DE3039122A1

DE3039122A1 - Glucagonfragment und seine verwendung

Info

Publication number: DE3039122A1
Application number: DE19803039122
Authority: DE
Inventors: Shigeo Katsuragi; Kikuo Kotani; Kaoru Morita; Nobuaki Nakagawa; Toshiharu Tagata Shizuoka Noda; Kunio Ohyama
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-10-16
Filing date: 1980-10-16
Publication date: 1981-04-30
Also published as: FR2467841A1; FR2467841B1; NL8005703A; GB2062644B; SE8007074L; GB2062644A; JPS5657753A

Description

Die Erfindung betrifft ein Glucagonfragment der Formel

H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH

die konjugierte Form des Glueagonfragments und Protein sowie ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Antikörpers unter Verwendung der konjugierten Form.

Glucagon ist ein Hormon, welches auf den Kohlenhydrat-Metabolismus wirkt und als 1-29-Peptid des Pankreas der Formel

1 2345678 H - His - Ser - GIn - GIy - Thr - Phe - Thr - Ser -

9 10 11 12 13 14 15 16 17 Asp - Tyr - Ser - Lys - Tyr - Leu - Asp - Ser - Arg -

18 19 20 21 22 23 24 25 26 Arg - AIa - GIn - Asp - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu -

27 28 29
Met - Asn - Thr - OH (II)

bekannt ist, und wird im folgenden als Glucagon (1-29) bezeichnet. Seine Bestimmung im Blutgehalt besitzt für die klinische Analyse eine wichtige Bedeutung.

Der Radioimmunoassay, der fluorezierende Immunoassay, der Enzymimmunoassay und ähnliche Assaymethoden auf der Grundlage einer Immunreaktion werden als wichtigstes Analysenverfahren für Spurenmengen an Glucagon verwendet. Es besteht daher ein großer Bedarf nach seinem spezifischen Antikörper .

Der spezifische Antikörper von Glucagon kann derzeit nur durch eine kombinierte Verwendung von Glucagon (1-29) als Hapten und Rinderserumalbumin (BSA) erhalten werden. Weiterhin kann seine Reproduktionsfähigkeit nicht erwartet werden.

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Es wurden einige Beispiele für die Herstellung von Antikörper unter Verwendung von Kombinationen eines Haptens, wie einem Fragment von Glucagon (1-29), beispielsweise einem Glucagonfragment, welches Peptid (18-29) in Glucagon enthält, einem Glucagonfragment, welches Peptid (19-29) in Glucagon enthält und im folgenden als Glucagon (19-29) bezeichnet wird (vergl. JA-OS 53-99320), oder einem Glucagonfragment, welches Peptid (15-29) in Glucagon enthält (vergl. JA-OS 54-24868), und BSA beschrieben.

Die Anmelderin hat Untersuchungen durchgeführt, um wirksame Antikörper bei einer Analyse auf der Grundlage der Immunreaktion von Glucagon(1-29) zu erhalten, und gefunden, daß die Kombination von Protein und neuem Glucagonfragment, welches Peptid(16-29) in Glucagon enthält, einen Antikörper wirksam produziert und daß der Antikörper bevorzugt mit markiertem Glucagon(1-29) und verschiedenen markierten Glucagonfragmenten bei der Immunreaktion reagiert.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Glucagonfragment zur Verfügung zu stellen, welches ein Peptid der Formel

H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-

29
Thr-OH (I)

enthält und im folgenden als Glucagonfragment(16-29) bezeichnet wird.

Erfindungsgemäß soll eine Kombination aus Glucagon(16-29) und Protein zur Verfügung gestellt werden.

Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Antikörpers zur Verfügung gestellt werden, bei dem eine Kombination aus Glucagon(16-29) und Protein verwendet wird.

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-p-

Die Synthese des erfindungsgemäßen Glucagons(16-29) kann wie folgt durchgeführt werden. Eine Aminosäure und/oder ein niedriges Peptid werden durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel (I) umgesetzt und die Schutzgruppe der reaktiven Gruppe wird bei der Endstufe der Reaktion freigesetzt. Die Kondensationsreaktion kann nach an sich bekannten Peptidsynthesen erfolgen, wobei die Anbindung und Entfernung der Schutzgruppe und der Kondensation wiederholt erfolgen. Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte sind übliche Schutzgruppen für die Peptidsynthese und sie sind leicht durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse entfernbar.

Beispielsweise kann die oc-Aminogruppe zweckdienlich mit einer Benzyloxycarbonylgruppe, wie einer Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, oder einer aliphatischen Oxycarbonylgruppe, wie einer t-Amyloxycarbonyl- oder t-Butoxycarbonylgruppe, geschützt sein.

Die Carboxylgruppe kann durch Veresterung geschützt sein. Die Estergruppe wird mit einem Alkanol, wie Methanol oder Äthanol, oder einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder Dichlorbenzylalkohol, substituiert.

Die Hydroxygruppe im Serin und Threonin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Veretherung geschützt sein. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist Benzyloxycarbonyl. Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist die Benzylgruppe.

Die Aminogruppe in der Guanidinogruppe im Arginin wird durch eine Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt.

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-D-

Es ist jedoch nicht immer erforderlich, die Guanidinogruppe zu schützen.

Nach Beendigung der letzten Stufe der Kondensationen werden diese Schutzgruppen bevorzugt durch Säurezersetzung, wie durch Fluorwasserstoff, in einer Stufe entfernt. Daher werden die reaktiven Seitenkettengruppen in Serin, Arginin, Asparaginsäure oder Threonin durch Schutzgruppen, die durch Fluorwasserstoff leicht entfernbar sind, geschützt. Beispielsweise wird die Hydroxylgruppe in Serin und Threonin durch eine Benzylgruppe; die Aminogruppe in der Guanidinogruppe im Arginin durch eine Tosylgruppe; und die Seitenketten-Carboxylgruppe in der Asparaginsäure durch eine Benzylestergruppe geschützt.

Andere oc-Aminogruppen und Carboxylgruppen werden durch eine Schutzgruppe, die unter solchen Bedingungen, bei denen die Seitenkettenschutzgruppe nicht entfernt wird, entfernt werden kann, geschützt. Beispielsweise wird die a-Aminogruppe bevorzugt durch eine t-Butoxycarbonyl- oder t-Amyloxycarbonylgruppe geschützt, die leicht durch Trifluoressigsäure entfernt werden kann, oder sie wird durch eine Benzyloxycarbonylgruppe, die durch katalytische Reduktion entfernt werden kann, geschützt. Die Carboxylgruppe wird durch den Methyl- oder Äthylester, der mit verdünntem, wäßrigem Natriumhydroxid entfernt werden kann, geschützt. Die Carboxylgruppe am endständigen C-Atom wird durch den Benzylester geschützt, der durch wasserfreien Fluorwasserstoff entfernt werden kann.

Die Kondensation der Aminosäure und/oder des Peptids erfolgt wie folgt. Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten cc-Aminogruppe und einer aktivierten, endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien a-Aminogruppe und einer

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geschützten, endständigen Carboxylgruppe umgesetzt. Andererseits kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer aktivierten a-Aminogruppe und einer geschützten, endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien, endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe umgesetzt werden.

Die Carboxylgruppe kann z.B. durch Umwandlung in das Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid, Isoxazolid oder den aktiven Ester oder durch Umsetzung mit Carbodiimid oder Ν,Ν'-Carbonyl-diimidazol aktiviert werden.

Bevorzugte Kondensationsreaktionen sind das Carbodiimid-, Azid- oder aktive Ester-Verfahren. Bei der Kondensationsreaktion sollte eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden, und bevorzugte Verfahren sind das Azid-, aktive Ester-Verfahren unter Verwendung eines Succinimidesters oder eines p-Nitrophenylesters, das Wunsch-Verfahren [Z. Naturforsch., 216, 426 (1966)] oder das Geiger-Verfahren [Chem.Ber., 1055 788 (1970)], insbesondere das modifizierte Geiger-Verfahren, bei dem N-Äthyl-N'-3-dimethylaminopropylcarbodiimid als Kondensationsmittel verwendet wird.

Es wird so das geschützte Peptid (I) erhalten. Diese Schutzgruppen werden bevorzugt durch Zersetzung mit Säure, wie in einer einstufigen Umsetzung mit Fluorwasserstoff, entfernt und schließlich wird das Produkt (i) erhalten.

Die Reinigung des Peptids (I) kann durch bekannte Säulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers erfolgen.

Das erfindungsgemäße Glucagon(16-29) ist an Protein gebunden, wobei die konjugierte Form für die Erzeugung des Antikörpers entsteht. Beispiele von Proteinen, die üblicherweise verwendet werden, sind BSA oder seine Modifizierungen,

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wobei die Spaltung der inneren Moleküldisulfidgruppe durch Alkali- oder Natriumlaurylsulfat- und Mercaptoäthanol-Behandlung erfolgt.

Beispiele von Konjugationsreagentien für Glucagon und Protein sind polyfunktionelle Konjugationsreagentien, wie Glutaraldehyd oder 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-proplonatsuccinimidester (vergl. JA-PA 53-85900). Diese polyfunktionellen Konjugationsreagentien werden für die funktionelle Gruppe ausgewählt, die an der Bindung des Proteins teilnimmt.

Das Verhältnis von Glucagon(16-29) und Protein, wie BSA, ist 1 Mol oder mehrere Mol Glucagon(i6-29)/i Mol BSA, bevorzugt 10 Mol Glucagon(16-29)/1 Mol BSA. Bei der Bindungsreaktion wird beispielsweise die notwendige Menge an Glucagon(i6-29) in wäßrigem Mediun von pH 7 bis. 8 zugegeben, und ein polyfunktionelles Konjugationsreagens wird zugefügt. Die Reaktion verläuft unter Kühlen oder bei Umgebungstemperatur während 1 bis 4 Stunden. Nach der Reinigung durch Gelfiltration wird BSA zugegeben und 1 bis 4 Stunden bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Das konjugierte Produkt von Glucagon(16-29) und BSA wird nach der Reinigung, wie der Gelfiltration und Dialyse, erhalten und gegebenenfalls nach der Lyophilisierung gelagert.

Die so erhaltene konjugierte Form von Glucagon(16-29) und Protein wird Säugetieren, wie Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen oder Mäusen, für die Sensibilisierung verabreicht. Beispielsweise wird die konjugierte Substanz in Freund's vollständigem Adjuvans suspendiert und subkutan Meerschweinchen in einem Verhältnis von 30 bis 70 γ Glucagon(16-29) 4 bis 7 Mal in zweiwöchigen Intervallen verabreicht. Das Antiserum wird aus dem Blut der sensibilisierten Tiere nach an sich bekannten Verfahren, wie durch Sammeln des Blutes und Zentrifugieren, erhalten. Das Antiserum enthält eine höhere Kon-

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zentration an spezifischem Antikörper und kann in einem Gefrierschrank gelagert werden und durch aliquote Verdünnung verwendet werden. Der spezifische Antikörper ist immunologisch nicht nur an markiertes Glucagon(1-29), sondern auch an verschiedene markierte Glucagonfragmente, wie Glucagonfragment(16-29), Glueagonfragment(17-29) und Glucagonfragment (19-29), gebunden.

Wie zuvor erläutert, ist das erfindungsgemäße Glucagonfragment (16-29) für die Antikörpererzeugung in Form eines
Konjugats aus Glucagon(16-29) und Protein geeignet. Der so erhaltene Antikörper besitzt ausgezeichnete Bindungsfähigkeit bei der Immunreaktion, und die Immunreaktion wird bevorzugt für einen Radioimmunoassay, einen fluoreszierenden Immunoassay und Enzymimmunoassay von Glucagon(i-29) in vivo verwendet.

In der JA-OS 55-39702 wird berichtet, daß das Glucagonfragment (15-29) eine Aktivität gegenüber dem konjugierten Protein aufweist. In dieser Patentschrift werden jedoch keine Beispiele von Glucagon(16-29) erwähnt. Das erfindungsgemäße
Glucagon(i6-29) ist reaktiver und spezifischer, verglichen mit dem Fragment(15-29), bedingt durch das N-endständige
Aminosäureserin von Glucagon(16-29).

Die Abkürzungen in der Anmeldung besitzen die folgenden Be-

deutungen:	L-Serin	VaI: L-Valin
Ser:	L-Arginin	Trp: L-Tryptophan
Arg:	L-Alanin	Leu: L-Leucin
AIa:	L-Glutamin	Met: L-Methionin
GIn:	L-Asparaginsäure	Asn: L-Asparagin
Asp:	L-Phenylalanin	Thr: L-Threonin
Phe:	t-Butoxycarbonyl	OBzI: Benzylester
BOC:

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AOC: t-Amyloxycarbonyl

Z: Benzyloxycarbonyl BzIι Benzyl

Tos: Tosyl

OMe: Methylester

THF: Tetrahydrofuran

HOBT: 1-Hydroxybenzotriazol

OSU: N-Hydroxysuccinimidester

ONP: p-Nitrophenylester TFA: Trifluoressigsäure NMM: N-Methylmorphorin t₂O: Diäthylather DMF: Dimethylformamid

WSC: N-Äthyl-N'-^-dimethylaminopropylcarbodiimid.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungslösungsmittel bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet.

Träger: Merck Cellulose Art 5716 Entwickler:

(1) Butanol - Pyridin - Essigsäure - Wasser (15:10: 3:11);

(2) obere Schicht aus Butanol - Pyridin - Essigsäure Wasser (10:3:0,1:11);

(3) obere Schicht aus Butanol - Pyridin - Essigsäure Wasser (5:3:0,1:11).

Träger: Merck Silikagel Art 5721 Entwickler:

(4) Chloroform - Methanol - Essigsäure (95:5:3);

(5) Chloroform - Methanol - Essigsäure (80:25:2);

(6) Chloroform - Äthanol - ithylacetat (5:2:5);

(7) Chloroform - Methanol - Essigsäure (85:15:5)·

Beispiel 1

Herstellung von H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH fGlucagonf 16-29) 1

6 ml Anisol, 0,94 ml (10 mMol) Äthandithiol und 131 mg(1 mMol) Skatol werden zu 2,5 g (1 mMol) BOC-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)·

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Ala-Gin-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(BzI)-OBzI gegeben. Das Gemisch wird zu 20 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF) gegeben, 1 h bei O⁰C gerührt und HF wird schnell im Vakuum abdestilliert. 100 ml Et₂O wird zu dem Rückstand zur Abtrennung des Niederschlags zugefügt. Das Präzipitat wird in 100 ml 50- bis 80%iger Essigsäure gelöst und zentrifugiert. Das überstehende Material wird gefriergetrocknet; man erhält 1,22 g Pulver. Das Pulver wird in 150 ml 8 M wäßrigem Harnstoff gelöst und dann wird der pH-Wert durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9 eingestellt. Die Lösung wird auf eine Säule aus Carboxylmethylcellulose (4 χ 20 cm) gegeben, die mit 8 M wäßrigem Harnstoff äquilibriert ist. Nach 30 min wird die Säule vollständig mit Wasser zur Entfernung des Harnstoffs gewaschen und mittels des kontinuierlichen Konzentrationsgradientenverfahrens unter Verwendung von 1 1 Wasser, eingestellt mit Essigsäure auf pH 4,5, zu 1 1 wäßrigem 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5) eluiert. Dann wird die Säule mit 500 ml wäßrigem 0,5 M Ammoniumacetat (pH 4,5) eluiert. Schließlich wird mit wäßrigem 0,5 M Ammoniumacetat (pH 4,5), welches 8 M Harnstoff enthält, eluiert, um die aktiven Fraktionen II (Röhrchen Nr. 80 bis 110), III (Röhrchen Nr. 120 bis 170), IV (Röhrchen Nr. 171 bis 230) und V (Röhrchen Nr. 231 bis 290) in jeweils 7 ml Fraktionen zu fraktionieren. Diese aktiven Fraktionen werden gefriergetrocknet.

Aus der aktiven Fraktion V hergestelltes, getrocknetes Pulver wird in 50 ml 50%iger Essigsäure gelöst. 2,5 ml Thioglykolsäure werden zu der Lösung gegeben, welche 21 h bei 45°C stehengelassen wird. 24 g Harnstoff werden in der Lösung gelöst. Der unlösliche Teil wird durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird auf eine Säule (4,2 χ 104 cm) aus Sephadex LH-20 (Warenzeichen) gegeben und und 50%iger Essigsäure eluiert. Fraktionen der Röhrchen Nr. 62 bis 79, je

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7 ml-Fraktionen, werden gesammelt und gefriergetrocknet; man erhält 150 mg Pulver, TLCi Rf₁ = 0,50; Rf₂ = 0,34.

Aus der aktiven Fraktion IV erhaltenes, lyophilisiertes Pulver wird in 20 ml 50&Lger Essigsäure gelöst, dann wird 1 ml Thioglykolsäure zugegeben und 21 h bei 45⁰C stehengelassen. 9,6 g Harnstoff werden in dieser Lösung gelöst und das unlösliche Material wird abfiltriert. D_as Filtrat wird auf eine Säule (3 »3 x 120 cm) aus Sephadex LH-20 (Warenzeichen) gegeben und mit 5O?6iger Essigsäure eluiert. Aktive Fraktionen der Röhrchen Nr. 32 bis 37₉ je 7 ml-Fraktionen, werden gesammelt und gefriergetrocknet; man erhält 110 mg Pulver, TLC: Rf₁ =0,50«

Aminosäure-Analyse? Asp 2,03 (2), Thr 0,96 (1), Ser 0,87 (1), GIu 2,07 (2), AIa 1,02 (1), VaI 0,91 O)₅ Met 0,95 (1), Leu 1, Phe 0,95 (1), Arg 2,19 (2), Trp 1,04(1).

Die in den aktiven Fraktionen III und II erhaltenen Lyophilisate werden behandelt und der Säulenchromatographie auf gleiche Weise wie die obige aktive Fraktion IV unterworfen. Man erhält 130 mg Pulver (TLC: Rf₁ = 0,50) aus den Fraktionen der Röhrchen 31 bis 36 bei der aktiven Fraktion III und 50 mg Pulver (TLC: Rf₁ = 0,50) aus den Fraktionen der Röhrchen 39 bis 44 bei der aktiven Fraktion II.

Beispiel 2

Konjugierte Form von Glucagon(16-29) und BSA oder modifiziertem BSA

(1) Konjugierte Form von Glucagon(16-29) und BSA

15 mg Glucagon(16-29) werden in 0,0001N Natriumhydroxid gelöst und dann wird der pH-Wert auf 8,0 eingestellt. Man erhält 20 ml Lösung. 1,5 ml wäßriger 25%iger Glutaraldehyd werden zu der Lösung zugegeben und dann wird 2 h bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch

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eine Säule (5 χ 50 cm) von Sephadex G-15 geleitet und di© durchgegangenen Fraktionen werden gesammelte Eine Lösung enthält etwa 11 mg Derivat ₉ bei dem der¹ Glutaraldehyd mit dem N-endständigen Glucaton(i6-=29) reagiert hat»

42 ag BSA (Produkt der Sigma Co₀) werden zugesetzt und dann wird 2 h bei Zimmertemperatur umgesetzte Das Reaktionsgemisch wird in destilliertem Wasser dialysiert und das Dialysat wird lyophilisierto Man erhält die konjugierte Form von GlucagonC16-29) und BSA [molares Bindungsverhältnis von BSAs Glucagon(16-29) = etwa 1s10]5 Ausbeute 48 mg_o

(2) Konjugierte Form von Glucagon(16-29) und modifiziertem BSA

15 mg Glucagon( 16-29) werden in OpOOOIH Natriumhydroxid gelöst und dann wird der pH-lfert auf 8_s0 eingestellt» Man erhält 20 ml Lösung= 1 „573 ml einer OpijSigen Dimethylformamid= lösung von 3- (2' -Benzothiazolyl-dithio) -propionat-succiniiaidester werden zu der Lösung gegeben und dann wiru 1 h bei 5⁰C umgesetzt= Das Reaktionsgemisch wird durch eine Säule (5 χ 50 cm) aus Sephadex G-15_S die mit Acetatpuffer (pH 5) gepackt ist und Dimethylformamid enthält _s geleitete Man erhält die durchgegangene Fraktion. [Eine Lösung, die 11„5 mg eines Derivats enthält, worin die 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionylgruppe in das endständige N-Atom von Glucagon (16-29) eingeführt worden ist.] Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 eingestellt, und 45 mg modifiziertes BSA, das zuvor mit Natriumlaurylsulfat und Mercaptoäthanol bei Zimmer™ temperatur über Nacht behandelt wurde, werden zugesetzt und dann wird 1 h bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in destilliertem Wasser dialysiert und lyophilisiert; man erhält die konjugierte Form von Glucagon (16-29) und modifiziertem BSA [Bindungsverhältnis: modifiziertes BSA:Glucagon(16-29) = etwa 1:10]; Ausbeute 52 mg.

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Das obige GlucagonC16=29) wird durch Glucagon(i7=29)_P Glucagon(19-29) und GlucagonC1-29) (Produkt der Sigma Co₀) ersetzt und auf die oben beechriebene Weise behandelt» Man erhält die konjugierte Form von BSA oder modifiziertem BSA und Glucagon(17-29), Glucagon(19-29) oder Glueagon(1-29).

Beispiel 3

I. Antikörper-Erzeugung unter Verwendung der konjugierten

Form von GlucagonC16-29) und BSA

(1) Konjugierte Form von Glucagon(16-29) und BSA (1 mg) [248 γ als GlucagonC 16-29)] wird in 1,0 ml 10 mM Phosphat= puffer (pH 7,2) ₉ enthaltend 0,15 M NaCl₅ gelöste Freund's komplettes Adjuvans (1,0 ml) wird zugegeben und dann wird gut gemischt. Man erhält eine Emulsion»

0,5 ml der Emulsion werden in die Haut des Fingers oder des Fußes und anderer subkutaner Teile des Rückens eines Meerschweinchens injiziert» Die gleiche "Menge an Emulsion wird subkutan 6 Mal in zweiwöchigen Intervallen injizierte Nach 10 Tagen von der letzten Injektion wird das gesamte Blut gesammelt und 60 min für die Koagulation stehengelassen. Anti-Glucagon(16-29)-Serum wird durch Zentrifugieren bei 3000 U/min während 10 min erhalten»

(2) Konjugierte Form von Glucagon(17-29) und BSA (1

Die konjugierte Form von Glucagon(i9-29) und BSA (1 mg) und die konjugierte Form von GlucagonC 1-29) und BSA (2_S5 mg)» erhalten gemäß Beispiel 2, werden verwendet und auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(1) behandelt» Man erhält Anti» GlucagonC17-29)-Serum, Anti-GlucagonC19-29)-Serum und Anti-GlucagonC1-29)-Serum.

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II. Immunreaktivität des Antiseruras

(1) Analysenverfahren für die Immunreaktivität

Die obigen Antisera werden auf 200-, 400-, 800-_s 3200-, 6400-, 12 800-, 25 600- und 51 20Ofache mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 1 mM MgCl₂, 0,1% NaN₃, 3 mMol EDTA und 0,15 M NaCl, verdünnt. Je 100/Ul davon werden mit 100yul Phosphatpufferlösung (der gleichen Zusammensetzung wie oben) von markiertem Glucagon (1-29) oder markiertem Glueagonfragment [Markierungι ß-Galactosidase, Glucagonfragment? Glucagon(16-29), Glucagon (17-29)f Glucagon(19-29)] 16 h bei 5°C umgesetzt. Der Meerschweinchen IgG (4 γ) und Anti-Meerschweinchen IgG-Kaninchenserum werden zugegeben und dann wird 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren bei 3000 U/min während 10 min gesammelt und zu 200/ul eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 6,7) (enthaltend 0,1% BSA, 1 mM MgCl₂, 0,1% NaN, und 0,15 M NaCl), welcher 5 mg/ml Q-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid enthält, gegeben. Dann wird 45 min bei 37°C inkubiert, um die ß-Galactosidase-Aktivität bei 420 nm mittels Kolorimetrie zu analysieren. Das vereinigte Verhältnis zu markiertem Glucagon und markiertem Glucagonfragment in jeder Verdünnungskonzentration der Antisera bei der Immunreaktion wird bestimmt.

(a) Markiertes Glucagon(1-29): Mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(i-29) [40 pg als Glucagon(1-29)], erhalten gemäß dem im folgenden beschriebenen Verfahren, wird verwendet.

(b) Markierte Glucagonfragmente: Mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(16-29), mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(i7-29) und mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon (19-29), hergestellt nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren, werden · in einer Menge von etwa 20 pg je Glucagonfragment verwendet.

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^ η ο q -ι οο

Iji.'; Y^Thri ■*;."**° -ΐπf» -i^r⁵ ,

errechnet durch 'ί' Msngan der Präzipitate bei jedem Anti=* sr.r'-ss, siri. in der Tabelle für die 800=, 6400= imd 51 20C» f-c"is:\ '•.^r-5xli'.".i--:.igen aufgeführt. Die Kombinationsverhältniss

•i-v-r üOmbixieuionsverhältnis

: r " «^! 50 - 75%

ί- ί ·' 23 - 50%

•>u'! diij·.· ^:i?abelle f'ol^to daß das erfindungsgemäße Gluca^on (16-29) in seiner Struktur Glucagon(i7-29) und Glucagon i'i'y-Z'J) ähnelt, daß jedoch die Immunreaktivität des Anti-Kvrpers in aem Antiserum^ die man bei der Injektion von je- er-.^ i-r-_&gffi5äiit erhält ρ wesentlich unterschiedlich sind»

^\ntikörper, die durch das erfindungs gemäße Glucagon( 16-29) hergestellt wurden, zeigen eine empfindliche und vorteilhafte Immunreaktivität nicht nur gegenüber Glucagon(16-29)? sondern auch gegenüber Glucagon(17-29), Glueagon(19-29) und Glueagon(1-29).

Diese Ergebnisse zeigen, daß spezifische Antikörper am endständigen C-Atom (Antikörpertiter) quantitativ unter Verwendung der erfindungsgemäßen Glucagonfragmente bestimmt werden können.

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BAD ORIGINAL

Glucagon und Glue agonfragment für die Immunität

Antiseraverdünnung

Tabelle

Mit ß-Galactosxdase markierte Verbindungen, die für die

Analyse verwendet werden

Glucagone15-29; Glucagone17-29; Glucagone19-29; Glucagone 1-29;

Erfindungsgemäß Glucagon(16-29)

x800 x6400 x5.1

Vergleich Glucagon(17-29)

GlucagonC19-29) Glucagone1-29)

x800 x6400 x51

CD CO CJD

III. Herstellung von markiertem Glucagon(i-29) und markierten Glucagonfragmenten

(1) Markiertes Glucagon(i-29)

10/Ul wäßrige 100 mM EDTA und 264,4 /ul 0,1%iger 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionat-succinimidester in Dimethylformamid werden zu 1 mg Glucagon(1-29), gelöst in 0,4 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), gegeben und dann setzt man 1 h bei 5⁰C um. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Sephadex G-15-Säule (1,5 x 40 cm) für die Gelfiltration geleitet und dann werden die durchgegangenen Fraktionen gesammelt, wobei man eine Lösung erhält, die ein Derivat enthält, welches eine eingeführte 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionylgruppe in der Aminogruppe von Glucagon(1-29) aufweist.

2,78 mg ß-Galactosidase (Produkt der Boehringer Mannheim GmbH) werden zu 2 ml 50 mMol Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 25 /Ug des Derivats von 3-(2^l-Benzothiazolyl-dith±o)-propionyl-glucagon{i-29), gegeben und dann wird 1 h bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Säule (1,5 x 90 cm) aus Sephadex G-150 für die Gelfiltration geleitet. Dann werden die durchgegangenen Fraktionen gesammelt, wobei man mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(i-29) erhält, worin das endständige N-Atom des Glucagons(1-29) und die Thiolgruppe in der ß-Galactosidase aneinander gebunden sind.

(2) Markierte Glucagonfragmente

10/Ul wäßrige 100 mM EDTA und 625/ul 0,1&Lger 3-(2-Benzothiazolyl-dithioj-propionat-succinimidester in Dimethylformamid werden zu 0,5 mg Glucagon(16-29), gelöst in 0,4 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), gegeben und dann setzt man 1 h bei 5°C um. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Sephadex G-15-Säule (1,5 x 40 cm) für die Gelfiltration geleitet. Dann werden die durchgegangenen Fraktionen gesammelt,

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wobei man eine Lösung erhält, welch© ei". D^rivs+ ^rw-KT'-in das die 2-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionyl=Grupps in das endständige N Atom von GlucagonC 16-29) eingeführt ist«,

6,19 mg ß-Galactosidase werden in 2 ml 50 mM Phosphatpuffes· (pH 8,0) gegeben, der das Derivat (25/Ug) von 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)-propionyl-glucagon(i6-29) enthält, und dann wird 1 h bei Zimmertemperatur umgesetzt. Das Reaktion^= gemisch wird durch eine Säule (1,5 x 90 cm) aus Sephadex G-150 für die Gelfiltration geleitet. Die durchgegangenen Fraktionen werden gesammelt; man erhält mit ß-Galactosida-=?*? markiertes Glueagon(16-29)» in dem das endständig N-Atom des Glucagons(16-29) und die Thiolgruppe in der ß-Galactosidase aneinander gebunden sind»

Das obige Glucagon(16-29) wird durch Glucagon(17-29) und Glucagon(19-29) ersetzt und auf gleiche Weise _s wie oben beschrieben, behandelt, wobei man mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(19-29) und mit ß-Galactosidase markiertes Glucagon(19-29) erhält.

Ende der Beschreibung.

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BAD ORIGINAL

Claims

KRAUS & WESSERT PATENTANWÄLTE 3 P 3 9 1 2 DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHi UNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2724 AW/My TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata, Japan Glucagonfragment und seine Verwendung Patentansprüche

1./ Peptid der Formel

H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.

2. Konjugierte Form des Peptids der Formel

H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
und Protein.

3. Konjugierte Form nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Albumin oder seine modifizierte Form ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Verabrei-

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chung einer konjugierten Form eines Peptids der Formel

H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH

und Protein in Säugetieren sensibilisiert.

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