieses Versuches bestimmt und sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben, aus der hervorgeht, daß durch die Regeneration die Polysaccharidbildungsfähigkeit des immobilisierten Systems wieder erneut wird.

Tabelle 7

1A-55 067

ii

Tabelle 7

-	Zeit (h)	Gehalt an Zellen auf dem Träger vmg/g7	Pr0duktquotient	_;039
5	0	35,0	0,001
	16,25	20 jA	0, 010
	39,^3	lU,0	0_y03^
	7^,3^	9,17	0_;030
	96,2	9,19	0_;0l6
10	111	8,6	0,0.2
	135	8,9	0_y011
	159	6,98	0^,007
	183	6,8	0_;005
	208	6,8	0,010
15	21» 0	21J
	262	38,2
	281 ■	36,9
	302	35,7
	331/0	35,0
20	16,7	22,1	Regenerations—
	in,8	16_;97	Phase
	77; ¹I	IU, 5
	100,8	15,3	0,007
	iiU,8"	12,61*	0,021
25	1U2	13,9	o_;oU6
Oj Ο63
0,01+3
0,0U9
C

/20

1A-55 067

Beispiel 3

Um die Ergebnisse zu zeigen', die mit einem Organismus erhalten wurden, der während der Polymerbildung wachsen muß, wurde eine Paste von Xanthomonas campestris ATCC 13951 durch Wachstum in situ auf drei unterschiedliche Träger aufgebracht. Jedes System (10 g) wurde dann in 100 ml einer 100 mM Tris-Pufferlösung bei pH 7,4, enthaltend 1 % Glucose, gegeben und die Polymerbildung mit Hilfe eines Verfahrens entsprechend demjenigen des Beispiels B 1 oben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben»

Trägermaterial

Norton Aluminium-20 oxid 06519

Norton Kieselsäure/Aluminiumoxid 06482

Fractosil 25000 ( Me rck, Da rms t ad t)

Tabelle 8

Zellgehalt auf
dem Träger (mg/g)

6,8

7,2
8,8

Polymerkonzentrat i on nach 140 h (g/l)

1,4

0,3 0,7

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß Polymer gebildet wird, obwohl die Bildungsgeschwindigkeit geringer ist als diejenige, die mit Pseudomonas sp. NCIB 11592 erreicht wird.

Vergleichsbeispiel

Alternative Immobilsierungsverfahren

Die folgenden Beispiele zeigen, daß die erfindungsgemäßen Inun&bilisierungsverfahren notwendig sind für

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eine wirksame Polysaccharxdproduktion, da alternative übliche Verfahren nicht geeignet sind.

1. Immobilisierung durch kovalente Bindung

Geeignete Träger wurden durch die folgenden Kcpplungsreagenzien aktiviert: 1-Äthyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, Glutaraldehyd, Chinon und N-Hydroxy-succinimid. Die aktivierten Träger wurden mit einer Zellpaste von Pseudomonas sp. NCIB 11592 einige Stunden vermischt, um eine wirksame Immobilisierung zu erreichen,. In allen Fällen trat entweder keine deutliche Bindung der Zellen auf oder die gebundenen Zellen verloren ihre Aktivität für die

15 Polysaccharidsynthese.

2. Immobilisierung durch Gel-Einschluß

Verfahren zur Immobilisierung von Zellen in Gelen sind bekannt. Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden immobilisiert durch Einschluß in die folgenden Gele: Agar, Polyacrylamid, Calcium-alginate In allen Fällen waren die Zellen ausreichend immobilisiert und behielten ihre Fähigkeit in Gegenwart von Glucoselösung zu atmen. Es wurde jedoch kein Polymer in die Lösung abgegeben. Es wird angenommen, daß die Poren in dem Gel zu klein sind, um das Austreten des Polymers aus den Teilchen zu ermöglichen.

6224

Claims

WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ l\ '

DIFL.-CHEM. IJR. K. FHFIUl l.l· VON ITC)IMANH PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN ΓΑΤΕΝΤ OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids durch Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen in immobilisierter Form auf einem porösen, feinteiligen inerten Träger, dessen Porengröße mehr als 0,5 uns beträgt, mit einem wäßrigen Nährmedium zusammengebracht werden und das Polysaccharidhaltige Medium von dem System abgezogen wirdo

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium kontinuierlich durch das immobilisierte System geleitet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß Mikroorganismen angewandt werden, die das Polysaccharid in der stationären Phase des Wachstumszyklus bilden«,

4β Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e kennzeichnet , daß als Mikroorganismen eines schleimbildende Spezies der Gattung Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes oder Agrobacterium angewandt wird. ·

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5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein anorganisches Oxid angewandt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Porengröße des Trägers 2 bis 30 um beträgt,

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch

gekennzeichnet, daß der mittlere Teilchendurchmesser des Trägers 100 bis 600 um beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen auf dem Träger immobilisiert worden sind durch Züchtung der Mikroorganismen in Gegenwart des Trägers und eines Wachstumsmediums, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit essentiellen Mineralien enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium während der Polysaccharidbildung keinen bzw. nicht ausreichend Stickstoff enthält, um ein aktives Wachstum zu ermöglichen und auf die Phase der PoIysaccharidbildung eine Regenerationsphase folgt, während der das immobilisierte Zellsystem ein vollständiges Wachstumsmedium mit assimilierbarem Kohlen-

30 stoff und Stickstoff enthält«,

10. Immobilisiertes Zellsystem zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 9, umfassend einen Polysaccharid-bildenden Mikroorganismus auf einem porösen, feinteiligen inerten Träger mit einer Porengröße von mehr als 0,5 >um.

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11. Anwendlang des nach Anspruch 1 bis 9 erhaltenen Polysaccharid-haltigen Mediums,gegebenenfalls nach Einstellung der Konzentration und/oder Zusatz weiterer Verbindungen,zur Injektion in eine flüssigkeitsführende permeable Erdformation.

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