DE19952568C2

DE19952568C2 - Fluorescence-labeled nucleic acid ligands

Info

Publication number: DE19952568C2
Application number: DE19952568A
Authority: DE
Inventors: Volker A Erdmann; Jens Peter Fuerste; Claudia Gauglitz; Sven Klusmann
Original assignee: Noxxon Pharma AG
Current assignee: TME Pharma AG
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: DE19952568A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Zielmole küls gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1; ferner ein Verfahren zur schnellen und direkten Bestimmung von Bindungskonstanten eines Ligand-Target-Komplexes gemäß Anspruch 20, insbesondere unter Verwendung von Nukleinsäuren als Li ganden; ferner die Verwendung dieses Verfahrens im Rahmen diagnostischer und analytischer Untersuchungen.The invention relates to a method for determining the concentration of a target mole küls according to the preamble of claim 1; also a method for rapid and direct determination of binding constants of a ligand-target complex according to claim 20, in particular using nucleic acids as Li ligands; furthermore the use of this method in the context of diagnostic and analytical investigations.

Diagnostika dienen der Überprüfung von Zustand und Funktion des menschlichen Körpers und seiner Organe. Sie können prinzipiell im und am Organismus (unmittel bar) oder außerhalb des Körpers (mittelbar) angewandt werden. Zu den mittelbaren Diagnostika zählen unter anderem die Reagenzien der Harn- und Blutanalytik. Die unmittelbaren, oral oder parenteral zu applizierenden Diagnostika können für die Stoffwechsel-, Funktions- und Organdiagnostik verwendet werden. Diagnostika die nen der Kontrolle des Krankheitsverlaufs, der Therapiekontrolle sowie der Therapie steuerung. Sie können chemischer, biochemischer oder immunologischer Herkunft sein. Die mit Diagnostika durchgeführten Bestimmungsmethoden sollten bei hoher Spezifität, Genauigkeit und Nachweisempfindlichkeit schnell und einfach durchführ bar und nach Möglichkeit auch automatisierbar sein.Diagnostics are used to check the condition and function of the human Body and its organs. You can in principle in and on the organism (immediate bar) or outside the body (indirect). To the indirect Diagnostics include the reagents used in urine and blood analysis. The Immediate, oral or parenteral diagnostics can be used for Metabolism, function and organ diagnostics can be used. Diagnostics the control of the course of the disease, control of therapy and therapy control. They can be of chemical, biochemical or immunological origin his. The determination methods performed with diagnostics should be high Perform specificity, accuracy and sensitivity quickly and easily cash and, if possible, can also be automated.

Viele diagnostische und umweltanalytische Verfahren beruhen darauf, bestimmte Substanzen und deren Konzentrationen in physiologischen oder nichtphysiologi schen Testmedien nachzuweisen. Die Art und Funktion des nachzuweisenden Mo leküls kann dabei stark variieren. Es kann sich dabei um makro- oder niedermoleku lare körpereigene Stoffe aber auch um Arznei- oder Giftstoffe (z. B. Pestizide) han deln, deren Konzentration im Serum, in Organen oder auch in Boden- oder Luftpro ben nachzuweisen sind. Da die Konzentration der nachzuweisenden Stoffe häufig sehr niedrig ist, ist es wichtig, empfindliche und zuverlässige analytische Methoden zur Verfügung zu haben.Many diagnostic and environmental analytical procedures rely on certain Substances and their concentrations in physiological or non-physiological test media. The type and function of the Mo leküls can vary widely. It can be macro or low molecular weight The body's own substances are also concerned with medicinal or toxic substances (e.g. pesticides) deln, their concentration in serum, in organs or in soil or air pro must be proven. Because the concentration of the substances to be detected often is very low, it is important to use sensitive and reliable analytical methods to have available.

Bei der Suche nach neuen Diagnostika ist die Bestimmung der Bindungskonstanten des Targetkomplexes von essentieller Bedeutung. Die Wechselwirkungen zwischen einem Diagnostikum und dessen Zielstrukturen werden durch physikalisch chemisch definierbare Bindungskräfte bestimmt. Das Ausmaß dieser Kräfte hängt von der Art und Anzahl der Partialstrukturen ab, die an der Bindung beteiligt sind. Auch die stereochemischen Möglichkeiten, die die Moleküle zur Anpassung an mak romolekulare Bindungspartner (z. B. Proteine und Rezeptoren) oder auch kleinere Targetstrukturen (z. B. niedermolekulare Arzneistoffe, Neurotransmitter) haben, wir ken sich entscheidend auf die Stärke der Komplexbildung aus.When looking for new diagnostics is the determination of the binding constants of the target complex of essential importance. The interactions between a diagnostic and its target structures are physically chemically definable binding forces determined. The extent of these forces depends depends on the type and number of partial structures involved in the binding. Also the stereochemical possibilities that the molecules have to adapt to mak romolecular binding partners (e.g. proteins and receptors) or smaller ones We have target structures (e.g. low molecular weight drugs, neurotransmitters) have a decisive influence on the strength of the complex formation.

In der modernen Labordiagnostik haben sich Immunoassays aufgrund der hohen Spezifität der hierbei verwendeten Antikörper etabliert. Antigene Substanzen wer den dabei in vitro durch Antigen-Antikörper-Reaktionen als Prinzip immunologischer und serologischer Testverfahren mit unterschiedlichem Testaufbau nachgewiesen. Antigene und Antikörper können dabei frei (gelöst) oder gebunden, markiert oder unmarkiert vorliegen. Die Möglichkeit der Markierung eines Antikörpers ist dabei vielfältig (z. B. mit einem Radionuklid, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem En zym) und hängt vom gewählten Nachweisverfahren ab. Bei den Immungssays kön nen kompetitive und nichtkompetitive Nachweismethoden angewandt werden. Die Antigen-Antikörper-Komplexbildung kann direkt (z. B. turbimetrisch, nephelo metrisch oder mit Hilfe der Biosensorik) oder indirekt (anhand der Markierung) aus gewertet werden.In modern laboratory diagnostics, immunoassays are due to the high Specificity of the antibodies used here established. Antigenic substances who the in vitro through antigen-antibody reactions as a principle of immunological and serological test procedures with different test setups. Antigens and antibodies can be free (dissolved) or bound, labeled or unmarked. The possibility of labeling an antibody is included diverse (e.g. with a radionuclide, a fluorescent dye or an ene zym) and depends on the chosen detection method. In the immunization tests competitive and non-competitive detection methods are used. The Antigen-antibody complex formation can occur directly (e.g. turbimetric, nephelo metric or with the help of biosensor technology) or indirectly (based on the marking) get ranked.

Bei kompetitiven Immungssays werden die nicht durch ein Antigen gebundenen Bindungsstellen des Antikörpers durch Zugabe eines weiteren markierten Antikör pers (Anti-Komplex-Antikörper, Reporter) nachgewiesen (Cook & Self, 1995). Der Nachweis ist besonders problematisch, wenn geringe Konzentrationen einer antige nen Struktur bestimmt werden sollen. In diesem Fall wird eine große Menge des Reporters gebunden. Das Ausgangssignal ist daher zwangsläufig hoch. Der Unter schied der Signalstärke zweier Proben mit niedrigen, aber unterschiedlichen Anti genkonzentrationen wird somit im Verhältnis zur Gesamtsignalstärke sehr klein. Kompetitive Assays besitzen deshalb eine eingeschränkte Sensitivität. Eine weitere Variante eines kompetitiven Immungssays ist der Einsatz zweier Antikörper, die miteinander um das Antigenepitop konkurrieren. Bei Zugabe des zweiten Antikör pers, wird der erste aus dem gebildeten Komplex verdrängt. Nachgewiesen wird dann die Konzentration des freien ersten Antikörpers.In competitive immunoassays, those not bound by an antigen are used Binding sites of the antibody by adding another labeled antibody pers (anti-complex antibody, reporter) detected (Cook & Self, 1995). The Detection is particularly problematic when low concentrations of an antigen structure should be determined. In this case, a large amount of the Reporters bound. The output signal is therefore necessarily high. The sub the signal strength of two samples with low but different anti gene concentrations thus becomes very small in relation to the overall signal strength. Competitive assays are therefore of limited sensitivity. Another A variant of a competitive immunoassay is the use of two antibodies, the compete with each other for the antigen epitope. When adding the second antibody pers, the first is displaced from the complex formed. Is proven then the concentration of the free first antibody.

Zu den wichtigsten nichtkompetitiven Immungssays zählt das Sandwich-Verfahren. Bei diesem Assay werden ebenfalls zwei Antikörper eingesetzt. Diese konkurrieren jedoch nicht miteinander um die gleiche Bindungsstelle. Entweder erkennen sie ver schiedene Epitope des Antigens oder der zweite Antikörper bindet an den bereits im Komplex befindlichen, ersten Antikörper. In beiden Fällen ist der nachträglich zuge gebene Antikörper markiert und seine Komplexkonzentration wird gemessen. Nachteilig an dem Sandwich-Verfahren ist die Schwierigkeit der Herstellung von Antikörpern gegen niedermolekulare Stoffe wie z. B. das hier verwendete Adenosin. Zum einen ist es generell problematisch, bei niedermolekularen Verbindungen, wie es die meisten Arzneistoffe, Drogen, Umweltgifte, kleinere Peptide und Metaboliten sind, Antikörper gegen zwei unterschiedliche Epitope der antigenen Struktur zu ent wickeln. Ein weiteres Problem ist es, daß beim Sandwich-Assay beide Antikörper gleichzeitig an das antigene Molekül binden müssen. Damit läßt sich das Sandwich- Verfahrens zum Nachweis sehr kleiner Moleküle nicht mehr anwenden.The sandwich method is one of the most important non-competitive immunization assays. Two antibodies are also used in this assay. These compete but not around the same binding site. They either recognize ver different epitopes of the antigen or the second antibody binds to the one already in the Complex first antibody. In both cases it is added later the antibodies given are labeled and their complex concentration is measured. A disadvantage of the sandwich process is the difficulty in producing Antibodies against low molecular weight substances such. B. the adenosine used here. On the one hand, it is generally problematic with low molecular weight compounds such as most of the drugs, drugs, environmental toxins, smaller peptides and metabolites are antibodies against two different epitopes of the antigenic structure wrap. Another problem is that in the sandwich assay both antibodies bind to the antigenic molecule at the same time. This allows the sandwich Do not use the procedure for the detection of very small molecules.

Als der Erfindung nächstkommender Stand der Technik beschreiben Kleinjung et al. (Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) beschreiben einen Biosensor für L-Adenosin, bei dem modifizierte Nukleotide eingeführt werden können, um ein Bindungsereignis direkt darzustellen, wobei die spezifische Position der fluoreszierenden Gruppe in nerhalb einer als Liganden dienenden Nukleinsäure jedoch nicht spezifiziert ist.As the closest prior art to the invention, Kleinjung et al. (Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) describe a biosensor for L-adenosine, in to which modified nucleotides can be introduced to create a binding event directly depicting the specific position of the fluorescent group in is not specified within a nucleic acid serving as a ligand.

Die DE 37 85 591 T2 offenbart keine spezifische Ausgestaltung des dort verwende ten Nukleinsäure-Liganden. Diese Druckschrift offenbart nicht die spezifische Aus gestaltung des Nukleinsäure-Liganden; die Markierung ist terminal angebracht und nicht, wie Gegenstand der vorliegenden Erfindung in einer Schleife oder einer un gepaarten Region der Nukleinsäure, wobei hier ungepaart im. Sinne eines "bulge" zu verstehen ist und nicht etwa auch ein 5'- oder 3'-Ende einer Nukleinsäuresequenz bezeichnen kann.DE 37 85 591 T2 does not disclose any specific embodiment of the use there nucleic acid ligands. This document does not disclose the specific Aus design of the nucleic acid ligand; the marking is attached and not as the subject of the present invention in a loop or un paired region of the nucleic acid, where unpaired in. Sense of a "bulge" too is to be understood and not also a 5 'or 3' end of a nucleic acid sequence can designate.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es mithin, ein System zur direkten und nichtkompetitiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen einem Ligan den und seinem Targetmolekül zur Verfügung zu stellen. Weitere Aufgabe der Er findung ist es, dieses System ohne Markierung mit radioaktiven Isotopen zur Verfü gung zu stellen.The object of the present invention is therefore a system for direct and non-competitive determination of dissociation constants between a ligan to provide the and its target molecule. Another task of the Er It is the invention to provide this system without radioactive isotope labeling supply.

Die in vitro-Evolution bietet die Möglichkeit, ausgehend von großen Nukleinsäurebibliotheken hochaffine RNAs (haRNAs) oder DNAs (haDNAs) gegen nahezu jedes beliebige Target (z. B. Arzneistoffe, Hormone, Neurotransmitter, Metaboliten, Proteine und Pestizide) zu entwickeln (Gold et al., 1995; Uphoff et al., 1996). Diese Nukleinsäureliganden, die je nach ihrer Struktur als Aptamere (Ellington & Szostak, 1990) oder Spiegelmere (Klußmann et al., 1996; Klußmann et al., 1990; PCT/EP 97/04726) bezeichnet werden können, binden ihr Target wie ein Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität. Im Gegensatz zu den Antikörpern besitzen sie jedoch den enormen Vorteil, daß sie chemisch synthetisierbar sind. Auch die US 5,958,691 beschreibt den Einbau modifizierter Nukleotide während des Verfahrens der in vitro-Evolution (SELEX) von Aptameren und stellt allgemeinen Stand der Technik dar.The in vitro evolution offers the possibility of starting from large Nucleic acid libraries against high affinity RNAs (haRNAs) or DNAs (haDNAs) almost any target (e.g. drugs, hormones, neurotransmitters, Metabolites, proteins and pesticides) (Gold et al., 1995; Uphoff et al., 1996). These nucleic acid ligands act as aptamers depending on their structure (Ellington & Szostak, 1990) or Spiegelmere (Klussmann et al., 1996; Klußmann et al., 1990; PCT / EP 97/04726) can be used to integrate their target like Antibodies with high affinity and specificity. In contrast to the antibodies However, they have the enormous advantage that they can be synthesized chemically. No. 5,958,691 also describes the incorporation of modified nucleotides during the Method of in vitro evolution (SELEX) of aptamers and represents general State of the art.

Hochaffine Nukleinsäuren zeichnen sich im Vergleich zu Antikörpern durch ihren einfachen Aufbau und ihre geringe Größe aus. Während ein Nukleinsäureligand aus einer oder zwei miteinander hybridisierten kurzen Oligonukleotidketten (ca. 15 bis 60 Nukleotide) besteht, ist ein IgG-Antikörper aus vier Polypeptidketten zusammenge setzt, die zudem noch über mehrere Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Mit einer molaren Masse von ca. 150.000 Da enthält ein Antikörper ca. 1360 Aminosäu ren. Ein großer Vorteil, den hochaffine Nukleinsäuren somit gegenüber Antikörpern haben, ist die Möglichkeit, sie chemisch herstellen zu können.Highly affine nucleic acids are characterized by their compared to antibodies simple structure and small size. During a nucleic acid ligand one or two short oligonucleotide chains hybridized with each other (approx. 15 to 60 Nucleotides), an IgG antibody is composed of four polypeptide chains sets, which are also linked together via several disulfide bridges. With a molar mass of approx. 150,000 Da, an antibody contains approx. 1360 amino acids Ren. A great advantage, the high affinity nucleic acids over antibodies is the possibility of being able to manufacture them chemically.

Die chemische Synthese bietet ein Werkzeug zum Einbau modifizierter Nukleotide an vorbestimmte Positionen innerhalb eines Liganden. Dies ist z. B. wichtig für die Stabilisierung eines Liganden gegenüber enzymatischer Spaltung oder auch bei der Strukturanalyse von Nukleinsäureliganden bzw. Ligand-Target-Komplexen.Chemical synthesis offers a tool for incorporating modified nucleotides at predetermined positions within a ligand. This is e.g. B. important for the Stabilization of a ligand against enzymatic cleavage or at Structural analysis of nucleic acid ligands or ligand target complexes.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Durch diese erfindungsgemäßen Maßnahmen wird ein System zur direkten und nichtkompetitiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen einem Ligan den und seinem Targetmolekül durch Fluoreszenztitration geschaffen. Die Erfindung arbeitet ohne Markierung mit radioaktiven Isotopen und verknüpft zwei Techniken miteinander, die in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen haben, nämlich die in vitro-Evolution von Nukleinsäuren und die Fluoreszenzspektroskopie.This object is achieved by the features listed in claim 1. Through these measures according to the invention, a system for direct and non-competitive determination of dissociation constants between a ligan the and its target molecule created by fluorescence titration. The invention works with radioactive isotopes without labeling and combines two techniques with each other, which have become increasingly important in recent years, namely the in vitro evolution of nucleic acids and fluorescence spectroscopy.

Durch den erfindungsgemäßen Einbau einer fluoreszierenden Base in einen Nuk leinsäure-Liganden ist es nunmehr möglich, über die Bindungskonstante eines Li gand-Target-Komplexes und damit auch über die Targetkonzentration in der Testlö sung Aussagen treffen zu können. Meßgröße ist hierbei die Änderung der Fluores zenzintensität der Nukleinsäure bei Komplexbildung. Die Integration der Reporter gruppe in den Liganden ermöglicht eine nichtkompetitive analytische Messung und liefert dadurch bessere Ergebnisse als kompetitive Methoden. Als Reportergruppe wird vorzugsweise - aber nicht ausschließlich - 1,N⁶-Ethenoadenosin verwendet, das nach Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 300 nm starke Fluoreszenz mit ei nem Maximum bei 410 nm aufweist. Der Fluorophor ersetzt in der Sequenz des Liganden ein Adenosin, das sich vorzugsweise in einer Loop- oder Bulge-Position befindet. Da an dieser Position keine Basenpaarung vorliegt, wird die räumliche Struktur des Moleküls auch nach Substitution weitgehend erhalten bleiben. Dadurch ist eine vergleichsweise starke Bindung des Targetmoleküls an den neuen RNA- Liganden wahrscheinlich. Die Fluoreszenzintensität der Reportergruppe ist überra schenderweise trotz eines möglichen Quenchingeffektes durch den Einbau in ein Oligomer noch ausreichend stark. Die Position der Reportergruppe innerhalb des Oligoribonukleotidliganden wird deshalb so gewählt, daß bei Bindung des Targetmo leküls an den Liganden ein deutlicher Effekt auf die Fluoreszenzeigenschaften der Testlösung nachzuweisen ist (Fluoreszenzsminderung oder -steigerung in Abhän gigkeit von der zugegebenen Targetmenge und damit auch von der Konzentration des entstehenden Komplexes). By incorporating a fluorescent base into a nucleic acid ligand according to the invention, it is now possible to be able to make statements about the binding constant of a ligand-target complex and thus also about the target concentration in the test solution. The measured variable here is the change in the fluorescence intensity of the nucleic acid during complex formation. The integration of the reporter group in the ligands enables a non-competitive analytical measurement and thus delivers better results than competitive methods. The reporter group used is preferably, but not exclusively, 1, N ⁶ -thenoadenosine which, after irradiation with light of wavelength 300 nm, has strong fluorescence with a maximum at 410 nm. The fluorophore replaces an adenosine in the sequence of the ligand, which is preferably in a loop or bulge position. Since there is no base pairing at this position, the spatial structure of the molecule will largely be retained even after substitution. A comparatively strong binding of the target molecule to the new RNA ligand is therefore likely. Surprisingly, the fluorescence intensity of the reporter group is still sufficiently strong despite a possible quenching effect due to the incorporation into an oligomer. The position of the reporter group within the oligoribonucleotide ligand is therefore chosen so that when the target molecule is bound to the ligand, a clear effect on the fluorescence properties of the test solution can be demonstrated (fluorescence reduction or increase depending on the amount of target added and thus also on the concentration of the emerging complex).

Im Sinne der Erfindung werden als "bulge"-Regionen im Englischen ungepaarte Nukleinsäure-Regionen bezeichnet. Die der Erfindung zugrundeliegende Markie rung ist in einer Schleife oder einer ungepaarten Region der Nukleinsäure angeord net, wobei hier ungepaart im Sinne eines "bulge" zu verstehen ist und nicht etwa auch ein 5- oder 3'-Ende einer Nukleinsäuresequenz bezeichnen kann.For the purposes of the invention, "bulge" regions are unpaired in English Designated nucleic acid regions. The Markie on which the invention is based tion is arranged in a loop or an unpaired region of the nucleic acid net, whereby unpaired is to be understood in the sense of a "bulge" and not about can also denote a 5 or 3 'end of a nucleic acid sequence.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein System zur direkten und nicht radioaktiven Bestimmung von Dissoziationskonstanten zwischen Nukleinsäureliganden und ih rem Zielmolekül geschaffen. Durch den Austausch von Adenosin durch 1,N⁶- Ethenoadenosin, eines fluoreszierenden Derivats des natürlich vorkommenden Nukleotids Adenosin, in eine Nukleinsäure (D-DNA oder L-DNA oder D-RNA oder L- RNA) mittels automatisierter Phosphoramidit-Festphasensynthese kann ein Nukleinsäureligand hergestellt werden, der zusätzlich zu seinen bindenden Eigen schaften selbst als Signalmolekül zur fluorimetrischen Detektion dient. Das Problem der geringen Stabilität des Fluorophors in basischem Milieu kann durch den Einsatz von Phosphoramiditen mit leicht abspaltbaren Schutzgruppen an den Aminofunktio nen und daraus folgenden geringen alkalischen Entschützungszeiten umgangen werden. Die durch direkte fluorimetrische Titration erhaltenen Dissoziationskonstan ten sind mit denen vergleichbar, die durch die nichtkompetitive Gleichgewichtsdialy se erhalten werden. Durch den Austausch des Adenosins an verschiedene Positio nen eines Nukleinsäureliganden können zudem erste Aussagen über seine Beteili gung am Bindungsvorgang bei der Komplexbildung gemacht werden (kinetische Messungen).The present invention provides a system for the direct and non-radioactive determination of dissociation constants between nucleic acid ligands and their target molecule. By replacing adenosine with 1, N ⁶ - ethenoadenosine, a fluorescent derivative of the naturally occurring nucleotide adenosine, into a nucleic acid (D-DNA or L-DNA or D-RNA or L-RNA) using automated phosphoramidite solid-phase synthesis, a nucleic acid ligand can be produced, which in addition to its binding properties itself serves as a signaling molecule for fluorometric detection. The problem of the low stability of the fluorophore in a basic environment can be avoided by using phosphoramidites with easily removable protective groups at the amino functions and the resulting short alkaline deprotection times. The dissociation constants obtained by direct fluorimetric titration are comparable to those obtained by the non-competitive equilibrium dialysis. By exchanging the adenosine at different positions of a nucleic acid ligand, first statements can be made about its participation in the binding process in complex formation (kinetic measurements).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für hochaffine Nukleinsäuren ist es möglich auch sehr kleine Moleküle in der klinischen Diagnostik nachzuweisen. Bei fluori metrischer Quantifizierung von Komplexen zwischen hochaffinen Nukleinsäuren und ihrem Target war es bisher notwendig, den Analyten nach der Selektion durch Kopplung mit einer fluoreszierenden Reportergruppe zu modifizieren. Somit wurde nicht die Affinität zwischen Ligand und Target, sondern die Affinität zum modifizier ten Bindungspartner gemessen. Erst mit der kompetitiven Verdrängung des modifi zierten Moleküls durch seine unmodifizierte Variante konnten Erkenntnisse über den Bindungsvorgang gesammelt werden, der untersucht werden sollte. Nachteil einer kompetitiven Bestimmung von Bindungskonstanten gegenüber eines nichtkompetiti ven Assays ist die größere Ungenauigkeit des Verfahrens. Bei Anwendung eines kompetitiven Verfahrens werden zwei Bindungsvorgänge quantifiziert. Dieses kann zu einer erhöhten Meßungenauigkeit führen. Ein Vergleich von Dissoziati onskonstanten, die mit nichtkompetitiven und kompetitiven Verfahren parallel ermit telt wurden, zeigt deutliche Unterschiede zwischen den ermittelten K_d-Werten (Jeni son et al., 1994; Klußmann, 1996). Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein gesetzte Ligand hingegen hat eine fluoreszierende Reportergruppe in seiner Se quenz integriert. Somit ist eine fluorimetrische Quantifizierung auch ohne zusätzli che Markierung des Targets möglich.With the method according to the invention for high-affinity nucleic acids, it is also possible to detect very small molecules in clinical diagnostics. In the case of fluorometric quantification of complexes between high-affinity nucleic acids and their target, it was previously necessary to modify the analyte after selection by coupling it with a fluorescent reporter group. Thus, it was not the affinity between ligand and target that was measured, but rather the affinity for the modified binding partner. Only with the competitive displacement of the modified molecule by its unmodified variant was it possible to gain knowledge about the binding process that was to be investigated. The disadvantage of a competitive determination of binding constants compared to a non-competitive assay is the greater inaccuracy of the method. When using a competitive process, two binding processes are quantified. This can lead to increased measurement inaccuracy. A comparison of dissociation constants, which were determined in parallel using non-competitive and competitive methods, shows clear differences between the K _d values determined (Jenison et al., 1994; Klußmann, 1996). The ligand used in the method according to the invention, however, has a fluorescent reporter group integrated in its sequence. Fluorimetric quantification is therefore also possible without additional marking of the target.

Vorteilhaft hat sich die Verwendung von 1,N⁶-Ethenoadenosin als Fluorophor zum Einbau in einen Liganden erwiesen. Die Base 1,N⁶-Ethenoadenin kann physiolo gisch durch den Kontakt mit Vinylhalogeniden, Urethanen und Vinylcarbamaten aus Adenin gebildet werden (Barbin et al., 1975). Diese karzinogenen Verbindungen sind gängige Industriechemikalien und werden durch das Cytochrom-P450 System zu ihren entsprechenden Epoxiden metabolisiert. Die so entstandenen hoch reakti ven Verbindungen können Adenosin, Cytosin und Guanosin zu den zyklischen DNA-Addukten, 1,N⁶-Ethenodesoxyadenosin, N²,3-Ethenodesoxyguanosin und 3,N⁴-Ethenodesoxycytosin modifizieren. In den betroffenen DNA-Regionen entste hen dann Fehler bei der Replikation und Transkription (Barbin et at, 1981; Hall et at 1981; Kusmierek & Singer, 1982).The use of 1, N ⁶ -thenoadenosine as a fluorophore for incorporation into a ligand has proven to be advantageous. The base 1, N ⁶ -thenoadenin can be formed physiologically by contact with vinyl halides, urethanes and vinyl carbamates from adenine (Barbin et al., 1975). These carcinogenic compounds are common industrial chemicals and are metabolized to their corresponding epoxides by the cytochrome P450 system. The resulting highly reactive compounds can modify adenosine, cytosine and guanosine to form the cyclic DNA adducts, 1, N ⁶ -ethenodeoxyadenosine, N ² , 3-ethenodeoxyguanosine and 3, N ⁴ -ethenodeoxycytosine. Errors in replication and transcription then occur in the affected DNA regions (Barbin et at, 1981; Hall et at 1981; Kusmierek & Singer, 1982).

1,N⁶-Ethenoadenosin weist große strukturelle Ähnlichkeit zum natürlich in der Nuk leinsäure vorkommendem Adenosin auf. Als Nukleotid unterbricht es das Zucker- Phosphat-Rückgrad der Nukleinsäurestruktur nicht. Außerdem besitzt das fluores zierende Nukleotid in etwa die gleiche Größe wie die vier natürlichen Nukleotide und beeinflusst deshalb die Sekundär- und Tertiärstruktur des Liganden und somit auch die Bildung eines Liganden-Target-Komplexes kaum. Als aromatischer Fluorophor ist es bei Anregung durch Licht zur Eigenfluoreszenz fähig. 1,N⁶-Ethenoadenosin zeigt starke Fluoreszenz mit einer Lebensdauer von 20 nsec in Wasser. Bei Anre gung mit Licht der Wellenlänge 300 nm liegt das Fluoreszenzmaximum im neutralen Milieu bei 410 nm (Barrio et al., 1972).1, N ⁶ -thenoadenosine shows great structural similarity to adenosine naturally occurring in the nucleic acid. As a nucleotide, it does not interrupt the sugar-phosphate backbone of the nucleic acid structure. In addition, the fluorescent nucleotide is approximately the same size as the four natural nucleotides and therefore hardly influences the secondary and tertiary structure of the ligand and thus also the formation of a ligand-target complex. As an aromatic fluorophore, it is capable of self-fluorescence when excited by light. 1, N ⁶ -thenoadenosine shows strong fluorescence with a lifespan of 20 nsec in water. When excited with light of wavelength 300 nm, the fluorescence maximum in the neutral environment is 410 nm (Barrio et al., 1972).

Die Platzierung des 1,N⁶-Ethenoadenosins in eine Loop- oder Bulge-Region des Liganden hat sich als vorteilhaft erwiesen, weil keine Doppelstrangregionen oder Helixstrukturen durch Störung von Watson-Crick Basenpaarungen aufgebrochen werden. Durch die Ethenobrücke zwischen den Positionen N1 und N6 des Adeno sins und dem dadurch entstandenen zusätzlichen dritten Ring im Molekül steht der Wasserstoff an N1 des Adenosins nicht mehr für die Ausbildung einer Wasserstoff brückenbindung mit dem Sauerstoff des Uridins zur Verfügung. An der Position N6 ändert sich außerdem die sterische Ausrichtung des freien Elektronenpaares des Stickstoffatoms. Auch hier kann keine Wasserstoffbrücke mehr mit Uridin ausgebil det werden.The placement of the 1, N ⁶ -thenoadenosine in a loop or bulge region of the ligand has proven to be advantageous because no double-stranded regions or helix structures are broken up by disturbing Watson-Crick base pairs. Due to the ethene bridge between positions N1 and N6 of adenosine and the resulting additional third ring in the molecule, the hydrogen at N1 of adenosine is no longer available for the formation of a hydrogen bond with the oxygen of uridine. At position N6, the steric orientation of the nitrogen lone pair also changes. Here, too, it is no longer possible to form a hydrogen bond with uridine.

Hervorzuheben ist, dass Ethenoadenosin nur eines der möglichen von vielen be kannten fluoreszenten Basenanaloga ist. Weiterhin sind auch fluoreszente Gruppen denkbar, die an andere Positionen der Nukleinsäure gehängt werden (z. B. an den Zucker, an die Phosphodiesterbindung oder 5'- bzw. 3'-terminal).It should be emphasized that ethenoadenosine is only one of the possible be known fluorescent base analogs. There are also fluorescent groups conceivable that are attached to other positions of the nucleic acid (e.g. to the Sugar, to the phosphodiester bond or 5'- or 3'-terminal).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die D-Nucleinsäuren D-Ribonucleinsäuren.In a further preferred embodiment of the method according to the invention the D-nucleic acids are D-ribonucleic acids.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens sind die D-Ribonucleinsäuren Ribozyme.In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention Rens are the D-ribonucleic acids ribozymes.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die D-Nucleinsäuren D-Desoxyribonucleinsäuren.In a further preferred embodiment of the method according to the invention the D-nucleic acids are D-deoxyribonucleic acids.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens sind die D-Ribonucleinsäuren Desoxyribozyme.In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention The D-ribonucleic acids are deoxyribozymes.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zielmolekül ein Peptid, ein Polypeptid, oder ein aus mehreren Polypeptiden zusam mengesetztes Protein. Erfindungsgemäß wird unter Peptid, Polypeptid und Protein jedes dieser (Makro)Moleküle verstanden, mit der die D-Nucleinsäuren wechselwir ken können. Beispiele derartiger (Makro)Moleküle sind Enzyme, Strukturproteine und Hormone. Die (Makro)Moleküle können demgemäß Bestandteile einer größeren Struktur sein oder frei in biologischen Systemen in Lösung vorliegen. In a further embodiment of the method according to the invention Target molecule a peptide, a polypeptide, or one of several polypeptides together set protein. According to the invention, peptide, polypeptide and protein understood each of these (macro) molecules with which the D-nucleic acids interact can know. Examples of such (macro) molecules are enzymes, structural proteins and hormones. The (macro) molecules can accordingly be components of a larger one Be structure or freely available in solution in biological systems.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zielmolekül eine einzelsträngige RNA, eine doppelsträngige RNA, eine ein zelsträngige DNA oder eine doppelsträngige DNA, sowie Kombinationen daraus.In another preferred embodiment of the method according to the invention the target molecule is a single-stranded RNA, a double-stranded RNA, a cell-stranded DNA or a double-stranded DNA, as well as combinations thereof.

Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß diese Nukleinsäuren unter verschie denen Bedingungen verschiedene Konformationen einnehmen können. Das erfin dungsgemäße Verfahren umfaßt jede Konformation, die diese (Makro)Moleküle o der Kombinationen daraus einnehmen können. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt weiterhin Kombinationen dieser Makromoleküle. Solche Kombinationen können beispielsweise aus einzel- und doppelsträngiger RNA oder DNA oder aus Tripelhelices bestehen.It is self-evident for the person skilled in the art that these nucleic acids differ where conditions can assume different conformations. That invented The method according to the invention includes any conformation which these (macro) molecules o who can take combinations of them. The method according to the invention also includes combinations of these macromolecules. Such combinations can, for example, from single and double stranded RNA or DNA or from Triple helices exist.

Ein Antibiotikum oder ein pharmazeutisch wirksames Substrat ist das Zielmolekül einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.An antibiotic or a pharmaceutically active substrate is the target molecule a further preferred embodiment of the method according to the invention.

Zielmolekül in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens ist ein Zuckermolekül. Der Begriff "Zuckermolekül", wie hier ver wendet, betrifft sowohl monomere als auch zusammengesetzte komplexe Zucker strukturen.Target molecule in a further preferred embodiment of the invention The process is a sugar molecule. The term "sugar molecule" as ver applies to both monomeric and compound complex sugars structures.

Die Erfindung betrifft ferner L-Nucleinsäuren, die spezifisch an ein wie vorstehend definiertes Zielmolekül binden.The invention further relates to L-nucleic acids specific to one as above bind defined target molecule.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße L- Nucleinsäure eine L-Ribonucleinsäure. Diese L-Ribonucleinsäure kann in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen.In a further special embodiment, the L- Nucleic acid an L-ribonucleic acid. This L-ribonucleic acid can be or double-stranded form.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure ein Ribozym.In a further particularly preferred embodiment, the invention is L-nucleic acid a ribozyme.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure eine L-Desoxyribonucleinsäure.In a further particularly preferred embodiment, the invention is L L-nucleic acid an L-deoxyribonucleic acid.

Wie bereits für die erfindungsgemäßen L-Ribonucleinsäuren bemerkt, kann die L- Desoxyribonucleinsäure in einzel- oder doppelsträngiger Form vorliegen. As already noted for the L-ribonucleic acids according to the invention, the L- Deoxyribonucleic acid is in single or double stranded form.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemä ße L-Nucleinsäure ein Desoxyribozym.In a further particularly preferred embodiment, the invention is L-nucleic acid is a deoxyribozyme.

Schließlich betrifft die Erfindung einen Kit. Der erfindungsgemäße Kit kann für dia gnostische und analytische Zwecke verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, in ähnlicher Weise wie monoclonale Antikörper eingesetzt werden können, bietet sich dem Fachmann als Einsatzgebiet für den erfindungsgemäßen Kit das gesamte Spektrum der diagnostischen Möglich keiten monoklonaler Antikörper.Finally, the invention relates to a kit. The kit according to the invention can be used for dia Gnostic and analytical purposes can be used. Since the invention Nucleic acids as described above in a manner similar to monoclonal Antibodies can be used as a field of application for the person skilled in the art the entire spectrum of diagnostic possibilities for the kit according to the invention of monoclonal antibodies.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik be kannten Methoden zur biosensorischen Messung verwendet werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß im Gegensatz zu beschriebenen Verfahren (Kleinjung et al., Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) der Analyt in unmodifizierter Form in Echtzeit zu erfassen ist.Furthermore, the method according to the invention can be used in the prior art known methods for biosensory measurement can be used. The advantage The method is that, in contrast to the method described (Kleinjung et al., Anal. Chem. 70 (1998), 328-331) the analyte in unmodified form is to be recorded in real time.

Mithin kombiniert das erfindungsgemäße Verfahren zusammenfassend die Methode der in vitro-Evolution von Nukleinsäuren mit fluorometrischen Bestimmungsmetho den. Durch eine nachfolgende Synthese des entsprechenden fluoreszierenden L- RNA-Liganden gegen das natürlich vorkommende D-Adenosin (Spiegel-Design) steht ein potentes nichtradioaktives und nukleasestabiles Diagnostikum zur Verfü gung.The method according to the invention therefore combines the method in summary the in vitro evolution of nucleic acids with fluorometric determination method the. Through a subsequent synthesis of the corresponding fluorescent L- RNA ligands against the naturally occurring D-adenosine (mirror design) there is a potent non-radioactive and nuclease-stable diagnostic available supply.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben. Es zeigt:Further advantageous measures are contained in the remaining subclaims. The invention is illustrated in the accompanying drawings and is as follows described in more detail. It shows:

Fig. 1 Die 2'-O-tert-Butyldimethylsilyl-5'-O-(4,4'- Dimethoxytrityl)-β-D-ribonukleosid-3'-O-β-cyanoethyl- N,N'-diisopropyl-phoshoramidite der einzelnen Ba sen. Fig. 1 The 2'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -β-D-ribonucleoside-3'-O-β-cyanoethyl-N, N'-diisopropyl-phoshoramidite of the individual bases.

Fig. 2 Sekundärstruktur des RNA-Liganden D- A649_38. Das Modell zeigt alle sechs synthetisierten Oligoribonukleotidstränge. Die Struktur wurde mit dem Computer-programm RNA FOLD berechnet. Die Positionen, an denen ein Adenosin gegen ein 1,N⁶- Ethenoadenosin ausgetauscht wurde, sind mit der Bezeichnung des Oligomers gekennzeichnet. Die Namen der unmodifizierten Ligandenhälften wurden mit den Suffixen (u) bzw. (l) versehen. Fig. 2 secondary structure of the RNA ligand D-A649_38. The model shows all six synthesized oligoribonucleotide strands. The structure was calculated using the RNA FOLD computer program. The positions at which an adenosine was exchanged for a 1, N ⁶ - ethenoadenosine are marked with the name of the oligomer. The names of the unmodified ligand halves were given the suffixes (u) and (l).

Die Fig. 1 zeigt die 2'-O-tert-Butyldimethylsilyl-5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-β-D- ribonukleosid-3'-O-β-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl-phoshoramidite der einzelnen Ba sen, nämlich
A: N⁶-tert-Butylphenoxyacetyl-adenyl
B: N⁴-fert-Butylphenoxyacetyl-cytosyl
C: N²-tert-Butylphenoxyacetyl-guanyl
D: Uracyl
E: 1,N⁶-Ethenoadenosyl Fig. 1 shows the 2'-O-tert-butyldimethylsilyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -β-D-ribonucleoside 3'-O-β-cyanoethyl-N, N'-diisopropyl -phosphoramidites of the individual bases, namely
A: N ^6- tert-butylphenoxyacetyl adenyl
B: N ⁴ -fert-butylphenoxyacetyl-cytosyl
C: N ² tert-butylphenoxyacetyl guanyl
D: Uracyl
E: 1, N ⁶ -thenoadenosyl

Fig. 2 zeigt die Sekundärstruktur des RNA-Liganden D-A649_38. Das Modell zeigt alle sechs synthetisierten Oligoribonukleotidstränge. Die Struktur wurde mit dem Computer-programm RNA FOLD berechnet. Die Positionen, an denen ein Adenosin gegen ein 1,N⁶-Ethenoadenosin ausgetauscht wurde, sind mit der Bezeichnung des Oligomers gekennzeichnet. Die Namen der unmodifizierten Ligandenhälften wurden mit den Suffixen (u) bzw. (l) versehen:
(u): oberer Strang (upper)
(f): unterer Strang (lower) Fig. 2 shows the secondary structure of the RNA ligand D-A649_38. The model shows all six synthesized oligoribonucleotide strands. The structure was calculated using the RNA FOLD computer program. The positions at which an adenosine was exchanged for a 1, N ⁶ -thenoadenosine are marked with the name of the oligomer. The names of the unmodified ligand halves were given the suffixes (u) and (l):
(u): upper strand (upper)
(f): lower strand

Die Erfindung sei an folgendem Beispiel der Positionierung eines fluoreszierenden Reporternukleotids in einen durch in vitro-Evolution gewonnenen RNA-Liganden erläutert, mit dem ein Fluoreszenzassay zur direkten Bestimmung von Bindungs konstanten ermöglicht wird:
Als Testsequenz für die Synthese fluoreszierender Oligoribonukleotide und für den Aufbau des direkten Nachweisverfahrens wurde der an L-Adenosin bindende RNA- Ligand D-A649_38εA25 gewählt (vgl. Fig. 2). Dieser Ligand wurde durch in vitro- Evolution und nachfolgender Deletionsanalyse entwickelt (Klußmann, 1996). The invention is illustrated by the following example of the positioning of a fluorescent reporter nucleotide in an RNA ligand obtained by in vitro evolution, which enables a fluorescence assay for the direct determination of binding constants:
The RNA ligand D-A649_38εA25 binding to L-adenosine was selected as the test sequence for the synthesis of fluorescent oligoribonucleotides and for the construction of the direct detection method (cf. FIG. 2). This ligand was developed through in vitro evolution and subsequent deletion analysis (Klußmann, 1996).

Der verwendete RNA-Ligand D-A649_38∈A25 enthält nach Aussagen der Sekun därstrukturvorhersage (Computerprogramm RNA FOLD, dem der Faltungsalgorith mus nach Zuker und Stiegler zugrunde liegt (Zuker & Stiegler, 1981; Zuker 1989)) vier Adenosine, die sich in einer Bulge- oder Loop-Position befinden. Die Oligoribo nukleotide wurden durch bekannte Festphasensynthese an einem Syntheseautoma ten durchgeführt. Die Ribonukleinsäuren wurden nach dem ebenfalls bekannten Phosphoramidit-Verfahren (Beaucage & Caruthers, 1981) unter Verwendung von Standardlösungsmitteln synthetisiert. Bei den Phosphoramiditen wurde zum Schutz der 2'-Hydroxylgruppen entweder eine Triisopropylsilylgruppe verwendet oder eine tert-Butyldimethylsilylgruppe (tBDMS). Die 5'-Hydroxylgruppen aller Phosphoramidi te wurden durch eine Dimethoxytritylgruppe und der Phosphor durch eine β-Cyanoethyl- und eine Diisopropylamingruppe geschützt. Die Phosphoramidite wurden direkt vor Synthesebeginn in trockenem Acetonitril (Wassergehalt < 0,001%) unter Argon gelöst. Die Endkonzentration betrug 0,15 M für Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uracil bzw. 0,2 M für 1,N⁶-Ethenoadenosin in absolutem Ace tonitril. Es wurde der Standardsynthesezyklus verwendet (Nolte et al., 1996). Die Kopplungszeit der Phosphoramidite wurde auf 900 sec festgesetzt, um trotz steri scher Hinderung der voluminösen 2'-Hydroxylschutzgruppen eine ausreichend gute Kopplung zu ermöglichen. Die Synthese begann mit der Abspaltung der säurelabi len DMT-Schutzgruppe mittels Trichloressigsäure (TCA) am Startnukleosid. An schließend wurde das Phosphoramidit des folgenden Nukleosids gemeinsam mit aktivierendem Tetrazol auf die Synthesesäule gegeben. Im Anschluß wurden mit einer Mischung von Acetanhydrid bzw. tert-Butylphenoxy-acetanhydrid mit N- Methylimidazol die nicht gekoppelten 5'-Hydroxylgruppen acyliert (Capping). Nach Kopplung und Capping wurde die trivalente Phosphortriester-Bindung mittels Iodlö sung zu einer stabileren pentavalenten Phosphorbindung oxidiert und der Synthe sezyklus damit beendet.According to the secondary structure prediction (computer program RNA FOLD, which is based on the folding algorithm according to Zuker and Stiegler (Zuker & Stiegler, 1981; Zuker 1989)), the RNA ligand D-A649_38∈A25 contains four adenosines, which are in a bulge - or loop position. The oligoribo nucleotides were carried out by known solid phase synthesis on a synthesizer. The ribonucleic acids were synthesized by the phosphoramidite method (Beaucage & Caruthers, 1981), which is also known, using standard solvents. For the phosphoramidites either a triisopropylsilyl group or a tert-butyldimethylsilyl group (tBDMS) was used to protect the 2'-hydroxyl groups. The 5'-hydroxyl groups of all phosphoramidites were protected by a dimethoxytrityl group and the phosphorus by a β-cyanoethyl and a diisopropylamine group. The phosphoramidites were dissolved in dry acetonitrile (water content <0.001%) under argon immediately before the start of the synthesis. The final concentration was 0.15 M for adenosine, guanosine, cytidine and uracil or 0.2 M for 1, N ⁶ -thenoadenosine in absolute ace tonitrile. The standard synthesis cycle was used (Nolte et al., 1996). The coupling time of the phosphoramidites was set at 900 sec in order to enable a sufficiently good coupling despite steric hindrance of the bulky 2'-hydroxyl protective groups. The synthesis began with the cleavage of the acid-labile DMT protective group using trichloroacetic acid (TCA) on the starting nucleoside. The phosphoramidite of the following nucleoside was then added to the synthesis column together with activating tetrazole. Subsequently, the uncoupled 5'-hydroxyl groups were acylated with a mixture of acetic anhydride or tert-butylphenoxyacetic anhydride with N-methylimidazole (capping). After coupling and capping, the trivalent phosphorus triester bond was oxidized to a more stable pentavalent phosphorus bond by means of iodine solution and the synthesis cycle ended.

Der Synthesezyklus wurde so lange wiederholt, bis die erwünschte Kettenlänge erreicht wurde. Abschließend wurde die DMT-Schutzgruppe, die sich am letzten Nukleosid befand, abgespalten. Das Syntheseprodukt wurde unter Argon getrock net. Das bei der Festphasensynthese erhaltene Substanzgemisch muß vor der Auf reinigung vom Säulenmaterial abgespalten und von Schutzgruppen befreit werden. Die Abspaltung des Trägermaterials sowie die Entfernung der Basen- und Phos phatschutzgruppen findet durch alkalische Hydrolyse statt. The synthesis cycle was repeated until the desired chain length was achieved. In conclusion, the DMT protection group was the last Nucleoside was split off. The synthesis product was dried under argon net. The mixture of substances obtained in the solid phase synthesis must before the on detach cleaning from the column material and be freed of protective groups. The cleavage of the carrier material and the removal of the base and phos Protection groups take place through alkaline hydrolysis.

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die synthetisierten RNA-Sequenzen mit 1,N⁶- Ethenoadenosin als fluoreszierendem Nukleotid:Table 1 below shows the synthesized RNA sequences with 1, N ⁶ - ethenoadenosine as the fluorescent nucleotide:

Tabelle 1 Table 1

Der fluoreszierende Nukleosidbaustein ist äußerst instabil in alkalischem Milieu. Als vorteilhaft haben sich folgende alkalischen Entschützungsbedingungen, denen die Oligoribonukleotide nach der Synthese unterworfen wurden, erwiesen:The fluorescent nucleoside building block is extremely unstable in an alkaline environment. As The following alkaline deprotection conditions, which the Subjected to oligoribonucleotides after synthesis proved:

Tabelle 2 Table 2

Die vier chemisch synthetisierten Oligoribonukleotide D-A649_38εA23, D-A649_38εA25, D-A649_38εA48 und D-A649_38εA53 enthielten jeweils ein 1,N⁶-Ethenoadenosin als Reportergruppe in definierter Position (gekennzeichnet durch "ε"). Es wurde dazu ein ungepaartes Adenosin des ursprünglichen D- A649_38 RNA-Liganden durch 1,N⁶-Etheno-adenosin ersetzt (Fig. 2). Durch die Verwendung tert-Butylphenoxyacetyl-geschützter Synthone konnte die Zeit für die Entschützung der freien exozyklischen Aminofunktionen mit wäßrigem Ammoniak auf 30 Minuten gesenkt werden, und somit der Zerstörungsgrad des Fluorophors minimiert werden.The four chemically synthesized oligoribonucleotides D-A649_38εA23, D-A649_38εA25, D-A649_38εA48 and D-A649_38εA53 each contained a 1, N ⁶ -ethenoadenosine as a reporter group in a defined position (identified by "ε"). For this purpose, an unpaired adenosine of the original D-A649_38 RNA ligand was replaced by 1, N ⁶ -etheno-adenosine ( FIG. 2). The use of tert-butylphenoxyacetyl-protected synthons reduced the time for deprotection of the free exocyclic amino functions with aqueous ammonia to 30 minutes, thus minimizing the degree of destruction of the fluorophore.

Die Tabelle 3 zeigt die molaren Extinktionskoeffizienten und molare Massen der für die Bindungsanalysen synthetisierten Oligoribonukleotide. Die Oligoribonukleotide εA23, εA25, εA48 und εA53 sind modifiziert. Anhand der Werte der letzten Spalte konnte die gemessene Absorption bei 260 nm direkt in die Masse umgerechnet werden.Table 3 shows the molar extinction coefficients and molar masses for the binding analyzes synthesized oligoribonucleotides. The oligoribonucleotides εA23, εA25, εA48 and εA53 are modified. Based on the values in the last column was able to convert the measured absorption at 260 nm directly into the mass become.

Tabelle 3 Table 3

Determination of the binding constants

Die Affinität zwischen einem Makromolekül und seinem Targetmolekül wird durch die Dissoziationskonstante des gebildeten Komplexes beschrieben. Wenn dieser Komplex nicht zu einem weiteren Produkt umgesetzt wird, kann die Dissoziati onskonstante mittels direkter "Steady-State"-Studien bestimmt werden. Die Kom plexbildung und ihre Dissoziation kann durch folgende allgemeine Gleichung be schrieben werden:
The affinity between a macromolecule and its target molecule is described by the dissociation constant of the complex formed. If this complex is not converted into another product, the dissociation constant can be determined by means of direct "steady-state" studies. The complex formation and its dissociation can be described by the following general equation:

K_a steht hierbei für die Assoziationskonstante des Komplexes und K_d für dessen Dissoziationskonstante (1/K_a). Die Dissoziationskonstante, die in der Dimension M (molar) angegeben wird, kann über das Massenwirkungsgesetz beschrieben wer den. K _a stands for the association constant of the complex and K _d for its dissociation constant (1 / K _a ). The dissociation constant, which is given in the dimension M (molar), can be described using the law of mass action.

Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird das Gleichgewicht zwischen Li gand und Target als Funktion der Ligandenkonzentration bei gleichbleibender Tar getkonzentration betrachtet. Hierbei müssen die Konzentrationen des RNA- Liganden, des Targetmoleküls sowie die des gebildeten Komplexes im Gleichge wichtszustand bestimmt werden. Eine Methode, die relativ zuverlässige Bestim mungen der Dissoziationskonstanten im Bereich von 10^-7 bis 10^-3 M zuläßt, ist die Gleichgewichtsdialyse (Uhlenbeck et al., 1970; Bisswanger, 1994). Bei dieser Me thode wird die Konzentration des freien und des komplexierten Targets direkt ge messen.To determine the dissociation constant, the equilibrium between ligand and target is considered as a function of the ligand concentration with the target concentration remaining the same. The concentrations of the RNA ligand, the target molecule and that of the complex formed must be determined in the equilibrium state. One method that allows relatively reliable determinations of the dissociation constants in the range from 10 ^-7 to 10 ^-3 M is equilibrium dialysis (Uhlenbeck et al., 1970; Bisswanger, 1994). With this method, the concentration of the free and the complexed target is measured directly.

Für einige RNA-Liganden wurde eine Bestimmung der Dissoziationskonstanten an hand eines Meßpunktes (Einpunktbestimmung) unter Verwendung der oben er wähnten Gleichung durchgeführt. Die fehlenden Werte zur Berechnung der Bin dungskonstanten ergaben sich aus der Messung der Radioaktivität der beiden Kammerhälften und der Kenntnis der eingesetzten Ausgangskonzentrationen an L- Adenosin und Oligoribonukleotid. Die Berechnung der Dissoziationskonstanten durch Einpunktmessung erfolgt durch folgende Formel:
For some RNA ligands, the dissociation constants were determined using a measuring point (single point determination) using the equation mentioned above. The missing values for the calculation of the binding constants resulted from the measurement of the radioactivity of the two chamber halves and the knowledge of the initial concentrations of L-adenosine and oligoribonucleotide used. The calculation of the dissociation constant by single-point measurement is carried out using the following formula:

wobei cpm₁ die Aktivität des RNA-enthaltenden Kammerkompartiments und cpm₂ die Aktivität des ausschließlich L-Adenosin-enthaltenden Kammerkompartiments ist.where cpm _{1 is} the activity of the RNA-containing chamber compartment and cpm _{2 is} the activity of the chamber compartment containing only L-adenosine.

Die mit dieser Methode erhaltenen Werte wiesen eine relativ starke Streuung aus. Es wurden deshalb Mittelwerte aus drei Bestimmungen gebildet. Um genauere Wer te für die Dissoziationskonstante zu erhalten, wurden bei dem unmodifizierten Li ganden D-A649 38 und dem zur Fluoreszenztitration verwendeten Liganden D- A649_38∈A25 Meßreihen von je sieben Meßpunkten durchgeführt. Hierbei wurden Doppelbestimmungen gemacht und ebenfalls die Mittelwerte der einzelnen Meß punkte der Berechnung des K_d-Wertes zugrunde gelegt. Die ermittelten Bindungs konstanten werden in Tabelle 4 aufgeführt:The values obtained with this method showed a relatively large spread. Therefore, averages from three determinations were formed. In order to obtain more precise values for the dissociation constant, measurement series of seven measuring points each were carried out for the unmodified ligand D-A649 38 and the ligand D-A649_38∈A25 used for fluorescence titration. Duplicate determinations were made and the mean values of the individual measuring points were also used to calculate the K _d value. The bond constants determined are listed in Table 4:

Tabelle 4 Table 4

Diese Tabelle zeigt die Dissoziationskonstanten der Liganden-Target-Komplexe. Dargestellt sind die Dissoziationskonstanten für die einzelnen RNA-Liganden. Die Werte wurden entweder durch Einpunktbestimmungen (a) oder Meßreihen (b) ermit telt.This table shows the dissociation constants of the ligand-target complexes. The dissociation constants for the individual RNA ligands are shown. The Values were determined either by single-point determinations (a) or series of measurements (b) telt.

Die Fig. 2 zeigt ferner, daß verschiedene Adenosine innerhalb des Liganden durch 1,N⁶-Ethenoadenosin ausgetauscht wurden. Drei der vier Modifikationen des Aus gangsliganden zeigten Bindungskonstanten, die um das mindestens 18-fache höher lagen, als die des unmodifizierten Binders. Es ist daher offensichtlich, daß die Ade nosine in diesen Positionen für die Bindung mit dem Targetmolekül von Bedeutung sind. Die Komplexbildung kann z. B. durch nicht aufzubauende Wasserstoffbrücken zwischen der Base und dem Target gestört worden sein. Ferner ist eine sterische Hinderung der Einlagerung des Targets in die Bindungstasche durch den zusätzli chen Imidazolring möglich. Als weitere Möglichkeit ist eine Störung bei der Ausbil dung der Tertiärstruktur in Betracht zu ziehen. Auch in diesem Falle können sich die veränderten Verhältnisse an den Stickstoffatomen der Base bei der Ausbildung von Interaktionen zwischen verschiedenen Basen als störend erweisen. FIG. 2 also shows that various adenosines within the ligand were replaced by 1, N ⁶ -ethenoadenosine. Three of the four modifications of the starting ligand showed binding constants that were at least 18 times higher than those of the unmodified binder. It is therefore evident that the ade nosins in these positions are important for binding to the target molecule. The complex formation can e.g. B. may have been disturbed by hydrogen bonds between the base and the target which are not to be built up. A steric hindrance to the storage of the target in the binding pocket by the additional imidazole ring is possible. Another possibility is a disruption in the formation of the tertiary structure. In this case, too, the changed conditions at the nitrogen atoms of the base can prove to be disruptive in the formation of interactions between different bases.

Eine Modifikation des Ursprungsliganden an Position 25 resultiert in einer Bindungs konstanten, die nur um das etwa 1,5-fache erhöht war. Der Einbau des Fluorophors in dieser Position hat eine Zunahme der Fluoreszenz des Liganden bei Titration mit steigenden Targetkonzentrationen zur Folge. L-Adenosin selbst weist unter den Testbedingungen keine Fluoreszenz auf, so daß sich die Änderung der Fluoreszenzintensität bei Titration auf eine Konformationsänderung des Liganden bei Komplexbildung zurückführen läßt. Aufgrund des Anstiegs der relativen Fluoreszenzintensität bei Anregung mit Licht der Wellenlänge 300 nm und einer Emissionswellenlänge von 410 nm kann die Dissoziationskonstante des Liganden- Target-Komplexes direkt ermittelt werden.A modification of the original ligand at position 25 results in a binding constant, which was only increased by about 1.5 times. The installation of the fluorophore in this position has an increase in the fluorescence of the ligand upon titration increasing target concentrations. L-adenosine itself exhibits among the Test conditions no fluorescence, so that the change in Fluorescence intensity when titrated for a change in the conformation of the ligand in the case of complex formation. Because of the increase in relative Fluorescence intensity when excited with light of wavelength 300 nm and one Emission wavelength of 410 nm, the dissociation constant of the ligand Target complex can be determined directly.

Das Auftreten einer Fluoreszenzsteigerung statt -löschung zeigt zudem, daß das Reporternukleotid, wenn es sich an Position 25 befindet, nicht direkt mit dem Target interagiert. Statt dessen scheint sich die aromatische Dreiringstruktur der Base bei Bindung an das Target durch eine Konformationsänderung der Oligoribonukleo tidstruktur aus dem entstehenden Komplex herauszudrehen. Der Fluorophor steht dann nicht mehr in direktem Kontakt zu den benachbarten Basen, was einen Ener gieaustausch auf Donor-Akzeptor-Basis erschwert oder gar unterdrückt.The occurrence of an increase in fluorescence instead of quenching also shows that the Reporter nucleotide, if at position 25, is not directly with the target interacts. Instead, the aromatic three-ring structure of the base appears to be Binding to the target by changing the conformation of the oligoribonucleo tide structure from the emerging complex. The fluorophore stands then no longer in direct contact with the neighboring bases, resulting in an ener gi exchange on donor-acceptor basis difficult or even suppressed.

Die Fluoreszenzintensität des 1,N⁶-Ethenoadenosins ist sehr sensitiv gegenüber Basenstapelung (base stacking). Schon der Einbau in das Dinukleotid (∈A)p(∈A) senkt die relative Fluoreszenzintensität des Fluorophors um das 14-fache (Tolman et al., 1974). Durch Einbau von 1,N⁶-Ethenoadenosin an Position 73 in die tRNA^Phe von Hefe mit Hilfe von RNA-Ligase T4 erhielt man z. B. eine biochemisch aktive tRNA, bei der die Auflockerung der Sekundär- und Tertiärstruktur (Destacking) nach Zugabe von Magnesiumionen fluoreszenzspektroskopisch zu verfolgen war (Paul sen & Wintermeyer, 1984). Untersuchungen mit der prokaryontischen lntitiator-tRNA (tRNA^fMet) zeigten eine Fluoreszenzabnahme des 1,N⁶-Ethenoadenosins nach Ein bau an Position 73 der tRNA und eine Fluoreszenzzunahme bei Bindung der ent sprechenden aminoacetylierten tRNA an die ribosomalen P-Seite. Auch bei diesen Experimenten konnte die Auswirkung der Basenstapelung auf die Fluoreszenz der Reportergruppe beobachtet werden.The fluorescence intensity of the 1, N ⁶ -thenoadenosine is very sensitive to base stacking. Even the incorporation into the dinucleotide (∈A) p (∈A) lowers the relative fluorescence intensity of the fluorophore by a factor of 14 (Tolman et al., 1974). By incorporating 1, N ⁶ -thenoadenosine at position 73 in the tRNA ^Phe of yeast using RNA ligase T4, z. B. a biochemically active tRNA, in which the loosening of the secondary and tertiary structure (destacking) after the addition of magnesium ions could be followed by fluorescence spectroscopy (Paul sen & Wintermeyer, 1984). Investigations with the prokaryotic initiator tRNA (tRNA ^fMet ) showed a decrease in fluorescence of the 1, N ⁶ -thenoadenosine after installation at position 73 of the tRNA and an increase in fluorescence when the corresponding aminoacetylated tRNA bound to the ribosomal P side. The effect of base stacking on the fluorescence of the reporter group could also be observed in these experiments.

Das System, das durch den Einbau von 1,N⁶-Ethenoadenosin in einen RNA- Liganden entwickelt wurde, bietet eine direkte Methode zur Bestimmung von Disso ziationskonstanten durch den Einsatz fluoreszierender RNA-Liganden. Durch Nut zung hochaffiner Oligoribonukleotide, die durch Einbau eines fluoreszierenden Nukleotids in ihre Sequenz selbst zum funktionellen Reportersystem wurden, kön nen außerdem erste Aussagen zu Interaktionen zwischen einem Liganden und sei nem Target sowie über Konformationsänderungen des Liganden bei der Komplex bildung gemacht werden. Mit dem entwickelten System könnten vor allem die Kon zentrationen niedermolekularer Stoffe, die bisher nur durch aufwendige und kosten intensive HPLC-Diagnostikverfahren bestimmbar waren, genau und mit geringerem Aufwand ermittelt werden. The system, which was developed by incorporating 1, N ⁶ -thenoadenosine into an RNA ligand, offers a direct method for determining dissociation constants by using fluorescent RNA ligands. By using high-affinity oligoribonucleotides, which themselves became a functional reporter system by incorporating a fluorescent nucleotide into their sequence, first statements can be made about interactions between a ligand and its target and about conformational changes of the ligand during complex formation. With the system developed, the concentrations of low molecular weight substances, which could previously only be determined using complex and cost-intensive HPLC diagnostic methods, could be determined precisely and with less effort.

Bibliography

Barbin, A., Bartsch, H., Leconte, P., and Radman, U. (1981) Studies on the miscoding properties of 1,N⁶ Barbin, A., Bartsch, H., Leconte, P., and Radman, U. (1981) Studies on the miscoding properties of 1, N ⁶

-ethenoadenine and 3,N⁴ -ethenoadenine and 3, N ⁴

-ethenocytosine, DNA- reaction products of vinyl chloride metabolites, during in vitro DNA synthesis Nucleic Acids Res. 9, S. 375-387;
Barbin, A., Bresil, H., Croisy, A., Jaquignon, P., Malaveille, C., Montesano, R., and Bartsch, H. (1975) Liver microsome-mediated formation of alkylat ing agents from vinyl bromide and vinyl chloride Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, S. 596-603;
Barrio, J. R., Secrist, J. A., and Leonard N. J. (1972) Fluorescent adenosine and cytidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Comm. 46(2), S. 597-604;
Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H. (1981) Deoxynucleoside phos phoramidites - A new class of key intemediates for deoxypolynucleotide syn thesis. Tetrahedron Lett. 22, S. 1859-1862;
Bisswanger, H.; (1994) Enzymkinetik, Theorie und Methoden. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim;
Cook, D. B. and. Self, C. H. (1995) Monoclonal antibodies in diagnostic im munoassays In: Monoclonal antibodies: Production, engineering and clini cal application Ritter, M. A., and Ladyman, H. M. (Eds.) Cambridge Univer sity Press, London;
Ellington, A. D., and Szostak, J. W. (1990) In vitro selection of RNA mole cules that bind specific ligands. Nature 346, S. 818-822;
Gold, L., Allen, P., Binkley, J., Brown, D., Schneider, D., Eddy, S. R., Tuerk, C., Green, L., MacDougal, S., and Tasset, D.; Gesteland, R. F., and Atkins, J. F. (Ed.) (1993) RNA: The shape of things to come. In: The RNA World. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York, S. 497-509;
Hall, J. A., Saffill, R., Green, T., and Hathway, D. E. (1981) The induction of errors during in vitro synthesis following chloroacetaldehyde tratment of poly(dA-dT) and poly(dG-dC) templates Carcinogenesis 2, S. 141-145;
Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., and Polisky, B. (1994) High-resolution molecular discrimination by RNA. Science 264, S. 1425-1429;
Kleinjung, F., Klußmann, S., Erdmann, V. A., Scheller, F. W., Fürste, J. P., and Bier, F. F. (1998) High-affinity RNA as a recogniton element in a biosensor. Anal. Chem. 70, S. 328-331;
Klußmann, S., Nolte, A., Bald, R., Erdmann, V. A., Fürste, and J. P. (1996) Mirror-image RNA that binds D-Adenosine. Nature Biotechnology 14, S. 1112-1115;
Klußmann, S.; (1996) Spiegel-Design: Identifizierung und Charakterisie rung hochaffiner L-RNA-Moleküle. Shaker Verlag, Aachen
Kusmierek, J. T., and Singer, B. (1982) Chlorocacetaldehyde-treated ribo- and deosyribonucleotides. Errors in transcription by different polymerases resulting from ethenocytosine and its hydrated intermediate Biochemistry 21, S. 5723-5728;
Nolte, A., Klußmann, S., Bald, R., Erdmann, V. A., and Fürste, J. P. (1996) Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-argenine. Nature Bio technology 14, S. 1116-1119;
Paulsen, H., and Wintermeyer, W. (1984) lncorporation of 1,N⁶ -ethenocytosine, DNA- reaction products of vinyl chloride metabolites, during in vitro DNA synthesis Nucleic Acids Res. 9, pp. 375-387;
Barbin, A., Bresil, H., Croisy, A., Jaquignon, P., Malaveille, C., Montesano, R., and Bartsch, H. (1975) Liver microsome-mediated formation of alkylate ing agents from vinyl bromide and vinyl chloride Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, pp. 596-603;
Barrio, JR, Secrist, JA, and Leonard NJ (1972) Fluorescent adenosine and cytidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Comm. 46 (2), pp. 597-604;
Beaucage, SL, and Caruthers, MH (1981) Deoxynucleoside phos phoramidites - A new class of key intemediates for deoxypolynucleotide syn thesis. Tetrahedron Lett. 22, pp. 1859-1862;
Bisswanger, H .; (1994) Enzyme Kinetics, Theory and Methods. VCH publishing company, Weinheim;
Cook, DB and. Self, CH (1995) Monoclonal antibodies in diagnostic in munoassays In: Monoclonal antibodies: Production, engineering and clini cal application Ritter, MA, and Ladyman, HM (Eds.) Cambridge University Press, London;
Ellington, AD, and Szostak, JW (1990) In vitro selection of RNA mole cules that bind specific ligands. Nature 346, pp. 818-822;
Gold, L., Allen, P., Binkley, J., Brown, D., Schneider, D., Eddy, SR, Tuerk, C., Green, L., MacDougal, S., and Tasset, D .; Gesteland, RF, and Atkins, JF (Ed.) (1993) RNA: The shape of things to come. In: The RNA World. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York, pp. 497-509;
Hall, JA, Saffill, R., Green, T., and Hathway, DE (1981) The induction of errors during in vitro synthesis following chloroacetaldehyde steps of poly (dA-dT) and poly (dG-dC) templates Carcinogenesis 2, Pp. 141-145;
Jenison, RD, Gill, SC, Pardi, A., and Polisky, B. (1994) High-resolution molecular discrimination by RNA. Science 264, pp. 1425-1429;
Kleinjung, F., Klußmann, S., Erdmann, VA, Scheller, FW, Fürste, JP, and Bier, FF (1998) High-affinity RNA as a recogniton element in a biosensor. Anal. Chem. 70, pp. 328-331;
Klussmann, S., Nolte, A., Bald, R., Erdmann, VA, Fürste, and JP (1996) Mirror-image RNA that binds D-adenosine. Nature Biotechnology 14, pp. 1112-1115;
Klussmann, S .; (1996) Spiegel-Design: Identification and characterization of high affinity L-RNA molecules. Shaker Verlag, Aachen
Kusmierek, JT, and Singer, B. (1982) Chlorocacetaldehyde-treated ribo- and deosyribonucleotides. Errors in transcription by different polymerases resulting from ethenocytosine and its hydrated intermediate Biochemistry 21, pp. 5723-5728;
Nolte, A., Klussmann, S., Bald, R., Erdmann, VA, and Fürste, JP (1996) Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-argenine. Nature Bio technology 14, pp. 1116-1119;
Paulsen, H., and Wintermeyer, W. (1984) Corporation of 1, N ⁶

- ethenoadenosine into the 3'-terminus of tRNA using T4 RNA ligase - 1. Preparation of yeast tRNA^Phe - ethenoadenosine into the 3'-terminus of tRNA using T4 RNA ligase - 1. Preparation of yeast tRNA ^Phe

derivatives Eur. J. Biochem. 138, S. 117-123;
Tuerk, C., and Gold, L (1990) Systematic evolution of ligands by exponen tial enrichment: RNA ligands to Bacteriophage T4 DNA polymerase. Sci ence 249, S. 505-510;
Uhlenbeck, O., Baller, J., and Doty, P. (1970) Complementary oligonucleo tide binding to the anticodon loop of fMet-transfer RNA. Nature 225, S. 508- 510;
Uphoff, K. W., Bell, S. D., and Ellington, A. D. (1996) In vitro selection of ap tamers: The dearth of pure reason Curr. Opin. Struct. BioL 6, S. 281-288;
Zuker, M. (1989) Computer prediction of RNA structure Methods Enzymol. 180, 262-288;
Zuker, M., and Stiegler, P. (1981) Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary Information Nucleic Acids Res. 9, S. 133-148. derivatives Eur. J. Biochem. 138, pp. 117-123;
Tuerk, C., and Gold, L (1990) Systematic evolution of ligands by expon tial enrichment: RNA ligands to Bacteriophage T4 DNA polymerase. Sci ence 249, pp. 505-510;
Uhlenbeck, O., Baller, J., and Doty, P. (1970) Complementary oligonucleotides binding to the anticodon loop of fMet-transfer RNA. Nature 225, pp. 508-510;
Uphoff, KW, Bell, SD, and Ellington, AD (1996) In vitro selection of ap tamers: The dearth of pure reason Curr. Opin. Struct. BioL 6, pp. 281-288;
Zuker, M. (1989) Computer prediction of RNA structure Methods Enzymol. 180, 262-288;
Zuker, M., and Stiegler, P. (1981) Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary Information Nucleic Acids Res. 9, pp. 133-148.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. A method for determining the concentration of a target molecule, wherein
the target molecule is brought into contact with a ligand comprising a fluorescent group and a complex is formed from the target molecule and ligand,
the fluorescence signal of the ligand in the complex differs from the fluorescence signal of the free ligand,
the fluorescence signal of the ligand in the complex is determined and from this the concentration of the complex and thus the target molecule is determined,
characterized in that
the ligand is a nucleic acid and the nucleic acid comprises at least one fluorescent group, the fluorescent group being arranged in a loop or an unpaired region of the nucleic acid.

2. The method according to claim 1, characterized in that the fluorescent group 1, N ⁶ -thenoadenosine.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the nuc linseic acid is selected from the group consisting of D-ribonucleic acid, L- Ribonucleic acid, D-deoxyribonucleic acid and L-deoxyribonucleic acid includes.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that for the synthesis of the fluorophore phosphoramidite with easily removable Protecting groups are used on the amino functions.

5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the D- Nucleic acid is a D-ribonucleic acid.

6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the D- Ribonucleic acid are ribozymes.

7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the D- Nucleic acid is a D-deoxyribonucleic acid.

8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the D- Ribonucleic acids are deoxyribozymes.

9. The method according to any one of the preceding claims, wherein as the target molecule a peptide, a polypeptide and / or one of several polypeptides together set protein is used.

10. The method according to any one of the preceding claims, wherein as the target molecule a single stranded RNA, a double stranded RNA, a single stranded DNA and / or a double-stranded DNA, as well as combinations thereof, be used.

11. The method according to any one of the preceding claims, wherein as the target molecule an antibiotic or a pharmaceutically active substrate is used becomes.

12. The method according to any one of the preceding claims, wherein as the target molecule a sugar molecule is used.

13. The method of claim 12, wherein an L-nucleic acid specific to a such a sugar molecule is bound.

14. The method according to claim 13, wherein the L-nucleic acid is an L- Is ribonucleic acid.

15. The method of claim 13, wherein the L-nucleic acid is a ribozyme.

16. The method according to claim 13, wherein the L-nucleic acid is an L- Is deoxyribonucleic acid.

17. The method of claim 13, wherein the L-nucleic acid is a deoxyribozyme is.

18. The method according to claim 13, wherein the L-nucleic acid is an L- Is ribonucleic acid.

19. Use of a method according to the preceding claims for egg an immunoassay.

20. A method for the rapid and direct determination of the binding constant of a ligand-target molecule complex, wherein
a certain concentration of target molecule and ligand is provided,
Ligand and target molecule are brought into contact with one another,
the concentration of the target molecule in the complex and / or the complex is determined by a method according to one of claims 1 to 18 and
the binding constant is calculated from this.

21. Kit for diagnostic and analytical purposes using the method according to one of claims 1 to 18 and / or claim 20.