DE10159904A1

DE10159904A1 - Oligonucleotide arrangement, method for nucleotide detection and device therefor

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Publication number: DE10159904A1
Application number: DE10159904A
Authority: DE
Inventors: Stefanie Waschuetza; Alf-Andreas Krehan; Oliver Boecher
Original assignee: Adnagen GmbH
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2003-07-03
Also published as: EP1456406A2; WO2003048385A3; AU2002349054A1; WO2003048385A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Oligonukleotidanordnung mit einem Substrat, das mindestens ein Feld aufweist, wobei in dem zumindest einen Feld Oligonukleotide mit feldspezifischer Sequenz immobilisiert sind und wobei die immobilisierten Oligonukleotide des mindestens einen Feldes derart modifiziert sind, daß sie durch zumindest eine vorbestimmte oder alle Nukleasen, die spezifisch einzelsträngige Nukleinsäure spalten, nicht verdaubar sind.The present invention relates to an oligonucleotide arrangement with a substrate that has at least one field, wherein in the at least one field oligonucleotides with a field-specific sequence are immobilized and wherein the immobilized oligonucleotides of the at least one field are modified such that they are modified by at least one predetermined or all nucleases that specifically cleave single-stranded nucleic acid are not digestible.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Oligonukleotidanordnung, beispielsweise ein Oligonukleotid-Array wie den DNS-Chips u. dgl., ein Verfahren zum Nachweis von Oligonukleotiden sowie eine Vorrichtung zur Durchführung derartiger Verfahren. Derartige Oligonukleotidanordnungen werden verwendet, um mittels ihrer einzelnen Felder gleichzeitig eine Vielzahl von Oligonukleotidsequenzen nachzuweisen oder zu überprüfen. Dabei enthalten die jeweiligen Felder der Nukleotid-Arrays Oligonukleotide in immobilisierter Form, die eine komplementäre Sequenz zu den nachzuweisenden Oligonukleotiden aufweisen. Befindet sich nun in einer Probe ein entsprechendes Oligonukleotid, so wird es an das entsprechende komplementäre Oligonukleotid in einem bestimmten Feld des Arrays hybridisiert und ist dann dort nachweisbar. The present invention relates to a Oligonucleotide arrangement, for example a Oligonucleotide array such as the DNA chips u. Like., a method for the detection of oligonucleotides and a Device for carrying out such methods. such Oligonucleotide arrays are used to using their individual fields at the same time Detect or assign a large number of oligonucleotide sequences check. The respective fields contain the Nucleotide arrays of immobilized oligonucleotides Form that is a complementary sequence to the have to be detected oligonucleotides. Is located now a corresponding oligonucleotide in a sample, so it becomes the corresponding complementary Oligonucleotide in a specific field of the array hybridizes and is then detectable there.

Die direkte Hybridisierung von Arrays mit genomischer DNA erreicht jedoch im Regelfall nicht die erforderliche Sensivität des nachfolgend aufgrund einer komplementären Bindung von Nukleinsäuren detektierten Signals. Daher ist im Regelfall eine der Hybridisierung vorgeschaltene selektive Vervielfältigung (z. B. durch PCR) einzelner Sequenzen erforderlich. Diese muß für jeden Array separat etabliert werden und hat eine mengenmäßige Begrenzung (beispielsweise als Multiplex, in der gleichzeitig nicht mehr als 50 verschiedene Sequenzen amplifiziert werden können, wobei obendrein die Amplifikationseffizienz für einzelne Sequenzen bei dieser Komplexität unterschiedlich sein kann. The direct hybridization of arrays with genomic However, DNA usually does not reach that required sensitivity of the following due to a complementary binding of nucleic acids detected Signal. Therefore, one of the most common Selective duplication prior to hybridization (e.g. by PCR) of individual sequences. This must be established separately for each array and has a quantitative limit (e.g. as Multiplex in which at the same time no more than 50 different sequences can be amplified, whereby on top of that, the amplification efficiency for individuals Sequences at this complexity may be different can.

Eine zweite Schwierigkeit besteht darin, daß, um ein detektierbares Signal zu erhalten, die bindende Komponente entweder direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen werden muß oder eine chemische Modifikation besitzen muß, die eine nachfolgende radioaktive oder Fluoreszenzmarkierung ermöglicht. Im ersten Fall bestehen Handhabungseinschränkungen für den hybridisierten Array, da er unter Lichtabschluß aufbewahrt werden muß, im zweiten Fall ist mindestens ein weiterer Markierungs- und Waschschritt erforderlich, der die Gesamtprozedur verlängert und damit weniger effizient werden läßt. A second difficulty is that in order to detectable signal to get the binding Component either directly with a Fluorescent dye must be provided or a chemical Modification must have a subsequent one radioactive or fluorescent labeling allows. In the first There are handling restrictions for the case hybridized array since it is under light must be kept, in the second case at least one further marking and washing step required, which extends the overall procedure and therefore less can become efficient.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, eine Oligonukleotidanordnung, beispielsweise ein DNS-Chip, zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und hochsensitive Weise die Hybridisierung von Oligonukleotiden in den einzelnen Feldern nachgewiesen werden kann. Weiterhin ist es Aufgabe, ein entsprechendes Nachweisverfahren und eine Vorrichtung hierzu zur Verfügung zu stellen. The object of the present invention is now a Oligonucleotide arrangement, for example a DNA chip, with the simple, safe and highly sensitive way of hybridizing Oligonucleotides in the individual fields can be demonstrated. Furthermore, it is a task corresponding detection method and a device to make available for this.

Diese Aufgabe wird durch die Oligonukleotidanordnung gemäß Anspruch 1, das Verfahren gemäß Anspruch 6 sowie die Vorrichtung gemäß Anspruch 25 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnung, des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden in den jeweiligen Ansprüchen gegeben. This task is accomplished by the oligonucleotide arrangement according to claim 1, the method according to claim 6 and the device according to claim 25 solved. Advantageous further development of the invention Oligonucleotide arrangement, of the method according to the invention and the device according to the invention are in the given respective claims.

Im folgenden wird ein Beispiel für eine derartige Oligonukleotidanordnung sowie ihre Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. The following is an example of such Oligonucleotide arrangement and their use in the described method according to the invention.

Auf einem Array werden Sequenzen aufgetragen, die anstelle einer Phosphorsäureesterbindung im Zucker- Phosphatrückgrat der Oligonukleotide Thioester enthalten (Thiophosphonate). Die Hybridisierung erfolgt mit fragmentierter genomischer DNA ohne vorherige Amplifikation bei der für die entsprechenden Sequenzen optimalen Hybridisierungstemperatur. Um eine vollständige und spezifische Hybridisierung zu erreichen, wird dieser Hybridisierungsschritt zyklisch mit jeweils neuer Gabe von fragmentierter, nicht amplifizierter DNA wiederholt. Die Fragmentierung der DNS kann beispielsweise durch zumindest teilweisen Restriktionsverdau oder durch Scheren der DNS erfolgen. Es werden jeweils nur geringe Mengen an genomischer DNA eingesetzt, um die Spezifität weiter zu erhöhen (statt etwa 10 ng/30 µl bei einer Fläche von 4 qcm wird dies auf ca. 1 ng reduziert). Nachfolgend zu jedem Hybridisierungsschritt wird die Hybridisierungslösung durch eine Lösung für einen Restriktionsverdau mit S1-Nuklease ersetzt, wobei die Temperatur auf 37°C reduziert wird. Als S1-Nuklease wurde hier beispielhaft die S1-Nuklease M5761 der Firma Promega verwendet. Hierdurch werden Einzelstränge aller Art, wie sie bei Fehlhybridisierungen vorkommen, sowie überstehende Strangenden beseitigt. Eine erneute Temperaturerhöhung auf die Hybridisierungstemperatur denaturiert das Restriktionsenzym und verhindert so für den nächsten folgenden Hybridisierungsschritt den Verdau von einzelsträngiger DNA. Außerdem werden verbliebene kurze DNS-Abschnitte, die jedoch nicht mit dem gesamten Oligonukleotid hybridisieren, abgelöst, ohne daß vollständig hybridisierte, nachzuweisende DNS-Abschnitte abgelöst werden. Danach wird erneut DNA-Lösung (genomische, nicht-amplifizierte gescherte DNA ohne Modifikationen) aufgebracht. Diese zyklisch wiederholte Hybridisierung kann durch automatisiertes Wechseln der Lösungen vereinfacht werden. Auf diese Weise wird eine vollständige Absättigung aller Oligonukleotide an einem Auftragungsort erreicht, während unvollständige und falsche Hybridisierungen vermieden werden; bei Sequenzen ohne genomisches Pendant liegt nach Hybridisierung kein Doppelstrang vor. Sequences are plotted on an array instead of a phosphoric acid ester bond in the sugar Phosphate backbone of the oligonucleotides thioester contain (thiophosphonates). The hybridization takes place with fragmented genomic DNA without previous Amplification at for the corresponding sequences optimal hybridization temperature. To one to achieve complete and specific hybridization, this hybridization step is carried out cyclically each new gift of fragmented, not amplified DNA repeated. DNA fragmentation can for example by at least partially Restriction digestion or by shearing the DNA. There are only small amounts of genomic each DNA used to further increase specificity (instead of about 10 ng / 30 µl with an area of 4 qcm this is reduced to approx. 1 ng). Below too each hybridization step Hybridization solution by a solution for a restriction digest replaced with S1 nuclease, the temperature being up 37 ° C is reduced. As a S1 nuclease, here the S1 nuclease M5761 from Promega, for example used. In this way, single strands of all kinds, as they occur with incorrect hybridizations, as well protruding strand ends eliminated. Another Temperature increase to the hybridization temperature denatures the restriction enzyme, thus preventing for the next following hybridization step Digestion of single-stranded DNA. Also be remaining short sections of DNS, but not with hybridize the entire oligonucleotide, detached, without fully hybridized detection DNS sections will be replaced. After that, again DNA solution (genomic, non-amplified sheared DNA applied without modifications). This cyclically repeated hybridization can be automated Switching solutions can be simplified. To this Way, a complete saturation of all Oligonucleotides reached at one application site while incomplete and incorrect hybridizations avoided become; sequences without a genomic counterpart no double strand before hybridization.

Dadurch, daß durch die Nukleasen die nicht vollständig hybridisierten Oligonukleotide aus der Probe sowie die überstehenden Nukleotide des Strangendes eines vollständig hybridisierten Oligonukleotides, die jeweils als Einzelstrang vorliegen, abgebaut bzw. geschnitten werden, ist eine vollständige Hintergrundreduzierung möglich. Denn die Restfragmente, die nach Abbau der einzelsträngigen Nukleotidbereiche an die immobilisierten Oligonukleotide weiterhin gebunden sind, lösen sich schon bei einer geringen Erwärmung ab, so daß die entsprechenden Oligonukleotide, die an den Feldern immobilisiert sind, anschließend wieder beim nächsten Zyklus vollständig für eine Hybridisierungsreaktion zur Verfügung stehen. Es ist also möglich, jeglichen Hintergrund zu beseitigen. Because the nucleases do not fully hybridized oligonucleotides from the sample and the protruding nucleotides at the end of the strand of a fully hybridized oligonucleotide that each available as a single strand, dismantled or to be cut is a complete Background reduction possible. Because the residual fragments that after Degradation of the single-stranded nucleotide regions to the immobilized oligonucleotides still bound are loosened even with a little warming so that the corresponding oligonucleotides attached to the fields are immobilized, then again in the next cycle completely for one Hybridization reaction are available. So it is possible to remove any background.

Nach vollständiger Hybridisierung ist eine optische Unterscheidung von hybridisierten und nichthybridisierten Sequenzen notwendig. Dies kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. Eine Möglichkeit besteht darin, einen in doppelsträngiger DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, wodurch auch eine absolute Quantifizierung ermöglicht wird. Hierzu wird nach der letzten Hybridisierung/S1- Verdau die Temperatur auf einen Wert, der geringfügig unter der Hybridisierungstemperatur liegt, gebracht und eine Lösung mit einem selektiv in doppelsträngige DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs zugesetzt. Dadurch kann in relativ kurzer Zeit eine hochspezifische Färbung ohne Hintergrund erfolgen. Durch die proportionale Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs ist dann eine Absolutquantifizierung möglich. After complete hybridization is an optical Differentiation from hybridized and non-hybridized sequences necessary. This can be due to can be achieved in different ways. A Possibility is one in double-stranded DNA to use intercalating fluorescent dye which also enables absolute quantification becomes. After the last hybridization / S1- Digest the temperature to a value that is negligible is below the hybridization temperature and a solution with a selective in double-stranded DNA intercalating fluorescent dye added. As a result, a highly specific coloring without background. Through the proportional intercalation of the fluorescent dye absolute quantification is then possible.

Als Nachweismethoden für die letztlich doppelsträngig vorliegende Nukleinsäure jedes einzelnen Feldes eignen sich weiterhin die folgenden Möglichkeiten:
Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen;
Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalierenden Substanzen mit Modifikation (z. B. Biotin), über die ein Fluoreszenz- oder anderer Farbstoff gebunden werden kann;
Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalierenden Substanzen mit Modifikation (z. B. Biotin), über die ein Enzym gebunden werden kann, welches eine Farbreaktion katalysiert;
Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalierenden Substanzen mit Modifikation (z. B. Biotin), über die ein Enzym gebunden werden kann, welches eine Bio- oder Chemilumineszenzreaktion katalysiert;
Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalierenden Substanzen mit Modifikation (z. B. Biotin), über die spezifisch eine radioaktivmarkierte Komponente gebunden werden kann;
Verwendung einer Komponente, die in einer Redoxreaktion spezifisch an den randständigen Zucker des bindenden Stranges kovalent addiert und als Farbstoff/Fluoreszenzfarbstoff/radioaktive Markierung oder Chemi- bzw. Biolumineszenzreaktion identifiziert werden kann. The following options are also suitable as detection methods for the ultimately double-stranded nucleic acid of each individual field:
Use of fluorescent dyes intercalating in DNA double strands;
Use of substances intercalating in DNA double strands with modification (e.g. biotin), via which a fluorescent or other dye can be bound;
Use of substances intercalating in DNA double strands with modification (eg biotin) via which an enzyme can be bound which catalyzes a color reaction;
Use of substances intercalating in DNA double strands with modification (eg biotin) via which an enzyme can be bound which catalyzes a bio- or chemiluminescence reaction;
Use of substances intercalating in DNA double strands with modification (e.g. biotin), via which a radio-labeled component can be specifically bound;
Use of a component which covalently adds to the marginal sugar of the binding strand in a redox reaction and can be identified as a dye / fluorescent dye / radioactive label or a chemical or bioluminescent reaction.

Weiterhin ist es möglich, die einzelnen Hybridisierungstemperaturen der einzelnen Arrayfelder aneinander anzugleichen, um eine annähernd einheitliche Hybridisierung zu erreichen. Dies kann beispielsweise durch eine chemische Modifikation der immobilisierten Oligonukleotide etwa am Ribosebestandteil oder durch eine geeignete Wahl der Oligonukleotidlänge für jedes einzelne Oligonukleotidfeld erreicht werden. Furthermore, it is possible for the individual Hybridization temperatures of the individual array fields align with each other to create an approximately uniform To achieve hybridization. For example through a chemical modification of the immobilized Oligonucleotides on the ribose component or through an appropriate choice of oligonucleotide length for each single oligonucleotide field can be reached.

Insgesamt besitzt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Vorteile:
Eine Absolutquantifizierung wird möglich, die LNA- Technologie bei Punktmutationen kann eventuell umgangen werden, es entfällt weiterhin ein separater Markierungsschritt bei geeigneter Verfahrensführung und Nachweis mittels interkalierender Substanzen, das Gesamtverfahren ist automatisierbar und ermöglicht die Verwendung der genomischen DNA ohne jede chemische Modifikation bzw. ohne jede vorhergehende Vervielfältigung. Dies bedeutet einen geringen technischen und zeitlichen Aufwand bei der Probenvorbereitung. Bezüglich der Markierungstechnologie ist maximale Flexibilität gegeben, da unterschiedlichste Marker verwendet werden können. Overall, the method according to the invention has the following advantages:
An absolute quantification is possible, the LNA technology in the case of point mutations can possibly be circumvented, a separate marking step with appropriate process management and detection using intercalating substances is also omitted, the entire process can be automated and enables the use of genomic DNA without any chemical modification or without any previous duplication. This means that the sample preparation takes little time and money. There is maximum flexibility with regard to the marking technology, since a wide variety of markers can be used.

Zusammenfassend unterscheiden folgende Besonderheiten die erfindungsgemäße Technologie von dem Stand der Technik:
Es werden stabilisierte immobilisierte Oligonukleotide eingesetzt;
wesentliche Eigenschaft der immobiliseirten Oligonukleotide ist ihre Widerstandsfähigkeit gegen Verdau durch einzelstrangspaltende Nukleasen;
zusätzlich haben derart modifizierte Oligonukleotide eine höhere Bindeintensität. Hierdurch wird eine höhere, besser ausgleichbare Hybridisierungstemperatur ermöglicht;
es wird ein selektiver Schritt der Restriktionsspaltung auf dem Array durchgeführt;
das Enzym wird durch Temperaturerhöhung inaktiviert, was für den nächsten Zyklus ohnehin erforderlich ist;
eine mehrfache Wiederholung des Vorganges bis zur Absättigung ist möglich;
durch Verdau überstehender Enden der hybridisierten Nukleotide aus der Probe werden diese entfernt, so daß eine Verwendung von Interkalationsfarbstoffen möglich ist ohne daß ein zusätzlicher Hintergrund entsteht;
der Interkalationsfarbstoff kann erst am Ende des Verfahrens zugesetzt werden, dadurch Vermeidung von lichtgeschützter Handhabung während der vorausgehenden Hybridisierungen. In summary, the following special features distinguish the technology according to the invention from the prior art:
Stabilized immobilized oligonucleotides are used;
The essential property of the immobilized oligonucleotides is their resistance to digestion by single-strand cleaving nucleases;
additionally modified oligonucleotides have a higher binding intensity. This enables a higher, more easily compensated hybridization temperature;
a selective restriction cleavage step is performed on the array;
the enzyme is inactivated by increasing the temperature, which is necessary for the next cycle anyway;
it is possible to repeat the process several times until saturation;
by digesting protruding ends of the hybridized nucleotides from the sample, these are removed, so that the use of intercalation dyes is possible without creating an additional background;
the intercalation dye can only be added at the end of the process, thereby avoiding light-protected handling during the previous hybridizations.

Im folgenden zeigen 4 Figuren eine erfindungsgemäße Vorrichtung und den prinzipiellen Verfahrensablauf. In the following, 4 figures show an invention Device and the basic procedure.

Es zeigen: Show it:

Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Querschnitt; Figure 1 shows a device according to the invention in cross section.

Fig. 2 eine Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung; Fig. 2 is a plan view of an inventive device;

Fig. 3 eine Aufsicht auf einen Querschnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung und Fig. 3 is a plan view of a cross section through an inventive device and

Fig. 4 den prinzipiellen Verfahrensablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 4 shows the basic process flow of the method according to the invention.

In Fig. 1 ist mit dem Bezugszeichen 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens bezeichnet. Diese weist einen Träger 2 auf, der eine Ausnehmung 3 als Hybridisierungskammer besitzt. Diese Hybridisierungskammer 3 ist mit einem Deckel 6 verschlossen, der auf dem Träger 2 aufliegt. Der Träger 2 enthält weiterhin ein Heizelement, um die Hybridisierungskammer aufzuheizen bzw. abzukühlen. Das Heizelement kann jedoch auch unterhalb/außerhalb des Trägers im umgebenden Gerät lokalisiert sein. Das Aufheizen bzw. Abkühlen kann beispielsweise durch ein Peltierelement erfolgen. Die Hybridisierungskammer 3 besitzt eine weitere im Querschnitt schmalere Vertiefung, die als erfindungsgemäßer Oligonukleotid-Array ausgebildet ist. In Fig. 1, reference numeral 1 denotes an apparatus according to the invention for carrying out the detection method according to the invention. This has a carrier 2 , which has a recess 3 as a hybridization chamber. This hybridization chamber 3 is closed with a cover 6 which rests on the carrier 2 . The carrier 2 also contains a heating element in order to heat or cool the hybridization chamber. However, the heating element can also be located below / outside the carrier in the surrounding device. The heating or cooling can take place, for example, using a Peltier element. The hybridization chamber 3 has a further recess with a narrower cross section, which is designed as an oligonucleotide array according to the invention.

Fig. 2 zeigt ebenfalls eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei hier wie im folgenden mit gleichen oder ähnlichen Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Elemente bezeichnet sind. Auch hier ist in einen Träger 2 eine Hybridisierungskammer 3 eingebracht, die als DNS-Chip ausgebildet ist. Über Zuläufe 6, 7, 8 und 9 können beispielsweise Probenflüssigkeiten oder Waschlösungen oder Nukleaselösungen über den DNS-Chip geleitet und über einen Ablauf 10 wieder abgeleitet werden. Die Steuerung der Zuläufe 6 bis 9 kann beispielsweise über magnetisch gesteuerte Ventile und eine entsprechende Mikroprozessorsteuerung erfolgen. FIG. 2 also shows a device according to the invention, the same or similar elements being referred to here with the same or similar reference numerals as in the following. A hybridization chamber 3 , which is designed as a DNS chip, is also introduced into a carrier 2 . Via feeds 6 , 7 , 8 and 9 , for example, sample liquids or washing solutions or nuclease solutions can be passed over the DNA chip and can be derived again via a drain 10 . Inlets 6 to 9 can be controlled, for example, via magnetically controlled valves and a corresponding microprocessor control.

Fig. 3 zeigt wiederum eine Vorrichtung 1 mit einem Träger 2, einer Hybridisierungskammer 3 und einem Heiz- und Kühlelement 4, mit dem die Hybridisierungskammer 3 und damit der DNS-Chip aufgeheizt bzw. abgekühlt werden kann. Prinzipiell ist es auch möglich, die Hybridisierungskammer 3 derart auszubilden, daß sie einen DNS-Chip aufnehmen kann, so daß der DNS- Chip austauschbar ist. Fig. 3 again shows a device 1 comprising a support 2, a hybridization chamber 3 and a heating and cooling element 4 by which the hybridization chamber 3 and thus the DNA chip can be heated or cooled. In principle, it is also possible to design the hybridization chamber 3 in such a way that it can accommodate a DNS chip, so that the DNS chip can be replaced.

Fig. 4 zeigt den prinzipiellen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 4 shows the basic flow of the method according to the invention.

Fig. 4A zeigt dabei ein Feld eines DNS-Arrays mit einer Oberfläche 11, an die nicht durch Nukleasen spaltbare Oligonukleotide 12 mit feldweise gleicher Nukleotidsequenz angebunden sind. Fig. 4A shows a field of a DNA array having a surface area 11, are tied to the non-cleavable by nucleases, oligonucleotides 12 with each field, the same nucleotide sequence.

In Fig. 4B ist dargestellt, wie nach Kontaktierung dieses Feldes mit einer Probenlösung beispielsweise ein Oligonukleotid 13 aus der Probenlösung an ein Oligonukleotid 12 hybridisiert. Dies erfolgt unter Schlaufenbildung. Demgegenüber bindet Oligonukleotid 13' in regulärer Weise an das Oligonukleotid 12 unter Ausbildung eines Doppelstranges. Der überstehende Teil des Oligonukleotides 13' bindet seinerseits wiederum Oligonukleotide 14 aus der Probenlösung, die jedoch einen störenden Hintergrund bilden. FIG. 4B shows how, after contacting this field with a sample solution, for example an oligonucleotide 13 hybridizes from the sample solution to an oligonucleotide 12 . This takes place with the formation of loops. In contrast, oligonucleotide 13 'binds in a regular manner to oligonucleotide 12 to form a double strand. The protruding part of the oligonucleotide 13 'in turn binds oligonucleotides 14 from the sample solution, which, however, form a disturbing background.

Fig. 4C zeigt das Ergebnis nach einem Verdau durch S1-Nuklease. Die nicht hybridisierten Schleifen des Oligonukleotides 13 sind nun entfernt, ebenso das über das Oligonukleotid 12 hinausstehende Ende des Nukleotids 13' und dort anhybridisierten Oligonukleotide 14. Es verbleiben folglich zwei kurze Bruchstücke 15, 16 und ein korrekter Doppelstrang 17. Fig. 4C shows the result of digestion by S1 nuclease. The non-hybridized loops of the oligonucleotide 13 have now been removed, as has the end of the nucleotide 13 'projecting beyond the oligonucleotide 12 and the oligonucleotides 14 hybridized there. Consequently, two short fragments 15 , 16 and a correct double strand 17 remain.

Fig. 4C zeigt das Ergebnis nach Erwärmen des Oligonukleotid-Arrays auf ca. 65 bis 75°C. Dadurch wird die S1-Nuklease zerstört und die kurzen Bruchstücke 15, 16 lösen sich von dem Oligonukleotid 12. Damit verbleibt lediglich noch das korrekte doppelsträngige Oligonukleotid 13', 17 und alle weiteren Nukleotide 12 sind für einen weiteren Zyklus zum Durchlaufen der Schritte gemäß der Abb. 4A bis 4D bereit. Fig. 4C shows the result after heating the oligonucleotide arrays to about 65 to 75 ° C. This destroys the S1 nuclease and the short fragments 15 , 16 detach from the oligonucleotide 12 . All that is left is the correct double-stranded oligonucleotide 13 ', 17 and all other nucleotides 12 are ready for another cycle to go through the steps shown in FIGS. 4A to 4D.

Nach Abschluß mehrerer derartiger Zyklen sind ausreichend viele Oligonukleotide 12 korrekt doppelsträngig hybridisiert, so daß der Zyklus abgebrochen wird und nun die doppelsträngige DNA mit einem interkalierenden Farbstoff angefärbt wird. Dies ermöglicht eine absolute Quantifizierung der in dem Feld des DNS- Arrays an der Oberfläche anhybridisierten Oligonukleotide aus der Probe. After the completion of several such cycles, a sufficient number of oligonucleotides 12 are hybridized correctly double-stranded, so that the cycle is terminated and the double-stranded DNA is now stained with an intercalating dye. This enables an absolute quantification of the oligonucleotides from the sample which are hybridized in the field of the DNA array on the surface.

In einem ersten Beispiel wurde nachgewiesen, ob das VDR-Gen eine Punktmutation enthält, die zu einer Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease FokI führt. Diese Punktmutation ist im folgenden dargestellt, wobei ein DNS-Abschnitt mit insgesamt 36 Nukleotiden dargestellt ist.

In a first example, it was demonstrated whether the VDR gene contains a point mutation which leads to an interface for the restriction endonuclease FokI. This point mutation is shown below, with a DNA segment with a total of 36 nucleotides being shown.

Zu diesem DNS-Abschnitt des Wildtyps wurde ein komplementäres Oligonukleotid hergestellt und immobilisiert. To this section of DNA of the wild type was a Complementary oligonucleotide prepared and immobilized.

Dieses Oligonukleotid war bezüglich seines Rückgrats wie oben beschrieben als Thiophosphonat modifiziert. Dadurch ist es für die S1-Nuklease M5761 der Firma Promega nicht zu verdauen. This oligonucleotide was like in terms of its backbone modified as thiophosphonate described above. Thereby it is not for the S1 nuclease M5761 from Promega to digest.

Bindet nun eine den DNS-Abschnitt fragmentierter genomischer DNS vom Wildtyp an dieses Oligonukleotid, so erfolgt eine vollständig Hybridisierung mit einem Schmelzpunkt von T_M = 78,30°C. Da hier eine vollständige Hybridisierung und damit ausschließlich ein Doppelstrang vorliegt, wird in dem nachfolgenden Behandlungsschritt mit der genannten S1-Nuklease lediglich der Überstand am 5' bzw. 3' Ende, der nicht mit dem Oligonukleotid hybridisiert ist, weggeschnitten, so daß eine 36 Nukleotide lange doppelsträngige DNS entsteht. If a wild-type genomic DNA fragmented from the DNA section binds to this oligonucleotide, a complete hybridization takes place with a melting point of T _M = 78.30 ° C. Since there is a complete hybridization and thus only a double strand, in the subsequent treatment step with the S1 nuclease mentioned, only the supernatant at the 5 'or 3' end which is not hybridized with the oligonucleotide is cut away, so that a 36 nucleotides long double-stranded DNA is formed.

Liegt jedoch die beschriebene Mutation vor, so erfolgt die Hybridisierung zwar an 35 der 36 Nukleotide jedoch nicht an dem Nukleotid, das ausgetauscht wurde. Hier liegt eine einzelsträngige DNS vor, so daß im nachfolgenden Behandlungsschritt die S1 Nuklease den anhybridisierten DNS-Abschnitt an dieser Stelle schneidet. Die entstehenden DNS-Bruchstücke sind im folgenden dargestellt

However, if the mutation described is present, the hybridization takes place on 35 of the 36 nucleotides but not on the nucleotide that was exchanged. Here there is a single-stranded DNA, so that in the subsequent treatment step the S1 nuclease cuts the hybridized DNA section at this point. The resulting DNA fragments are shown below

Weiterhin entfernt die S1-Nuklease sowohl am 5' als auch am 3' Ende die jeweils überstehende einzelsträngige DNS. Dadurch sind nun an das immobilisierte Oligonukleotid zwei DNS Fragmente mit jeweils ≤ 18 Nukleotiden hybridisiert. Diese beiden Nukleotide besitzen Schmelztemperaturen von
T_M = 64,4°C bzw. T_M = 66,7°C. Furthermore, the S1 nuclease removes the protruding single-stranded DNA at both the 5 'and the 3' end. As a result, two DNA fragments, each with ≤ 18 nucleotides, are now hybridized to the immobilized oligonucleotide. These two nucleotides have melting temperatures of
T _M = 64.4 ° C or T _M = 66.7 ° C.

Wird für im nachfolgenden Schritt dann die Temperatur beispielsweise auf ca. 70°C erhöht, so lösen sich die kurzen Abschnitte von dem immobilisierten Oligonukleotid, während der DNS-Abschnitt vom Wildtyp hybridisiert bleibt. Zugleich wird durch diesen Temperaturerhöhungsschritt die S1 Nuklease inaktiviert. Then in the following step the temperature For example, increased to about 70 ° C, so the short sections of the immobilized oligonucleotide, while the wild-type DNA section hybridizes remains. At the same time, through this Temperature increasing step inactivates the S1 nuclease.

Im nächsten Schritt kann nun erneut fragmentierte DNS auf die Oligonukleotidanordnung gegeben werden. Auf diese Art und Weise werden im Laufe mehrerer Zyklen sämtliche Oligonukleotide mit Wildtyp-DNS-Abschnitten abgesättigt, sofern diese vorhanden sind. Beim anschließenden Nachweis mittels interkalierender Fluoreszenzfarbstoffe kann also festgestellt werden, ob in der ursprünglichen Probe DNS vom Wildtyp oder lediglich DNS gemäß der oben beschriebenen Mutation vorlag. In the next step, DNS can now be fragmented again the oligonucleotide arrangement can be given. In this manner and manner all become in the course of several cycles Saturated oligonucleotides with wild-type DNA segments, if they exist. With the subsequent proof using intercalating fluorescent dyes determine whether DNA in the original sample wild-type or only DNA according to the above described mutation was present.

In einem weiteren Beispiel wurde wiederum das Vorliegen einer Mutation im VDR-Gen untersucht, bei der eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease BsmI entsteht. Diese ist im folgenden dargestellt

In another example, the presence of a mutation in the VDR gene was investigated, in which an interface for the restriction endonuclease BsmI arises. This is shown below

Auch hier wird wiederum ein Oligonukleotid hergestellt und immobilisiert auf der Oligonukleotidanordnung, das der hier dargestellten Nukleotidsequenz der DNS des Wildtyps komplementär ist. An oligonucleotide is also produced here and immobilized on the oligonucleotide assembly that the nucleotide sequence of the DNA of the Wild type is complementary.

Das weitere Verfahren verläuft wie beim obigen Beispiel beschrieben, wobei die im folgenden dargestellten Fragmente entstehen, wenn DNS von Mutationstyp an das Oligonukleotid bindet mit einer Fehlpaarung an der Punktmutationsstelle und anschließend durch die S1-Nuklease M5761 dort geschnitten wird.

The further procedure proceeds as described in the example above, the fragments shown below arise when DNA of the mutation type binds to the oligonucleotide with a mismatch at the point mutation site and is then cut there by the S1 nuclease M5761.

Die Schmelztemperatur des hybridisierten Widtyp-DNS- Abschnitts mit 34 Nukleotiden beträgt 74,3°C während für die beiden Fragmente die Schmelztemperaturen jeweils 64,4°C bzw. 52,7°C betragen. The melting temperature of the hybridized widtype DNA Section with 34 nucleotides is 74.3 ° C while for the two fragments each have a melting temperature of 64.4 ° C or 52.7 ° C.

Wird nun das obige Verfahren in gleicher Weise durchgeführt, so verbleiben letztlich an dem immobilisierten Oligonukleotid, das wie oben derart modifiziert ist, daß es durch die S1-Nuklease M5761 nicht geschnitten werden kann, ausschließlich DNS-Bruchstücke mit 34 Nukleotiden vom Wildtyp hybridisiert. Damit kann nachgewiesen werden, ob in der ursprünglichen genomischen DNS Probe DNS vom Wildtyp vorlag. Now the above procedure works in the same way carried out, so ultimately remain on the immobilized Oligonucleotide modified as above such that it cannot be cut by the S1 nuclease M5761 can, only DNA fragments with 34 nucleotides hybridized from the wild type. It can be used to demonstrate whether in the original genomic DNA sample DNA from Wild type was present.

Selbstverständlich können beide Beispiele auch derart variiert werden, daß das immobilisierte Nukleotid komplementär zur Sequenz der jeweiligen Mutation ist, bzw. auf zwei Feldern der Oligonukleotidanordnung jeweils verschiedene Oligonukleotidsequenzen immobilisiert sind, wobei die eine Sequenz komplementär zum Wildtyp und die andere Sequenz komplementär zur Mutation ist. In diesem Falle ist eine genaue Unterscheidung zwischen homozygotem Wildtyp, homozygotem Mutationstyp bzw. bei Nachweis von genomischer DNS in beiden Feldern heterozygotem Wildtyp/Mutation möglich. Of course, both examples can also be used in this way be varied that the immobilized nucleotide is complementary to the sequence of the respective mutation, or on two fields of the oligonucleotide array each different oligonucleotide sequences are immobilized, the one sequence complementary to the wild type and the other sequence is complementary to the mutation. In this Trap is an exact distinction between homozygous wild type, homozygous mutation type or upon detection of genomic DNA heterozygous in both fields Wild type / mutation possible.

Claims

1. oligonucleotide arrangement with a substrate having at least one field, wherein in the at least one field oligonucleotides with a field-specific sequence are immobilized, characterized in that the immobilized oligonucleotides of the at least one field are modified in such a way that they are modified by at least one predetermined or all nucleases that specifically cleave single-stranded nucleic acid are not digestible.

2. Arrangement according to the preceding claim, characterized in that the oligonucleotides of the at least one field employee one Phosphoric acid ester bond in sugar Phosphate backbone of the oligonucleotides thioester contain.

3. Order according to at least one of the preceding claims, characterized by at least two separate fields, whereby in the at least two separate fields Oligonucleotides with different from field to field, however field-specific sequence are immobilized.

4. Arrangement according to at least one of the previous claims, characterized in that the immobilized Oligonucleotides are modified so that they with complementary nucleotide sequences in the hybridize in the same temperature range.

5. Arrangement according to the preceding claim, characterized in that the immobilized Oligonucleotides of suitable length or chemical modification, for example the Ribose constituent, that they are modified with complementary nucleotide sequences in the same Hybridize temperature range.

6. A method for the detection of a nucleotide sequence in a sample, characterized in that

a) with at least sections of the nucleotide sequence to be detected, complementary oligonucleotides are immobilized on a substrate, the oligonucleotides being modified such that they are not digestible by a predetermined or all nucleases which specifically cleave single-stranded nucleic acid and one or more of the following steps b ) and c):

b) the substrate is brought into contact with the material of the sample;

c) the surface of the substrate is subjected to a restriction digest by the predetermined or a nuclease which specifically cleaves single-stranded nucleic acid, and

d) finally the presence of double-stranded nucleic acids on the substrate is detected.

7. The method according to the preceding claim, characterized in that between step b) and c) in a further step b1) Substrate is heated.

8. The method according to the preceding claim, characterized in that the substrate on is heated above 40 ° C.

9. The method according to the preceding claim, characterized in that the substrate on 60th is heated to 75 ° C.

10. The method according to any one of claims 6 to 9, characterized in that in each step b) further sample material with the substrate in Is brought into contact.

11. The method according to any one of claims 6 to 10, characterized in that before each step c) non-inactivated nuclease is added.

12. The method according to any one of claims 6 to 11, characterized in that as nuclease S1- Nuclease is used.

13. The method according to any one of claims 6 to 12, characterized in that a sample is a sample containing fragmented, sheared, and / or in smaller fragments previously partially digested and / or non-amplified nucleic acids used becomes.

14. The method according to any one of claims 6 to 13, characterized in that for the detection of double-stranded nucleic acid in step

a) the substrate

1. in one of the preceding steps or in step d) is brought into contact with a substance that intercalates into double-stranded nucleic acids,

2. the substrate is washed

3. the intercalating substance remaining on the substrate is detected.

15. The method according to the preceding claim, characterized in that as an intercalating Fabric a dye is used.

16. The method according to claim 14, characterized in that as an intercalating A fluorescent dye is used.

17. The method according to claim 14, characterized in that as an intercalating Substance is a substance used before or after the intercalation in the double-stranded nucleic acid a marker, for example a radioactive component, a dye or one a color reaction, one Bioluminescence reaction and / or a chemiluminescence reaction catalyzing enzyme, can be bound.

18. The method according to any one of claims 6 to 17, characterized in that for the detection of double-stranded nucleic acid in step d)

1. the substrate is brought into contact in a step preceding step d) or in step d) with a substance which binds to the nucleic acid to be detected but not to immobilized oligonucleotides which are present in single strands,

2. the substrate is washed

3. the substance remaining on the substrate and binding to the nucleic acid to be detected is detected.

19. The method according to the preceding claim, characterized in that as a binding substance a dye is used.

20. The method according to claim 18, characterized in that as a binding substance a fluorescent dye is used.

21. The method according to claim 18, characterized in that as a binding substance a substance is used in front of or after binding to the one to be detected Nucleic acid a marker, for example a radioactive component, a dye or a Color reaction, a bioluminescence reaction and / or catalyzing a chemiluminescent reaction Enzyme can be bound.

22. The method according to any one of claims 18 to 21, characterized in that the to the Detectable nucleic acid binding substance a substance is used which is on the marginal sugar the nucleic acid to be detected, advantageously covalent, binds.

23. Method according to one of the preceding Expectations, characterized in that for step d) Temperature of the substrate below that Hybridization temperature of the immobilized Oligonucleotides with complementary nucleotides is lowered.

24. The method according to any one of claims 6 to 23, characterized in that a Oligonucleotide arrangement according to one of claims 1 to 6 is used.

25. Device for performing the method according to one of claims 6 to 24 with a holder for the arrangement of an oligonucleotide arrangement according to one of claims 1 to 6 on one Surface of the bracket as well as a Heating / cooling device for heating or cooling the oligonucleotide arrangement.

26. Device according to the preceding claim, characterized in that devices for Supply of sample solutions, nuclease solutions and / or wash solutions to the surface of the Holder for the olionucleotide arrangement available.

27. Device according to one of the two preceding Expectations, characterized by a spectral apparatus for Detection from above the surface of the Bracket arriving electromagnetic Radiation, especially x-rays, UV Light, visible light, IR light or Particle beams.

28. Device according to one of the three previous Expectations, characterized by a device for Radiation of electromagnetic radiation, especially UV, visible and / or IR light on the surface of the bracket.