DE10209958A1

DE10209958A1 - Escherichia coli DSM 6601 as antiphlogistic agent, useful for treating inflammatory skin diseases and rheumatic disease

Info

Publication number: DE10209958A1
Application number: DE10209958A
Authority: DE
Inventors: Toshifumi Hibi; Nagamu Inoue; Kenichi Maeda; Nobuhiko Kamada; Ulrich Sonnenborn; Juergen Schulze; Hans Proppert
Original assignee: Pharma Zentrale GmbH
Current assignee: Pharma Zentrale GmbH
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2003-09-25

Abstract

Use of Escherichia coli strain DSM 6601 as antiphlogistic agent for treatment of inflammatory skin disorders and diseases of the rheumatic type.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Escherichia coli, im folgenden E. coli, Stamm DSM 6601 als Antiphlogistikum zur Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen und Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises. The invention relates to the use of Escherichia coli, hereinafter E. coli, strain DSM 6601 as an anti-inflammatory agent for the treatment of inflammatory skin diseases and rheumatic diseases Form circle.

Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 wird seit längerem in lebender Form als probiotisches Arzneimittel zur Behandlung bestimmter Darmerkrankungen, so bei Darmfunktionsstörungen, wie der chronischen Obstipation und dem Reizdarmsyndrom, aber auch bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Morbus Crohn), therapeutisch eingesetzt. Seine therapeutische Wirksamkeit bei diesen Indikationen ist in einer Reihe von klinischen Studien und Erfahrungsberichten dokumentiert (z. B. Schütz, 1989; Möllenbrink & Bruckschen, 1994, Malchow, 1997; Kruis et al. 1997; Rembacken et al., 1999). Alphabetisch geordnete Literaturliste ist als Anlage A beigefügt. The apathogenic E. coli strain DSM 6601 has been living for some time Form as a probiotic medicine used to treat certain Bowel diseases, such as bowel dysfunction, such as chronic Constipation and irritable bowel syndrome, but also for chronic inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis, Crohn's disease), used therapeutically. Its therapeutic effectiveness in these Is in a number of clinical trials and indications Experience reports documented (e.g. Schütz, 1989; Möllenbrink & Bruckschen, 1994, Malchow, 1997; Kruis et al. 1997; Rembacken et al., 1999). An alphabetical list of references is attached as Appendix A.

Die zuvor genannten Darmerkrankungen und -dysfunktionen gehen bekanntermaßen mit Störungen der physiologischen Darmflora einher (Balsari et al., 1982; McKay, 1999; Onderdonk 2000; Sartor, 1997b, 2000). So wurden sowohl beim Reizdarmsyndrom (RDS) als auch bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) in verschiedenen Untersuchungen Veränderungen der Bakterienflora des Gastrointestinaltraktes festgestellt, wie beispielsweise Veränderungen des normalen Darmkeimspektrums und ein erhöhter Nachweis darmpathogener Erreger (Gorbach et al., 1968; Van der Wiel-Korstanje & Winkler, 1975; Balsari et al., 1982; Tvede & Willumsen, 1982; Ruseler von Embden & Both-Patoir, 1983; Bradley et al., 1987; Hartley et al., 1992; Weber et al., 1992; Fabia et al., 1993; Kallinowski et al., 1998). The aforementioned bowel diseases and dysfunctions go as is known to be accompanied by disorders of the physiological intestinal flora (Balsari et al., 1982; McKay, 1999; Onderdonk 2000; Sartor, 1997b, 2000). Both irritable bowel syndrome (RDS) and inflammatory bowel disease (IBD) in various Changes in the bacterial flora of the Gastrointestinal tract, such as changes in the normal intestinal germ spectrum and an increased detection intestinal pathogen (Gorbach et al., 1968; Van der Wiel-Korstanje & Winkler, 1975; Balsari et al., 1982; Tvede & Willumsen, 1982; Ruseler from Embden & Both Patoir, 1983; Bradley et al., 1987; Hartley et al., 1992; Weber et al., 1992; Fabia et al., 1993; Kallinowski et al., 1998).

E. coli DSM 6601 weist aufgrund seiner Fähigkeit, ein antibakteriell wirksames Microcin zu produzieren in vitro in Co- Kultivierungsexperimenten eine ausgeprägte Hemmwirkung, also einen Antagonismus gegen enteropathogene Keime auf. Da dieser E. coli Stamm auch in vivo das Wachstum darmpathogener Erreger unterdrückt und dadurch diese unerwünschten Keime aus dem Lumen des Gastrointestinaltraktes verdrängen kann, nahm man bisher an, daß die therapeutische Wirksamkeit von E. coli DSM 6601 bei RDS und CED auf seinen antimikrobiellen Wirkungen beruht. E. coli DSM 6601 exhibits an antibacterial ability to produce effective microcin in vitro in co- Cultivation experiments have a pronounced inhibitory effect, i.e. one Antagonism against enteropathogenic germs. Since this E. coli Strain also suppresses the growth of intestinal pathogens in vivo and thereby these unwanted germs from the lumen of the Can displace gastrointestinal tract, it was previously assumed that the therapeutic efficacy of E. coli DSM 6601 in RDS and IBD based on its antimicrobial effects.

Es wurde jetzt festgestellt, daß E. coli DSM 6601 nicht nur die Mikroflora im Darmlumen beeinflussen kann, sondern auch in der Lage ist, mit den Epithelzellen des Darmes direkt zu kommunizieren. Überraschenderweise hemmt der Zusatz von E. coli DSM 6601 zu einer Darmepithelzellkultur (HCT15-Zellen) dosisabhängig die durch Behandlung mit Tumor-Nekrose- Faktor (TNFα) provozierte Ausschüttung des pro-inflammatorischen Botenstoffs Interleukin-8 (IL-8) Abb. 1. Die Sekretion von IL-8 ist eine charakteristische Antwort der Epithelzelle auf Infektionen mit entheropathogenen Erregern bzw. auf entzündliche Reize, wie sie als Folge einer Infektion auftreten und dient dazu, die Abwehrzellen des Immunsystems zu alarmieren, zu mobilisieren und an den Ort der Infektion zu locken (Schulte et al., 1996; McCormick et al., 1998). Hier angelangt, können die Immunzellen (Makrophagen, Granulozyten) dann die lokale Infektion bekämpfen. Dabei kommt es unvermeidlicherweise auch stets zu Gewebsläsionen durch die aggressiven lytischen Enzyme, die die Immunzellen sezernieren. It has now been found that E. coli DSM 6601 can not only influence the microflora in the intestinal lumen, but is also able to communicate directly with the epithelial cells of the intestine. Surprisingly, the addition of E. coli DSM 6601 inhibits a Darmepithelzellkultur (HCT15 cells) dose-dependently provoked by treatment with tumor necrosis factor (TNF) release of pro-inflammatory messenger Interleukin-8 (IL-8) FIG. 1. The secretion of IL-8 is a characteristic response of the epithelial cell to infections with entheropathogenic pathogens or to inflammatory stimuli, which occur as a result of an infection, and serves to alarm, mobilize the immune system's immune cells and to target the site of the infection lure (Schulte et al., 1996; McCormick et al., 1998). Once here, the immune cells (macrophages, granulocytes) can fight the local infection. Inevitably there are always tissue lesions due to the aggressive lytic enzymes that secrete the immune cells.

Bei ansonsten gesunden Personen bleibt nach einer Darminfektion diese Entzündung auf den Ort der Infektion begrenzt und ist auch zeitlich limitiert. Bei den CED dagegen breitet sich der Entzündungsprozeß immer weiter aus und chronifiziert, da das Abwehrsystem seine natürliche immunologische Toleranz gegenüber der eigenen Darmflora verloren hat und diese daher als "fremd" erkennt, die normalen Darmkeime somit wie Infektionserreger behandelt und kontinuierlich bekämpft (Macpherson et al., 1996, Duchmann et al., 1995, 1996; Sartor, 2000). Dies führt in der Folge bei den betroffenen Patienten zu den bekannten ausgedehnten Gewebsschädigungen der Darmwand. In otherwise healthy people, this remains after an intestinal infection Inflammation is limited to the location of the infection and is also temporal limited. With the IBD, however, the inflammatory process always spreads further out and chronified because the defense system is its natural has lost immunological tolerance to its own intestinal flora and therefore recognizes it as "foreign", the normal intestinal germs like Infectious agents treated and continuously controlled (Macpherson et al., 1996, Duchmann et al., 1995, 1996; Sartor, 2000). This results in the Follow the well-known extensive in the affected patients Tissue damage to the intestinal wall.

Da der E. coli Stamm DSM 6601 die Ausschüttung des pro- inflammatorischen Botenstoffs IL-8 aus den Darmepithelzellen unterbinden kann, spiegelt diese Fähigkeit nicht nur einen weiteren Wirkmechanismus des Stammes wieder, sondern ist auch geeignet, neue Anwendungsgebiete für diesen Lebendkeimwirkstoff zu erschließen. Since the E. coli strain DSM 6601 distributed the pro- inflammatory messenger IL-8 from the intestinal epithelial cells can prevent this ability not only reflects another Mechanism of action of the strain again, but is also suitable for new ones Open up areas of application for this live germ active ingredient.

Ein neues Anwendungsgebiet für den Einsatz von E. coli DSM 6601 als probiotisches Arzneimittel ist aufgrund der neuen Erkenntnisse zur anti- inflammatorischen Wirkung dieses Bakterienstammes die Prophylaxe von entzündlichen intestinalen Erkrankungen. Im Bereich gastroenterologischer Indikationen sind hier zu nennen zum einen die prophylaktische Behandlung von Personen mit familiärer Neigung zu chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Jayanthi et al., 1991; Ma et al., 1999; Sandler & Eisen, 2000), zum anderen die prophylaktische Behandlung von Patienten, die Arzneimittel einnehmen müssen, welche als Nebenwirkung Darmentzündungen auslösen können (Bjarnason & Peters, 1996). A new application for the use of E. coli DSM 6601 as probiotic medicinal product is new inflammatory effect of this bacterial strain the prophylaxis of inflammatory intestinal diseases. In the area gastroenterological indications include the first prophylactic treatment of people with a family inclination to inflammatory bowel disease (Jayanthi et al., 1991; Ma et al., 1999; Sandler & Eisen, 2000), on the other hand the prophylactic Treatment of patients who need to take medicines which can cause intestinal inflammation as a side effect (Bjarnason & Peters, 1996).

Beispielhaft sie hier die Arzneimittelgruppe der nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR) genannt. For example, here the drug group of the non-steroidal Called anti-inflammatory drugs (NSAIDs).

Vor allem aber bietet die überraschende Wirksamkeit von E. coli Stamm DSM 6601 als Hemmer der IL-8-Sekretion in Epithelzellen die Möglichkeit, diesen Keim auch bei der Behandlung von extraintestinalen Erkrankungen entzündlicher Genese einzusetzen. Above all, the surprising effectiveness of E. coli strain offers DSM 6601 as an inhibitor of IL-8 secretion in epithelial cells the possibility this germ also in the treatment of extraintestinal diseases inflammatory genesis.

Als extraintestinale Erkrankungen, für die eine prophylaktische oder auch therapeutische Behandlung mit E. coli DSM 6001 möglich ist, seien hier die atopischen und chronisch entzündlichen Hauterkrankungen wie Neurodermitis, Psoriasis, Urtikaria und seborrhoisches Ekzem, angeführt. Interessanterweise liegt bei Atopikern neben den bekannten immunologischen Störungen auch eine reduzierte Permeabilitätsbarriere im Darmtrakt vor (Benard et al., 1996; Majamaa & Isolauri, 1996), so daß die ohnehin dysregulierte Immunabwehr dieser Patienten zusätzlich mit einer erhöhten Translokation mikrobieller Bestandteile aus dem Darmlumen belastet wird. As extraintestinal diseases for which a prophylactic or also therapeutic treatment with E. coli DSM 6001 is possible here the atopic and chronic inflammatory skin diseases like Neurodermatitis, psoriasis, urticaria and seborrheic eczema. Interestingly, atopic patients lie next to the known ones immunological disorders also have a reduced permeability barrier in the intestinal tract (Benard et al., 1996; Majamaa & Isolauri, 1996), so that the already dysregulated immune defense of these patients an increased translocation of microbial components from the Intestinal lumen is loaded.

Auch bei bestimmten entzündlichen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises mit engen Beziehungen zum Gastrointestinaltrakt (z. B. enterogene Arthritis, post-infektiöse/reaktive Arthritis, rheumatoide Arthritis) ist der Einsatz dieses probiotischen E. coli Stammes mit anti- inflammatorischer Wirkung, therapeutisch oder prophylaktisch angewandt, sinnvoll. Even with certain inflammatory diseases of the rheumatic Form circle with close relationships to the gastrointestinal tract (e.g. enterogenic arthritis, post-infectious / reactive arthritis, rheumatoid Arthritis) is the use of this probiotic E. coli strain with anti inflammatory effect, used therapeutically or prophylactically, meaningful.

Epidemiologische Studien und genetische Untersuchungen haben gezeigt, daß die o. g. entzündlichen intestinalen und extraintestinalen Erkrankungen familiär gehäuft vorkommen, d. h. einen bestimmten genetischen Hintergrund besitzen (CED: Jayanthi et al., 1991; Gregory & Ho, 1992; Ma et al., 1999; Sandler & Eisen, 2000; Chronisch entzündliche Hauterkrankungen: Barger, 1991; Bos et al., 1994; Stern, 1997; Rudikoff & Lebwohl, 1998; Arthritiden: Benjamn & Parham, 1992; Hughes & Keat, 1994; Lahesmaa et al.; 1995; Fomberstein et al., 1996; Woo & Wedderblum, 1998). Epidemiological studies and genetic studies have shown that the above inflammatory intestinal and extraintestinal Family diseases occur frequently, d. H. a certain one have a genetic background (CED: Jayanthi et al., 1991; Gregory & Ho, 1992; Ma et al., 1999; Sandler & Eisen, 2000; Chronic inflammatory Skin diseases: Barger, 1991; Bos et al., 1994; Stern, 1997; Rudikoff & Lebwohl, 1998; Arthritis: Benjamn & Parham, 1992; Hughes & Keat, 1994; Lahesmaa et al .; 1995; Fomberstein et al., 1996; Woo & Wedderblum, 1998).

Allerdings ist die erbliche Veranlagung allein bei den genannten entzündlichen Erkrankungen im allgemeinen nicht ausreichend, um die latent vorhandene Erkrankung zum Ausbruch zu bringen. Umweltfaktoren, wie Infektionskeime, bestimmte Komponenten der Darmflora, Nahrungsbestandteile oder allergene Stoffe müssen als sogenannte Trigger-Faktoren auftreten, um die Erkrankung manifest werden zu lassen (CED: Koutroubakis et al., 1996; Sartor, 1997a, b; Sandler & Eisen, 2000; Chronisch entzündliche Hauterkrankungen: James & Warm, 1971; Atherton, 1988; Boehnke, 1996; Arthritiden: Bremell et al., 1991; Nissilä et al., 1994; Probst et al., 1994; Hazenberg, 1995). However, the hereditary disposition is solely with the above inflammatory diseases in general are insufficient to treat the bring latent disease to the outbreak. Environmental factors, like infection germs, certain components of the intestinal flora, Food components or allergenic substances have to be called Trigger factors occur to make the disease manifest (CED: Koutroubakis et al., 1996; Sartor, 1997a, b; Sandler & Eisen, 2000; Chronic Inflammatory Skin Disorders: James & Warm, 1971; Atherton, 1988; Boehnke, 1996; Arthritis: Bremell et al., 1991; Nissila et al., 1994; Probst et al., 1994; Hazenberg, 1995).

Aufgrund dieser Erkenntnisse ist es angebracht, solche familiär vorbelasteten gefährdeten Personen prophylaktisch zu behandeln, um einen möglichen Ausbruch der entzündlichen Erkrankungen zu vermeiden. On the basis of these findings, it is appropriate to have such a family prophylactically treat vulnerable persons who have to avoid a possible outbreak of inflammatory diseases.

Im Falle der Verhinderung von Arzneimittelschäden an der Darmwand ist die direkte anti-entzündliche Wirkung von E. coli DSM 6601 auf die Darmepithelzellen ebenfalls von grundlegender Bedeutung. Durch eine Vorbehandlung oder Parallelbehandlung der Patienten, die beispielsweise nicht-steroidale Antirheumatika einnehmen müssen, mit E. coli DSM 6601 kann ein Schutz des Darmepithels vor überschießenden entzündlichen Reaktionen auf den Arzneimittelreiz erzielt werden. In the case of preventing drug damage to the intestinal wall the direct anti-inflammatory effect of E. coli DSM 6601 on the Intestinal epithelial cells are also fundamental. By a Pretreatment or parallel treatment of patients, for example need to take non-steroidal anti-inflammatory drugs with E. coli DSM 6601 can protect the intestinal epithelium from excessive inflammatory Responses to the drug stimulus are achieved.

Die anti-inflammatorische Wirkung von E. coli DSM 6601 wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert: The anti-inflammatory effect of E. coli DSM 6601 is as follows explained in more detail using the examples:

example 1 Inhibition of TNFα-induced IL-8 secretion in HCT15 epithelial cells by E. coli DSM 6601

Als Zellinie wurde die humane Kolonkarzinomzellinie HCT15 verwendet, die in DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium) mit 10% foetalem Kälberserum (FKS) bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert wurde. Untersucht wurde die Wirkung von E. coli DSM 6601 und E. coli K-12 (als Kontrollstamm) auf die IL-8-Sekretion der Epithelzellen nach Stimulierung durch Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα). Dazu wurden die HCT15-Zellen in Gewebekulturplatten mit jeweils 6 Kavitäten eingesät mit einer Konzentration von ca. 1 × 10⁶ Zellen pro Kavität und über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ gezüchtet, um Adhäsion zu ermöglichen. Bakterien des Stammes E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K-12 wurden in LB (Luria-Bertani)- Medium in einem Gesamtvolumen von 25 ml logarithmisch wachsen gelassen bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,6, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Bakterien wurden zweimal gewaschen und wieder in DMEM resuspendiert. Die gewünschte Bakterienkonzentration wurde eingestellt durch Messung der OD bei 600 nm. Die optische Dichtemessung wurde überprüft durch Ausplattieren serieller Verdünnungen der Bakteriensuspensionen auf LB-Agar und Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) nach Übernacht-Inkubation bei 37°C. HCT15-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Bakterien bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Danach erfolgte die Stimulierung durch TNFα (Endkonzentration 20 ng/ml) bei 37°C für 30 bis 40 Minuten. Nach der Stimulierung durch TNFα wurden die Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellsedimente wurden suspendiert in 1 ml TRIZOL und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Gesamt-RNA der Zellen wurde mit Hilfe der Trizol-Methode (Gibco BRL) extrahiert. Für die RT-PCR wurde die "first-strand" komplementäre DNA synthetisiert unter Verwendung von Oligo(dT) entsprechend den Angaben des Herstellers (SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR kit,I Incitrogen). 1 µl der 1-st-strand cDNA wurde über 25 PCR-Zyklen amplifiziert in einer Reaktionsmischung aus 5 µl 10 × PCR-Puffer, je 2 µl von 2,5 µM Sense- und Antisene-Primern für hIL-8 oder je 2 µl von 5,0 µM Sense- und Antisense-Primern für hGAPDH, 4 µl dNTPs, 35,5 µl H₂O und 0,5 µl Taq Polymerase. Die PCR-Bedingungen waren: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden. Die anfängliche Denaturierungs- und abschließenden Extensionsbedingungen waren 94°C für 5 Minuten bzw. 72°C für 7 Minuten. Die Amplifikate wurden auf einem 2%-igen Agarose-Gel in TBE elektrophoretisiert, und die Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt. Das Verhältnis der Bandenintensität der Amplifikate von hIL-8 zu hGAPHD wurde bestimmt. Die folgenden PCR- Primer-Sequenzen wurden verwendet: IL-8, 5' ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc ctg und 3' ggc aac cct aca aca gac cca cac aat aca; GAPDH, 5' tga agg tcg gag tca acg gat ttg gt und 3' cat gtg ggc cat gag cac cac. The human colon carcinoma cell line HCT15 was used as the cell line, which was cultivated in DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium) with 10% fetal calf serum (FCS) at 37 ° C. and 5% CO ₂ . The effect of E. coli DSM 6601 and E. coli K-12 (as a control strain) on the IL-8 secretion of the epithelial cells after stimulation by tumor necrosis factor α (TNFα) was examined. For this purpose, the HCT15 cells were sown in tissue culture plates with 6 wells each, with a concentration of approx. 1 × 10 ⁶ cells per well and grown overnight at 37 ° C. and 5% CO ₂ to enable adhesion. Bacteria of the strain E. coli DSM 6601 or E. coli K-12 were grown logarithmically in LB (Luria-Bertani) medium in a total volume of 25 ml to an optical density (OD) of 0.6, measured at a wavelength of 600 nm. The bacteria were washed twice and resuspended in DMEM. The desired bacterial concentration was set by measuring the OD at 600 nm. The optical density measurement was checked by plating serial dilutions of the bacterial suspensions onto LB agar and determining the colony-forming units (CFU) after overnight incubation at 37 ° C. HCT15 cells were incubated with various concentrations of the bacteria at 37 ° C for 30 minutes. The stimulation was then carried out by TNFα (final concentration 20 ng / ml) at 37 ° C. for 30 to 40 minutes. After TNFα stimulation, the cells were harvested using trypsin-EDTA and washed twice with PBS. The cell sediments were suspended in 1 ml TRIZOL and stored at -80 ° C until further use. The total RNA of the cells was extracted using the Trizol method (Gibco BRL). For the RT-PCR, the "first-strand" complementary DNA was synthesized using oligo (dT) according to the manufacturer's instructions (SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR kit, I Incitrogen). 1 µl of the 1 st strand cDNA was amplified over 25 PCR cycles in a reaction mixture of 5 µl 10 × PCR buffer, 2 µl each of 2.5 µM sense and antisene primers for hIL-8 or 2 µl each of 5.0 µM sense and antisense primers for hGAPDH, 4 µl dNTPs, 35.5 µl H ₂ O and 0.5 µl Taq polymerase. The PCR conditions were: 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds. The initial denaturation and final extension conditions were 94 ° C for 5 minutes and 72 ° C for 7 minutes, respectively. The amplicons were electrophoresed on a 2% agarose gel in TBE and the gels were stained with ethidium bromide. The ratio of the band intensity of the amplicons from hIL-8 to hGAPHD was determined. The following PCR primer sequences were used: IL-8, 5 'ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc ctg and 3' ggc aac cct aca aca gac cca cac aat aca; GAPDH, 5 'tga agg tcg gag tca acg gat ttg gt and 3' cat gtg ggc cat gag cac cac.

Die dosisabhängige Hemmung der TNFα-induzierten IL-8-Sekretion in HCT15-Epithelzellen durch E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K-12 im Vergleich zu reinem Kulturmedium (als Kontrolle) ist in der Abb. 1 dargestellt. The dose-dependent inhibition of TNFα-induced IL-8 secretion in HCT15 epithelial cells by E. coli DSM 6601 or E. coli K-12 compared to pure culture medium (as a control) is shown in Fig. 1.

Aus der Abbildung ergibt sich die Hemmung der TNFα-induzierten IL-8- Sekretion in HCT15-Epithelzellen durch E. coli DSM 6601 bzw. E. coli K- 12. Die Bakteriensuspensionen wurden auf 10⁶, 10⁷, 10⁸ und 10⁹ KBE/ml eingestellt und mit den HCT15-Epithelzellen inkubiert. Aufgetragen ist die TNFα-induzierte relative epitheliale Sekretion vin IL-8 nach Inkubation mit den verschiedenen Bakterienkonzentrationen im Vergleich zur Kontrolle (Kulturmedium = 100%). E. coli DSM 6601 zeigt eine deutlich effektivere Hemmung der IL-8-Sekretion als E. coli K-12. The illustration shows the inhibition of TNFα-induced IL-8 secretion in HCT15 epithelial cells by E. coli DSM 6601 and E. coli K-12. The bacterial suspensions were found at 10 ⁶ , 10 ⁷ , 10 ⁸ and 10 ⁹ CFU / ml adjusted and incubated with the HCT15 epithelial cells. The TNFα-induced relative epithelial secretion of IL-8 is shown after incubation with the different bacterial concentrations compared to the control (culture medium = 100%). E. coli DSM 6601 shows a significantly more effective inhibition of IL-8 secretion than E. coli K-12.

Example 2 Treatment of patients with atopic dermatitis with E. coli DSM 6601

58 Patienten (38 weiblich und 20 männlich im Alter zwischen 10 und 34 Jahren), die an einer klinisch gesicherten Neurodermitis (Neurodermitis constitutionalis atopica) litten, wurden in einer Hautarztpraxis über 4 Wochen beobachtet. 58 patients (38 female and 20 male between the ages of 10 and 34 Years) suffering from clinically proven neurodermatitis (neurodermatitis constitutionalis atopica), were over 4 in a dermatological practice Weeks watched.

28 Patienten wendeten übliche dermatologische Präparationen an. 30 Patienten erhielten zusätzlich ein zugelassenes Präparat mit lebensfähigen E. coli DSM 6601. Kein Patient nahm während dieser Zeit Steroide, andere Antiphlogistika oder Antibiotika ein. 28 patients used standard dermatological preparations. 30 Patients also received an approved preparation with viable E. coli DSM 6601. No patient took steroids during this time, others Anti-inflammatory drugs or antibiotics.

Medical history

Trotz Einhaltung einer gemäßigten hypoallergenen Diät litten 31 von ihnen unter schwerer atopischer Dermatitis mit einem für dieses Krankheitsbild im Akutstadium typischen Lokalbefund im Gesicht, an den Extremitäten und am Körperstamm. Bei allen wurde eine Superinfektion der Haut mit Staphylococcus aureus nachgewiesen. 13 dieser Patienten hatten zusätzlich einen mukokutanen Befall mit Candida sp., Streptococcus pyogenes und Enterokokken. 7 weitere Patienten waren zusätzlich mit Corynebakterien besiedelt. Bei 1 Patienten konnte zudem eine Infektion mit Herpes simplex festgestellt werden. Despite adhering to a moderate hypoallergenic diet, 31 of them suffered with severe atopic dermatitis with a for this clinical picture in Acute stage typical local findings on the face, on the extremities and on the Trunk. All of them had a super infection of the skin Staphylococcus aureus detected. 13 of these patients also had a mucocutaneous infestation with Candida sp., Streptococcus pyogenes and Enterococci. 7 other patients were additionally with corynebacteria populated. Herpes simplex infection was also found in 1 patient be determined.

27 Patienten hatten eine leichtere Form der Neurodermitis mit Erythemen, Xerosis, Lichenifikation und oberflächlichen Beugenexkoriationen. Auch bei ihnen wurde ein Hautbefall mit Staphylococcus aureus festgestellt. 9 von ihnen zeigten außerdem einen kutanen Befall mit Enterokokken. Zusätzlich wurden bei 2 Patienten Corynebakterien und bei einem Patient Enterobacteriaceaen nachgewiesen. 27 patients had a mild form of eczema with erythema, Xerosis, lichenification and superficial flexion excoriations. Also at they were diagnosed with Staphylococcus aureus. 9 of they also showed cutaneous infestation with enterococci. additionally Corynebacteria were found in 2 patients and in 1 patient Enterobacteriaceaen detected.

Bei allen Patienten wurden neben den üblichen Sicherheitsparametern im Blut Serumproteine mit handelsüblichen Kits (Boehringer Mannheim) und IgE-Antikörper gegen mikrobielle Antigene (z. B. Staphylococcus aureus, Candida albicans) mit standardisierten Enzym-Immunoassays (Padezym PRIST und RAST, Pharmacia) gemessen. In addition to the usual safety parameters, all patients were Blood serum proteins with commercially available kits (Boehringer Mannheim) and IgE antibodies against microbial antigens (e.g. Staphylococcus aureus, Candida albicans) with standardized enzyme immunoassays (Padezym PRIST and RAST, Pharmacia) measured.

13 Patienten (22,4%) hatten bei offensichtlich normaler Leberfunktion und fehlender Proteinurie eine Albuminkonzentration von weniger als 4 g/dl. 28 Patienten (48,3%) zeigten erniedrigte Gammaglobulinwerte (0,31-0,89 g/dl) und dabei meist auch erniedrigte Gesamtserumproteine. Erhöhte Gesamt-IgE- Werte, verbunden mit einer Eosinophilie wurden bei allen Patienten beobachtet. Thirteen patients (22.4%) had apparently normal liver function and lack of proteinuria an albumin concentration of less than 4 g / dl. 28 Patients (48.3%) showed decreased gamma globulin levels (0.31-0.89 g / dl) and usually also reduced total serum proteins. Increased total IgE Values associated with eosinophilia were seen in all patients observed.

therapy

Alle Patienten wurden aufgefordert, die gemäßigte hypoallergene Mischkost für die 4wöchige Behandlungszeit beizubehalten. Jeweils 15 Patienten mit einer schweren und 15 Patienten mit einer leichten Form der Neurodermitis erhielten über 4 Wochen zusätzlich eine Präparation mit E. coli DSM 6601. Jeweils morgens zum Frühstück wurden 200 mg Trockenmasse (100 mg Trockenmasse enthielten 10⁹-10¹⁰ lebensfähige E. coli DSM 6601) mit etwas Flüssigkeit eingenommen. Nach 4 Wochen wurde der Gesundheitszustand aller Patienten inklusive mikrobiologischer Hautbefunde und Serumparameter beurteilt. All patients were asked to maintain the moderate hypoallergenic mix for the 4-week treatment period. 15 patients with a severe and 15 patients with a mild form of neurodermatitis received an additional preparation with E. coli DSM 6601 over 4 weeks. In the morning, 200 mg dry matter (100 mg dry matter contained 10 ⁹ -10 ¹⁰ viable E. coli DSM 6601) taken with a little liquid. After 4 weeks, the health status of all patients, including microbiological skin findings and serum parameters, was assessed.

Result (see table 1)

Bei 7 (46,7%) von 15 Patienten mit schwerer Neurodermitis, die mit E. coli DSM 6601 behandelt wurden, fanden sich nur noch leichte Symptome (Erytheme, Lichenifikation, oberflächliche Exkorationen). 4 Patienten (26,7%) waren beschwerdefrei. 4 weitere Patienten (26,7%) zeigten ein unverändertes Beschwerdebild. In 7 (46.7%) of 15 patients with severe atopic dermatitis who had E. coli DSM 6601 were treated, there were only mild symptoms (Erythema, lichenification, superficial excorations). 4 patients (26.7%) were symptom-free. 4 other patients (26.7%) showed one unchanged complaint picture.

Im Gegensatz dazu hatten 10 (62,5%) der unbehandelten Patienten mit diesem Krankheitsschweregrad keine Verbesserung der Symptome, während 6 Patienten (37,5%) nur noch leichte Beschwerden hatten. Kein Patient war beschwerdefrei. 10 der 15 Patienten (66,7%) mit der anfangs diagnostizierten leichteren Form der Neurodermitis, die E. coli DSM 6601 erhielten, fühlten sich beschwerdefrei und hatten nur noch verschwindend geringe Erythematisierungen und Lichenifikationen der Haut. Bei 3 Patienten (20%) verbesserten sich die Hautsymptome. 2 Patienten (13,3%) zeigten keine therapeutischen Erfolge. Von den 12 unbehandelten Patienten dieses Schweregrades zeigten 3 (25%) eine Verschlimmerung mit großflächigen Exanthemen an Extremitäten und am Stamm, 4 (33,3%) eine Verbesserung des Krankheitsbildes. Bei 5 (41,7%) wurden keine Veränderungen festgestellt. In contrast, 10 (62.5%) of the untreated patients had this disease severity does not improve symptoms while 6 patients (37.5%) had only mild complaints. No patient was symptom-free. 10 of the 15 patients (66.7%) diagnosed with the initially lighter form of eczema received E. coli DSM 6601 free of symptoms and had only negligible Erythematization and lichenification of the skin. In 3 patients (20%) the skin symptoms improved. 2 patients (13.3%) showed none therapeutic success. Of the 12 untreated patients this one Severity showed 3 (25%) an aggravation with large areas Rash on extremities and trunk, 4 (33.3%) an improvement of the clinical picture. In 5 (41.7%) there were no changes detected.

Die mikrobiologischen Befunde zeigten eine Verminderung der Keimbelastung der Haut in der Behandlungsgruppe, unabhängig vom Ausgangsschweregrad. Das Keimspektrum blieb nahezu unverändert. In der unbehandelten Gruppe wurden weder quantitativ noch qualitativ Veränderungen gefunden. Veränderungen im Plasma-Eiweißspiegel und in den IgE-Werten spiegelten Veränderungen im Krankheitsbild unabhängig vom Therapieschema wider. So verminderten sich bei allen Patienten, deren Krankheitsbild sich besserte, die erhöhten IgE-Werte; allerdings blieben die positiven RAST-Werte erhalten. Die vorher gefundene Hypoproteinämie verbesserte sich bei diesen Patienten und erreichte teilweise Normalwerte, gemessen am Albumin- und Gammaglobulin-Gehalt. The microbiological findings showed a decrease in Germ load on the skin in the treatment group, regardless of Output severity. The spectrum of germs remained almost unchanged. In the untreated groups were neither quantitative nor qualitative Found changes. Changes in plasma protein levels and in the IgE values reflected changes in the clinical picture independently reflected by the therapy regimen. So decreased in all patients whose Clinical picture improved, the increased IgE values; however, they remained received positive RAST values. The previously found hypoproteinemia improved in these patients and partially reached normal values, measured by the albumin and gamma globulin content.

Conclusion

Teile der kutanen Hautflora wie Staphylococcus aureus fungieren als permanente Stimuli allergischer Hautreaktionen bei genetisch vorgeprägten Personen und können Exazerbationen einer atopischen Dermatitis triggern. In vitro führt die Stimulation von T-Zellen mit Su-perantigenen dieser Bakterien zur Freisetzung von Zytokinen vom TH2-Muster. Über diesen Weg können Mastzellen und Basophile zur Mediatoren-Ausschüttung induziert werden (Wehner J. et al. Staphylococcus aureus enterotoxins induce histamine and leukotriene release in patients with atopic eczema. Brit. J. Dermatol. 145 (2001) 302-305). Offensichtlich wird durch die orale Verabfolgung des E.-coli-Stammes DSM 6601 eine systemische Hemmung inflammatorischer Zytokine erzielt. Das zeigt sich im Abklingen der entzündlichen Hauterscheinungen beim atopischen Neurodermitiker, ohne daß die bakterielle Hautbesiedlung maßgeblich beeinflußt wird.

Parts of the cutaneous skin flora such as Staphylococcus aureus act as permanent stimuli of allergic skin reactions in genetically pre-characterized individuals and can trigger exacerbations of atopic dermatitis. In vitro, stimulation of T cells with superantigens of these bacteria leads to the release of cytokines from the TH2 pattern. In this way, mast cells and basophils can be induced to release mediators (Wehner J. et al. Staphylococcus aureus enterotoxins induce histamine and leukotriene release in patients with atopic eczema. Brit. J. Dermatol. 145 (2001) 302-305). Obviously, oral administration of the E. coli strain DSM 6601 results in systemic inhibition of inflammatory cytokines. This can be seen in the disappearance of the inflammatory skin symptoms in atopic neurodermatitis, without significantly influencing the bacterial skin colonization.

Claims

1. Use of Escherichia coli strain DSM 6601 as Anti-inflammatory drug for the treatment of inflammatory Skin diseases and rheumatic diseases Form circle.

2. Use according to claim 1 as a prophylactic for predisposed People.

3. Use according to claim 1 or 2 in liquid preparation form with a content of living germs in the order of about 10 ⁷ to 10 ¹⁰ CFU / ml.