DE102004042894A1

DE102004042894A1 - Use of blockers of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction in autoimmune diseases

Info

Publication number: DE102004042894A1
Application number: DE102004042894A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dr. Steinle; Manuel Dr. Walton Manor Friese; Heinz Dr. Wiendl; Michael Prof. Dr. Weller; Bettina Dr. Schreiner; Robert Dr. Weissert
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-03-02
Also published as: WO2006024367A2; EP1848452A2; WO2006024367A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, insbesondere der Multiplen Sklerose, sowie zur Blockierung des NKG2D-Rezeptors, wobei die Blocker ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lösliches ULBP1, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAET1L, lösliches RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.The present invention relates to the use of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction blockers for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases, in particular multiple sclerosis, and for blocking the NKG2D receptor, the blockers being selected from the group consisting of comprising soluble NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBP1, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAET1L, soluble RAET1G, allelic variants or fragments or derivatives of said blockers, and synthetically produced NKG2D receptor / NKG2D blockers ligand interaction.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Blockern der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten.The The present invention relates to the use of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction blockers for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases.

Autoimmunität beruht auf einer spezifischen, adaptiven Immunantwort gegen körpereigene Antigene. Normalerweise lässt das Immunsystem körpereigene Substanzen unbehelligt und bekämpft nur Fremdkörper. Autoimmunität lässt sich als Ergebnis eines Zusammenbruchs der Toleranz gegenüber körpereigenen Stoffen und/oder eines defekten Kontroll- und Regulationsmechanismus des Immunsystems auffassen. Die genauen Ursachen für die Entstehung von Autoimmunkrankheiten sind bisher unbekannt. Es wird jedoch vermutet, dass neben umweltbedingten auch erbliche Faktoren eine Rolle spielen. T-Lymphozyten scheinen an der Auslösung der Krankheiten wesentlich beteiligt zu sein, da sie sowohl als cytotoxische T-Lymphozyten als auch durch die Aktivierung von Makrophagen Gewebeschädigungen verursachen können.Autoimmunity is based on a specific, adaptive immune response against the body's own Antigens. Usually leaves the body's own immune system Substances unmolested and fought only foreign objects. Autoimmunity can be as a result of a collapse of tolerance to the body's own Substances and / or a defective control and regulatory mechanism of the immune system. The exact causes of the genesis Autoimmune diseases are unknown. However, it is believed that in addition to environmental and hereditary factors play a role. T lymphocytes seem essential in triggering the diseases to be involved, as they are both cytotoxic T lymphocytes as well as by activating macrophages tissue damage can cause.

Autoimmunkrankheiten lassen sich in gewebe- oder organspezifische sowie systemische, also nicht-organspezifische Autoimmunkrankheiten einteilen. So ist bspw. die Erkrankung Multiple Sklerose ein Beispiel für eine organspezifische, vermutlich T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung beim Menschen.Autoimmune diseases can be divided into tissue- or organ-specific as well as systemic, thus divide non-organ specific autoimmune diseases. So is eg the disease multiple sclerosis an example of an organ specific, probably T cell-mediated Autoimmune disease in humans.

Bei der T-Zell-vermittelten Immunantwort erkennen zytotoxische T-Lymphozyten körpereigene Peptide in Kontext von MHC-Klasse I Molekülen (MHC = major histocompatibility complex/Haupthistokompatibilitätskomplex) und führen zur Zerstörung der erkannten Zelle. Dies ist vermutlich der Fall bspw. bei der rheumatoiden Arthritis und bei dem insulinabhängigen Diabetes mellitus.at of the T cell-mediated immune response recognize cytotoxic T lymphocytes endogenous Peptides in the context of MHC class I molecules (MHC = major histocompatibility complex / major histocompatibility complex) and lead to destruction the recognized cell. This is probably the case, for example, in the rheumatoid arthritis and insulin-dependent diabetes mellitus.

Der Nachweis von Autoimmunkrankheiten, die durch autoreaktive T-Lymphozyten verursacht werden, ist schwierig, da die Isolierung und Charakterisierung der entsprechenden autoantigenen Peptide technisch schwierig ist.Of the Detection of autoimmune diseases caused by autoreactive T lymphocytes Being caused is difficult because of the isolation and characterization the corresponding autoantigenic peptides is technically difficult.

In der Praxis ist das therapeutische Vorgehen oft konfrontiert mit chronischen, langsam fortschreitenden Autoimmunkrankheiten. Zu Teilerfolgen führte der Einsatz von Immunsuppressiva und Corticosteroiden.In In practice, the therapeutic approach is often confronted with chronic, slowly progressive autoimmune diseases. Partial successes led the use of immunosuppressants and corticosteroids.

Andere Therapieansätze machen sich die Idee zunutze, dass bestimmte Peptide die Autoimmunreaktion verhindern können. Die Peptide, die eine ähnliche Aminosäurestruktur wie das die Krankheit verursachende Selbstpeptid besitzen, binden dann zwar an die MHC-Moleküle, die von den T-Zell-Rezeptoren der autoreaktiven T-Zellen erkannt werden, jedoch werden die T-Zellen dadurch nicht mehr aktiviert.Other therapies take advantage of the idea that certain peptides cause the autoimmune reaction can prevent. The peptides that have a similar amino acid structure like the self-peptide causing the disease then to the MHC molecules, recognized by the T cell receptors of autoreactive T cells but the T cells are no longer activated.

Mit anderen Therapieansätzen soll erreicht werden, dass lösliche Komplexe aus MHC-Molekülen, Peptid und einem Toxin an diejenige T Zellen binden, die den Schaden im Organismus auslösen.With other therapeutic approaches should be achieved that soluble Complexes of MHC molecules, peptide and a toxin to those T cells that bind the damage in the Cause organism.

In anderen Ansätzen werden Cytokine, die bei der Auslösung von Autoimmunkrankheiten beteiligt sind, durch Antagonisten blockiert, wie bspw. Interleukin-1- und Tumor-Nekrosis-Faktor-α-Antagonisten.In other approaches Cytokines are used in the triggering of autoimmune diseases are blocked by antagonists, such as interleukin-1. and tumor necrosis factor α antagonists.

Neuere Studien haben nun Anhaltspunkte aufgezeigt, wonach der NKG2D-Rezeptor eine Rolle zumindest bei manchen Autoimmunkrankheiten spielt.newer Studies have now shown evidence that the NKG2D receptor plays a role in at least some autoimmune diseases.

Der aktivierende Immunrezeptor NKG2D wird auf natürlichen Killerzellen (NK Zellen) und mehreren T-Zellsubpopulationen einschließlich CD8+ T Zellen exprimiert.Of the activating immune receptor NKG2D is activated on natural killer cells (NK cells) and several T-cell subpopulations including CD8 + T cells.

NK Zellen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als solche an der Immunabwehr von Viren und Tumoren beteiligt. Dabei bestimmt das Zusammenspiel von Signalen aktivierender und inhibitorischer Rezeptoren die Aktivierung von NK Zellen. Durch die Vermittlung des aktivierenden Immunrezeptors NKG2D erkennen zytotoxische Lymphozyten, das heißt NK Zellen und CD8+ T Zellen, virusinfizierte bzw. maligne Körperzellen, die infolge dessen eliminiert werden können. Außer auf CD8+ αβ T Zellen und NK Zellen konnte die NKD2D-Expression auch auf γδ T Zellen gezeigt werden.NK Cells are an important part of the innate immune system and as such involved in the immune defense of viruses and tumors. This determines the interaction of signals activating and inhibitory receptors activation of NK cells. By recognize the mediation of the activating immune receptor NKG2D cytotoxic lymphocytes, ie NK cells and CD8 + T cells, virus-infected or malignant body cells, which can be eliminated as a result. Except for CD8 + αβ T cells and NK cells were able to express NKD2D even on γδ T cells to be shown.

Der Rezeptor NKG2D wird konstitutiv auf der Zelloberfläche exprimiert und ist mit dem Adapterprotein DAP10 assoziiert. Nach Interaktion mit seinen MHC Klasse I-ähnlichen Liganden vermittelt der Rezeptor NKG2D über das Adapterprotein ein Aktivierungssignal in die zytotoxischen Lymphozyten.Of the Receptor NKG2D is constitutively expressed on the cell surface and is associated with the adapter protein DAP10. After interaction with its MHC class I-like Ligands, the receptor mediates NKG2D via the adapter protein Activation signal in the cytotoxic lymphocytes.

Als NKG2D-Liganden sind bisher im Menschen die MHC-Klasse-I-Ketten-ähnlichen Moleküle A (MICA), MICB und die UL16-bindenden Proteine (ULBP) 1, 2, 3 und 4 (= RAET1E) und RAET1L sowie RAET1G identifiziert worden (siehe Steinle et al., „Interactions of human NKG2D with its Ligands MICA , MICB, and homologs of the mouse RAE-1 Protein Family", Immunogenetics 53:279-287, 2001; Cosman et al., „ULBPs, novel MHC Class I related Molecules, bind to CMV Glycoprotein UL 16 and stimulate NK Cytotoxicity through the NKG2D Receptor", Immunity 14:123-133, 2001; Bacon et al., „Two human ULBP/RAET1 molecules with transmembrane regions are ligands for NKG2D", J. Immunol. 173:1078-1084, 2004). In der Maus sind die NKG2D-Liganden RAE-1α, β, γ ,δ und ε, sowie H60 und das ULBP-Homolog MULT1 beschrieben worden.When NKG2D ligands have so far been MHC class I chain-like in humans molecules A (MICA), MICB and the UL16 binding proteins (ULBP) 1, 2, 3 and 4 (= RAET1E) and RAET1L and RAET1G have been identified (see Steinle et al., "Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB, and homologs of the mouse RAE-1 Protein Family ", Immunogenetics 53: 279-287, 2001; Cosman et al., "ULBPs, novel MHC Class I related molecules, bind to CMV glycoprotein UL 16 and stimulate NK Cytotoxicity through the NKG2D Receptor ", Immunity 14: 123-133, 2001; Bacon et al., "Two Human ULBP / RAET1 molecules with transmembrane regions are ligands for NKG2D ", J. Immunol. 173: 1078-1084, 2004). In the mouse, the NKG2D ligands are RAE-1α, β, γ, δ and ε, as well as H60 and the ULBP homolog MULT1 has been described.

Die verschiedenen NKG2D-Liganden haben unterschiedliche Expressionsmuster. Die Liganden werden nach derzeitigem Kenntnisstand nicht oder nur in geringem Umfang von normalen Körperzellen exprimiert, während unter pathologischen Bedingungen ihre Expression hochreguliert wird, wie beispielsweise bei Transformationen (bspw. epitheliale Tumore, Gliome, Leukämien), Infektionen (bspw. durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) oder durch Mycobacterium tuberculosis) oder bei zellulärem Stress.The Different NKG2D ligands have different expression patterns. The ligands are not or only to the current knowledge expressed to a small extent by normal body cells while under pathological conditions, their expression is upregulated as For example, in transformations (eg epithelial tumors, gliomas, Leukemias) Infections (eg by the human cytomegalovirus (HCMV) or by Mycobacterium tuberculosis) or in cellular stress.

Trotz der aufgezeigten Möglichkeiten zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten besteht immer noch ein großes Interesse, Alternativen zu den bisher eingesetzten Therapieansätzen zu finden, da die aufgezeigten Ansätze oftmals schwerwiegende Nebenwirkungen verursachen oder nur mit großem Aufwand und unter hohen Kosten durchzuführen sind oder nur Teilerfolge erbringen.In spite of the indicated possibilities there is still a lot of interest in treating autoimmune diseases, Alternatives to the previously used therapeutic approaches too find, as the indicated approaches often cause serious side effects or only with great effort and at high cost or only partial successes.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zur Herstellung eines Arzneimittels bereitzustellen, welches zur Prophylaxe und/oder Therapie von Autoimmunkrankheiten dient.task It is therefore the object of the present invention to produce substances to provide a drug which is used for prophylaxis and / or Therapy of autoimmune diseases serves.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung von zumindest einem Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion gelöst, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lösliches ULBP1, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAET1L, lösliches RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.According to the invention this Task solved by providing at least one blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction, the selected is more soluble from the group NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBP1, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAET1L, soluble RAET1G, as well as allelic variants or fragments or derivatives the said blocker, as well as synthetically produced blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass durch die Gabe eines genannten löslichen Blockers der NKG2D-Rezeptor-/Liganden-Interaktion der Ausbruch von Autoimmunkrankheiten verhindert oder zumindest gebremst werden konnte.The Inventors could show in their own experiments that through the gift a said soluble blocker the NKG2D receptor / ligand interaction the onset of autoimmune diseases prevented or at least could be slowed down.

Ogasawara et al. („NKG2D Blockade Prevents Autoimmune Diabetes in NOD Mice", Immunity 20:757-767, 2004) zeigten, dass NKG2D-Liganden-Expression in Pankreas von erkrankten NOD-(„nonobese diabetic"-) Mäusen nachgewiesen werden konnte. Dieselbe Arbeitsgruppe konnte auch zeigen, dass eine Blockade des NGK2D-Rezeptors durch anti-NKG2D monoklonale Antikörper in NOD-Mäusen den Ausbruch der Krankheit verhindern konnte.Ogasawara et al. ( "NKG2D Blockade Prevents Autoimmune Diabetes in NOD Mice ", Immunity 20: 757-767, 2004) showed that NKG2D ligand expression in pancreas of diseased NOD (nonobese diabetic) mice could be. The same working group could also show that a Blockade of the NGK2D receptor by anti-NKG2D monoclonal antibodies in NOD mice Could prevent the onset of the disease.

Ferner konnten Groh et al. („Stimulation of T-Cell Autoreactivity by Expression of NKG2D and its MIC Ligands in Arthritis", Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 100:9452-9457, 2003) in ihren Studien zeigen, dass beim Menschen auf Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Athritis NKG2D-Liganden vorliegen und dass deren Interaktion mit NKG2D-Rezeptoren, die bei diesen Patienten auch auf CD4+ CD28- T-Zellen exprimiert werden, die Zerstörung von Synovialzellen bedeutend beeinflussen kann.Further Groh et al. ("Stimulation of T-Cell Autoreactivity by Expression of NKG2D and its MIC Ligands in Arthritis ", Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 100: 9452-9457, 2003) in their studies show that in humans on synoviocytes of patients with rheumatoid Athritis NKG2D ligands and their interaction with NKG2D receptors present in these patients also on CD4 + CD28 T cells be expressed, the destruction of synovial cells.

Jedoch ist in keiner der neueren Studien gezeigt, noch ist ein Hinweis darauf zu finden, dass durch lösliche NKG2D-Rezeptoren, MICR/B oder lösliches ULBP die NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion derart beeinflusst werden kann, dass der Ausbruch von Autoimmunkrankheiten verhindert oder zumindest verzögert werden kann.however is not shown in any of the recent studies, nor is a hint to find that through soluble NKG2D receptors, MICR / B or soluble ULBP the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction are influenced in such a way can prevent the onset of autoimmune diseases or at least delayed can be.

Die Erfinder haben mit ihren Versuchen hingegen erstmalig gezeigt, dass durch die Gabe von löslichem NKG2D-Rezeptor der Ausbruch von Symptomen der Multiplen Sklerose deutlich gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen somit die Möglichkeit auf, lösliche Liganden oder Fragmente davon im Rahmen einer Therapie bei Autoimmunkrankheiten einzusetzen. Darüber hinaus zeigten transgene Mäuse, die eine hohe Konzentration von löslichem MICR im Serum enthielten, ebenfalls eine ähnliche Verzögerung des Krankheitsausbruchs.In contrast, the inventors have shown for the first time that the administration of soluble NKG2D receptor significantly inhibited the onset of symptoms of multiple sclerosis. These results thus show the possibility of using soluble ligands or fragments thereof in a therapy of autoimmune diseases. In addition, transgenic mice containing high levels of soluble MICR in serum also showed a similar delay in the disease standardized outbreak.

Durch die Gabe von löslichem NKG2D-Rezeptor und dessen Bindung an seine (an Zelloberflächen gebundenen) Liganden wird verhindert, dass diese Liganden den auf Oberflächen von (u.a.) NK Zellen exprimierten NKG2D-Rezeptor binden und diese aktivieren.By the gift of soluble NKG2D receptor and its binding to its (bound to cell surfaces) Ligands are prevented from these ligands on surfaces of (i.a.) NK cells express and bind NKG2D receptor.

Andererseits kann die Gabe von löslichen NKG2D-Liganden bewirken, dass diese an den auf Oberflächen von (u.a.) NK Zellen exprimierten NKG2D-Rezeptor binden, diesen jedoch nicht aktivieren können, da hierzu vermutlich ein Zell-Zell-Kontakt notwendig ist.on the other hand can the gift of soluble NKG2D ligands cause these to bind to surfaces on (et al.) NK cells express NKG2D receptor but bind it can not activate since this probably a cell-cell contact is necessary.

Vorliegend bedeutet „Fragment" jedes Fragment eines der genannten löslichen Peptide, welches wie das lösliche Protein an den NKG2D-Rezeptor binden kann. Mit „Derivaten" sind jede Protein-Abwandlungen gemeint, die vom löslichen Protein abweichende Modifizierungen aufweisen, bspw. Aminosäuresubstitutionen, und zwar insbesondere an den Stellen der löslichen Proteine, über welche die Bindung der Proteine an den NKG2D-Rezeptor nicht vermittelt wird. Auch solche Proteine oder Peptide, die von den Blockern abgeleitet sind, können für eine erfindungsgemäße Verwendung eingesetzt werden.present "Fragment" means every fragment of a the said soluble Peptides, which like the soluble Protein can bind to the NKG2D receptor. By "derivatives" is meant any protein modifications that are of the soluble type Have protein aberrant modifications, for example, amino acid substitutions, and in particular at the sites of soluble proteins, via which does not mediate the binding of the proteins to the NKG2D receptor becomes. Also those proteins or peptides derived from the blockers, can for one use according to the invention be used.

Ferner bedeutet vorliegend „allelische Varianten" alle Varianten von Nucleotidsequenzen der für die genannten Proteine codiernden Gene, die zumindest bisher im Stand der Technik bekannt sind. So sind bspw. für MICA bisher 56 Allele identifiziert worden (siehe bspw. auf der Internetseite des EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) www.ebi.ac.uk/imgt/hla) und für MICB 16 Allele.Further in the present case means "allelic Variants "all Variants of nucleotide sequences encoding the said proteins Genes that are at least heretofore known in the art. So are for example for MICA has so far been identified 56 alleles (see, for example, on the Website of the EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) www.ebi.ac.uk/imgt/hla) and for MICB 16 alleles.

Somit werden unter „Fragmenten, Derivaten oder allelische Varianten der genannten Blocker" alle Substanzen verstanden, die die gleichen Bindungseigenschaften wie die genannten Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion aufweisen.Consequently become "fragments, Derivatives or allelic variants of said blockers "all substances understood that have the same binding properties as those mentioned Blockers of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Es können jedoch nicht nur die genannten Proteine als Blocker eingesetzt werden, sondern vielmehr jeder niedermolekulare synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Ligangen-Interaktion. Solche synthetisch hergestellte Blocker können bspw. dadurch identifiziert werden, dass durch Zugabe synthetischer Substanzen, die z. B. durch kombinatorische Chemie hergestellt wurden, im „high throughput"-Verfahren eine Blockierung der Interaktion zwischen rekombinant hergestelltem löslichem MICA, das z. B. auf Mikrotiterplatten oder sog. „beads" immobilisiert wird, und mit rekombinant hergestelltem löslichem, biotinyliertem NKG2D analysiert wird. Eine Bindung von NKG2D an MICA kann über Streptavidin-Konjugate detektiert werden (z. B. Streptavidin-Phycoerythrin in der Durchflusszytometrie oder Streptavidin-Meerrettichperoxidase in ELISA-Verfahren). Derart identifizierte synthetische Blocker können dann in funktionellen Versuchen, z. B. in Zytotoxizitätsexperimenten mit NK Zellen, getestet werden.It can however, not only the proteins mentioned are used as blockers, but rather any low molecular weight synthetically produced Blocker of NKG2D receptor / NKG2D-ligand interaction. Such For example, synthetically produced blockers can be identified be that by addition of synthetic substances, the z. B. by combinatorial chemistry were prepared in the "high throughput" method blocking the interaction between recombinantly produced soluble MICA, the z. B. on microtiter plates or so-called. "Beads" is immobilized, and with recombinant prepared soluble, biotinylated NKG2D is analyzed. A binding of NKG2D on MICA can over Streptavidin conjugates are detected (eg, streptavidin-phycoerythrin in flow cytometry or streptavidin horseradish peroxidase in ELISA method). Such identified synthetic blockers can then be functionalized Try, for. In cytotoxicity experiments with NK cells, to be tested.

Als Blocker können aber auch bspw. Antikörper eingesetzt werden, die gegen den NKG2D-Rezeptor gerichtet sind, oder Fragmente davon.When Blockers can but also, for example, antibodies can be used, which are directed against the NKG2D receptor, or fragments thereof.

Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere von Kanninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.polyclonal antibody can in conventional By immunization of animals, in particular of rabbits, by injection of the antigen or fragments thereof, followed by purification of the immunoglobulin.

Monoklonale anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein beschriebenen Prinzip („Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495-497, 1975) gewonnen werden. Hierfür werden bspw. Mäuse immunisiert und anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert, bspw. durch Fusion mit Myelomzellen. Anschließend wird der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischen Standardassays auf monoklonale anti-NKG2D-Rezeptor-Antikörper gescreent. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper ggf. auf herkömmliche Weise chimerisiert (siehe bspw. Neuberger et al., „Recombinant antibodies possessing novel effector functions" Nature 312:604-608, 1984) oder humanisiert (siehe bspw. Riechmann et al., „Reshaping human antibodies for therapy", Nature 332:323-327, 1988) werden.monoclonal anti-NKG2D receptor antibodies can according to standard protocols according to the von Kohler and Milstein described principle ("Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity ", Nature 256: 495-497, 1975). Therefor become, for example, mice immunized and subsequently antibody-producing Immortalized cells of the immunized animals, for example by fusion with myeloma cells. Subsequently becomes the supernatant the obtained hybridomas by standard immunological assays screened for monoclonal anti-NKG2D receptor antibody. For the therapeutic or diagnostic use in humans, these animal antibodies may be on conventional Chimerized (see, for example, Neuberger et al., "Recombinant antibodies possessing novel effector functions "Nature 312: 604-608, 1984) or humanized (see, for example, Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy ", Nature 332: 323-327, 1988).

Insbesondere ist bevorzugt, wenn als Blocker ein Protein oder Peptid eingesetzt wird, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus den im beiliegenden Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen mit den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID NR. 15, und insbesondere ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 15.Especially is preferred when used as a blocker, a protein or peptide which is an amino acid sequence contains the selected is from the sequences listed in the accompanying Sequence Listing with SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15, and in particular a protein, which has an amino acid sequence which selected is from the sequences having SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15.

Das im beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführte Peptid mit der SEQ ID-Nr. 1 des beigefügten Sequenzprotokolls stellt die komplette (full-length) Aminosäuresequenz des NKG2D-Rezeptors dar. Dieser weist eine cytoplasmatische Domäne (AS 1-51), eine Transmembrandomäne (AS 52-72) und eine Ektodomäne (AS 73-216) auf. Mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID- Nr. 2 des beigefügten Sequenzprotokolls ist vorliegend die diese Ektodomäne umfassende Sequenz identifiziert. Mit der SEQ ID-Nr. 3 des beigefügten Sequenzprotokolls ist die Sequenz von MICA*01, mit der SEQ ID-Nr. 5 die Sequenz von MICB*02 identifiziert. Die SEQ ID-Nrn. 4 und 6 sind jeweils Sequenzabschnitte von MICA*01 und MICB*02. Unter den SEQ ID-Nrn. 7 bis 15 des beigefügten Sequenzprotokolls sind jeweils die full-length Sequenzen sowie Sequenzabschnitte der Proteine ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAET1L und RAET1G aufgeführt. Eine Übersicht über die bereits bekannten Sequenzen sowie deren Datenbank-Identifikationsnummern (Accession Number) findet sich in der beigefügten Tabelle 1.The in the attached Sequence listing listed Peptide with SEQ ID NO. 1 of the attached Sequence Listing the complete (full-length) amino acid sequence of the NKG2D receptor This has a cytoplasmic domain (AS 1-51), a transmembrane domain (AS 52-72). and an ectodomain (AS 73-216). With the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 of the attached Sequence listing is present in this ectodomain comprehensive Sequence identified. With the SEQ ID no. 3 of the attached Sequence Listing is the sequence of MICA * 01, with SEQ ID NO. 5 the sequence of MICB * 02 identified. SEQ ID Nos. 4 and 6 are each sequence sections from MICA * 01 and MICB * 02. Under the SEQ ID Nos. 7 to 15 of the attached Sequence Listing are each the full-length sequences and sequence sections of Proteins ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAET1L and RAET1G are listed. An overview of the already known sequences and their database identification numbers (Accession Number) can be found in the attached Table 1.

Es ist bevorzugt, wenn die Blocker, also löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA/B und lösliche ULBP-Moleküle, für die Verwendung rekombinant hergestellt werden.It is preferred when the blockers, ie soluble NKG2D receptor, soluble MICA / B and soluble ULBP molecules for the Use can be produced recombinantly.

Hierbei kann es von Vorteil sein, nicht das full-length Protein zu exprimieren, sondern bspw. nur bindungsrelevante Domänen der Proteine. So kann bspw. der lösliche NKG2D-Rezeptor ohne die cytoplasmatische Region und ohne die Transmembran-Domäne exprimiert werden (z. B. von Asn 80 bis Val 216; = SEQ ID Nr. 2); lösliches MICA kann bspw. von Glu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-Nr. 4), lösliches MICB von Glu 1 bis Lys 276 (= SEQ ID-NR. 6), lösliches ULBP1 von Asp 1 bis Lys 181 (= SEQ ID-NR. 8), lösliches ULBP2 von Asp 1 bis Ala 181 (= SEQ ID-NR. 10) und lösliches ULBP3 von Asp 1 bis Ala 181 (= SEQ ID-Nr. 12) exprimiert werden. Geeignet für die Expression sind bspw. Sf9 Insektenzellen oder eukaryontische Expressionssysteme, wie z.B. 293T oder COS7 Zellen.in this connection it may be beneficial not to express the full-length protein, but, for example, only binding-relevant domains of the proteins. So can eg. the soluble one NKG2D receptor expressed without the cytoplasmic region and without the transmembrane domain (eg from Asn 80 to Val 216; = SEQ ID NO: 2); soluble MICA can, for example, from Glu 1 to Lys 276 (= SEQ ID NO: 4), soluble MICB from Glu 1 to Lys 276 (= SEQ ID NO: 6), soluble ULBP1 from Asp 1 to Lys 181 (= SEQ ID NO: 8), soluble ULBP2 from Asp 1 to Ala 181 (= SEQ ID NO: 10) and soluble ULBP3 from Asp 1 to Ala 181 (= SEQ ID NO: 12). Suitable for the expression are, for example, Sf9 insect cells or eukaryotic Expression systems, e.g. 293T or COS7 cells.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist insbesondere bevorzugt, wenn die Autoimmunkrankheiten ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondylarthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus Erythematodes (SLE).at the use according to the invention is especially preferred when the autoimmune diseases are selected from the group comprising multiple sclerosis, diabetes type I, rheumatoid Arthritis, psoriasis, spondylarthritides, celiac disease, Behcet's disease, Morbus Crohn's, Ulcerative Colitis and Systemic Lupus Erythematosus (SLE).

Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Verwendung bei der schubförmigen Multiple Sklerose erfolgt, vorzugsweise in der Anfangsphase der schubförmigen Multiplen Sklerose.Especially is preferred when used with the reload multiple Sclerosis occurs, preferably in the initial phase of the relapsing multiplicates Sclerosis.

Bei der Multiplen Sklerose sind in den Entzündungsherden (Plaques) u.a. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen zu finden, was als Hinweis auf eine Autoimmunreaktion gewertet wird. Ferner konnten Autoantikörper gegen verschiedenen Komponenten der Myelinschicht nachgewiesen werden, bspw. gegen basische Myelinproteine, Proteolipid-Proteine oder gegen das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Zur Therapie der multiplen Sklerose wird momentan insbesondere rekombinant hergestelltes Interferon β eingesetzt, insbesondere beim schubförmigen Krankheitsverlauf.at multiple sclerosis are in the inflammatory (plaques) u.a. T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages to find what as Reference to an autoimmune reaction is evaluated. Furthermore, autoantibodies against various components of the myelin sheath are detected For example, against myelin basic proteins, proteolipid proteins or against the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). For the therapy of Multiple sclerosis is currently produced in particular recombinantly Interferon β is used, especially when relocated Disease.

Der Autoimmunkrankheit Diabetes Typ I liegt eine zellulär vermittelte chronische und irreversible Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas zugrunde, wobei vermutlich ein auf den β-Zellen präsentiertes Peptid von autoimmunen T-Lymphozyten erkannt wird, die ihrerseits die β-Zellen zerstören.Of the Autoimmune Disease Diabetes Type I is a cellular mediated chronic and irreversible destruction of insulin-producing β-cells of the Pancreas, presumably an autoimmune peptide presented to the β-cells T lymphocytes detected which, in turn, is the β-cell to destroy.

Bei der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoimmunkrankheit, bei welcher vermutlich durch eine Veränderung von Synovialzellen eine Immunantwort von T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Makrophagen induziert wird, die zur Antikörperbildung gegen Synovialzellen führt. Als Folge werden Hydrolasen, Kollagenasen und lysosomale Enzyme freigesetzt, die zur Zerstörung von Gelenkknorpel führen. Eine Therapie erfolgt momentan mit Antiphlogistika, Corticosteroiden u.a. Antirheumatika, sowie mit anti-TNF-α-Antagonisten.at rheumatoid arthritis is an autoimmune disease, in which probably by a change of synovial cells induces an immune response of T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages which is responsible for antibody formation against synovial cells. As a result, hydrolases, collagenases and lysosomal enzymes set free to destruction lead from articular cartilage. A therapy is currently with anti-inflammatory drugs, corticosteroids et al Antirheumatics, as well as with anti-TNF-α antagonists.

Eine mögliche Erklärung der NKG2D-Wirkungsweise bei der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten ist eine Induktion von NKG2D-Liganden durch zellulären Stress oder virale oder bakterielle Infektionen auf den Zellen der Organe bzw. Gewebe, die von der Autoimmunität betroffen sind. Diese induzierte Expression von NKG2D-Liganden könnte dann eine Lyse der entsprechenden Zellen durch NK Zellen vermitteln. Hierdurch würde nicht nur das entsprechende Gewebe zerstört, sondern auch sehr viele Autoantigene freigesetzt, die wiederum von Antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und über MHC-Moleküle präsentiert werden könnten, was zur Aktivierung potentiell autoreaktiver T Zellen führen könnte. Alternativ könnten autoreaktive T Zellen auch direkt durch die NKG2D-Liganden-Expression auf dem betroffenen Gewebe aktiviert werden.A possible statement the NKG2D mode of action in the pathogenesis of autoimmune diseases is an induction of NKG2D ligands by cellular Stress or viral or bacterial infections on the cells of the Organs or tissues affected by autoimmunity. This induced Expression of NKG2D ligands might be then mediate lysis of the respective cells by NK cells. This would not only destroys the appropriate tissue, but also many Autoantigens released, in turn, from antigen-presenting Cells picked up and over MHC molecules presents could become, which could lead to the activation of potentially autoreactive T cells. alternative could autoreactive T cells also directly by NKG2D ligand expression be activated on the affected tissue.

Mit der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Ansatz aufgezeigt, mit welchem eine neue Alternative zur Behandlung der oben angegebenen Krankheiten ermöglicht wird. Die Erfinder konnten nämlich in eigenen Versuchen zeigen, dass in Mäusen bei einem Einsatz von löslichem NKG2D-Rezeptor der Ausbruch der schubförmigen Multiplen Sklerose im Vergleich zu unbehandelten Mäuse deutlich hinausgezögert werden konnte. Gleiches wurde mit MICA-transgenen Mäusen gezeigt, die hohe Serumkonzentrationen an löslichem MICA enthalten.With the use according to the invention, an approach is shown with which a new Alterna tive for the treatment of the diseases specified above. In fact, the inventors were able to show in their own experiments that in mice with the use of soluble NKG2D receptor, the outbreak of relapsing forms of multiple sclerosis could be significantly delayed compared to untreated mice. The same has been demonstrated with MICA transgenic mice containing high serum concentrations of soluble MICA.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest einen Blocker der NKG2D-Rezeptor-/NKG2D-Liganden-Interaktion enthält.The Invention further relates to a pharmaceutical composition, the at least one blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction contains.

Dabei ist bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest einen Blocker enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend löslicher NKG2D-Rezeptor, lösliches MICA, lösliches MICB, lösliches ULBP1, lösliches ULBP2, lösliches ULBP3, lösliches ULBP4, lösliches RAET1L, lösliches RAET1G, sowie allelische Varianten oder Fragmente oder Derivate der genannten Blocker, sowie synthetisch hergestellte Blocker der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion.there is preferred when the pharmaceutical composition is at least contains a blocker that selected is more soluble from the group NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBP1, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAET1L, soluble RAET1G, as well as allelic variants or fragments or derivatives the said blocker, as well as synthetically produced blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Blocker ein Protein enthält, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der im beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 15, und insbesondere ein Protein, das eine solche Aminosäuresequenz aufweist.The Invention further relates to a pharmaceutical composition, which contains a protein as blocker, the one amino acid sequence contains the selected is from the attached Sequence Listing listed Sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15, and in particular a protein, such an amino acid sequence having.

Dabei ist nicht ausgeschlossen, dass die Zusammensetzung auch mehrere der genannten Blocker enthält.there is not excluded that the composition also several contains said blocker.

Die Zusammensetzung kann darüber hinaus auch weitere Zusatzstoffe und/oder Träger enthalten, die üblicherweise bei der Zubereitung einer zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Solche Inhaltsstoffe sind zum Beispiel Verdünnungsmittel, Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw. Dazu zählen, sind aber nicht hierauf beschränkt, z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyetylenglycole, Monoglyceride, etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe findet sich beispielsweise in A. Tippe, „Handbook of Pharmaceutical Excepients", 3. Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.The Composition can about it also contain other additives and / or carriers, which are usually in the preparation of a pharmaceutical composition to be administered be used. Such ingredients are, for example, diluents, Binders, suspending agents, lubricants, stabilizers, etc. These include, but are not limited to this e.g. Water, salt solutions, Alcohols, vegetable oils, Polyethylene glycols, monoglycerides, etc. An overview of such ingredients For example, see A. Tippe, "Handbook of Pharmaceutical Excepients ", 3. Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.

Je nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, also oral oder parenteral, wird die Zusammensetzung formuliert sein, also beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten oder aber flüssigen Zubereitungen, die bspw. auch injiziert oder intravenös verabreicht werden können. Die Verabreichung kann ferner in Abhängigkeit vom Patienten und der Erkrankung, systemisch oder lokal und subtil gerichtet vorgenommen werden.ever after administration of the pharmaceutical composition, that is orally or parenteral, the composition will be formulated, ie for example in the form of capsules, tablets or else liquid preparations, which can also be injected or administered intravenously, for example. The Administration may also be dependent of the patient and the disease, systemic or local and subtle be made directed.

Ferner kann die Zusammensetzung weitere aktive Inhaltsstoffe oder Arzneimittel ausweisen, wie beispielsweise Interferone und ähnliche.Further The composition may contain other active ingredients or drugs identify such as interferons and the like.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dann bei Autoimmunkrankheiten eingesetzt werden, wie bspw. Multiple Sklerose, Diabetes Typ I, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Spondyl arthritiden, Zöliakie, Morbus Behcet, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Systemischer Lupus Erythematodes (SLE).The pharmaceutical composition can then be used in autoimmune diseases used, such as multiple sclerosis, diabetes type I, rheumatoid arthritis, psoriasis, spondyl arthritides, celiac disease, Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis and systemic lupus Erythematosus (SLE).

Weitere Vorteile ergeben sich aus den Figuren und dem nachfolgenden Beispiel.Further Advantages will be apparent from the figures and the example below.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It it is understood that the above and the following yet to be explained Features not only in the specified combination, but also usable in other combinations or alone are without departing from the scope of the present invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:embodiments The invention will be explained in more detail in the following figures. It demonstrate:

1 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS bei Patienten mit Multipler Sklerose sowie in humaner Mikroglia: 1 NKG2D Ligand Expression in the CNS in Patients with Multiple Sclerosis and in Human Microglia:

1A: Immunhistochemische Anfärbung von demyelinisierten ZNS-Läsionen („plaque" bzw. „shadow plaque") von MS-Patienten. Gezeigt sind Anfärbungen von MHC-Klasse II Molekülen (MHC-II), MIC-Molekülen (BAMO1) und „Major Basic Protein" (MBP), sowie mit einer Isotypkontrolle. 1A : Immunohistochemical staining of demyelinated CNS lesions ("plaque" or "shadow plaque") of MS patients. Shown are staining of MHC class II molecules (MHC-II), MIC molecules (BAMO1) and "Major Basic Protein" (MBP), as well as an isotype control.

1B: Quantifizierung von MICA Transkripten mittels Echtzeit-PCR im ZNS von gesunden („Normal") versus MS-Patienten („MS") mit Normierung auf die T98G Gliomazelllinie, sowie von unreifen Dendritischen Zellen (DC „imm") versus reifen DC („DC mature") versus isolierter Mikroglia. 1B : Quantification of MICA transcripts by means of real-time PCR in the CNS of healthy ("normal") versus MS patients ("MS") with normalization to the T98G glioma cell line, as well as immature dendritic cells (DC "imm") versus mature DC (" DC mature ") versus isolated microglia.

2 NKG2D-Liganden-Expression im ZNS und in Mikrogliazellen bei der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis von Mäusen: 2 NKG2D Ligand Expression in the CNS and Microglial Cells in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis of Mice:

2A: Nachweis von RAE-1 und NKG2D im ZNS von C57BL/6 Mäusen am Tag der EAE-Induktion (day 0) sowie am Tag 10 bzw. 20 nach EAE-Induktion mittels Immunblot. Die Zahlen geben die Einheiten der relativen Densitometrie wieder (Tag 0 normiert auf 1.0). Zur Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge wurde β-Aktin detektiert. 2A : Detection of RAE-1 and NKG2D in the CNS of C57BL / 6 mice on the day of EAE induction (day 0) as well as on day 10 and 20 after EAE induction by immunoblot. The numbers represent the units of relative densitometry (day 0 normalized to 1.0). To control the amount of protein applied, β-actin was detected.

2B: Quantifizierung von RAE-1δ Transkripten mittels Echtzeit-PCR im ZNS von C57BL/6 Mäusen („Normal") und C57BL/6 Mäusen nach EAE-Induktion („EAE") mit Normierung auf die Maus-Gliomazelllinie GL261, sowie in isolierten Astrozyten und Mikrogliazellen von C57BL/6 Mäusen. 2 B : Quantification of RAE-1δ transcripts by means of real-time PCR in the CNS of C57BL / 6 mice ("normal") and C57BL / 6 mice after EAE induction ("EAE") with normalization to the mouse glioma cell line GL261, as well as in isolated astrocytes and microglial cells of C57BL / 6 mice.

3 Effekt der NKG2D-Blockade bei der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE). 3 Effect of NKG2D blockade in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).

3A: Durchschnittlicher „clinical score" von je sechs H2-K^b-MICA transgenen Mäusen (offene Kreise) sowie sechs nicht-transgenen Geschwistern (geschlossene Kreise) an Tagen 0 bis 30 nach EAE-Induktion. 3A : Average "clinical score" of six H2-K ^b -MICA transgenic mice (open circles) and six non-transgenic siblings (closed circles) on days 0 to 30 after EAE induction.

3B: Durchschnittlicher „clinical score" an Tagen 0 bis 25 nach EAE-Induktion von fünf C57BL/6 Mäusen bei Gabe von löslichem NKG2D (offene Kreise; die sechste Maus zeigte keinerlei Symptome) sowie von sechs Mäusen bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise). PBS bzw. sNKG2D wurde an Tagen 0, 2, 4, 6, 8, und 10 intraperitoneal appliziert. 3B : Average "clinical score" on days 0 to 25 after EAE induction of five C57BL / 6 mice on administration of soluble NKG2D (open circles, the sixth mouse showed no symptoms) and of six mice on administration of PBS (closed circles). PBS or sNKG2D was administered intraperitoneally on days 0, 2, 4, 6, 8, and 10.

3C: MOG-Peptid spezifische T Zellproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie in 3B beschrieben, behandelt wurden. Milzzellen wurden mit 1μg/ml oder 10μg/ml MOG-Peptid stimuliert. 3C : MOG-peptide-specific T cell proliferation in mice in which EAE was induced and those either with PBS or with soluble NKG2D, as in 3B described, were treated. Spleen cells were stimulated with 1 μg / ml or 10 μg / ml MOG peptide.

3D: Durchschnittlicher „clinical score" an Tagen 0 bis 30 nach EAE-Induktion von je sechs C57BL/6 Mäusen bei Gabe von löslichem NKG2D (offene Kreise) sowie bei Gabe von PBS (geschlossene Kreise). PBS bzw. sNKG2D wurde an Tagen 10, 12, 14, 16, 18, und 20 intraperitoneal appliziert. 3D : Average "clinical score" on days 0 to 30 after EAE induction of six C57BL / 6 mice each with administration of soluble NKG2D (open circles) and when PBS was given (closed circles) PBS and sNKG2D, respectively, on days 10, 12, 14, 16, 18, and 20 administered intraperitoneally.

3E: MOG-Peptid spezifische T Zellproliferation bei Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, und die entweder mit PBS oder mit löslichem NKG2D, wie unter 3D beschrieben, behandelt wurden. Milzzellen wurden mit 1μg/ml oder 10μg/ml MOG-Peptid stimuliert. 3E : MOG-peptide-specific T cell proliferation in mice in which EAE was induced and those either with PBS or with soluble NKG2D, as described in US Pat 3D described, were treated. Spleen cells were stimulated with 1 μg / ml or 10 μg / ml MOG peptide.

Beispielexample

1. Material und Methoden1. Material and methods

1.1 Patienten1.1 patients

Hirne von MS-Patienten wurden immunohistochemisch untersucht. Die Studie wurde gemäß dem durch das Ethikkomitee des Universitätsklinikums Tübingen zugelassenen Protokoll durchgeführt.brains MS patients were examined by immunohistochemistry. The study was in accordance with the the Ethics Committee of the University Hospital Tübingen approved protocol.

1.2 Antikörper1.2 antibodies

Folgende monoklonale Antikörper wurden verwendet: BAMO1 (Maus IgG₁), anti-MICA/B; anti-Maus RAE-1γ (R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland), anti-Maus NKG2D (R & D Systems) und anti-β-Aktin (Santa Cruz Biotechnologies).The following monoclonal antibodies were used: BAMO1 (mouse IgG ₁ ), anti-MICA / B; anti-mouse RAE-1γ (R & D Systems, Wiesbaden, Germany), anti-mouse NKG2D (R & D Systems) and anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnologies).

1.3 Zelllinien1.3 cell lines

Die humane maligne Gliomazelllinie T98G wurde von Dr. Tribolet (Lausanne, Schweiz) erhalten. Die Maus-Gliomazelllinie GL261 war ein Geschenk von XO Brakefield (Harvard Medical School Boston, USA). Die Zellen wurden in DMIM-Medium kultiviert, welches mit 2mM L-Glutamin (Gibco Life Technologies, Paisley, Großbritannien), 10 % FCS (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) und Penicillin (100 IU/ml)/Streptomycin (100 μg/ml; Gibco) ergänzt war.The human malignant glioma cell line T98G Tribolet (Lausanne, Switzerland). The mouse glioma cell line GL261 was a gift from XO Brakefield (Harvard Medical School Boston, USA). The cells were cultured in DMIM medium supplemented with 2 mM L-glutamine (Gibco Life Technologies, Paisley, United Kingdom), 10% FCS (Biochrom KG, Berlin, Germany) and penicillin (100 IU / ml) / streptomycin (100 μg / ml; Gibco) was.

1.4 Immunoblot1.4 Immunoblot

Zu den angegebenen Zeitpunkten nach Induzierung der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis wurde das Gehirngewebe der Mäuse isoliert. Das Gewebe wurde in Lysispuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) mit 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 2 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin und 100 μg/ml PMSF) mittels Ultraschall aufgeschlossen. Aliquots der Gewebelysate wurden auf 12 % SDS- PAGE Gelen unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose überführt. Die Gesamtmenge an Protein der Lysate betrug 40 μg je Spur. Nach Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % (w/v) Milchpulver in PBS für 30 Minuten wurden die Filter mit den spezifischen monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 4°C inkubiert, gewaschen und mit Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen oder Ziegen-Anti-Ratte IgG (1:3000 verdünnt; Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, USA) drei Stunden lang bei 22°C inkubiert. Die Primärantikörper wurden in einer Konzentration von 1 μg/ml in PBS mit 0,05 % Tween20 und 1,3 % fettarme Milch eingesetzt.To at the indicated times after induction of the experimental autoimmune encephalomyelitis, the brain tissue of the mice was isolated. The tissue was incubated in lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) at 120 mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5% NP-40, 2μg / ml Aprotinin, 10 μg / ml Leupeptin and 100 μg / ml PMSF) disrupted by means of ultrasound. Aliquots of the tissue lysates were at 12% SDS-PAGE Gels electrophoretically separated under non-reducing conditions and transferred to nitrocellulose. The Total amount of protein of the lysates was 40 μg per lane. After blocking of unspecific binding sites with 5% (w / v) milk powder in PBS for For 30 minutes, the filters with the specific monoclonal antibodies were overnight at 4 ° C incubated, washed and with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit or goat anti-rat IgG (diluted 1: 3000; Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, USA) for three hours at 22 ° C. The primary antibodies were at a concentration of 1 μg / ml used in PBS with 0.05% Tween20 and 1.3% low-fat milk.

1.5 Isolierung der humanen Mikrogliazellen1.5 Isolation of human microglia

Primäre gliale Zellen wurden aus adulten Patienten während einer chirurgischen Resektion gewonnen, welche zur Behandlung einer nicht Tumor-bezogenen unheilbaren Epilepsie durchgeführt wurde. Die Gewebeproben wurden in Regionen entnommen, die abseits der aktiven Stelle lagen. Die methodische Isolierung und Kultivierung adulter menschlicher Mikroglia wurde bereits beschrieben, bspw. von Yong et al. („Culture of Cells from Human Brains Biopsies", Protocol for Neural Cell Culture, Seite 35-42, 1992). Hierzu wurden ein bis drei mm³ Gewebe mit 0,025 % Collagenase A und DNase (50 mg/ml) (Böhringer, Mannheim) für 45 Minuten behandelt, und anschließend mittels Passage durch ein 130 μm Nylonnetz mechanisch auftrennt. Die Zellen wurden über einen 30 %igen Percoll-Gradienten (Pharmacia) bei 15.000 rpm für 30 Minuten weiter aufgetrennt. Die Zellen, die aus der Zwischenschicht gewonnen wurden, enthielten eine gemischte gliale Zellpopulation, die aus ungefähr 65 % Oligodendroglia, 30 % Mikroglia und 5 % Astroglia bestand. Zur Anreicherung der Mikroglia wurde die gemischte Zellpopulation in Eagels MEM suspendiert, das mit 5 % FCS, 2,5 U/ml Penicillin, 2,5 mg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin und 0,1 % Glukose (alles von Gibco) ergänzt war, und wurde über Nacht in 25 cm² Gewebekulturflaschen oder 48-Well-Platten (Falcon, Fisher Scientific) in feuchter Atmosphäre bei 37°C mit 5 % CO₂ inkubiert. Die weniger adhärierenden Oligodendroglia wurden durch vorsichtiges Schütteln entfernt. Die übrigen adhärierenden Zellen, also Astroglia und Mikroglia, ließ man morphologisch über drei Tage entwickeln. Danach wurden die weniger adhärierenden Astroglia durch rotierendes Schütteln für fünf Stunden bei 150 rpm abgespült. Die zurückbleibenden Mikroglia (1,2 × 105 Zellen(cm²) waren zu 95 % rein, was durch Immunzytochemie bestätigt werden konnte.Primary glial cells were obtained from adult patients during a surgical resection performed to treat non-tumor-related incurable epilepsy. The tissue samples were taken in regions beyond the active site. The methodological isolation and cultivation of adult human microglia has already been described, for example, by Yong et al. (Culture of Cells from Human Brain Biopsies, pp. 35-42, 1992), to which was added one to three mm ³ tissue with 0.025% collagenase A and DNase (50 mg / ml) (Böhringer, Mannheim ) and then mechanically separated by passage through a 130 μm nylon mesh The cells were further fractionated on a 30% Percoll gradient (Pharmacia) at 15,000 rpm for 30 minutes The cells recovered from the intermediate layer containing a mixed glial cell population consisting of approximately 65% oligodendroglia, 30% microglia and 5% astroglia To enrich the microglia, the mixed cell population was suspended in Eagels MEM supplemented with 5% FCS, 2.5 U / ml penicillin, 2.5mg / ml streptomycin, 2mM glutamine and 0.1% glucose (all from Gibco) and was added overnight in 25cm ² tissue culture flasks or 48 well plates (Falcon, Fisher Scientific) in a humidified atmosphere 37 ° C with 5% CO ₂ incubated. The less adherent oligodendroglia were removed by gentle shaking. The remaining adherent cells, ie astroglia and microglia, were morphologically developed over three days. Thereafter, the less adherent astroglia were rinsed by rotary shaking for five hours at 150 rpm. The remaining microglia (1.2 x 10 5 cells (cm ² ) were 95% pure, which could be confirmed by immunocytochemistry.

1.6 Isolierung von Maus-Mikrogliazellen1.6 Isolation of mouse microglial cells

Maus-Mikrogliazellen wurden von primären gemischten Hirngliazellkulturen durch Anwendung eines modifizierten, bereits beschriebenen Verfahrens isoliert (siehe Magnus et al., J. Neuropatol. ex. Neurol. 2002, 61(9):760-766).Mouse microglia were from primary mixed brain glial cell cultures by applying a modified, already isolated (see Magnus et al., J. Neuropatol. ex. Neurol. 2002, 61 (9): 760-766).

1.7 Real-time PCR1.7 Real-time PCR

RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurden mittels Standardverfahren durchgeführt. Die quantitative Analyse der Gen-expression wurde mit QRT-PCR unter Verwendung des ABI Prism 7000 Sequenzdetektionssystems (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe Wiendl et al. Brain, 2003, 126:1026-1035). Dabei wurde die cDNA-Amplifikation unter Verwendung der SYBRGreen-Chemie nachgewiesen. Die Zyklus parameter betrugen zwei Minuten bei 50°C, zehn Minuten bei 95°C, sowie vierzig Zyklen mit jeweils fünfzehn Sekunden Denaturierung bei 95°C und eine Minute Annealing bei 60°C. Die Daten wurden mit dem ABI PRISM^® Detektionssystem analysiert und unter Verwendung des ΔC_T-Verfahrens zur relativen Quantifizierung quantifiziert. Die Grenzwertzyklen (C_T) für die 18S rRNA (Referenz) und MICA oder RAE-1 (Probe) wurden je zweimal bestimmt. Ein Kalibrierungswert (100 %) wurde abgeschätzt und die relative Veränderung der Kopienzahl gemäß der Formel rl = 2 – [(C_TProbe – C_T Referenz) – (C_T Kalibrierungsprobe – C_T Kalibrierungsreferenz)] berechnet. Die folgenden spezifischen Primer wurden verwendet: 18S:5'-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3' (SEQ ID-Nr. 16), 5'-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3' (SEQ ID-Nr. 17), MI-CA:5'-CCT TGG CCA TGA ACG TCA GG-3' (SEQ ID-Nr. 18), 5'-CCT CTG AGG CCT CRC TGC G-3' (SEQ ID-NR. 19), RAE-1δ:5'-TCC TAC CCC AGC AGA TGA AG-3' (SEQ ID-Nr. 20), 5'-CCA CTT CAG TGG CAT TTG CTG-3' (SEQ ID-Nr. 21).RNA extraction and cDNA synthesis were performed by standard methods. Quantitative analysis of gene expression was performed by QRT-PCR using the ABI Prism 7000 sequence detection system (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) as previously described (see Wiendl et al., Brain, 2003, 126: 1026-1035). The cDNA amplification was detected using SYBRGreen chemistry. The cycle parameters were two minutes at 50 ° C, ten minutes at 95 ° C, and forty cycles of fifteen seconds denaturation at 95 ° C and one minute annealing at 60 ° C. The data were analyzed with the ABI PRISM ^® detection system and quantified using the .DELTA.C _T -Verfahrens for relative quantification. The threshold cycles (C _T ) for the 18S rRNA (reference) and MICA or RAE-1 (sample) were determined twice each. A calibration value (100%) was estimated and the relative change in copy number in accordance with the formula rl = 2 - [(C _T test - _T C Reference) - (C _T calibration sample - C _T calibration reference)] calculated. The following specific primers were used: 18S: 5'-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3 '(SEQ ID NO: 16), 5'-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3' (SEQ ID NO: 17 ), MI-CA: 5'-CCT TGG CCA TGA ACG TCA GG-3 '(SEQ ID NO: 18), 5'-CCT CTG AGG CCT CRC TGC G-3' (SEQ ID NO: 19), RAE-1δ: 5'-TCC TAC CCC AGC AGA TGA AG-3 '(SEQ ID NO: 20), 5'-CCA CTT CAG TGG CAT TTG CTG-3' (SEQ ID NO: 21).

1.8 Produktion von löslichem Maus NKG2D-Rezeptor in Insektenzellen1.8 production of soluble Mouse NKG2D receptor in insect cells

Der rekombinante lösliche Maus NKG2D-Rezeptor ohne die aminoterminale cytoplasmatische Region und die Transmembrandomäne wurde in Sf9 Insektenzellen (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung des BAC-to-BAC-Systems (Gibco Life Technologies, Großbritannien) hergestellt. Das Expressionskonstrukt (SEQ ID-Nr. 24) besitzt eine amino-terminale FLAG/Hexahistidin-Markierungssequenz (siehe Steinle et al., „Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB and homologs of the mouse RAE-1 Protein family", Immungenetics 53:279-287, 2001). Die Sequenz des Maus NKG2D-Rezeptors (full-length) ist in dem beiliegenden Sequenzprotokoll mit der SEQ ID-Nr. 23 wiedergegeben.Of the recombinant soluble Mouse NKG2D receptor without the amino-terminal cytoplasmic region and the transmembrane domain was in Sf9 insect cells (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) using the BAC-to-BAC system (Gibco Life Technologies, Great Britain) produced. The expression construct (SEQ ID NO: 24) has a amino terminal FLAG / hexahistidine tag sequence (see Steinle et al., "Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB and homologs of the mouse RAE-1 protein family ", Immunogenetics 53: 279-287, 2001). The sequence of the mouse NKG2D receptor (full-length) is in the attached sequence listing with the SEQ ID no. 23 reproduced.

1.9 Mäuse1.9 mice

Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden von Charles River Labratories (Sulzfeld, Deutschland) käuflich erworben. MICA-transgene C57BL/6-Mäuse (freundlicherweise überlassen von Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle) exprimieren MICA*07 cDNA unter Kontrolle eines MHC-Klasse I Promotors, nämlich des MHC-Klasse I Gens K^b. Für die Experimente wurden Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen eingesetzt.Female C57BL / 6 mice were purchased from Charles River Labratories (Sulzfeld, Germany). MICA transgenic C57BL / 6 mice (kindly provided by Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle) express MICA * 07 cDNA under the control of an MHC class I promoter, MHC class I gene K ^b . For the experiments, mice were used at the age of six to eight weeks.

1.10 EAE Induktion und Behandlung1.10 EAE induction and treatment

EAE (experimentelle autoimmune Encephalomyelitis) wurde bei C57BL/6-Mäusen durch subkutane Immunisierung mit 200 μg MOG_35-55Peptid in CFA (Sigma-Aldrich) induziert. Ferner wurden intraperitoneal oder intravenös 200 ng Pertussistoxin (Calbiochem) am Tag der Immunisierung und zwei Tage danach verabreicht. Körpergewicht und klinische Einordnung („Clinical Scores") (0 = gesund; 1 = schlaffer Schwanz; 2 = Ataxie und/oder Lähmung der Hintergliedmaßen; 3 = Lähmung der Hintergliedmaßen und/oder Lähmung der Vordergliedmaßen; 4 = Tetraparalyse; 5 = sterbend oder tot) wurden aufgezeichnet. Die Versuche wurden gemäß den NIH (National Institute of Health) Richtlinien „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" durchgeführt. Bei denjenigen Versuchen, bei welchen lösliche NKG2D-Rezeptoren (= sNKG2D) eingesetzt wurden, um die NKG2D-Liganden-/NKG2D-Rezeptoren-Interaktion zu blockieren, wurden die Tiere entweder mit löslichem Maus-NKG2D-Rezeptor (intraperitoneal) oder mit PBS behandelt (i.p.). Am Tag der Immunisierung oder am Tag zehn wurden jeweils 100 μg verabreicht und 50 μg jeweils jeden zweiten Tag bis zehn Tage nach der Immunisierung oder am Tag zwanzig.EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) was induced in C57BL / 6 mice by subcutaneous immunization with 200 μg MOG _35-55 peptide in CFA (Sigma-Aldrich). In addition, 200 ng of pertussis toxin (Calbiochem) were administered intraperitoneally or intravenously on the day of immunization and two days thereafter. Body weight and clinical score (0 = healthy, 1 = flaccid tail, 2 = ataxia and / or paralysis of the hind limbs, 3 = paralysis of the hind limbs and / or paralysis of the forelegs, 4 = tetraparalysis, 5 = dying or The experiments were conducted in accordance with the National Institutes of Health (NIH) Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. In those experiments in which soluble NKG2D receptors (= sNKG2D) were used to block NKG2D ligand / NKG2D receptor interaction, animals were treated with either soluble mouse NKG2D receptor (intraperitoneally) or with PBS (ip). On the day of immunization or on day ten, 100 μg each were administered and 50 μg each every other day to ten days after immunization or by day twenty.

1.11 Splenozyten-Proliferations-Assay1.11 splenocyte proliferation assay

Aus Milz gewonnene Zellsuspensionen (5 × 10⁵-Zellen/Well) wurden in 100 μl RPMI 1640-Medium mit 10 % FCS (Biochrom KG), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco) und 50 μM 2-Mercaptoethanol (Gibco) mit MOG_35-55 in unterschiedlichen Konzentrationen ausplattiert. Kontroll-Wells enthielten lediglich Respondersplenozyten plus Medium. Alle Versuchsansätze werden jeweils dreifach ausgemessen. Während des viertägigen Kulturzeitraums wurden die Kulturen mit 1 μCi/Well pulsiert [Methyl-3^H]-Thymidin (Amersham). Die Zellen wurden geerntet und die eingebaute Radioaktivität wurde anschließend in einem „Wallac 1450 Microbeta plus" Flüssigszintillationszähler augezählt.Spleen-derived cell suspensions (5 x 10 ⁵ cells / well) were resuspended in 100 μl of RPMI 1640 medium containing 10% FCS (Biochrom KG), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin-streptomycin (Gibco) and 50 μM 2-mercaptoethanol (Gibco) with MOG _35-55 in different concentrations. Control wells contained only responder plenocytes plus medium. All experimental approaches are measured in triplicate. During the four day culture period cultures were pulsed with 1 μCi / well of [methyl-3 ^H ] -thymidine (Amersham). The cells were harvested and the incorporated radioactivity was then counted in a "Wallac 1450 Microbeta plus" liquid scintillation counter.

1.12 Statistik1.12 Statistics

Die Signifikanzanalyse wurde unter Verwendung des zweiseitigen Students t-Test durchgeführt, wobei P < 0,05 als signifikant und P < 0,001 als hochsignifikant betrachtet wurde (Excel, Microsoft, USA). P-Werte wurden mittels des Mantel log-rank Tests evaluiert (siehe Mantels "Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration", Cancer Chemother. Rep. 50163-170, 1966).The Significance analysis was performed using two-sided students t-test carried out, where P <0.05 as significant and P <0.001 was considered highly significant (Excel, Microsoft, USA). P values were by means of the coat log-rank test (see Mantel's "Evaluation of survival data and two new rank and place statistics in his consideration ", Cancer Chemother. Rep. 50163-170, 1966).

2. Ergebnisse2 results

2.1 Expression von MICA in MS-Läsionen2.1 Expression of MICA in MS lesions

Die Expression von NKG2D-Liganden wurde in Gehirnproben von MS-Patienten und in Kontroll-ZNS-Gewebe untersucht. Im ZNS-Gewebe der normalen grauen oder weißen Substanz von MS-Gewebeproben konnte keine Immunreaktivität für MICA/B nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte eine starke MICA/B-Expression in MS-Patientenproben detektiert werden, die im Bereich von demyelinisierten ZNS-Läsionen mit aktivierten, MHC Klasse II positiven Mikrogliazellen kolokalisiert (1A). Diese Beobachtung konnte auf mRNA-Ebene bestätigt werden: Hier zeigte sich eine starke Hochregulierung der MICA mRNA in Gewebeproben entzündlicher MS-Läsionen im Vergleich zu Kontrollgewebe. Entsprechend zu den Beobachtungen in vivo zeigten isolierte menschliche Mikrogliazellen, wie Dendritische Zellen, ebenfalls eine Expression von MICA mRNA in vitro (1B).The expression of NKG2D ligands was examined in brain samples from MS patients and in control CNS tissue. In the CNS tissue of the normal gray or white matter of MS tissue samples no immunoreactivity for MICA / B could be detected. In contrast, strong MICA / B expression could be detected in MS patient samples that colocalized in the region of demyelinated CNS lesions with activated MHC class II positive microglial cells ( 1A ). This observation could be confirmed at mRNA level: Here, a strong upregulation of the MICA mRNA was shown in tissue samples of inflammatory MS lesions compared to control tissues. Similar to the observations in vivo, isolated human microglial cells such as dendritic cells also displayed expression of MICA mRNA in vitro ( 1B ).

2.2 Expression von NKG2D-Liganden und NKG2D-Rezeptoren im Maus EAE-Modell2.2 Expression of NKG2D Ligands and NKG2D receptors in the mouse EAE model

Nach dem Nachweis einer starken NKG2D-Ligandenexpression in MS-Gehirnproben wurde die pathogene Bedeutung der Expression dieser Proteine bei einer entzündlichen ZNS-Demyelinisierung im Tiermodell anhand der MOG-induzierten EAE untersucht. Hierzu wurde die Expression des Maus-NKG2D-Liganden RAE-1 und des NKG2D-Rezeptors im Verlauf der EAE im ZNS untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 2 gezeigt. Ein Immunblot von Proteinen aus Gehirnen von Mäusen mit EAE zeigt, dass die die Expression von RAE-1 und NKG2D im Verlauf der EAE deutlich ansteigt, während die Expression des Kontrollproteins (β-Aktin) unverändert bleibt (2A). Dies deutet darauf hin, dass im Verlauf der EAE Mikrogliazellen aktiviert wurden und NKG2D-positive Lymphozyten in das Gehirn eingewandert sind. Diese Ergebnisse konnten auch auf der mRNA-Ebene bestätigt werden. Auch die relative Expression der RAE-1δ mRNA ist in Gehirngewebe von Mäusen mit EAE (an Tag 20 nach der Induktion) um ein Vielfaches höher als in normalen Kontroll-Gehirngewebe (2B). In isolierten Maus-Mikrogliazellen, nicht jedoch auf Astrozyten, konnten ebenfalls erhöhte RAE-1δ Transkriptmengen nachgewiesen werden (2B).Following the demonstration of strong NKG2D ligand expression in MS brain samples, the pathogenic role of expression of these proteins in inflammatory CNS demyelination in the animal model was investigated using MOG-induced EAE. For this purpose, the expression of the mouse NKG2D ligand RAE-1 and the NKG2D receptor in the course of EAE in the CNS was investigated. The results of these investigations are in 2 shown. An immunoblot of proteins from brains of mice with EAE shows that the expression of RAE-1 and NKG2D increases significantly in the course of EAE, while the expression of the control protein (β-actin) remains unchanged ( 2A ). This suggests that during the EAE, microglial cells were activated and NKG2D-positive lymphocytes migrated to the brain. These results could also be confirmed at the mRNA level. Also, the relative expression of RAE-1δ mRNA is many times higher in brain tissue of mice with EAE (on day 20 post-induction) than in normal control brain tissue ( 2 B ). In isolated mouse microglial cells, but not on astrocytes, increased RAE-1δ transcript levels could also be detected ( 2 B ).

2.3 MICA-transgene Tiere sind weniger empfänglich für MOG-induzierte EAE.2.3 MICA transgenic animals are less receptive for MOG-induced EAE.

Für die Untersuchung der Bedeutung der NKG2D-Rezeptor/NKG2DL-Liganden-Interaktion bei der entzündlichen ZNS Demyelinisierung wurde der Krankheitsverlauf von MOG-induzierter EAE in MICA-transgenen C57BL/6-Mäusen untersucht. Diese Mäuse exprimieren eine MICA*07 cDNA konstitutiv unter Kontrolle eines MHC Klasse I Promotors (H-2K^b) und weisen hohe Konzentrationen an löslichem MICA im Serum auf (45-90 ng/ml). Aufgrund dessen ist bei diesen transgenen Mäusen die NKG2D Expression deutlich vermindert, vermutlich durch eine Liganden-induzierte Herabregulation, und NKG2D-vermittelte NKG2D-Effektorfunktionen sind stark beeinträchtigt. Im Vergleich zu nicht-transgenen Mäusen wurde bei den MICA-transgenen Mäusen eine bedeutende Verzögerung des Ausbruchs der Krankheitssymptome beobachtet (3A).To investigate the role of NKG2D receptor / NKG2DL ligand interaction in inflammatory CNS demyelination, the disease progression of MOG-induced EAE in MICA transgenic C57BL / 6 mice was investigated. These mice express a MICA * 07 cDNA constitutively under control of an MHC class I promoter (H-2K ^b ) and have high levels of soluble MICA in the serum (45-90 ng / ml). As a result, NKG2D expression is markedly reduced in these transgenic mice, presumably by ligand-induced down-regulation, and NKG2D-mediated NKG2D effector functions are severely impaired. Compared to non-transgenic mice, a significant delay in the onset of disease symptoms was observed in MICA transgenic mice ( 3A ).

2.4 Blockierung von NKG2D-Liganden mit löslichem NKG2D-Rezeptor schützt Tiere vor MOG-induzierter EAE.2.4 Blocking of NKG2D Ligands with soluble NKG2D receptor protects animals before MOG-induced EAE.

Um zu untersuchen, ob eine Blockierung der NKG2D-Rezeptor/NKG2D-Liganden-Interaktion den Verlauf der EAE beeinflussen kann, wurde den Mäusen lösliches NKG2D (sNKG2D) (wie unter 1.8 sowie 1.10 beschrieben) verabreicht, um die Interaktion der Liganden mit dem Rezeptor in unterschiedlichen Phasen der EAE zu unterbrechen. Hierzu wurde sNKG2D an den Tagen null bis zehn (Frühphase) verabreicht. Es konnte beobachtet werden, dass bei einer sNKG2D-Behandlung während der Frühphase EAE deutlich später ausbrach (3B). Es erkrankten auch nur fünf der sechs Mäuse in der sNKG2D-behandelten Gruppe. Darüber hinaus war die MOG-Peptid-spezifische T-Zellproliferation von Milzzellen aus Mäusen mit sNKG2D-Behandlung im Vergleich zu Milzzellen von Kontroll-behandelten Mäusen signifikant reduziert ( 3C).To investigate whether blocking the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction may affect the course of EAE, mice were given soluble NKG2D (sNKG2D) (as described under 1.8 and 1.10) to monitor the interaction of the ligands with the receptor in different phases of the EAE interrupt. For this, sNKG2D was administered on days zero to ten (early phase). It could be observed that during sNKG2D treatment during the early phase EAE broke much later ( 3B ). Only five of the six mice in the sNKG2D-treated group also developed disease. In addition, MOG-peptide-specific T-cell proliferation of spleen cells from mice treated with sNKG2D was significantly reduced in comparison to spleen cells from control-treated mice ( 3C ).

Als nächstes wurde der EAE-Verlauf bei einer Verabreichung von sNKG2D in der Spätphase (Tag 10 bis 20) untersucht. Hierbei ergab sich keine Verbesserung im Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontroll-behandelten Tieren (3D). Entsprechend war die MOG-Peptid-spezifische T-Zell-Proliferation auch nicht durch die Verabreichung von löslichem NKG2D-Rezeptor beeinflusst (3E).Next, the EAE course was studied with sNKG2D in the late phase (days 10 to 20). There was no improvement in disease progression compared to control-treated animals ( 3D ). Similarly, MOG peptide-specific T cell proliferation was not affected by the administration of soluble NKG2D receptor ( 3E ).

Insgesamt entwickelten alle Tiere, die mit dem Peptid MOG-_35-55 immunisiert wurden, starke EAE-Symptome, jedoch hatte eine frühe Behandlung mit löslichem NKG2D-Rezeptor einen stark positiven Effekt, da hierdurch der Krankheitsausbruch deutlich verzögert werden konnte.Overall, all animals immunized with the peptide MOG- _{35-55 developed} strong symptoms of EAE, but early treatment with soluble NKG2D receptor had a strong positive effect as it significantly delayed the disease onset.

Tabelle 1

Table 1

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Claims

Use of at least one blocker of the NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases, characterized in that the blocker is selected from the group comprising soluble NKG2D receptor, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBP1, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAET1L, soluble RAET1G, as well as allelic variants or fragments or derivatives of said blockers, as well as synthetically produced blockers of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Use according to claim 1, characterized in that a protein which has an amino acid sequence is used as blocker contains the selected is from the sequences with the SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15th

Use according to claim 1 or 2, characterized in that a protein which has an amino acid sequence is used as blocker owns, which is selected is from the sequences with the SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15th

Use according to one of Claims 1 to 3, characterized that a blocker is used which has been produced recombinantly.

Use according to one of Claims 1 to 4, characterized the use is for diseases that are selected from the group comprising multiple sclerosis, diabetes type I, rheumatoid Arthritis, psoriasis, spondylarthritides, celiac disease, Behcet's disease, Morbus Crohn's, Ulcerative Colitis, Systemic Lupus Erythematosus (SLE).

Use according to claim 5, characterized that use is in relapsing forms of multiple sclerosis.

Use according to claim 6, characterized that use is in the initial phase of relapsing forms of multiple sclerosis.

Use of anti-NKG2D receptor antibodies for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases, the selected are from the group comprising multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, Psoriasis, spondylarthritis, celiac disease, Behcet's Disease, Crohn's Disease, Ulcerative Colitis, Systemic Lupus Erythematosus (SLE).

Pharmaceutical composition containing at least a blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Pharmaceutical composition according to claim 8, characterized in that the blocker is selected from the group comprising soluble NKG2D receptor, anti-NKG2D receptor antibody, soluble MICA, soluble MICB, soluble ULBP1, soluble ULBP2, soluble ULBP3, soluble ULBP4, soluble RAET1L, soluble RAET1G, as well as allelic variants or fragments or derivatives the said blocker, as well as synthetically produced blocker of NKG2D receptor / NKG2D ligand interaction.

Pharmaceutical composition according to claim 9, characterized in that a protein is used as blocker which is an amino acid sequence contains the selected is from the sequences with the SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15th

Pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that a protein is used as blocker which is an amino acid sequence owns, which is selected is from the sequences with the SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 15th

Pharmaceutical composition according to one of claims 8 to 11 for the treatment of autoimmune diseases, especially for Behanldung multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, spondylarthritis, celiac disease, Behcet's Disease, Crohn's Disease, Ulcerative Colitis, Systemic Lupus Erythematosus (SLE).