DE10056802B4

DE10056802B4 - Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik

Info

Publication number: DE10056802B4
Application number: DE10056802A
Authority: DE
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock; Kurt Dr. Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-11-14
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-11-15
Also published as: WO2002040710A2; US20040048279A1; JP2004513650A; AU2002223672A1; DE10056802A1; WO2002040710A3; EP1337668A2

Abstract

Verfahren zur toxikologischen Diagnostik dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte ausgeführt werden:
a) einem Lebewesen oder einer Zellkultur, die zuvor einer bestimmten auf ihre toxikologische Wirkung zu untersuchende Substanz ausgesetzt wurden, wird eine Probe entnommen, die DNA besagten Lebewesens oder der Zellkultur enthält;
b) die in der Probe enthaltene DNA wird derart behandelt, dass methylierte Cytosinbasen zu einer anderen Basenabfolge an einer gegebenen Position in der besagten behandelten DNA führen als unmethylierte Cytosinbasen an einer gegebenen Position in besagter behandelter DNA;
c) die Basenabfolge eines Teils der modifizierten DNA wird bestimmt und daraus auf einen für die Probe charakteristischen Methylierungszustand oder ein charakteristisches Methylierungsmuster geschlossen;
d) durch Abgleich mit Daten aus Methylierungszuständen anderer Proben wird auf die Einwirkung einer Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur geschlossen und/oder die Einwirkung dieser Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur im Vergleich zu anderen Substanzen in toxikologischer Hinsicht...

Description

Gebiet der Erfindung
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
In der vorliegenden Erfindung werden die Methylierungszustände von toxikologisch relevanten Genen bestimmt und die dabei erfassten Daten zu Methylierungsmustern zusammengefasst. Durch Vergleich der erhaltenen Muster mit entsprechenden Referenzproben können umfassende prognostische Aussagen über die toxikologischen Eigenschaften von Substanzen gemacht werden. Des weiteren soll ein Verfahren vorgestellt werden, welches die Analyse von Methylierungspositionen der zu untersuchenden Gene in grossem Umfang ermöglicht.

Die toxikologische Beurteilung von chemischen Substanzen wird gegenwärtig vor allem durch Versuche an Tieren durchgeführt. Tierversuche sind ethisch problematisch, zeitaufwendig und teuer. Um die toxikologischen Konsequenzen von Substanzen besser abschätzen zu können, werden zunehmend Verfahren der Genexpressionsanalyse eingesetzt. Solche Ansätze beruhten bisher im wesentlichen auf der Analyse der mRNA. Vor allem durch DNA Chips können dabei tausende von Genen bezüglich Veränderungen ihrer transkriptionellen Aktivität parallel untersucht werden. Aus der veränderten Genexpression kann wiederum auf bestimmte toxikologische Parameter geschlossen werden (Stoughton R. et al., U.S. 6132969 ).

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064–5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylienangsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94–98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275–276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res: 1997, 25, 2529–2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532–2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299–2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Gegenwärtig ist es nicht Stand der Technik, grosse Mengen von Proben hinsichtlich bedeutsamer Methylierungspositionen für die toxikologische Diagnostik zu untersuchen.

Aufgabenstellung

Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose von Methylierungszuständen von Genen mit toxikologischer Relevanz eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-Methylierungszustände zur Diagnose von Expressionsveränderungen von Genen mit toxikologischer Relevanz besonders eignen.

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Beurteilung toxikologischer Eigenschaften bestimmter Substanzen. Das Verfahren beruht auf der Detektion spezifischer, durch die zu prüfende Substanz bewirkte Veränderungen des Methylierungszustandes oder des Methylierungsmusters von genomischer DNA.

Ein Methylierungszustand in dieser Erfindung ist ein für eine DNA-Probe spezifischer Zustand der Methylierung von Cytosinbasen.

Einem Lebewesen oder einer Zellkultur, die zuvor einer auf ihre toxikologische Wirkung zu überprüfende Substanz ausgesetzt waren, wird eine Probe entnommen, die DNA des Lebewesens oder der Zellkultur enthält.

Die zu analysierende genomische DNA wird dabei bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehim-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.

In einem ersten Verfahrensschritt wird die erhaltene DNA derart behandelt, dass methylierte Cytosinbasen zu einer anderen Basenabfolge in der besagten DNA Probe führen. Anschließend wird die Basenabfolge der besagten behandelten DNA Probe bestimmt und auf einen für die Probe charakteristischen Methylierungszustand oder ein Methylierungsmuster geschlossen. Schließlich kann durch Vergleich des erhaltenen Methylierungszustandes oder Methylierungsmusters mit den Methylierungszuständen oder Methylierungsmustern von anderen Proben auf die Einwirkung der verwendeten Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur geschlossen werden und/oder die Einwirkungen verschiedener Substanzen miteinander verglichen werden.

Bevorzugt wird im ersten Verfahrensschritt eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.

Im zweiten Verfahrensschritt wird die Basenabfolge eines Teils der chemisch behandelten DNA bestimmt und auf für die Probe charakteristische Methylierungszustände geschlossen.

Bevorzugt werden in einem zweiten Verfahrensschritt zunächst aus der chemisch vorbehandelten genomischen DNA Fragmente unter Verwendung von Primeroligonukleotiden amplifiziert.

Bevorzugt werden mehr als 10 unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare lang sind.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei vorzugsweise eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der Sequenzen der zu untersuchenden Gene sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.

Bevorzugt enthält mindestens eines der beiden zur Amplifizierung eines bestimmten Abschnitts der chemisch vorbehandelten DNA verwendeten Primeroligonukleotide identifizierbare Markierungen.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

Vorzugsweise sind die Sondenoligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist ferner, dass unterschiedliche Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.

Im dritten Verfahrensschritt hybridisiert man die Amplifikate an einen Satz von mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Proben, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Unter Hybridisierung im Sinne dieser Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt.

Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen der zu untersuchenden Gene ist. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen der zu untersuchenden Gene ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4: bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Verwendung eines Verfahrens zur Diagnose von Methylierungszuständen innerhalb einer Gruppe von Genen, die sich durch eine besonders gut dokumentierte Verbindung zu toxikologischen Prozessen auszeichnen.

Bevorzugt dient das Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse im Zusammenhang mit der Diagnose toxikologisch bedeutender Parameter stehen.

Erfindungsgemäss verwendet wird das Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse im Zusammenhang mit der Diagnose toxikologisch bedeutender Parameter stehen.

Der zu untersuchende Satz von Genen umfasst mindestens eines der in Tab. 1 aufgeführten Gene oder aber Sequenzen, die im Bereich der Exons identisch oder zu mindestens 85% homolog zu den in Tab: 1 aufgeführten Genen sind. Tab. 1:

Besonders bevorzugt wird der Methylierungszustand von im wesentlichen aller in Tab. 1 aufgeführten Gene untersucht.

Bevorzugt wird ein Satz von Genen auf Methylierung untersucht, in dem bis zu 25% der in Tab. 1 aufgeführten Gene nicht enthalten sind.

Bevorzugt ist ferner, dass mindestens 95% der in Tab. 1 aufgeführten Gene zusammen mit einer begrenzten Anzahl zusätzlicher nicht aufgeführter Gene auf ihren Methylierungszustand untersucht werden.

Bis zu 25% der in Tab. 1 aufgeführten Gene sind erfindungsgemäß durch einen kompletten Satz anderer nicht aufgeführter Gene ersetzt.

Bevorzugt stimmt die chemisch vorbehandelte DNA Sequenz der nachzuweisenden Gene mindestens zu 95% mit der entsprechend vorbehandelten DNA Sequenz der Gene aus Tab. 1 überein.

Sequenzen, die in einem mindestens 25 Basenpaare langen Abschnitt des Exons zu 100% übereinstimmen, werden in dieser Erfindung als homolog bezeichnet. Dieses trifft auch auf Sequenzen zu, deren Homologie erst unter Berücksichtigung eventueller Frameshifts zu erkennen ist.

In den nachfolgenden Beispielen sind einige der zu untersuchenden Gene und ihre Bedeutung für toxikologische Prozesse aufgeführt.

Die genomischen Sequenzen der zu untersuchenden Gene können durch Vergleich der jeweiligen cDNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen Datenbanken, in denen genomische Sequenzen hinterlegt sind, abgeleitet werden.

Beispiel 1 Methylierungsanalyse des Cyp1a1 Gens
Besonders bevorzugt in der Analyse von veränderten Methylierungsmustern, die wiederum Genexpressionsveränderungen widerspiegeln, sind Gene, die Enzyme kodieren, die die Biotransformation von toxikologischen Substanzen katalysieren. Eine zentrale Funktion kommen hierbei unter anderen den Genen der Cytochrom P450 Familie zu. In Tierversuchen konnte unter anderem gezeigt werden, dass eines der Gene aus dieser Klasse, Cyp1a1, nach Exposition von Mäusen mit beta-Naphtoflavon induziert wurde (Arch Biochem Biophys 2000 Apr 1; 376(1): 66–73). Zur Methylierungsanalyse muß zunächst die genomische DNA Sequenz, die das Cyp1a1 Gen kodiert identifiziert werden. Dazu kann z.B. die cDNA Sequenz (Genbank Acc. NM_000499) mit einer genomischen Datenbank (z.B. Genbank htgs) verglichen werden, wobei in der Regel der BLAST Vergleichsalgorithmus, der über das Internet verfügbar ist (www.ncbi.nlm.nih.gov), verwendet wird. Im vorliegenden Fall kann so der Abschnitt der genomischen DNA, der Cyp1a1 kodiert identifiziert werden (Genbank Acc.AC020705). Bevorzugt werden genomische Abschnitte im Bereich des Promoters sowie des ersten Exons bzw. Introns auf Methylierungsunterschiede untersucht, da relevante CpG Dinukleotide, deren Methylierung die Genexpression beeinflusst, bevorzugt in diesen Abschnitten zu finden sind. Im Beispiel des Cyp1a1 Gens wurde Exon 1 (unterstrichen) im folgenden genomischen Sequenz abschnitt lokalisiert:
>genomische Region, die Exon 1 des Cyp1a1 Gens enthält (Exon1 hervorgehoben)
Sequenzabschnitt nach Bisulfitbehandlung und PCR Amplifizierung (die verwendeten Primeroligonukleotide und das analysierte CpG sind hervorgehoben)
Um einen Teil des dargestellten genomischen Abschnitts nach der Bisulfitbehandlung zu amplifizieren können beispielsweise die beiden Primer mit der Sequenz TATGTTAAATGGTATTGG und CATCCAAAAACTAT verwendet werden, mit denen sich definierte Fragmente der Länge 1316 Basenpaare amplifizieren lassen. Diese Amplifikate dienen als Sonde, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide, beispielsweise CTACCCCGTAATA, hybridisiert werden, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 837 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 oder Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Beispiel 2 Einordnung einer chemischen Substanz in eine Toxizitätsklasse durch Bestimmung des Methylierungsmusters
Um anhand des Methylierungsmusters eine Einordnung einer chemischen Substanz in eine bestimmte Klasse durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von exponierten und einer Gruppe von nichtexponierten Lebewesen, etwa Versuchstieren. Die Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Anschließend wird das Methylierungsmuster der zu beurteilenden Substanz mit bereits bekannten Methylierungsmustern anderer chemischer Substanzen verglichen. Aus den toxikologischen Eigenschaften derjenigen chemischen Substanzen mit ähnlichem Methylierungsmuster können Hinweise auf die Eigenschaften der zu untersuchenden Substanz gewonnen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenden Reagenz, einen Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der Basensequenzen der zu untersuchenden Gene entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, zur Herstellung der Amplifikate, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, eine Kontrollnukleinsäure sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel belegt, dass es durch die Einwirkung bestimmter Substanzen zu einer Änderung des Methylierungsmusters in bestimmten Genen kommen kann. Ein Vergleich mit bekannten Methylierungsmustern erlaubt eine Aussage über die toxische Wirkung bestimmter Substanzen und ermöglicht so eine Risikoabschätzung.
Die Daten stammen aus zwei verschiedenen Studien. In beiden Fällen wurde – wie in der Anmeldung beschrieben – die DNA aus den Zellen extrahiert und einer Bisulfitumwandlung unterzogen. Anschließend wurde eine Multiplex-PCR durchgeführt. Auf einen Glasträger wurden für die CpG-Positionen der Gene spezifische Oligonukleotide immobilisiert (Microarray). Die fluoreszenzmarkierten PCR-Amplifikate wurden mit den Olionukleotiden hybridisiert. Der resultierenden Muster wurden datentechnisch verarbeitet und in das dargestellte Farbmuster übersetzt. Die grüne Farbe zeigt dabei eine Hypo-, die rote Farbe eine Hypermethylierung an (zur Vorgehensweise siehe die detaillierte Darstellung in: Adorjan et al., Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 1; 30(5):e21.).
In der ersten Studie (1) wurde die Wirkung des chemischen Stoffes MG 98 auf das Methylierungsmuster von vierzig verschiedenen Genen analysiert. Untersucht wurde das Tumorgewebe von sechs unterschiedlichen Personen. Auf der y-Achse befinden sich die Abkürzungen der Namen der untersuchten Gene. Auf der x-Achse sind die (internen) Bezeichnungen der Proben aufgeführt, links die vor der MG-98-Behandlung (schwarze Schrift), rechts die nach der Behandlung (rote Schrift). Während die Gene vor der MG- 98-Behandlung ein klares Hypermethylierungsmuster zeigen, überwiegt nach der Behandlung eine Hypomethylierung. Insbesondere der Methylierungsstatus der beiden Gene PTEN-B (Phosphatase und Tensin Homolog) und CDH1-B (Cadherin) zeigt signifikante Unterschiede (zweite und drittletzte Reihe von unten).
Die zweite Studie (2) zeigt den Einfluß von Milrinon und Trichostatin zu unterschiedlichen Zeiten auf das Methylierungsmuster von HT29-Zellen. Hier kommt es zu einer Hypermethylierung der Zellen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur toxikologischen Diagnostik dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte ausgeführt werden: a) einem Lebewesen oder einer Zellkultur, die zuvor einer bestimmten auf ihre toxikologische Wirkung zu untersuchende Substanz ausgesetzt wurden, wird eine Probe entnommen, die DNA besagten Lebewesens oder der Zellkultur enthält; b) die in der Probe enthaltene DNA wird derart behandelt, dass methylierte Cytosinbasen zu einer anderen Basenabfolge an einer gegebenen Position in der besagten behandelten DNA führen als unmethylierte Cytosinbasen an einer gegebenen Position in besagter behandelter DNA; c) die Basenabfolge eines Teils der modifizierten DNA wird bestimmt und daraus auf einen für die Probe charakteristischen Methylierungszustand oder ein charakteristisches Methylierungsmuster geschlossen; d) durch Abgleich mit Daten aus Methylierungszuständen anderer Proben wird auf die Einwirkung einer Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur geschlossen und/oder die Einwirkung dieser Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur im Vergleich zu anderen Substanzen in toxikologischer Hinsicht verglichen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungszustand oder das Methylierungsmuster eines Satzes von Genen untersucht wird, der mindestens eines der im Folgenden aufgeführten Gene oder aber Sequenzen, die im Bereich der Exons identisch oder zu mindestens 85% homolog zu den im Folgenden aufgeführten Genen sind, umfasst:
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungszustand oder das Methylierungsmuster von im wesentlichen allen der im Anspruch 2 aufgeführten Genen untersucht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass ein Satz von Genen auf Methylierung untersucht wird, in dem bis zu 25% der in Anspruch 2 aufgeführten Gene nicht enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 95% der in Anspruch 2 aufgeführten Gene zusammen mit einer begrenzten Anzahl zusätzlicher nicht aufgeführter Gene auf ihren Methylierungszustand oder ihr Methylierungsmuster untersucht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, dass bis zu 25% der aufgeführten Gene durch einen kompletten Satz anderer nicht aufgeführter Gene ersetzt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 für einen Satz von Genen gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1–6, in welcher die chemisch vorbehandelte DNA Sequenz der nachzuweisenden Gene mindestens zu 95% mit der entsprechend vorbehandelten DNA Sequenz der Gene aus obiger Liste übereinstimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt: a) einem Lebewesen oder einer Zellkultur wird eine Probe entnommen, die die DNA besagten Lebewesens oder besagter Zellkultur enthält; b) in einer Probe, die genomische DNA enthält, wandelt man durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder Thymidin um, wobei an der 5-Position methylierte Cytosinbasen unverändert bleiben; c) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA amplifiziert man Fragmente; d) die amplifizierten Fragmente werden an Oligonukleotide oder PNA Oligomere hybridisiert; e) der Methylierungszustand oder das Methylierungsmuster wird aus dem Hybridisierungsverhalten der amplifizierten Fragmente abgeleitet; f) durch Abgleich mit Daten aus Methylierungszuständen anderer Proben wird auf die Einwirkung einer Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur geschlossen und/oder die Einwirkung dieser Substanz auf das Lebewesen oder die Zellkultur im Vergleich zu anderen Substanzen in toxikologischer Hinsicht verglichen.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung mit der Lösung eines Bisulfits erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifizierung mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Sätze von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide zur Amplifizieurng verwendet werden, deren Sequenzen jeweils mindestens 18 Basenpaare lange Abschnitte der nach chemischer Modifikation erhaltenen Nukleinsäure Sequenzen der in Anspruch 2 aufgeführten Gene entsprechen oder zu ihnen komplementär sind.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass Sätze von Primeroligonukleotiden verwendet werden, die identifizierbare Markierungen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Primeroligonukleotide Fluoreszenzmarkierungen sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Primeroligonukleotide Radionuklide sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Primeroligonukleotide ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können.
Verfahren nach Anspruch 8 adurch gekennzeichnet, dass die hybridisierten Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16 dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–17, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide oder PNA Oligomere nach Anspruch 8 d) mehrheitlich – identisch oder komplementär zu einem mindestens 9 Nukleotide langen Sequenzabschnitt mindestens eines der Gene nach Anspruch 2 sind, wie er nach der chemischen Modifizierung gemäss Anspruch 8 voliegt und – mindestens ein CG oder TG Dinukleotid enthalten.
Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass Oligonukleotide verwendet werden, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids oder das Thymin des TpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid vom 5-Ende des 13 mers ist.
Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass PNA Oligomere verwendet werden, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids oder das Thymin des TpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5-Ende des 9 mers ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden und mit dem gleichen Satz von Sondenoligonukleotiden nach einem der Ansprüche 18 bis 20 untersucht werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenoligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Detektionsoligonukleotide und/oder PNA-Oligomersequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23 dadurch gekennzeichnet, dass die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich ein Oligonukleotid befindet, identifizierbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22–24 dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die genomische DNA aus einer DNA enthaltenden Probe gewonnen wird, wobei Quellen für DNA Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfasst.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse im Zusammenhang mit mit der Diagnose toxikologisch bedeutender Parameter stehen.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse im Zusammenhang mit der Diagnose toxikologisch, bedeutender Parameter stehen.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch, enthaltend a) eine chemische Substanz zur Modifizierung von Cytosinbasen; b) Primeroligonukleotide zur Amplifizierung der modifizierten Nukleinsäuren; c) Sondenoligonukleotide oder PNA Oligomere; und optional d) eine Anleitung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der voranstehenden Ansprüche; e) eine Kontroll-Nukleinsäure mit bekanntem Methylierungszustand oder Methylierungsmuster.