DE10021204A1

DE10021204A1 - Method for the highly parallel analysis of polymorphisms

Info

Publication number: DE10021204A1
Application number: DE10021204A
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin; Ivo Glynne Gut
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2001-11-08
Also published as: EP1309728A2; DE10191554D2; WO2001081620A3; AU2001265759A1; WO2001081620A2

Abstract

The invention relates to a method for the highly parallel characterization of polymorphisms, especially SNPs, which can be used for the simultaneous or separate detection of DNA methylations. A set of probes that is provided with at least one detectable marking characteristic of the corresponding probe is bound to an addressed surface, the bond of the probes to the surface being photochemically, chemically or enzymatically cleavable. A nucleic acid to be analyzed is then bound to said probes, the probes are modified in an allele-specific enzymatic reaction and a part of the probes that is irrelevant for the analysis of the allele-specific reaction is removed. The allele-specific products are analyzed by means of the detectable markings and the alleles present in the analyzed nucleic acid probe are determined.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Analyseverfahren mit hohem Durchsatz zur parallelen Charakterisierung von Polymorphismen, insbesondere SNPs. Gleichzeitig oder in einem separaten Experiment kann das Verfahren zur Analyse von DNA-Methylierung eingesetzt werden.The present invention describes an analysis method with high throughput for parallel characterization of Polymorphisms, especially SNPs. Simultaneously or in A separate experiment can use the method for analysis of DNA methylation.

Das Humangenomprojekt, die Erstsequenzierung des mensch lichen Genoms, wird in den nächsten Jahren abgeschlossen sein. Durch dieses Projekt wird es möglich werden, alle etwa 100.000 Gene zu identifizieren. Die Sequenzinforma tion öffnet ungeahnte Möglichkeiten für die Aufklärung der Genfunktionen. Dies wiederum eröffnet die Möglich keit, Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zu betreiben. Die Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielt auf den Einsatz von Medikamenten in Abhängigkeit eines Genotypen. Dadurch soll die Effektivität von Medikamenten gesteigert werden. Der notwendige Zwischenschritt ist die Bestimmung der Polymorphismen und Genotypen, die mit einem bestimm ten Ansprechen assoziiert sind. Verlangt werden deshalb immer effizientere Genotypisierungsmethoden.The human genome project, the first sequencing of humans genome, will be completed in the next few years his. This project will make it possible for everyone to identify about 100,000 genes. The sequence information tion opens up unprecedented opportunities for enlightenment of gene functions. This in turn opens up the possibility ability to operate pharmacogenetics and pharmacogenomics. Pharmacogenetics and pharmacogenomics target the Use of drugs depending on a genotype. This is said to increase the effectiveness of medication become. The necessary intermediate step is the determination of the polymorphisms and genotypes associated with a particular responses are associated. Therefore they are asked for ever more efficient genotyping methods.

Derzeit gibt es zwei Kategorien von polymorphen Markern, die zur Genotypisierung eingesetzt werden, Mikrosatelli ten und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Mikrosa telliten sind hoch polymorph, d. h. sie haben eine Viel zahl von Allelen. Sie sind dadurch charakterisiert, dass ein repetitives Sequenzelement, mit einer unterschiedli chen Anzahl Wiederholungen für unterschiedliche Allele, von konservierten Sequenzen flankiert ist. Durchschnitt lich gibt es einen Mikrosatellitenmarker pro 1 Million Basen. Eine Karte von 5.000 positionierten Mikrosatelli tenmarkern wurde von CEPH publiziert (Dil. C., et al. Nature, March 14, 1994). Mikrosatelliten werden durch die Grössenbestimmung von Produkten einer PCR mit Primern der konservierten, flankierenden Sequenz genotypisiert. Die fluoreszent markierten PCR Produkte werden auf Gelen aufgetrennt.There are currently two categories of polymorphic markers, used for genotyping, Mikrosatelli ten and single nucleotide polymorphisms (SNPs). Microsa tellites are highly polymorphic; H. they have a lot number of alleles. They are characterized in that a repetitive sequence element, with a differ number of repetitions for different alleles, is flanked by conserved sequences. Average There is one microsatellite marker per million Bases. A card of 5,000 microsatelli positioned tenmarker was published by CEPH (Dil. C., et al. Nature, March 14, 1994). Microsatellites are through the size determination of products of a PCR with primers the conserved, flanking sequence genotyped. The fluorescent labeled PCR products are on gels separated.

Es gibt vergleichsweise wenige beschriebene SNP Marker. Eine Karte mit 300.000 SNP Markern wird derzeit vom SNP Konsortium enwickelt und wird öffentlich zugänglich sein.There are comparatively few described SNP markers. A card with 300,000 SNP markers is currently issued by the SNP Consortium is developing and will be publicly available.

Es gibt eine Handvoll Genotypisierungsmethoden für SNPs. Einige basieren auf der Auftrennung von Produkten auf Ge len, wie der oligonucleotide ligase assay (OLA). Er eig net sich daher eher für den mittleren Durchsatz. Andere vertrauen auf reine Hybridisierung, die jedoch nicht die gleiche Stringenz hat. DNA Arrays (DNA chip) eignen sich für die Analyse einer grossen Anzahl SNPs in einer be schränkten Anzahl von Individuen. Bis jetzt sind Beispie le gezeigt worden, in denen 1.500 SNPs auf einem DNA Chip genotypisiert wurden. Die wirkliche Stärke von DNA Chips liegt in Ansätzen, wie der Resequenzierung und der Ex pressionsanalyse. Ansätze, welche Primerverlängerung an wenden sind gezeigt worden. Diese haben den Vorteil, dass wenn mit fluoreszenzmarkierten Terminatorbasen gearbeitet wird, die Resultate mit einem einfachen ELISA Lesegerät gesammelt werden können.There are a handful of genotyping methods for SNPs. Some are based on the separation of products on Ge len, such as the oligonucleotide ligase assay (OLA). He proper is therefore more suitable for medium throughput. Other rely on pure hybridization, but not that has the same stringency. DNA arrays (DNA chip) are suitable for the analysis of a large number of SNPs in one be limited number of individuals. So far there are examples le have been shown in which 1,500 SNPs on a DNA chip were genotyped. The real strength of DNA chips approaches such as resequencing and ex pressure analysis. Approaches which primer extension to have been shown. These have the advantage that when working with fluorescence-labeled terminator bases the results with a simple ELISA reader can be collected.

Es gibt einige SNP Genotypisierungsmethoden, die Mas senspektrometrie zur Analyse verwenden. Diese haben den wesentlichen Vorteil, dass die allelspezifischen Produkte eine physische Darstellung der Produkte sind und kein fluoreszierendes Signal, dass indirekt dem Produkt zuge ordnet werden muss.There are several SNP genotyping methods that Mas Use spectrometry for analysis. These have that essential advantage that the allele-specific products are a physical representation of the products and not fluorescent signal that indirectly delivered to the product must be arranged.

Eine Methode, die kürzlich vorgestellt wurde, ist der In vader Assay und als Variante davon der Invader Squared (T. Griffin and L. M. Smith Proceedings of the ASMS 1998). Für diese Methode werden mindestens zwei Oligonukleotide verwendet, die einen bekannten SNP abdecken. Ein Oligo nukleotid deckt die Sequenz von der 5'-Seite bis unmit telbar zum SNP hin ab, so dass sich der SNP an das 3'- Ende dieses Oligonukleotids anschliesst. Meistens werden zwei weitere Oligonukleotide, von denen jeder ein Allel des Polymorphismus abdeckt und einen unterschiedliche 5'- Überhang hat, an das System hybridisiert. Eine struktur aktive Endonuklease entfernt vom vollständig komplementä ren Oligonukleotid den 5'-Überhang. Der abgekappte Über hang wird mittels Massenspektrometrie analysiert und zur Identifikation des Allels verwendet. Ein Nachteil der ge zeigten Methode ist, dass die Produkte vor der mas senspektrometrische Analyse gründlich gereinigt werden müssen. Für diese Aufreinigung werden magnetic beads ver wendet, die nicht einfach in der Handhabung sind. Dies ist ein wesentlicher Nachteil von vielen Genotypisie rungsmethoden, die Massenspektrometrie zur Analyse ver wenden.One method that was recently introduced is the In vader assay and, as a variant, the Invader Squared (T. Griffin and L.M. Smith Proceedings of the ASMS 1998). At least two oligonucleotides are used for this method used that cover a known SNP. An oligo nucleotide covers the sequence from the 5 'side to immediately telbar towards the SNP, so that the SNP addresses the 3'- End of this oligonucleotide. Mostly two other oligonucleotides, each of which is an allele of the polymorphism and a different 5'- Overhang has hybridized to the system. A structure active endonuclease removed from the completely complementary oligonucleotide the 5 'overhang. The trimmed over slope is analyzed by mass spectrometry and Identification of the allele used. A disadvantage of ge showed method is that the products before the mas spectrometric analysis can be cleaned thoroughly have to. Magnetic beads are used for this purification uses that are not easy to use. This is a major disadvantage of many genotypes methods that use mass spectrometry for analysis turn.

Eine weitere Genotypisierungsmethode ist der Taq Man As say. In diesem wird allelspezifisch enzymatisch ein Fluo rezenzlöscher von einem fluoreszenzfarbstofftragenden Oligonukleotid getrennt.Another genotyping method is the Taq Man As say. In this allele-specific enzyme becomes a fluo Quencher from a fluorescent dye-bearing Oligonucleotide separated.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight Massenspektrometrie (MALDI) hat die Analytik von Biomolekülen revolutioniert (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)). MALDI ist in verschie denen Varianten zur Analyse von DNA eingesetzt worden. Die Varianten reichen von primer extension bis Sequenzie rung (Liu, Y.-H., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 735-743 (1995); Ch'ang, L.-Y., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 772-774 (1995); Little, D. P., et al. J. Mol. Med. 75, 745-750 (1997); Haff, L. & Smirnov, I. P. Genome Res. 7, 378-388 (1997), Fei, Z., Ono, T. & Smith, L. M. Nucleic Acids Res. 26, 2827-2828 (1998); Ross, P., Hall, L., Smirnov, I. & Haff, L. Nature Biotech. 16, 1347-1351 (1998); Ross, P. L., Lee, K. & Belgrader, P. Anal. Chem. 69, 4197-4202 (1997); Griffin, T. J., Tang, W. & Smith, L. M. Nature Biote ch. 15, 1368-1372 (1997)). Der grösste Nachteil dieser Methoden ist, dass alle eine gründliche Aufreinigung der Produkte vor der MALDI Analyse bedingen. Spin column Aufreinigung oder der Einsatz von magnetic bead technology oder reversed-phase Aufreinigung sind notwendig.Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of flight mass spectrometry (MALDI) has the analytics of Biomolecules revolutionized (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)). MALDI is in various which variants were used to analyze DNA. The variants range from primer extension to sequencing tion (Liu, Y.-H., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 735-743 (1995); Ch'ang, L.-Y., et al. Rapid Commun. Measure Spectrom. 9: 772-774 (1995); Little, D.P., et al. J. Mol. Med. 75: 745-750 (1997); Haff, L. & Smirnov, I.P. Genome Res. 7, 378-388 (1997), Fei, Z., Ono, T. & Smith, L.M. Nucleic Acids Res. 26, 2827-2828 (1998); Ross, P., Hall, L., Smirnov, I. & Haff, L. Nature Biotech. 16, 1347-1351 (1998); Ross, P.L., Lee, K. & Belgrader, P. Anal. Chem. 69: 4197-4202 (1997); Griffin, T.J., Tang, W. & Smith, L.M. Nature Biote ch. 15, 1368-1372 (1997)). The biggest Disadvantage of these methods is that they are all thorough Condition the products before the MALDI analysis. Spin column purification or the use of magnetic bead technology or reversed-phase purification necessary.

Die Analyse von DNA im MALDI ist stark abhängig vom La dungszustand des Produktes. Eine 100-fache Verbesserung der Empfindlichkeit in der MALDI Analyse kann dadurch er zielt werden, dass der Ladungszustand auf dem zu analy sierenden Produkt so kontrolliert wird, dass nur eine einzige positive oder negative Überschussladung vorhanden ist. So modifizierte Produkte sind auch wesentlich weni ger anfällig auf die Ausbildung von Addukten (z. B. mit Na und K, Gut, I. G. and Beck, 5. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 1367-1373; Gut, I. G., Jeffery, W. A., Pappin, D. J. C. and Beck, S. Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43-50 (1997)). Ein SNP Genotypisierungsverfahren, welches von diesen Bedingungen Gebrauch macht, mit dem Namen "GOOD Assay" wurde kürzlich vorgestellt (Sauer, S. et al., Nuc leic Acids Research, Methods online, 2000, 28, e13). Nachteil ist, dass das gesamte Verfahren einen beschränk ten Multiplexierungsgrad zulässt, und die Probenvorberei tung immer den Einsatz modernster und teurer Pipettier technologie bedingt.The analysis of DNA in MALDI is heavily dependent on La condition of the product. A 100-fold improvement The sensitivity in the MALDI analysis can thereby aims to analyze the state of charge on the product is checked so that only one only positive or negative excess charge available is. Products modified in this way are also considerably less susceptible to the formation of adducts (e.g. with Na and K, Gut, I.G. and Beck, 5. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 1367-1373; Gut, I.G., Jeffery, W.A., Pappin, D.J.C. and Beck, S. Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43-50 (1997)). An SNP genotyping method, which by makes use of these conditions with the name "GOOD Assay "was recently introduced (Sauer, S. et al., Nuc leic Acids Research, Methods online, 2000, 28, e13). The disadvantage is that the entire process limits one permitting degree of multiplexing, and the sample preparation always use the most modern and expensive pipette technology-related.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur hochparallelen Genotypisierung von Polymorphismen zur Verfügung zustellen.The object of the present invention is a method for highly parallel genotyping of polymorphisms for To make available.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt:
The task is solved by a method for the highly parallel characterization of polymorphisms, whereby the following steps are carried out:

a) one binds a set of probes with at least one characteristic of the respective probe markable is provided to an addressed Surface, the generated binding of the probes to the Surface photochemically, chemically or enzymatically like which is fissile;
b) a nucleic acid to be investigated is hybridized these probes;
c) one changes the probes in an allele-specific enzymatic reaction;
d) one part of the probes is removed, which is used for the analy it is meaningless in the allele-specific reaction;
e) the allele-specific products are analyzed on the basis of the detectable markings and makes a determination the alleles present in the nucleic acid queried sample by.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren wobei die Ad resse der Oberfläche in Schritt a) die Position (Oligo nukleotidarray), eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isotopische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung ist.According to the invention, a method is preferred in which the ad the surface in step a) the position (oligo nucleotide array), a color, a fluorescent label, an isotopic label, a chemical label or is a radioactive label.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Sonden Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen sind, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.It is further preferred according to the invention that the probes Oligonucleotides, modified oligonucleotides, peptides nucleic acids (PNAs), chimera of these classes of compounds or other substances that are sequence-specific DNA interact.

Auch ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche bindet. Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass die zu untersu chende Nukleinsäuren in Schritt b) genomische DNA, klo nierte DNA, cDNA, RNA, PCR Produkte oder Ligationsproduk te sind.It is also preferred according to the invention that the probes binds to the surface via reversible binding systems. It is also preferred according to the invention that the to be examined nucleic acids in step b) genomic DNA, loo nated DNA, cDNA, RNA, PCR products or ligation products te are.

Bevorzugt ist ferner, dass die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spe zifischen Produkten, entsprechend Schritt c) umgesetzt werden.It is further preferred that the probes are dependent on the respective sequence of the hybridized template by means of a polymerase and nucleotide building blocks specific products, implemented according to step c) become.

Besonders bevorzugt ist auch, dass man durch gleichzeiti gen Einsatz von Desoxy- und Didesoxynukleotidbausteinen eine Sequenzierung durchführt und nicht nur Polymorphis men detektiert.It is also particularly preferred that by simultaneously gene use of deoxy and dideoxynucleotide building blocks does sequencing and not just polymorphis men detected.

Insbesondere ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Ligase und ei nem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezifischen Pro dukten, entsprechend Schritt c) umsetzt.In particular, it is preferred according to the invention that the Probes depending on the particular sequence of hybridized template using a ligase and egg phosphorylated oligonucleotide to specific pro products, implemented according to step c).

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels eines Helferoligo nukleotids und einer strukturaktiven Endonuklease al lelspezifisch schneidet. Weiterhin bevorzugt ist auch, dass man die allelspezifischen Produkte mittels Mas senspektrometrie analysiert.It is also preferred according to the invention that the Probes depending on the particular sequence of template hybridized to it using a helper oligo nucleotide and a structurally active endonuclease al cuts specific to the oil. It is also preferred that that the allele-specific products can be analyzed spectrometry.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Mas senspektrometrie (MALDI) oder Elektrospray lonisations Massenspektrometrie zur Analyse verwendet wird.According to the invention, it is particularly preferred that Matrix-assisted laser desorption / ionization mas sens spectrometry (MALDI) or electrospray ionizations Mass spectrometry is used for analysis.

Dabei ist es bevorzugt, dass die allelspezifischen Pro dukte in einer Art vorliegen, die sich besonders gut zur massenspektrometrischen Analyse eignen. It is preferred that the allele-specific Pro products are available in a way that is particularly good for Mass spectrometric analysis are suitable.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die al lelspezifischen Produkte gemäss Schritt d) mittels einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt. Dabei ist besonders bevorzugt, dass die besonders gute Eignung zur massenspektrometrischen Analyse dadurch zustande kommt, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind. Weiterhin ist hierbei bevorzugt, dass eine chemische Reaktion zur Neutralisie rung von Ladungen eingesetzt wird, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produk tes beitragen würden. Somit ist auch bevorzugt, dass man Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen, oder Dithi ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert. Be sonders ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die ein fache Ladung erfindungsgemäß dadurch zu stande kommt, dass man eine chemische Funktion einbringt, welche die Ladung trägt.It is further preferred according to the invention that the al Oil-specific products according to step d) using a shortened enzymatic or chemical method. It is particularly preferred that the particularly good suitability for mass spectrometric analysis that the allele-specific products are simply positive net or are simply negatively charged. Furthermore, here is preferred that a chemical reaction to neutralize charge is used, which would otherwise become a neutral or multiple negative net charge of the product would contribute. It is therefore preferred that one Phosphate groups, thiophosphate groups, or dithi ophosphate groups of the oligonucleotide backbone by a selective alkylation reaction charge neutralized. Be It is also particularly preferred according to the invention that the one fold charge comes about according to the invention, that you bring in a chemical function that Carries cargo.

Bevorzugt ist insbesondere auch, dass die reversible Bin dungschemie durch einen induzierten Bruch die einfache Ladung zum Produkt beisteuert. Dabei ist bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zustande kommt. Weiterhin ist dabei bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch während eines Desorptionsprozes ses des Analysevorgangs stattfindet.It is also particularly preferred that the reversible bin manure chemistry by an induced break the simple Load contributed to the product. It is preferred that the induced bond breakage chemically or photochemically comes about. It is further preferred that the induced bond breakage during a desorption process the analysis process takes place.

Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, dass man eine Matrix auf die Oberfläche aufbringt, welche die De sorption im MALDI Prozess unterstützt. Dabei ist wiederum bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch durch die Matrix induziert wird.It is very particularly preferred according to the invention that applies a matrix to the surface, which the De sorption supported in the MALDI process. It is again preferred that the induced bond break through the Matrix is induced.

Bevorzugt ist erfindungsgemäß ferner, dass auf einem ad ressierten Analysepunkt der Oberfläche eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die al lelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markierung ergeben. Außerdem ist bevor zugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragmentmassen als nachweisbare Markierung ergeben. Insbesondere bevorzugt ist hierbei, dass die Massen aller Produkte oder Produktfragmente der allelspezifischen Re aktionen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der ab gefragten Nukleinsäure vorhandenen Allele zulassen.It is also preferred according to the invention that on an ad interested in analyzing the surface of a variety of are different probes. It is further preferred that allele-specific products of the probes by the al Oil-specific reaction after step c) after cleavage a clear mass from the surface in the analysis result as a detectable marking. Also is before causes that allele-specific products of the probes by the allele-specific reaction after step c) after cleavage a clear pattern from the surface in the analysis of fragment masses as a detectable marker. It is particularly preferred here that the masses of all Products or product fragments of the allele-specific Re actions a clear conclusion on the in the allow alleles in demand.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass bekannte Poly morphismen in der zu untersuchenden DNA genotypisiert werden.It is also preferred according to the invention that known poly morphisms genotyped in the DNA to be examined become.

Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man un bekannte Polymorphismen in der zu untersuchenden DNA i dentifiziert.Furthermore, it is preferred according to the invention that un known polymorphisms in the DNA to be examined i diagnosed.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass man Cytosin- Methylierungen detektiert und visualisiert.It is also preferred according to the invention that cytosine Methylations detected and visualized.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung der DNA mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.It is particularly preferred according to the invention that chemical treatment of the DNA with a bisulfite solution (Disulfite, hydrogen sulfite) is carried out.

Bevorzugt ist auch, dass die Amplifikation mittels der Polymerasereaktion (PCR) erfolgt.It is also preferred that the amplification by means of the Polymerase reaction (PCR) takes place.

Weiterhin ist bevorzugt, dass bekannte Methylierungs muster in der zu analysierenden Probe nach der erfin dungsgemäß vorbehandelten DNA untersucht werden. It is further preferred that known methylation pattern in the sample to be analyzed according to the invented DNA pretreated according to the invention are examined.

Das erfindungsgemäße Verfahren übertrifft die Effizienz bestehender Verfahren, in Bezug auf die Einfachheit der Handhabung, die Kosten, die Qualität und den Durchsatz, bei weitem.The method according to the invention exceeds the efficiency existing procedures, in terms of the simplicity of Handling, cost, quality and throughput, by far.

Die Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur hochpa rallelen Charakterisierung von Polymorphismen.The invention thus describes a method for hochpa parallel characterization of polymorphisms.

Im ersten Schritt des Verfahrens wird ein Satz von Sonden an eine adressierte Oberfläche gebunden.The first step in the process is a set of probes bound to an addressed surface.

Man setzt als Sonden vorzugsweise Oligonukleotide, modi fizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen ein, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.Oligonucleotides, modes, are preferably used as probes infected oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs), Chimeras of these classes of compounds or other substances that interact sequence-specifically with DNA.

Die jeweilige Sonde ist mit einer charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen. Besonders bevorzugt ist diese Markierung die Masse eines Fragments der Sonde.The respective probe has a characteristic provide a detectable marking. Particularly preferred this label is the mass of a fragment of the probe.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Ad ressierung der Oberfläche die Position (Oligonukleotidar ray), eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isoto pische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung.In a preferred variant of the method, the ad surface position (oligonucleotide ray), a color, a fluorescent label, an isoto chemical marker, or a chemical marker radioactive labeling.

Die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche ist photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar.The generated binding of the probes to the surface is Can be cleaved again photochemically, chemically or enzymatically.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche gebunden.In a particularly preferred variant of the method are the probes via reversible binding systems to the Surface bound.

Im zweiten Verfahrensschritt hybridisiert man die zu un tersuchende Nukleinsäure, die vorzugsweise aus genomi scher DNA, klonierter DNA, vorbehandelter DNA, cDNA, RNA, PCR Produkten oder Ligationsprodukten besteht, an die be sagten Sonden.In the second step of the process, one hybridizes to un ternary nucleic acid, preferably from genomi shear DNA, cloned DNA, pretreated DNA, cDNA, RNA, PCR products or ligation products exist to which be said probes.

Bevorzugt wird die DNA zuvor mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) behandelt.The DNA is preferred beforehand with a bisulfite solution (Disulfite, hydrogen sulfite) treated.

Im dritten Verfahrensschritt verändert man die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion.In the third step, the probes are changed to an allele-specific enzymatic reaction.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spezifischen Produkten umge setzt.In a preferred variant of the method, the Probes depending on the particular sequence of template hybridized thereon by means of a polymerase and nucleotide building blocks to specific products puts.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Se quenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Li gase und einem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezi fischen Produkten umgesetzt.In another preferred variant of the method are the probes depending on the respective Se sequence of the hybridized template using a Li gases and a phosphorylated oligonucleotide to spec fish products implemented.

Anschließend werden die Sonden bevorzugt in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mit einem Helferoligonukleotid und einer struk turaktiven Endonuklease allelspezifisch geschnitten.The probes are then preferably dependent of the respective sequence of the hybridized thereon Template with a helper oligonucleotide and a struc turaactive endonuclease cut allele-specific.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens lassen sich dabei Methylierungsmuster in der zu analysie renden vorbehandelten DNA untersuchen.In a particularly preferred variant of the method methylation patterns can be analyzed Examine the pre-treated DNA.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden SNPs in der zu analysierenden vorbehandelten DNA untersucht. In a further preferred variant of the method become SNPs in the pretreated DNA to be analyzed examined.

Auf einem adressierten Analysepunkt der Oberfläche befin den sich vorzugsweise eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden.Located on an addressed analysis point on the surface which are preferably a variety of different Probes.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reakti on bedeutungslos ist.In the fourth process step, part of the is removed Probes used for the analysis of allele-specific reactions one is meaningless.

Die allelspezifischen Produkte werden dabei vorzugsweise mit einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt.The allele-specific products are preferred shortened with an enzymatic or chemical method.

Im fünften Verfahrensschritt analysiert man die allelspe zifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt die Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäureprobe durch.In the fifth step, the allelspe is analyzed specific products based on the detectable markings and performs the determination of the alleles present in the queried nucleic acid sample.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die allelspezifischen Produkte mittels Massenspektrometrie analysiert.In a preferred variant of the method, the allele-specific products using mass spectrometry analyzed.

Die allelspezifischen Produkte liegen vorzugsweise in ei ner Art vor, die sich besonders gut zur massenspektro metrischen Analyse eignet.The allele-specific products are preferably in egg ner type that is particularly good for mass spectrometry suitable for metric analysis.

Bevorzugt kommt die besonders gute Eignung zur mas senspektrometrischen Analyse dadurch zustande, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind.The particularly good suitability is preferred for mas spectrometric analysis by the fact that the allele-specific products simply positive or net are simply negatively charged.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird eine chemische Reaktion zur Neutralisierung von Ladungen ein gesetzt, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produktes beitragen würde.In a preferred variant of the method, a chemical reaction to neutralize charges otherwise set to a neutral or multiple negative net charge of the product would contribute.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen oder Dithi ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert.In another preferred variant of the method become phosphate groups, thiophosphate groups or dithi ophosphate groups of the oligonucleotide backbone by a selective alkylation reaction charge neutralized.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt die einfache Ladung dadurch zustande, dass eine chemische Funktion eingebracht wird, die die Ladung trägt.In a preferred variant of the method, the simple charge by the fact that a chemical Function that carries the load is introduced.

Die reversible Bindungschemie steuert vorzugsweise die einfache Ladung durch einen induzierten Bruch zum Produkt bei.The reversible binding chemistry preferably controls that simple loading through an induced break to the product at.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zu stande.In a preferred variant of the method, the induced bond breakage chemically or photochemically stood.

In einer weiteren bevorzugten Variante findet der indu zierte Bindungsbruch während des Desorptionsprozesses des Analysenvorgangs statt.In a further preferred variant, the indu graced bond break during the desorption process of the Analysis process takes place.

Eine Matrix wird bevorzugt auf die Oberfläche aufge bracht, die die Desorption im MALDI Prozess unterstützt.A matrix is preferably applied to the surface that supports desorption in the MALDI process.

In einer weiteren bevorzugten Variante wird der induzier te Bindungsbruch durch die Matrix induziert.In a further preferred variant, the induced te broken bond induced by the matrix.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder Elektronenspray lonisa tions Massenspektrometrie zur Analyse verwendet.In a particularly preferred variant of the method become matrix-assisted laser desorption / ionization Mass spectrometry (MALDI) or lonisa electron spray tion mass spectrometry used for analysis.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ergeben die Verlängerungsprodukte der Sonden durch die allelspezifi sche Reaktion nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markie rung. Bekannte Polymorphismen lassen sich damit vorzugs weise in der zu untersuchenden DNA identifizieren. In a preferred variant of the method, the Extension products of the probes through the allele-specific reaction after splitting off from the surface in the Analysis of a clear mass as a detectable markie tion. Known polymorphisms can thus be preferred identify wisely in the DNA to be examined.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens er geben die Verlängerungsprodukte der Sonden durch die al lelspezifische Reaktion nach Abspaltung von der Oberflä che in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragment massen als nachweisbare Markierung. Unbekannte Poly morphismen lassen sich damit vorzugsweise in der zu un tersuchenden DNA identifizieren.In another preferred variant of the method, he give the extension products of the probes by the al Oil-specific reaction after separation from the surface in the analysis a clear pattern of fragment measures as a detectable marking. Unknown poly Morphisms can thus preferably be found in the un identify the DNA being searched.

Die Massen aller Produkte der Reaktionen lassen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der abgefragten Nuk leinsäure vorhandenen Allele zu.The masses of all products of the reactions leave you unequivocal conclusion on the nuk queried existing alleles.

Das Verfahren wird abschließend durch die Abbildungen er läutert.The process is finally illustrated by the illustrations purifies.

Anhand der Figuren wird die Erfindung näher erläu tert.The invention is explained in more detail with reference to the figures tert.

Es zeigen:Show it:

Fig. 1a und 1b eine Veranschaulichung der Verfahrens schritte an einem Beispiel und Fig. 1a and 1b an illustration of the method steps of an example and

Fig. 2 ein mögliche Immobilisierung der Sonden an der Oberfläche umfassend einen photolabilen Linker. Fig. 2 shows a possible immobilization of the probes on the surface comprising a photolabile linker.

In den Fig. 1a und 1b werden folgende Schritte darge stellt:
The following steps are shown in FIGS . 1a and 1b:

1. First, a probe is placed on the addressed surface bound.
2. The nucleus to be examined is then hybridized acid to the probe.
3. The probes are then extended in an allelspe specific reaction.
4. The nucleic acid to be examined is removed.
5. Then remove part of the probes, the is meaningless for the allele-specific reaction.
6. Finally, analyze the remaining part of the extended probes. A is preferred for analysis Mass spectrometer used that the extended probes identified by their masses and that at the same time allows detachment from the surface (e.g. photo lytic reaction in a laser desorption Mass spectrometry).

Fig. 2 stellt die eine mögliche Verknüpfung der Primer mit der Oberfläche dar. Das abgebildete Nukleotid ist Teil des Primers, welcher der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist. Fig. 2 represents a possible linkage of the primer to the surface. The nucleotide shown is part of the primer, which is not shown for clarity.

Claims

1. A method for the highly parallel characterization of polymorphisms, taking the following steps:

a) one binds a set of probes which is provided with at least one detectable marking which is characteristic of the respective probe, to an addressed surface, the binding of the probes produced being photochemically, chemically or enzymatically cleavable again;
b) a nucleic acid to be investigated is hybridized to these probes;
c) the probes are changed in an allele-specific enzymatic reaction;
d) a part of the probes is removed which is meaningless for the analysis of the allele-specific reaction;
e) the allele-specific products are analyzed on the basis of the detectable markings and a determination of the alleles present in the queried nucleic acid sample is carried out.

2. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 1, characterized net that the address of the surface in step a) the position (oligonucleotide array), one color, one Fluorescent label, an isotopic label, a chemical label or a radioactive mar is.

3. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 1, characterized net that the probes modified oligonucleotides Oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs), Chima re these classes of compounds or other substances that interact with DNA in a sequence-specific manner.

4. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that the probes over reversible binding systems bind to the surface.

5. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 1, characterized net that the nucleic acids to be examined in Step b) genomic DNA, cloned DNA, cDNA, RNA, PCR products or ligation products are.

6. The method according to one of the preceding claims characterized by that the probes are dependent of the respective sequence of the hybridized to it Templates using a polymerase and nucleotide building blocks for specific products, accordingly Claim 1c) are implemented.

7. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 6, characterized in net that you can use Deso xy and dideoxynucleotide building blocks a sequence and not only detects polymorphisms animals.

8. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of claims 1 to 5, since characterized by that the probes are dependent depending on the sequence of the hybri based template using a ligase and a phosphorylated oligonucleotide to specific pro products, implemented according to claim 1c).

9. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of claims 1 to 5, since characterized by that the probes are dependent of the respective sequence of the hybridi attached to it based template using a helper oligonucleotide and a structurally active endonuclease allele-specific fish cuts.

10. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of claims 1 to 9, there characterized by that you have the allele-specific Products analyzed using mass spectrometry.

11. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 10, characterized in net that matrix-assisted laser desorpti ons / ionization mass spectrometry (MALDI) or E Electrospray ionization mass spectrometry for Ana lysis is used.

12. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 11, characterized in net that the allele-specific products in a kind are present, which are particularly good for mass spectrometry metric analysis.

13. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that the allele-specific fish products according to claim 1d) by means of a shortened enzymatic or chemical method.

14. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 12, characterized in net that the particularly good suitability for mas by spectrometric analysis, that the allele-specific products are simply po net sitiv or simply negatively charged.

15. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 14 characterized net that a chemical reaction for neutralization of charges that otherwise become one neutral or multiple negative net charge of the Would contribute to the product.

16. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 15, characterized in net that phosphate groups, thiophosphate groups, or dithiophosphate groups of the oligonucleo backbone through a selective alkylation reaction on charge neutralized.

17. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of claims 14 to 16, characterized in that the simple charge of Claim 13 arises from the fact that one chemical function that brings the charge wearing.

18. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claims 1 to 16, characterized characterized that the reversible binding chemistry of claim 4 by an induced fracture fold charge to the product from claim 13 contributed.

19. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 18 characterized net that the induced bond break chemically or comes about photochemically.

20. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 18, characterized in net that the induced bond break during a Desorption process of the analysis process takes place.

21. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claims 10 to 20 thereby characterized that you have a matrix on the surface which applies desorption in the MALDI process supported.

22. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 21, characterized in net that the induced bond break through the Mat rix is induced.

23. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claims 1 to 22, characterized characterized that on an addressed analysis point of the surface a variety of different Chen probes.

24. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 23, characterized net that allele specific products of the probes the allele-specific reaction according to claim 1c) Cleavage from the surface in the analysis one result in clear dimensions as a verifiable marking.

25. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 23, characterized net that allele specific products of the probes the allele-specific reaction according to claim 1c) Cleavage from the surface in the analysis on a clear pattern of fragment masses as detectable Result in marking.

26. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to at least one of claims 23 to 25, characterized in that the masses of all Products or product fragments of the allele-specific Reactions a clear conclusion to the in the alleles present to the nucleic acid queried to let.

27. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that known poly morphisms genotyped in the DNA to be examined become.

28. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of claims 1 to 26, there characterized by that unknown poly Identify morphisms in the DNA to be examined graces.

29. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that cytosine Methylations detected and visualized.

30. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that the chemical Treatment of the DNA with a bisulfite solution (Disul fit, hydrogen sulfite).

31. A method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to one of the preceding claims che, characterized in that the amplification by means of the polymerase reaction (PCR).

32. Method for the highly parallel characterization of Polymorphisms according to claim 26 characterized net that known methylation pattern in the to ana lysing sample as claimed in claim 30 delten DNA can be examined.