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Immunogene, Verfahren zu deren Herstellung sowie damit
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gewonnene Antikörper gegen glykosiliertes Hämoglobin Die Erfindung
betrifft Immunogene sowie Verfahren zu deren Herstellung, Antikörper gegen das glykosilierte,
N-terminale Ende der ß-Kette des glykosilierten Hämoglobins sowie deren Gewinnung
und deren Verwendung zur immunologischen Bestimmung des glykosilierten Hämoglobins.
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Glykosiliertes Hämoglobin entsteht in vivo durch nicht-enzymatische
Reaktion von Hämoglobin mit Glucose.
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Die Glykosilierung verläuft über die Bildung einer Schiffschen Base
zwischen der Aldehyd-Gruppe der Glucose und der Aminogruppe des Valin-Restes, der
sich am Aminoende der ß-Kette des Hämoglobins befindet. Das gebildete Aldimin lagert
sich durch Amadori-Reaktion zum N-(l-Desoxy-D-fructos-l-yl)-L-Valin-Rest um, im
folgenden "Fructose-Valin" genannt. In dieser umgelagerten Form ist das glykosilierte
Hämoglobin stabil.
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Im Blut von Erwachsenen beträgt der Anteil an nicht-glykosiliertem
Hämoglobin normalerweise etwa 90 % des totalen Hämoglobin-Gehaltes. Der Anteil von
HbAlc, dem wichtigsten der glykosilierten Hämoglobine, liegt üblicherweise bei 3
bis 6 %. Bei erhöhtem Blutzuckerspiegel nimmt der Anteil der glycosilierten Hämoglobine
am Gesamt-Hämoglobin-Gehait zu. Der Gestalt an HbAlc kann bis auf 15 % ansteigen.
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Die Bestimmung des glykosilierten Hämoglobins hat insbesondere in
der Diabetologie als retrospektiver Langzeit-Parameter des Kohlenhydrat-Stoffwechsels
Bedeutung. Für die Analyse der glykosilierten Hämoglobine
gibt es
eine Reihe von Verfahren. Die geläufigsten Methoden beruhen auf dem Verlust von
positiven Ladungen im Hämoglobin-Molekül, wenn die freien Aminogruppen der ß-Ketten
mit Glucose umgesetzt werden. Vor allem säulenchromatographische und elektrophoretische
Verfahren finden Verwendung. Andere Methoden versuchen die eingebauten Glucosemoleküle
bzw. nach der Amadori-Umlagerung die Fructose-Moleküle colorimetrisch zu erfassen
(ThiobarbitursSure-Methode).
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Die vorbekannten Verfahren sind zum Teil sehr zeitaufwendig und umständlich
und zum Teil auch nicht spezifisch genug für das glykosilierte Hämoglobin. Es bestand
daher weiterhin der Bedarf nach einem Bestimmungsverfahren, das sehr spezifisch
diesen glykosilierten Anteil im Gesamthämoglobin zu erfassen vermag. Aufgabe der
vorliegenden Erfindung war es daher, ein solches Verfahren bereitzustellen. Diese
Aufgabe wira dadurch gelöst, dald zunächst Immunogene bereitgestellt werden, mit
deren Hilfe sehr spezifisch gegen das glykosilierte Hämoglobin gerichtete Antikörper
gewonnen werden können.
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Gegenstand der Erfindung sind daher immunogene der allgemeinen Formel
I
in der R1 Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe, R eine einfache
chemische Bindung, einen Aminosäure-Rest oder einen Peptid-Rest mit 2 bis 7 Aminosäure-Einheiten,
A eine einfache chemische Bindung oder ein Brückenglied und T einen immunogenen
Träger bedeuten, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
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Kernstück dieser Immunogene ist das Tripeptid ValHisLeu, das identisch
ist mit dem Ende der ß-Kette des Hämoglobins. An dieses Tripeptid können weitere
Aminosäure-Reste geknüpft sein, wobei die Zahl dieser Aminosäure bis zu 8 betragen
kann. Die Einführung weiterer Aminosäuren ist wenig sinnvoll, da mit zunehmender
Peptidkette des Immunogens die Spezifität für das glykosilierte N-terminale Ende
der ß-Kette des Hämoglobins verloren geht. Der Peptio-Rest in der Definition von
K in der allgemeinen Formel I weist demnach 2 bis 7 Aminosäure-Einheiten auf. Besonaers
oevorzugt ist ein Di-oder Tripeptid-Rest. Es können im Prinzip alle möglichen Aminosäuren
in die Peptidkette eingebaut werden. Die Aminosäurereste werden vorzugsweise aus
der Gruppe Threonin, Prolin, Glutamin, Lysin, Serin, Alanin una Valin ausgewählt.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die in der ß-Kette des Hämoglobins jeweils
nächstfolgenuen Aminosäuren einzusetzen. Die Gruppe R hat daher ganz besonders bevorzugt
die Bedeutung Thr, ThrPro, ThrProGlu, ThrProGluGlu, ThrProGluGluLys, ThrProGluGluLysSer,
ThrProGluGluLysSerAla, ThrProGluGluLysSerAlaVal oder ThrProGluGluLysSerAlaValThr.
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Das Brückenglied in der Definition der Gruppe A stellt eine üblicherweise
zur Verknüpfung einer Peptidkette mit einem imunogenen Träger verwendete Spacergruppierung
dar.
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Als Brückenglied eignen sich alle üblichen zur Verknüpfung eines Peptid-Restes
mit einem immunogenen Träger verwendeten Gruppierungen, als beispielhaft seien angeführt
t-Aminocarbonsäuren sowie deren Derivate. Die Carboxyl-Funktion der Peptidkette
kann beispielsweise auch mit einem Cystein oder Homo-Cystein substituiert werden,
so daß die Bindung an den Träger über die SH-Gruppe erfolgen kann.
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Als immunogener Träger T können alle üblichen dem Fachmann bekannten
immunogene Trägermaterialien eingesetzt werden.
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Bevorzugt sind Proteine wie Ovalbumin, Edestin, Keyhole Limpet Hemocyanin,
Rinderserumalbumin, Poly-L-Lys, Poly-L-(Lys:Glu) u. ä..
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Zur Herstellung der Immunogene der allgemeinen Formel I werden Fructose-Peptid-Derivate
der allgemeinen Formel II
in der R1 und R die oben angegebene Bedeutung haben und X eine Hydroxygruppe oder
eine reaktive Gruppe bedeuten, mit einem gegebenenfalls aktivierten immunogenen
Träger T gegebenenfalls unter Zwischenschaltung eines Brückengliedes A' verknüpft.
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Als reaktive Gruppe X eignen sich prinzipiell alle in der Peptidchemie
üblicherweise eingesetzten reaktiven Gruppen, besonders bevorzugt sind die N-Hydroxysuccinimidyl-
und die N-Hydroxysulfosuccinimidyl-Gruppe.
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Als Brückenglied A' eignen sich ebenfalls die üblicherweise eingesetzten
bifunktionellen Substanzen, insbesondere Cystein, Homocystein, Diamide, k?-Aminocarbonsäuren,
wobei insbesonuere die Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel III, H2N (CH2)n
COY (III) in der Y eine Hydroxy-, N-Hydroxysuccinlmiay1- oder N-Hydroxysulfosuccinimidyl-Gruppe
und n eine Zahl von 2 - 8 bedeuten, bevorzugt sind.
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Zur Kupplung der Fructose-Peptide der allgemeinen Formel I mit dem
immunogenen Träger T können die üblichen in der Peptidchemie gebräuchlichen Kondensationsreaktion
eingesetzt werden.
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Das Peptid-Derivat der allgemeinen Formel II kann über die reaktive
Gruppe X am Carboxylterminus direkt an das Trägerprotein T gebunden werden. Es ist
aber auch möglich, eine Verbindung der allgemeinen Formel II zunächst mit einer
reaktiven Spacer-Gruppierung A' umzusetzen und die dabei erhaltene Verbindung an
den immunogenen Träger T zu knüpfen. Schließlich kann auch der immunogene Träger
zunächst mit einer Spacer-Gruppierung At verknüpft werden.
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In einem zweiten Schritt wird dann ein Peptidrest der allgemeinen
Formel II an den so modifizierten Träger gebunden. Für all diese Umsetzungen stehen
mehrere, in der Peptidchemie üblichen Methoden zur Verfügung.
Beispielsweise
kann man Verbindungen der allgemeinen Formel II zunächst mit Cystein oder Homo-Cystein
umsetzen.
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Die so erhaltene Cystein bzw. Homocystein-enthaltenden Peptide werden
mit einem immunogenen, Amino-Gruppen-haltigen Träger verknüpft, der zuvor aktiviert
worden ist, zweckmäbigerweise durch Reaktion mit 3-Maleinimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester
(MBS) oder mit Maleinimidohexanoyl-N-Hydroxysuccinimidester (MHS).
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Bevorzugt werden Peptid-Derivate der allgemeinen Formel II nach der
Carboiimid-Methode mit dein immunogenen Träger verbunden. Hierzu wird das reaktive
Peptid-Derivat mit Dicyclohexylcarbodiimid in einen aktiven Ester übergeführt. Das
am Carboxylende so derivatisierte Peptid der allgemeinen Formel II wird dann mit
einem immunogenen Aminogruppen-haltigen Träger verknüpft.
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Wird das Peptid-Derivat der Formel II über ein Brückenglied mit dem
Träger T verknüpft, so ist es vorteilhaft, bei der Peptidsynthese der Verbinaung
der Formel II das Brückenglied A' bereits einzubauen.
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Im Peptid-Derivat der allgemeinen Formel 11 vorhandene Aminogruppen
werden dabei üblicherweise durch Schutzgruppen geschützt, die nach der Umsetzung
in üblicher Weise abgespalten werden können. Solche Schutzgruppen sind beispielsweise
die N$-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe, die mit einer wäßrigen Base, z. B.
verdünnten Ammoniak, verdünnter Natronlauge, entfernt werden kann, oder die tert.-Buthoxy-carbonyl
(BOC)-Gruppe, die üblicherweise durch Reaktion mit wasserfreier Trifluoressigsäure
abgespalten wird.
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Zur Herstellung der Peptid-Derivate der allgemeinen Formel II bedient
man sich der in der Peptidchemie üblichen Synthesewege. Hierbei hat sich besonders
zweckmäßig die Festphasensynthese (Übersicht in G. Barany und R. W.
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Merrifield in Gross, Meierhofer, The Peptides, Vol. 2, S.
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3 - 285, New York, 1978) erwiesen. Die «-Aminogruppen werden dabei
zweckmäßigerweise mit Ni-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe geschützt. Die Seitenkettenfunktionen
werden als tert.-Butylether, tert.-Butylester bzw. als tert.-Butoxycarbonyl(BUC)-ruppe
geschützt. Diese Schutzgruppen werden bei der acidolytischen Spaltung des fertig
syntnetisierten Peptids vom Träger ebenfalls entfernt. Der Zuckerrest wird bei der
Festphasensynthese mit der letzten Aminosäure zusammen als geeignet geschütztes
Eructose-Valin-Derivat eingeführt.
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Die Peptid-Derivate der allgemeinen Formel I1 können auch durch Festphasensynthese
beginnend mit der Carboxylendständigen Aminosäure bis zum Hystidin-Rest hergestellt
und vom Harz abgespalten werden. Der glykosilierte Amino-Terminus wird dann durch
Reaktion mit einem N-geschützten Fructose-Valin-Aktivester, oeispieisweise N-Hydroxysucciiiiinidester
oder N-Hyctroxysuifosuccinimidester mit dem treten Peptid in Wasser oaer Wasser-Dioxan-Gemiscllen
eingeLührt.
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Der Fructose-Rest kann selbstverständlich auch eingeführt werden,
in nem das fertig syntnetisierte Peptid mit Glucose umgesetzt wird mit anschlieender
Amadori-Umlagerung (vgl. K. Heyns und 11. Paulsen, J.
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Liebigs Ann. Chem. 627 [1959], s. 160 - 174 und H. Röper et al., Carbohydrates.
116 L1983], s. 183 - 195).
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Ein für die vorstehend aufgeführten Syntheseverfahren geeignetes Fructose-Valin-Derivat
kann wie folgt dargestellt werden:
Zunächst wird Fructose-Valin
nach literaturbekannten Verfahren nach Heyns und Paulsen bzw. Röper (a. a. O.) dargestellt.
Die Amino-Schutzgruppe führt man wie bei den Hydroxygruppenhaltigen Aminosäuren
ein, z. B. mit Fmoc-N-hydroxysuccinimidester bzw. BOC-N-hydroxysuccinimidester.
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Zur Verwendung in der Festphasensynthese mit Dicyclohexylcarbodiimid(UCC)/N-Hydroxybenzotriázol
(HOBT) als Kupplungsreagenz werden die Hydroxy-Gruppen des Zuckerteils des Zucker-Valin-Derivates
mit Acetyl-, Benzyl- oder sonstigen in der Zuckerchemie üblichen Schutzgruppen blockiert.
Wird der Fructose-Valin-Teil in Lösung gekuppelt, so ist es zweckmäßig, die Carbonsäurefunktion
in üblicher Weise in einen aktivierten Carbonsäureester überzuführen. Besonders
vorteilnaft ist die Einführung einer Succinimidyl-, Sulfosuccinimidyl-oder eine
p-Nitrophenyl-Gruppe.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind spezifisch gegen glykosiliertes
Hämoglobin gerichtete Antikörper.
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Diese können monoklonale oder auch polyklonale Antikörper darstellen.
Die Gewinnung der Antikörper erfolgt nach üblichen Methoden.
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Es können beispielsweise Säugetiere, wie aus, Schaf, Kaninchen, Ratte
oder Meerschweinchen, mit den immunogenen der allgemeinen Formel I immunisiert werden.
Das Immunogen wird dabei vorzugsweise unter Zusatz eines üblichen Hilfsstoffes,
insbesondere dem kompletten "reundscen Adjuvanz", einschließlich eines Puffers,
vorzugsweise Phosphatpuffer, pH 7,4, dem Wirtstier injiziert. Die Injektion kann
dabei an verschiedenen Körperstellen erfolgen, z. B. subkutan, intraperitoneal,
intravenös oder intramuskulär. Zur Gewinnung eines hohen Antikörper-liters wird
die Injektion in regelmälßigen Abständen, z. B. alle
zwei bis vier
Wochen, wiederholt. Die Antikörper enthaltenden Antiseren werden in üblicher Weise
aus dem Blut der Wirtstiere gewonnen.
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Hochspezifische monoklonale Antikörper können mit den erfindungsgemäßen
Peptidimmunogenen der allgemeinen Formel I nach der bekannten Hybridisierungstechnik
gewonnen werden (vgl. Nature 266, [1977], S. 495 und Science 208, [1980], S. 692
ff.).
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Die Antikörperaktivitäten im Serum bzw. in den Hybridoma-Uberständen
werden in üblicher Weise, beispielsweise mit der tnzyinimmunoassay-Techni k durchgeführt.
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Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen immunogene gewonnenen Antikörper
zeichnen sich durch eine hohe Spezifität und hohen Affinität zu glykosiliertem Hämoglobin
aus. Die Kreuzreakion mit nichtglykosiliertem Hämoglobin ist vernachlässigbar gering.
Die erfinaungsgenäiäen Antikörper sowie Fragmente dieser Antikörper eignen sich
dauer hervorragend für die immunolugische Best imflung von glykosiliertem Hämoglobin.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der
erfindungsgemäßen Antikörper bzw. Fragmente dieser Antikörper zur immunologischen
Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1 Herstellung des Peptids H-HisLeuThrProOH Die Peptidsynthese
wird in einem halbautomatischen Peptid-Synthesizer durchgeführt. Man startet mit
5 g Fmoc-Pro-OCH2C6H4()CH2-Harz (0,5 mmol/g Harz) Ein Kupplungsschritt umfaßt die
folgenden Teilschritte: - Deblockieren mit 50 % Piperidin/Methylenchlorid; 1 x 5
min, 1 x 25 min - Waschen mit Methylenchlorid und Dimethylformamid, jeweils 2 x
2 Minuten - Waschen mit hasser/Dioxan, 2:1, 2 x 5 min - Waschen mit Diinethylformamid
und Methylenchloriå, jeweils 3 x 2 min - Aquilibrieren mit dem dreifachen Überschuld
Fmoc-Aminosäure, 5 min - Kupplung mit dem 3, 3fachen Überschuß DCC und HOBT, 1,5
h - Waschen mit Methylenchlorid, Dimethyl£ornamid, Isopropanol, jeweils 2 x 2 min,
3 mal wiederholen - Waschen mit Methylenchlorid 3 x 2 min.
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Das hasch- bzw. Reaktionsvolumen ist jeweils 75 ml.
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In den Kupplungsschritten werden eingesetzt: 1. 2,98 g Fmoc-Thr(tBu)-OH
2. 2,65 g Fmoc-Leu-OH 3. 4,5 g Fmoc-His(Fmoc)-OH.
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Nach dem letzten Kupplungsschritt wird mit Piperidin/Methylenchlorid
deblockiert, gewaschen und mit 50 ml Trifluoressigsäure/Methylenchlorid, 1:1, 1
h bei Raumtemperatur geschüttelt. Man filtriert, wäscht mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid,
1:1, dampft das Filtrat im Volumen ein und gibt 100 ml Ether zu dem Rückstand. Nach
Filtration wird getrocknet und gereinigt durch Chromatographieren an Sephadex G-15
(Eluent: Wasser) und DE-Cellulose (Eluent: Gradient 0,05 M Ammoniumcarbonat bis
0,5 M Ammoniumcarbonat, pH 8,1). Nach Eindampfen der jeweiligen Hauptfraktion erhält
man 760 mg weiße Kristalle MS (FAB):M + H+ = 467.
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In analoger Weise erhält man ausgehend von 12,5 g Fmoc-6-Aminohexansäure-OCH2C6H4OCH2-Harz
mit 7,45 g Fmoc-Thr(tBu)-OH, 6,62 g Fmoc-Leu-OH, 11,25 g Fmoc-His(Fmoc)-OH und 6,36
g BUC-Val-OH 2,7 g H-ValhisLeuThr-6-Aminohexansäure.
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Nach der letzten Kupplung wird direkt vom Harz abgespalten.
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Beispiel 2 l-Desoxy-D-Fructos-l-yl-(Fmoc)-ValHis~ uIhrPro-0H 2,8 g
Fructose-Valin werden in 20 ml lU%igem Natriumcarbonat gelöst und auf 0° C gekühlt.
Dazu tropft man 2,6 g Chlorameisensäure-9-Fluorenylmethylester, gelöst in 15 ml
1,4-Dioxan. Man läßt auf Raumtemperatur erwärmen und rührt noch 5 h. Die Reaktionsmischung
wird im Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft, mit 100 ml Methanol aufgenommen und
mit 20 g Dowex 50 H+ 5 min gerührt. Man filtriert, dampft ein und trocknet über
Posphorpentoxid.
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Ausbeute: 4,5 g Fmoc-Fructose-Valin; MS (FAB): M + H+ = 502.
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Das so erhaltene Produkt wird in 50 ml 1,4-Dioxan aufgenommen, auf
-10° C gekühlt, mit 2 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1 g N-Hydroxysuccinimid versetzt
und 1 h bei -10° C, dann 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen
Dicyclohexyl-Harnstoff ab und fällt den Hydroxysuccinimidester mit Diisopropyläther
aus. Nach dem Trocknen erhält man: 5,4 g.
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MS (FAB): M + H+ = 616.
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500 mg H-HisLeuThrPro-0H werden in 5,0 ml Wasser una 1,7 ml 1N Natronlauge
gelöst. Man gibt 2,1 g von dem oben erhaltenen N-Hydroxysuccinimidester zu una rührt
5 h.
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Dabei wird der pH-Wert bei 8,5 gehalten. Man uampft im Vakuum ein
und chromatographiert an Sephadex LH 20 (Eluent: Methanol). Ausbeute: 780 mg MS
(FAB): M + H+ = 951.
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Beispiel 3 l-Desoxy-D-Fructos-l-yl-ValHìsLeuTìlr-6-Aminohexansäure
3,1 g Glucose, 2,5 g H-ValHisLeupro-6-Aminohexansäure una 0,4 g Natriumpyrosulfit
werden 3 h in 10 ml Methanol/Wasser 1:1 unter Rückflub erhitzt.
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Man dampft ein, chromatographiert an Sephadex G-25 (Eluent: Wasser)
und Dowex 50 H+. Man wäscht zuerst mit Ethanol/Wasser, 1:1, dann mit Wasser und
eluiert anschließend das Produkt mit 0,1 M Ammoniak.
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Ausbeute: 250 mg; MS (FAB): M + H+ = 744.
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Beispiel 4 l-Desoxy-D-fructos-l-yl-ValHisLeuThrPro-Edestin-Immunogen
200 mg l-Dexoxy-D-fructos-l-yl-(Fmoc)-ValHisLeuThrPro-OH werden in 10 ml Dioxan
aufgenommen und mit 40 nig Dicyclohexylcarbodiimid und 40 mg N-Hydroxysuccinimid
behandelt. Nach 5 h saugt man den Niederschlag ab und tropft die Lösung zu einer
Suspension von 0,5 g Edestin in 50 ml Wasser, die auf pH 8,5 eingestellt ist.
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Man rührt 2 Tage bei Raumtemperatur und hält dabei den pH-Wert auf
8,5.
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Man zentrifugiert, rührt 6 h mit 100 ml 0,1 N Ammoniak und stellt
mit Salzsäure einen pH-Wert von 7 ein. 3 x wird dann zentrifugiert und mit 20 ml
Wasser/Dioxan, 5:1, gewaschen.
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Beispiel 5 l-Desoxy-D-Fructos-l-yl-ValHisLeuThr-6-Aminohexansäure-Edestin-Immunogen
Zu einer Suspension von 0,5 g Eaestin in 50 ml wasser gibt man bei pH 8 200 mg l-Desoxy-D-Fructos-l-yl-ValHisLeuThr-6-Aminohexansäure
und 70 mg Ethyl,diethylaminoethylcarbodiimid-Hyurocillorid. Nach 2 Tagen Rühren
bei Raumtemperatur wird abzentritugiert und der Niederschlag 3 mal mit 20 ml wasser
gewaschen.
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Beispiel 6 Gewinnung von monoklonalen Antikörpern 600 /ug Immunogen
aus Beispiel 4 oder 5 werden mit 2 ml einer Emulsion aus kompletten Freundschen
Adjuvanz mit Phosphatpuffer pH 7,4 vermischt. Dieses Gemisch wird Mäusen an mehreren
Stellen injiziert. Im ersten Monat der Immunisierung wird wöchentlich appliziert,
danach nur noch einmal pro Monat.
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Nach 6 Monaten wird die Fusion mit einer Maus-Myeloma-Zellinie nach
Köhler und Milstein (Nature 256 [1975] Seite 495 - 497) zur Gewinnung der monoklonalen
Antikörper vorgenommen. Die erhaltenen Hybridoma-Zellinien werden in üblicher Weise
selektioniert und kloniert.
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Man gewinnt auf diese Weise mehrere Hybridoma-Zellinien, die monoklonale
Antikörper proauzieren, die nicht nur gegen das eingesetzte Immunogen, sondern auch
gegen glykosiliertes Hämoglobin sehr spezifisch sind.
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Beispiel 7 Gewinnung eines polyklonalen Antikörper Kaninchen werden
nach dem selben Verfahren wie im beispiel 6 mit dem Immunogen aus Beispiel 4 oder
Beispiel 5 immunisiert. Nach 8 wochen und uarauffolgend jeden Monat wird die AntiKörper-Aktivität
des Serums immunologisch (siehe Beispiel 8) getestet.
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Nach 6 Monaten kann bei 6 von 10 Wirtstieren die Bildung des Antikörpers
nachgewiesen werden, der in üblicher Weise isoliert werden kann.
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Beispiel 8 Nachweis der Antikörper-Aktivität Die Antikörper-Aktivität
wira mit einem konventionellen Enzymimmunoassay getestet. Hierzu wird eine ELISA-Platte
mit einem entsprechenden menschlichen Serumalbumin-Peptid-Konjugat, hergestellt
analog Beispiel 4 und Beispiel 5, 3 Stunden bei Raumtemperatur in Phosphat pH 9
inkubiert. Man wäscht mit einer 0,4 M Natriumchloridlösung, die 1 mg/ml Rinderserumalbumin
enthält. Danach wird mit den Serumproben bzw.
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Kulturüberständen 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und mit derselben
Waschlösung gewaschen. In einem analogen Inkubations-/Waschschritt behandelt man
mit Schaf-Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat bzw. mit Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat
(1:1000 verdünnt) 1 h bei Raumtemperatur. Als Substrat wird eine ABTS/H202-Lösung
verwendet.
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Die Kreuzreaktion der erfindungsgemäßen Antipeptid-Antikörper mit
glykosiliertem Hämoglobin und Hämoglobin wurde in einem kompetitiven Enzymimmunoassay
nachgewiesen. Man läßt beispielsweise die klon-Überstände mit glykosiliertem Hämoglobin
vorreagieren und verfährt nach dem oben bescriebenen Verfahren. Von den durch Immunisierung
mit den Immunogenen gemä Beispiel 4 und Beispiel 5 nach den Beispielen 6 und 7 erhaltenen
Antikörper zeigen einige eine Kreuzreaktivität gegen glykosiliertem Hämoglobin.
Eine Kreuzreaktivität mit nicht glykosiliertem Hämoglobin wurde nict beobachtet.